Пцр диагностика что это: что это такое и что показывает, как делается и сколько стоит исследование?

Содержание

Что такое ПЦР тест на коронавирус

Новый коронавирус SARS-CoV-2, вызвавший пандемию несколько месяцев назад, пока недостаточно изучен. Ученые только постигают, чем лучше лечить COVID-19, какие осложнения он может вызвать, к каким отдаленным последствиям для здоровья привести. Однако диагностирование патологии вопросов практически не вызывает. Метод ПЦР, так называемый золотой стандарт в выявлении инфекций, оказался эффективен и в отношении этого возбудителя.

Содержание:

Принцип действия ПЦР

Полимеразная цепная реакция с высокой точностью определяет в биологических материалах любые виды чужеродных микробов, включая вирусы, грибки, бактерии. Лабораторному исследованию подвергают пробы сыворотки крови, мочи, слюны и других жидкостей организма, в которых предположительно могут присутствовать патогены. Образцы обрабатывают химическим реагентом, благодаря которому в них выделяются фрагменты генома возбудителей. Затем посредством амплификации ферментом полимеразой и воздействия слабых электротоков обнаруженные в анализах количество чужеродных нуклеиновых кислот увеличивают, делая их видимыми для компьютерного оборудования.

Высокая чувствительность ПЦР обеспечивает точный результат даже при незначительном содержании инфекционных частиц в организме и отсутствии клинических признаков болезни. Это качественный анализ, отвечающий на главный вопрос: заражен человек или нет. Определить с его помощью, как давно был контакт с патогеном, какова инфекционная нагрузка и на какой стадии находится заболевание, невозможно. Для этого существуют другие методы диагностики.

Особенности теста ПЦР на новый коронавирус

Вирус SARS-CoV-2, как все респираторные агенты, проникает внутрь через слизистые оболочки носа, глаз или рта. В клетках он закрепляется, цепляясь специфическими шипами к рецепторам на их мембранах. Наиболее уязвимы для поражения ткани системы дыхания, мочевыделения, пищеварения, ЦНС, сердца. Их поверхность содержит рецепторы АПФ2 и ACE2, к которым тропны белки коронавируса.

В первые дни после заражения SARS-CoV-2 активно размножается в эпителии носоглотки. Инфекция содержится в отделяемом слизистом секрете и слюне. Носители, не подозревая об этом, распространяют ее при чихании, кашле, глубоком дыхании. Даже не имея симптомов такие люди опасны для окружающих. Выраженный COVID в большинстве случаев не отличается от обычных ОРВИ, специфических проявлений у него нет. Определить, заражен ли человек новым патогеном, способна только ПЦР.

В крови и лимфе коронавирусы не циркулируют. Пробы на анализ берут со слизистых оболочек носоглотки. Опыт медиков показал, что у людей с бессимптомным и манифестным течением болезни точностью исследования — около 80%, довольно велика вероятность ложноотрицательных результатов. На эпителии возбудитель долго не задерживается, подвергаясь иммунным атакам. По этой причине рационально повторять обследование несколько раз. А при длительном невыявлении вируса у людей с подозрением на COVID следует сдавать кровь на антитела к инфекции методом ИФА.

Кому необходим ПЦР-тест на коронавирус

Есть несколько основных категорий лиц, которые считаются приоритетными:

бывшие в контакте с людьми, у которых впоследствии был подтвержден COVID-19;

больные пневмонией;

обнаружившие у себя симптомы гриппа или ОРЗ после визита в неблагополучные регионы или очаги повышенного заражения;

граждане старше 65 лет с признаками простуды;

состоящие в группе риска по состоянию здоровья: онкологические больные, с хроническими патологиями сердца, сосудов, легких, эндокринной системы;

прошедшие курс лечения от COVID, которым требуется подтверждение выздоровления.

Перечисленным группам исследование должно проводиться в рамках ОМС. Другие желающие провериться на наличие SARS-CoV-2, могут сделать это в лабораториях платно. Необходимые для исследования тестовые системы производятся только в научно-исследовательских институтах, имеющих государственную лицензию.

Условия проведения теста

Перед взятием биоматериала на анализ необходима подготовка. В противном случае риск ложноотрицательного результата возрастает. За сутки нужно:

За 2 часа:

не принимать пищу, напитки и воду;

не употреблять освежающих леденцов, не чистить зубы;

не курить;

не пользоваться жевательной резинкой, полосканиями для полости рта, назальными препаратами, ингаляторами.

Мазок на исследование берут из зева пациента. Диагностический набор может быть доставлен ему на дом бесконтактно курьером медцентра. Аппликатором со стерильным тампоном на конце несколько раз проводят по слизистой. Затем помещают взятый материал в герметичный пакет и отправляют в лабораторию.

Возбудитель COVID относится к РНК-вирусам. В процессе тестирования методом обратной транскрипции обнаруженный геном переводят в ДНК. Затем размноженный геном вновь «превращают» в РНК.

Полный цикл анализа до получения результата занимает от 2 до 4 суток. Экспресс-диагностика проводится в течение 0,5–1 часа, но имеет большую погрешность. Ее данные считаются предварительными, требующими обязательной повторной проверки.

Результаты диагностики

Трактуются результаты исследования следующим образом:

РНК SARS-CoV-2 не обнаружена: тест отрицательный — вируса в биоматериале нет;

РНК SARS-CoV-2 обнаружена: тест положительный — инфекция в организме присутствует.

В зависимости от места прохождения теста ответ может быть выслан клиникой прльзователю на электронную почту или сообщен пациенту лечащим врачом. При сомнении в достоверности результатов рекомендуется пройти ПЦР-тестирование еще раз — через 4–5 дней. Повторное обследование требуется также закончившим лечение COVID-19 для подтверждения выздоровления.

12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция почти для каждого из нас стала обыденностью, даже если этот каждый никогда и слов таких не слышал. Медицинские центры наперебой предлагают диагностировать у вас все мыслимые болезни с помощью «ПЦР-анализа». Но задумывались ли вы о том, что это за анализ? как там всё работает? для чего еще применяют ПЦР? и есть ли какие-то альтернативные, менее дорогие, трудоёмкие и, может быть, более эффективные методы анализа? Нет? А мы вам всё равно об этом расскажем…

Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Партнер этой статьи — Bio-Rad

Компания Bio-Rad Laboratories, Inc. USA («Био-Рад», США) является одним из мировых лидеров производства оборудования и реагентов для научных исследований. В рамках взаимодействия с научными, медицинскими, биотехнологическими и образовательными организациями «Био-Рад» предлагает современные технологии, оборудование и реагенты.

Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков.

Изобретение ПЦР полностью и безвозвратно изменило медицину, науку и нашу жизнь в целом. Появилась возможность быстро и эффективно диагностировать наследственные заболевания и инфекции, определять личность преступников по одному волоску и свободно манипулировать генами. Не будь этого уникального метода, человечество вряд ли оказалось бы на пороге эпохи генной терапии.

История метода

Рисунок 1. История развития метода ПЦР. 1957 г. Американец Артур Корнберг выделил из бактерий Escherichia coli фермент ДНК-полимеразу. 1971 г. Норвежец Хьелль Клеппе опубликовал в Journal of Molecular Biology статью, в которой описал метод, очень похожий на ПЦР. 1976 г. Ученые из США — Эллис Чиен, Дэвид Эдгар и Джон Трела — выделили термостабильную ДНК-полимеразу из бактерии Thermus aquaticus и назвали ее Taq-полимеразой. 1977 г. Англичанин Фредерик Сенгер предложил свой метод секвенирования ДНК. 1983 г. Американец Кэри Мюллис изобрел и протестировал метод ПЦР. 1985 г. Появился первый прототип ПЦР-циклера — Mr. Cycle. 1987 г. Компания Cetus получила патент на метод ПЦР. 1988 г. Первое упоминание о ПЦР с обратной транскрипцией в журнале Science. 1990 г. Компания Cetus получила патент на метод ПЦР с Taq-полимеразой. 1991 г. Права на метод ПЦР и использование Taq-полимеразы купила компания Hoffman-La Roche за $300 млн. 1992 г. Сотрудники Roche Molecular Systems разработали метод ПЦР в реальном времени. 1992 г. Ученые из Калифорнийского университета в Беркли создали технологию иммуно-ПЦР. 1993 г. Кэри Мюллис стал лауреатом Нобелевской премии по химии за изобретение ПЦР. 2000 г. В Японии предложили метод опосредованной образованием петель изотермической амплификации (LAMP) как альтернативу стандартной ПЦР. 2004 г. Сотрудники компании New England Biolabs (NEB) разработали технологию хеликазозависимой амплификации. 2006 г. Британские ученые из TwistDX LTD разработали метод изотермической рекомбиназной полимеразной амплификации. 2011 г. Компания BioRad начала коммерческое использование технологии капельной цифровой ПЦР.
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

1957 г. Американец Артур Корнберг впервые выделил из бактерий Escherichia coli фермент, который назвал ДНК-полимеразой [1]. Статьи с описанием работы он отправил в Journal of Biological Chemistry, где их отвергли… из-за названия фермента: рецензенты считали, что нужно использовать более точный термин «полидезоксирибонуклеотидполимераза» и что вообще «ДНК» в названии указывает на «генетическую активность» (сущность, составляющую?) фермента, а раз ее нет, то и называть фермент так нельзя [2]. Однако в 1958 году в журнале сменился главный редактор, и статьи наконец увидели свет [3]. А уже в 1959 году Артура Корнберга удостоили Нобелевской премии по физиологии и медицине.

1971 г. Норвежский биохимик Хьелль Клеппе (рис. 2) опубликовал в Journal of Molecular Biology статью, в которой описал метод, очень похожий на ПЦР [4]. С 1968 по 1970 годы Клеппе работал постдоком в Университете Висконсина, в лаборатории Хара Гобинда Кораны — нобелевского лауреата 1968 года за расшифровку генетического кода. Именно в лаборатории знаменитого индийца чуть раньше разработали методики синтеза олигонуклеотидных праймеров — «затравок», необходимых для работы ДНК-полимеразы.

Рисунок 2. Хьелль Клеппе.

Статья, написанная Клеппе в соавторстве с Кораной и посвященная репарационной репликации с помощью ДНК-полимеразы, содержала такие строки: «Можно ожидать, что после охлаждения получатся две структуры, каждая из которых содержит полноразмерную матричную цепь, подобающим образом связанную с праймером. Для завершения процесса репаративной репликации нужно будет добавить ДНК-полимеразу. В результате получатся уже две молекулы исходного дуплекса. Цикл можно повторять, каждый раз добавляя свежую порцию фермента».

К сожалению, эта гипотеза так гипотезой и осталась. Может, Клеппе даже и проводил какие-то эксперименты, но результаты не публиковал.

1976 г. Ученые из США, Эллис Чиен, Дэвид Эдгар и Джон Трела, выделили термостабильную ДНК-полимеразу из бактерии Thermus aquaticus и назвали ее Taq-полимеразой [5]. Этот фермент сохранял активность даже при температурах выше 75 °С.

1977 г. Фредерик Сенгер, английский биохимик и лауреат Нобелевской премии 1958 года за работы по структуре белков [6], предложил метод секвенирования ДНК, сейчас известный как метод Сенгера [7], [8]. Этим он заработал еще одну нобелевскую медаль, в 1980-м, и стал единственным ученым в истории, получившим две «химических» премии [9].

1983 г. Руководитель лаборатории синтеза ДНК в Cetus Corporation (США) Кэри Мюллис (рис. 3) апрельской ночью ехал вдоль побережья из Сан-Франциско в Мендосино, в свой загородный дом. Долгой трехчасовой дорогой он обдумывал отнюдь не проведение выходных, а предстоящий эксперимент по секвенированию ДНК. И тут (по словам Мюллиса) его озарило: он ясно представил процесс амплификации (преумножения) генов, который позже получит название полимеразной цепной реакции.

До работы в Cetus Кэри Мюллис изучал химию в Технологическом институте Джорджии, затем биохимию в Калифорнийском университете в Беркли, а после работал постдоком в Калифорнийском университете Сан-Франциско по направлению «фармацевтическая химия». В 1979 году его пригласили в Cetus синтезировать праймеры для секвенирования, а уже через два года Мюллис возглавил лабораторию синтеза ДНК и автоматизировал производство олигонуклеотидов [10].

Рисунок 3. Кэри Мюллис.

В 1983 году Мюллис участвовал в проекте по изучению серповидноклеточной анемии. Чтобы проанализировать мутации, биологи проводили секвенирование по Сэнгеру, где используется один праймер для синтеза по одной из цепей ДНК. На серпантине по пути в Мендосино Мюллис предположил, что данные будут точнее, если использовать два праймера — для синтеза одновременно по двум цепям. Тогда можно будет сравнить получившиеся фрагменты и исключить неточности. И вот тут-то неожиданное прозрение заставило его вздрогнуть: если повторить цикл несколько раз, то можно получить множество копий нужного фрагмента строго определенной длины — она будет ограничена праймерами, от концов которых навстречу друг другу и будут строиться новые цепи ДНК [11]!

Вернувшись в понедельник в Cetus, Кэри Мюллис сразу направился в библиотеку, где попросил одного из сотрудников найти всю литературу о ДНК-полимеразе. В результате он не обнаружил ничего, касающегося амплификации. Это утверждение — самое слабое место во всей истории, так как в собранной библиотекарем стопке статей просто не могло не быть работы Хьелля Клеппе.

За следующие полгода Мюллис провел два эксперимента для проверки своей гипотезы, но безуспешно. Тогда он предположил, что отрицательный результат связан с большим размером ДНК-матрицы, используемой в опытах, и решил продолжить работу с маленьким вектором pBR322, в который вставил намножаемый ген. И 16 декабря 1983 года Мюллис впервые увидел вожделенные, хоть и слабые, полосы в геле для детекции. Однако другие сотрудники и руководство Cetus не разделили радости Мюллиса: их всё это попросту не интересовало [10].

