Проведение электрофореза: Лекарственный электрофорез

Алгоритм действий м/с при выполнении процедуры гальванизации

1. Ознакомиться
   с назначением врача Ф. – 044;

2. Зафиксировать
   процедуру в журнале, сделать отметку
   в карте Ф. – 044;

3. Предложить
   пациенту пройти в кабинет, обнажить
   нужный участок тела, лечь на кушетку;

4. Осмотреть
   целостность кожных покровов;

5. Берутся
   нужные прокладки, смачиваются теплой
   водой под краном, отжимаются, кладутся
   на тело;

6. Сверху
   электроды;

7. Выбирается
   средство фиксации;

8. Электроды
   подсоединяются к клеммам аппарата
   «Поток – 1»;

9. Пациент
   укрывается простыней;

10. М/с
    объясняет пациенту ощущения во время
    процедуры;

11. Включается
    аппарат, зажигается сигнальная лампочка;

12. Проверяется
    положение шунта 5 или 50 мА:

I
для головы и для ребенка до 7 лет

II
положение для тела взрослого;

13. Включается
    ток, поворачивая руку потенциометра
    по часовой стрелке;

14. Ток
    выводят до ощущения легкого жжения или
    покалывания;

15. Включают
    процедурные часы на 15 – 30 минут по
    назначению врача;

16. После
    процедуры ручку потенциометра
    поворачивают влево. Стрелка миллиампера
    возвращается к 0;

17. Отключают
    аппарат;

18. Снимают
    прокладки, полощут под краном, отжимают,
    вешают на леску, промаркированную + и
    –;

19. В
    конце смены прокладки кипятятся в
    стерилизаторе + и – раздельно.

21. Приготовить пациента к процедуре лекарственного электрофореза. Построить схему действия м/с при проведении процедуры.

Электрофорез
– это метод введения лекарственного
вещества в организм человека с помощью
постоянного тока малой силы и низкого
напряжения. Процедура отпускается с
помощью аппаратов: Поток – 1, 2, АГН.

• На
  процедуру необходимо прийти отдохнувшим,
  не ранее 40 минут после завтрак и 1,5 час
  после обеда;

• При
  себе иметь личную простыню или пеленку;

• Процедура
  выполняется на обнаженном теле;

• Ощущение
  пациента – легкое жжение и покалывание;

• При
  появлении сильного жжения позвать м/с;

• Самому
  регулировать силу тока нельзя;

• После
  процедуры необходим отдых в течении
  20 – 30 минут.

Алгоритм действия

1. Ознакомиться
   с назначением врача Ф. – 044;

2. Зафиксировать
   процедуру в журнале *;

3. Сделать
   отметку в карте Ф. – 044;

4. Посмотреть
   с какого полюса вводится заданное
   лекарственное вещество;

5. Предложить
   пациенту пройти в кабину, раздеться,
   обнажить нужный участок тела, лечь на
   кушетку;

6. Осмотреть
   целостность кожных покровов;

7. Взять
   фильтровальную бумагу, налить на нее
   разовую дозу лекарственного вещества,
   положить на тело;

8. Взять
   прокладки, смочить теплой водой под
   краном, положить поверх фильтровальной
   бумаги;

9. Сверху
   электроды;

10. Выбирается
    средство фиксации;

11. Подсоединить
    электроды к клеммам аппарата «Поток –
    1» согласно полярности вводимого
    лекарственного вещества;

12. Пациент
    укрывается простыней, инструктируется
    об ощущениях;

13. Включается
    аппарат, загорается сигнальная лампочка;

14. Нажимают
    кнопку шунта:

5
мА для головы и для ребенка до 7 лет

50
мА для проведения процедуры на теле
взрослого;

15. Поворачивают
    ручку потенциометра по часовой стрелке,
    выводя ток по ощущениям пациента;

16. Включают
    процедурные часы;

17. После
    окончания процедуры отключают аппарат,
    снимают электроды, прокладки.
    Фильтровальная бумага выбрасывается
    в корзину. Прокладки промываются,
    сушатся на леске. В конце смены кипятятся
    в стерилизаторе + и – раздельно.

Аппарат для гальванизации и проведения электрофореза Поток-1

Аппарат «ПОТОК» предназначен для лечения различных нервно-мышечных заболеваний и болевых состояний со спазмами мышц, заболеваний опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, женских половых органов, а также для воздействия постоянным током на организм человека с лечебными и профилактическими целями и проведения электрофореза в лечебных и оздоровительных учреждениях различного профиля.

            Метод гальванизации заключается в воздействии на ту или иную область организма постоянным током относительно небольшой силы. Ток от источника подводится к месту воздействия с помощью проводов и электродов, накладываемых на поверхность тела. Движение в растворах, под действием электрически заряженных частиц используется в электротерапии для введения в организм лекарственных веществ.

Гальванизация стимулирует регуляторную функцию нервной и эндокринной систем, способствует нормализации секреторной и моторной функций органов пищеварения, стимулирует трофичес­кие и энергетические процессы в организме, повышает реактив­ность организма, устойчивость к внешним воздействиям, в частно­сти, повышает защитные функции кожи.

К достоинствам аппарата «ПОТОК»   относится следующее:

• Аппарат выполнен  на современной  элементной базе, позволяющей реализовать более полное и точное исполнение заданных функций;
• Аппарат снабжен электронным защитным устройством, позволяющим производить установку тока в цепи пациента плавно с минимальной величины;
• В аппарате имеется встроенный таймер, что  упрощает контроль времени выполнения процедуры. По истечении установленного времени выполнение процедуры прекращается и подается звуковой сигнал;
• В аппарате предусмотрена цифровая индикация величины выходного тока с плавной  регулировкой;
• Расширенный набор электродов различных форм и размеров с мягкими  (в силиконовой изоляции) проводами;
• Аппарат имеет современный дизайн и эргономичную форму;
• Прост и удобен в эксплуатации.

            В комплект поставки аппарата входит: электроды физиотерапевтические с токопроводящей  углеродной тканью прямоугольные: (30х60 мм, 50х70 мм, 60х100 мм, 80х120 мм, 100х150 мм, 120х170 мм) — 2 шт, кабель пациента  – 1 шт, вставка плавкая — 2 шт, паспорт.

Рецензии

Еще нет отзывов об этом товаре.

Записаться на электрофорез в Ростове.

Воздействие электрофореза на человеческий организм

Под воздействием непрерывного тока с низким напряжением и низкой постоянной интенсивностью повышается чувствительность тканей. После того как лекарство проникает в неглубокие слои кожи, оно через микрососуды попадает в кровоток и в лимфу. При этом одновременно создается оптимальная концентрация лекарственного препарата непосредственно в патологическом очаге, то есть осуществляется его целенаправленное продолжительное действие. Очень важно, что благодаря этому не страдает слизистая оболочка пищеварительного тракта. Гальванический ток, оказывая биологическое и терапевтическое действия, улучшает микроциркуляцию, устраняет отечность и болевой синдром, активизирует защитные силы организма, вызывает расслабление скелетной мускулатуры, ускоряет регенеративные процессы и выздоровление.

Показания к проведению электрофореза

• Болезни опорно-двигательного аппарата.
• Заболевания центральной и периферической нервной системы.
• Гинекологические патологии.
• Болезни дыхательной системы и лор-органов.
• Кожные заболевания.
• Сердечно-сосудистые нарушения.
• Мочеполовые патологии и др.

Противопоказания

• Непереносимость электрического тока.
• Острые инфекционные заболевания.
• Злокачественные новообразования.
• Гипертермия (высокая температура тела).
• Болезни крови.
• Нарушения психики.
• Общее тяжелое состояние пациента.

Электрофорез в клинике «Юнона»

В физиотерапевтическом отделении медицинского центра «Юнона» при проведении лечебно-профилактического воздействия постоянным током используется современный гальванизатор «Поток» и многофункциональный аппарат «Рефтон». Процедуры электрофореза, осуществляемые на данных устройствах, отличаются практически полной безболезненностью и выраженным лечебным эффектом. Стоимость услуг по направлению «лекарственный электрофорез» в Ростове на Дону указана в разделе «Цены / физиотерапевтические процедуры».

Что нужно знать при проведении электрофореза на дому

Электрофорез представляет собой безболезненную процедуру, направленную на оздоровление организма. Врачи назначают его по самым разным причинам. Так, например, он показан после переломов, больным астмой или бронхитом, а также людям с различными заболеваниями опорно-двигательного аппарата.

Эффект от электрофореза проявляется только в том случае, если больной пройдет полный курс лечения без перерывов и пропусков процедур. И в этом заключается самая большая сложность. Посещать манипуляционный кабинет каждый день на протяжении 10-14 дней достаточно сложно. Тем более, что после процедуры больному желательно находиться в покое, а не ездить в общественном транспорте или передвигаться пешком по городу. Поэтому электрофорез стоит проводить дома. Но как это сделать самостоятельно?

Особенности процедуры

В целом проведение электрофореза – это достаточно просто. Все, что нужно – это взять направление у врача, приобрести необходимые медикаменты и посетить манипуляционный кабинет в больнице. Там следует уточнить дозировку препаратов, длительность процедуры и точки, в которых следует размещать электроды. Чтобы описанный процесс был понятнее, приведем простой пример.

Допустим, врач поставил четырехмесячному малышу диагноз «дисплазия тазобедренных суставов». Это заболевание, которое проявляется в недостаточном развитии костей таза. Если его не лечить, ребенок в дальнейшем останется инвалидом и будет хромать всю жизнь. Электрофорез обязательно показан при таком заболевании. Для его проведения в этом случае необходим раствор кальция хлорида с дистиллированной водой. Этим раствором смачивают тряпичную прокладку, которая надевается на электроды аппарата и прикладывается к бедрам с двух сторон.

