Neisseria spp: Дифференциальная диагностика болей в горле

Дифференциальная диагностика болей в горле

И.Б. АНГОТОЕВА, к.м.н., кафедра оториноларингологии Российской медицинской академии последипломного образования

Боль в горле — это жалоба, с которой довольно часто обращаются пациенты к лор-врачу и терапевту. Однако боль в горле не всегда означает ангину или другое воспалительное заболевание ротоглотки. Это утверждение имеет практическое значение, поскольку, как надеется автор, оно поможет врачу провести дифференциальный диагноз заболеваний, при которых может возникнуть боль в горле. В конечном итоге, если удалось правильно поставить диагноз, предоставляется возможность оказать квалифицированную помощь.

 

Чаще всего боль в горле беспокоит пациентов с острой респираторной вирусной инфекцией (ОРВИ). Боль в горле при ОРВИ обычно невыраженная, в основном пациенты жалуются на першение в горле или несильные боли при глотании. Боли в горле при ОРВИ сопровождаются кашлем и насморком. Причем важным моментом является то обстоятельство, что начало заболевания проявляется в носовой полости, только затем присоединяются боли в горле.

Этиологическая диагностика затруднена, особенно в рутинной практике. Врач на первичном приеме не может точно сказать, каким вирусом вызвана данная инфекция у конкретного пациента. Имея лишь время для сбора жалоб и анамнеза, при классической клинической картине, врач может предположить влияние того или иного вируса, с которым он имеет дело. В этом положении практические врачи вынуждены опираться на данные литературы. В большинстве случаев (20—30%) не удается точно идентифицировать вирус, вызвавший заболевание у данного человека, даже прибегнув к помощи вирусологической лаборатории. Данные успешной верификации диагноза на 1-е место в этиологии ОРВИ верхних дыхательных путей ставят риновирусы (30—50%). Надо отметить, что вирус гриппа вызывает только от 5 до 15% случаев от всех ОРВИ [3]. В то же время этиологическое лечение ОРВИ существует в основном против вирусов гриппа. Это объясняет неудачи при эмпирическом выборе противовирусных препаратов. Поэтому приходится проводить симптоматическое лечение, основой которого являются препараты местного применения. Препаратами выбора при болях в горле при ОРВИ являются антисептики. При выраженных болях в горле применяют препараты, содержащие нестероидные противовоспалительные препараты. В некоторых случаях возможно применение препарата Эреспал, оказывающего комплексное воздействие на организм: антигистаминное, противоспалительное, спазмолитическое.

Ангина — это инфекционное заболевание, с преимущественным поражением небных миндалин, которое чаще всего вызывается стрептококковой инфекцией (Streptococcus pyogenes). Однако причиной возникновения ангины могут быть грибы, вирусы и другие бактериальные агенты:

•    Staphylococcus aureus,

•    Diplococcus pneumoniae,

•    Cory-nebacterium diphtheriae,

•    Bordetella pertussis,

•    Haemophilus influenzae,

•    Neisseria species.

Путь распространения инфекции: воздушно-капельный (при чиханье и кашле больного, а также через посуду и другие бытовые предметы). Инкубационный период 1—2 дня.

Виды ангин:

1. Катаральная ангина (рис. 1) — характеризуется гиперемией слизистой оболочки небных миндалин

.

Катаральную ангину стоит отличать от респираторно-вирусной инфекции, при которой гиперемия и отек слизистой оболочки преимущественно наблюдаются на задней стенке глотки, а не на небных миндалинах (рис. 2).

Кроме того, при ангине пациент не будет жаловаться на кашель и насморк, а при ОРВИ чаще всего заболевание начинается с насморка, а першение и боли в горле присоединяются позже. Если пациент остается без лечения, то катаральная ангина может перейти в фолликулярную и даже в лакунарную ангины.

2. Фолликулярная ангина характеризуется более выраженными болями в горле и гнойным воспалением в лакунах, которое выглядит как четко очерченные островки (рис. 3). Боль в горле интенсивная при глотании.

3. При лакунарной ангине небные миндалины покрыты грязно-желтым налетом. Боль в горле давящего характера, глотание затруднено меньше. Общее состояние страдает меньше, чем при фолликулярной ангине (рис. 4).

Клиника ангины:

•    боли в горле разной интенсивности (от незначительных болей при глотании до выраженных, при которых затруднен прием пищи),

•     лихорадка — фебрильные цифры,

•    лимфаденит — увеличение шейных лимфоузлов по передней поверхности кивательной мышцы.

Характерно острое начало, как правило, после переохлаждения, сначала возникает боль в горле и повышается температура тела. Страдает общее состояние пациента: ощущение ломоты в мышцах, слабость, головная боль.

Лечение ангины предполагает применение системной антибиотикотерапии и местных средств.

При решении вопроса о системной антибиотикотерапии руководствуются следующими критериями:

•    фебрильная лихорадка,

•    воспалительный экссудат в лакунах миндалин,

•    увеличение передних шейных лимфоузлов,

•    отсутствие насморка и кашля,

•    положительный тест на стрептококк.

 Наличие двух или трех вышеперечисленных критериев является показанием к назначению системной антибактериальной терапии [4].

При назначении местной терапии врач находится перед большим выбором лекарственных препаратов. Если разбираться в их многообразии, то следует отметить следующие группы (табл. 1):

•    антисептики,

•    антибиотики,

•    нестероидные противовоспалительные препараты,

•    иммуностимуляторы,

•    растительные антисептики.

Местная терапия при ангине средней степени и тяжелой степени тяжести назначается дополнительно к системной антибиотикотерапии. В качестве монотерапии местные препараты используются только при легкой степени тяжести.

При ангине логично назначать антисептики, антибиотики. При выраженных болях назначают нестероидные противовоспалительные препараты, но не более 3 дней, и у препаратов имеется суточное ограничение до 4—5 раз в день.

 
Инфекционный мононуклеоз — инфекционное заболевание, вызванное вирусом Эпштейна — Барр, проявляющееся поражением ретикулоэндотелиальной и лимфатической систем.

Симптомы инфекционного мононуклеоза:

•    лихорадка,

•    тонзиллит (рис. 5),

•    полиаденит — увеличиваются не только шейные лимфоузлы, но и подмышечные и паховые лимфоузлы,

•    увеличение печени и селезенки,

•    лейкоцитоз с преобладанием базофильных мононуклеаров.

 

Заболевание начинается с лихорадки и болей в горле. Общее состояние в ряде случаев страдает очень сильно. Пациенты жалуются на плохое самочувствие, упадок сил, снижение аппетита. Боли в горле могут носить у взрослых интенсивный характер. Затем увеличиваются лимфоузлы, лихорадка разнообразна по характеру и продолжительности. Возможно возобновление лихорадки после уменьшения цифр температуры тела. У пациентов, которым была назначена системная антибиотикотерапия, особенно аминопенициллины, появляется сыпь. Поэтому для раннего выявления инфекционного мононуклеоза необходимо провести общий анализ крови, в котором могут быть обнаружены мононуклеары, но это не специфическая реакция организма. Повышение этих клеток может быть и при других вирусных инфекциях. Необходимо использовать обнаружение в крови IgM, который является показателем острой фазы заболевания, появляется одновременно с клиническими симптомами и сохраняется в течение 1—2 мес. IgG обнаруживается в течение жизни у всех пациентов, перенесших инфекционный мононуклеоз. Его исследование значимо только для проведения эпидемиологических исследований [5].

Для местного лечения инфекционного мононуклеоза препаратами выбора являются антисептики.

Однако боль в горле не всегда вызывается воспалительными заболеваниями глотки. Боль в горле может быть вызвана хроническим фарингитом на фоне ларингофарингеального рефлюкса (ЛФР). Этот термин был предложен в 1991 г. J. Koufman. Ларингофарингеальный рефлюкс — это обратный ток жидкости из желудочно-кишечного тракта на слизистую оболочку гортани и глотки. Это самое частое проявление экстраэзофагеального рефлюкса [1].

Клинические проявления ЛФР:

•    першение в горле,

•    чувство инородного тела или «комка», который пациент не может проглотить,

•    постоянное покашливание,

•    обилие слизи в ротоглотке и гортаноглотке,

•    налет на языке,

•    кровоточивость десен,

•    афты,

•    отпечатки зубов на языке,

•    несоответствие выраженности симптомов, которые предъявляет пациент (например, очень сильные боли в горле) и фарингоскопической картины,

•    симптомы, связанные с неприятными ощущениями в ушах, которые не фиксируются объективно (от «хлопков» в ушах до заложенности уха),

•    несоответствие выраженности симптомов со стороны гортани, осиплость вплоть до афонии и ларингоскопической картины,

•    неэффективность системной антибиотикотерапии при болях в горле.

Если боль в горле не очень интенсивная, больше першение, иногда сопровождается кашлем и наблюдаются вышеперечисленные клинические симптомы, то можно говорить о ЛФР. Для уточнения диагноза возможно провести анкетирование пациента. Анкета «Индекс симптомов рефлюкса» (J. Koufman) переведена на русский язык, ее валидность доказана, анкета обладает высокой чувствительностью. Пациенту необходимо оценить нижеперечисленные симптомы: 0 — отсутствие симптома, 5 — мучительно на столько, на сколько можно представить (табл. 2).

Все баллы суммируются, и в зависимости от суммы осуществляется интерпретация полученных данных: от 0 до 9 баллов — рефлюкс желудочного содержимого в гортань и пищевод являлся сомнительным и не учитывается при терапии данного пациента; от 9 до 13 баллов — диагноз ГЭРБ является вероятным и требует подтверждения дополнительными клиническими методиками; при сумме выше 13 баллов — диагноз лор-формы ГЭРБ расценивается как несомненный.

Назначение антисептических и антибактериальных препаратов пациентам, у которых по анкете ИСР более 13 баллов не только не помогает, но и вызывает ухудшение состояния и усиление симптомов. Таких пациентов необходимо направить к гастроэнтерологу. Препаратами скорой помощи для таких пациентов являются антациды.

Приведем клинический пример из практики доктора О.Н. Романовой, к.м.н., который показывает ценность культурального посева с небных миндалин. Пациент М., 40 лет, обратился за помощью к оториноларингологу с болями в горле. При фарингоскопии были обнаружены гнойные налеты на миндалинах (рис. 7). Был назначен защищенный пенициллин как первая линия при эмпирическом назначении системных антибиотиков. Недельный курс этого антибиотика не был успешен, но к моменту оценки курса лечения был готов культуральный посев с небных миндалин и выявлено, что ангину вызвала Pseudomonas aeruginosa (крайне редкая ситуация). При назначении курса ципрофлоксацина ангина у данного пациента разрешилась.

