Многоводие мкб 10: Ошибка 404. Файл не найден

КЛАСС XV БЕРЕМЕННОСТЬ, РОДЫ И ПОСЛЕРОДОВОЙ ПЕРИОД (O00-O99) «МЕЖДУНАРОДНАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ БОЛЕЗНЕЙ (МКБ-10)» (утв. Приказом Минздрава РФ от 27.05.97 N 170) (Часть I)

★ Многоводие — заболевания по алфавиту .. Информация

Пользователи также искали:

многоводие 31 неделя,

многоводие 37 недель,

многоводие форум 2019,

многоводие форум,

многоводие на 34 неделе,

многоводие на 38 неделе,

многоводие норма,

выраженное многоводие,

многоводие,

Многоводие,

неделе,

форум,

многоводие форум,

недель,

неделя,

выраженное,

норма,

многоводие на неделе,

многоводие недель,

многоводие неделя,

выраженное многоводие,

многоводие норма,

многоводие на 34 неделе,

многоводие 37 недель,

многоводие на 38 неделе,

многоводие 31 неделя,

многоводие форум 2019,

заболевания по алфавиту. многоводие,

…

Многоводие — Polyhydramnios — qaz.wiki

Избыток околоплодных вод в амниотическом мешке

Многоводие — это заболевание, характеризующее избыток околоплодных вод в амниотическом мешке . Это наблюдается примерно в 1% беременностей. Обычно это диагностируется, когда индекс околоплодных вод (AFI) превышает 24 см. Существует две клинических разновидности многоводия: хроническое многоводие, при котором избыток околоплодных вод накапливается постепенно, и острое многоводие, при котором избыток околоплодных вод накапливается быстро.

Противоположность многоводию — маловодие , недостаток околоплодных вод.

Презентация

Сопутствующие условия

Плоды с многоводием подвержены риску ряда других проблем, включая выпадение пуповины , отслойку плаценты , преждевременные роды и перинатальную смерть. При родах необходимо проверить ребенка на наличие врожденных аномалий.

Причины

В большинстве случаев точную причину установить невозможно. Один случай может иметь один или несколько причин, в том числе внутриутробной инфекции ( TORCH ), RH-isoimmunisation или chorioangioma плаценты. При многоплодной беременности причиной многоводия обычно является синдром переливания крови между близнецами . Материнские причины включают сердечные проблемы, проблемы с почками и материнский сахарный диабет , который вызывает гипергликемию плода и, как следствие, полиурию (моча плода является основным источником околоплодных вод).

Недавнее исследование различает легкое и тяжелое многоводие и показало, что оценка по шкале Апгар менее 7, перинатальная смерть и структурные пороки развития наблюдаются только у женщин с тяжелым многоводием. В другом исследовании у всех пациентов с многоводием, у которых был сонографически нормальный плод, хромосомных аномалий не было.

(M / C для многоводия — это аномалии плода ‘Williams Obstetrics, 24th Edition — Cunningham, Leveno, Bloom et al. Таблица 11-2), но эти аномалии включают:

• желудочно — кишечные нарушения , такие как атрезии пищевода и двенадцатиперстной кишки атрезия (вызывая неспособность глотать амниотическую жидкость), анэнцефалия, расщелины лица, шеи масс, трахеопищеводный свища, и диафрагмальных грыж. Причиной может быть обструкция кольцевидной железы поджелудочной железы.
• Грыжа Бохдалека, при которой плевро-перитонеальные мембраны (особенно левая) не могут развиваться и закупоривать перикардиоперитонеальные каналы. Это приводит к выпячиванию желудка в грудную полость, и плод не может проглотить достаточное количество околоплодных вод.
• нарушения функции почек у плода, которые приводят к увеличению продукции мочи во время беременности, например, при антенатальном синдроме Барттера . Для этих состояний доступна молекулярная диагностика.
• неврологические нарушения, такие как анэнцефалия , которые нарушают глотательный рефлекс. Анэнцефалия — это неспособность закрыть ростральные нейропоры (дефект ростральной нервной трубки). Если ростральные нейропоры не закрываются, не будет нервного механизма глотания.
• хромосомные аномалии, такие как синдром Дауна и синдром Эдвардса , которые сами по себе часто связаны с желудочно-кишечными аномалиями.
• Дисплазия скелета или карликовость. Существует вероятность того, что грудная полость окажется недостаточно большой для размещения всех органов ребенка, что приведет к ограничению трахеи и пищевода, не позволяя ребенку проглотить соответствующее количество околоплодных вод.
• крестцово-копчиковая тератома

Диагностика

Есть несколько патологических состояний, которые могут предрасполагать к многоводию. К ним относятся наличие в анамнезе матери сахарного диабета , резус-несовместимости плода и матери, внутриутробной инфекции и многоплодной беременности .

Во время беременности некоторые клинические признаки могут указывать на многоводие. У матери врач может наблюдать увеличенный размер живота, непропорциональный ее прибавке в весе и сроку гестации, размер матки, превышающий гестационный срок, блестящую кожу с полосами (обычно наблюдаемую при тяжелом многоводии), одышку и тяжесть в груди. При осмотре плода слабые тоны сердца плода также являются важным клиническим признаком этого состояния.

Уход

Легкое бессимптомное многоводие лечится выжидательно. Женщине с симптоматическим многоводием может потребоваться госпитализация. Для снятия изжоги и тошноты могут быть назначены антациды . Нет данных в поддержку диетического ограничения соли и жидкости. В некоторых случаях амниоредукция , также известная как терапевтический амниоцентез , использовалась в ответ на многоводие.

Смотрите также

Рекомендации

внешняя ссылка

<img src=»https://en.wikipedia.org//en.wikipedia.org/wiki/Special:CentralAutoLogin/start?type=1×1″ alt=»» title=»»>

МКБ 10 — МЕДИЦИНСКАЯ ПОМОЩЬ МАТЕРИ, СВЯЗАННАЯ С СОСТОЯНИЕМ ФРУКТОВ, АМНИТИЧЕСКОЙ ПОЛОСТИ И ВОЗМОЖНЫМИ ТРУДНОСТИ РАДИОРАЗОЛЯЦИИ (O30-O48)

O30 Многоплодная беременность

Исключено: осложнения, характерные для многоплодной беременности (O31.-)

O31 Осложнения при многоплодной беременности

Исключены: сросшиеся близнецы, приводящие к несоответствию размеров таза и плода (O33.7) задержке рождения последующего ребенка от двойни, тройни и т. Д.(O63.2) неправильное предлежание одного или нескольких плодов (O32.5) с затрудненными родами (O64-O66)

O32 Материнская помощь в случае установленного или подозреваемого ложного предлежания плода

Включены: условия, являющиеся основанием для наблюдения, госпитализации или другой акушерской помощи матери, а также для проведения кесарева сечения до начала родов. Исключены: перечисленные состояния с затрудненными родами (O64.-)

O33 Материнская помощь в случае установленного или подозреваемого несоответствия таза и плода

Включает: условия, являющиеся основанием для наблюдения, госпитализации или другой акушерской помощи матери, а также для проведения кесарева сечения до начала родов.Исключены: перечисленные состояния с затрудненными родами (O65-O66)

O34 Материнская помощь В случае установленной или предполагаемой аномалии тазовых органов

Включены состояния, являющиеся основанием для наблюдения, госпитализации или другой акушерской помощи матери, а также для проведения кесарева сечения до начала родов. Исключены: перечисленные состояния с затрудненными родами (O65.5)

O35 Материнская помощь В случае установленных или подозреваемых аномалий и травм плода

Включаются: условия, являющиеся основанием для наблюдения, госпитализации и другой акушерской помощи матери или для прерывания беременности.Исключено: медицинская помощь матери в случае установленного или предполагаемого несоответствия таза и размера плода (O33.-)

O36 Материнская помощь при других установленных или подозреваемых состояниях плода

Включены: состояния плода, являющиеся основанием для наблюдения, госпитализации и другой акушерской помощи матери или для прерывания беременности. Исключено: роды, осложненные стрессом (дистрессом) плода (O68.-) синдромом переливания плаценты (O43.0)

O40 Многоводие

Гидрамнион

O41 Другие болезни околоплодных вод и оболочек

Исключено: преждевременный разрыв плодных оболочек (O42.-)

O42 Преждевременный разрыв плодных оболочек

O43 Плацентарные расстройства

Исключено: медицинская помощь матери при медленном росте плода из-за плацентарной недостаточности (O36.5) предлежании плаценты (O44.-) преждевременной отслойке плаценты (O45.-)

O44 Предлежание плаценты

O45 Преждевременная отслойка плаценты [отслойка плаценты]

O46 Пренатальное кровотечение, не классифицированное в других рубриках

Исключено: кровотечение на ранних сроках беременности (O20.-) кровотечение из родов NKDF (O67.-) предлежание плаценты (O44.-) преждевременная отслойка плаценты [O45.-)

O47 False Craps

O48 Беременная

Продолжение после расчетного (предполагаемого) срока родов Продолжение после нормального периода беременности

Роль KMT2D и KDM6A в развитии сердца: межвидовой анализ у людей, мышей и рыбок данио

Abstract

Врожденные пороки сердца (ВПС) являются наиболее частой формой врожденных дефектов, наблюдаемой у 4-10 / 1000 живорожденных.ИБС приводят к широкому спектру структурных и функциональных аномалий сердца, которые существенно влияют на качество жизни и смертность. ИБС часто наблюдается у пациентов с мутациями в эпигенетических регуляторах экспрессии генов, таких как гены, участвующие в синдроме Кабуки — KMT2D и KDM6A, , которые играют важную роль в нормальном развитии и функционировании сердца. Здесь мы исследовали роль двух эпигенетических ферментов, модифицирующих гистоны, KMT2D и KDM6A, в экспрессии генов, связанных с ранним развитием сердца и клеток нервного гребня (NCC).Используя CRISPR / Cas9-опосредованный мутагенез kmt2d, kdm6a и kdm6al у рыбок данио, мы показываем, что экспрессия генов сердца и NCC снижена, что соответствует измененной морфологии сердца и снижению частоты сердечных сокращений. Чтобы перевести наши результаты в патофизиологический контекст человека и сравнить транскриптомные мишени для KMT2D и KDM6A у разных видов, мы выполнили секвенирование РНК (seq) лимфобластоидных клеток от пациентов с синдромом Кабуки, несущих мутации в KMT2D и KDM6A .Мы сравнили наборы данных RNA-seq человека с наборами данных RNA-seq, полученными от мышей и рыбок данио. Наш сравнительный межвидовой анализ выявил общие мишени KMT2D и KDM6A , которые являются общими для разных видов, и экспрессия этих генов-мишеней снижена у мутантов рыбок данио. Взятые вместе, наши результаты показывают, что KMT2D и KDM6A регулируют общие и уникальные гены у людей, мышей и рыбок данио для раннего сердечного и общего развития, что может способствовать пониманию эпигенетической дисрегуляции при ИБС.

Введение

Болезни сердца являются основной причиной смерти в Соединенных Штатах и ​​во всем мире, а врожденные пороки сердца (ВПС) — ведущая причина младенческих заболеваний и смерти, связанных с врожденными дефектами (Benjamin et al., 2019; Gilboa, Салеми, Нембхард, Фикслер и Корреа, 2010; Остер и др., 2013; Оттавиани и Буя, 2017). ВПС присутствуют при рождении, и они оказывают глубокое влияние на структуру и функцию сердца младенцев. ИБС охватывают широкий спектр дефектов, начиная от легких небольших дефектов межпредсердной перегородки, которые заживают сами по себе, до серьезных крупных дефектов межжелудочковой перегородки, требующих медицинского вмешательства.В некоторых случаях осложнения, связанные с ИБС, возникают во взрослом возрасте, в то время как при критических ИБС требуется хирургическое вмешательство на первом году жизни.

Существуют значительные пробелы в наших знаниях о причинах ИБС, которые могут быть связаны с генетическими, эпигенетическими факторами и факторами окружающей среды. Хотя эпигенетические сигнатуры, такие как метилирование ДНК, модификации гистонов, ремоделирование хроматина и микроРНК, начали исследоваться при CHDs и эмбриональном развитии в целом, лежащие в их основе механизмы кардиогенеза изучены не полностью.Тем не менее, эпигенетические модификации вносят значительный вклад в этиологию и прогноз ИБС и других нарушений развития, поскольку пациенты с одинаковыми генотипами и синдромами часто имеют большие различия в фенотипе, пенетрантности и степени тяжести. В самом деле, мутации в ремоделе хроматина Chd7 и гистонацетилтрансферазе Kat6a / b связаны с врожденными дефектами, ведущими к синдромам Charge и Ohdo, соответственно (Vissers et al., 2004) (Campeau et al., 2012).

