Сколько делают электрофорез: Электрофорез | Детский медицинский центр «ЧудоДети»

Электрофорез для грудничка. Узнать больше о Электрофорез для грудничка. Жмите.

Электрофорез для грудничка

Если у новорожденного обнаруживаются симптомы неврологического заболевания или нарушения развития опорно-двигательного аппарата, педиатр назначает достаточно большое количество лечебных процедур. Обладатель, пожалуй, самого пугающего названия из этого списка – электрофорез для грудничка – воспринимается многими неосведомленными родителями как нечто сложное и опасное. Давайте разберемся, что же являет собой данная процедура в действительности и обоснованы ли подобные страхи.

Позитивное влияние электрофореза

Больше всего вопросов у молодых родителей возникает в тот самый момент, когда они узнают, что при электрофорезе применяется заряд электрического тока. Воображение тут же рисует какие-то страшные картины, не имеющие ничего общего с реальным положением вещей. Хотим сразу развеять наиболее распространенные опасения.

Болезненна ли процедура электрофореза для грудничков? Нет. Максимум, что почувствует ребенок – это толчок, сравнимый с легким ударом пальца. Некоторый дискомфорт могут вызвать салфетки, влажные от лечебного раствора.

Зачем вообще применяется электрический ток? Безопасен ли он для младенца? Не просто безопасен – процедура абсолютно безвредна, если педиатр установил, что ребенку она не противопоказана. Разряд тока в данном случае выступает в качестве средства доставки лекарственных средств до пораженного заболеванием участка организма. К тому же, если сравнивать с традиционным пероральным приемом лекарств, эта методика лишена массы побочных эффектов. Подробнее о принципе работы электрофореза мы поговорим чуть позже.

Какова эффективность электрофореза? В каких случаях он применяется?

Как показала практика, электрофорез для грудничка способен привести к серьезному улучшению состояния ребенка при многих недугах. В частности, к ним относятся заболевания центральной и периферийной нервной системы, послеродовые травмы, колиты, циститы н многие другие. Эффективность процедуры зависит от свойств задействованных препаратов и их сочетания.

Как это работает

Электрофорез относится к категории физиотерапевтических методик лечения. На начальном этапе определяется орган или ткань, нуждающуюся в лечении определенным препаратом. Далее, на участок кожи, находящийся непосредственно вблизи от зоны поражения накладывается ткань, пропитанная лекарственным препаратом и электроды. В среднем электрофорез для грудничка длится от 5 до 15 минут.

Под воздействием кратковременного (десятая доля секунды) электрического разряда в растворе происходит распад препарата на ионы, которые переносятся в ткани организма. В качестве путей доставки в данном случае выступают сальные и потовые железы. Уникальность электрофореза состоит в том, что лекарственное средство поступает в нужное место, минуя кровеносную систему и не оказывая негативного воздействия на желудочно-кишечный тракт. Такой подход минимизирует количество побочных эффектов. Повторив процедуру несколько раз, физиотерапевт доводит концентрацию препарата в определенном участке до необходимого уровня, повышая эффективность лечения.

Подробнее о лекарственных препаратах

При электрофорезе для грудничков рекомендуется к использованию множество препаратов различного назначения. В частности, это противовоспалительные, обезболивающие средства, а также препараты, оказывающие расслабляющий эффект на определенные группы мышц. Особо отмечается позитивное влияние данной процедуры при нарушениях работы опорно-двигательного аппарата ребенка, отклонениях в тонусе мышц, нарушениях неврологического характера.

Ориентируясь на специфику заболевания, терапевт может назначить в качестве основного лекарственного средства папаверин, кальций, магнезию, дибазол и ряд других препаратов. При этом в ходе лечения может применяться комплекс из нескольких препаратов, которые в различных сочетаниях и пропорциях оказывают разное действие на организм:

Кальций является основным общеоздоровительным средством при заболеваниях опорно-двигательного аппарата.

Дибазол относится к разряду спазмолитиков. Помимо расширения сосудов, оказывает другие действия, несущие особую пользу в сочетании с другими средствами.

Задача эуфиллина состоит в улучшении кровообращения в определенных участках тканей. Также электрофорез для грудничка с эуфиллином способствует укреплению миокарда, с его помощью добиваются расслабления гладких мышц.

Применение магнезии помогает добиться гармоничного развития нервной и сосудистой систем.

Сочетание электрофореза и массажа

При лечении дисплазии, помимо десятидневного курса электрофореза с назначением кальцинированного раствора, также рекомендован терапевтический массаж. Он усиливает действие препарата, эффективно устраняя проблемы с суставами, характерные для данного заболевания. Массаж также рекомендован при лечении неврологических нарушений. Он проводится совместно с применением магнезии.

Процедура может проводиться на дому

Многих родителей интересует: может ли применяться электрофорез для грудничка в домашних условиях? Это действительно возможно, при наличии соответствующего оборудования. Кроме того, необходимо получить подробную консультацию у врача насчет длительности проведения процедуры, дозировки лекарственных средств и правильного порядка установки электродов. Для проведения электрофореза на дому можно пригласить приходящую медсестру. Таким образом, отпадает необходимость в ежедневном посещении больницы.

Положительное воздействие электрофореза

Как видим, применение процедуры электрофореза для грудничка не несет в себе какую-либо опасность. Более того, для организма младенца данный способ доставки лекарственных средств является предпочтительным. Побочные эффекты сводятся к нулю, а внутренние органы не страдают от токсического воздействия препаратов, принимаемых перорально или через инъекции. Это безболезненная процедура, которую можно включить в терапевтический курс лечения детей возрастом от 1 месяца.

Электрофорез для детей | Записаться на прием

Аппарат предназначен для местного лечебного воздействия электромагнитным полем высокой частоты. Применяется в клиниках терапевтического, неврологического, хирургического, психиатрического, акушерско-гинекологического профиля и в других лечебных учреждениях.

Аппарат «Тонус ДТГ» предназначен для лечения различных нервно-мышечных заболеваний и болевых состояний со спазмами мышц, возникших в результате растяжений, травм, а также подострого и острого периатрита плеча, люмбаго, ишиалгии, гастроптоза, невралгии, парезов, невралгических радикулитов, невритов и др.

В аппарате также имеется функция гальванизации для воздействия постоянным током на организм человека с лечебными и профилактическими целями и проведения лекарственного электрофореза в лечебных и оздоровительных учреждениях различного профиля.

Аппарат «Тонус ДТГ» представляет собой источник непрерывного импульсного тока синусоидальной формы (частотой 50 и 100 Гц) и различных посылок этого тока, отличающихся по длительности, числу и частоте импульсов, форме нарастания и спада амплитуды.

Генерируемые аппаратом токи обладают болеутоляющим действием, а также вазомоторной активностью, способной рассасывать отечности.

Аппарат соответствует второму классу защиты и эксплуатируется без заземляющего провода, что обеспечивает полную безопасность пациента и обслуживающего персонала.

Аппарат снабжен электронным блокирующим устройством, которое исключает появление тока в цепи пациента, если ручка регулятора установлена не в нулевое положение: при включении аппарата; переключений режимов работы; переключений диапазонов тока, что исключает появление острых болевых ощущений в процессе проведения процедуры и позволяет плавно с минимальной величины устанавливать ток в цепи пациента.

В аппарате имеется встроенный таймер. По истечении установленного времени выполнение процедуры прекращается автоматически и подается звуковой сигнал.

Главные принципы физиопроцедур для детей

После назначения педиатра или узкопрофильных специалистов, детская физиотерапия должна на определенное время стать неотъемлемой частью жизни ребенка. Дополнительный положительный эффект, которого удается достичь за счет аппаратных процедур детской физиотерапии, – помощь в борьбе с разными заболеваниями и позволяет повысить иммунные свойства организма. Но для этого необходимо придерживаться нескольких ключевых принципов физиопроцедур для детей.

Какой должен быть режим дня при физиотерапии?

Процедуры проводятся через час после еды (если нет других специфических ограничений), а также желательно за 1–2 часа до сна. Этот режим дня при физиотерапии особенно важен для грудничков, которым, как правило, назначаются:

• массаж;
• электрофорез;
• магнитные процедуры на суставы, в частности при дисплазии.

Медленная реадаптация

Именно поэтому детская физиотерапия назначается с более длительным интервалом, нежели взрослым, ведь организм ребенка постоянно растет согласно возрастным особенностям. Минимальный перерыв между комплексом процедур – не менее 2-х месяцев.

Начало с минимальных дозировок

Из-за высокой лабильности все процедуры назначаются с минимальных доз.

Часто, особенно детям, у которых диагностированы натальные травмы или в первые дни было неправильное положение головы, диагностируется кривошея. Современная гальванизация и электрофорез в комплексе с массажем, некоторыми медицинскими препаратами, лечебной физкультурой, специальной подушкой для фиксации положения головы во сне показывают хорошие результаты. Начинают процедуры детской физиотерапии не только с минимальных доз тока, но еще и с минимальных площадей влияния на тело.

Для детей – меньшие нагрузки, чем для взрослых

Чтобы достигнуть максимального эффекта и свести к минимуму риски детская физиотерапия в Саратове, в том числе, УВЧ-терапия, лазеротерапия или другие процедуры, назначаются с учетом возраста, веса и роста ребенка. При этом, если, например, для взрослого сеанс длиться 15 минут, то для ребенка до 3-х лет – он будет составлять 5 минут, до 7 лет – до 10 минут.

Постоянный контроль над реакцией

Важно не только соблюдать режим дня при физиотерапии, но и следить за проявлением реакции. Прежде всего, это местное и общее проявление.

Местная реакция после процедуры детской физиотерапии включает:

• покраснение;
• появление высыпания;
• воспаление участка, на котором проводилась процедура.

Общая: подавленное настроение, падение аппетита, редко повышение температуры. Например, после электростимуляции, временно появляется покраснение, но через пару минут после завершения процедуры покраснение спадает. Как правило, ореол не имеет четких границ. Увидев любую реакцию на теле ребенка, или заметив изменение в его состоянии или настроении, необходимо сообщить детском физиотерапевту или педиатру во время начала следующего сеанса детской физиотерапии в Саратове.

Также важно сообщить об аллергических реакциях во время детской физиотерапии, если они проявлялись в первый раз проведения процедуры. Например, магнитотерапия относится к процедурам, которые крайне редко вызывают побочные реакции, но если она спровоцировала покраснение или сухость кожи, которая сразу прошла, все равно стоит сообщить об этом специалисту.

Не все зоны разрешены для проведения физиотерапии. Например, область возле сердца не разрешено использовать для манипуляций, также, как и места с плохим кровообращением, а вот траскраниальная магнитотерапия, которая основывается на зоне оголовья и плеч, позволяет улучшить работу нервной системы, разрешена с раннего возраста после консультации с врачом.

Назначение строго по возможностям

Когда у ребенка снижены адаптационные возможности, замедлены реакции, наблюдается повышенная температура или кровоточивость, процедуры детской физиотерапии не назначаются, и даже приостанавливаются до возвращения в привычный режим. Когда назначается электростимуляция разных зон тела, предварительно исключаются возможные повреждения на этих участках.

Возрастной принцип

Все эти принципы актуальны во время назначения широкого спектра процедур: фототерапии (с рождения), гальванизации и электрофорез с 1 месяца, ЛФК, которая назначается индивидуально, электросон – с 2-х лет, массаж – со 2 месяца, а ультразвук – с 2-х лет; динамическое токи – с раннего школьного возраста, ингаляции – с 3-х лет. Большой популярностью в детской физиотерапии для повышения иммунных свойств и защиты организма от острых вирусных заболеваний и сопутствующих факторов (насморк, кашель) пользуется галотерапия, которую многие дети любят, и посещают соляную пещеру регулярно с хорошим настроением.

Вы можете записаться на процедуры детской физиотерапии в Саратове к опытному профессиональному физиотерапевту Первого детского медицинского центра — Татарской Тамаре Фимовне.

Здоровье вашего ребенка нужно доверить профессионалам. При возникновении первых же симптомов обратитесь к врачу! В Первом Детском Медицинском Центре опытные врачи быстро распознают признаки заболевания, проведут полное обследование на современном медицинском оборудовании и окажут квалифицированную медицинскую помощь. Мы работаем без выходных и ждём вас в любое время с 8.00 до 20.00.

Записаться к Врачу

УВЧ в детской физиотерапии

УВЧ (ультравысокочастотная терапия) — метод детской физиотерапии, при котором применяется воздействие…

Магнитотерапия в детской физиотерапии – эффективность и надежность

Магнитотерапия является одной из популярных процедур в детской физиотерапии. Магнитотерапия — метод лечебного…

ДМВ-физиотерапия: что это такое, как проводится и эффекты от процедуры

Детская физиотерапия в Саратове представлена широким спектром проводимых процедур. В данной статье мы…

Топ-5 наивных мифов о физиотерапии: разбираемся и развенчиваем

Достаточно часто, особенно от людей, которые никак не связаны с медициной, можно услышать, что физиотерапия…

Электрофорез – эффективная и популярная физиотерапевтическая процедура

Электрофорез как метод физиотерапии популярен более 50-ти лет. За это время его основной принцип работы…

Физиотерапия при ЗРР. Нормализация речевого развития у ребенка

Задержка речевого развития – не приговор, и если вовремя обратиться к профильным специалистам, сформировать…

Физиотерапия в педиатрии – помощь каждому ребенку

На разных возрастных этапах ребенку нужна комплексная детская физиотерапия для того, чтобы устранить…

Врач-физиотерапевт – кто это? Какие заболевания лечит физиотерапевт?

Детский врач-физиотерапевт – специалист с дипломом о высшем медицинском образовании, который не просто…

Амплипульстерапия как вид физиолечения заболеваний опорно-двигательной системы

Ответ на вопрос, чтo тaкoe aмплипyльcтepaпия, стоит начать с того, что это один из видов физиотерапии,…

Физиотерапия для детей

— Когда используется физиотерапия: во время острого периода болезни, подострый период или только с реабилитационной…

Первый детский медицинский центр

Здоровье детей – спокойствие родителей!

Поделиться в соцсетях:

ФИЗИОТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ №1

Фельдман Рита Михайловна

Заведущая физиотерапевтического отделения 

Врач высшей квалификационной категории.

Физиокабинеты больницы открывались одновременно с открытием взрослой поликлиники и взрослого стационара, затем детского стационара и детской поликлиники. С первого дня функционирования лечебных корпусов физиолечение, было включено в лечение для взрослых больных и детей, оставаясь одним из эффективных методов лечения и до настоящего времени.

Физиотерапевтическое отделение обслуживает больных взрослого и детского стационаров, взрослой и детской поликлиники, обслуживающих население Привокзального и Советского районов.

В физиокабинете детского стационара лечатся больные из педиатрического отделения, психоневрологического отделения для детей, хирургического отделения для детей, отделения патологии новорожденных, отделения для выхаживания недоношенных детей, отоларингологического отделения.

В физиокабинете взрослого стационара лечатся больные из урологического отделения, кардиологического отделения,  нейрососудистого отделения.

Население детской и взрослой поликлиники получает физиолечение по заболеваниям верхних дыхательных путей, заболеваниям бронхов и легких, заболеваниям нервной системы, заболеваниям органов пищеварения, мочевой системы, заболевания сердечно-сосудистой системы, заболевания костно-мышечной системы.

В состав физиотерапевтического отделения входит кабинет физиотерапии в детской поликлинике, взрослой поликлинике, кабинет электролечения, светолечения, кабинет ультравысокочастотной терапии, ингаляторий, кабинет парафинолечения.

Во всех физиокабинетах проводится электрофорез с эуфиллином на воротниковую зону, на грудную клетку; электрофорез с магнезией на воротниковую зону, на грудную клетку, на область правого подреберья; электрофорез хлористого кальция эндоназально и на область тазобедренных суставов, применяется электрофорез новокаина и анальгина на область позвоночника, суставов, а так же введение этих лекарств с помощью импульсивных токов. При экссудативных отитах, тугоухости используется электрофорез иодида калия эндоурально. Широко используется амплипульстерапия и диадинамотерапия при заболеваниях нервной системы и опорно — двигательного аппарата.

