Электрофореграмма это: Электрофореграмма — Справочник химика 21

Содержание

Электрофорез белков


Общий белок сыворотки крови состоит из смеси белков с разной структурой и функциями. Электрофорез белков  – это метод разделения белковых фракций, основанный на различной скорости их движения в электрическом поле в зависимости от размера, заряда и формы белковой молекулы. При электрофорезе белков сыворотки крови получают 5 основных фракций: альбумины, α1,α2,β,γ-глобулины. Основная белковая фракция сыворотки – это альбумин. На его долю приходится около 2/3 всего белка крови.


Фракция α1-глобулинов включает в себя белки острой фазы воспаления: α1-кислый гликопротеин (орозомукоид), α1-антитрипсин (основной компонент этой фракции) — ингибитор многих протеолитических ферментов — трипсина, химотрипсина, плазмина,  транспортные белки: тироксинсвязывающий глобулин, транкортин (функции — связывание и транспорт кортизола и тироксина соответственно), α1-липопротеин (функция — участие в транспорте фосфолипидов и холестерина).


Фракция α2-глобулинов включает также острофазные белки — α2-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин. α2-макроглобулин (основной компонент фракции) участвует в развитии инфекционных и воспалительныхреакций.Гаптоглобин- это гликопротеин, который образует комплекс с гемоглобином, высвобождающимся из эритроцитов при внутрисосудистом гемолизе, который затем утилизируется клетками ретикулоэндотелиальной системы.


Церулоплазмин — связывает ионы меди, а также является оксидазой аскорбиновой кислоты, адреналина, диоксифенилаланина (ДОФА), способен инактивировать свободные радикалы.


В состав β-глобулиновой фракции входят трансферрин (белок-переносчик железа), гемопексин (связывает гем, что предотвращает его выведение почками и потерю железа), компоненты комплемента (участвующие в реакциях иммунитета) и часть иммуноглобулинов. Фракцияγ-глобулиновсостоит из иммуноглобулинов, (в порядке количественного убывания — IgG, IgA, IgM, IgE), функционально представляющих собой антитела, обеспечивающие гуморальную иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ.


Различные острые и хронические воспалительные процессы и опухолевые заболевания сопровождаются изменением нормального соотношения белковых фракций.  (диспротеинемия). Диспротеинемии наблюдаются чаще, чем изменение общего количества белка и при наблюдении в динамике могут характеризовать стадию заболевания, его длительность, эффективность проводимых лечебных мероприятий. Парапротеинемия – появление в крови структурно аномальных и функционально неполноценных белков из группы иммуноглобулинов при моноклональных гаммапатиях. В эту группу заболеваний входят: множественная миелома, моноклональная гаммапатия неясного генеза, макроглобулинемия Вальденстрема и некоторые другие состояния. Эти заболевания характеризуются клональной пролиферацией В-лимфоцитов или плазматических клеток, при которой происходит бесконтрольная выработка одного вида (одного идиотипа) иммуноглобулинов.


Исследование белковых фракций сыворотки крови используют для диагностики различных синдромов иммунодефицита. Примером может послужить агаммаглобулинемия Брутона, при которой снижается концентрация всех классов иммуноглобулинов. Электрофорез белков сыворотки пациента с болезнью Брутона характеризуется отсутствием или крайне низким уровнем  γ -глобулинов.


Широкий спектр состояний, при которых наблюдаются качественные и количественные изменения протеинограммы, включает самые разные заболевания (от хронической сердечной недостаточности до вирусных гепатитов). Несмотря на наличие некоторых типичных отклонений протеинограммы, позволяющих в ряде случаев с определенной уверенностью диагностировать заболевание, обычно результат электрофореза белков сыворотки не может служить однозначным критерием постановки диагноза. Поэтому интерпретацию исследования белковых фракций крови проводят с учетом дополнительных клинических, лабораторных и инструментальных данных.      Результат электрофоретического разделения белков может быть представлен графически, при этом каждая фракция характеризуется определенной высотой, отражающей ее долю в общем белке сыворотки. Патологическое увеличение доли какой-либо фракции носит название «пик», например, «М-пик» при множественной миеломе. 


Кровь рекомендуется сдавать утром, натощак (не менее 8 и не более 14 часов голодания, воду пить можно). Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение и не курить в течение 30 минут до сдачи крови. Накануне исследования не должно быть приема радиоконтрастных веществ, а также  процедуры гемодиализа.


 


Материал для исследования: сыворотка крови.


Интерпретация результатов содержит аналитическую информацию для лечащего врача. Лабораторные данные входят в комплекс всестороннего обследования пациента, проводимого врачом и не могут быть использованы для самодиагностики и самолечения.


Причины повышения фракции альбумина:


§  дегидратация;


§  шок;


Причины понижения фракции альбумина:


§  острая ревматическая лихорадка;


§  острый холецистит;


§  сахарный диабет;


§  воспалительные и опухолевые заболевания ЖКТ;


§  нефротический синдром;


§  нефритический синдром;


§  лейкоз;


§  лимфома;


§  хроническая сердечная недостаточность;


§  макроглобулинемия;


§  множественная миелома;


§  остеомиелит;


§  язвенная болезнь;


§  пневмония;


§  саркоидоз;


§  системная красная волчанка;


§  неспецифический язвенный колит;


§  прием глюкокортикоидов.


 


Причины повышения фракции альфа-1-глобулина:


§  острые или хронические воспалительные заболевания;


§  лимфогранулематоз;


§  цирроз печени;


§  язвенная болезнь;


§  беременность;


§  стресс;


§  прием пероральных контрацептивов.


 


Причины понижения фракции альфа-1-глобулина:


§  недостаточность альфа-1-антитрипсина;


§  острый вирусный гепатит.


 


Причины повышения фракции альфа-2-глобулина:


§  острая ревматическая лихорадка;


§  хронический гломерулонефрит;


§  цирроз печени;


§  сахарный диабет;


§  диспротеинемия;


§  лимфогранулематоз;


§  пожилой и младенческий возраст;


§  нефротический синдром;


§  остеомиелит;


§  язвенная болезнь;


§  пневмония;


§  узловатый полиартериит;


§  ревматоидный артрит;


§  саркоидоз;


§  стресс;


§  системная красная волчанка;


§  мальабсорбция;


§  неспецифический язвенный колит.


 


Причины понижения фракции альфа-2-глобулина:


§  острый вирусный гепатит;


§  гипогаптоглобинемия;


§  интраваскулярный гемолиз;


§  гипертиреоз;


§  мальабсорбция.


 


Причины повышения фракции бета-глобулина:


§  острые воспалительные заболевания;


§  сахарный диабет;


§  диспротеинемия;


§  гломерулонефрит;


§  гиперхолестеринемия;


§  железодефицитная анемия;


§  подпеченочная желтуха;


§  макроглобулинемия;


§  нефротический синдром;


§  беременность;


§  ревматоидный артрит;


§  саркоидоз;


§  прием пероральных контрацептивов.


 


Причины понижения фракции бета-глобулина:


§  аутоиммунные заболевания;


§  лейкоз;


§  лимфома;


§  нефротический синдром;


§  системная склеродермия;


§  стеаторея;


§  системная красная волчанка;


§  цирроз печени;


§  неспецифический язвенный колит.


 


Причины повышения фракции гамма-глобулина:


§  амилоидоз;


§  цирроз печени;


§  хронический лимфолейкоз;


§  криоглобулинемия;


§  муковисцидоз;


§  тиреоидитХашимото;


§  ювенильный ревматоидный артрит;


§  множественная миелома;


§  моноклональнаягаммапатия неясного генеза;


§  ревматоидный артрит;


§  саркоидоз;


§  системная склеродермия;


§  синдром Шегрена;


§  системная красная волчанка;


§  макроглобулинемия Вальденстрема.


 


Причины понижения фракции гамма-глобулина:


§  острый вирусный гепатит;


§  агаммаглобулинемия;


§  гломерулонефрит;


§  лейкоз;


§  лимфома;


§  нефротический синдром;


§  мальабсорбция;


§  склеродермия;


§  стеаторея;


§  неспецифический язвенный колит.

ДНК-ТИПИРОВАНИЕ • Большая российская энциклопедия

  • В книжной версии

    Том 9. Москва, 2007, стр. 148-149

  • Скопировать библиографическую ссылку:


Авторы: П. Л. Иванов

Электрофореграмма двух амплифицированных фрагментов ДНК: аллели локусов 3’A’poB (дорожки 1–3) и D1S80 (дорожки 4–6) у семейной группы мать (дорожки 1, 4), ребёнок (дорожки 2, 5), отец (дорожки 3, 6). …

ДНК-ТИПИ́РОВАНИЕ (мо­ле­ку­ляр­но-ге­не­ти­че­ская ин­ди­ви­дуа­ли­за­ция ор­га­низ­мов, ДНК-ин­ди­ви­дуа­ли­за­ция), спо­соб ис­сле­до­ва­ния ге­не­тич. ма­те­риа­ла, на­прав­лен­ный на вы­яв­ле­ние и оцен­ку ин­ди­ви­ду­аль­ных ге­не­тич. осо­бен­но­стей био­ло­гич. объ­ек­та. Цель та­ко­го ис­сле­до­ва­ния – ус­та­нов­ле­ние сход­ст­ва (или раз­ли­чий) раз­ных ор­га­низ­мов для оп­ре­де­ле­ния сте­пе­ни их род­ст­ва.

