Молекулярно биологическое исследование пцр: Молекулярно-биологические исследования

Молекулярно-биологические исследования (ПЦР) – СПб ГБУЗ КДЦД

Молекулярно-биологическое исследование крови на токсоплазмы (Toxoplasma gondii)

Определение ДНК вируса простого герпеса 1 и 2 типов (Herpes simplex virus types 1, 2) методом ПЦР в крови, качественное исследование

Определение ДНК вируса герпеса 6 типа (HHV6) методом ПЦР в периферической и пуповинной крови, качественное исследование

Молекулярно-биологическое исследование крови на вирус Эпштейна-Барра (Epstein – Barr virus)

Молекулярно-биологическое исследование крови на цитомегаловирус (Cytomegalovirus)

Определение антител классов M, G (IgM, IgG) к микоплазме пневмонии (Mycoplasma pneumoniae) в крови (Молекулярно-биологическое исследование крови на Mycoplasma pneumoniae методом ПЦР)

Молекулярно-биологическое исследование крови на хламидии (Chlamydophila pneumoniae)

Молекулярно-биологическое исследование периферической и пуповинной крови на парвовирус B19 (Parvovirus B19)

Определение антигена стрептококка группы A (S.pyogenes) в отделяемом верхних дыхательных путей

Исследование крови для диагностики врожденного дефицита факторов свертывания (Дифференциальное определение однонуклеотидных полиморфизмов генов системы свертывания крови и фолатного цикла (12 полиморфизмов методом ПЦР.)

Определение ДНК вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая (Varicella-Zoster virus) в везикулярной жидкости, соскобах с высыпаний методом ПЦР

Молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене MYH в крови (Определение полиморфизма – 13910С>Т (замена цитозина на тимин), в гене МСМ6, ассоциированным с нарушением обмена лактозы)

Определение ДНК хламидии трахоматис (Chlamydia trachomatis) в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов методом ПЦР

Определение ДНК Chlamydophila pneumoniae в мазках со слизистой оболочки носоглотки методом ПЦР

Определение ДНК уреаплазм (Ureaplasma urealiticum) в отделяемом из уретры методом ПЦР, качественное исследование

Определение ДНК трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis) в отделяемом из уретры методом ПЦР

Молекулярно-биологическое исследование отделяемого из уретры на грибы рода кандида (Candida spp. ) с уточнением вида (Candida spp.)

Определение ДНК микоплазмы гениталиум (Mycoplasma genitalium) в отделяемом из уретры методом ПЦР

Определение ДНК микоплазмы хоминис (Mycoplasma hominis) в отделяемом из уретры методом ПЦР, качественное исследование

Определение ДНК Mycoplasma pneumoniae в мазках со слизистой оболочки носоглотки методом ПЦР

Определение ДНК вируса простого герпеса 1 и 2 типов (Herpes simplex virus types 1, 2) в отделяемом из цервикального канала

Определение ДНК вируса герпеса 6 типа (HHV6) в мазках со слизистой оболочки ротоглотки методом ПЦР, качественное исследование

Молекулярно-биологическое исследование отделяемого из уретры на вирус папилломы человека (Papilloma virus)

Молекулярно-биологическое исследование отделяемого из уретры на условно-патогенные генитальные микоплазмы (Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis) (Исследование микоплазмы Ureaplasma parvum)

Молекулярно-биологическое исследование мазков со слизистой оболочки ротоглотки на вирус Эпштейна-Барр (Epstein – Barr virus)

Молекулярно-биологическое исследование отделяемого из уретры на цитомегаловирус (Cytomegalovirus)

Определение РНК вируса гепатита C (Hepatitis C virus) в крови методом ПЦР, качественное исследование

Определение ДНК вируса гепатита B (Hepatitis B virus) в крови методом ПЦР, качественное исследование

Сделать молекулярно-биологические (пцр) исследования в Тюмени, цены

Железнодорожная отделенческая больница в г. Тюмень предлагает пациентам диагностические услуги по молекулярно-биологическим исследованиям биоматериала методом ПЦР.

Суть метода

ПЦР или полимеразная цепная реакция – достаточно новый и эффективный метод. С его помощью достигается существенное увеличение необходимых фрагментов ДНК в биоматериале (в нашем случае – это проба крови). С помощью метода ПЦР  диагностируют инфекционные и наследственные заболевания. В научной деятельности метод ПЦР используют для клонирования, установления отцовства, для выделения нового генного материала.

Диагностика с помощью ПЦР позволяет установить даже единственную копию чужеродной ДНК в крови. Так же метод ПЦР отличается специфичностью, т.е. практически не дает ложноположительных результатов.

Подготовка пациента

Кровь на анализ методом  ПЦР берут из локтевой вены. Пациенту перед анализом не разрешается завтракать, за 3 дня до исследования рекомендовано исключить из рациона алкогольные напитки.

Перечень  анализов

В нашей лаборатории в формате Мультипрайм можно пройти следующие обследования методом ПЦР:

1. Молекулярно-биологическое исследование  на хламидию, уреаплазму, микоплазму.
2. Молекулярно-биологическое исследование на  гарднереллы, лактобациллы (количественное определение), серию  флороценоз.
3. Анализ на трихомониаз, гонорею.

Другие анализы:

1. Анализы  отделяемого  из цервикального и мочевого канала, влагалищного отделяемого на вирус герпеса, папиллома вирус, кандиды, микоплазму хоминис, микоплазму гениталиум, хламидии, цитомегаловирус.
2. Анализы на гепатиты – В, С.

Стоимость на любой вид услуг можно узнать на сайте http://zdnuz.ru/tseny/isledovaniya/.

ЧУЗ «Клиническая больница «РЖД-Медицина» города Тюмень», адрес: Магнитогорская, 8 тел: 8 (3452) 560-150; 8-800-234-31-90

Лаборатория ПЦР (полимеразная цепная реакция)

Для инфекций передающихся половым путем (ИППП), в большинстве случаев, характерно отсутствие специфических признаков заболевания, а у значительного числа пациентов инфекции протекают бессимптомно. Кроме того часто встречаются сочетанные инфекции:гонорея, хламидиоз, микоплазмоз и др., что определяется общностью путей передачи инфекций. В связи с неспецифическими клиническими проявлениями диагноз ИППП основывается на результатах лабораторных методов исследования, которые включают микроскопические, культуральные, серологические и молекулярно-биологические.

В последние годы во всем мире в лабораторной диагностике различных инфекций, в том числе ИППП, все большее распространение стали получать методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), направленные на выявление специфических фрагментов ДНК или РНК возбудителей. Одним из наиболее распространенным МАНК является метод ПЦР.  Преимуществами данного метода являются высокие аналитические и диагностические показатели чувствительности и специфичности.

Молекулярно-биологические исследования биологического материала включает три последовательных технологически связанных между собой этапа экстракцию и очистку НК, собственно постановку и проведение реакции амплификации и детекцию продуктов амплификации.

Детекция продуктов амплификации в используемой нами методике происходит непосредственно в процессе реакции в режиме реального времени. Для ПЦР в реальном времени помимо праймеров в ПЦР-смесь добавляются ФМ-зонды, которые при появлении специфического продукта амплификации гибридизуются с ним, вызывая увеличение уровня флуоресцентного сигнала. Для стандартизации всех методов исследования и достижения высокого качества метода в условиях клинико-диагностической лаборатории используется несколько контрольных образцов: ВКО, ПКО, «К-«, «К+». данные образцы позволяют контролировать каждый этап ПЦР-исследования – от экстракции НК до анализа результатов, что способствует достижению максимальной достоверности анализа.

ПЦР в режиме реального времени позволяет не только выявлять ДНК возбудителя , но и определять количественно. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью независимо от локализации инфекционного процесса, его длительности, наличия или отсутствия клинических проявлений и их выраженности.

ПЦР-исследование позволяет быстро и достоверно диагностировать инфекционные заболевания урогенитального тракта (ИППП)

Группой риска для ИППП являются молодые люди до 30 лет, ведущие активную половую жизнь с частой сменой половых партнеров и практикующих незащищенные половые контакты. Клиническое значение ИППП связано в первую очередь с нарушениями репродуктивной функции человека в результате восходящей инфекции, приводящей к воспалительным заболеваниям органов малого таза, а также с нарушениями нормального течения беременности и риска инфицирования новорожденных.

Воспалительные процессы, вызванные урогенитальными инфекциями в десятки раз увеличивают риск передачи ВИЧ.

