Электрофорез механизм действия показания и противопоказания: Страница не найдена

Содержание

показания и противопоказания, методики, алгоритм проведения, механизм действия, преимущества

В настоящее время в лечении различных заболеваний используют разнообразные методы. Если раньше медицина больше основывалась на лекарственной терапии, то сейчас часто назначают физиотерапевтические процедуры. Они помогают быстрее справиться с болезнью. Надо знать, что физиотерапия включает много методов, с одним из которых мы и познакомимся подробнее. Рассмотрим, что собой представляет лекарственный электрофорез, при каких патологиях он показан и имеет ли противопоказания.

Сущность метода лечения

Электрофорез относится к физиотерапевтическим процедурам. Во время сеанса организм пациента подвергается воздействию электрических импульсов с целью получить стойкий терапевтический эффект.

Лекарственный электрофорез используют также для введения медицинских препаратов через кожные покровы и слизистые оболочки. Можно сказать, что этот метод является комплексным, так как идет одновременное воздействие тока и лекарственного средства. Какой препарат выбрать для процедуры, каковы процентное содержание и полярность введения, определяет только лечащий врач с учетом состояния пациента и тяжести заболевания.

Сущность электрофореза сводится к тому, что лекарственные препараты поступают внутрь тканей в виде заряженных частиц через межклеточные пространства, протоки потовых и сальных желез. В результате воздействия электрического тока эффективность препаратов существенно увеличивается, так как происходит повышение чувствительности тканей.

Все медикаменты вводятся с учетом их полярности, если это катионы, то они вводятся с анода, а анионы — с катода. Самым лучшим растворителем считается дистиллированная вода, но для плохорастворимых соединений используют спирт или «Димексид».

Лекарственный электрофорез

Механизм действия этой процедуры заключается в том, что лекарственный препарат в виде ионов поступает внутрь организма пациента через поры и протоки сальных и потовых желез. Катионы и анионы задерживаются на кожных покровах под электродом, а затем постепенно проникают в кровь и лимфу. Из-за такого постепенного поступления воздействие лекарства на организм длительное, что является одним из преимуществ этого метода терапии.

Осуществляется лекарственный электрофорез при помощи разных аппаратов, одним из которых является «Поток». Этот прибор в медицине используется уже давно, он проверен временем и надежен. Есть возможность регулировать во время процедуры силу тока, а также устанавливать время. В настоящее время выпускаются современные аналоги прибора, которые имеют цифровые индикаторы.

Чтобы получить терапевтический эффект, совсем необязательно располагать электроды на больном органе или вводить большие дозы препаратов. Посредством физиотерапии вводят ионы кальция, магния, йода для повышения рефлекторного воздействия на пораженную ткань.

Методики проведения электрофореза

Чтобы повысить эффективность данной процедуры, постоянно разрабатываются и совершенствуются методики электрофореза лекарственного. В настоящее время используют следующие:

Пролонгированная гальванизация. Применяют электрический ток малой силы, но время воздействия продолжительное. Батарея «Крона» является источником тока. Курс лечебных процедур обычно составляет 20-30 сеансов. Электрофорез хорошо успокаивает, оказывает обезболивающее действие.
Лабильная гальванизация. Один электрод во время процедуры закрепляется неподвижно, а второй находится в движении и перемещается со скоростью 3-5 см в секунду по поверхности кожи. Чтобы исключить колебания тока, в аппарат вводят стабилизирующее устройство. Процедура хорошо повышает метаболизм, улучшает кровоснабжение органов и тканей и нервно-мышечную проводимость.
Внутритканевый электрофорез. Проведение процедуры лекарственного электрофореза по данной методике сводится к введению через канюлю подкожно или внутримышечно препарата или смеси веществ. Вводиться лекарство может струйно или капельно. К очагу поражения поперек накладывают электроды, чтобы увеличить концентрацию медицинского препарата. Если лекарство вводят струйно, то ток включают одновременно с этим, а при капельном — после введения.

В неврологической практике электрофорез используют при многих заболеваниях нервной системы. Применяют следующие методики:

1. Вакуум-электрофорез. Используется специальный аппарат ЭВАК-1, который имеет вакуумный насос, кюветы. Во время процедуры кюветы прикладываются к кожным покровам или слизистой оболочке, а прокладка пропитывается лекарственным препаратом. После того как создается разряженное давление, кожа приподнимается и тесно соприкасается с препаратом. Длительность процедуры составляет всего 5-10 минут, на курс необходимо сделать таких 5-10 в зависимости от состояния пациента и тяжести его заболевания. Этот метод электрофореза позволяет ввести большее количество лекарства и гораздо глубже.

2. Микроэлектрофорез. Для проведения процедуры используют ватный вкладыш, в который вставляют фитилек, пропитанный лекарственным препаратом. Сверху располагается электрод для создания контакта металлического наконечника с ватой. Применение лекарственного электрофореза по данной методике используют часто при гипертонии, нарушениях сна, патологиях нервной системы.

3. Электрофонофорез представляет собой сочетание ультразвука и электрофореза. Имеется специальный прибор, который состоит из источника переменного тока, оказывающего терапевтический эффект, датчика, преобразующего ультразвук, источника стабилизированного тока, электронасадки и электрода. Во время процедуры электрод фиксируется на коже, электронасадку заполняют препаратом, закрепляют на ультразвуковом датчике и соединяют с другим полюсом источника тока. Сила тока наращивается постепенно, а потом уже включается ультразвук. Процедуры делают ежедневно, можно через день, по 10-15 минут.

Методики электрофореза лекарственного разные, но какие использовать, решает лечащий врач.

Способы электрофореза

Кроме различных методик, имеются способы использования данной процедуры:

Ванночковый. Сущность заключается в том, что в специальную емкость со встроенными электродами помещается лекарственный раствор и погружается часть тела пациента.
Внутритканевый. Внутривенно или перорально вводят препарат, а на больной участок накладывают электроды.
Полостной способ используют при заболеваниях прямой кишки или влагалища. Внутрь вводится лекарство и подводится электрод, а второй электрод прикрепляется на внешней части тела.

Если назначается лекарственный электрофорез, алгоритм проведения важно знать, но надо также и учитывать, что на всасывание препарата могут оказать влияние различные факторы:

Место воздействия процедуры.
Возраст больного.
Продолжительность электрофореза.
Дозировка и концентрация лекарства.
Сила электрического тока.
Заряд ионов и их размер.
Индивидуальные особенности пациента.

Все это необходимо учитывать и корректировать параметры в каждом случае индивидуально.

В чем преимущества электрофореза

Существует много физиотерапевтических процедур, и каждая имеет свои плюсы и минусы. Преимущества лекарственного электрофореза заключаются в следующем:

Во время процедуры вводится небольшое количество лекарственного средства.
Вещества накапливаются, значит, процедура оказывает пролонгированное действие.
Лекарства вводятся в наиболее доступной форме, в виде ионов.
Создается высокая местная концентрация без насыщения крови и лимфы.
Можно вводить лекарственные вещества в места патологии, что особенно важно при нарушении микроциркуляции.
Процедура абсолютно безболезненная.
Очень редко наблюдаются побочные эффекты.
Лекарства не поступают в ЖКТ, а значит, не разрушаются.
Лекарственное вещество вводится через целостные кожные покровы, поэтому специальной стерилизации не требуется.

Таким образом, можно сказать, что этот метод физиотерапевтического воздействия не только эффективный, но и безопасный. Но прежде чем делать лекарственный электрофорез, показания и противопоказания должны быть изучены.

В каких случаях назначают электрофорез

Эта физиотерапевтическая процедура назначается достаточно часто в комплексном лечении многих неврологических, гинекологических, хирургических заболеваний. Не обходится без электрофореза педиатрия и стоматология. Вот перечень некоторых патологий, которые успешно лечатся данной процедурой:

Болезни органов дыхательной системы, начиная с обычного бронхита и заканчивая бронхиальной астмой и пневмонией.
Заболевания уха, горла и носа.
Прекрасно поддаются терапии болезни ЖКТ, например гастрит, панкреатит, язвенная болезнь.
Используется электрофорез в комплексной терапии патологий сердечно-сосудистой системы. Сюда можно отнести гипертонию, гипотонию, стенокардию, мерцательную аритмию и др.
Заболевания мочеполовой системы.
Патологии нервной системы практически не обходятся без данного способа лечения. Прекрасно лечатся мигрени, неврозы, радикулиты, межпозвоночные грыжи и др.
Опорно-двигательная система также хорошо отзывается на электрофорез. Эту процедуру часто назначают после переломов, при остеохондрозе, артрозе, артрите.
Болезни эндокринной системы.
Кожные заболевания.
В области стоматологии также не редкость электрофорез, например при стоматите, гингивите, пародонтите.

Как видно из приведенного списка, лекарственный электрофорез показания имеет достаточно обширные.