Ме­тод ДНК-т. ос­но­ван на су­ще­ст­во­ва­нии раз­ли­чий в струк­ту­ре ДНК у раз­ных ин­ди­ви­дуу­мов. Это ка­са­ет­ся т. н. ги­пер­ва­риа­бель­ных уча­ст­ков, об­ла­даю­щих струк­тур­ным по­ли­мор­физ­мом (име­ют неск. ал­лель­ных форм). В их фор­ми­ро­ва­нии гл. роль иг­ра­ют от­но­си­тель­но ко­рот­кие нук­лео­тид­ные по­сле­до­ва­тель­но­сти, по­лу­чив­шие назв. ми­ни­са­тел­лит­ные и мик­ро­са­тел­лит­ные ДНК, со­стоя­щие со­от­вет­ст­вен­но из 15–70 и 2–5 пар нук­лео­ти­дов. Эти по­сле­до­ва­тель­но­сти рас­сея­ны по ге­но­му в ви­де бло­ков (ло­ку­сов) и име­ют тан­дем­ную ор­га­ни­за­цию (мно­го­крат­но сле­ду­ют друг за дру­гом). Чис­ло тан­дем­ных по­вто­ров (и, сле­до­ва­тель­но, дли­на са­мих ло­ку­сов) варь­и­ру­ет в пре­де­лах от 2–4 до не­сколь­ких ты­сяч. На­ли­чие по­вто­ряю­щих­ся эле­мен­тов в та­ких го­мо­ло­гич­ных са­тел­лит­ных бло­ках и обу­слов­ли­ва­ет струк­тур­ный по­ли­мор­физм этих ло­ку­сов, про­яв­ляю­щий­ся, в ча­ст­но­сти, как фе­но­мен по­ли­мор­физ­ма дли­ны ре­ст­рик­таз­ных фраг­мен­тов (ПДРФ). Та­кие фраг­мен­ты об­ра­зу­ют­ся по­сле фер­мен­та­тив­но­го рас­ще­п­ле­ния ДНК ре­ст­рик­та­за­ми (внут­ри по­вто­ров рас­ще­п­ле­ния не про­ис­хо­дит из-за осо­бен­но­стей их нук­лео­тид­но­го со­ста­ва). В пер­во­на­чаль­ных ва­ри­ан­тах ДНК-т. фраг­мен­ты ДНК раз­де­ля­ли элек­тро­фо­ре­зом в ага­роз­ном ге­ле, а за­тем по­лу­ча­ли от­пе­ча­ток это­го ге­ля на мем­бран­ном фильт­ре. По­след­ний ин­ку­би­ро­ва­ли в рас­тво­ре, со­дер­жа­щем спе­ци­аль­но по­доб­ран­ные зон­ды – фраг­мен­ты ДНК, ме­чен­ные ра­дио­изо­то­пом. Со­дер­жа­щие ком­пле­мен­тар­ные зон­ду уча­ст­ки ис­сле­дуе­мой ДНК свя­зы­ва­лись (гиб­ри­ди­зо­ва­лись) с ним и вы­яв­ля­лись с по­мо­щью ра­дио­ав­то­гра­фии. Т. о. на ра­дио­чув­ст­ви­тель­ной плён­ке в ви­де на­бо­ра по­лос иден­ти­фи­ци­ро­ва­лись сра­зу все мик­ро- и ми­ни­са­тел­ли­ты ге­ном­ной ДНК, го­мо­ло­гич­ные ис­поль­зуе­мо­му зон­ду. По ана­ло­гии с ана­ли­зом дак­ти­ло­ско­пич. от­тис­ка (ри­сун­ком па­пил­ляр­ных ли­ний) поя­вил­ся тер­мин «ге­не­ти­че­ская, или ге­ном­ная, дак­ти­ло­ско­пия». Ка­ж­дый ин­ди­ви­ду­ум име­ет свой ге­ном­ный «от­пе­ча­ток», ко­то­рый ха­рак­те­ри­зу­ет­ся оп­ре­де­лён­ным чис­лом по­лос (до не­сколь­ких де­сят­ков), их рас­по­ло­же­ни­ем на до­рож­ке и ин­тен­сив­но­стью по­чер­не­ния ка­ж­дой из по­лос. Чем боль­ше род­ст­во, тем боль­ше сов­па­де­ний. Вся кар­ти­на об­на­ру­жи­ва­ет да­же бо­лее вы­со­кую ин­ди­ви­ду­аль­ную спе­ци­фич­ность, чем па­пил­ляр­ные узо­ры, и по­это­му мо­жет слу­жить «ге­не­тич. удо­сто­ве­ре­ни­ем» лич­но­сти. У кров­ных род­ст­вен­ни­ков чис­ло со­в­па­даю­щих по­лос за­мет­но боль­ше, у близ­не­цов они иден­тич­ны.

Раз­ра­бот­ка ме­то­да (кон. 1980-х гг.) по­ли­ме­раз­ной цеп­ной ре­ак­ции (ПЦР) по­зво­ли­ла раз­мно­жать (ам­пли­фи­ци­ро­вать) лю­бую по­сле­до­ва­тель­ность ДНК, по­лу­чать де­сят­ки и сот­ни мил­лио­нов её ко­пий и ис­поль­зо­вать для мо­ле­ку­ляр­но-ге­не­тич. ана­ли­за ис­че­заю­ще ма­лые ко­ли­че­ст­ва био­ло­гич. ма­те­риа­ла. По­яви­лась воз­мож­ность срав­ни­вать дли­ну отд. це­лых ло­ку­сов ми­ни­са­тел­лит­ных ДНК, не под­вер­гая их пред­ва­ри­тель­но­му фер­мен­та­тив­но­му рас­щеп­ле­нию, т. е. осу­ще­ст­в­лять ана­лиз по­ли­мор­физ­ма дли­ны ам­пли­фи­ци­ро­ван­ных фраг­мен­тов (ПДАФ). По­сле раз­де­ле­ния про­дук­тов ПЦР элек­тро­фо­ре­зом их по­ло­же­ние в ге­ле вы­яв­ля­ют с по­мо­щью спец. кра­си­те­лей, флуо­рес­цент­ных ме­ток и др. Раз­ра­бо­та­ны так­же т. н. муль­ти­плекс­ные ам­пли­фи­ка­ци­он­ные сис­те­мы, ко­то­рые по­зво­ля­ют од­но­вре­мен­но ана­ли­зи­ро­вать ПДАФ сра­зу не­сколь­ких ло­ку­сов (их мо­жет быть бо­лее де­ся­ти). В этом слу­чае ам­пли­фи­ка­ци­он­ный про­филь ДНК, соз­да­вае­мый уже сум­мой ло­ку­сов, ока­зы­ва­ет­ся чрез­вы­чай­но по­ли­морф­ным (яв­ля­ет­ся ком­би­на­ци­ей не­сколь­ких не­за­ви­си­мых по­ли­морф­ных эле­мен­тов), но обес­пе­чи­ва­ет очень вы­со­кую дос­то­вер­ность ана­ли­за.

Ва­риа­бель­ность в струк­ту­ре по­ли­морф­ных ге­нов ми­ни- и мик­ро­са­тел­лит­ных ДНК мо­жет быть обу­слов­ле­на так­же то­чеч­ны­ми нук­лео­тид­ны­ми за­ме­на­ми. Та­кие ло­ку­сы раз­ли­ча­ют­ся толь­ко по нук­лео­тид­но­му со­ста­ву. В этом слу­чае оп­ре­де­ля­ют пер­вич­ную струк­ту­ру ам­пли­фи­ци­ро­ван­ных фраг­мен­тов (см. Се­к­ве­ни­ро­ва­ние). Наи­бо­лее раз­ра­бо­тан­ным ме­то­дом ДНК-т., ос­но­ван­ным на се­к­ве­ни­ро­ва­нии фраг­мен­тов, яв­ля­ет­ся ана­лиз ми­то­хон­д­ри­аль­ной ДНК (мтДНК), ко­то­рая ха­рак­те­ри­зу­ет­ся вы­со­ким уров­нем по­ли­мор­физ­ма, на­ли­чи­ем боль­шо­го чис­ла ко­пий, от­сут­ст­ви­ем ре­ком­би­на­ции и ма­те­рин­ским ха­рак­те­ром на­сле­до­ва­ния (за­ро­дыш по­лу­ча­ет ми­то­хон­д­рии толь­ко из яй­це­клет­ки). Всё это по­зво­ли­ло ши­ро­ко ис­поль­зо­вать мтДНК в по­пу­ля­цион­ных и фи­ло­ге­не­тич. ис­сле­до­ва­ни­ях, а в не­ко­то­рых слу­ча­ях сде­ла­ло её един­ст­вен­но воз­мож­ным ин­ст­ру­мен­том для ДНК-т.; напр., ко­гда ДНК, со­дер­жа­щая­ся в об­раз­це, силь­но де­гра­диро­ва­на, а хро­мо­сом­ная ДНК не мо­жет быть ам­пли­фи­ци­ро­ва­на. На­сле­до­ва­ние по ма­те­рин­ской ли­нии и от­сут­ст­вие ре­ком­би­на­ции по­зво­ля­ют ис­поль­зо­вать мтДНК в ка­че­ст­ве т. н. «трас­си­рую­ще­го» ро­до­слов­но­го ге­не­тич. мар­ке­ра. Это осо­бен­но важ­но при ус­та­нов­ле­нии род­ст­ва в тех слу­ча­ях, ко­гда ге­не­тич. дис­тан­ция, раз­де­ляю­щая род­ст­вен­ни­ков, ока­зы­ва­ет­ся боль­ше, чем од­но по­ко­ле­ние. Яр­ким при­ме­ром ис­поль­зо­ва­ния мтДНК для ДНК-т. яви­лась ра­бо­та рос., брит. и амер. учё­ных по иден­тифи­ка­ции ос­тан­ков рос. имп. се­мьи в 1992–98. Позд­нее ана­лиз мтДНК был мно­го­крат­но ис­поль­зо­ван для ин­ди­ви­дуа­ли­за­ции ко­ст­ных и му­ми­фи­цир. ос­тан­ков, воз­раст ко­то­рых ис­чис­ля­ет­ся де­сят­ка­ми, сот­ня­ми и да­же де­сят­ка­ми ты­сяч лет.

Ме­то­дом ДНК-т. поль­зу­ют­ся в кри­ми­на­ли­сти­ке для иден­ти­фи­ка­ции лич­но­сти и ус­та­нов­ле­ния родств. от­но­ше­ний, а так­же в ме­ди­ко-био­ло­гич. ана­ли­зе. В ге­не­ти­ке и се­лек­ции с.-х. жи­вот­ных и рас­те­ний этот ме­тод ис­поль­зу­ют для пас­пор­ти­за­ции и от­бо­ра чис­то­по­род­но­го по­том­ст­ва жи­вот­ных, ти­пи­ро­ва­ния сор­тов рас­те­ний, оп­ре­де­ле­ния меж­ви­до­вых и меж­сор­то­вых раз­ли­чий, а в прак­тич. бак­те­рио­ло­гии и эпи­де­мио­ло­гии – для иден­ти­фи­ка­ции бак­те­ри­аль­ных штам­мов. ДНК-т. мож­но ис­поль­зо­вать при изу­че­нии струк­тур­но-­функ­цио­наль­ных осо­бен­но­стей ге­не­тич. ап­па­ра­та и яв­ле­ний ге­ном­ной не­ста­биль­но­сти при нор­маль­ном функ­цио­ни­ро­ва­нии кле­ток и па­то­ге­не­зе, в по­пуля­ци­он­ной и эво­лю­ци­он­ной ге­не­ти­ке.

Сдать анализ на белковые фракции

Метод определения
Капиллярный электрофорез.

Исследуемый материал
Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Онлайн-регистрация

Синонимы: Белковые фракции крови; Протеинограмма. 

Serum Protein Electrophoresis (SPE, SPEP). 

Краткая характеристика теста «Белковые фракции» 

Количественное соотношение фракций общего белка крови, отражающее физиологические и патологические изменения состояния организма. 

Общий белок сыворотки состоит из смеси белков с разной структурой и функциями. 

Разделение на фракции основано на разной подвижности белков в разделяющей среде под действием электрического поля. 

Обычно методом электрофореза выделяют 5-6 стандартных фракций: 1 – альбумины и 4-5 фракций глобулинов (альфа1-, альфа2-, бета- и гамма-глобулины, иногда отдельно выделяют фракции бета-1 и бета-2 глобулинов). Глобулиновые фракции более разнородны. 

Фракция альфа1-глобулина включает в себя острофазные белки: альфа1-антитрипсин (основной компонент этой фракции) – ингибитор многих протеолитических ферментов – трипсина, химотрипсина, плазмина и т. д., а также альфа1-кислый гликопротеин (орозомукоид). Он обладает широким спектром функций, в зоне воспаления способствует фибриллогенезу. К глобулинам относятся транспортные белки: тироксинсвязывающий глобулин, транкортин (функции: связывание и транспорт кортизола и тироксина соответственно), альфа1-липопротеин (функция: участие в транспорте липидов). 

