Электрофорез что дает: Электрофорез | Детский медицинский центр «ЧудоДети»

Электрофорез. Где пройти лечение электрофорезом в Москве

Электрофорез

Электрофорез – это физиотерапевтическая процедура, обеспечивающая лечебный эффект с помощью сочетания локального воздействия постоянного электрического тока и лекарственных препаратов, вводимых при помощи тока. Под воздействием электрического поля лекарство в виде заряженных частиц (ионов) проникает в кожу через устья сальных и потовых желёз, волосяные фолликулы и межклеточные промежутки. Основная часть введенного лекарства остаётся в области, подвергаемой воздействию, некоторая часть с током крови и лимфы разносится по всему организму.

Электрофорез имеет широкую сферу применения. С помощью электрофореза может вводиться достаточно широкий перечень лекарственных препаратов. Данный вид физиотерапии используется в лечении многих заболеваний. Обычно курс состоит из 10 сеансов электрофореза, проводимых ежедневно или через день. Продолжительность одного сеанса — 10-15 минут.

Если вы ищете, где пройти лечение электрофорезом в Москве, обратитесь в АО «Семейный доктор». Оплатив весь курс процедур сразу, вы получаете скидку на последнюю процедуру. При единовременной оплате 5-ти процедур скидка на последнюю составит 50%, при оплате 7-ми — 70%. При оплате 10-ти процедур электрофореза последняя будет для вас бесплатной

Ниже вы можете уточнить стоимость лечения электрофорезом (цену процедуры), а также выбрать поликлинику, находящуюся в наиболее удобном для вас районе Москвы. 

Уважаемые пациенты!

Обращаем Ваше внимание, что стоимость визита к врачу не всегда совпадает с указанной ценой приёма.

Окончательная стоимость приема может включать стоимость дополнительных услуг.

Необходимость оказания таких услуг определяется врачом в зависимости от медицинских показаний непосредственно во время приёма.

Косметологический центр

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Электрофорез — метод электротерапии, основанный на сочетанном воздействии постоянного тока и лекарственного вещества, вводимого с его помощью. Местом вхождения препарата при прохождении его через кожу являются протоки потовых и сальных желёз, волосяные фолликулы а также межклеточные пространства.

При электрофорезе происходит депонирование препарата в коже. Из кожных депо препарат медленно и постепенно проникает в более глубокие ткани. Депонирование вещества в коже способствует длительному пребыванию его в организме, медленному выведению и пролонгированному действию.

Метод электрофореза даёт возможность ввести лекарственное средство непосредственно в проблемную зону.

В эстетической косметологии достаточно широко используются растворы металлов — цинка, меди, серебра, магния. Кроме лекарственных препаратов могут применяться косметические средства с биологически активными веществами.

При проведении процедуры учитываются ощущения пациента: при наличии боли или сильного жжения сила тока уменьшается. Чувствительность кожи лица к току также отличается в разных зонах: шея и веки обычно более чувствительны. чем щеки и лоб. порог чувствительности индивидуален и может меняться в течение дня.

Продолжительность процедуры бывает различной — от 6 до 25 минут. Курс лечения, как правило, состоит из 10 — 20 сеансов. проводимых ежедневно или через день.

Показания для проведения электрофореза:

— угревые высыпания;

— розовые угри;

— все виды себореи;

— постугревые рубцы;

— постакне;

— розацеа;

— алопеция;

— сухая. увядающая кожа;

— профилактика старения.

Противопоказания к проведению электрофореза:

— острые инфекционные заболевания и лихорадочные состояния;

— злокачественные новообразования;

— наличие имплантированного кардиостимулятора;

— системные заболевания крови;

— декомпенсация сердечно — сосудистых и других соматических заболеваний;

— кровотечения и склонность к кровоточивости;

Клиника Медикс | Физиолечение

Это метод воздействия на ткани волной с частотой 1-3 мегагерца, которые неслышимы человеческим ухом. Волны проникают вглубь биологических тканей узконаправленно на 5-6 см. Лечебное воздействие ультразвуковых волн – механическое, тепловое и физико-химическое. Микровибрация на уровне клеточных структур активизирует функции клеток, ускоряет процессы обмена веществ. Температура тканей повышается лишь на 1-2 °С, что бережно стимулирует биохимические реакции и локальное кровообращение.

Показания: Ультразвуковая терапия уменьшает боль, отёки, воспаление и спазм мышц, ускоряет регенерацию (заживление) тканей, наиболее часто назначается ультразвук в ортопедии, травматологии, хирургии, неврологии, дерматологии. Показаниями для ультразвуковой терапии являются: заболевания крупных и мелких суставов и позвоночника, перенесённые травмы костей, сухожилий и мышц, нарушения лимфо- и кровообращения и многое другое.

Разновидностью ультразвуковой терапии является ультрафонофорез, когда воздействие ультразвуком сочетается с введением лекарственных препаратов, возникает «двойной эффект». Ультразвук способен повышать проницаемость кожи, подкожной клетчатки и соединительной ткани для лекарственных препаратов, происходит своеобразное разрыхление плотных тканей и усиление транспорта межклеточной жидкости и растворенных в них лекарственных препаратов.

Противопоказания ко всем видам электротерапии следующие: злокачественные образования, склонность к кровотечениям, эпилепсия, жечлче- и мочекаменная болезни, общая слабость, высокая температура, непереносимость тока. Электролечение нельзя применять в один день с вакцинацией, УЗИ или рентгенологическим исследованием.

Гальванизация — физиопроцедура, основанная на действии непрерывного постоянного электрического тока малой силы (до 50 мА) и низкого напряжения. Применяется для оказания обезболивающего действия при острых воспалениях, улучшения микроциркуляции, проницаемости сосудистых стенок и обмена веществ. Назначается для лечения неврологических заболеваний у детей (невралгии, невриты), а также хронических воспалительных процессов.

Преимущества: Лекарственная субстанция под действием ультразвука не изменяет свою структуру и фармакологическую активность. Ультразвук и лекарство действуют совместно, усиливая действие друг друга. Лекарственный препарат, введённый с помощью фонофореза, начинает воздействовать на очаг заболевания быстро и действует долго, так как в тканях образуется его депо и эффект сохраняется в течении нескольких недель и даже месяцев. С другой стороны риск побочных эффектов лекарственного препарата меньше, чем при введении с помощью уколов или таблеток. Воздействие ультразвуком практически не имеет побочных реакций, тем не менее, есть ряд противопоказаний, поэтому необходимо обязательно проконсультироваться с врачом.

Специальной подготовки пациента не требуется. Длительность процедур ультразвуковой терапии и ультрафонофореза 10-20 минут, обычно назначается лечебный курс из 7-10 процедур. Процедуры абсолютно безболезненны и хорошо переносятся и детьми, и взрослыми.

ФИЗИОТЕРАПИЯ ДЛЯ КОСМЕТОЛОГИИ | Пансионат имени А.И. Майстренко

1.Лечение контрактур, келоидных, послеоперационных,

послеожоговых рубцов:

-Фонофорез с ферменколом или  контратубексом или карипаин- кремом на область рубца. Контактно, лабильно.0,4-0,6 Вт/см2 ; на область лица 0,2-0,4 Вт/см2, режим непрерывный 15 минут, № 20

-Электрофорез  Карипаина(+) 1 флакон Карипаина разводится в 5–10 мл физиологического раствора непосредственно перед процедурой. В раствор добавляется 2–3 капли Димексида. Раствор наносится на фильтровальную бумагу белого цвета, размещенную на прокладках электрода. Размеры электрода-прокладки 10 х 15 см. Сила тока 3-5 мА,Время 15-20 мин .Курс 20-30 процедур. В течении года 2-3 курса

-Электрофорез Лидазы(+)  64 Ед с кислотным буфером. Раствор наносится на фильтровальную бумагу белого цвета, размещенную на прокладках электрода.  Сила тока 3-5 мА, Время 15-20 мин .Курс 20-30 процедур. В течении года 2-3 курса.

Между курсами рубец смазывается одним из дефиброзирующих средств.

-Лазеротерапия «РИКТА»

Для предупреждения образования рубцов, через 10 дней после снятия швов.