Таким образом, боль в горле не всегда возникает при воспалительных заболеваниях ротоглотки. Врачу на приеме нельзя забывать:

•    о проведении стрептотеста при всех острых состояниях ротоглотки,

•     проведении культурального посева с небных миндалин при ангине,

•     проведении анкетирования с использованием ИСР,

•     проведении общего анализа крови,

•    проведении общего анализа мочи (для исключения генерализованных стрептококковых инфекций),

•     проведении биохимического анализа крови (антистрептолизин О, С-реактивный белок, ревматоидный фактор).

Тщательное выполнение всех пунктов вышеприведенного алгоритма важно для достижения хороших результатов лечения и профилактики осложнений.

Литература

1.    Koufman JA. The otolaryngologic manifestations of gastroesophageal reflux disease (GERD): a clinical investigation of 225 patients using ambulatory 24-hour pH monitoring and an experimental investigation of the role of acid and pepsin in the development of laryngeal injury. Laryngoscope, 1991, 101 (53): 1-78.

2.    Lund VJ, Grouin JM, Eccles R, Bouter C, Chabolle F. Efficacy of fusafungine in acute rhinopharyngitis: a pooled analysis. Rhinology, 2004, 42(4): 207-212.

3.    Бартлетт Дж. Инфекции дыхательных путей. Пер. с англ. М.: Бином, 2000: 192.

4.    Шпынев К.В., Кречиков В.А. Современные подходы к диагностике стрептококкового фарингита. КМАХ, 2007, 9 (1).

5.    Шувалова Е.П. Инфекционные болезни: учебник. М.: Медицина, 2005.

Источник: Медицинский совет, № 15, 2014

Нейссерии: возбудители гонореи и менингита

Нейссерии (Neisseria) — род грамотрицательных кокковидных бактерий. Своё название род Neisseria получил в честь немецкого дерматовенеролога и бактериолога Альберта Людвига Нейссера (1855-1916), который открыл возбудителя гонореи (1879 г.).

Род Neisseria включает в себя патогенные для человека виды нейссерий: возбудителя гонореи (Neisseria gonorrhoeae) и возбудителя менингита (Neisseria meningitidis). Традиционно Neisseria gonorrhoeae часто называют гонококком, а Neisseria meningitidis — менингококком.

Также у человека выделяют непатогенные виды нейссерий, обитающих на слизистых оболочках: Neisseria sicca, Neisseria mucosa, Neisseria perflava.

Гонококковая инфекция (гонорея)

Гонорея относится к инфекциям, передаваемым половым путем (ИППП).

Neisseria gonorrhoeae — грамотрицательная бактерия, принадлежащей к семейству Neisseriaceae, роду Neisseria.

Возбудитель гонореи, как и возбудитель урогенитального хламидиоза (Chlamydia trachomatis), имеет высокую тропность к цилиндрическому эпителию, поэтому поражает цервикальный канал, эндометрий, маточные трубы, уретру.

Неосложненная гонорея у мужчин протекает чаще всего в форме острого гнойного или гнойно-слизистого уретрита. Признаками гонореи у женщин является цервицит с гнойно-слизистыми выделениями. При аногенитальных и орогенитальных контактах возможно развитие проктита или фарингита.

Симптомы и проявления гонококковой инфекции, за небольшим исключением, неспецифичны, для постановки диагноза необходимы лабораторные исследования для выявления возбудителя гонореи.

У мужчин до 15% случаев гонококковой инфекции может протекать без клинической симптоматики, а у 5-10% не сопровождается и лабораторными признаками уретрита. У женщин доля бессимптомных форм гонореи может достигать 45-55%.

Как при клинически выраженных, так и при малосимптомных формах гонококковой инфекции при отсутствии лечения высок риск развития осложнений. У мужчин осложнениями гонореи являются стриктуры уретры, простатит, орхоэпидидимит; у женщин — эндометрит, сальпингит, сальпингоофорит, пельвиоперитонит, тубоовариальный абсцесс, внематочная беременность, трубное бесплодие.

Своевременно проведенное лабораторное исследование позволяет вовремя поставить диагноз и предотвратить развитие осложнений.

Менингококковая инфекция (менингит)

Возбудителем менингококковой инфекции (менингита) является Neisseria meningitidis (менингококк).

Менингококковая инфекция – острое инфекционное заболевание, протекающее в виде острого назофарингита, гнойного менингита и менингококкцемии.

Штаммы менингококка в зависимости от химического строения капсулы делятся на группы: А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29-E, H, I, K, L. Более чем 90% случаев генерализованных форм менингококковой инфекции  обусловлены штаммами групп А, В и С, значительно реже – штаммами групп X, Y и W-135, остальные группы не представляют эпидемиологического интереса.

Менингококковая инфекция поражает лиц всех возрастов, но чаще (70%) болеют дети. Показатель летальности при менингите составляет в среднем 10%, что определяет высокую социальную значимость заболевания.

Колонизируя заднюю стенку носоглотки человека, менингококк может долгое время не вызывать заболевание. В этом случае, при отсутствии симптомов, его обнаружение возможно только в результате лабораторного обследования. Часто назофарингит предшествует развитию менингита.

Менингит – воспаление оболочки головного и/или спинного мозга. Говоря «менингит» обычно подразумевают воспаление именно мягкой мозговой оболочки, так как эта патология встречается чаще других. К симптомам менингита относят:

• общеинфекционные симптомы – озноб, повышение температуры тела до 40-42°, учащение пульса и частоты дыхания;
• менингеальный синдром – напряжение мышц туловища и конечностей, гиперестезия, повышенная чувствительность к звуковым, световым и болевым стимулам, болевые феномены (болезненность при надавливании на глазные яблоки, в точках выхода тройничного нерва), симптомы Кернига и Брудзинского;
• общемозговые симптомы – тошнота, рвота «фонтаном», не приносящая облегчение, головная боль, нарушение сознания (психомоторное возбуждение), головокружение, судороги и др.

При менингите, обусловленном именно Neisseria meningitidis, показательным симптомом является сыпь. Она носит геморрагических характер и «звёздчатую» форму. Начинается с бедер и ягодиц, распространяется по телу. Появление сыпи на лице – неблагоприятный признак.

Лабораторная диагностика генерализованной формы менингококковой инфекции (менингита) включает микроскопию биологического материала, посев биоматериала с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением чувствительности к антибиотикам; обнаружение специфических антител методом РПГА.

Бактериологическое исследование отделяемого верхних дыхательных путей на микрофлору с определением чувствительности к антибиотикам (количественный метод)

АНМО «Ставропольский краевой клинический консультативно-диагностический центр»:

355017, г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Посмотреть подробнее

Обособленное подразделение «Диагностический центр на Западном обходе»:

355029 г. Ставрополь, ул. Западный обход, 64

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-68-89 (факс)

Посмотреть подробнее

Клиника семейного врача:

355017 г. Ставрополь, пр. К. Маркса, 110 (за ЦУМом)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-50-60 (регистратура)

Посмотреть подробнее

Невинномысский филиал:

357107, г. Невинномысск, ул. Низяева 1

(86554) 95-777, 8-962-400-57-10 (регистратура)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Черкесске :

369000, г. Черкесск, ул. Умара Алиева 31

8(8782) 26-48-02, +7-988-700-81-06 (контактные телефоны)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Элисте :

358000, г. Элиста, ул. Республиканская, 47

8(989) 735-42-07 (контактные телефоны)

Посмотреть подробнее

ЗАО «Краевой клинический диагностический центр»:

355017 г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Савченко, 38 корп. 9:

355021, г. Ставрополь, ул. Савченко, 38, корп. 9

8 (8652) 316-847 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Чехова, 77 :

355000, г. Ставрополь, ул. Чехова, 77

8(8652) 951-943 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Михайловске:

358000, г. Михайловск, ул. Ленина, 201 (в новом жилом районе «Акварель»).

8(988) 099-15-55 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Neisseria spp. (нейссерии), ДНК (ПЦР), качественный, соскоб из носоглотки (носа)

Neisseria spp DNA in nasopharyngeal swab by PCR

Описание исследования

Подготовка к исследованию:
Специальной подготовки не требуется

Исследуемый материал:
Мазок с конъюнктивы

Neisseria species – это род грамотрицательных кокков, к которому относятся N. gonorrhoeae — возбудитель гонореи и септического артрита, N. meningitidis — возбудитель менингококкового менингита, и ещё несколько видов непатогенных микроорганизмов.

Cептический артрит и менингит – это клинические формы распространённой бактериальной инфекции, которая может представлять угрозу жизни и требует точного и быстрого определения возбудителя и своевременной антибактериальной терапии.

Генетический материал (геномная ДНК) Neisseria species

Метод

Метод ПЦР – полимеразная цепная реакция, позволяющая идентифицировать наличие в биологическом материале искомый участок генетического материала.
Подробнее о методе ПЦР — его разновидностях, преимуществах и области применения в медицинской диагностике.

Референсные значения — норма

(Neisseria spp. (нейссерии), ДНК (ПЦР), качественный, соскоб из носоглотки (носа))

Информация, касающаяся референсных значений показателей, а также
сам состав входящих в анализ показателей может несколько отличаться в зависимости от лаборатории!

Норма:

Отрицательно (ДНК Neisseria species не обнаружена)

Показания

Диагностика гонококкового артрита, менингококкового менингита, сепсиса и других форм диссеминированной инфекции нейссериями.

Повышение значений (положительный результат)

• Подтверждена связь диссеминированной инфекции с нейссериями.

Понижение значений (отрицательный результат)

• Отсутствует связь диссеминированной инфекции с нейссериями;

Возможен ложноотрицательный результат, который вызывает приём некоторых антибиотиков (фторхинолонов, цефалоспоринов, аминогликозидов, тетрациклина)

Где сдать анализ

Найдите этот анализ в другом населенном пункте

Сдать анализы на аллергены в Москве по самой доступной цене. — Лаборатория ИАКИ

Neisseria species – это род грамотрицательных кокков, к которому относятся N. gonorrhoeae — возбудитель гонореи и септического артрита, N. meningitidis — возбудитель менингококкового менингита, и ещё несколько видов непатогенных микроорганизмов.

