Исследование пцр: Диагностика инфекций, передающихся половым путем (ИППП) методом ПЦР-анализа

Диагностика методом ПЦР — Комплексы медицинских анализов и их цен в KDL

Алергология. ImmunoCAP. Индивидуальные аллергены, IgE

Аллергокомпоненты ImmunoCAP

Аллергокомпоненты деревьев

Аллергокомпоненты животных и птиц

Аллергокомпоненты плесени

Аллергокомпоненты трав

Пищевые аллергокомпоненты

Аллергология. ImmunoCAP. Комплексные исследования IgE (результат по каждому аллергену)

Аллергология. ImmunoCAP. Панели аллергенов IgE, скрининг (результат СУММАРНЫЙ)

Аллергология. ImmunoCAP. Фадиатоп

Аллергология. Immulite. Индивидуальные аллергены

Аллергены гельминтов, IgE

Аллергены грибов (кандида и плесневых), IgE

Аллергены деревьев, IgE

Аллергены животных и птиц, IgE

Аллергены клещей домашней пыли, IgE

Аллергены лекарств и химических веществ, IgE

Аллергены насекомых, IgE

Аллергены пыли, IgE

Аллергены ткани, IgE

Аллергены трав, IgE

Бактериальные аллегены (стафилококк), IgE

Пищевые аллергены, IgE

Пищевые аллергены, IgG

Аллергология. Immulite. Комплексы аллергенов, IgE (результат по каждому аллргену)

Аллергология. Immulite. Панели аллергенов, скрининг (результат СУММАРНЫЙ)

Аллергены деревьев, IgE (панель)

Аллергены животных и птиц, IgE (панель)

Аллергены трав, IgE (панель)

Ингаляционные аллергены, IgE (панель)

Пищевые аллергены, IgE (панель)

Аллергология. Immulite. Панели пищевых аллергенов IgG (результат СУММАРНЫЙ)

Аллергология. ImmunoCAP. Индивидуальные аллергены, IgE

Аллергены деревьев, IgE

Аллергены животных и птиц, IgE

Аллергены пыли, IgE

Аллергены трав, IgE

Пищевые аллергены, IgE

Аллергология. RIDA. Комплексы аллергенов, IgE

Аллергология. RIDA. Комплексы аллергенов, IgE (результат по каждому аллргену)

Аллергология. Местные анестетики, IgE

Биохимические исследования крови

Диагностика анемий

Липидный обмен

Обмен белков

Обмен пигментов

Обмен углеводов

Специфические белки

Ферменты

Электролиты и микроэлементы

Биохимические исследования мочи

Разовая порция мочи

Суточная порция мочи

Витамины, аминокислоты, жирные кислоты

Гематология

Гемостаз (коагулограмма)

Генетические исследования

HLA-типирование

Исследование генетических полиморфизмов методом пиросеквенирования

Исследование генетических полиморфизмов методом ПЦР

Молекулярно-генетический анализ мужского бесплодия

Гистологические исследования

Гистологические исследования лаборатории UNIM

Гормоны биологических жидкостей

Гормоны гипофиза и гипофизарно-адреналовой системы

Гормоны крови

Гормоны гипофиза и гипофизарно-адреналовой системы

Маркеры остеопороза

Пренатальная диагностика

Ренин-альдостероновая система

Тесты репродукции

Функция органов пищеварения

Функция щитовидной железы

Гормоны мочи

Диагностика методом ПЦР

COVID-19

Андрофлор, иследование биоценоза (муж)

Вирус герпеса VI типа

Вирус Варицелла-Зостер (ветряной оспы)

Вирус герпеса VI типа

Вирус простого герпеса I, II типа

Вирус Эпштейна-Барр

Вирусы группы герпеса

Возбудитель туберкулеза

ВПЧ (вирус папилломы человека)

Грибы рода кандида

Листерии

Парвовирус

Респираторные инфекции

Стрептококки (вкл. S.agalactie)

Токсоплазма

Урогенитальные инфекции, ИППП

Урогенитальные инфекции, комплексные исследования

Урогенитальные инфекции, условные патогены

Фемофлор, исследование биоценоза (жен)

Флороценоз, иследование биоценоза (жен)

Цитомегаловирус

Диагностика методом ПЦР, кал

Кишечные инфекции

Диагностика методом ПЦР, клещ

Клещевые инфекции

Диагностика методом ПЦР, кровь.

Вирус Варицелла-Зостер (ветряной оспы)

Вирус герпеса VI типа

Вирус простого герпеса I, II типа

Вирус Эпштейна-Барр

ВИЧ

Возбудитель туберкулеза

Гепатит D

Гепатит G

Гепатит А

Гепатит В

Гепатит С

Листерии

Парвовирус

Токсоплазма

Цитомегаловирус

Жидкостная цитология

Изосерология

Иммуногистохимические исследования

Иммунологические исследования

Иммунограмма (клеточный иммунитет)

Интерфероновый статус, базовое исследование

Интерфероновый статус, чувствительность к препаратам

Оценка гуморального иммунитета

Специальные иммунологические исследования

Исследование абортуса

Исследование мочевого камня

Исследование парапротеинов. Скрининг и иммунофиксация

Исследования слюны

Исследования слюны

Комплексные исследования

Лекарственный мониторинг

Маркеры аутоиммунных заболеваний

Антифосфолипидный синдром (АФС)

Аутоиммунные заболевания легких и сердца

Аутоиммунные неврологические заболевания

Аутоиммунные поражения ЖКТ и целиакия

Аутоиммунные поражения печени

Аутоиммунные поражения почек и васкулиты

Аутоиммунные эндокринопатии и бесплодие

Диагностика артритов

Пузырные дерматозы

Системные ревматические заболевания

Эли-тесты

Микробиологические исследования (посевы)

Посев крови на стерильность

Посев на гемофильную палочку

Посев на грибы (Candida)

Посев на грибы (возбудители микозов кожи и ногтей)

Посев на дифтерию

Посев на микоплазмы и уреаплазмы

Посев на пиогенный стрептококк

Посев на стафилококк

Посевы кала

Посевы мочи

Посевы на микрофлору (конъюнктива)

Посевы на микрофлору (отделяемое)

Посевы на микрофлору (урогенитальный тракт женщины)

Посевы на микрофлору (урогенитальный тракт мужчины)

Посевы на микрофлору ЛОР-органы)

Ускоренные посевы с расширенной антибиотикограммой

Неинвазивная диагностика болезней печени

Программы неинвазивной диагностики болезней печени

Неинвазивный пренатальный ДНК-тест (НИПТ)

Неинвазивный пренатальный тест (пол/резус плода)

Общеклинические исследования

Исследование назального секрета

Исследование секрета простаты

Исследования кала

Исследования мочи

Исследования эякулята

Микроскопическое исследование биологических жидкостей

Микроскопия на наличие патогенных грибов и паразитов

Микроскопия отделяемого урогенитального тракта

Онкогематология

Иммунофенотипирование при лимфопролиферативных заболеваниях

Миелограмма

Молекулярная диагностика миелопролиферативных заболеваний

Цитохимические исследования клеток крови и костного мозга

Онкогенетика

Онкомаркеры

Пищевая непереносимость, IgG4

Полногеномные исследования и панели наследственных заболеваний

Пренатальный скрининг

Серологические маркеры инфекций

Аденовирус

Бруцеллез

Вирус HTLV

Вирус Варицелла-Зостер (ветряной оспы)

Вирус герпеса VI типа

Вирус Коксаки

Вирус кори

Вирус краснухи

Вирус эпидемического паротита

Вирус Эпштейна-Барр

Вирусы простого герпеса I и II типа

ВИЧ

Гепатит D

Гепатит А

Гепатит В

Гепатит Е

Гепатит С

Грибковые инфекции

Дифтерия

Кишечные инфекции

Клещевые инфекции

Коклюш и паракоклюш

Коронавирус

Менингококк

Паразитарные инвазии

Парвовирус

Респираторные инфекции

Сифилис

Столбняк

Токсоплазма

Туберкулез

Урогенитальные инфекции

Хеликобактер

Цитомегаловирус

Специализированные лабораторные исследования.

Дыхательный тест

Микробиоценоз по Осипову

Тяжелые металлы и микроэлементы

Тяжелые металлы и микроэлементы в волосах

Тяжелые металлы и микроэлементы в крови

Тяжелые металлы и микроэлементы в моче

Услуги

Выезд на дом

ЭКГ

Установление родства

Химико-токсикологические исследования

Хромосомный микроматричный анализ

Цитогенетические исследования

Цитологические исследования

ПЦР (полимеразная цепная реакция). Сдача анализов на ПЦР в Санкт-Петербурге

directions

ПЦР (полимеразная цепная реакция) – метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий выявить разные виды инфекционных и наследственных патологий в острой и хронической форме, задолго до того, как патология проявляется клинически. Специфичность данного анализа обеспечивает его высокую, почти стопроцентную точность. ПЦР – метод, который способен исследовать практически любой материал. В нашем медицинском центре Вы сможете пройти ПЦР-исследование любого характера.

Врачи-специалисты

Старшая медицинская сестра

Медицинская сестра

Медицинская сестра эндоскопического кабинета

Врач-терапевт

Медицинская сестра процедурной

Анализ на коронавирус методом ПЦР. Результат в течение 3-х дней

Наши клиники в Санкт-Петербурге

Медицентр Юго-Запад

Пр.Маршала Жукова 28к2
Кировский район

• Автово
• Проспект Ветеранов
• Ленинский проспект

Получить подробную информацию и записаться на прием Вы можете по телефону
+7 (812) 640-55-25

Своевременное выявление опасных внутриутробных инфекций позволяет врачам провести мгновенную терапию и существенно снизить вероятность летального исхода. Кроме этого на сегодняшний момент существует очень много инфекционных заболеваний, возбудители которых очень быстро приспосабливаются к условиям среды и эволюционируют. Исследование методом ПЦР – уникальный метод, позволяющий выделить присутствие даже одной клетки чужеродной ДНК.

Метод ПЦР диагностики помогает лечащему врачу поставить точный диагноз и назначить наиболее подходящее лечение индивидуально для каждого пациента.

Виды анализов, проводимых методом ПЦР

Диагностика методом ПЦР является практически незаменимой для обнаружения и диагностики различных инфекционных заболеваний. Метод ПЦР применяется в следующих случаях:

1. наиболее широкое распространение метод получил при исследовании ЗППП;
2. ранняя диагностика инфекций и серонегативных пациентов;
3. контроль за эффективностью лечения;
4. эпидемиологические исследования;
5. диагностика инфекций, которые в большинстве случаев протекают на фоне иммунодефицита. В этом случае точная постановка диагноза по серологическим исследованиям затруднительна ввиду некоторых несоответствий;
6. выявление штаммов инфекционных агентов;
7. разрешение сомнительных результатов серологического исследования;
8. при постановке либо подтверждении диагноза;
9. молекулярно-генетических исследованиях.

Помимо всего данный вид анализа позволяет разделить неонкогенные и онкогенные папилломавирусы, а так же выполнить генотипирование (при гепатите С).

Проведение ПЦР-исследования

Чтобы получить верные результаты, в первую очередь необходимо осуществить правильный забор образцов, их хранение и транспортировку. При нарушении этих условий результат анализа может быть как ложноположительным, так и ложноотрицательным, что существенно мешает постановке правильного диагноза.

Как происходит забор проб для исследования?

Для анализа используются различные виды материала. Это может быть:

• кровь;
• форменные элементы крови;
• сыворотка крови;
• слюна;
• моча;
• мазки;
• соскобы;
• слёзная жидкость;
• биоптаты тканей и органов.

Забор проб производится только одноразовыми инструментами.

Преимущества ПЦР

Исследования, проводящиеся методом ПЦР, имеют ряд преимуществ перед другими видами анализа:

1. прямое обнаружение наличия возбудителя. В процессе обследования выявляется ДНК возбудителя, которое точно указывает на присутствие определённой инфекции;
2. высокая специфичность заключается в том, что в материале выявляется уникальный фрагмент ДНК, который характерен только для этого вида возбудителя;
3. данный вид анализа является высокочувствительным и позволяет определить даже единичные клетки вирусов или бактерий.
4. возможность диагностировать наличие нескольких возбудителей только из одной пробы;
5. быстрота получения результатов

Методом ПЦР можно диагностировать не только острые инфекции, но и те, которые находятся в скрытой (латентной) форме.

757,742,840,761,860,1322

Яника Сок

01.02.2021

22:09
medi-center.ru

Мне очень понравилось на приеме у доктора. Провела осмотр и УЗИ, это единственный из всех врачей которая увидела на УЗИ спайки!!!Спайки действительно есть!(данные лапароскопии)
Во время ультразвукового обследования доктор все объясняла, рассказывала и даже наглядно показывала. Изначально я к ней пришла на ГСГ процедуру доктор провела замечательно, ничего не больно, успокаивала меня (я еще та трусиха)…на основании ГСГ дала свои рекомендации Правильные. Спасибо Вам огромное!
Доктор очень вежливая, тактичная и замечательная.
Профессионализм Регины Гумеровны на высшем уровне, качеством её работы я осталась полностью довольна.
Я и буду советовать доктора к посещению!

Прошу премировать доктора!

Была 21.06.20 у Гареевой Регины Гумеровны.Хочу поблагодарить ее за проффесионализм,хорошее отношение к пациентам и за здравое рассуждение!Она все подробно объяснила,не пугала и не делала поспешных выводов,как некоторые,а ,наоборот,подбадривала.На вид добрая и спокойная.Всем советую????????

Хочу выразить благодарность Агамурату Оразмамедовичу, за отзывчивость и профессиональную помощь моему сыну, спасибо вам за нашу ручку!!!

Добрый день!Хочу поблагодарить Радченко Сергея Ивановича за прекрасную работу и высокий уровень компетенции.По мимо основной причины обращения, помог по сопутствующим вопросам.Обращался в «Медицентр» на Аллее Поликарпова 6. Очень благодарен!

Добрый вечер, хочу выразить благодарность клинике на Охтинской аллее, прикрепились с мужем по ОМС, всегда чисто, приятный персонал, приветливый, внимательный, всегда подскажет и ответит на любой вопрос, врачи специалисты в своем деле, принимают в назначенное время, без очередей.

Выражаю огромную благодарность Медиценру на Охтинской Аллее за быстрое и качественное предоставление услуг. Персонал очень приятный и высококвалифицированный. Особую благодарность хочу выразить Инессе и Александру, ребята быстро и качественно взяли кровь, при этом не забывая морально меня поддерживать, т.к. я с детства боюсь уколов, но все прошло на высшем уровне.

Что такое ПЦР-анализ? Ответы на вопросы о ПЦР-диагностике

К нам часто поступает множество вопросов, касающихся такого метода лабораторной диагностики как ПЦР. В своей статье, мы постарались рассмотреть самые актуальные из них.

Надеемся наш материал будет полезным для Вас!

Что такое ПЦР-диагностика?

ПЦР-анализ (полимеразная цепная реакция) — это высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, основанный на анализе генетического материала (ДНК и РНК). Для диагностики используется слюна, кровь, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы, в зависимости от целей исследования.

Какие опасные инфекции можно выявлять в реанимации методом ПЦР?

Методом ПЦР можно выявлять любые опасные инфекции, которые приводят к критическому состоянию пациента. Своевременное выявление инфекционного агента, вызвавшего данное состояние, позволит правильно скорректировать лечение и спасти жизнь.

Подойдёт ли этот метод для скрининга, для подтверждения диагноза?

Скрининговый анализ, в общем понимании, действительно не совсем подходящий метод для неотложной медицины. Скрининг, по большей части, является профилактическим мероприятием и представляет собой массовые тотальные исследования по выявлению скрытых, внешне не проявляющихся или недавно начавшихся патологических процессов у пациентов. Например, ПЦР-диагностика прекрасно используется в гинекологической практике для скрининга вируса папиломы человека (ВПЧ) или болезней, передающихся половым путём (ЗППП). Также ПЦР метод широко используется для скринингового тестирования плазмы крови на предмет выявления вирусов гепатита В, С, D, E. И так далее.

