После электрофореза: Электрофорез: показания и противопоказания применения с эуфиллином, лидазой, карипазимом, кальцием хлоридом

Электрофорез в домашних условиях — как делать и чем можно заменить? Аппараты для проведения

Сегодня, любой желающий может приобрести в аптеке или специализированном магазине прибор для проведения электрофореза. Данным устройством можно пользоваться в домашних условиях. Поэтому, данные приборы часто используют для лечения заболеваний, которые связаны с ограниченной двигательной активностью.

Электрофорез является комбинированным методом лечения, лекарственным веществом, которое вводят в организм посредством тока.

Для электрофореза используют вещества, которые в растворах дислоцируют на ионы.

В качестве растворителей используют:

1. Дистиллированную воду.
2. Физиологический раствор с различными значениями рН.
3. Для малорастворимых в воде веществ целесообразно применять диметилсульфоксид (димексид).

Проницательность кожи для лекарственных веществ уменьшается в направлении от головы к ногам:

1. Максимальной проницательностью характеризуется кожа лица.
2. Наибольшей проницательностью кожа голеней и стоп.

Необходимо отметить, что проницательность слизистых оболочек при гальваническом введении веществ в 2–2,5 раза больше, чем проницательность кожи. Глубина проникновения веществ во время электрофореза составляет примерно 1 см. С возрастом, тургор кожи уменьшается, что приводит к уменьшению количества введения в организм лекарственного вещества.

Довольно низкая проницаемость кожи для лекарственных веществ приводит к тому, что примерно половина введения лекарств задерживается в коже и, создавая там депо, вызывает эффект «микрокапельницы».

Электрофорез характеризуется пролонгированным воздействием лекарственных веществ. Если при действии гальванического тока, эффект последействия продолжается до 4 часов после проведённого сеанса, то антибиотики остаются в депо до 3 суток.

Адреналин и норадреналин выводится из организма в течение недели. Довольно перспективной модификацией лекарственного электрофореза является внутренне органный, при котором требуемый медикамент вводится внутривенно и в период его наибольшей концентрации в крови на заинтересованном органе осуществляют гальванизацию.

Проведение в домашних условиях

1. Первым делом, проводят различные подготовительные мероприятия в зависимости от болезни человека. Однако, подготовительные процедуры проводятся не всегда. Например, если человек страдает болезнью печени, то они не проводятся.
2. Далее, необходимо подготовить раствор с лекарственным средством. Основная часть раствора состоит из дистиллированной воды. Как правило, концентрация составляет 1–5%. Бывают случаи, когда лекарство не может раствориться в воде. В таком случае, применяют диметилсульфоксид.
3. Во время проведения процедуры, человек должен находиться в лежачем положении на кушетке или кровати. Предварительно смоченные специальным раствором электроды, прикладывают к необходимым областям. При необходимости, используют повязку для фиксации электрода.
4. Далее, специальный прибор вставляют в розетку и настраивают необходимые параметры. Максимальная сила электрического тока составляет 15 мА. Во время данной процедуры человек не испытывает неприятных ощущений. Как правило, все манипуляции выполняются в течение 20 мин. Для эффективного лечения необходимо 10–20 сеансов.

Электрофорез — проводится как в медицинских учреждениях, так и дома. Все что вам необходимо – это соблюдать инструкцию по применению устройства. Но количество и длительность сеансов, а также используемые лекарственные препараты должен назначать лечащий врач.

Для проведения процедуры желательно воспользоваться услугами врача. Это особенно важно, если вы проводите данную процедуру впервые. Доктор научит вас правильному пользованию, а также ответит на все ваши вопросы. Устройства для лечения продаются в специализированных магазинах и аптеках.

Процедура абсолютно безболезненна для человека. Она подразумевает введение определённых медикаментов в слизистую.

Кроме этого, терапия осуществляется по двум направлениям:

1. Ток.
2. Специально подобранные препараты.

Эта процедура не имеет возрастных ограничений. Однако детей, как правило, лечат дома.

Перед проведением этой процедуры нужно проконсультироваться у специалиста или самостоятельно изучить методы установки всех электродов. Полученные знания уберегут вас от несчастных случаев. То есть это обеспечит безопасность.

Ваш лечащий врач должен определить:

1. Длительность процедуры.
2. Используемые лекарственные средства.
3. Применяемый аппарат.

Показания и противопоказания к применению

Электрофорез лекарственных веществ применяется для лечения местных и региональных процессов различного характера:

1. Воспалительного.
2. Дистрофического.
3. Аллергического и т. д.

Электрический ток с успехом применяется при:

1. Вертеброгенных заболеваниях.
2. Заболеваниях центральной и периферической системы (энцефалиты, миелит, невриты, плеяситы, радикулиты).
3. Неврозах (неврастения).
4. Бронхиальной астме.
5. Гипертонус мышц.
6. Остеохондрозе.
7. При угрозе выкидыша.
8. При проблемах с зачатием.
9. При заболеваниях почек.
10. Хроническом гепатите.
11. Циррозе печени.
12. Поражение печени.
13. Дискинезии жёлчного пузыря.

Процедура электрофореза безопасна и доступна каждому.

Однако существуют заболевания, при которых нежелательно использовать данные приборы:

1. Злокачественные новообразования.
2. Различные стадии сердечной недостаточности.
3. Гнойные образования на кожных покровах.
4. Различные заболевания кожи (дерматит, экзема и другие).
5. Заболевания мочеполовой системы.
6. Повышенная или пониженная свёртываемость крови.
7. Запрещается проведение процедуры при увеличении температуры тела.
8. Кроме этого, нельзя использовать приборы для электрофореза, если человек страдает непереносимостью электрического тока.
9. Если у пациента есть металлические зубные протезы, то электроды нельзя прикладывать к лицу.

Если соблюдать рекомендации доктора и следовать инструкции специального прибора, то процедура принесёт положительный результат. По сути, использование прибора для электрофореза в домашних условиях ничем не уступает проведению процедуры в больнице.