В отдельном кабинете отпускаются процедуры ультравысокочастотной терапии при острых воспалительных и гнойных заболеваниях различных органов и тканей. В отделении имеется достаточное количество аппаратов магнитотерапии «Алмаг 02», поэтому магнитотерапия широко используется при различных заболеваниях.

При многих заболеваниях слизистой оболочки, кожи и подкожной клетчатки используется общее и местное ультрафиолетовое облучение.

При заболеваниях верхних дыхательных путей, бронхитах, пневмониях применяются тепловлажные ультразвуковые ингаляции различных медикаментов. При аденоидитах, риносинуситах эффективно используется лазерная терапия эндоназально.

При различной патологии мочевого пузыря, мочевыводящих путей используется ультразвуковая терапия и введение лекарственных средств с помощью ультразвука. В кабинете парафинолечения с большой эффективностью используется парафино-озокеритовая апликации на различные области организма.

Все физиокабинеты оснащены современной аппаратурой: аппаратами магнитотерапии, ультравысокочастотной терапии, светотерапии, аппаратами лазерной терапии, ультразвуковой терапии, аппаратами электротерапии.

В физиотерапевтическом отделении №1 работают мед сестры с большим стажем работы, имеющие высшую и первую квалификационную категорию , повышающие свою квалификацию каждые  5 лет на базе колледжа последипломного образования средних мед работников.

Все мед сестры быстро осваивают работу на физиотерапевтическом оборудовании, поступающим в отделение. В отделении ежемесячно проводятся сестринские конференции по различной тематике, занятия по технике безопасности и противопожарной безопасности, занятия по гражданской обороне.

В 2014 году усилиями администрации больницы открыт кабинет лечебной физкультуры и кабинет массажа в детском стационаре. Кабинет лечебной физкультуры в течении года был полностью оснащен необходимым оборудованием: а именно, шведской стенкой из трех секций, гимнастической скамейкой, детскими велотренажерами, беговой дорожкой, манупедом и степпером, а также большим количеством различных мячей и гимнастическими палочками, что позволило более эффективно проводить реабилитацию детей при: ДЦП, остеопатиях, пневмониях, ортопедической патологии. В кабинете массажа установлен современный массажный стол, что помогает массажистке успешно проводить курсы массажа у больных детей.

показания, особенности процедуры, результаты. Как часто можно делать электрофорез ребенку

Электрофорез ребенку назначается довольно часто для лечения некоторых патологий. С его помощью в организм малыша вводятся активные вещества, которые поступают непосредственно в пораженное место. Используют для этих целей минимальный разряд тока, чтобы не причинить вред здоровью маленького пациента. Продолжительность манипуляции зависит от возраста ребенка.

Принцип действия

Электрофорез представляет собой движение в электрическом поле заряженных ионов, способных переносить в жидкой или парообразной среде различные частицы. Принцип действия следующий. На дерму кладут прокладки электродов, обернутые тканью, пропитанной лекарственным средством. Благодаря воздействию тока растворы препаратов распадаются на ионы, образуя гидрофильные заряженные комплексы, которые проникая в биологические ткани оказывают лечебное действие. Большая их часть задерживаясь в коже, проявляет местный терапевтический эффект.

Оставшаяся часть вместе с током крови и лимфы разносится по всему организму. Положительно заряженные частицы оказывают обезболивающее, успокаивающее, антивоспалительное и обезвоживающее действие. Отрицательные нормализуют процессы обмена, расслабляют, расширяют сосуды. Кроме того, электрофорезу присущ незначительный согревающий эффект.

Показания и противопоказания

Для чего назначают электрофорез детям? Эта процедура отлично справляется с остаточными явлениями простуды и ее зачастую рекомендуют детские доктора в восстановительный период. А также его назначают для лечения следующих патологических состояний:

• Родовые травмы.
• Аномалии и врожденные пороки сердца.
• Ожоги.
• Костно-мышечные нарушения.
• Гипер- или гипотонус мышц.
• Для уменьшения болевых ощущений при различных недугах.
• Лор-болезни.
• Неврологические нарушения.
• Диатез.
• Болезни глаз.

Кроме того, его применяют, когда необходимо направить действие лекарства непосредственно в центр очага воспаления.

Как часто можно делать электрофорез ребенку? Любое физиотерапевтическое лечение назначается с частотой не более четырех раз в год. Интервал между курсами должен быть не менее трех месяцев.

Противопоказана эта процедура при наличии у детей:

• повреждения кожи в месте наложения электродов;
• гнойничков;
• дерматита;
• высокой температуре;
• почечной и сердечной недостаточности;
• опухоли;
• бронхиальной астме в острой стадии;
• острого воспалительного процесса;
• нарушения свертываемости крови и риске кровотечения;
• аллергических проявлений на медикаменты, рекомендуемые для проведения процедуры электрофореза.

Преимущества и недостатки

Довольно часто назначается лекарственный электрофорез детям. Что это такое? Это одновременное воздействие на организм электрического тока и препарата. Использование этого физиотерапевтического метода дает хороший эффект.

Преимущества электрофореза:

• отсутствует ощущение дискомфорта;
• нет риска развития аллергических или иных неблагоприятных реакций местного или общего характера;
• длительность терапевтического эффекта от суток до двадцати;
• имеется возможность введения медикамента непосредственно в пораженный участок, минуя сосудистую систему и ЖКТ;
• малыши старше года обычно хорошо переносят эту процедуру.

Среди недостатков следует отметить:

• наличие противопоказаний у конкретного индивида;
• не все лекарства можно ввести данным методом.

Особенности действия электрического тока у маленьких пациентов

Что дает электрофорез детям? Лечение этой методикой позволяет частично отказаться от перорального или инъекционного приема медикаментов.

Рассмотрим некоторые особенности детского организма:

1. Морфофункциональная незрелость дермы – тонкий наружный слой. В нем содержится малое количество клеточных слоев, которые рыхло связаны с тонким бесклеточным слоем, отделяющим соединительную ткань от эндотелия (базальной мембраны).
2. У малышей младше четырех месяцев неразвиты потовые железы, а также внутрикожные сосуды склонны к расширению.
3. Кожные покровы обладают высокой интенсивностью молекулярного взаимодействия с водой, т. е. они имеют низкое сопротивление к электрическому току и с большой скоростью впитывают вещества.
4. Химическая и температурная регуляция недостаточно развита, поэтому процедуру электрофореза проводят осторожно.

В период манипуляции, длительность которой зависит от возраста, необходим контроль за состоянием ребенка со стороны и медиков, и родителей.

Под воздействием тока наблюдаются такие эффекты, как:

• лимфодренажный;
• гормонорегулирующий;
• сосудорасширяющий;
• лимфодренажный;
• противовоспалительный;
• миорелаксирующий;
• иммуностимулирующий.

Лекарственные средства, используемые для физиопроцедуры

Как уже упоминалось, довольно часто назначают электрофорез детям. Что это такое? Это один из безопасных и эффективных методов введения медикаментов при многих недугах. Он прост в исполнении, но требует понимания некоторых физических законов и фармакологического действия применяемых лекарств. Используя электрический ток вводят различные медикаменты, при этом системное воздействие на организм ребенка существенно снижается. В пораженном очаге создается максимальная концентрация активного вещества. Выбор препарата зависит от имеющихся болезней:

• Опорно-двигательного аппарата и внутренних органов с болевым синдромом – НПВС и спазмолитики: «Папаверин», «Метамизол натрия», «Прокаин», «Папаверин»
• Последствия черепно-мозговых травм и нейроинфекций у ребенка – электрофорез с «Лидазой», «Никотиновой кислотой», «Пирацетамом», «Йодом», «Магния сульфатом».

• Поражение ЦНС – «Дротаверин», «Магния сульфат», «Аскорбиновая кислота», «Аминофиллин», «Никотиновая кислота», т. е. медикаменты, оказывающие дегидратирующее и сосудорасширяющее действие, а также улучшающие венозный отток.
• Полинейропатии и невриты – антихолинстеразные средства и витамины: «Прозерин», «Пиридоксина гидрохлорид», «Токоферола ацетат».
• Астенический синдром – адаптогены: «Экстракт алоэ», «Кофеин».
• Воспалительный процесс антибактериальной природы – антибиотики: «Эритромицин», «Ампициллин».

Специалист индивидуально подбирает необходимую концентрацию раствора, силу тока, а также длительность проведения манипуляции.

Помогает ли электрофорез детям? Ответ на этот вопрос положительный. Эта методика безопасна, позволяет создать в патологическом очаге высокую концентрацию активного вещества, дает быстрый и стойкий эффект. Кроме того, данная физиотерапевтическая процедура доступна практически во всех учреждениях здравоохранения на бесплатной основе.

Методики проведения физиолечения

Суть электрофореза заключается в следующем. С его помощью в организм ребенка вводятся различные лекарства, которые поступают непосредственно в пораженное место. Для этой цели применяют минимальный разряд тока, чтобы не причинить вреда и не спровоцировать болевой синдром.

Известные следующие разновидности проведения электрофореза:

• Полостной – в прямую кишку, желудок, мочевой пузырь, т. е. в полые органы вводится лекарственное средство и электрод со знаком «плюс», а на поверхности находится электрод со знаком «минус». Этот способ эффективен при патологии органов малого таза и кишечника.
• Ванночковый – в емкость с электродами наливается необходимое лекарство в виде раствора и в него погружается больной участок тела, например, нижняя или верхняя конечность.
• Внутритканевой – первоначально пациенту вводится медикамент перорально или внутривенно, а далее на пораженную область накладывают электроды. Преимущественно используют такую методику при болезнях дыхательной системы – ларингиты, бронхиты.

Методики, используемые в детском возрасте

Перечисленные выше методики применяют и у детишек. Кроме того, существует несколько способов, которые преимущественного используют у маленьких пациентов:

1. Гальванический воротник по Щербакову – разрешен для малышей с двух лет. Так называемый «шалевый» электрод размещают в воротниковой области. Другой, мелкий, накладывают на область пояснично-крестцового отдела позвоночника. Первоначально, сила тока не более трех, далее, ее постепенно увеличивают до десяти-двенадцати ампер. По длительности первые два сеанса не более четырех минут. В дальнейшем время увеличивается до пятнадцати минут. Курсовое лечение максимум двенадцать манипуляций.
2. По Левину – используют при гиперкинезе конечностей и гипертонусе. Такие состояния характерны для органических поражений головного мозга. На пальцах нижних и верхних конечностей размещают раздвоенные электроды. Спустя пятнадцать минут меняют полярность на руках и ногах.
3. При патологии суставов (дисплазия тазобедренных суставов) – благодаря электрофорезу происходит правильное оформление тканей сустава. В итоге, объем движений в нижних конечностях восстанавливается.
4. По Вермелю – для новорожденных и грудничков. Один электрод располагают на уровне второго-десятого грудного позвонка, второй – на передней части брюшной стенки. Среднее время процедуры около десяти минут.
5. Назальный – у малышей и дошкольников трудно выполнить эту процедуру, так как они категорически отказываются от введения посторонних предметов в носовую полость. Непосредственно перед процедурой электрофореза ребенку промывают нос физраствором или обычной кипяченой водой. Тампон из ваты, пропитанный раствором новокаина или кальция хлорида, вводят в носовые ходы. Концы турунд соединяют с первым электродом над верхней губой, второй – располагают на задней поверхности шеи. По времени процедура длится не более двадцати минут.
6. По Келлата-Змановскому – чаще всего применяют при заикании и спастической дизартрии. На боковую поверхность головы помещают двухлопастные электроды. Подают ток, силой от трех до семи ампер. Продолжительность процедуры минимум семь и максимум пятнадцать минут.
7. По Бургиньону – показан при аномалиях неврологического характера, локализованных внутри черепа, травматических и ишемических поражениях нервной системы, а также вегетососудистой дистонии. Один электрод (раздвоенный) накладывают на закрытые глаза, а второй – в виде пластины — на заднюю поверхность шеи.

Ток в ходе проведения электрофореза ребенку добавляется постепенно. При появлении покалывания его перестают подавать. Длительность манипуляции от десяти до пятнадцати минут. Делают ее через день или ежедневно. Курс лечения минимум десять и максимум двадцать процедур.

Какие бывают электроды

Существует большое разнообразие этих изделий:

1. Самые распространенные – это бумажные одноразовые. Они снабжены гидрофильными прокладками, за счет которых активное действующее вещество медикамента сквозь них проникает в дерму. Такие медицинские изделия чаще всего состоят из двух пластин, но имеются и более сложные варианты. Непосредственно перед манипуляцией их обильно пропитывают физиологическим раствором, водой или лекарством. Преимущество одноразовых электродов – это возможность придать любую форму для удобства наложения на разные участки тела.
2. Одноразовые полостные электроды для электрофореза предназначены для проведения процедуры внутри полостей. Они стерильны и не требуют никакой дополнительной обработки.
3. Медицинские изделия многоразового использования — практичны, но требуют стерилизации. Они изготовлены из хлопчатобумажной ткани, обладающей хорошей электропроводностью и устойчивостью к действию агрессивных кислот и щелочей. Материю складывают в несколько слоев, между ними располагают углетканевые электроды, через которые подается ток.
4. В резиновые пластины вшиваются специальные токопроводящие элементы, благодаря которым они становятся прочными и надежными. Ими комплектуют многие современные аппараты для физиотерапии.
5. Металлические электроды используют в настоящее время довольно редко. Для их изготовления чаще всего используют медь или свинец.
6. Можно и самостоятельно сделать гидрофильные прокладки. Для этого берут натуральную ткань, например, хлопок или фланель, складывают в несколько слоев, чтобы толщина была не более десяти миллиметров и смачивают солевым раствором или водой. Электрод размещают на прокладке.

К подбору этих изделий следует подходить ответственно и перед покупкой желательно проконсультироваться со специалистом.

Обзор моделей

Для проведения физиотерапевтического лечения дома надо приобрести устройство для электрофореза. Желательно уточнить у доктора, какого производителя лучше всего покупать аппарат. Первую процедуру выполняют в присутствии медсестры. Кроме того, надо научиться подбирать готовить растворы для проведения манипуляции. На рынке представлен большой выбор приборов для электрофореза. Рассмотрим некоторые из них:

• «Поток-1» – преимущественно применяют в медицинских организациях, занимающихся реабилитацией.
• «Радиус-01» – одноканальный переносной аппарат, как и предыдущий объединяет в себе несколько физиотерапевтических способов: диадинамотерапию, гальванизацию, амплипульстерапию и электрофорез лекарственный. Его широко используют в санаторных и косметологических учреждениях, а также в стоматологии и в домашних условиях.
• «Рефтон-01-ФС» – прибор, сочетающий несколько функций: флюктуоризацию, диадинамотерапию, электрофорез, электростимуляцию и амплипульстерапию. Процедуру электрофореза ребенку можно делать и у его постели.
• «Элфор» – портативный аппарат, который используют и в домашних условиях, и в учреждениях здравоохранения.

Таким образом, выполняют физиолечение используя разные аппараты. Помните, что решение о необходимости проведения данной манипуляции принимает лечащий доктор вашего ребенка.

Вместо заключения

Какой физический процесс используется при электрофорезе? Метод основан на следующих явлениях: электропроводимости структур организма, гальванизации, электролитической диссоциации. При этой физиотерапевтической процедуре под действием постоянного электрического тока небольшой силы, который подводится к телу индивида через электроды, в тканях происходит перемещение заряженных частиц: отрицательные движутся к аноду, а положительные – к катоду. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы скорости различны.

Теперь вы знаете какой физический процесс используется при электрофорезе.

Электрофорез для грудничков в УльтраКИДС в Нижнем Новгороде

В области педиатрии часто прибегают к физиотерапевтическим процедурам Основная причина – безболезненность и эффективность при широком спектре заболеваний. Один из видов таких процедур – электрофорез.
Данная процедура представляет собой введение лекарственных препаратов через слизистые и кожные покровы, используя метод гальванизации, то есть посредством электрического тока. Процедура безболезненна и поэтому электрофорез используется для грудничков, начиная с трехнедельного возраста для коррекции различных патологий, в том числе и в сочетании с другими типами терапии, например массажем, ЛФК.

Электрофорез используется для терапии многих заболеваний и патологий. Наиболее часто – дисплазия тазобедренных суставов, вывихи, подвывихи.

