Кровь на пцр: Сдать анализ крови на ПЦР в Выборгском районе СПб

Содержание

ПЦР на COVID-19

ПЦР-тест на короновирус: как берут, что показывает

ПЦР – сложная химико-биологическая цепная реакция, позволяющая методом поэтапного исследования определить в тканях организма человека чужеродные компоненты, вирусные и бактериальные структуры, грибки.

Вирус SARS-CoV-2 относится к респираторным агентам и в организм попадает через слизистые – нос, глаза, рот. В клетках слизистых тканей он фиксируется, прикрепляясь шипами оболочки к клеточным мембранам. А вот в крови и лимфе вируса нет. Анализ крови становится показательным только при длительной болезни, когда появляется иммунный ответ организма на вирусную атаку. В этом случае ПЦР уже не информативен, и при подозрении на COVID стоит сдавать иммуноферментный анализ (ИФА) крови – определять антитела к вирусной инфекции.

В первые дни заражения, когда симптоматика заболевания отсутствует или слабо выражена, SARS-CoV-2 уже активно размножается в носоглотке. Инфекцию легко обнаружить в тканях слизистых и даже в слюне. Носители вируса могут и не подозревать о его наличии, и определить, заразен ли человек, может только анализ ПЦР.

Мазок для выявления короновируса методом ПЦР берут из ротоглотки и носоглотки. Для этого используют зонд со стерильной щеточкой или тампоном. Медсестра безболезненно и аккуратно проводит несколько раз по слизистым пациента, а затем биоматериал запаковывают и передают в лабораторию для тщательного исследования.

Показания для диагностики: кому стоит сдавать ПЦР на ковид

Выделяют несколько категорий, кому показана диагностика на короновирус методом ПЦР:

Условно здоровые люди. Исследование для них – возможность получить справку об отсутствии ковид для выезда или иных целей.

Контактные – те, кто общался с заболевшими, не зная об этом. После лабораторного подтверждения заболевания у родных, знакомых или сотрудников, рекомендована диагностика на «корону» методом ПЦР.

Пенсионеры и лица, попадающие в группу риска по состоянию здоровья.

Корпоративная диагностика – при выявлении в коллективе заболевшего или в качестве планового обследования.

Анализ проводят при отсутствии симптомов заболевания новой короновирусной инфекцией – пациентам без высокой температуры, кашля, слабости, отдышки.

ПЦР на COVID-19: подготовка к анализу

Тест чувствительный, поэтому во избежание риска получения неправильного результата до проведения ПЦР следует соблюдать определенные правила:

За 2-3 часа до взятия мазков из ротоглотки пациент не должен принимать пищу, курить, полоскать горло или рот, чистить зубы, жевать жевательную резинку.

В течение суток до момента сдачи анализа использовать сосудосуживающие назальные спреи, наносить гормональные, антисептические или противовирусные мази, а также не применять спреи для местного лечения горла.

Результаты диагностики

Проведенный тест бывает:

отрицательный – вирус SARS-CoV-2 не определен, инфекции COVID-19 нет;

положительный – найден вирус SARS-CoV-2, инфекция COVID-19 подтверждена.

Медицинский центр «ЛМ-клиника» проводит ПЦР-исследования на короновирусную инфекцию для частных лиц и организаций. Квалифицированный подход и внимательность медперсонала гарантируют высокую точность каждого исследования. Для записи на анализ методом ПЦР достаточно позвонить по телефону клиники или оставить заявку на сайте.

Диагностика методом ПЦР, кровь. — Комплексы медицинских анализов и их цен в KDL

Алергология. ImmunoCAP. Индивидуальные аллергены, IgE

Аллергокомпоненты ImmunoCAP

Аллергокомпоненты деревьев

Аллергокомпоненты животных и птиц

Аллергокомпоненты плесени

Аллергокомпоненты трав

Пищевые аллергокомпоненты

Аллергология. ImmunoCAP. Комплексные исследования IgE (результат по каждому аллергену)

Аллергология. ImmunoCAP. Панели аллергенов IgE, скрининг (результат СУММАРНЫЙ)

Аллергология. ImmunoCAP. Фадиатоп

Аллергология. Immulite. Индивидуальные аллергены

Аллергены гельминтов, IgE

Аллергены грибов (кандида и плесневых), IgE

Аллергены деревьев, IgE

Аллергены животных и птиц, IgE

Аллергены клещей домашней пыли, IgE

Аллергены лекарств и химических веществ, IgE

Аллергены насекомых, IgE

Аллергены пыли, IgE

Аллергены ткани, IgE

Аллергены трав, IgE

Бактериальные аллегены (стафилококк), IgE

Пищевые аллергены, IgE

Пищевые аллергены, IgG

Аллергология. Immulite. Комплексы аллергенов, IgE (результат по каждому аллргену)

Аллергология. Immulite. Панели аллергенов, скрининг (результат СУММАРНЫЙ)

Аллергены деревьев, IgE (панель)

Аллергены животных и птиц, IgE (панель)

Аллергены трав, IgE (панель)

Ингаляционные аллергены, IgE (панель)

Пищевые аллергены, IgE (панель)

Аллергология. Immulite. Панели пищевых аллергенов IgG (результат СУММАРНЫЙ)

Аллергология. ImmunoCAP. Индивидуальные аллергены, IgE

Аллергены деревьев, IgE

Аллергены животных и птиц, IgE

Аллергены пыли, IgE

Аллергены трав, IgE

Пищевые аллергены, IgE

Аллергология. RIDA. Комплексы аллергенов, IgE

Аллергология. RIDA. Комплексы аллергенов, IgE (результат по каждому аллргену)

Аллергология. Местные анестетики, IgE

Биохимические исследования крови

Диагностика анемий

Липидный обмен

Обмен белков

Обмен пигментов

Обмен углеводов

Специфические белки

Ферменты

Электролиты и микроэлементы

Биохимические исследования мочи

Разовая порция мочи

Суточная порция мочи

Витамины, аминокислоты, жирные кислоты

Гематология

Гемостаз (коагулограмма)

Генетические исследования

HLA-типирование

Исследование генетических полиморфизмов методом пиросеквенирования

Исследование генетических полиморфизмов методом ПЦР

Молекулярно-генетический анализ мужского бесплодия

Гистологические исследования

Гистологические исследования лаборатории UNIM

Гормоны биологических жидкостей

Гормоны гипофиза и гипофизарно-адреналовой системы

Гормоны крови

Гормоны гипофиза и гипофизарно-адреналовой системы

Маркеры остеопороза

Пренатальная диагностика

Ренин-альдостероновая система

Тесты репродукции

Функция органов пищеварения

Функция щитовидной железы

Гормоны мочи

Диагностика методом ПЦР

COVID-19

Андрофлор, иследование биоценоза (муж)

Вирус герпеса VI типа

Вирус Варицелла-Зостер (ветряной оспы)

Вирус герпеса VI типа

Вирус простого герпеса I, II типа

Вирус Эпштейна-Барр

Вирусы группы герпеса

Возбудитель туберкулеза

ВПЧ (вирус папилломы человека)

Грибы рода кандида

Листерии

Парвовирус

Респираторные инфекции

Стрептококки (вкл. S.agalactie)

Токсоплазма

Урогенитальные инфекции, ИППП

Урогенитальные инфекции, комплексные исследования

Урогенитальные инфекции, условные патогены

Фемофлор, исследование биоценоза (жен)

Флороценоз, иследование биоценоза (жен)

Цитомегаловирус

Диагностика методом ПЦР, кал

Кишечные инфекции

Диагностика методом ПЦР, клещ

Клещевые инфекции

Диагностика методом ПЦР, кровь.

Вирус Варицелла-Зостер (ветряной оспы)

Вирус герпеса VI типа

Вирус краснухи

Вирус простого герпеса I, II типа

Вирус Эпштейна-Барр

ВИЧ

Возбудитель туберкулеза

Гепатит D

Гепатит G

Гепатит А

Гепатит В

Гепатит С

Листерии

Парвовирус

Токсоплазма

Цитомегаловирус

Жидкостная цитология

Изосерология

Иммуногистохимические исследования

Иммунологические исследования

Иммунограмма (клеточный иммунитет)

Интерфероновый статус, базовое исследование

Интерфероновый статус, чувствительность к препаратам

Оценка гуморального иммунитета

Специальные иммунологические исследования

Исследование абортуса

Исследование мочевого камня

Исследование парапротеинов. Скрининг и иммунофиксация

Исследования слюны

Комплексные исследования

Лекарственный мониторинг

Маркеры аутоиммунных заболеваний

Антифосфолипидный синдром (АФС)

Аутоиммунные заболевания легких и сердца

Аутоиммунные неврологические заболевания

Аутоиммунные поражения ЖКТ и целиакия

Аутоиммунные поражения печени

Аутоиммунные поражения почек и васкулиты

Аутоиммунные эндокринопатии и бесплодие

Диагностика артритов

Пузырные дерматозы

Системные ревматические заболевания

Эли-тесты

Микробиологические исследования (посевы)

Посев крови на стерильность

Посев на гемофильную палочку

Посев на грибы (Candida)

Посев на грибы (возбудители микозов кожи и ногтей)

Посев на дифтерию

Посев на микоплазмы и уреаплазмы

Посев на пиогенный стрептококк

Посев на стафилококк

Посевы кала

Посевы мочи

Посевы на микрофлору (конъюнктива)

Посевы на микрофлору (отделяемое)

Посевы на микрофлору (урогенитальный тракт женщины)

Посевы на микрофлору (урогенитальный тракт мужчины)

Посевы на микрофлору ЛОР-органы)

Ускоренные посевы с расширенной антибиотикограммой

Неинвазивная диагностика болезней печени

Программы неинвазивной диагностики болезней печени

Неинвазивный пренатальный ДНК-тест (НИПТ)

Неинвазивный пренатальный тест (пол/резус плода)

Общеклинические исследования

Исследование назального секрета

Исследование секрета простаты

Исследования кала

Исследования мочи

Исследования эякулята

Микроскопическое исследование биологических жидкостей

Микроскопия на наличие патогенных грибов и паразитов

Микроскопия отделяемого урогенитального тракта

Онкогематология

Иммунофенотипирование при лимфопролиферативных заболеваниях

Миелограмма

Молекулярная диагностика миелопролиферативных заболеваний

Цитохимические исследования клеток крови и костного мозга

Онкогенетика

Онкомаркеры

Пищевая непереносимость, IgG4

Полногеномные исследования и панели наследственных заболеваний

Пренатальный скрининг

Серологические маркеры инфекций

Аденовирус

Бруцеллез

Вирус HTLV

Вирус Варицелла-Зостер (ветряной оспы)

Вирус герпеса VI типа

Вирус Коксаки

Вирус кори

Вирус краснухи

Вирус эпидемического паротита

Вирус Эпштейна-Барр

Вирусы простого герпеса I и II типа

ВИЧ

Гепатит D

Гепатит А

Гепатит В

Гепатит Е

Гепатит С

Грибковые инфекции

Дифтерия

Кишечные инфекции

Клещевые инфекции

Коклюш и паракоклюш

Коронавирус

Менингококк

Паразитарные инвазии

Парвовирус

Респираторные инфекции

Сифилис

Столбняк

Токсоплазма

Туберкулез

Урогенитальные инфекции

Хеликобактер

Цитомегаловирус

Специализированные лабораторные исследования.

Дыхательный тест

Микробиоценоз по Осипову

Тяжелые металлы и микроэлементы

Тяжелые металлы и микроэлементы в волосах

Тяжелые металлы и микроэлементы в крови

Тяжелые металлы и микроэлементы в моче

Услуги

Выезд на дом

ЭКГ

Установление родства

Химико-токсикологические исследования

Хромосомный микроматричный анализ

Цитогенетические исследования

Цитологические исследования

Чекап

ПЦР-диагностика (венозная кровь) — сдать анализы в Москве. Научный центр «ЭФиС»