Обработка проводится на дистанции 0,5-1 см. Скорость сканирования 1 см в секунду. Начинать следует с воздействия на окружающие рану “здоровые” участки кожи, постепенно приближаясь к центру раны. Для усиления эффекта лечения лучше дополнительно проводить чрез кожное воздействие на кровь в регионе, максимально приближенном к зоне поражения.

 Требуемое число процедур- до 7-10 на курс, по 1 процедуре в день. После каждой процедуры можно применять традиционные повязки. При неполном заживлении можно провести повторный курс с интервалом в 1 месяц.

2.ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЖИ:

-Дарсонвализация. Методика дистантная лабильная. Грибовидный электрод на расстоянии 1-2 см медленными круговыми движениями перемещают вдоль морщин в направлении ото лба к спинке и крыльям носа и нижней челюсти, огибая угол рта и уплотнения тканей. Используют искровой разряд средней мощности. Продолжительность процедуры 5-12 минут. Ежедневно. По мере привыкания интенсивность и продолжительность увеличивается. Курс 8-12 процедур. Повторный курс можно назначить через месяц.

-Лазеротерапия «Рикта».

 Косметические процедуры в области лица и шеи проводятся сканирующим методом вдоль линий на частоте 50 Гц.

Воздействие в области лица проводится в течение 10 минут, в области шеи 5 минут. Начинать сканирование необходимо с задней поверхности шеи по направлению к плечам и в область лопаток.

Следует обратить внимание на то, что при имеющемся заболевании щитовидной железы процедуры в области шеи противопоказаны.

Необходимо отметить, что все косметические процедуры нужно проводить на чистой, сухой коже до наложения кремов.

Противопоказано одновременное проведение лечения заболеваний волос и кожных покровов лица и шеи, т.к. общее время воздействия в области головы не должно превышать 10 минут.

-Витамин Е— электрофорез на область морщин. Один электрод размером 4х6 см смоченный в 0,5 мл 2% р-ра витамина Е , растворенного в 25% растворе ДМСО, помещают в области морщин на лице и соединяют с анодом (+), катод (-) размещают на заднешейный отдел. Сила тока 1-2 мА. Время 20 минут. Курс до 30 процедур. 2-3 раза в год.

-Лидаза-электрофорез, используют полумаску Бергонье с вырезанной по форме фильтровальной бумагой. Смачивают раствором лидазы (+) (0,1 г на 30 мл дистиллированной воды ,подкисленной до рН 5,0-5,2) помещают на одну половину лица, под бумагу смоченную водой и отжатую прокладку. Сила тока 3-5 мА. Время процедуры 15 минут. На следующий день на другой половине лица. Курс 18-20 процедур.

3.ВЫПАДЕНИЕ ВОЛОС,АЛОПЕЦИЯ:

-Дарсонвализация волосистой части головы, Используют гребешковый электрод, контактно, лабильно от лба к затылку. Мощность малая. Ежедневно или через день. Курс 15-20 процедур.

-Электрофорез кальция хлорида 5% (+) на шейно-воротниковую зону. Катод (-) на поясничной области. Сила тока 3-5 мА, время 15 минут. №10-12 ежедневно.

—ЛАЗЕРОТЕРАПИЯ «Рикта»:

 Лечение проводится сканирующими движениями со скоростью 1 см в секунду с максимальным приближением излучателя к поверхности кожных покровов волосистой части головы (1).

Оптимальным при этом является использование излучателя типа ДУШ-2 (лазерная расческа). На правление движений представлены на рисунке . Все время воздействия в области головы не должно превышать 10 минут. Частота воздействия 1000 Гц.

В качестве дополнительной терапии необходимо проводить неинвазивное воздействие на кровь в области пульсации сонных артерий (2) по 2 минуты с каждой стороны на частоте. Для достижения желаемого эффекта необходимо проведение 3-6 курсов терапии по 15 сеансов в каждом.

-Электрофорез никотиновой кислоты 1% (-) на шейно-воротниковую зону. Анод (+) на поясничной области. Сила тока 3-5 мА, время 15 минут. №10-12 ежедневно.

 4. ПИОДЕРМИЯ,АКНЕ:

Не используют при остром и осложненном течении заболевания.

-КУФ — локальное облучение.С 1 биодозы +1/2 биодозы до 2 биодоз, № 5 через день.

-Лечение акне должно проходить параллельно с Универсальной Реабилитационной Программой (УРП), так как это заболевание чаще является следствием гормональной перестройки.

   После проведения УРП осуществляется местное лечение сканирующим методом над пораженными участками на частоте 50 Гц. Время воздействия: лицо — до 10 минут, грудь — 10 минут, спина — 10 минут. Необходимо проводить от одного до трёх курсов по 10-12 сеансов.

Электрофорез с магнезией

АНМО «Ставропольский краевой клинический консультативно-диагностический центр»:

355017, г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Посмотреть подробнее

Обособленное подразделение «Диагностический центр на Западном обходе»:

355029 г. Ставрополь, ул. Западный обход, 64

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-68-89 (факс)

Посмотреть подробнее

Клиника семейного врача:

355017 г. Ставрополь, пр. К. Маркса, 110 (за ЦУМом)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-50-60 (регистратура)

Посмотреть подробнее

Невинномысский филиал:

357107, г. Невинномысск, ул. Низяева 1

(86554) 95-777, 8-962-400-57-10 (регистратура)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Черкесске :

369000, г. Черкесск, ул. Умара Алиева 31

8(8782) 26-48-02, +7-988-700-81-06 (контактные телефоны)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Элисте :

358000, г. Элиста, ул. Республиканская, 47

8(989) 735-42-07 (контактные телефоны)

Посмотреть подробнее

ЗАО «Краевой клинический диагностический центр»:

355017 г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Савченко, 38 корп. 9:

355021, г. Ставрополь, ул. Савченко, 38, корп. 9

8 (8652) 316-847 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Чехова, 77 :

355000, г. Ставрополь, ул. Чехова, 77

8(8652) 951-943 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Михайловске:

358000, г. Михайловск, ул. Ленина, 201 (в новом жилом районе «Акварель»).

8(988) 099-15-55 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Методика проведения электрофореза в агарозном геле

Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») —метод разделения макромолекул, различающихся по размеру, молекулярной массе, пространственной конфигурацией, вторичной структурой или электрическому заряду. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.

Принцип метода

Молекулы в буферном растворе обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. При пропускании электрического тока через раствор в нем формируется направленное электрическое поле, напряженность которого измеряется разностью потенциалов по концам емкости, в которой производится электрофорез. Под действием поля молекулы начинают движение в направлении катода или анода. Скорость движения зависит от величины заряда, размеров и трения окружающей среды. С течением времени смесь разделяется на фракции, состоящие из молекул, движущихся с одинаковой скоростью. В современных экспериментах рабочий канал приборов для электрофореза заполняют гелем, имеющим структуру сетки. В этом случае основное влияние на подвижность молекул и их степень разделения оказывают их линейные размеры. В некоторых случаях может возникнуть ситуация, при которой особо крупные молекулы не проходят через поры геля.

Методика электрофореза в агарозном геле.

Электрофорез в агарозном геле в различных модификациях широко применяется для разделения молекул нуклеиновых кислот, белков и других макромолекул в биологии и медицине. На водяной бане или в лабораторной печи плавят смесь агарозы, буфера и воды. Затем ее охлаждают до 50-60 °C и заливают в форму. Лунки для нанесения делаются при помощи гребенки. Исследуемый образец наносят в лунку при помощи дозатора. Когда краситель, помещаемый в лунки в начале эксперимента, достигает конца геля, электрофорез останавливают. Затем гель окрашивают красителем, который связывается с исследуемыми молекулами. Интенсивность окраски полос красителя дает представление о концентрации молекул в образце. Кроме концентрации, метод электрофореза позволяет определить относительную молекулярную массу исследуемых молекул, для этого в крайнюю лунку помещают набор маркеров молекулярной массы,  который должен полностью покрывать диапазон молекулярных масс исследуемой системы.

Выбор карсителя и буфера

Бромфеноловый синий и ксиленцианол  — могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. Краситель Cresol red совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV. OrangeG наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV. Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле.