Электрофорез на тазобедренные суставы грудничку подразумевает наложение электродов в специальных тряпичных чехлах, смоченных в лекарственном препарате на пораженную область. Чаще всего назначается 10 процедур. Помимо электрофореза лечение сопровождается специальным ЛФК и массажем. В зависимости от тяжести случая может быть назначено широкое пеленание или ношение специального ортопедического приспособления.

Очень часто приходится слышать вопрос – можно ли электрофорез грудничку? Грудничкам можно делать электрофорез, начиная с трехнедельного возраста. Но нужно убедиться, что лекарство не будет вызывать местной аллергической реакции, что на практике встречается довольно редко, ведь концентрация препарата на самом деле очень низкая, намного меньше, чем, если бы маленькому пациенту был назначен препарат в виде инъекций или таблеток.

При дисплазии младенцам часто назначают электрофорез в сочетании с массажем. При этом курс может быть даже не один, в зависимости от клинической ситуации и динамики. Наиболее назначаемым препаратом в данном случае является кальций.

Электрофорез с кальцием для грудничков позволяет снять тонус, отек с поврежденных тканей, насытить костную ткань необходимым материалом. При этом достигается высокая локальная концентрация вещества, а воздействия на желудок не происходит. В коже препарат откладывается как бы в клеточном депо и расходуется дольше, то есть электрофорез грудничку при дисплазии позволяет пролонгировать действие препарата, замедлить его выведение из организма.

В детской клинике «УльтраКИДС» вы можете пройти курс электрофореза. У нас также можно записаться на профессиональный массаж и ЛФК. У нас работают только высококлассные специалисты, а также созданы комфортные условия для пребывания маленьких пациентов. Позвоните нам и запишитесь на процедуры в удобное вам время.

• Вопрос: Нужно ли как-то готовиться к электрофорезу?

Ответ: Нет, подготовка к процедуре не требуется.

• Вопрос: Почему ребенок капризничает во время электрофореза?

Ответ Процедура может доставлять небольшой дискомфорт, например небольшие покалывания, но болевых ощущений не должно быть.

• Вопрос: Сколько длится электрофорез у грудничка?

Ответ: Среднее время процедуры 10-15 минут.

• Вопрос: Можно ли в один день делать массаж и электрофорез?

Ответ: Обычно так и делают. Врач в зависимости от клинической ситуации может порекомендовать, что делать первым электрофорез или массаж.

Электрофорез | Кунцевский многопрофильный лечебно-реабилитационный центр

Что такое электрофорез с карипазимом

Электрофорез – это лечение постоянным током. Действие физиотерапии дополняет карипазим (карипаин) – лечебное вещество с сильным протеолитическим и противовоспалительным эффектом.

Описание процедуры

При нанесении карипаина на тело, постоянный ток выступает направленным проводником к источнику боли. В результате варьирования силы тока, длительности сеанса, количества электродов, концентрации медикамента выраженность лечебного эффекта различается.

Карипазим состоит из солей, магния, кальции, аминокислот, натрия и калия. Он разрушает белок в составе хрящевой и костной ткани, не влияя на коллаген, за счет чего обеспечивается уменьшение размера новообразования. Медикамент воздействует только на больной участок, не затрагивая здоровые зоны нервных окончаний и костей.

Показания

Чаще всего процедуру назначают травматологи, нейрохирурги и ортопеды при болезнях спины и позвоночника. Поводом для записи на электрофорез с карипазимом становится:

• пролежни и некрозы I стадии,
• воспаления нервных корешков позвоночного столба,
• воспаления твердых оболочек головного мозга,
• ожоги, ссадины, раны тяжелой степени тяжести,
• переломы суставов,
• защемление лицевого и других нервов,
• чрезмерный тонус головного мозга.

Зачем нужен электрофорез с карипазимом

Наибольший эффект процедура оказывает при межпозвонковой грыже. Клиническая картина улучшается, новообразование уменьшается в размере, нервные окончания расщемляются и из-за этого боль стихает. Кроме этого, методика назначается для лечения:

• остеохондроза,
• периартрита,
• артрита и артроза,
• радикулита,
• межреберной невралгии,
• неврита.

Положительное воздействие электрофореза с карипазимом наблюдается при лечении послеоперационных рубцов и спаек, воспалений малого таза.

Эффективность

Карипазимам имеет пролангированное действие, поэтому для достижения выраженных результатов требуется пройти несколько курсов, состоящих из 30 ежедневных процедур.

Медикамент под воздействием постоянного тока размягчает хрящи и выводит отложения кальцинатов, укрепляет и повышает амортизацию межпозвонковых дисков, регенерирует ткани.

Запись на сеанс электрофореза с карипазимом

Для того, чтобы записаться к врачу, выбирайте любой способ:

• звонок по телефону клиники +7 (495) 103-99-55,
• 
  заказать обратный звонок,
• 
  оставить заявку на запись на прием, через удобную форму на сайте:

ЗАПИСЬ НА ПРИЕМ

Где пройти курс электрофореза с карипазимом

Чтобы достичь успеха в лечении, нужно попасть к грамотному физиотерапевту. У нас работают опытные специалисты высшей категории, которые индивидуально рассчитывают дозировку препарата и настраивают аппарат.

Найти клинику можно по адресу в Москве: ул. Партизанская, д.1. На запад столицы можно добраться на метро до станции «Молодежная» или личном транспорте, оставив автомобиль на бесплатной парковке.

Противопоказания

Нужно учесть следующие ограничения к процедуре:

• индивидуальная непереносимость действующего вещества,
• непереносимость тока,
• онкология,
• обострение хронических заболеваний,
• повышенное артериальное давление,
• нарушенная целостность кожи на спине.

Дополнительно нужно проконсультироваться с лечащим врачом, если нужно лечение грыжи, направленной внутрь.

Стоимость

Для расчета полной стоимости курса электрофореза с карипазимом стоит обратиться к администратору клиники. Цены на сеанс средние по Москве.

Электрофорез в агарозном геле (основной метод)

Электрофорез в агарозном геле (основной метод)

Фон

Электрофорез в агарозном геле — самый простой и распространенный способ разделения и анализа ДНК.
Цель геля может заключаться в изучении ДНК, ее количественной оценке или выделении определенной полосы. В
ДНК визуализируется в геле путем добавления бромистого этидия, который является мутагенным или менее токсичным патентованным веществом.
красители, такие как GelRed, GelGreen и SYBR Safe.Бромид этидия и запатентованные красители связываются с ДНК и являются
флуоресцентные, что означает, что они поглощают невидимый УФ-свет и передают энергию в виде видимого света.

Какой процент геля?

Большинство агарозных гелей составляют от 0,7% до 2%. 0,7% гель покажет хорошее разделение (разрешение) больших ДНК.
фрагменты (5–10 т.п.н.) и 2% гель покажут хорошее разрешение для небольших фрагментов (0,2–1 т.п.н.).
Некоторые люди доходят до 3% для разделения очень мелких фрагментов, но вертикальный полиакриламидный гель более эффективен.
уместно в этом случае.Гели с низким процентным содержанием очень непрочные и могут сломаться, когда вы попытаетесь их поднять.
Гели с высоким процентным содержанием часто бывают хрупкими и не схватываются равномерно. Я обычно делаю 1% гели.

Какой резервуар для геля?

Маленькие гели (минигели) размером 8х10 см очень популярны и дают хорошие фотографии. Для аппликаций используются гели большего размера.
такие как Саузерн и Нозерн блоттинг. Объем агарозы, необходимый для минигеля, составляет около 30–50 мл, для
гель большего размера может быть 250 мл. Этот метод предполагает, что вы делаете мини-гель.

Сколько ДНК мне нужно загрузить?

Большой вопрос. Возможно, вы готовите аналитический гель, чтобы просто посмотреть на свою ДНК. В качестве альтернативы,
вы можете готовить препаративный гель для отделения фрагмента ДНК перед тем, как вырезать его из геля.
для дальнейшего лечения. В любом случае вы хотите видеть полосы ДНК в ультрафиолетовом свете в
окрашенный бромистым этидием гель.Обычно полоса легко заметна, если она содержит около 20 нг ДНК.

Теперь рассмотрим пример. Предположим, вы перевариваете плазмиду, которая
содержит 3 т.п.н. вектора и 2 т.п.н. вставки. Вы используете EcoRI (обычный рестрикционный фермент)
и вы ожидаете увидеть три полосы: линеаризованный вектор (3 кб), 5 ‘конец вставки (0,5 кб)
и 3’-конец вставки (1,5 т.п. н.). Чтобы увидеть самую маленькую полосу (0.5 кб) хочешь
содержать не менее 20 нг ДНК. Самая маленькая полоса составляет 1/10 размера неразрезанной плазмиды.
Следовательно, вам нужно вырезать 10×20 нг, то есть 200 нг ДНК (0,2 мкг).
Тогда ваши три полосы будут содержать 120 нг, 20 нг и 60 нг ДНК соответственно. Все три группы будут
должна быть четко видна на геле, и самая большая полоса будет в шесть раз ярче, чем самая маленькая.

Теперь представьте, как разрезать ту же плазмиду с помощью BamHI (еще одного популярного рестрикционного фермента) и
что BamHI разрезает плазмиду только один раз, чтобы линеаризовать ее.Если в этом случае вы переварите 200 нг ДНК, то
полоса будет содержать 200 нг ДНК и будет очень яркой.

Слишком много ДНК , нанесенное на гель, — это плохо. Группа, кажется, бежит быстро (подразумевая
что он меньше, чем есть на самом деле) и в крайних случаях может испортить электрическое поле для
другие полосы, из-за чего они тоже выглядят неправильного размера.

Слишком мало ДНК — проблема только в том, что вы не сможете увидеть
самые маленькие полосы, потому что они слишком тусклые.

Тем не менее, гели ДНК прощают, и широкий диапазон нагрузок ДНК даст приемлемые результаты.
Я обычно перевариваю и загружаю 2–4 мкл из 50 мкл, полученных из набора miniprep.
Для реакций ПЦР это зависит от ПЦР, но для рутинных применений 10–20 мкл должно быть достаточно.
чтобы увидеть продукт на геле.

Какой гребень?

Это зависит от объема загружаемой ДНК и количества образцов.Расчески с множеством крошечных зубцов
может содержать 10 мкл. Это бесполезно, если вы хотите загрузить 20 мкл ограничения.
дайджест плюс 5 мкл загрузочного буфера. Решая, достаточно ли зубцов у расчески, помните, что
нужно загрузить хотя бы одну маркерную полосу, а лучше две.

Изготовление геля (для 1% геля объемом 50 мл)

Отвесить 0,5 г агарозы в коническую колбу на 250 мл. Добавьте 50 мл 0.5xTBE,
закрутите, чтобы перемешать.

Хорошо использовать большую емкость, если она подходит для микроволновой печи, потому что агароза легко вскипает.

В микроволновой печи около 1 минуты, чтобы растворить агарозу.

Раствор агарозы может очень легко вскипеть, поэтому постоянно проверяйте его. Хорошо это прекратить после
45 секунд и дайте ему вращаться. Может перегреться
и НЕ кипятите, пока не достанете, после чего он закипит на всех ваших руках.Итак, носите перчатки и
держите его на расстоянии вытянутой руки. Вы можете использовать горелку Бунзена вместо микроволновой печи — просто не забывайте следить за ней.

Дайте ему остыть на столе в течение 5 минут до температуры около 60 ° C (слишком жарко, чтобы держать его голыми руками).

Если вам пришлось долго кипятить, чтобы растворить агарозу, возможно, вы потеряли немного воды.
к водяному пару. Вы можете взвесить колбу до и после нагрева и добавить немного дистиллированной воды.
восполните этот потерянный объем.Пока агароза остывает, приготовьте резервуар для геля на ровной поверхности.

Добавьте 1 мкл бромида этидия (10 мг / мл) и встряхните, чтобы перемешать

Причина, по которой агарозе нужно немного остыть перед этим этапом, состоит в том, чтобы минимизировать производство.
паров бромистого этидия. Бромистый этидий мутаген , и с ним следует обращаться с особой осторожностью.
Утилизируйте загрязненный наконечник в специальный контейнер для отходов бромистого этидия.Раствор бромистого этидия 10 & nbspmg / мл
изготавливается из таблеток (во избежание взвешивания порошка) и хранится при 4 ° C в темноте с наклейками TOXIC.

Существуют альтернативы использованию токсичного и мутагенного бромистого этидия:

Медленно налейте гель в резервуар. Отодвиньте пузырьки в сторону с помощью одноразового наконечника. Вставлять
расческу и дважды проверьте правильность ее положения.

Преимущество медленного наливания заключается в том, что большинство пузырьков остается в колбе. Немедленно промойте колбу.

Оставьте для застывания не менее 30 минут, предпочтительно 1 час, если возможно, с закрытой крышкой.

Гель может выглядеть гораздо быстрее, но слишком быстрое введение ДНК в гель может привести к ужасному виду.
результаты с размытыми диффузными полосами.

Залейте 0,5x буфер TBE в резервуар с гелем, чтобы погрузить гель на глубину 2–5 мм.Это рабочий буфер.

На этом этапе необходимо использовать тот же буфер, что и при приготовлении геля. т.е. Если вы использовали 0.6xTBE
в геле используйте 0,6xTBE в качестве рабочего буфера. Не забудьте удалить металлические гелеобразователи, если они используются в резервуаре с гелем.

Подготовка образцов

Перенесите необходимое количество каждого образца в новую микроцентрифужную пробирку.

Это может быть 10 мкл 50 мкл реакции ПЦР или 5 мкл 20 мкл расщепления рестрикционным ферментом.если ты
загружают все 20 мкл 20 мкл реакции ПЦР или ферментного переваривания (как я часто это делаю), тогда нет необходимости использовать свежие
пробирки, просто добавьте загрузочный буфер в пробирки для ПЦР. Запишите в своей лабораторной книге физический порядок пробирок, чтобы вы могли идентифицировать
полосы на фотографии геля.

Добавьте необходимое количество загрузочного буфера в каждую пробирку и оставьте наконечник в пробирке.

Добавить 0.2 объема загрузочного буфера, например. 2 мкл на образец объемом 10 мкл. Наконечник будет снова использован для загрузки геля.

Загрузите первую лунку маркером.

Я храню свои маркеры в готовом виде с загрузочным буфером при 4 ° C. Я знаю, что нужно загрузить 2 мкл и сколько ДНК находится в каждой полосе.
Подробнее об этом см. Ниже.
По возможности избегайте использования концевых колодцев. Например, если у вас есть 12 образцов и 2 маркера, всего вы будете использовать 14 дорожек.Если ваша расческа
сформировано 18 скважин, то вы не будете использовать 4 скважины. Лучше не использовать внешние колодцы, потому что они, скорее всего, будут работать ненормально.

Продолжить загрузку образцов и закончить с последней полосой маркера

Я загружаю гели справа налево, ориентируя гель так, чтобы лунки находились близко к краю стола, и ДНК будет
отойти от края скамейки. Это потому, что гели публикуются по соглашению, как если бы лунки были вверху, а ДНК стекала вниз по странице.

Закройте резервуар с гелем, включите источник питания и прогоните гель при 5 В / см.

Например, если электроды находятся на расстоянии 10 см друг от друга, то прогоните гель при 50 В. Это нормально, если гель будет работать медленнее, чем это, но не быстрее.
При напряжении выше 5 В / см агароза может нагреться и начать таять, что пагубно скажется на разрешении геля.Некоторые люди сначала наносят гель медленно
(например, 2 В / см в течение 10 минут), чтобы позволить ДНК перемещаться в гель медленно и равномерно, а затем ускорить гель позже.
Это может дать лучшее разрешение. Можно запускать гели на ночь при очень низких напряжениях, например. 0,25–0,5 В / см, если хочешь домой уже в 11 часов.

Проверить, течет ли ток

Вы можете проверить это на источнике питания, миллиамперы должны быть в том же диапазоне, что и напряжение, но лучше всего посмотреть на
электроды и убедитесь, что они выделяют газ (т. е.пузыри). Если нет, то проверьте соединения, подключен ли источник питания и т. Д. Это было
известно, что происходит, если люди используют воду вместо проточного буфера.