Преимущества и растворы для электрофореза

Основные преимущества лечения:

1. Лекарственный препарат поступает в виде ионов (наиболее усваиваемая форма).
2. Использование минимальных дозировок.
3. Не происходит проникновение вещества в кровоток.
4. Препарат проникает в необходимое место.
5. Действующее вещество скапливается в необходимом месте.
6. Введённые препараты действуют продолжительное время.
7. Отсутствие побочных эффектов, а также алл

Что нельзя делать после электрофореза. Противопоказания к процедуре

Спасибо

Электрофорез – определение и физическая суть процесса

Термин «электрофорез» состоит из двух частей – «электро» и «форез», где «электро» означает электрический ток, а «форез» переводится с греческого как перенос. Электрофорез
представляет собой движение заряженных частиц (ионов) в электрическом поле, создаваемом внешним источником. Физический процесс электрофореза сегодня имеет широкое применение в различных отраслях. Чаще всего его применяют в качестве процедуры физиотерапии , и в исследовательских методах для разделения биологических веществ.

Медицинская процедура – лекарственный электрофорез

Электрофорез, как медицинская процедура, также называется ионофорез, ионотерапия, ионогальванизация или гальваноионотерапия, причем все данные термины означают один и тот же процесс. Применительно к медицинской практике, электрофорез представляет собой метод электротерапии, который основан на эффектах постоянного тока и действии лекарственных препаратов, доставляемых при помощи того же тока. Доставка различных медицинских препаратов при помощи данного метода называется лекарственным электрофорезом. Сегодня в лечебной практике применяется несколько видов электрофореза, в которых используют различные электрические токи.

Для доставки лекарственных препаратов методом электрофореза используют следующие токи:

1.
Постоянный (гальванический) ток.
2.
Диадинамические токи.
3.
Синусоидальные модулированные токи.
4.
Флюктуирующие токи.
5.
Выпрямленный ток.

Принцип действия лекарственного электрофореза

В основе электрофореза лежит процесс электролитической диссоциации. Химическое вещество, являющееся лекарством, распадается на ионы в водном растворе. При пропускании электрического тока через раствор с медицинским препаратом ионы лекарства начинают перемещаться, проникают через кожу, слизистые оболочки, и попадают в организм человека.

Ионы лекарственного вещества проникают в ткани по большей части через потовые железы, но небольшой объем способен про

назначение процедуры и ее выполнение

Лечение женских болезней обуславливается не только медикаментозным курсом и вагинальными свечками. Многие болезни развиваются за счет анатомических нарушений. Именно по этой причине применяется целый комплекс методик. Электрофорез в гинекологии применяется также часто, как и лечение с помощью грязей. Но смысл у них аналогичен, лечебные препараты попадают в организм через кожные покровы.

Лечение гинекологических болезней электрофорезом – действенный метод

Преимуществом таких методик является сохранение функциональности желудочно-кишечного тракта. Электрофорез применяется со множеством лекарств: с магнезией, цинком, калием и т. д., но основной принцип работы основывается на подаче постоянного тока, на определенной частоте. За счет такого воздействия, пациент может подвергаться только терапевтическим процедурам, без хирургического вмешательства.

Какой эффект оказывает

Электрофорез с цинком в гинекологии применяется уже давно, а сам метод исключал остатки медицинских препаратов в крови будущей матери, тем самым предотвращая последствия во время и после беременности. Иногда такая процедура намного эффективнее медикаментозных курсов, а иногда намного безопаснее.

Современная медицина все больше акцентирует внимание на заболеваниях женских органов. Все больше зарегистрированных случаев болезней, провоцирующих ослабление кровотока в области женских гениталий. На основании исследований ученые выяснили, что болезнь прогрессирует из-за недостатка медикаментозного лечения, поскольку активные вещества просто не доходили до органов малого таза, оседая на здоровых участках организма. За счет исследований медицина выявила еще несколько новых заболеваний, вызванных переизбытков препаратов в здоровых органах.

Электрофорез поможет снять отеки

Электрофорез с медью или другим препаратом (зависит от назначений врача) эффективно борется с патологиями:

• устраняет отеки;
• уменьшает боли;
• регенерирует кожные покровы.

За счет ионного ввода зарегистрированных случаев аллергии на медикаменты все меньше, а преимуществом метода является безболезненный ввод в нужное место.

Важным преимуществом электрофореза с йодистым калием или медью в гинекологии считается обход кровеносной системы и желудочно-кишечного тракта. За счет этого не нарушается работа ни одного органа.

Когда проводятся процедуры

Показания к электрофорезу с цинком, медью, калием, демексидом основываются на недавних исследованиях, которые выявили новые заболевания, а список болезней и терапий значительно увеличился:

• хронические патологии органов малого таза;
• воспалительные процессы в придатках;
• бесплодие;

Часто проводится при подготовке к ЭКО

• послеоперационная восстановительная терапия;
• регенерация ткани маточных труб;
• повышение чувствительности клеток к гинекологическим медикаментозным курсам;
• репродукция слизистых оболочек;
• реабилитация после процесса прерывания беременности;
• снятие отечностей и воспаления;
• хронические воспалительные процессы;
• терапия, влияющая на улучшение питания клеток;
• подготовительный этап женских органов для ЭКО.

Электрофорез с калий йодом в гинекологии используется в качестве безболезненного ввода препаратов во влагалище, создавая при этом эффект чаши с лекарством. За счет прохождения нескольких курсов электрофореза, медицинские препараты впитываются во влагалище за несколько приемов. Стоит отметить, что курс нужно пройти полностью для эффективного лечения.

Какие препараты применяются

Поскольку терапия основана на пропускании тока через ткани организма, используются только проводящие препараты. Их выбор основывается на следующих параметрах:

1. Гормональный фон.
2. Активность яичников.
3. Функциональность женских половых органов.