Самое широкое применение агарозные гели имеют в исследованиях, связанные с разделением нуклиновых кислот. Последние имеют довольно значительные отрицательный заряд, величина которого слабо зависиот от pH раствора, вследствие чего разделение на фракции происходит в основном за счет различия в линейных размеров молекул. В таких экспериментах используют 0.089М Трис-боратный, 0.05 Трсфосфатный и Трис-ацетатный буфер. Стоит отметить, что при обычном электрофорезе в геле можно разделять фрагменты нуклеиновых кислот, размер которых менее 50 тыс п.н. Также часто из эксперимента нужно получить оценку размеров молекул. Для этого используются наборы молекул известной длины. Например, для регистрации продуктов  амплификации ДНК применяется электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого эитидия, который образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением длиной волны 290-330 нм.

Капиллярный электрофорез

Капиллярный электрофорез объединяет группу связанных между собой методик
разделения веществ, где используются узкие кварцевые капилляры для разделения сложных смесей.
В зависимости от типа используемого капилляра и буфера, капиллярный электрофорез можно разделить на:

• капиллярный зональный электрофорез
• капиллярный гель-электрофорез
• изоэлектрическая фокусировка в капиллярах и др.

На сегодняшний день данный метод является одним из перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты.

А-Я
A-Z
0-9
ВСЕ

АБВГДЕЁЖЗИЙКЛМНОПРСТУФХЦЧШЩЪЫЬЭЮЯ

ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ

0123456789

Имеется 3 позиций

Электрофорез | Спросите у биолога

Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле позволяет разделять фрагменты ДНК по размеру. Обычно молекула ДНК переваривается рестрикционными ферментами, и электрофорез в агарозном геле используется в качестве диагностического инструмента для визуализации фрагментов. Электрический ток используется для перемещения молекул ДНК через агарозный гель, который представляет собой полисахаридную матрицу, которая функционирует как своего рода сито. Матрица помогает «поймать» молекулы по мере их перемещения электрическим током.

Эта техника имеет множество применений. Вообще говоря, вы можете анализировать фрагменты ДНК, полученные в результате ферментативного переваривания более крупного фрагмента ДНК, чтобы визуализировать фрагменты и определить размеры фрагментов.

Помимо полезности в исследовательских методах, электрофорез в агарозном геле является распространенным методом судебной медицины и используется для снятия отпечатков пальцев ДНК.

А нельзя было просто покрасить?

Бромид этидия представляет собой интеркалирующий краситель, что означает, что он внедряется между основаниями, расположенными в центре спирали ДНК.Одна молекула бромида этидия связывается с одним основанием. Когда каждая молекула красителя связывается с основаниями, спираль разматывается, чтобы принять напряжение от красителя.

Замкнутая кольцевая ДНК ограничена и не может противостоять такому напряжению скручивания, как линейная ДНК, поэтому кольцевая ДНК не может связывать столько красителя, сколько линейная ДНК.

Бромид этидия легко проникает в ваши клетки. ДНК человека линейна и хорошо окрашивается. Это значит, что он может попасть в вашу ДНК и раскрутить ее. Это нехорошо, поэтому будьте осторожны и защищены при использовании бромистого этидия.

Есть также более безопасные и менее токсичные альтернативы, которые вы можете использовать. GelRed и GelGreen — это пятна ДНК, которые не могут проходить через клеточные мембраны, что делает их более безопасными в использовании и утилизации.

Перемещение по матрице

Молекулы фосфата, составляющие основу молекул ДНК, имеют высокий отрицательный заряд. Когда ДНК помещают в поле с электрическим током, эти отрицательно заряженные молекулы ДНК перемещаются к положительному концу поля, которое в данном случае представляет собой гель агарозы, погруженный в буферную ванну.

Гель агарозы представляет собой сшитую матрицу, которая чем-то похожа на трехмерную сетку или экран. Молекулы ДНК притягиваются к положительному концу током, но они сталкиваются с сопротивлением этой агарозной сетки. Более мелкие молекулы могут перемещаться по сетке быстрее, чем более крупные, поэтому они продвигаются дальше по гелю, чем более крупные молекулы. Вот как электрофорез в агарозе разделяет разные молекулы ДНК в зависимости от их размера. Гель окрашивают бромидом этидия, поэтому вы можете визуализировать, как эти молекулы ДНК распадаются на полосы вдоль геля.

Саузерн-блоттинг также можно использовать в качестве метода визуализации агарозных гелей.

Неизвестные образцы ДНК обычно обрабатываются на одном геле с «лестницей». Лестница — это образец ДНК, размер полос которого известен. Итак, после того, как вы закончите свой образец, вы можете сравнить неизвестные фрагменты с фрагментами лестницы и определить приблизительный размер неизвестных полос ДНК по тому, как они соответствуют известным полосам лестницы.

Дополнительные изображения из Викимедиа с помощью Якопо Вертера (аппарат для электрофореза) и Мнольфа (гель-электрофорез)

Двойные полосы в гель-электрофорезе ДНК, вызванные бисинтеркалирующими красителями.

Nucleic Acids Res. 1995 11 июля; 23 (13): 2413–2420.

Кафедра физической химии, Технологический университет Чалмерса, Гетеборг, Швеция.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Сообщается, что многие бисинтеркалирующие красители, используемые для флуоресцентного обнаружения ДНК в электрофорезе, вызывают расщепление и уширение полос, что приводит к плохому разрешению и снижению чувствительности обнаружения. Мы изучили димерный краситель YOYO-1 и, в некоторой степени, также TOTO-1 и EthD-1, и обнаружили, что в комплексе с ДНК эти красители образуют два компонента с различной электрофоретической подвижностью.Эксперименты по электрофорезу и спектроскопические измерения двух компонентов показывают, что они различаются тем, что молекулы ДНК имеют разное количество связанного красителя. Наши результаты исключают, что лишние полосы вызваны межмолекулярным сшиванием. Инкубация образцов в течение увеличенного времени перед электрофорезом заставляет полосы перемещаться все ближе и ближе друг к другу, поскольку молекулы красителя становятся более однородно распределенными среди молекул ДНК. Наконец, две полосы сливаются в одну в промежуточном положении.Этот процесс уравновешивания происходит очень медленно при комнатной температуре (дни) и поэтому не является практическим методом устранения расщепления полос в рутинном анализе. Однако мы обнаружили, что если температура повышается до 50 градусов C, комплексы краситель-ДНК полностью уравновешиваются всего за 2 часа.

Полный текст

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии. Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (1,5 Мбайт) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей.Ссылки на PubMed также доступны для Избранные ссылки .

Изображения в этой статье

Щелкните изображение, чтобы увидеть его в увеличенном виде.

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed. Это может быть не полный список ссылок из этой статьи.