ПЦР-ДИАГНОСТИКА (венозная кровь)
Вирус гепатита D (HDV), определение РНК, кач.ан.	до 5 д.	580 р.
Вирус гепатита G (HGV), определение РНК, кач.ан.	до 5 д.	580 р.
Вирус гепатита А (HAV), определение РНК, кач.ан.	до 5 д.	580 р.
Вирус гепатита В (HBV), определение ДНК, кач.ан.	до 5 д.	580 р.
Вирус гепатита В (HBV), определение ДНК, кол.ан.	до 7 д.	2190 р.
Вирус гепатита В (HBV), определение ДНК, ультрачувствительный метод, кач.ан.	до 7 д.	2860 р.
Вирус гепатита В, качественное определение генотипа	до 7 д.	1210 р.
Вирус гепатита С (HCV), определение РНК, кач.ан.	до 5 д.	580 р.
Вирус гепатита С (HCV), определение РНК, кол.ан.	до 7 д.	2750 р.
Вирус гепатита С (HCV), определение РНК, кол.ан.(тест-система Hoffmann-La Roche)	до 12 д.	9900 р.
Вирус гепатита С (HCV), определение РНК, ультрачувствительный метод, кач.ан.	до 7 д.	2860 р.
Вирус гепатита С (HCV), определение РНК, ультрачувствительный метод, кол.ан.	до 9 д.	5500 р.
Вирус гепатита С, расширенное определение генотипа (типы 1а, 1b, 2, 3a, 4, 5, 6)	до 11 д.	2310 р.
Вирус герпеса человека 6 типа (HHV 6), определение ДНК, кач.ан.	до 5 д.	350 р.
Вирус герпеса человека 6 типа (HHV 6), определение ДНК, кол.ан.	до 6 д.	540 р.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 типа, определение ДНК провируса, кач.ан.	до 9 д.	2850 р.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 типа, определение РНК, кол.ан.	до 9 д.	7150 р.
Вирус Краснухи (Rubella virus), определение РНК, кач.ан.	до 5 д.	790 р.
Вирус простого герпеса 1,2 (HSV 1,2), определение ДНК, кач.ан.	до 5 д.	310 р.
Вирус ТТ, определение ДНК (TTV general), кач.ан.	до 8 д.	780 р.
Вирус Эпштейна-Барра (EBV), определение ДНК, кач.ан.	до 5 д.	310 р.
Вирус Эпштейна-Барра (EBV), определение ДНК, кол.ан.	до 6 д.	540 р.
Гемолитический стрептококк (Streptococcus pyogenes), определение ДНК, кач.ан.	до 3 д.	550 р.
Гемофильная палочка (Haemophilus influenzae), определение ДНК, кач.ан.	до 4 д.	830 р.
Интерлейкин 28 бета — IL28B, генотипирование (исследование генетических маркеров определяющих эффективность лечения хронического гепатита С интерфероном и рибавирином)	до 10 д.	1650 р.
Листерии (Listeria monocytogenes), определение ДНК, кач.ан.	до 9 д.	572 р.
Микобактерии туберкулеза (M. tuberculosis), определение ДНК, кач.ан.	до 5 д.	610 р.
Определение РНК вируса гепатита С/ ДНК вируса гепатита В/ РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типа (ультрачувствительный метод), кач.ан.	до 7 д.	3960 р.
Парвовирус В19 (Parvovirus B19), определение ДНК, кол.ан.	до 3 д.	650 р.
Стрептококк пневмония (Streptococcus pneumoniae), определение ДНК, кач.ан.	до 6 д.	550 р.
Токсоплазма (Toxoplasma gondii), определение ДНК, кач.ан.	до 3 д.	360 р.
Цитомегаловирус (Cytomegalovirus), определение ДНК, кач.ан.	до 5 д.	310 р.
Цитомегаловирус (Cytomegalovirus), определение ДНК, кол.ан.	до 6 д.	540 р.
Цитомегаловирус, Вирус Эпштейна-Барр, Вирус герпеса 6 типа (CMV/ EBV/ HHV VI), определение ДНК, кол.ан.	до 5 д.	1100 р.

Диагностика COVID-19

На данный момент Медгард предлагает следующие методы исследования на COVID-19, а точнее на SARS-CoV-2

Экспресс-тест на антитела иммуноглобулинов M и G

Для проведения анализа берется капиллярная кровь. Метод исследования — иммунохроматографический. Результаты анализа будут готовы через 10 минут. Производство тестов — Китай. С помощью теста можно выявить антитела двух типов: IgM и IgG. Антитела к иммуноглобулину M появляются в организме вскоре после инфицирования, а затем их концентрация падает. Антитела к иммуноглобулину G вырабатываются на поздней стадии и остаются в крови долгое время после выздоровления. Таким образом, с помощью теста можно узнать, болеет ли человек COVID-19 в данный момент или он уже перенес инфекцию и у него есть иммунитет. Если человек не болел или не болеет в данный момент, тест покажет отрицательный результат

Действует акция для семей — скидка 10% при одновременной сдаче анализов членами одной семьи от 3 человек

ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция) с мазком из зева

Результат будет готов через 3 дня, не включая день забора анализа. Метод показывает наличие или отсутствие вируса в организме, начиная с 2-3 дня заражения

ЛДК Медгард осуществляет забор анализа, проводит же анализ лаборатории Наука, СИТИЛАБ

Есть возможность провести ускоренный ПЦР-анализ с результатом в этот же или на следующий день в зависимости от того, в какое время произошел забор анализа. В этом случае наценка за срочность 10%

Действует акция для семей — скидка 10% при одновременной сдаче анализов членами одной семьи от 3 человек

Экспресс-тест на антиген Ag иммунохроматографическим методом

Исследование проводится на основании взятого мазка из ротоглотки. Результат будет готов через 5-8 минут. Производство тестов — Южная Корея. Анализ показывает наличие или отсутствие в организме антигена (вируса) на 2-3 день заражения, в латентный период, когда еще нет симптомов заболевания. По сути данный анализ является аналогом ПЦР, только результат вы получаете сразу, не нужно ждать несколько дней

Действует акция для семей — скидка 10% при одновременной сдаче анализов членами одной семьи от 3 человек

Антитела к коронавирусу IgG, количественно (венозная кровь)

Показывает, что вы уже переболели и насколько сильно отреагировал ваш организм

Антитела к коронавирусу IgM, качественно (венозная кровь)

Показывает, болеете ли вы сейчас

Антитела к коронавирусу IgM качественно и IgG количественно (венозная кровь)

Показывает, болеете ли вы сейчас, начал ли ваш организм давать иммунный ответ и насколько сильно

По срокам последние 3 анализа готовятся до 2 суток.

Для юридических лиц цены существенно отличаются. Действует гибкая система скидок

Обязательна предварительная запись по тел (8422) 44-06-44

Для обеспечения безопасности пациентов и сотрудников ЛДК «Медгард» желающие сдать тесты могут обращаться через отдельный вход (3-ий подъезд). Еще раз обращаем ваше внимание, что данные виды диагностики имеет смысл проходить людям без явных клинических симптомов.

Стоимость

Антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 (COVID-19), IgG, количественно

930 ₽

Антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 (COVID-19), IgM, качественно

930 ₽

Антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 (COVID-19), IgM качественно и IgG количественно

1 680 ₽

ПЦР-диагностика на коронавирус COVID-19 с мазком из зева

1 450 ₽

ПЦР-диагностика на коронавирус COVID-19 с мазком из зева c выдачей сертификата на английском языке

1 650 ₽

Экспресс-тест на антиген короновируса SARS-CoV-2 (COVID-19), качественно

1 590 ₽

Определение антител (IgM, IgG) коронавируса (Covid-19) в крови

1 600 ₽

Прием ведет

Методы тестирования при подозрении на коронавирус COVID-19 ПЛР ПЦР ИФА Экспресс-тест

Уже совсем скоро коллективы предприятий выйдут на работу в офисы и на производства после карантинных действий.

У каждого руководителя возникает вопрос: как уберечь персонал от локальной вспышки инфекции?

Для наилучшей эффективности противоэпидемических мероприятий специалисты “Универсум Клиник» готовы подобрать наиболее экономную и информативную систему тестирования коллектива и в случае выявления заболевших, полностью обеспечить режим лечения.
Наталья Богомолова
Директор клиники “Универсум Клиник»

Медицинский Центр “Универсум Клиник» предлагает Вам актуальную информацию относительно проведения диагностики вируса SARS-CoV-19.

Мы предоставляем четыре метода диагностики:


Материал:	мазок из носа и рта	капля крови из пальца	венозная кровь	венозная кровь
Время анализа:	24-48 часов	5 минут	24-48 часов	24-48 часов
Время контакта:	начиная с 1 дня	начиная с 7 дня	начиная с 7 дня	начиная с 10 дня
Суть метода (что ищем?):	РНК ядра вируса (вирус селится первично в клетках на слизистой)	антитела (имунные клетки человека), которые организм выработал в ответ на вирус.	антитела, которые присутствуют в крови с 7 по 21 день заболевания.	антитела, присутствуют в крови с 14 дня заболевания в течение 4-6 месяцев.
	Полноценный лабораторный метод	Экспресс метод	Полноценный лабораторный метод	Полноценный лабораторный метод
Вероятность верного результата:	99,90%	заявлено производителем 70 %	99,90%	99,90%
Стоимость:	1300 грн.	830 грн.	480 грн.	480 грн.
Что узнаем?	есть или нет на момент забора и 1-3 дня до забора вирус в организме	болел или не болел covid 2019 в течение 3 недели- 4 месяца	болел или не болел covid 2019 в течение 2 недели- 1 месяц	болел или не болел covid 2019 в течение 1-6 месяцев
Что дальше?	Изоляция заболевшего и контактных, наблюдение доктора	консультация доктора	консультация доктора	консультация доктора

Тест-системами ПЦР —

это лабораторное тестирование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые достоверно выявляют наличие или отсутствие коронавируса у человека с первого дня заражения. Даже до начала проявления симптомов болезни COVID-19 (если человек является только носителем вируса и не болеет). Это единственный самый достоверный во всем мире и в Европе сейчас метод диагностики коронавируса COVID-19.

Экспресс-тест —

не обладают такой высокой точностью как ПЦР-системы. Они «видят» не вирус, а антитела к нему (IgM и IgG) — белковые соединения, вырабатываемые в организме человека только на 5-7 день после проявления симптомов болезни. Негативный результат этого теста не может исключать того, что человек заражен в данный момент. Для проведения экспресс-теста используется капиллярная кровь. Результат известен через 5 минут.

Анализ крови на наличие антител к коронавирусу —

анализ крови на наличие IgG либо IgМ covid 2019 в течение 48 часов с момента взятия материала покажет, есть у человека иммунитет именно к коронавирусу 2019.
Позитивный результат значит, что человек выработал иммунный ответ к вирусу.
Негативный результат — человек не сформировал иммунный ответ к вирусу ковид 2019.

Оформить заявку на тестирование

Для сбора анализов при подозрении ковида 2019 на территории нашей клиники, пациенту обеспеченна возможность пройти в специально отведенный манипуляционный кабинет через отдельный вход.

Также Универсум Клиник предлагает выезд доктора для проведения ПЦР-диагностики в любое время, когда это необходимо Клиенту (место и время согласовываетса в момент поступления запроса).

Территория обслуживания:

-город Киев (без ограничения по количеству человек для диагностики за один выезд доктора),

— все областные центры Украины,

— иные населенные пункты Украины по индивидуальному согласованию (выезд от 10-ти человек).

Ознакомиться с программой сопровождения и лечения больных с коронавирусной инфекцией можно на странице нашего сайта: Программа antiCovid-19 online

Будьте здоровы!

🏥 Сдать анализ ПЦР в Ростове-на-Дону: сдать кровь на ПЦР

Диагностика организма методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет провести точную оценку состояния здоровья, выявить имеющиеся отклонения в виде заболеваний. Эта методика является одной из самых точных на данный момент за счет использования принципов молекулярной биологии. Лаборатория клиники «Гармония» проводит ПЦР анализ в Ростове-на-Дону с применением особых ферментативных формул, копирующих фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни. Это помогает провести скрининг биоматериала для выявления половых инфекций, вирусов иммунодефицита и папилломы человека, гепатита С, туберкулеза, клещевого энцефалита и других патологий. Наш медицинский центр расположен по адресу: Ростов-на-Дону, ул. Красноармейская, 170 (2 этаж) .

Особенности и сфера применения ПЦР анализа

Технически суть исследования заключается в сравнении полученных копированием фрагментов с существующей базой данных инфекционных агентов. Благодаря поиску схожих показателей, кровь на ПЦР позволяет точно установить возбудителя болезни, а также выявить концентрацию чужеродного тела в организме. Анализ проходит в условиях нагрева-охлаждения среды, когда пробирки с биологическим образцом помещаются в амплификатор.

Спектр диагностических возможностей метода очень обширен. ПЦР используют для выявления перечисленных выше болезней, а также при обнаружении признаков мононуклеоза, кандидоза, цитомегаловируса, листериоза и других патологий. Известно, что лабораторный анализ крови на ПЦР используется в криминалистике для определения принадлежности биологических образцов тому или иному лицу. Также метод показал хорошие результаты при идентификации отцовства.

Преимущества и недостатки

Исследование с применением полимеразной цепной реакции имеет немало преимуществ перед другими технологиями. В их числе:

Высокая точность результатов ― достаточно нескольких молекул ДНК для проведения полноценного анализа. Таким образом можно установить заболевания на ранних стадиях, когда лечение наиболее эффективно.

Универсальность методики ― не обязательно брать кровь на ПЦР для диагностики состояния. Подойдут волосы, ногти, частицы слюны и клетки кожи.

Скорость расшифровки результатов ― на составление резюме достаточно 5-7 часов. Заключение выдается в день обращения пациента в клинику или на следующие сутки.

Одновременное выявление нескольких возбудителей ― у нас вы можете сдать кровь на 12 инфекций, передаваемых половым путем;

Цена исследования ― стоимость услуги забора крови и проведения анализа вполне бюджетная.

По отзывам экспертов, минусов подобное обследование практически не имеет. Рекомендуем сдать анализ ПЦР в Ростове-на-Дону в сертифицированном лабораторно-диагностическом комплексе. Стоит учитывать, что даже незначительные отхождения от технологии проведения скрининга способны повлиять на точность ПЦР диагностики. Мы гарантируем соблюдение всех регламентированных норм и выдачу качественных результатов обследования.