                      Инфекции передающиеся половым путем

           Показания к обследованию на ИППП

— клинические и/или лабораторные признаки воспалительного процесса органов урогенитального тракта

—  предгравидарное обследование половых партнеров

— обследование женщин во время беременности

— предстоящие оперативные(инвазивные) манипуляции на органах малого таза

— перинатальные потери и бесплодие в анамнезе

— половой контакт с партнером больным ИППП

— сексуальное насилие

При неустановленном источнике инфицирования рекомендуется провести повторное серологическое обследование: на сифилис через 3 мес. ,  на ВИЧ,  гепатиты   В  и  С через 3-6-9 мес.

Правила получения клинического материала для лабораторных  исследований

Для получения достоверных результатов лабораторных исследований необходимо соблюдение ряда требований, к которым относятся:

Сроки получения клинического материала с учетом применения лекарственных препаратов на основании ПЦР в режиме реального времени – не ранее чем через месяц после окончания приема препаратов

Получение клинического материала из уретры не ранее чем через 3 часа после последнего мочеиспускания, при наличии обильных уретральных выделений – через 15-20 минут после мочеиспускания

Получение клинического материала из цервикального канала и влагалища вне менструации

Диагностика урогенитальных инфекций | Axion Med

Молекулярно-биологическое исследование влагалищного отделяемого на микроорганизмы-маркеры бактериального вагиноза (Lactobacillus spp, Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp, Gardnerella vaqinalis, Mobilucus curtissi, Prevotella spp) + диагностическое заключен	1075
Септоскрининг — «Мужское здоровье», количественное определение ДНК (Enterobacter spp, Klebsiella spp, Escherichia coli, Proteus spp, Pseudomonas aeruqinosa, Serratia spp, Staphylo coccus, Strtptococcus spp)	1045
Определение ДНК вирусов папилломы человека (Papilloma virus) высокого канцерогенного риска в отделяемом (соскобе) из цервикального канала методом ПЦР 16 типа, качественное исследование	280
Определение ДНК вирусов папилломы человека (Papilloma virus) высокого канцерогенного риска в отделяемом (соскобе) из цервикального канала методом ПЦР 18 типа, качественное исследование	280
Определение ДНК вирусов папилломы человека (Papilloma virus) 16 типа в отделяемом (соскобе) из цервикального канала методом ПЦР, количественное исследование	390
Определение ДНК вирусов папилломы человека (Papilloma virus) 18 типа в отделяемом (соскобе) из цервикального канала методом ПЦР, количественное исследование	390
Определение ДНК гонококка (Neisseria gonorrhoeae) в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов методом ПЦР	250
Молекулярно-биологическое исследование влагалищного отделяемого на гарднереллу вагиналис (Gadnerella vaginalis)	250
Определение ДНК трихомонас вагиналис в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов (Trichomonas vaginalis) методом ПЦР	250
Определение ДНК хламидии трихоматис (Chlamydia trachomatis) в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов методом ПЦР	250
Определение ДНК микоплазмы гениталиум (Mycoplasma genitalium) в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов методом ПЦР	250
Микробиологическое (культуральное) исследование отделяемого из уретры на уреаплазму уреалитикум (Ureaplasma urealyticum)	250
Микробиологическое (культуральное) исследование отделяемого из уретры на хламидию трахоматис (Chlamydia trachomatis)	250
Молекулярно-биологическое исследование отделяемого из уретры на микоплазму хоминис (Mycoplasma hominis)	250
Молекулярно-биологическое исследование отделяемого из уретры на уреаплазмы (Ureaplasma spp. ) с уточнением вида	250
Определение ДНК микоплазмы хоминис (Mycoplasma hominis) в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов методом ПЦР, качественное исследование	250
Определение ДНК микоплазмы гениталиум уреаплазм (Ureaplasma spp) в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов методом ПЦР, качественное исследование	250
Определение ДНК уреаплазм (Ureaplasma parvum) с уточнением вида в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов методом ПЦР ( количественное определение)	250
Определение ДНК уреаплазм (Ureaplasma urealyticum) с уточнением вида в отделяемом слизистых оболочек женских половых органов методом ПЦР ( качественное определение)	250
Молекулярно- биологическое исследование влагалищного отделяемого на грибы рода кандида (Candida spp.) с уточнением вида	250
Молекулярно-биологическое исследование влагалищного отделяемого на микроорганизмы-маркеры бактериального вагиноза (Фемофлор-16)	2100
Молекулярно-биологическое исследование влагалищного отделяемого на микроорганизмы-маркеры бактериального вагиноза (Фемофлор-СКРИН)	2000
Микробиологическое (культуральное) исследование отделяемого из уретры на гонококк (Neisseria gonorrhoeae)	250
Молекулярно-биологическое исследование из уретры на гарднереллы (Gardnerella vaginalis)	250
Микроскопическое исследование отделяемого из уретры на трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis)	250
Молекулярно-биологическое исследование отделяемого конъюнктивы на хламидию трахоматис (Chlamydia trachomatis)	250
Молекулярно-биологическое исследование влагалищного отделяемого на микроорганизмы-маркеры бактериального вагиноза (Lactodacillus spp, Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp, Gadnerella vaginalis, Mobiluncus curtissi, Prevotella spp)+ диагностическое заключени	1100

ПЦР метод сдачи анализа на инфекции, полимеразная цепная реакция

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Основа метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Эффективность диагностики инфекций 

ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Для выявления каких инфекций используется метод ПЦР?

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.).

В урологической и гинекологической практике —

• для выявления хламидиоза,
• уреаплазмоза,
• гонореи,
• герпеса,
• гарднереллёза,
• микоплазменной инфекции,
• ВПЧ — вирусов папилломы человека;

В пульмонологии —

• для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний,
• туберкулёза;

В гастроэнтерологии —

• для выявления хеликобактериоза;

В клинике инфекционных заболеваний —

• в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза,
• дифтерии,
• вирусных гепатитов В, С и G;

В гематологии —

• для выявления цитомегаловирусной инфекции,
• онковирусов.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции.

При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу.

Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь.

При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева.

Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала.

Кровь сдается натощак утром.

Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер.

Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Молекулярно-генетические методы в практике современных медико-биологических исследований. Часть I: Теоретические основы ПЦР-диагностики | Волков

1. Zhu H, Zhang H, Xu Y, Laššáková S, Korabečná M, Neužil P. PCR past, present and future. BioTechniques. 2020;69(4):317- 325. https://dx.doi.org/10.2144/btn-2020-0057

2. Kralik P, Ricchi M. A Basic Guide to Real Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything. Front Microbiol. 2017;8:108. https://dx.doi. org/0.3389/fmicb.2017.00108

3. Волков А.Н., Хабиева С.М., Смирнова Е.Ю., Ларионов А.Ю. Генодиагностика мутаций UGT1A1 в практике современной медицины. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63(3):186-192 https://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-3-186-192

4. Tong Y, Shen S, Jiang H, Chen Z. Application of digital PCR in detecting human diseases associated gene mutation. Cell Physiol Biochem. 2017;43(4):1718-1730. https://dx.doi. org/10.1159/000484035

5. Волков А.Н., Лошакова Л.Ю. Значение полиморфизма генов человека, участвующих в амелогенезе и формировании микросреды ротовой полости, для развития кариеса зубов. Медицинская генетика. 2011;10(2):12-16

6. Дружинин В.Г., Волков А.Н., Глушков А.Н., Головина Т.А., Минина В.И., Ингель Ф.И., Ларионов А.В., Мейер А.В., Лунина А.А., Толочко Т.А., Ахальцева Л.В., Кривцова Е.К., Юрцева Н.А., Юрченко В.В. Роль полиморфизма генов репарации в оценке чувствительности генома человека к воздействию сверхнормативных концентраций радона. Гигиена и санитария. 2011;5:26-30

7. Cavanaugh SE, Bathrick AS Direct PCR amplification of forensic touch and other challenging DNA samples: A review. Forensic Sci Int Genet. 2018;32:40-49. https://dx.doi. org/10.1016/j.fsigen.2017.10.005

8. Petersen B, Fredrich B, Hoeppner MP, Ellinghaus D, Franke A. Opportunities and challenges of whole-genome and -exome sequencing. BMC Genet. 2017;18(1). https://dx.doi. org/10.1186/s12863-017-0479-5

9. Waller JV, Kaur P, Tucker A, Lin KK, Diaz MJ, Henry TS, Hope M. Diagnostic tools for Coronavirus disease (COVID-19): Comparing CT and RT-PCR viral nucleic acid testing. American Journal of Roentgenology. 2020;215. https:// dx.doi.org/10.2214/AJR.20.23418