Чтобы провести процедуру самостоятельно, нужно приложить электроды в прокладке, зафиксировать их с помощью эластичного бинта и включить аппарат для электрофореза на 5 минут на указанную врачом мощность. Полный курс лечения позволит с помощью этой процедуры укрепить кости таза и избежать инвалидности.

Аналогичным образом лечатся и другие заболевания. Обратите внимание на фотографию ниже. На ней изображена процедура электрофореза, назначенная для лечения межпозвоночной грыжи. В зависимости от особенностей заболевания пациента, при межпозвоночных грыжах курсы процедур назначают на 14 дней с длительностью процедуры 10-15 минут. Электрофорез не только эффективно лечит грыжи, но и снимает болевой синдром, позволяя двигаться без ограничений. По этой же причине его систематически назначают при артрозах, артритах и остеохондрозе.

Выбор прибора для электрофореза

Среди всех приборов для электрофореза, которые есть в продаже, стоит обратить внимание на аппарат ЭЛФОР. Он отличается от аналогов целым рядом преимуществ:

• Доступной ценой;
• Удобным и понятным управлением;
• Полной безопасностью (прибор не ударит током и не причинит боли даже при неправильном использовании).

ЭЛФОР – это эксклюзивная разработка инженерного центра НЕВОТОН. Аналогов этого аппарата на данный момент нет. Другие приборы для электрофореза работают на порядок хуже. Именно поэтому ЭЛФОР пользуется большой популярностью. Его используют по всей территории СНГ и в ряде европейских стран.

Аппарат производится только в инженерном центре НЕВОТОН и продается только у официальных представителей, например в интернет-магазине life7.ru. Заказывайте ЭЛФОР прямо сейчас, чтобы откладывать лечение и профилактику на потом.

В нашем интернет-магазине вы можете заказать Алмаг недорого.

Электрофорез с литием

Соли лития применялись еще в древности для лечения подагры и растворения почечных камней. При проведении электрофореза с литием при заболеваниях суставов было обнаружено усиление выработки коллагена, который идет на постройку хрящевой ткани больного. Он стимулирует регенеративные процессы, тем самым останавливает болезнь.   

Лечебное действие

• усиливает выработку  коллагена, который идет на постройку хрящевой ткани,

• регенеративное действие,

• стимулирует клеточный иммунитет,

• повышает функцию лимфоцитов,

• обладает антигистаминным действием.

Показания:

Имплантация золотых нитей в биологически активные точки, столь широко рекламируемая в косметологии и орто-травматологии — это все тот же биоинертный материал. В данном случае вместо лития используется золото. Золото, как и литий усиливает выработку коллагена, который идет на постройку хрящевой ткани.

Преимущество методики электрофореза литием заключается в отсутствии травматизации кожи, возможности сочетания лекарственного воздействия с другими препаратами. И самое главное — наличие металла в организме в виде пластин, золотых нитей является противопоказанием для всех электропроцедур.

Остеофиты, связанные с костным перерождением связок, являются главной причиной, из-за которой больные обращаются за медицинской помощью. На сегодняшний день многие специалисты с помощью мануальной терапии, массажа, лечебной физкультуры, хирургическим путем пытаются «разбить» эти костные разрастания, или хотя бы уменьшить их прогрессирование. К сожалению, эти воздействия малоэффективны.

В лечебно-восстановительном центре «ОДА» применяется уникальная методика для лечения остеофитов, разработанная в НИИ им. Бурденко, г. Москва. Это сочетанное введение Карипазима (папаина)  с хлористым литием. На курс требуется от 20 до 30 процедур электрофореза.

Вестерн-Блот

Содержание

— Введение
— Растворы
— Лизис образца
— Подготовка образца
— Проведение электрофореза
— Перенос белка из ПААГ на мембрану
— Окраска мембраны

Введение

Вестерн-блоттинг — аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце, разделенных путем электрофореза в полиариламидном геле. Далее белки из геля переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану, затем детектируют исследуемые белки с использованием антител, специфичных к конкретному белку и проявляют, используя вторичные антитела.

Растворы

Буфер для лизиса
Буфер NP-40
150 мМ NaCl
1,0% NP-40 (Tergitol® тип NP-40)
50 мМ Трис-HCl, pH 8,0
Ингибиторы протеаз

Sample буфер (x5) 
10% SDS
5% 2-меркаптоэтанол
50% глицерин
0,01% бромфеноловый синий
0,4 М Имидазол

Проверить pH и довести до pH 6,8

Разделяющий буфер (буфер нижнего, разделяющего геля)
400 мМ Трис-HCl
0,1% SDS
0,01% TEMED
0,1% персульфат натрия

Проверить pH и довести до pH 8,3

Буфер для переноса (полусухой)
16 мМ Трис-HCl
200 мМ Глицин
0,1% SDS
20% метанол

Проверить pH и довести до pH 8,3

Буфер для блокировки 
150 мМ NaCl
10 мМ Na₂HPO₄
3-5% обезжиренного сухого молока

Проверить pH и довести до pH 7,5

Буфер для промывки (PBST)
150 мМ NaCl
10 мМ Na₂HPO₄
0,2% Tween-20

Проверить pH и довести до pH 7,5

Лизис образца

Приготовление лизата из культуры клеток

1. Поместите емкость с клетками на лед и промойте клетки охлажденным раствором PBS.

2. Полностью удалите раствор  PBS, затем добавьте охлажденный буфер для лизиса (1 мл на 10⁷клеток/150 см²; 0,5 мл на 5×10⁶клеток/75 см²). 

3. Отделите клетки от пластика, затем аккуратно перенесите суспензию клеток в охлажденную пробирку для центрифугирования. 

4. Инкубируйте пробирку с суспензией при постоянном перемешивании в течение 30 минут при +4℃. 

5. Отцентрифугируйте суспензию при +4℃. Реккомедуемая стандартная скорость 12000 об/мин в течение 20 мин, однако эти параметры необходимо определять для конкретного эксперимента и типа клеток. 

6. Отберите полученный супернатант

Приготовление лизата из тканей 

1. Отделите часть исследуемой ткани, используя чистые инструменты.   

2. Поместите ткань в пробирку для центрифугирования. Добавьте в пробирку охлажденный буфер для лизиса (0,3 мл/5 мг ткани). Измельчите образец, использую гомогенизатор. Промойте лезвия гомогенизатора 0,2 мл охлажденным буфером для лизиса. Смыв добавьте к образцу. Избегайте излишнего разбавления образца. Минимальная концентрация при нагрузке составляет 0,1 мг/мл. Оптимальный диапазон — 1-5 мг/мл 

3. Инкубируйте пробирку с суспензией при постоянном перемешивании в течение 2 часов при +4℃ 

4. Отцентрифугируйте суспензию при 12000 об/мин в течение 20 минпри +4℃ 

5. Отберите полученный супернатант

Подготовка образца 

1. Определите концентрацию белка в полученных лизатах.  

2. Определите необходимое для нагрузки количество белка и добавьте к образцу 5X Sample буфер в 4 раза меньшем объеме.

Мы рекомендуем использовать восстановленные и денатурированные образцы

3. Для восстановления и денатурации образца его необходимо прокипятить в Sample буфере при +100℃ в течение 5 мин. 

Проведение электрофореза

Поместите одинаковые количества образцов и маркера молекулярных весов в лунки полиакриламидного геля. Нагрузка для лизата должна составлять 20-30 мкг общего содержания белка, нагрузка для чистого белка — 10-100 нг.  
Проведите электрофорез белков в полиакриламидном геле 

Возможно использование градиентных гелей

Перенос белка из ПААГ на мембрану

Для переноса можно использовать нитроцеллюлозную или PVDF мембрану. Активируйте PVDF мембрану предварительно вымочив ее в течение 1 минуты в метаноле. Перед проведением переноса, промойте ее в буфере для переноса. Мы рекомендуем использовать полусухой способ переноса белков на мембрану. Степень переноса белков на мембрану можно проверить, используя краску Ponceau S, перед блокировкой мембраны.

Подготовьте мембрану для переноса в соответствии с рисунком

Окраска мембраны 

1. Ополосните мембрану раствором PBS. 

2. Для блокировки мест неспецифического связывания проинкубируйте мембрану в буферном растворе для блокировки в течение ночи при +4℃ или в течение 40 минуту при +37℃ и постоянном перемешивании. 

3. Для отмывки мембраны проинкубируйте ее 3 раза в растворе PBST в течение 5 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании. 

4. Проведите инкубацию с антителами к исследуемому белку в растворе PBS в течение 40 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании.

5. Для отмывки мембраны проинкубируйте ее 3 раза в растворе PBST в течение 5 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании 

6. Проведите инкубацию мембраны с вторичными антивидовыми антителами (иммуноконъюгаты) в растворе PBS течение 40 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании. 

7. Промойте мембрану 5 раз в растворе PBST в течение 5 минут при +37℃ и постотоянном перемешивании. 

8. Для детекции связавшихся антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, рекомендуем использовать субстратный раствор DAB. 

Аппарат ЭЛФОР-портативный для гальванизации и проведения электрофореза

Аппарат ЭЛФОР-портативный для гальванизации и проведения электрофореза может использоваться для быстрого и эффективного снятия боли и лечебного воздействия при таких заболеваниях, как бронхит, радикулит, остеохондроз, вегетососудистая дистония, гипертония. Лекарственные вещества вводятся в организм с помощью воздействия гальванического тока, что способствует лучшему их восприятию.

Аппарат может использоваться при остеохондрозе, вегето-сосудистой дистонии, гипертонии I и II стадии, бронхите и бронхиальной астме, последствиях травм (переломов, ушибов, растяжений), артрите, полиартрите, артрозе, спондилезе, болезни Бехтерева.

