Электрофорез что: Лекарственный электрофорез

Содержание

Электрофорез в санатории «Виктория»



Электрофорезом называется процедура введения лекарственных препаратов в кожу или слизистые оболочки с помощью электрического поля – безболезненно и без инъекций. В поверхностных тканях они частично депонируются, и из нее поступают в общий кровоток, оказывая необходимые эффекты.


Кроме действий, обусловленных воздействием вводимых препаратов, электрофорез производит сосудорасширяющий и обезболивающий эффекты, улучшает метаболизм клеток, уменьшает степень воспаления, стимулирует выработку биоактивных веществ, уменьшает выраженность отеков. Под влиянием электрического поля препарат можно ввести в кожу и создать в ней депо, откуда лекарство будет расходоваться постепенно, обеспечивая пролонгированность действия и исключая разрушение действующего вещества секретами желез. Медицинские средства можно вводить непосредственно в область воспаления, уменьшая их воздействие на организм.


Показания к электрофорезу:

  • неврастения;
  • мигрень;
  • невроз;
  • стенокардия;
  • гипертоническая болезнь;
  • синуситы;
  • бронхиты;
  • бронхиальная астма;
  • атеросклероз сосудов;
  • остеоартроз;
  • рубцы;
  • спаечная болезнь;
  • гидросальпинкс;
  • эрозия шейки матки;
  • себорея;
  • ювенильный ревматоидный артрит;
  • гастрит;
  • панкреатит;
  • холецистит;
  • воспалительные заболевания мочеполовой системы;
  • воспалительные патологии глаз, кожи, полости рта.


Противопоказан электрофорез при сердечной недостаточности, психических нарушениях, тяжелом состоянии, болезни Бехтерева, недавно перенесенном инсульте, наличии кардиостимулятора, тяжелом течении астмы, нарушении свертываемости, непереносимости электрического тока.

Адрес санатория:
Россия, Ставропольский край, г. Кисловодск, ул. Кирова, д.12
Отдел реализации путевок (г. Кисловодск):
Тел: 8 (800) 250-60-63

e-mail: [email protected]

Посмотреть на карте

лечение в санатории «Березовый гай»

Для лечения заболеваний ЦНС и ПНС, хронических воспалений, ряда заболеваний сердечно-сосудистой системы, суставов, нарушений функциональной работы органов пищеварения успешно применяются различные методы физиотерапии. Это электрозвуковая терапия, дарсонвализация, лазерная терапия, криотерапия и множество других методов. Одной из наиболее популярных и действенных процедур считается электрофорез. Что представляет собой этот метод физиотерапии?

Электрофорез имеет и другие название: ионотерапия, ионофорез, гальваноионотерапия. Этот вид лечения основан на введении в организм пациента различных лекарственных средств в виде ионов с помощью постоянного тока низкого напряжения и силы (гальванизации). Особенностью такого метода как раз и является воздействие на организм 2-х факторов: гальванического тока и лекарств. Так результат от введения медицинских препаратов достигается гораздо быстрее.

Лекарства во время процедуры электрофореза поступают в организм по большей части через выводные протоки потовых и сальных желез.

Преимущества введения лекарств с помощью электрофореза

Процедура электрофореза имеет значительные преимущества перед традиционными способами принятия лекарственных средств: в виде инъекций, таблеток или капсул:

  • самая высокая концентрация препарата образуется именно в очаге поражения;
  • можно вводить несколько различных препаратов одновременно с разных полюсов;
  • так как лекарство поступает в организм в виде ионов, повышается его фармакологическая активность;
  • во время процедуры не нарушаются кожные покровы, поэтому нет нужды в стерилизации;
  • отсутствуют побочные эффекты от препаратов, в отличие от других способов их введения;
  • нет раздражения слизистой ЖКТ, так как препараты вводят конкретно в очаг поражения.
  • Проведение процедуры электрофореза

    На кожу под электродами кладутся смоченные водой тканевые прокладки. Делается это для того, чтобы избежать негативного влияния высокой физико-химической активности ионов, под воздействием электролиза ставших атомами.

    Длительность одного сеанса электрофореза составляет 15-30 минут, проводятся они через день, иногда реже, и только по рекомендации врача ежедневно. Продолжительность курса также определяется лечащим врачом либо врачом-физиотерапевтом и обычно составляет 10-30 процедур.

    Электроды нельзя накладывать на места порезов, царапин, ожогов и ран, либо нужно изолировать поврежденный участок, смазав его вазелином. Нормальной реакцией на процедуру электрофореза является покраснение участка, на котором была аппликация, его зуд и жжение, которые быстро проходят.

    Показания к электрофорезу

    Наилучший эффект электрофорез дает в сочетании с некоторыми другими физиотерапевтическими процедурами (в зависимости от заболевания). Это ультразвук, светолечение, магнитотерапия и другие.

    Основные показания к прохождению курса электрофореза:

  • воспалительные процессы и спайки в органах малого таза;
  • заболевания позвоночника и суставов;
  • мигрень, невроз и другие неврологические заболевания;
  • гипертония и гипотония;
  • рубцы и ожоги;
  • заболевания опорно-двигательного аппарата.
  • Противопоказания к электрофорезу

    Однако есть ряд случаев, когда от процедуры придется отказаться:

  • индивидуальная непереносимость тока;
  • злокачественные опухоли;
  • острые сердечно-сосудистые и гнойно-воспалительные заболевания;
  • склонность к кровотечениям и другие.
  • Эффект от курса электрофореза

    Если специалист определил, что вам показана процедура электрофореза, то после прохождения курса (и даже после нескольких процедур) вы почувствуете, что электрофорез оказывает на организм следующие эффекты, каждый из которых зависит от доминирующего электрода (анода или катода). Отрицательный электрод — катод — способствует:

  • нормализации обмена веществ;
  • расширению сосудов;
  • расслаблению;
  • улучшению метаболизма.
  • Положительный электрод — анод — способствует:

  • уменьшению воспалений;
  • выводу жидкостей из тканей;
  • обезболиванию.
  • Электрофорез как действенный физиотерапевтический метод зарекомендовал себя не только в медицине, но и в косметологии.

    Комфортное лечение в санатории «Березовый гай»

    Каждому из нас, даже человеку с богатырским здоровьем, необходимо время от времени давать своему телу, мозгу и душе полноценный отдых. Санаторий «Березовый гай» предоставляет вам возможность как избавиться от различных недугов (с помощью методов диагностики наши специалисты определят комплекс необходимых процедур), так и просто восстановить силы после трудовых будней. Проживание в комфортных номерах, живописная природа вокруг и чистый воздух — улучшение сна, настроения и состояния организма гарантировано!

    Электрофорез в ЦМРТ Великий Новгород

    Диагностика

    Вовремя выявленная неврология увеличивает шансы на полное выздоровление
    и избавление от симптомов. В качестве диагностики специалисты используют УЗИ, нейросонографию,
    электроэнцефалографию, компьютерную томографию, дуплексное сканирование шеи и сосудов головного
    мозга, МРТ, полисомнографию и другие.

    МРТ — магнитно-резонансная томография

    Исследует изменения в структурах внутренних и наружных органов человека. МРТ
    используют для…

    Чек-ап — комплексное обследование организма

    Исследует изменения в структурах внутренних и наружных органов человека. МРТ
    используют для…

    Второе мнение

    Услуга второе мнение
    подразумевает расшифровку
    результатов МРТ и КТ от лица
    квалифицированного специалиста.

    Электрофорез. Гальванизация

    Одними из распространенных физиотерапевтических процедур являются гальванизация и лекарственный электрофорез. Гальванизация — это воздействие на организм в лечебных целях постоянного тока низкого напряжения. В результате в тканях происходят сложные биохимические процессы, имеющие терапевтический эффект стимулируется лимфо- и кровообращение, улучшается обмен веществ, проявляется болеутоляющее действие.

    Аппарат электротерапии ПОТОК-1 используется для профилактического и лечебного воздействия постоянным током на организм человека, а также для проведения лекарственного электрофореза. Особенностью методов гальванизации и электрофореза, применяемых в приборе ПОТОК-1, является большая лечебная эффективность, безболезненность процедур, возможность сочетания с другими методами лечебного воздействия. «Поток-1» — один из самых известных аппаратов гальванации и электрофореза в нашей стране. Качество работы на аппарате «Поток-1» оценили миллионы врачей.

    Самой популярной формой гальванизации является лекарственный электрофорез, сочетающий в себе воздействие тока и вводимого с его помощью лекарственных препаратов.

    Медицинский центр «Исида» проводит лечение грыж межпозвонковых дисков методом электрофореза с ферментным препаратом «Карипаин». Суть метода в том, что препарат вводится в ткани под воздействием постоянных токов, и именно благодаря этому достигается лучшее проникновение.

    Методика лечения папаиносодержащими препаратами применяется в медицинской практике более 10 лет.

    «Карипаин» — это ферментный препарат растительного происхождения, в его состав входят биологически активные вещества (папаин, лизоцим и др.), которые положительно влияют на коллагеновые хрящевые ткани. Из этих тканей состоят межпозвонковые диски и, соответственно, грыжа. В определенной концентрации «Карипаин», введенный методом электрофореза влияет на саму грыжу, она начинает постепенно уменьшаться, становится мягкой.

    Этого бывает достаточно, чтобы освободить нервное окончание, которое она защемляет, и боли в позвоночнике постепенно проходят.

    «Карипаин» также действует на весь межпозвонковый диск. Он становится более эластичным, «упругим», увеличивает высоту. Препарат усиливает регенерацию тканей диска, который восстанавливает свою нормальную форму и свою функцию амортизатора. Вводимый «Карипаин» воздействует на несколько соседних межпозвонковых дисков, восстанавливая целый отдел позвоночника.

    Электрофорез в современном диагностическом процессе

    Электрофорез в современном диагностическом процессе

    Профессор Н.А. Сергеева.

    Кафедра факультетской хирургии Российский государственный медицинский Университет, г. Москва

    Современная диагностика в любой области медицины основана на высоком уровне технического обеспечения исследований, включаемых в сложный цикл клинического обследования.

    В настоящее время к клиническим лабораториям все настойчивее предъявляются требования проведения наиболее информативных и экономичных исследований. Аналитические методы, основанные на предложенном Тиселиусом в 1937 году (11) принципе электрофореза представляют все увеличивающуюся область диагностических исследований, проводимых в клинических лабораториях. Однако, из-за недостаточной осведомленности врачей о современных возможностях данного метода его значимость в диагностическом процессе еще не полностью оценена.

    Тиселиус за разработку метода электрофоретического разделения макромолекул был удостоен Нобелевской премии в 1948 году. Принципиальной основой всех электрофоретических методов является тот факт, что находящиеся в растворе молекулы, располагающие электрическим зарядом, под действием сил электрического поля смещаются в сторону противоположно заряженного электрода.

    Скорость миграции вещества в среде с одной и той же силой электрического поля, зависит от размера частиц и их электрического заряда. В случае белковых молекул, благодаря их амфотерным свойствам, направление и скорость смещения во многом зависит от рН среды, в которой происходит миграция (3). Заряд различных белков в растворах с одинаковым рН зависит от аминокислотного состава, так как диссоциация белковых цепей приводит к образованию групп, имеющих положительный или отрицательный заряд. Под влиянием сил электрического поля компоненты разгоняемой системы распределяются согласно их заряду, приобретая соответствующую скорость движения, т.е. происходит электрофоретическое разделение. Внедрение электрофоретических «носителей» привело к улучшению технологий и одновременно к упрощению фракционирования. В качестве «носителей» используются фильтровальная бумага, целлюлоза, ацетат целлюлозы, различные гели (полиакриламид), агароза и др. При этом во время элекрофореза, наряду с разделением частиц согласно их зарядам, вступает в силу так называемый «молекулярно ситовой эффект», когда гелевая структура ведет себя по отношению к ионам как фильтр. Ионы, превышающие ее пористость не проходят или проходят очень медленно, а более мелкие ионы быстрее проникают через поры медиума. Таким образом, скорость передвижения зависит не только от заряда иона, но и от величины пор геля, формы пор, величины движущихся ионов, взаимодействия между матрицей геля и движущимися ионами (адсорбция и др.)

    Электрофорез как биохимический метод — очень мощное приспособление для оценки широкого спектра жизненных процессов.

    Наибольшая популярность до настоящего времени принадлежит электрофорезу белков как одному из наиболее информативных лабораторных тестов, используемых в настоящее время (4). Он предполагает огромную диагностическую информацию, особенно когда исследование дополняется такими высокоспецифичными тестами как иммуноэлектрофорез, количественной оценкой иммуноглобулинов и других специфических протеинов, Т- и В-лимфоцитов и стадий трансформации лимфобластов.

    Электрофоретическое разделение протеинов позволяет изучать их биологические и физические характеристики, являясь индикатором заболеваний печени и почек, иммунной системы, злокачественной патологии, острых и хронических инфекций, генетических поломок, заболеваний центральной нервной системы и многих других видов патологии. Используя ацетат целлюлозу, можно разделить сывороточные белки на 5 фракций: альбумин и 4 глобулиновых группы

    — альфа 1, альфа 2, бета (часто подразделяются на 2 различные группы

    — бета 1 и бета 2) и гамма (7) (рис.1).

    Рис.1 Нормальная электрофореграмма сывороточных протеинов

    Альбумин — низкомолекулярный сывороточный белок (м.в. около 70000 дальтон), образующий комплексы с многими протеинами, гормонами, билиарными пигментами, кальцием и другими субстанциями, играет ключевую роль в поддержании осмотического давления.

    Все 4 группы глобулинов характеризуются гораздо более высоким молекулярным весом, чем альбумин. Альфа- и бета-глобулины также являются транспортными формами протеинов, образуя комплексы с пигментами, металлами, углеводами и липидами. Эти белки очень гетерогенны, разброс их молекулярного веса от 40000 до 1000000 дальтон. Гамма глобулины, или иммуноноглобулины характеризуются молекулярным весом от 15000 дальтон до более чем 1000000 дальтон (для IgM).

    Синтезируемые В-лимфоцитами антитела в виде JgG, JgA и JgE представляют собой один из компонентов иммунной защиты организма, которая включает кроме того Т-клеточный иммунитет, фагоцитоз и систему комплемента. Нарушение одного из компонентов иммунной системы приводит к изменению защиты организма и клинически выявляется как одна из форм иммунодефицитного состояния. Выявления и идентификация нозологических форм иммунодефицитных состояний — актуальнейшая проблема клинической медицины. Одним их наиболее информативных методов первичной диагностики иммунодефицитов является электрофоретическая протеинограмма сыворотки крови.

    В последние годы все большую диагностическую значимость приобретает электрофорез высокого разрешения протеинов, который позволяет выделить около 15 фракций белков. Число фракций зависит от среды, на которой происходит разгонка, и техники окрашивания. Наряду с числом компонентов, их качественной и количественной характеристикой иногда возникает необходимость дальнейшего более подробного исследования. В 1976 году для изучения иммуноглобулинов был предложен метод иммунофиксации (11). Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) — это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута сыворотка крови, моча, спинномозговая или другая жидкость организма. На электрофоретически разделенные антигены наносят иммунные сыворотки, содержащие различные специфические антитела. При встрече соответствующих антигена и антитела в зоне оптимального их соотношения наблюдается реакция преципитации невооруженным глазом. Иммунный электрофорез объединяет преимущества электрофореза и иммунной реакции: высокая разрешающая способность метода, разделяющая компоненты анализируемой системы на основе электрофоретической мобильности и высокая специфичность иммунных антисывороток. Электрофорез с иммунофиксацией — один из современнейших методов в кинической лаборатории для получения характеристик моноклональных иммуноглобулинов. Моноклональная гаммопатия характеризуется неконтролируемой пролифирацией одного клона плазменных клеток за счет других клеток. Эта дисфункция часто приводит к синтезу большого количества одного иммуноглобулина или его субъединицы со снижением нормальных уровней иммуноглобулинов. При этом на электрофореграмме выявляется один резко увеличенный пик в бета-гамма-области (рис.2) .

    Большинство моноклональных гаммопатий являюттся доброкачественными и не проявляют себя клинически. Однако, высокие уровни моноклонального протеина на фоне сниженных уровней других иммуноглобулинов могут быть ассоциированы с малигнизацией.

    В последние годы участились парапротеинемические гемобластозы (миеломная болезнь, лимфоцитомия, лейкозы), когда на электрофореграмме может наблюдаться присутствие двух (и очень редко трех) моноклональных протеинов. Анализ протеинов абсолютно необходим в диагностике и мониторинге лимфопролиферативных заболеваний. При этом если иммуннохимический метод может выявить количественные отклонения протеиновой продукции, отмечая наличие расстройства в этой среде, то электрофорез в состоянии продемонстрировать моноклональную сущность этих нарушений. Однако, выявление того или иного варианта парапротеинемии на электрофоретической картине недостаточно для полной идентификации патологического процесса. В таких случаях необходимо использовать иммуноэлектрофорез.

    Поликлональные гаммопатий в общих чертах характеризуются диффузным увеличением уровня протеина в гамма-регионе на электрофоретической пластине. Обычно концентрации трех главных иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) соответственно увеличены (рис.3).

    Обычно поликлональная гаммопатия наиболее часто встречаемое в клинике отклонение после гипоальбуминемии.

    Сохраняющаяся поликлональная гаммопатия имеет определенную прогностическую значимость при ряде заболеваний: хроническая патология печени, коллагенозы, хронические инфекции, метастатистическая карцинома, ожоговая болезнь.

    Снижением большинства или даже всех иммуноглобулинов характеризуется гипогаммоглобулинемия и агаммоглобулинемия (Рис.4).

    Рис.4 Гипогаммаглобулинемия и агаммаглобулинемия Чаще всего это связано с наследственной патологией и проявляется уже в раннем детстве (синдром Вискотт-Алдриха, болезнь Брутона, атаксия).

    Приобретенная недостаточность иммуноглобулинов во взрослом возрасте может быть вторичной, в виде моноклональной гаммопатии или быть индуцированной иммуносупрессивной терапией. Остановимся на электрофоретических характеристиках сывороточных протеинов при некоторых клинических проявлениях.

    1. Острое воспаление. характеризующееся локализованным биохимическим ответом (активация комплемента) и реакцией на клеточном уровне (мобилизация фагоцитов, увеличение синтеза протеинов), дает при электрофорезе белков сыворотки увеличение уровней альфа 1-й альфа 2-глобулинов, фибриногена (рис.5).

    Рис.5 Острое воспаление

    2.Хроническое воспаление ассоциируется с увеличением фракций белков, рассматриваемых как «белки хронической фазы». Электрофоретически это будет проявляться умеренным увеличением альфа 2-глобулинов и легким увеличением бета-глобулинов. Альбумин может быть слегка подавлен на фоне поликлонального увеличения гамма глобулинов (рис.6).

    Рис.6 Хроническое воспаление

    Такие отклонения, характеризующие хроническое воспаление, могут проявляться при хронических инфекциях (бруцеллез, туберкулез и др.), коллагенозах, аллергиях, аутоиммунных процессах, а также при малигнизации.

    3. Заболевание печени. В связи с тем, что в печени синтезируются альбумин и альфа-глобулин, заболевания этого органа, затрагивающие белковосинтезирующую функцию могут сопровождаться снижением их уровней в крови, что соответственно отразится на электрофореграммах (рис.7).

    Следует однако помнить, что печень обладает значительными резервами синтезирующей способности, поэтому выявление данных нарушений будет свидетельствовать о глубоких гепатоцеллюлярных нарушениях

    4. Нефротический синдром может быть обусловлен различными патологическими процессами (диабет, заболевание соединительной ткани, гломерулонефриты и др.). Для данного синдрома характерна потеря большого количества альбумина в связи с нарушением фильтрационной способности почек. При этом альбумин и другие низкомолекулярные белки (трансферрин и альфа 1- антитрипсин) выходят через гломерулярные канальцы. Это сопровождается увеличением в крови уровней высокомолекулярных протеинов (макроглобулин, IgM, липопротеины). Электрофоретическая картина при этом выявляет существенное снижение пика альбумина и увеличение альфа 1- и альфа 2-глобулинов (рис.8).

    5. Гастроэнтеропатическая гипопротеинемия.

    Избыточная потеря альбумина и других протеинов может сопутствовать ряду заболеваний желудочно-кишечного тракта, причем клинические проявления зависят от глубины поражения и степени потери белков (рис.9).

    Рис.9 Гастроэнтеропатическая гипопротеинемия

    Выявляемый при обследований «протеиновый профиль» будет отражать основной патологический процесс.

    Различные типы протеинурии могут быть дифференцированы с помощью электрофореза мочи (рис.10).

    Рис.10 Нормальная электрофореграмма белков мочи

    Выявление и дифференцировка плазменных белков в моче с помощью электрофореза является весьма информативным тестом в оценке почечной функции, нарушения которой могут быть обусловлены ослабленной канальцевой реабсорбцией, но в большинстве случаев являются результатом патологической проницаемости гломерулярных капилляров (8) (рис.11 и 12).

     

    Следует подчеркнуть возможность электрофоретического обследования цереброспинальной жидкости.

    Продуцируясь путем ультрафильтрации плазмы, спинномозговая жидкость «обновляется» примерно 4 раза в сутки благодаря экскреции и реабсорбции через гемато-энцефалический барьер. Несмотря на внедрение в клиники нейрозаболеваний таких современных методов диагностики как компьютерная томография и ЯМРТ, исследование спинномозговой жидкости остается одним из ведущих методов клинической диагностики при заболеваниях нервной системы, помогая уточнить характер патологического процесса, особенности течения заболевания, его прогноз, контролировать эффективность лечения (4). Соотношение концентраций белков плазмы и цереброспинальной жидкости может свидетельствовать о той или иной степени проницаемости гемато-энцефалического барьера. Поэтому изучение статуса белков в цереброспинальной жидкости должно обязательно сопровождаться параллельным обследованием плазмы (рис.13).

    Такой электрофоретический профиль является важным диагностическим аргументом при диагностике иммунопатологических процессов с неврологической аффектацией. Выявление олигоклональных групп при электрофорезе цереброспинальной жидкости — лучший и единственный на настоящее время тест для диагностики рассеянного склероза (1) (рис.14).

    Специфические картины дает электрофорез цереброспинальной жидкости при нейросифилисе (Рис.15), менингите цитомегаловирусной этиологии (Рис.16), церебральном токсоплазмозе (Рис.17) (10).

      

    Определение фракций белков-маркеров спинномозговой жидкости в динамике лечения черепно-мозговой травмы имеет существенное значение для современной и более точной диагностики, а также для обоснованного прогноза (2).

    Из других биологических сред организма, используемых для электрофоретических тестов с целью установления диагноза, следует упомянуть плевральную, перикардиальную, синовиальную и слезную жидкости. Что касается электрофореза слезной жидкости, то в данном случае это один из наиболее информативных биохимических методов в диагностике патологичесих процессов слезных желез, т.к. фракции быстро мигрирующих белков (RMP), лактотрансферрин (Ltt) и лизозим (Lys), синтезируемые слезными железами, образуют три основных пика на целлюлез-ацетатной электрофореграмме (Рис.18).

    Дисфункция слезных желез приводит к снижению синтеза одного или нескольких из этих белков, что отчетливо проявляется в процессе электрофореза. Причем, изменение нормальных фракций или даже появление новых может проявляться у здоровых субъектов и объясняться использованием не достаточно качественных контактных лиз (Рис.19).

    Другой областью широкого клинико-лабораторного использования электрофореза является изучение липидного профиля. Клиническая значимость данного теста возрастает в последнее время параллельно увеличивающейся статистике сердечно-сосудистых заболеваний. Точное определение фенотипа дислипопротеинемии абсолютно необходимо для обоснования патогенетического лечения и обоснованного прогноза, т.к. лечение гиперлипидемий зависит от фенотипа. Классическое исследование фенотипов связано в первую очередь с определением холестерина и триглицеридов в крови, однако, этого далеко не достаточно. Электрофорез разделяет липопротеины на альфа (HDL), пре-бета (VLDL), бета (LDL) и иногда хиломинроны. В добавление к 4 главным липидным фракциям при использовании агарозного или полиакрил амид ного геля могут быть определены: липопротеины промежуточной плотности (JDL), липопротеин(а), липопротеин-Х (абнормальный липопротеин, который появляется при холестазе или при обогащенном липидами парэнтеральном питании). Классификация и идентификация гиперлипидемий основаны на определении липидного спектра сыворотки крови.

    Предложенные Фредриксоном классификации липидных фенотипов включает 5 типов, прекрасно дифференцируемых с помощью электрофореза (Рис.20).

    Рис.20 Фенотипы гиперлипидемий

    Электрофорез изоэнзимов.

    Изоэнзимы, являющиеся молекулярными вариациями некоторых ферментов, имеют идентичную каталитическую активность, но различаются пространственной конфигурацией. Отличаясь электрофоретической мобильностью, эти молекулы разделяются, характеризуя специфическую ферментативную активность определенного органа. Наибольшую диагностическую значимость приобретает интерпретация электрофореза изоэнзимов креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и щелочной фосфатазы (ЩФ).

    Креатинкиназа имеет три изоформы: СК-ММ (в скелетной мускулатуре), СК-ВВ (в мозгу) и СК-МВ (в миокарде).

    В последнее время выделен еще митохондриальный изоэнзим (СКт), который характеризуется отсутствием М и В субъединиц, аффинностью к креатинфосфату и стабильностью при нагревании (5 минут при 56 С). Высокое содержание митохондриального изоэнзима обнаружено в сыворотке большинства больных с неопластическими процессами. СКт рассматривается как маркер корциномы в метастатической стадии развития, являясь настораживающим прогностическим индикатором. Выявление данного изоэнзима у новорожденных указывает на митохондриальную гиперактивность и тканевую гипоксию. Электрофорез креатинкиназы — референтный метод для определения кардиальных энзимов, являющийся быстрым и точным тестом для документации острого инфаркта миокарда (9). Увеличение активности СК-МВ (более чем 5% от тотальной) при ранних клинических проявлениях ишемий миокарда предполагает в дальнейшем мониторинг активности изоэнзима каждые 3 часа в течение суток, что наряду с уточнением диагноза указывает на эффективность терапии (Рис.21).

    Рис.21 Массивный инфаркт миокарда

    В последнее время СК-МВ разделяют на 2 изоформы: СК-МВ 1 и СК-МВ2.

    СК-МВ2 — тканевая форма, которая попадая в кровоток, конвертируется в МВ1, поэтому изменение соотношения МВ2/МВ1 через 1-2 часа после начала болевого синдрома может документировать наличие инфаркта. Таким образом, высочайшая кардиоспецифичность изоформ дает максимально раннюю информацию о нарушениях миокарда и возможность своевременного применения тромболитической терапии.

    Одной из наиболее удобных для этой цели систем является прелагаемая фирмой Helena France система Cardio Rep. В автоматическом режиме в течение 18 минут с высокой чувствительностью (96%) и специфичностью (94%) выдаются результаты определения 3 изоформ, являющихся дереватами СК-ММ и двух от СК-МВ: МВ2, соотношение МВ2 к MB 1, общая активность СК-МВ и %МВ.

    Щелочная фосфатаза — фермент существующий фактически во всех органах и тканях, однако, печень, кости и кишечник имеют свои органоспецифические изоферменты. В связи с тем, что щелочная фосфатаза широко распространена в различных тканях, определение в крови тотальной активности данного фермента мало информативно. С этой точки зрения становится понятной значимость определения раздельных ихоэнзимов, активность которых в том или ином органе уникальна. Иоэнзимы щелочной фосфатазы отличается физико-химическими и электрофоретическими свойствами, что и создает возможности для их идентификации с помощью электрофореза, где наряду с разделением печеночных, костных, кишечных и плацентраных изоэнзимов в сыворотке могут быть выделены еще такие изоэнзимы, как : макрогепатические, ренальные, Nagao.

    Таким образом, электрофоретическое разделение изоферментных форм позволяет идентифицировать патологию того или иного органа, активно включаясь в диагностический процесс.

    Электрофорез гемоглобина

    Гемоглобинопатии — генетически детерменированные аномалии, характеризующиеся количественными или качественными вариациями гемоглобина. К настоящему времени у человека идентифицированы более 200 анормальных гемоглобинов. Наибольшее клиническое значение из них имеют гемоглобины S (депраноциты), С, D и Е. Электрофорез как способ диагностики заболеваний, связанных с выявлением той или иной формы гемоглобинопатии на современном этапе является самым информативным методом. Так выявление на электрофореграмме депраноцитоза (Hb S) свидетельствует о наличии серпавидноклеточной анемии. Гетерозиготные формы гемоглобинопатии с НЬС и НЬЕ наиболее часто встречающиеся в Западной Африке и на Востоке чаще всего не имеют клинической манифистации. Группа гемоглобинопатии, при которых отсутствует или снижается продукция одной или более глобиновых цепей, называется талассемия. При этом нарушение происходит не в структуре цепи, а в дефиците синтеза цепи, как правило бетта-цепи реже альфа-цепи. Существует много вариантов талассемий, при чем иногда талассимия сочетается с другими гемоглобинопатиями, серповидноклеточная талассемия — наиболее частое сочетание.

    Внедрение электрофореза в неонатальную скрининговую программу, а также обследование семейных пар на выявление риска генетических патологий гемоглобина у планируемого ребенка позволяет насторожить родителей о возможных проблемах до появления тяжелых симптомов, таких как серповидно-клеточная анемия и др. Нельзя не упомянуть о электрофоретическом количественном измерении гликированного гемоглобина.

    Гликозилированный гемоглобин (HbAl) компонуется из 5 фракций (HbAla, HbAlb, HbAlc, HbAld и HbAle) и в норме составляет от 5 до 8 % тотального гемоглобина.

    Наибольший интерес представляет HbAlc. В структуре которого N-терминал аминокислоты соединен с молекулой глюкозы и составляет 4-6 % тотального гемоглобина, т.е. основную часть гликированных форм гемоглобина (HbAla — 0,2%, HbAlb — 0,5 %, HbAld — 0,2%). Гликирование — это медленный, необратимый, неферментативный процесс, в результате которого гемоглобин теряет кислороднесущую функцию на период всей жизни эритроцитов (120 дней). В связи с этим пропорционально времени и концентрации глюкозы содержание гликированного гемоглобина в крови отражает гликемический статус за предыдущие тестированию 3 месяца, в то время, как измерение глюкозы в крови отражает гликемию в момент взятия крови.

    Таким образом для выявления преддиабетических состояний и оценки антидиабетической терапии абсолютно необходимо определениеНЬА1с (рис. 22).

    Рис.22 Нормальная электрофореграмма гликированного гемоглобина

    Мощный технический прогресс последних десятилетий и развитие коммерционализации в медицине дали толчок для развития новейших технологий на базе известных принципов электрофореза. Диагностическая значимость данного метода подтверждается огромным разнообразием выпускаемых в настоящее время систем для электрофореза. Причем, наряду с такими мощными лидерами в производстве, как Helena Laboratories (Франция) или Beckman (США), где лишь перечень выпускаемого оборудования составляет десятки страниц предлагаются и небольшие автоматические денситометры простые в эксплуатации, предназначенные для рутинных исследований белковых фракций (Biosystems, Испания). Широкий спектр современных приборов основан на знании клинических потребностей в различных областях медицины, вплоть до самых узких диагностических задач и на современнейших технологиях, позволяющих создавать полностью автоматизированные системы для электрофореза (REP 3, Helena Laboratories, Франция; Biomek 2000, Beckman, США). Новинкой являются предлагаемые системы для капиллярного электрофореза (CES I, PrinCE, Helena Laboratories, Франция; Paragon CZE 2000, Beckman, США). Автоматические системы капиллярного электрофореза выполняют быстрое разделение биомолекул с высокой разрешающей способностью на фемтомолярном уровне (10 15 моля) из нанолитровых объемов (10 9 литра) образца. Электрофоретическое разделение макромолекул происходит внутри капилляра под воздействием высокого напряжения. Работа систем полностью контролируется компьютером.

    Использование современных электрофоретических анализаторов позволяет с высокой точностью и минимальными трудозатратами исследовать широчайший спектр биохимических параметров с целью уточнения диагноза, мониторинга патологического процесса и обоснования патогенетической терапии.

    Возможность упростить процесс обработки обширной и разносторонней информации, получаемой в результате электрофоретических и других исследований дает использование лабораторной компьютерной системы (Рис.23).

    Рис.23 Типичный экран лабораторной компьютерной системы при выборе электрофоретических исследований

    Компьютера в лаборатории не надо бояться. Его намного быстрее и легче освоить, чем заполнять вручную многочисленные журналы, бланки, направления, отчеты и т.д. Кроме того, систематизация лабораторной информации, начиная с кодирования пробирок с образцами и кончая архивированием обработанных данных значительно увеличивает точность исследований, повышая производительность лаборатории в целом и эффективность ее взаимодействия с лечебными отделениями.

    Таким образом, далеко не полный перечень возможностей клинического применения электрофореза, дает лишь общее представление о незаменимой роли данного метода для дифференцировки патологических отклонений в сложном процессе диагностических обследований.

    Вопросы для самоконтроля.

    1. Основной принцип электрофоретического разделения.
    2. Фракционный состав типичной электрофореграммы протеинов.
    3. Основная цель электрофореза с иммуннофиксацией.
    4. Характеристика электрофореграмм при гиперлипидемиях.
    5. Клиническое значение электрофореза изоферментов креатинфосфокиназы.
    6. Основные точки приложения электрофореза в диагностике гемоглобинопатии.
    7. Наиболее современные направления технологий электрофореза.

    Список литературы

    Иллюстративные и графические материалы любезно представлены компанией Helena Laboratories (Франция) и научно производственным объединением «АЛТЭЙ» (Москва).

    1. Гусев Е.И., Демина Т.Л., Бойко А.Н.

      «Рассеянный склероз», г.Москва, 1997 г.
    2. Куксинский В.А., Чурляев Ю.А., Никифорова Н.В. и др.

      «Содержание белков-маркеров спинномозговой жидкости при тяжелой черепно-мозговой травме» — Клиническая лабораторная диагностика, 1997 г., №11, стр.11-13
    3. Джорджеску П., Пэунеску Е.

      «Биохимические методы диагноза и исследования»,

      Бухарест, 1963 г., стр. 84-106
    4. Эйнштейн Э.Р.

      «Белки мозга и спинномозговой жидкости в норме и патологии; пер. с англ. — М., 1988 г.
    5. Alper, С.A., Plasma Protein Measurements as a Diagnostics Aid, N.Eng.J.Med., 291:287, 1974
    6. Alper, C.A., Johnson, A.M., Immunofixation Electrophoresis: a Technique for the Study of Protein Polymorphism. Vo Sang 17: 445-452, 1969
    7. Killingsworth, L.M., Plasma Protein Natterns in Health and Lisease, CRC Crit. Rev. in Clin. Lab. Sci, August, 1979
    8. Killingsworth, L.M. etal., «Protein Analysis, Diag. Med, 3-15, Jan/Feb, 1980
    9. Marmor, A etal., The MB Isoenzyme of Creatine Kinase as an Indicator of Severity of Myocardialschemia, Lancet, Oct. 812-814, 1978
    10. Pitzmann, S.E., Daniels, J.E., Serum Protein abnormalities: Diagnostic and Clinical aspects; Allen Less Co., 1982
    11. Tiselius, A., A New apporoach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures, Trans Faraday Soc, 33:524, 1937

    Терминология. Что такое электрофорез ?


    Под электрофорезом понимают процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Многие биологически важные молекулы (белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты и др.) имеют в своем составе ионизирующие группы. Поэтому в биологических жидкостях (крови, лимфе и др.) они существуют в виде катионов и анионов. Помимо этого, молекулы имеющие примерно одинаковый заряд могут отличаться молекулярными массами и отношением заряда к массе. На этих различиях и основано разделение ионов при движении их в растворе под действием электрического поля.

    Скорость перемещения зависит от величины заряда, а также в ряде случаев, от размера и формы молекул. Так как в большинстве случаев молекулы отличаются по своим физическим и химическим свойствам, то очень немногие из них имеют одинаковую электрофоретическую подвижность. Скорость движения частиц (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью.

    В зависимости от способа проведения электрофореза его делят на свободный или фронтальный, когда электрофоретическое разделение осуществляется в водной фазе и зональный, т.е. электрофорез на поддерживающей среде, когда разделение осуществляется на каком-либо инертном носителе (бумага, асбестовые пластины, целлюлоза, агаровый, крахмальный и полиакриламидный гели и др.).

    Суть зонального электрофореза заключается в том, что раствор смеси веществ, подлежащих разделению вводят на определенный участок носителя, пропитанного электролитом. Биологический материал, подлежащий электрофоретическому разделению, растворяют или суспензируют в буфере, чтобы обеспечить проведение электрического тока, этим же буфером насыщают и носитель. В растворе между электродами ток обусловлен ионами буфера и образца, в остальной части цепи — электронами. После снятия электрического поля ионы исследуемой смеси распределятся в соответствии с их электрофоретической подвижностью.
    В клинико-лабораторных исследованиях чаще используется зональный электрофорез на агаре или полиакриламидном геле. При наложении электрического поля частицы подлежащей разделению смеси придут в состояние направленного движения (будут двигаться к противоположно заряженному полюсу) и распределятся на носителе в виде отчетливых зон, которые легко обнаружить соответствующим аналитическим методом.

    Важными характеристиками процесса зонального электрофореза являются градиент потенциала (В/см) и сила тока, приходящаяся на 1 см поперечного сечения полосы (плотность тока — мА/см).
    Под градиентом потенциала понимают падение напряжения на 1 см носителя, расположенного между электродами. В зависимости от градиента потенциала различают низковольтный электрофорез (5-15 В/см) и высоковольтный (более 50 В/см). Низковольтный электрофорез используется для разделения высокомолекулярных соединений типа белков, липопротеинов, гликопротеинов и др. Высоковольтный электрофорез используется для разделения низкомолекулярных веществ, типа аминокислот, их производных и др. Так как различие в заряде и молекулярной массе у таких веществ невелико, то нужен большой градиент потенциала, чтобы произошло эффективное разделение частиц. Так как при этом происходит значительное разогревание носителя, требуются специальные устройства для его охлаждения.

    В зависимости от целей исследования электрофорез делят на аналитический и препаративный. В клинико-биохимических исследованиях используют обычно аналитический электрофорез, который позволяет работать с очень небольшими количествами исследуемого вещества и вести их количественное определение. В тех случаях, когда требуется получить большое количество изучаемого вещества, необходимого для дальнейших исследований используют препаративный вариант электрофореза.
    Капиллярный электрофорез предполагает быстрое разделение с исключительной эффективностью и разрешением для аналитических задач, особенно когда возникают трудности при использовании жидкостной хроматографии.

    Система капиллярного электрофореза показывает беспрецедентную ВЭЖХ — подобную чувствительность для широкого ряда аналитических задач. Преимущество капиллярного электрофореза в том, что для проведения различных методов разделения используется один прибор. Это делает капиллярный электрофорез очень гибким инструментом для широкого ряда различных применений при решении задач разделения.

    В настоящее время для анализа биологических смесей все шире используется капиллярный электрофорез, при котором электрофоретическое разделение проводится в тонких капиллярах диаметром 25-200 мкм и длинной 10-100 см, заполненных буферным раствором. Под действием электрического поля (электрофорез проводится при напряжении 10000-30000 В) в капилляре создается электроосмотический поток, направленный к отрицательному полюсу, вместе с которым перемешаются и компоненты, подлежащие разделению. В зависимости от заряда и массы скорость их движения будет различной, что приводит к фракционированию смеси. В концевой точке капилляра разделенные компоненты количественно определяют, используя различные оптические детекторы Близким к электрофорезу является метод изоэлектрического фокусирования, когда разделение белков и некоторых других анализируемых веществ идет в зависимости от величины их изоэлектрических точек.

    Изоэлектрической точкой называют такое состояние белковой молекулы, при котором ее суммарный заряд равен нулю. В методе изоэлектрического фокусирования вначале между электродами устанавливают градиент рН с помощью веществ особой химической природы, получивших название амфолитов-носителей. Заряженные молекулы белков в ходе опыта будут двигаться в направлении противоположно заряженного электрода в соответствии с их действительным зарядом. Так как молекулы белков амфотерны, то при перемещении в градиенте рН их суммарный заряд будет меняться до тех пор, пока он не станет равным 0. Это произойдет в том месте, где величина рН будет равна изоэлектрической точке. Поэтому молекулы с одинаковой изоэлектрической точкой сконцентрируются в одной узкой зоне.

    Электрофорез

    Электрофорез — это один из методов физиотерапии, который заключается в одновременном воздействии на организм постоянного электрического тока малой силы и низкого напряжения, и вводимых им (через кожу или слизистые оболочки) ионов лекарственных веществ. Доказано, что при электрофорезе повышается чувствительность рецепторов к лекарственным веществам, которые полностью сохраняют свои фармакологические свойства. Основные особенности электрофореза — выраженное и продолжительное терапевтическое действие малых доз лекарственных веществ за счёт создания своеобразного кожного депо применяемых препаратов, а также возможность оказывать местное воздействие при некоторых патологических затрудняющих поступление препарата в патологический очаг из крови.

    При электрофорезе возможно одновременное применение нескольких лекарственных веществ. В ряде случаев для электрофореза используют также импульсный ток постоянного направления, что повышает лечебный эффект метода. Источники тока, а также правила проведения электрофореза такие же, как при гальванизации. Для электрофореза оба электрода с прокладками, смоченными раствором лекарственного вещества, располагают на коже либо один из них помещают в полости носа, уха, во влагалище и других; в некоторых случаях вместо прокладки используют ванночку с раствором лекарственного вещества, в которую опущен угольный электрод. Электрофорез применяют при заболеваниях центральной и периферической нервной системы, опорно-двигательного аппарата,  гинекологических заболеваниях, органов дыхания и сердечно -сосудистой системы, заболевания желудочно-кишечного тракта и др.

    Противопоказания

    • индивидуальная непереносимость;
    • нарушение кожной чувствительности;
    • заболевания в стадии декомпенсации;
    • дерматит;
    • нарушение целостности кожного покрова в зоне воздействия.

     Дополнительная информация по телефону:  8 (8453) 33-39-36

    Электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

    Abstract

    Электрофорез в агарозном геле — наиболее эффективный способ разделения фрагментов ДНК различного размера от 100 до 25 т.п.н. 1 . Агароза выделена из водорослей родов Gelidium и Gracilaria и состоит из повторяющихся субъединиц агаробиозы (L- и D-галактозы) 2 . Во время гелеобразования полимеры агарозы нековалентно связываются и образуют сеть пучков, размер пор которых определяет свойства молекулярного сита геля.Использование электрофореза в агарозном геле произвело революцию в разделении ДНК. До внедрения агарозных гелей ДНК в первую очередь разделяли с использованием центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, которое давало лишь приблизительный размер. Чтобы отделить ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, ДНК загружают в предварительно залитые лунки геля и прикладывают ток. Фосфатный остов молекулы ДНК (и РНК) заряжен отрицательно, поэтому при помещении в электрическое поле фрагменты ДНК будут мигрировать к положительно заряженному аноду.Поскольку ДНК имеет однородное соотношение масса / заряд, молекулы ДНК разделены по размеру в агарозном геле в таком порядке, что пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму ее молекулярной массы 3 . Ведущей моделью движения ДНК через агарозный гель является «смещенная рептация», когда передний край движется вперед и тянет остальную часть молекулы вдоль 4 . Скорость миграции молекулы ДНК через гель определяется следующим: 1) размером молекулы ДНК; 2) концентрация агарозы; 3) конформация ДНК 5 ; 4) приложенное напряжение, 5) присутствие бромистого этидия, 6) тип агарозы и 7) буфер для электрофореза.После разделения молекулы ДНК можно визуализировать в ультрафиолетовом свете после окрашивания соответствующим красителем. Следуя этому протоколу, учащиеся должны уметь: 1. Понимать механизм, с помощью которого фрагменты ДНК разделяются в гелевой матрице 2. Понимать, как конформация молекулы ДНК будет определять ее подвижность через гелевую матрицу 3. Определить раствор агарозы подходящая концентрация для их нужд 4. Приготовьте агарозный гель для электрофореза образцов ДНК 5. Установите аппарат для гель-электрофореза и источник питания 6.Выберите подходящее напряжение для разделения фрагментов ДНК 7. Понять механизм, с помощью которого бромид этидия позволяет визуализировать полосы ДНК 8. Определить размеры разделенных фрагментов ДНК

    Ключевые слова: Genetics, Issue 62, Gel-электрофорез, агароза , Разделение ДНК, бромид этидия

    Протокол

    1. Приготовление геля

    1. Взвешивают соответствующую массу агарозы в колбу Эрленмейера. Гели агарозы готовят с использованием процентного раствора вес / объем.Концентрация агарозы в геле будет зависеть от размеров разделяемых фрагментов ДНК, причем большинство гелей находится в диапазоне от 0,5% до 2%. Объем буфера не должен превышать 1/3 вместимости колбы.

    2. Добавьте рабочий буфер в колбу с агарозой. Вращайте, чтобы перемешать. Наиболее распространенными буферами для прогрева геля являются ТАЕ (40 мМ трис-ацетат, 1 мМ EDTA) и TBE (45 мМ трис-борат, 1 мМ EDTA).

    3. Расплавить смесь агарозы / буфера. Чаще всего это делается путем нагревания в микроволновой печи, но можно также сделать это и над пламенем Бунзена.С интервалами в 30 с снимают колбу и перемешивают содержимое, пока оно хорошо перемешивается. Повторяйте до полного растворения агарозы.

    4. Добавьте бромид этидия (EtBr) до концентрации 0,5 мкг / мл. В качестве альтернативы гель можно также окрашивать после электрофореза в рабочем буфере, содержащем 0,5 мкг / мл EtBr, в течение 15-30 минут с последующим обесцвечиванием в рабочем буфере в течение равного промежутка времени.

    Примечание: EtBr является подозреваемым канцерогеном и должен быть утилизирован в соответствии с правилами учреждения.При работе с гелями, содержащими EtBr, всегда следует носить перчатки. Доступны альтернативные красители для окрашивания ДНК; однако EtBr остается самым популярным из-за его чувствительности и стоимости.

    1. Дайте агарозе остыть либо на столе, либо путем инкубации на водяной бане с температурой 65 ° C. В противном случае поднос с гелем будет деформироваться.

    2. Поместите лоток для геля в литейный аппарат. В качестве альтернативы можно также заклеить открытые края лотка для геля, чтобы создать форму.Поместите соответствующую гребенку в гелевую форму, чтобы создать лунки.

    3. Залейте расплавленную агарозу в гелевую форму. Дайте агарозе остыть при комнатной температуре. Снимите гребешок и поместите гель в коробку для геля. Кроме того, гель можно завернуть в полиэтиленовую пленку и хранить при 4 ° C до использования (, рис. 1, ).

    2. Установка гелевого аппарата и разделение фрагментов ДНК

    1. Добавьте краситель в образцы ДНК, которые необходимо разделить ( Рис.2 ). Краситель с гелевой загрузкой обычно изготавливается с 6-кратной концентрацией (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина). Загрузка красителя помогает отследить, как далеко прошел образец ДНК, а также позволяет образцу погрузиться в гель.

    2. Запрограммируйте источник питания на желаемое напряжение (1-5 В / см между электродами).

    3. Добавьте достаточное количество рабочего буфера, чтобы покрыть поверхность геля. Важно использовать тот же рабочий буфер, который использовался для приготовления геля.

    4. Подсоедините провода коробки с гелем к источнику питания. Включите источник питания и убедитесь, что гелевый бокс и источник питания работают.

    5. Снимите крышку. Медленно и осторожно загрузите образец (ы) ДНК в гель ( рис. 3, ). Маркер подходящего размера ДНК всегда следует загружать вместе с экспериментальными образцами.

    6. Установите крышку на коробку с гелем. Катод (черные выводы) должен быть ближе к лункам, чем анод (красные выводы).Дважды убедитесь, что электроды вставлены в правильные гнезда источника питания.

    7. Включите питание. Наносите гель, пока краситель не переместится на необходимое расстояние.

    3. Наблюдение за разделенными фрагментами ДНК

    1. После завершения электрофореза выключите источник питания и снимите крышку контейнера с гелем.

    2. Извлеките гель из контейнера для геля. Слейте лишний буфер с поверхности геля. Поместите лоток с гелем на бумажные полотенца, чтобы впитать лишний буферный раствор.

    3. Удалите гель из лотка для геля и подвергните гель воздействию ультрафиолета. Чаще всего это делается с помощью системы гель-документации ( рис. 4, ). Полосы ДНК должны отображаться как оранжевые флуоресцентные полосы. Сделайте снимок геля ( рис. 5, ).

    4. Утилизируйте гель и рабочий буфер в соответствии с правилами учреждения.

    4. Типичные результаты

    Рисунок 5 представляет собой типичный результат после электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР.После разделения полученные фрагменты ДНК видны в виде четко определенных полос. Стандарт ДНК или лестницу следует разделять до такой степени, чтобы можно было эффективно определять размеры полос образца. В показанном примере фрагменты ДНК размером 765 п.н., 880 п.н. и 1022 п.н. разделяют на 1,5% агарозном геле вместе с 2-логарифмической лестницей ДНК.

    Рисунок 1. Затвердевший гель агарозы после удаления гребня.

    Рис. 2. Студентка добавляет краситель к своим образцам ДНК.

    Рис. 3. Студент загружает образец ДНК в лунку геля.

    Рисунок 4. Пример системы документации геля.

    Рисунок 5. Изображение после электрофореза в геле. EtBr добавляли к гелю перед электрофорезом до конечной концентрации 0,5 мкг / мл с последующим разделением при 100 В в течение 1 часа. Гель подвергали воздействию ультрафиолета и фотографировали с помощью системы документирования геля.

    Обсуждение

    Электрофорез в агарозном геле оказался эффективным и действенным способом разделения нуклеиновых кислот.Высокая прочность геля агарозы позволяет работать с гелями с низким процентным содержанием для разделения больших фрагментов ДНК. Молекулярное просеивание определяется размером пор, образованных пучками агарозы 7 в гелевой матрице. Как правило, чем выше концентрация агарозы, тем меньше размер пор. Традиционные агарозные гели наиболее эффективны при разделении фрагментов ДНК размером от 100 до 25 т.п.н. Для разделения фрагментов ДНК размером более 25 т.п.н. потребуется использовать гель-электрофорез 6 в импульсном поле, который включает приложение переменного тока с двух разных направлений.Таким образом, фрагменты ДНК большего размера разделяются скоростью, с которой они переориентируются при изменении направления тока. Фрагменты ДНК размером менее 100 п.н. более эффективно разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В отличие от агарозных гелей, матрица полиакриламидного геля образуется в результате химической реакции, управляемой свободными радикалами. Эти более тонкие гели имеют более высокую концентрацию, работают вертикально и имеют лучшее разрешение. В современном секвенировании ДНК используется капиллярный электрофорез, при котором капиллярные трубки заполняются гелевой матрицей.Использование капиллярных трубок позволяет применять высокие напряжения, тем самым обеспечивая быстрое разделение фрагментов ДНК (и определение последовательности ДНК).

    Агароза может быть модифицирована для создания агарозы с низкой температурой плавления путем гидроксиэтилирования. Агароза с низкой температурой плавления обычно используется, когда требуется выделение разделенных фрагментов ДНК. Гидроксиэтилирование снижает плотность упаковки агарозных пучков, эффективно уменьшая размер их пор 8 . Это означает, что фрагменту ДНК того же размера потребуется больше времени, чтобы пройти через легкоплавкий агарозный гель, в отличие от стандартного агарозного геля.Поскольку связки связаны друг с другом посредством нековалентных взаимодействий 9 , можно повторно расплавить гель агарозы после того, как он застынет.

    EtBr — наиболее распространенный реагент, используемый для окрашивания ДНК в агарозных гелях 10 . Под воздействием ультрафиолета электроны в ароматическом кольце молекулы этидия активируются, что приводит к высвобождению энергии (света), когда электроны возвращаются в основное состояние. EtBr работает, внедряясь в молекулу ДНК в зависимости от концентрации.Это позволяет оценить количество ДНК в любой конкретной полосе ДНК на основе ее интенсивности. Из-за его положительного заряда использование EtBr снижает скорость миграции ДНК на 15%. EtBr является подозреваемым мутагеном и канцерогеном, поэтому следует проявлять осторожность при обращении с агарозными гелями, содержащими его. Кроме того, EtBr считается опасными отходами и должен утилизироваться надлежащим образом. Альтернативные красители для ДНК в агарозных гелях включают SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet и Methyl Blue.Из них метиловый синий и кристально-фиолетовый не требуют воздействия на гель ультрафиолетового света для визуализации полос ДНК, тем самым снижая вероятность мутации, если требуется извлечение фрагмента ДНК из геля. Однако их чувствительность ниже, чем у EtBr. SYBR gold и SYBR green являются высокочувствительными УФ-зависимыми красителями с меньшей токсичностью, чем EtBr, но они значительно дороже. Более того, все альтернативные красители либо не работают, либо не работают при прямом добавлении в гель, поэтому гель необходимо будет подвергнуть последующему окрашиванию после электрофореза.Из-за стоимости, простоты использования и чувствительности EtBr по-прежнему остается предпочтительным красителем для многих исследователей. Однако в определенных ситуациях, например, когда удаление опасных отходов затруднено или когда молодые студенты проводят эксперимент, может быть предпочтительнее менее токсичный краситель.

    Краски, используемые в гель-электрофорезе, служат трем основным целям. Сначала они увеличивают плотность образца, позволяя ему погрузиться в гель. Во-вторых, красители придают цвет и упрощают процесс загрузки. Наконец, красители перемещаются через гель со стандартной скоростью, что позволяет оценить расстояние, на которое мигрировали фрагменты ДНК.

    Точные размеры разделенных фрагментов ДНК можно определить, построив логарифм молекулярной массы для различных полос стандарта ДНК в зависимости от расстояния, пройденного каждой полосой. Стандарт ДНК содержит смесь фрагментов ДНК заранее определенного размера, которые можно сравнить с неизвестными образцами ДНК. Важно отметить, что разные формы ДНК проходят через гель с разной скоростью. Суперспиральная плазмидная ДНК из-за своей компактной конформации движется через гель быстрее всего, за ним следует линейный фрагмент ДНК того же размера, а открытая кольцевая форма движется медленнее всего.

    В заключение, с момента принятия агарозных гелей в 1970-х годах для разделения ДНК, он оказался одним из самых полезных и универсальных методов в исследованиях биологических наук.

    Электрофорез | Спросите у биолога

    Электрофорез в агарозном геле

    Электрофорез в агарозном геле позволяет разделять фрагменты ДНК по размеру. Обычно молекула ДНК переваривается рестрикционными ферментами, и электрофорез в агарозном геле используется в качестве диагностического инструмента для визуализации фрагментов.Электрический ток используется для перемещения молекул ДНК через агарозный гель, который представляет собой полисахаридную матрицу, которая функционирует как своего рода сито. Матрица помогает «поймать» молекулы по мере их перемещения электрическим током.

    Эта техника имеет множество применений. Вообще говоря, вы можете анализировать фрагменты ДНК, полученные в результате ферментативного переваривания более крупного фрагмента ДНК, чтобы визуализировать фрагменты и определить их размеры.

    Помимо полезности в исследовательских методах, электрофорез в агарозном геле является распространенным методом судебной медицины и используется для снятия отпечатков пальцев ДНК.

    А нельзя было просто покрасить?

    Бромид этидия представляет собой интеркалирующий краситель, что означает, что он внедряется между основаниями, расположенными в центре спирали ДНК. Одна молекула бромида этидия связывается с одним основанием. Когда каждая молекула красителя связывается с основаниями, спираль разматывается, чтобы принять напряжение от красителя.

    Замкнутая кольцевая ДНК ограничена и не может противостоять такому напряжению скручивания, как линейная ДНК, поэтому кольцевая ДНК не может связывать столько красителя, сколько линейная ДНК.

    Бромид этидия легко проникает в ваши клетки. ДНК человека линейна и хорошо окрашивается. Это значит, что он может попасть в вашу ДНК и раскрутить ее. Это нехорошо, поэтому будьте осторожны и осторожны при использовании бромистого этидия.

    Есть также более безопасные и менее токсичные альтернативы, которые вы можете использовать. GelRed и GelGreen — это пятна ДНК, которые не могут проходить через клеточные мембраны, что делает их более безопасными в использовании и утилизации.

    Перемещение по матрице

    Молекулы фосфата, составляющие основу молекул ДНК, имеют высокий отрицательный заряд.Когда ДНК помещают в поле с электрическим током, эти отрицательно заряженные молекулы ДНК перемещаются к положительному концу поля, которое в данном случае представляет собой гель агарозы, погруженный в буферную ванну.

    Гель агарозы представляет собой сшитую матрицу, которая чем-то похожа на трехмерную сетку или экран. Молекулы ДНК притягиваются к положительному концу током, но они сталкиваются с сопротивлением этой агарозной сетки. Более мелкие молекулы могут перемещаться по сетке быстрее, чем более крупные, поэтому они продвигаются дальше по гелю, чем более крупные молекулы.Вот как электрофорез в агарозе разделяет разные молекулы ДНК в зависимости от их размера. Гель окрашивают бромидом этидия, поэтому вы можете визуализировать, как эти молекулы ДНК распадаются на полосы вдоль геля.

    Саузерн-блоттинг также можно использовать в качестве метода визуализации агарозных гелей.

    Неизвестные образцы ДНК обычно обрабатываются на одном геле с «лестницей». Лестница — это образец ДНК, размер полос которого известен. Итак, после того, как вы закончите свой образец, вы можете сравнить неизвестные фрагменты с фрагментами лестничной диаграммы и определить приблизительный размер неизвестных полос ДНК по тому, как они совпадают с известными полосами лестницы.


    Дополнительные изображения из Викимедиа через Якопо Вертера (аппарат для электрофореза) и Mnolf (гель-электрофорез)

    8.3: Электрофорез — Biology LibreTexts

    Электрофорез использует электрическое поле, приложенное к гелевой матрице для разделения больших молекул, таких как ДНК, РНК и др. белки по заряду и размеру. Образцы загружаются в лунки гелевой матрицы, которая может разделять молекулы по размеру, и к гелю прикладывается электрическое поле. Это поле заставляет отрицательно заряженные молекулы двигаться к положительному электроду.Сама гелевая матрица действует как сито, через которое самые маленькие молекулы проходят быстро, а более длинные молекулы движутся медленнее.

    Для ДНК и РНК сортировка молекул по размеру таким способом тривиальна из-за однородного отрицательного заряда на фосфатном скелете. Для белков, которые различаются по своему заряду, необходимо использовать хитрый трюк, чтобы сделать их похожими на нуклеиновые кислоты — см. Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) ниже. У разных видов гелей разный размер пор. Как и сита с более мелкими или крупными ячейками, одни гели лучше справляются с разделением более мелких молекул, а другие — с более крупными.Гель-электрофорез может использоваться как препаративный метод (то есть при очистке белков или нуклеиновых кислот), но чаще всего он используется как аналитический инструмент.

    Электрофорез в агарозном геле

    Электрофорез в агарозном геле — это метод, используемый для разделения нуклеиновых кислот в первую очередь по размеру. Агароза — это полисахарид, полученный из морских водорослей (рис. 8.11). Его можно растворить в кипящем буфере и вылить в поддон, где он остынет (рис. 8.12), образуя пластину. Гели агарозы наливают с помощью расчески, чтобы сделать лунки, в которые помещают образцы ДНК или РНК после затвердевания геля.Гель погружают в буфер, и через пластину пропускают ток. Двухцепочечная ДНК имеет однородный отрицательный заряд, который не зависит от состава последовательности молекулы. Следовательно, если фрагменты ДНК поместить в электрическое поле, они будут мигрировать от катода (-) к аноду (+). Скорость миграции напрямую зависит от способности каждой молекулы ДНК проникать через просеивающий гель. Матрица агарозы обеспечивает отверстия для движения макромолекул.Самым крупным макромолекулам труднее всего перемещаться по гелю, тогда как самые маленькие макромолекулы проходят через него быстрее всего.

    Рисунок 8.11 — Структура полисахарида агарозы. Википедия

    Поскольку при электрофорезе в качестве силы для перемещения молекул через матрицу используется электрический ток, разделяемые молекулы должны быть заряжены. Поскольку отношение размера к заряду для ДНК и РНК постоянно для всех размеров этих нуклеиновых кислот, молекулы просто сортируются на основе их размера — наименьшие перемещаются быстрее, а наибольшие — медленнее.

    Все фрагменты заданного размера будут перемещаться по гелю на одинаковое расстояние, образуя так называемые «полосы» на геле. Визуализация фрагментов ДНК в геле стала возможной благодаря добавлению красителя, такого как бромид этидия, который интеркалирует между основаниями и флуоресцирует при просмотре в ультрафиолетовом свете (рис. 8.13). можно определить размеры фрагментов ДНК в образце. Полезно отметить, что по соглашению фрагменты ДНК описываются не их молекулярными массами (в отличие от белков), а их длиной в парах оснований (bp) или килобазах (kb).

    Рисунок 8.12 — Разделение ДНК электрофорезом в агарозном геле — оранжевые полосы — это фрагменты ДНК. Wikipedia

    Рисунок 8.13 — Полосы ДНК, визуализированные при окрашивании бромидом этидия. Википедия

    Электрофорез в полиакриламидном геле (СТРАНИЦА)

    Подобно ДНК и РНК, белки представляют собой большие макромолекулы, но, в отличие от нуклеиновых кислот, белки не обязательно заряжены отрицательно. Заряд каждого белка зависит от его уникальной аминокислотной последовательности. Таким образом, белки в смеси не обязательно будут двигаться к аноду.

    Кроме того, в то время как двухцепочечная ДНК имеет форму палочки, большинство белков глобулярны (свернуты). Кроме того, белки значительно меньше нуклеиновых кислот, поэтому отверстия в матрице агарозного геля просто слишком велики для эффективного разделения. Следовательно, неизмененные (нативные) белки не очень перспективны для электрофореза на агарозных гелях. Чтобы разделить белки по массе с помощью электрофореза, необходимо внести несколько модификаций.

    Гелевая матрица

    Во-первых, используется матрица, полученная путем полимеризации и сшивания акриламидных звеньев.Мономерный акриламид (рис. 8.14) полимеризуется, и полимеры сшиваются с использованием N, N’-метилен-бисакриламида (рис. 8.15), чтобы создать сетчатую структуру. Размер отверстий матрицы / сетки можно легко регулировать, изменяя процентное содержание акриламида в реакции. Более высокие проценты акриламида дают меньшие отверстия и более эффективны для разделения более мелких молекул, тогда как более низкие проценты акриламида используются при разделении смесей более крупных молекул. (Примечание: полиакриламидные гели также используются для разделения небольших фрагментов нуклеиновых кислот, при этом некоторые акриламидные гели способны разделять фрагменты ДНК, длина которых различается всего на один нуклеотид.)

    Рисунок 8.14 — Акриламидный мономер. Википедия

    Рис. 8.15 — N, N’-Метиленбисакриламид — сшивающий реагент акриламид. Википедия

    Изменение заряда по SDS

    Второе соображение состоит в том, что белки должны быть физически изменены, чтобы «представить» себя матрице, как отрицательно заряженные стержни ДНК. Это достигается обработкой белков анионным детергентом, SDS (додецилсульфатом натрия). SDS денатурирует белки, так что они принимают стержнеобразную форму, а молекулы SDS покрывают белки таким образом, что внешняя поверхность нагружается отрицательными зарядами, маскируя исходные заряды на белках и делая заряд на белках более пропорциональным их массе. как основа ДНК.

    Поскольку белки обычно имеют дисульфидные связи, которые не позволяют им полностью разворачиваться в детергенте, образцы кипятят с меркаптоэтанолом, чтобы разорвать дисульфидные связи и гарантировать, что белки имеют как можно более стержневидную форму в SDS. Такие реагенты, как меркаптоэтанол (а также дитиотреитол), представляют собой сульфгидрилсодержащие реагенты, которые окисляются, поскольку они восстанавливают дисульфидные связи в других молекулах (см. Рис. 8.16)

    Рисунок 8.16 — Восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом.Википедия

    Гель для укладки

    Третье соображение заключается в том, что «укладывающийся гель» можно использовать в верхней части полиакриламидного геля, чтобы обеспечить способ сжатия образцов в плотную полосу до того, как они попадут в основной полиакриламидный гель (называемый разделяющим гелем). Точно так же, как фрагменты ДНК при электрофорезе в агарозном геле сортируются по размеру (наибольшее движение — самое медленное, а наименьшее — самое быстрое), белки мигрируют через матрицу геля со скоростью, обратно пропорциональной их размеру.По завершении электрофореза белки можно визуализировать путем окрашивания соединениями, которые связываются с белками, такими как кумасси бриллиантовый синий (рис. 8.17) или нитрат серебра.

    Рис. 8.17. Два геля SDS-PAGE. Белки представляют собой синие полосы (окрашенные кумасси синим). Википедия

    Неденатурирующий гель-электрофорез

    Метод SDS_PAGE, описанный выше, является наиболее распространенным методом, используемым для электрофоретического разделения белков.Однако в некоторых ситуациях белки могут быть разделены на так называемых «нативных» гелях в отсутствие SDS. В этих условиях на движение белков через гель будет влиять не только их масса, но и их заряд при рН геля. Белки в комплексе с другими молекулами могут перемещаться как единое целое, что позволяет изолировать партнеров связывания интересующих белков.

    Изоэлектрическая фокусировка

    Белки значительно различаются по своему заряду и, следовательно, по значению pI (pH, при котором их заряд равен нулю).Это можно использовать для разделения белков в смеси. Разделение белков с помощью изоэлектрического фокусирования требует установления градиента pH в пробирке, содержащей матрицу из акриламидного геля. Размер пор геля регулируется так, чтобы он был большим, чтобы уменьшить эффект просеивания в зависимости от размера. Подлежащие разделению молекулы наносят на гель, содержащий градиент pH, и прикладывают электрическое поле. В этих условиях белки будут двигаться в соответствии со своим зарядом.

    Положительно заряженные молекулы, например, движутся к отрицательному электроду, но поскольку они движутся через градиент pH, когда они проходят через него, они достигают области, где их заряд равен нулю, и в этот момент они перестают двигаться.В этой точке они не притягиваются ни к положительному, ни к отрицательному электроду и, таким образом, «сфокусированы» на своей точке pI (рис. 8.18). Используя изоэлектрическое фокусирование, можно разделить белки, значения pI которых отличаются всего на 0,01 единицы.

    Рисунок 8.18 — Изоэлектрическая фокусировка: A. В начале пробега; Б. в конце цикла

    2Д гель-электрофорез

    И SDS-PAGE, и изоэлектрическая фокусировка являются мощными методами, но умная комбинация этих двух является мощным инструментом протеомики — науки об одновременном изучении всех белков клетки / ткани.При 2-мерном гель-электрофорезе сначала готовят лизат из представляющих интерес клеток. Белки в лизате разделяются сначала по их pI с помощью изоэлектрического фокусирования, а затем по размеру с помощью SDS-PAGE.

    Рисунок 8.19 — Схема для проведения 2-D гель-анализа. Изображение Aleia Kim

    Смесь белков сначала наносится на пробирку или полоску (рис. 8.19, этап 1), где выполняется изоэлектрическое фокусирование для разделения белков по их значениям pI (этап 2). Затем, как показано на рисунке, гель, содержащий белки, разделенные их pI, переворачивают на бок и наносят на верхнюю часть полиакриламидной пластины для SDS-PAGE для разделения в зависимости от размера (этап 3).Белки в матрице изоэлектрической фокусировки подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле и разделяются по размеру. Продукт этого анализа представляет собой двумерный гель, как показано на рисунке 8.20. Сила двумерного гель-электрофореза заключается в том, что практически каждый белок в клетке может быть отделен и появится на геле в виде пятна, определяемого его уникальным размером и размером. Пи. На рисунке точки в левом верхнем углу соответствуют большим положительно заряженным белкам, а точки в правом нижнем углу — небольшим отрицательно заряженным белкам.Каждое пятно на 2-мерном геле можно элюировать и идентифицировать с помощью высокопроизводительной масс-спектрометрии. Это особенно эффективно, когда сравнивают белковые профили между разными тканями или между контрольными и обработанными образцами одной и той же ткани.

    Рисунок 8.20 — Результат разделения 2-D гель-электрофорезом. Википедия

    Сравнение протеиновых профилей

    Сравнение 2-D гелей белков из незлокачественной ткани и белков из раковой ткани того же типа обеспечивает быструю идентификацию белков, уровень экспрессии которых различается между ними.Подобная информация может быть полезна при разработке методов лечения или для понимания механизма (ов) развития рака.