Противопоказания к процедуре

Нет такого лечения или процедуры, которые бы были разрешены абсолютно всем. Мы уже рассмотрели, какие имеет лекарственный электрофорез показания. И противопоказания у данного метода терапии имеются. К таковым можно отнести:

Доброкачественные и злокачественные новообразования в любом месте организма.
Наличие сердечной недостаточности.
Наличие кардиостимулятора.
Любой воспалительный процесс в организме в стадии обострения.
Высокая температура тела.
Тяжелая форма бронхиальной астмы.
Нарушения свертывания крови.
Кожные заболевания, например экзема или дерматит.
Нарушение чувствительности кожных покровов.
Наличие механических повреждений в месте наложения лекарственных прокладок.
Непереносимость электрического тока.
Аллергия на лекарственный препарат.
Если предполагается наложение электродов на область матки и яичников, то менструация является противопоказанием.

В любом случае, даже если вы считаете, что у вас нет противопоказаний к процедуре, проведение лекарственного электрофореза возможно только после консультации с врачом. Должны быть учтены все нюансы.

Лечебное воздействие электрофореза

Если назначается лекарственный электрофорез, методика проведения, в принципе, любая принесет большую пользу, так как процедура производит следующий терапевтический эффект:

Снижает интенсивность воспалительных процессов.
Обладает противоотечным действием.
Снимает болевые ощущения.
Устраняет спазм мышечных волокон.
Действует успокаивающе на нервную систему.
Ускоряет регенерацию тканей.
Активизирует иммунную систему человека.

В момент процедуры эффект также зависит от доминирующего электрода. Если это катод, то:

Происходит расширение кровеносных и лимфатических сосудов.
Релаксация.
Нормализуется обмен веществ.
Стабилизируется работа желез внутренней секреции.
Стимулируется выработка биологически активных веществ.

Положительный электрод – анод — оказывает следующее воздействие:

Способствует выведению лишней жидкости из организма.
Обезболивает.
Убирает воспаление.

В пользе такой процедуры можно не сомневаться, но главное, чтобы были учтены все противопоказания, иначе это может привести к нежелательным последствиям.

Побочные эффекты электрофореза

Если процедура назначена врачом с учетом состояния пациента и его заболевания, то лекарственный электрофорез нежелательные эффекты дает достаточно редко. Чаще всего это аллергические реакции на лекарственный препарат, которые могут проявляться жжением, покраснением, сыпью и отечностью. После окончания процедуры все симптомы быстро исчезают.

Некоторые пациенты через несколько сеансов отмечают усиление болезненности, небольшое повышение температуры тела. Обычно к концу курса терапии все ощущения проходят без медицинского вмешательства.

Этапы проведения процедуры

Если назначено проведение процедуры лекарственного электрофореза, алгоритм должен быть следующим:

Медсестра или врач перед процедурой должны обязательно проверить исправность аппарата.
Посмотреть в карточке пациента назначения доктора.
Подробно разъяснить, особенно если человек в первый раз делает электрофорез, какие ощущения могут быть.
Помочь пациенту занять удобное положение.
Удостовериться в целостности кожных покровов в месте наложения прокладки.
Приготовить прокладки, соответствующие месту наложения, намочить их в теплой воде.
Приложить их на тело больного.
Сверху накладывается свинцовая пластина, которая будет соединяться проводом с аппаратом.
Произвести расчет силы тока для процедуры.
Проверить, чтобы регулятор интенсивности тока стоял в крайнем левом положении.
Подключить прибор к сети.
Переключатель шунта поставить на отметку «5», если пациентом является ребенок или процедура делается на голову, и «50» для взрослых пациентов и других частей тела.
Постепенно увеличивать силу тока до необходимой величины.
Если пациент процедуру переносит хорошо, то его можно накрыть, но предупредить, что при любых неприятных ощущениях он должен сообщить медсестре.
Засечь время проведения электрофореза.
После окончания регулятор силы тока поставить в положение «0».
Отключить прибор от сети.
Снять с тела пациента электроды и осмотреть кожу на наличие покраснений и раздражений.
Пациенту напомнить, когда он должен прийти на следующую процедуру.

Этот алгоритм выполнения должна знать любая медицинская сестра.

Любые физиотерапевтические процедуры окажут существенную помощь в комплексной терапии, но только тогда, когда они назначаются с учетом патологии и индивидуальных особенностей пациента, а также выполняются качественно, грамотным специалистом. Не стоит пренебрегать электрофорезом, эта процедура поможет быстрее справиться с заболеванием.

Лекарственный электрофорез, принцип действия, показания, противопоказания, дозировка. — Детский массаж в Краснодаре, массаж и физиотерапия c выездом на дом

Электрофорез (phoresis — несение, перенесение, греч.) -перемещение в электрическом поле взвешенных в жидкости частиц, молекул. В физиотерапии — это метод введения в организм лекарственных веществ посредством постоянного электрического тока через кожные покровы или слизистые оболочки.

При этом имеется сочетанное воздействие постоянным электрическим током и лекарственным веществом.

Лекарственный электрофорез, это не просто сочетание эффектов гальванического тока и лекарственного вещества. В результате их взаимодействия усиливается влияние каждого из факторов, в результате этого наблюдается качественно новое воздействие. Ответная реакция зависит в первую очередь от фармакологических свойств лекарственного вещества.
Скорость движения лекарства через кожу в электрическом поле постоянного тока составляет около 1 см в час. За время процедуры лекарственное вещество проникает на небольшую глубину, образуя депо в коже, частично в подкожной клетчатке.

Метод лекарственного электрофореза имеет ряд особенностей и достоинств по сравнению с другими способами введения лекарств:

1) дает возможность создать в патологическом очаге, расположенном поверхностно, высокую концентрацию лекарства, осуществить локальное воздействие;
2) лекарственные вещества, введенные этим способом, реже вызывают побочные реакции по сравнению с введенными энтерально и парэнтерально;
3) метод лечения безболезненный, не вызывает деформации кожи нарушений в ней микроциркуляции, отсутствует раздражение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта;
4) вводятся ионы или отдельные инградиенты лекарственных веществ, на лечебное действие которых расчитывают. Лекарства в ионной форме проявляют свою максимальную активность;
5) лекарственные вещества действуют на фоне изменений тканей, вызванных гальваническим током..

Лекарственные вещества, не растворимые в воде и спирте, вводят на среде ДМСО (диметилсульфоксид, димексид), которая является универсальным растворителем. Для электрофореза ферментов (лидаза, ронидаза, трипсин, химотрипсин) применяются буферные растворы.
В настоящее время используют небольшие концентрации лекарственных веществ, в основном до 5%.
Для объяснения механизма действия на внутренние органы лекарственных веществ, введенных методом электрофореза, используют учение об ионных рефлексах, разработанные А.Е. Щербаком. Согласно этому учению рецепторы кожи раздражаются ионами лекарственного вещества и постоянным электрическим током. При местном воздействии на кожу ионы лекарства оказывают влияние через вегетативные нервные пути на внутренние органы. С учетом этого действия электроды следует располагать на участках кожи, связанных вегетативной иннервацией с внутренними органами.

При поверхностно расположенных патологических процессах методом электрофореза можно создать достаточно высокую концентрацию лекарства непосредственно в очаге поражения, не насыщая им организм.

При заболеваниях внутренних органов используется «внутритканевой электрофорез» — способ элиминации лекарственного вещества из крови с помощью гальванического тока. Лекарство вводится в кровяное русло (обычно внутривенно капельно). Через некоторое время от начала введения лекарства начинается гальванизация соответствующего органа или ткани. Происходит элиминация лекарства из крови, протекающей через пораженный орган или ткань.

Показания к применению определяются фармакологическими свойствами лекарственного вещества с учетом показаний к применению гальванизации. Лекарственные вещества выбираются по тем же принципам, что и в фармакотерапии.

Противопоказания к применению те же, что и к гальванизации. Дополнительным противопоказанием является индивидуальная непереносимость лекарственного вещества.

Дозировка осуществляется так же, как и при гальванизации.

Основными приборами в нашей стране являются: Поток-1 и Элфор. Это аппараты хорошо себя зарекомендовали в клинических условиях при работе с большим потоком людей.

Электрофорез с новокаином, гидрокортизоном, димексидом: показания и противопоказания

Электрофорез – эффективный физиотерапевтический метод воздействия, в процессе которого на организм человека действуют электрические постоянные импульсы. С помощью техники возможно введение лекарственных средств через кожу или слизистые оболочки.

Электрофорез: механизм действия

Особенность техники заключается в том, что медикаментозные растворы попадают в ткани в виде заряженных частиц через межклеточные пространства и протоки потовых желез. В результате происходит увеличение эффективности от лечения.

К достоинствам метода относится:

Снижение вероятности развития аллергических реакций.
Увеличение срока действия вводимого вещества.
Создается высокая местная концентрация без циркуляции лекарсв по всему организму, лидаза.
Процедура является безболезненной.
Возможность избавления от многих болезней без затрагивания ЖКТ.

Вместе с тем не все медикаменты могут быть введены таким способом. Есть и противопоказания к процедуре.

Показания

Этот вид лечения показан при большинстве болезней. Его используют в качестве вспомогательного или основного лечения. Чаще всего электрофорез и гальванизация назначается в неврологии для лечения неврозов, невралгий, радикулитов, органических заболеваниях нервной системы, простудных заболеваний дыхательной системы, уха при отитах, пневмонии, носа при ринитах. Возможно применение и в кардиологии для борьбы с ишемической и хронической болезнью вне стадии обострения.