Часто для проведения процедуры используют димексид

Самыми распространенными в гинекологии являются:

• цинк;
• йодид калия;
• медь;
• димексид.

Цинковый раствор широко применяется для лечебных процедур при эрозии и неполноценной функциональности желтого тела. Электроферез на основе цинка предусматривает использование раствора в 0,25 или 0,5 %. Лечебный курс при этом достигает 30 дней, а посещений процедурной до 15 раз. Перерыв между лечением составляет 60 дней.

В послеоперационный период обычно применяют методику с йодидом калия, поскольку он влияет на рецепторы боли и снижает синдром болезненности при спаечном процессе.

Использование препарата запрещено во время нарушений в функциональности яичников.

Обычно калиевый йод заменяют на:

1. Новокаин.
2. Магний.

Возможно применение Новокаина

Комплекс из цинка и лидазы применяется в случае возникновения рубцевания и спайек в яйцеводах, после операций. Довольно редко используется за счет целого списка противопоказаний.

Стоит отметить, что боли во время менструального цикла испытывают 10% женщин. Иногда реакция на резкие болезненные месячные – потеря сознания. В этом случае специалисты рекомендуют использовать 7 дневный лечебный курс с применением новокаина.

Имеет ли процедура противопоказания

Противопоказания делятся на: полные, ограниченные и общие. Ограничение для проведения процедур вводится при беременности, эндокринных заболеваниях, хронических поражениях почек и болезнях легких.

Полные противопоказания:

• кисты;
• реабилитационный период после хирургической операции;
• кровотечения;
• полипы;
• папилломные и кондиломные поражения;
• любой вид рака гениталий;
• генетическая предрасположенность, влияющая на изменения месячного цикла;
• гнойные поражения.

Из этого ролика вы узнаете. как проходит электрофорез:

Общая группа:

• непереносимость разряда;
• простудные заболевания;
• температура;
• ВИЧ-инфекции;
• любой вид гепатита и туберкулеза;
• раны или порезы в области проведения;
• обостренная форма почечной или печеночной недостаточности;
• болезни кровеносной системы;
• алкоголизм;
• наркотическая зависимость;
• психические отклонения.

Специалисты рекомендуют проводить электрофорез в стационарном режиме.

На сегодняшний день огромным спросом пользуется травяной сбор «КАРОНАСТОП». Популярность обоснована прежде всего тем, что в сборе собрано 16 трав, благодаря чему средство способно оказывать помощь в поддержании иммунитета, широко при этом воздействуя на все внутренние органы. Известность о целебном воздействие напитка распространилась достаточно быстро, его эффективность была оценена многими людьми, которым он значительно улучшил качество жизни и оказал существенную помощь в поддержке иммунитета в период вирусных и инфекционных заболеваний. Сейчас это как никогда важно!

Электрофорез при близорукости — энциклопедия Ochkov.net

Для коррекции близорукости используют очки и контактные линзы. Некоторые люди подходят к лечению иначе — они выбирают лазерную коррекцию зрения. В детском возрасте такие операции обычно не проводятся. Чаще всего назначается консервативное лечение. Окулисты обычно рекомендуют пройти курс физиотерапии с применением электрофореза.

Что такое электрофорез?

Электрофорез — один из самых известных и популярных методов физиотерапии. С помощью этой процедуры в ткани организма вводятся лекарственные вещества. Происходит это посредством электрического тока низкого напряжения. Физиотерапевт наносит лекарственное вещество на прокладки электродов. После этого под силой электрического тока они попадают в организм. Этот способ лечения оказывает положительное воздействие на физиологические и патологические процессы.

В медицине электрофорез используется много лет. Этот физиотерапевтический метод отлично показал себя в терапии многих заболеваний. Процедура часто применяется в неврологии, травматологии, гинекологии и многих других отраслях медицины. Успешно освоили ее и офтальмологи. Физиотерапия глаз очень распространена при близорукости у детей. Прохождение ребенком полного курса электрофореза замедляет развитие миопии и не дает ей прогрессировать некоторое время.

Применение электрофореза в офтальмологии

В офтальмологии метод электрофореза успешно применяется. Это связано с тем, что роговица глаза прекрасно пропускает ток. Она представляет собой полупроницаемую мембрану, через которую ионы проходят в центр глазного яблока. Внутри глаза концентрация лекарственного вещества возрастает. Это повышает эффективность терапии. Электрофорез назначается для лечения детей при таких заболеваниях, как:

• дистрофия роговицы;
• рубцовые изменения век;
• халязион;
• флегмона;
• гордеолум;
• кератит;
• эписклерит.

Методика доказала свою эффективность при макулодистрофических процессах, когда поражается сетчатая оболочка глаза и происходит нарушение центрального зрения. Этот вид физиотерапевтических процедур окулисты назначают людям при ретинопатии, которая возникла на фоне тромбоза вен. При атрофических изменениях зрительного нерва электрофорез также эффективен. Применяется он и при менее серьезных патологиях органов зрения, в том числе при близорукости.

Физиотерапия при близорукости у детей может быть рекомендована не во всех случаях. Этот метод лечения имеет определенные противопоказания. К ним относятся:

• заболевания крови;
• острые инфекции;
• простудные заболевания;
• эпилепсия.

Электрофорез с рибофлавином для лечения близорукости у детей

При лечении детской близорукости окулисты чаще используют аппаратную методику. Какая из них будет назначена ребенку, определит физиотерапевт. Многое зависит от степени близорукости, возраста малыша, наличия хронических болезней. Самым популярным методом лечения является проведение электрофореза с использованием рибофлавина — витамина В2.

Перед началом процедуры ребенка кладут на кушетку. Он обязательно должен находиться в лежачем положении. Предварительно ребенку промывают нос физраствором. Это необходимо для очищения носовых проходов. После этого врач выжидает 5-10 минут и вводит при помощи воздействия слабых токов в слизистую носа витамин.