10. Long C, Xu H, Shen Q, Zhang X, Fan B, Wang C, Zeng B, Li Z, Li X, Li H. Diagnosis of the Coronavirus disease (COVID-19): rRT-PCR or CT? European Journal of Radiology. 2020;126:108961. https://dx.doi.org/10.1016/j. ejrad.2020.108961

11. Udugama B, Kadhiresan P, Kozlowski HN, Malekjahani A, Osborne M, Li VYC, Chen H, Mubareka S, Gubbay JB, Chan WCW. Diagnosing COVID-19: The disease and tools for detection. ACS Nano. 2020;14(4):3822-3835. https://dx.doi. org/10.1021/acsnano.0c02624

12. Ghatak S, Muthukumaran RB, Nachimuthu SK. A simple method of genomic DNA extraction from human samples for PCR-RFLP analysis. J Biomol Tech. 2013;24:224-231. https:// dx.doi.org/10.7171/jbt.13-2404-001

13. Hue NT, Chan NDH, Phong PT, Linh NTT, Giang NDT. Extraction of human genomic DNA from dried blood spots and hair roots. Int J Biosci Biochem Bioinforma. 2012;2(1):21-26. 14. Khare P, Raj V, Chandra S, Agarwal S. Quantitative and qualitative assessment of DNA extracted from saliva for its use in forensic identification. J Forensic Dent Sci. 2014;6(2):81- 85.

14. Волков А.Н. Фиксированные лимфоциты человека как источник ДНК для ПЦР-диагностики. Клиническая лабораторная диагностика. 2016;61(12):819-821 https:// dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2016-61-12-819–821

15. Green MR, Sambrook J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc; 2018. https://dx.doi.org/10.1101/ pdb.top093336

16. Katevatis C, Fan A, Klapperich CM. Low concentration DNA extraction and recovery using a silica solid phase. PLoS ONE. 2017;12(5):e0176848. https://dx.doi.org/10.1371/journal. pone.0176848

17. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Morgan D, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular biology of the cell. 6th ed. New YorkLondon: Garland Science Publishing; 2015.

18. Pierce BA. Genetics: A conceptual approach. New York: WH Freeman and Company; 2012.

19. Браун Т.А. Геномы. М.–Ижевск: Институт компьютерных исследований; 2011.

20. Кребс Дж., Голдштейн Э, Килпатрик С. Гены по Льюину. М.: Лаборатория знаний; 2017

21. Li D, Zhang J, Li J. Primer design for quantitative realtime PCR for the emerging Coronavirus SARS-CoV-2. Theranostics. 2020;10(16):7150-7162. https://dx.doi. org/10.7150/thno.47649.

22. Potapov V, Ong JL. Examining sources of error in PCR by single-molecule sequencing. PLoS One. 2017;12(1):e0169774. https://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0169774

23. Chen S, Zheng X, Cao H, Jiang L, Liu F, Sun X. A simple and efficient method for extraction of Taq DNA polymerase. Electronic Journal of Biotechnology. 2015;18:355-358. https:// dx.doi.org/10.1016/j.ejbt.2015.08.001

24. Green MR, Sambrook J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harb Protoc; 2019(1). https:// dx.doi.org/10.1101/pdb.top100388

Прейскурант

Перечень

платных услуг с указанием цен, оказываемых
в КОГБУЗ «Инфекционная клиническая больница»

Правила оказания платных медицинских услуг

Лицензии и сертификаты

Правила подготовки к исследованиям

Сроки лабораторных исследований

Бесплатные медицинские услуги

Образец простой письменной доверенности для получения результатов анализов другим лицом

Стоимость комплексных исследований

Стоимость забора анализов

ВИЧ-инфекция

Вирусные гепатиты

Коронавирусная инфекция

Герпес-вирусные инфекции

Инфекции, передаваемые половым путем

Другие вирусные инфекции

Клещевые инфекции

Бактериальные инфекции

Паразитарные заболевания

Гельминтозы

Кишечные инфекционные заболевания

Онкомаркеры

Гормоны

Определение иммунного статуса

Исследования крови

Коагулогические исследования

Исследования мочи

Исследования кала

Исследования спиномозговой жидкости

Прочие исследования, не вошедшие в другие разделы лабораторной диагностики

УЗИ

Рентгенография

Другие виды диагностики

Для граждан РФ исследование на выявление антител и
антигена р24 к ВИЧ проводится бесплатно

Исследование
возбудителя новой коронавирусной инфекции COVID-19 SARS-cov2

(забор анализов производится  в Центре СПИД по адресу Маклина, 3 с понедельника по пятницу с 12-00 до
18-30, 1-й этаж здания,
вход со двора, по предварительной записи по телефону 21-88-98)

Срок изготовления — 2 рабочих дня не считая дня забора

 *Цены указаны без стоимости забора анализа

Комплексные исследования

Исследования, рекомендуемые при подготовке к оперативным вмешательствам

Исследования на антитела к ВИЧ (тест на ВИЧ) – бесплатно для граждан РФ

Определение антигена к вирусу гепатита B (HbsAg Hepatitis B virus) в крови (HBsAg) – 120,00 р.

Определение антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусному гепатиту C (Hepatitis C virus)
в крови (анти-НСV сумм.) – 190,00 р.

Определение антител к бледной трепонеме (Treponema pallidum) в крови (Исследование на сифилис методом ИФА
и РМП) – 140,00 р.

Забор крови из вены – 75,00 р.

Итого: 525,00 р.

Дополнительно возможно определение группы крови и резус-фактора – 310,00 р.

Забор крови из вены – 75,00 р

Комплексное обследование на заболевания, передающиеся половым путем (урогенитальные инфекции) 

ДЛЯ ЖЕНЩИН
(на 6-8 день от первого дня менструации;)

Стоимость комплексного обследования: от 2615,00 р.

Включает в себя

1. Исследование крови на: 
— определение антител к ВИЧ – бесплатно для граждан РФ
— определение антигена к вирусу гепатита B (HbsAg) в крови – 120,00 р.
— определение антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусному гепатиту C в крови (анти-НСV сумм.) – 190,00 р.
— определение антител к бледной трепонеме (Treponema pallidum) в крови (Исследование на сифилис методом ИФА и РМП) – 140,00 р.
— определение антител к хламидии трахоматис в крови (Хламидиоз методом ИФА (IgA, IgG) – 380,00 р.
— забор крови из вены – 75,00 р.

2. Исследование мазков (соскоб)
— молекулярно-биологическое исследование отделяемого из уретры на хламидии (Chlamydia trachomatis) (Выявление ДНК Сhlamydia trachomatis (хламидиоз – соскоб) – 630,00 р.
— микробиологическое
исследование на уреаплазму (Мико, уреаплазмоз – бак-посев на среде DUO) – 730,00 р.
— исследования
на флору (микроскопия мазков) – 290,00 р.
— забор материала на УГИ у женщин – 60,00 р.

По рекомендации врача Вы можете пройти молекулярно-биологическое
исследование на вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ – соскоб) – 740,00 р.

Итого (с учетом дополнительных исследований): 3355,00 р. 

Обследование на внутриутробные инфекции (рекомендуется при планировании беременности) 

Стоимость обследования: от 2785,00 р. 

Включает в себя:
— определение
антител к токсоплазме (Toxoplasma gondii) в крови (метод ИФА) – 660,00 р.
— определение
антител классов M, G (IgM, IgG) к цитомегаловирусу в крови (метод ИФА) – 770,00 р. 
— определение
антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусу краснухи в крови (метод ИФА) – 680,00 р.
— определение
антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусу простого герпеса в крови (метод ИФА) – 600,00 р.
— забор крови из вены – 75,00 р.

Комплексное обследование на заболевания, передающиеся половым путем (урогенитальные инфекции) 
ДЛЯ МУЖЧИН

Стоимость комплексного обследования: от 2615,00 р. 

Включает в себя:

1. Исследование крови на: 
— определение антител к ВИЧ – бесплатно для граждан РФ
— определение антигена к вирусу гепатита B (HbsAg) в крови – 120,00 р.
— определение антител классов M, G (IgM, IgG) к вирусному гепатиту C в крови (анти-НСV сумм.) – 190,00 р.
— определение антител к бледной трепонеме (Treponema pallidum) в крови (Исследование на сифилис методом ИФА и РМП) – 140,00 р.
— определение антител к хламидии трахоматис в крови (Хламидиоз методом ИФА (IgA, IgG) – 380,00 р.
— забор крови из вены – 75,00 р. 