В урологии средство применяется для лечения простатитов и воспалительных заболеваний мочевого пузыря. Хорошо помогает справляться с последствием ожогов, а также различных послеоперационных ран. Эффективно при лечении таких заболеваний кожи, как себорея, купероз, рубцы.

Может применяться техника для грудничков и детей до 1 года при гипо- или гипертонусе мышц, неврологических нарушениях незначительной степени выраженности.

Отзывы и применение электрофореза при лечении разнообразных заболеваний:

Как проводится процедура?

Есть несколько техник для проведения электрофореза:

При ванночковом способе в емкость наливают раствор и добавляют необходимое лекарственное вещество. После этого пораженный участок тела погружается в жидкость.
Внутритканевая техника подразумевает введение перорально или внутривенно введение медикаментов и прикладывания электродов на больную зону. Особенно актуально при болезнях дыхательной системы (накладывается на воротниковую зону).
Полостной метод заключается в том, что во влагалище или анальное отверстие вводится раствор с лекарством. Затем электрод обратной полярности крепится на наружной поверхности тела. Техника актуальна при болезнях малого таза и толстого кишечника.

Обычно лекарство вводится пациенту с электрода, который несет такой же разряд, как у ионизированных частиц. Иона неметаллов и кислот притягиваются к катоду. Дозировка определяется с учетом показателя форетической подвижности состава и концентрации. Плотность тока устанавливается в зависимости от состояния организма.

Как проводится процедура

Лекарства и растворы

Для лечения с этой техникой возможно применение только тех препаратов, которые проникают через кожу. Каждое лекарство имеет свои показания:

Атропин применяется при язвенной болезни, проблемах со зрением и бронхиальной астме. В процессе воздействия происходит снижение тонуса гладких мышц.
Кальций необходим при заболеваниях, вызванных его недостатком. К ним относятся переломы, дисплазия, воспалительные заболевания во рту. Кальций обладает противоаллергическим, кровоостанавливающим и противовоспалительным действием.
Эуфиллин эффективно справляется с гипертонией, нарушением кровообращения и межпозвоночных грыжах. Происходит уменьшение спазма гладких мышц, устраняется боль.
Витамин В1 актуален при заболеваниях ЦНС, органов пищеварения, состояниях, связанных с дефицитом внимания. Витамин обладает противоаллергическим и противовоспалительным эффектом, принимает участие в работе многих органов и систем.

Как сделать электрофорез в домашних условиях, смотрите в нашем видео:

Лечебный эффект

При курсовом использовании техники происходит снижение интенсивности воспалительных процессов. Средство обладает противоотечным действием, снимает болевые ощущения, устраняет спазмы.

Эффект зависит и от доминирующего электрода. Например, если это катод, то расширяются лимфатические сосуды, нормализуется обмен веществ, стабилизируется работы желез внутренней секреции. Положительный электрод выводит лишнюю жидкость из организма, обладает обезболивающим действием.

Противопоказания и побочный эффект

К абсолютным противопоказаниям относится непереносимость тока, тяжелое состояние здоровья, высокая температура тела, туберкулез, плохая свертываемость крови. Нельзя проходить лечение людям с шизофренией, эпилепсией и некоторыми другими психическими заболеваниями.

К относительным противопоказаниям относится беременность, детский возраст (отдельные препараты), гипертония в стадии обострения. При назначении лекарства учитывается возраст пациента, чувствительность к электрофорезу, наличие острых и хронических болезней.

Побочные эффекты появляются редко, но сохраняется риск развития аллергии на применение отдельных препаратов. В редких случаях при длительном воздействии тока может появиться покраснение в месте наложения прокладки.

Физиотерапевтическая ценность

Электрофорез может оказать существенную помощь в комплексной терапии, но только при назначении с учетом патологии и индивидуальных особенностей пациента. Важно, чтобы процедуру проводил грамотный специалист. Электрофорез дает возможность ввести препараты в области, где отмечается нарушение микроциркуляции и кровообращения.

Положительной чертой техники является и низких уровень аллергических и побочных реакций. Благодаря современным аппаратам врач может регулировать интенсивность воздействия.

Электрофорез, методика проведения процедур, показания и противопоказания / OMEDVET

Электрофорез — метод введения лекарственных веществ в организм через кожу, слизистые оболочки при помощи постоянного тока.

Механизм действия электрофореза связан с распадом лекарственного вещества на ионы и накоплением его в коже, откуда с током крови и лимфы оно медленно поступает в организм, усиливая свои фармакологические действия. При электрофорезе одновременно действуют два фактора — лекарственный препарат и гальванический ток, что способствует поступлению лекарственного препарата в более активной форме. Можно одновременно вводить с разных полюсов разные лекарственные растворы. Однако не каждые лекарственные вещества можно вводить в организм методом электрофореза, так как некоторые из них под действием постоянного тока могут распадаться, изменять фармакологические свойства и оказывать вредное действие.

Показания. Подострые и хронические процессы, ревматические и травматические поражения суставов, мышц, сухожилий, гайморит, фронтит, мастит, невралгии, неврит.

Противопоказания. Повышенная чувствительность к гальваническому току, острые гнойные воспаления, геморрагические диатезы, злокачественные новообразования, необратимые дегенеративные процессы.

Методика проведения электрофореза аналогична гальванизации, только в зависимости от заряда иона вводимого лекарственного вещества им смачивают гидрофильную прокладку с одинакового по заряду электрода. С прокладки положительного электрода (анода) вводятся ионы многих металлов, а также положительные ионы сложных веществ, содержащих кальций, натрий, магний и т. д., с отрицательного (катода) — ионы кислых радикалов и отрицательные ионы сложных веществ, содержащих хлор, йод, бром и т. д. Растворы большинства вводимых лекарственных веществ 1-5% -ной концентрации. В качестве растворителя применяют диметилсульфоксид (ДМСО) или дистиллированную воду, подкисленную соляной кислотой. Растворы антибиотиков и сульфаниламидных препаратов пригодны для применения в течение 4-7 дней. При введении дорогостоящих лекарственных препаратов для гидрофильной прокладки вместо фланелевых мешочков можно применить фильтровальную бумагу или небольших размеров марлю.

Основы практики, процедура, механизм действий

Автор

Викас Шривастава, MD Врач-резидент, Отделение дерматологии, Военно-морской медицинский центр Сан-Диего

Раскрытие: Ничего не разглашать.

Соавтор (ы)

Кендалл М. Иган, доктор медицины, FAAD Дерматолог, Медицинский центр по делам ветеранов; Дерматолог, Spruce Health, дерматолог, DermOne

Кендалл М. Иган, доктор медицинских наук, FAAD является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии, Американская медицинская ассоциация, Ассоциация военных дерматологов

Раскрытие информации: не раскрывать.

Специальная редакционная коллегия

Ричард П. Винсон, доктор медицины Ассистент клинического профессора, кафедра дерматологии, Центр медицинских наук Техасского технического университета, Медицинская школа Пола Л. Фостера; Консультант, Дерматология Маунтин-Вью, PA

Ричард П. Винсон, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии, Техасская медицинская ассоциация, Ассоциация военных дерматологов, Техасское дерматологическое общество

Раскрытие: нечего раскрывать.

Аманда М. М. Окли, MBChB, FRACP Адъюнкт-профессор, кафедра медицины, клиническая школа Вайкато; Дерматолог, отделение дерматологии, больница Вайкато, Новая Зеландия

Аманда М.М. Окли, MBChB, FRACP является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии, Американская дерматологическая ассоциация, Австралийское и новозеландское вульвовагинальное общество, Международное исследовательское общество по вульвовагинальным заболеваниям, Новозеландское дерматологическое общество, Королевский австралазийский колледж врачей

Раскрытие информации: Полученный доход в размере 250 долларов США или более от: Непосредственно в качестве сотрудника DermNet New Zealand, от нескольких фармацевтических компаний-спонсоров
Получено Консультационный сбор от MoleMap NZ за консультацию.по: MoleMap New Zealand.

Главный редактор

Уильям Д. Джеймс, доктор медицины Пол Р. Гросс, профессор дерматологии, заместитель председателя, директор программы резидентуры, факультет дерматологии, Медицинская школа Университета Пенсильвании

Уильям Д. Джеймс, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американских Академия дерматологии, Общество следственной дерматологии

Раскрытие информации: Полученный доход в размере 250 долларов США или выше от: Elsevier; WebMD
Выступал в качестве спикера для различных университетов, дерматологических обществ и дерматологических факультетов.

Дополнительные участники

Гарольд С. Рабиновиц, доктор медицины Клинический профессор кафедры дерматологии Медицинского факультета Университета Майами

Раскрытие информации: раскрывать нечего.

Благодарности

Camille E Introcaso, MD Сотрудник службы эпидемической разведки, Центры по контролю и профилактике заболеваний

Camille E Introcaso, MD является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha и Американской академии дерматологии

Раскрытие информации: Ничего не нужно раскрывать.