Фракция альфа2-глобулинов преимущественно включает острофазные белки – альфа2-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин. Альфа2-макроглобулин (основной компонент фракции) участвует в развитии инфекционных и воспалительных реакций. Гаптоглобин – это гликопротеин, который образует комплекс с гемоглобином, высвобождающимся из эритроцитов при внутрисосудистом гемолизе, утилизирующийся затем клетками ретикулоэндотелиальной системы. Церулоплазмин специфически связывает ионы меди, а также является оксидазой аскорбиновой кислоты, адреналина, диоксифенилаланина (ДОФА), способен инактивировать свободные радикалы. Фракция бета-глобулинов содержит трансферрин (белок-переносчик железа), гемопексин (связывает гем, что предотвращает его выведение почками и потерю железа), компоненты комплемента (участвующие в реакциях иммунитета) и часть иммуноглобулинов. Фракция гамма-глобулинов состоит из иммуноглобулинов, (в порядке количественного убывания – IgG, IgA, IgM, IgE), функционально представляющих собой антитела, обеспечивающие гуморальную иммунную защиту организма от инфекций и чужеродных веществ. 

При многих заболеваниях встречается нарушение соотношения фракций белков плазмы (диспротеинемия). Диспротеинемии наблюдаются чаще, чем изменение общего количества белка и при наблюдении в динамике могут характеризовать стадию заболевания, его длительность, эффективность проводимых лечебных мероприятий. 

Парапротеинемия – появление на электрофореграмме дополнительной дискретной полосы, свидетельствующей о присутствии в большом количестве однородного (моноклонального) белка, обычно иммуноглобулинов или отдельных компонентов их молекул, синтезирующихся в В-лимфоцитах. Большие концентрации М-белка (больше 15 г/л) с большой вероятностью указывают на миелому.  

С какой целью выполняют тест «Белковые фракции» в крови 

Электрофорез белков сыворотки крови используют в диагностике состояний, сопровождающихся аномальным синтезом или потерей белка. Скрининговый тест при подозрении на миелому. 

Что может повлиять на результат теста «Белковые фракции» 

Исследование белковых фракций при подозрении на миелому имеет особую диагностическую ценность. Лёгкие цепи иммуноглобулинов (белок Бенс-Джонса) свободно проходят через сывороточный фильтр и на электрофореграмме сыворотки могут не определяться. Малые М-белки иногда могут наблюдаться при хронических гепатитах, доброкачественно – у пациентов престарелого возраста. Имитировать малую парапротеинемию могут большие концентрации С-реактивного белка и некоторых других острофазных белков, присутствие в сыворотке фибриногена, иногда – лекарственные препараты на основе моноклональных антител в пиковой концентрации (используются в качестве противоопухолевых препаратов, иммунодепрессантов и др.). 

Внимание! Данное исследование отдельно не выполняется, только в комплексе с тестом № 28 Общий белок (в крови) (Protein total).

ОФС.1.2.1.0022.15 Капиллярный электрофорез | Фармакопея.рф

Содержимое (Table of Contents)

Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Капиллярный                                                  ОФС.1.2.1.0022.15

электрофорез                                                    Вводится впервые

Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.

Скорость миграции частиц определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора.

Электрофоретическая подвижность вещества (μэф) зависит от его характеристик (электрического заряда, размеров и формы) и от характеристик буферной среды, в которой происходит разделение (типа и ионной силы электролита, рН, вязкости и добавок):

 

где    q   –   эффективный заряд частицы;

          η   –   вязкость раствора электролита;

          r   –   стоксовский радиус частицы.

         Электрофоретическую скорость (νэф) для  вещества сферической формы определяют по формуле:

где    E  –   сила электрического поля;

          V  –   приложенное напряжение;

          L   –   общая длина капилляра.

Когда к капилляру, заполненному буферным раствором, приложено электрическое поле, внутри капилляра образуется поток растворителя, называемый электроосмотическим потоком. Скорость и направление электроосмотического потока зависят от электроосмотической подвижности (μэо), определяемой знаком и плотностью заряда на внутренней стенке капилляра, а также характеристиками буфера:

где    ε    –    диэлектрическая константа буфера;

         ζ    –    дзета-потенциал поверхности капилляра.

Электроосмотическую скорость (νэо) рассчитывают по формуле:

Электрофоретическая и электроосмотическая подвижность ионов могут быть направлены в одну и ту же или в противоположные стороны в зависимости от заряда частиц; таким образом, скорость движения растворенного вещества будет определяться уравнением:

Если электроосмотическая скорость выше электрофоретической, можно одновременно разделить как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. Время, затраченное ионом для миграции от конца, в котором вводится образец, до места детекции (l – эффективная длина капилляра), определяют по формуле:

Как правило, капилляры из плавленого кварца без покрытия при pH выше 3 несут на внутренней поверхности отрицательный заряд из-за диссоциации силанольных групп. При этом электроосмотический поток направлен от анода к катоду.

В некоторых случаях необходимо уменьшить или изменить направление электроосмотического потока. Для этого различным образом модифицируют внутреннюю стенку капилляра или изменяют рН буферного раствора.

После введения образца в капилляр каждый анализируемый ион движется внутри фонового электролита в виде отдельной зоны в соответствии со своей электрофоретической подвижностью. Степень размывания каждой зоны растворенного соединения определяется совокупностью различных причин. В идеальном случае единственной причиной размывания зон является продольная молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра. В этом, идеальном, случае эффективность разделения полосы, характеризуемая числом теоретических тарелок (N), выражается формулой:

где    D   –    молекулярный коэффициент диффузии растворенного вещества в буферном растворе.

На практике на размывание полос значительное влияние оказывают тепловое рассеяние, адсорбция образца на стенке капилляра, различная проводимость между образцом и буфером, длительность ввода пробы, размеры детектирующей ячейки и различия уровней жидкости в емкостях с буферными растворами.

Разделение между двумя полосами, называемое разрешением (Rs), определяют по формуле (8):

где    μэфб и μэфа  –  электрофоретические подвижности каждого из двух разделенных ионов;

–   их средняя электрофоретическая подвижность.

Среднюю электрофоретическую подвижность определяют по формуле:

Оборудование

Система для капиллярного электрофореза состоит из высоковольтного источника напряжения; двух флаконов с буферными растворами и погруженными в них электродами; капилляра, заполненного соответствующим раствором и погруженного обоими концами во флаконы с буферными растворами; системы ввода образца; детектора, способного в режиме реального времени регистрировать вещества, проходящие мимо оптического окна капилляра; системы термостатирования; регистрирующего прибора или подключенного компьютера.

Для введения пробы могут использоваться три способа: гидростатический – за счет разного уровня буферных растворов, гидродинамический – с помощью прилагаемого давления или вакуума и электрокинетический – благодаря прилагаемому напряжению. В последнем случае степень ввода в капилляр каждого компонента пробы зависит от соответствующей электрофоретической подвижности. Электрокинетическая система ввода для многокомпонентной смеси с разной электрофоретической подвижностью ведет к изменению соотношения концентраций ее составляющих и в данном случае может адекватно применяться лишь для качественного анализа. При условии определения в многокомпонентной смеси одного или двух соединений этот метод может использоваться и для количественного анализа. Кроме того, такой способ введения может позволить увеличить чувствительность анализа.

Детектирование осуществляется с помощью абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях, флуориметрии, кондуктометрии, амперометрии или масс-спектрометрии.

Для обнаружения не поглощающих в ультрафиолетовой области и не флуоресцирующих соединений используется непрямое детектирование. В этом случае в ведущий электролит вводится вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение и образующее выраженное фоновое поглощение. При этом зона определяемого вещества визуализируется в виде обратного пика. С использованием специального программного обеспечения электрофореграмме придают стандартный вид.

Применяемый раствор электролита фильтруют для того, чтобы удалить крупные частицы (размером более 0,45 мкм), и дегазируют для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут быть помехой для детектирующей системы или могут нарушить электропроводность в капилляре во время проведения анализа. Для хорошей воспроизводимости времени миграции анализируемых компонентов проб для каждого определения должна быть разработана определенная процедура промывки капилляра.

Основными формами проведения капиллярного электрофореза являются: капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование и капиллярный изотахофорез.

Капиллярный зонный электрофорез

Аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор. Разделение происходит за счет того, что различные компоненты образца движутся с разными скоростями, образуя так называемые зоны. Скорость движения каждой зоны зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и от электроосмотического потока в капилляре. Для уменьшения адсорбции веществ на поверхности плавленого кварца могут использоваться капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.

Использование капиллярного зонного электрофореза позволяет выполнить разделение как малых (молекулярная масса < 2 кДа), так и больших молекул (2 кДа < молекулярная масса < 100 кДа). При этом может быть обеспечено разделение молекул, имеющих лишь незначительные отличия в соотношениях заряда к массе. Этот способ позволяет также разделять хиральные соединения, для чего в буферный раствор вводятся хиральные селекторы.

Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако увеличение используемого напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и, как следствие, вязкости буфера внутри капилляра. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения. Температура изменяет вязкость буфера и электропроводность и, следовательно, влияет на скорость миграции. В некоторых случаях возрастание температуры в капилляре может вызвать конформационные изменения белков, изменяя времена их миграции и эффективность разделения.

Длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа, эффективность разделения и нагрузочную емкость. Увеличение как эффективной, так и общей длины капилляра может уменьшить электрическое поле, что увеличивает время миграции. При заданном буфере и электрическом поле от внутреннего диаметра капилляра зависят тепловое рассеивание и, следовательно, уширение полос образца.

Для предотвращения адсорбции компонентов анализируемой пробы на стенке капилляра применяются различные подходы: экстремальные значения рН, адсорбция положительно заряженных буферных добавок, покрытие внутренней стенки капилляра различными полимерами (нейтральными, гидрофильными, катионными или анионными).

Ведущий электролит для капиллярного электрофореза должен иметь оптимальное значение ионной силы, увеличение которой приводит к возрастанию силы тока, уменьшению электроосмотического потока и, соответственно, снижению скорости движения пробы.

Буферные системы для капиллярного электрофореза должны иметь оптимальную буферную емкость в выбранном диапазоне рН и низкую электропроводность для уменьшения возникающего тока. Для симметричной формы регистрируемого пика необходимо, чтобы скорость движения ионов буфера примерно соответствовала скорости движения аналита. Увеличение концентрации буфера (при заданном рН) уменьшает электроосмотический поток и скорость движения пробы.

Значение рН буферного раствора влияет на разделение, изменяя заряд анализируемого соединения и добавок, а также электроосмотический поток. При разделении белков и пептидов изменение рН буфера от более низкого, чем изоэлектрическая точка, к более высокому изменяет суммарный заряд растворенного вещества от отрицательного к положительному. Увеличение рН буфера обычно увеличивает электроосмотический поток.

Среда для растворения пробы важна для достижения концентрирования образца. Органические модификаторы (метанол, ацетонитрил и др.) добавляют к водному буферному раствору для увеличения растворимости пробы, а также для изменения степени ионизации компонентов образца. Добавление этих органических модификаторов обычно вызывает уменьшение электроосмотического потока.