ПЦР кровь

Название		Материал	Условия подготовки к анализам*	Время выдачи результатов*
Вирус гепатита В	кач.	Кровь	Специальной подготовки не требуется	Через 2 дня
	п/кол.
	колич.
Вирус гепатита C	кач.	Кровь	Специальной подготовки не требуется	Через 2 дня
	п/кол.
	колич.
Вирус гепатита G	кач.	Кровь	Специальной подготовки не требуется	Через 2 дня
	п/колич.
Вирус гепатита D	кач.	Кровь	Специальной подготовки не требуется	Через 2 дня
	п/колич.
Генотипирование HCV	кач.	Кровь	Специальной подготовки не требуется	Через 2 дня
Вирус простого герпеса I и II типа	кач.	УГ соскоб, моча, эякулят, слюна, букальный соскоб	За 2 часа до сдачи не мочиться	Через 6 часов
Вирус герпеса VI типа	кач.	Кровь, слюна соскоб	По назначению врача	Через 6 часов
Вирус Эпштейн-Барр (ВЭБ, EBV)	кач.	УГ соскоб, моча, эякулят, слюна, букальный соскоб	За 2 часа до сдачи не мочиться	Через 6 часов
Цитомегаловирус	кач.	УГ соскоб, моча, эякулят, слюна, букальный соскоб	За 2 часа до сдачи не мочиться	Через 6 часов
Вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59)	колич.	УГ соскоб, моча, эякулят, слюна, букальный соскоб	За 2 часа до сдачи не мочиться	Через 6 часов
	генотип.

Использование ПЦР в реальном времени на образцах крови для диагностики инвазивного аспергиллеза | Клинические инфекционные болезни

Аннотация

Мы разработали новую количественную систему для диагностики инвазивного легочного аспергиллеза (IPA) с использованием автоматической полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Уровни точности внутри анализа и между анализами для исследования in vitro составляли 2,53% и 2,20%, соответственно, и линейность этого анализа была получена при наличии> 20 копий на лунку.Мы исследовали 323 образца, взятые у 122 пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями, в том числе у 33 пациентов с ИПА и 89 пациентов контрольной группы. Образцы крови были подвергнуты методам обнаружения антигена ПЦР с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) и определения концентрации (1 → 3) -β-D-глюкана (BDG) в плазме. Чувствительность измерений ПЦР, ELISA и BDG для диагностики IPA составляла 79%, 58% и 67% соответственно; специфичность составила 92%, 97% и 84%. Положительные результаты ПЦР предшествовали результатам компьютерной томографии на -0.3 ± 6,6 суток, БДГ — 6,5 ± 4,9 суток, ИФА — 2,8 ± 4,1 суток. ПЦР в реальном времени была чувствительной для диагностики IPA, а количественное определение было точным.

Инвазивный легочный аспергиллез (IPA) является смертельным осложнением у хозяев с ослабленным иммунитетом, которые подвергаются интенсивной цитотоксической химиотерапии. Выживание этих пациентов зависит от ранней диагностики и быстрого начала терапевтических мероприятий [1], но микологический и гистопатологический диагноз устанавливается редко, поскольку посев крови недостаточно чувствителен для этого заболевания [2], а для получения патологических данных необходимы инвазивные процедуры. свидетельство.Сложность ранней диагностики IPA — критическая проблема. Поэтому были предприняты усилия по разработке надежных неинвазивных диагностических методов.

Использование компьютерной томографии грудной клетки и методов обнаружения антигенов было рекомендовано для ранней диагностики IPA. Наиболее характерными находками КТ в IPA являются ореол затухания в матовом стекле вокруг фокальных узелков и образование серповидного цвета [3]. Оба признака относительно специфичны для ИПА у пациентов с фебрильной нейтропенией, но также сообщалось о связи с множеством других заболеваний [4].Таким образом, на основании данных компьютерной томографии грудной клетки невозможно установить точный диагноз ИПА. Обнаружение циркулирующих Aspergillus или грибковых антигенов является еще одним полезным методом диагностики IPA. В настоящее время используются 3 метода: тест латексной агглютинации, ELISA и измерение концентрации (1 → 3) -β-D-глюкана (BDG) в плазме. Тест латексной агглютинации и ELISA коммерчески доступны для использования при обнаружении циркулирующего галактоманнанового антигена. БДГ является распространенным компонентом грибов [5], и определение его концентрации в плазме — еще один полезный метод скрининга глубоких микозов, включая IPA [6].Анализ BDG широко используется в Японии. Поскольку эти анализы крови обнаруживают циркулирующие грибковые компоненты, их специфичность достигает 90% [6–8]. Однако эти тесты дают положительные результаты только на поздних стадиях инфекции у большинства пациентов с ИПА, что является критической проблемой [9, 10].

ПЦР может быть полезна для обнаружения нуклеиновых кислот грибов, поскольку она может быть более чувствительной, чем существующие методы обнаружения антигенов. Было разработано множество протоколов для диагностики инфекции Aspergillus с помощью ПЦР [11–13], и они были успешно использованы для обнаружения ДНК Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа [14] и в сыворотке крови пациентов с ИПА. [12].Хотя традиционный анализ ПЦР высокочувствителен, с пределом обнаружения 10 фг ДНК, специфичной для Aspergillus [12], он не дает количественной информации о грибковой нагрузке. Такая информация необходима для управления IPA. ПЦР в реальном времени — это количественный анализ, описанный Heid et al. в 1996 г. [15]. Этот метод измеряет накопление продуктов ПЦР с помощью флуорогенного зонда с двойной меткой (TaqMan Probe) и обеспечивает точное и воспроизводимое количественное определение копий гена [15].Недавно мы разработали новую количественную диагностическую систему, использующую этот анализ ПЦР на основе экзонуклеаз в качестве быстрой альтернативы традиционной ПЦР для диагностики IPA. Это первый отчет об использовании количественной ПЦР в реальном времени для диагностики IPA.

Материалы и методы

Извлечение ДНК из образцов крови . ДНК грибов экстрагировали из 200 мкл цельной крови или плазмы в кожухе биобезопасности в отдельной комнате, снабженной оборудованием, используемым исключительно для экстракции ДНК [16].О процедурах, используемых для выделения ДНК, сообщалось в другом месте [17]. Во избежание контаминации ампликоны на этом участке никогда не обрабатывались.

Образцы крови хранили при -80 ° C и оттаивали до 4 ° C перед тестированием. Циклы замораживания / оттаивания не повторялись, и в этом исследовании мы использовали только что размороженные образцы. Наше предварительное исследование показало, что чувствительность ПЦР увеличивается с увеличением объемов крови (данные не показаны), и, следовательно, для образцов ПЦР предпочтительно использовать> 5 мл крови.Однако мы использовали 200 мкл крови или плазмы для образцов ПЦР, потому что объем большинства хранимых образцов составлял 200–500 мкл.

Амплификация и обнаружение Aspergillus ДНК . Последовательности праймеров и зондов для ПЦР были отобраны на основе последовательностей генов 18S рРНК грибов в базе данных GenBank. Праймеры и зонды гибридизировали консенсусную последовательность для видов Aspergillus . Прямой праймер был 5′-TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT-3 ‘, а обратный праймер был 5′-TCTAAGGGCATCACAGACCTG-3’.Зонд TaqMan выбрал область между праймерами, которая была помечена флуоресценцией FAM (6-карбоксифлуоресцеин) на 5′-конце в качестве репортерного красителя и TAMRA (6-карбокситереметил-родамин) на 3′-конце в качестве тушитель (FAM-TCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGC-TAMRA). Праймеры и зонд TaqMan были получены от FASMAC.

Процедуры ПЦР и обнаружения продукта ПЦР описаны в другом месте [17]. ДНК из изолята Aspergillus fumigatus амплифицировали с обоими праймерами и вставляли в pCR2.1 Вектор клонирования ТА (Invitrogen). Мы использовали эту плазмиду в качестве стандарта в этом исследовании.

Количественное определение ДНК Aspergillus проводили с серийно разведенным стандартом в диапазоне 1 × 10 ¹ –1 × 10 ⁸ копий / лунку, а количество копий видов Aspergillus рассчитывали с помощью определения последовательности Система v. 1.6.3. программное обеспечение (PE Biosystems). Интенсивность флуоресценции измеряли в каждой лунке каждые 7 с, и результат считался положительным, когда интенсивность флуоресценции превышала в 10 раз базовую флуоресценцию (рисунок 1).Величина порогового цикла была определена как номер цикла ПЦР в этой точке.

Рисунок 1

Профиль амплификации стандартов для Aspergillus ПЦР в реальном времени; 10 ¹ –10 ⁸ копий на лунку (черная полоса) стандартной ДНК Aspergillus амплифицировали в двух экземплярах в течение 50 циклов. Нормализованное значение репортера (Rn) рассчитывали путем деления интенсивности испускания репортерного красителя на интенсивность испускания референсного красителя, включенного в TaqMan Universal PCR Master Mix, который не участвует в анализе ПЦР на основе экзонуклеаз.δRn — это разница между значением Rn + и значением Rn-, где Rn + — значение Rn реакции, которая содержит все компоненты, включая матрицу, а Rn- — значение Rn, полученное на ранних циклах, до заметного увеличения флуоресценции. , во время ПЦР в реальном времени.

Рисунок 1

Профиль амплификации стандартов для Aspergillus ПЦР в реальном времени; 10 ¹ –10 ⁸ копий на лунку (черная полоса) стандартной ДНК Aspergillus амплифицировали в двух экземплярах в течение 50 циклов.Нормализованное значение репортера (Rn) рассчитывали путем деления интенсивности испускания репортерного красителя на интенсивность испускания референсного красителя, включенного в TaqMan Universal PCR Master Mix, который не участвует в анализе ПЦР на основе экзонуклеаз. δRn — это разница между значением Rn + и значением Rn-, где Rn + — значение Rn реакции, которая содержит все компоненты, включая матрицу, а Rn- — значение Rn, полученное на ранних циклах, до заметного увеличения флуоресценции. , во время ПЦР в реальном времени.

Исследование чувствительности и специфичности автоматизированной ПЦР в реальном времени in vitro . Чтобы определить чувствительность автоматизированной ПЦР в реальном времени для обнаружения Aspergillus, 100 копий / мкл стандартной ДНК серийно разбавляли TE-буфером (10 мкМ M Tris-HCl [pH 8,0] и 1 мкМ M EDTA. ). Разбавленные образцы ДНК измеряли 5 раз.

Для определения специфичности ДНК из изолятов A. fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida glabrata, и Candida guilliermondii подвергали ПЦР в реальном времени.

Сравнение in vivo ПЦР в реальном времени с ELISA и измерением BDG . Чтобы сравнить чувствительность и специфичность ПЦР в реальном времени с таковыми других анализов крови для диагностики IPA, мы исследовали образцы крови, полученные от пациентов в наших гематологических отделениях, которые прошли химиотерапию для лечения гематологических злокачественных новообразований или тяжелой апластической анемии.

Все образцы крови были подвергнуты ПЦР в реальном времени, ELISA (Platelia Aspergillus; Diagnostic Pasteur) и определению BDG (Fungi-Tec; Seikagaku Corporation).Эти тесты были выполнены, как описано в [5, 18]. Когда соотношение оптических плотностей ELISA> 1,5 наблюдалось по крайней мере в 2 образцах, мы классифицировали результаты ELISA для этих пациентов как положительные. Пороговый уровень для измерения БДГ составлял 20 пг / мл [6]. Когда эти тесты проводились более одного раза, при анализе данных использовалось самое высокое значение в каждом эпизоде лихорадки.

Условия госпитализации 900 26. Все пациенты, перенесшие трансплантацию костного мозга (ТКМ), и некоторые пациенты, получавшие высокодозную химиотерапию, находились в защитной изоляции в комнатах, оборудованных высокоэффективными воздушными фильтрами для твердых частиц, на протяжении всего периода нейтропении.Все пациенты получали флуконазол (200 или 400 мг / день) или итраконазол (200 мг / день) в качестве противогрибковой профилактики. Мы лечили нейтропеническую лихорадку в соответствии с процедурами, описанными в отчете Пиццо [19].

Забор крови, компьютерная томография грудной клетки и посевы грибков . С августа 1996 года по март 1999 года образцы крови хранились, когда мы подозревали на основании клинических и радиологических данных, что у этого пациента был ИЛА. С апреля 1999 г. по апрель 2000 г. мы проспективно обследовали пациентов с устойчивой к антибиотикам лихорадкой.Образцы крови отбирали еженедельно и подвергали анализу ELISA, BDG и ПЦР. Посевы проводились на образцах из горла, мочи, кала, крови и мокроты при развитии устойчивой к антибиотикам лихорадки. Мы выполняли компьютерную томографию грудной клетки, когда у пациентов были какие-либо признаки легочной инфекции или лихорадки, устойчивой к антибиотикам. Сообщалось о пациентах с состояниями, требующими КТ грудной клетки [20]. Бронхоальвеолярный лаваж обычно не проводится в наших учреждениях, если у пациентов есть тромбоцитопения или нейтропения.

Диагностические критерии для IPA . Мы поставили диагноз определенного IPA, когда у пациентов были гистологические доказательства инвазии тканей разветвленными перегородками гиф, когда состояние пациента не реагировало на антибактериальные средства, и когда анализ образцов мокроты или биоптатов или результаты аутопсии были положительными для видов Aspergillus . . Мы классифицировали пациентов, у которых развилась лихорадка, но не было признаков ИПА, как пациентов контрольной группы. Пациенты, у которых предполагалось наличие ИПА на основании радиологических данных [3], но у которых не было гистологических свидетельств ИФА, были исключены из этого исследования.

Статистический анализ . Статистическую значимость данных анализировали с помощью двустороннего точного критерия Фишера или критерия χ. Корреляционный анализ проводился с использованием непараметрического коэффициента корреляции Кендалла. Уровень статистической значимости был установлен на уровне P <0,05.