• Wakelin LP. Полифункциональные интеркалирующие агенты ДНК. Med Res Rev. Июль-сентябрь 1986; 6 (3): 275–340. [PubMed] [Google Scholar]
• Wakelin LP, Romanos M, Chen TK, Glaubiger D, Canellakis ES, Waring MJ.Структурные ограничения на бифункциональную интеркаляцию диакридинов в ДНК. Биохимия. 1978, 14 ноября; 17 (23): 5057–5063. [PubMed] [Google Scholar]
• Асса-Мунт Н., Денни В.А., Леупин В., Кернс Д.Р. Исследование связывания бис (акридинов) с d (AT) 5. d (AT) 5 с помощью ЯМР 1H. 1. Режим привязки. Биохимия. 12 марта 1985 г .; 24 (6): 1441–1449. [PubMed] [Google Scholar]
• McFadyen WD, Wakelin LP, Roos IA, Hillcoat BL. Биядерные комплексы платина (II) -терпиридин. Новый класс бифункциональных ДНК-интеркалирующих агентов.Biochem J., 15 сентября 1986 г., 238 (3): 757–763. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Уилсон В.Д., Кил Р.А., Джонс Р.Л., Мошер К.В. Вискозиметрический анализ взаимодействия соединений бисфенантридиния с замкнутой кольцевой суперспиральной и линейной ДНК. Nucleic Acids Res. 10 июля 1982 г.; 10 (13): 4093–4106. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Уоринг MJ, Wakelin LP, Lee JS. Метод распределения растворителей для измерения связывания лекарств с ДНК. Применение к хиноксалиновым антибиотикам эхиномицину и триостину А.Biochim Biophys Acta. 1975, 1 октября; 407 (2): 200–212. [PubMed] [Google Scholar]
• Ван А.Х., Угетто Дж., Куигли Дж. Дж., Хакосима Т., ван дер Марель Г.А., ван Бум Дж. Х., Рич А. Молекулярная структура комплекса ДНК-триостин А. Наука. 1984, 14 сентября; 225 (4667): 1115–1121. [PubMed] [Google Scholar]
• Чжан XL, Патель DJ. Структура раствора комплекса лузопептин-ДНК. Биохимия. 1991, 23 апреля; 30 (16): 4026–4041. [PubMed] [Google Scholar]
• Аддес К.Дж., Синшаймер Дж. С., Фейгон Дж. Структура раствора комплекса между [N-MeCys3, N-MeCys7] TANDEM и [d (GATATC)] 2.Биохимия. 1993 16 марта; 32 (10): 2498–2508. [PubMed] [Google Scholar]
• Гао К., Уильямс Л.Д., Эгли М., Рабинович Д., Чен С.Л., Куигли Дж. Дж., Рич А. Восстановление ДНК, индуцированное лекарствами: рентгеновская структура комплекса ДНК-дитеркалиний. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1991, 15 марта; 88 (6): 2422–2426. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Delepierre M, Milhe C, Namane A, Dinh TH, Roques BP. 1H- и 31P-ЯМР-исследования связывания дитеркалиния с миниспиралями d (GCGC) 2 и d (CCTATAGG) 2: исследование специфичности последовательности.Биополимеры. 1991 15 февраля; 31 (3): 331–353. [PubMed] [Google Scholar]
• Peek ME, Lipscomb LA, Bertrand JA, Gao Q, Roques BP, Garbay-Jaureguiberry C, Williams LD. Искажение ДНК в бисинтеркалированных комплексах. Биохимия. 1994 5 апреля; 33 (13): 3794–3800. [PubMed] [Google Scholar]
• Geierstanger BH, Mrksich M, Dervan PB, Wemmer DE. Дизайн G.C-специфичного пептида, связывающегося с малой бороздкой ДНК. Наука. 1994 28 октября; 266 (5185): 646–650. [PubMed] [Google Scholar]
• Бенсон С.К., Мэтис Р.А., Глейзер А.Н.Гетеродимерные ДНК-связывающие красители, предназначенные для передачи энергии: стабильность и применение комплексов ДНК. Nucleic Acids Res. 1993, 11 декабря; 21 (24): 5720–5726. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rye HS, Yue S, Wemmer DE, Quesada MA, Haugland RP, Mathies RA, Glazer AN. Стабильные флуоресцентные комплексы двухцепочечной ДНК с бисинтеркалирующими асимметричными цианиновыми красителями: свойства и применение. Nucleic Acids Res. 11 июня 1992 г .; 20 (11): 2803–2812. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rye HS, Yue S, Quesada MA, Haugland RP, Mathies RA, Glazer AN.Детектирование по пикограмме стабильных комплексов интеркаляции краситель-ДНК с помощью двухцветного сканера конфокальной флуоресценции с возбуждением от лазера. Методы Энзимол. 1993; 217: 414–431. [PubMed] [Google Scholar]
• Олер Л.Д., Золло М., Мэнсфилд Е.С., Роуз Е.А. Использование чувствительного флуоресцентного интеркалирующего красителя для обнаружения продуктов ПЦР с низким числом копий и высокой молекулярной массой. Методы ПЦР Прил. 1993 Октябрь; 3 (2): 115–119. [PubMed] [Google Scholar]
• Hirons GT, Fawcett JJ, Crissman HA. TOTO и YOYO: новые очень яркие флуорохромы для анализа содержания ДНК методом проточной цитометрии.Цитометрия. 1994, 1 февраля; 15 (2): 129–140. [PubMed] [Google Scholar]
• Огура М., Мицухаши М. Метод скрининга большого количества продуктов полимеразной цепной реакции путем измерения флуоресценции YOYO-1 на 96-луночных полипропиленовых планшетах. Анальная биохимия. 1994 1 мая; 218 (2): 458–459. [PubMed] [Google Scholar]
• Auzanneau I, Barreau C, Salomé L. Получение изображений с помощью флуоресцентной видеомикроскопии отдельных одноцепочечных молекул ДНК в растворе. C R Acad Sci III. 1993. 316 (5): 459–462. [PubMed] [Google Scholar]
• Perkins TT, Smith DE, Chu S.Прямое наблюдение за трубчатым движением одиночной полимерной цепи. Наука. 1994 6 мая; 264 (5160): 819–822. [PubMed] [Google Scholar]
• Perkins TT, Quake SR, Smith DE, Chu S. Расслабление одиночной молекулы ДНК, наблюдаемое с помощью оптической микроскопии. Наука. 1994 6 мая; 264 (5160): 822–826. [PubMed] [Google Scholar]
• Глейзер А.Н., Рай Х.С. Стабильные комплексы интеркаляции краситель-ДНК в качестве реагентов для высокочувствительной флуоресцентной детекции. Природа. 1992 29 октября; 359 (6398): 859–861. [PubMed] [Google Scholar]
• Ким Й., Моррис, Мэриленд.Разделение нуклеиновых кислот капиллярным электрофорезом в растворах целлюлозы с моно- и бисинтеркалирующими красителями. Anal Chem. 1994, 1 апреля; 66 (7): 1168–1174. [PubMed] [Google Scholar]
• Чжу Х., Кларк С.М., Бенсон С.К., Рай Х.С., Глейзер А.Н., Мэтис Р.А. Высокочувствительный капиллярный электрофорез двухцепочечных фрагментов ДНК с использованием мономерных и димерных флуоресцентных интеркалирующих красителей. Anal Chem. 1 июля 1994 г .; 66 (13): 1941–1948. [PubMed] [Google Scholar]
• Попа Л.М., Винтер С., Лёбер Г. Некоторые новые свойства гомодимерных комплексов ДНК-YOYO-3, выявленные с помощью электрофореза и измерений времени жизни флуоресценции.Biochem Mol Biol Int. 1994 декабрь; 34 (6): 1189–1196. [PubMed] [Google Scholar]
• Nielsen PE, Zhen WP, Henriksen U, Buchardt O. Взаимодействие олигоакридинов с ДНК под влиянием последовательности, обнаруженное с помощью замедленной электрофоретической миграции геля. Биохимия. 12 января 1988 г.; 27 (1): 67–73. [PubMed] [Google Scholar]
• Риз HR. Влияние заряда и длины ДНК на электрофоретическую подвижность интеркалированной ДНК. Биополимеры. 1994 Октябрь; 34 (10): 1349–1358. [PubMed] [Google Scholar]
• Crater GD, Gregg MR, Holzwarth G.Поверхности подвижности для гель-электрофореза линейной ДНК с инверсией поля. Электрофорез. 1989 Май-июнь; 10 (5-6): 310–315. [PubMed] [Google Scholar]
• Stellwagen NC. Влияние электрического поля на кажущуюся подвижность крупных фрагментов ДНК в агарозных гелях. Биополимеры. 1985 декабрь; 24 (12): 2243–2255. [PubMed] [Google Scholar]
• Хуанг СН, Мирабелли К.К., Монг С., Крук ST. Межмолекулярное сшивание ДНК посредством бифункциональной интеркаляции противоопухолевого антибиотика лузопептина А (BBM-928A).Cancer Res. 1983 июн; 43 (6): 2718–2724. [PubMed] [Google Scholar]
• Глейзер А.Н., Пек К., Мэтис Р.А. Стабильный двухцепочечный гомодимерный комплекс ДНК-этидий: применение для определения флуоресценции ДНК в агарозных гелях с использованием пикограмм. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1990 May; 87 (10): 3851–3855. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Уоринг MJ. Комплексообразование между бромидом этидия и нуклеиновыми кислотами. J Mol Biol. 1965 августа; 13 (1): 269–282. [PubMed] [Google Scholar]
• Канеллакис Е.С., Шоу Ю.Х., Ханнерс В.Е., Шварц Р.А.Диакридины: бифункциональные интеркаляторы. I. Химия, физическая химия и ростовые свойства. Biochim Biophys Acta. 1976 5 февраля; 418 (3): 277–289. [PubMed] [Google Scholar]
• Аннан Н.К., Кук П.Р., Маллинс С.Т., Лоу Г. Доказательства поперечного сшивания ДНК бисинтеркаляторами с жесткими и удлиненными линкерами получены путем связывания узлов и катенации. Nucleic Acids Res. 1992 11 марта; 20 (5): 983–990. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wright RG, Wakelin LP, Fieldes A, Acheson RM, Waring MJ.Влияние кольцевых заместителей и линкерных цепей на бифункциональную интеркаляцию диакридинов в дезоксирибонуклеиновую кислоту. Биохимия. 1980, 9 декабря; 19 (25): 5825–5836. [PubMed] [Google Scholar]
• Гауген Б., Барбет Дж., Капелле Н., Рокес Б.П., Ле Пек Дж. Б. Бифункциональные интеркаляторы ДНК. 2. Флуоресцентные свойства и ДНК-связывающее взаимодействие гомодимера этидия и гетеродимера этидия акридина. Биохимия. 1978, 28 ноября; 17 (24): 5078–5088. [PubMed] [Google Scholar]
• Брэдли Д.Ф., Вольф М.К.АГРЕГАЦИЯ КРАСИТЕЛЕЙ, СВЯЗАННЫХ С ПОЛИАНИОНАМИ. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1959 июл; 45 (7): 944–952. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rye HS, Quesada MA, Peck K, Mathies RA, Glazer AN. Высокочувствительное двухцветное обнаружение двухцепочечной ДНК с помощью конфокального флуоресцентного гелевого сканера с использованием гомодимера этидия и тиазолового оранжевого. Nucleic Acids Res. 1991 25 января; 19 (2): 327–333. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Статьи из исследования нуклеиновых кислот любезно предоставлены Oxford University Press