Cептический артрит и менингит – это клинические формы распространённой бактериальной инфекции, которая может представлять угрозу жизни и требует точного и быстрого определения возбудителя и своевременной антибактериальной терапии.

В соответствии с Федеральным законом ФЗ № 323 «Об основах защиты здоровья граждан в Российской Федерации» интерпретация результатов исследований, установление диагноза, назначение лечения, должны производиться врачом соответствующей специализации.

Диагностика гонококкового артрита, менингококкового менингита, сепсиса и других форм диссеминированной инфекции нейссериями.

Для получения достоверных результатов при исследовании методом ПЦР забор материала на выявление возбудителей инфекций:

1. рекомендуется проводить до приема антибактериальных препаратов или не менее чем через 2 недели после последнего приема;
2. рекомендуется проводить до начала противовирусной терапии или не менее чем через 2 недели после последнего приема ;
3. рекомендуется проводить до приема противогрибковых препаратов или не менее чем через 2 недели после последнего приема;
4. рекомендуется проводить до начала приема антибактериальных препаратов или не менее чем через 1 месяц после последнего приема антибактериальных препаратов для следующих инфекций .


Хламидия (Chlamydia trachomatis), Микоплазма (Mycoplasma genitalium), Уреаплазма (U.urealyticum / U.parvum), Микоплазма (Mycoplasma hominis), Гарднерелла (Gardnerella vaginalis),
Возбудитель гонореи (Neisseria gonorrhoeae), Возбудитель трихомоноза (Trichomonas vaginalis).



Мазки из зева и носа берутся натощак (через 3-4 часа после последнего приема пищи).


Моча (только у мужчин) собирается в стеклянную или пластиковую посуду. Исследованию подлежит первая порция утренней мочи, в количестве 25-40 мл.


Соскоб из уретры рекомендуется сдавать через 2 часа после последнего мочеиспускания.

Посев спермы на neisseria gonorrhoeae и определение чувствительности к антибиотикам

Исследование эякулята (спермы) направлено на выделение возбудителя заболевания и на определение количественной оценки выявленных микроорганизмов.

Инфекции урогенитального тракта у мужчин в основном обусловлены возбудителями инфекций, передающихся половым путем (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis и др.) и типичными представителями уропатогенов (E. coli, Proteus spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Ureaplasma spp., Staphylococcus spp., Streptococcus pyogenes, Mycoplasma spp. и др.).

Приблизительно около 15% сексуально активных пар не достигают беременности в течении 1 года. У половины бездетных пар бесплодие связано с «мужским фактором», проявляющимся отклонениями параметров эякулята, которые в 8% обусловлены урогенитальными инфекциями.

Neisseria gonorrhoeae — неподвижный грамотрицательный диплококк, анаэроб вызывает гнойное воспаление слизистых оболочек, покрытых цилиндрическим железистым эпителием. Мало устойчив во внешней среде погибает при высыхании и при температуре 40-45оС. У мужчин вызывает уретрит, при осложнении — простатит, орхоэпидидимит. У 10% мужчин и до 80% женщин гонорейная инфекция может протекать бессимптомно.

Материал для исследования следует брать до начала антибактериальной терапии или через 12-14 дней после завершения курса лечения. Рекомендуется половое воздержание в течение 3 дней.

Перед сбором материала тщательно вымыть с мылом руки и наружные половые органы. Насухо вытереть чистым полотенцем. Получить эякулят путем мастурбации и собрать в стерильный контейнер. Не дотрагиваться руками до внутренних стенок и крышки контейнера. Плотно закрыть контейнер крышкой и доставить в лабораторию в наиболее короткие сроки, до 24 часов при +4 — + 8оС. При пролонгированном сроке хранения материала, использовать тубу с гелевой угольной средой Эймса и зонд (стерильный тампон — вискоза на пластиковой основе). Стерильный тампон пропитывается эякулятом и помещается в тубу с транспортной средой Эймса. Допускается хранение и доставка до 48 часов при +4 — + 8оС.

Исследование обычно проводится при бесплодии, простатитах, орхите (воспаление яичек), эпидидимите (воспаление придатка яичка).

Основной целью определения чувствительности микроорганизмов к АБП является прогнозирование их эффективности при лечении инфекций у конкретных пациентов. Определение чувствительности также проводят при наблюдении за распространением резистентности среди микроорганизмов.

Определение чувствительности к АБП проводится при выявлении этиологически значимых микроорганизмов в количестве 103 и более КОЕ/мл.

Основой для выбора АБП, подлежащих включению в исследование, являются данные о природной чувствительности обнаруженных микроорганизмов или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также клинической эффективности АБП. По научным данным в России резистентность гонококков распространяется на препараты группы пенициллинов (ампициллину, ампиоксу), а также доксициклину.

В этом исследовании для определения чувствительности к АБП обычно используется 6 различных антибактериальных препаратов.

Определять чувствительность к АБП представителей нормальной микрофлоры человека (при их выделении из естественных мест обитания) не проводится.

Neisseria spp

Neisseria — обзор | ScienceDirect Topics

Бактериальные характеристики

Neisseria spp. представляют собой грамотрицательные неспорообразующие диплококки уплощенной формы; его размер колеблется в пределах 0,6–0,8 мкм. Это оксидаза-положительные кокки или пухлые палочки, не являющиеся кислотоустойчивыми. Они могут достигать диаметра примерно 0,6–0,8 мкм, а иногда и 1,0 × 2,0–3,0 мкм. Кокки часто встречаются парами со сплющенными соседними сторонами, что придает им типичную форму фасоли. Это неподвижные аэробы, а некоторые являются микроаэрофильными или факультативными анаэробами.Они негалофильные; у некоторых оптимальная температура роста составляет около 37 ° C. Им нужна кровь или асцитическая жидкость для роста, а также повышенное давление углекислого газа. Neisseria spp. имеют хорошо развитый функционирующий цикл трикарбоновых кислот с возможностью использования Enter – Doudoroff и пентозного шунта. Ферменты Эмбдена-Мейерхофа (EM) присутствуют, но этот путь широко не используется и, вероятно, вообще не используется в аэробных условиях. Ферментация сахаров в основном приводит к образованию кислоты из глюкозы; однако некоторые штаммы обладают способностью производить кислоты из других сахаров.

Генетически ДНК состоит на 49–56 мол.% Из гуанина + цитозина (G + C). Генетические исследования показали, что существует связь между видов Neisseria , особенно между N. meningitidis и N. flavescens ; при определенных условиях N. flavescens может вызвать менингит, который нельзя лечить обычным способом. N. flavescens был выделен из пищевых и молочных продуктов: возможно, это мутантная форма N.meningitidis , который может вызвать менингит. Этот генетический анализ используется как наиболее надежный метод для подтверждения принадлежности типов бактерий к определенному семейству, он несколько более точен, чем другие процедуры.

N. meningitidis — обычный комменсальный организм нософарникса человека; он еще не изолирован от животных или источников окружающей среды. Эта бактерия привередлива: оптимальный рост происходит во влажной среде с температурой от 35 до 37 ° C в атмосфере с содержанием углекислого газа около 5–10%.

Другой важной особенностью этой группы бактерий является наличие пилей, которые способствуют вторжению в клетки-хозяева и являются фактором прилипания. Около Neisseria продуцируют эндотоксины из-за присутствия липоолигосахаридов и белков в их наружных мембранах. N. gonorrhoeae отличается от других Neisseria своей способностью сбраживать глюкозу, но не мальтозу или лактозу. Клеточная стенка Neisseria содержит фермент цитохромоксидазу, поэтому результат теста на оксидазу, полученный этими бактериями, положительный.

Паспорта безопасности патогенов: инфекционные вещества — Neisseria spp.

ПАСПОРТ БЕЗОПАСНОСТИ ДЛЯ ПАТОГЕНОВ — ИНФЕКЦИОННЫЕ ВЕЩЕСТВА

РАЗДЕЛ I — ИНФЕКЦИОННЫЙ АГЕНТ

НАЗВАНИЕ : Neisseria spp. (кроме N. gonorrhoeae и N. meningitidis )

СИНОНИМ ИЛИ ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА :

1) Большинство видов Neisseria , ассоциированных с человеком, не являются патогенными и являются нормальными обитателями верхних дыхательных путей.Связанные с человеком виды включают: N. gonorrhoeae , N. meningitidis , N. lactamica , N. cinerea , N. polysaccharea , N. mucosa , N. flavescens , N. sicca , N. subflava , включая биовары subflava , flava, и perflava и N. elongata , подвиды elongata , glycolytica и nitroreduce.Только N. gonorrhoeae и N. meningitidis считаются патогенами. ^{Footnote 1Footnote 2} .

2) Neisseria видов, связанных с животными, включают: N. canis, N . weaveri (собаки), N. denitrificans (морские свинки), N. macacae (макака-резус), N. dentiae (коровы) и N. iguanae (ящерицы). ^{Сноска 1 Сноска 2}

ХАРАКТЕРИСТИКИ : Neisseria spp.являются грамотрицательными, неподвижными и неспорообразующими бактериями, принадлежащими к семейству Neisseriaceae ^{Footnote 1Footnote 3} . Все представители Neisseria spp., За исключением трех подвидов N. elongata и N. weaveri , встречаются как диплококковые бактерии со сплющенными соседними сторонами, напоминающими почки или кофейные зерна. Три подвида N. elongata и N. weaveri встречаются в виде средних и длинных пухлых палочек попарно или коротких цепочек.Все виды являются оксидазоположительными ^{Footnote 1Footnote 3} , и все виды, кроме N. elongata , подвидов nitroreducens и N. elongata , подвидов elongata , являются каталазоположительными ^{Footnote 3} . Большинство видов оптимально растут при температуре от 35 до 37 ° C, и рост обычно стимулируется углекислым газом и влажностью. Виды обычно аэробны, но некоторые виды могут демонстрировать рост в анаэробных условиях.