1984 г. На ежегодной конференции корпорации Cetus в калифорнийском Монтерее Кэри Мюллис представил плакат, рассказывающий об амплификации гена β-глобина. К удивлению автора, и на этот раз его работу обошли вниманием [10].

Чуть позже Мюллису удалось кое-как убедить корпоративных боссов в важности его экспериментов: Cetus, как и многие начинающие компании, вкладывала ресурсы только в те проекты, что сулили прибыль в краткосрочной перспективе. Его освободили от обязанностей главы лаборатории и дали год на исследования ПЦР. И эти эксперименты завершились успешно [10].

1985 г. Мюллис и его группа разработчиков подали заявку на патент, который утвердили 28 июля 1987 года. В том же 1985-м в Cetus начали использовать для ПЦР термостабильную Taq-полимеразу, что значительно упростило работу: раньше перед каждым новым синтетическим циклом в смесь надо было добавлять новую порцию фермента, потому что он быстро выходил из строя от высоких температур. В декабре 1985 года журнал Science опубликовал первую статью Кэри Мюллиса о ПЦР [12].

Тогда же открылось совместное предприятие PerkinElmer Cetus Instruments (PECI), которое выпустило первый прототип ПЦР-циклера — Mr. Cycle (рис. 4). И только в 1987 году в продажу поступил первый общедоступный прибор, PCR-1000 Thermal Cycler.

Рисунок 4. Mr. Cycle — первый прототип ПЦР-амплификатора.

1986 г. Корпорация Cetus выплатила Кэри Мюллису премию $10 000. Остальные члены его группы получили по символическому доллару. Это обострило и так напряженные отношения в коллективе. Осенью Мюллис покинул компанию [13].

После ухода из Cetus он два года возглавлял молекулярно-биологический отдел в Xytronyx, а в 1992-м открыл компанию по продаже ювелирных изделий с амплифицированной ДНК знаменитостей — Элвиса Пресли, Мэрилин Монро и т.п. [14].

В 1993 году Кэри Мюллис стал лауреатом Нобелевской премии по химии за изобретение ПЦР. Его награждение — до сих пор больной вопрос для норвежского научного сообщества, где первооткрывателем метода считают Хьелля Клеппе.

Сейчас Мюллису 72 года, он работает научным сотрудником Научно-исследовательского института детской больницы Окленда и с 2011 года возглавляет предприятие Altermune LLC, занимающееся изучением иммунитета [14].

Кэри Мюллис нередко выступает на конференциях, рассказывает о своей жизни, работе и, конечно, своем открытии (см. видео 1). Он — прекрасный рассказчик, его всегда интересно слушать.

Видео 1. Выступление Кэри Мюллиса на конференции TED2002

Время от времени Мюллис принимает ЛСД. Однажды он рассказал о ночной встрече со светящимся зеленым

ПЦР анализ – что это такое, как делают ПЦР анализ крови.

Диагностика методом ПЦР на сегодняшний день является самым эффективным способом обнаружения и идентификации возбудителей половых инфекций в человеческом организме.

В этой статье мы разберем, что такое анализ ПЦР, как и где сдать этот тест.

Вы узнаете, какова цена этого исследования, где выполняют ПЦР анализы и как готовится, когда требуется сдать ПЦР анализ.

Вы узнаете о методиках забора мазков, какой врач берет анализы на ПЦР и почему медсестра плохо берет мазки на ПЦР анализ.

Разберем ПЦР анализ: что это такое и как выполняют это исследование.

ПЦР анализ: что это такое?

ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей.

В них происходит анализ на предмет присутствия возбудителей инфекционных, паразитарных или вирусных заболеваний.

Суть ПЦР состоит в многократном «клонировании» находящихся в исследуемом материале фрагментов ДНК инфекционного агента.

ПЦР диагностика инфекций считается наиболее быстрым, современным методом.

ПЦР диагностику используют повсеместно.

Все ведущие клиники используют диагностику ПЦР для верификации инфекционных заболеваний.

Часто пациенты спрашивают, какие именно заболевания можно выявить при помощи метода ПЦР диагностики?

Диагностика методом ПЦР используется для выявления широкого спектра возбудителей.

Как делают ПЦР анализ?

Такое исследование проводится одинаково для диагностики любого заболевания.

Разница может быть лишь в исследуемом субстрате.

Для этого пробирку с биоматериалом помещают в реактор, где с помощью катализаторов происходит процесс копирования молекул ДНК возбудителя инфекции.

ПЦР диагностика: расшифровка

Давайте разберем, как проводится расшифровка ПЦР диагностики.

Метод ПЦР очень быстрый и простой.

В качестве результата, вы получаете заключение врача лаборанта.

В результате четко будет прописано: получен положительный результат или отрицательный.

Ответ приходит на конкретную инфекцию.

Когда вы сдавали палитру инфекции напротив каждого возбудителя будет указано получен положительный или отрицательный результат.

Если вы сомневаетесь в результатах, покажите бланк вашему лечащему врачу.

Доктор поможет интерпретировать результат ПЦР и подберёт правильное лечение.

Помните!Исследование методом ПЦР не всегда можно использовать в медицинской практике.

Такие исследования не проводятся при контрольном тестировании после проведения лечения.

Когда берется ПЦР анализ после лечения, при разных инфекциях, можно получить положительный результат, который будет ложным.

Это связано с тем, что частички убитых возбудителей, уже неактивные, могут давать положительную реакцию.

Если вы сомневаетесь, можно ли вам сдавать ПЦР или нет, проконсультируйтесь с врачом.

Разберем, какие материалы могут быть применены для тестирования ПЦР.

в качестве материала для исследования методом ПЦР

Что может быть использовано в качестве материала для исследования методом ПЦР:

Врач всегда рекомендует определенные анализы.

Тем не менее, существует определенный перечень материалов, которые покажут наиболее точные результаты.

Соскобы со слизистых оболочек (чаще всего уретры, влагалища, шейки матки). Их исследуют, главным образом, для диагностики половых инфекций. Таким способом во взятом мазке можно обнаружить возбудителей уреаплазменной и микоплазменной инфекций, гонококки, хламидии, трихомонады, гарднереллы, грибки рода Candida, вирус генитального герпеса и др.

Моча. Ее можно использовать в диагностике урогенитальных инфекций. ПЦР анализ мочи является альтернативой исследованию мазка из уретры для мужчин. Это особенно подходит тем пациентам, которые боятся болезненного взятия уретрального мазка.

Бронхиальная слизь. Может исследоваться с целью диагностики респираторных форм хламидийной и микоплазменной инфекций.
Кровь. Анализ крови ПЦР – это один из самых точных способов выявления в организме некоторых патогенных вирусов.

Такое исследование позволяет диагностировать:

вирусные гепатиты
генитальный герпес
цитомегаловирусную инфекцию
ВИЧ
Другие биологические жидкости: секрет предстательной железы, околоплодная жидкость, слюна и др.

ПЦР диагностика. Что это такое, где применяется, как сдавать, расшифровка анализов

В большинстве случаев пациентам приходится сталкиваться с такой ситуацией, когда для обследования или определения заболевания требуется ПЦР диагностика. Важно понимать, что она собой представляет и для чего необходима.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – это такое исследование, которое помогает определить многие заболевания на начальных этапах развития. Суть его заключается в нахождении ДНК или РНК присутствующего в организме патогена. ПЦР позволяет определить возбудитель в тех случаях, когда другие виды исследования неэффективны.

Содержание записи:

Почему ПЦР-диагностика так популярна?

Популярность данного метода состоит в простоте и широте использования. Он применяется клиницистами для диагностики различных заболеваний. Позволяет быстро проводить сложные количественные и геномные исследования.

Одним из наиболее важных медицинских применений классического метода ПЦР является обнаружение микроорганизмов, которые способны вызывать патологические состояния.

Суть анализа ПЦР

ПЦР диагностика (что это такое, объясняется молекулярной биологией) является методом молекулярного клонирования, используемого для анализа короткой последовательности ДНК, которая присутствует в минимальных количествах в образцах, содержащих какой-либо генетический материал. Этот метод часто называют «копировальным аппаратом ДНК».

ПЦР диагностика осуществляется in vitro (вне тела) в лаборатории и основана на естественном процессе удвоения ДНК перед её делением. Кроме возможности обнаружить вирус, бактерию или другие микроорганизмы в образце, ПЦР позволяет идентифицировать их количество.

При таких заболеваниях, как заражение вирусом гепатита С или вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусная нагрузка является хорошим показателем того, на каком этапе находится заболевание и насколько эффективной является терапия.

Вооруженные этой информацией, врачи могут определить, когда следует начинать лечение, а также контролировать сам процесс. Это позволяет составить индивидуальный подход для каждого пациента.

ПЦР диагностика включает три этапа, в каждом из которых количество ДНК-мишени увеличивается в разы. В результате такой реакции получается более одного миллиарда копий исходной или «целевой» ДНК, что и позволяет оценить присутствие вируса в организме. Это и является основным свойством метода ПЦР.

Преимущества и недостатки метода

ПЦР диагностика (что это такое, рассказано выше) была подробно описана Кери Муллисом в 1983 году. С тех пор метод пользуется огромной популярностью в лабораторной практике.

Основными преимуществами такого вида исследования является:

универсальность;
быстрота результатов;
высокая вероятность получения достоверных результатов;
специфичность;
многообразие заболеваний, которые можно определить.

Универсальность метода ПЦР состоит в возможности использования любых физиологических материалов человека. Даже одного волоса достаточно для анализа.

Процесс обработки данных, благодаря автоматизации, может занять несколько часов. Специфичность состоит в выделении определённого ДНК-фрагмента, характерного для конкретного возбудителя. С помощью ПЦР-анализа могут быть диагностированы многие заболевания, как в стадии обострения, так и в стадии скрытого течения.

что это такое, этапы реакции, результаты

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяется при инфекционных болезнях. Главным преимуществом этой методики является возможность выявить скрытые инфекции и заболевание на раннем этапе, когда еще нет клинических и лабораторных признаков болезни.

Что такое ПЦР-анализ

Исследуемый образец помещают в специальную среду со строго заданными условиями. К материалу добавляют ферменты, участвующие в репликации отдельного участка ДНК и РНК возбудителя. Реакция повторяется до тех пор, пока не станет возможным идентифицировать вид инфекционного агента. ПЦР-диагностика инфекций считается самым информативным, точным и высокочувствительным диагностическим методом.

Суть исследования

Сборка цепочки нуклеотидов в ДНК происходит при участии фермента ДНК-полимеразы. К исследуемому биологическому материалу добавляются:

термостабильный фермент;
ионы магния;
смесь нуклеотидов;
праймеры.

Эта смесь помещается в особые температурные условия в термоциклер (амплификатор). Прибор последовательно нагревает или охлаждает пробирки. Во время одного температурного цикла происходит сборка 2 фрагментов ДНК. Чтобы накопилось достаточное для идентификации количество генетического материала, температурный цикл повторяют 25-35 раз.

Спектр применения

Сферы применения ПЦР включают:

клиническую медицину;
экологию;
криминалистику и судебную медицину;
фармакологию;
ветеринарию;
научные исследования.

Клиническая медицина использует ПЦР в:

Урологии и гинекологии для выявления vaginalis mycoplasma genitalium, gonorrhoeae trichomonas, vaginalis gardnerella, vaginalis candida, ИППП 7, chlamydia gonorrhoeae, ureaplasma urealyticum u parvum, ДНК chlamydia trachomatis, Сandida albicans, genitalium cmv h (hominis) и другие штаммы ВПЧ.
Неонатологии для выявления врожденных инфекций, генетических мутаций, инфицирования при прохождении родовых путей у ВИЧ-инфицированных матерей, для обнаружения микоплазмы, хламидии, РНК HCV, Neisseria spp, вирусов папилломы, краснухи, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр (вируса герпеса 4 типа), токсоплазмы и др.
Фтизиатрии и пульмонологии для выявления туберкулеза, pneumoniae, хламидии, микоплазмы и др.

Вариации метода

Сегодня используются следующие варианты ПЦР:

количественная;
секвенирование – позволяет прочесть сразу несколько участков ДНК;
пиросеквенирование – определение последовательности присоединения нуклеотидов в реакции амплификации путем их поочередного добавления.

Кроме стандартного метода, используется ПЦР в модификации FLASH, позволяющая проводить идентификацию инфекционного агента, не открывая пробирки. Это исключает риск загрязнения пробы и повышает информативность, чувствительность метода.

Широко применяется MLPA. Аббревиатура расшифровывается как мультиплексная амплификация зонда, синтезируемого лигазой. В реакции используется только 1 пара праймеров, что удешевляет и упрощает анализ. При этом происходит копирование не отдельного участка ДНК, а мультиплексной смеси лигированных зондов разной длины.

Сбор материала для диагностики

Для проведения анализа используется любой материал, содержащий ДНК:

Соскоб из уретры, цервикального канала, дыхательных путей, зева, конъюнктивы. Материал берется с поверхности слизистой с помощью особого ершика и помещается в стерильную емкость. В пробу не должна попасть кровь пациента. ПЦР соскоб используют для выявления урогенитальных, пульмонологических, офтальмологических и лор-инфекций.
Мокрота – ее отбирают в стерильную герметичную емкость для проведения анализа на туберкулез и другие респираторные инфекции.
Моча – в стерильную емкость отбирают 50 мл утренней мочи. Анализ можно сдать для выявления урогенитальных инфекций.
Кровь, плазма, сыворотка – кровь на ПЦР сдается из вены в объеме 1-1,5 мл на голодный желудок. Образец хранят при +4°С в течение 24 часов.
Биологические жидкости (слюна, амниотическая, спинномозговая, внутрисуставная, плевральная, простатическая). Забор производят с помощью пункции.
Биоптат. Отбирают его из органов ЖКТ для определения Helicobacter pylori или из других органов для идентификации онкологических заболеваний.