Для разделения оптических изомеров к буферному раствору добавляют хиральные модификаторы: циклодекстрины, краун-эфиры, полисахариды и белки. Другими факторами, контролирующими разрешение в хиральном разделении, являются концентрация хирального модификатора, состав и рН буфера, а также температура. Использование органических компонентов, таких, как метанол или мочевина, может также влиять на достигаемое разрешение.

Мицеллярная электрокинетическая хроматография

В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение осуществляется в растворе электролита, содержащего поверхностно-активное вещество в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы растворенного вещества распределяются между буферным раствором и псевдостационарной фазой, состоящей из мицелл. Этот метод может использоваться для разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве анионного поверхностно-активного вещества наиболее часто используется додецилсульфат натрия, в качестве катионного – соли цетилтриметиламмония.

При нейтральных и щелочных значениях рН возникает сильный электроосмотический поток, который движет ионы разделяющего буфера в сторону катода. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия электрофоретическое движение анионных мицелл направлено в противоположную сторону – к аноду. В результате суммарная скорость движения мицелл снижена по сравнению с основным потоком раствора электролита. В случае нейтральных веществ скорость движения компонента, не имеющего электрофоретической подвижности, зависит только от его коэффициента распределения между мицеллой и водной средой. На электрофореграмме сначала появляется пик маркера электроосмотического потока, затем пики аналитов, и в конце – пик маркера мицелл. Время между первым и последним пиком называется окном разделения. На движение заряженных веществ влияют как их коэффициенты распределения между мицеллой и водным буферным раствором, так и их собственная электрофоретическая подвижность.

Движение аналитов и разрешение может быть описано термином «фактор удерживания (k)», представляющим собой отношение молярных долей аналита в мицелле и в подвижной фазе. Для нейтрального вещества k вычисляют по формуле:

где    tR        –   время миграции аналита;

          t0        –   время миграции неудерживаемого вещества;

          tmc      –   время миграции мицеллы;

          K     –   коэффициент распределения аналита;

          VS      –   объем мицеллярной фазы;

          VM   –   объем подвижной фазы.

Разрешение для двух близко движущихся аналитов (RS) рассчитывают по формуле:

где      N         –  число теоретических тарелок для одного из аналитов;

           α         –  селективность разделения;

           ka и kb  –  коэффициенты удерживания обоих аналитов соответственно
(kb > ka).

Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако следует учитывать, что увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения.

Как и в капиллярном зонном электрофорезе, при мицеллярной электрокинетической хроматографии длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение длины капилляра уменьшает электрическое поле, увеличивает время миграции и повышает эффективность разделения. Уменьшение внутреннего диаметра повышает рассеяние тепла и  увеличивает разрешение.

Величина рН среды влияет на электроосмотический поток в немодифицированных капиллярах. Уменьшение рН снижает электроосмотический поток и вследствие этого увеличивает разрешение нейтральных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии за счет увеличения времени анализа.

Для улучшения разделения гидрофобных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии используют органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). При этом необходимо учитывать, что добавление органического модификатора влияет на критическую концентрацию мицеллообразования.

Для разделения с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии энантиомеров в мицеллярную систему включают хиральные селекторы: ковалентно связанные с поверхностно-активным веществом (соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и др.) или вводимые в состав электролита (циклодекстрины).

Для улучшения селективности разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии применяют также вещества, способные изменить взаимодействие аналита с мицеллой путем адсорбции на последней. Этими добавками могут быть второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), ведущее к образованию смешанных мицелл, катионы металлов, которые распределяются в мицелле и образуют координационные комплексы с аналитом, а также ион-парные соединения, которые взаимодействуют с заряженными компонентами пробы и задерживают их, например, тетрабутиламмония бромид.

Капиллярный гельэлектрофорез

В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим в качестве молекулярного сита. При равном отношении заряда к массе более мелкие компоненты движутся в капилляре быстрее, чем более крупные. Капиллярный гель-электрофорез может быть использован для разделения биологических макромолекул по их молекулярной массе. Электроосмотический поток при этом полностью устраняется путем модификации внутренней стенки капилляра.

В капиллярном гель-электрофорезе используются два типа гелей: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, как, например, поперечно-сшитый полиакриламид, поливинилпирролидон, готовятся внутри капилляра посредством полимеризации мономеров. Они обычно связаны с кварцевой стенкой капилляра и не могут быть удалены без его разрушения. При использовании таких гелей для анализа белков в редуцирующих условиях буферный раствор содержит обычно додецилсульфат натрия и образцы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси додецилсульфата натрия с 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. При анализе в нередуцирующих условиях 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол не используют. Разделение в поперечно сшитых гелях оптимизируют модификацией буферного раствора (как указано в разделе «Капиллярный зонный электрофорез») и контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость этих гелей регулируют изменением концентрации акриламида, а также его соотношения со сшивающим реагентом. Уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности аналитов. Из-за неподвижности таких гелей допустимо только электрокинетическое введение пробы.

Динамически модифицированные гели являются гидрофильными полимерами, как, например, линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и т. п., которые могут быть растворены в водных разделительных буферных растворах с образованием разделяющей среды, действующей как молекулярное сито. После приготовления они могут быть введены в капилляр под давлением. Замена геля перед каждой инжекцией улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей увеличивается при использовании полимеров с большей молекулярной массой или уменьшении концентрации полимера. Для выбранного буферного раствора уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности компонентов раствора. Так как растворение этих полимеров в буферном растворе дает растворы с низкой вязкостью, может быть использован гидродинамический или электрокинетический ввод пробы.

Капиллярное изоэлектрическое фокусирование

В изоэлектрическом фокусировании заряженные молекулы движутся под воздействием электрического поля в рН-градиенте, созданном амфолитами с широким диапазоном значений рI, растворенными в буфере разделения.

Тремя основными этапами изоэлектрического фокусирования являются введение пробы, фокусирование и мобилизация.

Этап введения пробы осуществляют в один прием, когда образец смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или под вакуумом, или в несколько приемов, когда в капилляр последовательно вводится ведущий буферный раствор, амфолиты, образец, смешанный с амфолитами, снова амфолиты и, наконец, заключающий буферный раствор. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы не изменять рН-градиент.

На этапе фокусирования амфолиты движутся после приложения напряжения к катоду или аноду согласно их суммарному заряду, создавая, таким образом, рН-градиент от более низкого рН (у анода) к более высокому рН (у катода). Движение каждого аналита продолжается до тех пор, пока он не достигнет рН, соответствующего его изоэлектрической точке (pI).

На этапе мобилизации полосы разделенных компонентов приводятся в движение в сторону детектора благодаря электроосмотическому потоку путем приложения  давления после стадии фокусирования или с помощью добавления солей к флакону у катода или анода.

Достигнутое разделение, выражаемое как  , зависит от градиента , количества амфолитов, имеющих различные значения pI, молекулярного коэффициента диффузии (D), интенсивности электрического поля (E) и вариации электрофоретической подвижности аналита в зависимости от :

Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке разделения, являются:

– Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании используется очень высокое электрическое поле – от 300 до 1000 В/см на этапе фокусирования.

– Капилляр. Электроосмотический поток должен быть уменьшен или полностью подавлен. Для уменьшения электроосмотического потока используют капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.

– Растворы. Анодный флакон заполняется буферным раствором с рН ниже, чем pI наиболее кислого амфолита, а катодный флакон заполняется раствором с рН выше, чем pI наиболее щелочного амфолита. Обычно для анода используется фосфорная кислота, а для катода – натрия гидроксид.

Добавление в раствор амфолита полимера, такого как метилцеллюлоза, ведет к подавлению конвекции и электроосмотического потока при увеличении вязкости. Широкие диапазоны рН используются для оценки изоэлектрической точки, в то время как более узкие диапазоны применяются для улучшения точности.

Осаждение белков в их изоэлектрической точке во время этапа фокусирования предотвращают в случае необходимости с помощью таких буферных добавок, как глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттерионные буферные соли.

Капиллярный изотахофорез

Изотахофорез – это метод разделения, который проводится в режиме поддержания постоянства тока (все разделенные зоны движутся с одной скоростью). При этом должно обеспечиваться постоянное отношение между концентрацией и подвижностью ионов в каждой зоне.

В капиллярном изотахофорезе применяются два буферных раствора, между которыми находятся зоны аналита. Например, для анализа анионов буфер должен быть выбран таким образом, чтобы ведущий электролит содержал анион с фактической подвижностью, превышающей характерную для разделяемых веществ. Аналогично ион завершающего электролита должен иметь меньшую подвижность, чем подвижность разделяемых веществ. В результате разделения ведущий анион движется первым, за ним движется анион с очередной высокой подвижностью и т. д. В капиллярном изотахофорезе индивидуальные анионы мигрируют в дискретных зонах, но все движутся с той же скоростью, что и ведущий анион. Концентрации анализируемых веществ одинаковы в каждой зоне; таким образом, длина каждой зоны пропорциональна количеству отдельного компонента. Зоны менее сконцентрированные, чем ведущий электролит, сужаются, зоны более сконцентрированные – расширяются. Принцип изотахофореза используется для предварительного концентрирования образца перед разделением его компонентов с помощью других методик капиллярного электрофореза.

Обработка результатов

Качественный анализ. К качественным результатам относится определение идентичности компонента пробы внутреннему или внешнему стандартному веществу по времени появления соответствующего пика.

Полуколичественный анализ. Полуколичественным результатом считается определение концентрации компонента пробы по площади или высоте пика при соотношении сигнал/фон от 2:1 до 3:1.

Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:

где:     H     –       высота пика целевого компонента на электрофореграмме раствора сравнения, измеренная от максимума пика до базовой линии сигнала;

h     –       уровень шума на электрофореграмме, полученной после ввода холостой пробы.

Количественный анализ. Количественным результатом является определение концентрации искомого компонента пробы по площади пика при соотношении сигнал/шум больше, чем 3:1.

При количественном анализе образца для компенсации различий во временах миграции от анализа к анализу и для устранения различий в сигналах компонентов образца, обладающих различными временами миграции, площади пиков должны быть нормированы на соответствующие времена миграции. При использовании внутреннего стандарта необходимо убедиться, что ни один пик исследуемого вещества не маскируется пиком внутреннего стандарта.

Абсолютное содержание компонентов рассчитывают по отношению площадей анализируемого пика и пика стандарта. Процентное содержание одного или более компонентов анализируемого образца рассчитывают путем определения процентной доли скорректированных площадей пиков от общей площади всех пиков, за исключением пиков, вызванных растворителями или другими добавленными реактивами (процедура нормализации).

В качестве параметров пригодности системы используются: кажущееся число теоретических тарелок (N), разрешение (Rs), фактор емкости (k’) (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии) и фактор симметричности (As).

Кажущееся число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано эмпирически по формуле:

где    tr         –  время миграции или расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика соответствующего компонента;

         w0,5   –  ширина пика на половине высоты.

 

Разрешение (Rs) между пиками схожей величины двух компонентов вычисляют по формуле:

где    tr,b и tr,a – времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков;

         w0,5,a и w0,5,b – ширина пиков на половине высоты.

Фактор симметричности пика рассчитывают по формуле:

где    w0,05 –  ширина пика на 1/20 от его высоты;

         d      –  расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 от высоты пика.