В нескольких исследованиях сообщалось о связи между ранним развитием сердца и двумя эпигенетическими модификаторами — KMT2D, , который метилирует гистон h4K4 (гистон 3 лизин 4), и KDM6A, , который деметилирует h4K27 (гистон 3 лизин 27) (Ali, Hom , Blakeslee, Ikenouye, & Kutateladze, 2014; Hong et al., 2007; Koutsioumpa et al., 2019; Lan et al., 2007). Мутации в KMT2D и / или KDM6A приводят к синдрому Кабуки (СК), при котором 28-80% пациентов страдают ИБС (Digilio et al., 2017), такими как дефекты межпредсердной и межжелудочковой перегородок, двустворчатые клапаны аорты, коарктация аорты, правый желудочек с двойным выходом, транспозиция магистральных артерий, инфундибулярный стеноз легочной артерии, диспластический митральный клапан, тетралогия Фалло и т.д. Applegate, Bodamer, & Bjornsson, 2019; Shangguan et al., 2019; Текендо-Нгонганг, Крушка, Мартинес и Мюнке, 2019; Яп и др., 2020). Несколько вариантов и миссенс-мутаций KMT2D и KDM6A были идентифицированы при СК и других новых синдромах (Cocciadiferro et al., 2018; Cuvertino et al., 2020; Xin et al., 2018). Помимо ИБС, пациенты с СК имеют типичные дисморфические черты, такие как длинные глазные щели с выворотом боковой трети нижнего века, дугообразные и широкие брови с зазубринами или разрежением боковой трети, короткая колумелла с вдавленным кончиком носа, выступающие или куполообразные уши и устойчивые подушечки пальцев (Adam et al., 2019).

Недавние исследования внесли значительный вклад в наше понимание развития и функции сердца, регулируемых KMT2D и KDM6A (Ang et al., 2016; Lee, Lee & Lee, 2012; Schwenty-Lara, Nurnberger, & Borchers , 2019; Серрано, Демарест, Тоне-Пах-Хот, Тристани-Фирузи и Йост, 2019). KMT2D или лизин-специфическая метилтрансфераза 2D, также известная как MLL2 или миелоидно-лимфоидный лейкоз или лейкоз смешанного происхождения 2. Он принадлежит к семейству из 7 SET1-подобных гистоновых метилтрансфераз (Ali et al., 2014). KMT2D содержит домен SET для метилирования гистонов, домены PHD и coiled-coil и домены цинковых пальцев. KDM6A (и kdm6l у рыбок данио) или лизин-деметилаза 6A, также известная как UTX или повсеместно транскрибируемый тетратрикопептидный повтор, X-хромосома. UTX, UTY и JMJD3 составляют подсемейство белков, содержащих JmjC-домен (Jumonji C) и цинковые пальцы, и они эволюционно консервативны от Caenorhabditis elegans до человека (Klose, Kallin, & Zhang, 2006; Lan et al., 2007; Ши и Ветстайн, 2007). JmjC-домен связан с деметилированием гистонов (Accari & Fisher, 2015), тогда как повторы тетратрикопептида в N-концевых областях UTX и UTY являются предполагаемыми мотивами взаимодействия белков (Lan et al., 2007). Важно отметить, что KDM6A или UTX является X-сцепленным геном с 2 копиями у женщин (XX) и 1 копией у мужчин (XY), где Y-хромосома имеет гомолог UTY (Itoh и др., 2019). Исследования показывают, что UTY и UTX отличались от общего предка, однако функциональная роль UTY в деметилировании гистонов требует дальнейшего изучения, поскольку некоторые исследования показывают, что он имеет более низкую активность деметилирования гистонов, чем UTX (Faralli et al. al., 2016; Hong et al., 2007; Ито и др., 2019; Lan et al., 2007; Шпаргель, Стармер, Ван, Ге и Магнусон, 2017; Шпаргель, Стармер, Йи, Полерс и Магнусон, 2014 г .; Walport et al., 2014).

Чтобы выяснить роль KMT2D и KDM6A в сердце и общем развитии, мы провели межвидовое сравнение общих генов-мишеней KMT2D и KDM6A из наборов данных RNA-seq рыбок данио, мышей и человека. и in vivo анализ мутаций в генах рыбок данио kmt2d, kdm6a и его паралог kdm6al, во время раннего развития.Мы мутировали kmt2d , kdm6a и kdm6al с помощью мутагенеза CRISPR / Cas9, в то время как данные о людях получены из анализа секвенирования РНК двух пациентов с синдромом Кабуки (СК). Один из пациентов с KS имеет замену T на C в положении 4288 в кДНК KMT2D , что приводит к замене аминокислоты C на R в положении 1430, в то время как другой пациент имеет микроделецию 3,2 МБ на X-хромосоме (chrX: 43620636 -46881568), что привело к делеции KDM6A (Van Laarhoven et al., 2015). Наши результаты показывают, что некоторые из генов, которые участвуют в кардиогенезе, сердечной функции, сосудистой сети, нейрогенезе и общем развитии, регулируются KMT2D и KDM6A у рыбок данио, мышей и людей. Наш анализ in vivo на CRISPR-мутировавших рыбках данио показывает, что kmt2d и kdm6a регулируют гены, участвующие в развитии ранних эмбриональных, сердечных клеток и клеток нервного гребня (NCC). Хотя механизм фенотипов еще предстоит выяснить, наши результаты подтверждают текущие открытия в этой области и представляют пан-видовую перспективу роли KMT2D и KDM6A в сердце и общем развитии.Исследование укрепляет позиции рыбок данио в качестве модели для изучения ИБС, возникающих в результате KS и эпигенетической дисрегуляции, и идентифицирует гены, нацеленные на KMT2D и KDM6A у людей, мышей и рыбок данио, которые могут служить либо потенциальными биомаркерами, либо терапевтическими мишенями. при пороках сердца.

Материалы и методы

Животные

Рыбок данио содержали, как описано ранее (Westerfield, 2000). Эмбрионы выращивали в определенной среде для эмбрионов в возрасте 28 лет.5 ° C и в стадии разработки в соответствии с опубликованными стандартами, как описано (Kimmel, Ballard, Kimmel, Ullmann, & Schilling, 1995). Комитет по институциональному уходу и использованию животных Медицинского кампуса Аншутц Университета Колорадо одобрил все эксперименты на животных, проведенные в этом исследовании, и соответствующие нормативным стандартам ухода NIH.

Генотипирование

Для рыб заколки плавников, отдельные целые зародыши или хвосты отдельных зародышей лизировали в буфере для лизиса (10 мМ трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ KCl, 0.3% Твин-20, 0,3% NP-40, 1 мМ ЭДТА) в течение 10 минут при 95 ° C, инкубировали с 50 мкг протеиназы K при 55 ° C в течение 2 часов с последующей инкубацией при 95 ° C в течение 10 минут. . Для генотипирования мутантов kmt2d использовали следующие праймеры (F) 5’-AACAGAGGCAGTACAAAGCCAT-3 ’и (R) 5’-TTGTTGTTGCATCAATAGGTCC-3’. Продукт ПЦР размером 300 п.н. наносили на гель агарозы с высоким процентным содержанием (4%), чтобы отличить гомозиготные мутантные эмбрионы от гетерозиготных эмбрионов и эмбрионов дикого типа. Этот продукт ПЦР размером 300 п.н. разбавляли 1: 100 водой, свободной от нуклеаз.Второй набор праймеров был разработан с использованием dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/) для создания праймера, содержащего несоответствие, которое создает сайт рестрикционной эндонуклеазы на основе идентифицированной мутации SNP в мутанте kmt2d аллель. Используя указанный выше прямой праймер и (R) 5′-GCATTCCTACTGCCGAAGCATCAAGAGAAG -3 ‘, был получен продукт ПЦР, который затем был расщеплен с использованием рестрикционного фермента MboII, который переваривает последовательность дикого типа, но не может разрезать мутантную последовательность, что позволяет получить гомозиготный мутант. эмбрионы следует отличать от гетерозиготных эмбрионов и эмбрионов дикого типа.Для kdm6a, праймерами для генотипирования являются (F) 5’-ATGAAATCGTGCGGAGTGTCGGT-3 ’и (R) 5’-ATAGAGGACAACACAGGCGGTTC-3’. Для dCAPS используется указанный выше прямой праймер и (R) 5’-CTGCAATCATTTGCACCGCTTTGAGCAT-3 ’, за которым следует рестрикционный фермент SphI. Для kdm6al, праймерами генотипирования являются (F) 5’-GGCTTTTATTGTGGCTTTTGGAC-3 ’и (R) 5’-AACTATCAAAAGCGCAGAAGCC-3’. Для dCAPS используются (F) 5’-GAGGAGAAGAAAATGGCGGCG GGAAAAGCGAGTGAACTCGA -3 ’, указанный выше обратный праймер, и рестрикционный фермент XhoI.

Генерация мутантных линий рыбок данио

Мутантные линии рыбок данио для kmt2d и kdm6a и kdm6a (kdm6a / l) были созданы с помощью мутагенеза на основе CRISPR. Целевые сайты CRISPR были идентифицированы с помощью Zifit Targeter http://zifit.partners.org/ZiFiT/ и CHOPCHOP https://chopchop.cbu.uib.no/. Выбранные мишени были использованы для создания направляющих РНК (гРНК), специфичных для kmt2d, или kdm6a. гРНК получали, как описано ранее (Gagnon et al., 2014). Подготовленные гРНК затем совместно инъецировали с 600 нг / мкл белка Cas9 (PNA bio) и 200 мМ KCl. Комплексы Cas9 / sgRNA были сформированы путем инкубации белка Cas9 с sgRNA при комнатной температуре в течение 5 минут перед инъекцией в цитоплазму эмбрионов рыбок данио дикого типа на стадии 1 клетки. Основатели зародышевой линии Mosaic были идентифицированы путем скрининга потомства рыбы с инъекцией CRISPR, выросшей до взрослого возраста. Для каждого отдельного мутантного гена были идентифицированы два отдельных аллеля, и мы сосредоточились на аллелях, схематически представленных на рисунке 1.Мутантные аллели kmt2d и kdm6a / l представляют собой предсказанные мутации сдвига рамки считывания, которые прерывают кодирующую последовательность выше доменов SET и JmjC, соответственно, которые отвечают за функциональную активность гистон-метилтрансферазы и деметилазы в соответствующих генах.

Рисунок 1:

CRISPR / Cas9-опосредованное нарушение kmt2d и kdm6a / l приводит к мутациям сдвига рамки считывания, ведущим к изменениям морфологии сердца и глобальным уровням h4K4me3 и h4K27me3, снижению частоты сердечных сокращений наряду с уменьшением частоты сердечных сокращений.

A. Вверху: Схема белка Kmt2d рыбок данио, полученного из UniProt, с различными доменами. Внизу: схема гена kmt2d рыбок данио, показывающая область-мишень CRISPR. Розовая стрелка показывает целевой сайт CRISPR в обоих. Показаны аллели дикого типа и два мутантных аллеля с соответствующими длинами ORF. Шрифты: розовый — целевой сайт CRISPR, красный — стоп-кодон, зеленый — последовательность PAM (смежный мотив протоспейсера), тире (-) — делеция, точки (….) — продолжение. Сокращения: aa — аминокислоты, bp — пары оснований, CDS — кодирующая последовательность, ORF — открытая рамка считывания, PHD — гомеодомен растения, FYRC — фенилаланин-тирозин — C-концевой домен, SET — Su (var) 3-9, энхансер -of-zeste и Trithorax.

B и C. Вверху: схема белка Kdm6a и Kdm6al рыбок данио, полученного из UniProt, с различными доменами. Внизу: схема гена kdm6a / l рыбок данио, показывающая область-мишень CRISPR. Розовая стрелка показывает целевой сайт CRISPR в обоих. Показаны аллели дикого типа и два мутантных аллеля с соответствующими длинами ORF. Шрифты: розовый — целевой сайт CRISPR, красный — стоп-кодон, зеленый — последовательность PAM (смежный мотив протоспейсера), тире (-) — делеция, точки (…) — продолжение. Сокращения: aa — аминокислоты, bp — пары оснований, CDS — кодирующая последовательность, ORF — открытая рамка считывания, TPR — тетратрикопептидный повтор, JmjC — Jumonji C.

D. Гибридизация in situ , показывающая экспрессию мРНК kmt2d, kdm6a, и kdm6al у дикого типа (вверху) и соответствующих мутантов (внизу) через 48 часов после оплодотворения (часы после оплодотворения). Боковые виды показаны спереди налево, масштаб 250 мкм. Мутанты наблюдались в менделевских отношениях n = 7/29 для kmt2d, n = 8/31 для kdm6a, и n = 7/30 для kdm6al.