Что делать перед исследованием

Подготовка к ПЦР зависит от вида отбираемого материала. Например, перед ПЦР крови необходимо:

есть не позже 8-10 часов до забора;
не курить за 2 часа, не пить алкоголь за 1-2 дня;
не принимать препараты за 24 часа;
не волноваться, избегать физических нагрузок.

Чтобы при соскобе из урогенитального тракта получить достоверный результат, нельзя:

вступать в половые отношения позже 2 дней до анализа;
проводить спринцевание;
мочиться позже 3 часов до процедуры;
использовать химические ПАВ с антибактериальными свойствами для обмывания гениталий.

Не проводят отбор материала у женщин во время менструации.

Как берут материал на анализ методом ПЦР у мужчин

Если кровь, другие биологические жидкости и биоптаты отбираются без учета гендерных отличий, то при заборе материала из половых и мочевыводящих путей особенности мужского и женского организма учитываются. Соскоб из уретры для проведения ПЦР у мужчин делают так:

с помощью мыла и воды производят туалет половых органов;
наружный покров органа обрабатывают физраствором и подсушивают салфеткой;
осторожно вводят стерильный зонд на 2-4 см в канал;
вращательным движением производят забор биоматериала и помещают его в транспортный раствор в стерильном контейнере, отдают в лабораторию.

Делать соскоб нужно осторожно, чтобы не повредить слизистую, имеющую морфофункциональные нарушения, обусловленные имеющимся заболеванием мочеполовой системы.

Сбор материала у женщин

Для подтверждения патологий женской репродуктивной системы соскоб делают со слизистой влагалища или цервикального канала. Для отбора материала применяют специальный инструмент в виде щеточки или ватную палочку. Предварительно удаляют слизь. Полученный образец помещают в стерильный сосуд с физраствором для транспортировки в лабораторию.

Этапы реакции

Полимеразная реакция протекает в несколько этапов. Для каждого необходим особый набор реактивов и применение специальной аппаратуры.

Денатурация

На начальном этапе исследуемый образец поме

что это такое? Метод полимеразная цепная реакция или ПЦР-диагностика инфекций (мазок)

Как известно, множество заболеваний является следствием прогрессирующих или давно присутствующих в организме пассивных инфекций. Вполне естественно, что качественное и своевременное выявление существующей инфекции поможет предотвратить последствия деятельности болезнетворных микроорганизмов, и одним из наиболее действенных способов в данном случае является ПЦР диагностика, широко использующаяся множеством медицинских заведений.

Что такое ПЦР анализ?

Ответ на вопрос о том, что это такое – ПЦР анализ, волнует каждого, кто столкнулся с необходимостью проведения этой разновидности диагностики впервые. По своей сути, ПЦР (полимеразная цепная реакция) является способом ферментативного получения огромного числа копий фрагментов молекулы ДНК, подвергаемых изучению, путем разбиения ее цепи на несколько нитей. Причем в данном случае копируется исключительно изучаемый участок ДНК, что обуславливается его соответствием заданным параметрам поиска и присутствием в исследуемом образце.

Родоначальником метода ПЦР стал Кэри Мюллис, получивший Нобелевскую премию за свое открытие. Для того, чтобы провести данный анализ, требуется:

молекула ДНК, являющаяся вместилищем исследуемого фрагмента и играющая роль матрицы;
ДНК-полимераза, представляющая собой фермент, позволяющий произвести копии ДНК и нуклеотиды, необходимые для производства ДНК ДНК-полимеразой;
2 праймера ПЦР, представляющих собой 2 комплиментарных началу изучаемого участка ДНК коротких сегмента однонитевой нуклеиновой кислоты.

Как производится исследование методом ПЦР?

В современной нам медицине исследование методом ПЦР производится в 4 этапа, включающих в себя:

получение биологического материала, требуемого для исследования;
вычленение ДНК;
амплификацию ДНК-фрагментов;
детекцию ДНК-продуктов амплификации.

Рассмотрим каждый из них более подробно.

Способы получения биологического материала

Исследовать в данном случае можно практически все биологические жидкости: мочу, кровь, слюну, спинномозговую жидкость, отделяемое слизистых оболочек и раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Забираются образцы для исследования ПЦР одноразовыми инструментами, после чего помещаются в стерильные пробирки из пластика или же на культуральные среды с последующим перемещением в лабораторию, занимающуюся этим видом исследований.

Вычленение ДНК — первый этап проведения ПЦР-диагностики

Вычленение ДНК является самым первым этапом проведения ПЦР-диагностики. Заключается он в следующем: забранные у больного образцы обрабатываются специальным образом, в результате чего сдвоенная спираль ДНК расщепляется на несколько нитей. Стоит отметить, что с целью обеспечения чистоты реакции в образцы добавляется определенная компонента, позволяющая растворить всю органику. Именно этим способом удаляются аминокислоты, углеводы, липиды, пептиды, полисахариды и белки. Вследствие всех этих манипуляций создается ДНК.

Необходимость подобных мероприятий обуславливается, прежде всего, тем, что в основе ПЦР-диагностики инфекций лежит создание новых ДНК или РНК инфекций. И, конечно, осуществить это, не удалив клеточный материал, нельзя.

Что такое амплификация ДНК?

Для того, чтобы осуществить амплификацию ДНК, используются ДНК-матрицы, представляющие собой молекулы ДНК инфекций, использующиеся с целью клонирования ДНК. В основе самой амплификации лежит присущий всем живым организмам процесс достраивания ДНК при помощи удвоения его единичной цепочки.

Именно поэтому, взяв единичный фрагмент ДНК, специалист, выявляющий заболевание методом полимеразной цепной реакции, способен скопировать его и увеличить до требуемого числа копий в режиме цепной реакции. Так, например, первый цикл копирования образует 2 фрагмента, второй – 4, а третий уже, соответственно, 8.

Причем цикл длится считанные минуты и позволяет изменить температуру в микроскопическом химическом реакторе, содержащем все требуемые для воссоздания компоненты. В ходе присоединения искусственно созданных участков ДНК, ничем не отличающихся от ДНК вирусов и бактерий, создаются две короткие спирали, позволяющие воспроизвести будущую ДНК и включающие в свой состав 2 цепи участков ДНК.

В процессе амплификации применяется специфический участок ДНК-полимеразы и давший название тесту ПЦР, о котором идет речь в данной статье. Полимераза выступает в качестве катализатора реакции и обеспечивает прикрепление нуклеотидных оснований к увеличивающейся цепи ДНК, носящее последовательный характер. Это означает, что процесс амплификации ДНК является неоднократным возрастанием числа копий ДНК, присущих тому или иному микроорганизму.

Именно поэтому необходимость достраивания всей цепи ДНК для того, чтобы выявить возбудителя, отсутствует. Необходим лишь участок, присущий тому или иному микроорганизму. Производится анализ ПЦР на скрытые инфекции на специально программируемом оборудовании, а именно на амплификаторе или на ПЦР-термостате. Причем в зависимости от разновидности выявляемой инфекции данный процесс занимает не более 2-3 часов.

Детекция ДНК-продуктов амплификации

В ходе детекции результатов ПЦР продукты, получившиеся в ходе амплификации, разделяются. Параллельно с этим к смеси добавляются вещества, наделяющие фрагменты ДНК способностью к яркому свечению, говорящему о наличии болезнетворных элементов в исследуемом материале.

Основные преимущества метода полимеразной цепной реакции

К основным преимуществам метода полимеразной цепной реакции можно отнести:

Возможность выявления того или иного возбудителя напрямую. Подавляющее большинство классических методов лабораторной диагностики позволяют определить вирусы и микробы исключительно по присущим им косвенным признакам. Так, например, ИФА-диагностика позволяет обнаружить в крови заболевших белки, образованные в ходе распада возбудителей болезней. Метод же ПЦР дает возможность увидеть специфический участок ДНК возбудителя.
Высокую специфичность. В ходе изучения образцов, забранных у пациента, выделяется присущий только тому или иному возбудителю уникальный фрагмент ДНК.
Высокую чувствительность. Выявление болезнетворных микроорганизмов возможно даже тогда, когда в человеческом организме присутствует всего один представитель своего вида.
Универсальность. На сегодняшний день реакция ПЦР может быть получена практически при любом биологическом материале – от мочи и до соскоба клеток эпителия.
Быстроту получения результата. Благодаря универсальности способа обработки предоставленного для анализа материала, распознаванию продуктов реакции, а также использованию современного оборудования произвести диагностику ПЦР ДНК можно всего за 5-6 часов.
Возможность определения самых разнообразных возбудителей. Метод ПЦР-диагностики настолько чувствителен, что дает возможность определить возбудителя не только у больного, страдающего заболеванием в острой стадии, но и при хронической форме заболевания.

Основные недостатки метода полимеразной цепной реакции

К основным недостаткам метода полимеразной цепной реакции относятся:

Необходимость грамотного подхода к подбору последовательности праймеров. Конечно же, в лабораториях используются программы, существенно упрощающие поиск требуемых регионов ДНК, однако ни одна из имеющихся методик не гарантирует хорошую работу праймеров, ведь фактически они являются набором молекул разнообразного состава и длины.
Это является причиной возникновения «минусовых» фракций, представляющих собой молекулы, последовательность которых укорочена на одно или несколько оснований, причем местоположение пропущенного нуклеотида в данной ситуации может быть любым. Именно поэтому получить качественный результат можно только после того, как эти фракции будут очищены.
Сложности со смешиванием 4-х видов нуклеотидов. Различная пропорция нуклеотидов может повлечь за собой значительное увеличение ошибок ДНК-полимеразы в ходе амплификации. Именно поэтому в ходе ПЦР-анализа на инфекции требуется следить за концентрацией ионов магния ввиду того, что уменьшение катионов оказывает влияние на специфичность и температуру гибридизации праймеров.
Необходимость соблюдения определенных технологий, а также тщательного соблюдения всех этапов исследования в изолированных друг от друга лабораторных зонах, обусловленная риском амплификации незначительных объемов неспецифических ДНК, способных привести к постановке неверного диагноза. Кроме того, ПЦР-анализ на инфекции больше используется для получения ответов на поставленные вопросы по принципу «да-нет», а именно о том, присутствует ли в образце возбудитель того или иного заболевания.
А вот для определения того, какой микроорганизм из огромного количества существующих имеется в образце, этот анализ подходит замечательно. Обуславливается это тем, что метод ПЦР наиболее эффективен тогда, когда тестовая реакция содержит одну или несколько пар праймеров. Если же в одной реакции задействовано большее количество пар праймеров, соответствующих разнообразным инфекциям, появляется проблема, связанная с возникновением артефактов.
Возможность неправильной интерпретации результатов анализов, связанная с тем, что определение ДНК возбудителя далеко не во всех случаях свидетельствует о том, насколько он жизнеспособен, а также о непосредственной связи обнаруженного инфекционного агента с тем или иным патологическим процессом.
Возможность получения неверного результата в случае неправильного забора биоматериала. Строго говоря, для того, чтобы произвести качественный ПЦР-анализ, необходимо правильно забрать образцы биоматериала у пациента и правильно их подготовить.
Необходимость максимально полного удаления антикоагулянтов и остатков гемма во время извлечения нуклеиновых кислот с целью обеспечения максимальной эффективности амплификации.
Склонность ДНК-полимераз, используемых в ПЦР, к ошибкам.

Какие инфекции выявляет ПЦР?

На сегодняшний день к числу ПЦР инфекций можно отнести:

пневмонию и дифтерию бактериальной и вирусной формы, туберкулез;
болезни ЖКТ, обусловленные присутствием в организме бактерии Helicobacter Pilori;
болезни, обусловленные наличием в организме сальмонеллы, холерного вибриона, боррелий;
инфекции, носящие вирусный характер, например, ВИЧ, вирусы папилломы человека, герпеса, гепатита, онковирусы и ретровирусы;
инфекционный мононуклеоз;
заболевания, обусловленные генетическими особенностями человека;
ЗППП, например, гарднереллез, уреаплазмоз, микоплазмоз, хламидиоз, трихомониаз;
клещевой энцефалит;
цитомегаловирусную инфекцию;
кандидоз;
листероз и многие другие заболевания, на протяжении многих лет способные присутствовать в человеческом организме в скрытом виде.

Как расшифровывается ПЦР-анализ?

Ответ на вопрос о том, как расшифровывается ПЦР-анализ, волнует большинство из тех пациентов, кто сдал его впервые. В данном случае все достаточно просто. После того, как исследование будет закончено, пациент получает либо положительный, либо отрицательный результат. Естественно, что положительные результаты анализа будут говорить о наличии в организме той или иной инфекции, а отрицательные – о том, что в организме больного та или иная инфекция отсутствует, т.е. в биологическом материале, забранном у больного, ничего не было обнаружено.

Несмотря на кажущуюся простоту расшифровки, трактовать результаты анализов должен только ваш лечащий врач, который и назначил прохождение данного анализа. Причем расстраиваться в случае получения положительных результатов не стоит, ведь ПЦР методика в данном случае выявила заболевание, что означает, что в ближайшем времени будут приняты все меры по его скорейшему излечению. И главное здесь – не пытаться заниматься самолечением и не игнорировать этот процесс, растягивая срок болезни.

История PCR

Roche и PCR: монументальное научное открытие

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ¹, признанная одним из важнейших научных достижений 20-го века, представляет собой быстрый и простой способ создания неограниченных копий ДНК из одной исходной цепи. Миллионы копий участка ДНК создаются всего за несколько часов. Скопированную ДНК можно затем надежно использовать в широком спектре тестов для диагностики или мониторинга заболеваний или для фундаментальных исследований молекулярной биологии.

PCR был удостоен Нобелевской премии по химии 1993 года.