В качестве параметров пригодности используются также испытания на воспроизводимость площади (стандартное отклонение площади или отношения площади к времени миграции) и воспроизводимость времени миграции (стандартное отклонение времени миграции).

Перечень условий, подлежащих указанию

В фармакопейной статье указывают использование определенного капилляра, буферного раствора, метода предварительной подготовки капилляра, пробоподготовки и условий миграции.

Скачать в PDF ОФС.1.2.1.0022.15 Капиллярный электрофорез

Поделиться ссылкой:

Диагноз по обломкам ДНК- 2 часть — — Статьи

Сравнение пробирок для стабилизации внеклеточной ДНК: 

Streck Cell-Free DNA BCT и Roche Cell-Free DNA Collection Tubes 

Обзор основан на публикации: Sarah Parackal, Donghui Zou, Robert Day, Michael Black, Parry Guilford,  Practical Laboratory Medicine, 16 (2019)

В настоящее время клиническая практика наблюдения за онкологическими больными обычно включает рентгенологическое исследование. Эта процедура имеет существенные недостатки, такие как облучение,  неудобства для пациента и высокие эксплуатационные расходы. 

Наличие циркулирующих в кровеносном русле нуклеиновых кислот позволяет преодолеть эти ключевые недостатки. В настоящее время разрабатываются методы наблюдения за онкологическим процессом, основанные на исследовании внеклеточной ДНК (cfDNA, вкДНК), циркулирующей в кровотоке. 

Феномен циркулирующей внеклеточной ДНК хорошо известен и достаточно изучен: 

• вкДНК представляет собой короткие фрагменты клеточной ДНК (размер 130-180 п.н.), попадающие в кровоток через апоптоз, некроз и активную секрецию;

• вкДНК характерна для более чем 90% здоровых индивидуумов; 

• количество вкДНК существенно возрастает при воспалении, повреждении тканей, физической нагрузке, беременности и т.д.

Апоптоз – генетически запрограммированная (физиологическая) гибель клеток, которая приводит к аккуратной «разборке» и удалению клеток

Некроз — повреждение клеточной мембраны химическими агентами или физическими факторами; поврежденные клетки лизируются; развивается воспалительный процесс

Фрагменты ДНК могут попадать в кровоток, как из нормальных клеток организма, так и опухолевых клеток. Циркулирующая опухолевая ДНК (ctDNA, цоДНК) — это внеклеточная ДНК, которую в кровоток выделяют клетки опухоли. 

В настоящее время цоДНК разрабатывается в качестве клинического инструмента («жидкая биопсия») для диагностики и наблюдения за онкологическими заболеваниями, без необходимости физического проведения биопсии. 

Получение цоДНК происходит посредством обычного взятия крови у пациента. Анализ состоит из  обнаружения и количественного определения мутаций-маркеров с использованием таких методов, как целевое секвенирование следующего поколения (NGS) и методы цифровой ПЦР (ddPCR и BEAMing). Результаты такого анализа в реальном времени представляют молекулярную картину динамики онкологического процесса и реакции опухоли на лечение. 

Многочисленные исследования продемонстрировали обоснованность использования циркулирующей опухолевой ДНК в клиническом диагностическом сценарии, однако ее применение затрудняется отсутствием стандартизированных операционных протоколов.

В частности, преаналитические переменные, такие как сбор образцов, длительность хранение и транспортировка на большие расстояния, оказывают существенное влияние на  целостность циркулирующей ДНК и ее пригодность для последующего тестирования. 

Регулярный анализ цоДНК требует, чтобы серийные образцы крови отбирались у пациентов в пробирки с антикоагулянтом, таким как этилендиаминтетрауксусная кислота калия (K3EDTA). Однако использование только антикоагулянта  K3EDTA для стабилизации образцов крови является существенным препятствием для долговременного сохранения вкДНК после венепункции. 

В выполненных ранее исследованиях было определено, что образцы крови, собранные в пробирки с K3EDTA, должны быть обработаны в течение 24 часов после венепункции, чтобы предотвратить лизис лейкоцитов и высвобождение в плазму геномной ДНК. Срок хранения образцов может быть увеличен за счет их охлаждения (4-6°C), но это значительно увеличивает стоимость доставки. Кроме того, отправка образцов в удаленные лаборатории происходит в условиях постоянного перемешивания и колебаний температуры, что, как известно, значительно увеличивают лизис лейкоцитов. K3EDTA категорически не подходит для длительного хранения образцов (> 24 ч) при комнатной температуре.

Следовательно, специальные пробирки, со стабилизатором внеклеточной ДНК, приобретают особое значение для точного выявления и количественного определения вкДНК в клинических исследованиях.

Коммерчески доступные пробирки для вкДНК соединяют в себе сбор, транспортировку и долгосрочное хранение образцов крови для последующего выделения и анализа вкДНК. Такие пробирки содержат консервационный буфер, который предназначен для стабилизации образца крови и предотвращения лизиса лейкоцитов при колебаниях температуры и перемешивании в течение длительного периода (более 10 дней).

Пробирка Cell-Free DNA BCT (Streck, США) содержит запатентованный буфер, стабилизирующий образцы цельной крови в процессе сбора, транспортировки и хранения, для последующего клинического анализа вкДНК. Образцы крови в пробирках Streck BCT стабильны в течение 14 дней после венепункции, в пределах температур 6-37°C. Обширные валидационные исследования пробирок Streck BCT, в сравнении со стандартными пробирками с K3EDTA, показали значительное снижение выхода геномной ДНК (gДНК) из лейкоцитов в плазму при различных условиях доставки образца. Существует коммерчески доступный похожий продукт — пробирки Roche Cell-Free Collection Tubes (Roche). Пробирки Roche также содержат стабилизирующий буфер, который, как утверждает производитель, предотвращает высвобождение gДНК в течение 7 дней после сбора в различных условиях поставки. 

Чтобы выявить возможные различия в стабильности вкДНК между пробирками Streck Cell-Free DNA BCT и Roche Cell-Free Collection Tubes, был проведен ряд исследований. Сравнивались концентрации вкДНК и уровни ее загрязнения геномной ДНК при хранении пробирок с образцами в  течение 14 дней с момента сбора при комнатной температуре (22°C). Был выбран 14-дневный период хранения, поскольку это максимальный период времени для поддержания стабильности образца, указанный производителем пробирок Streck BCT.

Архитектура исследования

Кровь (~ 8,5–10 мл) брали у здоровых добровольцев венепункцией в пробирки  Streck Cell-Free DNA BCT и Roche Cell-Free Collection Tubes. У одного добровольца кровь была также взята в пробирки K3EDTA BD Vacutainer. Все образцы хранились при температуре 22°С.

Образцы обрабатывали в дни 0, 4, 7, 10 и 14 после сбора. В День 0 образцы обрабатывали в течение 2 часов после взятия крови. Плазму отделяли от эритроцитов центрифугированием. ДНК выделяли из плазмы с использованием набора QIAGEN для циркулирующей нуклеиновой кислоты.

Концентрацию плазменной ДНК измеряли на флуориметре. 

Разделение фрагментов ДНК по размерам выполняли с помощью капиллярного электрофореза. 

Количественное определение фрагментов ДНК длиной 35 — 10380 п.н. проводили по электрофореграмме (флуоресцентные пики). 

Это позволяло визуально различать вкДНК (длиной ~165 п.н.) и загрязнение геномной ДНК. 

Для каждого субъекта были рассчитаны различия в концентрациях вкДНК (Streck минус Roche).

Стабилизация вкДНК в пробирках Streck и K3EDTA

Степень загрязнения образцов геномной ДНК в различные моменты времени выявляли с помощью капиллярного электрофореза. Размер фрагмента ДНК определяли по интенсивности флуоресценции (в единицах измерения FU). Большинство фрагментов вкДНК имеют длину приблизительно 165 п.н., тогда как gДНК состоит из более длинных высокомолекулярных фрагментов около 10 000 п.н. Таким образом, выявлялись образцы с загрязнением gДНК, возрастающим в течение пяти временных периодов.

Электрофореграммы для образцов День 0 и День 14, хранившихся в пробирках Streck и K3EDTA, показаны ниже. Графики дают визуальное представление об уровне вкДНК и начале ее загрязнения геномной ДНК. Пики ДНК количественно определяются между двумя маркерами: нижним (35 п. н.) и верхним (10 380 п. н.). Пик внеклеточной ДНК был идентифицирован между 150 и 200 п. н. Пики геномной ДНК сгруппированы вокруг верхнего маркера. Графики показаны для трех добровольцев. 

1) Пробирки Streck

Электрофореграмма образца Streck в День 0 показывает пик вкДНК 182 п.н. при интенсивности флуоресценции 40 FU (А), два дополнительных пика 375 п.н. и 500 п.н. и фрагменты геномной ДНК от 4000 до 6000 п.н. при 10 FU. На 14-й день  флуоресценция пика вкДНК снизилась до 20 FU (В), геномная ДНК вблизи верхнего маркера имела ту же интенсивность флуоресценции, что и в образце Дня 0. Очевидного лизиса лейкоцитов и массового выхода gДНК не наблюдалось. 

 

2) Пробирки K3EDTA

В пробирке с K3EDTA определяли загрязнение внеклеточной ДНК в результате лизиса лейкоцитов в образцах, не содержащих клеточного стабилизатора. В образце K3EDTA День 0 был выявлен пик вкДНК 181 п.н. с флуоресценцией 18 FU и несколько фрагментов gДНК от 3000 до 8000 п.н. при <10 FU (E). На День 14  значительно увеличилось количество фрагментов ДНК и интенсивность их флуоресценции с наибольшим пиком 9000 п.н. при 2000 FU. Флуоресценция этих длинных фрагментов частично затеняет пик вкДНК (F). 

 

Таким образом, в пробирках с антикоагулянтом K3EDTA, без добавления клеточного стабилизатора, на 14-й день хранения при комнатной температуре содержится значительно больше высокомолекулярных фрагментов геномной ДНК (из-за лизиса лейкоцитов), по сравнению с образцами в пробирках Streck, в которые добавлен клеточный стабилизатор.

Стабилизация вкДНК в пробирках Streck и Roche

Для образцов, собранных в пробирки Streck BCT, не наблюдалось  статистически значимого изменения общей концентрации вкДНК между днями 0 – 4, 0 – 7, 0 – 10 и 0 – 14 (p > 0,05). Для образцов, хранящихся в пробирках Roche, средние концентрации вкДНК достоверно различались между днями 0 – 4, 0 – 7, 0 – 10 и 0 – 14 (p <0,05). Это свидетельствует о загрязнении геномной ДНК образцов Roche в результате лизиса лейкоцитов, начиная с 7-го дня хранения при комнатной температуре (Таблица 1).

Таблица 1
Парный анализ пробирок Streck p-значение
День 0 и 4 0,4
День 0 и 7 0,1
День 0 и 10 1,1
День 0 и 14 1,6
 

p> 0,05

Парный анализ пробирок Roche
День 0 и 4 0,2
День 0 и 7 0,01
День 0 и 10 0,046
День 0 и 14 0,002
 

р <0,05

В более ранних публикациях (Alidousty et al., 2017; Nikolaev et al., 2018) также оценивалось, как влияет продолжительность хранения цельной крови (при 22°С) на обнаружение геномной ДНК в пробирках для вкДНК Streck и Roche.  Для этого в течение 7 дней с момента сбора образца определяли уровни загрязнения плазмы геномной ДНК. Статистически значимой разницы между пробирками Streck и Roche не было обнаружено.