РАЗДЕЛ II — ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОПАСНОСТИ

ПАТОГЕННОСТЬ / ТОКСИЧНОСТЬ : Neisseria spp. являются частью комменсальной флоры слизистых оболочек человека и некоторых животных и обычно считаются непатогенными, за исключением N. gonorrhea и N. meningitidis ^{Footnote 1} . У людей с сопутствующими заболеваниями и / или подавлением или недостаточностью иммунитета могут развиться серьезные инфекции, вызванные обычно комменсальными видами Neisseria .Например, сообщалось, что N. lactamica вызывает бактериемическую пневмонию и сепсис у лиц с ослабленным иммунитетом. ^{Footnote 4} . N. cinerea обычно выделяют из верхних дыхательных путей, но также выделяют из других участков, включая шейку матки, прямую кишку, конъюнктиву, кровь и спинномозговую жидкость (CSF). ^{Footnote 1} . Он также был связан с редкими случаями перитонита. ^{Footnote 5} , тонзиллита, лимфаденита, проктита и легочной кавитации. ^{Footnote 6} . N. flavescens и N. polysaccharea обнаружены в верхних дыхательных путях и ротоглотке (соответственно) человека и редко связаны с инфекционными процессами. ^{Footnote 1} . N. subflava, N. flava, N. perflava, N. mucosa и N. sicca обнаруживаются в верхних дыхательных путях человека и являются случайными изолятами инфекционных процессов, включая эндокардит, бактериемию, менингит, пневмонию и др. эмпиема, перикардит, перитонит, септический артрит и абсцесс печени ^{Сноска 1 Сноска 7-Сноска 10} . N. elongata подвидов обнаружены в верхних дыхательных путях человека и были изолированы от инфекционных процессов, включая эндокардит, сепсис и остеомиелит. ^{Footnote 1Footnote 11-Footnote 13} . N. weaveri является частью нормальной флоры ротовой полости собак и был выделен в случае инфекции нижних дыхательных путей. ^{Footnote 14} .

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ: во всем мире; часть комменсальной флоры верхних дыхательных путей и ротоглотки человека и некоторых животных. Примечание 1.

ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ДИАПАЗОНА : Люди и некоторые животные (собаки, морские свинки, макаки-резусы, коровы и ящерицы-игуаниды) ^{Сноска 1} .

ИНФЕКЦИОННАЯ ДОЗА : Неизвестно.

СПОСОБ ПЕРЕДАЧИ: Может передаваться при контакте с каплями и выделениями из носа и горла инфицированных людей; однако передача вируса происходит редко из-за низкой вирулентности. Также может передаваться через укусы инфицированных или колонизированных собак (для N. weaveri).

ПЕРИОД ИНКУБАЦИИ : Неизвестно.

КОММУНИКАЦИЯ : Легкость передачи от человека к человеку неизвестна из-за низкой вирулентности.

РАЗДЕЛ III — РАСПРОСТРАНЕНИЕ

РЕЗЕРВУАР : Люди и некоторые животные (собаки, морские свинки, макаки-резусы, коровы и ящерицы-игуаниды) ^{Сноска 1} .

ЗООНОЗ: Возможен для патогенов животных; N. weaveri (обнаруженный у собак) был выделен из участков ран у людей в результате укусов собак. Сноска 14.

ВЕКТОРЫ : Нет.

РАЗДЕЛ IV — УСТОЙЧИВОСТЬ И ЖЕСТКОСТЬ

ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ : Neisseria spp. чувствительны к цефотаксиму, цефтриаксону и амоксициллину ^{Footnote 6Footnote 10Footnote 15} . В зависимости от штамма некоторые демонстрируют устойчивость к пенициллину и амоксициллину от средней до высокой. ^{Footnote 15Footnote 16} . N. polysaccharea устойчива к ванкомицину ^{Footnote 1} .

УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕЗИНФЕКЦИОННЫМ СРЕДСТВАМ: грамотрицательные бактерии обычно чувствительны к ряду дезинфицирующих средств, включая фенольные соединения, гипохлориты (1% гипохлорит натрия), спирты (70% этанол), формальдегид (18.5 г / л; 5% формалина в воде), глутарового альдегида и йода (0,075 г / л) Сноска 17.

ФИЗИЧЕСКАЯ НЕАКТИВАЦИЯ : Бактерии обычно чувствительны к влажному теплу (121 ° C в течение как минимум 15 минут) и сухому теплу (от 160 до 170 ° C в течение как минимум 1 часа) ^{Footnote 18} .

ВЫЖИВАНИЕ ВНЕ ХОЗЯЙСТВА: Неизвестно; однако он может быть похож на других представителей этого рода, включая N. gonorrhoeae и N. meningitis. Известно, что N. gonorrhoeae выживает на различных поверхностях, включая сиденья унитаза (короткие периоды до 2 часов), сноска 3, сноска 19, туалетную бумагу (до 3 часов), сноску 19, слайды (до 17 часов) и полотенца ( до 24 часов).N. meningitidis плохо выживает в окружающей среде, но, как сообщается, выживает на траве и пластике при температуре окружающей среды в течение нескольких часов или дней. Сноска 20.

РАЗДЕЛ V — ПЕРВАЯ ПОМОЩЬ / МЕДИЦИНСКАЯ

НАБЛЮДЕНИЕ : Следите за симптомами. Подтвердить путем посева ЦСЖ или крови или посева образцов биопсии ^{Footnote 6Footnote 21} .

Примечание : Не все методы диагностики доступны во всех странах.

ПЕРВАЯ ПОМОЩЬ / ЛЕЧЕНИЕ : Вымойте пораженный участок теплой водой с мылом (не используйте мыло, если обнажены слизистые оболочки).При необходимости проведите соответствующую терапию антибиотиками.

ИММУНИЗАЦИЯ : Нет.

PROPHYLAXIS : Нет.

РАЗДЕЛ VI — ЛАБОРАТОРНАЯ ОПАСНОСТЬ

ИНФЕКЦИИ, ПРИОБРЕТЕННЫЕ В ЛАБОРАТОРИИ : На сегодняшний день сообщений о случаях лабораторных инфекций не поступало.

ИСТОЧНИКИ / ОБРАЗЦЫ : мазки и смывы из горла и / или носоглотки ^{Сноска 21} , плеврально-выпотные образцы, кровь ^{Сноска 9 Сноска 13} , CSF ^{Сноска 9} , образцы биопсии ^{Сноска 69099 сноска 900 Сноска 14} .

ОСНОВНЫЕ ОПАСНОСТИ : Случайная парентеральная инокуляция и / или проглатывание зараженных образцов, а также воздействие на слизистые оболочки при вдыхании инфекционных выделений, передающихся по воздуху.

ОСОБЫЕ ОПАСНОСТИ : Нет.

РАЗДЕЛ VII — КОНТРОЛЬ ВОЗДЕЙСТВИЯ / ЛИЧНАЯ ЗАЩИТА

КЛАССИФИКАЦИЯ ГРУПП РИСКА : Группа риска 2 ^{Сноска 22} . Эта группа риска применяется ко всему роду в целом и может не относиться ко всем видам в пределах рода.

ТРЕБОВАНИЯ К СРЕДЕ : Помещения, оборудование и методы работы уровня сдерживания 2 для работы с инфекционными или потенциально инфекционными материалами, животными или культурами. Эти требования по содержанию применяются ко всему роду в целом и могут не применяться к каждому виду в пределах рода.

ЗАЩИТНАЯ ОДЕЖДА : Лабораторный халат. Перчатки при неизбежном прямом контакте кожи с инфицированными материалами или животными ^{Footnote 23} . Защита глаз должна использоваться там, где существует известный или потенциальный риск воздействия брызг.

ДРУГИЕ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ : Все процедуры, которые могут привести к образованию аэрозолей, или связаны с высокими концентрациями или большими объемами, должны проводиться в шкафу биологической безопасности (BSC). ^{Footnote 23} . Использование игл, шприцев и других острых предметов должно быть строго ограничено. Дополнительные меры предосторожности следует учитывать при работе с животными или крупномасштабной деятельности.

РАЗДЕЛ VIII — ОБРАЩЕНИЕ И ХРАНЕНИЕ

РАЗЛИВЫ : Дайте аэрозолям осесть и, надев защитную одежду, аккуратно накройте разливы впитывающими бумажными полотенцами и нанесите соответствующее дезинфицирующее средство, начиная с периметра и двигаясь к центру.Перед очисткой дайте достаточно времени для контакта. ^{Footnote 23} .

УТИЛИЗАЦИЯ : Обеззараживайте все отходы, которые содержат или вступили в контакт с инфекционным организмом, с помощью автоклава, химической дезинфекции, гамма-облучения или сжигания перед утилизацией. ^{Footnote 23} .

ХРАНЕНИЕ : Инфекционный агент должен храниться в герметичных контейнерах, имеющих соответствующую маркировку ^{Сноска 23} .

РАЗДЕЛ IX — НОРМАТИВНАЯ И ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ

НОРМАТИВНАЯ ИНФОРМАЦИЯ: Импорт, транспортировка и использование патогенных микроорганизмов в Канаде регулируется многими регулирующими органами, в том числе Агентством общественного здравоохранения Канады, Министерством здравоохранения Канады, Канадским агентством по инспекции пищевых продуктов, окружающей средой Канады и Министерством транспорта Канады.Пользователи несут ответственность за соблюдение всех соответствующих законов, постановлений, руководств и стандартов.

ОБНОВЛЕНО : сентябрь 2011 г.

ПОДГОТОВЛЕНО : Управление по регулированию патогенов, Агентство общественного здравоохранения Канады.

Хотя информация, мнения и рекомендации, содержащиеся в этом Паспорте безопасности патогенов, собраны из источников, которые считаются надежными, мы не несем ответственности за точность, достаточность или надежность, а также за любые убытки или травмы, возникшие в результате использования информации.Часто обнаруживаются новые опасности, и эта информация может быть не полностью актуальной.

Авторские права ©

Агентство общественного здравоохранения Канады, 2011 г.

Канада

СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ:

Идентификация Neisseria spp., Haemophilus spp. И других привередливых грамотрицательных бактерий с помощью идентификационной панели MicroScan Haemophilus-Neisseria.