Эволюция и революция PCR

В 1983 году Кэри Маллис, доктор философии, ученый из Cetus Corporation, задумал ПЦР как метод копирования ДНК и синтеза больших количеств конкретной целевой ДНК. В течение следующих двух лет группа ученых Cetus, осознавшая потенциальное влияние ПЦР на молекулярную биологию, исследовала, уточнила и воплотила теоретический процесс в жизнь.

Команда впервые была представлена в 1985 году на ежегодном собрании Американского общества генетики человека. Позже в том же году журнал «Наука» Американской ассоциации развития науки № ³ сообщил о результатах в первой публикации этого процесса.

Два значительных достижения позволили ПЦР стать современной технологией — Taq-полимераза и термоциклер.

В 1986 году ученые Cetus выделили полимеразу Taq из Thermus aquaticus, бактерии, обнаруженной в горячих источниках.² Поскольку Taq может выдерживать высокие температуры, он устраняет необходимость вмешательства человека во время реакции, ⁴ упорядочивает и сокращает процесс. Без термостойкого фермента, такого как полимераза Taq, ПЦР не могла бы использоваться в больших масштабах, так как процесс был бы слишком громоздким.

До Taq на втором этапе ПЦР использовалась ДНК-полимераза из E. coli, фермент, который не выдерживал быстрого нагрева и охлаждения. Используя E. Coli, полимеразу заменяли вручную на каждой стадии реакции, поскольку она разлагалась от тепла.²

В 1987 году PerkinElmer, другая биотехнологическая компания из США, запустила термоциклер, прибор, который запрограммирован на регулирование температуры реакции, нагрев или охлаждение образцов по мере необходимости. Опять же, этот прогресс минимизировал человеческое взаимодействие в реакции, что привело к элегантному, эффективному и оптимизированному процессу. ²

Рождение компании Roche Molecular Diagnostics

В 1991 году компания Roche выкупила права на ПЦР у Cetus и инвестировала в совершенствование науки для использования в молекулярной диагностике для выявления заболеваний.Компания Roche Molecular Diagnostics не только определила и усовершенствовала ПЦР, но и осталась явным лидером и первооткрывателем этой технологии.

Тесты на антитела, антиген и ПЦР для COVID-19: узнайте различия: выстрелы

Центр тестирования антител COVID-19 можно увидеть на рынке Стива на 9-й улице в Бруклине 25 апреля. Вот краткое руководство по определению плюсов и минусов каждого типа теста.

Майкл Нэгл / Информационное агентство Синьхуа / Getty Images

скрыть подпись

переключить подпись

Майкл Нэгл / Информационное агентство Синьхуа / Getty Images

Центр тестирования антител COVID-19 замечен на рынке Стива на 9-й улице в Бруклине 25 апреля.Вот краткое руководство по определению плюсов и минусов каждого типа теста.

Майкл Нэгл / Информационное агентство Синьхуа / Getty Images

Обновлено 9 мая, чтобы отразить разрешение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов на первый тест на антиген.

В новостях много говорится о тестировании на коронавирус. Первое и самое безотлагательное внимание уделяется расширению доступа к тестам для диагностики людей с текущими инфекциями.Но теперь появляются и другие тесты. Стали доступны тесты на антитела, которые могут идентифицировать людей с признаками перенесенной инфекции. И третий тип испытаний уже готов.

Вот краткое руководство по определению плюсов и минусов для каждого типа теста.

Диагностический тест или ПЦР

Назначение: Врачи используют этот тест для диагностики людей, которые в настоящее время болеют COVID-19. Это тот, о котором мы так много слышали.

Как это работает: В этом тесте используется образец слизи, обычно взятой из носа или горла человека.Тест также может работать на слюну — это расследуется. Он ищет генетический материал коронавируса. В тесте используется технология, называемая ПЦР (полимеразная цепная реакция), которая значительно усиливает вирусный генетический материал, если он присутствует. Этот материал можно обнаружить, когда человек активно заражен.

Насколько он точен: Вообще говоря, это самые надежные тесты.Однако может пройти несколько дней, прежде чем вирус начнет реплицироваться в горле и носу, поэтому тест не выявит тех, кто недавно был инфицирован. Иногда мазки не обнаруживают признаков активной инфекции.

Насколько это быстро: Эти образцы обычно отправляются в централизованные лаборатории для анализа, поэтому получение результатов может занять несколько дней. В начале пандемии время ожидания было больше из-за отставания в тестировании. Есть также два экспресс-теста ПЦР, которые можно запустить на специализированном оборудовании, уже широко распространенном по всей территории США.S. Самый быстрый тест от Abbott Laboratories может дать результат за 13 минут, но одно исследование показывает, что этот тест может пропустить более 10% случаев.

Тест на антитела

Что он делает: Тесты на антитела выявляют людей, которые ранее были инфицированы коронавирусом. Они не показывают, инфицирован ли человек на данный момент. Прежде всего, это хороший способ отслеживать распространение коронавируса среди населения.

Как это работает: Это анализ крови.Ищет антитела к коронавирусу. Ваше тело вырабатывает антитела в ответ на инфекционный агент, такой как вирус. Эти антитела обычно возникают через четыре дня или более чем через неделю после заражения, поэтому они не используются для диагностики текущего заболевания.

Насколько это точно: На рынке представлено более 120 тестов на антитела. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов разрешило их продажу без разрешения FDA, и качество вызывает большую озабоченность. Несколько тестов были добровольно представлены на дополнительное одобрение FDA.Другие тесты проверяются отдельными медицинскими лабораториями или университетскими исследователями.

В целом, эти тесты недостаточно надежны, чтобы люди могли действовать на основе результатов. Исследователи говорят, что даже если бы вы были уверены, что у вас есть антитела к коронавирусу, все равно неизвестно, защищает ли это вас от повторного заболевания. Тем не менее, эти тесты могут предоставить хорошую информацию о темпах заражения в сообществе, где ошибки в индивидуальных результатах имеют меньшее влияние.

Насколько это быстро: Эти тесты обычно дают результаты в течение нескольких минут, основываясь на капле крови, взятой из пальца.Некоторые исследовательские лаборатории используют более сложный тест на антитела, называемый иммуноферментным анализом ELISA (иммуноферментный анализ), который более точен, но не так широко доступен.

Тест на антиген

Что он делает: Этот тест выявляет людей, которые в настоящее время инфицированы коронавирусом. Его можно использовать как быстрый тест для выявления активных инфекций. Первоначально он не будет использоваться для диагностики заболевания, но может использоваться для проверки людей с целью выявления тех, кто нуждается в более точном тесте.

Как это работает: Тесты на антигены могут идентифицировать вирус в секретах из носа и горла. Он делает это путем поиска белков вируса (в отличие от диагностического теста, который ищет генетический материал). Эта же технология используется в кабинете вашего врача для быстрого тестирования на стрептококк.

Насколько это точно: Первый из этих тестов получил разрешение FDA 8 мая. Компания Quidel Corp. заявляет, что будет использовать первые 40 000 тестов, чтобы получить лучшее представление о точности своего теста.Исследователи не ожидают, что он будет таким же точным, как диагностический тест ПЦР, но не исключено, что тесты на антигены могут использоваться для скрининга пациентов на наличие инфекции. Доктор Джордан Лазер, директор лаборатории Northwell Health, отмечает, что тесты на антигены используются для быстрых тестов на стрептококк, которые являются надежными, и быстрых тестов на грипп, которые нет.

Насколько это быстро: Эти тесты должны дать результаты всего за несколько минут. В результате их можно использовать для проверки людей в больницах, на определенных рабочих местах или в других случаях, когда важно быстро выяснить, подвержен ли кто-то в настоящее время риску распространения болезни.Но до тех пор, пока не будет доказано, что эти тесты являются очень точными, врачам все равно потребуется проверить положительный результат с помощью ПЦР-теста, чтобы поставить медицинский диагноз.

Вы можете связаться с научным корреспондентом NPR Ричардом Харрисом по телефону [email protected] .

Диагностическое тестирование и скрининг на SARS-CoV-2

Диагностические образцы

Образцы для диагностических тестов на SARS-CoV-2 могут быть взяты из верхних отделов (мазки из носоглотки / ротоглотки, носовой аспират, назальный смыв или слюна) или нижних дыхательных путей (мокрота или трахеальный аспират или бронхоальвеолярный лаваж — БАЛ).Данные, сравнивающие точность тестирования RT-PCR, показывают, что чувствительность теста может варьироваться в зависимости от типа образца.

Одно исследование показало, что уровни вирусной РНК выше и РНК чаще обнаруживается в образцах из носа по сравнению с образцами из полости рта, однако это открытие было основано на небольшом количестве протестированных мазков из носа [1]. Группа исследователей COVID-19 в США, сравнив 117 пар образцов из носоглотки и ротоглотки одновременно от 12 пациентов, обнаружила, что 32 пары не согласуются с одним положительным и другим отрицательным тестом: образец из носоглотки дал положительный результат в 66% этих пар по сравнению с 34% для образца из ротоглотки [2].Другое исследование не показало более высоких уровней вирусной РНК в носоглотке по сравнению с образцами из ротоглотки [3].

При сравнении различных типов образцов предварительные результаты предпечатной статьи, еще не прошедшей экспертную оценку, показали, что наиболее точным образцом для диагностики SARS-CoV-2 была мокрота, за которой следовали мазки из носа и горла [4]. Мета-анализ исследований слюны показал чувствительность 91% (95% ДИ = 80% -99%) для тестов слюны и 98% (95% ДИ 89% -100%) чувствительность для тестов мазков из носоглотки при ранее подтвержденном COVID-19 инфицированные пациенты с умеренной неоднородностью исследований [5].Другое исследование показало, что слюна является наиболее подходящим образцом для диагностики SARS-CoV-2 [6]. Слюна предлагает неинвазивный образец, который также можно рассмотреть для самостоятельного отбора. В ситуации, когда образец из носоглотки или другой вышеупомянутый образец неприемлем, слюна может рассматриваться как альтернативный образец.

Комбинация образцов мазков из носоглотки и ротоглотки оказалась более чувствительной для диагностики SARS-CoV-2 по сравнению с мазками из носоглотки только в трех различных исследованиях [7] [8,9].

Типы анализов

Существует три основных типа тестов для обнаружения, относящихся к диагностическому тестированию и скринингу COVID-19, в зависимости от обнаруживаемой цели:

Тесты на нуклеиновую кислоту обнаруживают присутствие вирусной РНК. Обычно они используют стадию амплификации на основе RT-PCR.
Тесты на антиген выявляют присутствие вирусного антигена, как правило, части поверхностного белка.
Тесты на антитела обнаруживают наличие антител, генерируемых против SARS-CoV-2.Три наиболее часто используемых анализа — это иммуноферментный анализ (ELISA), хемолюминесцентный анализ (CLIA) и анализ латерального потока (LFA). Кроме того, используются тесты нейтрализации вирусов, которые могут специфически обнаруживать нейтрализующие антитела, но в основном они используются для проверки и исследования тестов. Предварительные отчеты об анализах ELISA показали хорошую корреляцию результатов титрования антител с вируснейтрализующими антителами [116, 160].

Помимо этих основных анализов обнаружения, можно также провести полногеномное секвенирование для определения последовательности вируса SARS-CoV-2 в образце с возможными квазивидовыми вариантами [10].

Внутренние тесты по сравнению с медицинскими приборами для диагностики in vitro

Внутренние тесты — это некоммерческие методы испытаний in vitro, выполняемые в лабораториях в соответствии с научно опубликованным протоколом после внутренней проверки эффективности в соответствии с их системой обеспечения качества, основанной на международных стандартах качества клинических лабораторий. Собственные методы тестирования полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени, нацеленные на вирусную РНК SARS-CoV-2, являются золотым стандартом in vitro для диагностики случаев подозрения на COVID-19.Эти ПЦР-тесты можно автоматизировать с помощью роботизированных молекулярных платформ для высокопроизводительной пакетной обработки клинических образцов.

Медицинские устройства для диагностики in vitro (IVD) — это коммерческие наборы или системы, на которые должна быть нанесена этикетка CE-IVD для размещения на рынке ЕС. Директива IVD 98/79 / EC [11] определяет «медицинское устройство для диагностики in vitro» как любое медицинское устройство, которое является реагентом, продуктом реагента, калибратором, контрольным материалом, комплектом, инструментом, аппаратом, оборудованием или системой, независимо от того, используются ли они. отдельно или в комбинации, предназначенные производителем для использования in vitro для исследования образцов, включая кровь и донорские ткани, полученные из человеческого тела, исключительно или в основном с целью предоставления информации в контексте COVID-19, касающейся физиологическое или патологическое состояние, или контролировать терапевтические меры.«Назначение» IVD означает использование, для которого предназначено устройство, в соответствии с данными, указанными производителем на этикетке, в инструкциях по применению и / или в рекламных материалах. В соответствии со статьей 9 [11] Директивы IVD 98/79 / EC о процедурах оценки соответствия для диагностических устройств COVID-19, которые не предназначены для использования в качестве самопроверки, производитель должен, чтобы нанести маркировку CE, составить декларация соответствия ЕС, необходимая перед размещением устройств на рынке.Это процедура самодекларации, основанная на выполнении основных требований безопасности и производительности, перечисленных в Директиве, и технических характеристик устройства, заявленных производителем. В случае самотестирования необходимо участие стороннего органа по оценке соответствия. Рабочие характеристики устройств для тестирования на месте и для быстрой диагностики, представленных на рынке ЕС с маркировкой CE, могут отличаться в лаборатории по сравнению с исследованием производительности, проведенным производителем для целей маркировки CE. Существует несколько сотен CE-маркированных IVD для обнаружения вируса COVID-19 или антител: независимая оценка их диагностической точности продолжается.