Из основных особенностей лечебного воздействия гальванотерапевтического аппарата можно выделить следующее. Гальванический ток сам по себе уже оказывает лечебное воздействие на проблемную зону. Он воздействует как сосудорасширяющее, заживляющее и болеутоляющее средство, замедляет воспалительные процессы и снимает отек. Электрофорез сочетает действие на организм постоянного тока и лекарственных средств, вводимых с его помощью. Эффективность подобного использования лекарств усиливается тем, что вещество попадает непосредственно в болезненную зону без нарушения кожных покровов не проходя через пищеварительную систему.  Электрофорез — наиболее эффективный и безопасный метод лекарственной терапии. Данная процедура не имеет возрастных ограничений и применяется как для детей так и для пожилых людей. Аппарат Элфор обеспечивает возможность проведения процедуры в любом месте, компактность и легкость прибора делают его незаменимым для спортсменов, тренеров, спортивных врачей, людей, занимающихся спортом, ведущих активный образ жизни. Проведение процедуры не требует специальных навыков, с ней легко справится любой человек. Перед применением прочитайте инструкцию, которая содержит необходимую информацию по применению аппарата гальванизации. Продолжительность процедуры в среднем составляет 20 минут.

Электрофорез ДНК в агарозных гелях, полиакриламидных гелях и в свободном растворе

Электрофорез. Авторская рукопись; доступно в PMC 2010 1 июня.

Опубликован в окончательной отредактированной форме как:

PMCID: PMC2757927

NIHMSID: NIHMS147373

Nancy C. Stellwagen

Департамент биохимии, Университет Айовы, штат Айова, США

Нэнси С. Стеллваген, факультет биохимии, Университет Айовы, Айова-Сити, Айова, США;

Переписка: Др.Нэнси С. Стеллваген, Департамент биохимии, Университет Айовы, Айова-Сити, Айова 52242, США, ude.awoiu@negawllets-ycnan, факс: + 319-335-9570 См. Другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

В обзоре описан электрофорез изогнутых и нормальных молекул ДНК в агарозных гелях, полиакриламидных гелях и в свободном растворе. Эти исследования были предприняты, чтобы выяснить, почему изогнутые молекулы ДНК аномально медленно мигрируют в полиакриламидных гелях, но не в агарозных гелях.Приводятся две важные статьи, в которых графики Фергюсона использовались для оценки эффективного размера пор агарозного и полиакриламидного гелей. Также описаны последующие исследования влияния электрического поля на агарозные и полиакриламидные гелевые матрицы, взаимодействия ДНК с двумя гелевыми матрицами и влияние кривизны на подвижность ДНК в свободном растворе. Объединенные результаты предполагают, что аномально низкая подвижность, наблюдаемая для изогнутых молекул ДНК в полиакриламидных гелях, в первую очередь обусловлена ​​предпочтительными взаимодействиями изогнутых ДНК с матрицей полиакриламидного геля; ограничительный размер пор матрицы имеет меньшее значение.В свободном растворе подвижность ДНК увеличивается с увеличением молекулярной массы до выравнивания на уровне плато (3,17 ± 0,01) × 10 ^-4 см ² / Vs в 40 мМ трис-ацетат-EDTA буфере при 20 ° C. Изогнутые молекулы ДНК аномально медленно мигрируют в свободном растворе, а также в полиакриламидных гелях, что объясняет, почему графики Фергюсона изогнутых и нормальных ДНК, содержащих одинаковое количество пар оснований, экстраполируются на разные подвижности при нулевой концентрации геля.

Ключевые слова: агарозных гелей, капиллярный электрофорез, ДНК, подвижность свободного раствора, полиакриламидные гели

1 Исторический обзор

Изучение электрофореза ДНК началось в 1964 году, когда три группы исследователей [1-5] измерили подвижность в свободное решение с использованием методов подвижной границы.Они обнаружили, что подвижность не зависит от размера для молекул ДНК, превышающих ∼400 пар оснований (п.н.) [5], и зависит от ионной силы [3, 5], а также от идентичности и валентности катиона в фоновом электролите [2, 3]. Примерно в то же время, вдохновленные разделением белков в синтетических гелевых матрицах [6-10], другие исследователи начали использовать аналогичные матрицы для разделения молекул РНК [11-19] и ДНК [15, 20-24] по молекулярной массе. . Матрицы для разделения включали агар [11, 18, 20, 21], агарозу [22, 23], полиакриламид [13, 14, 19, 24-28] и составные агарозо-акриламидные [16, 17] гели.Поскольку электрофоретические методы были улучшены за счет очистки агарозы [29-31] и использования пластинчатых гелей вместо гелей для пробирок [25, 32], а также открытие рестрикционных ферментов позволило получить монодисперсные фрагменты ДНК известного размера [33] , 34], стало очевидно, что разделение фрагментов ДНК по молекулярной массе зависит от гелевой матрицы, в которой это разделение проводилось [33, 35]. Эксперименты с электронной микроскопией [36] показали, что подвижности, наблюдаемые в агарозных гелях, точно отражают молекулярную массу ДНК, в то время как подвижности, наблюдаемые в полиакриламидных гелях, нет.Более подробные исследования [37, 38], проведенные с рестрикционными фрагментами размером от 40 до 4000 пар оснований (п.н.), показали, что подвижность ДНК монотонно снижается с увеличением молекулярной массы в агарозных гелях, но что ~ 25% тех же фрагментов аномально медленно мигрировала в полиакриламидных гелях.

Затем многие исследователи обратили свое внимание на физические свойства ДНК, которые могут быть ответственны за аномально медленную подвижность, наблюдаемую для определенных рестрикционных фрагментов в полиакриламидных гелях.Вскоре было обнаружено, что самые большие аномалии подвижности наблюдались для молекул ДНК, содержащих A-тракты, серии из 4-6 смежных остатков аденина, повторяющиеся примерно через каждые 10 пар оснований, в фазе с повторением спирали [39-41]. Другие исследования с использованием различных методов [42-48] показали, что молекулы ДНК, которые аномально медленно мигрировали в полиакриламидных гелях, имели спиральные скелеты, которые были изогнутыми, а не прямыми. Поскольку изогнутые молекулы ДНК имеют меньшую длину от конца до конца и большую площадь поперечного сечения, чем линейные молекулы, содержащие такое же количество пар оснований, изогнутые ДНК потребовали бы более крупных пор для миграции через гелевую матрицу, чтобы они вели себя электрофоретически так, как если бы они были больше, чем их истинные размеры [40, 47].

Не менее важный вопрос заключается в том, почему изогнутые молекулы ДНК, содержащие А-тракт, аномально медленно мигрируют в полиакриламидных гелях, но не в агарозных гелях. Различия в подвижности в двух гелевых средах проиллюстрированы здесь, где сравниваются подвижности мономеров, димеров, тримеров и высших мультимеров нормальных (N) и аномальных (A) фрагментов ДНК длиной 167 пар оснований. Как показано на левой панели, нормальные (N) и аномальные (A) мультимеры одинакового размера мигрируют с одинаковой подвижностью в 2% -ных агарозных гелях, как и ожидалось, из-за их равных молекулярных масс.Однако, как показано на правой панели, аномальные мультимеры (A) мигрируют медленнее, чем их нормальные аналоги (N) в полиакриламидных гелях, содержащих 5,7% и 1,5% C. Аналогичные результаты наблюдаются для полиакриламидных гелей разного состава [50-52].

Электрофорез нормальных и аномальных фрагментов ДНК в: (A), 2,0% агарозных гелях; и (В) гели полиакриламида 5,7% Т, 1,5% С. Мономеры нормальных (N) и аномальных (A) рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих 167 п.н., были лигированы (отдельно) для создания мультимеров различного размера.Снизу вверх последовательные полосы на каждой дорожке каждого геля соответствуют мономерам, димерам, тримерам, 4-мерам, 5-мерам и более высоким мультимерам нормальной (N) и аномальной (A) ДНК. Эффективный радиус пор агарозного геля оценивается в 51 нм [69]; эффективный радиус пор полиакриламидного геля оценивается в 132 нм [83].

Поэтому возникает несколько очевидных вопросов. Имеют ли агарозные и полиакриламидные гели в среднем разные размеры пор, и являются ли эти различия ответственными за аномально медленную подвижность, наблюдаемую в полиакриламидных гелях? По-разному ли электрическое поле влияет на агарозный и полиакриламидный гели, и могут ли эти различия объяснить результаты? Взаимодействуют ли молекулы ДНК с агарозным и полиакриламидным гелями во время электрофореза, и если да, то взаимодействуют ли изогнутые и нормальные молекулы ДНК с двумя матрицами по-разному? Чтобы ответить на эти вопросы, мы провели подробные исследования электрофореза ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях.Два из этих исследований [51, 52], которые были разработаны для измерения видимого размера пор геля, цитируются в этом выпуске журнала Electrophoresis как важные статьи:

Эти статьи цитировались соответственно 59 и 54 раза в 2008. Результаты, полученные в основных документах и ​​связанных исследованиях, наряду с последующей работой по влиянию электрического поля на агарозный и полиакриламидный гели и взаимодействия двух гелевых матриц с изогнутыми и нормальными молекулами ДНК, описаны в следующих трех разделах. этого обзора.В следующем разделе описывается подвижность ДНК в свободном растворе. Краткое резюме завершает статью.

2 Видимый размер пор геля

2.1 Агарозные гели

Агароза представляет собой чередующийся сополимер 1,3-связанной β-D-галактозы и 1,4-связанной 3,6-ангидро-α-L-галактозы, редко замещенных с карбоксилатными, пируватными и / или сульфатными остатками [29-33]. Молекулы агарозы в растворе имеют хаотическую клубковую структуру при высоких температурах [33-35]. При охлаждении агарозные цепи образуют спиральные пучки волокон, удерживаемые вместе нековалентными водородными связями; гелеобразование происходит при еще более низких температурах, когда пучки волокон соединяются в «зонах стыка» за счет образования дополнительных водородных связей [35-40].Обмен партнерами цепи происходит в зонах стыков путем перегруппировки водородных связей [32, 33, 38].

