Электрофорез принцип метода: Ошибка: 404 Страница не найдена

Электрофорез белков сыворотки крови в клинико-диагностической лаборатории «Философия красоты и здоровья»

Краткая характеристика белковых фракций сыворотки крови 

Общий белок сыворотки крови состоит из смеси белков с разной структурой и функциями. Разделение на фракции основано на разной подвижности белков в разделяющей среде под действием электрического поля. Методом капиллярного электрофореза выделяют пять стандартных фракций: альбумин, альфа-1-, альфа-2-, бета- (иногда отдельно выделяют фракции бета-1- и бета-2-глобулинов) и гамма-глобулины. 
Фракция альбуминов составляет 40-60% от общего количества белка (см. тест № ). Основным компонентом фракции является альбумин. При капиллярном электрофорезе в данную фракцию попадают также альфа-липопротеины, пре-бета-липопротеины и бета-липопротеины. 
Фракция альфа-1-глобулина включает в себя острофазные белки: альфа-1-антитрипсин (основной компонент этой фракции, ингибитор многих протеолитических ферментов: трипсина, химотрипсина, плазмина и т. п.), альфа-1-кислый гликопротеин (орозомукоид). 
Фракция альфа-2-глобулинов включает высокомолекулярные преимущественно острофазные белки − альфа-2-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин. Основным компонентом фракции является альфа-2-макроглобулин – ингибитор протеиназ (в т. ч. ферментов систем кинина, комплемента, свертывания и фибринолиза), модулятор иммунных и воспалительных реакций. 
Фракция бета-глобулинов содержит трансферрин (белок-переносчик железа), гемопексин (участвует в метаболизме железа, связывая гем при метаболизме гемсодержащих белков), С3 и С4 компоненты комплемента (участвуют в реакциях иммунитета), С-реактивный белок. 
Фракция гамма-глобулинов состоит из иммуноглобулинов, функционально представляющих собой антитела, которые обеспечивают гуморальную иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ. 

При каких состояниях может изменяться нормальное соотношение белковых фракций в сыворотке крови 

Спектр состояний, при которых наблюдаются изменения протеинограммы, чрезвычайно широк, и включает заболевания различной этиологии (воспалительные процессы, связанные с инфекциями, аутоиммунные заболевания, болезни печени, нефротический синдром, дефицит альфа-1-антитрипсина, моноклональные гаммапатии и пр.). Как правило, результат протеинограммы не может служить единственным критерием постановки диагноза. Поскольку в настоящее время существует много более специфичных тестов для диагностики этих заболеваний, наибольшую клиническую значимость исследование белковых фракций представляет в качестве первичного скринингового теста при подозрении на моноклональную гаммапатию, о которой свидетельствует выявление при электрофорезе аномальной фракции (парапротеина). 
Парапротеинемия − появление на электрофореграмме дополнительной дискретной полосы, свидетельствующей о присутствии в большом количестве однородного (моноклонального) белка, обычно иммуноглобулинов или отдельных компонентов их молекул, синтезируемых В-лимфоцитами. Высокая концентрация М-белка (больше 15 г/л) с большой вероятностью указывает на миелому. Исследование белковых фракций при подозрении на миелому имеет особую диагностическую ценность. Следует учитывать, что легкие цепи иммуноглобулинов (белок Бенс-Джонса) свободно проходят через сывороточный фильтр и на электрофореграмме сыворотки крови могут не определяться. Малые М-белки иногда могут выявляться при хронических гепатитах, доброкачественно − у пациентов престарелого возраста. Имитировать малую парапротеинемию может большая концентрация С-реактивного белка и некоторых других острофазных белков, а также присутствие в сыворотке фибриногена. 

С какой целью определяют белковые фракции в сыворотке крови 

Электрофорез белков сыворотки крови используют в диагностике состояний, сопровождаемых аномальным синтезом или потерей белка. Скрининговый тест при подозрении на миелому.

ОФС.1.2.1.0021.15 Электрофорез | Фармакопея.рф

Содержимое (Table of Contents)

Электрофорез – метод анализа, основанный на способности заряженных частиц, растворенных или диспергированных в электролите, перемещаться под действием внешнего электрического поля.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Электрофорез                                                   ОФС.1.2.1.0021.15

Взамен ст. ГФ XI, вып.1

Электрофорез – метод анализа, основанный на способности заряженных частиц, растворенных или диспергированных в электролите, перемещаться под действием внешнего электрического поля.

Различие физико-химических свойств заряженных частиц (размер, форма, величина заряда), а также влияние факторов электролитической среды (напряженность электрического поля, природа среды, вязкость электролита, рН, температура среды, а также продолжительность электрофореза) обусловливают различие скоростей перемещения частиц и, следовательно, обеспечивают их разделение. При электрофорезе на твердых носителях на подвижность и эффективность разделения дополнительное влияние оказывают: адсорбция, неоднородность вещества носителя и его ионообменные свойства, размер пор, электроосмос и капиллярный эффект.

Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для данного вещества. Различают абсолютную и относительную электрофоретическую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность, формирующаяся под влиянием внешнего электрического поля, измеряется в сантиметрах в секунду. Относительная электрофоретическая подвижность  представляет собой отношение подвижности исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт.

Все электрофоретические методы могут быть разделены на две основные категории: электрофорез в свободном растворе, называемый также электрофорезом с подвижной границей или фронтальным электрофорезом; и электрофорез на поддерживающих средах, называемый также зональным электрофорезом.

Фронтальный электрофорез

В данном методе воздействию электрического тока подвергается раствор электролита и анализируемые компоненты,  помещенные непосредственно в раствор. Этот метод является способом прямого определения электрофоретической подвижности веществ в отсутствие влияния эффектов носителя (адсорбции, электроосмоса, неоднородности среды), однако метод непригоден для выделения чистых компонентов анализируемой смеси из-за низкого разрешения. Метод может применяться для веществ с относительно высокой молекулярной массой, обладающих низкой диффузионной способностью.

Зональный электрофорез

В этом методе используется неподвижный носитель, по поверхности или через объем которого осуществляется миграция ионов, причем стабилизация электролита на плотной матрице позволяет предотвратить конвекцию и смешивание зон после разделения компонентов.

В зависимости от среды и способа проведения зональный электрофорез имеет несколько вариантов. Природа поддерживающей плотной среды (бумага, силикагель, пленки из ацетата целлюлозы, гели на основе крахмала, агарозы, полиамидов или смешанные гели) вносит множество дополнительных факторов, изменяющих подвижность. Если среда не является электрически нейтральной, то в ней на подвижность анализируемых компонентов дополнительное влияние оказывает электроосмотический поток. Например, в капиллярном электрофорезе электроосмотический поток возникает из-за образования двойного слоя между раствором и внутренней стенкой капилляра. Внутренняя стенка плавленого кварца отрицательно заряжена за счет присутствия диссоциированных силанольных групп. Этот отрицательно заряженный слой притягивает положительные ионы из раствора, в результате чего образуется положительно заряженное кольцо жидкости, движущееся в направлении отрицательно заряженного катода.

Электроосмотический поток сильно зависит от рН. Он присутствует только при значениях рН более 4. Чем выше значение рН, тем более четко выражен эффект. Электроосмотический поток может быть уменьшен в результате химической модификации или покрытия внутренней стенки капилляра положительно заряженными амфолитами.

Профиль электроосмотического потока очень плоский по сравнению с гидродинамическим потоком, профиль которого параболический. В результате электроосмотический поток не вызывает размывания пиков.

Разогрев среды, вследствие эффекта Джоуля, может вызывать некоторое испарение жидкости из поддерживающей среды, которое, вследствие капиллярных взаимодействий, вызывает перемещение раствора от краев пластинки к центру.

Следовательно, скорость перемещения зависит от 4 главных факторов: подвижности заряженной частицы, электроосмотического потока, скорости испарения и напряженности поля. Для достижения воспроизводимых результатов необходимо установить и контролировать определенные условия электрофореза (напряжение, температура и т. д.) и использовать реактивы установленной квалификации.

Многообразие методов электрофореза связано с большим количеством разных способов стабилизации электрофоретической среды (градиенты плотности с добавлением глицерина, гликолей, сахарозы, полиаминополикарбоновых кислот), носителей различной природы и разнообразия способов их использования (электрофорез в крахмальном блоке, в тонком слое, на колонке, в пленке или в пластине геля, в трубках или на бумаге).

Влияние различных факторов на электрофоретическую подвижность

Влияние заряда, размера частицы, вязкости электролита и градиента напряжения

Электрофоретическая подвижность заряженной частицы непосредственно связана с величиной заряда и обратно пропорциональна размеру частицы, непосредственно связанному, в свою очередь, с ее молекулярной массой. Поскольку пептиды и другие биологически активные вещества, которые могут быть проанализированы методом электрофореза, обычно не имеют идеальной сферической формы и не подчиняются закону Стокса, то их электрофоретическая подвижность (u₀) лучше всего описывается уравнением:

где    v   –   скорость частицы;

          E  –   градиент напряжения, наложенный на электролит;

          A  –   коэффициент формы, обычно в диапазоне от 4 до 6, который показывает обратную зависимость подвижности от квадрата радиуса. В терминах молекулярной массы это подразумевает обратную зависимость подвижности от 2/3 единицы молекулярной массы;

          Q  –   заряд  частицы;

          r   –   радиус частицы;

          η   –   вязкость электролита.

Влияние величины рН

Электрофоретическая подвижность зависит от величины рН раствора, влияющей на степень ионизации вещества. В качестве примера на рисунке приведена зависимость подвижности глицина от величины рН.

Зависимость подвижности глицина от величины рН

Рисунок – Зависимость подвижности глицина от величины рН

Значения pK_a 2,2 и 9,9 совпадают с точками перегиба графика. Так как соответствующие функциональные группы на 50 % ионизированы при тех значениях, где pH = pK_a, то электрофоретическая подвижность в этих точках составляет половину от величины, наблюдаемой для полностью ионизированного катиона и аниона, существующего при очень низком и очень высоком значении pH, соответственно. Цвиттер-ион, который существует в промежуточном диапазоне значений pH, электрически нейтрален и имеет нулевую подвижность.