Использование по назначению

Диагностическое тестирование на COVID-19 путем обнаружения вирусной РНК или белка в респираторных образцах поддерживает принятие решений для клинического, инфекционного контроля или управления общественным здравоохранением. Обнаружение SARS-CoV-2 для диагностики пациентов с симптомами, подобными COVID-19, важно для ухода за пациентами, сортировки и изоляции в медицинских учреждениях.

Обнаружение SARS-CoV-2 также может использоваться для скрининга близких контактов на бессимптомную инфекцию и заболевание в рамках отслеживания контактов или расследования вспышек. Тестирование также используется для выявления инфекции в ключевых целевых группах, таких как медицинские и социальные работники, в рамках местных программ эпиднадзора. Это особенно важно для предотвращения и раннего контроля передачи вируса уязвимым лицам, живущим в закрытых учреждениях, таких как учреждения длительного ухода.

Помимо использования в режиме реального времени для лечения случаев в медицине или общественном здравоохранении и контроля передачи, тесты на обнаружение вирусов используются в целях надзора, ориентированного на политику, для мониторинга эпидемиологической ситуации с точки зрения заболеваемости и распространенности инфекций и болезней.Это использование включает обследования распространенности и программы дозорного эпиднадзора в группах пациентов, оказывающих первичную или стационарную помощь.

Тесты на антитела в настоящее время имеют ограниченное диагностическое применение. Их можно использовать в качестве дополнения к тестам на обнаружение вирусов для пациентов, поступивших поздно после появления симптомов в медицинские учреждения и у которых тесты на обнаружение вирусов отрицательны, несмотря на явные признаки инфекции. Кроме того, они потенциально могут быть использованы для информирования о решении о выписке пациентов, которые выздоровели от инфекции SARS-CoV-2, но остаются РНК-положительными с помощью ОТ-ПЦР в течение длительного времени после исчезновения симптомов.Степень защитного иммунитета, обеспечиваемого антителами, обнаруженными у субъектов, перенесших в прошлом инфекцию SARS-CoV-2, или коррелирующая с ними, все еще исследуется. Как только это будет прояснено, такие тесты на антитела могут стать, вместе с прямым обнаружением вируса, важным инструментом в стратегиях деэскалации. В настоящее время тесты на антитела используются для сероэпидемиологических обследований и исследований.

Скорость и точка тестирования

Двумя другими важными аспектами анализов обнаружения являются их быстрота и простота использования.Общие технические спецификации медицинских устройств для диагностики in vitro (IVD, Решение Комиссии 2002/364 / EC) [12] определяют быстрые тесты как качественные или полуколичественные IVD, используемые один раз или в небольшой серии, которые включают неавтоматизированные процедуры и были разработаны, чтобы дать быстрый результат. Как правило, экспресс-тесты можно выполнить менее чем за 30 минут.

Тесты, которые могут быть выполнены в месте оказания медицинской помощи менее специализированным персоналом, называются тестами в месте оказания медицинской помощи (POCT). POCT обычно также являются экспресс-тестами.

Когда экспресс-тесты на антигены хорошо подтверждены, их можно рассматривать для быстрой диагностики инфицированных пациентов. Однако эти тесты, как правило, имеют более низкую чувствительность, чем ОТ-ПЦР, и поэтому отрицательный экспресс-тест не может исключить инфекцию. Они могут быть полезны во время продолжающейся вспышки, когда недоступен своевременный доступ к чувствительным молекулярным тестам, но отрицательный результат должен интерпретироваться медицинским работником с осторожностью и на основании клинической оценки.

Точность диагностики и подтверждение

Комиссия опубликовала рабочий документ, в котором предлагается предварительное определение критериев эффективности диагностического теста COVID-19, а также проанализировала общедоступные данные о производительности коммерческих тестов IVD с маркировкой CE [13].Эти критерии включают аналитическую чувствительность, аналитическую специфичность, клиническую чувствительность и клиническую специфичность. Следуя этому документу, Европейская комиссия собирает в доступной для поиска базе данных данные производителей коммерческих тестов IVD с маркировкой CE и анализирует тесты, разработанные в собственной лаборатории, с данными о производительности в научных публикациях [14].

Большое количество коммерческих тестов для обнаружения РНК SARS-CoV-2 или антигена, а также серологических тестов на антитела, специфичные для SARS-CoV-2, размещаются на рынке или потенциально могут быть экспортированы в страны ЕС с маркировкой CE-IVD.Однако информация об их клинической эффективности все еще ограничена, и дальнейшее научное подтверждение их диагностической точности, то есть клинической чувствительности и специфичности, является приоритетом. Это должно быть выполнено в реальных проспективных когортных исследованиях пациента, собирающегося пройти тестирование, или населения в целом. Фонд инновационных новых диагностических средств (FIND), сотрудничающий центр ВОЗ по укреплению лабораторий и оценке диагностических технологий, получил заявки от более 600 производителей для IVD и проводит независимые клинические оценки в нескольких больницах, сотрудничающих с FIND, в некоторых из них.ECDC собирает данные о клинических характеристиках коммерческих тестов с 1 апреля из лабораторий государств-членов, желающих поделиться такой информацией друг с другом.

Эксперты ВОЗ с помощью процедуры включения в список для использования в чрезвычайных ситуациях (EUL) составляют краткий список молекулярных тестов для обнаружения на основе данных производителей как подходящих для срочных закупок до полной клинической валидации и предварительной квалификации [15].

Биобезопасность

3 июня 2020 года Комиссия приняла Директиву (ЕС) 2020/739 [16], обновляющую Директиву о биологических агентах 2000/54 / EC с классификацией SARS-CoV-2 как группы риска 3 в списке биологических агентов Приложения III.В соответствии со Статьей 16 (1) (c) и в соответствии с временными рекомендациями ВОЗ по лабораторной биобезопасности для лабораторных процедур COVID-19, нераспространяющие диагностические лабораторные работы, связанные с SARS-CoV-2, должны проводиться на объекте с использованием эквивалентных процедур. как минимум до уровня сдерживания 2. Работа по размножению (культивирование вируса, анализы нейтрализации) с участием инфекционного SARS-CoV-2 должна проводиться в лаборатории уровня сдерживания 3 при отрицательном атмосферном давлении.

Возможности и методики тестирования

В рамках Совместной европейской дорожной карты по отмене мер сдерживания COVID-19 Европейская комиссия выпустила Руководство по диагностическим тестам COVID-19 in vitro и их эффективности [17].Эти руководящие принципы оценивают как информацию, которую различные типы тестов могут предоставить для принятия решений в медицине и общественном здравоохранении, так и то, как проверить соответствие результатов теста поставленной цели. Чтобы способствовать расширению возможностей тестирования и обеспечить надлежащее качество тестов в ЕС, Комиссия предприняла ряд действий, включая:

оценка общих подходов в национальных стратегиях тестирования;
обсуждение передового опыта и разработка руководства по оценке эффективности и оценке соответствия испытаний;
предоставление справочных материалов и общепринятых методов сравнения устройств;
обмен информацией о выполнении тестов;
дополнительный диалог с отраслью и национальными компетентными органами;
поддержка в борьбе с контрафактными устройствами;
согласование спроса и предложения;
обеспечение справедливого распределения лабораторных принадлежностей между государствами-членами.

В этом контексте ECDC способствует наращиванию потенциала и усилиям по валидации тестов путем мобилизации знаний и опыта государств-членов в рамках европейских сетей экспертов в области общественного здравоохранения и справочных лабораторий. ECDC координирует сеть COVID-19 / SARS-CoV-2, которая включает лабораторных экспертов и регулярно обсуждает ключевые лабораторные аспекты внутри сети. В тесном сотрудничестве с ВОЗ и справочными лабораториями ВОЗ ECDC организует мероприятия по внешней оценке качества и способствует обмену информацией о результатах тестов между лабораториями общественного здравоохранения государств-членов из лабораторной сети COVID-19.

Несмотря на нехватку расходных материалов в прошлом, возможности тестирования для обнаружения вирусов в странах ЕС / ЕЭЗ быстро расширились за счет развертывания диагностики на основе ПЦР из центральных лабораторий общественного здравоохранения в региональные и местные диагностические лаборатории и использования высокопроизводительных платформы для автоматизированного молекулярного тестирования. Однако дополнительные возможности для гораздо более масштабного тестирования с помощью быстрых коммерческих тестов, как только такие тесты будут проверены на адекватную производительность для обнаружения инфекции, скорее всего, будут необходимы для полного удовлетворения операционных потребностей в борьбе с COVID-19 в ближайшие месяцы.

Список литературы

Какова диагностическая точность тестов на антитела для выявления инфекции вирусом COVID-19?

Фон

COVID-19 — это инфекционное заболевание, вызываемое вирусом SARS-CoV-2, которое легко распространяется между людьми так же, как простуда или грипп. Большинство людей с COVID-19 имеют респираторное заболевание от легкой до умеренной степени тяжести, а у некоторых могут отсутствовать симптомы (бессимптомная инфекция).Другие испытывают серьезные симптомы и нуждаются в специализированном лечении и интенсивной терапии.

Иммунная система людей с COVID-19 реагирует на инфекцию, вырабатывая белки, которые могут атаковать вирус (антитела) в их крови. Тесты на обнаружение антител в крови людей могут показать, есть ли у них COVID-19 в настоящее время или он был ранее.

Почему важны точные тесты?

Точное тестирование позволяет идентифицировать людей, которым может потребоваться лечение или которым необходимо изолировать себя, чтобы предотвратить распространение инфекции.Неспособность обнаружить людей с COVID-19, когда он присутствует (ложноотрицательный результат), может задержать лечение и подвергнуть риску дальнейшее распространение инфекции среди других. Неправильная идентификация COVID-19 при его отсутствии (ложноположительный результат) может привести к ненужным дальнейшим тестам, лечению и изоляции человека и близких контактов. Правильная идентификация людей, ранее переболевших COVID-19, важна для измерения распространения заболевания, оценки успеха вмешательств в области общественного здравоохранения (например, изоляции) и, возможно, выявления людей с иммунитетом (если в будущем будет показано, что антитела указывают на иммунитет).

Для выявления ложноотрицательных и ложноположительных результатов результаты тестов на антитела сравниваются у людей, о которых известно, что они заражены COVID-19 и заведомо не инфицированы COVID-19. Участники исследования классифицируются в зависимости от того, известно ли им о COVID-19 или нет, на основании критериев, известных как «эталонный стандарт». Многие исследования используют образцы, взятые из носа и горла, для выявления людей с COVID-19. Образцы подвергаются тесту, называемому полимеразной цепной реакцией с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Этот процесс тестирования может иногда пропускать инфекцию (ложноотрицательный результат), но дополнительные тесты могут выявить инфекцию COVID-19 у людей с отрицательным результатом ОТ-ПЦР.К ним относятся измерение клинических симптомов, таких как кашель или высокая температура, или визуализационные тесты, такие как рентген грудной клетки. Людей, у которых известно, что они не заражены COVID-19, иногда можно идентифицировать по хранимым образцам крови, взятым до того, как COVID-19 появился, или по пациентам с респираторными симптомами, вызванными другими заболеваниями.

Что изучал обзор?

В исследованиях были изучены три типа антител: IgA, IgG и IgM. Большинство тестов измеряют как IgG, так и IgM, но некоторые измеряют одно антитело или комбинации трех антител.

Уровни антител повышаются и понижаются в разное время после заражения. IgG повышается последним, но сохраняется дольше всех. Уровни антител обычно максимальны через несколько недель после заражения.

Некоторые тесты на антитела требуют специального лабораторного оборудования. Другие используют одноразовые приспособления, похожие на тесты на беременность. Эти тесты можно использовать в лабораториях или где бы ни находился пациент (на месте оказания медицинской помощи), в больнице или дома.

Мы хотели выяснить, можно ли использовать тесты на антитела:

— достаточно точные для диагностики инфекции у людей с симптомами COVID-19 или без них, и

— для определения наличия у кого-либо COVID-19.

Что мы сделали?

Мы искали исследования, в которых измерялась точность тестов на антитела по сравнению с эталонными стандартными критериями для выявления текущей или прошлой инфекции COVID-19. Исследования могут оценивать любой тест на антитела по сравнению с любым эталонным стандартом. Люди могут пройти тестирование в больнице или в общине. Исследования могут проверять людей, которые, как известно, имеют — или не имеют — или подозреваются в наличии COVID-19.

Характеристики исследования

Мы нашли 54 соответствующих исследования.Исследования проводились в Азии (38), Европе (15), а также в США и Китае (1).

Сорок шесть исследований включали людей, которые находились в больнице только с подозрением или подтвержденной инфекцией COVID-19. В 29 исследованиях сравнивали результаты тестов у людей с COVID-19 с результатами тестов у здоровых людей или людей с другими заболеваниями.

Не во всех исследованиях была представлена подробная информация о возрасте и поле участников. Часто мы не могли сказать, оценивали ли исследования текущую или прошлую инфекцию, так как немногие сообщали, выздоравливают ли участники.Мы не нашли исследований, в которых тестировались бы только бессимптомные люди.

Основные результаты

Наши результаты получены в основном из 38 исследований, которые предоставили результаты, основанные на времени, когда люди впервые заметили симптомы.

Тесты на антитела через неделю после первых симптомов выявили только 30% людей, у которых был COVID-19. Точность увеличилась на 2-й неделе с обнаружением 70% и была максимальной на 3-й неделе (обнаружено более 90%). После 3 недели данных было мало.Тесты дали ложноположительные результаты у 2% людей, не инфицированных COVID-19.

Результаты тестов на IgG / IgM через три недели после появления симптомов предполагают, что если у 1000 человек были тесты на антитела, а 50 (5%) из них действительно имели COVID-19 (как мы могли ожидать в национальном скрининговом исследовании): У 58 человек положительный результат теста на COVID-19. Из них 12 человек (21%) не имели бы COVID-19 (ложноположительный результат).