Эллен Дж. Ким, доктор медицинских наук Доцент кафедры дерматологии Медицинской школы Пенсильванского университета, больница Пенсильванского университета

Эллен Дж. Ким, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Американская академия дерматологии, Фонд дерматологии, Общество медицинской дерматологии и Phi Beta Kappa

Раскрытие информации: Ничего не нужно раскрывать.

Майкл С. Лерер, доктор медицины Доцент кафедры дерматологии Пенсильванского университета

Майкл С. Лерер, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Американской академии дерматологии, Американского колледжа микрографической хирургии и кожной онкологии Мооса и Американского общества дерматологической хирургии

Раскрытие информации: Ничего не нужно раскрывать.

Ален Рук, доктор медицины Профессор отделения дерматологии, больница Пенсильванского университета

Раскрытие информации: Ничего не нужно раскрывать.

Благодарности

Взгляды, выраженные в этой рукописи, принадлежат авторам и не отражают официальную политику Министерства Военно-Морского Флота, Министерства Армии, Министерства обороны или правительства США. Авторы — сотрудники правительства США и военнослужащие.Эта работа была подготовлена в рамках их служебных обязанностей. Раздел 17, USC, § 105 гласит, что «Защита авторских прав в соответствии с этим разделом недоступна для какой-либо работы правительства Соединенных Штатов». Раздел 17, USC, § 101 определяет работу правительства США как работу, подготовленную военнослужащим или служащим правительства США в рамках официальных обязанностей этого лица.

границ | Бромид этидия изменяет электрофоретическую подвижность CAG в агарозе • Альтернативные структуры ДНК CTG, полученные с помощью ПЦР

Введение

Расширение последовательностей ДНК с нестабильными тринуклеотидными повторами является генетической причиной серьезных заболеваний человека, включая миотоническую дистрофию 1 типа (DM1), болезнь Хантингтона (HD), атаксию Фридрейха (FRDA) и синдром ломкой Х-хромосомы (FRAXA; Pearson et al., 2005; Гомеш-Перейра и Монктон, 2006 г .; Чжао, Усдин, 2015). По крайней мере 15 из этих состояний, включая DM1, HD и многие спиноцеребеллярные атаксии (SCA), были связаны с экспансией триплетных повторов CAG • CTG (Gomes-Pereira and Monckton, 2006; Zhao and Usdin, 2015). Последующий патогенез, запускаемый расширениями повторов, варьирует от болезней и может опосредоваться разными молекулярными механизмами (Gatchel and Zoghbi, 2005). Среди них токсичность РНК была впервые описана при DM1 (Mankodi et al., 2000), мультисистемное расстройство, вызванное аномальной экспансией некодирующего CAG • CTG тринуклеотидного повтора ДНК (Brook et al., 1992). Помимо DM1, токсические транскрипты РНК участвуют в патогенезе других заболеваний распространения CAG • CTG, таких как SCA типа 8 (SCA8), SCA12, HD, болезнь Хантингтона, подобная-2 (HDL2) и эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса (FECD). ; Sicot et al., 2011; Sicot, Gomes-Pereira, 2013; Du et al., 2015).

CAG, ассоциированный с заболеванием • Тринуклеотидные повторы CTG крайне нестабильны в зародышевой линии и в соматических клетках, проявляя заметную тенденцию к дальнейшей экспансии.Поскольку более длинные повторы связаны с более тяжелым фенотипом и более ранним возрастом начала, смещенная к экспансии нестабильность повторов зародышевой линии объясняет феномен ожидания; при этом у последующих поколений наблюдается более ранний возраст начала и более серьезные симптомы. Кроме того, появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что тканеспецифический, возрастной и зависимый от экспансии соматический мозаицизм, скорее всего, способствует тканеспецифическим симптомам и прогрессированию заболевания при расстройствах распространения CAG • CTG (Kennedy et al., 2003; Уиллер и др., 2003; Свами и др., 2009; Моралес и др., 2012). В результате расшифровка молекулярных механизмов экспансии тринуклеотидных повторов не только поможет понять важные аспекты патогенеза заболевания, но также может открыть новые возможности для разработки новых терапевтических вмешательств (Gomes-Pereira and Monckton, 2006; López Castel et al. ., 2010).

Был предложен ряд различных молекулярных механизмов экспансии тринуклеотидных повторов, включая аберрантную репликацию ДНК, репарацию ДНК и / или гомологичную рекомбинацию ДНК (Richards and Sutherland, 1994; Richard and Pâques, 2000; Pearson et al., 2005; Гомеш-Перейра и Монктон, 2006 г .; Миркин, 2007; МакМюррей, 2010; Усдин и др., 2015). Несмотря на то, что они зависят от различных молекулярных событий, большинство предложенных механизмов объединяет одна общая тема: предположение о том, что повторяющиеся не-B-ДНК структуры, принятые одной или обеими цепями ДНК, участвуют в механизме генетической нестабильности, действуя как движущая сила расширения (Sinden, Wells, 1992; McMurray, 1999; Wells et al., 2005; Mirkin, 2006; Usdin et al., 2015). Вычислительные исследования предсказали необычные биофизические свойства последовательностей тринуклеотидных повторов (Baldi et al., 1999). В частности, тринуклеотидные повторы CAG • CTG образуют стабильные внутрицепочечные шпильки ДНК, не только in vitro (Gacy et al., 1995), но также в моделях клеток млекопитающих нестабильности CAG • CTG (Liu et al., 2010). Самое интересное, что была идентифицирована новая форма двухцепочечной структуры, отличной от B-ДНК. Плавление и повторный отжиг плазмидной ДНК или фрагментов генов, содержащих CAG • CTG-повторы, приводит к тому, что большая часть популяции ДНК принимает альтернативные конформации с замедленной подвижностью в нативных полиакриламидных гелях (Pearson and Sinden, 1996).Биохимические доказательства и данные электронной микроскопии согласуются с существованием структур со скользящей цепью ДНК (S-ДНК), образованных внутри триплетных повторов в линейных дуплексных молекулах (Pearson et al., 1997, 1998, 2002; Tam et al., 2003). ). Как склонность к образованию S-ДНК, так и сложность структур возрастают с увеличением длины пути чистого повтора (Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1997) и параллельны вероятности расширения повтора, предполагая критическую роль в механизм мутации размера повтора.В самом деле, уровни структур ДНК со скользящей цепью, выделенных иммунопреципитацией из разных тканей пациентов с DM1, коррелируют со степенью соматического мозаицизма (Axford et al., 2013). Такие структуры распознаются и связываются белком репарации ошибочного спаривания MSh3 (Pearson et al., 1997), что, возможно, способствует их удержанию и последующей экспансии повторов (Kovtun and McMurray, 2001; Savouret et al., 2004; Tomé et al., 2009). ; Guo et al., 2016). В дополнение к функциональному MSh3, по крайней мере четыре других компонента пути репарации ошибочного спаривания ДНК необходимы для обеспечения высоких уровней соматической экспансии CAG • CTG (Manley et al., 1999; ван Ден Брук и др., 2002; Гомеш-Перейра и др., 2004; Фойри и др., 2006; Сериола и др., 2011; Пинто и др., 2013; Томе и др., 2013; Моралес и др., 2016). Более того, прерывания последовательности в пределах чисто повторяющихся участков резко снижают склонность к образованию структур ДНК со скользящей цепью, а также гетерогенность формируемых структур (Pearson et al., 1998). Защитный эффект прерывания последовательности на образование альтернативных структур ДНК CAG • CTG параллелен стабилизирующему эффекту при DM1 (Musova et al., 2009; Braida et al., 2010; Botta et al., 2017), SCA1 (Chung et al., 1993; Chong et al., 1995), SCA2 (Choudhry et al., 2001) и SCA17 (Gao et al., 2008). Взятые вместе, эти наблюдения убедительно подтверждают роль структур со скользящей цепью в процессе экспансии CAG • CTG повторов.

ДНК, интеркалирующий краситель бромистый этидий, взаимодействует напрямую с ДНК и способен изменять структурные особенности, зависящие от последовательности, такие как хиральность, планарность и скручивание изогнутых сегментов ДНК (Brukner et al., 1997; Хаяси и Харада, 2007; Lipfert et al., 2010). Следовательно, бромид этидия может изменять структурные особенности альтернативных последовательностей тринуклеотидных повторов при добавлении к агарозным гелям. Мы исследовали влияние этого интеркалирующего красителя на конформационный метаболизм повторяющихся последовательностей CAG • CTG и разработали простой метод обнаружения присутствия альтернативных структур, не относящихся к B-ДНК, на основе дифференциальных электрофоретических профилей последовательностей тринуклеотидных повторов в агарозных гелях. в присутствии и в отсутствие бромистого этидия.

Материалы и методы

ПЦР-амплификация и анализ

Аллели DM1 одного размера, содержащие 5, 22, 44, 56 или 200 повторяющихся единиц CTG, были выделены последовательным разведением и амплификацией одной молекулы геномной ДНК человека с помощью ПЦР, как описано ранее (Gomes-Pereira et al., 2004). Затем эти аллели использовали в качестве входной ДНК (0,1–1 нг) в последующих стандартных амплификациях ПЦР с использованием ранее описанных олигонуклеотидных праймеров DM-A, DM-BR, DM-C, DM-DR, DM-ER, DM-H ( Monckton et al., 1995, 1997). ПЦР-амплификации, электрофорез в агарозном геле, блоттинг по Саузерну и гибридизацию выполняли, как описано ранее (Gomes-Pereira et al., 2004). Молекулярная линейка AmpliSize ^TM (лестница 50–2000 пар оснований; BioRad) или лестница GeneRuller 100 пар оснований (Thermo Scientific) и программное обеспечение Kodal Digital Science 1D (Kodak) использовались для количественной оценки электрофоретической подвижности и определения размеров ДНК. Все участники исследования были набраны с информированного согласия для генетических исследований миотонической дистрофии.