2. Исследование мазков (соскоб) 
— молекулярно-биологическое исследование отделяемого из уретры на хламидии (Chlamydia trachomatis) (Выявление ДНК Сhlamydia trachomatis (хламидиоз – соскоб) – 630,00 р.
— микробиологическое
исследование на уреаплазму (Мико, уреаплазмоз – бак-посев на среде DUO) – 730,00 р.
— исследования
на флору (микроскопия мазков) – 290,00 р.
— забор материала на УГИ у мужчин – 60,00 р.

Для повышения точности
диагностики возможно проведение дополнительных исследований методом ПЦР:
— выявление ДНК Ureaplasma
urealiticum (уреаплазмоз) – соскоб – 580,00 р.
— выявление ДНК Mycoplasma
hominis (микоплазмоз) – соскоб – 650,0 р.

Итого (с учетом дополнительных исследований): от 3845,00 р.

Услуги предоставляются по адресу ул.Ленина, 207

Запись по телефону 22-30-22

УЗИ

Рентгенография

Другие
виды исследований

Услуги предоставляются при госпитализации в отделения стационара по адресу г.Киров, ул. Ленина, 207

Консультации специалистов стационара

Пребывание в стационаре. Стоимость за 1 койко-день,  рубли

Прочие медицинские
услуги стационара. 

Стоимость за 1 процедуру

Услуги физиотерапевтического
кабинета стационара
Стоимость за 1 процедуру

Фундаментальные принципы ПЦР и молекулярной биологии

Репликация ДНК

используется клетками для деления клеток либо при воспроизводстве, либо при дублировании новых клеток в многоклеточных или одноклеточных организмах. Сложность процесса репликации ДНК требует участия большого количества специфических ферментов. ДНК присутствует в клетках в виде молекулы с двойной спиралью, и когда эта спираль раскручивается, вместе с родительской цепью появляется вновь синтезированная цепь. Нить ДНК, используемая для получения комплементарной цепи, называется цепочкой-матрицей, которая используется для синтеза комплементарных цепей каждой родительской цепи.Таким образом, репликация — это полуконсервативный процесс.

На диаграмме ниже (слева) показано простое цветовое обозначение этого полуконсервативного процесса.

Предшественник каждого нового нуклеотида в цепи ДНК соответствует дезоксинуклеозид-5’-трифосфату. Во время репликации два концевых фосфата удаляются, и внутренний фосфат ковалентно связывается с дезоксирибозой растущей цепи ДНК. Добавление нуклеотида требует наличия свободной гидроксильной группы, которая доступна только на правильном конце, поэтому добавление нуклеотидной фосфатной группы связывает 3’-гидроксил (ОН) предыдущего нуклеотида.Ферменты, катализирующие добавление дезоксирибонуклеотидов, называются ДНК-полимеразами. Есть несколько типов этих ферментов, каждый из которых играет определенную роль. Все известные ДНК-полимеразы работают в направлении от 5 ’к 3’, но ни одна из них не может запустить синтез ДНК в одиночку. Поскольку ДНК-полимераза может добавлять нуклеотиды только к 3’-OH, для создания новой цепи ей требуется праймер.

Праймер — это молекула нуклеиновой кислоты, к которой ДНК-полимераза может добавлять нуклеотид. Часто праймер представляет собой небольшой фрагмент РНК вместо ДНК.Когда двойная спираль раскручивается в начале репликации, фермент полимеризации РНК (примаза) синтезирует праймер РНК с 11-12 нуклеотидами, который комплементарен цепи матрицы ДНК. В конце праймера РНК находится 3’-OH группа, в которую ДНК-полимераза добавляет первый дезоксирибонуклеотид. Позже праймер РНК будет удален и заменен ДНК.

Прежде чем ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, существующая двойная спираль ДНК должна пройти процесс раскручивания, чтобы обнажить цепь-матрицу.Неупакованная область — это место, где начнется репликация, и она называется вилкой репликации. Фермент ДНК-геликаза отвечает за раскручивание и разделение цепей двойной спирали ДНК в АТФ-зависимом процессе, обнажая небольшую область одной цепи. Геликаза может перемещаться по структуре двойной спирали прямо в передней части репликационной вилки. Существуют определенные области для начала репликации, также известные как источники репликации.

Процесс репликации всегда происходит в направлении от 5 ’к 3’, что означает, что новый нуклеотид добавляется к 3’-OH группе растущей цепи ДНК.По этой причине в синтезируемой нити используется 3’-5 ’нить в качестве матрицы, и мы называем ее ведущей нитью (непрерывная нить). Синтез ДНК происходит непрерывно, так как всегда есть свободная 3’-ОН группа. С другой стороны, во вновь синтезированной цепи, использующей в качестве матрицы 5’-3 ’цепь ДНК, синтез ДНК происходит в прерывистом процессе. В нем нет свободного 3’-OH для добавления нуклеотида. Таким образом, в отстающей цепи примазе необходимо повторно синтезировать праймер, чтобы сделать доступной свободную 3’-OH группу.В непрерывной цепи в начале синтеза ДНК требуется только один праймер, но отстающая цепь синтезируется в виде коротких фрагментов, также известных как фрагменты Окадзаки. Эти фрагменты сливаются кзади, образуя непрерывную цепочку.

Комплекс белков, включающий ДНК-полимеразу, прикрепляется к цепи ДНК в вилке репликации и скользит по цепи матрицы ДНК. Две ДНК-полимеразы и белковые комплексы необходимы для репликации ДНК (по одной для каждой цепи) в репликационной вилке.После синтеза ведущей цепи и отстающей цепи необходима ДНК-полимераза с экзонуклеазной активностью для удаления праймера РНК и добавления дополнительных нуклеотидов ДНК. Последнее лигирование фосфодиэфира осуществляется ферментом ДНК-лигазой. Фермент лигаза присоединяется к разрезам ДНК, которые содержат 5’-PO4 и прилегающую 3’-OH группу.

Транскрипция — это синтез РНК рибонуклеиновой кислоты с использованием ДНК в качестве матрицы. Между РНК и ДНК есть три существенных химических различия:

1. РНК содержит сахар рибозу вместо дезоксирибозы.

РНК

2. содержит урацил, заменяющий тимин из ДНК.
3. За исключением некоторых вирусов, РНК не является двухцепочечной.

Замена дезоксирибозы рибозой влияет на химические свойства нуклеиновой кислоты, и обычно ферменты, катализирующие реакции в ДНК, не действуют на РНК (и наоборот). Между тем замена тимина на урацил не влияет на спаривание оснований, поскольку тимин и урацил соединяются с аденином с одинаковой эффективностью.

Все молекулы РНК являются продуктом транскрипции ДНК. Они играют роль на двух разных уровнях: генетическом и функциональном. На генетическом уровне мРНК несет генетическую информацию от генома к рибосоме. С другой стороны, рРНК играет функциональную и структурную роль в рибосомах, а тРНК отвечает за транспортировку аминокислот для синтеза белка. Некоторые молекулы РНК, включая рРНК, могут обладать ферментативной активностью.

Транскрипция генетической информации осуществляется ферментом РНК-полимеразой аналогично тому, как это делает ДНК-полимераза при репликации ДНК.РНК-полимераза катализирует образование фосфодиэфира между рибонуклеотидами. Это происходит за счет энергии, высвобождаемой при гидролизе двух фосфатных связей рибонуклеотидов. Подобно синтезу ДНК, синтез РНК осуществляется в направлении 5’-3 ’, при этом рибонуклеотиды добавляются к свободной 3’-ОН группе от предыдущего рибонуклеотида.

В отличие от ДНК-полимеразы, РНК-полимераза способна независимо образовывать новые цепи. Следовательно, нет необходимости в грунтовке.Чтобы начать синтез РНК, необходимо, чтобы РНК-полимераза распознавала инициирующие последовательности ДНК, также называемые промоторами. После связывания РНК-полимеразы с промотором разрешается запуск транскрипции. В этом процессе двойная спираль ДНК в промоторной области разматывается РНК-полимеразой, обнажая цепь матрицы ДНК. Когда участок ДНК имеет два близких промотора с противоположными направлениями, транскрипция происходит с использованием обеих цепей ДНК в качестве матриц, но в разных направлениях.Когда вновь синтезированная цепь РНК отделяется от ДНК, раскручивающаяся ДНК снова замыкается обратно в свою первоначальную структуру двойной спирали.

РНК-полимераза

использует в качестве матрицы двухцепочечную ДНК (дцДНК), однако для каждого гена транскрибируется только одна из цепей. По сравнению с репликацией ДНК, при которой реплицируется вся геномная ДНК, при транскрипции транскрибируются только небольшие фрагменты ДНК. Обычно эти фрагменты соответствуют одному гену. Эта система позволяет клетке транскрибировать разные гены с разной частотой в зависимости от требований клетки.