Следите за продвижением геля по маркерному красителю.

Остановите гель, когда бромфеноловый синий пройдет 3/4 длины геля.

Выключите и отсоедините резервуар с гелем и отнесите гель (в держателе, если возможно) в темную комнату, чтобы посмотреть на УФ-световой короб.

Некоторые держатели для геля не прозрачны для УФ-излучения, поэтому необходимо аккуратно нанести гель на стеклянную поверхность светового бокса.
УФ канцерогенное вещество , и его нельзя допускать попадания на голую кожу или глаза. Так что надевайте защиту лица, перчатки и длинные рукава.

Буферы загрузки

Загрузочный буфер придает цвет и плотность образцу, чтобы облегчить загрузку в лунки. Также,
красители заряжены отрицательно в нейтральных буферах и, таким образом, движутся в том же направлении, что и ДНК во время
электрофорез.Это позволяет следить за продвижением геля.
Наиболее распространенными красителями являются бромфеноловый синий (Sigma B8026) и ксилолцианол (Sigma X4126). Плотность обеспечивается
глицерином или сахарозой.

Типовой рецепт

• 25 мг бромфенолового синего или ксилолцианола
• 4 г сахарозы
• H ₂ O до 10 мл

Точное количество красителя не важно
Хранить при 4 ° C, чтобы в сахарозе не образовалась плесень.10 мл загрузочного буфера хватит на годы.

Бромфеноловый синий мигрирует со скоростью, эквивалентной 200–400 п.н. ДНК. Если вы хотите видеть фрагменты где угодно
около этого размера используйте другой краситель, потому что бромфеноловый синий скроет видимость мелких фрагментов. Ксилол цианол
переносится с эквивалентностью примерно 4 КБ. Так что не используйте это, если хотите визуализировать фрагменты размером 4 кб.

Маркеры размера

Есть много разных типов маркеров размера ДНК.В былые времена самые дешевые определялись
ДНК была получена из бактериофага, поэтому многие маркеры были разрезаны ДНК фага рестрикционными ферментами. Многие из этих
все еще очень популярны, например, лямбда HindIII, лямбда PstI, PhiX174 HaeIII. Это дает полосы с известными размерами
но размеры произвольные. Выберите маркер с хорошим разрешением в соответствии с размером фрагмента, который вы ожидаете увидеть.
в ваших пробных полосах. Например, для крошечных продуктов ПЦР вы можете выбрать PhiX174 HaeIII, но для фрагментов размером 6 КБ
вы бы выбрали лямбда HindIII.Совсем недавно компании начали
изготовление лестничных маркеров с полосами через определенные интервалы, например. 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 кб и так далее до 10 кб.
Если вам известно общее количество ДНК, загруженной в маркерную дорожку, и вы знаете размеры всех полос, вы можете рассчитать
количество ДНК в каждой полосе, видимой на геле. Это может быть очень полезно для количественного определения количества
ДНК в полосах образцов по сравнению с полосами маркеров.Хорошо загрузить две маркерные полосы, фланкирующие
образцы. Многие компании продают маркеры размера ДНК. Стоит покупать самые дешевые товары. Часто местная кухня-раковина
Биотехнологическая компания продает отличные маркеры.

.

TBE

TBE расшифровывается как Tris Borate EDTA.

Люди также используют TAE (трисацетат EDTA). Сделайте 10-кратный запас, используя дешевые реактивы.Не использовать
дорогие реактивы «аналитической чистоты». Недорогое основание Трис и борную кислоту можно купить оптом.

Рецепт на 2 л 10xTBE ​​

• 218 г Трис-основа
• 110 г Борная кислота
• 9,3 г ЭДТА

Растворите ингредиенты в 1,9 л дистиллированной воды. pH примерно до 8,3 с использованием NaOH и довести до 2 л.

.

5 способов разрушить ваш агарозный гель

Одним из первых вещей, которые вы, вероятно, узнали вскоре после работы в своей первой лаборатории, был электрофорез в агарозном геле. Заливка и запуск геля агарозы должны быть простой и рутинной процедурой, которая, как вы не думаете, может пойти не так, как надо. На самом деле существует удивительное количество способов разрушить ваш агарозный гель. Вот пять распространенных виновников неудачного электрофореза в агарозном геле:

1.Используйте воду вместо буфера для геля или рабочего буфера

.

Агарозные гели отливают и обрабатывают с использованием буфера TAE или TBE. Поскольку оба эти буфера прозрачные, их легко принять за воду. Если используется вода, гель расплавится вскоре после нанесения заряда на коробку с гелем — попрощайтесь с этими образцами! (Выбор правильного буфера также важен.)

2. Забудьте добавить бромид этидия

В спешке легко забыть добавить бромид этидия в агарозу перед нанесением геля.Без него, конечно, невозможно будет визуализировать вашу ДНК. К счастью, вы можете спасти неокрашенный гель после того, как он закончится, замочив его в буфере, содержащем бромид этидия. Фактически, некоторые люди даже предпочитают окрашивать его после этого, хотя тогда вам придется утилизировать большой объем отходов бромистого этидия (к счастью, его можно использовать повторно несколько раз, прежде чем вам придется от него избавляться).

3. Используйте неправильный процент (или тип) агарозы

Стандартный процент агарозы, используемой для разделения ДНК, равен 1. 0%. Использование большего количества агарозы в геле увеличивает разрешение более мелких полос, в то время как более низкий процент агарозы позволяет более мелким полосам быстро проходить через гель, тем самым обеспечивая лучшее разрешение и разделение более крупных полос. Если используется неправильный процент, может быть трудно визуализировать ваши полосы. Будьте осторожны при использовании процентного содержания агарозы ниже 0,8%, так как эти гели станут слабее и более склонны к разрушению.

Агароза с низкой температурой плавления используется для специальных применений, таких как лигирование в геле.Эти гели очень «жидкие» и хрупкие даже при сопоставимых процентах, поэтому убедитесь, что вы взяли правильный реагент, прежде чем смешивать партию агарозы.

4. Отключить провода от источника питания

Одна из самых неприятных ошибок — это случайное отключение проводов от источника питания, так что гель стекает в обратном направлении. Поскольку лунки находятся так близко к концу геля, вы, скорее всего, потеряете все свои образцы, если не заметите ошибку сразу. Неплохая привычка проверять гель в течение первых нескольких минут после начала электрофореза, что также дает вам возможность убедиться в наличии тока (что легко проверить по пузырькам, выходящим на электроды). Если вы замечаете, что ваши группы движутся в неправильном направлении, пока не стало слишком поздно, просто поменяйте местами провода и верните их в другую сторону.

5. Оставьте гель по пути к тепловизору

Серьезно — не позволяйте этому случиться с вами.

К счастью, большинство из нас не позволяет этим вещам случаться с нами более одного раза.Какие уроки вы извлекли из неудач с агарозным гелем?

Вам это помогло? Тогда поделитесь, пожалуйста, со своей сетью.

Часто задаваемые вопросы о геле агарозы | GoldBio

Это некоторые из главных вопросов, касающихся гель-электрофореза и агарозных гелей. Узнайте о том, как повторно использовать / переплавлять гели, как рассчитать концентрацию, какой объем геля использовать для вашего конкретного лотка и многое другое.

1. Можно ли повторно использовать / переплавлять агарозу?

Агарозу всегда можно снова расплавить для повторного использования. Это также значительная экономия средств. Однако, как и во всем остальном, есть время, когда это выгодно, и время, когда нет.

Каждый раз, когда вы просто запускаете стандартные гели или проводите демонстрацию, повторное использование геля агарозы — отличный вариант. Но когда дело доходит до более тонкой стороны исследования: подтверждения результатов, публикации, клонирования, секвенирования, экстракции, саузерн-блоттинга и т. Д., мы рекомендуем использовать свежий гель.

Имейте в виду, что каждый раз при повторном использовании геля фон начинает увеличиваться.

Будьте осторожны при переплавке легкоплавкой агарозы. Повторное использование легкоплавкой агарозы может повлиять на ее концентрацию, поскольку вода теряется в процессе плавления.

Помимо переплавки, некоторые исследователи снимают полосы с геля и повторно используют гель без переплавки. Однако со временем гель теряет проводимость.

2. Как подготовить агарозу для повторного использования?

Вы можете повторно использовать свой агарозный гель несколькими способами:

• Сохранить в буфере и перезапустить
• Слейте гель
• Remelt
• Нанесите гель с достаточным количеством дорожек для работы с несколькими разными гелями

Для первого метода (хранение и повторный запуск) все, что вам нужно сделать, это сохранить использованный гель в контейнере с буфером TAE.Когда будете готовы запустить его, обязательно добавьте еще бромида этидия, запустите, сфотографируйте и снова сохраните. Повторное использование геля может продлить его срок службы примерно на неделю, а возможно и дольше, в зависимости от ваших предпочтений.

Удалите беговые ленты после использования (второй метод) и затем сфотографируйте. Опять же, при этом не забудьте добавить свой EtBr. И просто знайте, что для первого или второго метода вы можете повторно использовать эти гели только несколько раз. Через некоторое время они потеряют проводимость и получат повышенный фон.

Для третьего метода вы можете просто переплавить агарозу и повторно приготовить ее. Однако имейте в виду, что есть некоторые опасения, что обработка в микроволновой печи агарозы, содержащей EtBr, может высвободить ее в виде пара, а затем ее можно будет вдохнуть. Эта проблема вызывает споры среди исследователей, и переплав по-прежнему является распространенным методом.

Последний метод предполагает использование дополнительных неиспользуемых полос для дополнительных прогонов. Например, предположим, что ваш первый запуск включает четыре дорожки, а второй — шесть, вы можете использовать 16-луночный гель для первого набора, а затем запустить второй в оставшихся лунках позже в тот же день.Если в тот день у вас не получится, заверните гель в полиэтиленовую пленку и храните при 4 ° C.

3. Можно ли автоклавировать агарозу GoldBio?

Да, агарозу, в том числе легкоплавкую, можно автоклавировать. Это особенно полезно при работе со средой для выращивания, содержащей агарозу. Соблюдайте осторожность при автоклавировании. Лучше всего, , не автоклавировать материал , который содержит бромид этидия (EtBr) или продукты, которые считаются мутагенами, которые интеркалируют с ДНК. Это может привести к загрязнению машины.

4. Как хранить уже обработанный агарозный гель / агарозу, содержащую ДНК?

Бывают ситуации, когда вам, возможно, придется не фотографировать гель. И часто случайно узнаешь, что установка геля в буфер на ночь или даже в холодильнике все испортит. Ну так что ты делаешь?

Лучшее решение, которое мы нашли, — обернуть гель полиэтиленовой пленкой без буфера и хранить при 4 ° C. Хранение в буфере, вероятно, вызовет вымывание вашей ДНК в буфер.Вместо этого, этот метод должен купить вам дополнительный день или два.

Другой вариант, если вам нужно запустить гель, но вы не можете проанализировать его до следующего дня, — запустить его при низком напряжении. Проблема в том, что это работает только тогда, когда вы планируете отсрочку. В незапланированных ситуациях и в чрезвычайных ситуациях лучше всего обернуть гель и поставить его в холодильник. Это также замечательно, если вы планируете позже извлечь ленту для клонирования. В этом случае просто отрежьте ремешок и храните его в пластиковой пробирке на 1,5 мл при 4 ° C.Не забудьте держать пробирку должным образом закрытой, чтобы предотвратить обезвоживание, и не используйте буфер .

5. Можно ли замораживать гели агарозы?

Замораживание гелей агарозы вызывает обледенение и скопление воды. Даже если вы пытаетесь сохранить нарезанный гель для будущей экстракции, лучше не замораживать его. Вместо этого заверните гель агарозы в чистую пластиковую пленку без буфера и храните при 4 ° C.

6. Как долго можно хранить агарозу?

Исходная смесь агарозы в гелеобразной форме без буфера имеет срок годности пару недель.Если бромид этидия не добавляется в исходную смесь и смесь хранится в хороших условиях, она может прослужить дольше.

7. В чем разница между агарозным и полиакриламидным гелями?

Различия в приложениях: Ответ больше связан с тем, чего вы пытаетесь достичь. Гели агарозы отлично подходят для более крупных фрагментов ДНК, а гели полиакриламида лучше подходят для белков и фрагментов ДНК менее 1000 пар оснований.

Вам может быть любопытно, почему агароза, кажется, является обычным выбором для анализа нуклеиновых кислот, в то время как полиакриламид (SDS-PAGE) используется для белков.Вы все еще можете использовать SDS-PAGE для нуклеиновых кислот, и это идеально подходит для разделения очень маленьких фрагментов. Поскольку агароза лучше подходит для более крупных молекул, белки не будут растворяться с помощью этого метода.

Химические и структурные различия: Чтобы отлить агарозный гель, гель необходимо охладить, чтобы он затвердел. С другой стороны, для затвердевания полиакриламидных гелей требуется химическая реакция, и полиакриламид не может быть повторно нагрет для повторного использования.

Размер пор между двумя гелями также различается.1% -ный агарозный гель имеет средний размер пор примерно 100 нм. Имейте в виду, что это число составляет , медиана , поскольку агароза не имеет постоянного размера пор. Размер пор для полиакриламидного геля может составлять от 20 до 140 нм в зависимости от состава, а размер пор остается более постоянным для полиакриламидных гелей.

Различия в заливке: Гели агарозы и полиакриламидные гели заливаются и работают по-разному. Гели агарозы наливают горизонтально, а полиакриламид — вертикально.

Гели агарозы разливаются и растекаются горизонтально (на фото слева), в то время как полиакриламидные гели заливаются и растекаются вертикально (на фото справа).

Различия в безопасности: Поскольку акриламид является нейротоксином, при заливке и использовании этих типов гелей возникают проблемы с безопасностью. Важно, чтобы люди, работающие с полиакриламидными гелями, носили соответствующую защитную одежду и прошли обучение.

Гели агарозы считаются нетоксичными. По этой причине их значительно легче разливать, хранить, использовать и анализировать.

8. Какова история гель-электрофореза?

Арне Тизелиус получил высокую оценку за его работу по электрофорезу с использованием техники, называемой «электрофорез с подвижными границами», в которой использовался U-образный аппарат, называемый «Аппарат Тизелиуса». На этом раннем этапе (примерно в 1930-х и 1940-х годах) Тизелиус использовал электрофорез в первую очередь для изучения белков.

Этот прибор обладал множеством преимуществ и привел к некоторым захватывающим научным открытиям. Однако в то время электрофорез все еще требовал утомительной работы, нормального снабжения белками и грубой оптической системы.

Со временем процесс становился все более и более совершенным. Форма зонного электрофореза, в которой используется фильтровальная бумага, становится все более популярной из-за ее способности лучше разделять белки. Конечно, у этого метода были и недостатки, в основном то, что белки прилипали к бумаге.

Исследователи начали изучать различные среды для создания матрицы для электрофореза, включая крахмальное зерно для разработки электрофореза в крахмальном геле.

К концу 1960-х годов агароза стала более распространенной средой.С развитием исследований нуклеиновых кислот и интеркалирующих красителей электрофорез стал популярным к 1970-м годам.

9. Безопасна ли агароза GoldBio?

Хотя акриламидный мономер в полиакриламидных гелях считается нейротоксином, агарозный гель не представляет опасности. Для получения полной информации о безопасности агарозы LE GoldBio обратитесь к нашему паспорту безопасности (SDS).

Гель агарозы считается безопасным, но в паспорте безопасности указаны важные меры первой помощи на случай, если исследователь вдохнет, проглотит и т. Д.

10. Как определить качество ДНК с помощью агарозного геля?

Для геномной ДНК вы можете использовать гель-электрофорез, чтобы определить целостность вашей ДНК. Многие исследователи предлагают использовать гель низкого напряжения (~ 75 В) 0,8% — 1% в течение примерно 45 минут. В этом случае вы хотите увидеть, есть ли у вас симпатичная узкая полоска к верхней части геля. Это было бы признаком хорошей геномной ДНК. Смазанные результаты часто являются признаком деградации ДНК.