Результаты

Чувствительность, воспроизводимость и специфичность ПЦР в реальном времени in vitro . Число копий ДНК Aspergillus и значения порогового цикла серийно разведенного стандарта были нанесены на ось X и ось Y , соответственно, графика, показанного на рисунке 2.Коэффициент корреляции составил 0,988. Коэффициент вариации внутри анализа (CV) был <5% (0,83% –4,7%) между 20 и 10 ¹⁰ копий на лунку и 12,8% при 10 копиях на лунку. Хотя мы могли обнаружить всего 10 копий на лунку, чувствительность ПЦР в реальном времени как количественного анализа была снижена до 20 копий на лунку. Когда мы измерили образцы, содержащие 10 ², 10 ⁵ и 10 ⁶ копий ДНК Aspergillus 5 раз, значения CV между анализами (± SD) составили 2.20% ± 0,77%, 1,33% ± 0,36% и 2,01% ± 0,40% соответственно. ДНК, полученная из A. fumigatus, A. niger, A. terreus, Aspergillus flavus, и Aspergillus oryzae , была успешно амплифицирована, но ни один из видов Candida не был обнаружен.

Рисунок 2

Стандартная кривая для Aspergillus ПЦР в реальном времени. Значения порогового цикла наносили на график против различного количества стандартных копий ДНК. Наклон составлял -3,54 цикла / логарифм.Коэффициент корреляции составил 0,988.

Рисунок 2

Стандартная кривая для Aspergillus ПЦР в реальном времени. Значения порогового цикла наносили на график против различного количества стандартных копий ДНК. Наклон составлял -3,54 цикла / логарифм. Коэффициент корреляции составил 0,988.

Характеристики пациента . Мы обследовали 122 пациента, прошедших химиотерапию по поводу злокачественных гематологических заболеваний или тяжелой апластической анемии, 48 из которых были проспективно исследованы.В общей сложности 33 пациента имели определенный IPA, а остальные 89 пациентов служили контрольными пациентами. Характеристики пациентов представлены в таблице 1. Органами, инфицированными Aspergillus , были паренхима легких ( n = 31), трахеи ( n = 3), ЦНС ( n = 10), почка ( n ). = 6), печень ( n = 7), селезенка ( n = 5), желудочно-кишечный тракт ( n = 5), щитовидная железа ( n = 2) и надпочечники ( n = 2).Поражение Aspergillus было ограничено легкими у 16 пациентов, а системное распространение наблюдалось у остальных 17 пациентов. Осложнениями в контрольной группе были сепсис, вызванный C. tropicalis ( n = 2), сепсис, вызванный C. glabrata ( n = 2), пневмония, вызванная C. albicans ( n ). = 1), пневмония, вызванная C. tropicalis ( n = 2), цитомегаловирусная пневмония ( n = 2), цитомегаловирусная виремия ( n = 2), респираторно-синцитиальная вирусная пневмония ( n = 1). ), Pneumocystis carinii пневмония ( n = 5), бактериальная септицемия ( n = 15), бактериальная пневмония ( n = 25), бактериальный энтероколит ( n = 7), трансплантат против хозяина заболевание ( n = 7), прогрессирование гематологического злокачественного новообразования ( n = 13) и лихорадка неизвестного происхождения ( n = 6).

Таблица 1

Характеристики пациентов с определенным инвазивным легочным аспергиллезом (IPA) и пациентов контрольной группы.

Таблица 1

Результаты измерения ПЦР, ИФА и БДГ в реальном времени . Мы получили 102 образца крови, включая 92 образца цельной крови и 10 образцов плазмы, от 33 пациентов с IPA и 221 образец, включая 198 образцов цельной крови и 23 образца плазмы, от 89 контрольных пациентов.Мы не разделяли образцы крови на цельную кровь и плазму, чтобы выяснить, какой из 2 образцов больше подходит для использования в ПЦР для обнаружения ДНК грибов. В среднем от пациентов в группе IPA и в контрольной группе было отобрано 3,1 (диапазон 1–8) и 2,5 (диапазон 1–7) образцов соответственно. В таблице 2 показаны результаты этих тестов для каждого пациента с ИПА.

Таблица 2

Результаты компьютерной томографии грудной клетки, ПЦР в реальном времени, ELISA и анализа плазмы (1 → 3) -β- d -глюкан (BDG) у пациентов с инвазивным легочным аспергиллезом (IPA).

Таблица 2

Из 33 пациентов с IPA, 26, 19 и 22 имели положительные результаты измерений ПЦР, ELISA и BDG, соответственно, а 7, 3 и 14 из 89 контрольных пациентов имели положительные результаты этих анализов. Чувствительность измерений ПЦР в реальном времени, ELISA и BDG составляла 79%, 58% и 67% соответственно.Специфичность анализов составила 92%, 97% и 84%. Прогнозирующая ценность положительного результата составила 79%, 86% и 61% соответственно, а прогностическая ценность отрицательного результата — 92%, 86% и 87%.

Из 102 образцов, полученных от 33 пациентов с IPA, 34 были взяты до начала эмпирического лечения амфотерицином B или у пациентов, которые не получали профилактику итраконазолом. Грибковая ДНК была обнаружена с помощью ПЦР в 12 из 34 образцов. Шестьдесят восемь образцов были собраны после начала эмпирического лечения амфотерицином B или во время профилактического введения итраконазола.Грибковая ДНК была обнаружена с помощью ПЦР в 20 из этих 68 образцов. Прием амфотерицина B и итраконазола не повлиял на результаты ПЦР ( P = 0,6516).

Результаты посева грибов и компьютерной томографии . КТ грудной клетки была проведена всем 33 пациентам с ИПА. У всех пациентов были обнаружены отклонения от нормы на компьютерной томографии. Наиболее частым признаком КТ были множественные узелковые уплотнения. Признаки ореола или полумесяца наблюдались у 12 пациентов с ИПА.Этих признаков не было у контрольных пациентов.

Все пациенты с IPA имели микробиологические доказательства инфекции Aspergillus . Организм был выделен из посевов образцов, полученных перед смертью от 13 пациентов. Двенадцать культур были образцами мокроты, а 1 — биопсией легкого. Инфекция Aspergillus была выявлена после смерти пациента у оставшихся 20 пациентов. Возбудителями видов Aspergillus были видов A. fumigatus ( n = 20), A.flavus ( n = 4), A. niger ( n = 2) и Aspergillus видов, которые не были подклассифицированы ( n = 6).

Мы показываем связь между ПЦР и другими исследованиями в таблице 3. Существенной связи между ПЦР и другими исследованиями не наблюдалось.

Таблица 3

Связь между результатами ПЦР и других исследований на аспергиллез.

Таблица 3

Связь между результатами ПЦР и других исследований на аспергиллез.

Интервал между началом лихорадки и днем, когда каждый тест дал положительные результаты . После ретроспективного исследования 18 пациентов мы проспективно оценили 15 пациентов с ИПА. Для этих пациентов компьютерная томография, ПЦР, измерение BDG и ELISA дали результаты, которые подтвердили диагноз IPA в среднем (± стандартное отклонение) 11,2 ± 3,5, 11,1 ± 5,7, 15,5 ± 8,4 и 17,2 ± 10,2 дней после начала заболевания. лихорадки соответственно. Положительные результаты ПЦР предшествовали результатам компьютерной томографии на -0.3 ± 6,6 дня, среднее значение (± стандартное отклонение) для анализа BDG составило 6,5 ± 4,9 дня и предшествовало результатам ELISA в среднем на 2,8 ± 4,1 дня (таблица 2).

Типичное клиническое течение . Рисунок 3 иллюстрирует клиническое течение пациента, у которого развился IPA с трахеобронхиальным поражением (пациент 9, таблица 2) [21]. Пациент умер от дыхательной недостаточности, вызванной трахеобронхитом Aspergillus . ELISA, измерение BDG и ПЦР в реальном времени дали положительные результаты на 165, 169 и 161 день после трансплантации, соответственно.ПЦР в реальном времени дала положительные результаты раньше, чем анализ BDG и ELISA, и с большей чувствительностью отражала ответ на противогрибковое лечение.

Рисунок 3

Клиническое течение пациента, у которого после трансплантации костного мозга развился инвазивный легочный аспергиллез с поражением трахеобронхов. ELISA, измерение BDG и ПЦР в реальном времени дали положительные результаты на 165, 169 и 161 день после трансплантации, соответственно. ПЦР в реальном времени дала положительные результаты раньше, чем анализ BDG или ELISA, и с большей чувствительностью отражала ответ на противогрибковое лечение.На 161-й день после трансплантации в 1 мл крови было обнаружено 1150 копий. Число копий ДНК Aspergillus быстро увеличилось до 3350 копий / мл крови на 168 день. AmB, амфотерицин B; БДГ, (1 → 3) -β-D-глюкан; mPSL, метилпреднизолон; OD, оптическая плотность.

Рисунок 3

Клиническое течение пациента, у которого после трансплантации костного мозга развился инвазивный легочный аспергиллез с поражением трахеобронхов. ELISA, измерение BDG и ПЦР в реальном времени дали положительные результаты на 165, 169 и 161 день после трансплантации, соответственно.ПЦР в реальном времени дала положительные результаты раньше, чем анализ BDG или ELISA, и с большей чувствительностью отражала ответ на противогрибковое лечение. На 161-й день после трансплантации в 1 мл крови было обнаружено 1150 копий. Число копий ДНК Aspergillus быстро увеличилось до 3350 копий / мл крови на 168 день. AmB, амфотерицин B; БДГ, (1 → 3) -β-D-глюкан; mPSL, метилпреднизолон; OD, оптическая плотность.

Обсуждение

Мы разработали новый метод диагностики IPA, ПЦР в реальном времени для использования с образцами крови.Этот метод имеет некоторые преимущества перед тестами на обнаружение антигенов и обычными ПЦР-анализами.

Во-первых, ПЦР в реальном времени чувствительна для диагностики IPA. Хотя ПЦР с использованием образцов крови не была успешно применена для диагностики IPA [22], ДНК Aspergillus была обнаружена у 26 из 33 пациентов с IPA в нашем исследовании. Чувствительность ПЦР в реальном времени (79%) была выше, чем чувствительность ELISA (58%) и измерения BDG (67%), и была сопоставима с таковой для вложенной ПЦР [23]. Хотя предел обнаружения ПЦР в реальном времени, 20 копий / мл, может быть нечувствительным по сравнению с пределом обнаружения традиционной ПЦР [12], мы можем точно количественно определить 20 копий ДНК, специфичной для Aspergillus , с помощью этого метода ПЦР и можем обнаружить <10 Копии ДНК.Принимая во внимание количественную способность этого анализа, мы определили 20 копий как его пороговое значение.

Может быть важно, чтобы мы экстрагировали ДНК Aspergillus из крови без удаления клеточных стенок грибов механическим разрушением или ферментативной обработкой. Эти шаги считаются важными для извлечения ДНК из грибов. Однако ДНК Aspergillus может циркулировать в крови как голая ДНК или в сочетании с поврежденными клеточными стенками. Количественное определение этой ДНК может быть многообещающим для ПЦР грибов.Интересно, что ни ПЦР, ни тесты на определение антигена чаще в нашем исследовании не давали положительных результатов (таблица 3). Поскольку три анализа распознают различные грибковые компоненты, совместное использование этих тестов повысит скорость обнаружения инфекции Aspergillus .

Вторая, ПЦР в реальном времени очень специфична для инфекции Aspergillus . № Candida видов ДНК была амплифицирована во время исследования in vitro, и ПЦР в реальном времени дала отрицательные результаты для пациентов с инвазивным кандидозом, пневмонией Pneumocystis carinii и вирусными инфекциями.

В-третьих, ПЦР в реальном времени кажется точным методом количественного определения копий грибов. Исследование in vitro показало, что CV ПЦР в реальном времени составлял <5% для 20–10 ¹⁰ Aspergillus копий и увеличивался до 12,8% при количестве копий 10. Кроме того, максимальные уровни (в копиях / мл) для ПЦР хорошо коррелировали с таковыми для ELISA и BDG в клинических условиях (таблица 2). Рисунок 3 иллюстрирует клиническое течение пациента, у которого развился IPA после BMT.Количество копий, обнаруженных с помощью ПЦР, хорошо коррелировало с оптической плотностью ELISA и уровнями BDG. ПЦР в реальном времени дала положительные результаты раньше, чем другие методы, и с большей чувствительностью отражала развитие болезни.

ПЦР в реальном времени — многообещающий метод для диагностики IPA, но мы должны прокомментировать контаминацию. В Aspergillus PCR заражение происходит из-за инокуляции переносимых по воздуху спор во время процедур, из-за переноса продукта и из-за наличия спор грибов в материалах PCR.В этом исследовании ни один из контрольных реагентов не дал положительных результатов на ДНК Aspergillus , что означает, что загрязнение окружающей среды было незначительным. Другой возможной причиной заражения является унос продуктов ПЦР. Ампликоны ПЦР могут служить мишенями для дальнейших реакций. Чтобы избежать переноса ампликонов, мы обрабатывали образцы ПЦР с помощью расщепления урацил-ДНК-гликозилазой, которая, как было доказано, инактивирует ампликоны из продуктов ПЦР [24]. Другая возможность — это загрязнение коммерчески доступных продуктов, используемых для ПЦР.Эти материалы могут быть переносчиками спор грибов, и многие компании, похоже, не знают о том, что их продукты могут быть использованы для ПЦР грибов [25]. Мы также испытали такое загрязнение реагентов ПЦР во время разработки ПЦР в реальном времени и поэтому взяли за правило проверять загрязнение реагентов перед анализами ПЦР. После этого проблема загрязнения реагентов исчезла.