— 942 человека дали бы отрицательный результат на COVID-19. Из них 4 человека (0.4%) действительно имели бы COVID-19 (ложноотрицательный результат).

Если бы мы проверили 1000 медицинских работников (в условиях высокого риска), у которых были симптомы, и 500 (50%) из них действительно имели COVID-19:

— 464 человека дали бы положительный результат на COVID-19. Из них 7 человек (2%) не имели бы COVID-19 (ложноположительный результат).

— 537 человек дали бы отрицательный результат на COVID-19. Из них 43 (8%) действительно имели бы COVID-19 (ложноотрицательный результат).

Мы не обнаружили убедительных различий в точности для разных типов тестов на антитела.

Насколько надежны были результаты исследований этого обзора?

Наша уверенность в доказательствах ограничена по нескольким причинам. В целом исследования были небольшими, не использовали самые надежные методы и не сообщали о своих результатах полностью. Часто они не включали пациентов с COVID-19, у которых мог быть ложноотрицательный результат ПЦР, и брали свои данные для людей без COVID-19 из записей тестов, проведенных до возникновения COVID-19.Это могло повлиять на точность теста, но невозможно определить насколько.

К кому относятся результаты этого обзора?

Большинство участников были в больнице с COVID-19, поэтому у них было более тяжелое заболевание, чем у людей с легкими симптомами, которые не были госпитализированы. Это означает, что мы не знаем, насколько точны тесты на антитела для людей с более легкими заболеваниями или без симптомов.

Более половины исследований оценивали тесты, которые они разработали сами, большинство из которых невозможно купить.Многие исследования были быстро опубликованы в Интернете в виде «препринтов». Препринты не проходят обычных строгих проверок опубликованных исследований, поэтому мы не уверены, насколько они надежны.

Поскольку большинство исследований проводилось в Азии, мы не знаем, будут ли результаты тестов аналогичными в других странах мира.

Каковы последствия этого обзора?

Обзор показывает, что тесты на антитела могут сыграть полезную роль в определении наличия у кого-либо COVID-19, но важно время, когда тесты будут использоваться.Тесты на антитела могут помочь подтвердить инфекцию COVID-19 у людей, у которых симптомы наблюдаются более двух недель и у которых нет теста RT-PCR, или у людей есть отрицательные результаты теста RT-PCR. Тесты лучше выявляют COVID-19 у людей через две или более недель после появления симптомов, но мы не знаем, насколько хорошо они работают более чем через пять недель после появления симптомов. Мы не знаем, насколько хорошо тесты работают у людей с более легкими формами заболевания или без симптомов, потому что исследования в обзоре проводились в основном на людях, которые находились в больнице.Со временем мы узнаем, обеспечивает ли ранее перенесенный COVID-19 иммунитет к будущей инфекции.

Необходимы дальнейшие исследования использования тестов на антитела у людей, выздоравливающих от инфекции COVID-19, и у людей, у которых были легкие симптомы или никогда не было симптомов.

Насколько актуален этот обзор?

В этот обзор включены данные, опубликованные до 27 апреля 2020 г. Поскольку в этой области публикуется много новых исследований, мы будем часто обновлять этот обзор.

Какие существуют типы тестов на COVID-19? Что нужно знать

Люди часто говорят о тестировании на COVID-19 так, будто это означает только одно. Но на самом деле Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) до сих пор выдало разрешение на экстренное использование более 200 различных тестов, предназначенных для выявления текущей или прошлой инфекции SARS-CoV-2, вируса, вызывающего COVID-19. Совсем недавно агентство сделало заголовки об утверждении первого такого теста, в котором используются образцы слюны, — теста с метким названием SalivaDirect, разработанного Йельской школой общественного здравоохранения.

Эти тесты COVID-19 делятся на три основные категории: ПЦР, антиген и антитела. Доктор Аниш Мехта, руководитель службы инфекционных заболеваний в больнице Университета Эмори в Атланте, штат Джорджия, подробно остановился на различиях между ними и на том, что нужно иметь в виду, если вы решите пройти тестирование.

ПЦР-тесты

Большинство тестов на COVID-19 проводится в США.С. сейчас использует технологию полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти тесты обнаруживают болезнь, ища следы генетического материала вируса в образце, который чаще всего берется с помощью мазков из носа или горла. Центры США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) считают тесты ПЦР «золотым стандартом» тестирования COVID-19, но, как и все тесты, они не идеальны. Исследования показали, что до 30% результатов ПЦР-теста на COVID-19 неточны. (Для сравнения, CDC в 2018 году подсчитал, что быстрые тесты на грипп дают примерно такой же процент неверных результатов.)

В тестах на COVID-19 ложноотрицательные результаты кажутся гораздо более распространенными, чем ложноположительные, поэтому, если вы получите положительный результат, скорее всего, у вас действительно есть вирус. Если вы получили отрицательный результат, но у вас есть симптомы коронавируса или вы недавно столкнулись с кем-то, кто болел этим вирусом, вам все равно следует самоизолироваться, пока симптомы не исчезнут.

Ложноотрицательные результаты могут быть получены, если медицинские работники не проникнут достаточно глубоко в нос или горло, чтобы собрать хороший образец.Время проведения теста тоже имеет значение. Исследования показывают, что инфекции можно пропустить, если тестирование проводится слишком рано после контакта. Возможно и обратное. «Иногда после того, как вирус был уничтожен, в организме все еще остается много [генетического материала]», — говорит Мехта. Это может вызвать положительный результат теста, даже если он не болеет. Прохождение тестирования примерно через пять дней после возможного заражения кажется оптимальным вариантом.

Для запуска ПЦР-теста и считывания его результатов требуется специальное оборудование и химические вещества (известные как реагенты), которых не хватает, что частично является причиной того, что U.С. попал в такое отставание в тестировании. Чтобы сократить время ожидания, несколько компаний разработали тесты, которые могут обнаруживать генетический материал вируса за считанные минуты, но некоторые — например, тест Abbott ID NOW, используемый в Белом доме — имеют высокий уровень ложноотрицательных результатов. Эти быстрые тесты пока недоступны для большей части американской общественности, но некоторые эксперты утверждают, что они могут служить ценной цели, несмотря на их сомнительную точность. Быстрые тесты могут значительно увеличить возможности тестирования, выявляя больше случаев COVID-19, чем наша текущая стратегия тестирования, несмотря на проблемы с точностью.

Анализы слюны

Тесты слюны на коронавирус — это новый вид ПЦР-диагностики COVID-19. Тестирование слюны «действительно зависит от стандартной технологии ПЦР и требует некоторого ручного труда, чтобы пройти через этапы теста», — говорит Мехта. Но сбор слюны менее инвазивен, чем мазок из носа или горла, и его легче делать дома или без медицинской подготовки, говорит Мехта.SalivaDirect, тест от Йельского университета, также не требует запатентованных химических реактивов или пробирок, что, как надеются его разработчики, поможет облегчить проблемы с поставкой и доступом.

Раннее исследование Йельского университета, проведенное при тестировании профессиональных баскетболистов, предполагает, что тест слюны примерно такой же точный, как и традиционный носовой ПЦР-тест, но Мехта говорит, что «нам нужно проверить его в более широком смысле», чтобы увидеть, верны ли эти выводы.

Антигенные тесты

Тесты на

Antigen могут изменить результаты за считанные минуты, но скорость требует компромисса.

Как и ПЦР, тесты на антигены обычно требуют мазка из носа или горла. Но в отличие от тестов ПЦР, которые ищут генетический материал из вируса SARS-CoV-2, тесты на антигены ищут белки, которые живут на поверхности вируса. Этот процесс немного менее трудоемок, чем тестирование ПЦР, поскольку в нем не так много химии, но он также менее чувствителен. Мехта говорит, что это открывает дверь для возможных ложных срабатываний (если тест обнаруживает белки, похожие на белки SARS-CoV-2) или отрицательных результатов (если он полностью пропускает белки).Ложноположительные результаты при тестах на антигены редки, но, как сообщается, до половины отрицательных результатов являются неточными. Если результат теста отрицательный, но симптомы проявляются или вы подверглись риску заражения, ваш врач может назначить ПЦР-тест для подтверждения результата.

В то время как тестирование на антигены становится все более распространенным в США, пока только несколько таких тестов были одобрены FDA. Как и в случае с экспресс-генетическими тестами, некоторые эксперты утверждают, что быстрые тесты на антигены могут помочь в достаточной степени облегчить узкие места тестирования, чтобы компенсировать их пониженную точность.

Тесты на антитела

В отличие от других тестов, перечисленных здесь, тесты на антитела не предназначены для выявления текущей инфекции SARS-CoV-2. Скорее, они ищут в крови антитела, белки, которые организм вырабатывает в ответ на инфекцию, которая может обеспечить иммунитет против той же болезни в будущем. Эти тесты ищут антитела, специфичные для SARS-CoV-2, чтобы определить, был ли у вас ранее коронавирус.

Прямо сейчас тесты на антитела мало что могут сделать, кроме как удовлетворить любопытство.Во-первых, говорит Мехта, ложные результаты довольно распространены. Даже если результаты точны, ученые еще не знают, насколько хорошо и как долго антитела к коронавирусу защищают кого-то от будущего случая COVID-19. Положительный результат теста на антитела не означает, что вы не сможете снова заразиться COVID-19, по крайней мере, как предполагает современная наука.

Широкомасштабное тестирование на антитела полезно для исследователей, поскольку оно может дать оценку того, сколько людей на самом деле болеет COVID-19, и помочь ученым узнать больше о том, придают ли антитела иммунитет к коронавирусу и каким образом.

«С точки зрения исследований, мы можем получить много информации при тестировании на антитела, если собираем ее с течением времени», — говорит Мехта. Но с точки зрения полезной информации для людей тесты на антитела пока мало что дают. «То, что мы можем обнаружить антитела, не обязательно означает, что вы полностью защищены от заражения этой инфекцией», — говорит Мехта. «Продолжайте принимать все те же меры предосторожности, что и все остальные».

Краткая информация о коронавирусе.Все, что вам нужно знать о глобальном распространении COVID-19

Спасибо!

Для вашей безопасности мы отправили письмо с подтверждением на указанный вами адрес. Щелкните ссылку, чтобы подтвердить подписку и начать получать наши информационные бюллетени.Если вы не получите подтверждение в течение 10 минут, проверьте папку со спамом.

Напишите Джейми Дюшарму на [email protected].

Диагностические тесты и процедуры — Ссылка на COVID

Диагноз

Решающее значение имеет быстрое выявление и изоляция инфицированных людей. Диагноз ставится на основании клинических, лабораторных и рентгенологических данных.Поскольку симптомы и радиологические данные COVID-19 неспецифичны, инфекция SARS-CoV-2 должна быть подтверждена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе нуклеиновых кислот, амплифицирующей конкретную генетическую последовательность в вирусе. Всего через несколько дней после публикации первых случаев был представлен утвержденный рабочий процесс диагностики SARS-CoV-2 (Corman 2020), демонстрирующий огромные возможности реагирования, достигнутые за счет координации академических и государственных лабораторий в национальных и европейских исследовательских сетях.

Существует временное руководство по диагностическому тестированию на COVID-19 при подозрении на заболевание людей, опубликованное ВОЗ в марте и обновленное 11 сентября 2020 г. (WHO 20200911). Недавно было опубликовано несколько всеобъемлющих современных обзоров лабораторных методов диагностики SARS-CoV-2 (Kilic 2020, Loeffelholz 2020).

Открыть ссылки на эту главу в отдельном окне.

Согласно ВОЗ, решение о тестировании «должно основываться как на клинических, так и на эпидемиологических факторах», чтобы поддержать клиническое ведение пациентов и меры инфекционного контроля.Пациентам с симптомами следует немедленно провести ПЦР-тест, особенно медицинским работникам с симптомами. В частности, это относится к домам престарелых и другим учреждениям длительного пребывания, где могут возникать крупные вспышки с высокой смертностью жителей. В таких условиях важен каждый день: как резидентов, так и медицинских работников следует немедленно пройти обследование. При регрессионном анализе 88 домов престарелых с задокументированным случаем до проведения общеклинического тестирования каждый дополнительный день между выявлением первого случая и завершением общеклинического тестирования был связан с идентификацией 1.3 дополнительных случая (Hatfield 2020). Однако прогностическая ценность тестов заметно варьируется в зависимости от времени воздействия и появления симптомов. Уровень ложноотрицательных результатов самый низкий через 3 дня после появления симптомов или примерно через 8 дней после контакта (см. Ниже).

Однако в условиях ограниченных ресурсов пациенты должны проходить тестирование только в том случае, если положительный результат теста требует принятия необходимых мер. Необязательно пытаться установить распространенность инфекции с помощью ПЦР. Например, в семье, которая была помещена на карантин после того, как инфекция была подтверждена у одного члена, не все контактные лица в семье должны быть проверены, особенно молодые люди с только легкими симптомами.

Для многих стран и регионов официальные органы и учреждения постоянно обновляют рекомендации о том, кто должен проходить тестирование и когда: эти рекомендации постоянно меняются и должны быть адаптированы к местной эпидемиологической ситуации. Чем ниже уровень инфицирования и чем выше возможности тестирования, тем больше пациентов смогут пройти тестирование.

COVID Справочные ресурсы:

Сбор образцов

Дыхательные пути

SARS-CoV-2 может быть обнаружен в широком диапазоне различных тканей и жидкостей организма.В исследовании 1070 образцов, собранных у 205 пациентов с COVID-19 (Wang X 2020), образцы жидкости из бронхоальвеолярного лаважа показали самые высокие положительные показатели (14 из 15; 93%), за которыми следовала мокрота (72 из 104; 72%), мазки из носа (5 из 8; 63%), кистевая биопсия при фибробронхоскопии (6 из 13; 46%), мазки из глотки (126 из 398; 32%), кал (44 из 153; 29%) и кровь (3 из 307). ; 1%).