Для скрининга эффективнее использовать ныне устаревающий метод ИФА или современной ИХЛА?

С методами ИФА и ИХЛА не всё так однозначно. Они выявляют косвенные признаки патологических изменений и это является их главным недостатком. Организму на вредное воздействие необходимо вначале сформировать иммунный ответ, наработать антитела, которые в последующем возможно выявить только со временем. Может возникнуть ситуация, когда организм уже заражен какой-либо инфекцией, а антител к ней еще нет или их титр находится ниже порога чувствительности тест-набора. Или наоборот – возбудителя уже нет в организме, а антитела ещё выявляются.

Хронологически метод ПЦР в клинической практике появился позже ИФА и ИХЛА и по факту является более современным. По показателям специфичности и чувствительности ПЦР выше данных иммунологических методов. К тому же ПЦР-анализ выявляет прямую первопричину процессов – их генетическую основу, а не следствие. Для получения нужного результата при постановке ПЦР нет необходимости выявлять весь геном мишени. Задачи по анализу всего генома решаются с помощью других методов (например, таргетный или полногеномный анализ с помощью секвенирования нового поколения – NGS). С помощью ПЦР-теста выявляется высоко консервативный фрагмент ДНК (определённая нуклеотидная последовательность), однозначно характеризующий мишень. А при методе ПЦР в реальном времени можно даже определить изначальное количество мишени в пробе.

Что этот метод даст для лечения и выявления мультирезистентного штама микобактерий?

Выявление мультирезистентных шаммов позволит изначально не использовать те антибиотики, к которым у возбудителя существует генетически обусловленная стойкость, а использовать другие препараты. Например против штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к Изониазиду и Рифампицину сразу применять фторхинолоны или инъекционные препараты.

Можно ли при ВИЧ вылечить чувствительные штаммы?

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вообще не восприимчив ко антибиотикам и противомикробным препаратам, потому что не является бактерией. Против вирусов необходимо применять противовирусные препараты. Трудность лечения вирусных заболеваний вообще и СПИДа в частности обусловлена их биологической особенностью – активная фаза жизнедеятельности вируса проходит только внутри живой клетки. Поэтому вирусные частицы защищены от воздействий внешней среды. Уничтожить вирус можно только с клеткой, в случае с ВИЧ – с клеткой иммунной системы.

Как исследование соотношения субпопуляций лейкоцитов выявляет онкомаркеры?

Числовое значение соотношения субпопуляций лейкоцитов является индикаторным или маркерным показателем наличия онкологического процесса, т.е. одним из онкомаркеров. В норме и при патологии данное значение отличается. Например, при значениях CD4+/CD8+ в диапазоне от 1,2 до 2,6 может свидетельствовать о возможном наличии в организме множественной миеломы или солидных опухолей. Увеличение значения более до 3 и более может указывать на острый Т-лимфобластный лейкоз или хронический Т-лейкозе. И т.д. Другими словами –в данном случае преобладание Т-хелперов над Т-киллерами специфически информативно.
Но онкомаркеры могут быть и генетическими. На сегодняшний момент обнаружены тысячи мутантных аллелей генов, которые с той или иной вероятностью могут приводить к развитию онкологического процесса. На рынке существует множество тест-систем для выявления онкомаркеров разных производителей.

Рак шейки матки целесообразно предотвращать (или диагностировать на ранней – внутриэпителиальной стадии) до его развития путём разработки и внедрения государственных программ по тотальному скринингу женщин на наличие ВПЧ с регулярными подтверждающими цитологическими исследованиями. Также огромным фактором по своевременному предотвращению данного заболевания будет внедрение вакцинации против ВПЧ всех младенцев при рождении (и мальчиков и девочек).

ПЦР исследования — Медицинский центр «КОНСУЛЬТАНТ»

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить.
Это самый современный метод молекулярной биологии.
В настоящее время метод амплификации нуклеиновых кислот (НК) полимеразной цепной реакцией (ПЦР) уже достаточно широко используется в нашем центре как эффективный инструмент лабораторной диагностики.

Лаборатория оснащена необходимым современным оборудованием для ПЦР. В наличии имеется Амплификатор с детекцией в режиме реального времени CFX 96 Touch. Данный прибор относится к новейшей линейке приборов компании BIO-RAD (США) — амплификаторам серии 1000. Он занимает одно из лидирующих мест на рынке ПЦР-диагностики. Позволяет проводить мультиплексный анализ до 5 мишеней (5 инфекций в одной пробирке) в 96 пробах одновременно. Также имеется амплификатор АЛА ¼ производства Латвии. При помощи данного прибора проводится исследование по «конечной точке», т.е. на наличие ДНК/РНК возбудителя (без определения количества). Диагностические наборы реагентов для выявления и количественного определения ДНК/РНК возбудителей урогенитальных инфекций, гепатитов и пневмоний приобретаются в ООО «ИнтерЛабСервис» г. Москва.

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК или РНК бактерии или вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: моча, плазма крови, мокрота, соскоб эпителиальных клеток, сок простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость.

При обследовании на инфекции, передающиеся половым путем (ИППП), у мужчин и женщин с помощью стерильного зонда из половых органов делается соскоб из шейки матки, влагалища или соскоб из уретры (мочеиспускательного канала), моча.

При обследовании на инфекции (герпетические инфекции, ЦМВИ, гепатиты В, С, Д) на ПЦР забирают кровь.

При обследовании на вирусы Эпштейн-Барра, Цитомегаловирус и Герпес 6-го типа в качестве материала забираются кровь из вены, слюна или соскоб из ротовой полости.

Перечень исследований:

1.Определение ДНК вируса гепатита В (HBV) в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Аналитические показатели

Определяемый фрагмент – специфичный участок ДНК вируса гепатита В. Специфичность определения — 100%. Чувствительность определения — 50 МЕ/мл.

2. Количественное определение ДНК вируса гепатита В (HBV) (оценка вирусной нагрузки) в плазме крови методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Аналитические показатели

Определяемый фрагмент – специфический участок ДНК вируса гепатита В. Клиническая специфичность теста: 100%. Чувствительность теста составляет 75 МЕ/мл.

Количественная характеристика содержания ДНК гепатита В в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии.

3. Определение РНК вируса гепатита С (HСV) в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Аналитические показатели

Определяемый фрагмент — специфичный участок РНК вируса гепатита С. Специфичность определения — 100%. Чувствительность определения – 50 МЕ/мл.

В острую фазу гепатита С РНК вируса выявляют в крови уже через 1-2 недели после инфицирования, т.5 МЕ/мл наряду с определением генотипа вируса является независимым и наиболее информативным параметром прогнозирования эффективности лечения. Снижение концентрации РНК гепатита С к третьему дню от начала терапии на 85% является быстрым и точным параметром для предсказания эффективности терапии, приводящей к раннему вирусологическому ответу.

5. Определение РНК вируса гепатита D (НDV) в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Вирус гепатита D передаётся парентеральным путём и обнаруживается только у лиц, инфицированных вирусом гепатита В. Развивающийся в этом случае хронический гепатит, протекает очень тяжело, c массивным поражением печени, часто сопровождается отёками и асцитом.

Аналитические показатели

Определяемый фрагмент — специфичный участок РНК вируса гепатита D. Специфичность определения — 100%. Чувствительность определения — 50 МЕ/мл.

6. Определение ДНК вируса простого герпеса (HSV) I типа (губного или лабиального) и II типа (генитального) в соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Вирусы простого герпеса 1-го (ВПГ-1) типа и 2-го (ВПГ-2) типа относят к семейству герпесвирусов (Herpesviridae), общим свойством которых является постоянное персистирование в организме после инфицирования. Попадают в организм через слизистые (обычно «входные ворота» для ВПГ-1 – слизистые ротовой полости и носоглотки, для ВПГ-2 – слизистые половых органов). Клинические проявления герпетической инфекции в любой форме (высыпания на коже и слизистых оболочках, симптомы поражения нервных клеток и др.), как правило, свидетельствуют о снижении иммунитета. Первичная герпетическая инфекция и реактивация инфекции (в гораздо меньшей степени) в период беременности могут вызывать патологию беременности, внутриутробное инфицирование плода или инфицирование ребенка во время родов.

7. Определение ДНК Цитомегаловируса (CMV) в крови и соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Цитомегаловирус – широко распространённый вирус семейства герпесвирусов. После окончания острого периода инфекция цитомегаловирусом обычно переходит в латентную форму, из которой может реактивироваться. Цитомегаловирус относят к так называемым оппортунистическим инфекциям: выраженные клинические проявления CMV-инфекции отмечаются чаще всего у пациентов с врождёнными или приобретенными иммунодефицитами (в том числе вследствие ВИЧ-инфекции, применения иммунодепрессантов при трансплантации органов и др.), а также на фоне физиологических иммунодефицитных состояний (дети первых 3 — 5 лет жизни, беременные).

Первичная инфекция или (в меньшей степени) реактивации инфекции в период беременности связаны с риском внутриутробной инфекции, опасной для развития плода. Проявления инфекции зависят от особенностей иммунитета матери, вирулентности и локализации вируса. В целях выявления возможной инфицированности организма цитомегаловирусом, оценки риска возникновения острой инфекции, распознавания первичной инфекции целесообразно выявление вирусной ДНК методом ПЦР.

Важно! CMV-инфекция входит в группу TORCH-инфекций (название образовано начальными буквами в латинских наименованиях — Toxoplasma, Rubella, Cytomegalovirus, Herpes), считающихся потенциально опасными для развития ребёнка. Лабораторное обследование на TORCH-инфекции наиболее целесообразно проводить за 2 — 3 месяца до планируемой беременности. Это даёт возможность предпринять необходимые лечебные или профилактические меры, и служит точкой сравнения с результатами обследований во время беременности.

8. Качественное обнаружение ДНК вируса папилломы человека (HPV) 14 типов высокого онкогенного риска: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67 в соскобе эпителиальных клеток урогенитального тракта.

Вирус папилломы человека (ВПЧ) может быть причиной возникновения рака гениталий у женщин и плоскоклеточного рака у мужчин и женщин. Доказано, что этот вирус является причиной возникновения остроконечных кондилом, кондилом и новообразований шейки матки. Различные виды ВПЧ являются причиной различных поражений. Некоторые из них являются факторами высокого онкогенного риска.

Формат выдачи результата включает суммарный ответ по всем указанным типам ВПЧ-обнаружено/не обнаружено. Результат ОБНАРУЖЕНО следует интерпретировать как наличие в образце специфических участков ДНК одного или нескольких типов ВПЧ без указания конкретного типа (16 тип идентифицируется). Результат НЕ ОБНАРУЖЕНО следует интерпретировать как отсутствие в образце специфических участков ДНК ВПЧ всех указанных типов.

9. Определение ДНК возбудителя гонореи (Neisseria gonorrhoeae) в соскобе эпителиальных клеток урогенитального тракта методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Гонорея — венерическое заболевание вызывается грамотрицательным диплококком — Neisseria gonorrhoeae. Передаётся половым путем, поражая преимущественно слизистые оболочки мочеполовой системы.

У мужчин возбудитель гонореи является причиной уретритов, стриктуры уретры, эпидидимита, простатита, орхита и других заболеваний яичек и его придатков.

У женщин проявляется как уретрит, бартолинит, эндоцервицит, эндометрит, сальпингит и пельвиоперитонит. Симптомы хронической гонореи у женщин могут быть минимальными, заболевание трудно диагностируется.

Новорожденные могут заразиться гонореей при прохождении ребёнка через родовые пути матери (бленнорея новорожденных).

10. Определение ДНК гарднереллы (Gardnerella vaginalis) в соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Гарднереллёз (бактериальный вагиноз) чаще выявляется у женщин детородного возраста. Заболевание возникает как следствие резкого нарушения баланса микрофлоры влагалища: преобладающие в норме лактобактерии замещаются анаэробными микроорганизмами. Гарднереллёз может являться причиной осложнений беременности: воспалительных заболеваний, маточных кровотечений, послеродового эндометрита, пневмонии у новорождённых.

11. Качественное определение ДНК микоплазмы (Mycoplasma genitalium) в соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Mycoplasma genitalium – микроорганизм, обладающий высокой патогенностью по отношению к клеткам эпителия мочеполовых органов человека, обладает высокой контагиозностью, то есть почти всегда передается половому партнеру. Часто являться причиной негонококкового уретрита и простатита, патологии беременности и плода, бесплодия у женщин и мужчин. Микоплазма гениталиум способна прикрепляться к сперматозоидам и снижать их функциональность (в том числе подвижность), а это может приводить к развитию мужского бесплодия. У женщин этот возбудитель все чаще выявляется при острых эндометритах и аднекситах – воспалениях матки с придатками. Установлено, что Mycoplasma genitalium может вызывать трубное бесплодие у женщин.

12. Определение ДНК Mycoplasma pneumoniae в соскобе эпителиальных клеток из ротоглотки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

13. Определение ДНК Chlamydia pneumoniae в соскобе эпителиальных клеток из ротоглотки методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Микоплазменная и/или хламидийная пневмония. Атипичные микроорганизмы, вызывающие пневмонию, составляют от 8 до 25% случаев заболевания. В половине случаев ошибочно диагностируются бронхит, трахеит или ОРЗ. Поэтому диагностика микроплазменной и хламидийной пневмоний основывается в первую очередь на выявлении с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР).

14. Определение ДНК микоплазмы (Mycoplasma hominis) в соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В настоящее время микоплазмы принято считать условно-патогенными микробами.

Микоплазмы передаются половым путём, могут являться причиной негонококкового уретрита и простатита, воспалительных заболеваний, патологии беременности и плода, бесплодия у женщин и мужчин. Эти микроорганизмы можно обнаружить, по разным данным, у 15-50% здоровых женщин.

15. Определение ДНК yреаплазмы (Ureaplasma urealyticum/parvum) в соскобе эпителиальных клеток урогенитального тракта методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Уреаплазмы в настоящее время принято считать условно-патогенными микробами. Уреаплазмы передаются при половых контактах, могут являться причиной негонококкового уретрита и простатита, воспалительных заболеваний, патологии беременности и плода, бесплодия у женщин и мужчин.

16. Определение ДНК хламидии (Chlamydia trachomatis) в соскобе эпителиальных клеток урогенитального тракта методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Хламидии — облигатные внутриклеточные паразиты, передающиеся преимущественно половым путём, и вызывающие хламидиоз (в первую очередь, поражения слизистых оболочек половых путей, конъюнктивиты). Достаточно широко распространённая инфекция, может протекать бессимптомно, часто переходит в хроническую форму, сопровождается различными осложнениями, которые иногда у женщин являются причиной бесплодия и невынашивания беременности.

Особенности жизненного цикла Chlamydia trachomatis приводят к частому возникновению персистирующей формы инфекции, малочувствительной к терапии. Реактивация инфекции может произойти под действием изменения иммунного или гормонального статуса, травмы, операции, стресса. У Chlamydia trachomatis низкая иммуногенность, вследствие чего у 50% инфицированных людей антитела не обнаруживаются. Поэтому (особенно в сомнительных случаях, при отсутствии антител к хламидии) микроорганизм выявляют только высокочувствительным и специфичным прямым методом – ПЦР.

17. Определение ДНК Кандиды (Candida albicans) в соскобе эпителиальных клеток урогенитального кожи методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Кандиды выявляются на слизистых оболочках полости рта и желудочно-кишечного тракта у 30-50% здоровых людей и на слизистых оболочках гениталий у 20-30% здоровых женщин. При этом важно различать кандидоз и колонизацию слизистых оболочек и кожи. Микозы обычно развиваются у пациентов с различными нарушениями в системе противоинфекционной защиты (факторами риска).