Гель-электрофорез также можно использовать для идентификации загрязняющих веществ, таких как РНК и загрязняющая геномная ДНК.Ключом к оценке вашего геля на предмет загрязнения являются основы разделения по молекулярной массе: РНК с низкой молекулярной массой будет стекать в гель дальше, чем вы ожидаете. Геномная ДНК, имеющая более высокий молекулярный вес, не будет работать так далеко, как ожидалось.

11. Как я могу рассчитать процент агарозы для использования в моем геле?

Концентрация геля агарозы зависит от размера ДНК, с которой вы работаете. В этой таблице показано, какие концентрации геля подходят для данного размера ДНК.Как правило, для разделения более мелких фрагментов ДНК требуется более высокая концентрация геля.

Затем определяется процент геля по массе по объему. 10% гель будет 10 граммов агарозы в 100 мл TAE. 100% гель будет состоять из 100 граммов агарозы в 100 мл TAE. А 1% гель будет составлять 1 грамм агарозы на 100 мл TAE.

12. Как определить, какой объем агарозного геля использовать?

Объем геля агарозы будет зависеть от размера вашей кастрюли.Маленькие (мини-гелевые) лотки обычно содержат 40 мл геля. Для лотка с гелем размером приблизительно 9 x 11 см потребуется объем 70-80 мл, а для лотка большего размера размером около 12 x 14 см потребуется объем геля от 120 до 130 мл.

13. Как растворить агарозу?

Растворение агарозы для гель-электрофореза — очень простой процесс. После того, как вы определились с концентрационным гелем, который хотите приготовить, отмерьте необходимую массу порошка агарозы.

Приготовьте колбу, вмещающую в 2-4 раза больше агарозы, которую вы готовите.

Добавьте в колбу необходимый объем разбавленного буфера, а затем взвешенную агарозу.

Используйте мешалку и магнит, чтобы перемешать раствор.

После перемешивания раствора снимите стержень мешалки . Поместите колбу в лабораторную микроволновую печь, закрыв колбу неплотной крышкой. Вы также можете накрыть полиэтиленовой пленкой и сделать небольшое отверстие в верхней части для вентиляции.

Нагрейте колбу в микроволновой печи порциями по 30 секунд. Закручивайте после каждого взрыва.

Для более подробного ознакомления с протоколом вы можете обратиться к этому видео или к этому протоколу.

Имейте в виду, что для эксперимента вам нужно будет выбрать подходящую агарозу. Агароза высокого разрешения лучше всего подходит для анализа фрагментов нуклеиновых кислот менее 1 килобаз. Общая агароза LE лучше всего подходит для нуклеиновых кислот в диапазоне от 50 до 25 т.п.н. А легкоплавкая агароза идеально подходит для разделения более крупных фрагментов ДНК (более 1000 п.н.).

14. Что такое гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE)?

Короче говоря, гель-электрофорез в импульсном поле, или PFGE, представляет собой подход к разделению гораздо более крупных нуклеиновых кислот, которые в противном случае не были бы разделены с помощью обычного электрофореза. PFGE использует переменный градиент напряжения, который перемещает фрагменты в структуру, зависящую от молекулярной массы. Электрические токи переключаются между тремя различными направлениями: одно проходит через центральную ось, а два с каждой стороны устройства проходят под углом 60 градусов.

В PFGE напряжение переключается между тремя разными направлениями: одно проходит по центральной оси, а два с каждой стороны проходят под углом 60 градусов.

Изменения электрического направления могут меняться несколько раз в течение процесса и длиться разное заданное время.

Основа PFGE по-прежнему аналогична стандартному гель-электрофорезу. По сути, оба метода основаны на молекулярной массе для анализа разделения, и оба полагаются на агарозные гели и электрические токи для выполнения процесса. Различающие факторы заключаются в том, что PFGE не зависит от постоянного напряжения, направление тока меняется, а период времени направления заряда регулярно переключается между тремя направлениями.

Приложения для использования включают снятие отпечатков пальцев, эпидемиологическую работу и генотипирование.

15. Должен ли я использовать TAE или TBE?

Если вы не уверены, использовать ли трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ) или трис-борат-ЭДТА (ТВЭ), приведенная ниже таблица может помочь вам сузить выбор. Таким образом, выбор зависит от того, что вы хотите сделать, и последующих процессов, которые вы планируете. Если вы все еще не уверены, вы можете провести оба эксперимента экспериментально и посмотреть, какой из них решает лучше или лучше всего подходит для ваших конкретных нужд.

Информация, полученная из статьи BiteSize Bio Dr.Ник Освальд « Что лучше: TAE, TBE или что-то еще? ”Посетите их и многие другие статьи, чтобы получить отличную информацию.

Протокол 50x TAE Stock Solution

Протокол 10x TBE Stock Solution

16. Что означает низкий EEO и почему это важно?

EEO означает электроэндосмос, и это термин, который описывает электрическое воздействие на движение материала через пористый материал. Низкий EEO позволяет повысить мобильность, уменьшить искажение полосы частот (вызванное противотоком) и улучшить разрешение.Это также позволяет сократить время работы. Агароза с низким EEO или агарозный LE позволяет более крупным частицам, таким как вирусы, мигрировать внутри матрицы.

17. Как определить напряжение, которое будет использоваться при электрофорезе?

Выбор напряжения действительно зависит от ваших общих планов. Более высокое напряжение вызовет более быструю миграцию. Более низкое напряжение вызовет более медленную миграцию. Еще одно важное замечание: более высокое напряжение значительно увеличивает температуру в гелевой камере и может привести к расплавлению геля.

Если вы оказались в ситуации, когда вам нужно было оставить гель на несколько часов, лучше запустить его при более низком напряжении в течение более длительного периода.

Как правило, гели должны работать при напряжении 75–150 В в течение примерно 40–80 минут. Эти настройки также будут зависеть от вашего устройства и прилагаемых к нему инструкций. Некоторые машины могут предупреждать о превышении определенного значения напряжения.

Список литературы

Брэдберн, С. (29 сентября 2017 г.). Руководство по электрофорезу в агарозном геле.Получено в мае 2019 г. с https://toptipbio.com/guide-agarose-gel-electrophoresis/.

Коллин. (2010, 07 марта). Разница между. Получено 3 мая 2019 г. с http://www.differencebetween.net/science/difference-between-agarose-and-polyacrylamide/.

Электронная микроскопия наук. (нет данных). Получено 5 мая 2019 г. с сайта https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/10205_gel_electrophoresis.aspx.

Безопасность электрофореза — Стандарт, гигиена окружающей среды и безопасность.(нет данных). Получено 2 мая 2019 г. с сайта https://ehs.stanford.edu/reference/electrophoresis-safety.

Labnet International. (2018, 16 апреля). Получено 2 мая 2019 г. с https://www.labnetinternational.com/blog/2018/04/brief-history-electrophoresis.

MIT Open Courseware. (2015). Получено в мае 2019 г. с https://ocw.mit.edu/courses/biology/7-15-experimental-molecular-genetics-spring-2015/labs/MIT7_15S15_Agarose.pdf.

Освальд, Н. (20 сентября 2013 г.). Что лучше: TAE, TBE или что-то еще? Получено 7 мая 2019 г. с сайта https: // bitesizebio.com / 2737 / tae-or-tbe-электрофорез /

Освальд, Н. (9 июля 2016 г.). Краткий справочник: определение концентрации и чистоты ДНК. Получено 2 мая 2019 г. с https://bitesizebio.com/25270/quick-reference-determining-dna-concentration-purity/.

Освальд, Н. (11 января 2017 г.). Почему гели SDS-PAGE не горизонтальны? Получено 2 мая 2019 г. с https://bitesizebio.com/10699/why-arent-sds-page-gels-horizontal/.

Провост, Дж. (Нет данных). МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ АГАРОЗНЫХ ГЕЛЕЙ (ГОРИЗОНТАЛЬНО… Получено 6 мая 2019 г. с сайта http://home.sandiego.edu/~josephprovost/AGAROSE GELS.pdf.

Типирование для гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE). (нет данных). Получено 6 мая 2019 г. с сайта https://foodsafety.foodscience.cornell.edu/laboratory-molecular-typing-lmt/pulsed-field-gel-electrophoresis-pfge-typing/.

Гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE) | Методы PulseNet | PulseNet | CDC. (нет данных). Получено 6 мая 2019 г. с https://www.cdc.gov/pulsenet/pathogens/pfge.html.

Рейна, О.(2014, 14 мая). Агароза против полиакриламида: не все гели одинаковы. Получено 3 мая 2019 г. с сайта https://bitesizebio.com/20395/agarose-versus-polyacrylamide-not-all-gels-are-created-equal/.

Сау, С. (14 февраля 2014 г.). Методики электрофореза. Получено 2 мая 2019 г. с https://www.slideshare.net/SayantiSau/techniques-of-electrophoresis.

Schecter, R. (нет данных). Повторное использование гелей агарозы. Получено 3 мая 2019 г. с https://www.benchfly.com/video/108/reusing-agarose-gels/.

Smithies, О.(2012). Как все начиналось: личная история гель-электрофореза. Методы электрофореза белков молекулярной биологии, 1-21. DOI: 10. 1007 / 978-1-61779-821-4_1

Stellwagen, Северная Каролина (2009, июнь). Электрофорез ДНК в агарозных гелях, полиакриламидных гелях и в свободном растворе. Получено 3 мая 2019 г. с https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2757927/.

Тизелиус А. (1937, 1 января). Новый аппарат для электрофоретического анализа коллоидных смесей.Получено 2 мая 2019 г. с сайта https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/1937/tf/tf9373300524#!divAbstract.

UMich Maddoc Lab. (нет данных). Как сделать гель из агарозы для электрофореза. Получено 2 мая 2019 г. с http://labs.mcdb.lsa.umich.edu/labs/maddock/protocols/DNA/agarose_gels.html.

Что такое электроэндосмос? — Определение из Коррозиипедии. (нет данных). Получено в мае 2019 г. с https://www.corrosionpedia.com/definition/5483/electroendosmosis.

Визуализация и характеристика ДНК, РНК и белков

Цели обучения

• Объясните использование зондов нуклеиновых кислот для визуализации конкретных последовательностей ДНК
• Объясните использование гель-электрофореза для разделения фрагментов ДНК
• Объясните принцип анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и его использование
• Сравнить и сопоставить Саузерн-блоттинг и Нозерн-блоттинг
• Объясните принципы и способы использования микроматричного анализа
• Опишите методы, используемые для разделения и визуализации вариантов белка
• Объясните метод и использование полимеразной цепной реакции и секвенирования ДНК

Последовательность молекулы ДНК может помочь нам идентифицировать организм по сравнению с известными последовательностями, хранящимися в базе данных. Последовательность также может рассказать нам кое-что о функции определенной части ДНК, например, кодирует ли она определенный белок. Сравнение сигнатур белка — уровней экспрессии определенных наборов белков — между образцами — важный метод оценки клеточных реакций на множество факторов окружающей среды и стрессов. Анализ белковых сигнатур может выявить личность организма или то, как клетка реагирует на заболевание.

Интересующие нас ДНК и белки являются микроскопическими и обычно смешиваются со многими другими молекулами, включая ДНК или белки, не относящиеся к нашим интересам.Было разработано множество методов для выделения и характеристики интересующих молекул. Эти методы изначально были разработаны для исследовательских целей, но во многих случаях они были упрощены до такой степени, что стало возможным рутинное клиническое использование. Например, многие патогены, такие как бактерия Helicobacter pylori , вызывающая язву желудка , могут быть обнаружены с помощью тестов на основе белков. Кроме того, все большее количество высокоспецифичных и точных идентификационных анализов на основе амплификации ДНК теперь может обнаруживать патогены, такие как устойчивые к антибиотикам кишечные бактерии, вирус простого герпеса , вирус ветряной оспы и многие другие.

Молекулярный анализ ДНК

В этом подразделе мы опишем некоторые из основных методов, используемых для разделения и визуализации определенных фрагментов ДНК, представляющих интерес для ученого. Некоторые из этих методов не требуют знания полной последовательности молекулы ДНК. До появления быстрого секвенирования ДНК эти методы были единственными доступными для работы с ДНК, но они по-прежнему составляют основной арсенал инструментов, используемых молекулярными генетиками для изучения реакции организма на микробные и другие заболевания.

Зонд нуклеиновых кислот

молекул ДНК маленькие, и информация, содержащаяся в их последовательности, невидима. Как исследователь выделяет определенный участок ДНК или, изолировав его, определяет, из какого он организма, какова его последовательность или какова его функция? Один из методов определения наличия определенной последовательности ДНК использует искусственно созданные фрагменты ДНК, называемые зондами. Зонды могут использоваться для идентификации различных видов бактерий в окружающей среде, и теперь доступно множество ДНК-зондов для обнаружения патогенов клинически.Например, ДНК-зонды используются для обнаружения вагинальных патогенов Candida albicans , Gardnerella vaginalis и Trichomonas vaginalis .

Чтобы проверить геномную библиотеку на определенный ген или интересующую последовательность, исследователи должны что-то знать об этом гене. Если у исследователей есть часть последовательности ДНК для интересующего гена, они могут разработать ДНК-зонд , одноцепочечный фрагмент ДНК, который комплементарен части интересующего гена и отличается от других последовательностей ДНК в образце. .ДНК-зонд может быть синтезирован химическим путем в коммерческих лабораториях или может быть создан путем клонирования, выделения и денатурирования фрагмента ДНК из живого организма. В любом случае ДНК-зонд должен быть помечен молекулярной меткой или маяком, например радиоактивным атомом фосфора (как используется для авторадиографии ) или флуоресцентным красителем (как используется при флуоресцентной гибридизации in situ или FISH ), чтобы можно было увидеть зонд и ДНК, с которой он связывается (рис. 1). Зондируемый образец ДНК также должен быть денатурирован, чтобы сделать его одноцепочечным, чтобы одноцепочечный ДНК-зонд мог отжигаться с одноцепочечным ДНК-образцом в местах, где их последовательности комплементарны.Хотя эти методы ценны для диагностики, их прямое использование для анализа мокроты и других образцов тела может быть проблематичным из-за сложной природы этих образцов. Часто ДНК необходимо сначала выделить из образцов тела с помощью методов химической экстракции, прежде чем ДНК-зонд можно будет использовать для идентификации патогенов.

Рис. 1. ДНК-зонды могут использоваться для подтверждения наличия подозреваемого патогена в образцах пациентов. На этой диаграмме показано, как можно использовать зонд ДНК для поиска интересующего гена, связанного с предполагаемым патогеном.

Клиническая направленность: Карни, часть 2

Этот пример продолжает историю Карни, начавшуюся с книги «Микробы и инструменты генной инженерии».

Легкие симптомы гриппа, которые испытывает Карни, могут быть вызваны любым количеством инфекционных агентов. Кроме того, некоторые неинфекционные аутоиммунные состояния, такие как рассеянный склероз, системная красная волчанка (СКВ) и боковой амиотрофический склероз (БАС), также имеют симптомы, соответствующие ранним симптомам Карни.Однако в течение нескольких недель симптомы Карни ухудшились. Она начала испытывать боли в суставах в коленях, учащенное сердцебиение и странную вялость лицевых мышц. Кроме того, она страдала от скованности шеи и болезненных головных болей. Неохотно она решила, что пора обратиться за медицинской помощью.

• Дают ли новые симптомы Карни какие-либо ключи к разгадке того, какой у нее тип инфекции или другое заболевание?
• Какие тесты или инструменты может использовать поставщик медицинских услуг, чтобы определить патоген, вызывающий симптомы Карни?

Мы вернемся к примеру Карни позже на этой странице.

Электрофорез в агарозном геле

Существует ряд ситуаций, в которых исследователь может захотеть физически разделить коллекцию фрагментов ДНК разного размера. Исследователь также может переваривать образец ДНК рестрикционным ферментом с образованием фрагментов. Полученный размер и образец распределения фрагментов часто могут дать полезную информацию о последовательности оснований ДНК, которую можно использовать, подобно сканированию штрих-кода, для идентификации человека или вида, к которым принадлежит ДНК.

Гель-электрофорез — это метод, обычно используемый для разделения биологических молекул на основе размера и биохимических характеристик, таких как заряд и полярность. Электрофорез в агарозном геле широко используется для разделения ДНК (или РНК) различного размера, которая может быть получена при расщеплении рестриктазами или другими способами, такими как ПЦР (рис. 2).