Гель-электрофорез | Пути с течением времени

Гели агарозы обеспечивают простой метод анализа препаратов ДНК.Молекулы ДНК имеют одинаковое соотношение заряд / масса, что придает аналогичные электрофоретические свойства линейным молекулам ДНК различной длины. Мы будем использовать термин «молекула» для обозначения линейного фрагмента ДНК, но имейте в виду, что одна «молекула» ДНК может содержать последовательности нескольких генов или частей генов.

Гели агарозы представляют собой пористые матрицы
Несколько факторов влияют на миграцию ДНК через гели агарозы
Флуоресцентные интеркалирующие агенты используются для визуализации молекул ДНК в гелях
Стандарты используются для оценки размеров молекул ДНК

Гели агарозы представляют собой пористые матрицы

Агароза — это полисахарид, очищенный от красных водорослей или морских водорослей.Агароза более очищенная (и значительно более дорогая!), Чем агар, который получают из тех же морских водорослей. Молекулы агарозы представляют собой длинные линейные полимеры повторяющегося дисахарида D-галактозы и 3,6-ангидро-α-L-галактопиранозы (справа). Типичная молекула агарозы содержит более ста субъединиц. Агароза, используемая для электрофореза, была высокоочищенной. В процессе очистки удаляются примеси, которые могут мешать работе ферментов, используемых при молекулярном клонировании, такие как эндонуклеазы рестрикции 90–160.В процессе также генерируется препарат агарозы с желаемыми электрофоретическими свойствами и минимальной фоновой флуоресценцией, что важно для визуализации молекул ДНК.

Молекулы агарозы способны образовывать гели с относительно определенными размерами пор из-за химических свойств молекул агарозы. Агароза демонстрирует гистерезис — ее температура плавления выше, чем температура гелеобразования. Молекулы агарозы растворяются при температуре около 90 ° C, образуя беспорядочные клубки в растворе. Гели образуются при понижении температуры примерно до 40 ° C.По мере образования геля молекулы агарозы сначала собираются в спиральные волокна, которые затем объединяются, образуя сети суперспиральных спиралей, стабилизированных водородными связями. Размер пор, который обычно составляет от 50 до 200 нм, зависит от концентрации агарозы. По мере увеличения концентрации агарозы средний диаметр поры уменьшается.

Несколько факторов влияют на миграцию ДНК через агарозные гели

Из-за отрицательного заряда фосфатных остатков в основной цепи ДНК молекулы ДНК движутся к положительному полюсу (аноду) аппарата для электрофореза.Фактическая скорость миграции молекул ДНК в конкретном эксперименте зависит от множества факторов. Некоторые из этих факторов присущи молекулам ДНК, в то время как другие факторы относятся к электрофоретическим условиям. Внутренние факторы включают длину и конформацию анализируемых молекул ДНК. В пределах определенного диапазона размеров, определяемого условиями геля, скорость миграции линейных молекул ДНК обратно пропорциональна log ₁₀ (количество пар оснований).Миграция более структурированных молекул ДНК, таких как суперспиральные плазмиды, гораздо менее предсказуема. Скорость миграции этих более структурированных ДНК зависит от плотности спиралей, наличия зазубрин и других структурных особенностей.

На скорость миграции молекул ДНК в агарозных гелях также влияет состав геля. Скорость миграции молекулы ДНК снижается по мере увеличения концентрации агарозы в геле. Исследователи обычно регулируют концентрацию агарозы, чтобы оптимизировать разрешение молекул ДНК в пределах определенного диапазона размеров.Два буфера, обычно используемые в лабораториях, TAE (трис: ацетат: EDTA) и TBE (трис: борат: EDTA), также влияют на скорость электрофореза.

Из-за этой присущей изменчивости исследователи ВСЕГДА включают ряд стандартов ДНК с известными размерами в тот же гель, что и анализируемые образцы. Важно отметить, что эти стандарты должны иметь аналогичную структуру (например, линейную или суперспиральную) и подвергаться тем же химическим модификациям, что и анализируемые образцы ДНК.

Флуоресцентные интеркалирующие агенты используются для визуализации молекул ДНК в гелях

Нуклеиновые кислоты визуализируются флуоресцентными красителями, которые прочно связываются с ДНК.Красители представляют собой интеркалирующие агенты, которые вставляются в спираль ДНК и в структурированные области одноцепочечных нуклеиновых кислот. Флуоресценция этих красителей увеличивается на порядок, когда они связывают нуклеиновые кислоты, поэтому фоновая флуоресценция на агарозных гелях обычно низкая. В этом классе мы будем использовать бромид этидия (EtBr) для визуализации фрагментов ДНК. EtBr поглощает свет в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне и излучает оранжевый свет. Гели просматривают с помощью специальных трансиллюминаторов, содержащих УФ-свет.EtBr — это светочувствительное соединение, поэтому запасы хранятся в темноте.

Стандарты используются для оценки размеров молекул ДНК

На рисунке справа показана полоса от окрашенного EtBr 1% агарозного геля, содержащего стандарты размера ДНК. Лестница размером 1 кб, показанная в этом студенческом геле, представляет собой запатентованную смесь линейных фрагментов ДНК размером от 0,5 до 10 килобаз (кб). Интенсивность окрашивания полос на агарозных гелях отражает количество ДНК в полосе, поскольку EtBr интеркалирует довольно равномерно по длине линейных молекул ДНК.Как вы можете видеть, эта конкретная смесь содержит одинаковые количества каждого фрагмента ДНК, за исключением фрагмента размером 3 т.п.н., который имеет на ~ 2,5 больше ДНК, чем другие фрагменты. Более высокая интенсивность фрагмента размером 3 т.п.н. служит полезным маркером ориентации в ситуациях, когда более мелкие фрагменты могли выходить за пределы геля или когда некоторые маркеры плохо отделяются друг от друга. (Это обычное явление!)

Обратите внимание, что самые короткие молекулы на геле лучше отделены друг от друга, чем более длинные молекулы.Продукты ПЦР, которые вы будете анализировать в этой лаборатории, в основном находятся в диапазоне 400–1000 пар оснований. Чтобы увеличить разрешение этих молекул, мы будем использовать 1,25% гели агарозы. (Это снизит разрешение более крупных молекул ДНК). Также обратите внимание, что меньшие полосы кажутся более размытыми на окрашенном геле, потому что на них больше влияет случайная диффузия, поскольку они мигрируют через сеть полимеров агарозы.