Тампон заранее обильно смачивается в рибофлавине. После этого врач, используя пинцет, вводит ватный тампон в ноздри ребенка. Электроды присоединяются к тампонам. По ним проходит ток силой 1 миллиампер. Во время проникновения в кровоток рибофлавин достаточно быстро достигает структур глаза. Это повышает скорость биохимических процессов и стимулирует дыхание тканей.

Чтобы детская близорукость перестала прогрессировать, окулисты обычно назначают не менее 15 сеансов. Их длительность врач определяет в индивидуальном порядке. В большинстве случаев сеанс продолжается 15 минут. В некоторых ситуациях, например, при сильной близорукости, офтальмолог может порекомендовать продлить стандартную процедуру до 20 минут.

Диадинамометрия в терапии близорукости

Распространенной физиотерапевтической процедурой является диадинамометрия. Иногда ее называют диадинамофорез. Этот метод лечения миопии заключается в воздействии на глаза низкочастотного импульсного тока. Он проходит через специальные электроды, которые имеют форму пластинок. Такой способ лечения врачи чаще назначают детям школьного возраста.

Под электроды физиотерапевт размещает гидрофильные прокладки. Пластины кладут ребенку на веки, после чего пускают ток. Для эффективности лечения силу тока рекомендуется постепенно увеличивать. Делать это можно до того момента, пока ребенок не начнет чувствовать вибрацию. По окончании процедуры проходит усталость глаз, улучшается кровообращение и обменные процессы в тканях зрительных органов.

Воздействие тока на глаза ребенка длится не более 10 минут. Обычно курс состоит из 10-15 процедур. В некоторых случаях ребенку могут быть назначены 20 сеансов, но такое бывает редко. П

Руководство по поиску и устранению неисправностей электрофореза нуклеиновой кислоты | Thermo Fisher Scientific

Руководство по поиску и устранению неисправностей при электрофорезе нуклеиновых кислот | Thermo Fisher Scientific

Методы: электрофорез

Методы: электрофорез

23.04.2006

В предыдущей лабораторной работе мы обсуждали движение частицы
в жидкой среде, где осаждающая сила была гравитационным притяжением (на
текущая жидкость), а противодействующая сила была силой трения, пропорциональной
скорость частицы.Эти силы действуют в противоположных направлениях и в конечном итоге уравновешивают
друг друга, приводя к равномерному движению частицы в подвижной жидкой среде
(т.е. частица движется с постоянной скоростью). Если внешнее поле — электрическое поле
вместо гравитационного поля макромолекула будет реагировать двумя способами.
внешнее поле. Если молекула заряжена, она будет мигрировать в электрическом поле в
электрод противоположного заряда. Это принцип, лежащий в основе техники
электрофорез.Если макромолекула имеет асимметричное распределение заряда (т.е.
постоянный дипольный момент), молекула будет стремиться ориентироваться в электрическом поле. Этот
Принцип лежит в основе методов электрического двулучепреломления и дихроизма.
Мы обсудим только электрофорез.

Рассмотрим простой случай, когда заряженная частица (+ Q) движется
в электрическом поле (E) в непроводящей среде, такой как вода. Если частица
движется с постоянной скоростью к катоду (- электроду), результирующая сила F _до
на частице равно 0 (поскольку F = ma, а ускорение (a) частицы равно 0 при
постоянная скорость).На частицу действуют две силы: одна F _E , сила
воздействует на заряженную частицу полем в направлении движения
(по направлению к катоду), а другой, F _f , сила трения на заряженном
частица, которая замедляет свое движение к катоду и, следовательно, находится в направлении
против движения (к анодному (+) электроду). Это показано на схеме
ниже:

Следовательно:

(1) F _до = F _e + F _f = 0,
где
(2) F _e = QE (электрическая сила) и
(3) F _f = -fv (сила трения),

где v — скорость частицы, а f — константа, называемая фрикционной.
коэффициент.Уравнение (3) показывает, что сила F _f , препятствующая движению в направлении
катод пропорционален скорости частицы. Это интуитивно понятно, поскольку можно
ожидайте, что чем выше скорость, тем больше у F _f , что будет препятствовать
движение. Коэффициент трения зависит от размера и формы молекулы. В
чем больше молекула, тем больше коэффициент трения (т.е. больше сопротивление движению
молекулы). Можно показать, что коэффициент трения для сферической частицы
дается формулой

(4) f = 6πηR _s ,

, где η —
вязкость (мера сопротивления течению жидкости — вода имеет низкую вязкость, реальную
кленовый сироп высокой вязкости), а R _s (радиус Стокса) — радиус
гидратная сфера (чем больше R _s , тем больше коэффициент трения, тем
больше F _f , который сопротивляется движению к катоду).Из (1), (2) и (3),
F _e = F _f или

(5) QE = fv.

Следовательно, v / E = Q / f = U = электрофоретическая подвижность, или

(6) U = v / E = Q / 6πηR _s .

Следовательно, электрофоретическая подвижность U равна
пропорциональна плотности заряда (заряд / размер, Q / R _s ) частицы.
Таким образом, электрофорезом можно разделить макромолекулы с разной плотностью заряда. Этот
обсуждение касается простейшего случая, так как в действительности в
раствор (из солей), который образует облако вокруг заряженной макромолекулы, и
частично экранировать заряженную частицу от электрического поля E.

Современный электрофорез проводят в твердых гелях (например,
как полиакриламид), которые образуются из жидких растворов акриламида после добавления
полимеризующего агента. Твердый гель пористый для растворенных веществ и молекул растворителя и
служит средой для электрофореза, помогая устранить силы конвекции в
жидкость, которая может помешать разделению. Электрофоретический эксперимент был
проводились на космическом шаттле в условиях невесомости с целью предотвращения таких
возмущения.