Из-за своего отрицательно заряженного скелета ДНК сильно притягивается к положительному электроду. При электрофорезе в агарозном геле гель ориентируют горизонтально в буферном растворе.Образцы загружают в лунки для образцов на стороне геля, ближайшей к отрицательному электроду, затем протягивают через молекулярное сито агарозной матрицы к положительному электроду. Матрица агарозы препятствует движению более крупных молекул через гель, в то время как молекулы меньшего размера проходят сквозь гель легче. Таким образом, расстояние миграции обратно пропорционально размеру фрагмента ДНК, при этом более мелкие фрагменты проходят большее расстояние через гель. Размеры фрагментов ДНК в образце можно оценить путем сравнения с фрагментами известного размера в лестнице ДНК , также работающей на том же геле.Для разделения очень больших фрагментов ДНК, таких как хромосомы или вирусные геномы, электрофорез в агарозном геле можно модифицировать, периодически меняя ориентацию электрического поля во время гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) . В PFGE более мелкие фрагменты могут переориентироваться и мигрировать немного быстрее, чем более крупные фрагменты, и, таким образом, этот метод может служить для разделения очень больших фрагментов, которые в противном случае перемещались бы вместе во время стандартного электрофореза в агарозном геле. В любом из этих методов электрофореза положения фрагментов ДНК или РНК в геле можно определить различными методами. Одним из распространенных методов является добавление бромида этидия , красителя, который внедряется в нуклеиновые кислоты в неспецифических местах и ​​может быть визуализирован при воздействии ультрафиолетового света. Теперь доступны другие пятна, которые безопаснее, чем бромистый этидий, потенциальный канцероген.

Рисунок 2. Щелкните, чтобы увеличить изображение. (а) Процесс электрофореза в агарозном геле.(б) Исследователь загружает образцы в гель. (c) На этой фотографии показан завершенный цикл электрофореза на агарозном геле. Лестница ДНК расположена на дорожках 1 и 9. Семь образцов расположены на дорожках 2-8. Гель окрашивали бромидом этидия и фотографировали в ультрафиолетовом свете. (Фото a: модификация работы Магнуса Манске; кредит b: модификация работы Министерства сельского хозяйства США; кредит c: модификация работы Джеймса Джейкоба)

Анализ полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP)

Сайты узнавания рестрикционного фермента короткие (всего несколько нуклеотидов), палиндромы, специфичные для последовательности, и могут быть обнаружены по всему геному. Таким образом, различия в последовательностях ДНК в геномах индивидуумов приведут к различиям в распределении сайтов узнавания рестрикционных ферментов, которые могут быть визуализированы в виде отдельных полосатых полос на геле после электрофореза в агарозном геле. Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) Анализ сравнивает образцы полос ДНК различных образцов ДНК после рестрикционного расщепления (рис. 3).

Рис. 3. ПДРФ-анализ можно использовать для дифференциации последовательностей ДНК. В этом примере нормальная хромосома расщепляется на два фрагмента, тогда как переваривание мутированной хромосомы дает только один фрагмент.Маленькие красные стрелки, указывающие на два разных сегмента хромосомы, показывают расположение сайтов узнавания рестрикционного фермента. После переваривания и электрофореза в агарозном геле диаграммы полос отражают изменение, показывая потерю двух более коротких полос и усиление более длинной полосы. (кредит: модификация работы Национального центра биотехнологической информации)

Анализ RFLP имеет множество практических применений как в медицине, так и в судебной медицине . Например, эпидемиологи используют анализ ПДРФ для отслеживания и определения источника конкретных микроорганизмов, причастных к вспышкам пищевых отравлений или определенных инфекционных заболеваний. ПДРФ-анализ также может использоваться на ДНК человека для определения паттернов наследования хромосом с вариантными генами, включая те, которые связаны с наследственными заболеваниями, или для установления отцовства .

Судмедэксперты используют RFLP-анализ как форму дактилоскопии ДНК , которая полезна для анализа ДНК, полученной с мест преступления, подозреваемых и потерпевших.Образцы ДНК собирают, количество копий образцов молекул ДНК увеличивают с помощью PCR , а затем подвергают расщеплению рестрикционными ферментами и электрофорезу в агарозном геле для создания специфических полос. Сравнивая образцы, собранные с места преступления, с образцами, взятыми у подозреваемых или потерпевших, следователи могут окончательно определить, были ли доказательства ДНК, собранные на месте, оставлены подозреваемыми или потерпевшими.

Саузерн-блоты и модификации

Несколько молекулярных методов основаны на комплементарности последовательностей и гибридизации между нуклеиновыми кислотами образца и ДНК-зондами.Как правило, зондирование образцов нуклеиновых кислот в геле оказывается безуспешным, поскольку по мере того, как ДНК-зонд впитывается в гель, нуклеиновые кислоты образца в геле диффундируют. Таким образом, методы блоттинга обычно используются для переноса нуклеиновых кислот на тонкую положительно заряженную мембрану из нитроцеллюлозы или нейлона. В методе Саузерн-блот , разработанном сэром Эдвином Саузерн в 1975 году, фрагменты ДНК в образце сначала разделяются электрофорезом в агарозном геле, а затем переносятся на мембрану за счет капиллярного действия (рис. 4).Фрагменты ДНК, которые связываются с поверхностью мембраны, затем подвергаются воздействию специального одноцепочечного ДНК-зонда, меченного радиоактивным или флуоресцентным молекулярным маяком , чтобы помочь в обнаружении. Саузерн-блоттинг можно использовать для обнаружения присутствия определенных последовательностей ДНК в данном образце ДНК. После визуализации целевой ДНК внутри мембраны исследователи могут вырезать часть мембраны, содержащую фрагмент, чтобы извлечь интересующий фрагмент ДНК.

Рисунок 4.В методе саузерн-блоттинга фрагменты ДНК сначала разделяются электрофорезом в агарозном геле, затем переносятся капиллярным действием на нейлоновую мембрану, которую затем пропитывают ДНК-зондом, помеченным молекулярным маяком для облегчения визуализации.

Варианты саузерн-блоттинга — дот-блот, слот-блот и точечный блот — не включают электрофорез, а вместо этого концентрируют ДНК из образца в небольшом месте на мембране. После гибридизации с ДНК-зондом измеряется интенсивность детектируемого сигнала, что позволяет исследователю оценить количество целевой ДНК, присутствующей в образце.

Колониальный блот — это еще один вариант саузерн-блоттинга, в котором колонии, представляющие разные клоны в геномной библиотеке, переносятся на мембрану путем прижатия мембраны к культуральной пластине. Клетки на мембране лизируются, и затем мембрану можно исследовать, чтобы определить, какие колонии в геномной библиотеке несут целевой ген. Поскольку колонии на планшете все еще растут, интересующие клетки можно выделить из планшета.

В нозерн-блоте , другом варианте саузерн-блоттинга, РНК (не ДНК) иммобилизована на мембране и зондируется.Нозерн-блоттинг обычно используется для определения количества мРНК, образующейся в результате экспрессии генов в образце ткани или организма.

Анализ микрочипов

Другой метод, основанный на гибридизации между комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот, называется микроматричным анализом . Микроматричный анализ полезен для сравнения паттернов экспрессии генов между различными типами клеток — например, инфицированными вирусом клетками и неинфицированными клетками или злокачественными клетками и здоровыми клетками (рис. 5).

Обычно ДНК или кДНК из экспериментального образца откладывают на предметное стекло вместе с известными последовательностями ДНК. Каждый слайд может содержать более 30 000 различных типов фрагментов ДНК. Отдельные фрагменты ДНК (охватывающие всю геномную библиотеку организма) или фрагменты кДНК (соответствующие полному набору экспрессируемых генов в организме) могут быть индивидуально нанесены на предметное стекло.

После нанесения на предметное стекло геномную ДНК или мРНК можно выделить из двух образцов для сравнения.Если мРНК выделена, она подвергается обратной транскрипции в кДНК с использованием обратной транскриптазы. Затем два образца геномной ДНК или кДНК маркируются разными флуоресцентными красителями (обычно красным и зеленым). Затем меченые образцы геномной ДНК объединяют в равных количествах, добавляют в чип микроматрицы и дают возможность гибридизоваться с дополнительными пятнами на микроматрице.

Гибридизацию образцов молекул геномной ДНК можно отслеживать, измеряя интенсивность флуоресценции в определенных точках микроматрицы.Легко заметить различия в количестве гибридизации между образцами. Если нуклеиновые кислоты только одного образца гибридизуются с конкретным пятном на микроматрице, то это пятно будет либо зеленым, либо красным. Однако, если нуклеиновые кислоты обоих образцов гибридизуются, пятно станет желтым из-за комбинации красного и зеленого красителей.

Хотя технология микрочипов позволяет провести полное сравнение двух образцов за короткое время, для этого требуется сложное (и дорогое) оборудование для обнаружения и программное обеспечение для анализа.Из-за дороговизны эта технология обычно ограничивается исследовательскими установками. Исследователи использовали микроматричный анализ, чтобы изучить, как на экспрессию генов влияют организмы, инфицированные бактериями или вирусами или подвергнутые определенным химическим обработкам.

Рис. 5. (a) Проиллюстрированы этапы анализа микроматрицы. Здесь сравниваются паттерны экспрессии генов раковых и здоровых клеток. (b) Информация о микромассиве может быть выражена в виде тепловой карты. Гены показаны слева; различные образцы показаны внизу. Гены, экспрессируемые только в раковых клетках, показаны разными оттенками красного; гены, экспрессируемые только в нормальных клетках, показаны разными оттенками зеленого. Гены, которые экспрессируются как в раковых, так и в нормальных клетках, показаны желтым цветом.

Изучите технологию микрочипов на этом интерактивном веб-сайте.

Подумай об этом

• Из чего состоит ДНК-зонд?
• Почему после гель-электрофореза дайджеста ДНК используется Саузерн-блоттинг?

Молекулярный анализ белков

Во многих случаях может быть нежелательно или невозможно напрямую изучать ДНК или РНК.Белки могут предоставить видоспецифичную информацию для идентификации, а также важную информацию о том, как и реагирует ли клетка или ткань на присутствие патогенного микроорганизма. Различные белки требуют разных методов выделения и характеристики.

Электрофорез в полиакриламидном геле

Вариант гель-электрофореза, называемый электрофорезом в полиакриламидном геле (PAGE) , обычно используется для разделения белков. В PAGE гелевая матрица более тонкая и состоит из полиакриламида вместо агарозы.Кроме того, PAGE обычно выполняется с использованием вертикального гелевого аппарата (рис. 6). Из-за различных зарядов, связанных с боковыми цепями аминокислот, PAGE можно использовать для разделения интактных белков на основе их чистых зарядов. В качестве альтернативы белки можно денатурировать и покрыть отрицательно заряженным детергентом под названием додецилсульфат натрия (SDS) , маскируя нативные заряды и позволяя разделение только по размеру. PAGE может быть дополнительно модифицирован для разделения белков на основе двух характеристик, таких как их заряды при различных pH, а также их размер, с использованием двумерного PAGE .В любом из этих случаев после электрофореза белки визуализируются путем окрашивания, обычно окрашивания кумасси синим или серебристым.

Рисунок 6. Щелкните, чтобы увеличить изображение. (а) SDS — это детергент, который денатурирует белки и маскирует их естественные заряды, делая их равномерно отрицательно заряженными. (б) На этих этапах проиллюстрирован процесс SDS-PAGE. (c) Фотография геля SDS-PAGE показывает полосы, окрашенные Кумасси, где белки разного размера мигрировали вдоль геля в ответ на приложенное напряжение.На правой стороне геля видна полоса стандартного размера. (кредит b: модификация работы «GeneEd» / YouTube)

Подумай об этом

• На каком основании белки разделяются в SDS-PAGE?

Клиническое направление: Карни, часть 3

Этот пример продолжает историю Карни, начатую в «Микробах и инструментах генной инженерии» и выше.

Рис. 7. Сыпь типа «бычий глаз» — один из распространенных симптомов болезни Лайма, но до 30% инфицированных людей никогда не развивают сыпь.(кредит: Центры по контролю и профилактике заболеваний)

Когда Карни описала свои симптомы, ее врач сначала заподозрил бактериальный менингит , который соответствовал ее головным болям и ригидности шеи. Однако вскоре она исключила это как возможность, потому что менингит обычно прогрессирует быстрее, чем то, что было у Карни. Многие из ее симптомов все еще совпадают с симптомами бокового амиотрофического склероза (БАС) и системной красной волчанки (СКВ) , и врач также считал болезнь Лайма возможностью, учитывая, сколько времени Карни проводит в лесу.Карни не помнила, чтобы в последнее время укусили клещи (типичный способ передачи болезни Лайма), и у нее не было типичной бычьей сыпи, связанной с болезнью Лайма (рис. 7). Однако у 20–30% пациентов с болезнью Лайма эта сыпь никогда не появляется, поэтому врач не хотел ее исключать.

Врач Карни назначил МРТ ее мозга, общий анализ крови на анемию, анализы крови для оценки функции печени и почек и дополнительные тесты для подтверждения или исключения СКВ или болезни Лайма.Результаты ее теста не соответствовали ни СКВ, ни БАС, а результат теста на антитела к болезни Лайма был «двусмысленным», то есть неубедительным. Исключив БАС и СКВ, врач Карни решил провести дополнительные тесты на болезнь Лайма.

• Почему врач Карни все еще подозревал болезнь Лайма, даже если результаты анализов не обнаружили в крови антител Лайма?
• Какой тип молекулярного теста можно использовать для обнаружения в крови антител к болезни Лайма?

Мы вернемся к примеру Карни на следующих страницах.

Методы анализа ДНК на основе амплификации

Для получения последовательностей ДНК, полезных для изучения болезнетворных организмов, можно использовать различные методы. С появлением технологии быстрого секвенирования наша база знаний обо всех геномах патогенных организмов феноменально выросла. Мы начнем с описания полимеразной цепной реакции, которая не является методом секвенирования, но позволила исследователям и клиницистам получить большие количества ДНК, необходимые для секвенирования и других исследований.Полимеразная цепная реакция устраняет зависимость, которую мы когда-то имели от клеток для создания множественных копий ДНК, достигая того же результата за счет относительно простых реакций вне клетки.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Большинство методов анализа ДНК, таких как расщепление рестрикционными ферментами и электрофорез в агарозном геле, или секвенирование ДНК, требуют больших количеств определенного фрагмента ДНК. В прошлом большие количества ДНК производились путем выращивания клеток-хозяев из геномной библиотеки.Однако для подготовки библиотек требуется время и усилия, а интересующие образцы ДНК часто поступают в ничтожных количествах. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет быстро увеличить количество копий конкретных последовательностей ДНК для дальнейшего анализа (см. Фигуру 8). Один из самых мощных методов в молекулярной биологии, ПЦР, был разработан в 1983 году Кэри Муллис в компании Cetus Corporation. ПЦР находит особое применение в исследовательских, судебно-медицинских и клинических лабораториях, в том числе:

• определение последовательности нуклеотидов в определенной области ДНК
• амплификация целевой области ДНК для клонирования в плазмидный вектор
• идентификация источника образца ДНК, оставленного на месте преступления
• анализ образцов для определения отцовства
• сравнение образцов древней ДНК с современными организмами
• определение присутствия трудно культивируемых или некультивируемых микроорганизмов в организме человека или в образцах окружающей среды

Рисунок 8.Щелкните, чтобы увеличить изображение. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для получения множества копий определенной последовательности ДНК.

ПЦР — это лабораторный метод in vitro , который использует преимущества естественного процесса репликации ДНК. Ферменты термостойкой ДНК-полимеразы, используемые в ПЦР, получены из гипертермофильных прокариот. ДНК-полимераза Taq , обычно используемая в ПЦР, происходит от бактерии Thermus aquaticus , выделенной из горячего источника в Йеллоустонском национальном парке.Репликация ДНК требует использования праймеров для инициации репликации, чтобы иметь свободные 3′-гидроксильные группы, доступные для добавления нуклеотидов ДНК-полимеразой. Однако, хотя праймеры, состоящие из РНК, обычно используются в клетках, праймеры ДНК используются для ПЦР. Праймеры ДНК предпочтительны из-за их стабильности, а праймеры ДНК с известными последовательностями, нацеленными на конкретную область ДНК, могут быть химически синтезированы коммерчески. Эти ДНК-праймеры функционально подобны ДНК-зондам, используемым для различных методов гибридизации, описанных ранее, и связываются со специфическими мишенями из-за комплементарности между целевой последовательностью ДНК и праймером.