Однако в образцах, хранившихся в пробирках Roche при колеблющихся температурах (22 — 30°С), gДНК обнаруживается, начиная с 5-го дня хранения. В пробирках Streck, при таком же режиме хранения, фрагменты геномной ДНК не выявлялись. 

 

Выводы:

1. Пробирки Streck BCT сохраняли стабильность образца крови в течение 14 дней после сбора, в отличие от пробирок Roche, которые стабилизировали образец только в течение 7 дней. Это согласуется с рекомендациями производителей Streck и Roche, а также с предыдущими исследованиями.

2. Хранение,  транспортировка и обработка образцов в пробирках Roche сверх установленного периода времени в 7 дней приводит  к ложным результатам из-за загрязнения высокими уровнями геномной ДНК. 

3. В образцах из пробирок с K3EDTA  на 14-й день хранения содержится значительно больше высокомолекулярных фрагментов геномной ДНК (из-за лизиса лейкоцитов), по сравнению с образцами, хранящимися в пробирках Streck с клеточным стабилизатором.

 

4. Пробирка Streck Cell-Free DNA BCT представляется наилучшим вариантом для сохранения вкДНК в образцах крови в условиях длительной задержки  между венепункцией и отделением плазмы (>  7 дней). 

Список сокращений

       ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

    вкДНК – внеклеточная ДНК, cfDNA

    цоДНК – циркулирующая опухолевая ДНК, ctDNA

      gДНК – геномная ДНК, gDNA 

      ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота

          FU – единицы флуоресценции

        RBC – эритроциты

       WBC – лейкоциты

        ПЦР – полимеразная цепная реакция, PCR 

    ddPCR – цифровая капельная ПЦР 

        NGS – секвенирование нового поколения

BEAMing – метод, сочетающий эмульсионную цифровую ПЦР и проточную цитометрию

Литература

1. T.P. Copeland, B.L. Franc, High-cost cancer imaging: opportunities for utilization management, J. Canc. Pol. 12 (2017) 16–20.

2. G. Siravegna, et al., Integrating liquid biopsies into the management of cancer, Nat. Rev. Clin. Oncol. 14 (2017) 531.

3. A.R. Thierry, et al., Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology, Cancer Metastasis Rev. 35 (3) (2016) 347–376.

4. H.R. Underhill, et al., Fragment length of circulating tumor DNA, PLoS Genet. 12 (7) (2016), e1006162.

5. S. Jahr, et al., DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells, Cancer Res. 61 (4) (2001) 1659.

6. E. Crowley, et al., Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood, Nat. Rev. Clin. Oncol. 10 (8) (2013) 472–484.

7. A.S. Devonshire, et al., Towards standardisation of cell-free DNA measurement in plasma: controls for extraction efficiency, fragment size bias and quantification, Anal. Bioanal. Chem. 406 (26) (2014) 6499–6512.

8. S. Parpart-Li, et al., The effect of preservative and temperature on the analysis of circulating tumor DNA, Clin. Cancer Res. 23 (10) (2017) 2471–2477.

9. S.E. Norton, et al., A new blood collection device minimizes cellular DNA release during sample storage and shipping when compared to a standard device, J. Clin. Lab. Anal. 27 (4) (2013) 305–311.

10. S.E. Norton, et al., A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR, Clin. Biochem. 46 (15) (2013) 1561–1565.

11. Y. Hu, et al., False-Positive Plasma Genotyping Due to Clonal Hematopoiesis, Clinical Cancer Research, 2018.

12. A.L. Young, et al., Clonal haematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults, Nat. Commun. 7 (2016) 12484.

13. Q. Kang, et al., Comparative analysis of circulating tumor DNA stability in K3EDTA, Streck, and CellSave blood collection tubes, Clin. Biochem. 49 (18) (2016) 1354–1360.

14. P.V. Toro, et al., Comparison of cell stabilizing blood collection tubes for circulating plasma tumor DNA, Clin. Biochem. 48 (15) (2015) 993–998.

15. Roche, Cell Free DNA Collection Tubes, 2018 cited 2018 08/08/18.; Available from: https://sequencing.roche.com/en/products-solutions/by-category/samplecollection/

cell-free-dna-collection-tube.html.

16. R. Dhallan, et al., Methods to increase the percentage of free fetal dna recovered from the maternal circulation, J. Am. Med. Assoc. 291 (9) (2004) 1114–1119.

17. N.J. Panaro, et al., Evaluation of DNA fragment sizing and quantification by the agilent 2100 bioanalyzer, Clin. Chem. 46 (11) (2000) 1851–1853.

18. A.J. Bronkhorst, J. Aucamp, P.J. Pretorius, Cell-free DNA: preanalytical variables, Clin. Chim. Acta 450 (2015) 243–253.

19. M. Jung, et al., Changes in concentration of DNA in serum and plasma during storage of blood samples, Clin. Chem. 49 (6) (2003) 1028.

20. S. Nikolaev, et al., Circulating tumoral DNA: preanalytical validation and quality control in a diagnostic laboratory, Anal. Biochem. 542 (2018) 34–39.

21. C. Alidousty, et al., Comparison of blood collection tubes from three different manufacturers for the collection of cell-free DNA for liquid biopsy mutation testing, J. Mol. Diagn. 19 (5) (2017) 801–804.

22. A.J. Bronkhorst, et al., Characterization of the cell-free DNA released by cultured cancer cells, Biochim. Biophys. Acta 1863 (1) (2016) 157–165.

Основные положения

1. Сравнили две коммерческие пробирки для сбора внеклеточной ДНК: Streck Cell-Free DNA BCT T и Roche Cell Free DNA Collection Tubes.

2. Образцы крови, взятые у здоровых добровольцев в пробирки Streck и Roche, хранились при комнатной температуре в течение 14 дней.

3. Концентрация вкДНК плазмы измерялась в 5 временных точках (День 0, 4, 7, 10 и 14).

4. Загрязнение геномной ДНК определяли с помощью капиллярного электрофореза.

5. Пробирки Streck сохраняли стабильность образца при комнатной температуре в течение 14 дней после сбора, в отличие от пробирок Roche, которые стабилизировали образец только в течение 7 дней.

6. Наилучший вариант контейнера для взятия крови в условиях длительного хранения образцов (> 7 дней) — пробирка Streck Cell-Free DNA BCT.

7. Пробирки Roche подходят для сбора и хранения образцов при комнатной температуре не долее 7 дней.


Вернуться

Электрофореграмма — обзор | Темы ScienceDirect

2.4 Данные

Во время анализа собираются два типа информации: КЭ и МС, которые сохраняются в виде электрофореграммы и масс-спектра соответственно. Эти данные необходимо повторно обработать, чтобы объединить оба типа информации и представить записанные сигналы в трехмерном виде, включая m / z , время миграции и количество / интенсивность сигнала. Это может быть выполнено с использованием самого разного программного обеспечения и инструментов, которые либо имеют открытую лицензию, либо зависят от поставщика.На этом этапе фоновый шум удаляется, а все сигналы, связанные с совместным элюированием, идентифицируются с учетом различных аддуктов (например, [M + H] + , [M + Na] + , [M + K] + ), заряды (например, [M + 2H] 2 + , [M + 3H] 3 + , [M + H + Na] 2 + ), мультимеры ([2 M + H] + , [ 3 M + H] + ), а часто и фрагменты. Затем все эти типы сигналов могут быть либо суммированы, давая одно значение (признак), либо все дополнительные сигналы могут быть проигнорированы, оставив только [M + H] + в качестве основного сигнала.Обе эти стратегии одинаково распространены, и выбранный подход зависит от программного обеспечения и количества сформированных мультисигналов. Это очень важно, особенно для данных КЭ-МС, поскольку присутствие солей вызывает образование множества различных аддуктов и кластеров. Различия в концентрации соли между образцами вызывают различия в количестве и количестве образующихся различных аддуктов. Следовательно, лучший способ оценить количество конкретного соединения в образце — это суммировать все ионы в одно значение.Однако, поскольку поведение разных ионов в источнике может быть разным, некоторые авторы рекомендуют работать только с одним «репрезентативным» сигналом. Точные параметры обработки зависят от условий в источнике (особенно напряжения фрагмента и температуры газа), состава буферной и защитной жидкости (присутствие модификаторов), а также от состава самого образца (особенно pH и наличия солей).

Извлеченные признаки должны быть согласованы, чтобы соответствовать одним и тем же метаболитам в разных образцах.Этот шаг не отличается от других методов разделения, но более сложен в случае CE-MS. Это связано с известным сдвигом времени миграции, который, в зависимости от точных условий и продолжительности партии, может варьироваться от <1 мин до 5 мин и более. Более того, сдвиг по электрофореграмме не одинаков для всех соединений: соединения с более высокой электрофоретической подвижностью имеют тенденцию иметь меньший сдвиг МТ, чем соединения с более медленной электрофоретической подвижностью, особенно близкие к нейтральным молекулам [34].Это требует особого внимания к выравниванию элементов. Это даже более важно, учитывая тот факт, что многие метаболиты с одинаковой моноизотопной массой разделены, и разница в МТ между ними часто находится в пределах окна сдвига МТ (например, бетаин и валин или аланин и саркозин). По этой причине либо (i) коррекция MT (Mass Profiler Professional, Agilent Technologies) должна выполняться до самого выравнивания, либо (ii) визуализация выровненных элементов должна быть доступна для проверки и, в конечном итоге, исправления всех неправильных интеграций и несовпадений (Mass Profiler Professional, Agilent Technologies). Хантер Профайндер, Agilent Technologies).Другим решением проблемы нерегулярного сдвига MT является использование алгоритма с открытым исходным кодом для данных в формате mzXML под названием msalign2, который применяет генетический алгоритм и точки останова кусочной функции. На данный момент наиболее успешной и, следовательно, самой популярной стратегией для данных CE-MS является динамическое искажение времени. Этот алгоритм, с его многочисленными модификациями, имеет тенденцию находить соответствующие сигналы в разных выборках для создания функций деформации; например, алгоритм упорядоченного биективного интерполированного деформирования в платформе XCMS Metabolomic (Scripps Research Institute, Калифорния, США) [35] и функция деформации эталонного пика в MsXelerator [36].Чтобы справиться со всеми вышеупомянутыми ограничениями, многие исследовательские группы разработали свои собственные инструменты, обычно с использованием Matlab или R. Многие исследования были выполнены с использованием Mass Hunter и Mass Profiler Professional (Agilent Technologies), Master Hands (Университет KEIO) или XCMS. (Метаболомическая платформа) и анализ данных. В CE-MS используется много других инструментов, хотя они вносят более незначительный вклад в эту область; такие инструменты включают Analyst, MathDAMP, Mzmine, PeakView, MSXelerator, XCMS Metabolomic Platform и Human Metabolome Technologies [1].