E. Вестерн-блоты для определения глобальных уровней h4K4me3 и h4K27me3 с контролем h4 при 48 hpf дикого типа и соответствующих мутантов, как указано.Количественная оценка плотности полос показывает значительное снижение с использованием T-критерия Стьюдента * p <0,05

F. Иммунофлуоресценция для окрашивания антителами 48 hpf рыбок данио, визуализированных с помощью конфокальной микроскопии. Красный — MF20, зеленый — cmlc2 , синий — DAPI. Мутанты дикого типа и соответствующие мутанты помечены. Масштаб 75 мкм. А-предсердие, V — желудочек.

G. Количественная оценка частоты сердечных сокращений с использованием T-критерия Стьюдента p <0,05.

а, атриум; е, глаз; h, сердце; n — хорда; v, желудочек.

In situ гибридизация

Эмбрионы рыбок данио собирали через 48 часов после оплодотворения, фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи и обезвоживали в метаноле. После регидратации в градиентах метанола эмбрионы были обесцвечены (3% перекиси водорода и 0,5% гидроксида калия) до тех пор, пока пигментные клетки тела и глаза не станут видимыми (10 минут), расщеплены протеиназой K в течение 8 минут и зафиксированы в 4% параформальдегиде в течение 25 минут. мин при 4 ° C. Эмбрионы и меченные DIG зонды (sox10, foxd3, crestin, hand2a, mef2ca, kmt2d, kdm6a, kdm6al) предварительно гибридизовали в течение 24 часов при 65 ° C перед инкубацией эмбрионов с указанными зондами в течение ночи при 65 ° C.Эмбрионы подвергали серии жестких промывок в промывочном буфере, содержащем 50% формамида, 2X SSC pH 4,5 и 1% SDS перед блокированием в буфере, содержащем 2% блокирующего реагента (Roche) и 20% инактивированной нагреванием овечьей сыворотки, разведенной в 1X MABT (100 мМ малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween-20) и инкубация антител против DIG (Roche) в течение ночи при 4 ° C. После еще одного набора строгих промывок в NTMT (100 мМ NaCl, 100 мМ Трис, pH 9,5, 50 мМ MgCl ₂ , 1% Твин-20), эмбрионы развивались с помощью реагента BM Purple (Roche) и хранили в PBS.

Выделение РНК

и кПЦР

Полную РНК выделяли из эмбрионов kmt2d — / -, kdm6a — / -, и 48 hpf дикого типа с помощью реагента TRIzol (Invitrogen) и фен / хлороформа. РНК (1-1,5 мкг) подвергали обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью набора кДНК SuperScript III First-Strand Synthesis (Invitrogen). Используя Roche FastStart Universal Probe Master (Rox) (№ по каталогу 4

8001), была проведена полуколичественная ПЦР в реальном времени (qPCR) в Applied Biosystems StepOne Plus со следующими праймерами: sox12 Pr # 6 F: 5 ‘tgacttgcaccacaactgct 3’ R: 5 ‘gcaactcaccaattcctgct 3’ slc22a23 Pr # 56 F: 5 ‘ggcagtgatagtctgccctct 3’ R: 5 ‘gcagagactcgggaaaagc 3’ foxp4 Pr # 68 F: 5 ‘gacaaggcctggtgaaccta 3gcta ngcctgcctggtgaaccta 3gcta 3gctgctgcctggtgaaccta 3gcta 3gctgctgcctgtgaaccta 3gcta 3gctgctgcctgcctgtgaaccta 3gcta 3gctgctgcctgtgaaccta 3gcta 3gcta F: 5 ‘aaggccatagcgctcttct 3’ R: 5 ‘ctcggtaagagccacctgag 3’ six3a Pr # 67 F: 5 ‘aacaggagacaacgagacagg 3’ R: 5 ‘gccattctgccctattgct 3’ id3 Pr # 25 Fgatggtga ‘ggctcaccccttcactctct 3’ prdm1a Pr # 66 F: 5 ‘ccacattgccaccacaacta 3’ R: 5 ‘gtagcccttgaggtggaacc 3’ exca4 Pr # 68 F: 5 ‘agaggatgatgcccagaaggtc, за которым следует номер Pr # 68 F: 5’ agaggatgatgcccagaaggtctc, за которым следует номер Praggatgatgcccagaaggtctc, за которым следует ‘Rag номера зондов из универсальной библиотеки зондов Roche.Уровни транскрипта были нормализованы до actb1 в качестве эталонного гена, (F): 5’-GGCAGCGATTTCCTCATC-3 ’и (R): 5’-TCACTCCCCTTGTTCACAATAA-3’. Обилие транскриптов и относительные кратные изменения в экспрессии генов были количественно определены с использованием метода 2 ^-ΔΔCt относительно контроля.

Вестерн-блот

Для вестерн-блоттинга собирали от 30 до 40 эмбрионов рыбок данио каждого генотипа и объединяли через 48 часов после оплодотворения. Эмбрионы инкубировали на льду в течение 5 минут. Раствор Рингера рыбы Гинзберга без содержания кальция (NaCl, KCl, NaHCO3) добавляли к эмбрионам для деиолкинга.Образцы центрифугировали 1,5 минуты при 5000 об / мин. Гранулы промывали в буфере для удаления олифы (NaCl, Tris (pH 8,5), KCL и CaCl ₂ ). Образцы снова центрифугировали 1,5 минуты при 5000 об / мин. Всю жидкость удаляли, осадок ресуспендировали и лизировали в буфере для образцов SDS (0,1% глицерин, 0,01% SDS, 0,1 M Трис (pH 6,8)) в течение по меньшей мере 10 минут на льду. Эмбрионы гомогенизировали в буфере для лизиса и недолго центрифугировали. Концентрации общего белка определяли с помощью анализа белка Bio-Rad Dc.Белки (20 мкг) разделяли с помощью SDS-PAGE (12%) и переносили на поливинилидендифторидные мембраны. Мембраны блотировали с использованием антител к h4K4me3 (Abcam, ab8580), h4K27me3 (Abcam, ab6002) и h4 (Cell Signaling Technology, 9715S) и вторичных антител, то есть козьих антимышиных антител к h4K4me3 и h4 и козьих антимышиных антител против h3K27me3, конъюгирован с HRP (пероксидаза хрена). Хемилюминесцентное обнаружение выполняли с использованием Luminata Classico Western HRP Subtrate (Millipore) и отображали на мультиплексном устройстве для визуализации BioRad Chemidoc.

Whole Mount Immunofluorescence

Эмбрионы рыбок данио собирали в указанный момент времени и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи при 4 ° C. Эмбрионы промывали и обезвоживали с помощью серии градуированных метанолов. Образцы в 100% метаноле инкубировали, по крайней мере, в течение ночи в метаноле перед следующими этапами. После регидратации через обратный градиент метанола эмбрионы промывали 1x фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,3) с 0,1% Tween 3 раза в течение 10 минут при комнатной температуре, затем уравновешивали 150 мМ Tris pH 9.5 в течение 5 минут при комнатной температуре перед 20-минутной инкубацией в растворе Триса при 70 ° C. После этого этапа извлечения эмбрионы промывали 3 раза по 10 минут каждый в PBS с 0,1% твином при комнатной температуре, затем 2 раза по 5 минут в дистиллированной воде перед блокированием при комнатной температуре в блокирующем растворе, содержащем 10% нормальной козьей сыворотки и 1% бычьей сыворотки. сывороточный альбумин в PBS. Затем эмбрионы инкубировали с первичными антителами в течение 3 дней при 4 ° C. Первичные антитела против MF20 и против GFP (Life Technologies, Conjugate Alexa Fluor ^® 488 A-21311) разводили в блокирующем растворе.В отношении анти-MF20 мы благодарим Банк гибридных исследований развития (DSHB) Университета Айовы и доктора Дональда Алана Фишмана за внесение MF20 в DSHB (гибридомный продукт DSHB MF 20, идентификатор в реестре антител: AB_2147781). После инкубации первичных антител образцы тщательно промывали в PBS с 0,1% Triton X-100. Затем образцы инкубировали во вторичных антителах козы против 594 мыши с флуоресцентной меткой (Invitrogen, A-21044) в течение 2 дней при 4 ° C. После инкубации вторичных антител эмбрионы тщательно промывали в PBS с 0.1% Triton X-100 перед инкубацией в DAPI, разведенном в PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы быстро промывали PBS и пропускали через градиент глицерин / PBS перед нанесением на предметные стекла. Эмбрионы получали на конфокальном микроскопе Leica TCS SP8. Изображения были обработаны в программном обеспечении LASX, и количественная оценка количества клеток была завершена на максимальных проекциях изображений z-стека с использованием Image J.

Образцы клеток человека

Линии лимфобластоидных клеток, полученные от пациентов (LCL), использованные в этом исследовании, были ранее получены из KS. пациенты с мутациями в KMT2D / MLL2 и KDM6A (Van Laarhoven et al 2015).Контрольные LCL от подходящих по возрасту и демографии субъектов были получены из Coriell Institute for Medical Research https://www.coriell.org/

RNAseq пациентов с синдромом Кабуки и сравнения по таксонам

LCL человека из KMT2D и KMT2D и KDM6A пациентов и контрольных групп, как упоминалось выше, были выращены до 10 ⁶ и осаждены. РНК экстрагировали с помощью набора Zymo Research Direct-zol ^TM RNA MiniPrep (Каталожный № R2050). Две библиотеки кДНК для каждого генотипа (например,грамм. дикого типа, мутант KMT2D , мутант KDM6A ) получали из отдельных РНК MiniPreps с использованием набора мРНК Nugen для секвенирования Illumina. Секвенирование было выполнено на Illumina NovaSEQ6000 (чтение с парным концом 150 п.н.) в Genomics and Microarray Shared Resource Core Facility в Онкологическом центре Университета Колорадо в Денвере. Библиотеки были упорядочены до средней глубины 42 миллиона чтений. Считывания были сопоставлены с геномом человека (hg38) с использованием STAR Aligner (v2.7.3a) (Dobin et al., 2013), а количество генов было вычислено из STAR с использованием количественного режима (Dobin et al., 2013). Дифференциальное выражение было выполнено в R с использованием Deseq2 (Love, Huber, & Anders, 2014).

Мы сравнили наши данные RNAseq человека с ранее опубликованными наборами данных мутантов KMT2D и KDM6A от мышей и рыбок данио (Ang et al., 2016; Fahrner et al., 2019; Itoh et al., 2019; Lei & Jiao, 2018; Serrano et al., 2019; Шпаргель и др., 2017). Наборы данных RNAseq были загружены из NCBI Gene Expression Omnibus. Наборы данных включали GSE129365 (хондроциты мыши Kmt2d, (Fahrner et al., 2019)), GSE103849 (клетки нервного гребня мыши Kdm6a (Shpargel et al., 2017)), GSE121703 и GSE128615 (мышиные клетки Cd4, (Itoh et al., 2019)), GSE110392 (нервные стволовые клетки мыши, (Lei & Jiao, 2018)). Кроме того, набор данных RNAseq для мутантов Kmt2d цельных эмбрионов рыбок данио был предоставлен Serrano et al. (Серрано и др., 2019). При необходимости загруженные наборы данных RNAseq были повторно проанализированы с использованием DESeq2 для дифференциальной экспрессии.

Чтобы идентифицировать потенциальные основные гены, регулируемые Kmt2d и Kdm6a, мы нашли набор пересечений генов, дифференциально экспрессируемых при номинальном значении p, равном 0.05 в каждом наборе данных для всех наборов данных Kmt2d и Kdm6a RNAseq соответственно. Для этого мы использовали BioMart, реализованный в R, для преобразования нечеловеческих символов генов в ортологичные идентификаторы ансамблей человека, позволяя при этом множественные сопоставления учитывать дупликации генов. Множества пересечений были вычислены на основе этих идентификаторов ансамблей людей.

Статистический анализ

Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего из числа образцов или экспериментов, указанных в подписях к рисункам. Все анализы повторяли не менее трех раз с независимыми образцами.Значения P были определены с помощью тестов Стьюдента t с использованием GraphPad Prism.