Эффективный размер пор агарозных гелей можно оценить по графикам Фергюсона (логарифм подвижности в зависимости от концентрации геля [65]) молекул ДНК различных размеров. Предполагая гауссово распределение размеров пор, средний радиус поры геля, в котором подвижность данной молекулы ДНК снижается до половины ее подвижности при нулевой концентрации геля, равен радиусу вращения этой ДНК [51, 66 -68].Графики Фергюсона, такие как проиллюстрированные на, были измерены для нормальных молекул ДНК размером от 0,5 до 12,2 пар оснований в первой вехе, упомянутой выше. Было обнаружено, что средний радиус пор 1% -ного агарозного геля составляет ~ 100 нм [51], аналогично размерам пор, полученным в других электрофоретических исследованиях [67-71]. Однако расчетный радиус поры геля в некоторой степени зависит от метода, используемого для его определения. Радиусы пор геля агарозы, оцененные с помощью решеточных моделей гель-электрофореза ДНК [67, 72], как правило, в ~ 2 раза меньше, чем те, которые определены методами графика Фергюсона, в то время как радиусы пор геля, измеренные с помощью ЯМР [73] или атомно-силовой микроскопии (АСМ). ) [74] в ∼2 раза больше.Можно утверждать, что радиусы пор геля, определенные методами ЯМР или АСМ, являются более точными, поскольку значения, определенные электрофоретическими методами, представляют собой подмножество пор, доступных для мигрирующих молекул ДНК. Однако средний размер электрофоретически доступных пор в данной гелевой матрице, вероятно, более важен для интерпретации экспериментов по гель-электрофорезу.

Графики Фергюсона, наблюдаемые для нормальных молекул ДНК в агарозных гелях. Логарифм подвижности, экстраполированный до нулевой напряженности электрического поля при каждой концентрации геля, отображается как функция концентрации агарозы,% A.Линии проведены методом линейной регрессии; размер каждой ДНК в парах тысяч оснований указан рядом с каждой строкой. Адаптировано из [51] с разрешения.

2.2 Полиакриламидные гели

Полиакриламидные гели представляют собой химически сшитые гели, образованные реакцией акриламида с бифункциональным сшивающим агентом, таким как N, N’-метиленбисакриламид (Bis). Состав геля выражается в% T, общей (мас. / Об.) Концентрации акриламида плюс сшивающий агент, и% C, (мас. / Мас.) Процентном содержании сшивающего агента, включенного в% T.Полиакриламидные гели имеют полидисперсную структуру, поскольку бис полимеризуется сам с собой быстрее, чем с акриламидом [74–81]. По этой причине полиакриламидные гели состоят из сильно сшитых, богатых бисом узелков, связанных между собой редко сшитыми, относительно богатыми акриламидом волокнами [75, 80, 81].

Из-за структурной неоднородности матрицы полиакриламидного геля эффективный размер пор, определяемый электрофоретическими методами, зависит от размера аналита. Если белки используются в качестве аналитов, кажущийся размер пор соответствует порам в клубеньках, богатых бисом [82].Более крупные аналиты, такие как ДНК, не «видят» маленькие поры в узелках и вместо этого задерживаются за счет миграции через богатые акриламидом волокна [82]. Во второй важной работе, процитированной выше [52], графики Фергюсона были измерены для молекул ДНК размером от 123 до 1600 п.н. в полиакриламидных гелях, содержащих от 3,5% до 10,5% T и 3% Bis. Типичные примеры графиков Фергюсона, полученных для мультимеров изогнутых и нормальных фрагментов ДНК длиной 167 пар оснований, проиллюстрированы на рис. Графики Фергюсона, полученные для изогнутых мультимеров, имеют более крутой наклон и экстраполируют на более низкие подвижности при нулевой концентрации геля, чем графики Фергюсона их нормальных аналогов.Анализ графиков Фергюсона показывает, что эффективный радиус пор составляет от 20 до 140 нм в гелях, содержащих от 3,5% до 10,5% Т и от 0,5% до 10% С [52, 83]. Подобные радиусы пор геля наблюдались с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии [84-86]. Тем не менее, эксперименты по релаксации ЯМР [72] показали, что средний радиус пор в ~ 5 раз меньше, возможно, потому, что этот метод измеряет среднее значение радиусов пор конкреций и гелевых волокон.

Графики Фергюсона, наблюдаемые для нормальных (Δ) и аномальных (○) фрагментов ДНК в полиакриламидных гелях.Логарифм подвижности представлен как функция концентрации полиакриламида,% Т, в гелях, содержащих 3% С. Нормальные и аномальные фрагменты содержат один, два, четыре или восемь мономеров сверху вниз; размер каждой пары фрагментов в парах тысяч оснований указан рядом с каждой парой линий. Все линии проведены методом линейной регрессии. Адаптировано из [101] с разрешения.

3 Влияние электрического поля на агарозный и полиакриламидный гели

Подвижности, наблюдаемые для молекул ДНК в агарозных гелях, сильно зависят от электрического поля, приложенного к гелю [51, 87], скорее всего, потому, что электрическое поле разрушает водород. связи в зонах стыков, позволяя гелевым волокнам и пучкам волокон ориентироваться в электрическом поле [88, 89].Ориентированные гелевые волокна и пучки волокон очень большие, до 22 мкм в длину [88]. Удивительно, но гелевые волокна и пучки волокон ориентируются в перпендикулярном направлении, когда электрическое поле меняет полярность [89]. Получающаяся в результате ориентация и переориентация агарозных волокон и пучков волокон в обратных электрических полях обеспечивает механизм для создания временных пор в гелевой матрице, позволяя очень крупным молекулам ДНК мигрировать через гель во время гель-электрофореза в импульсном поле [89, 91].

Ориентация волокон агарозного геля и пучков волокон также влияет на электрофорез в однонаправленных электрических полях. Если агарозный гель предварительно подвергается электрофорезу в направлении, перпендикулярном возможному направлению электрофореза, линейные молекулы ДНК перемещаются по дорожкам с перекосом в сторону геля, как если бы предварительный электрофорез создал поры или каналы в этом направлении [93] . По мере продолжения электрофореза полосы постепенно выпрямляются и выравниваются в параллельном направлении, предположительно потому, что гелевые волокна и пучки волокон постепенно ориентируются в новом направлении поля.Полосы, смещенные в сторону геля, не наблюдаются, если гель предварительно электрофорезируют в направлении, в котором будет проводиться электрофорез, или если гелю, ориентированному в перпендикулярном направлении, дают постоять в течение 24 часов перед использованием [93] . Следовательно, ориентированные волокна геля агарозы и пучки волокон становятся случайными при стоянии, предположительно за счет перегруппировки водородных связей в зонах соединения. Подвижность ДНК в таких рандомизированных гелях идентична подвижности, наблюдаемой в гелях, которые не подвергались предварительному электрофорезу [93].

Полиакриламидные гели, химически сшитые, несколько искажаются электрическим полем, но значительной ориентации гелевых волокон не происходит [89]. По этой причине подвижность ДНК, наблюдаемая в полиакриламидных гелях, практически не зависит от напряженности электрического поля, используемого для электрофореза [38, 50].

4 Взаимодействие ДНК с матрицами агарозного и полиакриламидного гелей

4.1 Агарозные гели

Согласно теории гель-электрофореза Огстона-Родбарда-Чрамбаха [94, 95], подвижность полиэлектролита в гелевой матрице определяется дробной объем геля, доступный для мигрирующих макромолекул.Следовательно, ожидается, что графики Фергюсона будут экстраполированы на подвижность свободного раствора аналита при нулевой концентрации геля. Для ДНК графики Фергюсона должны экстраполироваться к общему пересечению при нулевой концентрации геля, поскольку подвижность молекул ДНК размером более ∼400 п.н. в свободном растворе не зависит от молекулярной массы [5, 96]. Однако, как показано для гелей агарозы, перехваты при нулевой концентрации геля монотонно уменьшаются с увеличением размера ДНК. Следовательно, молекулы ДНК, мигрирующие в агарозных гелях, по-видимому, задерживаются за счет молекулярно-массового механизма, который происходит в дополнение к просеиванию.Этот зависимый от молекулярной массы эффект, скорее всего, является временным взаимодействием молекул ДНК с волокнами агарозного геля во время электрофореза. Такое взаимодействие неудивительно, поскольку ДНК представляет собой сильно отрицательно заряженный полиэлектролит, а молекулы агарозы, как известно, связывают анионы [97, 98]. Другие исследования также показали, что молекулы ДНК взаимодействуют с матрицей агарозного геля во время электрофореза [обзор: 99]. Если подвижности, наблюдаемые при нулевой концентрации агарозного геля, линейно экстраполировать на нулевую молекулярную массу ДНК, результирующая подвижность будет (3.0 ± 0,1) × 10 ^-4 см ² / Vs в 40 мМ буфере трис-ацетат-ЭДТА [100], что очень близко к подвижности, наблюдаемой в свободном растворе в том же фоновом электролите [96].