Когда дело доходит до метаболического фенотипирования, больше данных не всегда означает больше информации. Некоторые участки электрофореграммы не содержат полезной или значимой информации. Обычно можно выделить две такие области: первая связана с пиком (относительно широким и с плоской вершиной), содержащим различные солевые кластеры, а вторая — с электроосмотическим потоком. Эта область (пик) может быть более или менее обильной в зависимости от количества нейтральных и отрицательных соединений и может быть исключена из электрофореграммы путем изменения диапазона регистрируемого времени.В качестве альтернативы данные, записанные в этой области, должны быть исключены из анализа данных из-за их низкой надежности, аналогично тому, что происходит с пиком, содержащим кластеры солей.

В настоящее время много внимания уделяется феномену фрагментации в источнике, поскольку небольшие полярные метаболиты очень хрупкие и имеют тенденцию легко распадаться в источнике. Это может быть очень проблематичным, учитывая тот факт, что фрагмент одного метаболита может иметь такую ​​же массу, как и совершенно другое соединение; е.г., m / z 130,086 представляет собой массу пипеколиновой кислоты и наиболее распространенного фрагмента лизина, а m / z 116,071 соответствует как пролину, так и фрагменту орнитина [37]. Поскольку множественные аддукты и мультизаряды уже были учтены в алгоритмах повторной обработки данных, фрагментация по-прежнему требует некоторых систематических решений.

Электрофореграмма для ДНК-тестирования Результаты

Так что же такое электрофореграмма?

Проще говоря, электрофореграмма позволяет визуализировать результаты того, что происходит на этапе анализа ДНК, известном как электрофорез (процесс, позволяющий сортировать молекулы по размеру).Фрагменты ДНК флуоресцентно метят (с использованием флуоресцентных праймеров в ПЦР). Лазер будет считывать количество флуоресценции, когда ДНК проходит мимо него, поэтому вместо того, чтобы видеть полосу на геле, вы видите флуоресцентный пик везде, где есть меченые фрагменты ДНК.

Образец изображения электрофореграммы

Электрофореграмма может быть заказана для следующих тестов:

  • Услуги по анализу ДНК
  • Тестирование на отцовство (доступно для послеродового, но не дородового тестирования)
  • Секвенирование ДНК
  • Тесты на взаимосвязь

Последовательности показаны резкими высокими пиками (как показано на диаграмме) — показания, очевидно, различаются в зависимости от последовательности каждого человека, поэтому электрофореграммы действительно индивидуальны для каждого человека.Пики на графиках представляют аллели в локусах.

При заказе щелкните изображение ниже (образец), чтобы отобразить ваш собственный профиль ДНК .

Щелкните здесь для просмотра изображения электрофореграммы

Я хочу заказать — как мне это сделать?

Заказать эту услугу очень просто! При покупке теста вы можете заказать свою электрофореграмму! Поэтому, когда вы выберете требуемый тест, перейдите на нашу страницу заказа — опция будет доступна, просто отметив ее.К окончательной цене будет добавлена ​​дополнительная плата — ваш заказ автоматически регистрируется и регистрируется в нашей системе.

Стоимость пожалуйста?

Ваша личная электрофореграмма будет стоить вам всего $ 60 за результат теста — это будет включать бумажную копию, которая будет отправлена ​​в виде вложения по электронной почте вместе с вашими результатами. Стоимость электрофореграммы является стандартной и не зависит от типа исследования.

Получу ли я электрофорез после завершения?

Вы можете подать заявление на электрофореграмму, если анализ ДНК проводился EasyDNA — даже после завершения теста.

Если вы уже являетесь нашим клиентом, просто отправьте свое полное имя, ссылку на дело и запрос на [email protected]

Интерпретация данных последовательности Сэнгера

Типичная электрофореграмма одного продукта ПЦР показана ниже. Каждый пик представляет собой один нуклеотид в последовательности ДНК, и каждый нуклеотид имеет свой цвет; A зеленый, T красный, C синий и G черный. от Lee, S.H .; Vigliotti, J.S .; Vigliotti, V.S .; Джонс, В .; Moorcroft, T.A .; Ланцман, К.Секвенирование ДНК для диагностики межсезонной спирохетемии с низкой бактериальной плотностью при инфекциях Borrelia burgdorferi и Borrelia miyamotoi. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 11364-11386. Средний продукт ПЦР содержит 200 нуклеотидов секвенирования, а максимальная длина, которая может быть секвенирована методом Сэнгера, составляет около 600 нуклеотидов. Таким образом, объем данных, генерируемых секвенированием по Сэнгеру для каждого пациента, варьируется в зависимости от размера секвенируемого гена. Секвенирование относительно небольшого гена, такого как HNF1A, генерирует более 2500 нуклеотидов данных секвенирования на пациента, и поскольку мутация может произойти в любом из нуклеотидов в электрофореграмме, каждый нуклеотид требует проверки на наличие мутации.Анализ секвенирования по Сэнгеру выполняется на сравнительной основе, когда электрофореграмма пациента сравнивается с электрофореграммой образца ДНК без мутации. Любые наблюдаемые различия между двумя следами регистрируются и анализируются на предмет их потенциального патогенного воздействия на белок. Исторически это выполнялось путем визуального сравнения каждого пика нуклеотидов на двух графиках, но это занимает много времени, подвержено ошибкам и не может соответствовать требованиям. требования к рабочей нагрузке и качеству современной высокопроизводительной диагностической лаборатории.Сегодня анализ секвенирования выполняется с помощью программного обеспечения, которое может выполнять сравнительный анализ десятков тысяч нуклеотидов за секунды. Программное обеспечение автоматически обнаруживает мутации и предоставляет описание мутации на уровне ДНК и белка с высокой степенью точности и чувствительности. Визуальный осмотр: отнимает много времени и подвержен ошибкам Программный анализ: быстрый и точный Создано Mutation Surveyor v 4.0.6 SoftGenetics, State College PA USA 16803 Каков был результат секвенирования гена Дэна HNF1A по Сэнгеру? Результат работы программы анализа секвенирования можно увидеть на картинке выше.На нем показана последовательность ДНК Дэна с гетерозиготной миссенс-мутацией в экзоне 7 гена HNF1A. Мутация представляет собой замену нуклеотида C на нуклеотид T в одной копии его гена HNF1A (на что указывает наличие пика C и T в положении нуклеотида 1340 в последовательности ДНК Дэна). Это приводит к изменению аминокислоты (с пролина на лейцин) под номером 447 в последовательности белка HNF1A. HNF1A является фактором транскрипции. Его функция — контролировать экспрессию других генов в бета-клетках поджелудочной железы, которые участвуют в производстве и секреции инсулина, включая сам ген инсулина.Факторы транскрипции работают, связываясь с промоторами генов и активируя транскрипцию генов (процесс создания копий мРНК гена, которые будут использоваться для синтеза белка). Промотор — это переключатель, который включает или выключает ген, а фактор транскрипции — это палец, который управляет этим переключателем. Авторские права: Университет Вайкато. Все права защищены. Science Learning Hub Мутация Дэна происходит в домене трансактивации белка HNF1A; область белка, ответственного за щелчок переключателя.Мутантный белок HNF1A способен связываться с промотором, но не может включать экспрессию гена. Это приводит к дефектной экспрессии генов, необходимых для производства и секреции инсулина, что приводит к дефициту инсулина и диабету. Это известная патогенная мутация, и поэтому мы можем быть уверены, что результат подтверждает диагноз HNF1A MODY в Dan.

# 1 для домашнего или юридического теста на отцовство ДНК в Австралии — EasyDNA AU

Электрофореграмма

С EasyDNA Australia теперь вы можете иметь копию своего собственного изображения электрофореграммы.Это уникальный способ представить ваш профиль / уникальный генетический образец. Мы предлагаем изображения электрофореграммы с различными видами предлагаемых нами услуг по тестированию ДНК. Вы получите электрофореграмму с результатами.

Изображение электрофореграммы — это графическое изображение секвенирования вашей ДНК, которое мы получаем во время анализа в нашей лаборатории. Как и ваша ДНК, каждая электрофореграмма уникальна для каждого человека.

Типичная электрофореграмма с EasyDNA может быть получена из этих тестов

  • Генетическое снятие отпечатков пальцев
  • Генеалогическое тестирование (генеалогическое древо)
  • Тесты на отцовство / материнство

Результат электрофореграммы


Электрофореграммы — это тип графика, который представляет относительную флуоресценцию образцов ДНК.То, что вы увидите, очень похоже на графики, используемые для построения сейсмических движений. Разные цвета используются для обозначения размеров разных единиц ДНК. На графиках будут показаны низкие впадины и высокие острые пики.

График построен на флуоресцентных красителях, которые используются во время анализа с использованием процедуры, называемой гель-электрофорезом.

Чтобы увидеть пример изображения электрофореграммы, предоставленной EasyDNA, просто нажмите здесь . Представленное изображение является примером изображения, поскольку изображение электрофореграммы каждого человека может отличаться.

Где я могу купить изображение электрофореграммы?

EasyDNA упростила процедуру заказа, чтобы упростить заказ изображения электрофореграммы. При заказе теста ДНК на нашем веб-сайте с простой навигацией вам просто нужно выбрать дополнительную опцию для покупки изображения электрофореграммы — вы найдете ее на нашей странице заказа. Изображение электрофореграммы будет обработано вместе с вашим тестом и доставлено непосредственно вам. Дополнительная цена за изображение электрофореграммы составляет за результат теста (это фиксированная стоимость, включающая электрофореграмму для всех людей, чья ДНК была проанализирована в тесте).

Все изображения электрофореграммы предоставляются в виде вложений по электронной почте, но также доступны в виде бумажных копий. Печатные копии будут разосланы по электронной почте после получения результатов. Доставка займет несколько рабочих дней.

Я уже заказал. Могу ли я получить электрофореграмму?

Пока ваши тесты ДНК проводились лабораторией EasyDNA, ваша электрофореграмма все еще доступна для покупки. Если ваше тестирование было завершено и вы хотели бы получить дополнительную информацию о том, как приобрести свою уникальную последовательность ДНК на изображении электрофореграммы, просто свяжитесь с нами по электронной почте info @ easydna.com.au.

Если вы делали тест ДНК вместе с нами, и с момента проведения теста прошло 3 месяца, может взиматься плата за повторную активацию.

Электрофореграмма секвенирования ДНК | AffinityDNA США

В соответствии с правилами Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк, мы не можем отправлять товары жителям Нью-Йорка. Все заказы из штата Нью-Йорк будут аннулированы.

Электрофореграмма — это график, на котором отображаются необработанные данные, полученные в результате секвенирования вашей ДНК.Пики на электрофореграмме секвенирования ДНК основаны на длине конкретных фрагментов ДНК и представлены числами в вашем тесте на отцовство или результатах теста на родство. В этой информации замечательно то, что она уникальна для вас и только для вас. Эти необработанные данные позволяют взглянуть на свою генетическую структуру так, как раньше было невозможно.

Мы можем включить электрофореграмму секвенирования ДНК практически в любой тест, который вы заказываете у нас, за небольшую дополнительную плату в размере 60 долларов США.В эту плату входит электрофореграмма для каждого человека, принимающего участие в тесте.

Что делать, если у меня уже есть результаты теста ДНК?