Результаты

Нарушение

kmt2d и kdm6a / l у рыбок данио вызывает сердечные дефекты

Мы нарушили kmt2d, kdm6a и kdm6al у рыбок данио с помощью CRISPR / Cas9 мутагенеза, чтобы понять их роль в развитии сердца. Направляющие РНК были разработаны для нацеливания на сайт Protospacer Adjacent Motif (PAM) в экзоне 6 kmt2d и экзоне 1 kdm6a и kdm6al (рис. 1A-C).Мутации в последовательностях ORF (открытая рамка считывания) для kmt2d , kdm6a и kdm6al показаны на фиг. 1A-C. kmt2d ^CO1015 , kdm6a ^CO1016 и kdm6al C ^O1017 используются в исследовании, далее обозначаемые как kmt2d — / -, kdm6a — / — и kdm6a — / — и kdm6a — / — — / — мутанты соответственно. Хотя мутации в аллелях kmt2d расположены в нижележащем экзоне, результирующие мутации, как предполагается, будут аллелями потери функции, подобными мутациям в kdm6a и kdm6al .Мутации были дополнительно подтверждены снижением экспрессии транскрипта для каждого аллеля в каждом из соответствующих мутантов через 48 часов после оплодотворения после гибридизации in situ с зондами, полученными из кДНК для kmt2d , kdm6a и kdm6al . У эмбрионов дикого типа kmt2d, kdm6a и kdm6al сильно экспрессируются в мозге, глазах и в целом в остальном теле, включая сердце, что согласуется с предыдущими сообщениями (Van Laarhoven et al., 2015) (Рисунок 1D). Экспрессия для kmt2d, kdm6a и kdm6al в соответствующих мутантах снижена, однако экспрессия в хорде, по-видимому, неспецифична. Чтобы изучить влияние каждой мутации на модификации гистонов, мы исследовали h4K4me3 и h4K27me3 с помощью вестерн-блоттинга на 48 hpf целых эмбрионах по сравнению с общими уровнями гистона3 (h4). В соответствии с ролью Kmt2d в продвижении h4K4me3 (Koutsioumpa et al., 2019) мы наблюдали снижение общих уровней h4K4me3 у kmt2d — / — рыбок данио через 48 часов после оплодотворения (Рисунок 1E).Сходным образом мутация kdm6a и его паралога рыбок данио kdm6al привела к увеличению h4K27me3 через 48 часов после оплодотворения по сравнению с общим h4 (Рис. 1E) (Hong et al., 2007).

Чтобы изучить роль kmt2d и kdm6a / kdm6l в развитии сердца, мы проанализировали формирование сердца у рыбок данио на фоне cmlc2 : GFP (холодное сердце) при 48 hpf. cmlc2 — ген легкой цепи 2 сердечного миозина, который маркирует миокард (Huang, Tu, Hsiao, Hsieh, & Tsai, 2003), и его экспрессия приводит к флуоресцентному сердцу.Мы использовали антитело против тяжелой цепи саркомерного миозина (MF20), которое экспрессируется в кардиомиоцитах (George, Colombo, & Targoff, 2015) на фоне cmlc2 : GFP для анализа морфологии сердца. Мы наблюдали измененную морфологию сердца у мутантов (рис. 1 F), у мутантов kmt2d и kdm6a , представленных с измененной морфологией камеры по сравнению с диким типом. Кроме того, у всех наблюдается небольшое, но статистически значимое снижение частоты сердечных сокращений (рисунок 1G), но не во всей области сердца (дополнительный рисунок 1).Следовательно, как ранее наблюдалось у пациентов с СК и в предыдущих исследованиях на животных, одиночные мутации в kmt2d, kdm6a и kdm6a вызывают дефекты сердечного развития на различных уровнях.

Дополнительный рисунок 1:

Количественная оценка площади сердца на рисунке 1F не показывает разницы в общем размере сердца.

Экспрессия генов клеток сердца и нервного гребня снижена у

kmt2d и kdm6a / l мутантных эмбрионов

Развитие сердца происходит раньше всех других функциональных органов, когда начинается формирование сердечного серпа с участием кардиогенных клеток-предшественников после гаструляции (Herrmann, Gross, Zhou, Kestler, & Kuhl, 2012).Впоследствии кардиогенная мезодерма дает начало первому полю сердца (FHF) и второму полю сердца (SHF) (Herrmann et al., 2012; Moretti et al., 2006; L. Yang et al., 2008). FHF влияет на первичную сердечную трубку, левый желудочек и большую часть предсердий, в то время как SHF способствует развитию правого желудочка, оттока и предсердий (Buckingham, Meilhac, & Zaffran, 2005; Herrmann et al., 2012; Laugwitz, Moretti, Карон, Накано и Чиен, 2008 г.). Согласованные сигналы от FHF и SHF, происходящих из мезодермы, а также от энтодермы, имеют решающее значение для кардиогенеза (Herrmann et al., 2012). Следовательно, мы проверили экспрессию hand2 и mef2ca , которые экспрессируются как в FHF, так и в SHF (Herrmann et al., 2012), у мутантов kmt2d , kdm6a и kdm6al in situ гибридизация через 48 часов оплодотворения. hand2a или h eart a nd n eural crest d производные, экспрессируемые 2a , является основным транскрипционным фактором спираль-петля-спираль, который регулирует морфогенез сердца, дифференциацию кардиомиоцитов и специфичную для сердца транскрипцию и экспрессируется в FHF и нервном гребне глоточных дуг (McFadden et al., 2005; Schindler et al., 2014). hand2a принадлежит к эволюционно законсервированной программе сердечной транскрипции, которая определяет сердечных предшественников в мезодерме передней боковой пластинки (ALPM), которые мигрируют в среднюю линию эмбриона для экспрессии белков сердечного саркомера, в конечном итоге сливаясь, образуя бьющуюся сердечную трубку (Lu , Langenbacher, & Chen, 2016). hand2a Домены экспрессии ограничивают область формирования сердца в ALPM (Lu et al., 2016; Schoenebeck, Keegan, & Yelon, 2007) и определяют основные домены, которые формируют глоточные дуги дорсовентральной оси рыбок данио (Talbot, Johnson, & Kimmel , 2010).В зачатке сердца рыбок данио домены экспрессии hand2a и появляются спереди-латеральнее ромбомера 3 заднего мозга (Maves, Tyler, Moens, & Tapscott, 2009). Экспрессия hand2a снижена у мутантов kmt2d, kdm6a и kdm6al (фиг. 2). hand2a обычно широко экспрессируется в сердце, снижается особенно по средней линии у мутантов kmt2d и kdm6a , но в меньшей степени у kdm6al — / -. Аналогичный паттерн экспрессии наблюдается для mef2ca , или m yocyte e nhancer f Actor 2ca , экспрессируется в основном в формирующейся области сердца, является фактором транскрипции, который регулирует дифференцировку миокарда и развитие сердца (Hinits и другие., 2012). В сердцах рыбок данио mef2ca экспрессируется в ALPM со стадии 6 сомитов и сохраняется во время слияния двух полей сердца в примитивную сердечную трубку (Hinits et al., 2012). Экспрессия mef2ca, аналогичным образом подавляется в области сердца у мутантов kmt2d, kdm6a и kdm6al . Следовательно, kmt2d, kdm6a и kdm6al регулируют гены, участвующие в ранних событиях развития сердца.

Рисунок 2: Экспрессия ранних генов сердечных маркеров снижена при мутациях синдрома Кабуки.

Гибридизация in situ , показывающая экспрессию мРНК hand2a и mef2ca у дикого типа и соответствующих мутантов через 48 часов после оплодотворения.

A, B. Вентральные виды показаны для экспрессии hand2a и mef2ca у развивающихся рыбок данио. Стрелки, экспрессия hand2 и mef2ca особенно снижены по средней линии эмбриона.

C. Боковые виды для mef2ca показывают сниженную экспрессию в области сердца (стрелка).

Масштаб 100 мкм. Перед левым для всех изображений. е, глаз; fb, плавник-бутон; г, ганглий; h, сердце; м, мышца; па, глоточные дуги. Мутанты наблюдались в менделевских отношениях n = 8/34 для kmt2d, n = 8/30 для kdm6a, n = 7/29 для kmd6al, для hand2a выражения и n = 7/30 для kmt2d, n = 8/31 для kdm6a, n = 8/33 для kdm6al, для mef2ca выражения.

Помимо кардиогенной мезодермы, развитие сердца также регулируется сердечными NCC, которые вносят вклад в перегородку тракта оттока, формирование паттерна дуги аорты и полулунные клапаны (Brade, Pane, Moretti, Chien, & Laugwitz, 2013).Предыдущие исследования показали, что kmt2d и kdm6a играют роль в регулировании образования NCC (Schwenty-Lara, Nehl, & Borchers, 2019; Shpargel et al., 2017). Для дальнейшего изучения роли kmt2d и kdm6a мы проанализировали экспрессию ранних маркеров нервного гребня, таких как sox10 , foxd3 и crestin у рыбок данио посредством гибридизации in situ . sox10 регулирует образование NCC с момента их появления и определяет несколько производных NCC (Aoki et al., 2003; Даттон и др., 2001; Саутард-Смит, Кос и Паван, 1998). foxd3 экспрессируется в NCC и поддерживает предшественников NCC (Labosky & Kaestner, 1998; Teng, Mundell, Frist, Wang, & Labosky, 2008). Крестин характеризуется экспрессией пан-нейрального гребня во время эмбриогенеза рыбок данио, включая премиграционные и мигрирующие NCC (Luo, An, Arduini, & Henion, 2001; Rubinstein, Lee, Luo, Henion, & Halpern, 2000). У мутантных рыбок данио kmt2d, kdm6a и kdm6a, l , экспрессия sox10 немного снижена у всех трех мутантов через 12 часов после оплодотворения, что указывает на снижение индукции NCC.Экспрессия foxd3 через 15 часов после оплодотворения также снижается специфически у большинства передних популяций, мигрирующих к сердцу, у kmt2d и kdm6a , но не у мутантов kdm6al . Общая экспрессия гребня через 24 часа после оплодотворения заметно не снижается ни у одного из мутантов, что указывает на нормальные миграционные потоки NCC (фиг. 3). Эти результаты показывают, что kmt2d и kdm6a регулируют ранние стадии развития NCCs у рыбок данио.

Рисунок 3: Экспрессия ранних маркерных генов, специфичных для нервного гребня, снижена при мутациях синдрома Кабуки.

A, B. Гибридизация in situ , показывающая экспрессию мРНК sox10 и foxd3 в эмбрионах дикого типа и соответствующих мутантах через 12 часов после оплодотворения и 14 часов после оплодотворения соответственно. Виды сверху показаны для sox10 и foxd3 с масштабом 100 мкм. Стрелка, сниженная экспрессия foxd3 в области формирования сердца у мутантов kmt2d и kdm6a .

C. Экспрессия гребня через 24 часа после оплодотворения, а виды сбоку показаны для гребня , с масштабом 250 мкм. Перед левым для всех изображений. е, глаз; h, сердце; nc — нервный гребень; у, желток. Мутанты наблюдались в менделевских отношениях n = 7/29 для kmt2d, n = 8/29 для kdm6a, n = 7/30 для kdm6al, для sox10 выражения; n = 8/34 для kmt2d, n = 8/31 для kdm6a, n = 7/29 для kdm6al, для foxd3 выражения и n = 8/30 для kmt2d, n = 8 / 31 для kdm6a, n = 7/30 для kdm6al, для выражения crestin .

Сравнительный анализ выявил общие цели для

KMT2D и KDM6A

Чтобы перевести наши результаты в контекст здоровья человека, мы исследовали транскриптом 2 пациентов с синдромом Кабуки, несущих мутации в KMT2D и KDM6A , РНК-секвенирование их лимфобластоидных клеток. Пациент с мутацией KMT2D имеет переход c.4288T> C (p.C1430R) (рис. 4A), а пациент с мутацией KDM6A имеет микроделецию в хромосоме X, приводящую к делеции KDM6A (рис. 4A, таблица ).В качестве контроля мы использовали LCL от лиц совпадающих по возрасту и этнической принадлежности. Чтобы установить дифференциальную экспрессию гена, сгенерированные чтения из RNA-seq были картированы в геном человека с использованием выравнивателя STAR (Dobin et al., 2013), а дифференциальная экспрессия была выполнена в R с помощью DESeq2. Дифференциально экспрессируемые гены (номинальное значение p <= 0,05) из нашего набора данных о человеке KMT2D сравнивали с наборами данных секвенирования РНК для мышей-мутантов Kmt2d и рыбок данио, созданных другими исследователями (см. Методы).Для мышей набор данных секвенирования РНК получен из эмбриональных сердец (Ang et al., 2016), а данные о рыбках данио получены из целых эмбрионов (Serrano et al., 2019). Аналогичным образом, наши наборы данных KDM6A seq РНК человека сравнивали с тремя отдельными наборами данных seq РНК мышей, которые являются мутантами по Kdm6a . Наборы данных о мышах получены из NCC (Shpargel et al., 2017), нервных стволовых клеток (Lei & Jiao, 2018) и клеток CD4 + (Itoh et al., 2019). Для KDM6A сравнение проводится только между людьми и мышами, поскольку секвенирование РНК рыбок данио для мутации kdm6a недоступно.