18. Определение ДНК трихомонады (Trichomonas vaginalis) в соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Трихомониаз — заболевание мочеполового тракта. Trichomonas vaginalis относится к роду простейших жгутиковых, является строгим облигатным паразитом человека. Это одно из самых частых заболеваний, передающихся половым путем. У мужчин поражается уретра, предстательная железа и семенные пузырьки, у женщин – влагалище, шейка матки и уретра.

19. Определение ДНК вируса Эпштейн-Барра (Epstein-Barr virus) в крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Вирус Эпштейн-Барр — является наиболее частой причиной инфекционного мононуклеоза у молодых людей. Характеризуется лихорадкой, недомоганием, фарингитом, лимфоаденопатией и лимфоцитозом. Вирус передается оральным (через слюну) и половым путем.

20. Определение ДНК вируса герпеса 6 типа в крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Вирус герпеса 6 типа вызывает у детей (в возрасте младше 2,5 лет) внезапную экзантему. В начале высыпания появляются на спине и шее, затем на руках и ногах, на лице сыпь отсутствует. У некоторых заболевших детей лихорадка может приводить к эпилептическим припадкам. Вирус передается оральным и аэрозольным путем. Аналитическая чувствительность тестов для урогенитальных инфекций составляет 1х103 ГЭ/мл.

Задать вопрос специалисту Вы можете по следующим электронным адресам: [email protected], [email protected].

Городская клиническая больница №31 — Лаборатория молекулярной генетики (ПЦР-диагностика)

Заведующий лабораторией к.м.н.

Антон Анатольевич Лыщёв

В лаборатории молекулярной генетики нашей больницы, организованной в 1991 году, выполняется широкий спектр молекулярно-генетических исследований, в основе которых лежит метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Основные направления деятельности лаборатории включают диагностику инфекционных заболеваний, различных злокачественных новообразований и определение генетической предрасположенности к различным болезням.

ПЦР-исследование позволяет быстро и достоверно диагностировать инфекционные заболевания в силу ряда преимуществ:

• универсальность ПЦР-метода (в одном образце биологического материала можно выявить возбудителей нескольких заболеваний). ПЦР-метод позволяет обнаружить чужеродную ДНК в самых различных биологических жидкостях и тканях: крови, слизи, моче, мокроте, соскобе эпителиальных клеток;
• ПЦР-метод обладает самой высокой чувствительностью в сравнении с другими методами лабораторных исследований;
• высокая специфичность ПЦР-метода позволяет обнаружить в изучаемом материале участок генома, присущий только конкретному возбудителю заболевания;
• ПЦР-метод позволяет выполнить исследование биоматериала за 7-8 часов.

ПЦР-тесты с успехом используются для идентификации трудно диагностируемых вирусных и бактериальных инфекций. В настоящее время в лаборатории проводится анализ ПЦР на  вирусы гепатита В и С, цитомегаловирус, вирус папилломы человека, хеликобактер, микобактерии туберкулеза и др.

Именно ПЦР-метод оказался в основе всех тест-систем на коронавирус, зарегистрированных на данный момент. Уже в самом начале пандемии новой коронавирусной инфекции covid-19 стало понятно, что наша лаборатория должна принять на себя всю нагрузку по обследованию пациентов и сотрудников больницы на коронавирус. В связи с этим была проведена большая и сложная подготовительная работа: разработана схема движения и маркировки биоматериала, проведена перепланировка лабораторных помещений, получен сертификат и разрешение Роспотребнадзора на выполнение ПЦР-тестов на COVID-19. Затем наши опытные врачи и лаборанты достаточно быстро освоили новые различные методики подготовки и выделения РНК и постановки ПЦР новыми зарегистрированными тест-системами. Таким образом, с конца марта 2020 г. в лаборатории больницы начали выполнять большой объем тестов на коронавирус, регулярно проверяя всех сотрудников и пациентов на наличие коронаровирусной инфекции. Результат известен в течение нескольких часов.

15 апреля 2020 г. в структуре Городской клинической больницы № 31, на базе лаборатории молекулярной генетики было создано еще одно новое специализированное подразделение  — Вирусологический центр, который в соответствии с приказом Минздрава Российской Федерации принял на себя весь объем тестирования на новую коронавирусную инфекцию COVID-19 бессимптомных пациентов и медработников по Калининскому району Петербурга .

В области диагностики онкологических заболеваний разработаны и широко применяются уникальные ДНК-тесты, позволяющие установить диагноз на ранней стадии болезни, оценить прогноз, а в последующем и качество проводимой терапии. Успешно применяются ДНК-тесты для определения индивидуального риска развития рака шейки матки, ранней диагностики рака предстательной железы.

Специалисты  лаборатории уделяют большое внимание развитию новых диагностических направлений, связанных с выявлением предрасположенности к развитию ряда соматических заболеваний, включая сердечно-сосудистые, эндокринные, аутоиммунные и другие. Наибольшие успехи достигнуты в области определения генетической предрасположенности к тромбозам.

В лаборатории по Вашему желанию можно составить индивидуальную «Генетическую карту здоровья», представляющую собой ДНК-анализ 61 гена.

Подробную информацию можно узнать по телефонам:
(812) 24-600-22;
(812) 230-86-30,  (812) 235-31-95 и +7-921-956-48-93 в будние дни с 8.30 до 16.30 час. — платные услуги (отдел страховой медицины).

диагностика — цены на анализы ПЦР в Москве

зачем проводят анализ на хламидии, что показывает ПЦР

11 ноября, 2020

2232

0

Анализ на хламидии является неотъемлемой частью комплекса исследований на инфекции, передающиеся половым путем. 
Здоровье женской репродуктивной системы напрямую зависит от наличия патогенных микроорганизмов в половых путях. Хламидия поражает урогенитальный тракт женского организма и вызывает воспалительные процессы, в том числе в фаллопиевых трубах. Такое заболевание может годами протекать бессимптомно и способствовать неуклонному развитию бесплодия. Хроническая инфекция провоцирует выделение плотного секрета и образование спаек в трубах. Непроходимость маточных труб может быть источником проблем с зачатием, а также таких тяжелых патологий как внематочная беременность. Самый надежный способ предотвратить развитие этой инфекции – сделать исследование ПЦР на хламидии.

Что такое хламидии?

В сфере акушерства и гинекологии представляет интерес только один вид инфекции – Chlamydia trachomatis. Микроорганизм относится к грамотрицательным облигатным внутриклеточным паразитам. Это одна из наиболее распространенных инфекций, передающихся половым путем. Каждый год хламидиозом заболевает около 100 миллионов жителей земного шара. Носителями инфекции является почти миллиард людей, что соответствует примерно одной восьмой части населения планеты. ПЦР исследования играют большую роль в профилактике дальнейшего распространения патогена. 

Жизненный цикл возбудителя располагает к хроническому течению заболевания и низкой восприимчивости к лечению антибактериальными препаратами. Внедряясь в клетку человеческого организма, хламидии начинают питаться ее содержимым. Там же происходит и их размножение. В случае разрушения больной клетки, в окружающие ткани мигрирует еще больше патогенов. Так поражается все больше и больше здоровых клеток. Заболевание склонно к скрытому течению. Это связано с тем, что микроорганизм способен к образованию особых L-форм. Для создания таких «спящих» форм требуются определенные для паразита условия. Это может быть малоэффективная антибактериальная терапия, переохлаждение или перегрев организма. В таком виде хламидии могут существовать внутри клеток длительное время, не вызывая отклика иммунной системы человека. При подавлении иммунитета происходит активизация инфекции и обратное преобразование микроорганизмов из L-форм. Выявить обычным методом скрытое заболевание достаточно сложно. Иммуногенность у патогена чрезвычайно низкая – антитела к Chlamydia trachomatis выявляются в анализах только у 50 % носителей. Поэтому наиболее эффективным методом считается ПЦР в режиме реального времени.

Наиболее частый способ заражения Chlamydia trachomatis – через незащищенный половой контакт, реже инфицирование происходит контактно-бытовым путем или через предметы личной гигиены. Именно поэтому в профилактике инфекции большую роль играют барьерные методы контрацепции и регулярные анализы на ИППП. Женщины более подвержены заражению чем мужчины. Инкубационный период заболевания варьируется от двух недель до одного месяца.  В первую очередь микроорганизм поражает слизистые половых органов и глаз. Процесс инфицирования начинается с присоединения элементарного тельца патогена к клетке эпителия конъюнктивы, уретры, эндометрия или эндоцервикса. В организме носителя хламидии могут существовать в двух формах: элементарных и ретикулярных телец. Первые, проникая в клетки эпителия, образуют колонию ретикулярных телец. Они размножаются внутри клетки, а после ее гибели поражают новые клетки.  Ориентировочно весь цикл развития составляет от 48 до 72 часов. 

Возможные симптомы заболевания, требующие проведения ПЦР теста:

• Зуд и жжение в половых органах
• 
  Неприятные ощущения при мочеиспускании
• 
  Боль при половом акте
• 
  Обильные гнойные выделения
• 
  Общее недомогание
• 
  Беспричинная слабость и утомляемость
• 
  Субфебрилитет 
• 
  Изменение цвета мочи

Если все вышеуказанные симптомы наблюдаются у полового партнера, сдать мазок на ПЦР исследование должны оба. Лечение в данном случае тоже проходят оба партнера. 

Плюсы и минусы анализа ПЦР на хламидии

Существует несколько видов ПЦР. Они применяются в разных направлениях медицинской диагностики и научных исследований. Автором методики является американский ученый Кэри Муллис, по праву получивший за нее в 1993 году премию Нобеля по химии. 

Данный анализ осуществляется в режиме реального времени с детекцией и расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Этот метод по праву завоевал доверие акушеров-гинекологов по всему миру. Специфика ПЦР заключается в том, что биоматериал пациента изучается на предмет ДНК конкретного патогена. Вместе с этим берется под контроль КВМ (качество взятия материала), где оценивается количество содержания человеческой ДНК в биоматериале.

Информативность анализа позволяет использовать его в диагностике самых различных заболеваний, в том числе генетических. К главным достоинствам метода относится высокая степень достоверности. Если исследование ПЦР выполнено с соблюдением всех правил и требований, оно полностью исключает ложноположительный результат. 

У ПЦР множество плюсов, в том числе:

• Высокая точность выявления ДНК хламидии
• 
  Возможность использования разных биологических материалов (мокрота, выделения, моча и т.д.)
• 
  Возможность определения возбудителя скрытого и хронически протекающего заболевания
• 
  Эффективность в выявлении предраковых и раковых клеток
• 
  Эффективность в выявлении других патогенных возбудителей ИППП
• 
  Высокая скорость исполнения (от одного рабочего дня)

Показания для анализа на хламидии

Для того, чтобы удостовериться в отсутствии скрытой инфекции, не нужно ждать появления симптомов. Анализы на ИППП рекомендуется проводить один раз в год в составе профилактического обследования.

В число прямых показаний к тесту на хламидии входят:

• Повышение температуры тела без ясных причин
• 
  Необходимость дифференцирования ИППП
• 
  Воспалительный процесс в органах малого таза
• 
  Оценка эффективности лечения хламидиоза
• 
  Подозрение на бесплодие
• 
  Непроходимость маточных труб
• 
  Планирование беременности 
• 
  Беременность

Подготовка к анализу ПЦР

Анализ на хламидии может выполнятся разными способами, в том числе таким методом как ПЦР. Соответственно, подготовка при этом будет отличаться.

 

Мазок на ИППП, в том числе на хламидии, сдается на приеме у врача. Он берется в процессе осмотра на гинекологическом кресле. Приходить на прием и сдачу анализа следует в первой половине менструального цикла. Если обследование требуется сделать в срочном порядке, подойти к доктору можно в любой день, но не позже чем за 5 дней до очередной менструации. За один-два дня до сдачи ПЦР мазка необходимо воздержаться от половых контактов, интравагинального УЗИ и кольпоскопии. 

 Для того, чтобы результаты анализа были максимально точными, нужно учитывать, принимались ли накануне теста антибиотики. На фоне антибиотикотерапии мазок не выполняется, поскольку показания исследований любым методом будут недостоверными. В этом случае рекомендуется выдержать временной промежуток не менее одного месяца.

 Если врач выдал направление на анализ крови, сдавать биоматериал на хламидии следует утром натощак.

Расшифровка результатов ПЦР

Существует несколько видов исследований на хламидии. Интерпретировать результаты любого из проводимых методом ПЦР тестов должен лечащий врач. 

Срок выдачи анализов составляет один рабочий день. В бланке исследования на хламидии указывается, обнаружен или нет инфекционный агент в биоматериале. 

Результаты анализа выглядят так:

Обнаружено. В образце биоматериала зафиксирована ДНК,
специфичная для возбудителя Chlamydia trachomatis;

Не обнаружено. В образце биоматериала не зафиксирована ДНК, специфичная для возбудителя Chlamydia trachomatis.
Если в урогенитальном тракте установлен воспалительный процесс, вполне вероятно, что он вызван именно данным возбудителем. Если же в мазке ПЦР найдено незначительное количество Chlamydia trachomatis, скорее всего воспаление спровоцировано другим патогеном. В этом случае может потребоваться дифференциальная диагностика заболевания и дополнительные анализы.

(2 оценок, среднее 4.5 из 5)

Читайте также

PCR: Тридцать пять лет и только | Наука

Технология Feature

Автор Алан Дав мая. 10, 2018, 14:00

За 35 лет, прошедших с момента изобретения, полимеразная цепная реакция (ПЦР) стала стандартным методом в лабораторной биологии, но ученые продолжают находить новаторские — и даже спасающие жизнь — применения для нее.

В мае 1983 года Кэри Маллис, в то время ученый в Cetus Corporation в Эмеривилле, Калифорния, синтезировал некоторые олигонуклеотиды, смешал их с небольшим количеством матричной ДНК и добавил фермент полимеразу и несколько других реагентов. После серии инкубаций полимераза многократно скопировала шаблон в цепной реакции, как и надеялся Маллис.

Mullis в конечном итоге отошел от научного мейнстрима, и Cetus был поглощен рядом других компаний, но PCR сохранилась.Подобно шаблонам ДНК, на которые она нацелена, ПЦР была воспроизведена, усилена и распространена в лабораториях по всему миру. Специализированные термоциклеры и связанные с ними инструменты наводняют рынок, поставщики продают широкий выбор термостабильных полимераз, а студенты во всем мире изучают эту технику на вводных курсах биологии.

В настоящее время отмечает свое 35-летие, ПЦР стал повсеместным лабораторным инструментом. Тем не менее исследователи, инженеры и врачи все еще находят способы продвинуть его на новые территории.Выборка некоторых из этих усилий показывает, насколько далеко расширился охват ПЦР: от молочных заводов до клиник, и от классных комнат до космоса.

Подобно шаблонам ДНК, на которые она нацелена, ПЦР была воспроизведена, амплифицирована и распространена в лабораториях по всему миру.

Последовательность запуска

Основным аппаратным компонентом ПЦР является термоциклер, устройство, способное быстро нагревать и охлаждать пробирки для образцов и поддерживать их при точной температуре в течение определенных периодов времени.Хотя три десятилетия разработки и конкуренции значительно улучшили эти машины, они все еще относительно тяжелые, энергоемкие и дорогие. В результате, один из определяющих методов современной молекулярной биологии упорно оставались недоступными для преподавателей и непригодным для использования во многих отдаленных местах.

«ПЦР — одна из наиболее важных [исследовательских] технологий, и все же она является одной из самых ограничивающих, когда вы находитесь за пределами лаборатории из-за размера и стоимости оборудования», — говорит Зик Альварес-Сааведра, генетик и соучредитель MiniPCR в Кембридже, Массачусетс.Разочарованный постоянной неподвижностью ПЦР, Альварес-Сааведра в 2013 году вместе с молекулярным нейробиологом Себастьяном Кравесом создали портативный термоциклер.