Электрофорез в неденатурирующем полиакриламидном геле

Неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили в гелевом аппарате BioRad Protean II, используя 8% (мас. / Об.) Неденатурирующие гели акриламид / бис (29: 1), содержащие 10% (об. / Об.) глицерин в 1X TBE (90 мМ основание Trizma, 90 мМ ортоборная кислота, 2 мМ EDTA). Полимеризующие агенты NNN’N’- тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) и персульфат аммония (APS) добавляли до конечной концентрации 0,625% (об. / Об.) И 0.125% (мас. / Об.) Соответственно. Перед загрузкой гели уравновешивали, применяя 5 Vcm ^-1 в течение 90 минут с непрерывной рециркуляцией рабочего буфера 1X TBE при 4 ° C. Образцы ДНК разделяли при 10 Vcm ^-1 в течение 16 часов при 4 ° C с рециркуляцией буфера. Гель окрашивали 500 нМ бромистого этидия в 1X TBE в течение 20 мин при комнатной температуре. Разделенные образцы ДНК визуализировали с помощью УФ-трансиллюминатора (длина волны 254 нм) и фотографировали. Альтернативно, ДНК переносили из полиакриламидного геля на нейлоновую мембрану с помощью блоттинга по Саузерну «сквош» и гибридизовали с радиоактивно меченным CAG • CTG-содержащим зондом, как описано ранее (Gomes-Pereira et al., 2004). Молекулярная линейка AmpliSize ^TM (лестница 50–2000 пар оснований; BioRad) и программное обеспечение Kodal Digital Science 1D (Kodak) были использованы для количественной оценки электрофоретической подвижности и определения размера ДНК.

Экстракция ДНК из неденатурирующих полиакриламидных гелей

Полосы, соответствующие интересующим образцам ДНК, вырезали из полиакриламидного геля с помощью скальпеля при УФ-трансиллюминации. ДНК элюировали из фрагментов геля простой диффузией в 500 мкл 1X TE (10 мМ Tris • HCl pH 8.0,1 мМ EDTA) при 37 ° C в течение 48 часов. Линейный полиакриламид использовали в качестве носителя ДНК для осаждения очищенных гелем образцов ДНК, как описано ранее (Gaillard and Strauss, 1990).

Протоколы денатурирования и повторного отжига

видов ДНК, элюированных из неденатурирующего PAGE, были либо денатурированы нагреванием, либо подвергнуты протоколу повторного отжига. Процедура денатурации заключалась в нагревании ДНК при 100 ° C в течение 5 минут в присутствии 40% (об. / Об.) Формамида с последующим быстрым охлаждением на льду.Протокол повторного отжига включал начальную стадию плавления при 100 ° C в течение 5 минут с последующим медленным охлаждением до 18 ° C со средней скоростью -0,5 ° C в минуту. Плавление и охлаждение проводили в термоциклере Biometra Uno.

Результаты

Измененная электрофоретическая подвижность последовательностей тринуклеотидных повторов в присутствии бромида этидия

Чтобы исследовать возможное влияние бромистого этидия на биофизические свойства двухцепочечных последовательностей ДНК с тринуклеотидными повторами, мы проанализировали электрофоретические профили повторяющихся последовательностей CAG • CTG, происходящих из локуса DM1 в различных условиях.Последовательности ДНК, содержащие различное количество повторов CAG • CTG (в диапазоне от 5 до 200), были получены с помощью двух раундов амплификации ПЦР, причем оба цикла включали <30 циклов. Геномную ДНК человека первоначально амплифицировали с помощью ПЦР с малым пулом одиночных молекул (SP-PCR) с олигонуклеотидными праймерами DM-A и DM-BR (Monckton et al., 1995). Разделенные продукты ПЦР, содержащие участки CAG • CTG разного размера, впоследствии амплифицировали с помощью стандартной ПЦР с различными комбинациями олигонуклеотидных праймеров для создания фланкирующих областей разного размера.Образцы разделяли через 1,8% (мас. / Об.) Агарозные гели с или без 500 нМ бромистого этидия, как в геле, так и в буфере для электрофореза, и детектировали с помощью Саузерн-сквош-блот-гибридизации (Gomes-Pereira et al., 2004 ). В присутствии бромистого этидия продукты ПЦР мигрировали преимущественно как один основной вид ДНК и в большинстве случаев генерировали четкую и четко очерченную полосу (рис. 1А). Напротив, те же продукты амплификации, содержащие 22, 56 и 200 триплетных повторов, генерировали одну или две дополнительные медленно мигрирующие полосы в отсутствие бромида этидия для всех исследованных фланкирующих последовательностей (Фигуры 1A, B).Продукты ПЦР, содержащие только пять повторяющихся единиц, не давали множественных полос в одних и тех же условиях. 22 повторных продукта ПЦР генерировали один дополнительный медленно мигрирующий вид. Продукты ПЦР с 55 повторами генерировали одну, но очень широкую дополнительную полосу ДНК, которая могла представлять собой диффузный дублет. Самые длинные продукты ПЦР, содержащие 200 повторов CTG, дали два четко разделяемых медленно мигрирующих вида (полосы 2 и 3, рисунок 1B). Подобный эффект бромистого этидия на электрофоретическую подвижность расширенных последовательностей триплетных повторов через агарозные гели наблюдался для продуктов ПЦР, полученных из HD, SCA7, FECD / CTG18.1 и ERDA1 локусов (Braida et al., Неопубликованные наблюдения), что указывает на то, что это общий феномен для последовательностей повторов CAG • CTG.

Рис. 1. Влияние бромистого этидия на подвижность CAG • Последовательности CTG в агарозных гелях. (A) Присутствие / отсутствие бромистого этидия изменяет подвижность ПЦР-амплифицированного расширенного CAG • Повторения CTG во время электрофореза в агарозном геле. Продукты ПЦР, содержащие 5, 22, 56 или 200 повторов CAG • CTG были индивидуально выделены из локуса DM1 человека серийным разведением, затем амплифицированы с различными комбинациями DM-специфических олигонуклеотидных праймеров (DM-A, DM-H, DM- C, DM-BR, DM-DR и DM-ER) и разрешены через 1.8% (мас. / Об.) Агарозные гели с (слева) или без (справа) 500 нМ бромистого этидия как в геле, так и в рабочем буфере 1X TBE. Затем амплифицированные продукты детектировали с помощью Саузерн-блот-гибридизации «сквош». Авторадиограммы демонстрируют повышенную подвижность альтернативных расширенных конформеров CAG • CTG в агарозных гелях в присутствии бромистого этидия. Обратите внимание на многочисленные альтернативные продукты, наблюдаемые в отсутствие интеркалирующего химического вещества. Шкала слева представляет положение и размеры маркеров молекулярной массы в п.о. (M). (B) Отсутствие бромистого этидия в геле и рабочем буфере приводит к обнаружению дополнительных медленно мигрирующих видов во время электрофореза в агарозном геле расширенных последовательностей CAG • CTG. На авторадиограмме крупным планом показаны продукты ПЦР DM1, разделенные в агарозном геле в отсутствие бромистого этидия. Обратите внимание на положение предполагаемых структур B-ДНК (1) и структур, отличных от B-ДНК (2 и 3). (C) Интенсивные быстро мигрирующие полосы, наблюдаемые в отсутствие бромида этидия, демонстрировали ту же электрофоретическую подвижность, что и одиночная полоса, обнаруживаемая в присутствии бромида этидия.Отношение между относительной подвижностью в агарозном геле и фактическим размером (_{п.н., кажущееся} / п.н. _{фактическое}) видов ДНК показано для продуктов ПЦР, содержащих 22, 56 и 200 повторов. График показывает значительную разницу между электрофоретической подвижностью медленно мигрирующих видов ДНК, обнаруженной в отсутствие бромистого этидия, и одиночной полосой, обнаруженной в присутствии красителя (* p <0,05; *** p <0,001 ; односторонний дисперсионный анализ (ANOVA)). (D) Предварительная инкубация с бромидом этидия не устраняет дополнительных медленно мигрирующих видов во время электрофореза в агарозном геле расширенных CAG, амплифицированных с помощью ПЦР • Повторы CTG. Аллели DM1 с различным числом повторов амплифицировали с помощью ПЦР с использованием нескольких комбинаций олигонуклеотидных праймеров, указанных на рисунке над каждой полосой. Половину каждого продукта ПЦР инкубировали с 500 нМ бромистого этидия в течение более 48 часов перед электрофорезом и гибридизационным анализом. Авторадиографы не выявляют каких-либо заметных различий в электрофоретическом профиле между обработанными и необработанными образцами. (E) Бромид этидия модифицирует электрофоретическую подвижность CAG в агарозе • Продукты CTG, полученные путем объемной ПЦР-амплификации 20–100 нг матричной геномной ДНК. Последующее окрашивание бромидом этидия выявило медленно мигрирующие виды ДНК, содержащие 56 и 200 повторов CAG • CTG, которые не были обнаружены при добавлении красителя в гель и рабочий буфер.