Abstract

Панель идентификации Haemophilus-Neisseria (HNID) (American MicroScan, Sacramento, Calif.) представляет собой систему формата 4-часового микроразбавления для идентификации видов Haemophilus и Neisseria, Branhamella (Moraxella) catarrhalis и Gardnerella vaginalis. Панель HNID оценивалась с использованием 423 клинических изолятов и исходных штаммов этих организмов, и идентификация HNID сравнивалась с данными, полученными обычными методами. Кроме того, 32 изолята, представляющих шесть родов, не включенных в базу данных HNID, были протестированы, чтобы определить, будут ли эти организмы производить уникальные номера биотипов для возможного включения в базу данных.Панель HNID правильно идентифицировала 95,3% из 86 штаммов Neisseria gonorrhoeae, 96% из 25 штаммов G. vaginalis и 100% из 28 штаммов Neisseria lactamica и 48 штаммов B. catarrhalis. Только 64,7% из 68 изолятов Neisseria meningitidis были идентифицированы правильно из-за ложноотрицательных или сомнительных углеводных и / или аминопептидазных реакций. Среди Haemophilus spp. Было правильно идентифицировано 98,8% из 83 штаммов H. influenzae, 97,1% из 34 штаммов H. parainfluenzae и 80% из 15 штаммов H. aphrophilus и H. paraphrophilus.Восемь штаммов Neisseria cinerea, вида, не включенного в базу данных, дали профили, идентичные профилям B. catarrhalis и N. gonorrhoeae. Изоляты других видов, не включенных в базу данных, в том числе Eikenella corrodens, Kingella spp. И Cardiobacterium hominis, вызвали на панели уникальные образцы биохимических реакций. Изменение критериев интерпретации для определенных тестов, расширение базы данных для включения других видов и предложения дополнительных подтверждающих тестов повысят точность и полезность панели HNID.

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии. Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (983K) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей. Ссылки на PubMed также доступны для Избранные ссылки .

Эти ссылки есть в PubMed. Это может быть не полный список ссылок из этой статьи.

Геномная характеристика новых видов Neisseria

Альтернативный вид Neisseria spp. гликозилирование пилина типа IV с остатком глицерамидо ацетамидо тридезоксигексозы

Абстрактные

Значение гликозилирования белков во взаимодействии патогенных бактерий со своим хозяином становится все более очевидным. Neisseria meningitidis , этиологический агент цереброспинального менингита, проникает через клеточные барьеры после прикрепления к клеткам-хозяевам через пили типа IV.Гены гликозилирования пилина ( pgl ) ответственны за гликозилирование PilE, основной субъединицы пилей типа IV, с остатком 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезоксигексозы. Однако почти половина клинических изолятов имеет вставку в оперон pglBCD , что, как ожидается, приведет к другому, неидентифицированному гликозилированию. При этом структура гликозилирования пилина у такого штамма была определена методом МС «сверху вниз». MALDI-TOF, анализ ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с ионизацией наноэлектрораспылением и квадрупольный анализ методом масс-спектрометрии с наноэлектрораспылением очищенных препаратов пилей, происходящих из N.meningitidis , штаммы дикого типа или с дефицитом гликозилирования пилина, выявили массу гликана, несовместимую с 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезоксигексозой или любым сахаром в базах данных. Эту необычную модификацию определяли путем диссоциации сахара от белка в источнике с последующим тандемным анализом MS с фрагментацией, вызванной столкновением, чтобы быть гексозой, модифицированной глицерамидной и ацетамидогруппой. Кроме того, мы показываем генетически, что природа сахара, присутствующего в пилине, определяется карбоксиконцевой областью гена pglB , модифицированной вставкой в ​​локус pglBCD .Таким образом, мы сообщаем о ранее не обнаруженном моносахариде, участвующем в посттрансляционной модификации субъединиц пилина IV типа с помощью подхода, основанного на MS, и определяем молекулярную основу его биосинтеза.

У эукариот гликозилирование признано ключевой особенностью поверхностных белков, участвующих, в частности, в распознавании клетка-клетка и клетка-матрица. В последнее время появляется все больше сообщений, описывающих O- и N-гликозилирование поверхностных бактериальных белков, в частности патогенов, ассоциированных со слизистой оболочкой (1).Важность этих событий гликозилирования в колонизации и патогенезе хозяина становится все более очевидной.

Грамотрицательная бактерия Neisseria meningitidis является комменсалом носоглотки человека: 10–20% населения являются носителями (2). N. meningitidis , однако, более известен как возбудитель цереброспинального менингита. С низкой частотой бактерии пересекают эпителиальный барьер и попадают в кровоток, где они быстро размножаются, вызывая сепсис.В кровотоке N. meningitidis взаимодействует с эндотелиальными клетками, проникает через гематоэнцефалический барьер и размножается в головном мозге.

Бактериальная адгезия является важным этапом колонизации носоглотки и считается предпосылкой для пересечения эпителия, доступа к крови и преодоления гематоэнцефалического барьера (3, 4). Подобно многочисленным патогенам, таким как энтеропатогенные Escherichia coli , Vibrio cholerae или Pseudomonas aeruginosa , патогенные Neisseria содержат пили IV типа, которые обеспечивают эффективную колонизацию слизистой оболочки человека (5).Хотя 15 белков участвуют в биогенезе пилей IV типа у N. meningitidis (6), основным компонентом этой нитчатой ​​органеллы является белок пилин, кодируемый геном pilE .

PilE претерпевает несколько посттрансляционных модификаций, включая гликозилирование, хотя роль этих модификаций остается неясной. Гликозилирование пилина в штамме Neisseria gonorrhoeae MS11 было впервые описано на основе кристаллографических данных (7) как О-связанное дисахаридное гликозилирование серина-63.В штамме N. meningitidis C311 трисахарид, состоящий из Gal (β1–4) Gal (α1–3) 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезоксигексозы (DATDH), был идентифицирован с помощью GC-MS ( 8). Сходная структура была обнаружена на пилине штамма N400, полученного из MS11, с использованием подходов MS (9, 10) с гексозой, связанной с DATDH.

Гены, участвующие в гликозилировании пилина, обозначенные как pgl гены гликозилирования пилина, первоначально были идентифицированы на основании поиска гомологии последовательностей. Первым был идентифицирован ген pglA (11), а затем кластер pglBCD (12, 13).Индивидуальная функция N. meningitidis PglB, PglC и PglD была предложена Power et al. (12) на основе гомологии последовательностей генов pgl из штаммов MC58 и C311 N. meningitidis , которые представляют DATDH на серине-63. Основываясь на этих прогнозах, эти ферменты будут синтезировать UDP-DATDH из UDP-GlcNAc со стадиями дегидратации (PglD) на атомах углерода 4 и 6 и переносом аминогруппы (PglC) и ацетилированием (PglB) на углероде 4. Гомологи pglBCD генов можно найти в Campylobacter jejuni , который синтезирует 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезоксиглюкопиранозу как часть олигосахарида, присутствующего на нескольких белках (14–16).Индивидуальная функция белков, кодируемых генами C. jejuni pgl , была охарактеризована на биохимическом уровне, и эти результаты подтверждают предсказанные функции для генов pglBCD в N. meningitidis (17, 18). PglB представляет собой бифункциональный фермент, карбоксильная концевая половина (PglBCter) обладает ацетилирующей активностью, описанной выше, а аминоконцевая половина переносит активированный DATDH на липидный носитель. Остатки галактозы добавляются к DATDH с помощью pglA и pglE (19).Гликолипид будет транспортироваться к периплазматической стороне внутренней мембраны с помощью PglF, и, наконец, PglL будет переносить олигосахарид на PilE (20).

Важно отметить, что Kahler et al. (13) сообщил об изменении этой темы; в их штамме N. meningitidis (NMB) была обнаружена вставка в гене pglB . Как следствие, карбоксиконцевая часть PglB не имеет какой-либо гомологии с ацетилтрансферазами, а скорее с карбамоилфосфатсинтазой.Этот новый аллель получил название pglB2 . Было высказано предположение, что это новое расположение генов приведет к другому гликозилированию пилина. Дженнингс и его коллеги (19) позже проверили коллекцию из 42 клинических изолятов N. meningitis на наличие аллеля pglB2 и ORF8 и обнаружили, что 48% штаммов имели вставку, включая секвенированный штамм FAM18. Интересно, что наличие последовательности, гомологичной pglB ниже вставки pglB2-ORF8 как в штаммах NMB, так и в FAM18, предполагает, что аллель pglB существовал до аллеля pglB2 (19).

Поскольку половина клинических изолятов демонстрирует аллель pglB2 , мы охарактеризовали природу сахарида, присутствующего на пили типа IV в таком штамме, используя комбинацию подходов МС «сверху вниз». Было показано, что нисходящие подходы имеют большое значение для анализа посттрансляционных модификаций (21, 22), в том числе для гликозилирования пилина (9). Мы разработали стратегию, основанную на фрагментации сахара в результате столкновений, чтобы получить представление о структуре сахара. Было обнаружено, что гликозилирование пилина представляет собой ранее неизвестную гексозу, содержащую глицерамидную группу.Мы также показываем, что присутствие карбоксиконцевой области белка PglB определяет присутствие этого нового сахара на субъединицах пилина IV типа.

Результаты

Штамм

N. meningitidis 8013 демонстрирует альтернативное гликозилирование субъединицы пилина.

Геномная последовательность штамма 8013 N. meningitidis показала, что он отображает аллель pglB2 гена pglB (V.П., неопубликованные данные). Пили были частично очищены от штамма 8013 дикого типа, а также от мутантных штаммов, и неочищенные препараты исследовали с помощью MALDI-TOF MS. Пили, очищенные от штамма дикого типа, давали один основной пик с массой 17 495 Да наряду с пиками более низкой интенсивности при 17 653 Да и 17 698 Да [подтверждающая информация (SI) Рис. 5]. Повторные измерения различных препаратов пилей ( n = 10) дали среднюю массу 17 496 Да для основного пика со стандартным отклонением 5 Да.

Чтобы конкретно определить массу сахара, присутствующего на аминокислоте 63 субъединицы пилина, пили были очищены от штамма, экспрессирующего белок PilE, с точечной мутацией, заменяющей серин-63 на аланин (S63A, зеленый). Анализ MALDI-TOF показал, что средняя молекулярная масса пилина, экспрессируемого мутантом pilE _S63A , составляет 17 209 ± 11 Да ( n = 4). Принимая во внимание мутацию серина в аланин (-16 Да), масса посттрансляционной модификации серина-63 соответствовала приблизительному сдвигу массы на 271 Да.Это не соответствовало ожидаемой массе для DATDH (228 Да), Hexose-DATDH или любой из посттрансляционных модификаций, представленных в общедоступных базах данных (RESID, UNIMOD и Delta Mass), указывающих на присутствие неидентифицированного остатка сахара (23).