Большинство термоциклов контролируют свою температуру с помощью переходов Пельтье, термоэлектрических устройств, которые могут быстро переключаться между нагревом и охлаждением. К сожалению, переходы Пельтье неэффективны, а компоненты, необходимые для их работы, делают машины ПЦР тяжелыми и жадными до электричества.

Альварес-Сааведра и Кравес использовали другой подход, нагревая образцы с помощью тонкопленочного резистивного нагревателя, аналогичного обогревателям окон в автомобилях.Для охлаждения команда использует простой вентилятор. Микроконтроллер управляет циклами нагрева, охлаждения и инкубации. Благодаря более простой конструкции машина стала намного меньше и легче обычных термоциклеров, а также принесла другие преимущества. «Когда вы делаете что-то меньшее, в нем меньше деталей и меньше блок питания … так что это помогает снизить стоимость», — говорит Альварес-Сааведра.

Как они и надеялись, недорогая система MiniPCR сразу же понравилась школам. «Учеба в старшей школе без возможности приблизиться к биотехнологиям была своего рода проблемой для нас [когда мы] становились учеными, поэтому мы хотели устранить эти препятствия», — говорит Кравес.Компания также разработала небольшую простую систему электрофореза в агарозном геле в качестве сопутствующего продукта. Полный комплект с термоциклером MiniPCR, гелевой системой и принадлежностями продается менее чем за 1000 долларов США, что позволяет уложиться в бюджеты многих школьных систем.

Хотя школы стали основным рынком для MiniPCR, другие также быстро приняли эту платформу. Кравес говорит, что полевые ученые, животноводы и пищевые компании все использовали эту систему, часто находя дешевле и быстрее проводить собственные анализы на основе ПЦР на месте, а не отправлять образцы в удаленную лабораторию.

Но самый неожиданный звонок поступил от инженеров, работающих на Международной космической станции. «Мы никогда не проектировали эту технологию так, чтобы она была удобной для космоса, поэтому мы были удивлены, когда космические агентства … сказали нам, что она очень хорошо разработана для космических полетов», — говорит Кравес. Система MiniPCR теперь является основным компонентом текущего конкурса «Гены в космосе», где учащиеся средних школ предлагают эксперименты на основе ПЦР, которые затем проводятся астронавтами на космической станции в условиях микрогравитации
.

Смартфон PCR

MiniPCR была первой компанией, которая запустила ПЦР в космос, но они не единственные, кто пытался сделать этот метод более дешевым и портативным. Ahram Biosystems в Сеуле, Южная Корея, продает миниатюрный термоциклер Palm PCR, который похож на устройство MiniPCR. Между тем, Biomeme в Филадельфии, штат Пенсильвания, выводит идею портативной ПЦР на новый уровень, расширяя ее, чтобы включить ПЦР в реальном времени.

В режиме реального времени или количественной ПЦР (кПЦР) экспериментаторы используют флуоресцентные маркеры для непрерывного мониторинга процесса амплификации ПЦР.Измеряя скорость появления новых копий ДНК, исследователи могут подсчитать, сколько молекул шаблона должно быть в исходном образце. Они также могут считывать результаты непосредственно из реакционных пробирок для ПЦР без использования агарозных гелей. Однако весь этот мониторинг и вычисления требуют значительной вычислительной мощности и дополнительного оборудования, что делает количественную ПЦР еще более сложной и дорогой, чем стандартная ПЦР.

Соучредители Biomeme Марк ДеДжон, Джесси ван Вестринен и Макс Перельман думали, что несвязанная тенденция может помочь вывести количественную ПЦР из лаборатории.«Мы подумали:« Эй, у каждого есть смартфон в кармане », [и] мы действительно не видели, чтобы кто-нибудь использовал их для молекулярной диагностики», — говорит ван Вестринен. Решая те же инженерные проблемы, с которыми MiniPCR столкнулся со своим термоциклером, Biomeme также справился с трудностями добавления оптических датчиков через приложение для смартфона, которое может контролировать и отслеживать реакции qPCR, а также стабильные наборы реагентов для подготовки проб.

Для использования в полевых условиях «пробоподготовка, пожалуй, самая сложная вещь…. и с самого начала одной из наших задач была разработка очень простого продукта, не требующего каких-либо знаний или специального лабораторного оборудования », — говорит ван Вестринен. Результатом стал каталог наборов, предназначенных для различных применений, каждый из которых содержит лиофилизированные реагенты и праймеры, предварительно отмеренные в пробирках для образцов.

Перельман говорит, что с помощью одного из наборов компании минимально обученный экспериментатор может за несколько минут превратить неочищенный образец в набор реакций количественной ПЦР, готовых для термоциклера.Сама машина имеет док-станцию, совместимую со стандартными разъемами для смартфонов. Веб-портал данных Biomeme может хранить полученные необработанные данные, которые исследователи могут анализировать онлайн или загружать на свои компьютеры.

Текущее устройство Biomeme стоит около 4000 долларов США, оно значительно дороже, чем система MiniPCR, но Перельман утверждает, что оно предлагает дополнительную полезность: «Вы можете завершить все менее чем за час … просто проведите пальцем влево или вправо в приложении и вы] можете видеть усиление в реальном времени.Перельман добавляет, что в настоящее время компания работает с пользователями из числа оборонных и правоохранительных органов, а также с учеными и пищевыми компаниями.

Живые и мертвые

В то время как портативный ПЦР значительно расширяет возможности этого метода, исследователи во всем мире также продолжают расширять его возможности бесчисленными способами. Хороший тому пример — отличить живые бактерии от мертвых.

ПЦР

чрезвычайно чувствительна и специфична для обнаружения последовательностей нуклеиновых кислот, но простое знание того, что конкретная последовательность ДНК или РНК присутствует, не доказывает, что она связана с живым организмом.Это серьезная проблема в пищевой промышленности, где как пастеризованные, так и непастеризованные продукты дают положительный результат на патогенные бактерии с помощью ПЦР, даже если бактерии безопасно мертвы в первом и опасно живы во втором. В результате пищевые лаборатории долгое время полагались на относительно медленные и громоздкие анализы культур для окончательного тестирования.

Реагенты

для сшивания ДНК, которые могут проникать только в мертвые бактерии, стали первым крупным достижением в этой области. Сшивание предотвращает амплификацию ДНК мертвых бактерий в последующей реакции ПЦР.С первым поколением этих реагентов было сложно работать, требовалось темное помещение и бережное хранение в холодильнике. Совсем недавно Такаши Соедзима и его коллеги из Morinaga Milk Industry в Канагаве, Япония, разработали стабильные, светостойкие соединения, которые аналогичным образом нацелены на мертвые бактерии. Последняя работа команды касалась реагентов на основе палладия, которые избирательно мешали ПЦР-амплификации ДНК мертвых, но не живых бактерий. Комбинирование палладиевых реагентов с КПЦР позволило провести тест, который может заменить старые и более дорогие методы, оптимизируя производство на молочных заводах и других предприятиях пищевой промышленности ( 1 ).

Избавиться от рака

Исследователи и производители оборудования также внесли более радикальные изменения в ПЦР, заимствуя технологии из других областей. Одна из таких попыток привела к цифровой ПЦР с каплями (ddPCR), которая сочетает в себе аспекты сортировки клеток, активируемых флуоресценцией, с традиционной ПЦР. Хотя протокол ддПЦР несколько сложен, он также стал высоко автоматизированным. Действительно, Bio-Rad в Геркулесе, Калифорния, теперь продает полные аппараты ddPCR, которые могут выполнять всю процедуру автоматически.В этих системах распылитель разделяет подготовленную реакцию ПЦР на тысячи капель размером нанолитр, а затем удерживает капли отдельно во время этапов термоциклирования. Каждая капля содержит собственную серию амплификаций, которые затем машина сортирует с помощью флуоресцентных маркеров для обнаружения целевых последовательностей.

ddPCR оказалась особенно полезной для обнаружения дефицитных мишеней в образцах с очень высокими фоновыми уровнями нецелевой ДНК, таких как маркеры опухоли ДНК, циркулирующие в образцах крови пациентов.Этот метод стал достаточно надежным, поэтому по крайней мере одна компания, Biodesix в Боулдере, штат Колорадо, теперь предлагает клинические тесты, называемые «жидкой биопсией», на основе ddPCR. Используя небольшой образец крови, тест Biodesix может быстро определить точные мутации в опухоли пациента с раком легкого, что позволяет врачам выбрать наиболее эффективные лекарства для этого типа опухоли.

«Как только мы узнаем точные мутации, появятся целевые методы лечения, которые могут повлиять на их результат, и это так…. изменение всей парадигмы того, как мы лечим пациентов », — говорят Марк Боулинг, Пол Р. и Кэтрин М. Хеттингер Уокер, заслуженный профессор клинической онкологии в Университете Восточной Каролины в Гринвилле, Северная Каролина, и один из первых приверженцев новой тестовое задание. В то время как обычный анализ биопсии и секвенирование могут дать ту же информацию, тест Biodesix выполняется намного быстрее. «Мы можем получить результаты тестов в течение трех дней», — говорит Боулинг. Стандартная биопсия может занять более двух недель.Боулинг говорит, что разница может буквально означать жизнь или смерть для пациентов, опухоли которых поддаются таргетной терапии.

Поскольку тест Biodesix основан на ПЦР, ему есть куда расширяться, поскольку производители лекарств выпускают более генетически ориентированные препараты. Однако Боулинг говорит, что даже при ограниченном выборе текущих целевых химиотерапевтических препаратов, знание точного типа опухоли пациента уже примерно в трети случаев меняет стратегию лечения его команды.

Создание лучшего цикла

Клинические испытания всегда были в центре внимания разработчиков ПЦР, но иногда требования техники сдерживали их.Первая публикация, подтверждающая принцип действия, описывающая метод ПЦР Маллиса, продемонстрировала, как его можно использовать для идентификации мутации гемоглобина, ответственной за серповидно-клеточный признак ( 2 ). К сожалению, ПЦР остается слишком дорогостоящим для многих клинических лабораторий в Африке к югу от Сахары, где серповидно-клеточная анемия является эндемическим заболеванием.

Несмотря на то, что ПЦР продолжает расширяться в новые области, эти и другие ограничения вдохновили многочисленных исследователей на разработку альтернативных методов амплификации нуклеиновых кислот.Многие из этих методов работают с аналогичными принципами, но предлагают разные наборы преимуществ. Амплификация с множественным смещением, в которой используется высокопроцессивная полимераза, стала стандартной техникой в ​​геномном секвенировании, в то время как амплификация с вращающимся кругом, которая может многократно копировать целевую последовательность на одну цепь ДНК, нашла широкое применение в биохимии.

Между тем, петлевая изотермическая амплификация (LAMP) стала популярным выбором для исследователей, которые хотят провести тесты на основе ДНК в сельской местности.Как следует из названия, LAMP использует фермент, который может открывать и многократно копировать молекулу ДНК при постоянной температуре, устраняя необходимость в дорогостоящих термоциклерах.

Это привлекательно для таких компаний, как LaCAR MDx Technologies в Льеже, Бельгия, которые пытаются разработать клинические тесты для использования в менее развитых странах. «Мы просто искали способ упростить молекулярно-генетическое тестирование. Вы можете использовать какой-нибудь картридж или [устройство ПЦР], но тогда вам понадобятся дорогие материалы и сложная технология », — говорит Арно Аллаер, генеральный директор LaCAR.

Вместо этого компания начала работать с LAMP и быстро обнаружила, что она чрезвычайно надежна. Помимо работы без термоциклера, тесты компании на основе LAMP могут определять точечные мутации в гене из свежих или замороженных образцов крови или даже из сухих пятен крови на промокательной бумаге, не требуя этапа извлечения ДНК. Наконец, выполнив обещание оригинальной ПЦР-бумаги, LaCAR теперь разработала недорогой и надежный тест на серповидно-клеточный признак, основанный на своих выводах.«Мы провели одно клиническое испытание в Университете Льежа, [и] мы проведем одно также в Конго», — говорит Аллаер ( 3 ).

Независимо от того, производят ли они портативные термоциклеры, используют передовые ПЦР-тесты для быстрой диагностики рака или изучают другие методы, позволяющие избавиться от ограничений ПЦР, эксперты в этой области с оптимизмом смотрят на следующие 35 лет амплификации ДНК. «Это захватывающее время», — говорит Боулинг.

Список литературы

1. T. Soejima, K. Iwatsuki, Appl.Environ. Microbiol. 82 , 6930–6941 (2016).

2. Р. К. Сайки, и др., ., Science , , 230, , 1350–1354 (1985).

3. Л. Детеммерман, С. Оливье, В. Бурс, Ф. Бёмер, Гематология 23 , 181–186 (2018).

Избранные участники

• Рекомендуемый продукт

  Термоциклеры для ПЦР в реальном времени

  Семейство продуктов qTOWER ³ обеспечивает получение точных результатов ПЦР в реальном времени, благодаря точному контролю температуры в блоке образцов, независимо от количества используемых образцов.Запатентованная волоконно-оптическая система челнока с уникальным источником света, состоящим из четырех высокоэффективных светодиодов, гарантирует идеальное возбуждение известных флуоресцентных красителей вплоть до темно-красного диапазона. При этом модуль обнаружения может принимать до шести различных модулей цветных фильтров. Технология серебряных блоков в циклах количественной ПЦР обеспечивает точный контроль ± 0,1 ° C для всего 96-луночного блока в формате 0,2 мл. Благодаря функции градиента устройство может быть оптимально адаптировано для новых анализов.Велосипеды доступны либо как автономные устройства со встроенным сенсорным экраном (10 дюймов), либо как компьютерные системы. Программное обеспечение включает в себя широкий спектр оптимизированных алгоритмов анализа, включая абсолютную и относительную количественную оценку, метод порога дельта-дельта цикла (ddCt), эффективность ПЦР, различение аллелей, определение конечных точек, кривую плавления и анализ белков.

  Аналитик Йена
  
  + 49- (0) -3641-77-7444
  
  http: // www.analytik-jena.de/en

• ДНК-полимераза Taq

  Полимераза

  BioReady Taq — отличный выбор для повседневной ПЦР. Эта рекомбинантная ДНК-полимераза оптимизирована для повышения эффективности и может амплифицироваться от 50 пар оснований (bp) до 5000 bp. При использовании с любым из наших термоциклеров протоколы могут быть выполнены менее чем за 1 час. BioReady Taq производится под строгим контролем GMP, и хотя мы не рекомендуем его, этот ультрачистый ферментный экстракт по-прежнему полностью активен после нескольких дней при температуре 37 ° C.Это также отличный фермент, который следует учитывать для значительного снижения стоимости ваших количественных экспериментов ПЦР.

  Бульдог Био
  
  603-570-4248
  
  http://www.bulldog-bio.com/bioreadyrtaq.html

• ПЦР-машина

  Новый Mastercycler X50 от Eppendorf позволяет проводить ПЦР с выдающейся скоростью и возможностями оптимизации. При средней скорости нагрева 10 ° C / с Eppendorf предлагает 96-луночный циклер для быстрого циклирования, совместимый с расходными материалами стандартного формата.Оптимизация ПЦР достигает новых масштабов с инновационным 2D-градиентом, который приносит совершенно новые ожидания в отношении выходов и специфичности ПЦР. Кроме того, интуитивно понятный интерфейс с сенсорным экраном помогает пользователям программировать циклер ПЦР еще быстрее, а возможность подключения к программному обеспечению VisioNize от Eppendorf предлагает широкий спектр функций мониторинга.