ПЦР в реальном времени определенно полезна для диагностики IPA, но наше исследование имеет несколько ограничений, которые необходимо обсудить.Наиболее важным было обнаружение того, что ПЦР в реальном времени давала ложноположительные результаты чаще, чем другие тесты в этом исследовании. Хотя исследование in vitro показало, что ПЦР в реальном времени была высокоспецифичной для видов Aspergillus , 7 (7,8%) из 89 контрольных пациентов имели положительные результаты в какой-то момент во время клинического течения их болезней. Мы не можем отрицать возможность того, что загрязнение было причиной этих ложноположительных результатов, но в этих образцах могла присутствовать ДНК, специфичная для Aspergillus .Мы сообщали в другом месте, что тест латексной агглютинации Aspergillus иногда давал положительные результаты у пациентов с нейтропенией без IPA [10]. Мы обсудили возможность того, что некоторые грибковые компоненты циркулировали в периферической крови этих пациентов и что эти компоненты выводились с восстановлением нейтрофилов. Положительные результаты ПЦР не обязательно указывают на присутствие IPA. ПЦР в реальном времени может помочь отличить истинный IPA от преходящей антигенемии Aspergillus , поскольку она может предоставить количественную информацию о грибковой нагрузке.

Кроме того, мы не можем сделать однозначный вывод относительно сроков положительных тестов из нашего исследования. Мы проспективно обследовали только 15 пациентов с ИПА. Положительные результаты ПЦР предшествовали результатам компьютерной томографии в среднем (± стандартное отклонение) -0,3 ± 6,6 дней, результатам анализа BDG в среднем 6,5 ± 4,9 дня и результатам ELISA в среднем 2,8 ± 4,1 дня ( Таблица 2). ПЦР казалась почти такой же чувствительной, как компьютерная томография грудной клетки для диагностики ИПА. Насколько рано в клиническом течении ПЦР дает положительные результаты для пациентов с ИПА, — это область, требующая дальнейшего изучения.В заключение, мы разработали ПЦР в реальном времени для использования в диагностике IPA, которая является высокочувствительной и позволяет нам точно определять количество циркулирующих копий ДНК Aspergillus .

Список литературы

1« и др.

Улучшенное ведение инвазивного легочного аспергиллеза у пациентов с нейтропенией с использованием компьютерной томографии грудной клетки и хирургического вмешательства на ранних этапах

J Clin Oncol

1997

, vol.

(стр.

139

—

) 2,.

Aspergillus fungemia: отчет о двух случаях и обзор

Clin Infect Dis

1995

, vol.

(стр.

598

—

605

) 3,,.

Инвазивный аспергиллез легких при остром лейкозе: характерные данные КТ, признак ореола КТ и роль КТ в ранней диагностике

Радиология

1985

, т.

157

(стр.

611

—

) 4,.

Аспергиллез и мукормикоз: два типа условно-патогенных грибковых пневмоний

Радиология

1981

, т.

140

(стр.

301

—

) 5,,,,,.

Определение (1 → 3) -бета-D-глюкана в плазме: новое средство диагностики глубоких микозов

J Med Vet Mycol

1992

, vol.

(стр.

275

—

) 6« и др.

Измерение (1 → 3) -бета-D-глюкана в плазме в диагностике инвазивного глубокого микоза и эпизодов грибковой фебрильной болезни

Lancet

1995

, vol.

345

(стр.

—

) 7,,,,,.

Использование теста латексной агглютинации антигена Pastorex aspergillus для диагностики инвазивного аспергиллеза

J Clin Pathol

1995

, vol.

(стр.

210

—

) 8,,,,,.

Сэндвич-ферментный иммуноферментный анализ в сравнении с тестом на латекс-агглютинацию Pastorex для диагностики инвазивного аспергиллеза у пациентов с ослабленным иммунитетом

J Clin Microbiol

1995

, vol.

(стр.

1912

—

) 9« и др.

Ограничение методов обнаружения циркулирующего антигена Aspergillus для реципиентов BMT

Пересадка костного мозга

1998

, vol.

(стр.

832

—

) 10,,, et al.

Частые ложноположительные результаты теста латексной агглютинации Aspergillus: временная антигенемия Aspergillus при нейтропении

Рак

1999

, vol.

(стр.

274

—

) 11« и др.

Обнаружение и идентификация грибковых патогенов в крови с помощью молекулярных зондов

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

1353

—

) 12,,,.

ПЦР-определение ДНК, специфичной для видов Aspergillus, в сыворотке крови пациентов с инвазивным аспергиллезом

J Clin Microbiol

1996

, vol.

(стр.

2464

—

) 13,,,.

Панфунгальный ПЦР-анализ для выявления грибковой инфекции в образцах крови человека

J Clin Microbiol

1998

, vol.

(стр.

1169

—

) 14,,,.

Обнаружение Aspergillus spp с помощью полимеразной цепной реакции и его оценка в жидкости бронхоальвеолярного лаважа

Am Rev Respir Dis

1993

, vol.

148

(стр.

1313

—

) 15,,,.

Количественная ПЦР в реальном времени

Genome Res

1996

, vol.

(стр.

986

—

) 16,,,,.

Сравнение различных методов выделения ДНК грибковых патогенов из культур и крови

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

3311

—

) 17« и др.

Автоматическая ПЦР в реальном времени для ранней диагностики и мониторинга цитомегаловирусной инфекции после трансплантации костного мозга

J Clin Microbiol

2000

, vol.

(стр.

2536

—

) 18,,,.

Новый чувствительный сэндвич-твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения галактофурана у пациентов с инвазивным аспергиллезом

J Clin Microbiol

1995

, vol.

(стр.

497

—

500

) 19.

Лечение лихорадки у больных раком и нейтропенией, вызванной лечением

N Engl J Med

1993

, vol.

328

(стр.

1323

—

) 20« и др.

Компьютерное томографическое сканирование грудной клетки, латекс-агглютинация и анализ плазмы (1-3) -бета-D-глюкана в ранней диагностике инвазивного легочного аспергиллеза: проспективное исследование 215 пациентов

Haematologica

2000

, vol. .

(стр.

745

—

) 21« и др.

Трахеобронхит Aspergillus после аллогенной трансплантации костного мозга

Трансплантация костного мозга

1999

, т.

(стр.

1145

—

) 22,,,,.

Количественное обнаружение галактоманнана превосходит ПЦР в диагностике и мониторинге инвазивного легочного аспергиллеза на экспериментальной модели крыс

J Clin Microbiol

2000

, vol.

(стр.

1434

—

) 23« и др.

Сравнение ПЦР и обнаружения антигена в сыворотке для диагностики легочного аспергиллеза

J Clin Microbiol

1999

, vol.

(стр.

218

—

) 24« и др.

Обнаружение ДНК Cryptosporidium parvum в сформированных фекалиях человека с помощью чувствительного анализа на основе ПЦР, включающего инактивацию урацил-N-гликозилазы

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

254

—

) 25« и др.

Загрязнения, возникающие в ПЦР-анализах на грибки

J Clin Microbiol

1999

, vol.

(стр.

1200

—

)

Использование ПЦР в реальном времени на образцах крови для диагностики инвазивного аспергиллеза | Клинические инфекционные болезни

Аннотация

Мы разработали новую количественную систему для диагностики инвазивного легочного аспергиллеза (IPA) с использованием автоматической полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.Уровни точности внутри анализа и между анализами для исследования in vitro составляли 2,53% и 2,20%, соответственно, и линейность этого анализа была получена при наличии> 20 копий на лунку. Мы исследовали 323 образца, взятые у 122 пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями, в том числе у 33 пациентов с ИПА и 89 пациентов контрольной группы. Образцы крови были подвергнуты методам обнаружения антигена ПЦР с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) и определения концентрации (1 → 3) -β-D-глюкана (BDG) в плазме. Чувствительность измерений ПЦР, ELISA и BDG для диагностики IPA составляла 79%, 58% и 67% соответственно; специфичность составила 92%, 97% и 84%.Положительные результаты ПЦР опережали результаты компьютерной томографии на -0,3 ± 6,6 дня, результаты измерения БДГ на 6,5 ± 4,9 дня и результаты ELISA на 2,8 ± 4,1 дня. ПЦР в реальном времени была чувствительной для диагностики IPA, а количественное определение было точным.

Материалы и методы

Рисунок 1

Профиль амплификации стандартов для Aspergillus ПЦР в реальном времени; 10 ¹ –10 ⁸ копий на лунку (черная полоса) стандартной ДНК Aspergillus амплифицировали в двух экземплярах в течение 50 циклов.Нормализованное значение репортера (Rn) рассчитывали путем деления интенсивности испускания репортерного красителя на интенсивность испускания референсного красителя, включенного в TaqMan Universal PCR Master Mix, который не участвует в анализе ПЦР на основе экзонуклеаз. δRn — это разница между значением Rn + и значением Rn-, где Rn + — значение Rn реакции, которая содержит все компоненты, включая матрицу, а Rn- — значение Rn, полученное на ранних циклах, до заметного увеличения флуоресценции. , во время ПЦР в реальном времени.

Результаты

Рисунок 2

Стандартная кривая для Aspergillus ПЦР в реальном времени. Значения порогового цикла наносили на график против различного количества стандартных копий ДНК. Наклон составлял -3,54 цикла / логарифм. Коэффициент корреляции составил 0,988.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Связь между результатами ПЦР и других исследований на аспергиллез.

Таблица 3

Связь между результатами ПЦР и других исследований на аспергиллез.

Рисунок 3

Клиническое течение пациента, у которого после трансплантации костного мозга развился инвазивный легочный аспергиллез с поражением трахеобронхов. ELISA, измерение BDG и ПЦР в реальном времени дали положительные результаты на 165, 169 и 161 день после трансплантации, соответственно.ПЦР в реальном времени дала положительные результаты раньше, чем анализ BDG или ELISA, и с большей чувствительностью отражала ответ на противогрибковое лечение. На 161-й день после трансплантации в 1 мл крови было обнаружено 1150 копий. Число копий ДНК Aspergillus быстро увеличилось до 3350 копий / мл крови на 168 день. AmB, амфотерицин B; БДГ, (1 → 3) -β-D-глюкан; mPSL, метилпреднизолон; OD, оптическая плотность.

Обсуждение

Список литературы

1« и др.

J Clin Oncol

1997

, vol.

(стр.

139

—

) 2,.

Aspergillus fungemia: отчет о двух случаях и обзор

Clin Infect Dis

1995

, vol.

(стр.

598

—

605

) 3,,.

Радиология

1985

, т.

157

(стр.

611

—

) 4,.

Аспергиллез и мукормикоз: два типа условно-патогенных грибковых пневмоний

Радиология

1981

, т.

140

(стр.

301

—

) 5,,,,,.

Определение (1 → 3) -бета-D-глюкана в плазме: новое средство диагностики глубоких микозов

J Med Vet Mycol

1992

, vol.

(стр.

275

—

) 6« и др.

Lancet

1995

, vol.

345

(стр.

—

) 7,,,,,.

J Clin Pathol

1995

, vol.

(стр.

210

—

) 8,,,,,.

J Clin Microbiol

1995

, vol.

(стр.

1912

—

) 9« и др.

Ограничение методов обнаружения циркулирующего антигена Aspergillus для реципиентов BMT

Пересадка костного мозга

1998

, vol.

(стр.

832

—

) 10,,, et al.

Рак

1999

, vol.

(стр.

274

—

) 11« и др.

Обнаружение и идентификация грибковых патогенов в крови с помощью молекулярных зондов

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

1353

—

) 12,,,.

ПЦР-определение ДНК, специфичной для видов Aspergillus, в сыворотке крови пациентов с инвазивным аспергиллезом

J Clin Microbiol

1996

, vol.

(стр.

2464

—

) 13,,,.

Панфунгальный ПЦР-анализ для выявления грибковой инфекции в образцах крови человека

J Clin Microbiol

1998

, vol.

(стр.

1169

—

) 14,,,.

Am Rev Respir Dis

1993

, vol.

148

(стр.

1313

—

) 15,,,.

Количественная ПЦР в реальном времени

Genome Res

1996

, vol.

(стр.

986

—

) 16,,,,.

Сравнение различных методов выделения ДНК грибковых патогенов из культур и крови

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

3311

—

) 17« и др.

J Clin Microbiol

2000

, vol.

(стр.

2536

—

) 18,,,.

J Clin Microbiol

1995

, vol.

(стр.

497

—

500

) 19.

Лечение лихорадки у больных раком и нейтропенией, вызванной лечением

N Engl J Med

1993

, vol.

328

(стр.

1323

—

) 20« и др.

Haematologica

2000

, vol. .

(стр.

745

—

) 21« и др.

Трахеобронхит Aspergillus после аллогенной трансплантации костного мозга

Трансплантация костного мозга

1999

, т.

(стр.

1145

—

) 22,,,,.

J Clin Microbiol

2000

, vol.

(стр.

1434

—

) 23« и др.

Сравнение ПЦР и обнаружения антигена в сыворотке для диагностики легочного аспергиллеза

J Clin Microbiol

1999

, vol.

(стр.

218

—

) 24« и др.

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

254

—

) 25« и др.

Загрязнения, возникающие в ПЦР-анализах на грибки

J Clin Microbiol

1999

, vol.

(стр.