Одна сложность, которая влияет на это идеализированное описание
электрофорез в полиакриламидных гелях заключается в том, что гели имеют поры, через которые
макромолекулы движутся. Как и в гель-хроматографии, более мелкие молекулы могут проходить через
поры легче, чем более крупные молекулы, поэтому существует дополнительный механизм просеивания, который
способствует эффективной подвижности (кроме того, гель может изменять локальные
эффективное электрическое поле). Просеивающий эффект геля фактически увеличивает разрешающую способность.
сила этой техники.

Было установлено, что действительный электрофоретический
подвижность белка, U, является функцией подвижности белка в концентрированном
раствор сахарозы (Uo) и T, общая концентрация акриламида в полимеризованном
гель. Чем выше концентрация акриламида в растворе неполимеризованного геля, тем
меньший размер пор в полимеризованном геле. Уравнение, показывающее взаимосвязь
между U, Uo и T показано ниже:

log U = log Uo — K _r T,

где K _r — наклон графика log U против T для данного белка.Так как K _r
является функцией радиуса молекулы, можно определить молекулярную
веса белковой молекулы путем проведения нескольких электрофоретических разделений в гелях
различные концентрации акриламида (T) и экстраполяция результатов на T = 0, следовательно,
устранение эффектов размера пор. Однако проблемы возникают, если белки не сфероидальные.
в форме

Есть ли способ получить информацию о молекулярной массе в
в дополнение к определению чистоты на одном геле ?.Что было бы, если бы два разных
белки, каждый с одинаковой молекулярной массой и общим чистым зарядом, но разной формы,
запускались на одном акриламидном геле? Тот, имеющий более вытянутую форму (большие Стокса
радиус) будет иметь более низкую электрофоретическую подвижность (U = Q / 6πηR _s ). А
более высокие значения Rs также могут вызвать более медленное проникновение белка в поры. Следовательно, оба
электрофоретическая подвижность и просеивающие эффекты могут вызвать аномальную работу этого белка
медленные и имеют более высокую кажущуюся молекулярную массу.Также представьте себе два глобулярных белка
разного размера, но с разницей в компенсационном заряде, что может позволить двум белкам
мигрировать с той же скоростью в геле.

Обычный метод, используемый для упрощения интерпретации
Электрофоретические прогоны в одном геле предназначены для прогона геля в денатурирующих условиях. В
денатурирующий агент обычно представляет собой додецилсульфат натрия (SDS), который является ионным детергентом.
со структурой CH ₃ (CH ₂ ) ₁₀ CH ₂ OSO ₃ ^—
(амфифил с одной цепью).Этот детергент связывается с большинством белков и денатурирует их,
около 1,4 г связывания SDS / г белка (около 1 SDS / 2 аминокислоты). Поскольку есть 1
отрицательный заряд / SDS, связывание SDS маскирует любой из зарядов на белке и дает
все белки имеют общий большой отрицательный заряд. Дополнительно , комплексы SDS-белки
было показано, что в целом они имеют удлиненную цилиндрическую форму. Поскольку сумма
SDS, связанный на единицу массы белка, постоянен, общая плотность заряда на всех белках
аналогична, поэтому электрофоретическая подвижность определяется только эффектами просеивания.SDS
также устраняет различия в форме белков в качестве переменной, определяющей просеивание,
поскольку все белки имеют одинаковую стержневидную форму. (Использование SDS аналогично
использование 8M мочевины в гель-хроматографическом разделении белков для определения
молекулярные массы). Подвижность становится только функцией молекулярной массы
белок, а не форму. Молекулярная масса неизвестного белка может быть определена с помощью
сравнение положения белка на полиакриламидном геле SDS с рядом известных
стандарты молекулярной массы, из которых можно построить линейный график зависимости ln Mr от R _f .
используется для расчета неизвестной молекулярной массы.Это похоже на анализ в геле.
хроматографии, где ln Mr является линейной функцией K _avg , распределение
коэффициент, когда гель работает в денатурирующих условиях. Однако некоторые белки работают
аномально на таких гелях (из-за неполного или избыточного связывания SDS), поэтому альтернатива
вместе с этим следует использовать методы определения молекулярной массы.
техника.

Белки обычно нагревают в SDS до 100 ^o C для
3 минуты в присутствии восстановителя, такого как b-меркаптоэтанол, до полного
денатурировать белок до белка в форме палочки.Видимая молекулярная масса может быть получена
в невосстанавливающих условиях (без b-ME), но их следует считать просто
оценки. Бегущие белки как в присутствии, так и в отсутствие восстановителя могут
предоставляют важную информацию о субъединичной структуре белка. Мультимерный белок
субъединицы которого удерживаются вместе дисульфидными связями, могут быть разделены на отдельные
компоненты при добавлении восстановителя. Если подразделения удерживаются вместе
нековалентные межмолекулярные притяжения, белки будут работать одинаково под
денатурирующие условия (SDS), которые устраняют взаимодействия субъединиц, в присутствии или
отсутствие b-ME.Чтобы определить субъединичный состав белка, удерживаемого вместе
нековалентных взаимодействий, электрофорез следует проводить в отсутствие
денатурирующие агенты.

Примечание: номенклатура электродов может сбивать с толку некоторые из
вы. Как упоминалось выше, катионы движутся к катоду (где восстановление
происходит), поэтому катод должен быть отрицательным. Точно так же анион движется к
анод (где происходит окисление), поэтому анод должен быть положительным. Это
противоположно тому, что вы могли бы вспомнить из общей или аналитической химии, когда
Вы обсуждали в первую очередь гальванические элементы.В гальванических элементах электрический
ток генерируется спонтанным набором окислительно-восстановительных полуреакций. Мы
имеют дело с электролитическими ячейками, например, при электролизе воды (2H ₂ O (l)
-> 2H ₂ (г) + O ₂ (г)) или в продуктах Cl ₂ (г)
и Mg (ов) из водного электролита MgCl ₂ (водн.). В
электролитические ячейки, источник питания должен подавать ток для управления
неспонтанные (термодинамически неблагоприятные) реакции, такие как описанные выше.
Посмотрите на обзорный рисунок ниже.