Затем мы проверили, участвовали ли ферменты, кодируемые генами pgl , в биосинтезе неизвестной модификации, обнаруженной в штамме 8013. Ген, кодирующий гликозилтрансферазу PglA, находится в выключенной фазе у штамма 8013 (V.P., неопубликованные данные), и, соответственно, пилин, очищенный из штамма, содержащего вставку транспозона в гене pglA , показал массу 17,497 ± 11 Да ( n = 4), что незначительно отличается от массы пилин дикого типа, что позволяет предположить, что PilE из штамма 8013 модифицирован моносахаридом. Белок PilE, очищенный из штаммов pglB , pglC и pglD , показал сходные массы с 17 231 ± 6 ( n = 3), 17 235 ± 2 ( n = 3) и 17 226 ± 7 Да (). n = 6) соответственно.При сравнении со штаммом дикого типа это показало приблизительные сдвиги массы на 265 Да, 261 Да и 270 Да для мутантов pglB , pglC и pglD соответственно. Таким образом, PglB, PglC и PglD необходимы для гликозилирования PilE, что позволяет предположить, что он соответствует сахаридной структуре, подобной DATDH. В соответствии с предыдущим сообщением (13), вставка транспозона в HAD-подобный ген (24) непосредственно после pglB не влияла на гликозилирование пилина (данные не показаны).В целом, этот цельнобелковый MALDI-TOF-анализ посттрансляционной модификации серина-63 указал на единственный сахаридный остаток, подобный, но отличный от DATDH, с приблизительной массой 270 Да.

Определение массы гликозилирования пилина методом ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FT-ICR).

МС

FT-ICR может достигать точности измерения массы ≤10 ppm, что соответствует стандартному отклонению 0,18 Да для белков 18 кДа. Поэтому образцы анализировали с помощью 7-T FT-ICR, снабженного наноэлектрораспылением.Массы будут представлены в виде рассчитанного значения моноизотопной массы, за которым следует разность масс (в единицах 1,00235 Да) между наиболее распространенным изотопным пиком и моноизотопным пиком (курсивом).

PilE дал основной пик на 17 481,00 -11 Да (MH ⁺ ) после деконволюции. Увеличение соответствующего диапазона масс показывает полностью разрешенную изотопную картину (рис.
А ). Также присутствуют сателлитные пики, соответствующие аддуктам натрия (M + Na ⁺ ) и калия (M + K ⁺ ), что часто наблюдается при анализе белков.Также обнаружен вторичный пик (MH ⁺ +153,93), вероятно, соответствующий добавлению одного фосфоглицерина (+154,00 Да теоретически) по сравнению с основным пиком PilE, как наблюдалось ранее (25).

Рисунок 1.

FT-ICR анализ гликозилирования PilE. ( A ) Анализ пилей, очищенных от штамма дикого типа.Увеличение спектра в диапазоне масс 17 480–17 520 Да, показывающее разрешенную изотопную оболочку для иона MH ⁺ , изображено на вставке . ( B ) Анализ негликозилированных форм PilE. Пили из штамма pilE _S63A (красный) и штамма pglD (синий) сравнивали с диким типом (черный). ( C ) Молекулы PilE, подвергнутые ISD, теряют свою сахарную составляющую, что приводит к появлению вторичного пика, соответствующего массе пилина без сахара.

субъединиц пилина, очищенных из штаммов pglD и pilE _S63A , дали массы 17207,00 -11 Да и 17,190,97 -11 , соответственно (рис.
Б ). С учетом мутации серина в аланин (Δmass = 15,99 Да), pilE
_S63A мутант показал модификацию с массой 274,04 Да (17 481,00-17 190,97-15.99). Соответственно, мутация pglD привела к сдвигу массы на 274,00 Да (17 481,00–17 207,00). FT-ICR MS также позволила провести диссоциацию в источнике (ISD) сахарного остатка, что позволило измерить массу белка без его сахарной части. В этих условиях в спектре появился новый пик, соответствующий потере 274,06 Да (17,480,90–17,206,84) (рис.
С ). Для сравнения, пили были очищены от мутанта pglA штамма MS11 N. gonorrhoeae и подвергнуты той же экспериментальной процедуре.Как и ожидалось, ISD привел к потере 228,1 Да из всего белка (данные не показаны), что соответствует DATDH (10).

Эти результаты однозначно указывают на то, что серин-63 PilE N. meningitidis штамма 8013 несет сахар, масса которого в свободной форме составляет 292 Да (274 + 18). Насколько нам известно, эта масса никогда ранее не описывалась.

Фрагментация сахара, вызванная столкновением, с использованием квадрупольного TOF (Q-TOF) MS выявляет атипичную глицерамидогексозу.

Поскольку мы показали выше, что можно отделить сахар от белка с помощью ISD, мы стремились наблюдать ион оксония в сахаре и фрагментировать его, чтобы понять его структуру (26, 27). Это было сделано с использованием масс-спектрометра Q-TOF Premier (Waters, Milford, MA), который обеспечивает как точность определения массы, так и эффективную фрагментацию для ионов с низкой массой.

ISD из образца пилей дикого типа N. meningitidis привело к образованию иона на высоте м / z 275.13 (отсутствует при 40 В), что соответствует ожидаемым видам оксония (рис.
A , сравните Верхний и Нижний ). Этот ион сопровождался ионами-сателлитами на м / z 257,12 (совместимо с потерей воды) и м / z 169,10. Обработка ISD на пилине из штамма N. gonorrhoeae MS11 приводила к появлению ионов на м / z 229,12, 211,11 и 169,10 (данные не показаны). m / z 229,12 соответствует ожидаемому оксониевому иону DADTH, а m / z 211,11 соответствует его дегидратированному продукту. m / z 169,10 — это фрагмент, общий для обоих сахаров, что позволяет предположить, что у них были родственные структуры.

Рис. 2.

Определение структуры гликанов с помощью ISD и MS / MS.Препараты сырых пилей анализировали на приборе Q-TOF Premier. Образцы были отправлены в ISD для отщепления сахара от остальной части белка и образования соответствующих ионов оксония. Затем ионы анализировались квадрупольным масс-спектрометром, а выбранные ионы далее фрагментировались столкновением и анализировались методом TOF-масс-спектрометрии. ( A ) Сравнение ионного профиля в присутствии (+ ISD) и в отсутствие (-ISD) ISD. Интересующие ионы выделены жирным шрифтом. ( B ) Фрагментация моносахаридов, диссоциированных из PilE, очищенных из N.gonorrhoeae MS11 (Ng MS11, m / z 229,1 Да) и штамм N. meningitidis 8013 (Nm 8013, m / z 275,1 Да) от ISD. ( C ) Фрагментация иона 169,1 Да из обоих сахаров.

На втором этапе анализа были выполнены тандемные MS (MS / MS) эксперименты с интересующими ионами. МС / МС иона m / z 229,12, соответствующего оксониевому иону DATDH из N.gonorrhoeae показан на рис.2.
B Верхний , ионный A . Предлагаемые структуры большинства наблюдаемых ионов представлены на рис. 3. Основная фрагментация — потеря 18,01 Да, что соответствует молекуле воды (H ₂ O), приводящей к иону на высоте м / z 211,1. Эта потеря воды обычно наблюдается для ионов оксония, но никогда не находила рационального объяснения. На рис. 6 на SI предлагаются различные пути для объяснения этой потери воды.С m / z 211 молекула кетена (CH ₂ CO, теоретическая масса 42,00 Да) может быть потеряна из одной ацетамидной группы с образованием m / z 169,1 Да. SI Рис. 7 показывает различные изомерные структуры для m / z 169,1, в зависимости от того, какая ацетамидная группа вступает в реакцию первой. Обратите внимание, что m / z 169.1 может дополнительно потерять NH ₃ с образованием иона m / z 152,1. Вторая потеря кетена (из второй ацетамидной группы) также наблюдается с m / z 169.1 дает m / z 127. Эти потери кетена очень незначительны для протонированных ацетамидогрупп. Механизм этого устранения показан на SI Рис. 7.

Рис 3.

Структуры и паттерны фрагментации DATDH и GATDH. ( A ) Структуры DATDH и GATDH, связанные с серином-63 PilE.( B ) Предложены последовательные шаги фрагментации DATDH и GATDH.

МС / МС неизвестного иона m / z 275,13 показано на рис.
B Нижний . Сравнение с МС / МС оксониевого иона ДАДТГ ( m / z 229,12) (рис.
B Upper ) выявил аналогичный спектр (почти идентичный, в диапазоне 70–170 m / z ), что подтвердило общее ядро ​​для обоих сахаров.Потеря одной молекулы воды из m / z 275,1 приводит к образованию m / z 257,1, аргументируя наличие хотя бы одной гидроксильной группы в структуре (рис.3). Также наблюдается вторая потеря воды ( m / z 239.1), что, вероятно, указывает на вторую гидроксильную группу, отсутствующую у N. gonorrhoeae. Что касается DATDH, дегидратированный ион оксония может дополнительно потерять кетеновую группу (с последующим отщеплением NH ₃ ) с образованием ионов m / z 215.1 и m / z 198.1. Это ясно демонстрирует присутствие одной ацетамидной группы в неизвестном сахаре.

Другой важной фрагментацией для m / z 275,1 является образование ионов на m / z 169,1, как это было обнаружено для структуры DATDH. MS / MS анализ m / z 169,1 ионов, образованных ( i ) из ISD пилей типа IV N. gonorrhoeae и ( ii ) из ISD пилей типа IV N.meningitidis . Результаты показывают, что оба иона дают идентичные спектры МС / МС, что означает, что их структура идентична (рис. 2).
С ). Основная фрагментация — это, опять же, потеря 42,01 Да с последующей потерей NH ₃ (чтобы получить m / z 110,06), что указывает на то, что m / z 169,1 также содержит одну ацетамидную группу. .

Взятые вместе, эти результаты показывают, что неизвестный сахар содержит одну ацетамидную группу и, по крайней мере, две гидроксильные функции и фрагменты, которые легко дают ион с длиной m / z 169.1, который также содержит ацетамидную группу. Структура этого иона m / z 169.1 такая же, как изображенная на рис.
B для DATDH. Таким образом, единственное различие между DATDH и неизвестным сахаром состоит в том, что одна ацетамидогруппа заменена группой 89-Да (257–169 + 1), содержащей по крайней мере один гидроксил. Только 2,3-дигидроксипропанамидо (также называемая глицерамидо) группа подходит под это описание (рис.
А ). Последовательность фрагментации предложена на рис.3
Б . Соответственно, переключение ацетильной группы на глицерамидную группу объясняет разницу в 46,01 Да, измеренную между обоими гликанами. Элементный состав этого нового сахара: C ₁₁ N ₂ O ₇ H ₂₀ (в свободной форме), что соответствует молекулярной массе 292,13 Да, что согласуется с приведенными выше результатами сравнения масс пилин с сахаром и без него.