1200

—

)

Использование ПЦР в реальном времени на образцах крови для диагностики инвазивного аспергиллеза | Клинические инфекционные болезни

Аннотация

Мы разработали новую количественную систему для диагностики инвазивного легочного аспергиллеза (IPA) с использованием автоматической полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.Уровни точности внутри анализа и между анализами для исследования in vitro составляли 2,53% и 2,20%, соответственно, и линейность этого анализа была получена при наличии> 20 копий на лунку. Мы исследовали 323 образца, взятые у 122 пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями, в том числе у 33 пациентов с ИПА и 89 пациентов контрольной группы. Образцы крови были подвергнуты методам обнаружения антигена ПЦР с использованием иммуноферментного анализа (ELISA) и определения концентрации (1 → 3) -β-D-глюкана (BDG) в плазме. Чувствительность измерений ПЦР, ELISA и BDG для диагностики IPA составляла 79%, 58% и 67% соответственно; специфичность составила 92%, 97% и 84%.Положительные результаты ПЦР опережали результаты компьютерной томографии на -0,3 ± 6,6 дня, результаты измерения БДГ на 6,5 ± 4,9 дня и результаты ELISA на 2,8 ± 4,1 дня. ПЦР в реальном времени была чувствительной для диагностики IPA, а количественное определение было точным.

Материалы и методы

Рисунок 1

Профиль амплификации стандартов для Aspergillus ПЦР в реальном времени; 10 ¹ –10 ⁸ копий на лунку (черная полоса) стандартной ДНК Aspergillus амплифицировали в двух экземплярах в течение 50 циклов.Нормализованное значение репортера (Rn) рассчитывали путем деления интенсивности испускания репортерного красителя на интенсивность испускания референсного красителя, включенного в TaqMan Universal PCR Master Mix, который не участвует в анализе ПЦР на основе экзонуклеаз. δRn — это разница между значением Rn + и значением Rn-, где Rn + — значение Rn реакции, которая содержит все компоненты, включая матрицу, а Rn- — значение Rn, полученное на ранних циклах, до заметного увеличения флуоресценции. , во время ПЦР в реальном времени.

Результаты

Рисунок 2

Стандартная кривая для Aspergillus ПЦР в реальном времени. Значения порогового цикла наносили на график против различного количества стандартных копий ДНК. Наклон составлял -3,54 цикла / логарифм. Коэффициент корреляции составил 0,988.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Связь между результатами ПЦР и других исследований на аспергиллез.

Таблица 3

Связь между результатами ПЦР и других исследований на аспергиллез.

Рисунок 3

Клиническое течение пациента, у которого после трансплантации костного мозга развился инвазивный легочный аспергиллез с поражением трахеобронхов. ELISA, измерение BDG и ПЦР в реальном времени дали положительные результаты на 165, 169 и 161 день после трансплантации, соответственно.ПЦР в реальном времени дала положительные результаты раньше, чем анализ BDG или ELISA, и с большей чувствительностью отражала ответ на противогрибковое лечение. На 161-й день после трансплантации в 1 мл крови было обнаружено 1150 копий. Число копий ДНК Aspergillus быстро увеличилось до 3350 копий / мл крови на 168 день. AmB, амфотерицин B; БДГ, (1 → 3) -β-D-глюкан; mPSL, метилпреднизолон; OD, оптическая плотность.

Обсуждение

Список литературы

1« и др.

J Clin Oncol

1997

, vol.

(стр.

139

—

) 2,.

Aspergillus fungemia: отчет о двух случаях и обзор

Clin Infect Dis

1995

, vol.

(стр.

598

—

605

) 3,,.

Радиология

1985

, т.

157

(стр.

611

—

) 4,.

Аспергиллез и мукормикоз: два типа условно-патогенных грибковых пневмоний

Радиология

1981

, т.

140

(стр.

301

—

) 5,,,,,.

Определение (1 → 3) -бета-D-глюкана в плазме: новое средство диагностики глубоких микозов

J Med Vet Mycol

1992

, vol.

(стр.

275

—

) 6« и др.

Lancet

1995

, vol.

345

(стр.

—

) 7,,,,,.

J Clin Pathol

1995

, vol.

(стр.

210

—

) 8,,,,,.

J Clin Microbiol

1995

, vol.

(стр.

1912

—

) 9« и др.

Ограничение методов обнаружения циркулирующего антигена Aspergillus для реципиентов BMT

Пересадка костного мозга

1998

, vol.

(стр.

832

—

) 10,,, et al.

Рак

1999

, vol.

(стр.

274

—

) 11« и др.

Обнаружение и идентификация грибковых патогенов в крови с помощью молекулярных зондов

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

1353

—

) 12,,,.

ПЦР-определение ДНК, специфичной для видов Aspergillus, в сыворотке крови пациентов с инвазивным аспергиллезом

J Clin Microbiol

1996

, vol.

(стр.

2464

—

) 13,,,.

Панфунгальный ПЦР-анализ для выявления грибковой инфекции в образцах крови человека

J Clin Microbiol

1998

, vol.

(стр.

1169

—

) 14,,,.

Am Rev Respir Dis

1993

, vol.

148

(стр.

1313

—

) 15,,,.

Количественная ПЦР в реальном времени

Genome Res

1996

, vol.

(стр.

986

—

) 16,,,,.

Сравнение различных методов выделения ДНК грибковых патогенов из культур и крови

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

3311

—

) 17« и др.

J Clin Microbiol

2000

, vol.

(стр.

2536

—

) 18,,,.

J Clin Microbiol

1995

, vol.

(стр.

497

—

500

) 19.

Лечение лихорадки у больных раком и нейтропенией, вызванной лечением

N Engl J Med

1993

, vol.

328

(стр.

1323

—

) 20« и др.

Haematologica

2000

, vol. .

(стр.

745

—

) 21« и др.

Трахеобронхит Aspergillus после аллогенной трансплантации костного мозга

Трансплантация костного мозга

1999

, т.

(стр.

1145

—

) 22,,,,.

J Clin Microbiol

2000

, vol.

(стр.

1434

—

) 23« и др.

Сравнение ПЦР и обнаружения антигена в сыворотке для диагностики легочного аспергиллеза

J Clin Microbiol

1999

, vol.

(стр.

218

—

) 24« и др.

J Clin Microbiol

1997

, vol.

(стр.

254

—

) 25« и др.

Загрязнения, возникающие в ПЦР-анализах на грибки

J Clin Microbiol

1999

, vol.

(стр.

1200

—

)

Одноступенчатая прямая ПЦР крови: надежный и быстрый метод диагностики нарушений с тройным повторением

https: // doi.org / 10.1016 / j.jns.2017.05.042Права и контент

Основные

•: BD-PCR — это одноэтапная процедура для молекулярной диагностики нарушения триплетных повторов.
•: Не требуется выделения ДНК или предварительной обработки образца крови.
•: BD-PCR работает быстрее и надежнее, чем традиционный метод.
•: BD-PCR преодолевает ограничения ДНК как источника генетической диагностики генетических заболеваний.

Реферат

Цель

Выделение ДНК перед амплификацией полимеразной цепной реакции (ПЦР) при генетической диагностике триплетно-повторяющихся расстройств (TRD) является утомительным и трудоемким процессом и имеет ограничения по загрязнению образца чужеродной ДНК, в том числе из предыдущих образцов. Поэтому мы стремились разработать быстрый, надежный и экономичный метод быстрого генетического исследования TRD из цельной крови в качестве матрицы ДНК.

Методы

Образцы периферической крови были взяты у 70 пациентов с клиническим подозрением на прогрессирующую атаксию.Традиционный метод с использованием геномной ДНК и одноэтапной методики прямой ПЦР с кровью (BD-PCR) с использованием всего 2 мкл образца цельной крови был протестирован для амплификации расширения триплетных повторов в генах, связанных со спиноцеребеллярной атаксией (SCA) типов 1, 2, 3. , 12 и атаксия Фридрейха (FRDA). После ПЦР картировали размеры аллелей и рассчитывали количество повторов с помощью GeneMapper и макросов, запускаемых в программах Microsoft Excel.

Результаты

Успешная амплификация целевых областей была достигнута во всех образцах обоими методами.Частота нормального и мутированного аллеля была согласованной между обоими методами, диагностировав 37% положительных мутаций в любом из генов-кандидатов. BD-PCR привела к более высокой интенсивности пиков продуктов нормальных и патогенных аллелей.

Выводы

Почти точный размер нормального и расширенного аллеля был достигнут за более короткое время (4–5 ч), без выделения ДНК и любого риска перекрестной контаминации, что позволяет предположить, что BD-PCR является надежным, недорогой и быстрый способ подтверждения TRD.Этот метод может быть использован в рутинных диагностических процедурах других тандемно-повторяющихся расстройств.

Ключевые слова

Прямая ПЦР крови

Нарушение триплетных повторов

Спиноцеребеллярная атаксия

FRDA

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

Полный текст

Цитирующие статьи

Сравнительная эффективность ПЦР с использованием ДНК, выделенной из сухих пятен крови и образцов цельной крови для диагностики малярии: метаанализ

В настоящем исследовании эффективность ПЦР с использованием ДНК из DBS и цельной крови кровь сравнивали.Результаты метаанализа 7 исследований показали отсутствие различий в обнаружении малярийных паразитов между двумя образцами крови для ПЦР-анализа. Поскольку результаты метаанализа были неоднородными, для определения источников неоднородности среди включенных исследований требовался анализ по одному или по подгруппам. Была проведена одна за другой интерпретация включенных исследований. Исследование Proux et al. показали, что ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, имеет более высокую эффективность для обнаружения малярийных паразитов в два раза, чем ПЦР с использованием ДНК, выделенной из цельной крови ¹⁶.Хотя исследование Proux et al. указали, что DBS имеет большую чувствительность для выявления паразитов малярии, эксперименты проводились в разных лабораториях с разными реагентами, термоциклерами и техниками ¹⁶; поэтому более высокая эффективность ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, по сравнению с ПЦР с использованием ДНК, выделенной из цельной крови, требует дальнейшего исследования. Исследование Strom et al. продемонстрировал более низкую эффективность ПЦР с использованием ДНК, экстрагированной из DBS, чем ПЦР с использованием ДНК, экстрагированной из цельной крови ¹².

Анализ подгрупп этого исследования продемонстрировал, что ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, обеспечивает более низкую эффективность при обнаружении P. vivax , чем ПЦР с использованием ДНК, выделенной из цельной крови, и нет разницы в производительности при обнаружении P. falciparum или смешанных инфекций не наблюдалось. Хотя не было продемонстрировано никакой разницы между сравнительной эффективностью ПЦР с использованием ДНК, экстрагированной из DBS, и ПЦР с использованием ДНК, экстрагированной из цельной крови для обнаружения P.falciparum , при использовании результатов пяти включенных исследований исследование Strom et al. продемонстрировал более низкую эффективность ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, и предположил, что концентрация ДНК в DBS была ниже, чем в цельной крови, а ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, пропустила 46,1% инфекций P. falciparum ¹². Для выполнения ПЦР при обнаружении малярии P. vivax результат метаанализа четырех исследований показал, что ПЦР имеет более низкую эффективность с использованием ДНК, выделенной из DBS, чем ПЦР с использованием ДНК, выделенной из цельной крови.Кроме того, среди четырех включенных исследований не было обнаружено гетерогенности, и поэтому результаты этого анализа можно надежно интерпретировать. Среди четырех включенных исследований исследование Canier et al. продемонстрировал, что ПЦР с использованием DBS пропустил 27% малярийных паразитов, в основном P. vivax (84%) ⁹. Кроме того, исследование Ataei et al. продемонстрировали, что ПЦР с использованием DBS пропустила только 10,3% инфекций P. vivax ¹⁴. Кроме того, исследование Zainabadi et al.показали, что ПЦР с использованием DBS пропустила 10% случаев инфицирования P. vivax и 25% смешанных инфекций ²¹.

Предыдущее исследование показало, что более низкая эффективность ПЦР с использованием DBS по сравнению с использованием цельной крови может быть связана с методами выделения ДНК, типом фильтровальной бумаги, факторами амплификации и хранением образцов ^15,17,22. Только два включенных исследования, а именно исследования Al-Harthi et al. и Taylor et al. использовали один и тот же метод экстракции ДНК как для DBS, так и для цельной крови ^15,20.Исследование Al-Harthi et al. продемонстрировали, что ДНК, экстрагированная с использованием коммерческого набора, обеспечивает более высокое качество ДНК, чем традиционный метод фиксации метанолом. ¹⁵. Несмотря на использование того же метода выделения ДНК (мини-набор для ДНК крови QIAamp), чувствительность ПЦР была ниже для DBS (57,6%), чем для цельной крови (67%) ¹⁵. Исследование Taylor et al. использовали Chelex 100 (Sigma) для экстракции ДНК как из DBS, так и из цельной крови. Однако они выполнили ПЦР в реальном времени, которая показала более высокую чувствительность для обнаружения малярии по DBS (74%), чем по цельной крови (69%). ²⁰.В этом исследовании использовались разные условия ПЦР для двух типов образцов, включая различия в количестве циклов ПЦР и пороге цикла для преодоления высокой фоновой флуоресценции фильтровальной бумаги ²⁰.

Исследование показало, что DBS содержит меньшее количество малярийной ДНК для амплификации, что приводит к более низкому обнаружению даже после ПЦР, тогда как образцы цельной крови содержат надежные количества малярийной ДНК для более успешной амплификации ДНК независимо от метода ПЦР. ^12,16.Следовательно, более низкая эффективность ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, для обнаружения P. vivax может быть связана с низким количеством и качеством ДНК. Другие факторы, которые могут способствовать низкой эффективности ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, включают, помимо прочего, чрезвычайно низкий уровень паразитемии ¹⁶, высокую температуру ¹² и влажность ^17,23, что может отрицательно сказаться на ней. влияют на общее качество образцов DBS во время хранения. По сравнению с этим, исследование и определение оптимальных протоколов и условий хранения образцов DBS для улучшения восстановления малярийной ДНК с использованием молекулярных методов представляется полезным.Несмотря на более низкую эффективность ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, она позволила обнаружить малярийных паразитов в нескольких образцах, которые оказались отрицательными при микроскопическом исследовании. Кроме того, DBS предлагает множество преимуществ, включая использование пробоотбора пальцем, долгосрочное хранение при комнатной температуре, легкую транспортировку проб, а также простые и быстрые протоколы для диагностических целей.

Это исследование имело некоторые ограничения. Во-первых, в анализ было включено небольшое количество исследований, сравнивающих ПЦР с использованием цельной крови и с использованием DBS.Во-вторых, включенные исследования различаются протоколом методов экстракции ДНК и протоколами ПЦР и, следовательно, могут быть источником неоднородности во всех включенных исследованиях. В-третьих, поскольку результаты метаанализа были неоднородными, сравнительные характеристики ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, по сравнению с ПЦР с использованием ДНК, выделенной из цельной крови, должны интерпретироваться с осторожностью. В заключение, сравнительные характеристики ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, и ПЦР с использованием ДНК, выделенной из цельной крови, значительно различались при обнаружении P.vivax . Следовательно, обнаружение P. vivax в эндемичных районах следует интерпретировать с осторожностью с помощью ПЦР в тех случаях, когда ПЦР с использованием ДНК, выделенной из DBS, потенциально дает отрицательный результат. Необходимы дальнейшие исследования для улучшения использования DBS для молекулярных методов, возможно, путем определения оптимальных протоколов и условий хранения для защиты целостности небольших количеств ДНК. Это улучшит обнаружение P. vivax и других малярийных паразитов, что будет полезно при проведении исследований и регулярном эпиднадзоре за малярией, особенно при новых усилиях по искоренению болезни.

Протокол набора для ПЦР крови Extract-N-Amp ™

Необходимые реагенты и оборудование, не входят в комплект

Микроцентрифужные пробирки или многолуночный планшет для экстракций (минимальный объем 200 мкл)
Перфоратор и карты для засохшей крови
Инкубатор или печь для карт крови (55 ° C) или однослойных клеток (75 ° C)
Пробирки или планшет для ПЦР
Термоциклер
Праймеры для ПЦР
Вода, реагент для ПЦР, Изделие №W1754

Хранение / стабильность

Храните наборы для ПЦР крови Extract-N-Amp ™ при 2–8 ° C до 3 недель. При хранении более 3 недель хранить при -20 ° C. Не храните в морозильной камере с морозильной камерой.

Меры предосторожности и отказ от ответственности

Наборы для ПЦР крови Extract-N-Amp ™ предназначены только для научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ, а не для лекарств, домашнего хозяйства или других целей. Раствор для лизиса едкий. Избегайте контакта с кожей. Надевайте перчатки, защитные очки и подходящую защитную одежду при работе с этим или любым другим реагентом, входящим в комплект.Обратитесь к паспорту безопасности материалов для получения информации об опасностях и правилах безопасного обращения.

Процедура

Все этапы выполняются при комнатной температуре, если не указано иное.

A. Выделение ДНК из цельной крови

1а. Соберите кровь в пробирки, содержащие ЭДТА, цитрат натрия или гепарин натрия. Наилучшие результаты могут быть получены
с ЭДТА или цитратом натрия. Тщательно перемешайте переворачиванием или покачиванием.
Примечание. Для источников, не относящихся к человеку, соберите кровь на трикалиевую ЭДТА (E0270) при конечном
концентрация 5 мМ для предотвращения коагуляции.

2а. Поместите 20 мкл раствора для лизиса крови в микроцентрифужную пробирку или лунку многолуночного планшета для каждого
добыча.

3а. Добавьте 10 мкл крови. Тщательно перемешайте встряхиванием или пипетированием.

4а. Инкубируйте при комнатной температуре 5 минут.

5а. Добавьте 180 мкл раствора для нейтрализации крови. Тщательно перемешайте встряхиванием или пипетированием.

6а. Храните нейтрализованный экстракт крови при 4 ° C или сразу используйте 2 мкл для ПЦР.Продолжите с шага 7.
Примечание: ДНК стабильна в экстракте не менее 6 месяцев при 4 ° C.

B. Извлечение ДНК из карт крови

1б. Соберите образец крови на карту для сбора, № продукта C2613. Дайте полностью высохнуть.

2б. Вырежьте диск (предпочтительно 1/8 дюйма или 3 мм) от карты крови и поместите в пробирку для микроцентрифуги.
Убедитесь, что пробойник содержит как можно больше окровавленного участка.

3б.Перенесите пипеткой 20 мкл раствора для лизиса крови на пробойник карты крови. Образцы можно вращать в
микроцентрифуга в течение нескольких секунд, чтобы заставить раствор попасть в пуансон.

4б. Инкубируйте при 55 ° C в течение 15 минут.

5б. Добавьте 180 мкл раствора для нейтрализации крови. Тщательно перемешайте встряхиванием или пипетированием.

6b Храните нейтрализованный экстракт крови при 4 ° C или сразу используйте 2 мкл для ПЦР. Продолжите с шага 7.
Примечание: ДНК стабильна в экстракте не менее 6 месяцев при 4 ° C.

C. Экстракция ДНК из культивируемых клеток млекопитающих

1с. Выращивайте однослойные клетки в многолуночном планшете до 90-95% конфлюэнтности.

2с. Аспирируйте среду из лунок с помощью наконечника пипетки, подключенного к вакуумной системе. Среда должна быть
удален полностью.

3с. Добавьте в лунки 20 мкл лизирующего раствора для крови.
Примечание. На этом этапе рекомендуется герметизировать пластину с помощью AlumaSeal ™ II (A2350), чтобы предотвратить появление
потери из-за испарения во время инкубации на этапе 4c.Alumaseal ™ можно проткнуть кончиком пипетки, чтобы добавить
раствор для нейтрализации крови на этапе 5c. Новый слой AlumaSeal ™ можно поместить поверх оригинального
.
слой, чтобы снова запечатать пластину для хранения.

4с. Инкубируйте планшет при 75 ° C в течение 5-10 минут (для 24-луночного планшета рекомендуется 5 минут, чтобы избежать этого.
пересушивание образцов).

5с. Добавьте 180 мкл раствора для нейтрализации крови в каждую лунку.Смешайте образцы пипеткой и
вниз.

6с. Храните нейтрализованный клеточный экстракт при 4 ° C или сразу используйте 2 мкл для ПЦР. Продолжите с шага 7.
Примечание: ДНК стабильна в экстракте не менее 6 месяцев при 4 ° C.

ПЦР-амплификация

Реагент Extract-N-Amp ™ Blood PCR ReadyMix содержит антитело JumpStart ™ для специфической амплификации с горячим стартом. Таким образом, реакции ПЦР можно проводить при комнатной температуре без преждевременной активности ДНК-полимеразы Taq .

Типичные конечные концентрации праймеров составляют приблизительно 0,4 мкМ каждая. Оптимальная концентрация праймера и параметры цикла будут зависеть от используемой системы.

7. Добавьте следующие реагенты в тонкостенную пробирку или планшет для ПЦР-микроцентрифуги:

Механизмы ингибирования гемоглобина, иммуноглобулина G и цельной крови в цифровой ПЦР и ПЦР в реальном времени

На протяжении всего исследования применялись два анализа: один был специфическим для человека, нацеленным на ген ретинобластомы 1 ( RB1 ) с ампликоном. размером 156 п.н. [18], а другой — анализ, нацеленный на Salmonella enterica серовар Typhimurium ( Salmonella Typhimurium) invA ген с размером ампликона 88 п.н. [19].Используемая ДНК-полимераза Ex Taq HS (TaKaRa Bio, Шига, Япония) оказалась устойчивой к ингибиторам в следовых количествах слюны и гуминовой кислоте [16, 20]. Количество ДНК поддерживали постоянным в экспериментах, чтобы оценить только эффекты ингибиторов.

Материалы

ДНК

Геномная ДНК человека для анализа RB1 в цПЦР представляла собой материал, полученный из внутреннего стандарта, описанного в предыдущих отчетах [21, 22]. Геномная ДНК для анализа RB1 в кПЦР была извлечена из крови одного мужчины путем экстракции на основе Chelex [23].Концентрацию ДНК измеряли с помощью анализа Qubit dsDNA BR (Thermo Fisher Scientific) с использованием флуорометра Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific). Геномная ДНК для анализа invA была приготовлена следующим образом: Salmonella Typhimurium штамм CCUG 31969 был регенерирован из глицерина при -80 ° C путем его штриховки на чашке с агаром для инфузии мозга и сердца (Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, NJ, USA) и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. После этого единственную колонию переносили в жидкую среду Луриа-Бертани и инкубировали при 37 ° C до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не была равна приблизительно 1.После этого для выделения геномной ДНК использовали набор для очистки геномной ДНК GeneJET (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Концентрацию измеряли с помощью анализа Qubit dsDNA BR, как описано выше. Все экстракты хранили при -20 ° C. Для получения матрицы оцДНК геномную ДНК Salmonella Typhimurium нагревали в течение 5 минут при 95 ° C, а геномную ДНК человека нагревали в течение 15 минут при 95 ° C с использованием термоциклера Applied Biosystems GeneAmp PCR 9700 (Thermo Fisher Scientific ), а затем мгновенное охлаждение и немедленное использование.Ампликоны для использования в анализе EMSA были приготовлены путем очистки продуктов ПЦР из анализа invA , проведенного в 50-мкл реакционных смесей с помощью термоциклера Applied Biosystems GeneAmp PCR system 9700. Продукты ПЦР очищали с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen, Hilden, Германия), и концентрацию измеряли с помощью анализа Qubit dsDNA BR, как описано выше.

Ингибиторы

IgG (номер продукта I4506) были приобретены у Sigma-Aldrich (Тауфкирхен, Германия) и растворены в воде до исходной концентрации 80 мкг / мкл.Человеческий гемоглобин был приобретен у Sigma-Aldrich (номер продукта H7379) и растворен в воде до исходной концентрации 100 мкг / мкл. Гематин свиньи был приобретен у Sigma-Aldrich (номер продукта h4281) и растворен в 0,1 М NaOH с образованием 6 мМ исходного раствора. FeCl ₃ был приобретен у Spectrum Chemical Manufacturing (Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США) и растворен в воде до 0,1 М. Последующие разбавления ингибиторов были сделаны водой. В целях сравнения конечные концентрации ингибиторов в реакциях рассчитывали на основе молекулярной массы или молярной массы IgG (150 кДа), гемоглобина (64.5 кДа), гематина (633,49 г / моль) и FeCl ₃ (162,2 г / моль).

В цПЦР следующие концентрации ингибиторов тестировали в трех повторностях: (1) 2,5%, 5,0%, 7,5%, 10% и 15% (об. / Об.) Кровь; (2) 27, 40, 53, 67, 110, 130, 160 и 190 мкМ IgG; (3) 39, 78, 160, 310, 470 и 620 мкМ гемоглобина; (4) 1000, 2000, 3000, 4000 и 6000 мкМ гематина; (5) 1000, 2000, 3000, 4000 и 6000 мкМ FeCl ₃.

В КПЦР следующие концентрации ингибиторов были протестированы в трех повторностях: (1) 0.00005%, 0,0005%, 0,005%, 0,05%, 1%, 5%, 10% и 20% (об. / Об.) Крови; (2) 1,7, 3,3, 6,7, 13, 27, 33 и 53 мкМ IgG: (3) 0,1, 0,4, 0,8, 1,6, 16, 62, 120, 160, 310, 470 и 620 мкМ гемоглобина; (4) 1, 5, 10, 15, 25, 50, 60 и 80 мкМ гематина; (5) 1, 2, 5, 10, 20, 30 и 40 мкМ FeCl ₃.

Кровь

Цельная кровь, использованная в этой работе, была получена от анонимного донора и была собрана в пробирку Vacuette K ₃ EDTA (номер продукта 454021, Greiner Bio-One International, Кремсмюнстер, Австрия).Пробирки сушили распылением с использованием 1,2–2,0 мг ЭДТА на миллилитр крови, что соответствует приблизительно 4 мМ ЭДТА в крови. Для 15% цельной крови в ПЦР в реакциях будет примерно 0,6 мМ ЭДТА. Мы оценили ингибирующий эффект ЭДТА и обнаружили, что 2 мМ не нарушали реакцию, тогда как 4 мМ ЭДТА приводили к полному ингибированию амплификации в цПЦР с анализом invA (данные не показаны), что означает, что ЭДТА в крови не обнаруживается. Ожидается, что это повлияет на усиление.

Digital PCR

Все эксперименты dPCR проводили с помощью системы анализа с ограничением разбавления в реальном времени / конечной точке BioMark 48.770 Digital Array (Fluidigm, Сан-Франциско, Калифорния, США). Инструмент Fluidigm Digital PCR Analysis, предоставленный производителем, использовался для обработки всех первичных данных с глобальными порогами интенсивности для конкретных анализов и порогом оценки качества 0,1. Циклы 1–60 были проанализированы с помощью пользовательского метода глобального анализа для определения положительных камер. Подробные результаты были экспортированы как.csv файлы для дальнейшей обработки данных.