ТЕХНИКА

В этой лаборатории вы установите SDS-полиакриламидный гель, нанесите
белков, хроматографически разделенных в предыдущей лаборатории, и выполнить
электрофорез. Результаты этой лаборатории должны помочь вам решить, какие белки элюируются в
различные фракции из экспериментов G50 и ионного обмена. Кроме того, вам следует
уметь определять субъединичный состав белков.

Полимеризация и заливка геля:

Электрофорез выполняется в пористой, но твердой среде,
для устранения любых проблем, связанных с конвекционными токами. Такие медиа формируются из
полимеризация жидкого раствора агарозы (используется в основном для электрофореза ДНК
фрагменты и очень большие белки) или акриламид. Полимеризация акриламида идет
инициируется добавлением персульфата аммония в присутствии тетраметилендиамина
(ТЕМЕД), наряду с димером акриламида (N, N’-метилен-бис (акриламид), связанным
ковалентно между амидными атомами азота акриламидов по метиленовой группе.В
Структура этих соединений показана ниже:

Свободнорадикальная полимеризация акриламида
инициируется добавлением персульфата аммония, который при растворении в воде образует свободный
радикалы, как показано ниже:

Радикал инициирует полимеризацию акриламида, как показано
ниже. ТЕМЕД, благодаря своей способности существовать как свободный радикал, действует как дополнительный
катализатор полимеризации.Однако жесткий гель образуется только тогда, когда
N, N’-метилен-бис (акриламид добавляется к смеси во время полимеризации, что
сшивает соседние полимеры акриламида, как показано ниже:

Количество бис, добавленного во время полимеризации, контролирует
степень сшивки и, следовательно, размер пор полимеризованного геля. Эффект
размер пор ПРОТИВ размера пор в гель-хроматографии. В обоих случаях большие белки
трудно проникнуть в поры.В гель-хроматографии большое разделение белков
предпочтительно в подвижную жидкую фазу (объем пустот) и элюируются максимально БЫСТРО
из колонки. При электрофорезе большие белки, которые не могут легко проникнуть в поры
в геле, не так легко переносятся электрическим полем через гель и элюируются
самый МЕДЛЕННО . Размер пор нельзя контролировать так точно, как при изготовлении
смолы для гель-хроматографии.

Как белки перемещаются через гель? Вязкий белок
раствор накладывается на верхнюю часть геля в небольшой лунке, впрессованной в гель во время
процесс полимеризации.Нижняя и верхняя части геля вставляются в резервуары.
содержащий буферный раствор и соответствующий электрод. Электрическое поле равно
наносится, и белки мигрируют через гидратированный гель. Природа буфера
раствор в резервуаре и в полимеризованном геле важен. Компоненты
буфер не должен связываться с разделяемыми белками. Кроме того, pH среды
должны быть такими, чтобы белки имели соответствующий заряд, поэтому они будут мигрировать в
ожидаемое направление.

Прерывистый гель-электрофорез:

Обычно используется множество разновидностей электрофореза.
Гели можно полимеризовать в пробирках или пластинах, а также в присутствии или в отсутствие денатурирования.
агенты. Кроме того, данная плита может состоять из двух отдельных плит, полимеризованных одна на
друг над другом, каждый с разной концентрацией акриламида и pH. Этот тип
называется прерывистым рН-гель-электрофорезом или дисковым электрофорезом.Мы будем использовать это
техника в сегодняшней лаборатории. Два различных геля для измерения pH и концентрации акриламида (
укладочный гель и бегущий гель) показаны на рисунке ниже.

Укладочный гель представляет собой акриламид низкой концентрации (2-4%).
полимеризуется в буферном растворе Трис HCl (pH 6,5) на две единицы pH ниже, чем используется в
текущий гель и нижний резервуар (буфер Tris HCl, pH 8,7). Нижний или беговой гель
концентрация акриламида колеблется от 7-15% в зависимости от молекулярной массы
белки, подлежащие разделению.Верхний буферный резервуар содержит Трис, забуференный слабым
кислоты, такой как глицин (pKa2 = 9,6), до того же pH, что и текущий гель.

Каковы преимущества разрешения прерывистого pH?
гелевая система? Основное преимущество заключается в том, что белки быстро подвергаются электрофорезу через
укладывать гель и «складывать» на границе между двумя гелями, прежде чем они
ввести гели. Это увеличивает компактность белков до того, как они попадут в
работает гель и увеличивает разрешение.Как работает этот процесс укладки? Когда
начинается электрофорез, ионы глицина из верхнего резервуара (при pH 8,7) поступают в
стекирующий гель, поскольку при таком pH они имеют средний частичный отрицательный заряд. Укладка
ионы гелевого буфера продолжают движение в геле для укладки, но когда ионы глицина попадают в
pH 6,5 стекирующего геля они становятся цвиттерионами с нулевым чистым зарядом и, следовательно,
прекратить движение к аноду. Затем электрическое сопротивление в геле для укладки увеличивается.
поскольку количество ионов, движущихся через гель для укладки, уменьшается.Для поддержания постоянного
ток во всей цепи, будет локализованное увеличение напряжения в
укладывающий гель (из закона Ома, V = iR). Это вызовет миграцию белков
быстро и все складывается в один очень тонкий диск сразу за ионами Cl- в
штабелирующий гель (которые находятся спереди, потому что у них самая высокая плотность заряда и
электрофоретическая подвижность любого иона в стопочном геле). Белки не пройдут
Cl-, поскольку, если бы они это сделали, они немедленно замедлились бы, так как они больше не будут
в области уменьшенных носителей заряда и более высокого напряжения.При укладке геля / бега
гелевый интерфейс, белки не могут мигрировать с одинаковой скоростью из-за эффектов просеивания
более концентрированного геля, и, следовательно, будет отделен в текущем геле. Глицин
в конечном итоге попадает в текущий гель, принимает полностью заряженное состояние при этом pH (8,7), будет
пропускают белки и восстанавливают дефицит заряда, возникший в геле для укладки.