Влияние ионной силы и температуры

Электрофоретическая подвижность уменьшается с увеличением ионной силы применяемого электролита. Ионная сила µ определяется как:

где    C_i  –   концентрация иона, моль/л;

          Z_i  –   валентность иона.

Для буферных растворов, в которых и анион, и катион являются одновалентными, ионная сила равна молярности.

Ионная сила электролитов, используемых для электрофореза, обычно выбирается в пределах от 0,01 до 0,10, что зависит от состава образца, так как буферная емкость должна быть достаточно большой, чтобы поддерживалось постоянное значение pH по области расположения зон компонентов.

Температура влияет на подвижность косвенно, так как вязкость η применяемого электролита является величиной, зависимой от температуры. Вязкость воды уменьшается приблизительно на 3 % при изменении температуры на 1 °C в диапазоне температур от 0 до 5 °С и, с меньшей скоростью, в диапазоне комнатных температур. Поэтому подвижность увеличивается с увеличением температуры электролита.

Скачать в PDF ОФС.1.2.1.0021.15 Электрофорез

Поделиться ссылкой:

Биолого-почвенный факультет

Биолого-почвенный факультет

1. Физико-химические методы анализа. Область применения, значение для биологии. Классификация физико-химических методов. Наиболее существенные открытия в развитии физико-химических методов.
2. Физико-химические свойства молекул, примеры взаимосвязи свойств молекул и методов их изучения.
3. Характеристика макромолекул: полипептидные цепи. Связи, обусловливающие взаимодействие аминокислот в белках и уровни структурной организации белков.
4. Характеристика макромолекул: полинуклеотидные цепи Компоненты нуклеиновых кислот. Связи, возникающие в полинуклеотидной цепи. Линейные и циклические полинуклеотидные цепи. Циклы Херши.
5. Микроскопия. Наиболее существенные открытия в развитии методов микроскопии. Принципы, возможности и разрешающая способность микроскопии. Виды микроскопии и область их применения.
6. Оптическая светопольная микроскопия. Факторы, определяющие увеличение микроскопа. Апертура. Разрешающая способность микроскопа.
7. Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия.
8. Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия. Особенности оптической системы флуоресцентного микроскопа. Красители, использующиеся в флуоресцентной микроскопии
9. Электронная микроскопия – принцип метода. Сканирующая и просвечивающая (трансмиссинная) микроскопия. Особенности и возможности методов.
10. Техника подготовки препаратов для микроскопии. Фиксация и окраска клеток.
11. Хроматография. Наиболее существенные открытия в развитии методов хроматографии. Теория хроматографического процесса. Классификация хроматографических методов.
12. Жидкостная колоночная хроматография: теоретические основы, аппаратура, детекторы.
13. Качественный и количественный анализ в жидкостной колоночной хроматографии.  Основные методы анализа. Хроматограмма, ее основные характеристики.
14. Жидкостно-адсорбционная хроматография. Принцип разделения и современные модификации метода.
15. Ионообменная хроматография. Типы ионообменников. Ионный обмен. Режимы элюирования.
16. Аффинная хроматография. Принцип разделения. Область применения.
17. Эксклюзионная хроматография. Принцип разделения. Область применения.
18. Газовая хроматография: принцип метода, аппаратура, детекторы и область применения.
19. Планарная хроматография. Разновидности метода. Качественный анализ в планарной хроматографии.
20. Планарная хроматография. Разновидности метода. Количественный анализ в планарной хроматографии.
21. Электрофорез. Наиболее существенные открытия в развитии методов электрофореза. Теория электрофореза. Скорость и электрофоретическая подвижность. Типы электрофореза.
22. Фронтальный и зональный электрофорез: сравнительные особенности.
23. Гель-электрофорез. Аппаратурное оформление гель-электрофореза. Характеристика агарозного и полиакриламидного гелей. 
24. Разновидности электрофореза в ПААГ: SDS-электрофорез.
25. Разновидности электрофореза в ПААГ: диск-электрофорез.
26. Разновидности электрофореза в ПААГ: градиент плотности и  изоэлектрофокусирование.
27. Разновидности электрофореза в ПААГ: изотахофорез и двумерный электрофорез.
28. Электрофорез нуклеиновых кислот. Характеристики нуклеиновых кислот, обусловливающие особенности их электрофореза. Электрофорез в денатурирующих гелях. Капиллярный электрофорез.
29. Центрифугирование. Основы теории седиментации. Коэффициент седиментации.
30. Аналитические и препаративные центрифуги. Виды седиментации – общая характеристика.
31. Скоростное и  зональное центрифугирование. Изопикнический и изокинетический градиенты.
32. Оптическая спектроскопия. Наиболее существенные открытия в развитии методов спектроскопии. Электромагнитный спектр. Виды спектроскопии.
33. Теоретические основы оптической спектроскопии. Постулаты Н. Бора. Теоретическая интерпретация формулы Ридберга. Волна де Бройля. Недостатки модели Бора для объяснения спектров сложных атомов.
34. Уравнение Э. Шредингера. Квантовые числа, их соотношение. Спектральный терм атома.
35. Спектральные свойства молекул. Молекулярные орбитали и молеклярные энергетические уровни. Кривая Морзе.
36. Молекулярная адсорбционная спектроскопия. Типы молекулярных электронных переходов. Оптическая плотность и спектр поглощения.
37. Закон Бугера-Ламберта-Бэра. Факторы, определяющие отклонение от линейной зависимости. Калибровочные графики.
38. Аппаратура для изучения спектров поглощения в видимом и в ультрафиолетовом свете: одно- и двухлучевые спектрофотометры.
39. Область применения видимой и УФ-спектроскопии в биологии и экологии: качественный и количественный анализ вещества. Исследование структурных и динамических свойств молекулярных систем.
40. Инфракрасная спектроскопия. Теоретические основы метода. Аппаратура для ИК-спектроскопии. Область применения и особенности ИК-спектров вещества.

Метод электрофореза в молекулярной биологии

Принципы гель-электрофореза

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Как это работает?

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

Трансиллюминатор

После завершения разделения гель окрашивается красителем, чтобы выявить полосы разделения. Бромид этидия представляет собой флуоресцентный краситель, обычно используемый в гелевом электрофорезе. Гель вымачивают в разбавленном растворе бромида этидия и затем помещают на УФ-трансиллюминатор для визуализации разделительных полос.

Полосы сразу проверяются или фотографируются для дальнейшего использования, поскольку они будут диффундировать в гель с течением времени. Краситель также может быть загружен в гель заранее, чтобы отслеживать миграцию молекул, как это происходит.

Применение гель-электрофореза

Гель-электрофорез широко используется в лабораториях молекулярной биологии и биохимии в таких областях, как судебная медицина, консервативная биология и медицина.

Ниже перечислены некоторые ключевые применения технологии:

• При отделении фрагментов ДНК для отпечатков пальцев ДНК для расследования преступлений
• Проанализировать результаты полимеразной цепной реакции
• Проанализировать гены, связанные с определенной болезнью
• В профилировании ДНК для проведения таксономических исследований для различения различных видов
• При тестировании отцовства с использованием отпечатков пальцев ДНК
• При изучении структуры и функции белков
• При анализе устойчивости к антибиотикам
• В методах блоттинга для анализа макромолекул
• Изучая эволюционные отношения, анализируя генетическое сходство между популяциями или видами

Система Capillarys-2 Flex Piercing : C-D-T.RU

Метод — гель-электрофорез — Большая Энциклопедия Нефти и Газа, статья, страница 1

Метод — гель-электрофорез

Cтраница 1

Метод гель-электрофореза всякий раз ставит экспериментатора перед выбором: либо, используя концентрированный гель, добиться высокого разрешения нуклеиновых кислот с относительно небольшой молекулярной массой, либо в геле низкой концентрации с невысоким разрешением разделить высокомолекулярные соединения. Поэтому для каждого конкретного набора молекул приходится принимать некое компромиссное решение.
 [1]

ДНК, отличающихся числом сверхвитков, методом гель-электрофореза.
 [2]

Для разделения белков и нуклеиновых кислот широко применяется метод гель-электрофореза. Его принцип заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Молекулы одинакового размера ( и одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные невидимые полосы. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся. Постепенно исходный препарат, состоящий из разных макромолекул, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки.
 [3]

Одним из наиболее изученных 4 ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза, является ЛДГ, катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Пять изоферментов ЛДГ образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов.
 [4]

Число витков суперспирали определяется различными способами — косвенно по связыванию лигандов и непосредственно методом гель-электрофореза. Этот метод очень чувствителен, он позволяет определить молекулы, у которых т разнятся всего лишь на единицу.
 [5]

Метод гель-электрофореза позволяет выделить каждый фрагмент в изолированном виде.
 [6]

При любом данном рН различные аминокислоты имеют слегка различающиеся суммарные заряды и поэтому, если наложить электрическое поле, будут двигаться к одному из электродов с разными скоростями. На этом основано их разделение методом гель-электрофореза ( гл.
 [8]

Быстрое распространение хроматографических и электрофо-ретических методов в области исследования нуклеиновых кислот, которому в значительной степени способствовало становление технологии рекомбинантных ДНК, продолжается и по сей день, особенно в таких направлениях, как разделение мРНК, фрагментов ДНК и нуклеопротеидов. Уже установлена первичная структура обширных участков генома многих животных, и непрерывное совершенствование метода гель-электрофореза, обладающего высоким разрешением, в сочетании с использованием компьютерной техники для определения полных нуклео-тидных последовательностей позволит добиться еще более значительных успехов. На ранних этапах развития этой области исследований одна из задач экспериментатора заключалась в том, чтобы приспособить используемые в других областях науки хроматографические и электрофоретические методы для разделения моно — и олигонуклеотидов. Теперь же, по прошествии тридцати лет, биохимия нуклеиновых кислот сама стала тем источником новых представлений о разделении макромолекул, который стимулирует развитие хроматографии и электрофореза.
 [9]

Последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза.
 [10]