Праймеры и зонды гидролиза (приобретенные у Thermo Fisher Scientific), используемые в этом исследовании, нацелены либо на ген invA ДНК Salmonella Typhimurium, либо на ген RB1 ДНК человека. Зонды, использованные в этом исследовании, были помечены 6-карбоксифлуоресцеином. Пассивный эталонный краситель 6-карбокси-X-родамин (ROX) (Thermo Fisher Scientific) использовали для нормализации.

Для анализа invA условия амплификации были 95 ° C в течение 2 минут, за которыми следовали 60 циклов по 10 с при 95 ° C, 20 с при 60 ° C и 30 с при 72 ° C.Скорость линейного изменения между заданными значениями температуры составляла 2 ° C / с. Если не указано иное, во все мастер-миксы для анализа invA были включены следующие реагенты: 1 × буфер Ex Taq (TaKaRa Bio), 0,2 мМ дезоксинуклеозидтрифосфат (dNTP; Roche Diagnostics, Базель, Швейцария), 2,0 мМ MgCl ₂ всего (Roche Diagnostics), каждый праймер по 0,3 мкМ (прямой праймер InvA, обратный праймер InvA [19]), зонд гидролиза 0,2 мкМ (связующее с малой бороздкой InvA [19]), 1,0 мкл 20-кратной загрузки GE. реагент (Fluidigm), 1 ед. ДНК-полимеразы Ex Taq HS (TaKaRa Bio), 1 × ROX и 2 мкл ДНК (приблизительно 30 пг / мкл).

Для анализа RB1 условия амплификации были 95 ° C в течение 2 минут, за которыми следовали 60 циклов по 15 с при 95 ° C и 1 мин при 60 ° C. Скорость линейного изменения между заданными значениями температуры составляла 2 ° C / с. Если не указано иное, во все мастер-миксы для анализа RB1 были включены следующие реагенты: 1 × буфер Ex Taq , 0,2 мМ dNTP, 4,0 мМ MgCl ₂ всего, каждый праймер по 0,3 мкМ (RB1_80F и RB1_235R [18]), зонд гидролиза 0,2 мкМ (RB1_212_MGB [18]), 1.0 мкл загрузочного реагента 20 × GE, 1 единица ДНК-полимеразы Ex Taq HS, 1 × ROX и 2 мкл ДНК (приблизительно 25 нг / мкл).

Для экспериментов с ингибиторами ингибирующее соединение добавляли к мастер-миксу, содержащему все реагенты, описанные выше, включая ДНК. При необходимости добавляли воду для амплификации (Promega, Мэдисон, Висконсин, США), чтобы получить общий объем 20 мкл. Этот объем затем использовали для трехкратного анализа dPCR путем добавления 4-мкл аликвот приготовленных мастер-миксов в соответствующее входное отверстие для образца для каждой панели из 48.770 массив. Массивы заполняли с использованием контроллера MX BioMark IFC и помещали в систему BioMark для амплификации и детекции.

Анализ данных результатов цПЦР

Данные анализировали с помощью программы Fluidigm Digital PCR Analysis (версия 3.1.3, сборка 20120816.1505) для определения количества положительных камер. Расчет концентраций ДНК, определение значений цикла количественной оценки (Cq) и эффективности амплификации, а также анализ интенсивности флуоресценции ROX выполняли, как описано в предыдущем исследовании [22].{-3}}, $$

, где y — количество положительных камер, 0,75 × 10 ^-3 — номинальный объем камеры (в микролитрах), указанный производителем, а 770 — общее количество камер. в каждой панели. Определение исходной концентрации образца для специфического для человека анализа RB1 (нг / мкл) было выполнено путем умножения количества копий на микролитр на 10 (коэффициент разведения) и деления на 311 (приблизительное количество копий на нанограмм, предполагая, что 6 .436 пг ДНК на диплоидную мужскую клетку человека [25]).

Определение исходной концентрации образца (пг / мкл) для Salmonella Typhimurium было выполнено путем умножения количества копий на микролитр на 10 (коэффициент разбавления) и деления на 200 (приблизительное количество копий на пикограмм, принимая вес 5 fg для одной копии ДНК Salmonella Typhimurium [26]).

Для определения значений Cq данные кривых амплификации были экспортированы в виде файлов .csv и проанализированы в программной среде R [27] с использованием пакета qpcR [28].Функция pcrbatch использовалась для подбора данных для всех кривых с помощью пятипараметрической лог-логистической функции. Значения Cq были определены с помощью второго метода производного максимума (называемого «cpD2» в пакете qpcR). Эффективность усиления рассчитывалась по отдельным кривым усиления с применением функции, описанной в [29]. Для графической визуализации использовалась GraphPad Prism версии 6.0. Для определения интенсивности флуоресценции ROX использовали ImageJ [30], и интенсивность измеряли в пределах десяти камер на панель.

Чтобы определить, когда имело место значительное влияние на количество положительных реакций, статистический инструмент, разработанный Sidstedt et al. [22]. Инструмент применялся для выявления любых систематических различий в вероятности положительных реакций между образцами с ингибитором или без него. Выходные данные представлены как апостериорное среднее значение разницы и апостериорная масса больше нуля, где 100% означает, что средние значения различны.

ПЦР в реальном времени и гель-электрофорез

Все эксперименты кПЦР проводили с помощью прибора LightCycler Nano (Roche Diagnostics) с реакционным объемом 20 мкл.Программное обеспечение LightCycler Nano версии 1.1 использовали для определения значений Cq.

Для анализа invA условия амплификации были 95 ° C в течение 2 минут, за которыми следовали 50 циклов по 10 с при 95 ° C, 20 с при 60 ° C и 30 с при 72 ° C. Если не указано иное, следующие реагенты были включены во все мастер-миксы для анализа invA : 1 × буфер Ex Taq , 0,2 мМ dNTP, 2,0 мМ MgCl ₂ всего, каждый праймер по 0,3 мкМ (прямой праймер InvA , Обратный праймер InvA [19]), 0.2 мкМ гидролизного зонда (связующее для малых бороздок InvA [19]) или 1 × EvaGreen (Biotium, Хейворд, Калифорния, США), 1 ед. ДНК-полимеразы Ex Taq HS и 4 мкл ДНК (0,013 нг / мкл).

Для анализа RB1 условия амплификации были 95 ° C в течение 2 минут, за которыми следовали 50 циклов по 10 с при 95 ° C, 20 с при 60 ° C и 30 с при 72 ° C. Если не указано иное, во все мастер-миксы для анализа RB1 были включены следующие реагенты: 1 × буфер Ex Taq , 0,2 мМ dNTP, 4.Всего 0 мМ MgCl ₂, каждый праймер по 0,3 мкМ (RB1_80F и RB1_235R [18]), зонд гидролиза 0,2 мкМ (RB1_212_MGB [18]) или 1 × EvaGreen, 1 единица ДНК-полимеразы Ex Taq HS и 2 мкл ДНК (1 нг / мкл).

продуктов ПЦР визуализировали с помощью гель-электрофореза (1% агароза, окрашенная 1 × GelRed от Biotium, 100 В, время пробега 30 мин).Впоследствии изображения были получены с помощью BioOne Quantity (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Реакционные смеси связывания, состоящие из 1 × ПЦР-буфера [50 мМ KCl, 10 мМ трис (гидроксиметил) аминометана гидрохлорид (Трис-HCl), pH 8, с 4 мМ MgCl ₂ всего], 105 Были приготовлены нг геномной ДНК Salmonella Typhimurium и различные количества IgG от 10 до 80 мкг, которые инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого 10 мкл продукта подвергали гель-электрофорезу (1% агароза, окрашенная 1 × GelRed, 100 В, время пробега 30 мин).Впоследствии изображения были получены с помощью BioOne Quantity. Для IgG и ампликонов применялся тот же рабочий процесс, с 40 нг ДНК ампликона invA для анализа в реакциях связывания. Для гемоглобина использовался тот же рабочий процесс с различным количеством гемоглобина от 10 до 80 мкг (только геномная ДНК).

Изотермическая калориметрия титрования

ITC — это мощный инструмент для термодинамических и кинетических исследований в химии, который применяется, например, в ферментативных исследованиях. Принцип ITC заключается в измерении тепла, выделяемого или поглощаемого во время химической реакции, и он имеет значительное преимущество по сравнению с другими методами в том, что он не полагается на какие-либо метки или детектирование флуоресценции, поскольку именно тепло от самого ферментативного процесса измеряется.В данной работе мы использовали модельную систему с фрагментом Кленова, который активен при 37 ° C, поскольку измерения ITC менее стабильны при 72 ° C.

Эксперименты по титрованию проводили на приборе PEAQ-ITC (MicroCal, Northampton, MA, USA) с объемом клеток 200 мкл и шприцем на 40 мкл. Лиофилизированный дезоксиаденозинтрифосфат, дезоксицитидин трифосфат, дезоксигуанозинтрифосфат и дезокситимидинтрифосфат (Jena Bioscience, Германия) растворяли в 1 × буфере для ПЦР (50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl pH 8Cl и 4 мМ 2 мМ исходного раствора 923 Mg. концентрации 10 мМ для каждого dNTP, а затем использовали в концентрации 0.1 мМ в шприце. Концентрацию белка во фрагменте Кленова (номер продукта EP0054, Thermo Scientific) определяли по поглощению УФ-излучения при 280 нм с помощью прибора BioDrop μLITE (BioDrop, Кембридж, Великобритания) с длиной пути 0,5 мм, молярным коэффициентом экстинкции 55450 и молекулярная масса 68 кДа. Олигонуклеотиды, используемые в качестве пары праймер-матрица, были адаптированы из Datta и LiCata [31, 32]. Следующие олигонуклеотиды были приобретены у Integrated DNA Technologies (Коралвилл, Айова, США) как очищенные с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии: 70-мерный, AAACCCTTGGACGGCTGCGAAAGTCGGCAAACGGCACGGTTATCCCAGTCACGAGCATGTACGCTGCGTA; 45мер, TACGCAGCGTACATGCTCGTGACTGGGATAACCGTGC CGTTTGCC.

Аликвоты по 10 мкл dNTP (0,1 мМ) вводили в клетку (10 с на инъекцию). Ячейку перемешивали на протяжении всего эксперимента (500 об / мин), и температуру ячейки устанавливали на 37 ° C. Клетка содержала 300 нМ фрагмента Кленова и 1 мкМ 70-мерных и 45-мерных олигонуклеотидов в качестве матрицы для фрагмента Кленова в 1 × ПЦР-буфере (50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl pH 8 и 4 мМ MgCl ₂) с общий объем 500 мкл. Были проведены контрольные эксперименты, в которых дНТФ вводили в клетку, содержащую все указанные выше реагенты, за исключением фрагмента Кленова.Для экспериментов с ингибиторами в реакциях использовали 0,50 мкМ гематина или 0,53 мкМ IgG.

ПЦР на COVID-19

ПЦР-тест на короновирус: как берут, что показывает

Показания для диагностики: кому стоит сдавать ПЦР на ковид

ПЦР на COVID-19: подготовка к анализу

Результаты диагностики

Диагностика методом ПЦР, кровь. — Комплексы медицинских анализов и их цен в KDL

ПЦР-диагностика (венозная кровь) — сдать анализы в Москве. Научный центр «ЭФиС»

Диагностика COVID-19

ПЦР-диагностика (полимеразная цепная реакция) с мазком из зева

Экспресс-тест на антиген Ag иммунохроматографическим методом

Антитела к коронавирусу IgG, количественно (венозная кровь)

Антитела к коронавирусу IgM, качественно (венозная кровь)

Антитела к коронавирусу IgM качественно и IgG количественно (венозная кровь)

Для юридических лиц цены существенно отличаются. Действует гибкая система скидок

Методы тестирования при подозрении на коронавирус COVID-19 ПЛР ПЦР ИФА Экспресс-тест

Будьте здоровы!

🏥 Сдать анализ ПЦР в Ростове-на-Дону: сдать кровь на ПЦР

Особенности и сфера применения ПЦР анализа

Преимущества и недостатки

ПЦР кровь

Использование ПЦР в реальном времени на образцах крови для диагностики инвазивного аспергиллеза | Клинические инфекционные болезни

Аннотация

Материалы и методы

Результаты

Обсуждение

Список литературы

Использование ПЦР в реальном времени на образцах крови для диагностики инвазивного аспергиллеза | Клинические инфекционные болезни

Аннотация

Материалы и методы

Результаты

Обсуждение

Список литературы

Использование ПЦР в реальном времени на образцах крови для диагностики инвазивного аспергиллеза | Клинические инфекционные болезни

Аннотация

Материалы и методы

Результаты

Обсуждение

Список литературы

Одноступенчатая прямая ПЦР крови: надежный и быстрый метод диагностики нарушений с тройным повторением

Основные

Реферат

Цель

Методы

Результаты

Выводы

Ключевые слова

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Сравнительная эффективность ПЦР с использованием ДНК, выделенной из сухих пятен крови и образцов цельной крови для диагностики малярии: метаанализ

Протокол набора для ПЦР крови Extract-N-Amp ™

Необходимые реагенты и оборудование, не входят в комплект

Хранение / стабильность

Меры предосторожности и отказ от ответственности

Процедура

ПЦР-амплификация

Механизмы ингибирования гемоглобина, иммуноглобулина G и цельной крови в цифровой ПЦР и ПЦР в реальном времени

Материалы

ДНК

Ингибиторы

Кровь

Digital PCR

Анализ данных результатов цПЦР

ПЦР в реальном времени и гель-электрофорез

Анализ сдвига электрофоретической подвижности

Изотермическая калориметрия титрования

Добавить комментарий Отменить ответ