Обычно процесс транскрипции включает транскрипцию генов, необходимых для клетки в это точное время, а это означает, что критически важно, чтобы транскрипция завершилась в нужном месте. Этот процесс терминации контролируется специфическими последовательностями нуклеотидов в матричной цепи ДНК.

В отличие от бактерий, большое количество транскриптов эукариот имеет интроны (ненужные участки для трансляции), которые потребуют дальнейшей обработки РНК. Этот процессинг РНК называется сплайсингом и происходит в ядре клетки.В сплайсинге участвует белковый комплекс, сплайсосома, который отвечает за удаление интронов из транскриптов и соединение остальных последовательностей, называемых экзонами.

Кроме того, есть еще два этапа обработки мРНК у эукариот. Первый — это процесс кэппинга, который происходит до завершения транскрипции. Процесс кэппинга — это добавление метилированного гуанинового нуклеотидного кэпа на 5’-конце пре-мРНК. Это ограничение будет иметь решающее значение для начала перевода.Второй этап включает расщепление 3’-конца транскрипта с последующим добавлением 100-200 остатков аденилата в поли-A-хвост. Этот хвост придает стабильность мРНК, и ее деградация необходима для обеспечения деградации РНК.

PCR

Создано Джорджем Райсом, Государственный университет Монтаны

ПЦР — это высшее биотехнологическое изобретение —

«ПЦР изменила молекулярную биологию, значительно расширив возможности по идентификации, манипулированию и воспроизведению ДНК.Он дает в изобилии то, что когда-то было дефицитом — генетический материал, необходимый для экспериментов ».

Пол Рабинов
(Making PCR, A Story of Biotechnology, University of Chicago Press, 1996)

Что такое ПЦР?

Иногда полимеразная цепная реакция (ПЦР), называемая «молекулярным фотокопированием», представляет собой быстрый и недорогой метод, используемый для «амплификации» — копирования — небольших сегментов ДНК. Поскольку для молекулярного и генетического анализа необходимы значительные количества образца ДНК, исследования изолированные фрагменты ДНК практически невозможны без ПЦР-амплификации.ПЦР, которую часто называют одним из самых важных научных достижений в молекулярной биологии, произвела революцию в изучении ДНК до такой степени, что ее создательница, Кэри Б. Маллис, была удостоена Нобелевской премии по химии в 1993 году.

(от National Human Human Институт исследования генома (подробнее) ) Для чего он используется?

После амплификации ДНК, полученная с помощью ПЦР, может использоваться во многих различных лабораторных процедурах, таких как —

Как это работает?

Чтобы амплифицировать сегмент ДНК с помощью ПЦР, образец сначала нагревают, чтобы ДНК денатурировала или разделялась на две части одноцепочечной ДНК.Затем фермент под названием «полимераза Taq» синтезирует — строит — две новые цепи ДНК, используя исходные цепи в качестве матриц. Этот процесс приводит к дублированию исходной ДНК, при этом каждая из новых молекул содержит одну старую и одну новую цепь ДНК. Затем каждую из этих нитей можно использовать для создания двух новых копий и так далее, и так далее. Цикл денатурирования и синтеза новой ДНК повторяется от 30 до 40 раз, в результате чего получается более одного миллиарда точных копий исходного сегмента ДНК.Весь цикл ПЦР автоматизирован и может быть завершен всего за несколько часов. Он управляется машиной, называемой термоциклером, которая запрограммирована на изменение температуры реакции каждые несколько минут, чтобы обеспечить денатурирование и синтез ДНК.

Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР). (двор лаборатории Брюса Фука)

Приборы для ПЦР —
Термоциклер или ПЦР-аппарат — это лабораторный аппарат, используемый для ПЦР.Устройство имеет термоблок с отверстиями, в которые можно вставить пробирки с реакционными смесями для ПЦР. Циклер затем повышает и понижает температуру блока дискретными, заранее запрограммированными шагами. Термоциклеры оснащены горячей крышкой, которая представляет собой нагретую пластину, которая прижимается к крышкам реакционных трубок. Это предотвращает конденсацию воды из реакционных смесей на внутренней стороне крышек и делает ненужным использование масла для ПЦР.

Ссылки по теме

• Веб-ссылки для ПЦР, включая такие ресурсы, как создание и история ПЦР, а также множество ресурсов по альтернативным методам ПЦР.

Преподавательская деятельность

Следующие ресурсы были первоначально доступны через коллекцию цифровых ресурсов BioSciEd Net (BEN), которая является Национальной научной цифровой библиотекой (NSDL) Pathway для образования в области биологических наук. Дополнительные учебные ресурсы можно найти на сайте BEN, чтобы использовать их базу данных с возможностью поиска. BEN можно использовать бесплатно, но требуется регистрация.

• Используйте ПЦР и один волос для получения отпечатка ДНК — этот PDF-документ содержит подробное руководство по протоколам и инструктивную информацию для выполнения студенческих лабораторных упражнений по молекулярной биологии и генетике, в которых студенты используют полимеразную цепную реакцию для создания отпечатков ДНК. из собственных волос.Он включает в себя конспекты студентов, заметки преподавателя и предлагаемые вопросы для лабораторных отчетов. ПО ЭТОЙ ССЫЛКЕ НА РЕСУРСЫ ТРЕБУЕТСЯ РЕГИСТРАЦИЯ (БЕСПЛАТНО) У BEN.
• ПЦР с обратной транскрипцией — этот ресурс от MicrobeLibrary.org предлагает флэш-анимацию, показывающую, как выполняется метод ПЦР с обратной транскрипцией и создаются некоторые образцы данных. Он использует звук и идентификацию при наведении указателя мыши, чтобы помочь студентам узнать больше и сохранить информацию.

Введение в ПЦР | Technology Networks

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод, который произвел революцию в мире молекулярной биологии и не только.В этой статье мы обсудим краткую историю ПЦР и ее принципов, выделив различные типы ПЦР и конкретные цели, для которых они применяются.

Принципы и история ПЦР

В 1983 году американский биохимик Кэри Маллис ехал домой поздно ночью, когда его осенило. На обратной стороне квитанции он написал идею, которая в конечном итоге принесет ему Нобелевскую премию по химии в 1993 году.Идея была проста: воспроизвести в лабораторной пробирке процесс репликации ДНК, происходящий в клетках. Результат тот же: создание новых цепей комплементарной ДНК (кДНК) на основе существующих.

Маллис использовал основу секвенирования ДНК Сэнгера в качестве отправной точки для своей новой техники. Он понял, что повторное использование ДНК-полимеразы запускает цепную реакцию, приводящую к амплификации определенного сегмента ДНК.

Основы его идеи были заложены в 1976 году открытием термостабильной ДНК-полимеразы Taq , выделенной из бактерии Thermus aquaticus , обнаруженной в горячих источниках. ¹ ДНК-полимераза Taq имеет температурный оптимум 72 ° C и выдерживает длительное воздействие температур до 96 ° C, что означает, что она может выдерживать несколько циклов денатурации.

До открытия полимеразы Taq молекулярные биологи уже пытались оптимизировать протоколы циклической амплификации ДНК, но им нужно было добавлять свежую полимеразу в каждый цикл, потому что фермент не выдерживал высоких температур, необходимых для денатурации ДНК.Наличие термостабильного фермента означало, что они могли повторять процесс амплификации много раз без необходимости использования свежей полимеразы в каждом цикле, что делало весь процесс масштабируемым, более эффективным и менее трудоемким.

Первое описание этой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием полимеразы Taq было опубликовано в Science в 1985 году. ²

В 1993 году на рынок вышел первый одобренный FDA набор для ПЦР. С тех пор ПЦР постоянно и систематически улучшалась.Он изменил правила игры во всем, от судебно-медицинской экспертизы и диагностики до мониторинга заболеваний и генной инженерии. Он, несомненно, считается одним из важнейших научных достижений 20, ^-го, -го века.

Обзор стандартного эксперимента ПЦР

ПЦР используется для амплификации определенного фрагмента ДНК из сложной смеси исходного материала, называемой матричной ДНК . Протоколы подготовки и очистки образцов зависят от исходного материала, включая матрицу образца и доступность целевой ДНК.Часто требуется минимальная очистка ДНК. Однако для ПЦР требуется знание информации о последовательности ДНК, которая фланкирует фрагмент ДНК, подлежащий амплификации (так называемая целевая ДНК , ).