ДНК-диагностика основывается на обнаружении известных нуклеотидных последовательностей; для этого синтезируют специфические праймеры и амплифицируют последовательность-мишень. Это позволяет использовать нерадиоактивные системы детекции ( например, хемилюминесцентный метод) или регистрировать ПЦР-продукты методом гель-электрофореза. Кроме того, ПЦР-продукты можно пометить флуоресцентным красителем, присоединив его к 5 -концу праймера.
 [11]

Использование геля как среды, где проводится электрофорез, полностью устранило трудность, связанную с броуновским движением. Червеобразные молекулы ДНК, подобно угрям, запутавшимся в рыбацкой сети, оказываются фиксированными в полимерной сетке геля. Лишь под действием электрического поля они очень медленно ползут, извиваясь, к аноду, едва протискиваясь сквозь тесные ячейки сетки. Разрешающая способность метода гель-электрофореза оказалась настолько высокой, что не слишком длинные фрагменты ДНК, отличающиеся всего на одно мономерное звено, четко отделяются друг от друга в виде хорошо различимых полосок.
 [12]

Допустим, что выделенный образец ДНК содержит тождественные однонитевые фрагменты. Другой конец цепи не несет метки. К первой из них добавляют вещество, рвущее нить вблизи аденина ( А) с тем расчетом, чтобы в среднем в каждом фрагменте происходил один разрыв. Полученные четыре образца разделяют параллельно методом гель-электрофореза. После этого на гель накладывается фотопластинка, на которой отпечатываются те полоски в геле, которые несут радиоактивную метку. Схематически полученный результат показан на рис. 8.7. Последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. В одном опыте удается прочесть текет длиною до 500 нуклеотидов.
 [13]

Страницы:  

   1

М-градиент, типирование. Электрофорез сыворотки крови и иммунофиксация с панелью антисывороток (IgG/A/M/каппа/лямбда) c количественной оценкой М-градиента

Метод определения

Электрофорез и иммунофиксация с панелью антисывороток (к IgG, IgA, IgM, каппа и лямбда цепям) с денситометрией и оценкой содержания М-компонента. 

Исследуемый материал
Сыворотка крови

Синонимы: Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови; Клинический электрофорез и иммунофиксация; Парапротеины (м-градиент) в сыворотке крови. 

Serum protein electrophoresis; Immunofixation electrophoresis (IFE) ; Detection of kappa and lambda light chain monoclonal proteins in human serum; Immunofixation for characterizing monoclonal proteins (M8proteins) in human serum. 

Краткое описание теста «М-градиент, типирование. Электрофорез сыворотки крови и иммунофиксация с панелью антисывороток (IgG/A/M/каппа/лямбда) c количественной оценкой М-градиента»

Выявление и типирование моноклональных иммуноглобулинов. 

Иммуноглобулины – белки, обладающие активностью антител (способностью специфично связывать определенные антигены). 

В отличие от большинства белков сыворотки крови, которые вырабатываются в печени, иммуноглобулины продуцируются плазматическими клетками – потомками стволовых клеток предшественников В-лимфоцитов в костном мозге. По структурным и функциональным различиям выделяют 5 классов иммуноглобулинов – IgG, IgA, IgM, IgD, IgE и ряд субклассов. Поликлональное увеличение количества иммуноглобулинов – нормальный ответ на инфекции. 

Моноклональные гамммапатии – состояния, когда клоном плазматических клеток или В-лимфоцитов (популяцией клеток, берущих начало от одной В-клетки предшественника) продуцируется аномальное количество иммуноглобулина. Такие состояния могут быть доброкачественными или являться проявлением болезни. Моноклональные гаммапатии выявляют по появлению аномальной полосы белка при электрофорезе сыворотки или мочи.  

Молекулы иммуноглобулинов состоят из одной или более структурных единиц, построенных по единому принципу — из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких пептидных цепей – каппа или лямбда. Разновидности тяжелых цепей являются основой деления иммуноглобулинов на классы. Цепи иммуноглобулинов имеют константные и вариабельные участки, последние связаны с антигенной специфичностью. 

Иммуноглобулин, продуцирующийся одним клоном клеток, имеет идентичную структуру — представляет один класс, подкласс, характеризуется идентичным составом тяжелых и легких цепей. Поэтому если в сыворотке присутствует аномально большое количество моноклонального иммуноглобулина, в процессе электрофоретического разделения белков сыворотки крови он мигрирует в виде компактной полосы, которая выделяется на фоне стандартной картины распределения белковых фракций сыворотки. При описании результатов электрофореза белков сыворотки его называют также парапротеином, М-пиком, М-компонентом, М-белком или М-градиентом. По структуре такой моноклональный иммуноглобулин может быть полимером, мономером или фрагментом молекулы иммуноглобулина (в случае фрагментов чаще это легкие цепи, реже – тяжелые). 

Легкие цепи способны проходить через почечный фильтр, и могут быть обнаружены при электрофорезе мочи. 

Выявление моноклональных парапротеинов основано на применении электрофореза белков. Иногда фибриноген и СРБ, которые мигрируют в бета или гамма-фракции, могут быть ошибочно расценены как парапротеины. Иммуноглобулиновую природу выявленного моноклонального компонента подтверждают с помощью иммунофиксации разделенных белков специфической поливалентной преципитирующей антисывороткой, направленной против иммуноглобулинов (тест № 4050). При подтверждении присутствия моноклонального иммуноглобулина проводится денситометрия и определяется его количественное содержание. Для полноценной идентификации (типирования) моноклонального компонента требуется развернутое исследование с помощью электрофореза и иммунофиксации с развернутой панелью антисывороток против IgG, IgA, IgM, каппа и лямбда цепей (тест № 4051). В диагностике и прогнозе учитывают класс выявленного парапротеина, его концентрацию в момент установления диагноза, скорость повышения его концентрации в динамике. Наличие парапротеина является маркером ряда гематоонкологических заболеваний. 

Что может повлиять на результаты теста «М-градиент, типирование. Электрофорез сыворотки крови и иммунофиксация с панелью антисывороток (IgG/A/M/каппа/лямбда) c количественной оценкой М-градиента» 

При обследовании пациентов, применяющих лекарственные препараты на основе моноклональных антител (могут использоваться в качестве противоопухолевой терапии, иммунодепрессантов и др.), следует учитывать, что на пиковых концентрациях после введения такие препараты иногда могут быть причиной выявления при электрофорезе малых аномальных полос белка иммуноглобулиновой природы. 

С какой целью применяют исследование «М-градиент, типирование. Электрофорез сыворотки крови и иммунофиксация с панелью антисывороток (IgG/A/M/каппа/лямбда) c количественной оценкой М-градиента» 

Множественная миелома — классическое гематологическое заболевание, обусловленное злокачественной пролиферацией плазмацитов, секретирующих моноклональный иммуноглобулин (парапротеин) или его фрагменты. Плазматические клетки чаще пролиферируют диффузно в костном мозге, заболевание приводит к остеолитическим поражениям костей, редукции других клеток костного мозга, что ведет к анемии, тромбоцитопении, лейкопении, ингибирует развитие нормальных клонов плазматических клеток. Пациенты могут обращаться с локальными симптомами патологии костей (боли, переломы) или неспецифичными симптомами (потеря веса, анемия, кровотечения, повторные инфекции или почечная недостаточность). У большинства больных на момент установления диагноза концентрация парапротеина превышает 25 г/л. При миеломе парапротеин в сыворотке крови чаще всего представлен IgG (60%), реже IgA (20%) и около 20% случаев приходятся на миелому Бенс-Джонса, связанную с продукцией свободных легких цепей каппа или лямбда (20%), которые могут быть обнаружены в моче. Иногда при миеломе может отмечаться биклональный парапротеин, представленный иммуноглобулинами разных классов или одного класса, но содержащий легкие цепи разных классов. Редко отмечается IgD и IgE миелома. Определение концентрации парапротеина используют для контроля эффективности лечения миеломы, такой мониторинг при миеломе на фоне терапии должен осуществляться каждые 3 месяца. Если содержание парапротеина снизилось ниже детектируемого, повторное измерение целесообразно проводить через 6 или 12 месяцев. 

Макроглобулинемия Вальденстрема представляет собой лимфому с гиперпродукцией моноклонального IgM. Лимфоплазмацитарные опухолевые клетки с характерным иммунофенотипом диффузно распределены в лимфатических узлах, селезенке и костном мозге. Высокая концентрация моноклонального IgM часто превышает 30 г/л и приводит к увеличению вязкости крови и ряду клинических проявлений, включающих спутанность сознания, слепоту, склонность к кровоточивости, сердечную недостаточность и гипертензию. При макроглобулинемии часто отмечается парапротеинемическая полинейропатия, холодовая гемолитическая анемия и криоглобулины. При других разновидностях лимфом и хроническом лимфолейкозе парапротеины класса IgM отмечается у 20% больных, однако концентрация парапротеина обычно ниже, чем 30 г/л.  

Болезнь тяжелых цепей (болезнь Франклина) сопровождается синтезом только тяжелой цепи IgG-гамма, без сопутствующей легкой цепи. Это крайне редкое заболевание проявляется отеком мягкого неба и лимфоидной инфильтрацией. Также редко отмечается болезнь тяжелых цепей альфа, при которой возникает хроническая диарея, нарушение всасывания, обусловленные лимфоидной инфильтрацией стенки кишки. 

Моноклональный парапротеин может быть обнаружен при ряде неопухолевых заболеваний, в частности, при эссенциальной криоглобулинемии (чаще IgM), парапротеинемической хронической полинейропатии, холодовой гемолитической анемии, АL-амилоидозе почек (свободные цепи лямбда), и внутренних органов, болезни отложения легких цепей. Парапротеин в сыворотке крови отмечается также при болезни Кастелмана (IgM/лямбда), POEMS-синдроме (полинейропатия с органной мегалией) и микседематозном лишае (IgG/каппа). 