Рисунок 4: KMT2D имеет общие цели для людей, мышей и рыбок данио.

A. Таблица: Информация о мутациях пациентов.

B. Диаграммы Венна, показывающие перекрытие между списками генов, полученными в результате анализа РНК-секвенирования (seq) наборов данных мутантов KMT2D от людей, мышей и рыбок данио, как указано.

C. Тепловые карты, показывающие 76 общих целей среди людей, мышей и рыбок данио. Гены, выбранные для RT-qPCR на рисунке 4C, выделены зелеными рамками.

Д.Экспрессия RT-qPCR мРНК цельного эмбриона 48 hpf рыбок данио sox12, slc22a23, foxp4, six3, и nr2f6a, нормализована по отношению к actb1. генов были отобраны из общих мишеней KMT2D , исходя из их роли в сердечном и общем развитии. * — p <0,05, ** - p <0,005, ns - несущественно

Сравнение наборов данных по 3 видам выявило 76 общих целей для KMT2D (Рисунок 4B). 30 из 76 общих мишеней либо активируются, либо подавляются по аналогичной схеме у 3 видов, в то время как 46 не имеют сходства в образцах экспрессии у 3 видов, как показано на тепловых картах (Рисунок 4C).Для KDM6A было обнаружено 7 общих целей между наборами данных человека и 3 мышей (рис. 5A). Различия в количестве общих целей между наборами данных KMT2D и KDM6A отчасти могут быть связаны с различиями в ролях и целях KMT2D и KDM6A , а также с функциональной избыточностью других членов семейства у разных видов ( Акерберг, Хеннер, Стюарт и Станкунас, 2017; Крамп и Милн, 2019; Феллоус, Эрли, Сильвестр, 2019; Ноттке, Колайаково и Ши, 2009).Тепловые карты показывают, что из 76 общих мишеней между 3 видами, паттерны экспрессии 49 генов аналогичны между наборами данных мыши и человека, а 27 генов — нет (Рисунок 5B). Несходство, вероятно, связано с различиями в типе клеток и возрасте. Следовательно, подобно KMT2D , KDM6A также, вероятно, регулирует экспрессию генов посредством жесткой временной и пространственной оркестровки.

Рисунок 5: KMT2D разделяет общие мишени для людей и различных типов клеток мышей, которые аналогичным образом регулируются у рыбок данио.

A. Диаграммы Венна, показывающие перекрытие между списками генов, полученными из анализа последовательностей РНК наборов данных мутанта KDM6A от людей и трех различных типов клеток мышей, как указано.

B. Тепловые карты, показывающие 7 общих целей среди людей и 3 типа клеток мышей. Сокращения: Ms — мышь, NCC — клетки нервного гребня, NSC — нервные стволовые клетки, Cd4 — Т-лимфоциты Cd4. Гены, выбранные для RT-qPCR на рисунке 5C, выделены зелеными рамками.

C. Экспрессия RT-qPCR на 48 hpf мРНК целого эмбриона рыбок данио id3, prdm1a, и тревожно4, нормализована по отношению к actb1 .Гены были выбраны из общих мишеней KDM6A ’ на основании их роли в сердечном и общем развитии. * — p <0,05, ** - p <0,005, нс - несущественно

Мы выбрали общие цели для наборов данных KMT2D и KDM6A , исходя из их роли в сердечном и общем развитии, как показано в таблицах 1 и 2, чтобы подтвердить, регулируются ли эти гены сходным образом с помощью kmt2d или kdm6a во время раннего развития у рыбок данио.Гены, выбранные из анализа наборов данных KMT2D : SOX12, SLC22A23, FOXP4, NR2F6, и SIX3 . Гены, выбранные из анализа наборов данных KDM6A : ID3 , PRDM1 и ANXA4 . Для проверки мы выполнили qRT-PCR для sox12, slc22a23, foxp4, nr2f6, и six3 в 48 hpf kmt2d — / — мутантных рыбок данио. Аналогичным образом мы выполнили qRT-PCR для id3 , prdm1a и alarma4 в 48 hpf kdm6a — / — мутантных рыбок данио.Наши результаты показывают снижение экспрессии для sox12 , foxp4 , nr2f6 и six3 в мутанте kmt2d — / — (рис. 4C) и id3 , prdm1a и alarma4 в мутант kdm6a — / — (фиг. 5D).

Таблица 1:

Характеристики, относящиеся к сердечному и общему развитию

Таблица 2:

Характеристики, относящиеся к сердечному и общему развитию

Наши результаты qRT-PCR для kmt2d — / — мутантных рыбок данио показывают подавление sox12 , foxp4 , nr2f6 и six3 , таким образом демонстрируя большую согласованность с seq РНК рыбок данио, где эти гены подавлены (рис. 4C). Sox12 , Foxp4 и Six3 не подавляются, а в различной степени активируются в RNA-seq мышей (рис. 4C). SOX12 , FOXP4 и NR2F6 не подвергаются понижающей регуляции, а скорее повышаются в различной степени в последовательности РНК человека (рис. 4C). Экспрессия slc22a23 существенно не изменяется в qRT-PCR, хотя она умеренно повышена у рыбок данио и мышей RNA-seq, и сильно в seq РНК человека (Рисунок 4C).Наборы данных KMT2D и KDM6A показывают вариации в паттернах экспрессии одних и тех же генов у разных видов и типов клеток, что указывает на тесную пространственную и временную оркестровку ролей KMT2D и KDM6A в регуляции генов.

Результаты qRT-PCR для мутантных рыбок данио kdm6a — / — показывают снижение id3, prdm1a, и тревога4 (рис. 5C), что согласуется с наборами данных RNA-seq из NCC мышей и нервного ствола. ячеек (рис. 5В).Кроме того, Prdm1 из CD4 + RNA-seq мыши и ANXA4 из seq РНК человека подавляются, как в данных qRT-PCR. Повышенная регуляция Id3, и Anxa4 в последовательности РНК CD4 + клеток мыши и ID3 и PRDM1 в последовательности РНК человека может быть объяснена различиями в используемых типах клеток-источников, а также различиями в видоспецифичных временных и пространственная регуляция экспрессии гена с помощью KDM6A, которая до конца не изучена. Интересно отметить сходство и различие транскриптомных профилей схожих типов клеток i.е. лимфобластоид человека и CD4 + мыши соответственно.

Обсуждение

Развитие сердца управляется клетками-предшественниками из кардиогенной мезодермы, проэпикарда и клеток сердечного нервного гребня (Brade et al., 2013). Мезодерма способствует формированию серпа сердца и линейной сердечной трубки, проэпикард способствует созреванию камеры и формированию коронарных сосудов, а клетки нервного гребня сердца вносят вклад в перегородку тракта оттока, формирование паттерна дуги аорты, полулунные клапаны, кардиомиоциты в амниотах и ​​регенерацию сердца у рыбок данио. (Брэйд и др., 2013; Jain et al., 2011; Тан, Мартик, Ли и Броннер, 2019 г.). Следовательно, CHDs возникают из-за нарушения развития сердечных клеток-предшественников, которое тесно координируется во временном и пространственном отношениях сложной сетью генетических и эпигенетических факторов. Высокопроизводительные анализы на основе отдельных клеток дополнительно подтверждают транскрипционную регуляцию кардиогенеза (de Soysa et al., 2019). Эпигенетические факторы, такие как KMT2D и KDM6A , были изучены несколькими группами, чтобы определить, как их мутации приводят к порокам сердца. KMT2D и KDM6A связаны с критическими модификациями гистонов — h4K4me3 и h4K27me3, соответственно, — которые связаны с различными аспектами сердечного развития и заболевания.

Здесь мы впервые представляем сравнение транскриптомов рыбок данио, мышей и людей с мутациями в KMT2D, и сравнение транскриптомов человека и трех различных популяций клеток мышей с мутациями в KDM6A. Подмножество генов, участвующих в развитии и физиологии сердца, сосудистой сети и общем развитии, оказалось общими целями во всех наборах данных для каждой мутации.В частности, наш анализ выявил 76 генов в качестве общих мишеней для KMT2D после сравнения наших наборов данных о людях с наборами данных для рыбок данио и мышей. 30 из 76 генов демонстрируют сходный паттерн экспрессии у 3 видов, а 46 генов — нет. Разные паттерны экспрессии 46 генов можно частично объяснить тем фактом, что транскриптомы 3 видов происходят из разных популяций клеток, происходящих на разных этапах жизни. Следовательно, эпигенетическая регуляция с помощью KMT2D строго организована пространственно и временно.С другой стороны, подобный паттерн экспрессии 30 генов KMT2D у 3 видов указывает на то, что его роль частично законсервирована. Для KDM6A, мы определили 7 общих целей при сравнении наборов данных RNA-seq человека с наборами данных 3 мышей, полученных из нервного гребня, нервного ствола и клеток CD4 +. Наш анализ in vivo мутаций kmt2d и kdm6a у рыбок данио подтверждает выводы предыдущих исследований, посвященных изучению этих двух генов в развитии и заболеваниях сердца (Ang et al., 2016; Ли и др., 2012; Швенти-Лара, Нюрнбергер и др., 2019; Серрано и др., 2019).

Серрано и др. показали, что kmt2d мутаций у рыбок данио вызывают дефекты сердечно-сосудистого развития, ангиогенеза и формирования дуги аорты, а также гипопластичность сердца (Serrano et al., 2019). Kmt2d ассоциируется с генами кардиомиоцитов, а делеция миокарда Kmt2d снижает экспрессию сердечных генов во время развития сердца мышей (Ang et al., 2016). У xenopus, основанный на морфолино нокдаун kmt2d вызывает гипопластичность сердца, снижение экспрессии генов раннего сердечного развития, таких как tbx20, isl1, nkx2.5 (Schwenty-Lara, Nurnberger, et al., 2019), а также нарушение образования и миграции NCC за счет снижения экспрессии ранних специфичных для NCC маркеров, таких как pax3 , foxd3 , twist и slug (Швенти-Лара, Нель и др., 2019).

С другой стороны, KDM6A или Utx способствует дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши (ESC) в сердечную линию и служит коактиватором основных факторов сердечной транскрипции, таких как Srf, Nkx2.5, Tbx5, и Gata4 (Lee et al., 2012). KDM6A или Utx ассоциируется с кардиоспецифичными генами, такими как Anf и Baf60c , чтобы помочь рекрутировать Brg1, АТФ-зависимый ремоделер хроматина, который активирует транскрипцию основных факторов транскрипции сердца (Hang et al., 2010; Lee et al., 2012; Lickert et al., 2004). Специфическая для нервного гребня условная делеция аллеля KDM6A или Utx с трансгеном Wnt1-Cre вызывает ИБС, подобную открытому артериальному протоку (Shpargel et al., 2017).

В то время как мы наблюдаем умеренное сокращение ранней спецификации NCC (sox10 и foxd3, Рисунок 3) у мутантов рыбок данио kmt2d и kdm6a , миграция по большей части кажется нормальной, поскольку мы не видим резкое уменьшение количества клеток в развивающемся сердце (Рисунки 2 и 3). Аналогичным образом, наш анализ in vivo рыбок данио показывает снижение экспрессии специфичных для NCC маркеров раннего сердечного развития, таких как hand2a и mef2ca (Рисунок 2).Вместе наше исследование подчеркивает несколько недавних публикаций о роли KMT2D и KDM6A на ранних стадиях развития сердца и сердечных NCC. Наш межвидовой транскриптомный анализ показывает консервативные и уникальные паттерны экспрессии генов для KMT2D, и KDM6A.

Наша работа над KMT2D и KDM6A потенциально может внести вклад в будущие исследования сердечной регенерации, перепрограммирования и болезней, в которых задействованы h4K4me3 и h4K27me3 (Ben-Yair et al., 2019; Delgado-Olguin et al., 2012; Энгель и Ардехали, 2018; He et al., 2012; Иеда и др., 2010; Йонссон и др., 2016; Канеда и др., 2009; Ли и др., 2012; К. Ф. Лю и Тан, 2019; Л. Лю, И. Лей, Х. Каратас и др., 2016; Л. Лю, Лэй и Ван, 2016; З. Лю и др., 2016; Матиялаган, Китинг, Ду и Эль-Оста, 2014 г .; Монро и др., 2019; Папайт и др., 2013; Роза-Гарридо, Чапски и Вондриска, 2018; Stein et al., 2011; Q. J. Zhang & Liu, 2015). Недавно было показано, что у рыбок данио h4K27me3 подавляет структурные гены в пролиферирующих кардиомиоцитах во время инвазии в рану и регенерации поврежденного сердца (Ben-Yair et al., 2019). Исследования ChIP-секвенирования первичных кардиомиоцитов новорожденных мышей показали, что h4K4me3 обогащен, а h4K27me3 снижен на промоторах кардиоспецифичных генов, таких как Mef2c, Gata4, и Tbx5 (Z. Liu et al., 2016). Это исследование также показало, что раннее изменение паттерна h4K4me3 и h4K27me3 происходит во время перепрограммирования индуцированных кардиомиоцитов (iCM), которые используются для моделирования сердечных заболеваний и регенерации (Z. Liu et al., 2016).