  Eppendorf
  
  800-645-3050
  
  http://www.eppendorf.com

• Система генотипирования SNP

  Система генотипирования rhAmp SNP от компании

  Integrated DNA Technologies позволяет исследователям делать точные, достоверные данные о однонуклеотидном полиморфизме (SNP) быстро и с минимальными затратами.В технологии rhAmp используется уникальная двухферментная система рибонуклеаза h3 / ДНК-полимераза, связанная с гибридными праймерами РНК-ДНК, для устранения неспецифической амплификации и образования праймер-димер, которые являются проблемой для других методов генотипирования. Химический состав rhAmp SNP соответствует текущему лидеру рынка по точности (точность определения более 99,5% в более чем 90% анализов), а также обеспечивает простые, быстрые и доступные результаты с доставкой анализов менее чем за семь рабочих дней. Сэкономив время и упростив рабочий процесс, rhAmp SNP предлагает простую установку для анализа с одной пробиркой, которая легко автоматизируется и предназначена для работы на всех ведущих коммерчески доступных платформах количественной ПЦР.Индивидуальный дизайн анализа также доступен для патентованных и нечеловеческих дизайнов SNP. Инструмент разработки генотипа rhAmp может создавать дизайны в областях со сложной последовательностью, вмещая очень короткие ампликоны (всего 40 пар оснований).

  Интегрированные ДНК-технологии
  
  800-328-2661
  
  http://www.idtdna.com

• Бусины для ПЦР

  PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads — это предварительно смешанные, предварительно дозированные, однократные реакции, оптимизированные для выполнения стандартных амплификаций ПЦР.Использование рекомбинантной ДНК-полимеразы PuReTaq и других реагентов высокой чистоты гарантирует надежную и стабильную работу как в конечных точках, так и в ПЦР-амплификациях на основе флуоресценции в реальном времени, а также обеспечивает минимально возможные уровни загрязнения прокариотических и эукариотических нуклеиновых кислот. Эти шарики предварительно составлены для обеспечения большей воспроизводимости между реакциями, минимизации этапов дозирования и снижения вероятности ошибок и загрязнения при дозировании. Единственными необходимыми дополнительными реагентами являются вода, праймеры и матричная ДНК.Гранулы предварительно распределяются в пробирки для ПЦР емкостью 0,2 или 0,5 мл. Пробирки на 0,2 мл также поставляются в формате 96-луночного (8 × 12) планшета, что позволяет легко снимать отдельные полоски из восьми пробирок. Такая гибкость позволяет использовать весь планшет, полоски из восьми или отдельные пробирки объемом 0,2 мл.

  GE Healthcare Life Sciences
  
  800-526-3593
  
  http://www.gelifesciences.com

• Планшеты для ПЦР

  Планшеты

  FrameStar оснащены тонкостенными полипропиленовыми трубками для оптимальных результатов ПЦР в сочетании с жесткой рамкой из поликарбоната для повышения термостойкости планшета во время ПЦР.В отличие от стандартной полипропиленовой пластины, пластина FrameStar не деформируется и не расширяется при быстром нагреве и охлаждении, поэтому целостность уплотнений останется постоянной, и меньшая часть вашего образца испарится. С FrameStar вы можете меньше тратить на дорогие реагенты, потому что вы сохраните больше во время ПЦР. Каждая разновидность планшетов бывает разного цвета, включая белые лунки для ПЦР в реальном времени и количественной ПЦР.

  4titude
  
  + 44- (0) -1306-884-885
  
  http: // www.4ti.co.uk/pcr/framestar-pcr-qpcr-plates/about-framestar

Отправьте пресс-релиз / описание нового продукта или информацию о литературе по адресу [email protected]. Посетите Science New Products для получения дополнительной информации.

В этом пространстве представлены недавно предлагаемые приборы, аппаратура и лабораторные материалы, представляющие интерес для исследователей всех дисциплин в академических, промышленных и государственных организациях. Особое внимание уделяется назначению, основным характеристикам и наличию продуктов и материалов.Подтверждение Science или AAAS любых упомянутых продуктов или материалов не подразумевается. Дополнительную информацию можно получить у производителя или поставщика.

приложений ПЦР — семь основных категорий | Thermo Fisher Scientific

ПЦР имеет широкий спектр применения не только в фундаментальных исследованиях, но и в области медицинской диагностики, судебной медицины и сельского хозяйства.Как описано на этой странице, некоторые примеры приложений ПЦР включают:

Типы и приложения ПЦР-реакций

Протоколы для ПЦР могут различаться в зависимости от приложений.В этом видеоролике представлен обзор рутинной ПЦР, ПЦР с горячим стартом, ПЦР с высокой точностью, ПЦР с высоким содержанием ГХ и длительной ПЦР.

Экспрессия гена

Вариации экспрессии генов среди типов клеток, тканей и организмов в определенный момент времени обычно исследуются с помощью ПЦР.В этом процессе РНК выделяется из представляющих интерес образцов, а информационная РНК (мРНК) подвергается обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК). Затем исходные уровни мРНК можно определить по количеству кДНК, амплифицированных в ПЦР. Этот процесс также известен как ПЦР с обратной транскрипцией , или RT-PCR ( Рисунок 1 ).

Рисунок 1.ОТ-ПЦР. РНК обратно транскрибируется в кДНК, которая, в свою очередь, амплифицируется с помощью ПЦР (RT = обратная транскрипция, RTase = обратная транскриптаза).

Конечная ПЦР может быть проведена для количественной оценки экспрессии РНК по интенсивности амплифицированных продуктов в геле, хотя это полуколичественный подход.Например, вводимая кДНК последовательно разбавляется, а затем амплифицируется. Конечные выходы различных входов визуализируются на геле (, рис. 2, ), а затем интенсивности полос количественно оцениваются и нормализуются к таковым для эталонного гена для оценки относительного уровня экспрессии амплифицированной мишени [1,2] . Сегодня ПЦР в реальном времени или кПЦР в основном заменили ПЦР по конечным точкам для получения более надежных и количественных результатов экспрессии генов (подробнее о количественной ПЦР и обратной транскрипции).

Рисунок 2.Выходы ПЦР, полученные из серийных разведений исходной кДНК, визуализированные окрашиванием продуктов ПЦР на агарозном геле.

Генотипирование

ПЦР можно использовать для обнаружения вариаций последовательности аллелей в конкретных клетках или организмах.Примером может служить генотипирование трансгенных организмов, таких как нокаутные и нокаутные мыши [3]. Наборы праймеров предназначены для фланкирования представляющих интерес областей и оценки генетических вариаций на основе присутствия или отсутствия ампликона и / или его длины (, фиг. 3, ). (Примечание по приложению: генотипирование мышей, обзорная статья: советы pcr по генотипированию мышей)

Рисунок 3.ПЦР для аллельного генотипирования трансгенных организмов. (A) Последовательности дикого типа или трансгенные последовательности в геномном локусе могут быть обнаружены путем конструирования праймеров ПЦР, специфичных для интересующих областей. (B) Продукты ПЦР можно использовать для определения генотипов, как показано на этом изображении геля. В этих экспериментах использовалась геномная ДНК мышей дикого типа (+ / +) и трансгенных (+/– и — / -) мышей.

Шесть советов ПЦР для быстрого генотипирования мышей

Вы тратите слишком много времени на генотипирование трансгенных мышей с помощью ПЦР? Посмотрите это видео с шестью советами по ПЦР, которые помогут вам завершить работу всего за час.

Однако для обнаружения специфических нуклеотидных мутаций амплифицированные последовательности должны быть дополнительно проанализированы. Например, секвенирование ампликонов ПЦР — один из подходов к изучению однонуклеотидных вариаций (SNV) и однонуклеотидных полиморфизмов (SNP).Настоятельно рекомендуется использовать ДНК-полимеразы высокой точности для предотвращения появления нежелательных мутаций во время ПЦР.

Генотипирование с помощью ПЦР также является фундаментальным аспектом генетического анализа мутаций рака и наследственности.

Клонирование

ПЦР широко используется для клонирования представляющих интерес фрагментов ДНК в методике, известной как клонирование ПЦР.В прямого клонирования ПЦР желаемый участок источника ДНК (например, гДНК, кДНК, плазмидная ДНК) амплифицируется и вставляется в специально разработанные совместимые векторы. Альтернативно, праймеры могут быть сконструированы с дополнительными нуклеотидами на их 5′-конце для дальнейших манипуляций перед вставкой. Примеры этих дополнительных последовательностей включают сайты рестрикции для клонирования посредством рестрикционного переваривания и лигирования, векторные-совместимые последовательности для независимого от лигирования клонирования и рекомбинационные последовательности для мультифрагментной сборки ( фиг. 4). (подробнее см. Веб-семинар по клонированию ПЦР)

Фигура 4. Клонирование ПЦР: вставки, полученные с помощью ПЦР, клонированы в совместимые векторы. ( A ) Методы прямого клонирования ПЦР включают ТА и клонирование с тупым концом. ( B ) При непрямом клонировании ПЦР ампликоны модифицируют, например, путем рестрикционного переваривания, перед вставкой в ​​совместимые векторы.

Поскольку праймеры синтезируются в направлении от 3 ‘до 5’, неудачный или неполный синтез этих олигонуклеотидов ДНК будет иметь усеченные 5 ‘последовательности.Поэтому рекомендуется очистка для удаления из синтеза не только избыточных реагентов, но и неполноразмерных олигонуклеотидов ДНК, чтобы обеспечить успешное клонирование желаемого фрагмента ПЦР.

Помимо подготовки вставки, ПЦР является полезным методом после клонирования для скрининга того, несут ли колонии желаемую вставку. Праймеры могут быть разработаны для определения присутствия вставки, а также ориентации в векторе (узнайте больше о скрининге колоний с помощью ПЦР).

Мутагенез

Одним из преимуществ клонирования с помощью ПЦР является возможность введения желаемых мутаций в интересующий ген посредством клонирования для исследований мутагенеза.В сайт-направленном мутагенезе праймеры ПЦР конструируются для включения замен, делеций или вставок оснований в определенной последовательности. На схемах, показанных на фиг. 5 , праймеры направлены на последовательность, которая уже была клонирована в плазмиде. Продукт ПЦР, содержащий введенную мутацию, затем самолигируется для регенерации кольцевой плазмиды и используется для трансформации компетентных клеток (примечание к приложению: сайт-направленный мутагенез).

Рисунок 5.ПЦР в сайт-направленном мутагенезе. В этом подходе используются неперекрывающиеся праймеры (красная звездочка = мутантный нуклеотид, серая линия = удаленная последовательность, синяя линия = вставленная последовательность). Также могут быть рассмотрены альтернативные конструкции праймеров, например с 5′-перекрывающимися последовательностями [4-6].

Важные соображения для экспериментов по сайт-направленному мутагенезу включают:

1. Грунтовка дизайнерская
2. Выбор ДНК-полимеразы
3. Параметры ПЦР

Дизайн праймера: При разработке мутагенных праймеров желательно размещать мутированную последовательность ближе к середине праймера или по крайней мере на расстоянии 7-8 нуклеотидов от 3′-конца.Это обеспечивает эффективное 3′-удлинение и предотвращает репарацию оснований ошибочного спаривания (3 ‘→ 5’-экзонуклеазная активность) ДНК-полимеразой. Очистка праймеров ПЦР рекомендуется для максимального повышения эффективности мутагенеза и клонирования (подробнее: технические ресурсы Oligo).

Выбор ДНК-полимеразы: Использование ДНК-полимеразы высокой точности имеет решающее значение для создания фрагментов ПЦР с желаемой мутацией без внесения непреднамеренных ошибок. Кроме того, выбранная ДНК-полимераза должна иметь возможность амплифицировать всю длину матричной ДНК (например,g., чтобы получить полноразмерную мутантную плазмиду).

Параметры ПЦР: Частота ошибок ПЦР ниже при более коротких мишенях ПЦР и меньшем количестве циклов ПЦР. Для сохранения точности последовательности при амплификации более длинной ДНК и / или для получения высоких выходов за счет меньшего количества циклов ПЦР рекомендуется ДНК-полимераза с чрезвычайно высокой точностью воспроизведения и высокой процессивностью (подробнее о характеристиках ДНК-полимеразы).

Для введения множественных сайтов мутаций могут быть разработаны мутагенные праймеры с перекрывающимися гомологичными последовательностями для ПЦР.Гомологичные концы ампликонов затем рекомбинируют направленно, в результате чего получается плазмида с желаемыми множественными мутациями (, фиг. 6, ). Этот подход можно использовать не только для генерации мутаций в плазмиде, которая слишком длинная для амплификации с помощью одной ПЦР, но и для того, чтобы избежать более высокой частоты ошибок при длительной амплификации ПЦР (узнайте больше о длинной ПЦР).

Рисунок 6.Сайт-направленный мутагенез с использованием праймеров ПЦР с мутантными последовательностями и гомологичными концевыми последовательностями. Подход, показанный здесь, описывает механизм наборов для сайт-направленного мутагенеза Invitrogen GeneArt, где квадратные блоки представляют сайты рекомбинации и мутагенные сайты.

Метилирование

ПЦР можно использовать для исследования локус-специфического метилирования.В методе, называемом специфической для метилирования ПЦР (MSP) , две пары праймеров конструируются для дифференциации состояния метилирования интересующего локуса [7,8].

В MSP образцы ДНК сначала обрабатывают бисульфитом для преобразования неметилированного цитозина (C) в урацил (U). Обработка бисульфитом не влияет на метилированный цитозин ( ^m5 C). Для обнаружения метилированных сайтов конструируют одну пару праймеров с гуанином (G) для спаривания с ^m5 C в целевой последовательности; для обнаружения неметилированных сайтов конструируется другая пара праймеров с аденином (A) для спаривания с U в молекулах, преобразованных бисульфитом (а затем спаривается с тимином (T) в последующих циклах ПЦР).Положительная амплификация ПЦР в результате связывания праймера используется для определения состояния метилирования локуса (, фиг. 7, ). (Также узнайте об анализе метилирования рестрикционными ферментами.)

Рисунок 7.ПЦР, специфичная для метилирования. На первом этапе образцы ДНК обрабатывают бисульфитом для преобразования неметилированного цитозина в урацил. Два набора праймеров для ПЦР (метилирование и неметилирование) разработаны для дифференциации состояния метилирования локуса на основе амплификации обработанной бисульфитом ДНК. Неметилированная ДНК присутствует в виде одиночных цепей после обработки бисульфитом из-за несоответствий G-U, и для упрощения здесь показана только одна цепь ДНК.

Поскольку MSP во многом зависит от специфичности праймера по отношению к последовательности, преобразованной в бисульфит, дизайн праймера играет решающую роль в успехе эксперимента.Во-первых, сайты связывания праймера должны содержать чувствительные к метилированию остатки, чтобы можно было обнаружить метилированные или неметилированные последовательности. Во-вторых, неметилированные праймеры обычно богаты АТ и, следовательно, должны быть длинными (например,> 30 нуклеотидов) с T _m ≥60 ° C для обеспечения специфического отжига. Кроме того, последовательности с высоким AT часто способствуют образованию димера праймера, гибридизации с ошибочным спариванием, проскальзыванию ДНК-полимеразы и смещению амплификации. Следовательно, выбранная ДНК-полимераза должна иметь возможность амплифицировать матрицы с широким диапазоном содержания AT / GC.В-третьих, специфичность праймера должна быть эмпирически проверена с контрольными ДНК с известными и неизвестными состояниями метилирования для оценки ложноположительных результатов. Чтобы помочь различать состояния метилирования по несовпадениям пар оснований, рекомендуется конструировать праймеры для метилирования и неметилирования с парой G-A или T-C на их 3′-концах (, рис. 7, ).

Помимо амплификации последовательностей, богатых AT, ДНК-полимераза должна быть способна считывать остатки U в ДНК после обработки бисульфитом. Большинство высокоточных ДНК-полимераз не подходят для MSP (если они специально не модифицированы) из-за наличия урацил-связывающего кармана из их архейского происхождения.Точно так же присутствие U в матричной последовательности не позволяет обрабатывать UDG для предотвращения заражения переносом ПЦР.