Анимация полиакриламида
Гель-электрофорез

Java-апплет: белок
Электрофорез

Обнаружение белков в геле:

Большинство белков не поглощают видимые длины волн света,
и, следовательно, не будет виден во время электрофореза.Чтобы гарантировать, что
белки не элюируются из геля в нижний буферный резервуар, небольшой молекулярный
вес, анионный краситель, бромфеноловый синий добавляется к белку перед его помещением на
гель. Электрофорез останавливают, когда краситель достигает конца текущего геля.
Сборку геля удаляют из камеры для электрофореза, стеклянные пластины разделяют,
и гель смыли серией растворов с целью придания полосатости
белки, видимые глазу.

В настоящее время используется несколько методов. Наиболее распространенным является
для окрашивания геля кумасси синим, растворенного в растворе метанол / уксусная кислота. В качестве
обнаруженный во второй лаборатории, белки связывают кумасси синий с сопутствующим спектральным сдвигом в
абсорбционные свойства связанного красителя. Метанол и уксусная кислота в красителе
раствор также помогает «закрепить» белок в геле и предотвратить его диффузию.
в раствор. После окрашивания геля фоновое пятно в геле удаляется.
с уксусной кислотой / метанолом, оставляя полосы белка синего цвета.Опять же, примечание
Внимание: некоторые белки не окрашиваются кумасси синим. Еще одно распространенное окрашивание
метод включает окрашивание серебром, которое включает восстановление Ag (I) до элементарного
серебро и его отложение белком в соответствующих реакционных растворах, как в
фотографический процесс. (Помните, что в анализе BCA пептидные связи восстанавливают Cu (II) до Cu (I),
который хелатирован с BCA.) Требуется раствор проявителя и закрепителя. Эта техника
В 10-50 раз чувствительнее, чем окрашивание кумасси синим.Преэлектрофорез
флуоресцентная или радиоактивная модификация белков позволяет еще больше
чувствительность. После
электрофорез радиоактивно меченного белка, гель можно высушить и покрыть рентгеновским излучением
пленка на период до нескольких месяцев, если необходимо, чтобы обеспечить достаточную экспозицию пленки
белком низкой концентрации. Эта техника визуализации называется
авторадиография.

Рисунок: SDS PAGE Гель со стандартами MW

фрагментов ДНК обычно разделяют на горизонтальном агарозном геле.
системы, которые заливать намного проще.

Рисунок: фрагменты ДНК, разделенные на агарозном геле

Варианты гель-электрофореза:

Изоэлектрическая фокусировка : В этом методе градиент pH
устанавливается в полиакриламидном геле. Это достигается путем предварительного электрофореза серии
низкомолекулярных молекул, содержащих амино и карбоксильные группы, называемых амфолитами.
Под воздействием электрического поля наиболее отрицательные виды будут концентрироваться в
анод, в то время как наиболее положительный будет концентрироваться к катоду.Остальное
амфолиты будут перемещаться между ними, в результате чего амфолиты мигрируют
до их изоэлектрической точки и установите линейный градиент pH в геле. Применяемый белок
гель будет мигрировать до pH, соответствующего его изоэлектрической точке, и остановится.

2D-электрофорез : Обычно он включает
белков для изоэлектрического фокусирующего электрофореза в полиакриламидном геле, отлитом в узкой
цилиндрическая трубка.После этого электрофореза гель из пробирки удаляется и помещается на верхнюю часть
укладывают гель и подвергают электрофорезу в SDS-полиакриламидном геле в направлении 90o
из начального эксперимента по изоэлектрической фокусировке. Если белки были получены из клеток
с маркировкой ³⁵ Met,
представляющие уникальные белки могут быть
полученные из данной популяции клеток.

Рисунок: 2D-гель

Вестерн-блоттинг: После стандартного электрофореза на SDS-пластинах
После проведения эксперимента гель покрывают кусочком нитроцеллюлозной фильтровальной бумаги.В
сэндвич из геля и фильтровальной бумаги помещают обратно в камеру для электрофореза так, чтобы
белки мигрируют из геля в нитроцеллюлозу, где они необратимо связываются.
Фильтровальную бумагу можно удалить и смочить в растворе, содержащем специфические антитела к
представляющий интерес белок на нитроцеллюлозе. Этот комплекс белок-антитело на фильтре
бумагу затем можно обнаружить, добавив флуоресцентно-меченное антитело, которое связывается с первым
антитело, например.

Рисунок: гель SDS PAGE и вестерн-блот для обнаружения CKK47

Рисунок: Обнаружение в Вестерн-блоттинге

Капиллярный электрофорез;

Обзор многих методик
очищений белка, которые мы изучаем в лаборатории.

ВИКТОРИНЫ ПО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

ВЫСОТА = «200»>

ВЫСОТА = «200»>

ВЫСОТА = «200»>

ВЫСОТА = «200»>

ВЫСОТА = «200»>

ВЫСОТА = «200»>

ВЫСОТА = «200»>

ВЫСОТА = «200»>

ВЫСОТА = «200»>

HEIGHT = «200»>

Оптимизированный протокол для анализа сдвига электрофоретической подвижности с использованием меченных инфракрасным флуоресцентным красителем олигонуклеотидов

EMSA используются для анализа взаимодействий между ДНК и белками с использованием нативных гелевых полиакрилатов. (PAGE) для разделения смеси представляющего интерес белка и меченого ДНК-зонда, содержащего потенциальные сайты-мишени белка ¹ .ДНК-зонд, связанный с белком, будет мигрировать медленнее, чем свободный ДНК-зонд, и поэтому его миграция через полиакриламидную матрицу замедляется. Мечение ДНК с помощью ³² P было преобладающим методом обнаружения в EMSA. Хотя применение радиоактивной метки в биохимических исследованиях было полезным, методы альтернативной маркировки ДНК с сопоставимой чувствительностью используются из-за рисков для здоровья и безопасности, связанных с обращением с радиоактивностью.Эти альтернативные методы включают конъюгацию ДНК с биотином ² или дигоксигенином (DIG) ³ (оба из которых затем обнаруживаются хемилюминесцентными системами), окрашивание SYBR зеленым гелей PAGE ⁴ или прямое обнаружение ДНК-флуоресцентных конъюгаты красителей путем сканирования геля ^5,6 .