4.2 Полиакриламидные гели

Графики Фергюсона, наблюдаемые для молекул ДНК в полиакриламидных гелях, экстраполируют на очень разные подвижности при нулевой концентрации геля, как показано в [52, 82, 101]. Если подвижности, наблюдаемые при нулевой концентрации геля, линейно экстраполируются на нулевую молекулярную массу ДНК, подвижность ДНК в свободном растворе рассчитывается как (3.1 ± 0,1) × 10 ^-4 см ² / Vs в 40 мМ буфере трис-ацетат-ЭДТА, что в пределах экспериментальной ошибки равно значению, полученному при экстраполяции графиков Фергюсона, наблюдаемых в агарозных гелях [100]. Следовательно, молекулы ДНК, подвергнутые электрофорезу в полиакриламидных гелях, также задерживаются за счет молекулярно-массового механизма, который происходит в дополнение к просеиванию, наиболее вероятно, временным взаимодействиям мигрирующих молекул ДНК с гелевой матрицей [52, 83, 100, 103]. Изогнутые молекулы ДНК, по-видимому, более задерживаются этим механизмом, чем нормальные ДНК, содержащие такое же количество пар оснований, потому что графики Фергюсона изогнутых ДНК имеют более крутые наклоны и экстраполируются на несколько более низкие подвижности при нулевой концентрации геля (сравните сплошные и пунктирные линии на рис. ).

Относительную важность просеивания и взаимодействий с гелевой матрицей для аномально медленных подвижностей, наблюдаемых для изогнутых молекул ДНК в полиакриламидных гелях, можно оценить путем измерения подвижностей изогнутых и нормальных ДНК в гелях, в которых размер пор варьируется путем изменения% T при постоянный% C (обычный метод изменения размера пор геля) и путем изменения% C при постоянном% T. Если эффекты просеивания являются основным фактором, способствующим аномально низкой подвижности, аномалии подвижности не должны зависеть от метода, используемого для изменения размера пор геля.Однако, если предпочтительные взаимодействия изогнутых молекул ДНК с волокнами полиакриламидного геля ответственны за аномально медленную подвижность, аномалии подвижности должны коррелировать с концентрацией акриламида в геле, а не с видимым размером пор геля. Когда размер пор полиакриламидного геля уменьшается за счет увеличения% T при постоянном% C, аномально медленная подвижность изогнутых молекул ДНК увеличивается с уменьшением радиуса поры геля [52, 101, 103], как если бы эффекты просеивания были ответственны за аномалии подвижности. [39, 104].Однако, когда размер пор геля изменяется путем изменения% C при постоянном% T, аномально медленные подвижности не зависят от радиуса поры геля, пока кажущийся радиус поры геля больше, чем радиус вращения ДНК [103]. Если радиус вращения ДНК больше, чем кажущийся радиус поры геля, аномально медленные подвижности изогнутых ДНК уменьшаются с увеличением радиуса поры геля до тех пор, пока радиус поры геля не станет равным радиусу вращения ДНК, после чего аномалии подвижности станут постоянными. и не зависит от размера пор геля.Следовательно, взаимодействие изогнутых молекул ДНК с гелевыми волокнами, богатыми акриламидом, по-видимому, является основной причиной аномально низкой подвижности, наблюдаемой для изогнутых ДНК в полиакриламидных гелях; просеивающие эффекты имеют второстепенное значение.

5 Подвижность ДНК в свободном растворе

5.1 Зависимость подвижности свободного раствора от молекулярной массы ДНК

Подвижность ДНК в свободном растворе часто считается независимой от молекулярной массы, поскольку линейная плотность заряда по существу постоянна.Ранние измерения электрофорезом подвижных границ растворов ДНК [5] с использованием относительно полидисперсных образцов ДНК соответствовали этому предположению. Однако более точные измерения подвижности, проведенные с помощью капиллярного электрофореза с использованием монодисперсных образцов ДНК, показали, что это предположение неверно [96, 105]. Подвижность малых молекул ДНК увеличивается с увеличением молекулярной массы, как показано светлыми кружками, прежде чем выравниваться и достигать постоянного значения плато для ДНК размером более ∼400 п.н.Поскольку теоретические исследования предполагают, что подвижность заряженных стержней должна возрастать с увеличением молекулярной массы [106, 107], результаты предполагают, что небольшие молекулы ДНК жесткие и стержневидные в растворе. ДНК размером более ∼400 п.н. начинают принимать конформацию случайных клубков и мигрировать как свободно дренирующиеся спирали [5, 96, 105, 108, 109]; тогда подвижность зависит только от эффективного заряда на единицу массы. Подвижность плато, наблюдаемая для молекул ДНК размером ≥400 п.н. в 40 мМ трис-ацетат-ЭДТА-буфере, составляет (3.17 ± 0,01) × 10 ^-4 см ² / Vs [110], по существу равняется подвижностям, вычисленным путем двойной экстраполяции графиков Фергюсона, полученных в агарозном и полиакриламидном гелях, до нулевой концентрации геля и нулевой молекулярной массы ДНК. Следовательно, процедура двойной экстраполяции приводит к достаточно точным значениям подвижности ДНК в свободном растворе.

Подвижность в свободном растворе нормальных (незакрашенных кружков) фрагментов ДНК различного размера в 40 мМ трис-ацетат-ЭДТА буфере, построенная как функция числа пар оснований в каждом фрагменте.Темными кружками обозначена подвижность изогнутых фрагментов длиной 199 п.н., содержащих от 1 до 5 А-трактов, в модуле кривизны, расположенном в центре каждого фрагмента. Адаптировано из [110] с разрешения.

5.2 Зависимость подвижности свободного раствора от кривизны ДНК

Подвижность изогнутых молекул ДНК в свободном растворе (а также подвижность, наблюдаемая в полиакриламидных гелях) зависит от степени кривизны остова спирали [110]. Этот эффект иллюстрируется темными кружками в, которые соответствуют фрагментам ДНК длиной 199 п.н., содержащим 1–5 А-трактов (сверху вниз), расположенных в «модуле кривизны» [111] в центре каждого фрагмента.Фрагмент с единственным A-трактом в модуле кривизны имеет конформацию нормальной ДНК [111] и демонстрирует подвижность, которая попадает на ту же плавную кривую, описывающую подвижности других нормальных фрагментов ДНК. Однако фрагменты, содержащие 2-5 A-трактов в модуле кривизны, которые становятся все более изогнутыми по мере увеличения количества A-трактов [111, 112], мигрируют все медленнее в свободном растворе. Аномально низкая подвижность, наблюдаемая для искривленных ДНК в свободном растворе, частично связана с зависимостью фактора трения от формы молекулы [112] и частично с преимущественным связыванием одновалентных катионов A-трактами ДНК, что снижает эффективный суммарный заряд [112, 113].

6 Заключительные замечания

Важнейшие статьи, процитированные в этом обзоре, были первой из серии статей, разработанных, чтобы лучше понять, почему изогнутые молекулы ДНК аномально медленно мигрируют в полиакриламидных гелях, но не в агарозных гелях. Важные документы показали, что ограниченный размер пор матрицы полиакриламидного геля не является основной причиной аномалий подвижности, поскольку гели с эквивалентными кажущимися размерами пор могут быть отлиты в обеих гелевых матрицах. В важных документах также предполагается, что молекулы ДНК взаимодействуют с агарозным и полиакриламидным гелями во время электрофореза, поскольку графики Фергюсона не экстраполируются к общему пересечению при нулевой концентрации геля.Подвижность ДНК в свободном растворе можно восстановить, если подвижности, наблюдаемые при нулевой концентрации геля, также экстраполировать на нулевую молекулярную массу ДНК.

Последующая работа, также описанная здесь, показала, что аномально низкие подвижности, наблюдаемые для изогнутых молекул ДНК в полиакриламидных гелях, коррелируют с концентрацией акриламида в гелевой матрице, а не с размером пор геля, поскольку аномалии подвижности наблюдаются даже в гелях в что эффективный радиус поры геля больше, чем радиус вращения ДНК.Следовательно, изогнутые молекулы ДНК, по-видимому, имеют большее сродство к богатым акриламидом гелевым волокнам, чем нормальные ДНК, содержащие такое же количество пар оснований. Различия в подвижности между изогнутыми и нормальными молекулами ДНК, содержащими одинаковое количество пар оснований, не наблюдаются в агарозных гелях, скорее всего, потому, что волокна агарозного геля ориентируются электрическим полем, создавая временные поры в матрице геля. Поскольку ориентирующие волокна и пучки волокон очень большие, временные поры нечувствительны к небольшим различиям в конформации ДНК.

Подвижность ДНК в свободном растворе увеличивается с увеличением молекулярной массы до тех пор, пока не стабилизируется на постоянном плато для фрагментов размером более ∼400 п.н. Изогнутые молекулы ДНК, которые аномально медленно мигрируют в полиакриламидных гелях, также аномально медленно мигрируют в свободном растворе, скорее всего, потому, что изогнутые ДНК обычно содержат несколько A-трактов, а A-тракты, как известно, связывают одновалентные катионы [114]. Связывание моновалентных катионов А-трактами ДНК должно уменьшать эффективный заряд искривленной ДНК, уменьшая наблюдаемую подвижность [110, 112, 113].Однако подробное обсуждение связывания катионов А-трактами ДНК — это отдельная тема для другого дня.