К началу

Обзор электрофореза в геле

| Science Primer

Электрофорез — это движение заряженных частиц в электрическом поле.Поскольку сахарно-фосфатная основа ДНК ^* имеет отрицательный заряд, можно использовать электрофорез, чтобы протянуть ДНК через электрическое поле к положительному электроду цепи. Молекулярные биологи использовали это поведение для разработки методов разделения, очистки и анализа фрагментов ДНК. Существует огромное количество вариантов гель-электрофореза, включая SDS-PAGE, секвенирование ДНК, 2D-гель-электрофорез, DGGE и многие другие. Детали каждого из этих методов различаются, но все они используют тот факт, что заряженные частицы, такие как ДНК, мигрируют, когда их помещают в электрическое поле.И что направление миграции зависит от заряда частицы.

На этой иллюстрации показаны различные компоненты установки для гель-электрофореза и описаны этапы, необходимые для подготовки геля и образцов ДНК для анализа с использованием этого метода.

Щелкните объекты и шаги, чтобы перейти к процессу настройки гель-электрофореза:

Гель
В основе техники лежит гель.Это матрица, которая содержит поры, через которые ДНК вытягивается при приложении электрического тока. Без геля вся ДНК попала бы прямо на положительный электрод (называемый анодом). Размер пор определяет скорость движения ДНК. Чем меньше поры, тем медленнее движется ДНК. Длина фрагментов ДНК влияет на скорость их прохождения через гель. Более длинные фрагменты движутся медленнее.

Для электрофореза используется ряд различных матриц.Агароза — одна из самых распространенных. Гели агарозы нетоксичны, относительно недороги и просты в приготовлении. Чем выше концентрация ^* агарозы в геле, тем меньше поры. Относительно высокая концентрация 1% агарозы используется для разделения небольших фрагментов ДНК, в то время как более низкие концентрации используются для разделения больших фрагментов. Для более сложной работы или для отделения более крупных фрагментов ДНК можно использовать полиакриламид. Полиакриламид обеспечивает более высокое разрешение по сравнению с агарозой и может использоваться в более разнообразных условиях, но имеет недостаток в том, что он токсичен.

Лунки
Лунки — это небольшие углубления, которые образуются в геле при его изготовлении. Лунки равномерно расположены вдоль стороны геля, ближайшей к отрицательному электроду. Равномерный, линейный интервал между лунками обеспечивает одинаковую начальную позицию для образцов. Лунки также позволяют помещать образцы в гель, так что при приложении тока образцы протягиваются через середину геля, а не через верх.

Рабочий буфер ^*
Раствор используется для проведения электрического тока через гель и помогает поддерживать постоянную среду во время бега.Решение называется работающим буфером. Буферизация необходима для поддержания постоянного pH и обеспечения ионов в растворе, чтобы облегчить прохождение электричества. Тепло генерируется при приложении тока к гелю, рабочий буфер также помогает сохранять гель в холодном состоянии. Это особенно важно для гелей агарозы, потому что они плавятся, если становятся слишком горячими.

Коробка для геля
Коробка для геля — это контейнер, в котором хранится гель, погруженный в рабочий буфер. Он спроектирован таким образом, что при подаче тока через электроды, прикрепленные к коробке, ток протекает через гель, создавая электрическое поле, необходимое для того, чтобы подтолкнуть отрицательно заряженные молекулы ДНК к положительному электроду.

Электропитание и источник питания
Сила, необходимая для протягивания ДНК через гель, обеспечивается электричеством. Источник питания берет стандартное электричество переменного тока, доступное из стенной розетки, и преобразует его в односторонний постоянный ток, необходимый для создания электрического поля через гель. Источники питания также предоставляют механизм для контроля количества и силы (силы тока и напряжения), находящихся в поле. Чем ниже напряжение, тем медленнее будет мигрировать ДНК.

По прошествии достаточного времени вся ДНК в образце в конечном итоге дойдет до конца геля и попадет в окружающий буфер. Это делает продолжительность включения тока важным параметром. Большинство источников питания имеют таймер для включения питания через заданный интервал.

Образец и подготовка образцов
С помощью методов гель-электрофореза анализируют различные материалы. Для целей этого обсуждения мы предполагаем, что образцы представляют собой линейные цепи двухцепочечной ДНК.В этом случае основным фактором, влияющим на миграцию цепей ДНК, является их длина. Другими типами материалов, которые обычно наносят на гели, являются ДНК-плазмиды, РНК и белки.

Загрузочный краситель ^*
Загрузочный краситель представляет собой цветной буфер, смешанный с ДНК перед нанесением на гель. Загрузочный краситель содержит относительно высокую концентрацию глицерина или сахарозы. Это делает раствор более плотным, чем окружающий рабочий буфер, так что, когда образец помещается пипеткой поверх лунки, он опускается в лунку.Он также содержит небольшое количество красителя (обычно бромфенолового синего). Окрашивание образца обеспечивает быстрое подтверждение того, что образцы погрузились в лунки, и позволяет легко отслеживать, какие лунки уже были загружены.

В диапазоне pH, в котором гели забуферены, бромфеноловый синий имеет отрицательный заряд, поэтому он мигрирует в том же направлении, что и ДНК. Это дает дополнительное преимущество в виде визуальной индикации прогресса миграции ДНК. Это чрезвычайно полезно, потому что сама ДНК не видна во время работы геля.Визуализация ДНК после прогона геля требует отдельного шага, который включает окрашивание геля чем-то, что связывается с ДНК, делая его видимым.

Стандарты ДНК
Из-за множества факторов, влияющих на скорость миграции ДНК через гель, оценка точной длины полосы в геле должна производиться относительно положения других полос в том же геле. Стандарт (также часто называемый «лестницей ДНК») помещается в одну из лунок. Сравнивая перемещение фрагментов известной длины в стандарте с фрагментами в образцах, можно сделать точную оценку длины цепей ДНК в образцах.Стандарт обрабатывают так же, как и образцы: смешивают с загрузочным красителем и добавляют в одну из лунок геля.

При наличии всех вышеперечисленных материалов для создания геля необходимо выполнить следующие действия:

1. Подготовьте контейнер с гелем, добавив достаточное количество рабочего буфера, чтобы гель полностью погрузился в него после того, как он будет помещен в контейнер с гелем. Буфер не нужно заменять каждый раз при запуске нового геля, но процесс электрофореза действительно разрушает буфер, поэтому рекомендуется его часто заменять.
2. Поместите гель в контейнер для геля, убедившись, что гель полностью погружен в буфер, а лунки правильно ориентированы (ближе всего к отрицательному, обычно черному, электроду).
3. Добавьте загрузочный краситель к образцам и стандартам.
4. Внесите пипеткой небольшой объем образца / стандарта ( ^* ) в каждую лунку.
5. Подключите электроды источника питания к любому концу коробки с гелем.

Гель готов к работе.

Многие факторы влияют на миграцию заряженных частиц в электрическом поле.Для того, чтобы гель-электрофорез ДНК работал как способ последовательного разделения полимеров ДНК в зависимости от их длины, условия изменяются таким образом, чтобы создать как можно более постоянную среду. Факторы, влияющие на миграцию, включают ионный состав и pH рабочего буфера; температура геля; напряжение, приложенное к гелю, и пористость гелевой матрицы. Контролируя все эти другие факторы, можно использовать гель-электрофорез для разделения цепей ДНК в зависимости от их длины.

В то время как тип геля, предварительная и постобработка, а также факторы, влияющие на направление и скорость миграции, варьируются от приложения к применению, твердое понимание основного электрофореза в агарозном геле линейных цепей ДНК, описанного выше, обеспечивает основу для понимания другого электрофореза методы могут быть построены.

Проверьте свое понимание этого материала с помощью этих концептуальных вопросов.