Разрешенные гели EMSA с использованием радиоактивно меченных ДНК-зондов требуют последующей обработки с помощью рентгенографических пленок или системы фосфорного визуализации для обнаружения радиоактивных сигналов ^1,7 .Гели EMSA с использованием биотин- ² или DIG-конъюгированных ³ ДНК-зондов также должны быть обработаны и перенесены на подходящую мембрану, а затем обнаружены с помощью хемилюминесценции ⁶ . Окрашивание геля зеленым SYBR требует окрашивания геля после прогона и флуоресцентного сканера ⁴ . Поскольку этапы обработки геля после прогона требуются для EMSA с использованием этих методов маркировки ДНК, растворенный гель можно анализировать только один раз. Напротив, ДНК-зонды, меченные флуорофорами, могут быть непосредственно обнаружены в геле внутри стеклянных пластин с помощью сканера.Следовательно, взаимодействия ДНК-белок можно отслеживать и анализировать несколько раз в разные моменты времени во время цикла, что значительно сокращает время и затраты. Конъюгаты ДНК-флуоресцентный краситель, которые использовались для EMSA, включают Cy3 ^6,8 , Cy5 ^6,8 , флуоресцеин ⁹ и инфракрасные флуоресцентные красители ^4-6 .

Регуляция транскрипции требует белок-ДНК взаимодействий факторов транскрипции и их генов-мишеней. Координация этих взаимодействий генерирует различные типы клеток от общего предка во время развития животных.Беспристрастный прямой генетический скрининг выявил миссенс-мутацию, G73E, в высококонсервативном ДНК-связывающем домене HMG транскрипционного фактора SOX-2 Caenorhabditis elegans . Мутация приводит к трансформации обонятельных нейронов AWB в обонятельные нейроны AWC на ​​молекулярном, морфологическом и функциональном уровнях ^5,10 . SOX-2 по-разному регулирует терминальную дифференцировку нейронов AWB и AWC путем взаимодействия с контекстно-зависимыми партнерскими факторами транскрипции и соответствующими сайтами-мишенями ДНК ^5,10 .SOX-2 партнерство с LIM-4 (LHX) в терминальной дифференцировке нейронов AWB, тогда как SOX-2 партнерство с CEH-36 (OTX / OTD) в терминальной дифференцировке нейронов AWC . Анализы репортерной люциферазы показывают, что белки SOX-2 и мутантные белки SOX-2 ^G73E кооперативно взаимодействуют с транскрипционными кофакторами LIM-4 и CEH-36, чтобы активировать промотор, экспрессируемый в нейронах AWB и AWC. Однако SOX-2 и мутант SOX-2 ^G73E проявляли свойства дифференциальной активации промотора.Чтобы исследовать молекулярные основы дифференциальной активности связывания ДНК SOX-2 и SOX-2 ^G73E , были выполнены fEMSA с этими белками и их потенциальными сайтами-мишенями.

Во-первых, был применен биоинформатический подход для идентификации биологически релевантных ДНК-связывающих последовательностей в промоторной области размером 1 т.п.н., используемой в анализе люциферазы. Поскольку в промоторе присутствовало множество потенциальных сайтов связывания SOX-2, мы сосредоточились на предсказанных сайтах связывания SOX-2, соседних с предполагаемыми сайтами связывания CEH-36 или LIM-4 и эволюционно консервативных у различных видов нематод.Эти последовательности были удалены или мутированы, а затем протестирован in vivo на их активность по экспрессии репортерных трансгенов GFP в нейронах AWB или AWC. С помощью этого подхода мы идентифицировали потенциальные LIM-4 / SOX-2 и CEH-36 / SOX-2 соседние сайты-мишени, которые специфически необходимы для экспрессии GFP в нейронах AWB и AWC, соответственно ⁵ . Мы исследовали потенциальные различия в связывании ДНК SOX-2 и SOX-2 ^G73E с использованием fEMSA с идентифицированными LIM-4 / SOX-2 и CEH-36 / SOX-2 соседними сайтами-мишенями.Наш анализ EMSA показал, что SOX-2 ^G73E не связывает ДНК-зонд, содержащий соседние сайты-мишени LIM-4 / SOX-2 (необходимые для экспрессии гена в AWB), так же эффективно, как WT SOX-2. Однако SOX-2 и SOX-2 ^G73E не имели разницы в связывании ДНК-зонда, содержащего соседний целевой сайт CEH-36 / SOX-2 (необходимый для экспрессии гена в AWC) ^5,10 . Наши анализы fEMSA предоставляют механистическое понимание природы мутации SOX-2 ^G73E , влияющей на специфическую активность связывания ДНК для фенотипа трансформации идентичности клеток AWB в AWC.Здесь мы описываем оптимизированный протокол fEMSA с использованием очищенного 6xHis-SOX-2 или 6xHis-SOX-2 ^G73E вместе с ДНК-зондами, меченными инфракрасным флуоресцентным красителем, содержащими соседние целевые сайты LIM-4 / SOX-2 в качестве тематического исследования. для решения важного биологического вопроса.

Требуется подписка. Пожалуйста, порекомендуйте JoVE своему библиотекарю.

электрофорез — французский перевод — Linguee