Хотя состав респираторных выделений может быть весьма различным, респираторные пробы остаются наиболее предпочтительным типом проб для диагностики.Репликация вируса SARS-CoV-2 очень высока в тканях верхних дыхательных путей, в отличие от SARS-CoV (Wolfel 2020). Согласно ВОЗ, респираторный материал для ПЦР должен быть взят из образцов верхних дыхательных путей (мазок из носоглотки и ротоглотки или смыв) у амбулаторных пациентов (ВОЗ, 2020). Предпочтительно собирать образцы как из носоглоточных, так и из ротоглоточных мазков, которые можно объединить в одной пробирке. Помимо мазков из носоглотки, образцы могут быть взяты из мокроты (если возможно), эндотрахеального аспирата или бронхоальвеолярного лаважа.Вероятно, образцы нижних дыхательных путей более чувствительны, чем мазки из носоглотки. Особенно у тяжелобольных пациентов в нижних отделах дыхательных путей часто больше вируса, чем в верхних (Huang 2020). Однако всегда существует высокий риск «аэрозолизации» и, следовательно, риск заражения сотрудников.

Бесплатная загрузка: 5 ^th Edition

В проспективном исследовании, проведенном в двух региональных больницах Гонконга, было изучено 563 серийных образца, собранных во время периода выделения вируса у 50 пациентов: 150 слюны из глубокого горла (DTS), 309 объединенных мазков из носоглотки (NP) и горла и 104 образцов мокроты (инструкции по глубокому исследованию). слюна из горла: сначала прочистите горло, прополоскав горло собственной слюной, а затем выплюните DTS в стерильную бутылку).Слюна из глубокого горла вырабатывала самую низкую концентрацию вирусной РНК и более низкий уровень положительных результатов ОТ-ПЦР по сравнению с обычными респираторными образцами. Буккальные мазки тоже не работают. У 11 детей положительный результат по мазкам из носоглотки, у 2 остался отрицательным с помощью буккальных мазков. Наблюдалась общая тенденция к тому, что образцы с щечной стороны содержали более низкую вирусную нагрузку SARS-CoV-2 по сравнению с образцами из носоглотки (Kam 2020).

Мазки из носоглотки — практические вопросы

Важно правильно провести процесс взятия мазка.Как мазки из носоглотки, так и ротоглоточные мазки имеют ряд вариантов ошибок, каждый из которых может привести к ложноотрицательным результатам. Кроме того, необходимо принять меры защиты, чтобы не подвергать экзаменатора опасности. Каждый тампон несет в себе высокий риск заражения! Защита органов дыхания, защитные очки, халат и перчатки обязательны. Необходимо практиковать правильное надевание и снятие защитной одежды! Многие ошибки возникают даже при снятии защитной маски. Сбор образцов из мазков из носоглотки и горла может вызвать дискомфорт у пациентов и подвергнуть риску медицинских работников.При неправильном выполнении или у пациентов со сложной и деликатной анатомией существует риск побочных эффектов, таких как утечка спинномозговой жидкости (Sullivan 2020). Есть очень полезное видео о защите, подготовке, снаряжении, обращении, снятии средств индивидуальной защиты и т. Д. (Marty 2020).

Для мазка пациенту следует сесть на стул и слегка запрокинуть голову. Обследующий должен стоять в слегка смещенном положении, чтобы избежать появления капель от кашля. Скажите пациенту, что в течение короткого времени это может быть неудобно.Следует использовать тампоны, подходящие для обнаружения вирусов и имеющие максимально гибкий пластиковый стержень. Деревянные палочки могут инактивировать вирусы и создавать высокий риск травм. Тампон следует держать между большим и указательным пальцами, как карандаш, так, чтобы конец ничего не касался. Задняя стенка носоглотки часто достигается через 5-7 см, на что указывает небольшое сопротивление. Мазки из носа могут быть менее чувствительными (Pinninti 2020). При взятии мазка из зева следует избегать прикосновения к зубам и языку; тампон следует удалить с задней стенки, непосредственно рядом с язычком.Осторожно с рвотным рефлексом! В Интернете есть множество практических видеороликов для правильного выполнения процедуры взятия мазка.

Чтобы свести к минимуму риск воздействия на медицинских работников и истощение средств индивидуальной защиты, мы разработали инструкции по взятию мазков для пациентов, которые могут делать это (то есть, большинство из них!) Дома. После соответствующих инструкций они могут сами проводить мазки. Курьер с трубками отправляется прямо к пациенту, и курьер ставит трубки у двери.Следует избегать прямого контакта между пациентом и курьером. Курьер не должен прикасаться к пробиркам с тампоном (положить их прямо в пакет или собрать перевернутым пакетом), их следует сразу вернуть обратно (без пересылки!). Это требует предварительного и точного инструктажа, но обычно вполне выполнимо. Неконтролируемый сбор мазков в домашних условиях был сопоставим с взятием мазков из носоглотки (McCulloch 2020). В одном из крупнейших на сегодняшний день исследований в общей сложности 530 пациентам с инфекциями верхних дыхательных путей были предоставлены инструкции и их попросили собрать образцы из языка, носа и средних носовых раковин (Вт, 2020).Затем медицинский работник взял у пациента образец из носоглотки. Когда этот образец NP использовался в качестве компаратора, оценочная чувствительность образцов языка, носа и средних носовых раковин, собранных пациентами, составила 89,8%, 94,0% и 96,2% соответственно.

Тампоны можно хранить сухими или в небольшом количестве раствора NaCl; при необходимости это следует заранее уточнить в лаборатории. Важно быстрое ПЦР-исследование, желательно в тот же день, если возможно.Тепло и более длительное хранение могут привести к ложноотрицательным результатам (Pan 2020).

Образцы из нижних дыхательных путей могут включать мокроту (если таковая имеется) и / или эндотрахеальный аспират или бронхоальвеолярный лаваж у пациентов с более тяжелыми респираторными заболеваниями. Однако следует учитывать высокий риск образования аэрозолей (строго соблюдать процедуры профилактики и контроля инфекций). Дополнительные клинические образцы могут быть собраны, поскольку вирус COVID-19 был обнаружен в крови и стуле (см. Ниже).

В отличие от многих респираторных вирусов, SARS-CoV-2 присутствует в слюне, и несколько исследований показали, что образцы слюны из задней ротоглотки (глубокого горла) возможны и более приемлемы для пациентов и медицинских работников (To 2020, Yu 2020, Wyllie 2020 , Йокота 2020).В большом исследовании «улучшенных» образцов слюны (сильный запах, вызванный кашель и сбор слюны / выделений) у 216 пациентов с симптомами, которые считались совместимыми с COVID-19, было получено 100% положительное согласие (38 из 38 положительных образцов) и 99,4% отрицательного согласия (177/178 отрицательных образцов).

Фекальные выделения

Хотя ни о каких случаях передачи фекально-оральным путем пока не сообщалось, есть также доказательства того, что SARS-CoV-2 активно реплицируется в желудочно-кишечном тракте.Несколько исследований показали длительное присутствие вирусной РНК SARS-CoV-2 в образцах фекалий (Chen 2020, Wu 2020). Объединив результаты 26 исследований, быстрый обзор показал, что 54% этих пациентов, тестированных на фекальную РНК, были положительными. Продолжительность выделения вируса из фекалий колебалась от 1 до 33 дней после получения отрицательного результата мазка из носоглотки (Gupta 2020). В другом метаанализе 17 исследований совокупный уровень обнаружения РНК SARS-CoV-2 в фекалиях составил 44% и 34% по пациентам и количеству образцов, соответственно. Пациенты с желудочно-кишечными симптомами (77% vs.58%) или с более тяжелым заболеванием (68% против 35%), как правило, имели более высокий уровень выявления.

Эти исследования вызвали озабоченность по поводу того, действительно ли пациенты с отрицательными мазками из глотки действительно свободны от вирусов или требуется отбор дополнительных участков тела. Однако клиническая значимость этих результатов остается неясной, и есть одно исследование, которое не обнаружило инфекционный вирус в образцах стула, несмотря на высокие концентрации вирусной РНК (Wolfel 2020). Следовательно, присутствие одной только нуклеиновой кислоты не может использоваться для определения вирусного выделения или потенциала инфекции (Atkinson 2020).Для многих вирусных заболеваний, включая SARS-CoV или MERS-CoV, хорошо известно, что вирусная РНК может быть обнаружена спустя долгое время после исчезновения инфекционного вируса.

Образцы, кроме респираторных и желудочно-кишечных: кровь, моча, грудное молоко

Кровь — у пациентов с легким или умеренным заболеванием SARS-CoV-2 относительно редко обнаруживается в крови (Wang W 2020, Wolfel 2020). В ходе скринингового исследования 7425 доноров крови в Ухани образцы плазмы оказались положительными на вирусную РНК от 2 бессимптомных доноров (Chang 2020).Другое исследование, проведенное в Корее, выявило семь бессимптомных доноров крови, которые позже были идентифицированы как подтвержденные случаи COVID-19. Ни один из 9 получателей переливания тромбоцитов или эритроцитов не дал положительных результатов на РНК SARS-CoV-2. Передача SARS-CoV-2 при переливании крови считалась маловероятной (Kwon 2020). Как и в случае с фекалиями, остается неясным, означает ли обнаруживаемая в крови РНК инфекционность. В исследовании 167 госпитализированных пациентов SARS-CoV-2 был обнаружен у 64 пациентов при поступлении в больницу, 3 из 106 пациентов с отрицательной реакцией на ПЦР и 15 из 61 положительного пациента умерли (Hagman 2020).Однако необходимо определить клиническое значение «РНКемии» SARS-CoV-2.
Моча — Ни один из 72 образцов мочи не дал положительных результатов (Wang X 2020).
Грудное молоко — в описании случая РНК SARSCoV2 была обнаружена в образцах грудного молока инфицированной матери в течение 4 дней подряд. Обнаружение вирусной РНК в молоке совпало с легкими симптомами COVID19 и положительным диагностическим тестом новорожденного на SARSCoV2 (Groß 2020). Однако это кажется редкостью. Из 64 образцов грудного молока от 18 инфицированных женщин РНК SARS-CoV-2 была обнаружена только в одном образце молока; вирусная культура для этого образца была отрицательной.Эти данные предполагают, что РНК SARS-CoV-2 не представляет собой вирус, способный к репликации, и что грудное молоко не может быть источником инфекции для младенца (Chambers 2020. Также сообщалось о случаях передачи антител в грудное молоко (Dong 2020 ).
Вагинальная жидкость — все пробы 10 женщин с COVID-19 были отрицательными (Saito 2020).
Сперма — отсутствие вируса в образцах, взятых у 12 пациентов на стадии выздоровления (Song 2020).
Слезы и секреты конъюнктивы — среди 40 пациентов (10 с конъюнктивитом), у которых была положительная реакция с помощью ОТ-ПЦР мазков из носоглотки и ротоглотки, ПЦР мазков с конъюнктивы была положительной у 3 пациентов, в том числе у одного с конъюнктивитом (Atum 2020).

PCR

Доступны десятки собственных и коммерческих анализов рОТ-ПЦР, поскольку лаборатории по всему миру адаптировали свои ПЦР-тесты для SARS-CoV-2, используя разные праймеры, нацеленные на разные участки генетической последовательности вируса. Недавно был опубликован обзор различных тестов и диагностических устройств (Loeffelholz 2020). Протокол для анализа в реальном времени (RT) -PCR для обнаружения SARS-CoV-2 для двух целей RdRp (IP2 и IP4) описан на https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse / real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf? sfvrsn = 3662fcb6_2

Новые анализы ОТ-ПЦР в реальном времени, нацеленные на РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp) / геликазы, шипы и гены нуклеокапсида SARS-CoV-2, могут помочь улучшить лабораторную диагностику COVID-19. По сравнению с опубликованным анализом RdRp-P2, который используется в большинстве европейских лабораторий, эти тесты не перекрестно реагируют с SARS-CoV в культуре клеток и могут быть более чувствительными и специфичными (Chan JF 2020).

Пределы обнаружения коммерческих наборов могут существенно отличаться.Однако большинство сравнительных исследований показали высокую чувствительность и их пригодность для целей скрининга во всем мире:

При сравнении 11 различных тест-систем ОТ-ПЦР, использованных в семи лабораториях в Германии в марте 2020 года, большинство анализов ОТ-ПЦР выявили около 5 копий РНК на реакцию (Münchhoff 2020). Сниженная чувствительность была отмечена для оригинального протокола подтверждения гена Charité RdRp, что могло повлиять на подтверждение некоторых случаев в первые недели пандемии.Набор праймеров / зондов CDC N1 оказался чувствительным и надежным для обнаружения SARS-CoV-2 в экстрактах нуклеиновых кислот из респираторного материала, стула и сыворотки пациентов с COVID-19.
Аналитические пределы обнаружения для семи анализов SARS-CoV-2 с использованием серийных разведений объединенного материала пациентов, количественно оцененных с помощью цифровой ПЦР по каплям. Пределы обнаружения составляли от ≤ 10 до 74 копий / мл для коммерческих лабораторных анализаторов с высокой пропускной способностью (Roche cobas, Abbott m2000 и Hologic Panther Fusion) и от 167 до 511 копий / мл для анализа образца до ответа (DiaSorin Simplexa, GenMark ePlex ) и инструменты для оказания медицинской помощи (Abbott ID NOW) (Fung 2020).
Всего 239 образцов (168 содержали SARS-CoV-2) были протестированы с помощью пяти методов испытаний (Procop 2020). Анализы, в которых отсутствовала стадия экстракции нуклеиновой кислоты, вызвали больше ложноотрицательных реакций, чем анализы, которые включали эту стадию. Частота ложноотрицательных результатов составила 0% для диагностической панели ОТ-ПЦР в реальном времени CDC 2019 nCoV, 3,5% для анализа TIB MOLBIOL (Roche), 2,4% для Xpert Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid), 11,9% для Simplexa. COVID-19 Direct Kit (DiaSorin) и 16,7% для ID NOW COVID-19 (Abbott).Большинство ложноотрицательных результатов наблюдалось у пациентов с низкой вирусной нагрузкой.