Если вы уже прошли тест ДНК через нашу компанию и получили свои результаты, вы все равно можете заказать электрофореграмму. Если результаты ваших анализов были опубликованы в течение последних 3 месяцев, мы все равно будем иметь вашу информацию в файле и можем очень быстро отправить вам электрофореграмму. Единственная плата, которую вам придется заплатить, — это стандартная дополнительная плата, нет необходимости проводить еще один тест.

Все, что вам нужно сделать, это связаться с нашей службой поддержки клиентов и сообщить номер вашего дела, чтобы подтвердить, что ваши результаты все еще находятся в файле. Если да, то мы можем обработать дополнительный платеж и отправить вам электрофореграмму в течение нескольких дней.

Зачем мне нужна электрофореграмма секвенирования ДНК?

Есть несколько причин, по которым вы можете захотеть получить эти данные. Во-первых, электрофореграмма — это точная копия вашего профиля ДНК, которая была нанесена на карту из предоставленного вами образца.Несмотря на то, что наши тесты очень точны, эту информацию можно передать в другие лаборатории для интерпретации, если вы когда-нибудь захотели узнать второе мнение или вам нужны более быстрые результаты для другого теста.

Поскольку они специфичны для вашей генетической структуры, здесь нет права на ошибку. Это максимально близко к визуализированному изображению вашей ДНК. Помимо того, что это хороший документ для хранения, на него также приятно смотреть. Вы получите представление о своей генетике и узнаете, что делает вас уникальным.

Дело в том, что никогда не повредит получить больше информации, относящейся к вашей генетической структуре. Со временем появится больше методов тестирования для самых разных вещей. Если у вас уже есть эта информация в файле, вам будет проще двигаться вперед и изучать варианты, которые будут доступны и станут доступны вам в ближайшее время.

Заказать электрофореграмму можно быстро и легко, если вы новый клиент. Во время оформления заказа вы увидите опцию, в которой вас спросят, хотите ли вы добавить электрофореграмму к вашему заказу.Просто выберите это поле, и оно будет включено в ваши результаты. Мы с нетерпением ждем вашего ответа и изучения вашей ДНК вместе с вами сейчас и в будущем.
ЗАКАЗАТЬ

Что такое фрагментный анализ? | Thermo Fisher Scientific

Фрагментный анализ — это метод генетического анализа, включающий серию техник, в которых фрагменты ДНК флуоресцентно метят, разделяют с помощью капиллярного электрофореза (КЭ) и определяют размер по сравнению с внутренним стандартом.

Генетические анализаторы

CE способны выполнять как секвенирование по Сэнгеру, так и фрагментный анализ. В отличие от секвенирования по Сэнгеру, анализ фрагментов может предоставить информацию о размерах, относительном количественном анализе и генотипировании с использованием флуоресцентно меченных фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР с использованием праймеров, разработанных для конкретной ДНК-мишени. Эта информация позволяет исследователям обнаруживать различия в аллелях, гомо- и гетерозиготности, химеризме, смесях образцов и наследовании. Фрагментный анализ позволяет использовать самые разные приложения, включая аутентификацию клеточных линий, определение эффективности редактирования генома CRISPR-Cas9, анализ микросателлитных маркеров, генотипирование SNP и многое другое.Фрагментный анализ отличается быстротой выполнения, высокой чувствительностью и разрешением, а также экономичностью.

Дополнительные преимущества фрагментного анализа:

  • Мультиплексирование — аллели перекрывающихся локусов различаются путем мечения локус-специфических праймеров красителями разного цвета; благодаря этой способности фрагментарный анализ позволяет анализировать более 20 локусов за одну реакцию
  • Чувствительность — фрагменты, отличающиеся только одной парой оснований, имеют точный размер
  • Простая подготовка — очистка ДНК не требуется (в отличие от секвенирования)
  • Простой анализ данных — программное обеспечение для генетического анализа упрощает анализ данных
  • Независимый метод — не требует знания последовательности фрагмента
  • Информация об относительном количественном анализе — по результатам измерений пиковой интенсивности
  • Автоматизированные рабочие процессы — возможность обрабатывать тысячи образцов фрагментов ДНК за один день
  • Высокая пропускная способность — может быть достигнута с помощью капиллярных решеток
Видео: Как работает анализ фрагментов?

Рабочий процесс анализа фрагментов

Рабочий процесс анализа фрагментов ДНК состоит из четырех основных этапов: выделение ДНК, амплификация ПЦР, капиллярный электрофорез и анализ данных (рис. 1).

Рисунок 1. Рабочий процесс фрагментного анализа.

Извлечение ДНК — важный первый шаг в экспериментальном рабочем процессе анализа фрагментов ДНК.На общую эффективность, качество и размер продукта ПЦР могут существенно влиять характеристики самого образца и метод, выбранный для экстракции и очистки нуклеиновых кислот. Идеальные методы будут варьироваться в зависимости от источника или типа ткани, от того, как образец был получен из его источника, и как с образцом обращались или хранились до экстракции.

Для выполнения фрагментного анализа в системе CE необходимо сконструировать праймеры, фланкирующие интересующую область. Флуоресцентные красители прикрепляются к праймерам, и фрагменты амплифицируются с помощью ПЦР перед электрофорезом.

Для подготовки к капиллярному электрофорезу необходимо выполнить спектральную калибровку с использованием соответствующего матричного стандарта для выбранной группы красителей на генетическом анализаторе, чтобы точно определить праймеры, меченные красителем. Каждый неизвестный образец смешивают со стандартом размера и формамидом перед проведением электрофореза. Стандарты размера позволяют определять размеры пиков пробы и корректировать вариации впрыска.

Во время капиллярного электрофореза продукты ПЦР электрокинетически вводятся в капилляры, заполненные полимером.Применяется высокое напряжение, так что флуоресцентные фрагменты ДНК разделяются по размеру и обнаруживаются системой лазера / камеры.

Программное обеспечение для анализа данных обеспечивает профиль разделения, точно рассчитывает размеры фрагментов и определяет микросателлитные аллели, присутствующие в образце (рис. 2).

Рисунок 2.Электрофореграмма при фрагментном анализе. Электрофореграмма представляет собой график размеров фрагментов ДНК. Флуоресцентно меченые фрагменты разделяют СЕ и измеряют в соответствии с внутренним стандартом. Пики соответствуют разным цветным красителям, которые все разрешимы и имеют размер по оси абсцисс. Красная линия указывает на сигналы низкого уровня (шум) между пиками.

Подробнее об этапах рабочего процесса фрагментного анализа ›

Фрагментный анализ позволяет использовать множество приложений и методов, в том числе:

  • Аутентификация клеточной линии — многие журналы и финансовые агентства теперь требуют от исследователей удостовериться в подлинности используемых клеточных линий; фрагментный анализ может предоставить простой, недорогой и высокоспецифичный генетический «отпечаток пальца» клеточной линии
  • Определение эффективности редактирования генома CRISPR-Cas9 —в любом эксперименте по редактированию генома процесс репарации не является полностью эффективным или точным; фрагментный анализ может быть использован для скрининга первичных трансформированных культур для определения эффективности редактирования
  • Генотипирование по однонуклеотидному полиморфизму (SNP) — SNP состоят из однонуклеотидных изменений оснований, которые приводят к появлению до четырех различных аллелей в данном локусе и, как было показано, ответственны за генетические признаки, предрасположенность к заболеванию и реакцию к медикаментозной терапии; анализ фрагментов может различать их, когда меченые красителем нуклеотиды используются вместо меченого праймера во время стадии ПЦР
  • Анализ микросателлитных маркеров — микросателлитные маркеры представляют собой кодоминантные полиморфные локусы ДНК, содержащие повторяющиеся нуклеотидные последовательности, обычно от 2 до 7 нуклеотидов на повторяющуюся единицу; количество нуклеотидов в повторяющейся единице одинаково для большинства повторов в пределах отдельного микросателлитного локуса, но количество повторов для конкретного локуса может отличаться, что приводит к аллелям различной длины, которые можно анализировать с помощью фрагментного анализа и используется для идентификации людей (например, в целях сохранения или идентификации человека (HID))

Фрагментный анализ — это мощный исследовательский инструмент, который предоставляет информацию для относительного количественного определения, размеров и генотипирования и позволяет использовать широкий спектр приложений для генетического анализа.

Чтобы узнать больше о приложениях, поддерживаемых CE, см. Статью Какие приложения поддерживает капиллярный электрофорез?

# 1 для домашнего или юридического теста на отцовство ДНК в Сингапуре — EasyDNA

Электрофореграмма

С EasyDNA Singapore теперь вы можете иметь копию своего собственного изображения электрофореграммы. Это уникальный способ представить ваш профиль / уникальный генетический образец. Мы предлагаем изображения электрофореграммы с различными видами предлагаемых нами услуг по тестированию ДНК.Вы получите электрофореграмму с результатами.

Изображение электрофореграммы — это графическое изображение секвенирования вашей ДНК, которое мы получаем во время анализа в нашей лаборатории. Как и ваша ДНК, каждая электрофореграмма уникальна для каждого человека.

Типичная электрофореграмма с EasyDNA может быть получена из этих тестов

  • Генетическое снятие отпечатков пальцев
  • Генеалогическое тестирование (генеалогическое древо)
  • Тесты на отцовство / материнство

Результат электрофореграммы


Электрофореграммы — это тип графика, который представляет относительную флуоресценцию образцов ДНК.То, что вы увидите, очень похоже на графики, используемые для построения сейсмических движений. Разные цвета используются для обозначения размеров разных единиц ДНК. На графиках будут показаны низкие впадины и высокие острые пики.

График построен на флуоресцентных красителях, которые используются во время анализа с использованием процедуры, называемой гель-электрофорезом.

Чтобы увидеть пример изображения электрофореграммы, предоставленной EasyDNA, просто нажмите здесь . Представленное изображение является примером изображения, поскольку изображение электрофореграммы каждого человека может отличаться.

Где я могу купить изображение электрофореграммы?

EasyDNA упростила процедуру заказа, чтобы упростить заказ изображения электрофореграммы. При заказе теста ДНК на нашем веб-сайте с простой навигацией вам просто нужно выбрать дополнительную опцию для покупки изображения электрофореграммы — вы найдете ее на нашей странице заказа. Изображение электрофореграммы будет обработано вместе с вашим тестом и доставлено непосредственно вам. Дополнительная цена за изображение электрофореграммы составляет за результат теста (это фиксированная стоимость, включающая электрофореграмму для всех людей, чья ДНК была проанализирована в тесте).

Все изображения электрофореграммы предоставляются в виде вложений по электронной почте, но также доступны в виде бумажных копий. Печатные копии будут разосланы по электронной почте после получения результатов. Доставка займет несколько рабочих дней.

Я уже заказал. Могу ли я получить электрофореграмму?

Пока ваши тесты ДНК проводились лабораторией EasyDNA, ваша электрофореграмма все еще доступна для покупки. Если ваше тестирование было завершено и вы хотели бы получить дополнительную информацию о том, как приобрести свою уникальную последовательность ДНК на изображении электрофореграммы, просто свяжитесь с нами по электронной почте info @ easydna.sg.

Если вы делали тест ДНК вместе с нами, и с момента проведения теста прошло 3 месяца, может взиматься плата за повторную активацию.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *