Электрофорез механизм действия показания и противопоказания: Страница не найдена

Содержание

показания и противопоказания, методики, алгоритм проведения, механизм действия, преимущества

В настоящее время в лечении различных заболеваний используют разнообразные методы. Если раньше медицина больше основывалась на лекарственной терапии, то сейчас часто назначают физиотерапевтические процедуры. Они помогают быстрее справиться с болезнью. Надо знать, что физиотерапия включает много методов, с одним из которых мы и познакомимся подробнее. Рассмотрим, что собой представляет лекарственный электрофорез, при каких патологиях он показан и имеет ли противопоказания.

Сущность метода лечения

Электрофорез относится к физиотерапевтическим процедурам. Во время сеанса организм пациента подвергается воздействию электрических импульсов с целью получить стойкий терапевтический эффект.

Лекарственный электрофорез используют также для введения медицинских препаратов через кожные покровы и слизистые оболочки. Можно сказать, что этот метод является комплексным, так как идет одновременное воздействие тока и лекарственного средства. Какой препарат выбрать для процедуры, каковы процентное содержание и полярность введения, определяет только лечащий врач с учетом состояния пациента и тяжести заболевания.

Сущность электрофореза сводится к тому, что лекарственные препараты поступают внутрь тканей в виде заряженных частиц через межклеточные пространства, протоки потовых и сальных желез. В результате воздействия электрического тока эффективность препаратов существенно увеличивается, так как происходит повышение чувствительности тканей.

Все медикаменты вводятся с учетом их полярности, если это катионы, то они вводятся с анода, а анионы — с катода. Самым лучшим растворителем считается дистиллированная вода, но для плохорастворимых соединений используют спирт или «Димексид».

Лекарственный электрофорез

Механизм действия этой процедуры заключается в том, что лекарственный препарат в виде ионов поступает внутрь организма пациента через поры и протоки сальных и потовых желез. Катионы и анионы задерживаются на кожных покровах под электродом, а затем постепенно проникают в кровь и лимфу. Из-за такого постепенного поступления воздействие лекарства на организм длительное, что является одним из преимуществ этого метода терапии.

Осуществляется лекарственный электрофорез при помощи разных аппаратов, одним из которых является «Поток». Этот прибор в медицине используется уже давно, он проверен временем и надежен. Есть возможность регулировать во время процедуры силу тока, а также устанавливать время. В настоящее время выпускаются современные аналоги прибора, которые имеют цифровые индикаторы.

Чтобы получить терапевтический эффект, совсем необязательно располагать электроды на больном органе или вводить большие дозы препаратов. Посредством физиотерапии вводят ионы кальция, магния, йода для повышения рефлекторного воздействия на пораженную ткань.

Методики проведения электрофореза

Чтобы повысить эффективность данной процедуры, постоянно разрабатываются и совершенствуются методики электрофореза лекарственного. В настоящее время используют следующие:

  1. Пролонгированная гальванизация. Применяют электрический ток малой силы, но время воздействия продолжительное. Батарея «Крона» является источником тока. Курс лечебных процедур обычно составляет 20-30 сеансов. Электрофорез хорошо успокаивает, оказывает обезболивающее действие.
  2. Лабильная гальванизация. Один электрод во время процедуры закрепляется неподвижно, а второй находится в движении и перемещается со скоростью 3-5 см в секунду по поверхности кожи. Чтобы исключить колебания тока, в аппарат вводят стабилизирующее устройство. Процедура хорошо повышает метаболизм, улучшает кровоснабжение органов и тканей и нервно-мышечную проводимость.
  3. Внутритканевый электрофорез. Проведение процедуры лекарственного электрофореза по данной методике сводится к введению через канюлю подкожно или внутримышечно препарата или смеси веществ. Вводиться лекарство может струйно или капельно. К очагу поражения поперек накладывают электроды, чтобы увеличить концентрацию медицинского препарата. Если лекарство вводят струйно, то ток включают одновременно с этим, а при капельном — после введения.

В неврологической практике электрофорез используют при многих заболеваниях нервной системы. Применяют следующие методики:

1. Вакуум-электрофорез. Используется специальный аппарат ЭВАК-1, который имеет вакуумный насос, кюветы. Во время процедуры кюветы прикладываются к кожным покровам или слизистой оболочке, а прокладка пропитывается лекарственным препаратом. После того как создается разряженное давление, кожа приподнимается и тесно соприкасается с препаратом. Длительность процедуры составляет всего 5-10 минут, на курс необходимо сделать таких 5-10 в зависимости от состояния пациента и тяжести его заболевания. Этот метод электрофореза позволяет ввести большее количество лекарства и гораздо глубже.

2. Микроэлектрофорез. Для проведения процедуры используют ватный вкладыш, в который вставляют фитилек, пропитанный лекарственным препаратом. Сверху располагается электрод для создания контакта металлического наконечника с ватой. Применение лекарственного электрофореза по данной методике используют часто при гипертонии, нарушениях сна, патологиях нервной системы.