Эти данные МС демонстрируют, что сахар присутствует на серине-63 из Н.meningitidis 8013 представляет собой 2-ацетамидо-4-глицерамидо 2,4,6-тридезоксигексозу или 2-глицерамидо-4-ацетамидо 2,4,6-тридезоксигексозу в зависимости от относительного положения глицерамидо и ацетамидогрупп. В оставшейся части исследования сахар будет называться глицерамидо ацетамидо тридезоксигексозой (GATDH).

Аллель

pglB2 определяет синтез и последующую передачу GATDH на субъединицы Pilin.

Приведенные выше результаты демонстрируют, что штамм 8013 экспрессирует ранее не идентифицированную гексозу, содержащую глицерамидную группу, которая отличается от ранее описанного остатка DATDH.Было заманчиво объяснить эту разницу экспрессией аллеля pglB2 штаммом 8013 по следующим причинам: ( i ) разница между двумя сахарами заключается в наличии глицерамидо вместо ацетильной группы гексозы. ; ( ii ) в штаммах, экспрессирующих DATDH-модифицированный пилин, ацетильная группа DATDH переносится на C4 гексозы по карбоксильному концу гена pglB; и ( iii ) аллель pglB2 характеризуется другой карбоксиконцевой частью PglB, генерирующей белок с неизвестной функцией (рис.4). Чтобы продемонстрировать, что карбоксиконцевая область PglB отвечает за синтез GATDH, а не DATDH, аллель pglB1 из штамма N. gonorrhoeae MS11 был заменен аллелем pglB2 из N. meningitidis . 8013, генерируя штамм MS11 pglB2 (см. Материалы и методы ).

Инжир.4.

Аллель pglB определяет, передается ли DATDH или GATDH на серин-63 PilE. ( A ) Генетическая организация аллелей pglB1 и pglB2 от разных Neisseria spp. штаммы. Серая заштрихованная область указывает области гомологии между обоими штаммами. Стрелки и пунктирная линия указывают область, амплифицированную с помощью ПЦР для вставки аллеля pglB2 в штамм MS11, экспрессирующий pglB1 .Tn указывает на сайт вставки транспозона. ( B ) Q-TOF-анализ гликозилирования пилина MS11. Пили были очищены от штамма MS11 (MS11), мутантного штамма pglA ( pglA ), мутантного штамма pglD ( pglD ) и штамма MS11, экспрессирующего аллель pglB2 (MS11 pglB2 pglB2 ). ).

Пили очищали от штамма MS11 pglB2 , и целые субъединицы пилина анализировали с помощью ионизации наноэлектроспреем Q-TOF (рис.4, MS11 pglB2 ). Наша цель состояла в том, чтобы использовать МС для обнаружения присутствия или отсутствия DATDH или GATDH в этих субъединицах пилей. С этой целью эти эксперименты проводились на приборе Q-TOF, который обеспечивает точные измерения средней массы и высокую чувствительность. Пили также очищали из штамма MS11 (MS11), мутанта pglA ( pglA ) и мутанта pglD ( pglD ). MS-анализ пилина, очищенного из штамма MS11, дал два основных пика после деконволюции в нейтральных молекулярных массах спектра многозарядных ионов: один пик, соответствующий молекулярной массе 17 865.2 Да и еще 17 742,5 Да. Разница в 122 Да между двумя массами соответствует ранее описанному остатку фосфоэтаноламина, присутствующему только в части белка PilE в штамме MS11 (9). Как и ожидалось, мутант pglA , в котором отсутствует N- ацетилгексозамин (203 Да), дал массу 17 661,5 Да, а мутант pglD , в котором отсутствуют как N- ацетилгексозамин, так и DATDH (228 Да), дает молекулярную массу 17 432,9 Да. Наконец, когда аллель pglB2 , происходящий от штамма 8013, был перенесен в штамм MS11 (рис.4, MS11 pglB2 ), вся масса пилина была сдвинута до 17 911,3 Да, что соответствует массе пилина (17 432,9 Да) с одним ацетилгексозамином N- (203 Да) и одним GATDH (274,1 Да). В заключение, природа аллеля pglB определяет модификацию гексозы и, следовательно, природу сахара. Если это аллель pglB1, пилин будет модифицирован с помощью DATDH, а если это аллель pglB2 , это будет GATDH.

Обсуждение

Хотя важность гликозилирования белков впервые была признана у эукариот, становится все более очевидным, что многие бактериальные белки посттрансляционно модифицируются путем гликозилирования и что эти модификации являются ключевыми в различных биологических и патологических процессах (1).В этом отчете была определена природа гликозилирования пилина клинического изолята N. meningitidis 8013. MS был выбран нисходящий подход, поскольку он дает более глобальное и количественное представление о посттрансляционных модификациях. MALDI-TOF позволил быстро провести скрининг большого количества мутантов и определить приблизительную массу со стандартным отклонением ≈5 Да для пилина 18 кДа. FT-ICR позволяет точно измерить модификацию даже для всего белка со стандартным отклонением <0.2 Да. FT-ICR также позволял сахарной составляющей диссоциировать с помощью ISD, таким образом определяя массу сахара только из одного образца белка и анализируя один спектр. Затем мы использовали возможность расщепления сахарного фрагмента с помощью ISD, чтобы запустить образец на MS / MS Q-TOF. Моносахаридные модификации белков обычно трудно анализировать, потому что технически сложно химически отделить моносахарид от основной цепи белка. Кроме того, анализ структуры сахара обычно основан на ГХ, которая основана на больших количествах высокоочищенного и модифицированного исходного материала.Последовательная комбинация ISD с последующей MS / MS позволила проанализировать структуру сахара, начиная с небольших количеств частично очищенного белка. Поэтому наш подход сочетал в себе чувствительность, скорость и точность. Кроме того, этот подход должен быть применим к различным гликозилированным белкам и, следовательно, должен иметь общую ценность. Было обнаружено, что сахар, присутствующий в штамме N. meningitidis 8013, тесно связан с DATDH, ранее идентифицированным на субъединицах пилина neisserial.Разница в 46 Да между обоими сахарами была локализована на одном из двух атомов углерода, несущих ацетамидную группу. Вместо двух ацетамидогрупп в положениях C2 и C4 сахар штамма 8013 несет одну ацетамидную и одну глицерамидную группы, что делает его GATDH. Относительное положение глицерамидных и ацетамидогрупп в положениях C2 или C4 еще предстоит определить. Поскольку UDP-GlcNAc является вероятным исходным материалом для биосинтеза этого сахара (17, 18), ацетамидная группа более вероятна на углероде 2, а глицерамидо в положении 4, что делает его 2-ацетамидо-4-глицерамидо 2,4, 6-тридезоксигексоза.

MS также позволило протестировать роль генов pgl в гликозилировании PilE с помощью GATDH. Мы обнаружили, что pglB , pglC и pglD были необходимы для гликозилирования пилина с помощью GATDH, как и в случае гликозилирования пилина N. gonorrhoeae MS11 с помощью DATDH (10). Поскольку очевидное различие между штаммом MS11 и штаммом 8013 в отношении генов pgl заключалось в наличии вставки в карбоксиконцевой части PglB (аллель pglB2 ), было заманчиво предположить, что за это отвечает pglB . для разницы в сахаре.Чтобы проверить эту гипотезу, мы сконструировали штамм MS11, экспрессирующий аллель pglB2 из штамма 8013. Поразительно, что этот штамм экспрессирует пилин, модифицированный GATDH, показывая, что разница в последовательности pglB определяет природу сахара в пилине и что оба вида синтезируют соответствующие метаболиты для продукции GATDH. Таким образом, карбоксиконцевая область PglB обладает биохимическим свойством переносить глицерамидную группу на C4 остатка сахара.Мы предполагаем, что в штаммах, несущих аллель pglB2 , имеет место следующая последовательность событий: PglD опосредует дегидратацию UDP-GlcNAc C2 и C4, PglC передает аминогруппу, а PglBCter добавляет глицерамидную группу на C4. Было бы интересно расширить анализ гликозилирования пилина на более широкий диапазон штаммов N. meningitidis и N. gonorrhoeae , а также других видов бактерий. Мы обнаружили, что патогенные бактерии Vibrio parahemoliticus экспрессируют ген pglB с высокой гомологией с геном N.meningitidis 8013 pglB2 (65,8% и 52,5% идентичности в амино- и карбоксиконцевых частях белка, соответственно), что позволяет предположить, что эта бактерия также может отображать остатки GATDH на своих субъединицах пилина IV типа. Насколько нам известно, гликозилирование пилина в Vibrio spp. не было описано. В геноме V. parahemoliticus ген pglB2 связан с гомологами pglC и pglD , что позволяет предположить, что может присутствовать полная система гликозилирования.

Сравнение последовательности PglBCter штамма 8013 с базой данных белковых доменов Prosite показывает, что она содержит АТФ-захватывающий домен (группа 3). Суперсемейство АТФ-захват включает 17 групп ферментов, катализирующих АТФ-зависимое лигирование молекулы, содержащей карбоксилат, с молекулой, содержащей аминогруппу (28). Поэтому реакция, катализируемая PglB, вероятно, потребует энергии за счет потребления АТФ. Интересно, что группа 3 суперсемейства АТФ-захватов, к которому принадлежит PglB, не имеет известной функции.Поскольку наше исследование демонстрирует, что PglBCter проявляет активность переноса глицерамидо, будет интересно проверить, обладают ли другие члены группы ATP-grasp_3 также этой активностью.

Следует подчеркнуть, что роль гликозилирования пилина остается полностью неизвестной. Существование альтернативного гликозилирования из-за вставки в ген pglB почти в 50% клинических изолятов поднимает вопрос о том, дает ли изменение модификаций сахара преимущество для штаммов.Изменение структуры гликозилирования пилина может быть формой иммунного бегства за счет изменения поверхностных эпитопов. Теоретически этот эффект может модулировать способность бактерий колонизировать носоглотку и, таким образом, обеспечивать бактериям преимущество, но нет никаких доказательств ни за, ни против этой гипотезы. Например, неизвестно, является ли этот эпитоп иммуногенным. Более того, поскольку оба сахара в равной степени представлены в популяции N. meningitidis , можно утверждать, что они оба обеспечивают одинаково эффективные маскирующие устройства против иммунной системы.