ПЦР проводится в течение нескольких циклов, каждый из которых состоит из трех этапов: денатурация, , отжиг, и удлинение. Машины под названием термоциклер s используются для ПЦР; эти машины могут быть запрограммированы на автоматический цикл изменения температуры, необходимой на каждом этапе (см. рисунок 1 в «Современные приложения микробной генетики»). Сначала двухцепочечную матричную ДНК, содержащую целевую последовательность, денатурируют примерно при 95 ° C. Высокая температура, необходимая для физического (а не ферментативного) разделения нитей ДНК, является причиной, по которой требуется термостойкая ДНК-полимераза.Затем температуру понижают примерно до 50 ° C. Это позволяет праймерам ДНК, комплементарным концам целевой последовательности, отжигаться (прилипать) к цепям матрицы, при этом один праймер отжигается с каждой цепью. Наконец, температуру повышают до 72 ° C, оптимальной температуры для активности термостойкой ДНК-полимеразы, что позволяет добавлять нуклеотиды к праймеру с использованием одноцепочечной мишени в качестве матрицы. Каждый цикл удваивает количество копий двухцепочечной ДНК-мишени.Обычно протоколы ПЦР включают 25-40 циклов, что позволяет амплифицировать одну целевую последовательность от десятков миллионов до более чем триллиона.

Естественная репликация ДНК предназначена для копирования всего генома и инициируется в одном или нескольких исходных сайтах. Праймеры конструируются во время репликации, а не до нее, и не состоят из нескольких конкретных последовательностей. ПЦР нацелена на определенные области образца ДНК с использованием праймеров, специфичных для последовательности. В последние годы было разработано множество изотермических методов амплификации ПЦР , которые позволяют обойти необходимость в термоциклировании и используют вспомогательные белки, которые помогают в процессе репликации ДНК.Поскольку разработка этих методов продолжается и их использование становится все более распространенным в исследовательских, судебно-медицинских и клинических лабораториях, термоциклеры могут устареть.

Углубите свое понимание полимеразной цепной реакции, просмотрев эту анимацию и выполнив интерактивное упражнение.

Варианты ПЦР

Несколько более поздних модификаций ПЦР еще больше увеличивают применимость этого метода. ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR) используется для получения копий ДНК конкретной молекулы мРНК.ОТ-ПЦР начинается с использования фермента обратной транскриптазы для преобразования молекул мРНК в кДНК . Эта кДНК затем используется в качестве матрицы для традиционной ПЦР-амплификации. ОТ-ПЦР может определить, был ли экспрессирован конкретный ген в образце. Еще одно недавнее применение ПЦР — ПЦР в реальном времени , также известная как количественная ПЦР (кПЦР) . Стандартные протоколы ПЦР и ОТ-ПЦР не являются количественными, потому что любой из реагентов может стать ограничивающим до того, как все циклы в рамках протокола будут завершены, а образцы анализируются только в конце.Поскольку невозможно определить, когда в протоколе ПЦР или ОТ-ПЦР конкретный реагент стал ограничивающим, невозможно узнать, сколько циклов было выполнено до этого момента, и, следовательно, невозможно определить, сколько исходных молекулы матрицы присутствовали в образце в начале ПЦР. Однако в кПЦР использование флуоресценции позволяет отслеживать увеличение двунитевой матрицы во время реакции ПЦР по мере того, как это происходит. Эти кинетические данные затем можно использовать для количественной оценки количества исходной целевой последовательности.Использование КПЦР в последние годы еще больше расширило возможности ПЦР, позволяя исследователям определять количество копий ДНК, а иногда и организмов, присутствующих в образце. В клинических условиях кОТ-ПЦР используется для определения вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных пациентов с целью оценки эффективности их терапии.

Секвенирование ДНК

Базовый метод секвенирования — это метод завершения цепи , также известный как дидезокси-метод или метод секвенирования ДНК Сэнгера , разработанный Фредериком Сангер в 1972 году.Метод терминации цепи включает репликацию ДНК одноцепочечной матрицы с использованием праймера ДНК для инициации синтеза комплементарной цепи, ДНК-полимеразы, смеси четырех мономеров регулярных дезоксинуклеотидов (dNTP) и небольшой доли мономеров дидезоксинуклеотид (ddNTP), каждый из которых мечен молекулярным маяком . ДдНТФ представляют собой мономеры, у которых отсутствует гидроксильная группа (–ОН) в месте, к которому обычно присоединяется другой нуклеотид, образуя цепь (рис. 9).Каждый раз, когда ddNTP случайным образом включается в растущую комплементарную цепь, он прекращает процесс репликации ДНК для этой конкретной цепи. Это приводит к появлению нескольких коротких цепей реплицированной ДНК, каждая из которых оканчивается в разных точках во время репликации. Когда реакционную смесь подвергают гель-электрофорезу, несколько вновь реплицированных цепей ДНК образуют лестницу разных размеров. Поскольку ddNTP мечены, каждая полоса на геле отражает размер цепи ДНК, когда ddNTP завершает реакцию.

Рис. 9. Дидезоксинуклеотид похож по структуре на дезоксинуклеотид, но в нем отсутствует 3′-гидроксильная группа (обозначена заштрихованной рамкой). Когда дидезоксинуклеотид включается в цепь ДНК, синтез ДНК останавливается.

Во времена Сэнгера для каждой секвенируемой молекулы ДНК проводили четыре реакции, каждая из которых содержала только один из четырех возможных ddNTP. Каждый ddNTP был мечен радиоактивной молекулой фосфора. Затем продукты четырех реакций прогоняли на отдельных дорожках бок о бок на длинных узких гелях для ПААГ, и полосы разной длины детектировали авторадиографией.Сегодня этот процесс был упрощен с использованием ддНТФ, каждый из которых помечен флуоресцентным красителем или флуорохромом разного цвета (рис.10), в одной реакции секвенирования, содержащей все четыре возможных ддНТФ для каждой секвенируемой молекулы ДНК (рис.11). Эти флуорохромы обнаруживаются с помощью флуоресцентной спектроскопии. Определение цвета флуоресценции каждой полосы при ее прохождении детектором дает нуклеотидную последовательность матричной цепи.

Рис. 10. Метод терминации дидезокси-цепи Фредерика Сэнгера проиллюстрирован с использованием ddNTP, меченных флуорохромами.Используя ддНТФ, можно получить смесь фрагментов ДНК любого возможного размера, длина которых варьируется только на один нуклеотид. ДНК разделяется по размеру, и каждая полоса может быть обнаружена детектором флуоресценции.

Рисунок 11. Щелкните, чтобы увеличить изображение. Эта диаграмма обобщает метод секвенирования по Сэнгеру с использованием меченных флуорохромом ддНТФ и капиллярного гель-электрофореза.

С 2005 года автоматизированные методы секвенирования, используемые лабораториями, подпадают под действие секвенирования нового поколения , которое представляет собой группу автоматизированных методов, используемых для быстрого секвенирования ДНК.Эти методы произвели революцию в области молекулярной генетики, поскольку недорогие секвенаторы могут генерировать последовательности из сотен тысяч или миллионов коротких фрагментов (от 25 до 600 пар оснований) всего за один день. Хотя несколько вариантов технологий секвенирования следующего поколения созданы разными компаниями (например, пиросеквенирование 454 Life Sciences и технология Solexa компании Illumina), все они позволяют быстро секвенировать миллионы оснований, что делает секвенирование целых геномов относительно простым и недорогим. и банально.Например, при секвенировании 454 (пиросеквенирование) образец ДНК фрагментируется на одноцепочечные фрагменты длиной 400–600 п.н., модифицированные путем добавления адаптеров ДНК к обоим концам каждого фрагмента. Затем каждый фрагмент ДНК иммобилизуют на шарике и амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров, предназначенных для отжига с адаптерами, создавая шарик, содержащий множество копий этого фрагмента ДНК. Затем каждую гранулу помещают в отдельную лунку, содержащую ферменты для секвенирования. В лунку каждый из четырех нуклеотидов добавляют один за другим; когда каждый из них включен, пирофосфат выделяется как побочный продукт полимеризации, испуская небольшую вспышку света, которая регистрируется детектором.Это обеспечивает порядок включения нуклеотидов при создании новой цепи ДНК и является примером секвенирования синтеза. Секвенсоры нового поколения используют сложное программное обеспечение для выполнения громоздкого процесса упорядочивания всех фрагментов. В целом, эти технологии продолжают быстро развиваться, снижая стоимость секвенирования и быстро увеличивая доступность данных о последовательностях широкого спектра организмов.

В Национальном центре биотехнологической информации находится широко используемая база данных генетических последовательностей под названием GenBank , куда исследователи хранят генетическую информацию для всеобщего использования.После публикации данных о последовательностях исследователи загружают их в GenBank, предоставляя другим исследователям доступ к информации. Сотрудничество позволяет исследователям сравнивать информацию о вновь обнаруженных или неизвестных последовательностях образцов с огромным массивом данных о последовательностях, которые уже существуют.

Просмотрите анимацию о секвенировании 454, чтобы лучше понять этот метод.

Использование NAAT для диагностики

инфекции C. difficile

Хавьер, 80-летний пациент с сердечным заболеванием в анамнезе, недавно вернулся домой из больницы после процедуры ангиопластики для вставки стента в сердечную артерию.Чтобы свести к минимуму возможность заражения, Хавьеру внутривенно вводили антибиотики широкого спектра действия во время и вскоре после процедуры. Его выписали через четыре дня после процедуры, но через неделю у него начались легкие спазмы в животе и водянистая диарея несколько раз в день. Он потерял аппетит, сильно обезвоживался, и у него поднялась температура. Он также заметил кровь в стуле. Жена Хавьера позвонила врачу, который посоветовал ей немедленно отвезти его в отделение неотложной помощи.

Персонал больницы провел несколько тестов и обнаружил, что уровень креатинина в почках Хавьера был повышен по сравнению с уровнями в его крови, что указывает на то, что его почки не функционируют должным образом. Симптомы Хавьера предполагали возможное заражение Clostridium difficile , бактерией, устойчивой ко многим антибиотикам. В больнице собрали и посеяли образец стула для выявления продукции токсинов A и B C.difficile , но результаты оказались отрицательными. Однако отрицательных результатов было недостаточно, чтобы исключить инфекцию C. difficile , потому что культивирование C. difficile и обнаружение его характерных токсинов может быть затруднено, особенно в некоторых типах образцов. На всякий случай они приступили к диагностическому тесту амплификации нуклеиновой кислоты (NAAT). В настоящее время NAAT являются золотым стандартом клинической диагностики для обнаружения генетического материала патогена.В случае Хавьера, qPCR использовался для поиска гена, кодирующего C. difficile токсин B ( tcdB ). Когда анализ КПЦР оказался положительным, лечащий врач пришел к выводу, что Хавьер действительно страдал от инфекции C. difficile , и немедленно прописал антибиотик ванкомицин для внутривенного введения. Антибиотик избавил от инфекции, и Хавьер полностью выздоровел.

Рис. 12. Гель, показывающий продукты ПЦР различных штаммов Clostridium difficile .Образец Хавьера показан внизу; обратите внимание, что он соответствует риботипу 27 в эталонном наборе. (кредит: модификация работы Американского общества микробиологов)

Поскольку инфекции, вызванные C. difficile , становились широко распространенными в сообществе Хавьера, его образец был дополнительно проанализирован, чтобы выяснить, можно ли идентифицировать конкретный штамм C. difficile . Образец стула Хавьера подвергали риботипированию, и анализу ПЦР на основе повторяющихся последовательностей (реп-ПЦР).При риботипировании короткая последовательность ДНК между генами 16S рРНК и 23S рРНК амплифицируется и подвергается рестрикционному расщеплению (фиг. 12). Эта последовательность варьируется между штаммами C. difficile , поэтому рестрикционные ферменты будут разрезаться в разных местах. В реп-ПЦР для ПЦР использовали праймеры ДНК, предназначенные для связывания с короткими последовательностями, обычно повторяющимися в геноме C. difficile . После рестрикционного переваривания в агарозном геле был проведен электрофорез в обоих типах анализа для изучения полосатости, полученной в результате каждой процедуры (фиг. 13).Rep-PCR может использоваться для дальнейшего подтипа различных риботипов, увеличивая разрешение для обнаружения различий между штаммами. Было обнаружено, что риботипом штамма, заражающего Хавьера, является риботип 27, штамм, известный своей повышенной вирулентностью, устойчивостью к антибиотикам и повышенной распространенностью в США, Канаде, Японии и Европе.

Рисунок 13. Штаммы инфекционных бактерий, таких как C. difficile, , можно идентифицировать с помощью молекулярного анализа. ПЦР-риботипирование обычно используется для идентификации конкретного C.difficile . Rep-PCR — это альтернативный молекулярный метод, который также используется для идентификации определенных штаммов C. difficile . (кредит b: модификация работы Американского общества микробиологов)

• Чем отличаются образцы полосатости между штаммами C. difficile ?
• Как вы думаете, почему лабораторные тесты не смогли напрямую определить выработку токсинов?

Подумай об этом

• Чем ПЦР похож на естественный процесс репликации ДНК в клетках? Чем он отличается?
• Сравните RT-PCR и qPCR с точки зрения их соответствующих целей.
• Как определяется идентичность каждого нуклеотида в последовательности при секвенировании с окончанием цепи?

Ключевые концепции и резюме

• Для поиска интересующего гена в образце необходимо использовать одноцепочечный ДНК-зонд , меченный молекулярным маяком (обычно радиоактивным или флуоресцентным), который может гибридизоваться с комплементарной одноцепочечной нуклеиновой кислотой в образце.
• Электрофорез в агарозном геле позволяет разделять молекулы ДНК по размеру.
• Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) Анализ позволяет визуализировать с помощью электрофореза в агарозном геле различные варианты последовательности ДНК, вызванные различиями в сайтах рестрикции.
• Саузерн-блот анализ позволяет исследователям находить конкретную последовательность ДНК в образце, тогда как анализ нозерн-блот позволяет исследователям обнаруживать конкретную последовательность мРНК, экспрессируемую в образце.
• Технология микрочипов — это метод гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет одновременно исследовать многие тысячи генов, чтобы найти различия в генах или паттернах экспрессии генов между двумя образцами геномной ДНК или кДНК,
• Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) позволяет разделить белки по размеру, особенно если заряды нативных белков замаскированы посредством предварительной обработки SDS.
• Полимеразная цепная реакция позволяет быстро амплифицировать определенную последовательность ДНК. Варианты ПЦР можно использовать для обнаружения экспрессии мРНК ( ПЦР с обратной транскриптазой ) или для количественной оценки конкретной последовательности в исходном образце (ПЦР в реальном времени ).
• Хотя разработка секвенирования ДНК по Сэнгеру была революционной, достижения в области секвенирования следующего поколения позволяют быстро и недорого секвенировать геномы многих организмов, увеличивая объем новых данных о последовательностях.

Множественный выбор

Какой метод используется для разделения фрагментов белка по размеру?

1. Электрофорез в полиакриламидном геле
2. Саузерн-блот
3. Электрофорез в агарозном геле
4. полимеразная цепная реакция

Показать ответ

Ответ а. Электрофорез в полиакриламидном геле используется для разделения фрагментов белка по размеру.

В каком методе используется расщепление рестрикционными ферментами с последующим электрофорезом в агарозном геле для создания полосатости для сравнения с другим образцом, обработанным таким же образом?

1. КПЦ
2. ОТ-ПЦР
3. RFLP
4. 454 секвенирование

Показать ответ

Ответ c.ПДРФ использует переваривание рестрикционными ферментами с последующим электрофорезом в агарозном геле для создания полосатости для сравнения с другим образцом, обработанным таким же образом.