Исследование интеграции ChIP- и ATAC-секвенирования сердечных фибробластов взрослого и плода человека (HCF) показало, что пики открытого хроматина или ATAC-seq перекрывают активные промоторы, маркированные h4K4me3, но не репрессивную метку h4K27me3 (Jonsson et al. ., 2016). Однако и h4K4me3, и h4M27me3 были обогащены вокруг стартовых сайтов транскрипции их соответствующих генов-мишеней (Jonsson et al., 2016). Более того, ChIP-секвенирование кардиомиоцитов взрослых мышей с последующим анализом онтологии генов (GO) с помощью Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) показало, что сайты с дифференциальным распределением h4K4me3 и h4K27me3 связаны с фенотипами гипертрофического сердца мыши, например с толстой стенкой желудочка. , нарушение сердечного сокращения, нарушение сократимости скелетных мышц и аномальный ударный объем сердца (Papait et al., 2013). Во время эмбриогенеза обогащение специфическим для зародышевого листка h4K27me3 было идентифицировано в сайтах высокого метилирования ДНК в недифференцированных состояниях (Gifford et al., 2013). Следовательно, сложности эпигенетических модификаций, связанных с KMT2D и KDM6A в кардиологической биологии, постепенно становятся понятными.

Мутации в KMT2D и KDM6A также способствуют осложнениям во время беременности (Rosenberg et al., 2020). О многоводии или избытке околоплодных вод в амниотическом мешке, снижении веса плаценты и аномальных тестах на четверные маркеры сообщается при анализе 49 человек с СК и их матерей (Rosenberg et al., 2020). Основываясь на клинических данных (Adam et al., 2019; Adam, Hudgins, & Hannibal, 1993; YR Wang, Xu, Wang, & Wang, 2019), вмешательства посредством генетического консультирования и текущих исследований эпигенетических ингибиторов на основе малых молекул могут предоставить потенциальные диагностические и профилактические решения для акушерских расстройств, связанных с синдромом Кабуки.

Интересно, что варианты missense KMT2D также коррелировали с новым синдромом множественных пороков развития, который отличается от СК (Cuvertino et al., 2020), в то время как мутации KDM6A и участвуют в аутоиммунитете и устойчивости к лекарствам при лейкемии (Itoh et al., 2019; Stief et al., 2020). Частые иммунопатологические проявления, такие как иммунная тромбоцитопеническая пурпура, витилиго и т. Д., Также были зарегистрированы в ходе регистрационного исследования 177 лиц с мутациями в KMT2D или KDM6A (Margot et al., 2020).

В заключение, некоторые особенности ролей KMT2D и KDM6A еще предстоит расшифровать, особенно другие факторы, которые перекрестно взаимодействуют с h4K4me3 / K27me3 и связаны с CHD, такими как KDM1A / LSD1, KDM4A, KDM4C, EZh3 , и реснички (Agger et al., 2007; Ахмед и Страйт, 2018; Л. Чен и др., 2012; Ли и др., 2012; Николсон и др., 2013; Росалес, Карулла, Гарсия, Варгас и Лискано, 2016 г .; Вилларедт, Горгас, Гарднер и Такер, 2012 г .; Wu et al., 2015; Y. Yang et al., 2019; Q.J. Zhang et al., 2011). Одобренные FDA препараты, нацеленные на ингибиторы LSD1 и EZh3, используются для лечения рака, что дает надежду на расширение в направлении разработки основанных на эпигенетике методов лечения сердечных заболеваний. Интересно, что мутации KMT2D и KDM6A также участвуют в развитии рака (Kantidakis et al., 2016; L. Wang & Shilatifard, 2019), и о кардиотоксичности сообщается как о побочном эффекте у некоторых, но не у всех пациентов, получающих лечение рака, что привело к развитию новой области исследований, называемой кардиоонкологией. Связь между эпигенетическими факторами развития и здоровья сердца и раком, хотя и находится на начальной стадии, потенциально может помочь в решении важных вопросов кардиоонкологии. В совокупности всестороннее понимание эпигенетической регуляции сердечного развития и болезней в сочетании с большими наборами данных о секвенировании следующего поколения от пациентов, которые постоянно создаются, в сочетании с моделями на животных может внести свой вклад в развивающуюся область персонализированной медицины для перевода основанных на эпигенетике исследований из скамейка к прикроватной тумбочке.

Конфликты интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

Благодарности

Мы благодарим Марию де лос Анхелес Серрано и Х. Джозефа Йоста за предоставление полного набора данных kmt2d мутантного секвенирования РНК рыбок данио, как указано в (Serrano et al. др., 2019). Исследование было поддержано Летней стипендией доктора наук Р. Сена из Американской кардиологической ассоциации (18POST33960371), финансируемой доктором К.Б. Артингер (R01DE024034).E.L поддерживает стипендию постдокторантуры T32 Национальной исследовательской службы имени Рут Л. Киршштейн Национальных институтов здравоохранения (T32CA17468).

204 Слов Педиатр 2017; 24: Pregledni članek / Обзорная статья ЗНАЧИЛЬНОСТИ, ЗАПЛЕТЫ В БОЛЕЗНИ ДВОЙЧКОВ ОСОБЕННОСТИ, ЗАБОЛЕВАНИЯ И ЗАБОЛЕВАНИЯ Близнецов

1204 Слов педиатр 2017; 24: Pregledni članek / Обзорная статья ЗНАЧИЛЬНОСТИ, ЗАПЛЕТЫ В БОЛЕЗНИ ДВОЙЧКОВ ОСОБЕННОСТИ, ЗАБОЛЕВАНИЯ И ЗАБОЛЕВАНИЯ БЛИЗНЕЦОВ С.Sitar Golob 1, G. Nosan 2 (1) Bolnišnica za ginekologijo in porodništvo Kranj, Kranj, Slovenija (2) Klinični oddelek za neonatologijo, Pediatrična Klinika, Univerzitetłodani klinični center Ijubljosvljos se v zadnjem času predvsem na račun zdravljenja neplodnosti vztrajno povečuje. Večplodna nočnost pri človeku ni običajna. Заради погибших заплетов захтева натанчней надзор, сай представляет вечное твегание за неугоден потек в изид ночечности.Im večje je število plodov, tem več zapletov lahko pričakujemo. Тако с погодой появляйо полигидрамний, недоношеность, застой плодове расти в низка породна тежа, знаменательная смрт, трансфузия од двойчка к двоичку в природе аномалии. Погостейши со стороны заплески сородом, ки воды в вечи материнско в неонатально оболевности в умрливости. В примерах з енойчки и при двойных перинатальных умрениях вечно приближно за петкрат, при троекких за десеткрат в при четвертых целло за двасеткрат.Заради всех возможных заплетов морамо носочность натанчно спремляти тер поскрбети за разрешни предпородно приправо в попородно оскрбо. Ключне besede: dvojčki, večplodna noečnost, bolezni dvojčkov, sindrom transfuzije od dvojčka k dvojčku, nedonošenost. РЕФЕРАТ Частота спонтанного рождения близнецов составляет примерно 1 из 86 беременностей, но в последние годы лечение бесплодия увеличило частоту многоплодных родов. Многоплодная беременность не характерна для человеческого вида, поэтому особый уход и внимание являются обязательными.И мать, и плод подвергаются высокому риску во время беременности и родов. Проблемы, связанные с беременностью двойней, включают многоводие, недоношенность, ограничение внутриутробного развития, низкий вес при рождении, внутриутробную гибель плода, синдром переливания крови из близнецов и врожденные пороки развития. Осложнения во время родов также более распространены, и перинатальная смертность

2 Slov Pediatr 2017; увеличивается в 5 раз для близнецов, в 10 раз для тройни и в 20 раз для четверых.В связи с повышенным риском осложнений показано тщательное наблюдение во время беременности и адекватная пренатальная подготовка и послеродовое ведение. Ключевые слова: двойня, многоплодная беременность, болезни у двойни, трансфузионный синдром от двойни к ​​двойне, недоношенность. UVOD Človeški organizationm je v osnovi nagnjen k monoovulaciji ter donositvi in ​​porodu enega otroka. Večplodna nočnost pri človeku ni običajna; zaradi večje obolevnosti in pogostejših zapletov zahteva natančnejši nadzor (1, 2). Появление спонтанных двоплодных носочностей и приближение 1/86 ночечности, появление спонтанных носочностей с тройками 1/86 2, появление спонтанных носочностей с четвёрками на 1/86 3.В задних летих сэтевило вечных носителей повествования предвсем зарады здоровья неплодности, конечно па туди заради все вышие старости матери об заноситви (3). В Словении я било тако мед лета 2007 в 2016 году кар 3739 пород двоев (появление 1/56 пород), 32 пород троеков (проявность 1/6568 унции пород) тер две породы четворчков (проявность 1 / унция пород) (4). Približno ena tretjina dvojčkov je enojajčnih oz. монозиготных. Nastanejo torej iz enega oplojenega jajčeca in imajo enak genetski material, kar pomeni, da so razlike med dvojčkoma v večini sledica delovanja dejavnikov okolja.Dve tretjini dvojčkov predstavljajo dvojajčni oz. dizigotni dvojčki, ki nastanejo iz dveh posamezno oplojenih jajčec in imajo zato različen genetski material, ki je skupaj z dejavniki okolja osnova razlik med dvojčkoma (1, 5, 6). При двойных двойках я размер мед сполома примерное размер при енойчких, при енояйчних в сиамских двойках па превладу женски спол, кар это верно после того, как выбрать отличные цвета в ночи. Огоженость плодов при вечных носочностях и боль кот од зиготности одвисна од плодовых овоев.Dvojajčni dvojčki imajo popolnoma ločeni posteljici in ločene plodove ovoje (bihorijski biamnijski dvojčki). Pri enojajčnih dvojčkih v% prevladujejo monohorijski biamnijski dvojčki s skupno posteljico, v% imata dvojčka vsak svojo posteljico in ločene plodove ovoje (bihorijski biamnijski dvojčki dvojčki del monohorijski dvojčki dvojčki del pajudi), v 1 kar zaradi možnosti prepletanja popkovnic oba ploda še dodatno ogroža. Glede na vrsto ovojev in posteljice lahko ocenimo, kdaj je prišlo do delitve oplojenega jajčeca kasneje kot pride do delitve, več Struktur si dvojčka delita (1).DEJAVNIKI TVEGANJA ZA VEČPLO- DNO NOSEČNOST Pojavnost enojajčnih dvojčkov je po vsem svetu bolj ali manj stalna in znaša 3 5 dvojčkov na 1000 živorojenih otrok, medtemvlovezdvočej švoteči Najpomembnejšo vlogo PRI spontanem nastanku dvojajčnih dvojčkov Igra višja koncentracija folikel stimulirajočega hormona (ФСГ), ки JE povišana ПОИ visokih в težjih materah тер mnogorodkah, nezanemarljivo ра nanj vplivajo Tudi etnična pripadnost Матере, geografska umeščenost в CELO Letni čas spočetja, Saj JE-об izpostavljenosti sončni svetlobi koncentracija FSH višja.Повечано твеганье за ​​вечно носецьность имайо туди женске з анамнезо двойчков в друзья, сай е нагненость к вечплодни носочности заради высе концентрация ФСХ лахко подедована. В заднем часу сэстевило вечплодных оз. dvojajčnih nočnosti povečuje predvsem na račun postopkov zdravljenja neplodnosti (1, 6). Погост