Качественная ПЦР

Для рутинной диагностики обычно достаточно качественной ПЦР («положительной или отрицательной»). Количественная оценка вирусной РНК в настоящее время (все еще) представляет только академический интерес.

Ложноположительные результаты очень редки. Однако они случаются. Хотя аналитическая специфичность этих тестов обычно составляет 100%, клиническая специфичность меньше из-за контаминации (значительная проблема для процедур NAT) и / или человеческой ошибки при работе с образцами или данными (очень трудно полностью устранить).Как видно из серологического исследования (см. Ниже), эти ложноположительные результаты могут иметь существенные последствия при низкой распространенности (Эндрю Коэн, личное сообщение).

Еще одна проблема любой качественной ПЦР — ложноотрицательные результаты, которые могут иметь множество причин (обзор: Волошин 2020). Особенно распространены неправильные мазки, но бывают и лабораторные ошибки. В обзоре 7 исследований с в общей сложности 1330 респираторных образцов авторы оценили количество ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР по дням с момента заражения.За 4 дня до появления симптомов показатель снизился со 100% до 67%. В день появления симптомов (5-й день) частота составила 38%, снизилась до 20% (8-й день), а затем снова начала увеличиваться с 21% (9-й день) до 66% (21-й день). Если клинические подозрения высоки, не следует исключать инфицирование только на основании ОТ-ПЦР. Уровень ложноотрицательных результатов самый низкий через 3 дня после появления симптомов или примерно через 8 дней после заражения (Kucirka 2020). Рисунок 1 иллюстрирует ПЦР и обнаружение антител во время инфекции SARS-CoV-2.

Рисунок 1. Временная шкала диагностических маркеров для обнаружения SARS-CoV-2. АВ = антитело.

Нужно ли повторное тестирование в случае отрицательного результата ПЦР? Несколько исследований выступают против этой стратегии, обнаружив очень низкие показатели конверсии из отрицательных в положительные при повторном тестировании (Lepak 2020). Среди 20 912 пациентов в одном исследовании анализировалась частота несоответствия теста SARS-CoV-2 ОТ-ПЦР среди людей, изначально отрицательных с помощью мазка из носоглотки, которые были повторно протестированы по клиническим причинам в течение 7 дней.Частота последующего положительного ответа в этом окне составила всего 3,5% и примерно одинакова для разных учреждений (Long 2020). Похоже, что если первая ПЦР отрицательна, вторая ПЦР дает лишь небольшое количество положительных результатов.

Несколько исследований показали, что бессимптомные пациенты также имеют положительные результаты ПЦР и могут передавать вирус (Bai 2020, Cereda 2020, Rothe 2020). Пороговые значения цикла ОТ-ПЦР для SARS-CoV-2 («вирусная нагрузка») у бессимптомных пациентов аналогичны таковым у пациентов с симптомами (Lee S 2020, Lavezzo 2020).

У пациентов с симптомами вирусное выделение может начаться за 2–3 дня до появления первых симптомов. Анализируя всего 414 мазков из горла у 94 пациентов, самая высокая вирусная нагрузка в мазках из горла была обнаружена во время появления симптомов. Инфекция началась за 2,3 дня (95% ДИ, 0,8–3,0 дня) до появления симптомов и достигла пика за 0,7 дня до появления симптомов (He 2020). По оценкам, инфекция быстро снизилась в течение 7 дней.

В когорте из 113 пациентов с симптомами средняя продолжительность обнаружения РНК SARS-CoV-2 составила 17 дней (межквартильный период 13–22 дня), измеренная с начала заболевания.У некоторых пациентов ПЦР была положительной еще дольше: мужской пол и тяжелое течение (инвазивная механическая вентиляция легких) были независимыми факторами риска длительного выделения (Xu K 2020).

Несколько отчетов пациентов неоднократно привлекали внимание СМИ, показывая положительные результаты после повторных отрицательных результатов ПЦР и клинического выздоровления (Lan 2020, Xiao AT 2020, Yuan 2020). Эти исследования подняли вопрос о реактивации или повторном заражении COVID-19 (см. Ниже, глава Clinical Presentation , стр. 279).Однако кажется вероятным, что результаты гораздо более вероятны из-за методологических проблем (Li 2020). При низких уровнях вируса, особенно в последние дни заражения, вирусная нагрузка может колебаться и иногда обнаруживаться, а иногда нет (Wolfel 2020). Реактивация, а также быстрое повторное заражение были бы очень необычными для коронавирусов.

Количественное определение вирусной нагрузки

В нескольких исследованиях оценивалась вирусная нагрузка SARS-CoV-2 на разных образцах. В небольшом проспективном исследовании вирусная нагрузка в мазках из носа и горла, полученных от 17 пациентов с симптомами, была проанализирована в зависимости от дня появления каких-либо симптомов (Zou 2020).Следует отметить, что вирусная нагрузка, обнаруженная у бессимптомных пациентов, была аналогична вирусной нагрузке у пациентов с симптомами, что позволяет предположить потенциал передачи у бессимптомных или минимально симптоматических пациентов.

В другом исследовании с участием 82 инфицированных лиц вирусная нагрузка в мазке из зева и образцах мокроты достигла пика примерно через 5–6 дней после появления симптомов и варьировалась от 79 900 копий / мл в горле до 752 000 копий на мл в мокроте (Pan 2020). . В исследовании образцов слюны ротоглотки, в отличие от SARS, пациенты с COVID-19 имели самую высокую вирусную нагрузку в преддверии презентации, что может объяснить быстро распространяющийся характер этой эпидемии (To 2020).Средняя вирусная нагрузка в задней ротоглоточной слюне или других респираторных образцах при представлении в этом исследовании составила 5,2 log ₁₀ копий на мл (IQR 4,1-7,0). В общей сложности 323 образца от 76 пациентов, средняя вирусная нагрузка в мокроте (17 429 копий / тест) была значительно выше, чем в мазках из зева (2552 копии) и мазках из носа (651 копия). Вирусная нагрузка была выше на ранней и прогрессивной стадиях, чем на стадии восстановления (Yu 2020). Согласно недавно опубликованному исследованию, распространение вируса может начаться уже за 2-3 дня до появления первых симптомов, и профиль заразности может больше напоминать профиль гриппа, чем SARS (He 2020).

Более высокие вирусные нагрузки могут быть связаны с тяжелыми клиническими исходами. В большой когорте (n = 1145) госпитализированных пациентов с симптомами из Нью-Йорка были измерены вирусные нагрузки. В модели пропорциональных рисков Кокса с поправкой на несколько искажающих факторов обнаружена значимая независимая связь между вирусной нагрузкой и смертностью (отношение рисков 1,07, 95% ДИ 1,03–1,11, p = 0,0014) с увеличением риска на 7% для каждого преобразованного логарифма. копия / мл (Pujadas 2020). Тем не менее, необходимы проспективные исследования, чтобы оценить роль вирусной нагрузки SARS-CoV-2 как маркера для оценки тяжести заболевания и прогноза.

Следует ли измерять вирусную нагрузку? Вероятно, да. Это может быть полезно в клинической практике. Положительный результат ОТ-КПЦР не обязательно означает, что человек все еще заразен или у него все еще есть какое-либо серьезное заболевание. РНК может быть из нежизнеспособного вируса и / или количество живого вируса может быть слишком низким для передачи.

Пороговые значения цикла (Ct)

RT-qPCR обеспечивает количественную оценку путем сначала обратной транскрипции РНК в ДНК, а затем выполнения qPCR, где сигнал флуоресценции увеличивается пропорционально количеству амплифицированной нуклеиновой кислоты.Тест считается положительным, если флуоресценция достигает определенного порога в течение определенного количества циклов ПЦР (значение Ct, обратно пропорциональное вирусной нагрузке). Во многих анализах кПЦР используется пороговая величина Ct, равная 40, что позволяет обнаруживать очень мало исходных молекул РНК. Некоторые эксперты (Tom 2020) предлагают использовать это значение Ct или рассчитать вирусную нагрузку, что может помочь уточнить процесс принятия решений (более короткая изоляция и т. Д.). К сожалению, все еще существует широкая неоднородность и несогласованность стандартных кривых, рассчитанных на основе исследований, которые предоставляют значения Ct из серийных разведений образцов и расчетные вирусные нагрузки.По мнению других экспертов, необходимы меры предосторожности при интерпретации значений Ct результатов ОТ-ПЦР SARS-CoV-2, показанных в публикациях COVID-19, чтобы избежать неправильного понимания кинетики вирусной нагрузки для сравнения в различных исследованиях (Han 2020). Следует с осторожностью относиться к значениям Ct как к суррогатному показателю «количества» в качественном ПЦР-анализе («вирусной нагрузки»). Результаты не могут быть переданы в разные анализы, разные генные мишени и разные типы образцов (Poon 2020).

Однако здесь перечислены некоторые ключевые клинические исследования:

У 678 пациентов с COVID-19 госпитальная летальность составила 35.0% с «высокой вирусной нагрузкой» (Ct <25; n = 220), 17,6% со «средней вирусной нагрузкой» (Ct 25-30; n = 216) и 6,2% с «низкой вирусной нагрузкой» ( Ct> 30; n = 242). Высокая вирусная нагрузка была независимо связана со смертностью (скорректированное отношение шансов 6,05; 95% ДИ: 2,92–12,52) и интубацией (СО 2,73; 95% ДИ: 1,68–4,44) в многомерных моделях (Magleby 2020).
Проспективный серийный отбор 70 пациентов выявил клинически значимые значения Ct, а именно: Ct 24 («высокая вирусная нагрузка») и> 40 («отрицательный»), произошедшие через 9 и 36 дней после появления симптомов (Lesho 2020).
Среди 93 членов домохозяйства (включая индексные случаи), у которых был положительный результат теста на SARS-CoV-2 с помощью мазка NP, значения Ct были самыми низкими вскоре после появления симптомов и значимо коррелировали со временем, прошедшим с момента появления; в течение 7 дней после появления симптомов среднее значение Ct составило 26,5 по сравнению со средним значением Ct 35,0 через 21 день после появления симптомов (Salvatore 2020).
Была предпринята попытка культивирования вируса из 324 образцов (из 253 случаев), которые дали положительный результат на SARS-CoV-2 с помощью ОТ-ПЦР. Значения Ct сильно коррелировали с культивируемым вирусом.Вероятность культивирования вируса снизилась до 8% в образцах с Ct> 35 и до 6% (95% ДИ: 0,9–31,2%) через 10 дней после начала заражения (Singanayagam 2020).
Поперечное исследование определило ПЦР-положительные образцы на их способность инфицировать клеточные линии. Из 90 образцов только 29% продемонстрировали рост вируса. Не было роста в образцах с Ct> 24 или продолжительностью симптомов> 8 дней (Bullard 2020).

Тест-системы, отличные от стандартной RT-PCR

Доступ к быстрой диагностике является ключом к борьбе с пандемией SARS-CoV-2.В будущем тестирование в местах оказания медицинской помощи может снизить нагрузку на централизованные лаборатории и повысить общий потенциал тестирования. Помимо ПЦР, дополнительные потенциально ценные методы амплификации / обнаружения, такие как CRISPR (нацеливание на кластеры с регулярными интервалами коротких палиндромных повторов), технологии изотермической амплификации нуклеиновых кислот (например, изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), и молекулярные микроматричные анализы находятся в стадии разработки). разрабатываются или находятся в процессе коммерциализации.По сообщению ВОЗ от 11 сентября, одобрение аналитических и клинических характеристик этих тестов, демонстрация их потенциальной практической полезности, быстрый обмен данными, а также экстренный нормативный обзор производимых, хорошо функционирующих тестов «поощряются для расширения доступа к Тестирование на SARS-CoV-2 »(ВОЗ 20200911).

Тесты в месте оказания медицинской помощи

Тесты в местах оказания медицинской помощи — это простые в использовании устройства, облегчающие тестирование за пределами лабораторных условий (Guglielmi 2020, Joung 2020).Их с нетерпением ждут. Но изменят ли они правила игры? 6 мая FDA предоставило разрешение на экстренное использование флуоресцентного анализа SARS-CoV-2 на основе CRISPR, продаваемого Sherlock Biosciences. Этот простой тест SARS-CoV-2 сочетает в себе упрощенное извлечение вирусной РНК с изотермической амплификацией и обнаружением, опосредованным CRISPR. Результаты доступны в течение часа с минимальным оборудованием. Первые результаты (n = 202 положительных / 200 отрицательных образцов): чувствительность 93,1%, специфичность 98,5% (Joung 2020).Однако его использование по-прежнему ограничено лабораториями, сертифицированными для проведения испытаний высокой сложности. Есть и другие отчеты о двойном анализе CRISPR-Cas12a «все в одном» (Ding 2020), который позволяет инкубировать все компоненты в одном сосуде для обнаружения нуклеиновых кислот на основе CRISPR, обеспечивая простую комплексную молекулярную диагностику без необходимость отдельных и сложных ручных операций.

6 мая FDA также разрешило (EUA) Quidel’s Sofia 2 иммунофлуоресцентный анализ на антиген SARS. Этот тест должен быть прочитан на специальном анализаторе и выявляет нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки за 15 минут.По заявлению производителя, анализ продемонстрировал приемлемую клиническую чувствительность и выявил 47 из 59 инфекций (80%). В другом исследовании так называемый тест CovidNudge имел 94% чувствительность и 100% специфичность по сравнению со стандартной лабораторной ОТ-ПЦР (Gibani 2020).