С практической точки зрения эксперимент ПЦР относительно прост и может быть завершен за несколько часов. Как правило, для реакции ПЦР требуются пять основных реагентов:

ДНК для амплификации : также называемая матрицей ПЦР или матричной ДНК. Эта ДНК может быть любого источника, такого как геномная ДНК (гДНК), кДНК и плазмидная ДНК.

ДНК-полимераза : для всех реакций ПЦР требуется ДНК-полимераза, способная работать при высоких температурах. Taq — широко используемая полимераза, которая может включать нуклеотиды со скоростью 60 оснований в секунду при 70 ° C и может амплифицировать матрицы размером до 5 т.п.н., что делает ее пригодной для стандартной ПЦР без особых требований. Новые поколения полимераз разрабатываются для улучшения характеристик реакции. Например, некоторые из них предназначены для активации только при высоких температурах, чтобы уменьшить неспецифическую амплификацию в начале реакции.Другие включают функцию «корректуры», важную, например, когда критично, чтобы амплифицированная последовательность точно соответствовала матричной последовательности, например, во время клонирования.

Праймеры : ДНК-полимеразам требуется короткая последовательность нуклеотидов, чтобы указать, где им нужно инициировать амплификацию. В ПЦР эти последовательности называются праймерами и представляют собой короткие фрагменты одноцепочечной ДНК (приблизительно 15-30 оснований). При разработке эксперимента ПЦР исследователь определяет область ДНК, подлежащую амплификации, и конструирует пару праймеров, один на прямой цепи, а другой на обратной, которые специфически фланкируют область-мишень.Дизайн праймера — ключевой компонент эксперимента ПЦР, и его следует проводить осторожно. Последовательности праймеров должны быть выбраны для нацеливания на уникальную интересующую ДНК, избегая возможности связывания с аналогичной последовательностью. Они должны иметь близкие температуры плавления, поскольку стадия отжига происходит одновременно для обеих нитей. На температуру плавления праймера может влиять процентное содержание оснований, представляющих собой гуанин (G) или цитозин (C), по сравнению с аденином (A) или тимином (T), при этом более высокое содержание GC увеличивает температуру плавления.Регулировка длины праймера может помочь компенсировать это при подборе пары праймеров. Также важно избегать последовательностей, которые будут иметь тенденцию к образованию вторичных структур или димеров праймеров, поскольку это снизит эффективность ПЦР. Доступно множество бесплатных онлайн-инструментов, помогающих в создании учебников.

Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP): они служат строительными блоками для синтеза новых цепей ДНК и включают четыре основных нуклеотида ДНК (dATP, dCTP, dGTP и dTTP). dNTP обычно добавляют в реакцию ПЦР в эквимолярных количествах для оптимального включения основания.

Буфер ПЦР: буфер ПЦР обеспечивает поддержание оптимальных условий на протяжении всей реакции ПЦР. Основные компоненты буферов ПЦР включают хлорид магния (MgCl ₂ ), трис-HCl и хлорид калия (KCl). MgCl ₂ служит кофактором ДНК-полимеразы, в то время как трис-HCl и KCl поддерживают стабильный pH во время реакции.

Реакция ПЦР проводится в одной пробирке путем смешивания реагентов, упомянутых выше, и помещения пробирки в термоциклер.

ПЦР-амплификация состоит из трех определенных наборов времен и температур, называемых этапами: денатурация , отжиг и расширение (рис. 1).

Рисунок 1: Этапы одного цикла ПЦР.

Каждый из этих шагов, называемых циклами , повторяется 30-40 раз, удваивая количество ДНК в каждом цикле и достигая амплификации (рис. 2).

Рисунок 2: Различные стадии и циклы амплификации молекулы ДНК с помощью ПЦР.

Давайте подробнее рассмотрим каждый шаг.

1. Денатурация

Первый этап ПЦР, называемый денатурацией, нагревает матричную ДНК до 95 ° C в течение нескольких секунд, разделяя две цепи ДНК, поскольку водородные связи между ними быстро образуются. сломанный.

2. Отжиг

Затем реакционную смесь охлаждают от 30 секунд до 1 минуты. Температура отжига обычно составляет 50–65 ° C, однако точная оптимальная температура зависит от длины и последовательности праймеров.Его необходимо тщательно оптимизировать с каждым новым набором праймеров.

Две нити ДНК могут воссоединиться при этой температуре, но большинство из них этого не делают, потому что смесь содержит большой избыток праймеров, которые связываются или отжигаются с матричной ДНК в определенных, комплементарных положениях. После завершения этапа отжига между матричной ДНК и праймерами образуются водородные связи. На этом этапе полимераза готова расширить последовательность ДНК.

3. Расширение

Затем температуру повышают до идеальной рабочей температуры для ДНК-полимеразы, присутствующей в смеси, обычно около 72 ° C, 74 ° C в случае Taq .

ДНК-полимераза присоединяется к одному концу каждого праймера и синтезирует новые цепи ДНК, комплементарные матричной ДНК. Теперь у нас есть четыре цепи ДНК вместо двух, которые были изначально.

Температура снова повышается до 94 ° C, и двухцепочечные молекулы ДНК — как «исходные» молекулы, так и вновь синтезированные — снова денатурируют в одноцепочечные. Это начинает второй цикл денатурации-отжига-удлинения. В конце этого второго цикла есть восемь молекул одноцепочечной ДНК.При повторении цикла 30 раз молекулы двухцепочечной ДНК, присутствующие в начале, превращаются в более 130 миллионов новых двухцепочечных молекул, каждая из которых является копией области исходной молекулы, очерченной сайтами отжига двух праймеров.

Чтобы определить, была ли амплификация успешной, продукты ПЦР можно визуализировать с помощью гель-электрофореза, показывая наличие / отсутствие ампликона, размер и приблизительное количество. В зависимости от приложения и вопроса исследования это может быть конечной точкой эксперимента, например, при определении наличия гена.В противном случае продукт ПЦР может стать отправной точкой для более сложных последующих исследований, таких как секвенирование и клонирование.

Варианты ПЦР

Благодаря своей универсальности методы ПЦР в последние годы эволюционировали, что привело к развитию нескольких различных типов технологии ПЦР.

Вот некоторые из наиболее широко используемых:

Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР)

Одним из наиболее полезных достижений стала количественная ПЦР в реальном времени или количественная ПЦР.Как следует из названия, кПЦР — это количественный метод, который позволяет в реальном времени контролировать процесс амплификации и обнаруживать продукты ПЦР по мере их производства. ² Его можно использовать для определения начальной концентрации целевой ДНК, что во многих случаях исключает необходимость гель-электрофореза. Это достигается благодаря включению неспецифических флуоресцентных интеркалирующих красителей, таких как SYBR® Green, которые флуоресцируют при связывании с двухцепочечной ДНК, или флуоресцентных зондов, специфичных для олигонуклеотидной последовательности ДНК, таких как зонды гидролиза (TaqMan) и молекулярные маяки. .Зонды специфически связываются с последовательностями-мишенями ДНК внутри ампликона и используют принцип передачи энергии резонанса Фёрстера (FRET) для генерации флуоресценции посредством связывания флуоресцентной молекулы на одном конце и гасителя на другом конце. Как для флуоресцентных красителей, так и для зондов, по мере увеличения количества копий целевой ДНК, уровень флуоресценции увеличивается пропорционально, что позволяет количественно определять амплификацию в реальном времени со ссылкой на стандарты, содержащие известные числа копий (рис. 3).

qPCR использует специализированные термоциклеры, оборудованные флуоресцентными системами обнаружения, которые отслеживают флуоресцентный сигнал по мере того, как происходит усиление.

Рис. 3: Пример графика амплификации qPCR и стандартной кривой, используемых для количественного определения количества копий в неизвестных образцах.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) и ОТ-кПЦР — это два широко используемых варианта ПЦР, позволяющие анализ транскрипции генов и количественное определение вирусной РНК как в клинических, так и в исследовательских целях.

RT — это процесс получения кДНК из одноцепочечной матричной РНК ³ и, следовательно, также называется синтезом первой цепи кДНК. Первым этапом ОТ-ПЦР является синтез гибрида ДНК / РНК между матрицей РНК и олигонуклеотидным праймером ДНК. Фермент обратной транскриптазы, который катализирует эту реакцию, обладает активностью РНКазы, которая затем разрушает РНК-часть гибрида. Затем под действием ДНК-полимеразной активности обратной транскриптазы синтезируется одноцепочечная молекула ДНК.Для успешной ОТ-ПЦР необходимы высокая чистота и качество исходной РНК.