При скрининговых обследованиях частота выявления парапротеинемии резко увеличивается в популяции после достижения 50 лет и достигает 4–10% у лиц старше 65 лет. Однако большинство впервые выявленных парапротеинемий в общей популяции представляют собой бессимптомные моноклональные гаммапатии невыясненного значения (МГНЗ). Концентрация парапротеина при МГНЗ существенно ниже 30 г/л и обычно не превышает 10–15 г/л. Кроме того, при МГНЗ парапротеин выявляется на фоне поликлональных иммуноглобулинов, т. е. угнетения нормального синтеза других иммуноглобулинов не происходит. Термин «МГНЗ» указывает на случаи парапротеинемии без других признаков онкогематологического заболевания, которые требуют ежегодного мониторинга, чтобы не пропустить момента озлакачествления процесса. При выявлении парапротеинов у обследованных моложе 50 лет необходимы еще более частые повторные обследования, поскольку у них отмечается высокий риск развития множественной миеломы. Если концентрация М-белка составляет более 15 г/л, вне зависимости от возраста рекомендуется проводить расширенное обследование, включающее электрофорез 24-часового образца мочи и иммунофиксацию каждые 3–6 месяцев, поскольку риск злокачественной трансформации очень высок. Выделяют доброкачественную парапротеинемияю, которая характеризуется сохранением парапротеина без прогрессирования в множественную миелому или другое заболевание в течение 5 лет наблюдения. При транзиторной парапротеинемии концентрация парапротеина обычно ниже 3 г/л.

Каков принцип электрофореза в агарозном геле? — MVOrganizing

Каков принцип электрофореза в агарозном геле?

Принцип: Отрицательно заряженные молекулы ДНК перемещаются к положительному заряду под действием постоянного тока, таким образом, разделение зависит от массы и заряда ДНК. Молекулы ДНК вынуждены перемещаться через поры геля агарозы.

Для чего нужен электрофорез в агарозном геле?

Электрофорез в агарозном геле используется для разделения фрагментов ДНК на основе их молекулярной массы.Более мелкие фрагменты мигрируют быстрее, чем более крупные; расстояние, которое проходит на геле, изменяется обратно пропорционально логарифму молекулярной массы.

Каков принцип электрофореза?

Принципы. Электрофорез — это общий термин, который описывает миграцию и разделение заряженных частиц (ионов) под действием электрического поля. Электрофоретическая система состоит из двух электродов с противоположным зарядом (анод, катод), соединенных проводящей средой, называемой электролитом.

Каковы этапы гель-электрофореза?

Существует несколько основных этапов проведения гель-электрофореза, которые будут описаны ниже; 1) заливка геля, 2) подготовка образцов, 3) загрузка геля, 4) запуск геля (воздействие на него электрического поля) и 5) окрашивание геля.

Каковы применения гель-электрофореза?

Применение гель-электрофореза

• При разделении фрагментов ДНК для снятия отпечатков ДНК для расследования места преступления.
• Для анализа результатов полимеразной цепной реакции.
• Для анализа генов, связанных с определенным заболеванием.
• В профилировании ДНК для таксономических исследований для различения различных видов.

Как приготовить агарозный гель для гель-электрофореза?

1. Приготовление геля

1. Взвешивают соответствующую массу агарозы в колбу Эрленмейера. Гели агарозы готовят с использованием процентного раствора вес / объем.
2. Добавьте рабочий буфер в колбу, содержащую агарозу.Вращайте, чтобы перемешать.
3. Расплавить смесь агарозы / буфера.
4. Добавить бромид этидия (EtBr) до концентрации 0,5 мкг / мл.

Почему чаще всего используется 1% -ный агарозный гель?

1% гелей часто используют для стандартного электрофореза. Гели с высоким процентным содержанием часто бывают хрупкими и не могут схватываться равномерно, в то время как гели с низким процентным содержанием (0,1-0,2%) хрупкие и с ними нелегко обращаться. Гели агарозы с низкой температурой плавления (LMP) также более хрупкие, чем гель нормальной агарозы.

Что бы произошло, если бы вы использовали воду для приготовления и прогона геля вместо буфера TAE?

1.Если вы используете воду вместо буфера для геля или рабочего буфера… Агарозные гели отливают и обрабатывают с использованием буфера. Если вы все же используете воду, гель расплавится вскоре после подачи напряжения на блок электрофореза.

Как бромид этидия связывается с ДНК?

Этидий связывается, вставляя себя между сложенными основаниями в двухцепочечной ДНК. При этом они искажают двойную спираль и мешают репликации ДНК, транскрипции, репарации ДНК и рекомбинации. Вот почему интеркалирующие агенты часто являются сильнодействующими мутагенами.

Почему SYBR Green связывается с ДНК?

Флуоресцентный краситель SYBR Green I связывается с малой бороздкой двойной спирали ДНК. Связывание ДНК приводит к резкому увеличению количества молекул SYBR Green I, излучающих свет при возбуждении. Во время удлинения все больше и больше молекул красителя связываются с вновь синтезированной ДНК.

Почему бромистый этидий флуоресцирует с ДНК?

Бромид этидия представляет собой интеркалирующий агент, напоминающий пару оснований ДНК. Благодаря своей уникальной структуре он может легко вставляться в цепь ДНК.Причиной интенсивной флуоресценции бромистого этидия после связывания с ДНК является гидрофобная среда между парами оснований.

Каковы две основные функции загрузочного красителя при электрофорезе?

Каковы две основные функции загрузочного буфера при гель-электрофорезе? Чтобы сделать образец более плотным, чтобы образец упал в лунки, а также чтобы предоставить маркеры красителя, которые позволят вам видеть образец во время его загрузки и предоставить вам информацию о разделении образцов на геле во время его работы.

Почему при гель-электрофорезе две полосы?

Гелевая матрица действует как сито: более мелкие молекулы ДНК мигрируют быстрее, чем более крупные, поэтому молекулы ДНК разного размера разделяются на отдельные полосы во время электрофореза.

Какого цвета краситель помогает увидеть, что ДНК перемещается в гель?

Бромид этидия имеет оранжевый цвет в видимом свете, но его реальная сила обнаружения проявляется в ультрафиолетовом диапазоне длин волн. В УФ-свете краситель ярко флуоресцирует.Поэтому, чтобы увидеть ДНК, гель помещают на источник УФ-света (рис. 18).

Что делает гель-электрофорез с ДНК?

Гель-электрофорез — это метод разделения фрагментов ДНК по размеру. Образцы ДНК загружают в лунки (углубления) на одном конце геля, и электрический ток пропускает их через гель. Фрагменты ДНК заряжены отрицательно, поэтому они движутся к положительному электроду.

Почему электрофорез в агарозном геле проводится горизонтально?

Горизонтальный гель-электрофорез. Поскольку ДНК и РНК имеют отрицательный заряд, они перемещаются с отрицательного конца на положительный.Гель агарозы содержит маленькие поры, которые позволяют перемещаться маленьким молекулам. Следовательно, после приложения электрического поля ДНК и РНК начинают мигрировать.

Для чего нужен тест для гель-электрофореза?

Для чего используется электрофорез в агарозном геле? анализ нуклеиновых кислот и белков. разделяет молекулы на основе скорости их движения через гель под действием электрического поля. Используется для определения наличия и размера продуктов ПЦР.

Что не может быть поводом к использованию электрофореза?

9.Когда не применяют электрофорез? Пояснение: Электрофорез нельзя использовать для разделения липидов.

Что подразумевается под электрофорезом?

Электрофорез — это лабораторный метод, используемый для разделения молекул ДНК, РНК или белков в зависимости от их размера и электрического заряда. Электрический ток используется для перемещения разделяемых молекул через гель. Условия, используемые во время электрофореза, можно отрегулировать для разделения молекул в желаемом диапазоне размеров.

Что такое электрофорез, приведу пример?

Электрофорез — это электрокинетический процесс, при котором заряженные частицы в жидкости разделяются с помощью поля электрического заряда.Это наиболее часто используется в науках о жизни для разделения молекул белка или ДНК и может быть достигнуто с помощью нескольких различных процедур в зависимости от типа и размера молекул.

Что такое электрофорез и его виды?

Электрофорез — это метод, используемый для разделения макромолекул в жидкости или геле в зависимости от их заряда, сродства связывания и размера под действием электрического поля. Анафорез — это электрофорез частиц или анионов с отрицательным зарядом, тогда как катафорез — это электрофорез ионов или катионов с положительным зарядом.

Что такое электрофорез со схемой?

Электрофорез — это метод разделения, основанный на подвижности ионов в электрическом поле. Ионы имеют разную скорость миграции в зависимости от их общего заряда, размера и формы, и поэтому их можно разделить. Этот метод используется, в частности, для макромолекул, таких как белки.

Сколько существует видов электрофореза?

восемь типов

Что вы подразумеваете под электрофорезом 12 класса?

Электрофорез.Электрофорез. Движение коллоидных частиц под действием электрического поля называется электрофорезом. Отрицательно заряженные частицы движутся к катоду, а положительно заряженные частицы движутся к аноду.

Для чего используется капиллярный электрофорез?

Капиллярный электрофорез или КЭ — это метод, используемый в химическом анализе для разделения молекул в электрическом поле по размеру и заряду. Капиллярный электрофорез проводится в трубке субмиллиметрового диаметра, называемой капилляром, которая содержит текущий раствор электролита.

В чем разница между капиллярным электрофорезом и гель-электрофорезом?

Но в отличие от обычного гель-электрофореза, который разделяет молекулы, когда они мигрируют через пластинчатую гелевую матрицу, капиллярный электрофорез разделяет молекулы, когда они движутся по внутренней части небольшой капиллярной трубки, заполненной проводящим жидким буфером, а не гелем. .

На чем основано разделение при электрофорезе?

Электрофорез — это метод разделения, основанный на миграции заряженных частиц в поддерживающей среде (жидкости или гидрофильном геле) под действием электрического поля.

В чем причина электрофореза?

Это в конечном итоге вызвано наличием заряженной границы раздела между поверхностью частицы и окружающей жидкостью. В этом методе применяется отрицательный заряд, поэтому белки движутся к положительному заряду. Электрофорез широко используется в анализе ДНК, РНК и белков.

Принцип, применение и типы электрофореза

Электрофорез

Электрофорез — это важнейший физический лабораторный метод анализа нуклеиновых кислот.Он включает соединения, которые могут приобретать электрический заряд в проводящих электродах. По сути, это движение заряженных частиц под действием внешнего электрического поля.

Этот метод используется для разделения и анализа нуклеиновых кислот, то есть ДНК, РНК и белков. Разделение основано на размере, заряде, плотности и чистоте молекул.

Принцип электрофореза

Это разделение или очистка белков, ДНК и РНК, которые различаются по заряду, размеру и конформации.

Заряженные молекулы помещаются с одного конца в соответствии с их зарядом, и к ним прикладывается электрическое поле. При прохождении тока они начинают мигрировать к противоположному электроду, который может быть как положительным, так и отрицательным электродом.

Размер, форма и заряд молекулы остаются постоянными во время электрофореза и определяют подвижность ионных частиц.

Факторы, влияющие на электрофорез

Концентрация агарозы

Концентрации и размер молекул обратно пропорциональны.Более высокие концентрации способствуют разделению ДНК небольшого размера, а низкие концентрации способствуют разделению больших молекул.

Напряжение

При приложении напряжения большие фрагменты движутся быстрее, чем маленькие. Заряд равномерно распределен, поэтому более крупные молекулы будут иметь больше заряженных групп.

Тепло

Энергия, генерируемая при большинстве типов электрофореза, рассеивается в виде тепла. Это тепло увеличивает скорость диффузии ионов образца и буферного раствора, тем самым расширяя разделенный образец.

Применение электрофореза

• Определение размеров молекул нуклеиновых кислот
• Фрагментация ДНК для Саузерн-блоттинга
• Фрагментация РНК для Нозерн-блоттинга
• Фрагментация белка для Вестерн-блоттинга
• Аналитическое разделение продуктов ПЦР
• Обнаружение и анализ мутаций или вариации в последовательностях.

Типы электрофореза

Электрофорез на бумаге

Электрофорез на бумаге — один из простейших методов электрофореза.Образец наносят на торец полоски фильтровальной бумаги, такой как Whatman № 1 и № 3 мм, который был увлажнен буферным раствором.

Затем каждый конец полосы погружают в отдельные емкости, состоящие из буферного раствора и различных электродов (анода или катода). Затем используется электрический ток, и образец перемещается к электроду с противоположной полярностью. Когда процесс завершен, полоска сушится и визуализируется системой обнаружения.

Бумажный электрофорез часто сравнивают с бумажной хроматографией. Разделение в хроматографии основано на полярности, тогда как разделение в электрофорезе основано на зарядах в электрическом поле.

Зональный электрофорез

Включает миграцию заряженной частицы на поддерживающую среду. Разделенные компоненты распределяются в дискретную зону на поддерживающей среде. Поддерживающая среда заполняется буферным раствором, небольшой объем образца наносится узкой полосой.

При приложении разности потенциалов на концах полоски части перемещаются со скоростью, определяемой их электрофоретической подвижностью.

Используется в биохимическом анализе. Его недостатком является то, что из-за наличия поддерживающей среды возникают такие технические проблемы, как движение капилляров, электроосмос, адсорбция и молекулярное просеивание.

Непрерывный электрофорез

Используется в препаративных целях. Предварительно определенный объем пробы 0.2 мл / мин через клапанное устройство постоянно используется в центре бумаги. Можно использовать силикагель, порошковое стекло, песок и агаровый гель.

Применяется разность потенциалов 500 В. Чистые вещества собираются в разные емкости, растворитель выпаривается, а чистые фракции рециркулируются. После полного электрофореза фильтр удаляется из устройства и окрашивается, чтобы определить местонахождение сегрегированных компонентов.

Электрофорез в агарозном геле

Агароза представляет собой полисахарид, который образует поры размером от 100 до 300 нм.Размер поры коррелирует с концентрацией агарозного геля. Чем больше концентрация агарозного геля, тем меньше размер пор, и наоборот.

Электрофорез в агарозном геле часто используется для разделения фрагментов ДНК или РНК разной длины. Он включает в себя движение отрицательно заряженных частиц ДНК или РНК от отрицательного электрода к положительному. Частицы разделяются в зависимости от их молекулярного размера.

Полиакриламид (PAGE)

Электрофорез с помощью полиакриламида (также называемый PAGE) обычно используется для разделения белков на основе размера молекулы и отношения заряда к массе.С помощью вертикальных кусочков или геля, встроенных в вертикальные стержни или цилиндры, исследователи могут разделить ДНК из 100 пар оснований или меньше и проанализировать отдельные белки в сыворотке (например, генетические варианты, изоферменты).

Помимо простоты и скорости разделения, он имеет лучшее преимущество, заключающееся в том, что гели стабильны в широком диапазоне pH и температуры, и могут образовываться гели с разным размером пор.

Электрофорез в импульсном поле

Гель-электрофорез в импульсном поле — это метод, используемый для разделения крупных частиц ДНК путем приложения к гелевой матрице электрического поля, которое иногда меняет направление.

В то время как в целом маленькие кусочки могут проходить через гелевую матрицу легче, чем большие кусочки ДНК, существует предельная длина, превышающая 30–50 т.п.н., при которой все большие фрагменты будут работать с одинаковой скоростью и проявляться в геле как единое целое. большая диффузная полоса.

Тем не менее, при регулярном изменении направлений поля ДНК различной длины реагируют на это изменение с разной скоростью. С течением времени при постоянной смене направлений каждая полоса начнет отделяться все больше и больше, даже на огромных участках.Таким образом, возможно разделение больших фрагментов ДНК с использованием PFGE.

Капиллярный электрофорез

Принцип электрофореза заключается в том, что заряженные молекулы будут перемещаться к противоположному полюсу и будут отличаться друг от друга в зависимости от физических характеристик.

Капиллярный электрофорез превратился в набор из серии стратегий разделения, которые включают приложение высокого напряжения к капиллярам, ​​заполненным буфером, для достижения разделения.

Капиллярный электрофорез — это метод проведения электрофореза в заполненных буфером капиллярах с узким отверстием, как правило, с внутренним размером (ID) от 25 до 100 мм. Используется высокое напряжение (обычно 10-30 кВ). Капилляры обычно имеют внутренний диаметр 50 мкм и длину от 0,5 до 1 м. За счет электроосмотического потока все элементы образца движутся к отрицательному электроду.

Стандартный электрофорез

Стандартный электрофорез — это традиционная и наиболее широко используемая в научных лабораториях технология разделения белков и нуклеиновых кислот.

Этот метод обычно выполняется на куске геля прямоугольной формы и также называется «зонным электрофорезом», учитывая, что он может вместить несколько образцов и контролей на одном геле и может использоваться для разделения растворенных веществ за один цикл.

Его также можно использовать для разделения белков, изоферментов, липопротеинов и гемоглобина в спинномозговой жидкости и моче.

Электрофорез в агарозном геле — приборы

• Электрофорез в агарозном геле — это метод гель-электрофореза, используемый в биохимии, молекулярной биологии, генетике и клинической химии для разделения смешанной популяции макромолекул, таких как ДНК, РНК или белки, в матрице агарозы.
• Агароза — это натуральный линейный полимер, извлеченный из морских водорослей, который образует гелевую матрицу за счет водородных связей при нагревании в буфере и охлаждении.
• Они являются наиболее популярной средой для разделения нуклеиновых кислот среднего и большого размера и имеют широкий диапазон разделения.

Принцип электрофореза в агарозном геле

Гель-электрофорез разделяет фрагменты ДНК по размеру в твердой среде-носителе, такой как агарозный гель.Образец (ДНК) пипеткой вносится в лунки для образцов, после чего прикладывается электрический ток, который вызывает миграцию отрицательно заряженной ДНК (электрофорез) к анодному положительному (+ ve) концу. Скорость миграции пропорциональна размеру: более мелкие фрагменты перемещаются быстрее и сворачиваются на дно геля.

ДНК

визуализируется включением в гель интеркалирующего красителя бромистого этидия. Фрагменты ДНК захватывают краситель, когда они мигрируют через гель. Освещение ультрафиолетовым светом вызывает флуоресценцию интеркалированного красителя.

Более крупные фрагменты флуоресцируют более интенсивно. Хотя каждый из фрагментов одного класса молекул присутствует в эквимолярных пропорциях, более мелкие фрагменты включают меньшую массу ДНК, поглощают меньше красителя и, следовательно, флуоресцируют менее интенсивно. «Лестничный» набор фрагментов ДНК известного размера может быть запущен одновременно и использоваться для оценки размеров других неизвестных фрагментов.

Требования к приборам для электрофореза в агарозном геле

Оборудование и материалы, необходимые для проведения электрофореза в агарозном геле, относительно просты и включают:

1. Камера для электрофореза и источник питания
2. Лотки для литья под гель , которые доступны в различных размерах и изготовлены из прозрачного для УФ-излучения пластика.Открытые концы лотков закрывают лентой во время заливки геля, затем удаляют перед электрофорезом.
3. Гребни для образцов , вокруг которых наливается расплавленная среда для формирования лунок для образцов в геле.
4. Буфер для электрофореза , обычно трис-ацетат-EDTA (TAE) или трис-борат-EDTA (TBE).
5. Загрузочный буфер , который содержит что-то плотное (например, глицерин), позволяющее образцу «упасть» в лунки для образца, и один или два отслеживающих красителя, которые мигрируют в геле и позволяют визуально контролировать или насколько далеко продвинулся электрофорез. .
6. Окрашивание : Молекулы ДНК легко визуализируются под ультрафиолетовой лампой при электрофорезе в присутствии примеси бромистого фтора этидия. Альтернативно, нуклеиновые кислоты можно окрашивать после электрофоретического разделения, пропитывая гель раствором бромистого этидия. При интеркалировании в двухцепочечную ДНК флуоресценция этой молекулы сильно увеличивается. Также возможно обнаружение ДНК с помощью примесного фтор-1-анилино-8-нафталинсульфоната.
7. Трансиллюминатор (бокс для ультрафиолетового излучения), который используется для визуализации окрашенной ДНК в гелях.

этапов электрофореза в агарозном геле

1. Для приготовления геля порошок агарозы смешивают с буфером для электрофореза до желаемой концентрации и нагревают в микроволновой печи для его плавления.

Концентрация геля агарозы

• Процент используемой агарозы зависит от размера фрагментов, которые необходимо разделить.
• Концентрация агарозы определяется как процентное соотношение агарозы к объему буфера (мас. / Об.), А гели агарозы обычно находятся в диапазоне 0.От 2% до 3%.
• Чем ниже концентрация агарозы, тем быстрее мигрируют фрагменты ДНК.
• В общем, если целью является разделение больших фрагментов ДНК, следует использовать низкую концентрацию агарозы, а если целью является разделение мелких фрагментов ДНК, рекомендуется высокая концентрация агарозы.

2. Бромид этидия добавляют к гелю (конечная концентрация 0,5 мкг / мл) для облегчения визуализации ДНК после электрофореза.
3. После охлаждения раствора примерно до 60 ° C его выливают в лоток для литья, содержащий гребенку для образцов, и дают ему затвердеть при комнатной температуре.
4. После затвердевания геля гребенку удаляют, стараясь не порвать дно лунок.
5. Гель, все еще находящийся в пластиковом лотке, горизонтально вставляется в камеру для электрофореза и покрывается буфером.
6. Образцы, содержащие ДНК, смешанную с загрузочным буфером, затем пипеткой вносятся в лунки для образцов, крышка и провода питания помещаются на устройство и подается ток.
7. Прохождение тока можно проверить, наблюдая за пузырями, выходящими из электродов.
8. ДНК будет перемещаться к положительному электроду, который обычно окрашен в красный цвет ввиду его отрицательного заряда.
9. Расстояние, на которое ДНК мигрировала в геле, можно определить, визуально наблюдая за миграцией отслеживающих красителей, таких как бромфеноловый синий и ксилолцианоловый красители.

Применение электрофореза в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле — это обычно используемый метод разделения белков, ДНК или РНК.

• Оценка размеров молекул ДНК
• Анализ продуктов ПЦР, e.грамм. в молекулярно-генетической диагностике или генетическом дактилоскопировании
• Разделение рестриктированной геномной ДНК перед Саузерн-анализом или РНК перед Нозерн-анализом.
• Электрофорез в агарозном геле широко используется для оценки размера фрагментов ДНК после переваривания рестрикционными ферментами, например при рестрикционном картировании клонированной ДНК.
• Электрофорез в агарозном геле обычно используется для разделения кольцевой ДНК с разной топологией суперспирализации, а также для разделения фрагментов, которые различаются из-за синтеза ДНК.
• Помимо обеспечения превосходной среды для анализа размера фрагментов, агарозные гели позволяют очищать фрагменты ДНК. Поскольку очистка фрагментов ДНК, разделенных по размеру в агарозном геле, необходима для ряда молекулярных методов, таких как клонирование, жизненно важно иметь возможность очищать представляющие интерес фрагменты из геля.

Преимущества электрофореза в агарозном геле

• Для большинства применений требуется только однокомпонентная агароза и катализаторы полимеризации не требуются.Следовательно, гели агарозы легко и быстро приготовить.
• Гель легко наливается, не денатурирует образцы.
• Образцы также можно восстановить.

Недостатки электрофореза в агарозном геле

• Гели могут плавиться во время электрофореза.
• Буфер может быть исчерпан.
• Различные формы генетического материала могут проявляться в непредсказуемых формах.

Список литературы

1. https: // pdfs.semanticscholar.org/36cf/d4ada922c44d233b6ebfa2af2c956c92e4ec.pdf
2. https://www.mun.ca/biology/scarr/Gel_Electrophoresis.html
3. https://www.wou.edu/las/physci/ch562/Gel%20Electrophoresis.pdf
4. https://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis
5. https://msu.edu/course/css/451/Lecture/PT-electrophoresis%20(2009).pdf
6. http://library.umac.mo/ebooks/b28050459.pdf

(PDF) Принципы разделения нуклеиновых кислот с помощью электрофореза в агарозном геле

Электрофорез в геле — принципы и основы

40

Однако количество надрезов ДНК намного ниже при 302 нм по сравнению с 254 нм.

Если SYBR Green будет использовать вместо бромистого этидия, еще одно 10-20-кратное увеличение чувствительности

с использованием традиционных методов съемки изображений вполне возможно.

Для обнаружения ДНК, окрашенных этим красителем, необходимо использовать желтый или зеленый желатиновый или целлофановый фильтр

с камерой вместе с освещением УФ-светом с длиной волны 300 нм.

4. Справочные материалы

Blasiak J, Trzeciak A, Malecka-Panas E, Drzewoski J & Wojewódzka M (2000).In vitro

Генотоксичность

этанола и ацетальдегида в лимфоцитах человека и

клетках слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Токсикология in Vitro 14 (4): 287–295.

Боффи, С. А. (1984). Выделение высокомолекулярной ДНК, в «Методы молекулярной биологии»

, т. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana, Totowa, NJ, 333-341.

Brody, J.R. & Kern, S.E. (2004). История и принципы создания токопроводящих сред для стандартного электрофореза ДНК

.Анальная биохимия. 333 (1): 1-13.

Корли, Р. Б. (2005). Руководство по методам в биомедицинских науках. ISBN: 0-387-22845-4

Харрингтон, Р. (1993). Исследование изгиба и гибкости ДНК с помощью электрофореза в геле

. Электрофорез. 14,732-746.

Джин X., Юэ С., Уэллс К.С. И певец В. (1994). SYBR Green: I. Новый флуоресцентный краситель optomized

для обнаружения пикограммовых количеств ДНК в гелях. Биофиз. J., 66, с. A159.

Lodge J, Лунд П.И Минчин С. (2007). Клонирование генов: принципы и приложения. ISBN 0-

7487-6534-4.

Крындушкин Д.С., Александров И.М., Тер-Аванесян М.Д., Кушниров В.В. (2003). [PSI +]

агрегатов прионов образуются небольшими полимерами Sup35, фрагментированными

Hsp10. Journal of Biological Chemistry. 278 (49): 49636.

Lane, D., Prentki, P. & Chandler, M. (1992). Использование гелевой задержки для анализа взаимодействия белков, нуклеиновых кислот

и

. Микробиологические обзоры.56,509-528.

Lewis M. Электрофорез в агарозном геле (основной метод). Биологические протоколы. Дата обращения 2011.

Лу И и Моримото К. (2009). Связано ли привычное употребление алкоголя со снижением

электрофоретической миграции ДНК в лейкоцитах периферической крови у японцев мужского пола с дефицитом ALDh3-

. Мутагенез. 24 (4): 303–308.

Мадруга М.Х., Москателло Д.К., Эмлет Д.Р., Дитерих Р. и Вонг А.Дж. (1997). Связанное с Grb2 связывающее вещество

опосредует активацию фосфатидилинозитол-3-киназы и способствует выживанию клеток

за счет нового фактора роста.Proc. Natl. Акад. Sci.Vol. 94, pp. 12419–12424

Rapley R., (2000). Справочник протоколов нуклеиновых кислот. ISBN 0-89603-459-3.

Саху Л. (2007). Лаборатория биотехнологии растений. руководство по эксплуатации.

Сэмбрук Дж. И Рассел Д.В. (2001). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство, 3-е изд. Cold

Лабораторный пресс Spring Harbor. Колд-Спринг-Харбор, штат Нью-Йорк.

Шарп П.А., Сагден Б. и Сэмбрук Дж. (1973). Обнаружение двух активностей рестрикционной эндонуклеазы

в Haemophilus parainfluenzae с помощью аналитического электрофореза в агарозо-этидийбромиде

.Биохимия. 12: 3055-3063.

http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis/

http://ocw.mit.edu/courses/biological-engineering/20-109-laboratory-fundamentals-in-

bio- engineering-fall-2007 / labs / mod1_2 /

http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Agarose_Gel_Electrophoresis

http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf

www.intechopen.com

Методы: электрофорез

Методы: электрофорез

23.04.2006

В предыдущей лабораторной работе мы обсуждали движение частицы
в текучей среде, где осаждающая сила была гравитационным притяжением (на
текущей жидкости), а противодействующая сила была силой трения, пропорциональной
скорость частицы.Эти силы действуют в противоположных направлениях и в конечном итоге уравновешивают
друг друга, приводя к равномерному движению частицы в подвижной жидкой среде
(т.е. частица движется с постоянной скоростью). Если внешнее поле представляет собой электрическое поле
вместо гравитационного поля макромолекула реагирует двумя способами.
внешнее поле. Если молекула заряжена, она будет мигрировать в электрическом поле в
электрод противоположного заряда. Это принцип, лежащий в основе техники
электрофорез.Если макромолекула имеет асимметричное распределение заряда (т. Е. Имеет
постоянный дипольный момент), молекула будет стремиться ориентироваться в электрическом поле. Этот
Принцип лежит в основе методов электрического двойного лучепреломления и дихроизма.
Мы обсудим только электрофорез.

Рассмотрим простой случай, когда заряженная частица (+ Q) движется
в электрическом поле (E) в непроводящей среде, такой как вода. Если частица
движется с постоянной скоростью к катоду (- электроду), результирующая сила F _до
на частице равно 0 (поскольку F = ma, а ускорение (a) частицы равно 0 при
постоянная скорость).На частицу действуют две силы: одна F _E , сила
действующее на заряженную частицу полем в направлении движения
(по направлению к катоду), а другой, F _f , сила трения на заряженном
частица, которая замедляет свое движение к катоду и, следовательно, находится в направлении
против движения (к анодному (+) электроду). Это показано на схеме.
ниже:

Следовательно:

(1) F _до = F _e + F _f = 0,
где
(2) F _e = QE (электрическая сила) и
(3) F _f = -fv (сила трения),

, где v — скорость частицы, а f — константа, называемая фрикционной.
коэффициент.Уравнение (3) показывает, что сила F _f , препятствующая движению в направлении
катод пропорционален скорости частицы. Это интуитивно понятно, так как можно было бы
ожидайте, что чем выше скорость, тем больше у F _f , что будет препятствовать
движение. Коэффициент трения зависит от размера и формы молекулы. В
чем больше молекула, тем больше коэффициент трения (т.е. больше сопротивление движению
молекулы). Можно показать, что коэффициент трения для сферической частицы
определяется выражением

(4) f = 6πηR _s ,

, где η —
вязкость (мера сопротивления течению жидкости — вода имеет низкую вязкость, реальную
кленовый сироп высокой вязкости), а R _s (радиус Стокса) — радиус
гидратная сфера (чем больше R _s , тем больше коэффициент трения, тем больше
больше F _f , который сопротивляется движению к катоду).Из (1), (2) и (3),
F _e = F _f или

(5) QE = fv.

Следовательно, v / E = Q / f = U = электрофоретическая подвижность, или

(6) U = v / E = Q / 6πηR _s .

Следовательно, электрофоретическая подвижность U равна
пропорциональна плотности заряда (заряд / размер, Q / R _s ) частицы.
Таким образом, электрофорезом можно разделить макромолекулы с разной плотностью заряда. Этот
обсуждение касается простейшего случая, так как в действительности противоионы находятся в
раствор (из солей), который образует облако вокруг заряженной макромолекулы, и
частично экранировать заряженную частицу от электрического поля E.

Современный электрофорез проводят в твердых гелях (например,
как полиакриламид), которые образуются из жидких растворов акриламида после добавления
полимеризующего агента. Твердый гель пористый для растворенных веществ и молекул растворителя и
служит средой для электрофореза, помогая устранить силы конвекции в
жидкость, которая может помешать разделению. Электрофоретический эксперимент был
проводились на космическом шаттле в условиях невесомости с целью предотвращения таких
возмущения.

Одна сложность, которая влияет на это идеализированное описание
электрофорез в полиакриламидных гелях заключается в том, что гели имеют поры, через которые
макромолекулы движутся. Как и в гель-хроматографии, более мелкие молекулы могут проходить через
поры легче, чем более крупные молекулы, поэтому существует дополнительный механизм просеивания, который
способствует эффективной подвижности (кроме того, гель может изменять локальные
эффективное электрическое поле). Просеивающий эффект геля фактически увеличивает разрешающую способность.
сила этой техники.

Было установлено, что действующий электрофоретический
подвижность белка U является функцией подвижности белка в концентрированном
раствор сахарозы (Uo) и T, общая концентрация акриламида в полимеризованном
гель. Чем выше концентрация акриламида в растворе неполимеризованного геля, тем
меньший размер пор в полимеризованном геле. Уравнение, показывающее взаимосвязь
между U, Uo и T показано ниже:

log U = log Uo — K _r T,

где K _r — наклон графика log U от T для данного белка.Так как K _r
является функцией радиуса молекулы, можно определить молекулярную
веса белковой молекулы путем проведения нескольких электрофоретических разделений в гелях
различные концентрации акриламида (T) и экстраполяция результатов на T = 0, следовательно,
устранение эффектов размера пор. Однако проблемы возникают, если белки не сфероидальные.
в форме

Есть ли способ получить информацию о молекулярной массе в
в дополнение к определению чистоты на одном геле ?.Что было бы, если бы два разных
белки, каждый с одинаковой молекулярной массой и общим чистым зарядом, но разной формы,
были запущены на одном акриламидном геле? Тот, имеющий более вытянутую форму (большие Стокса
радиус) будет иметь более низкую электрофоретическую подвижность (U = Q / 6πηR _s ). А
более высокие Rs также могут вызвать более медленное проникновение белка в поры. Следовательно, оба
электрофоретическая подвижность и просеивающие эффекты могут привести к аномальной работе этого белка
медленные и имеют более высокую кажущуюся молекулярную массу.Также представьте себе два глобулярных белка
разного размера, но с разницей в компенсирующем заряде, что может позволить двум белкам
перемещаться в геле с той же скоростью.

Обычный метод, используемый для упрощения интерпретации
Электрофоретические прогоны в одном геле предназначены для прогона геля в денатурирующих условиях. В
денатурирующий агент обычно представляет собой додецилсульфат натрия (SDS), который является ионным детергентом.
со структурой CH ₃ (CH ₂ ) ₁₀ CH ₂ OSO ₃ ^—
(одноцепочечный амфифил).Этот детергент связывается с большинством белков и денатурирует их,
около 1,4 г связывания SDS / г белка (около 1 SDS / 2 аминокислоты). Поскольку есть 1
отрицательный заряд / SDS, связывание SDS маскирует любой из зарядов на белке и дает
все белки имеют общий большой отрицательный заряд. Дополнительно , комплексы SDS-белки
как правило, имеют удлиненную цилиндрическую форму. Поскольку сумма
Связанный SDS на единицу массы белка постоянен, общая плотность заряда на всех белках
аналогична, поэтому электрофоретическая подвижность определяется только эффектами просеивания.SDS
также устраняет различия в форме белков в качестве переменной, определяющей просеивание,
поскольку все белки имеют одинаковую стержневидную форму. (Использование SDS аналогично
использование 8M мочевины в гель-хроматографическом разделении белков для определения
молекулярные массы). Подвижность становится только функцией молекулярной массы
белок, а не форму. Молекулярная масса неизвестного белка может быть определена с помощью
сравнение положения белка на полиакриламидном геле SDS с рядом известных
стандарты молекулярной массы, из которых можно построить линейный график зависимости ln Mr от R _f .
используется для расчета неизвестной молекулярной массы.Это похоже на анализ в геле.
хроматографии, где ln Mr — линейная функция от K _avg , распределение
коэффициент, когда гель работает в денатурирующих условиях. Однако некоторые белки работают
аномально на таких гелях (из-за неполного или избыточного связывания SDS), поэтому альтернатива
вместе с этим следует использовать методы определения молекулярной массы.
техника.

Белки обычно нагревают в SDS до 100 ^o ° C для
3 минуты в присутствии восстановителя, такого как b-меркаптоэтанол, до полного
денатурировать белок в белок палочковидной формы.Кажущаяся молекулярная масса может быть получена
в невосстанавливающих условиях (без b-ME), но их следует считать просто
оценки. Бегущие белки как в присутствии, так и в отсутствие восстановителя могут
предоставляют важную информацию о субъединичной структуре белка. Мультимерный белок
субъединицы которого удерживаются вместе дисульфидными связями, могут быть разделены на отдельные
компоненты при добавлении восстановителя. Если субъединицы удерживаются вместе
нековалентные межмолекулярные притяжения, белки будут работать одинаково под
денатурирующие условия (SDS), которые устраняют взаимодействия субъединиц, в присутствии или
отсутствие b-ME.Чтобы определить субъединичный состав белка, удерживаемого вместе
нековалентных взаимодействий, электрофорез следует проводить в отсутствие
денатурирующие агенты.

Примечание. Номенклатура электродов может сбивать с толку некоторые из
ты. Как упоминалось выше, катионы движутся к катоду (где восстановление
происходит), поэтому катод должен быть отрицательным. Точно так же анион движется к
анод (где происходит окисление), поэтому анод должен быть положительным. Это
противоположно тому, что вы могли бы вспомнить из общей или аналитической химии, когда
Вы обсуждали в первую очередь гальванические элементы.В гальванических элементах электрический
ток генерируется спонтанным набором окислительно-восстановительных полуреакций. Мы
имеют дело с электролитическими ячейками, например, при электролизе воды (2H ₂ O (l)
-> 2H ₂ (г) + O ₂ (г)) или при производстве Cl ₂ (г)
и Mg (ов) из водного электролита MgCl ₂ (водн.). В
электролитические ячейки, источник питания должен подавать ток, чтобы управлять
несамопроизвольные (термодинамически неблагоприятные) реакции, такие как описанные выше.
Посмотрите на обзорный рисунок ниже.

ТЕХНИКИ

В этой лаборатории вы установите SDS-полиакриламидный гель, нанесите
белков, хроматографически разделенных в предыдущей лаборатории, и выполнить
электрофорез. Результаты этой лаборатории должны помочь вам решить, какие белки элюируются в
различные фракции из экспериментов по G50 и ионному обмену. Кроме того, вам следует
уметь определять субъединичный состав белков.

Полимеризация и заливка геля:

Электрофорез проводят в пористой, но твердой среде,
для устранения любых проблем, связанных с конвекционными токами. Такие медиа формируются из
полимеризация жидкого раствора агарозы (используется в основном для электрофореза ДНК
фрагменты и очень большие белки) или акриламид. Полимеризация акриламида идет
инициируется добавлением персульфата аммония в присутствии тетраметилендиамина
(ТЕМЕД), вместе с димером акриламида (N, N’-метилен-бис (акриламид), связанным
ковалентно между амидными атомами азота акриламидов по метиленовой группе.В
Структура этих соединений показана ниже:

Свободнорадикальная полимеризация акриламида
инициируется добавлением персульфата аммония, который при растворении в воде образует свободный
радикалы, как показано ниже:

Радикал инициирует полимеризацию акриламида, как показано
ниже. ТЕМЕД, благодаря своей способности существовать как свободный радикал, действует как дополнительный
катализатор полимеризации.Однако жесткий гель образуется только тогда, когда
N, N’-метилен-бис (акриламид добавляется в смесь во время полимеризации, что
сшивает смежные полимеры акриламида, как показано ниже:

Количество бис, добавленного во время полимеризации, контролирует
степень сшивки и, следовательно, размер пор полимеризованного геля. Эффект
размер пор ПРОТИВ размера пор в гель-хроматографии. В обоих случаях большие белки
с трудом попадают в поры.В гель-хроматографии большое разделение белков
предпочтительно в подвижную жидкую фазу (объем пустот) и элюируются максимально БЫСТРО
из колонки. При электрофорезе большие белки, которые не могут легко проникнуть в поры
в геле, не так легко переносятся электрическим полем через гель и элюируются
самый МЕДЛЕННО . Размер пор нельзя контролировать так точно, как при изготовлении
смолы для гель-хроматографии.

Как белки перемещаются через гель? Вязкий белок
раствор накладывается на верхнюю часть геля в небольшой лунке, впрессованной в гель во время
процесс полимеризации.Нижняя и верхняя части геля вставляются в резервуары.
содержащий буферный раствор и соответствующий электрод. Электрическое поле равно
наносится, и белки мигрируют через гидратированный гель. Природа буфера
раствор в резервуаре и в полимеризованном геле важен. Компоненты
буфер не должен связываться с разделяемыми белками. Кроме того, pH среды
должны быть такими, чтобы белки имели соответствующий заряд, поэтому они будут мигрировать в
ожидаемое направление.