Сноски

Автор не заявлял об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

2. Росс П.Д., Скраггс Р.Л. Биополимеры. 1964; 2: 231–236. [Google Scholar] 4. Костантино Л., Ликури А.М., Витальяно В. Биополимеры. 1964; 2: 1–8. [Google Scholar] 5. Оливера Б.М., Бейн П., Дэвидсон Н. Биополимеры. 1964; 2: 245–257. [Google Scholar] 15. Епископ DHL, Клейбрук-младший, Шпигельман С. Дж. Мол биол.1967; 26: 373–387. [PubMed] [Google Scholar] 18. Цанев Р., Стайнов Д., Кокилева Л., Младенова И. Анальная биохимия. 1969; 30: 66–85. [PubMed] [Google Scholar] 24. Маниатис Т., Джеффри А., ван де Санде Х. Биохимия. 1975. 14: 3787–3794. [PubMed] [Google Scholar] 30. Duckworth M, Yaphe W. Carbohydr Res. 1971; 16: 189–197. [Google Scholar] 31. Duckworth M, Yaphe W. Carbohydr Res. 1971; 16: 435–445. [Google Scholar] 35. Зейгер РС, Саломон Р, Дингман CW, Павлин АС. Природа Новая Биол. 1972: 238: 65–69. [PubMed] [Google Scholar] 46.Гриффит Дж., Блейман М., Раух, Калифорния, Кухня, Пенсильвания, Энглунд, штат Пенсильвания. Клетка. 1986; 46: 717–724. [PubMed] [Google Scholar] 47. Макдональд Д., Герберт К., Чжан Х, Полгруто Т., Лу П. Дж. Мол биол. 2001; 306: 1081–1098. [PubMed] [Google Scholar] 53. Рис Д.А., Моррис Э.Р., Том Д., Мэдден Дж. К. В: Полисахариды. Аспиналл Г.О., редактор. Vol. 1. Академическая пресса; Нью-Йорк: 1982. С. 196–290. [Google Scholar] 55. Киркпатрик Ф.Х. В: Электрофорез больших молекул ДНК: теория и приложения, Современные коммуникации в молекулярной биологии.Лай Э., Биррен Б.В., редакторы. Vol. 1. Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор; Плейнвью, Нью-Йорк: 1990. С. 9–22. [Google Scholar] 57. Арнотт С., Фулмер А., Скотт В.Е., Деа ICM, Мурхаус Р., Рис Д.А. J Mol Biol. 1974; 90: 269–284. [PubMed] [Google Scholar] 58. Norton IT, Goodall DM, Austen KRJ, Morris ER, Rees DA. Биополимеры. 1986; 25: 1009–1029. [Google Scholar] 59. San Biagio PL, Madonia F, Newman J, Palma MU. Биополимеры. 1986; 25: 2255–2269. [Google Scholar] 60. Пайнс Э., Принс В. Макромолекулы. 1973; 6: 888–895. [Google Scholar] 61.Феке Ф. Т., Принс В. Макромолекулы. 1974; 7: 527–530. [Google Scholar] 62. Леоне M, Sciortino F, Migliore M, Fornili SL, Vittorelli MB. Биополимеры. 1987. 16: 743–761. [Google Scholar] 63. Emanuele A, DiStefano L, Giacomazza D, Trapanese M, Palma-Vittorelli MB, Palma MU. Биополимеры. 1991; 31: 859–868. [Google Scholar] 64. Bulone D, San Biagio PL. Chem Phys Lett. 1991; 179: 339–343. [Google Scholar] 67. Слейтер Г.В., Руссо Дж., Нооланди Дж., Турмел С., Лаланд М. Биополимеры. 1988. 27: 509–524. [PubMed] [Google Scholar] 71.Слейтер GW, Treurniet JR. J Chromatogr A. 1997; 772: 39–48. [Google Scholar] 72. Чуй М.М., Филлипс Р.Дж., Маккарти М.Дж. J Colloid Interface Sci. 1995. 174: 336–344. [Google Scholar] 73. Маалум М., Пернодет Н., Тинланд Б. Электрофорез. 1998; 19: 1606–1610. [PubMed] [Google Scholar] 74. Hecht AM, Duplessix R, Geissler E. Macromolecules. 1985; 18: 2167–2173. [Google Scholar] 75. Базельга Дж., Эрнандес-Фуэнтес I, Пьерола И.Ф., Льоренте Массачусетс. Макромолекулы. 1987. 20: 3060–3065. [Google Scholar] 76. Базельга Дж., Льоренте Массачусетс, Ньето Дж. Л., Эрнандес-Фуэнтес И., Пьерола И.Ф.Eur Polym J. 1988; 24: 161–165. [Google Scholar] 77. Базельга Дж., Льоренте Массачусетс, Эрнандес-Фуэнтес I, Пьерола ИФ. Eur Polym J. 1989; 25: 477–480. [Google Scholar] 79. Weiss N, Van Vleit T, Silberberg A. J. Polym Sci: Polym Phys Ed. 1979; 17: 2220–2240. [Google Scholar] 80. Джустен Дж.Г., Маккарти Дж. Л., Пьюзи П. М.. Макромолекулы. 1991; 24: 6690–6699. [Google Scholar] 85. Рюхель Р., Стир Р.Л., Эрбе Э.Ф. J Chromatogr. 1978; 166: 563–575. [Google Scholar] 92. Stellwagen J, Stellwagen NC. J. Phys Chem. 1995; 99: 4247–4251. [Google Scholar] 94.Огстон АГ. Trans Faraday Soc. 1958; 54: 1754–1757. [Google Scholar] 97. Piculell L, Nilsson S. J. Phys Chem. 1989; 93: 5596–5601. [Google Scholar] 98. Piculell L, Nilsson S. J. Phys Chem. 1989; 93: 5602–5611. [Google Scholar] 102. Киари М., Д’Алезио, Консонни Р., Ригетти П.Г. Электрофорез. 1995; 16: 1337–1344. [PubMed] [Google Scholar] 104. Марини Дж. К., Эффрон П. Н., Гудман ТК, Синглтон СК, Уэллс Р.Д., Уортелл Р.М., Инглунд П.Т. J Biol Chem. 1984; 259: 8974–8979. [PubMed] [Google Scholar] 105. Stellwagen E, Lu YJ, Stellwagen NC.Биохимия. 2003. 42: 11745–11750. [PubMed] [Google Scholar] 106. Völkel AR, Noolandi J. J Chem Phys. 1995. 102: 5506–5511. [Google Scholar] 107. Mohanty U, Stellwagen NC. Биополимеры. 1999; 49: 209–214. [Google Scholar] 112. Лу YJ, Stellwagen NC. Биофиз Дж. 2008; 94: 1710–1725. [Google Scholar] 113. Stellwagen NC, Magnúsdóttir S, Gelfi C, Righetti PG. J Mol Biol. 2001; 305: 1025–1033. [PubMed] [Google Scholar] Электрофорез в

гелях | BioNinja

Понимание:

• Гель-электрофорез используется для разделения белков или фрагментов ДНК в соответствии с размером

Гель-электрофорез — это лабораторный метод, используемый для разделения и выделения белков или фрагментов ДНК в зависимости от массы / размера

• Образцы помещаются в блок геля и прикладывается электрический ток, который заставляет образцы перемещаться через гель
• Меньшие образцы менее затруднены гелевой матрицей и, следовательно, будут быстрее перемещаться через гель
• Это приводит к разделению образцов разных размеров при их перемещении с разной скоростью

Обзор гель-электрофореза

Хотя и ДНК, и белки разделяются в соответствии с одним и тем же основным процессом, между двумя протоколами существуют различия.

Разделение ДНК

• ДНК можно разрезать на фрагменты с помощью рестрикционной эндонуклеазы — разные образцы ДНК будут генерировать фрагменты разной длины
• Фрагменты разделяются, потому что ДНК отрицательно заряжена из-за присутствия фосфатной группы (PO ₄ ^3–) на каждом нуклеотиде

Образцы

• ДНК помещают в гель агарозы и размер фрагмента рассчитывают путем сравнения с известным отраслевые стандарты
• Специфические последовательности могут быть идентифицированы путем включения комплементарного зонда гибридизации с радиоактивной меткой, переноса разделенных последовательностей на мембрану и последующей визуализации с помощью авторадиографии (Саузерн-блоттинг)

Электрофорез в агарозном геле (ДНК)

Разделение белков

• Белки могут складываться в различные формы (влияющие на размер) и иметь положительные и отрицательные области (без четкого заряда)
• Белки сначала необходимо обработать анионным детергентом (SDS) в Чтобы линеаризовать и придать однородный отрицательный заряд
• Образцы белка помещают в полиакриламидный гель , и размеры сравнивают с известными промышленными стандартами
• Разделенные белки переносятся на мембрану, а затем целевые белки идентифицируются путем окрашивания специфическими моноклональными антителами ( Вестерн-блоттинг)

Электрофорез в полиакриламидном геле (белки)

Электрофорез

Электрофорез — это движение дисперсных частиц относительно жидкости под действием однородного электрического поля.Таким образом, он разделяет компоненты смеси в зависимости от их размера и / или заряда.

Как запомнить, какой электрод является катодом, а какой анодом?

Простые … анионы перемещаются к аноду, а катионы — к катоду.

Визуализация белков на бумаге или в геле — важный этап любого электрофореза. Часто гели с ДНК пропитываются бромидом этидия, который внедряется в ДНК и флуоресцирует в УФ-свете (левое изображение).Белки можно визуализировать с помощью окрашивания серебром или красителя кумасси бриллиантовый синий (изображение справа). В некоторых случаях гели переносят на твердую основу (нитроцеллюлозу), а затем исследуют специфическими антителами (вестерн-блоттинг).

Бумага для электрофореза

Обычно используется для разделения АК или пептидов с разным зарядом. Как показано на рисунке, АК и пептиды будут разделяться в зависимости от их заряда, причем наиболее заряженные частицы перемещаются дальше всех.

PAGE (

P oly A crylamide G el E лектрофорез) — Native Gel

Он используется в клинической химии для разделения белков по заряду и / или размеру (агароза IEF, по существу не зависит от размера), а также в биохимии и молекулярной биологии для разделения смешанной популяции фрагментов ДНК и РНК по длине, для оценки размера ДНК и Фрагменты РНК или для разделения белков по заряду.Это процесс, который позволяет сортировать молекулы. С помощью электрического поля молекулы (например, ДНК) можно заставить двигаться через гель, сделанный из агара или полиакриламида. Электрическое поле состоит из отрицательного заряда на одном конце, который проталкивает молекулы через гель, и положительного заряда на другом конце, который протягивает молекулы через гель. Сортируемые молекулы распределяются в лунку гелевого материала. Гель помещается в камеру для электрофореза, которая затем подключается к источнику питания (см. Рисунок слева).При подаче электрического тока более крупные молекулы движутся через гель медленнее, а более мелкие — быстрее. Молекулы разного размера образуют четкие полосы на геле.