Вместо конечной ПЦР можно использовать ПЦР в реальном времени с MSP для более количественного анализа метилирования. С помощью ПЦР в реальном времени анализ кривой плавления ампликонов ПЦР является альтернативным основанным на ПЦР подходом для определения состояния метилирования интересующего локуса.

Последовательность действий

ПЦР — это относительно простой подход к обогащению матричной ДНК для секвенирования.Для подготовки матриц секвенирования настоятельно рекомендуется использовать ПЦР с высокой точностью, чтобы сохранить точность последовательности ДНК.

При секвенировании по Сэнгеру фрагменты, амплифицированные с помощью ПЦР, очищаются и подвергаются реакциям секвенирования. Праймеры ПЦР могут быть помечены на своих 5′-концах обычно используемым сайтом связывания для праймеров секвенирования (например, сайтом связывания «универсального праймера» M13 или T7) для упрощения рабочего процесса секвенирования (, фиг. 8, ).

Рисунок 8.Подготовка ампликонов ПЦР для секвенирования по Сэнгеру. Праймеры для ПЦР могут быть помечены общими сайтами праймеров для секвенирования для облегчения рабочего процесса.

В секвенировании следующего поколения (NGS) ПЦР широко используется для создания библиотек секвенирования ДНК. При подготовке библиотеки NGS образцы ДНК обогащаются с помощью ПЦР (когда начальное количество ограничено) и маркируются адаптерами секвенирования (вместе с уникальными штрих-кодами или индексами для мультиплексирования) ( Рисунок 9 ).В дополнение к высокой точности используемые ДНК-полимеразы должны демонстрировать минимальное смещение при амплификации, чтобы обеспечить репрезентативный охват библиотек секвенирования.

Рисунок 9.ПЦР при подготовке образцов ДНК для секвенирования следующего поколения.

Медицинские, судебно-медицинские и прикладные науки

Помимо фундаментальных исследований, технологии на основе ПЦР ежедневно используются в клинической диагностике, судебно-медицинских исследованиях и сельскохозяйственных биотехнологиях.Эти приложения требуют надежной работы, превосходной чувствительности и строгих технических характеристик. Таким образом, термоциклеры и реагенты должны соответствовать требованиям и специально разработаны для этих целей. Примеры молекулярной диагностики включают генетическое тестирование, обнаружение онкогенных мутаций и тестирование на инфекционные заболевания. В судебной медицине идентификация человека с помощью ПЦР основана на амплификации уникальных коротких тандемных повторов (STR) на гДНК для дифференциации людей. В сельском хозяйстве ПЦР играет важную роль в обнаружении пищевых патогенов, генотипировании растений для селекции и тестировании на ГМО.

В заключение, с момента своего появления в 1980-х годах, ПЦР продолжает доказывать, что является полезным инструментом с широким применением в биологии открытий, медицинской диагностике, судебной медицине и сельском хозяйстве.

1. Raeymaekers L (1999) Общие принципы количественной ПЦР. В: Kochanowski B, Reischl U (редакторы), Quantitative PCR Protocols .Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. С. 31–41.
2. Siebert PD (1999) Количественная ОТ-ПЦР. В: Kochanowski B, Reischl U (редакторы), Quantitative PCR Protocols . Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. С. 61–85.
3. Nobel Media AB (2014) Нобелевская премия по физиологии и медицине 2007 г. — Дополнительная информация . nobelprize.org
   
4. Zheng L, Baumann U, Reymond JL (2004) Эффективный одностадийный протокол сайт-направленного и сайт-насыщенного мутагенеза. Nucleic Acids Res 32 (14): e115.
5. Liu H, Naismith JH (2008) Эффективный протокол одноэтапной сайт-направленной делеции, вставки, одно- и многосайтового мутагенеза плазмиды. BMC Biotechnol 8:91.
6. Xia Y, Chu W, Qi Q et al. (2015) Новое понимание процесса QuikChange ™ помогает использовать ДНК-полимеразу Phusion для сайт-направленного мутагенеза. Nucleic Acids Res 43 (2): e12.
7. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996) ПЦР, специфичная для метилирования: новый анализ ПЦР для определения статуса метилирования CpG-островков. Proc Natl Acad Sci U S A 93 (18): 9821–9826.
8. Huang Z, Bassil CF, Murphy SK (2013) ПЦР, специфичная для метилирования. Методы Мол Биол 1049: 75–82.

Для чего используется ПЦР? — Science Learning Hub

Этот интерактивный курс исследует ряд приложений, в которых используется полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для создания миллионов копий целевого участка ДНК.Это незаменимый инструмент в современной молекулярной биологии, который изменил научные исследования и диагностическую медицину.

ПЦР и ее разновидности имеют широкий спектр специализированных приложений и используются учеными во всех областях биологии. Результаты также используются учеными во многих других областях.

Читать Что такое ПЦР? для получения дополнительной информации о том, что участвует в процессе ПЦР. Современная биотехнология представляет некоторые способы, которыми ДНК-технологии изменили возможности ученых.

В этом интерактивном режиме вы узнаете о разнообразных технологиях, которые возможны благодаря ПЦР.

Благодарности
Science Learning Hub выражает признательность следующим правообладателям за использование их изображений в нашем интерактиве:
Медицинское изображение, Стивен Максуини, лицензировано через 123RF Ltd
Forensics fingerprint image, Arfo, лицензировано через 123RF Ltd
Food and Agriculture sweetcorn image, Максим Народенко, лицензировано 123RF Ltd
Genetics double helix image, Pedro Nogueira, лицензировано 123RF Ltd

Стенограмма

Экологическая микробиология

ПЦР способствует нашему пониманию многих экологических проблем, особенно в тех случаях, когда обнаружение микроорганизмов в окружающая среда не требуется.ПЦР позволяет идентифицировать и количественно определять конкретные виды-мишени, даже если их количество очень мало. Одним из распространенных примеров является поиск патогенов или индикаторных видов, таких как колиформные бактерии, в системах водоснабжения.

Узнайте, как ученые использовали ПЦР для изучения окружающей среды в разделах «Разработка анализа», «Обнаружение вирусов в окружающей среде», «Жизнь в верхних слоях тропосферы» и «Охотники за вирусами».

Для размышлений:
Как население, мы становимся больше осознают важность качества воды.Кто должен следить за качеством воды? Кому следует предоставить доступ к информации о качестве воды? Кто несет ответственность за поддержание хорошего качества воды?

Благодарности:
Изображение предоставлено Пламеном Петровым, лицензировано 123RF Ltd.

Потребительская геномика

ПЦР позволила провести персонализированное тестирование генома. Возникла индустрия, предлагающая потребителям индивидуальные продукты и услуги, основанные на информации в их геноме. Например, нутригеномика — это особая форма потребительской геномики, связывающая генетическую информацию с информацией о продуктах питания, которые могут быть лучше или хуже при определенных состояниях, таких как воспалительное заболевание кишечника.

Пища для размышлений:
Как вы можете быть уверены, что продукты действительно полезны? Как вы можете быть уверены, что заявления о продукте являются научно достоверными?

Благодарности:
Image © 2006 Ewan Grant-Mackie.

Судебная медицина

ПЦР очень важна для идентификации преступников и сбора органических доказательств с места преступления, таких как кровь, волосы, пыльца, сперма и почва. Отпечатки пальцев ДНК (также называемые профилями ДНК), идентификация семейных отношений, выделение геномной ДНК и другие методы молекулярной диагностики и биохимические анализы могут проводиться судебно-медицинской экспертизой с помощью ПЦР.ПЦР позволяет идентифицировать ДНК по крошечным образцам — одной молекулы ДНК может быть достаточно для амплификации ПЦР.

Узнайте больше об извлечении ДНК, профилировании ДНК, криминалистике — интересные факты, криминалистике и ДНК или попробуйте детективную деятельность ДНК.

Для размышлений:
В настоящее время судебно-медицинские эксперты могут сравнивать ДНК места преступления только с базой данных образцов ДНК известных преступников.

Что вы думаете об идее создания национальной (и международной) базы данных всех профилей ДНК человека для помощи в идентификации преступников? Какие могут быть последствия для нашего общества, если ДНК каждого человека будет записана и предоставлена ​​правоохранительным органам? Какие могут быть последствия для более широкого доступа к информации?

Выражение признательности:
Paul Fleet / 123RF Ltd

Medicine

ПЦР позволил осуществить ценные разработки в нескольких медицинских дисциплинах.Например, теперь он используется для диагностики и, следовательно, помощи в лечении многих заболеваний, и он широко используется в исследованиях по диагностике, лечению и потенциальному излечению для ряда многих других. Подробнее читайте в статье Использование ПЦР в медицине.

Благодарности:
Изображение любезно предоставлено компанией Living Cell Technologies Ltd.

Филогенетика

Небольшие количества ДНК, включая древнюю ДНК, из таких источников, как волосы, кости и другие ткани, можно амплифицировать с помощью ПЦР.Затем ДНК может быть идентифицирована и проанализирована, а геномы могут быть секвенированы. Эти процессы позволяют ученым расширять свои знания и понимание эволюции и палеонтологии. Секвенирование генома также может помочь в филогенетических исследованиях, что приведет к лучшему пониманию эволюционных взаимоотношений организмов друг с другом. Эта информация может быть полезна ученым в поддержке усилий по сохранению, изучению эволюции и пониманию уникальных приспособлений.

В Science Learning Hub есть несколько статей, посвященных примерам новозеландских исследований в этой области, например,

Извлечение древней ДНК, Wētā poo и ДНК, коралловые водоросли на субантарктических островах Новой Зеландии, штрих-кодирование новозеландских болотных кур, штрих-кодирование ДНК, ДНК секвенирование, секвенирование ДНК акулы и секвенирование генома яблока.

Работа на благо:
Как, по вашему мнению, лучшее понимание генетики может помочь в сохранении?

Благодарности:
Изображение любезно предоставлено Бенце Виолой, Институт Макса Планка.

Продовольствие и сельское хозяйство

Генетические технологии включают в себя ряд методов, которые позволяют модифицировать существующие организмы с целью улучшения пищевых продуктов и производства пищевых продуктов. Конечно, селекционное разведение существует уже много веков, но теперь генетический код может быть изменен намеренно.Генетические манипуляции также могут быть гораздо более целенаправленными, а новые культуры выращивать гораздо быстрее. В Новой Зеландии генетическая модификация в настоящее время контролируется Законом об опасных веществах и новых организмах, находящимся в ведении Управления по охране окружающей среды, хотя изменения в 2017 году приведут к тому, что это будет перенесено в Закон об охране здоровья и безопасности на рабочем месте, а также в новый набор Правил по опасным веществам, которые будут введены в действие. администрируется WorkSafe.

Пища для размышлений:
Какие риски могут быть связаны с использованием генетических технологий для изменения наших пищевых продуктов? Как мы можем обеспечить безопасность наших продуктов? Какие преимущества может принести увеличение производства продуктов питания?

Благодарности:
Image © Goetz Laible, AgResearch, Ruakura.

Использование ПЦР в медицине

Какие риски могут быть связаны с использованием генетических технологий для изменения наших пищевых продуктов? Как мы можем обеспечить безопасность наших продуктов? Какие преимущества может принести увеличение производства продуктов питания?

Благодарности:
Goetz Laible, AgResearch, Ruakura.

Генетические исследования

Существует множество областей генетических исследований, в которых ПЦР используется в качестве важного инструмента. Большинство этих технологий имеют многопрофильное применение. Они включают создание, обнаружение и мониторинг генетически модифицированных организмов (ГМО), генную инженерию, модификацию генов, трансгенику, клонирование, гибридизацию, синтетическую биологию и направленную эволюцию.

Статьи и видео для получения дополнительной информации о некоторых из этих идей включают Тестирование гена казеина, Направленную эволюцию, Генетическую модификацию, Трансгенные коровы — введение, Создание трансгенного растения, Создание трансгенной коровы и Бактериальные библиотеки для улучшения белков.

Этика и наука:
Новые биотехнологии вызвали у общественности озабоченность по поводу их безопасности. Как может общественность принимать решения о том, какие методы и технологии приемлемы, а какие нет?

Благодарности:
Ричард Э.Вейле, Политехнический институт Вирджинии и Государственный университет, факультет садоводства

Типы ПЦР, используемые для генетических исследований: приложения, в которых различные типы ПЦР играют жизненно важную роль

В последние десятилетия генетические исследования бурно развиваются благодаря появлению новых технологий, прорывов в секвенировании и прогрессирующей сложности ПЦР. В этом кратком обзоре рассматриваются несколько приложений или областей генетических исследований и то, как ПЦР используется в этих типах исследований.

С расширением области генетических исследований расширилась и ПЦР. В настоящее время разработаны адаптированные варианты ПЦР, которые используются для подтверждения исследований, чтобы быть основным инструментом для поиска или для восходящего и нисходящего анализа.

ПЦР для генотипирования

Что такое генотипирование: При генотипировании используется информация о секвенировании для определения генетических различий или вариантов у людей или в биологических популяциях. Этот тип техники используется для исследования заранее определенной и очень специфической области генома.Например, если подумать о человеческой ДНК, большая ее часть идентична от одного человека к другому (более 99%), но все же есть различия от одного человека к другому, что делает нас очень уникальными. Генотипирование можно использовать для анализа некоторых из этих различий.

Иногда возникает вопрос, в чем разница между генотипированием и секвенированием. Секвенирование рассматривает геномную информацию от начала до конца, тогда как генотипирование рассматривает очень специфический аспект генома и сравнивает его с известными данными секвенирования.Это сравнение позволяет исследователям изучить различия в генетическом составе человека или популяции. Часто аналогия с книгой используется для описания разницы между генотипированием и секвенированием, когда вся книга будет вашим геномом, а секвенирование этой книги будет похоже на чтение всех букв в книге. Если в некоторых книгах была ошибка печати, когда на определенной странице отсутствовала одна буква, генотипирование было бы инструментом, исследующим такой тип ситуации.

Как ПЦР используется для генотипирования: Понимание генетической структуры позволяет исследователям получить больше информации о фенотипических признаках.Количественная ПЦР (кПЦР) — это только один из методов генотипирования, который используется для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Преимущества использования количественной ПЦР заключаются в возможности быстро и точно получать результаты и сводить к минимуму использование других опасных материалов.

ПЦР

для генотипирования обычно включает разработку праймеров, специфичных для изучаемой мутации или аллеля.

Типы ПЦР, используемые для генотипирования:

• PCR
• КПЦР
• ПЦР с последующим полиморфизмом длины рестрикционного фрагмента (ПЦР-ПДРФ)

ПЦР для анализа на микрочипах

Что такое анализ микроматрицы: Анализ микроматрицы рассматривает, какие гены включают в определенное время с обработкой или без нее (экспериментальные условия), и он может одновременно оценивать тысячи образцов.

Например, определенные гены включаются ночью, что приводит к экспрессии белков, специфичных для этого периода времени. В течение дня эти ночные гены выключены, и другие наборы генов могут быть включены, генерируя другие типы белков, необходимые в дневное время.

Анализ микрочипов

— это один из способов, с помощью которого исследователи могут понять, какие гены включены или выключены и когда.

При микроматричном анализе образец ткани можно сравнить с контрольным образцом, чтобы определить различия в уровне экспрессии между ними.Во время анализа микроматрицы флуоресцентный краситель прикрепляется к небольшим фрагментам кДНК, ранее полученным из экспериментальных и контрольных образцов. Красный краситель используется для мечения экспериментальной кДНК, а зеленый краситель используется для мечения контрольной кДНК. Процесс происходит на чипе, который имеет тысячи дополнительных фрагментов ДНК как для экспериментальных, так и для контрольных. Смесь флуоресцентно меченных контрольных и экспериментальных фрагментов кДНК наносят на чип и гибридизуют с его комплементарной цепью.