Все следующие методы включают гибридизацию между одноцепочечными молекулами нуклеиновой кислоты , кроме :

1. Саузерн-блоттинг
2. Анализ RFLP
3. Нозерн-блот анализ
4. микроматричный анализ

Показать ответ

Ответ б. ПДРФ-анализ не включает гибридизацию между одноцепочечными молекулами нуклеиновой кислоты.

Заполните бланк

Метод __________ блоттинга используется для поиска фрагмента РНК в образце, который комплементарен зонду ДНК.

Показать ответ

Метод блоттинга Northern используется для поиска фрагмента РНК в образце, который комплементарен зонду ДНК.

Стадия ПЦР, во время которой двухцепочечная матричная молекула становится одноцепочечной, называется _____________.

Показать ответ

Стадия ПЦР, во время которой двухцепочечная матричная молекула становится одноцепочечной, называется денатурацией .

Метод секвенирования, включающий включение ddNTP, называется __________.

Показать ответ

Метод секвенирования, включающий включение ddNTP, называется секвенированием по Сэнгеру, методом дидезокси или методом терминации цепи .

Верно / Неверно

При электрофорезе в агарозном геле ДНК будет притягиваться к отрицательному электроду.

Подумай об этом

1. Почему важно, чтобы ДНК-зонд был помечен молекулярным маяком?
2. Почему при разделении белков строго по размеру сначала требуется воздействие SDS?
3. Почему ДНК-полимераза, используемая во время ПЦР, должна быть термостойкой?
4. В чем преимущество микроматричного анализа перед нозерн-блоттингом в мониторинге изменений экспрессии генов?
5. В чем разница между ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) и количественной ПЦР в реальном времени (qPCR)?
6. Предположим, вы работаете в лаборатории молекулярной биологии и испытываете трудности с успешным выполнением ПЦР.Вы решаете перепроверить протокол ПЦР, запрограммированный в термоциклере, и обнаруживаете, что температура отжига была запрограммирована на 65 ° C вместо 50 ° C, как вы планировали. Как эта ошибка повлияет на реакцию ПЦР? См. Рисунок 8.

Начальное руководство лаборатории молекулярной биологии

Руководство по электрофорезу в агарозном геле

Если вы используете ДНК или проводите ПЦР в своих исследованиях, то вы можете гарантировать, что в какой-то момент вам понадобится приготовить агарозный гель. Я потерял счет тому, сколько гелей агарозы сделал за время работы в лабораториях. Вот мое руководство по приготовлению и приготовлению агарозных гелей:

1. Решите, какой процент геля сделать

Вам следует отрегулировать концентрацию геля в соответствии с размером продукта, который вы ожидаете увидеть.Как показывает практика, гели с низким процентным содержанием (0,8–1%) предпочтительнее, если вы хотите отделить ДНК с очень большой молекулярной массой, например геномную ДНК. Гели с более высоким процентным содержанием (1–3%) выбираются, когда требуется лучшее разрешение, обычно для визуализации полос меньшего размера (<500 пар оснований), например, созданных в ПЦР в реальном времени.

2. Рассчитайте количество порошка агарозы и объем буфера TBE

.

Лучше всего провести все расчеты до начала. Вам необходимо решить, какое количество порошка агарозы и объем буфера трис / борат / ЭДТА (ТВЭ) объединить для получения требуемого процентного содержания геля.Объем TBE будет зависеть от размера лотка для заливки геля, который вы используете. Самый простой способ решить эту проблему — долить воду в поддон до полного заполнения, а затем измерить объем использованной воды с помощью мерного цилиндра.

Вот несколько примеров растворов агарозного геля, которые следует приготовить при использовании лотка для заливки геля объемом 50 мл:

• 1% гель = 50 мл 1x буфера TBE и 0,5 г порошка агарозы
• 2% гель = 50 мл 1x буфера TBE и 1,0 г порошка агарозы
• 3% гель = 50 мл 1x буфера TBE и 1.5 г порошка агарозы

Чтобы рассчитать необходимое количество порошка агарозы, когда вы знаете объем буфера TBE и желаемый процент геля, вы можете использовать следующее уравнение:

Агароза (граммы) = желаемый гель (%) x объем 1x буфер TBE (мл)

3. Приготовление буфера TBE (при необходимости)

Прежде всего вам понадобится буфер TBE. Некоторые из вас могут купить готовый буфер TBE, что совершенно нормально, но его так просто и дешево сделать.Лучше всего приготовить 10-кратный стандартный раствор, а затем использовать его, чтобы приготовить 1-кратный рабочий раствор. Воспользуйтесь нашим рецептом для буфера 10x TBE здесь.

Приготовление агарозного геля

Теперь у вас есть рабочий раствор TBE, вы готовы приготовить агарозный гель:

1. Начните с взвешивания необходимого количества порошка агарозы и перенесите его в коническую колбу. При нагревании смеси для растворения агарозы раствор будет пузыриться, поэтому убедитесь, что вы выбрали коническую колбу, которая достаточно велика, чтобы вместить смесь, и имеет место для пузырящегося раствора.
2. Отмерьте объем рабочего раствора ТВЭ, необходимый для геля агарозы. Добавьте это в коническую колбу, содержащую порошок агарозы. Дайте смеси встряхнуть.
3. Нагрейте раствор, поместив колбу в микроволновую печь. Обязательно следите за нагревательным раствором. Если вы перегреете, вы обнаружите, что раствор повсюду в микроволновой печи. Лучше всего нагревать немного и часто, часто открывая микроволновую печь для проверки раствора.
4. Когда весь порошок растворится, выньте колбу из микроволновой печи и поставьте на стол, чтобы она остыла.Будьте осторожны, колба будет горячей!
5. Когда раствор достаточно остынет, и вы сможете с комфортом обращаться с ним рукой в ​​перчатке, можно добавить раствор для окрашивания нуклеиновой кислоты по своему выбору.
6. В нашей лаборатории мы используем неканцерогенный краситель Midori Green Advance (Nippon Genetics). Для этого красителя вам необходимо добавить 0,5 мкл раствора Midori Green Advance на каждые 10 мл раствора агарозного геля. Вращайте колбу, чтобы смешать краситель. Убедитесь, что весь краситель полностью смешан с раствором.
7. Перелейте раствор в поддон для гелевого литья, содержащий гелевые гребешки. Не делайте гель слишком густым. Примерно на полпути гребня должно хватить. Кроме того, старайтесь не допускать появления пузырей. Если вы видите пузыри, особенно вокруг гелевого гребня, возьмите наконечник пипетки и вытолкните его. Или переместите его на дно геля. Если у вас осталась смесь геля агарозы, вылейте ее в неиспользованный лоток для заливки, чтобы она застыла. Не сливайте его в канализацию.
8. Оставьте гелевую смесь для схватывания. Время, необходимое для полного схватывания геля, варьируется в зависимости от концентрации геля и окружающей температуры.Гели с более высоким процентным содержанием гелей схватываются быстрее, чем гели с более низким процентным содержанием, и более холодная среда также застывает гели быстрее, чем более теплые. Обычно я оставляю свой настаиваться минимум на 15 минут.
9. Осторожно снимите гребешки, не расслаивая гель, особенно вокруг лунок.
10. Перенесите гель в резервуар для гель-электрофореза и заполните резервуар 1x буфером TBE. В зависимости от размера резервуара для этого может потребоваться значительное количество рабочего буфера TBE. Убедитесь, что раствор полностью погружает агарозный гель.Убедитесь, что в лунках нет пузырьков воздуха. В таком случае используйте наконечник пипетки, чтобы вытащить его. Кроме того, убедитесь, что анод (положительно заряженный конец, красный цвет) находится на нижнем конце, чтобы гель переходил от отрицательного (отрицательно заряженного конца, черного цвета) к положительному.
11. Теперь гель готов к загрузке образцов.

Подготовка образцов к загрузке

Перед тем, как нанести образцы на гель, вам необходимо смешать его с красителем для загрузки геля ДНК.Краска для загрузки требуется для двух целей: во-первых, чтобы сделать ваши образцы более заметными во время загрузки и прогона геля; во-вторых, чтобы образцы оставались в лунках с агарозой.

Обычно вы можете получить краситель для загрузки геля ДНК при покупке лестниц ДНК. Они должны указать свою концентрацию на пробирке, например, 5x. Итак, в зависимости от общего объема, который вы хотите загрузить в каждую лунку (обычно от 5 до 20 мкл), вам необходимо определить, какое количество загрузочного красителя смешать с вашим образцом.Лучше всего это делать в пробирках для ПЦР.

Пример:

Если вы хотите загрузить 10 мкл в каждую лунку и у вас есть 5-кратный загрузочный буфер, смешайте 8 мкл образца с 2 мкл загрузочного буфера в пробирке для ПЦР.

После того, как ваши образцы смешаны с загрузочным красителем, их можно загружать в лунки.

Загрузка и запуск агарозного геля

Загрузите все образцы в соответствующие лунки. Будьте осторожны при дозировании, чтобы не повредить гель.Лучше всего добавлять образцы пипеткой медленно, чтобы они не вернулись из лунок.

Кроме того, добавьте лестницу ДНК, чтобы у вас был ориентир по размеру при просмотре результатов. Выберите лестницу ДНК с большим диапазоном размеров, которая соответствует размеру, который вы ожидаете от своих образцов.

Наконец, закройте бак крышкой и подключите к блоку питания. Выберите подходящее напряжение (В). Высокое напряжение (например, 100 В) будет перемещать образцы через гель быстрее, чем медленное напряжение (например.грамм. 40 В). Не запускайте образцы при слишком высоком напряжении (> 100 В), так как это может нагреть буфер TBE и вызвать легкое плавление агарозного геля. Также нужно подумать о размере геля. Очевидно, что более крупные гели могут работать намного дольше, чем более короткие, прежде чем ваши образцы выйдут из конца. Кроме того, при использовании гелей с более высоким процентным содержанием вы заметите, что миграция ваших образцов намного медленнее по сравнению с гелями с более низким процентным содержанием.

Я обычно устанавливаю свой блок питания на 60 В примерно на 60–90 минут.Какое бы напряжение вы ни выбрали, обязательно продолжайте проверять гель, чтобы убедиться, что вы все еще можете видеть образцы. Как только образцы окажутся у дна геля, можно остановить электрофорез и проверить гель с помощью УФ-трансиллюминатора.

Изображение предоставлено: PlaxcoLab (через Flickr)

Рецептов

R
E
К И П Е С

III.
Электрофорез в агарозном геле

2.0%
Агароза

получается 200
мл. Используйте в свежем виде или храните в желе при комнатной температуре (несколько недель).

1. Добавить 4,0
   г агарозы (степень чистоты для электрофореза) на 200 мл 1X буфера для электрофореза TBE
   в химическом стакане на 600 мл или колбе Эрленмейера.
2. Перемешать
   приостановить агарозу.
3. Крышка
   стакан с алюминиевой фольгой и нагреть на кипящей водяной бане (пароварке)
   или на горячей плите, пока вся агароза не растворится (примерно 10 минут).
   или
   Нагрейте без крышки в микроволновой печи на высокой температуре, пока все
   агароза растворяется (3-5 минут на стакан).
4. Вихрь
   раствора и проверьте дно стакана, чтобы убедиться, что вся агароза растворилась.
   (Непосредственно перед полным растворением частицы агарозы выглядят как
   полупрозрачные зерна.) Разогрейте в течение нескольких минут, если необходимо.
5. Крышка
   алюминиевой фольгой и подержать на водяной бане (примерно 60 ° C) до тех пор, пока
   готов к использованию.Удалите всю «корку» затвердевшей агарозы с поверхности.
   перед заливкой.

Примечания:

и. Образцы
порошка агарозы можно предварительно взвесить и хранить в закрытых пробирках
до готовности к использованию.

ii. Затвердевший
агарозу можно хранить при комнатной температуре, а затем снова растопить в кипящей воде.
ванна (15-20 минут) или в микроволновке (3-5 минут на стакан)
до использования.Всегда откручивайте крышку при переплавлении агарозы в бутылке.

iii. Когда
испарение агарозы при переплаве приведет к увеличению концентрации.
При необходимости компенсируйте, добавив небольшой объем воды.

1 г / мл красящего раствора бромистого этидия

получается 500
мл.Хранить в темноте при комнатной температуре (неограниченно).

ВНИМАНИЕ:
Бромид этидия является мутагеном, полученным методом микросом Эймса, и предположительно
канцероген. Надевайте резиновые перчатки при приготовлении и использовании бромистого этидия.
решения.

1. Добавить 100
   л 5 мг / мл бромистого этидия на 500 мл деионизированной или дистиллированной воды.
2. Магазин
   в небьющихся флаконах (желательно непрозрачных).Этикетка бутылок «ВНИМАНИЕ:
   Этидиум бромид. Мутаген и агент, вызывающий подозрение на рак. Наденьте резиновые перчатки.
   при обращении »

Примечание:
Бромид этидия светочувствителен; хранить в темной таре или в упаковке
контейнер в алюминиевой фольге.

Загрузка красителя

получается 100
мл. Хранить при комнатной температуре (неограниченно).

0,25
г бромфенолового синего (вес 669,96)
0,25 г ксилолцианола (вес 538,60)
50,00 г сахарозы (m.w. 342,30) (или 50 мл глицерина)
1,00 мл 1M Трис (pH 8,0)

При использовании
сахароза:

1. Растворение
   бромфеноловый синий, ксилолцианол, сахароза и трис в 60 мл деионизированного
   или дистиллированная вода.
2. Добавить деионизированный
   или дистиллированная вода до 100 мл общего раствора.

При использовании
глицерин:

1. Растворение
   ксилолцианол, бромфеноловый синий и Трис в 49 мл деионизированной или дистиллированной
   воды.
2. Перемешать
   в 50 мл глицерина до 100 мл общего раствора.
   

0,2% исходный раствор метиленового синего

получается 100
мл.Хранить при комнатной температуре (неограниченно).

1. Вес
   из 0,2 г тригидрата метиленового синего (m.w. 373,9) и добавить к 100 мл
   дистиллированная вода.
2. Перемешать
   до полного растворения.

0,025%
Окрашивающий раствор метиленового синего

получается 500
мл. Хранить при комнатной температуре (неограниченно).

1. Добавить 62,5
   мл 0,2% исходного раствора метелиенового синего на 437,5 мл дистиллированной воды.
2. Перемешать
   смешивать.

pBR322 / Bst N
Маркеры размера I (0,1 г / л)

Либо купите pBR322, предварительно разрезанную рестриктазой BstN I, в New England Biolabs.
(# N3031) или приготовьте по следующему протоколу:

На 1 мл

Магазин в
-20 С (1 год).

1. 1. Добавьте 10 л раствора 10 г / л pBR322 к 75 л дистиллированной жидкости,
   автоклавированная вода.
2. 2. Добавьте 10 мкл 10-кратного буфера (предоставляется поставщиком фермента).
3. 3. Добавьте 5 мкл рестрикционного фермента BstN I и инкубируйте при 60 ° C в течение 60 мин.
4. 4. Электрофорез 5 л (плюс 1 л загрузочного красителя) в 1-2% агарозном геле для проверки полного переваривания. Точно
   Должны быть видны 5 полос, соответствующих 1857 п.н., 1058 п.н., 929 п.н., 383 и 121 п.н.Любые дополнительные полосы указывают на неполное пищеварение; добавить дополнительный фермент и снова инкубировать
   при 60 ° С.

Буфер для электрофореза 10X Tris / Borate / EDTA (TBE)

— 1 шт.
литр. Хранить при комнатной температуре (неограниченно).

1. Вес
   из:
   1 г NaOH (м.в. 40,00)
   108 г Трис-основы (м.ш. 121,10)
   55 г борной кислоты (вес 61,83)
   7,4 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, динатриевая соль, m.w. 372,24)
2. Добавить все
   сухие ингредиенты на 700 мл деионизированной или дистиллированной воды в колбе на 2 л.
3. Перемешать
   растворять, предпочтительно с помощью магнитной мешалки.
4. Добавить деионизированный
   воды, чтобы довести общий раствор до 1 л.

1X буфер для электрофореза TBE

— это 10
литров.Хранить при комнатной температуре (неограниченно).

1. В
   наполненную бутылью, добавьте 9 литров деионизированной или дистиллированной воды к 1 литру
   10X буфера для электрофореза TBE.