Термин «гель» в данном случае относится к матрице, используемой для содержания, а затем разделения целевых молекул. В большинстве случаев гель представляет собой сшитый полимер, состав и пористость которого выбираются на основе удельного веса и состава анализируемой мишени. При разделении белков или небольших нуклеиновых кислот (ДНК, РНК или олигонуклеотидов) гель обычно состоит из разных концентраций акриламида и сшивающего агента, что дает полиакриламидные ячеистые сети разного размера.При разделении более крупных нуклеиновых кислот (более нескольких сотен оснований) предпочтительной матрицей является очищенная агароза. В обоих случаях гель образует твердую, но пористую матрицу. Агароза состоит из длинных неразветвленных цепей незаряженных углеводов без поперечных связей, в результате чего образуется гель с большими порами, позволяющими разделять макромолекулы и макромолекулярные комплексы.

«Электрофорез» относится к электродвижущей силе (ЭДС), которая используется для перемещения молекул через матрицу геля.Помещая молекулы в лунки геля и прикладывая электрическое поле, молекулы будут перемещаться через матрицу с разными скоростями, в значительной степени определяемыми их массой, но также их зарядом и формой, которые сильно различаются для белков. Электрофоретическая подвижность малых молекул больше подвижности больших молекул с той же плотностью заряда, что позволяет разделение. Для разделения белков или ДНК обычно pH смеси буфера и белков высокий (~ 9), так что белки несут чистый отрицательный заряд.Однако, поскольку размер, заряд и форма играют роль в том, как молекула будет вести себя в нативном геле, большинство ученых используют гель SDS-PAGE, который предсказуем.

СТРАНИЦА паспорта безопасности

SDS PAGE разделяет молекулы по размеру, поскольку присутствие SDS (додецилсульфата натрия) денатурирует белок, удаляя 2˚, 3˚ и 4˚ структуры (они предполагают линейную цепочку), а SDS покрывает молекулы, придавая им однородный заряд / массу. соотношение. Чаще всего образцы белка также обрабатывают ß-меркаптоэтанолом (ß-ME), чтобы разорвать любые существующие дисульфидные связи и придать им линейную цепь (структура 1˚).

Наличие стандартов известного размера: всегда необходимо создать калибровочную кривую, которую можно использовать для определения приблизительной молекулярной массы неизвестного белка (полосы).

IEF (IsoElectric Focusing) электрофорез

Изоэлектрическая фокусировка (IEF) — это метод разделения различных молекул по разнице в их изоэлектрической точке (pI).Это тип электрофореза, обычно выполняемый на белках в геле, который использует тот факт, что общий заряд интересующей молекулы является функцией pH окружающей среды. При заливке геля ИЭФ устанавливается градиент pH

Белок, который находится в области pH выше его изоэлектрической точки (pI), будет заряжен отрицательно и будет мигрировать к аноду (положительно). Однако по мере того, как он мигрирует через градиент снижения pH, общий заряд белка будет увеличиваться до тех пор, пока белок не достигнет области pH, соответствующей его pI.В этот момент у него нет чистого заряда, и поэтому миграция прекращается (поскольку нет электрического притяжения ни к одному из электродов). В результате белки фокусируются в четкие неподвижные полосы, причем каждый белок располагается в точке градиента pH, соответствующей его pI. Этот метод обеспечивает чрезвычайно высокое разрешение, когда белки, различающиеся одним зарядом, фракционируются на отдельные полосы.

2D Гель-электрофорез

Двумерный гель-электрофорез (2D-электрофорез) — это форма гель-электрофореза, обычно используемая для анализа белков, в которой смеси белков разделены двумя свойствами в двух измерениях на гелях.Как показано на рисунке, 2D-электрофорез начинается с геля IEF (в пробирке), который разделяет белки на основе их pI. Затем его кладут поверх геля SDS-PAGE (90 градусов от первого разделения). Поскольку маловероятно, что две молекулы будут похожи по двум различным свойствам, молекулы более эффективно разделяются в 2D-электрофорезе, чем в 1D-электрофорезе.

вернуться наверх | предыдущая страница | следующая страница

Определение и объяснение электрофореза

Электрофорез — это термин, используемый для описания движения частиц в геле или жидкости в относительно однородном электрическом поле.Электрофорез можно использовать для разделения молекул на основе заряда, размера и сродства связывания. Этот метод в основном применяется для разделения и анализа биомолекул, таких как ДНК, РНК, белки, нуклеиновые кислоты, плазмиды и фрагменты этих макромолекул. Электрофорез — один из методов, используемых для идентификации исходной ДНК, как при проверке отцовства, так и в судебной медицине.

Электрофорез анионов или отрицательно заряженных частиц называется анафорезом . Электрофорез катионов или положительно заряженных частиц называется катафорез .

Электрофорез впервые наблюдал в 1807 году Фердинанд Фредерик Ройсс из Московского государственного университета, который заметил, что частицы глины мигрировали в воде, находящейся под постоянным электрическим полем.

Ключевые выводы: электрофорез

• Электрофорез — это метод, используемый для разделения молекул в геле или жидкости с помощью электрического поля.
• Скорость и направление движения частицы в электрическом поле зависит от размера молекулы и электрического заряда.
• Обычно электрофорез используется для разделения макромолекул, таких как ДНК, РНК или белки.

Как работает электрофорез

В электрофорезе есть два основных фактора, которые определяют, насколько быстро частица может двигаться и в каком направлении. Во-первых, имеет значение плата за образец. Отрицательно заряженные частицы притягиваются к положительному полюсу электрического поля, а положительно заряженные частицы притягиваются к отрицательному полюсу. Нейтральные частицы могут быть ионизированы, если поле достаточно сильное.В противном случае это не повлияет.

Другой фактор — размер частиц. Маленькие ионы и молекулы могут перемещаться через гель или жидкость намного быстрее, чем более крупные.

В то время как заряженная частица притягивается к противоположному заряду в электрическом поле, существуют и другие силы, которые влияют на движение молекулы. Трение и сила электростатического замедления замедляют продвижение частиц через жидкость или гель. В случае гель-электрофореза концентрацию геля можно контролировать для определения размера пор гелевой матрицы, который влияет на подвижность.Также присутствует жидкий буфер, который контролирует pH окружающей среды.

Когда молекулы протягиваются через жидкость или гель, среда нагревается. Это может денатурировать молекулы, а также повлиять на скорость движения. Напряжение регулируется, чтобы попытаться свести к минимуму время, необходимое для разделения молекул, сохраняя при этом хорошее разделение и сохраняя нетронутыми химические частицы. Иногда электрофорез проводят в холодильнике, чтобы компенсировать жару.

Типы электрофореза

Электрофорез включает в себя несколько связанных аналитических методов.Примеры включают:

• аффинный электрофорез — Аффинный электрофорез — это тип электрофореза, при котором частицы разделяются на основе комплексообразования или биоспецифического взаимодействия , заряд и вязкость. Как следует из названия, эта техника обычно выполняется в стеклянной трубке. Он дает быстрые результаты и высокое разрешение разделения.
• гель-электрофорез — Гель-электрофорез — это широко используемый тип электрофореза, при котором молекулы разделяются путем движения через пористый гель под действием электрического поля. Двумя основными гелевыми материалами являются агароза и полиакриламид. Гель-электрофорез используется для разделения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), фрагментов нуклеиновых кислот и белков.
• иммуноэлектрофорез — Иммуноэлектрофорез — это общее название, данное множеству электрофоретических методов, используемых для характеристики и разделения белков на основе их реакции на антитела.
• электроблоттинг — Электроблоттинг — это метод, используемый для выделения нуклеиновых кислот или белков после электрофореза путем переноса их на мембрану. Обычно используются полимеры поливинилиденфторид (ПВДФ) или нитроцеллюлоза. После извлечения образца его можно дополнительно проанализировать с помощью красителей или зондов. Вестерн-блоттинг — это одна из форм электроблоттинга, используемая для обнаружения определенных белков с использованием искусственных антител.
• Гель-электрофорез в импульсном поле — Электрофорез в импульсном поле используется для разделения макромолекул, таких как ДНК, путем периодического изменения направления электрического поля, приложенного к гелевой матрице.Причина изменения электрического поля заключается в том, что традиционный гель-электрофорез не может эффективно разделить очень большие молекулы, которые все стремятся мигрировать вместе. Изменение направления электрического поля дает молекулам дополнительные направления движения, так что у них есть путь через гель. Напряжение обычно переключается между тремя направлениями: одно проходит вдоль оси геля, а два — под углом 60 градусов в каждую сторону. Хотя этот процесс занимает больше времени, чем традиционный гель-электрофорез, он лучше разделяет большие фрагменты ДНК.
• изоэлектрическая фокусировка — Изоэлектрическая фокусировка (IEF или электрофокусировка) — это форма электрофореза, при которой молекулы разделяются по разным изоэлектрическим точкам. ИЭФ чаще всего выполняется с белками, потому что их электрический заряд зависит от pH.

Устройство для гель-электрофореза Migele ™ | PerkinElmer

проверить количество

Продукты не могут быть лицензированы в соответствии с законами во всех странах. Уточняйте наличие у местного представителя.

Запросить дополнительную информацию

купить сейчас

Добавить в корзину

Запрос цитаты

Пожалуйста, введите действительное количество

Пожалуйста, авторизуйтесь, чтобы добавить в избранное.