Чтобы количественно оценить влияние бромистого этидия на электрофоретическую подвижность ПЦР-генерируемых последовательностей CAG • CTG в агарозных гелях, мы рассчитали соотношение между кажущимся размером видов ДНК и фактическим размером последовательности ( R = _{кажущихся} п.н. / bp _{фактическое}), как описано ранее (Chastain et al., 1995). Этот рисунок служит оценкой аберрантной миграции ДНК относительно известного маркера размера молекулы. Мы сосредоточились на размерах повторов, которые генерировали медленно мигрирующие полосы (22, 56 и 200 повторов CAG • CTG), и обнаружили, что кажущееся соотношение _п.н. / п.н. _{фактическое} соотношение быстро мигрирующих видов ДНК (обнаружено в отсутствие бромистого этидия). ) существенно не отличался от одиночной полосы, обнаруженной в присутствии бромистого этидия. Напротив, медленно мигрирующие виды ДНК показали значительно более высокое соотношение пар оснований _{, кажущееся} / bp _{, фактическое соотношение}, показывая увеличение на ~ 5% и ~ 11% для продуктов ПЦР, содержащих 56 или 200 повторов CAG • CTG, соответственно (рис. 1C).Учитывая идентичную электрофоретическую подвижность быстро мигрирующих полос в отсутствие бромистого этидия и единственной полосы, обнаруженной при добавлении интеркалирующего красителя в гель и рабочий буфер, мы предположили, что первые представляют собой предполагаемые линейные молекулы B-ДНК. Более того, денситометрическая количественная оценка предполагаемых видов не-B-ДНК, обнаруженных в этом анализе, показала, что относительное количество быстро мигрирующих молекул B-ДНК снижалось с увеличением длины аллелей (рис. 2D). Другими словами, электрофоретический профиль продуктов амплификации в отсутствие бромистого этидия становится более сложным по мере удлинения повторяющейся последовательности.

Рис. 2. Анализ альтернативных структур ДНК CAG • CTG-содержащие продукты ПЦР с помощью электрофореза в нативном полиакриламидном геле (PAGE). (A) Обнаружение множества медленно мигрирующих видов во время нативного PAGE амплифицированного с помощью ПЦР расширенного CAG • CTG-повторов. Аллели DM1 разной длины амплифицировали с использованием олигонуклеотидных праймеров DM-A и DM-DR и разделяли через неденатурирующий 8% (мас. / Об.) Полиакриламидный гель, содержащий 10% (об. / Об.) Глицерина в отсутствие бромида этидия.Продукты ПЦР детектировали с помощью саузерн-блот-гибридизации. Авторадиография показывает наличие сложной картины из множества полос для каждого продукта ПЦР. (B) Те же продукты ПЦР, содержащие различное количество повторов CAG • CTG, были разделены с помощью нативного PAGE в отсутствие (вверху) или в присутствии (внизу) 500 нМ бромистого этидия в геле и рабочем буфере. Бромид этидия не влияет на обнаружение медленно мигрирующих видов ДНК в неденатурирующих полиакриламидных гелях. Показаны маркеры размера молекул в п.о. (M). (C) Более длинный CAG • Повторяющиеся продукты CTG перемещаются аномально быстро во время естественного PAGE. Отношение между кажущимся размером нативных видов в нативном полиакриламиде и их фактическим размером (_{п.н., кажущееся} / п.о. _{фактическое}) наносят на график в зависимости от количества повторов продуктов ПЦР. График показывает линейную зависимость ( r ² = 0,986, p <0,001), что указывает на то, что увеличение электрофоретической подвижности за счет неденатурирующих полиакриламидных гелей увеличивается по мере удлинения повторяющегося тракта CAG • CTG. (D) Доля видов, не относящихся к B-ДНК, присутствующих в продуктах ПЦР-амплификации CAG • повторяющихся последовательностей CTG увеличивается с увеличением длины аллеля. Процент В-ДНК, обнаруженный в агарозных и неденатурирующих полиакриламидных гелях, оценивали денситометрическим анализом для каждого продукта ПЦР и наносили на график как функцию числа повторов CAG • CTG (логарифмическая шкала). Нелинейная регрессия указывает на снижение процента дуплекса B-ДНК, обнаруженного в агарозе ( r ² = 0.989, p = 0,03) или в полиакриламидных гелях ( r ² = 0,855, p = 0,02) по мере увеличения повторения.

Чтобы определить, являются ли интеркалирующие свойства бромида этидия per se ответственными за этот эффект, выбранные продукты ПЦР инкубировали с 500 нМ бромистого этидия в течение 48 часов перед электрофорезом. В этих условиях электрофорез в агарозном геле без добавления бромистого этидия к гелю или буферу привел к обнаружению тех же дополнительных медленно мигрирующих полос, которые наблюдались при полном отсутствии бромида этидия на любой стадии (рис. 1D).Эти данные предполагают, что бромид этидия способен изменять подвижность только структурных изомеров, образованных в последовательностях, расширенных CAG • CTG, когда они присутствуют в геле и рабочем буфере, и, по-видимому, не опосредует прямое взаимное превращение структурных изоформ.

Чтобы исключить возможность смешивания структурных артефактов, вносимых несколькими раундами амплификации ПЦР, мы проанализировали последовательности повторов, генерируемые прямой амплификацией 10–100 нг геномной ДНК от трансгенных мышей DM1, несущих 20, 55 или 260 CAG • Повторы CTG в организме человека Трансген DMPK (Gourdon et al., 1997; Seznec et al., 2000). Разделение продуктов ПЦР через агарозные гели, содержащие 500 нМ бромистого этидия, давало единичные резкие полосы ожидаемого размера. Напротив, пост-окрашивание гелей без бромида этидия выявило медленно мигрирующие виды ДНК с размерами повторов 55 CAG • CTG и выше (рис. 1E). Эти результаты демонстрируют, что бромид этидия обычно влияет на электрофоретическую подвижность CAG • повторяющихся последовательностей CTG, генерируемых протоколами ПЦР-амплификации.

Выявление альтернативных структур ДНК CAG • Последовательностей CTG в нативном полиакриламидном геле-электрофорезе

Чтобы подтвердить присутствие альтернативных структур, не относящихся к B-ДНК, в продуктах ПЦР, последовательности, амплифицированные с олигонуклеотидными праймерами DM-A и DM-DR, были разделены через нативный 8% (мас. / Об.) Полиакриламидный гель с 10% ( об. / об.) глицерин, и детектировали с помощью Саузерн-блот-гибридизации «сквош».Хотя каждый продукт ПЦР генерировал одну полосу после электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия (рис. 1А), сложные электрофоретические профили, состоящие из интенсивной быстро мигрирующей полосы и серии новых, близко расположенных видов ДНК, наблюдались на нативных полиакриламидные гели (рис. 2А). Интересно, что присутствие бромистого этидия в геле и / или рабочем буфере не сильно влияло на подвижность альтернативных последовательностей ДНК через нативные полиакриламидные гели (рис. 2В).Паттерны аномально мигрирующих продуктов были очень похожи на те, которые ранее были описаны для фрагментов генов или плазмид, содержащих триплетные повторы, после протоколов денатурации и ренатурации (Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1998).

Как сообщалось ранее, основная полоса, обнаруженная для каждого продукта ПЦР, мигрировала быстрее, чем ожидалось для предполагаемой двухцепочечной молекулы B-ДНК через нативные полиакриламидные гели (Chastain et al., 1995; Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1998). Чтобы количественно оценить этот эффект и оценить аберрантную миграцию ДНК относительно известных маркеров размера молекул, мы использовали соотношение _{кажущихся} пар оснований / фактическое пар оснований для каждого продукта ПЦР при нативном ПААГ, как описано (Chastain et al., 1995). Для основной быстро мигрирующей полосы соотношение варьировалось от 0,95 для продукта ПЦР, содержащего пять повторов CTG (что соответствует увеличению подвижности на ~ 5%), до 0,78 для самого длинного повтора (что соответствует увеличению подвижности на ~ 22%).В целом, длина повтора составляет ~ 99% вариации в соотношениях _{, кажущихся} / bp _{, фактических} ( r ² = 0,986, p <0,001; Рисунок 2C), что позволяет предположить, что их быстрая мобильность последовательности в нативных полиакриламидных гелях тесно зависят от размера повторов и, вероятно, связаны с повышенной гибкостью тракта тринуклеотидных повторов, как предполагалось ранее (Chastain and Sinden, 1998). Дополнительные полосы с более низкой подвижностью определяли электрофоретические картины, которые были аналогичными для всех проанализированных длин триплетных повторов.Медленно мигрирующие продукты характеризовались широким диапазоном соотношений размеров (_{п.н., кажущихся}/_{п.н., фактических}), варьирующих от ~ 1,3 до ~ 2,6, что, вероятно, представляет собой дискретные изоформы ДНК (Таблица 1). Примечательно, что медленно мигрирующая полоса, полученная из самого короткого продукта ПЦР (5 повторов CAG • CTG), показывала соотношение размеров п.н. _{кажущихся} / п.н. _{фактических} 1,56, тогда как более длинные аллели (22, 46 и 56 повторов) давали рост полосам с соотношением размеров до ~ 2,5. Это наблюдение может указывать на то, что соответствующая альтернативная структура не может быть сформирована с таким низким числом повторов.Самый длинный продукт амплификации (200 CAG • CTG) давал неоднородную картину, и поэтому было трудно точно определить полосы. Небольшие различия между соотношениями, описанными здесь, и соотношениями, описанными другими авторами, могут быть объяснены зависимостью подвижности от длины и природы последовательностей ДНК, фланкирующих триплетный повтор (Tam et al., 2003).