ОТ-ПЦР может выполняться двумя способами: одноэтапная ОТ-ПЦР и двухступенчатая ОТ-ПЦР. В первом случае реакция RT и реакция PCR происходят в одной пробирке, тогда как в двухэтапной RT-PCR две реакции являются отдельными и проводятся последовательно.

Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR)

Описанная выше обратная транскрипция также часто служит первым шагом в qPCR, количественно определяя РНК в биологических образцах (транскриптах РНК или полученных из геномов вирусных РНК) .

Как и в случае с ОТ-ПЦР, существует два подхода к количественному определению РНК с помощью ОТ-кПЦР: одноэтапная ОТ-кПЦР и двухэтапная ОТ-кПЦР. В обоих случаях РНК сначала подвергается обратной транскрипции в кДНК, которая используется в качестве матрицы для амплификации кПЦР. В двухэтапном методе обратная транскрипция и амплификация кПЦР происходят последовательно как два отдельных эксперимента. В одноэтапном методе ОТ и КПЦР выполняются в одной пробирке.

Цифровая ПЦР (dPCR) и цифровая капельная ПЦР (ddPCR)

Цифровая ПЦР (dPCR) — это еще одна адаптация исходного протокола ПЦР. ⁴ Как и qPCR, технология dPCR использует ДНК-полимеразу для амплификации целевой ДНК из сложного образца с использованием набора праймеров и зондов. Однако основное отличие заключается в разделении реакций ПЦР и получении данных в конце.

dPCR и ddPCR основаны на концепции ограничивающих разведений. Реакция ПЦР разбивается на большое количество субреакций (разделов) размером в нанолитр. ПЦР-амплификация проводится внутри каждой капли. После ПЦР каждая капля анализируется статистикой Пуассона для определения процента ПЦР-положительных капель в исходном образце.Некоторые разделы могут содержать одну или несколько копий цели, в то время как другие могут не содержать целевых последовательностей. Следовательно, разделы классифицируются как положительные (цель обнаружена) или отрицательные (цель не обнаружена), обеспечивая основу для формата цифрового вывода.

ddPCR — новейшая технология, которая стала доступной в 2011 году. ⁵ ddPCR использует водно-масляную эмульсию для образования перегородок, разделяющих молекулы матричной ДНК. Капли по существу служат отдельными пробирками, в которых происходит реакция ПЦР.

Микрожидкостная ПЦР

Недавняя разработка систем микрожидкостной обработки с микроканалами и микрокамерами проложила путь для ряда практических приложений, включая амплификацию ДНК с помощью ПЦР на микрожидкостных чипах.

ПЦР, проводимая на чипе, использует преимущества микрофлюидики в скорости, чувствительности и низком потреблении реагентов. Эти особенности делают микрофлюидную ПЦР особенно привлекательной для тестирования на месте, например, для диагностических приложений.С практической точки зрения образец протекает через микрожидкостный канал, многократно проходя через три температурные зоны, отражающие различные этапы ПЦР. На выполнение 20 циклов ПЦР для образца объемом 10 мкл требуется всего 90 секунд. ⁶ Последующий анализ может быть легко проведен вне кристалла.

Устранение неполадок ПЦР

Все разные подходы ПЦР имеют преимущества и недостатки, которые влияют на приложения, для которых они подходят ⁷ .Они приведены в таблице 1.

3

ускоренный процесс расход реагента

· Может быть адаптирован для высокой пропускной способности

· Портативное устройство для применения в местах оказания медицинской помощи

· Позволяет анализировать отдельные клетки

Таблица 1: Ключевые преимущества и недостатки различных подходов ПЦР.

Приложения вывода ПЦР

ПЦР стала незаменимым инструментом в современной молекулярной биологии и полностью изменила научные исследования. Этот метод также открыл исследования клеточных и молекулярных процессов для тех, кто находится за пределами области молекулярной биологии, и, следовательно, также находит применение учеными во многих дисциплинах.

Хотя ПЦР сама по себе является мощным автономным методом, она также была включена в более широкие методы, такие как клонирование и секвенирование, как небольшая, но важная часть этих рабочих процессов.

Исследовательские применения ПЦР включают:

Транскрипция генов — ПЦР позволяет исследовать вариации транскрипции генов среди типов клеток, тканей и организмов в определенный момент времени. В этом процессе РНК выделяется из представляющих интерес образцов и подвергается обратной транскрипции в кДНК. Исходные уровни РНК для конкретного гена затем могут быть количественно определены по количеству кДНК, амплифицированного в ПЦР.

Генотипирование — ПЦР может обнаруживать вариации последовательности в аллелях определенных клеток или организмов.Типичным примером является генотипирование трансгенных организмов, таких как нокаутные и нокаутные мыши. В этой заявке праймеры предназначены для амплификации либо части трансгена (у трансгенного животного), либо мутации (у мутантного животного).

Клонирование и мутагенез — Клонирование с помощью ПЦР — это широко используемый метод, при котором фрагменты двухцепочечной ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР, вставляются в векторы (например, гДНК, кДНК, плазмидную ДНК). Это, например, позволяет создавать бактериальные штаммы, из которых генетический материал был удален или вставлен.Сайт-направленный мутагенез также можно использовать для введения точечных мутаций посредством клонирования. При этом часто используется метод, известный как рекомбинантная ПЦР, в которой перекрывающиеся праймеры специально разработаны для включения замен оснований (рис. 4). Этот метод также можно использовать для создания новых слияний генов.

Рисунок 4: Диаграмма, изображающая пример рекомбинантной ПЦР.

Секвенирование — ПЦР можно использовать для обогащения матричной ДНК для секвенирования.Тип ПЦР, рекомендуемый для подготовки матриц секвенирования, называется ПЦР с высокой точностью и позволяет поддерживать точность последовательности ДНК. При секвенировании по Сэнгеру фрагменты, амплифицированные с помощью ПЦР, затем очищаются и запускаются в реакции секвенирования. При секвенировании следующего поколения (NGS) ПЦР используется на этапе подготовки библиотеки, где образцы ДНК обогащаются с помощью ПЦР для увеличения исходного количества и маркируются адаптерами секвенирования для обеспечения мультиплексирования. Мостовая ПЦР также является важной частью процесса секвенирования NGS второго поколения.

Как независимый метод, так и как рабочая лошадка в рамках других методов, ПЦР изменила ряд дисциплин. К ним относятся:

Генетические исследования — ПЦР используется в большинстве лабораторий по всему миру. Одним из наиболее распространенных приложений является анализ транскрипции гена ⁹ , направленный на оценку наличия или количества определенных транскриптов гена. Это мощный метод управления генетической последовательностью организмов — животных, растений и микробов — посредством клонирования.Это позволяет вставлять, удалять или мутировать гены или участки генов для создания генетических маркеров, изменять фенотипы, выяснять функции генов и разрабатывать вакцины, и это лишь некоторые из них. При генотипировании ПЦР может использоваться для обнаружения вариаций последовательности аллелей в конкретных клетках или организмах. Его использование не ограничивается людьми. Генотипирование растений в сельском хозяйстве помогает селекционерам в отборе, переработке и улучшении племенного стада. ПЦР также является первым шагом к обогащению образцов секвенирования, как обсуждалось выше.Например, большинство методов картирования в проекте «Геном человека» (HGP) основано на ПЦР.

Медицина и биомедицинские исследования — ПЦР используется во множестве медицинских приложений, от диагностического тестирования генетических мутаций, связанных с заболеванием, до идентификации инфекционных агентов. Еще один замечательный пример использования ПЦР в медицине — пренатальное генетическое тестирование. Пренатальное генетическое тестирование с помощью ПЦР может выявить хромосомные аномалии и генетические мутации у плода, давая будущим родителям важную информацию о том, есть ли у их ребенка определенные генетические нарушения.ПЦР также может использоваться в качестве инструмента преимплантационной генетической диагностики для скрининга эмбрионов на предмет процедур оплодотворения in vitro (ЭКО).

Судебная медицина — Наши уникальные генетические отпечатки пальцев означают, что ПЦР может использоваться как при проверке отцовства, так и при судебно-медицинских исследованиях для точного определения источников образцов. Небольшие образцы ДНК, выделенные с места преступления, можно сравнить, например, с базой данных ДНК или с ДНК подозреваемых. Эти процедуры действительно изменили способ проведения полицейских расследований.При проверке подлинности также используются генетические маркеры ПЦР, например, для определения вида, от которого получено мясо. Молекулярная археология также использует ПЦР для амплификации ДНК из археологических останков.