Обзор видео

Связанное содержимое

• Иллюстрации
• Наборы задач

Горизонтальный электрофорез | ЛСР | Bio-Rad

Гелевые коробки доступны в различных размерах для удовлетворения различных потребностей.Мини-форматы обычно используются для быстрого разделения и небольшого количества образцов; большие форматы идеальны для полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), саузерн-блоттинга и скрининга образцов ПЦР. Компания Bio-Rad предлагает несколько вариантов гелевых коробок, называемых субячеечными системами, для различных областей применения.

Многие пользователи наносят собственные гели; Фактически, гели можно заливать либо непосредственно в коробку для геля, используя гелевую кастрюлю, либо в УФ-лоток, на котором отверстия закрываются липкой лентой. Для упрощения заливки геля доступен большой выбор инструментов, включая гребни с разным количеством лунок и разной толщиной лунок, или УФ-лотки разного размера и литейщики для геля.

Для удобства многие пользователи покупают готовые гели, которые доступны в различных размерах и процентном содержании геля и готовятся либо с буфером трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ), либо с трис-боратным ЭДТА (ТВЭ) буфером. Для вашего удобства компания Bio-Rad предлагает множество готовых гелей и гелей ReadyAgarose.

Субъячейка Bio-Rad ^® Руководство по выбору системы

* Mini ReadySub-Cell GT — это Mini-Sub-Cell GT, предназначенный для использования готовых гелей ReadyAgarose, размер геля 7 x 10 см; производительность выборки составляет 8, 12 или 2 x 8.Эта ячейка не включает литниковые ворота, лоток или гребни.
** Wide mini ReadySub-Cell GT — это широкая Mini-Sub cell GT, предназначенная для работы с готовыми гелями ReadyAgarose, размер геля 15 x 10 см; пропускная способность образца составляет 20, 32, 2 x 32 или 4 x 26. Эта ячейка не включает литейные ворота, лоток или гребни.
*** Значение пропускной способности образца предполагает 1-2 гребня на гель.
† Пропускная способность образца предполагает 1–4 гребня на гель.

Оптимальный диапазон разрешения гелей ReadyAgarose

* С 3% гелем ReadyAgarose проще обращаться, и он дает те же характеристики, что и стандартный 4% гель.

Ручное литье агарозных гелей
Ручное литье предлагает варианты для различных размеров гелей. Доступны два аксессуара для гелей для ручного литья в пределах семейства ячеек для электрофореза Sub-Cell. Ролики для геля позволяют разместить несколько лотков с УФ-прозрачным (UVTP) гелем разного размера и доступны для всей линейки продуктов Sub-Cell. Литые ворота обеспечивают удобство литья непосредственно в ячейках электрофореза и доступны в одном определенном размере для каждой ячейки (см. Руководство по литью ниже).

Направляющая для литья

Варианты ручного литья для различных размеров геля .Два аксессуара доступны для ручного литья с семейством электрофорезных ячеек Sub-Cell: литейщики для геля и литниковые ворота. Ролики для геля позволяют разместить несколько лотков для геля разного размера. Они доступны для всей линейки систем Sub-Cell. Литые ворота, доступные в определенных размерах для каждой ячейки, предлагают удобство литья непосредственно в ячейках Sub-Cell.

Буфер для электрофореза проводит электрический ток через камеру для электрофореза; Наиболее часто используемые буферы для электрофореза ДНК — это ТАЕ или ТВЕ.Полные рецепты см. В таблице ниже.

Линейная двухцепочечная ДНК быстрее разделяется в буфере TAE; однако этот буфер имеет более низкую буферную емкость, чем TBE, потому что борат в буфере TBE действует как ингибитор фермента и может отрицательно повлиять на последующие приложения. Следовательно, TAE является предпочтительным буфером, если ДНК будет использоваться для клонирования или лигирования.

Руководство по выбору буфера для электрофореза

Руководство по выбору буфера для блоттинга

* Эти буферы можно использовать для всех типов и составов гелей.

Доступны различные порошки агарозы.При выборе типа агарозы наиболее важным фактором, который следует учитывать, является размер разделяемых фрагментов. Кроме того, учет процентного содержания агарозы в геле может лучше разрешить интересующие фрагменты и произвести гель, который даст изображение качества публикации. Гели с более высоким процентом разрешают более мелкие фрагменты ДНК, тогда как гели с более низким процентом разрешают более крупные фрагменты. Каждый тип агарозы в линейке продуктов сертифицированной агарозы Bio-Rad проходит тестирование на генетическое качество (GQT) и может использоваться для рутинного разделения и последующих задач молекулярной биологии.

Нуклеиновые кислоты Пятна и отслеживающие красители
Молекулы нуклеиновых кислот бесцветны, и для отслеживания их движения в геле обычно используется отслеживающий краситель, такой как бромфеноловый синий или ксилолцианол.После электрофореза окрашивают нуклеиновые кислоты. Чаще всего используется флуоресцентный краситель бромистого этидия, но доступны и другие красители. После окрашивания гель визуализируется с помощью тепловизора.

Стандартные разделения
Агароза, сертифицированная для молекулярной биологии, рекомендуется в качестве агарозы общего назначения для рутинного разделения фрагментов ДНК от ~ 500 до 20 т.п.н. Эта агароза обеспечивает высокую скорость миграции, гели, с которыми легко манипулировать, и демонстрирует высокую прочность даже при низком процентном содержании агарозы.

Влияние процентного содержания геля на оптимальное разрешение фрагментов ДНК

Разделение мелких фрагментов
Для разделения мелких фрагментов с высоким разрешением, таких как амплифицированные фрагменты ПЦР, рекомендуется сертифицированная агароза для ПЦР.Эта агароза разделяет фрагменты ДНК размером от 20 до 1000 пар оснований. Стандартная температура гелеобразования облегчает приготовление, а гели легко манипулировать и остаются гибкими даже при высоком процентном содержании геля. Эта агароза предлагает более высокое разрешение мелких фрагментов, чем сертифицированная агароза для молекулярной биологии.

Влияние процентного содержания геля на оптимальное разрешение фрагментов

Разделение очень маленьких фрагментов
Для разделения очень маленьких фрагментов ПЦР и праймеров (~ 10–200 п.н.) рекомендуется сертифицированная ультраагароза низкого диапазона. Эта агароза обеспечивает исключительно более высокое разрешение, чем стандартные гели при более низких концентрациях, позволяя визуализировать различия ~ 5 п.н. в диапазоне 10–100 п.н.В этом низком диапазоне ультраагароза низкого диапазона обеспечивает более высокое разрешение, чем агароза ПЦР.

Влияние процентного содержания геля на оптимальное разрешение фрагментов

Применение с низким содержанием плавления для фрагментов <1000 п.н.
Для таких приложений, как клонирование, нанесение в гель или выделение фрагментов ДНК и РНК, рекомендуется сертифицированная ПЦР-агароза с низкой температурой плавления.Эта агароза обладает высокой просеивающей способностью и обеспечивает отличное разрешение фрагментов <1000 пар оснований в легкоплавких приложениях.

Влияние процентного содержания геля на оптимальное разрешение фрагментов

Низкоплавкие применения для фрагментов> 1000 пар оснований
Для разделения молекул размером более 1000 пар оснований для разделения с помощью фиксированного гомогенного электрического поля (CHEF), извлечения большего фрагмента или запечатывания полосок IPG в 2-D SDS- Гели PAGE, рекомендуется сертифицированная легкоплавкая агароза.

Влияние процентного содержания геля на оптимальное разрешение фрагментов

Разделение большой ДНК для гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE)
Для аналитического разделения больших фрагментов ДНК, требующих PFGE, рекомендуется использовать сертифицированную агарозу в импульсном поле, а оптимальный диапазон разделения от 1 кб до 2 МБ доступен как предустановленный, выбираемый метод системы CHEF Mapper XA.Эту агарозу также можно использовать для блоттинга.

Более высокая скорость миграции для CHEF и FIGE
Для приложений CHEF, PFGE, разделения мегабазной ДНК или другого анализа больших фрагментов рекомендуется сертифицированная мегабазная агароза из-за ее высокого предела исключения, высокой электрофоретической подвижности и очень высокой прочности геля. Гели просты в обращении даже при 0,3%, имеют короткое время работы и имеют диапазон разделения от 1 кб до 5 МБ.