Таблица 1. Относительная подвижность CAG • CTG-содержащих продуктов ПЦР через нативные полиакриламидные гели.

Предполагая, что полоса быстрой подвижности представляет собой линейный дуплекс B-ДНК (Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1998), был проведен денситометрический анализ в попытке количественно оценить склонность различных размеров повторов к принятию альтернативной S-ДНК. (Рисунок 2D). Эти данные показали, что доля линейной дуплексной ДНК уменьшается с увеличением длины повтора, достигая плато около 50 повторяющихся единиц CAG • CTG. Нелинейный регрессионный анализ показал, что количество повторов в каждом фрагменте объясняет очень высокую долю вариации фракции не-B ДНК, обнаруженной в обеих агарозах ( r ² = 0.99, p = 0,02) и нативные полиакриламидные гели ( r ² = 0,85, p = 0,03). Это наблюдение подтверждает, что удлинение повторяющегося тракта увеличивает склонность к образованию структур S-ДНК, как описано в более ранних сообщениях (Pearson et al., 1998).

Подтверждение сворачивания S-ДНК в CAG • Последовательности CTG

Сходство между электрофоретическими профилями, наблюдаемыми при электрофорезе продуктов ПЦР в нативных полиакриламидных гелях, и предыдущими сообщениями о S-ДНК (Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1998) является убедительным свидетельством того, что структуры не-B-ДНК со скользящей цепью уже присутствовали в полученных продуктах ПЦР. Дополнительную экспериментальную поддержку получали путем плавления и повторного отжига ДНК, очищенной от отдельных полос, собранных из неденатурирующих полиакриламидных гелей. Отдельные полосы были выделены из двух продуктов ПЦР, содержащих 22 или 56 повторов CAG • CTG, поскольку они давали отдельные четкие отдельные полосы, легко очищаемые из геля (Фигуры 3A, B). Для каждого вида ДНК, полученного из одной полосы, был проведен анализ денатурации и повторного отжига с последующим проведением нативного PAGE.Все очищенные гелем виды ДНК мигрировали в виде отдельных полос (фиг. 3A, B, дорожки U), подтверждая их высокую стабильность на протяжении процедур элюирования и осаждения. Плавление ДНК в присутствии формамида привело к обнаружению двух полос ДНК с очень низкой подвижностью (фиг. 3A, B, дорожки F), которые соответствуют либо линейной одноцепочечной ДНК, либо агрегации ДНК, образующейся во время денатурации. Напротив, инкубация с бромидом этидия перед ПААГ не изменила характер миграции очищенных в геле видов ДНК (рис. 3С), подтверждая, что интеркалирующий химикат не может взаимно преобразовывать структурные изоформы ДНК.Полный набор аномально мигрирующих полос, наблюдаемых для исходного продукта ПЦР, был восстановлен после повторного отжига отдельных изолированных полос (Фигуры 3A, B, дорожки R). Наблюдение за тем, что протокол повторного отжига привел к образцу продуктов, который был очень похож на тот, который ранее наблюдался в исходных продуктах ПЦР, дополнительно подтвердил, что обнаруженные медленно мигрирующие виды ДНК соответствуют S-ДНК, образованной во время повторной гибридизации ДНК. пряди.

Рисунок 3.Генерация множества альтернативных структур ДНК после повторного отжига очищенного гелем CAG • Изомеры повторяющейся последовательности CTG . Продукты ПЦР, содержащие (A) 22 или (B) 56 CAG • Повторы CTG амплифицировали с олигонуклеотидными праймерами DM-A и DM-DR. ДНК экстрагировали из отдельных полос после нативного PAGE (полосы 1–4, черные стрелки) и повторно электрофорезировали (дорожки, отмеченные U, неденатурированные). Образцы дуплексной ДНК плавили при 100 ° C в присутствии 40% (об. / Об.) Формамида, обнаруживая полосы одноцепочечной ДНК с низкой подвижностью (дорожки, обозначенные F, формамид).В качестве альтернативы образцы ДНК денатурировали при 100 ° C, а затем повторно отжигали путем медленного снижения температуры в течение 3 часов (дорожки, помеченные R, повторный отжиг), получая сложную структуру полос, ранее наблюдаемую в исходном продукте ПЦР. (C) Инкубация изолированных видов ДНК с 500 нМ бромистого этидия перед повторным электрофорезом не изменила подвижность отдельных полос, экстрагированных из продуктов ПЦР с 56 повторами CAG • CTG. Показаны маркеры размера молекул в п.о. (M).

Создание альтернативных структур с помощью ПЦР-амплификации

Принимая во внимание нашу гипотезу о том, что дополнительные полосы, наблюдаемые при электрофорезе в агарозном геле и нативном PAGE, представляют конформации S-ДНК, принятые CAG • повторяющиеся структуры CTG, наши результаты показывают, что структуры, не относящиеся к B-ДНК, образуются в стандартных условиях цикла ПЦР (амплификация <30 циклы). Чтобы подтвердить, что ПЦР-амплификация достаточна для получения альтернативных структур ДНК, в качестве матрицы во второй реакции амплификации с теми же олигонуклеотидными праймерами использовали разведения очищенных гелем образцов ДНК, полученных из отдельных полос и несущих 22 повтора CAG • CTG.Образцы ДНК анализировали с помощью нативного PAGE до и после второго раунда амплификации ПЦР (рис. 4). Продукты, полученные в результате второй реакции амплификации, мигрировали в виде сложной структуры гетерогенных полос, демонстрируя электрофоретические профили, очень похожие на профили, обнаруженные в исходном продукте ПЦР, а также в соответствии с протоколом повторного отжига. Таким образом, амплификация образцов ДНК, полученных из локуса DM1 человека стандартными методами ПЦР, генерирует сложную смесь альтернативных конформаций ДНК, которые взаимно превращаются после протоколов денатурации и повторного отжига.

Рис. 4. Создание альтернативных структур ДНК с помощью ПЦР-амплификации . Образцы ДНК, содержащие 22 повторяющихся единицы CAG • CTG, элюировали из четырех полос (полосы 1–4, черные стрелки), вырезанных из нативного 8% (мас. / Об.) Полиакриламидного геля под УФ-светом, и использовали в качестве матриц для второй ПЦР. усиление. Каждый образец ДНК повторно подвергали электрофорезу до (дорожки, обозначенные Т, матрица) и после второй амплификации ПЦР (дорожки, обозначенные P, продукт ПЦР). В результате амплификации получился сложный узор полос, очень похожий на тот, который наблюдался в исходном продукте ПЦР (дорожка, обозначенная P0), из которого была извлечена матрица.Показаны маркеры размера молекул в п.о. (M).

Обсуждение

Молекулярный механизм (ы) мутации размера тринуклеотидного повтора, связанной с заболеваниями человека, вероятно, включает уникальные структурные свойства, связанные с последовательностями ДНК простых тринуклеотидных повторов. Формирование структур ДНК, таких как шпильки и спиральная ДНК, может влиять на нормальный метаболизм ДНК и приводить к необычной биологии, связанной с триплетными повторами (Mitas, 1997; Sinden et al., 2002; Mirkin, 2006).Мы разработали простой метод на основе агарозного геля для определения наличия альтернативных структур, отличных от B-ДНК, заимствованных двухцепочечными последовательностями ДНК, содержащими более пяти тринуклеотидных повторяющихся единиц CAG • CTG. Медленно мигрирующие виды ДНК, представляющие неортодоксальные конформации ДНК, принятые CAG • CTG-содержащими молекулами, легко обнаруживаются электрофорезом в агарозном геле в отсутствие бромистого этидия. В присутствии бромистого этидия одни и те же продукты разрушаются и мигрируют как единый вид ДНК.Важно отметить, что мы показали, что высокие уровни таких альтернативных структур образуются за счет небольшого количества циклов (<30) во время ПЦР-амплификации низких концентраций матричной ДНК, а также стандартной ПЦР-амплификации тысяч последовательностей геномной ДНК-матрицы. Поэтому настоятельно рекомендуется точный размер продуктов ПЦР, содержащих повторы CAG • CTG, с помощью электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Исключение бромистого этидия из гелей и рабочих буферов приводит к обнаружению дополнительных видов ДНК, которые могут быть неправильно классифицированы как мутантные аллели, что приводит к переоценке частот мутаций и / или неправильной диагностике пораженного статуса.