Прерывистый гель-электрофорез:

Обычно используется множество разновидностей электрофореза.
Гели можно полимеризовать в пробирках или пластинах, а также в присутствии или в отсутствие денатурирования.
агенты. Кроме того, данная плита может состоять из двух отдельных плит, полимеризованных одна на
друг над другом, каждый с разной концентрацией акриламида и pH. Этот тип
называется прерывистым рН-гель-электрофорезом или дисковым электрофорезом.Мы будем использовать это
техника в сегодняшней лаборатории. Два различных геля для измерения pH и концентрации акриламида (
гель для укладки и гель для бега) показаны на рисунке ниже.

Укладочный гель представляет собой акриламид низкой концентрации (2-4%).
полимеризуется в буферном растворе Tris HCl (pH 6,5) на две единицы pH ниже, чем используется в
текущий гель и нижний резервуар (буфер Tris HCl, pH 8,7). Нижний или беговой гель
концентрация акриламида колеблется от 7-15%, в зависимости от молекулярной массы
белки, подлежащие разделению.Верхний буферный резервуар содержит Трис, забуференный слабым
кислоты, такой как глицин (pKa2 = 9,6), до того же pH, что и текущий гель.

Каковы преимущества разрешения прерывистого pH?
гелевая система? Основное преимущество заключается в том, что белки быстро подвергаются электрофорезу через
укладывать гель и «складывать» на границе между двумя гелями, прежде чем они
ввести гели. Это увеличивает компактность белков до того, как они попадут в
работает гель и увеличивает разрешение.Как работает этот процесс укладки? Когда
начинается электрофорез, ионы глицина из верхнего резервуара (при pH 8,7) поступают в
стекирующий гель, поскольку при таком pH они имеют средний частичный отрицательный заряд. Укладка
ионы гелевого буфера продолжают двигаться в геле для укладки, но когда ионы глицина попадают в
При pH 6,5 стекирующего геля они становятся цвиттерионами с нулевым чистым зарядом и, следовательно,
прекратить движение к аноду. Затем электрическое сопротивление в геле для укладки увеличивается.
поскольку количество ионов, движущихся через гель для укладки, уменьшается.Для поддержания постоянного
ток по всей цепи, будет локализованное повышение напряжения в
укладывающий гель (из закона Ома, V = iR). Это заставит белки мигрировать
быстро и все складывается в один очень тонкий диск сразу за ионами Cl- в
стекирующий гель (которые находятся впереди, потому что у них самая высокая плотность заряда и
электрофоретическая подвижность любого иона в укладывающем геле). Белки не пройдут
Cl-, поскольку, если бы они это сделали, они немедленно замедлились бы, так как они больше не будут
в области уменьшенных носителей заряда и более высокого напряжения.При укладке геля / бега
гелевый интерфейс, белки не могут все мигрировать с одинаковой скоростью из-за эффектов просеивания
из более концентрированного геля, и, следовательно, будет отделен в текущем геле. Глицин
в конечном итоге попадает в текучий гель, принимает полностью заряженное состояние при этом pH (8,7),
пропускают белки и восстанавливают дефицит заряда, возникший в геле для укладки.

Анимация полиакриламида
Гель-электрофорез

Java-апплет: белок
Электрофорез

Обнаружение белков в геле:

Большинство белков не поглощают видимые длины волн света,
и, следовательно, не будет виден во время электрофореза.Чтобы гарантировать, что
белки не элюируются из геля в нижний буферный резервуар, небольшой молекулярный
вес, анионный краситель, бромфеноловый синий добавляется к белку перед его помещением на
гель. Электрофорез останавливают, когда краситель достигает конца текущего геля.
Сборку геля удаляют из камеры для электрофореза, стеклянные пластины разделяют,
и гель промывали серией растворов с целью придания полосатости
белки, видимые глазу.

В настоящее время используется несколько методов. Наиболее распространенным является
для окрашивания геля кумасси синим, растворенного в растворе метанол / уксусная кислота. В качестве
обнаруженный во второй лаборатории, белки связывают кумасси синий с сопутствующим спектральным сдвигом в
абсорбционные свойства связанного красителя. Метанол и уксусная кислота в красителе
раствор также помогает «закрепить» белок в геле и предотвратить его диффузию.
в раствор. После окрашивания геля фоновое пятно в геле удаляется.
с уксусной кислотой / метанолом, оставляя полосы белка синего цвета.Опять же, примечание
Внимание: некоторые белки не окрашиваются кумасси синим. Еще одно распространенное окрашивание
метод включает окрашивание серебром, которое включает восстановление Ag (I) до элементарного
серебро и его отложение белком в соответствующих реакционных растворах, как в
фотографический процесс. (Помните, что в анализе BCA пептидные связи восстанавливают Cu (II) до Cu (I),
который хелатирован с BCA.) Требуется раствор проявителя и закрепителя. Эта техника
В 10-50 раз чувствительнее, чем окрашивание кумасси синим.Преэлектрофорез
флуоресцентная или радиоактивная модификация белков позволяет еще больше
чувствительность. После
электрофорез радиоактивно меченого белка, гель можно высушить и покрыть рентгеновскими лучами
пленка на период до месяцев, если необходимо, чтобы обеспечить достаточную засветку пленки
белком низкой концентрации. Эта техника визуализации называется
авторадиография.

Рисунок: SDS PAGE Гель со стандартами MW

фрагментов ДНК обычно разделяют на горизонтальном агарозном геле.
системы, которые намного проще заливать.

Рисунок: фрагменты ДНК, разделенные на агарозном геле

Варианты гель-электрофореза:

Изоэлектрическая фокусировка : В этом методе градиент pH
устанавливается в полиакриламидном геле. Это достигается путем предварительного электрофореза серии
низкомолекулярных молекул, содержащих амино- и карбоксильные группы, называемых амфолитами.
Под воздействием электрического поля наиболее отрицательные из видов будут концентрироваться в
анод, в то время как наиболее положительный будет концентрироваться к катоду.Остальные
амфолиты будут перемещаться между ними, в результате чего амфолиты мигрируют
до их изоэлектрической точки и установите линейный градиент pH в геле. Применяемый белок
гель будет мигрировать до pH, соответствующего его изоэлектрической точке, и остановится.

2D-электрофорез : Обычно он включает
белков для изоэлектрического фокусирующего электрофореза в полиакриламидном геле, отлитом в узкой
цилиндрическая трубка.После этого электрофореза гель из пробирки удаляется и помещается на верхнюю часть
укладывают гель и подвергают электрофорезу в SDS-полиакриламидном геле в направлении 90o
из начального эксперимента по изоэлектрической фокусировке. Если белки были получены из клеток
с маркировкой ³⁵ Met,
представляющие уникальные белки могут быть
полученные из данной популяции клеток.

Рисунок: 2D Gel

Вестерн-блоттинг: После стандартного электрофореза на SDS-пластинах
После проведения эксперимента гель покрывают кусочком нитроцеллюлозной фильтровальной бумаги.В
сэндвич из геля и фильтровальной бумаги помещают обратно в камеру для электрофореза так, чтобы
белки мигрируют из геля в нитроцеллюлозу, где они необратимо связываются.
Фильтровальную бумагу можно удалить и смочить в растворе, содержащем специфические антитела к
представляющий интерес белок на нитроцеллюлозе. Этот комплекс белок-антитело на фильтре
бумагу затем можно обнаружить, добавив флуоресцентно меченое антитело, которое связывается с первым
антитело, например.

Рисунок: гель SDS PAGE и вестерн-блот для обнаружения CKK47

Рисунок: Обнаружение вестерн-блотов

Капиллярный электрофорез;

Обзор многих методик
очищений белка, которые мы изучаем в лаборатории.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Принципы и применения электрофореза в

геле — Селекция и геномика растений

Этот модуль знакомит с принципами и приложениями гель-электрофореза для генетики и селекции растений в текстовых, анимационных и видеоформатах.

Введение

Гель-электрофорез обычно используется в селекции растений и геномике для генотипирования с помощью молекулярных маркеров, но есть и несколько других применений (см. Ниже). Например, определенные фрагменты ДНК, используемые в качестве маркеров и выделенные из отдельных растений, амплифицируются с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и полученные фрагменты ДНК впоследствии загружаются в гель. Гель представляет собой твердое желатиноподобное вещество, используемое для разделения фрагментов ДНК по размеру.Гель помещается в проводящий солевой буфер, к которому прикладывается электрическое поле. По мере того как отрицательно заряженные фрагменты ДНК перемещаются к положительному полюсу, гель действует как размерный фильтр, при этом более мелкие фрагменты мигрируют быстрее, чем более крупные фрагменты.

Ресурсы по гель-электрофорезу

Кроме того, это видео демонстрирует основы экстракции ДНК и гель-электрофореза в помидорах:

Электронная библиотека наук о растениях и почвах Университета Небраски-Линкольн содержит информативный урок по гель-электрофорезу, включая анимацию процесса:

Фотография предоставлена: Электронная библиотека наук о растениях и почвах

Еще один анимационный ролик о гель-электрофорезе можно найти в Учебном центре ДНК Долана, входящем в лабораторию Колд-Спринг-Харбор:

Фотография предоставлена: Центр изучения ДНК Долана

В Учебном центре генетики при Университете Юты также есть анимация по гель-электрофорезу:

Фотография предоставлена: Учебный центр генетики

Применение гель-электрофореза

ДНК можно разделить электрофорезом на:

• Визуализировать полосы молекулярного маркера для генотипа отдельных растений
• Проверить амплификацию с помощью ПЦР или реакций секвенирования
• Проверить качество и количество геномной ДНК после выделения ДНК
• Отдельные фрагменты ДНК для клонирования определенной полосы

Внешние ссылки

Дополнительные ресурсы

Отчет о финансировании

Разработка этого урока была частично поддержана Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства (NIFA), скоординированным сельскохозяйственным проектом Solanaceae, соглашение 2009-85606-05673, администрируемым Университетом штата Мичиган.