Сертифицированная мегабазная агароза имеет превосходную электрофоретическую подвижность, более быструю скорость миграции, более быстрое время работы и лучшее разделение мегабазных фрагментов, чем агароза, сертифицированная импульсным полем.

Электрофорез гемоглобина

Электрофорез гемоглобина

Использование белка
Электрофорез для обнаружения аллозима
вариация:
Гемоглобин А против
С

Замена
мутации, которые приводят к
в
замена одной аминокислоты другой другой
электрические
обвинять
может привести к незначительным изменениям в общих расходах
белок.Эти
аллельные варианты (в ДНК) приводят к вариантам белков, называемым аллозимами , которые
отличаться
немного в электрическом заряде. Протеин
электрофорез [слева] используется для обнаружения аллозима
вариация. Ткань
экстракты вводятся
в
твердая опорная среда (гель)
в лунках для образцов на
в
Происхождение на правой стороне геля. Электрическое поле
применяется: многие белки имеют чистый отрицательный заряд и будут
мигрировать из
Происхождение у катода («черный»
знак равно
«отрицательный») конец к
анодный («красный» = «положительный») конец
поле.В
положение белковых продуктов определяется либо непосредственно
к
окрашивание, или
сопряженные ферментативные реакции.

В случае серпа
Гемоглобин клетки [справа], замена
отрицательно заряженный Glu в
стандартный HbA
бета-глобин нейтральным Валом в
HbS приводит к
белок с
немного уменьшился отрицательный заряд.В гомозиготных
люди, тетрамер HbA
электрофорезы
как единая «быстрая» группа, и
тетрамер HbS как
сингл «медленный»
группа.
Гемоглобин из гетерозиготного
индивидуальный
(с обоими аллелями)
включает обе формы
из
тетрамер, и поэтому проходит как две полосы.

Таким образом, гель будет «забит» (сверху вниз).
Нижний)
как FS, SS и FF, указывая на присутствие
S&A, S,
и гемоглобин,
соответственно.[Обратите внимание, что SS
индивидуальный
серповидно-клеточный
анемия,
тогда как гетерозигота AS
является
говорят, что проявляет серповидно-клеточную черту].

Домашнее задание:
Критикуйте следующее
заявление: «Электрофорез
гемоглобина показывает два аллеля, F
и S,
для гена Hb «.

Назначение для электрофореза в геле

1 Задание для электрофореза в геле

1

Благодаря сочетанию того, что вы узнали из справочной информации и экспериментов 1 и 2, вы сможете ответить на эти вопросы.Если у вас возникли проблемы, вернитесь к урокам и попробуйте снова. Если вы все еще не понимаете тему, либо свяжитесь с одним из людей на главной странице, либо попытайтесь найти реального человека, который может вам помочь (например, инструктора или ТА) !!

Что мы собираемся сделать сейчас, так это дать вам некоторые экспериментальные результаты и позволить вам их интерпретировать, так что давайте сразу приступим. Вы выполнили рестрикционное расщепление и электрофорез в агарозном геле очищенной плазмиды, используя 3 различных рестрикционных фермента и гель. показано ниже.К сожалению, вы забыли промаркировать свои пробирки или вести надлежащие записи, и единственное, что вы можете вспомнить об эксперименте, это то, что ваши стандарты находятся на дорожке 5, а ваш неразрезанный контроль — на дорожке 1, и что вы загрузили примерно такое же количество ДНК в дорожках для образцов (1–4). Эй, по крайней мере, ты это запомнил!

1. Без какой-либо другой информации и без математических расчетов, насколько приблизительно велика ваша исходная плазмида?

• 35 кб
• 15,5 кб
• 6.5 кб
• 5.0 кб
• 3.0 кб

Ответ

2. Сколько раз фермент, использованный на дорожке 2, переваривал плазмиду? Кажутся ли данные разумными? Какое вероятное количество пар оснований распознает этот фермент?

Отвечать

3. Когда ДНК выглядит как беспорядочная непрерывная полоса, как в нижней части дорожки 3, а не в виде независимых дискретных полос, эффект известен как размытие. Каковы возможные объяснения смазывания дорожки 3? У вас должно получиться как минимум два.

Отвечать

4. Сколько раз фермент, использованный в дорожке 4, переваривал плазмиду? Кажутся ли данные разумными?

Отвечать

Ответы на вопросы

1. Без какой-либо другой информации и без математических расчетов, каков примерный размер вашей исходной плазмиды? 6.5 кб. Помните, что неразрезанная ДНК может быть представлена ​​в трех формах, и самая медленная из них — линейная. Разрезанный только один раз и, следовательно, без удаления какой-либо ДНК, линейный фрагмент на неразрезанной дорожке должен приблизительно соответствовать размеру плазмиды.Поскольку он мигрирует около стандартной дорожки размером 6,56 т.п.н. (также является линейным фрагментом ДНК), он, вероятно, будет примерно такого же размера.

Вернуться к вопросу 1

2. Сколько раз фермент, использованный в дорожке 2, переваривал плазмиду? Кажутся ли данные разумными? Какое вероятное количество пар оснований распознает этот фермент? Фермент переваривает плазмиду в двух местах. Перед перевариванием важно подумать о состоянии ДНК. ДНК, использованная в этом эксперименте, была плазмидой, а плазмиды — кольцевыми.Если разрезать круг один раз, получится один линейный фрагмент. Вы должны разрезать его второй раз, чтобы получить 2 линейных фрагмента, как на дорожке 2. Данные кажутся разумными, потому что если вы сложите приблизительные размеры результирующих фрагментов (примерно 4 кб и 2,5 кб), вы получите исходный размер 6,5. кб. Наконец, вероятно, что используемый фермент распознает последовательность из 6 оснований. Если вы помните, фрезы с шестью резцами в среднем разрезают каждые 4096 баз. Однако это всего лишь среднее значение, поэтому в этом случае, когда у нас есть кусок ДНК длиной 6500 п.н., разрезание дважды будет очень разумным.

Вернуться к вопросу 2

3. Каковы возможные объяснения размытия, обнаруженного на дорожке 3? В общих чертах, размытие — это когда у вас есть много полос, достаточно близких по размеру, чтобы вы не могли различить соседние полосы (т. Е. Без разрешения). У начинающих молекулярных биологов наиболее вероятной причиной размазывания является заражение какой-то случайной нуклеазой, которая разложила ДНК на десятки, сотни или даже тысячи маленьких кусочков.Другая начальная ошибка — использование неправильного буфера, неправильной температуры или неправильных условий. Любое из них или все это может привести к плохому поведению фермента, в том числе разрезать вашу ДНК на множестве случайных участков. Однако по мере того, как вы проводите все больше и больше подобных экспериментов, личные ошибки становятся менее серьезной проблемой, и вам нужно начать думать с точки зрения науки. Если этот эксперимент был проведен без существенной ошибки, вероятное объяснение состоит в том, что использовался резак с четырьмя базами. Сокращение в среднем один раз на каждые 256 баз в 6.Плазмида размером 5 т.п.н. дает примерно 25 фрагментов, все меньше оригинала. Маловероятно, что можно было бы увидеть 25 отдельных фрагментов такого маленького размера, и, вероятно, можно было бы обнаружить размытый узор.

Вернуться к вопросу 3

4. Сколько раз фермент, использованный в дорожке 4, переваривал плазмиду? Кажутся ли данные разумными? Если вы сказали дважды, вы правы, но давайте посмотрим, были ли вы правы по правильным причинам. В вопросе 2 было указано, что для получения двух фрагментов из кольцевого фрагмента ДНК необходимо два разреза.Все идет нормально. Также было упомянуто, что общий размер полученных фрагментов ДНК должен в сумме равняться исходному размеру. Ой, они этого не делают, не так ли? Глядя на гель, вы видите одну полосу размером примерно 6,5 кб и одну большую полосу размером примерно 3 кб. 6,5 + 3 = 6,5? Не в этом классе.

Наука не лжет, просто иногда ее трудно интерпретировать. Так что сломайте это. Есть ли что-нибудь значимое в 6.5 кб? Да, это размер исходной плазмиды. Это, плюс тот факт, что есть полоса в неразрезанном контроле (дорожка 1), которая мигрирует в то же положение, должно предполагать, что не вся ваша ДНК была переварена (обычное явление).