    Как работает электрофорез | Sciencing

    Гель-электрофорез, часто также называемый электрофорезом ДНК или просто электрофорезом, — это метод, который используется для разделения фрагментов ДНК (и других заряженных молекул) по размеру. Обычно это делается с использованием геля агарозы и электрического заряда, чтобы отделить фрагменты друг от друга.

    Этот метод имеет несколько применений, включая исследование ДНК, снятие отпечатков пальцев ДНК, криминологию, а также различные медицинские приложения.

    Что такое гель-электрофорез?

    Гель-электрофорез — это метод, который позволяет ученым разделять заряженные молекулы по размеру. Это включает ДНК, РНК и белки.

    Помните, ДНК и РНК имеют небольшой отрицательный заряд благодаря отрицательно заряженным молекулам кислорода в сахарно-фосфатной основе молекулы.Белки могут иметь ряд зарядов в зависимости от аминокислот в полипептидной цепи.

    Компоненты электрофореза

    Для проведения электрофореза сначала необходимо приготовить гель. Это можно сделать практически в любой лаборатории; Наиболее распространены агарозные гели. Чтобы сделать гель, порошок агарозы смешивают со специальным буфером, называемым буфером для электрофореза. Затем эту смесь нагревают до растворения агарозы и полностью смешивают с буферным раствором.

    Обратите внимание, что некоторые протоколы электрофореза требуют добавления бромистого этидия (Et-Br).Это окрашивает любую ДНК, используемую в электрофорезе, чтобы вы могли видеть положение фрагментов в УФ-свете.

    Формование геля

    Затем его выливают в прямоугольную форму, называемую лотком для заливки геля. Наряду с формой, которая создает прямоугольный гель, используемый для электрофореза, на одном из концов геля помещается гребешок. Эта гребенка создает лунки, в которые загружаются образцы, которые вы хотите разделить с помощью электрофореза. Вы можете увидеть картинку здесь.

    После затвердевания геля гребенку из лунок удаляют и гель помещают в специальный резервуар для электрофореза.Другой буфер заполняется в резервуар до тех пор, пока небольшой слой буфера полностью не покроет агарозный гель.

    Этот резервуар вырабатывает электрический ток (от 50 до 150 В) через буферный раствор и, в свою очередь, через гель агарозы. Лунки с агарозным гелем помещают на отрицательном конце тока (катод , ), а другой конец геля — на положительном конце тока (анод , ).

    Как работает электрофорез?

    Перед тем, как электрический ток будет пропущен через резервуар и гель, ваши образцы загружаются в лунки.Это делается с помощью микропипетки. «Маркерный» образец, также известный как «лестница ДНК», представляет собой образец с известными размерами фрагментов ДНК, который может помочь вам сравнить ваши образцы и понять размеры исследуемого образца.

    Часто следящий краситель (также называемый загрузочным красителем) добавляется к каждому образцу, чтобы помочь вам загрузить образец в лунки. Краситель также помогает отслеживать движение образцов через гель.

    Так как же образцы действительно проходят через гель и разделяются по размеру? Это связано с электрическим током , который проходит через агарозный гель, а также с размером / структурой фрагментов и геля агарозы.

    Заряд и размер Определите полосы ДНК

    Помните, что в целом заряд ДНК составляет отрицательных . Поэтому, когда эти образцы помещаются в лунки, которые находятся рядом с отрицательным концом электрического тока, это приведет к тому, что отрицательно заряженная ДНК отодвинется на от катода (отрицательный заряд) и переместится на к аноду (положительный заряд). на противоположном конце.

    Помимо этого движения образцов, электрофорез также разделяет образцы и фрагменты в этих образцах по размеру.Это связано с тем, что более мелкие молекулы и фрагменты могут двигаться быстрее, и легче через гель, в то время как более крупные молекулы и фрагменты перемещаются медленнее . Это означает, что мелкие фрагменты будут перемещаться к концу геля быстрее, чем более крупные, и в результате каждый фрагмент разделяется по размеру.

    После прохождения геля в течение примерно часа (в большинстве протоколов) заряд отключается и гель анализируется. Вы увидите отчетливую прямоугольную полосу, часто называемую полосой ДНК или полосой белка, в различных точках геля.Каждая полоса представляет собой один фрагмент, который двигался по гелю.

    Применение и применение электрофореза

    В лаборатории существует множество применений электрофореза. Вот лишь некоторые из них:

    • ДНК-дактилоскопия для мест совершения преступлений и генетического тестирования
    • Тестирование продуктов полимеразной цепной реакции
    • Анализ генов для медицинских целей
    • Сравнение ДНК между видами или потомками
    • Анализ эволюционных и таксономических отношений между видами
    • Понимание того, где рестрикционные ферменты разрезают разные участки ДНК
    • Тестирование отцовства
    • Тестирование устойчивости к антибиотикам

    Как интерпретировать результаты гель-электрофореза ДНК

    Электрофорез в агарозном геле — это метод молекулярной биологии для
    анализировать и разделять фрагменты ДНК в зависимости от их размера.Когда вы используете гель
    электрофорез, чтобы помочь вам с молекулярным клонированием, вы можете столкнуться с общей проблемой.

    Например, вы готовы вырезать расщепленную плазмидную ДНК из агарозы. Однако вы видите более одной полосы на вашем усвоенном образце и задаетесь вопросом, какую из них вырезать. В этой статье мы рассмотрим различные формы плазмидной ДНК и дадим несколько полезных советов по интерпретации вашего геля.

    Содержание артикула:

    Структура агарозы

    Как циркулярная плазмидная ДНК работает во время гель-электрофореза?

    4 Общие формы плазмидной ДНК

    Как интерпретировать результаты гель-электрофореза

    Связанные товары

    Ссылки

    Структура агарозы

    Агароза, полученная из морских водорослей, представляет собой полисахаридный агар.Во время полимеризации полимеры агарозы нековалентно связываются и образуют сеть пучков. Эта сеть состоит из пор с молекулярными фильтрующими свойствами.

    Концептуальная визуализация геля агарозы на микроскопическом уровне.

    Разделение ДНК происходит из-за сеткообразной природы геля агарозы. Более мелкие фрагменты ДНК могут быстро перемещаться через поры, в то время как более крупные фрагменты захватываются и, следовательно, перемещаются медленно.

    Давайте посмотрим, как все это работает.Под мощным микроскопом гель будет выглядеть пористым, но невооруженным глазом он выглядит как гладкий непрозрачный желатин в форме квадрата с лунками на одном конце поверхности. Лунка — это полый карман в геле, куда загружается ДНК. Из-за отрицательно заряженного фосфатного остова ДНК сохраняет небольшой отрицательный заряд, который позволяет молекуле перемещаться к положительно заряженному аноду. Расстояние перемещения молекул ДНК в агарозном геле пропорционально логарифму его молекулярной массы.

    Как циркулярная плазмидная ДНК работает во время гель-электрофореза?

    Условия гель-электрофореза (включая присутствие бромистого этидия, концентрации геля, напряженность электрического поля, температуру и ионную силу буфера для электрофореза) могут влиять на подвижность плазмидной ДНК. Благодаря сетчатой ​​природе геля агарозы кольцевая плазмидная ДНК легче захватывается сеткой агарозы.

    Электрофоретический захват — это баланс между
    электрофоретическая сила (притягивание кольцевой плазмидной ДНК к ловушке) и
    диффузия (позволяющая кольцевой плазмидной ДНК вырваться из ловушки).Итак, большой
    Круглые молекулы имеют больше шансов попасть в ловушку, чем ДНК меньшего размера. Суперспиральную ДНК сложнее поймать из-за небольшого размера скрученной ДНК.
    ДНК.

    4 Общие формы плазмидной ДНК

    CCC (Ковалентно замкнутый круг) Мономер

    Мономер

    CCC представляет собой отрицательно заряженную сверхспиральную плазмиду. Интактные суперспиральные плазмиды имеют компактную двухцепочечную ДНК, скрученную вокруг себя. Плазмидная ДНК, выделенная из бактериальных хозяев, обычно присутствует в этой форме CCC.Непереваренная плазмидная ДНК обычно имеет суперспирали.

    OC (открытый круг) Мономер

    Открытая кольцевая форма возникает в результате надрезания (расщепления) одной цепи ДНК. Ультрафиолетовое облучение или нуклеазы могут вызвать этот разрыв одной нити. Эта структура представляет собой расслабленную и менее компактную форму плазмиды. Он также имеет меньшую суперспиральность, чем форма CCC.

    Линейный мономер

    Линейная форма является результатом расщепления обеих цепей ДНК, вызванного эндонуклеазами рестрикции.

    OC Димер (Конкатемер)

    Димер

    OC представляет собой олигомерную форму плазмиды. Конкатемер может возникнуть из-за репликации. Димеры обычно увеличиваются вдвое по сравнению с мономерами.

    Как интерпретировать результаты гель-электрофореза

    1. Если возможно, загрузите непереваренные, линеаризованные и УФ-излученные плазмиды рядом друг с другом в агарозный гель, затем вы можете сравнить полосы между этими образцами.
    2. В общем, сверхспиральные формы CCC мономера движутся быстрее, чем любые другие формы, потому что они имеют компактную суперспиральную структуру ДНК.Следовательно, они будут появляться в геле ниже.
    3. Открытые кольцевые (OC) и линейные мономеры движутся медленнее, чем сверхспиральный мономер CCC. У них больше проблем с прохождением через поры в гелевой матрице, чем у формы CCC. Следовательно, формы ОК будут появляться выше в геле. Порядок миграции обычно — форма мономера CCC (самая быстрая), за которой следуют линейная форма и форма OC.
    4. Полностью переваренная плазмидная ДНК обычно показывает только одну полосу, линейную форму плазмиды, на своей дорожке с ожидаемым размером.Непереваренная плазмида может иметь две формы, отображаемые на ее дорожке: димер CCC и формы мономера CCC. Формы димеров из-за их большего размера и размера вдвое по сравнению с мономерами обычно движутся медленнее, чем мономеры. Следовательно, в геле он будет выше, чем в мономере. Мономерная форма CCC работает быстрее, чем линейная форма расщепленной плазмидной ДНК.

    Примеры гель-электрофореза плазмидных форм. Lane 1: ДНК Ladder. Дорожка 2: непереваренная плазмида А.Дорожка 3: полностью переваренная плазмида А. Дорожка 4: УФ-облученная плазмидная ДНК.

    Теперь, как практика, можете ли вы угадать форму каждой плазмиды из этих
    полосы из геля агарозы ниже?

    Гель-электрофорез. Дорожка 1: ДНК-лестница. Дорожка 2: непереваренная плазмида A. Дорожка 3: полностью расщепленная плазмида A.

    Ответ:

    На дорожке 2 вы можете увидеть две полосы. Слабая полоса сверху — это OC, а нижняя — форма CCC.Для дорожки 3 это полностью переваренная плазмида, поэтому полоса имеет линейную форму.

    Как определить полосы в гелях агарозы?

    Во время гель-электрофореза вам может потребоваться загрузить неразрезанную плазмидную ДНК, расщепленный фрагмент ДНК, продукт ПЦР и, возможно, геномную ДНК, которую вы используете в качестве матрицы ПЦР, в лунки. Ваш расщепленный фрагмент ДНК представляет собой расщепленный продукт ПЦР. Следующий шаг — определить эти полосы, чтобы решить, какую из них вырезать.

    Гель-электрофорез. Дорожка 1: ДНК-лестница. Дорожка 2: непереваренная плазмида А. Дорожка 3: полностью расщепленная плазмида А. Дорожка 4: расщепленный продукт ПЦР (или фрагмент ДНК). Дорожка 5: Продукт ПЦР (со слабой полосой димера праймера). Дорожка 6: Геномная ДНК. Белые стрелки указывают полосы, которые вы хотите удалить.

    Советы по определению правильной полосы для удаления геля

    • Неразрезанную плазмидную ДНК на агарозном геле легко идентифицировать, поскольку она может иметь две формы плазмиды (формы OC и CCC).
    • Расщепленная плазмида, фрагмент расщепленной ДНК, продукт ПЦР и геномная ДНК могут иметь одну единственную полосу.Чтобы идентифицировать эти полосы, вам нужно будет проверить их размер, сверяясь с лестницей ДНК. Ваша расщепленная плазмида имеет линейную форму с размером между формами OC и CCC неразрезанной плазмиды. Геномная ДНК имеет большой размер. Итак, геномная ДНК обычно видна на самом верху геля (очень близко к лунке).
    • Расщепленный фрагмент ДНК может иметь одну полосу почти такого же размера, что и ваш продукт ПЦР. Это ваш целевой размер, и полоса в этом переваренном фрагменте ДНК — та, которую вы хотите вырезать.
    • Внизу полосы продукта ПЦР вы можете увидеть слабую полосу, указывающую на небольшие молекулы. Эти небольшие молекулы являются вашими молекулами праймера, которые связываются с другими молекулами праймера с образованием димера праймера. Размер этих маленьких молекул не является вашим целевым размером, поэтому вы не хотите вырезать эту полосу.

    Чтобы узнать больше о том, как интерпретировать гель-электрофорез ДНК, посмотрите наше видео ниже:

    Сопутствующие товары

    Продукты агарозы

    Agarose LE (степень молекулярной биологии) (Кат.А-201)

    Агароза высокого разрешения (для нуклеотидов <1 килобайт) (Каталожный № A-202)

    Агароза с низким содержанием плавления (Каталожный № A-204)

    Лестницы ДНК

    ДНК Ladder 1 kb (Каталожный № D010)

    1 kb PLUS ™ DNA Ladder (Каталожный № D011)

    ДНК-лестница из 100 п.н. (Каталожный № D001)

    100 п.н. PLUS ™ DNA Ladder (Каталожный № D003)

    ДНК-лестница из 50 п.н. (Каталожный № D100)

    VersaLadder ™, 100–10 000 пар оснований (Кат.D012)

    Красящие продукты с загрузкой геля

    6X Blue Loading Dye (Каталожный № L002)

    Буфер для загрузки 6X GelRed ™ Prestain с синими отслеживающими красителями (Каталожный № G-730)

    6X GelRed ™ Загрузочный буфер для предварительного окрашивания с оранжевым отслеживающим красителем (Каталожный № G-735)

    6X Green Loading Dye (Каталожный № L001)

    Свободная кислота бромфенолового синего, класс ACS (Каталожный № B092)

    Ксилолцианол FF, сверхчистый (Каталожный № X-300)

    Список литературы

    Коул, К.Д. и Теллез К. М. (2002). Разделение большой кольцевой ДНК электрофорезом в агарозных гелях. Прогресс биотехнологии, 18 (1), 82-87.