3206 Слов Педиатр 2017; 24 вечных носа при зунайтелесни оплодотворения в упражнениях здоровья за стимулирование плодородности, ки звишай концентрацию ФСГ, намреч кар двайсеткрат вечность кот при наравни заноситви (2).POMEN DIAGNOSTICIRANJA IN SLE- DENJA VEČPLODNE NOSEČNOSTI Zaradi večjega tveganja zapletov in neugodnega izida noečnosti moramo že med noečnostjo opredeliti vrsto večplodne nosečnosti. Pri monohorijskih dvojčkih namreč pričakujemo več zapletov kot pri bihorijskih dvojčkih. Dvojčka različnega spola sta vedno dvojajčna, če je spol enak, pa moramo ugotoviti zigotnost in vrsto prisotnih plodovih ovojev. Ultrazvočni prikaz tanke Membraned dvojčkoma kaže na biamnijske dvojčke, medtem ko odsotnost мембрана в prepletanje popkovnic govorita v prid monohorijski monoamnijskih dvojčkov (1, 3).По породу pregledamo plodove ovoje in posteljico ter telesne značilnosti novorojenčkov. Enojajčna dvojčka sta istega spola в sta videti bolj ali manj enako: imata enako teksturo, barvo, porazdelitev in skodranost las, enak barvni odtenek oči in kože ter praktično enake antropometrične meritve (3). Enojajčnih bihorijskih dvojčkov klinično nemoremo razlikovati od dvojajčnih dvojčkov istega spola. Za natančnejšo opredelitev je потребна HLA-typeizacija ali genetska analiza. Tudi pri enojajčnih dvojčkih so lahko prisotne razlike, bodisi zaradi vplivov znotrajmaterničnega okolja, zaradi razlik v mitohondrijskem genomu ali zaradi posttranslacijskih epigenetskih.ЗАПЛЕТИ ВЕЧПЛОДНИХ НОСЕЧНОСТЕЙ В БОЛЕЗНИ ДВОЙЧКОВ Вечерние носки так за матер, где бывает, за то, чтобы поменять вечность неугоднегогопотека носочности тер нежеленега изида носочности. Im večje je število plodov, tem več zapletov lahko pričakujemo (2, 3). Появляется се лахко полигидрамний, недоношеность, застой плодове расти в низка породна тежа, знотрайматеринна смрт, трансфузия од двойчка к двоичку в природе аномалии. Pogostejši so tudi zapleti med porodom (abrupcija posteljice, neoptimalna prezentacija ploda ob rojstvu, obporodna asfiksija ploda in the večja poperativnem dokončanju porodom), ki vodijos maijo in veči »Недоношенность Več kot polovica večplodnih noečnosti se konča pre dopolnjenim 37. tednom nočnosti. Повпречна носечностна старость с з вечным стэвила плодов в матерниц зманишуе в при енойцких значах 40 теднов, при двоечных 36 теднов, при троекких 32 теднов, при четвертых па 29 теднов (7). Dvojčki, spočeti z zunajtelesno oploditvijo, so v primerjavi s spontano spočetimi dvojčki pogostje nedonošeni (2). Дежавников, ки вода в презгодний пород, я вечно в нисо пополнома разискани. Fiziološki mehanizmi, ки sprožijo začetek poroda (mehanski razteg maternice, izločanje кортикотропин sproščujočega hormona из- posteljice тер povečano izločanje сурфактанта из- plodovih pljuč против amnijsko tekočino), так что V primeru večplodne nosečnosti заради številčnejših plodov в večje тазе tkiva posteljice najverjetneje bolj intenzivni, Кар би lahko bil razlog prezgodnjega poroda.На процесс активации порода впливайся в патолосы, tj. Болезенские действия, нпр. okužbe (ки со najpogostejši vzrok prezgodnjega poroda), cervikalna insuficienca, ishemija in prevelik razteg maternice pa tudi duševni stres pri materi (8).

4 Слов Педиатр 2017; Полег недоношености велико твеганье за ​​плод принаша туди цены. Огроженость зародышей преношености себе при двойных поясах мед 36. в 38. тедном ночечности, зато при носочности старости 38 теднов припорочамо элективни пород (7).Znotrajmaternični zastoj plodove rasti in nizka porodna teža Dvojčki se pogosto rodijo lahki za nočnostno starost. Низка породна тежа е присотна при кар% двоечков, кар е петь- до седемкрат веч кот пойвность низке породне теже при енойчких (6). Rast dvojčkov v maternici je do 28. oz. 30. Тедна носэчности приближно енака рости енойчков, нато па се постопно упочасни, зато плод в материи не дозаже причакованега растнега потенция, самое высокое на расчете поманиканья простора при плацентарной недостаточности.Več kot je plodov, manjša je njihova teža za nočnostno starost (1, 6). При моногорских двойках, ки si delita posteljico, pogosto pride do diskordantne rasti in lastično večje razlike med porodnima težama plodov (7). Природа аномалии Природа аномалия так при енояйчних двойных двакрат до трикрат больше погости кот при енойчких в двояких двойках, при катериях это появляющаяся природа аномалий 3% приближно ен. Dvojčki, ki so spočeti z zunajtelesno oploditvijo, imajo v primerjavi s spontano spočetimi dvojčki dvakrat večje tveganje za pojav primerjenih anomalij.Kromosomopatije so pri dvojčkih enako pogoste kot pri enojčkih (1, 5, 7). Med prirojene anomalije uvrščamo malformacije, disrupcije in deformacije. Za malformacije je značilna nepravilnost oblike ali funkcije telesa ob rojstvu, ki nastane zaradi motenega razvojnega processa v zgodnjem embrionalnem ali fetalnem razvoju kot lastica delovanja derrinzavičnih. Najpogostejše malformacije pri dvojčkih so anencefalija, kloakalne anomalije, defkti nevralne cevi, defkti trebušne stene в prirojene srčne hibe.При двойках v к skupino uvrščamo tudi siamske dvojčke. Disrupcije nastanejo zaradi zunanjih dejavnikov, ki delujejo na normalno tkivo med morfogenzo. V to skupino uvrščamo npr. amputacije udov zaradi amnijskih tračkov ter anomalije, ki pri enojajčnih dvojčkih nastanejo zaradi skupne posteljice in žilnih povezav (npr. hemifacialna mikrosomija). Deformacije, ki nastanejo zaradi vpliva zunanjih dejavnikov na že normalno razvito tkivo, so večinoma lastica pomanjkanja prostora v maternici. Погости знаки соэквиноварусне в положайне деформация стопала, изпах колка тертиколис (1, 5-7).Znotrajmaternična smrt Spontana znotrajmaternična smrt enega ali večih plodov pri večplodnih nočnostih je relativno pogosta, in sicer kar trikrat višja kot pri enojčkih. Лахко е последица генетических нападений, анатомических аномалий, недостаточности постелей, окужбе, материальных болезней, заплетений трансфузии од двойчка к двойчку ipd. С новыми техниками визуализираня плода в zgodnji nocečnosti so ugotovili, da se več kot polovica večplodnih noečnosti v prvih tednih noečnosti spontano convertira v enoplodno noečnost grey za fenvojšinda van .Tudi ti dvojčki imajo, tako kot dvojčki nasploh, večje tveganje prirojenih anomalij in spontanega splava (3, 6). Če smrt enega od dvojčkov nastopi v other polovici noečnosti, je tveganje za preživelega dvojčka bistveno večje. Pri njem namreč pogosto pride do zastoja rasti, prezgodnjega rojstva, okvar osrednjega živčevja in ishemičnih poškodb различных органов. Pogosteje se pojavljajo tudi ledvična odpoved,

5 208 Slov Pediatr 2017; 24 atrezija tankega črevesa, gastroshiza in amputacije udov.Najbolj ogroženi so monohorijski dvojčki, pri katerih lahko zaradi placentarnih anastomoz pride do izgube krvi v umrlega dvojčka ter se odraža s hudo anemijo, nevrološkimi posledicami. Sindrom transfuzije od dvojčka k dvojčku Sindrom transfuzije od dvojčka k dvojčku se razvije, ko zaradi arterijsko-venske anastomoze med obema dvojčkoma pride do razlike v concentraciji hemoglobina> 5. до веч кот 20% разлики в телесни тежи. Артерия из enega dvojčka dovaja kri v veno drugega dvojčka, ki postane pletoričen in večji, donorski dvojček pa anemičen in majhen.Zaradi hipoperfuzije donorskega dvojčka pride do hipovolemije in oligurije, ki vodita v oligohidramnij, medtem ko pri prejemniku hiperperfuzija povzroči hipervolemijo in poliurijo, ki se kaže s polihidramnij. По rojstvu ima donorski dvojček nizko porodno težo in bledico zaradi anemije, večji dvojček pa je zaradi policitemije in hiperbilirubinemije pletoričen in zlateničen. Pri njem sta zaradi hipervolemije lahko prisotni tudi hipertenzija in hipertrofija srca. При объех двойчких так погосте туди можганске капи е пред самим рожем.Ob znotrajmaternični smrti donorskega dvojčka lahko pride tudi do nastanka generaliziranih fibrinskih trombov in disminirane intravaskularne koagulacije pri preživelem dvojčku (3, 7, 10 12). Sindrom obrnjene arterijske prekrvitve dvojčka Sindrom obrnjene arterijske prekrvitve dvojčka (англ. Двойная обратная артериальная перфузия, TRAP) se pojavi pri približno 1% all monohorijskih dvojčkov. Pri tem sindromu ima en dvojček normalno srce, other pa nima srca oz. je srce nefunkcionalno (т. я. акардиални двойчек).За перфузией объех телес преко артерийско-артерийских в венско-венских анастомозах скрби први двойчек, ки му заради пременитве грозита срчна одповедь в водные капли. При акардиальном двойке заради незадостнега крвнега претока згорни дель телеса слабое развитие, вчасих па е присо тен ле недиференциран скупек маз (1, 3, 10). Zapleti monoamnijskih dvojčkov Ogroženost monoamnijskih dvojčkov je zaradi skupne amnijske vrečke največja, saj lahko zaradi skupnega prostora pride do prepleta popkovnic, nevrološke prizadetosti in smrtiosti.Присотно е tudi večje tveganje nastanka malformacij (1, 5). ЗАПЛЕТЫ ОБ ПОРОДА При вечных носочностях Лахко вечных заплетений причакуйно туди об породу. Ti obsegajo nepravilno vstavo, prezgodnjo ločitev posteljice, izpad popkovnice in obporodno krvavitev. Vaginalni porod je varen samo, če je prvi dvojček v glavični vstavi, sicer je na mestu porod s carskim rezom (2, 3, 7). Другорожени двоечек и большой опасность заради возможности присутствовать на двоечке, неправильное вступление, уманишанега тонуса материца в возможностях, да так и по ролевой игре открытия дверей.Kljub tradicionalni dogmi, da čas med porodom prvega in drugega dvojčka ne sm presegati 30 minut, izsledki najnovejših raziskav kažejo, da vmesni čas ni bistven, če je srčni utrip optima djerojka. Оболевность в умрливости заради заплетов об породах при тройках в четвёртых шеях, зато сэ правила родий с карским резом (3, 7). ОБРАВНА МЕД ПОРОДОМ В ПО РОЙСТВУ В пример вечности ночечности морамо в породни соби заготовити задольно штевило осебя в оптимальном состоянии за окрбо матере во всех новороенчков, при вагиналем породу на море призы биты срочно.Priporočamo

6 Слов Педиатр 2017; ustrezno analgezijo ter ultrazvočno spremljanje lege obeh plodov. Še пред породом морамо преучити все действия tveganja ter определили траянье носочности, да лахко оценка плодово носэчно старость в себе разрешно приправимо на моребитне заплете. Pričakujemo lahko splošne zaplete, ki pa niso nujno vezani na večplodno nosečnost (npr. Nedonošenost, zastoj plodove rasti, prirojene anomalije), in zaplete, specificične za večplodnevoči novčka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka dvočka djПри двойном моральном воздействии на вечные признаки природы аномалии искатываются активно (3, 6). NAPOVED IZIDA Perinatalna umrljivost enojčkov se je v zadnjih letih vztrajno zniževala, medtem ko se perinatalna umrljivost pri večplodnih nočnostih ni bistveno spreminjala. Perinatalna umrljivost dvojčkov je približno petkrat višja kot umrljivost enojčkov, perinatalna umrljivost trojčkov pa desetkrat višja kot umrljivost enojčkov (3, 9). В задних детских летних странах мира в Словении повторная перинатальная умственная способность двойников с породой тежо всай 500 г 16,5 на 1000 детей, кар-е 3,2-кратных вечеров од перинатальных умственных способностей на сроках 1000 лет, 1 год 4).Тако умрлівість кот невролошка призадетость ста при двойчких в велики мери последица презгодньега ройства. Церебральная парализа при двойных картах, чтобы уничтожить погостейшу кот при енойчких, при том, что так посебей огрожени тисти двойки, ки преживийо знотрайматерично смрт друга (13). Pogosteje se pojavljajo tudi epilepsija, kognitivni zaostanek ter zaostanek v govornem in gibalnem razvoju. Pogoste so vedenjske in učne težave ter nižje socialne в komunikacijske sposobnosti (13, 14).Dvojčki naj bi imeli pogosteje raka na dojkah in modih, medtem ko povečanega tveganja za zgodnejši začetek hipertenzije, srčno-žilnih bolezni in sladkorne bolezni v kasnejöjšem že? ЗАКЛЮЧЕК Rojstvo več otrok hkrati poleg večjega zdravstvenega tveganja s seboj prinaša tudi oteženo poporodno nego novorojenčkov, zato družina, predvsem mati, potrebuje dodatno pomoč in pomč. Že samo dojenje je za mater napor in časovna obremenitev, hkrati pa jo tudi skrbi, da z dojenjem ne bo zagotovila dovolj mleka za vse rojene отroke.Dojenje dvojčkov in trojčkov je navadno uspešno, znani so celo primeri uspešnega dojenja četvorčkov (9). Об моребитных заплетих в невролощих последних при новороенцких ста попородна нега в здравлях še БОЛЬШЕ ЗАХТЕВНИ тер зато за старше в системе здравоохранения še večja obremenitev. ЛИТЕРАТУРА 1. Зал JG. Twinning. Ланцет 2003; 362: Korošec S, Boc V. Носечность в породе двоек по послепарке IVF-ET. Medicinski razgledi 1999; 38: Вальдемар AC. Многоплодная беременность. В: Kliegman RM, Stanton BF, St Geme JW, Schor NF, ред.Нельсон Учебник педиатрии. 20-е изд. Филадельфия: Эльзевьер; 2015: Национальный институт за явно здравье. Perinatalni informacijski sistem Republike Slovenije. Dosegljivo na: NIJZ% 20podatkovni% 20portal /. 5. Маленький CM. Генетика и близнецы. Обзоры по уходу за новорожденными и младенцами, 2011 г .; 11: Множественная беременность. В: Гомелла Т.Л. Неонатология: ведение, процедуры, проблемы по вызову, болезни и лекарства. 6-е изд. США: компании McGraw-Hill; 2009; Blickstein I, Shinwell ES. Акушерская тактика многоплодной беременности и родов.В: Martin RJ, Fanaroff AA, Walsh MC, eds. Fa-