В заключение, настоящее исследование привело к идентификации моносахаридной модификации пилина типа IV, вероятно, присутствующей во всех штаммах, экспрессирующих аллель pglB2 , что составляет почти половину из клинических изолятов N. meningitidis . Поразительно, но идентифицированный здесь остаток GATDH, насколько нам известно, нигде не описан. Кроме того, новая биохимическая функция приписывается PglB2 как глицерамидотрансферазе, которая принадлежит к семейству белков, захватывающих АТФ.Для достижения этих результатов была разработана стратегия идентификации сахара на основе МС, сочетающая различные методы МС. Анализ МС с использованием ISD с последующей МС / МС привел к наглядной информации о структуре сахара в одноэтапном анализе частично очищенного белка. Этот подход должен оказаться полезным для быстрой и простой идентификации сахаров в гликозилированных белках.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и условия роста.

Если не указано иное, все штаммов N. meningitidis , описанные в этом исследовании, произошли от штамма 8013 клона 12. Также использовали штамм N. gonorrhoeae MS11. Neisseria spp. были выращены на чашках с агаром GCB (Becton Dickinson, Sparks, MD), содержащих добавки Келлог и, при необходимости, 100 мкг / мл канамицина при 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ . Трансформанты E. coli выращивали на твердом или жидком бульоне Лурия-Бертани (Becton Dickinson), содержащем 100 мкг / мл ампициллина.Мутанты, использованные в этом исследовании, описаны в таблице SI 1. Несколько мутантов, описанных в этом исследовании, были получены из библиотеки транспозиционных мутантов, описанных в другом месте (24).

Для переноса аллеля pglB2 из штамма 8013 в штамм MS11 геномная область, содержащая вставку, обнаруженную в аллеле pglB2 , была амплифицирована с pglB F1 (5′-CTGTTCGACATCATCATCATCC-3’B и pglB2 R1 (5′-TCGGCAAACACGGGATTTG-3 ‘) олигонуклеотидов, начиная с геномной ДНК, происходящей из штамма 8013, содержащего вставку транспозона в ген HAD.Полученный фрагмент размером 4,5 т.п.н. клонировали в плазмиде PCR2.1 Topo и проверяли секвенированием. Плазмиду использовали для трансформации штамма MS11, и трансформанты отбирали на чашках с канамицином.

Приготовление пили.

Пили получали, как описано ранее (29). Содержимое четырех чашек Петри собирали в 10 мл 150 мМ этаноламина при pH 10,5. Пили срезали встряхиванием в течение 1 мин. Бактерии центрифугировали при 17000 × g в течение 30 мин.Затем пили осаждали добавлением сульфата аммония в концентрации 10% к супернатантам, и образцы оставляли на 60 мин. Осадки осаждали центрифугированием при 5000 × g в течение 30 мин. Гранулы дважды промывали PBS и ресуспендировали в дистиллированной воде.

MS.

МАЛЬДИ-ТОФ.

Молекулярные массы очищенных пилей определяли с помощью MALDI-TOF MS с использованием масс-спектрометра Voyager-DE Pro (Applied Biosystems, Foster City, CA).Спектрометр MALDI-TOF работал в линейном режиме положительных ионов и использовался с ускоряющим напряжением 25 кВ, напряжением сетки 92,5% и временем задержки 350 нс. Растворы пили первоначально смешивали с равным объемом матрицы, приготовленной с использованием инструкции к набору (синапиновая кислота; LaserBioLabs, Sophia-Antipolis, Франция), и 2 мкл позволяли кристаллизоваться на планшете MALDI.

FT-ICR.

Растворы белков пилей

типа IV обессоливали с помощью очистки на зип-наконечнике C4 (Millipore, Billerica, MA) и элюировали 10 мкл 73.5: 23,5: 3 МеОН / вода / муравьиная кислота (об. / Об. / Об.). Те же образцы были использованы для анализов FT-ICR и Q-TOF.

Эксперименты проводились на масс-спектрометре 7-T APEX III FT-ICR (Bruker Daltonics, Бремен, Германия), оснащенном активно экранированным сверхпроводящим магнитом 7-T и бесконечной ячейкой. В качестве источника ионизации использовался источник наноэлектрораспыления Apollo. Стеклянные капилляры с наноэлектрораспылением (Proxeon, Odense, Дания) заполняли 2 мкл раствора белка, и каждый впоследствии открывали, ломая конический конец наконечника под микроскопом.Стабильный спрей наблюдался при приложении напряжения около -700 В между иглой (заземленной) и входом в стеклянный капилляр, используемый для переноса ионов. Температура источника 50 ° C использовалась для всех экспериментов с наноэлектрораспылением. Расчетный расход составлял 20–50 нл / мин. Ионы накапливались в области источника в гексапольном проводнике в течение 1 с и подавались в детекторную ячейку через серию электростатических линз. Наконец, ионы были захвачены в ячейку с помощью бокового удара и напряжения захвата спереди и сзади, равного 0.9 и 0,95 В. Масс-спектры были получены от м / z 600–3000 с 512 000 точек данных. Для ISD ионы диссоциировали за счет увеличения напряжения прескиммера (до 250 В) в последующей области прескиммера (давление ≈1 Торр). Все спектры деконволютировали на частицы MH ⁺ с использованием XMASS 6.1.4 (Bruker Daltonics). Теоретические изотопные структуры были получены с использованием DataAnalysis 3.2 (Bruker Daltonics). Калибровка внешней массы с использованием NaI (2 мг / мл в изопропаноле / воде) выполнялась ежедневно.

Q-TOF.

Образцы для электрораспыления готовили, как описано выше для FT-ICR. Определение структуры сахара методом МС / МС выполняли на приборе Q-TOF Premier (Waters). Q-TOF Premier — это квадрупольный тандемный масс-спектрометр TOF с ортогональным ускорением. Белки были ионизированы с помощью ионизации наноэлектроспреем в положительном режиме (ZSpray). Температура источника была установлена ​​на 80 ° C. Напряжения на капилляре и конусе были установлены равными 3000 и 40 или 80 В соответственно (80 В для ISD).Прибор Q-TOF Premier работал в широкополосном квадрупольном режиме для МС-экспериментов, при этом данные TOF собирались между м, / z 400 и 2000 с низкой энергией столкновения 10 эВ. В качестве газа столкновений использовался аргон. Сканы собирались в течение 1 с и накапливались для увеличения отношения сигнал / шум. Эксперименты МС / МС проводились с использованием переменной энергии столкновения (10–30 эВ), которая была оптимизирована для каждого иона-предшественника. Mass Lynx 4.1 использовался как для сбора данных, так и для обработки данных.Деконволюция многозарядных ионов на нейтральные частицы осуществлялась с помощью MaxEnt1 в диапазоне масс (10–25 кДа) с разрешением 0,01 Да на канал. Внешнюю калибровку в МС проводили с кластерами фосфорной кислоты (0,01 М в ацетонитриле 50:50: H ₂ O об. / Об.). Диапазон масс для калибровки составлял м / z 70–2000.

Благодарности

Мы благодарим А. М. Леннона Думениля за рецензирование рукописи.Работа финансировалась Национальным институтом Санте и медицинских исследований, Национальным агентством исследований (грант JC05-44953) и Университетом Рене Декарта. F.L. финансировался Фондом медицинских исследований.

Сноски

• ^§§ Кому следует направлять корреспонденцию. Эл. Почта: dumenil {at} Necker.fr

• Вклад авторов: Дж.К.-Р. и Г.Д. разработали исследования; J.C.-R., B.R., F.L., G.M., E.M., C.M., L.C. и G.D. проводили исследования; V.P., L.C. и G.D. предоставили новые реагенты / аналитические инструменты; J.C.-R., G.B., L.C., X.N. и G.D. проанализировали данные; и J.C.-R., X.N. и G.D. написали статью.

• ↵
  ^¶ Текущий адрес: Департамент молекулярной микробиологии и инфекций, Имперский колледж Лондона, Лондон SW7 2AZ, Великобритания.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/0705335104/DC1.

• Сокращения:

  DATDH,

  2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезоксигексоза;

  GATDH,

  глицерамидо ацетамидо тридезоксигексоза;

  ISD,

  диссоциация в источнике;

  FT-ICR,

  ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье;

  Q-TOF,

  квадрупольный TOF;

  MS / MS,

  тандемный MS.

• © 2007 Национальная академия наук США

% PDF-1.3
%
208 0 объект
>
эндобдж

xref
208 96
0000000016 00000 н.
0000002829 00000 н.
0000002989 00000 н.
0000003025 00000 н.
0000003428 00000 н.
0000003577 00000 н.
0000003688 00000 н.
0000003797 00000 н.
0000003910 00000 н.
0000004023 00000 н.
0000004134 00000 п.
0000004246 00000 п.
0000004359 00000 п.
0000004471 00000 н.
0000004584 00000 н.
0000004695 00000 н.
0000004808 00000 п.
0000004921 00000 н.
0000005034 00000 н.
0000005148 00000 п.
0000005261 00000 п.
0000005376 00000 п.
0000005491 00000 п.
0000005604 00000 п.
0000005719 00000 н.
0000005832 00000 н.
0000005995 00000 н.
0000006297 00000 н.
0000006546 00000 н.
0000006752 00000 н.
0000007077 00000 н.
0000007667 00000 н.
0000007893 00000 н.
0000008158 00000 п.
0000008471 00000 п.
0000008574 00000 н.
0000008890 00000 н.
0000009264 00000 н.
0000009538 00000 п.
0000009925 00000 н.
0000011454 00000 п.
0000011632 00000 п.
0000011993 00000 п.
0000012173 00000 п.
0000012672 00000 п.
0000012870 00000 п.
0000013166 00000 п.
0000013731 00000 п.
0000013936 00000 п.
0000014664 00000 п.
0000015090 00000 н.
0000015159 00000 п.
0000015832 00000 п.
0000016035 00000 п.
0000016328 00000 п.
0000016621 00000 п.
0000017074 00000 п.
0000017412 00000 п.
0000017481 00000 п.
0000018947 00000 п.
0000020442 00000 н.
0000020622 00000 п.
0000021435 00000 п.
0000021645 00000 п.
0000021939 00000 п.
0000022008 00000 п.
0000023495 00000 п.
0000024830 00000 п.
0000024996 00000 н.
0000025195 00000 п.
0000026693 00000 п.
0000026855 00000 п.
0000027118 00000 п.
0000027601 00000 п.
0000027971 00000 п.
0000028171 00000 п.
0000029618 00000 п.
0000030176 00000 п.
0000031624 00000 п.
0000032564 00000 н.
0000041342 00000 п.
0000048477 00000 н.