    Грин, М. Р., Сэмбрук, Дж. (2019a). Электрофорез в агарозном геле. Протоколы Колд-Спринг-Харбор, 2019 (1), pdb. prot100404.

    Джонсон, П. Х., и Гроссман, Л. И. (1977). Электрофорез ДНК в агарозных гелях. Оптимизация разделения конформационных изомеров двух- и одноцепочечных ДНК. Биохимия, 16 (19), 4217-4225.

    Шлиф, М. (2008). Плазмиды для терапии и вакцинации : John Wiley & Sons.

    Шмидт, Т., Friehs, K., & Flaschel, E. (2001). Структуры плазмидной ДНК. Плазмиды для терапии и вакцинации , 29-43

    Электрофорез белков — eClinpath

    Электрофорез сывороточного белка (SPE) разделяет белки на несколько полос с помощью электрического поля и может проводиться в различных средах, включая ацетат целлюлозы (в значительной степени замененный), агарозный гель или жидкость в капиллярной трубке (капиллярная зона).Все они разделяют белки на отдельные полосы или фракции. Фракции разделены по загрузке и размеру. Альбумин является наиболее распространенным отдельным белком в сыворотке и образует единую четкую полосу в геле. Глобулины далее разделяются, обычно на несколько полос, обозначаемых α1, α2, β1, β2 и γ. Несмотря на то, что есть один пик в каждом из разделенных компонентов, на самом деле существует несколько белков внутри многих пиков, то есть один пик не эквивалентен одному белку. При физиологическом pH большинство белков заряжены отрицательно, альбумин имеет более сильный отрицательный заряд и мигрирует дальше к положительному аноду, тогда как иммуноглобулины имеют самый слабый отрицательный заряд и находятся ближе к отрицательно заряженному катоду.Анод обычно изображается слева от электрофореграммы, делая альбумин первым пиком), а катод справа от электрофореграммы, делая иммуноглобулины последним пиком.

    Результаты SPE: отслеживание денситометром и таблица концентрации белка

    Белки можно визуализировать в виде денситометрической записи и полуколичественно определить в процентах от площади под кривой трассировки. Процент преобразуется в абсолютную концентрацию с использованием общей концентрации белка, полученной с помощью химического анализатора (аналогично количеству лейкоцитов, позволяющему преобразовать процент дифференциального подсчета клеток в абсолютное дифференциальное количество клеток).. Каждый результат SPE должен содержать два компонента: изображение графика плотномера и таблицу концентраций белка в каждой полосе.

    SPE чаще всего выполняется, чтобы отличить гиперглобулинемию, вызванную врожденным и / или приобретенным иммунным ответом (т. Е. Острофазовым ответом и / или «поликлональной гаммопатией»), от гиперглобулинемии, вызванной неопластической пролиферацией клона В-лимфоцитов или плазмы. клетки («моноклональная гаммопатия»). Электрофорез сывороточного белка обычно не применяется в случаях гипопротеинемии.Электрофорез не является подходящим методом для количественной оценки индивидуальных иммуноглобулинов или уровней иммуноглобулинов против конкретного антигена (например, инфекционных агентов).

    Электрофорез может также выполняться на других жидкостях, включая мочу (для потенциальной идентификации белков Бенс-Джонса у животных с подозрением на множественную миелому), жидкостях полости тела (например, перитонеальной жидкости для подтверждения диагноза инфекционного перитонита кошек, но это не всегда готово) и спинномозговой жидкости (при различных неврологических заболеваниях; опять же, это обычно не делается).

    Метод измерения

    Электрофорез разделяет белки жидкостей организма на несколько полос с использованием различных сред, как описано выше. В Cornell мы использовали электрофорез в агарозном геле, который используется для большинства изображений на этой странице (если не указано иное).

    • Электрофорез в агарозном геле : Процедура начинается с нанесения аликвоты сыворотки на гель. Гель содержит щелочной буфер, и в этой среде все белки имеют отрицательный заряд разной величины.Затем через среду в течение заданного периода времени пропускается сильный электрический ток. В это время белки перемещаются от точки приложения к положительно заряженному аноду на различные расстояния, связанные с их зарядом, размером и формой. Более чем один тип белка может мигрировать в одно и то же место в геле (поэтому один пик может содержать много разных белков). Альбумин имеет самый сильный отрицательный заряд в среде щелочного геля и является одним из самых маленьких белков в сыворотке.Из-за заряда и небольшого размера альбумин мигрирует дальше всего. Большие и более слабо заряженные белки, такие как иммуноглобулины, могут очень мало перемещаться в пределах электрического тока. По истечении заданного периода гель с отделенными белками удаляется и погружается в раствор, окрашивающий белок. Можно использовать несколько красителей, которые имеют разное сродство к белкам в сыворотке, например коллоидный синий, суданский черный, кислотный синий. Эти пятна могут давать разные результаты или могут выделять разные полосы, поэтому при сравнении результатов у отдельного пациента следует использовать один и тот же метод.Раньше в нашей лаборатории агарозные гели окрашивали кислотным синим. Очистка геля в уксусной кислоте показывает серию полос в разных положениях; ширина и плотность полос зависит от количества белков с данной электрофоретической подвижностью. После высыхания гель можно проверить визуально на наличие полос. Каждая полоса на геле представляет собой один или несколько белков с аналогичными размерами и характеристиками заряда. Альбумин является наиболее распространенным отдельным белком в сыворотке и образует единую четкую полосу в геле.Глобулины далее разделяются на 12 полос, в зависимости от вида и основных заболеваний. Эти полосы разделены на группы или фракции, обычно обозначаемые как α1, α2, β1, β2 и γ, в зависимости от их расположения относительно альбумина (α-глобулины находятся рядом с альбумином, а γ-глобулины находятся дальше всего от альбумина). Затем гель помещают в прибор, называемый денситометром, который определяет количество белка в каждой полосе по поглощению света.Денситометр преобразует эту информацию в серию пиков, называемых электрофореграммой. Технолог и клинический патологоанатом принимают (несколько субъективное) решение о том, как разделить пики на несколько фракций. Площадь под каждой кривой пропорциональна процентному содержанию этой фракции в сыворотке. Концентрация белка в каждой фракции в сыворотке определяется умножением общей концентрации белка в жидкости (полученной с помощью химического анализатора по реакции Биурета) на процентное значение каждой фракции (т.е.е. абсолютная доля белка в г / дл = общий белок в г / дл x% по данным денситометра). Затем абсолютные значения сравниваются с эталонными интервалами для рассматриваемых видов, если таковые имеются.

      Агароза против капиллярной зоны

    • Капиллярный зональный электрофорез (CZE) : это метод, который в настоящее время используется в Корнельском университете. Аликвоту сыворотки (или другого типа жидкости) добавляют к раствору жидкого электролита и протягивают через капиллярную трубку на основе диоксида кремния (от анода к катоду) с помощью электрического тока, который создает эндоосмотический поток к отрицательно заряженному катоду.Ультрафиолетовый детектор, подключенный к фотоумножителю, расположен на катоде и измеряет поглощение ионных молекул при их прохождении. Молекулы перемещаются по трубке в зависимости от заряда и размера, при этом менее отрицательно заряженные молекулы, такие как иммуноглобулины, мигрируют ближе к катоду и сначала отделяются, затем следуют более отрицательно заряженные частицы с более низким отношением заряда к массе (больше), а затем с более высоким зарядом. к массовым соотношениям (меньшим), а именно к альбумину. Конечный продукт от CZE похож на агарозный гель в том, что он дает отслеживание различных фракций, а также визуальное представление интенсивности поглощения, подобное окрашенному гелю.Собственное сравнение электрофореза в агарозном геле и CZE в нашей лаборатории показывает аналогичные результаты, за исключением того, что высота пика различается (и различается в зависимости от вида). Разрешение капиллярной зоны выше с более отрицательно заряженными молекулами, такими как альбумин, где у некоторых животных (и чаще у некоторых видов, таких как лошади) можно наблюдать два пика по сравнению с гамма-областью, где это может быть затруднительно. чтобы отличить поликлональную гаммапатию от моноклональной (Keren 1998).

    Устный перевод

    Содержание альфа-, бета- и гамма-диапазонов при электрофорезе сывороточных белков весьма разнообразно, но у большинства видов наиболее клинически значимые из них можно резюмировать следующим образом:

    • Альфа (α1 и α2): белков острой фазы, например гаптоглобин, гликопротеин α1-кислоты. У человека липопротеины высокой плотности могут мигрировать в эту область.
    • Бета (β1 и β2): Это гетерогенная группа, которая включает некоторые белки острой фазы, липопротеины (у людей липопротеины низкой плотности считаются β-липопротеинами, тогда как липопротеины очень низкой плотности считаются пре-β липопротеинами. ), иммуноглобулины (некоторые изотопы IgG, например.грамм. IgG1 у собак, IgM и IgA) и другие белки, например трансферрин (β1-глобулин). Фибриноген, β2-глобулин, не должен присутствовать на электрофореграмме, потому что тест должен проводиться на сыворотке , а не плазме.
    • Гамма (γ): Обычно IgG, однако IgM и IgA охватывают позднюю область β2-γ.

    Форма записи электрофореграммы и количество белка в различных фракциях предоставляют информацию об основном заболевании, т. Е.Интерпретация результатов электрофореза может быть как качественной, так и количественной — характер изменений на трассировке интерпретируется с абсолютными результатами и референсными интервалами для видов (если таковые имеются). Если он недоступен, мы ссылаемся на литературу для руководства и , чтобы помочь нам интерпретировать изменения, однако результаты очень зависят от метода, использованного для получения результатов (см. Выше).

    У здоровых животных присутствует большое количество альбумина, небольшие количества α- и β-глобулинов и смесь иммуноглобулинов, которая дает небольшую широкую кривую в γ-области. В целом мы распознаем следующие болезненные процессы на электрофореграмме (см. Выше, ):

    • Реакция острой фазы : Это врожденный иммунный ответ на воспаление, травму, инфекцию или повреждение ткани.Это характеризуется увеличением α-глобулинов (обычно α2-глобулинов у большинства видов). Фибриноген также является положительным белком острой фазы, однако он должен отсутствовать в образцах сыворотки. Эта реакция происходит очень быстро, то есть в течение нескольких часов после соответствующего стимула.
    • Поликлональная гаммапатия : Это указывает на приобретенный иммунный ответ на антигенный стимул с выработкой иммуноглобулина многими различными В-лимфоцитами. Различные иммуноглобулины (IgG, IgM, IgA), а также разные изотопы одного и того же иммуноглобулина (например,грамм. IgG1, IgG2a, IgG2b) продуцируются, что приводит к увеличению γ и обычно β) глобулинов, которые образуют широкое основание и широкий пик. Это поликлональная гаммопатия. Поскольку для ответа антител (анамнестического ответа на антиген) требуется около 7-10 дней, для развития этого типа гаммопатии требуется несколько дней. Существует множество различных ситуаций, которые приводят к поликлональной гаммопатии, включая инфекционные агенты, воспаление, заболевание печени, респираторное заболевание. Если источник антигенной стимуляции одновременно вызывает реакцию острой фазы, электрофореграмма покажет ответ острой фазы и поликлональную гаммопатию.
    • Моноклональная гаммопатия : Это указывает на то, что один клон иммуноглобулинов продуцируется В-клеткой или плазматической клеткой, и приводит к появлению узкой полосы (аналогичной ширине альбумина) в β- или γ-области электрофореграммы. Обычно это происходит из-за новообразования B или плазматических клеток (например, B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз, экстрамедуллярная плазмоцитома, множественная миелома). В редких случаях инфекционный агент может спровоцировать ограниченную экспансию (даже клональную экспансию) определенного клона лимфоцитов, что приводит к «моноклональному» ответу.В большинстве случаев это не «настоящий» моноклональный препарат, а на самом деле ограниченный олигоклональный препарат (отражающий рост очень небольшого количества лимфоцитов), но в некоторых случаях рисунок электрофореграммы имитирует истинную моноклональную гаммопатию, но вовлеченный иммуноглобулин всегда представляет собой IgG. . Мы наблюдали этот тип ответа при заражении Streptococcus zooepidemicus у кошек и Ehrlichia canis у собак.

    Накладка гемоглобина

    Артефакты

    Гемолиз приводит к образованию комплексов гемоглобин-гаптоглобин.У собак, кошек и лошадей это обычно мигрирует в области β-2 (см. Изображение справа), однако это верно не для всех видов. У игуан гемоглобин мигрирует в области β-2, тогда как у слайдеров пруда гемоглобин перемещается во фракциях α-1 и β-глобулина (Giménez et al 2010).