7210 Слов педиатр 2017; 24 Нарофф и Мартинс неонатально-перинатальная медицина: болезни плода и младенца. 9 изд. Сент-Луис, Миссури: Эльзевьер Мосби; 2011; Сток С., Норман Дж. Преждевременные и срочные роды при многоплодной беременности. Семинары по медицине плода и неонатологии 2010; 15: Лиссауэр Т., Фанаров А.А., Миалл Л., Фанаров Дж. Краткий обзор неонатологии. 3-е изд. Оксфорд, Англия: Уайли Блэквелл; 2016; Мэннинг Н.Влияние близнецов на развитие сердца. Раннее человеческое развитие 2008; 84: Бхат Р. Близнец с синдромом двойной перфузии. Катманду медицинский журнал 2010; 29: Sperling L, Kiil C, Larsen LU, Brocks V, Wojdemann KR, Qvist I, et al. Выявление хромосомных аномалий, врожденных аномалий и трансфузионного синдрома у близнецов. Ультразвуковой акушерский гинеколь 2007; 29: Pharoah PO. Неврологический исход у двойни. Семинары по неонатологии 2002; 7: Сатклифф А.Г., Дером С. Последующее наблюдение за близнецами: здоровье, поведение, речь, языковые результаты и последствия для родителей.Раннее человеческое развитие 2006; 82: Контактная осеба / Контактное лицо: Асист. Грегор Носан, д-р. med., специалист по педиатрии Клиническая клиника за неонатологами, Педиатрическая клиника, Университетский клинический центр Любляна, улица Богоричева 20, Любляна. Электронная почта: Prejeto / Получено: Sprejeto / Принято:

Страница не найдена — P-BIO

Rui Santos Ivo
Presidente do INFARMED

ARTIGO DE OPINIÃO

As doenças raras são doenças Potencialmente fatais ou cronicamente debilitantes que, de acordo com a Agência Europeia de Medicamentos (EMA), afetam cerca de 30 milhões de cidadãos europeus, соответствует приблизительно 7% общего числа зарегистрированных пользователей.[i]

Segundo Estimativa da Direção-Geral da Saúde, em Portugal existirão até 600.000 pessoas com estas patologias , sendo que na maioria das situações se tratam de doenças com uma prevalência inferior a 1 em cada men (100.000 евро) no nosso País). [ii]

Cerca de 80% das doenças raras têm origem genética Identificada e 50% de novos casos são diagnosticados em crianças. A maioria é grave e, por vezes, altamente incapacitante, enquanto outras não são impeditivas do normal desenvolvimento intelectual e apresentam evolução benigna e até funcional, se диагностикадас и tratadas atempadamente.

О desenvolvimento de medicamentos órfãos, destinados às doenças raras, apresenta-se como specificmente desafiante, em parte, devido às limitações no seu processo de desenvolvimento de de desenvolvimento clínico e à reduzida mensisolosoloso deos. O recrutamento de doentes para a realização de ensaios clínicos nem semper permite garantir uma população estatisticamente Representativa, devido ao reduzido número de doentes existentes.

Não obstante, e dado que, de acordo com a Comissão Europeia, 95% das doenças raras atualmente existentes não apresentam ainda terapêuticas disponíveis [iii], aposta na investigação e desenvolódosimento desenvolódosimento. Pública no quadro atual da União Europeia (UE).

De acordo com a avaliação da Comissão Europeia sobre a implementation do Regulamento dos medicamentos órfãos até 2017 («Краткое изложение Комиссии совместной оценки Регламента », назад от 2020 г.), houve uma maior e mais rápida disponibilização de medicamentos Europeia (1.956 designações órfãs; 142 medicamentos órfãos com Autorização de Introdução no Mercado — AIM). Выводы из раскрытия информации о стимулах, существующих в настоящее время, непрерывных релевантных действий, содержащихся в лекарствах, или об использовании лекарственных средств, а также в протоколе помощи (aconselhamento científico para medicamentos órfãosameçnés de avalés de avalientes).

Nível nacional no ano de 2020 há a destacar a aprovação para efeitos de financiamento público de 10 medicamentos órfãos e, já em 2021, aprovação para efeitos de financiasticmento público de 2 medicamentos.

Por outro lado, необходимо продвигать uma utilização e partilha mais racional dos dados científicos, существует глобальный uma escala, способный прогрессировать, который может помочь в уменьшении или продлении срока действия.

Агентство EMA, связанное с Agências Reguladoras dos Estados Membros da União Europeia, берет на себя важную ответственность за содействие в обмене данными и авторизацию медицинского обслуживания. Assim, não pode deixar de ser objetivo das Agências Reguladoras, e specificmente do INFARMED, garantir um acesso equitativo a medicamentos órfãos seguros e eficazes por todos os cidadãos que deles needitem.

Ao longo das últimas décadas a União Europeia (UE) tem feito grandes investimentos para apoiar a investigação na área das doenças raras, teno sido disponibilizados mais de 1,4 миллиона евро для инвестиций в предложения.Это соответствующий проект или проект RD-Connect , desenvolvido entre 2012-18, que criou стандарты и механизмы роботов, позволяющие взаимодействовать и использовать инфраструктуру, чтобы обеспечить соответствие требованиям, действующим в соответствии с требованиями. [iv] Adicionalmente, em 2019, foi criado o Programa Europeu Conjunto para as Doenças Raras (EJP RD) [v].

As doenças raras tendem a, parallelamente, ser mais diffíceis de Diagnosticar e de tratar quando em compareção com outras patologias, devido à ausência de conhecimento da fisiopatologia da doença, de normas clínicas bem definitionidas para cada doençúmero e ao tratamentos existentes.

Desta forma, e adicionalmente ao esforço existente ao nível da UE, colaboração a uma escala global através de projetos como или Платформа данных и аналитики редких заболеваний (RDCA-DAP), que visa a partilha de informação de informação de alfa cient researchadores dedicada ao estudo das doenças raras, pode dar um importante contributo no processo de caracterização destas patologias, etapa essencial no desenvolvimento de novos tratamentos.

A partilha de informação a uma escala global, desde que devidamente codificada de forma respeitar o estipulado pelo Regulamento Geral sobre a Proteção de Dados, pertilia uma melhor compreensão da evolução de cada patologia.

Лонго до текущего семестра, Португалия председательствует в Конселью да Юниан Европаиа, encontrando-se или INFARMED alinhado com as demais instituições de saúde, на повестке дня, учрежденной для Presidência na área da saúde, com um special digital enfoção numa transi. A acessibilidade apresenta-se como um dos pilares installedelecidos, mediante o acesso equitativo, custo-efetivo, e entado às tecnologias de saúde, em, в частности, как inovadoras. Nesse contexttoorganisaremos, em abril, uma Conferência sobre o Acesso a Medicamentos , para a qual gostaria desde já de convidar a P-Bio e seus associados.

No que Concerne ao Plano Estratégico do INFARMED para 2020-2022 , elegemos como um dos nossos objetivos estratégicos или apoio à inovação na área da saúde , por considerarmos ser geradora de eleviedado valor. Так же, как и инициативы INFARMED, включают в себя промо-де-интеграцию по регулированию, científico e tecnológico no desenvolvimento e na regulação de medicamentos, dispositivos médicos e cosméticos.

A inovação na área dos medicamentos órfãos constitui assim um importante contributo para a sociedade, allowindo o acesso a novos e melhores tratamentos.A geração de um quadro nacional que promova uma maior Competitividade e inovação através da Capcitação das infraestruturas e dos meios humanos existentes em Portugal na área da Investigação e Inovação, e specific importmente no setor dos Ensaio de Clanicoste de medicamentos inovadores na área das doenças raras.

O desenvolvimento de parcerias com entidades na área das ciências da vida apresenta-se como uma iniciativa Prioritária, não só através do reforço da transparência de informação sobre ensaiosça de transparência de informação Sobre Ensaiosçaça de laquión de l’Arquité, prodiscé de de la de la de la de la de de la de la de la de de la de la de la de la de de la de la de la de de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la de la enиемулятом, de investigação e pela divulgação de informação clara ao cidadão.O contributo do INFARMED passa assim não só pelo apoio na prossecução destes objetivos europeus e nacionais, como pela aplicação, em context nacional, do conhecimento regulamentar e científico resultante da Participação ativa alterno em grupos de tranbos de trades de transe de trades. Эта часть данных и информация в контексте цифрового преобразования являются важнейшими для использования, доступа и использования эффективных терапевтических средств.

Termino a minha intervenção reiterando o nosso компромисс: somos o segundo país da UE que avalia mais designações órfãs, que mais tarde se transformarão em medicamentos órfãos.Somos o terceiro país no que respeita a procedureimentos de autorização por reconhecimento mútuo. Estes dados confirmam o nossocommonisso e reconhecimento na Rede Europeia de avaliação de medicamentos e são как nossas credenciais. Garantir o acesso dos profissionais de saúde e dos cidadãos a medicamentos e produtos de saúde de qualidade, eficazes e seguros, também para as Doenças Raras, não é apenas a nossa missão — é uma realidade que de profissionam do . Contem connosco!

Rui Santos Ivo , Presidente do INFARMED

Fevereiro de 2021

[i] https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/overview/orphan-designation-overview

[ii] https://www.dgs.pt/documentos-e-publicacoes/informacao-de-apoio-a-pessoa-com-doenca-rara1.aspx

[iii] https://ec.europa.eu/info/law/better-regulation/have-your-say/initiatives/12767-/F1410746

[iv] https: // cordis.europa.eu/project/id/305444

[v] https://ec.europa.eu/info/research-and-innovation/research-area/health-research-and-innovation/rare-diseases_en

2000 — Врожденные дефекты, вызванные химическим действием Шардеина | Медицина

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 71 по 168 не показаны при предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 217 по 368 не показаны в этом предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 417 по 474 не показаны при предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 523 по 648 не показаны в этом предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 697 по 698 не показаны при предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 732 по 741 не показаны при предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 748 по 755 не показаны при предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 778 по 788 не показаны при предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 795 по 815 не показаны в этом предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 854 по 898 не показаны при предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 930 по 966 не показаны в этом предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 1001 по 1012 не отображаются в этом предварительном просмотре.

Вы читаете бесплатный превью

Страницы с 1035 по 1049 не показаны при предварительном просмотре.

23–26 июня 2012 г. Нюрнберг, Германия Тезисы…

9 Page 257 :

Рефераты — Европейская генетика человека

307 и 308:

Abstracts — European Human Genetics

и

Page 349 и 350:

Рефераты — Европейская генетика человека

381 и 382:

Abstracts — European Human Genetics

и

392:

Рефераты — Европейская генетика человека

9 1169 Page 409 и 410:

Abstracts — European Human Genetics

423 и 424:

Рефераты — Европейская генетика человека

455 и 456:

Abstracts — European Human Genetics

и

9116 9 Page 483 and 484:

Abstracts — European Human Genetics

Page 497:

Автор alexxlabОпубликовано 21.04.202107.03.2021Рубрики Разное