Экологическая микробиология и безопасность пищевых продуктов — Обнаружение патогенов с помощью ПЦР не только в образцах пациентов, но и в таких матрицах, как еда или вода, может иметь жизненно важное значение для диагностики и предотвращения инфекционных заболеваний.

ПЦР — это эталонная технология для обнаружения нуклеиновых кислот во всех областях, от биомедицинских исследований до судебной экспертизы.Идея Кэри Муллис, написанная на обратной стороне квитанции на обочине дороги, оказалась революционной.

Ссылки

1. Чиен А., Эдгар Д. Б., Трела Дж. М.. Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты из экстремального термофила Thermus aquaticus. J. Bacteriol 1976; 127 (3): 1550-57 DOI: 10.1128 / JB.127.3.1550-1557.1976

2. Сайки Р.К., Шарф С., Фалуна Ф. и др. Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии.Science 1985; 230 (4732): 1350 DOI: 10.1126 / science.2999980

3. Арья М., Шергилл И.С., Уильямсон М., Гоммерсолл Л., Арья Н., Пател ХРХ. Основные принципы количественной ПЦР в реальном времени. Экспертный обзор молекулярной диагностики 2005; 5 (2): 209-19 DOI: 10.1586 / 14737159.5.2.209

4. Бахман Дж. Глава вторая — ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В: Lorsch J, ed. Методы в энзимологии: Academic Press, 2013: 67-74. DOI: 10.1016 / B978-0-12-420037-1.00002-6

5. Морли AA. Цифровая ПЦР: краткая история.Biomol Detect Quantif 2014; 1 (1): 1-2 doi: 10.1016 / j.bdq.2014.06.001

6. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. Droplet Digital PCR по сравнению с qPCR для анализа экспрессии генов с малочисленными мишенями : от разной чепухи к данным о качестве публикации. Scientific Reports 2017; 7 (1): 2409 doi: 10.1038 / s41598-017-02217-x

7. Арберг К.Д., Манц А., Чанг Б.Г. Полимеразная цепная реакция в микрофлюидных устройствах. Лаборатория на чипе 2016; 16 (20): 3866-84 doi: 10.1039 / C6LC00984K

8. Гарибян Л., Авашия Н.Полимеразной цепной реакции. J Invest Dermatol 2013; 133 (3): 1-4 DOI: 10.1038 / jid.2013.1

9. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Двадцать пять лет количественной ПЦР для анализа экспрессии генов. BioTechniques 2008; 44 (5): 619-26 DOI: 10.2144 / 000112776

Полимеразная цепная реакция

| Определение и шаги

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) , метод, используемый для быстрого и точного создания множества копий определенного сегмента ДНК.Полимеразная цепная реакция позволяет исследователям получать большие количества ДНК, необходимые для различных экспериментов и процедур в молекулярной биологии, судебно-медицинской экспертизе, эволюционной биологии и медицинской диагностике.

Британская викторина

Викторина по генетике

Кто пришел к выводу, что пол человека определяется определенной хромосомой? Сколько пар хромосом находится в организме человека? Проверьте свои знания.Пройдите эту викторину.

ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Б. Маллис, американским биохимиком, получившим Нобелевскую премию по химии в 1993 году за свое изобретение. До разработки ПЦР методы, используемые для амплификации или создания копий рекомбинантных фрагментов ДНК, были трудоемкими и трудоемкими. Напротив, машина, предназначенная для проведения реакций ПЦР, может завершить множество циклов репликации, производя миллиарды копий фрагмента ДНК всего за несколько часов.

Метод ПЦР основан на естественных процессах, которые клетка использует для репликации новой цепи ДНК. Для ПЦР требуется всего несколько биологических ингредиентов. Неотъемлемым компонентом является матричная ДНК, т. Е. ДНК, которая содержит участок, который нужно скопировать, например ген. Всего одна молекула ДНК может служить шаблоном. Единственная информация, необходимая для репликации этого фрагмента, — это последовательность двух коротких участков нуклеотидов (субъединиц ДНК) на обоих концах интересующей области.Эти две короткие матричные последовательности должны быть известны, чтобы можно было синтезировать два праймера — короткие участки нуклеотидов, соответствующие матричным последовательностям. Праймеры связываются или отжигаются с матрицей на своих дополнительных сайтах и ​​служат отправной точкой для копирования. Синтез ДНК на одном праймере направлен навстречу другому, что приводит к репликации желаемой промежуточной последовательности. Также необходимы свободные нуклеотиды, используемые для построения новых цепей ДНК, и ДНК-полимераза, фермент, который выполняет построение путем последовательного добавления свободных нуклеотидов в соответствии с инструкциями шаблона.

ПЦР — это трехэтапный процесс, который выполняется в повторяющихся циклах. Первым шагом является денатурация или разделение двух цепей молекулы ДНК. Это достигается путем нагревания исходного материала до температуры около 95 ° C (203 ° F). Каждая прядь — это шаблон, по которому строится новая прядь. На втором этапе температура снижается примерно до 55 ° C (131 ° F), чтобы праймеры могли отжигаться с матрицей. На третьем этапе температура повышается примерно до 72 ° C (162 ° F), и ДНК-полимераза начинает добавлять нуклеотиды на концы отожженных праймеров.В конце цикла, который длится около пяти минут, температура повышается, и процесс начинается снова. Количество копий удваивается после каждого цикла. Обычно от 25 до 30 циклов вырабатывается достаточное количество ДНК.

Получите подписку Britannica Premium и получите доступ к эксклюзивному контенту.
Подпишись сейчас

В исходной процедуре ПЦР одна проблема заключалась в том, что ДНК-полимеразу приходилось пополнять после каждого цикла, потому что она нестабильна при высоких температурах, необходимых для денатурации.Эта проблема была решена в 1987 году с открытием термостойкой ДНК-полимеразы под названием Taq, — фермента, выделенного из термофильной бактерии Thermus aquaticus , обитающей в горячих источниках. Полимераза Taq также привела к изобретению ПЦР-машины.

Поскольку ДНК из широкого диапазона источников можно амплифицировать, этот метод был применен во многих областях. ПЦР используется для диагностики генетических заболеваний и выявления низких уровней вирусной инфекции. В судебной медицине он используется для анализа мельчайших следов крови и других тканей, чтобы идентифицировать донора по его генетическому «отпечатку пальца».Этот метод также использовался для амплификации фрагментов ДНК, обнаруженных в сохранившихся тканях, например, у замороженного шерстистого мамонта возрастом 40 000 лет или человека в возрасте 7500 лет, найденного в торфяном болоте.

Молекулярная биология

Методы молекулярной биологии — QIAGEN

Молекулярная биология и иммунология
— Eurofins Scientific

Молекулярно-биологические и иммунологические методы становятся все более важными в анализе пищевых продуктов и кормов.Используя самое современное оборудование и надежные методы, высококвалифицированный персонал Eurofins может определять состав и качество многих матриц продуктов питания и кормов, даже чрезвычайно сложных.

Молекулярный анализ

ПЦР (полимеразная цепная реакция): Этот метод амплифицирует последовательности ДНК, специфичные для выполняемого анализа, например генетические модификации ДНК или последовательностей ДНК, специфичные для конкретного вида животных. Если результат положительный, продукты можно будет сделать видимыми в ультрафиолетовом (УФ) свете.

Для определения видов животных (даже в пищевых продуктах с высокой степенью обработки) в нашем распоряжении есть несколько методов для решения различных задач:

• Скрининг для определения вида животных методом RFLP (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов)
• Определение конкретных видов с помощью стандартной или ПЦР в реальном времени

Примеры животных, на которых были проведены испытания: буйвол, кошка, курица, олень, собака, утка, коза, гусь, заяц, лошадь, бык, свинья, кролик, овца, спрингбок, индейка, кабан.

Иммунология

ELISA (иммуноферментный анализ): — это метод, в котором специфическое антитело используется против целевого белка. Затем цветная реакция выявляет присутствие белка. ИФА подан на:

• Определение вида животных (сырые и приготовленные продукты)
• Анализ на глютен
• Аллергены (например, арахис, фундук, овальный бмин и т. Д.)

Анализ генетических модификаций (ГМО) — нажмите здесь, чтобы узнать о наших услугах по тестированию на ГМО

Eurofins также предлагает некоторые специальные тесты, такие как:

• Проверка подлинности риса басмати
• Испытание на подлинность говядины Абердин-Ангус
• Тестирование пола говядины
• Прослеживаемость мяса

Контакты

За более подробной информацией обращайтесь в местную лабораторию Eurofins.