Результаты обозначаются зеленым, красным или желтым цветом. Зеленый цвет будет представлять высокие уровни экспрессии из контроля, красный — более высокие уровни в экспериментальном образце, а желтый — равные уровни экспрессии.

Как ПЦР используется для микрочипов: ПЦР может играть разные роли в отношении анализа микрочипов. RT-PCR иногда используется перед микрочипом для амплификации кДНК для анализа. Количественная ПЦР (кПЦР) — важный этап валидации микрочипов, позволяющий исследователям быть уверенными в результатах экспрессии генов.В то время как микроматрица анализирует относительные уровни экспрессии от одного образца к сравнительному эталонному образцу, qPCR обеспечивает количественные уровни экспрессии.

Иногда выбирают один метод вместо другого — ситуация кПЦР против микроматрицы. Если дело доходит до выбора между методами, исследователи должны выбрать количественную ПЦР при оценке экспрессии генов в известных образцах. Микроматрица, с другой стороны, подходит для ситуаций, когда изучается большее количество генов, или для анализа всего транскриптома между двумя образцами.Кроме того, микроматрицу следует проводить только при наличии хорошей эталонной последовательности.

Вывод заключается в том, что количественная ПЦР и микроматрица могут идти рука об руку, использоваться вместо друг друга или использоваться для проверки. В конечном итоге связь между этими двумя методами будет зависеть от экспериментальных целей.

Типы ПЦР, используемые для микрочипов:

ПЦР для секвенирования РНК (RNA-seq)

Что такое секвенирование РНК (RNA-seq): RNA-seq — это метод профилирования, используемый для определения типов генов, которые включают , и на каком уровне они экспрессируются.В процессе используется технология секвенирования следующего поколения (NGS) для анализа уровней и количества экспрессии.

RNA-seq позволяет исследователям изучать общий состав РНК внутри клетки (транскриптом) и связывать геномную информацию с функциональностью белка. Подобно микроматрице, RNA-seq дает нам представление о том, какие гены включаются в определенные периоды или при определенных условиях, что позволяет нам сравнивать продукцию белка в различных экспериментальных условиях. Используя технологию NGS, исследователи теперь могут выполнять точное секвенирование РНК с высокой производительностью.

Как используется ПЦР для RNA-seq: ПЦР может использоваться в производстве библиотеки RNA-seq (получение кДНК из мРНК), а также при амплификации образцов для секвенирования. Первая часть процесса включает обратную транскрипцию для получения кДНК. Затем следует амплификация с помощью ПЦР.

Эмульсионная ПЦР (ePCR) — это еще один вариант ПЦР, обычно используемый для амплификации перед NGS. В этом типе ПЦР используются поверхности шариков, вода и масло.ПЦР эмульсии позволяет одновременно амплифицировать каждую последовательность без риска контаминации. Здесь каждая гранула действует как микрореактор для ПЦР, каждая из которых содержит одну цепь ДНК.

Bridge PCR — еще один метод, используемый для амплификации последовательностей до NGS. Здесь два типа олигонуклеотидов прикреплены к проточной ячейке. Каждый олиго комплементарен каждому адаптеру, фланкирующему фрагмент ДНК. Фланговые адаптеры позволяют формировать мост между двумя типами олигонуклеотидов. После денатурирования каждой копии одиночные нити соединяются с олигонуклеотидами, и процесс повторяется.

Типы ПЦР, используемые для РНК-seq:

• ОТ-ПЦР
• ОТ-КПЦР
• Эмульсионная ПЦР (ePCR)
• Мостик PCR

ПЦР для однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)

Что такое однонуклеотидный полиморфизм (SNP): Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) — это однонуклеотидные замены в определенной области генома, встречающиеся у более чем 1% данной популяции.Геном человека примерно на 99,5% идентичен от одного человека к другому. Из этой вариации 0,5% SNP составляют около 90%. Эти вариации делают организмы уникальными. У людей SNP (произносится как snips ) являются наиболее распространенным типом генетической изменчивости и встречаются с частотой примерно один из каждых 100–300 нуклеотидов. Обычно они являются результатом ошибки копирования или исправления, но также могут быть результатом заболеваний, вызывающих мутации.

Хотя SNP довольно часто встречаются в геноме человека, они вряд ли будут влиять на клеточную функцию, если замена не происходит в кодирующей белок области генома.Тем не менее, SNP, обнаруженные в некодирующих регионах, могут по-прежнему приводить к факторам риска заболеваний и рака. SNP не только связаны с фенотипами заболеваний, но также могут быть связаны с различными характеристиками организмов. SNPedia — это база данных типа вики, посвященная изучению вариаций в генетике человека. Среди некоторых из наиболее широко исследуемых SNP перечислены вариации, вызывающие характеристики ушной серы, факторы риска рака груди и диабета 2 типа, влияние рецепторов окситоцина и многое другое.

Изучение SNP дает исследователям представление о заболеваниях, а не только их причинах — SNP также помогают исследователям идентифицировать регионы, соответствующие конкретным заболеваниям.

Как ПЦР используется для анализа SNP: Напомним, что генотипирование — это процесс сравнения информации о последовательностях ДНК для выявления различий между людьми и популяциями. Количественная ПЦР (qPCR) обычно используется для генотипирования SNP с целью амплификации и идентификации SNP. Количественная ПЦР будет идеальной в ситуациях, когда изучается мало SNP.Он подходит для большого или небольшого количества проб и позволяет проводить быстрый и точный анализ.

ПЦР с системой устойчивых к амплификации мутаций (ARMS PCR) — это еще один тип метода ПЦР, используемый для генотипирования SNP. Здесь специфичные для последовательности праймеры как для нормального, так и для SNP-содержащего аллеля (мутанта) используются в одной реакции ПЦР. Праймеры будут амплифицировать либо нормальный аллель, либо мутантный аллель, что можно визуализировать при анализе амплифицированных фрагментов с помощью электрофореза в агарозном геле.

Другие методы генотипирования SNP включают секвенирование и анализ микрочипов.

Типы ПЦР:

• КПЦР
• ARMS PCR
• КПЦР
• ОТ-ПЦР
• ОТ-КПЦР

ПЦР для анализа аллелей и анализа экспрессии генов

Что такое анализ аллель-специфической экспрессии: Анализ аллель-специфической экспрессии (ASE) — это инструмент, используемый для оценки разницы в аллельной экспрессии между обоими родительскими аллелями.Уровень аллельной экспрессии в диплоидах будет различаться между двумя унаследованными родительскими аллелями, причем один предпочтительно экспрессируется над другим. Регуляция аллельной экспрессии, которая выражается неравномерно, называется аллель-специфической экспрессией (или аллельным дисбалансом).

Считается, что такие различия в экспрессии частично связаны с цис-регуляторным элементом, участком некодирующей ДНК, который регулирует транскрипцию близлежащих генов на той же цепи ДНК. Примеры цис-регуляторных элементов включают регуляторные области, промоторы генов, терминатор, сайт связывания рибосомы РНК и энхансер.

Изучение аллельной экспрессии дает больше информации о фенотипических вариациях организма и заболеваниях в популяциях.

Что такое анализ экспрессии генов: Анализ экспрессии генов оценивает регуляцию генов и генные продукты с использованием РНК для определения паттернов экспрессии генов. Исследование экспрессии генов важно для понимания функциональности клеток через белковые продукты, понимания общей активности, понимания потока и регуляции информации от ДНК к РНК, понимания того, как количество продуцируемых белков влияет на систему и т. Д.

Как используется ПЦР для аллель-специфической экспрессии и анализа экспрессии генов: Секвенирование РНК (RNA-seq) — распространенный способ изучения экспрессии генов и аллелей. RNA-seq может количественно показать различия в уровнях экспрессии среди сравниваемых образцов. Однако ПЦР — еще один метод, который исследователи используют для изучения экспрессии.

Количественная ПЦР (qPCR) и количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR) — это типы ПЦР, которые в основном используются в исследованиях экспрессии генов. Одним из преимуществ RT-qPCR является то, что она подходит для более чувствительного количественного определения РНК.Это также обычно лучший выбор при анализе всего нескольких генов с известной последовательностью.

Типы ПЦР, используемые для изучения аллель-специфической экспрессии и экспрессии генов:

ПЦР для анализа метилирования ДНК

Что такое метилирование ДНК и анализ метилирования: Процесс, в котором метильная группа (Ch4) добавляется к ДНК, называется метилированием ДНК. Метилирование помогает регулировать экспрессию генов путем подавления транскрипции.Эта активность изменяет генетическую функцию без изменения последовательностей ДНК и является одним из многих эпигенетических механизмов.

Процессы экспрессии генов, приписываемые метилированию ДНК, включают геномный импринтинг, инактивацию Х-хромосомы, развитие и старение.

Анализ метилирования ДНК включает широкий набор методов, используемых для ответа на вопросы, возникающие в ходе исследования. Выбор метода анализа будет зависеть от нескольких факторов, включая цели, качество выборки, необходимую чувствительность, бюджет и т. Д.

Сергей Курдюков и Мартин Буллок опубликовали в 2016 году «Анализ метилирования ДНК: выбор правильного метода» с подробным руководством по выбору подхода к анализу.

• Методы, основанные на том, известны ли кандидаты или нет:
  • Варианты, когда известны гены-кандидаты:
    • Конверсия бисульфита с последующей ПЦР, специфичной для метилирования, ХОЛОДНОЙ ПЦР, секвенированием, пиросеквенированием или набором гранул.
    • Выполните ПЦР или КПЦР после расщепления.
  • Варианты, когда гены-кандидаты неизвестны:
    • Профилирование метилирования всего генома с последующим ИФА, масс-спектрометрией, ВЭЖХ-УФ, полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) или ПЦР LINE-1 с последующим пиросеквенированием.
    • Поиск дифференциально метилированных областей с последующим подсчетом чувствительных к метилу срезов (MSCC), микрочипом или матрицей шариков или секвенированием бисульфита.

Как ПЦР используется для анализа метилирования ДНК: Существует несколько типов методов ПЦР для амплификации и дальнейшего изучения метилирования.Различные типы ПЦР устраняют определенные препятствия или исследовательские потребности.

Обычно ПЦР начинается сначала с превращения бисульфита, поскольку последующие методы секвенирования не позволяют отличить метилированный цитозин от неметилированного цитозина. Бисульфит дезаминирует цитозин до урацила. После преобразования ДНК можно амплифицировать с помощью ПЦР, что дает возможность дальнейшего клонирования и секвенирования для дальнейшего понимания метилирования.

Сложность с преобразованием бисульфита заключается в том, что ДНК начиналась с 4 нуклеотидов (A, T, C, G), а теперь имеет только 3 (A, T, G).Эта потеря сложности ДНК также создает проблемы для дизайна праймеров.

Вложенная ПЦР — один из способов решения этих проблем. Исследователи также использовали другие методы ПЦР для преодоления препятствий или удовлетворения потребностей своих исследований. Ниже в разделе «Типы ПЦР» приведены краткие описания каждого типа ПЦР.

Типы ПЦР, используемые для анализа метилирования ДНК:

• КПЦР — КПЦР также называется количественной или количественной ПЦР в реальном времени. Этот метод ПЦР отслеживает объем амплификации продукта ПЦР в режиме реального времени.
• Вложенная ПЦР — Вложенная ПЦР используется для минимизации неспецифического связывания с помощью двух последовательных прогонов ПЦР, при этом во втором прогоне амплифицируется вторичная мишень из первого прогона.
• ПЦР, специфичная для метилирования — ПЦР, специфичная для метилирования, использует праймеры, специфичные для метилирования, и будет амплифицировать ДНК в зависимости от того, был ли образец ДНК метилирован.
• ПЦР плавления с высоким разрешением — Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) следует за ПЦР и является способом определения кривых плавления фрагментов ДНК.

COLD-PCR (коамплификация при более низкой температуре денатурации-PCR) — COLD-PCR позволяет исследователям предпочтительно амплифицировать меньшие аллели при наличии аллелей дикого типа.

Связанные продукты GoldBio:

Список литературы

(2014). Получено 12 июля 2019 г. с https://www.nature.com/scitable/topicpage/gene-expression-14121669.

23 и Я. (2019). В чем разница между генотипированием и секвенированием? Получено 12 июля 2019 г. с сайта https: // customercare.23andme.com/hc/en-us/articles/2020-What-is-the-difference-between-genotyping-and-sequencing-

23andMe. (нет данных). Что такое SNP? Получено 12 июля 2019 г. с https://www.23andme.com/gen101/snps/.

Абабон, М. (09 июля 2016 г.). Получите ПЦР для генотипирования, чтобы работать ВСЕГДА. Получено 12 июля 2019 г. с https://bitesizebio.com/28738/get-genotyping-pcr-work-every-time/.

Ap Tech Nova. (2018, 25 апреля). Технология микрочипов ДНК. Получено 12 июля 2019 г. с сайта https: // www.youtube.com/watch?v=yzBVOCwRanI

AuLab. (2016, 22 октября). Получено 12 июля 2019 г. с https://www.youtube.com/watch?v=PZW_eyDzYVQ.

Bioinformatics, U. (2014, 13 августа). Мостовое усиление, часть 1. Получено с https://www.youtube.com/watch?v=3URxJD5k3T8.

Blog, R. (20 апреля 2018 г.). Руководство по рабочему процессу для анализа RNA-seq функции шаперона и за ее пределами. Получено 12 июля 2019 г. с https://www.rna-seqblog.com/a-workflow-guide-to-rna-seq-analysis-of-chaperone-function-and-beyond/.

Мостик ПЦР.(нет данных). Получено 12 июля 2019 г. с https://binf.snipcademy.com/lessons/ngs-techniques/bridge-pcr.

Кастель, С. Э., Леви-Самогон, А., Мохаммади, П., Бэнкс, Э., и Лаппалайнен, Т. (2015). Инструменты и лучшие практики для обработки данных в анализе экспрессии аллелей. Genome Biology, 16 (1). DOI: 10.1186 / s13059-015-0762-6

Дорак, Т. (2007, июнь). Генотипирование с помощью ПЦР. Получено 12 июля 2019 г. с https://www.the-scientist.com/lab-tools-old/genotyping-with-pcr-46437.

ЭПЦР эмульсионной ПЦР.(нет данных). Получено 12 июля 2019 г. с https://binf.snipcademy.com/lessons/ngs-techniques/emulsion-pcr.

EncyclopediaBritannica. (2018, 05 декабря). Полиморфизм единичного нуклеотида. Получено 12 июля 2019 г. с https://www.britannica.com/science/single-nucleotide-polymorphism.

FGRS: подготовка библиотеки протокольных последовательностей РНК. (2011). Получено 12 июля 2019 г. с http://fg.cns.utexas.edu/fg/protocol__RNA-seq_Library_Preparation.html.

Анализ экспрессии генов. (п.г). Получено в июле 2019 г. с https://www.rtsf.natsci.msu.edu/genomics/gene-expression-analysis/.

Хэдфилд, Дж. (7 декабря 2017 г.). Введение в RNA-seq. Получено 12 июля 2019 г. с сайта https://bitesizebio.com/13542/what-everyone-should-know-about-rna-seq/.

Хеллеманс Дж. (26 августа 2019 г.). Сравнительный анализ чувствительности секвенирования РНК с использованием данных RT-qPCR в масштабе всего транскриптома. Получено 12 июля 2019 г. с https://blog.qbaseplus.com/benchmarking-rna-sequencing-sensitivity-using-transcriptome-wide-rt-qpcr-data.

Хан, Р.(2019). Что такое генотипирование? Получено 12 июля 2019 г. с сайта https://help.insito.me/en/articles/859665-what-is-genotyping.