Пониженная подвижность дополнительных полос в геле, наблюдаемая в отсутствие бромистого этидия, согласуется с ожидаемой для ДНК, содержащей изгибы, введенные из трех- и четырехсторонних соединений, генерируемых петлевой цепью, характерной для структур ДНК со скользящей цепью ( Pearson et al., 1998). Бромид этидия внедряется в ДНК и способен раскручивать неповторяющиеся последовательности ДНК, дестабилизируя взаимодействия тонкого стэкинга (Brukner et al., 1997; Hayashi and Harada, 2007; Lipfert et al., 2010) и увеличивая их подвижность за счет агарозных гелей (Brukner et al., 1997). Следовательно, при добавлении к агарозному гелю и буферу для электрофореза бромид этидия, скорее всего, модифицирует миграцию структурных изоформ повторяющихся последовательностей CAG • CTG, расслабляя дуплекс и увеличивая гибкость изгиба. Интересно, что бромид этидия не изменяет подвижность структурных изоформ через нативные полиакриламидные гели, в которых нормальные триплетные повторы B-ДНК имеют тенденцию проявлять повышенную подвижность (Chastain et al., 1995; Честейн и Синден, 1998; Williams et al., 1999). Более высокое разрешение полиакриламидных гелей может объяснить большую сложность электрофоретических профилей и более высокие уровни не-B-ДНК, обнаруженных по сравнению с электрофорезом в агарозном геле. Похоже, что агарозные гели способны разделять только B-ДНК из гетерогенного подмножества видов, отличных от B-ДНК, тогда как полиакриламидные гели разрешают различные формы молекул, отличных от B-ДНК.

Для всех проанализированных продуктов повторной ПЦР CAG • CTG значительная часть продуктов мигрировала в нативные полиакриламидные гели в виде широкого распределения видов с подвижностью, эквивалентной более чем двукратному их фактическому размеру.Предыдущие анализы с помощью электронной микроскопии показали, что две дополнительные цепи с одинаковым количеством повторов, спаренных вне регистра, образуют гомодуплексные вторичные структуры S-ДНК в случайных местах по всему тракту повторов, вызывая медленную миграцию и гетерогенную популяцию продукты (Pearson et al., 1998; рисунок 5). Тем не менее, обнаружение различных структурных изомеров не привело к равномерно распределенному смазыванию продуктов: предпочтение было отдано определенным вариантам подвижности, которые наблюдались в виде дискретных полос, что указывает на то, что многие изомеры имеют почти идентичную электрофоретическую подвижность, как предполагалось ранее (Pearson and Sinden, 1996; Pearson и другие., 1998, 2002). Учитывая возможность проскальзывания ДНК-полимеразы и образования теневых полос во время ПЦР-амплификации последовательностей тринуклеотидных повторов (Wu et al., 1998; Hunter et al., 2005; Mulero et al., 2006; Olejniczak and Krzyzosiak, 2006; Blanco et al., al., 2008; Gibb et al., 2009), гетеродуплексные двухцепочечные продукты ДНК также могут образовываться. Следовательно, по крайней мере, некоторые виды ДНК, обнаруженные с помощью нативного PAGE, могут соответствовать структурам промежуточной ДНК со скользящей цепью (SI-ДНК), образованным повторным отжигом одноцепочечных тринуклеотидных последовательностей с различным числом повторов (рис. 5).

Рисунок 5. Альтернативные структуры ДНК. (A) Схематическое изображение гомодуплекса B-ДНК. (B) Модели возможных структурных изомеров S-ДНК, генерируемых денатурацией и повторным отжигом вне регистра комплементарных цепей тринуклеотидных повторов. Участки с петлей могут иметь переменный размер и / или количество, и они могут располагаться по всему повторяющемуся тракту. (C) Генерация вариантов повторов малого размера путем проскальзывания ДНК-полимеразы во время ПЦР (теневые полосы).Денатурация и повторный отжиг вне регистра генерируют гомо- и гетеродуплексные двухцепочечные структуры ДНК. Тонкие линии представляют уникальную последовательность, фланкирующую ДНК. Толстые цветные линии представляют собой комплементарные последовательности ДНК, расширенные CTG и CAG.

Интересно, что короткие длины повторов, которые не связаны с заболеванием (5 и 22 CAG • CTG повторяющиеся единицы), также обладают потенциалом генерировать стабильные альтернативные структуры in vitro . Таким образом, способность сворачиваться в конформации не-B-ДНК как таковая не отличает длинные нестабильные патогенные повторы от коротких стабильных повторов.Важно отметить, что более длинные связанные с заболеванием повторы демонстрируют, однако, более высокую склонность к образованию структур ДНК со скользящей цепью, что оценивается по проценту линейной B-ДНК, обнаруженной с помощью нативного PAGE. Более того, ранее предполагалось, что длинные повторяющиеся участки образуют альтернативные структуры с значительно более длительным сроком службы (Gacy et al., 1995). Долгоживущие стабильные вторичные структуры могут рассматриваться как субстраты для механизма увеличения размера повторов, который включает промежуточные звенья ДНК со скользящей цепью, которые распознаются и восстанавливаются путем репарации ошибочного спаривания ДНК (Gomes-Pereira and Monckton, 2006; López Castel et al., 2010; McMurray, 2010), тем самым объясняя, почему расширение происходит с большей частотой при длинных повторах, но не при коротких повторах. Распознавание несовпадений опосредуется изгибом ДНК (Wang et al., 2003; Sass et al., 2010; Hura et al., 2013). Таким образом, можно ожидать, что соединения, такие как бромид этидия, которые интеркалируют в ДНК и изменяют свойства изгиба, изменят распознавание ошибочного спаривания и динамику тринуклеотидных повторов. Стабилизация расширенных повторов CAG • CTG в системе культуры клеток мыши с нестабильной ДНК с помощью бромистого этидия (Gomes-Pereira and Monckton, 2004) может быть, по крайней мере частично, следствием воздействия интеркалирующего химического вещества на структурную структуру ДНК. биология.Более глубокое понимание структур ДНК триплетных повторов и молекулярных механизмов расширения триплетных повторов может облегчить разработку новых путей терапии, основанных на изменении динамики ДНК.

Описанный здесь анализ открывает новые возможности для изучения альтернативных структур ДНК, заимствованных последовательностями тринуклеотидных повторов in vivo . Электрофорез в агарозном геле расщепленного геномного CAG • CTG-содержащая ДНК в отсутствие бромистого этидия может выявить не-B-ДНК структуры, сформированные in vivo при детекции с помощью саузерн-блот-гибридизации.Действительно, возможно, что присутствие / отсутствие бромида этидия в агарозных гелях может влиять на электрофоретическую миграцию и мазки, обнаруживаемые в настоящее время при диагностической гибридизации геномной ДНК по Саузерну. В соответствии с этой гипотезой, уникальное взаимодействие между бромидом этидия, последовательностями геномных тринуклеотидных повторов и их электрофоретической подвижностью было зарегистрировано для CGG • Расширения повторов CCG: бромид этидия снижает подвижность фрагментов геномной ДНК, происходящих из локуса синдрома ломкой Х (Cummins, 1997; Нолин и др., 2008). Противоположный эффект интеркалирующего красителя на подвижность геномных CGG • ДНК CCG и продуктов CAG • CTG, генерируемых ПЦР, остается невыясненным. Это может зависеть от нуклеотидной последовательности самого повтора, различных типов структур, отличных от B-ДНК, принятых CGG • CCG или CAG • CTG-повторов, их химического взаимодействия с бромидом этидия или структурных изменений, специфически вносимых при амплификации ПЦР. Следуя этим результатам, и во избежание возможности неправильного определения размера расширенных аллелей, необходимо тщательно рассмотреть вопрос о включении бромистого этидия в диагностические и исследовательские процедуры.Хотя предлагается исключить бромистый этидий из анализа хрупкой X-Саузерна (Cummins, 1997; Nolin et al., 2008), мы предлагаем включать бромид этидия в геле и рабочем буфере.

Авторские взносы

МГ-П: экспериментальная работа, сбор данных и подготовка рисунков. MG-P и DGM: дизайн / интерпретация исследования, анализ данных и подготовка рукописи.

Финансирование

Мы хотели бы поблагодарить Институт профилактической медицины Листера, Великобритания; Wellcome Trust, Великобритания (номер гранта: 057180) и Fundação para a Ciência e Tecnologia и Fundação Calouste Gulbenkian, Португалия (номер стипендии: Praxis XXI / BD / 18593/98) за финансовую поддержку.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарны Группе динамических мутаций и Маршаллу Старку из Университета Глазго за полезные обсуждения в ходе этой работы.

Список литературы

Аксфорд, М. М., Ван, Ю. Х., Накамори, М., Заннис-Хаджопулос, М., Торнтон, К. А., и Пирсон, К. Э. (2013). Обнаружение проскальзывающих ДНК в тринуклеотидных повторах локуса болезни миотонической дистрофии I типа в тканях пациента. PLoS Genet. 9: e1003866.DOI: 10.1371 / journal.pgen.1003866