    Острый фазовый отклик

    Электрофореграмма острой фазы отклика

    Белки острой фазы мигрируют в α- (в основном) и β-областях электрофореграммы, а иммуноглобулины составляют основную часть γ-области (хотя IgA, IgM и специфические подклассы IgG могут мигрировать в поздней β-области. ).Поскольку многие белки острой фазы являются α-глобулинами, увеличение концентрации α1- или α2-глобулинов является признаком острофазовой реакции и обнаруживается вскоре после начала воспаления, травмы или инфекции и может сохраняться до тех пор, пока не возникнет побуждающий стимул. решено. Как указано выше, эта реакция возникает быстро (в течение нескольких часов) и быстро уменьшается. Прямое измерение положительных белков острой фазы, например С-реактивный белок у собак, α1-кислотный гликопротеин, гаптоглобин у крупного рогатого скота, сывороточный амилоид А у лошадей) является более точным способом оценки острой фазы ответа.Обратите внимание, что некоторые белки острой фазы повышаются при медикаментозном лечении. Например, глюкокортикоиды увеличивают гаптоглобин и приводят к пику α2-глобулина у собак. Кроме того, отсутствие повышения уровня α-глобулинов не исключает лежащего в основе острофазового ответа. Мы наблюдаем увеличение α-глобулинов только тогда, когда белки острой фазы, обычно присутствующие в высоких концентрациях (количества в миллиграммах или граммах, например, гаптоглобин), увеличиваются в сыворотке. Белки острой фазы, обнаруженные в меньших количествах (количества в нанограммах или пикограммах, например.грамм. сывороточный амилоид A) не приведет к увеличению альфа-глобулинов, даже если он заметно повышен в сыворотке. Таким образом, измерение конкретных белков острой фазы является более чувствительным тестом реакции острой фазы, чем электрофорез.

    Типичные данные по SPE в острой фазе ответа:

    • Нормальное или умеренное увеличение общего белка (по данным химического анализатора, но включено в отчет SPE)
    • Снижение альбумина от нормального до умеренного (отрицательный белок острой фазы)
    • Переменное увеличение α1- или α2-глобулинов

    Поликлональная гаммопатия

    Электрофореграмма поликлональной гаммопатии

    Поликлональная гаммопатия у кошек с гингивитом

    Воспаление, инфекция или антигенная стимуляция любой причины (например,грамм. хронические заболевания печени, респираторные, желудочно-кишечные или дерматологические заболевания) могут вызывать секрецию смешанных иммуноглобулинов. Иммуноглобулины мигрируют в областях γ и β (большинство изотопов IgG мигрируют в пике γ; IgA и IgM мигрируют в начале γ и переходят в пик β). Иммуноглобулины, продуцируемые лимфоцитами и плазматическими клетками при иммунных ответах, происходят из множества клонов лимфоцитов или плазматических клеток и включают множество классов иммуноглобулинов. Следовательно, они имеют тенденцию перемещаться в несколько разные точки на электрофореграмме, что приводит к увеличению концентрации γ (а также обычно β) глобулинов с пиками в областях β и γ на графике, которые выше нормы и шире, чем альбумин. пик как у основания, так и (в некоторой степени) на кончике.Такие широкие пики в области γ описываются как поликлональная гаммапатия .

    Типичные результаты SPE поликлонального ответа:

    • Увеличение общего белка (по данным химического анализатора). В некоторых случаях концентрация общего белка может быть нормальной.
    • Широкий пик, обычно охватывающий области β и γ.

    Некоторые заболевания могут вызывать одновременный ответ в острой фазе и поликлональную гаммопатию, например.грамм. Кошачий инфекционный перитонит Вирусная инфекция у кошек, Leishmania инфекция у собак, системное воспаление. В этих случаях вы обычно увидите следующий шаблон ELP:

    • Увеличение общего белка (по данным химического анализатора).
    • Широкий пик, обычно охватывающий области β и γ (поликлональная гаммапатия).
    • Снижение альбумина от нормального до умеренного (отрицательный белок острой фазы)
    • Повышение уровня α1- или α2 глобулинов (острофазовый ответ).

    Моноклональная гаммопатия

    Электрофореграмма моноклональной гаммапатии

    Моноклональная гаммапатия IgG у кошек с множественной миеломой

    Иммуноглобулины, продуцируемые одним клоном В-лимфоцитов или плазматических клеток, обычно образуют высокий узкий пик в β- и γ-областях (в зависимости от задействованного иммуногльбулина). Это называется моноклональной гаммапатией . Моноклональная гаммопатия обычно возникает из-за следующего:

    • Иммуноглобулин-секретирующие В-клеточные новообразования , e.грамм. хронический лимфолейкоз или лимфома В-клеток.
    • Плазматические опухоли , например экстрамедуллярная плазмоцитома, солитарная миелома кости и множественная миелома.

    В этих случаях показано измерение соответствующего класса иммуноглобулинов, поскольку оно дает дополнительную информацию. В-клеточные опухоли обычно вызывают моноклональные гаммопатии IgM или IgG, тогда как моноклональные белки IgG или IgA обычно секретируются опухолями плазматических клеток. Кроме того, у пациентов с этими новообразованиями обычно снижается количество не задействованных иммуноглобулинов (вторичный иммунодефицит), что может помочь отличить истинное моноклональное распространение от ограниченного олигоклонального или «моноклонально-подобного» распространения вторичного инфекционного агента (в котором задействованный иммуноглобулин является вторичным. обычно концентрации IgG и иммуноглобулинов А и М обычно не снижаются).

    «Сплит-моноклональная» гаммопатия

    Необычные гаммопатии

    • «Расщепленная моноклональная» гаммапатия: Этот термин применяется, когда присутствуют два моноклональных пика. По нашему опыту, эта картина обычно связана с моноклональным IgA (который может димеризоваться). В редких случаях это может быть связано с секрецией двух разных иммуноглобулинов, т.е. истинной «биклональной» гаммопатией. Следовательно, в этих случаях полезно измерение вовлеченных типов иммуноглобулинов (обычно выполняется радиальной иммунодиффузией или RID).
    • «Ограниченная олигоклональная» гаммопатия: Этот термин применяется к высокому узкому «моноклональному» пику, наложенному на широкое «поликлональное» основание. Мы часто наблюдаем эту закономерность у собак и кошек с иммуноопосредованными, инфекционными или воспалительными состояниями, например тяжелый лимфоплазмоцитарный стоматит, инфекция Ehrlichia canis . Это вызвано стимуляцией специфических В-клеток, приводящей к секреции нескольких ограниченных классов иммуноглобулинов.Однако этот тип электрофореграммы также может быть связан с новообразованием лимфоидных клеток у животного с одновременной антигенной стимуляцией.

      «Ограниченная олигоклональная» гаммопатия

      Измерение конкретных концентраций иммуноглобулинов помогает различать эти возможности (как и тестирование на инфекционные заболевания и диагностические тесты для основного заболевания). Если иммуноглобулины в основном представляют собой IgG с повышенными или нормальными концентрациями IgM или IgA, «ограниченная олигоклональная» гаммопатия, вызванная инфекционным, воспалительным или иммуноопосредованным заболеванием, более вероятна, чем лимфоидная неоплазия.

    Агрессивная миелома легкой цепи, вызывающая двойной пик при электрофорезе сыворотки: что скрывается? — FullText — Acta Haematologica 2020, Vol. 143, № 1


    Уважаемый редактор,

    Миелома со свободными легкими цепями обычно характеризуется гипогаммаглобулинемией при обращении. По этой причине у таких пациентов наблюдение двойной M-полосы при электрофорезе сыворотки в отсутствие полных иммуноглобулинов при иммуноэлектрофорезе является редким явлением.

    Мы сообщаем о случае 57-летнего мужчины европеоидной расы, страдающего диабетом, недавняя история болезни которого началась с поступления в отделение неотложной помощи с метаболическим ацидозом и болями в костях. Образцы крови показали тяжелую почечную недостаточность, легкую анемию и гиперкальциемию, а именно: гемоглобин 9,4 г / дл, креатинин 9,54 мг / дл, общий белок сыворотки 7,6 г / дл, альбумин 3,6 г / дл и кальций 12,9 мг / дл. Бета-2-микроглобулин составлял 34,6 мкг / мл, а NTproBNP составлял 1154 пг / мл, без признаков сердечной недостаточности. При рентгенологическом обследовании выявлено несколько остеолитических поражений позвоночника.Биопсия костного мозга выявила массивную плазмоклеточную инфильтрацию более чем на 90%. Цитофлуориметрическое исследование, проведенное на образце костного мозга, показало, что 99% CD138 / CD38 / CD33 / CD56 позитивных плазматических клеток экспрессируют цитоплазматические лямбда-цепи.

    При электрофорезе миграция белка в гамма-области составила 16,6% (1,3 г / дл) с двойной M-полосой 7,4% (0,59 г / дл) и 8,5% (0,65 г / дл), соответственно. (Рис. 1), в то время как иммуноэлектрофорез в сыворотке и моче однозначно обнаружил присутствие свободных от лямбда легких цепей, а доза иммуноглобулина соответствовала глобальной гипогаммаглобулинемии.Дозировка свободной легкой цепи была следующей: лямбда 44 171,5 мг / л, каппа 6,7 мг / л. Пациент первоначально лечился бортезомиб-талидомид-дексаметазоном, но решил продолжить лечение в другом месте по материально-техническим причинам. Насколько нам известно, через год он был жив.

    Рис. 1.

    Денситометрическое отслеживание электрофореза белков сыворотки, выявляющее двойную М-полосу у пациента, страдающего миеломой легких цепей.

    Об этом явлении действительно мало литературы, о котором, кажется, редко сообщают.Подводя итог тому, что обычно известно о двойных гаммопатиях, можно выделить следующие параметры: одновременная антигенная экспансия двух клонов B-клеток, второй злокачественный клон, единственный злокачественный клон с отбором субклонов, легкие цепи, превышающие продукцию тяжелых цепей в патологическая моноклональная гаммопатия, или димеризация IgA [1, 2]. Мы не смогли отнести нашего пациента ни к одной из этих категорий, поскольку иммуноэлектрофорез обнаружил только лямбда-легкие цепи в образцах сыворотки.

    В 1976 г. Sölling [3] описал присутствие димерных лямбда-цепей в сыворотке как нормальных, так и анефрических людей. В отличие от каппа-цепей, которые в основном были связаны нековалентно и существовали в виде преобладающих мономерных форм, лямбда-цепи генерировали ковалентные связи и определялись как стабильные диммеры. Более того, обнаружено, что наличие концентрации легких цепей в сыворотке коррелирует с нарушением функции почек.

    В 2015 году Yang et al. [4] описали когорту из 26 пациентов, страдающих множественной миеломой, у которых была клональная M-полоса, состоящая из интактных иммуноглобулинов с двумя разными типами легких цепей лямбда, которые мигрировали по-разному при иммунофиксационном электрофорезе.Авторы пришли к выводу, что «две легкие цепи λ могут быть разными» [4].

    В заключение, мы можем предположить, что наш пациент имел биологическое заболевание, подобное тому, которое описано в китайской когорте [4], с той лишь разницей, что это миелома легкой цепи. Двойной пик, о котором мы сообщаем, мог возникнуть как из-за чрезмерного производства двух различных типов свободных лямбда-цепей, каждый из которых определяет М-полосу, так и из-за необычайного количества идентичных легких цепей лямбда, подчеркнутого почечной недостаточностью, которая частично подверглась димеризации.

    Заявление об этике

    Пациент предоставил письменное информированное согласие на публикацию клинических данных и лабораторных изображений.

    Заявление о раскрытии информации

    Авторы не заявляют о конфликте интересов и не получали финансирования для этой статьи.

    Вклад авторов

    Все авторы внесли свой вклад в клиническое ведение пациента и критически рассмотрели статью. НАПРИМЕР. подготовил документ. U.B. предоставил лабораторное изображение.

    Список литературы

    1. Guastafierro S, Ferrara MG, Sica A, Parascandola RR, Santangelo S, Falcone U. Двойные моноклональные компоненты сыворотки и гематологические злокачественные новообразования: только случайная ассоциация? Рассмотрение 34 случаев. Leuk Res.2012 Октябрь; 36 (10): 1274–7.

    2. Сринивасан В.К., Бхагат П., Бансал Ф., Чхабра С. Возникновение двойных моноклональных полос при электрофорезе белков: необычная находка. Индийский J Переливание гематоловой крови. 2016 июн; 32 (1 приложение 1): 184–8.

    3. Зёллинг К.Полимерные формы свободных легких цепей в сыворотке крови здоровых людей и пациентов с почечными заболеваниями. Сканд Дж. Клин Лаб Инвест. 1976 сентябрь; 36 (5): 447–52.

    4. Ян Г, Гэн Ц., Чен В. Клинические характеристики группы пациентов с множественной миеломой, у которых были две разные легкие цепи λ по данным иммунофиксационного электрофореза: ретроспективное исследование из одного центра.Exp Ther Med. 2015 Май; 9 (5): 1895–900.


    Автор Контакты

    Д-р Эухенио Галли

    Istituto di Ematologia, Polo Di Onco-Ematologia

    Università Cattolica del Sacro Cuore, Largo F. Vito 1

    IT – 0068 Rome (Италия)

    E-Mail eug.gal[email protected]


    Подробности статьи / публикации

    Поступила: 12 ноября 2018 г.
    Дата принятия: 10 мая 2019 г.
    Опубликована онлайн: 3 июля 2019 г.
    Дата выпуска: январь 2020 года

    Количество страниц для печати: 2
    Количество рисунков: 1
    Количество столов: 0

    ISSN: 0001-5792 (печатный)
    eISSN: 1421-9662 (онлайн)

    Для дополнительной информации: https: // www.karger.com/AHA


    Авторские права / Дозировка препарата / Заявление об ограничении ответственности

    Авторские права: Все права защищены. Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование или с помощью какой-либо системы хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
    Дозировка лекарств: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор и дозировка лекарств, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации.Тем не менее, ввиду продолжающихся исследований, изменений в правительственных постановлениях и постоянного потока информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на них, читателю рекомендуется проверять листок-вкладыш для каждого препарата на предмет любых изменений показаний и дозировки, а также дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендованным агентом является новый и / или редко применяемый препарат.
    Отказ от ответственности: утверждения, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и соавторам, а не издателям и редакторам.Появление в публикации рекламы и / или ссылок на продукты не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор (-ы) не несут ответственности за любой ущерб, причиненный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в контенте или рекламе.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.