Курдюков С., Буллок М. (6 января 2016 г.). Анализ метилирования ДНК: выбор правильного метода. Получено 12 июля 2019 г. с сайта https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4810160/.

Изучите генетику. (нет данных). ДНК-микрочип. Получено 12 июля 2019 г. с https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/.

Литтл, С. (2001, 01 мая).Амплификационно-рефрактерная система мутации (ARMS) Анализ точечных мутаций — Little — 1995 — Текущие протоколы в генетике человека — Онлайн-библиотека Wiley. Получено 19 июля 2019 г. с сайта https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142905.hg0908s07.

Лутце, К. (2017). 7 секретов оптимизации ПЦР эмульсии в рабочем процессе NGS. Получено 12 июля 2019 г. с https://blog.hseag.com/7-secret-tricks-to-optimize-emulsion-pcr-in-the-ngs-workflow.

Маккензи, Р.(2018). RNA-seq: основы, приложения и протокол. Получено 12 июля 2019 г. с https://www.technologynetworks.com/genomics/articles/rna-seq-basics-applications-and-protocol-299461.

Мори, Дж. С., Райан, Дж. К., и Ван Долах, Ф. М. (2006). Валидация микрочипов: факторы, влияющие на корреляцию между олигонуклеотидными микрочипами и ПЦР в реальном времени. Получено 12 июля 2019 г. с сайта https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779618/.

NIH. (2019). Что такое однонуклеотидный полиморфизм (SNP)? — Домашний справочник по генетике — NIH.Получено 12 июля 2019 г. с сайта https://ghr.nlm.nih.gov/primer/genomicresearch/snp.

NIH. (2015, 27 августа). Информационный бюллетень по технологии микрочипов ДНК. Получено в июле 2019 г. с сайта https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Microarray-Technology.

Шеперд, К. (20 июня 2019 г.). Количественная оценка экспрессии аллель-специфического гена с использованием методов на основе ПЦР. Получено 12 июля 2019 г. с https://bitesizebio.com/36768/quantifying-allelle-specific-gene-expression-using-pcr-based-methods/.

StatQuest с Джошем Стармером.(2017, 31 августа). Получено 12 июля 2019 г. с https://www.youtube.com/watch?v=tlf6wYJrwKY&t=636s.

Udacity. (2015, 23 февраля). Получено 12 июля 2019 г. с https://www.youtube.com/watch?v=qS8eboruKFE.

USD Биоинформатика. (2014, 15 августа). Эмульсионная ПЦР. Получено 12 июля 2019 г., из

Ван З., Герштейн М. и Снайдер М. (2009, январь). RNA-Seq: революционный инструмент для транскриптомики. Получено 12 июля 2019 г. с сайта https://www.ncbi.nlm.nih.gov / pmc / article / PMC2949280 /

Zou, J. (нет данных). ASE. Получено 12 июля 2019 г. с веб-сайта http://genetics.cs.ucla.edu/ase/.

Исследование: только у 1 из 32 выживших после COVID положительный результат теста имел живой вирус.

В сегодняшнем письме исследования JAMA Internal Medicine установлено, что 18% выздоровевших пациентов с COVID-19 дали положительный результат на SARS-CoV-2, вирус, который вызывает COVID-19, но только 3% (1 из 32) переносят реплицирующийся вирус в дыхательных путях.

Итальянские исследователи изучили 176 выздоровевших пациентов с COVID-19, поступивших для постострого последующего лечения в Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS в Риме с 21 апреля по 18 июня. Пациенты прекратили изоляцию в соответствии с текущими критериями — без лихорадки у 3 последовательные дни, улучшение симптомов и два отрицательных результата теста на вирус с обратной транскриптазой-полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) с интервалом в 24 часа.

Образцы мазков из носа / ротоглотки (NOS) от пациентов были проанализированы на общую (геномную) и репликативную (субгеномную) РНК SARS-CoV-2 с использованием анализов RT-PCR.Субгеномная РНК еще не упакована в вирионы — полную инфекционную форму вируса — и транскрибируется только в инфицированных клетках, что указывает на активную инфекцию и возможную передачу. Серологическое тестирование на иммуноглобулин (Ig) A и антитела IgG также проводилось в рамках последующего исследования.

Один пациент демонстрирует доказательства репликации РНК

Среди 176 образцов пациентов с БДУ 32 (18,2%) дали положительный результат на геномную РНК SARS-CoV-2 с вирусной нагрузкой в ​​диапазоне от 1,6 × 10 ¹ до 1.3 × 10 ⁴ копий РНК SARS-CoV2 на миллилитр.

Среднее время от постановки диагноза до последующего наблюдения у пациентов с SARS-CoV-2 составляло 48,6 дня. Только один из 32 положительных образцов (3,1%) имел репликативную субгеномную РНК SARS-CoV-2.

Все, кроме одного из 32 пациентов с SARS-CoV-2, имели положительный серологический тест при последующем наблюдении, как и 139 из оставшихся 144 пациентов. Пациент, у которого был отрицательный результат на антитела к SARS-CoV-2, не имел положительного результата теста на репликативную РНК SARS-CoV-2.

«Это исследование подчеркивает, что многие пациенты, выздоровевшие от COVID-19, могут быть все еще положительными (хотя и на более низком уровне) на РНК SARS-CoV-2, но только небольшая часть пациентов может быть носителем репликации SARS-CoV-2 дыхательные пути », — пишут авторы.

В настоящее время не существует широко доступного теста для определения вирусной репродукции и заразности, что подчеркивает необходимость дальнейших исследований, чтобы проверить, способны ли выздоровевшие пациенты с положительным результатом на SARS-CoV-2 передавать вирус, отмечают авторы.

Проблема с повторным контролем ПЦР

Повторное тестирование на SARS-CoV-2 у выздоровевших пациентов осложняется высокочувствительным тестом ОТ-ПЦР, который может обнаружить нежизнеспособные остатки вируса, что приводит к ненужному карантину и опасениям по поводу повторного заражения.

В редакционной статье того же журнала Митчелл Х. Кац, доктор медицинских наук, из отдела здравоохранения и больниц города Нью-Йорка, выступает против рутинного повторного тестирования ПЦР после выздоровления в свете чувствительности ПЦР и неопределенности заразности среди тех, кто продолжает тестирование. положительный на вирус.

«Реинфекция SARS-CoV-2 была задокументирована (на основе демонстрации различных генетических различий между вирусами, заражающими человека в первом и втором эпизодах), но встречается редко», — пишет Кац. «До тех пор, пока клинические лаборатории не будут иметь возможность проверить репродуктивную способность коронавируса, интерпретация эпидемиологического значения положительных результатов ПЦР среди выздоровевших пациентов будет оставаться сложной задачей».

См. Также:

24 августа CIDRAP News article «COVID-19 превысил 23 миллиона случаев, поскольку есть доказательства повторного заражения»

Наука, лежащая в основе теста на вирус COVID-19

Новый тест

Mayo Clinic на вирус, вызывающий COVID-19, описан в недавнем выпуске новостей как тест ПЦР.Хотя большинство не знает, что это означает, ПЦР — широко используемый инструмент в лабораторных и медицинских исследованиях. Ларри Пиз, доктор философии, иммунолог из клиники Мэйо и профессор клеточной биологии Гордона Х. и Вайолет Бартелс; и Кайл Родино, доктор философии, клинический микробиолог, объясняют, как работает этот тест.

Для начала ПЦР
означает лабораторный метод, известный как полимеразная цепная реакция. В этом
тест, целью является выборочное усиление следовых количеств генетического материала,
идентификация определенных частей ДНК.Напоминаем, что ДНК — это генетический код.
это присутствует в каждой клетке тела. Когда клетка делится, она копирует ДНК,
разделение двух цепей и создание новой цепи ДНК путем копирования
шаблон. ПЦР имитирует то, что обычно происходит в клетках.

12 марта 2020 года клиника Мэйо объявляет, что она разработала тест, который может обнаруживать вирус SARS-CoV-2 в клинических образцах. Вирус SARS-CoV-2 вызывает COVID-19.

Но почему ДНК?

ДНК

используется потому, что на самом различающем уровне структура ДНК может сказать вам, на какой организм изучается.В случае человека ПЦР может идентифицировать человека по его или ее генетической сигнатуре. В случае COVID-19 исследователи опубликовали более 100 геномов, собранных у пациентов, чтобы определить ключевые особенности вируса, вызывающего это заболевание, SARS-CoV-2.

Но есть
морщинка.

Только

ПЦР
работает с ДНК, а вирус COVID-19 использует РНК в качестве генетического кода. РНК
похож на ДНК, но имеет только одну нить. К счастью, вирусные ферменты превращаются в
РНК в ДНК были открыты несколько десятилетий назад и использовались вместе с
ПЦР, чтобы найти уникальные подписи в РНК.В этом случае ПЦР именуется
ПЦР с обратной транскрипцией или ОТ-ПЦР.

Вот как
оно работает.

Сначала человек с симптомами COVID-19 звонит своему местному врачу и спрашивает, как пройти обследование. Помните: сначала позвоните. Не ходите в свою клинику или больницу, не позвонив, чтобы узнать, как безопаснее всего пройти тестирование. Как только пациент прибывает в безопасное место для тестирования, медицинская бригада берет образец. Обычно это означает, что в нос или рот человека помещают узкий тампон для сбора клеток с задней стенки глотки.

«Образец из верхних дыхательных путей, в частности мазок из носоглотки, является наиболее распространенным образцом, собираемым для надежного обнаружения вируса», — говорит д-р Родино. «Некоторые образцы нижних дыхательных путей, такие как мокрота, также приемлемы в некоторых условиях».

В лаборатории,
образец обрабатывается, поэтому РНК выделяется и собирается. Все остальное
удаленный. РНК смешана с другими ингредиентами: ферментами (ДНК-полимеразой и
обратная транскриптаза), строительные блоки ДНК, кофакторы, зонды и праймеры, которые
распознают и связываются с SARS-CoV-2.

Затем вирусная РНК преобразуется в копию ДНК, и эта единственная копия затем преобразуется в миллионы копий с помощью ПЦР, которая может быть легко обнаружена.

Процесс выглядит следующим образом: с помощью тепла и ферментов преобразованные цепи вирусной ДНК разделяются. Короткие праймеры ДНК, соответствующие комплементарной цепи матрицы вирусной ДНК, слипаются, функционируя как искусственный стартовый сайт для синтеза ДНК.

Химическая промышленность
строительные блоки ДНК добавляются и соединяются вместе, расширяя синтетический
Праймер ДНК для формирования копии вирусной ДНК-матрицы.Второй праймер, сделанный в
противоположная ориентация после первого праймера также присутствует в
реакция. Это делает копию, которая дополняет первый синтезированный
прядь.

После одного
В ходе синтеза ДНК реакционная смесь нагревается до расплавления двух цепей.
отдельно, создавая два шаблона, которые могут быть расширены в следующем
круглый. Копии накапливаются, шаг за шагом, экспоненциально, так что миллионы
и генерируются миллионы копий для изучения с использованием обычных
подходы.

Потому что ферменты
и химикаты, добавленные в реакционную трубку, относительно термостойки — »
термочувствительные ферменты изолированы от термостойких бактерий из горячих
пружины «, — говорит доктор Пиз — реакция может протекать в автоматическом режиме.
мода нагрева, охлаждения и синтеза ДНК. Это займет всего несколько часов
анализ и получите результаты.

Если SARS-CoV-2
комплементарная ДНК присутствует в образце, праймеры могут копировать нацеленные
регионы. По мере того, как они копируют эти регионы, зонды, прикрепленные к этим новым фрагментам, высвобождают
визуальный сигнал, который может быть прочитан прибором, используемым в этом процессе.

»
миллионы копий усиливают этот сигнал, поэтому его можно легко обнаружить как
положительный результат. Если вируса нет, зонды не прилипают, есть
нет выхода сигнала, и это отрицательный результат », — поясняет д-р Родино.

Этот тип
анализ используется для исследований и клинических лабораторных испытаний. ПЦР может обнаружить все
типы бактерий, паразитов, вирусов и грибов, начиная с ДНК или РНК.
Хотя принцип и ингредиенты схожи, каждое использование требует определенного
праймеры или зонды для обнаружения различных организмов.Вот почему что-то для
SARS-CoV-2 пришлось разрабатывать с нуля. Во время разработки эти виды
доработаны тесты, чтобы убедиться, что они очень хорошо обнаруживают организм
интерес (чувствительный) и убедитесь, что тест не показывает положительный результат
когда организма нет (специфический).

«Важность
этапов ПЦР отмечен серией Нобелевских премий.
«, — говорит доктор Пиз. — Медицинская наука прогрессирует в результате
фундаментальных открытий о молекулярных основах живых систем, и это
один пример того, как эти открытия объединяются для решения важной
проблема в нашей жизни.«

Работает в качестве
исследовательской и клинической группы, эксперты Mayo смогли развернуть тест ПЦР для
SARS-CoV-2 за несколько недель — избавление от того, на что обычно уходят месяцы.
годы.

«Как
Вспышка COVID-19 увеличилась по размеру и размаху, наша команда руководителей сделала
решение продолжить разработку нового ПЦР-теста для диагностики пациентов
с этой инфекцией «, — говорит Мэтью Бинникер,
Кандидат медицинских наук, клинический микробиолог и заведующий отделением клинической вирусологии
Лаборатория клиники Мэйо.»Мы приняли это решение, потому что знали, что наши поставщики в клинике Мэйо,
а также поставщикам медицинских услуг по всей стране, потребуется лабораторная диагностика, чтобы
принимать важные решения по ведению пациентов. Это было только через коллектив
усилия команды преданных своему делу лабораторных профессионалов, которые мы смогли
сдать тест на COVID-19 всего за три недели. Это было необычайно
достижение, которое было вызвано миссией клиники Мэйо — дать надежду и
исцеление пациентов, которых мы обслуживаем «.

— Сара Тинер, 27 марта 2020 г.

ПЦР | Наборы для ПЦР | Полимеразная цепная реакция

ПЦР, полимеразная цепная реакция, является основным методом, который произвел революцию в молекулярной биологии.В ПЦР молекула ДНК является мишенью и копируется несколько раз, что обеспечивает экспоненциальную амплификацию целевой последовательности ДНК.

Ключевыми компонентами реакции ПЦР-амплификации являются термостабильная ДНК-полимераза, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), реакционный буфер и магний, два олигонуклеотидных праймера и термоциклер, который позволяет контролировать циклическое изменение температуры реакции посредством нескольких циклов денатурации ДНК, связывания праймера и Расширение ДНК.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) позволяет исследовать последовательности РНК.В ОТ-ПЦР РНК-мишень сначала подвергается обратной транскрипции в ДНК перед амплификацией с помощью ПЦР.

КПЦР в реальном времени обеспечивает более чувствительный количественный анализ образца. В КПЦР и ОТ-КПЦР меченые продукты реакции обнаруживаются в реальном времени по мере протекания реакции амплификации. Методы, основанные на кПЦР, являются стандартными средствами количественной оценки последовательностей ДНК-мишеней или мониторинга экспрессии генов.

Различия между термостабильными ДНК-полимеразами используются для оптимизации реакций для конкретных целей.Например, в ПЦР с горячим стартом ДНК-полимераза не становится активной до тех пор, пока не будет достигнута температура денатурации. Это сводит к минимуму образование неспецифических продуктов амплификации и обеспечивает удобство настройки реакции при комнатной температуре. Один из наиболее эффективных методов проведения реакций горячего старта может быть реализован с использованием антител, блокирующих активность полимеразы Taq.

ПЦР с дальним действием может быть проведена с использованием смеси термостабильных полимераз, таких как ДНК-полимераза Taq, и проверяющих ферментов, не обладающих 3´-5´ экзонуклеазной активностью, которые вырезают неправильно встроенные основания в синтезированной цепи ДНК.