НУЛЕВАЯ ИЛИ ПУСТАЯ КОРЗИНА

Обзор

Сегодня ученые всего мира используют изоэлектрическую фокусировку как метод выбора для определения и идентификации содержания белка в конкретном образце или анализа генно-инженерного белка. Изоэлектрическая фокусировка (IEF) — ценный метод для этого анализа. Например, наша установка для гель-электрофореза Migele ^™ и гели HyPure ^® могут определять генетическую чистоту семян перца и контролировать качество аквакультуры.Хотя для анализа можно использовать другие гели, они должны пройти тестирование на совместимость.

Характеристики

более

гель по сравнению с генотипированием с помощью капиллярного электрофореза для классификации результатов лечения в двух антималярийных испытаниях в Уганде | Malaria Journal

Исследовательские центры и дизайн испытаний

Клинические образцы были взяты из испытаний, проведенных в двух местах с заметно различающейся интенсивностью передачи: в медицинском центре Кихихи в районе Канунгу на западе Уганды и в медицинском центре Адуку в районе Апак в центральной части Уганды.В Канунгу малярия носит мезоэндемический характер, при этом показатель энтомологической инокуляции (EIR) оценивается в семь инфекционных укусов на человека в год [8]. Напротив, в Apac малярия носит холоэндемический характер, при этом EIR оценивается в 1564 инфекционных укуса на человека в год [8].

Детали клинических испытаний опубликованы в других источниках [5, 9]. В обоих испытаниях дети в возрасте от 6 месяцев до 10 лет с неосложненной малярией falciparum были рандомизированы для получения AL или DP и наблюдались в течение 42 дней.Результаты лечения оценивали в соответствии с рекомендациями ВОЗ [10]. У всех субъектов с рецидивирующей паразитемией, выявленной между 7 и 42 днями после начала терапии, были пробы, генотипированные со дня лечения (день 0) и дня выявления рецидивирующей паразитемии (день неудачи или день F). Генотипирование проводили поэтапно с использованием msp2 , glurp , а затем msp1 в соответствии с рекомендациями ВОЗ [6], с параллельным анализом капиллярным и гель-электрофорезом.Как обсуждается в этих рекомендациях, в первую очередь следует использовать локусы с наибольшим разнообразием. Для каждого локуса, если генотипирование определило исход как новую инфекцию (отсутствие общих аллелей между днями начальной и рецидивирующей паразитемии), дальнейшие локусы не изучались; если генотипирование определяло результат как потенциальное повторение (по крайней мере, один общий аллель), оценивались дополнительные локусы в порядке msp2 , затем glurp , затем msp1 . Пары образцов, которые имели хотя бы один аллель в каждом успешно генотипированном локусе, были определены как повторение.Те образцы, которые не удалось генотипировать с использованием msp2 , подверглись анализу на основе ПЦР, чтобы отличить P. falciparum от других видов плазмодий. Образцы, содержащие только ДНК, не относящуюся к falciparum, в дальнейшем не подвергались генотипированию. Если образец не прошел генотипирование по всем трем маркерам, он классифицировался как не прошедший молекулярное генотипирование.

Генотипирование с помощью электрофореза в агарозном геле

Амплификацию полиморфных поверхностных антигенов msp2 , glurp и msp1 проводили согласно стандартным протоколам ВОЗ [6].Вкратце, ДНК экстрагировали из пятен крови на фильтровальной бумаге в 130 мкл воды, используя стандартный метод Chelex [11], и 2 мкл матричной ДНК амплифицировали с помощью вложенной ПЦР. ПЦР выполняли в термоциклере Bio-Rad C-1000 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США). Праймеры, соответствующие аллельным семействам для msp2 (FC27 и IC3D7) и msp1 (K1, MAD20 и RO33) и полиморфной области glurp , использовали, как описано ранее [12, 13].Полученные продукты ПЦР разделяли на 2,5% агарозном геле (UltraPure Agarose: Invitrogen, Carlsbad, CA), окрашенном бромидом этидия. Технический специалист, не знающий идентичности образцов, оценил размер продуктов ПЦР с помощью программного обеспечения GelCompar II (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Бельгия). Считалось, что аллели в парных образцах совпадают для msp2 и msp1 , если они находятся в пределах 10 пар оснований, и для glurp , если они находятся в пределах 20 пар оснований.

Генотипирование с использованием капиллярного электрофореза

Для капиллярного электрофореза условия реакции и циклов были оптимизированы на основе ранее опубликованных протоколов, прежде чем были выбраны условия (последовательности праймеров, циклы и условия реакции в дополнительном файле 1, таблица S1).Все вложенные реакции имели прямые праймеры, помеченные флуорофорами на 5′-конце, и обратные праймеры, помеченные 5′-концом GTGTCTT «хвостом», чтобы способствовать добавлению дополнительного аденозинового основания для более однородных размеров продуктов ПЦР [14]. Все флуоресцентные праймеры, за исключением праймера, специфичного для семейства K1 для msp1 , использовали непатентованные метки HEX или 6-FAM для минимизации затрат.

После амплификации продукты ПЦР готовили для анализа путем смешивания 2 мкл разведенного образца 1:10 с 10 мкл формамида Hi-Di и 0.2 мкл стандарта подходящего размера (Genescan 500HD ROX (Applied Biosystems) для msp1 и msp2 ; Genescan 1000HD ROX (Applied Biosystems) для glurp . Затем образцы денатурировали при 95 ° C в течение 5 минут и прогоняли на анализатор ДНК Applied Biosystems 3730xl. Размер аллелей определялся с помощью программного обеспечения GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems). Аллели в парных образцах считались совпадающими для msp2 и msp1 , если они находились в пределах 1 базы. На основе нашего опыта, показывающего менее точный размер для более крупных фрагменты, аллели для glurp считались совпадающими, если в пределах 1 основания для аллелей <880 оснований, 1.5 оснований для аллелей между 880 и 930, 2 основания для аллелей между 930 и 980, 2,5 основания для аллелей между 980 и 1030 и 3 основания для аллелей между 1030 и 1100.

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с использованием Stata SE версия 10 (StataCorp., Колледж-Стейшн, Техас) и R версии 2.9.0 (Фонд R для статистических вычислений, Вена, Австрия). Для каждого локуса эмпирическое распределение размеров аллелей, обнаруженных в день 0, использовалось для оценки вероятности того, что два случайно выбранных аллеля будут совпадать случайно без произвольного объединения аллелей.Для каждого обнаруженного аллеля дня 0 рассчитывалась доля других обнаруженных аллелей, которые соответствовали соответствующим критериям соответствия (например, в пределах 10 пар оснований для геля MSP2 и 1 основания для капиллярного электрофореза MSP2), и использовалась для оценки вероятности того, что конкретный аллель дня 0 совпадет с другим случайно. Например, если 1000 аллелей геля MSP2 были обнаружены в 500 образцах, а аллель «A» попадает в 10 пар оснований по размеру 100 других аллелей, вероятность того, что этот конкретный аллель случайно совпадает с другим, составляет 100/1000 или 0.1. Среднее значение этих пропорций по всем аллелям дня 0 затем использовалось для оценки общей вероятности совпадения, происходящего случайно между двумя случайно выбранными аллелями. Следует отметить, что два аллеля в семействе аллелей могут совпадать по размеру, но иметь разные последовательности; с точки зрения ошибочной классификации не имеет значения, имеют ли два разных паразита совпадающий аллель, который отличается на основе последовательности или идентичен по последовательности.

Вероятность совпадения (P _{совпадение} ) между образцами дня 0 и дня F, которые могут оба содержать несколько аллелей, была рассчитана с учетом фактических аллелей, присутствующих в образце дня 0, а также количества аллелей, присутствующих в выборке дня F ( n ).Эта вероятность ранее была рассчитана после первого отнесения каждого аллеля к ячейке на основе размера [3]. Однако произвольное объединение аллелей не точно отражает вероятность называть аллели совпадающими на практике, например аллели размера 299 и 300 могут попадать в разные группы, но на практике их называют совпадением. Таким образом, был использован несколько иной метод, описанный ниже, который дает аналогичные результаты, но менее предвзят, требует меньше вычислительных ресурсов и проще в реализации. Для каждой пары образцов моделировали 10 000 возможных образцов дня F путем случайного выбора комбинаций n аллелей из эмпирического распределения аллелей дня 0.Затем вычисляли долю этих комбинаций, которые соответствовали критериям соответствия с фактическим образцом дня 0 (совпадение по меньшей мере одного аллеля), и использовали его для оценки совпадения P для этой пары образцов.

Бутстрап с 10 000 повторений был использован для проверки гипотезы о том, что вероятность случайного совпадения двух аллелей одинакова при гель-электрофорезе и капиллярном электрофорезе. Учитывая, что было -1 субъектов, в каждом повторении начальной загрузки все аллели из -1 субъектов нулевого дня как гель-электрофорезом, так и капиллярным электрофорезом отбирали с заменой.Вероятность случайного совпадения двух аллелей как для гель-электрофореза, так и для капиллярного электрофореза затем рассчитывалась из образца начальной загрузки, как описано выше, и рассчитывалась разница между этими двумя вероятностями. Тест Wilcoxon Rank Sum использовался для сравнения других характеристик гель-электрофореза и капиллярного электрофореза. Статистику каппа использовали для проверки согласованности результатов гелевого и капиллярного электрофореза между экспертами. 42-дневный риск неэффективности лечения был определен как рецидив малярии, вызванный рецидивирующими паразитами, по результатам генотипирования.Риск отказа оценивался по формуле предела продукта Каплана-Мейера. Данные были подвергнуты цензуре для субъектов, которые не завершили 42-дневное наблюдение, а также для новых инфекций. Бутстрап с 1000 повторениями использовался для проверки гипотезы о том, что 42-дневный риск неудачи различается между группами.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.