3. Электрофонофорез представляет собой сочетание ультразвука и электрофореза. Имеется специальный прибор, который состоит из источника переменного тока, оказывающего терапевтический эффект, датчика, преобразующего ультразвук, источника стабилизированного тока, электронасадки и электрода. Во время процедуры электрод фиксируется на коже, электронасадку заполняют препаратом, закрепляют на ультразвуковом датчике и соединяют с другим полюсом источника тока. Сила тока наращивается постепенно, а потом уже включается ультразвук. Процедуры делают ежедневно, можно через день, по 10-15 минут.

Методики электрофореза лекарственного разные, но какие использовать, решает лечащий врач.

Способы электрофореза

Кроме различных методик, имеются способы использования данной процедуры:

  1. Ванночковый. Сущность заключается в том, что в специальную емкость со встроенными электродами помещается лекарственный раствор и погружается часть тела пациента.
  2. Внутритканевый. Внутривенно или перорально вводят препарат, а на больной участок накладывают электроды.
  3. Полостной способ используют при заболеваниях прямой кишки или влагалища. Внутрь вводится лекарство и подводится электрод, а второй электрод прикрепляется на внешней части тела.

Если назначается лекарственный электрофорез, алгоритм проведения важно знать, но надо также и учитывать, что на всасывание препарата могут оказать влияние различные факторы:

  • Место воздействия процедуры.
  • Возраст больного.
  • Продолжительность электрофореза.
  • Дозировка и концентрация лекарства.
  • Сила электрического тока.
  • Заряд ионов и их размер.
  • Индивидуальные особенности пациента.

Все это необходимо учитывать и корректировать параметры в каждом случае индивидуально.

В чем преимущества электрофореза

Существует много физиотерапевтических процедур, и каждая имеет свои плюсы и минусы. Преимущества лекарственного электрофореза заключаются в следующем:

  • Во время процедуры вводится небольшое количество лекарственного средства.
  • Вещества накапливаются, значит, процедура оказывает пролонгированное действие.
  • Лекарства вводятся в наиболее доступной форме, в виде ионов.
  • Создается высокая местная концентрация без насыщения крови и лимфы.
  • Можно вводить лекарственные вещества в места патологии, что особенно важно при нарушении микроциркуляции.
  • Процедура абсолютно безболезненная.
  • Очень редко наблюдаются побочные эффекты.
  • Лекарства не поступают в ЖКТ, а значит, не разрушаются.
  • Лекарственное вещество вводится через целостные кожные покровы, поэтому специальной стерилизации не требуется.

Таким образом, можно сказать, что этот метод физиотерапевтического воздействия не только эффективный, но и безопасный. Но прежде чем делать лекарственный электрофорез, показания и противопоказания должны быть изучены.

В каких случаях назначают электрофорез

Эта физиотерапевтическая процедура назначается достаточно часто в комплексном лечении многих неврологических, гинекологических, хирургических заболеваний. Не обходится без электрофореза педиатрия и стоматология. Вот перечень некоторых патологий, которые успешно лечатся данной процедурой:

  1. Болезни органов дыхательной системы, начиная с обычного бронхита и заканчивая бронхиальной астмой и пневмонией.
  2. Заболевания уха, горла и носа.
  3. Прекрасно поддаются терапии болезни ЖКТ, например гастрит, панкреатит, язвенная болезнь.
  4. Используется электрофорез в комплексной терапии патологий сердечно-сосудистой системы. Сюда можно отнести гипертонию, гипотонию, стенокардию, мерцательную аритмию и др.
  5. Заболевания мочеполовой системы.
  6. Патологии нервной системы практически не обходятся без данного способа лечения. Прекрасно лечатся мигрени, неврозы, радикулиты, межпозвоночные грыжи и др.
  7. Опорно-двигательная система также хорошо отзывается на электрофорез. Эту процедуру часто назначают после переломов, при остеохондрозе, артрозе, артрите.
  8. Болезни эндокринной системы.
  9. Кожные заболевания.
  10. В области стоматологии также не редкость электрофорез, например при стоматите, гингивите, пародонтите.

Как видно из приведенного списка, лекарственный электрофорез показания имеет достаточно обширные.

Противопоказания к процедуре

Нет такого лечения или процедуры, которые бы были разрешены абсолютно всем. Мы уже рассмотрели, какие имеет лекарственный электрофорез показания. И противопоказания у данного метода терапии имеются. К таковым можно отнести:

  • Доброкачественные и злокачественные новообразования в любом месте организма.
  • Наличие сердечной недостаточности.
  • Наличие кардиостимулятора.
  • Любой воспалительный процесс в организме в стадии обострения.
  • Высокая температура тела.
  • Тяжелая форма бронхиальной астмы.
  • Нарушения свертывания крови.
  • Кожные заболевания, например экзема или дерматит.
  • Нарушение чувствительности кожных покровов.
  • Наличие механических повреждений в месте наложения лекарственных прокладок.
  • Непереносимость электрического тока.
  • Аллергия на лекарственный препарат.
  • Если предполагается наложение электродов на область матки и яичников, то менструация является противопоказанием.

В любом случае, даже если вы считаете, что у вас нет противопоказаний к процедуре, проведение лекарственного электрофореза возможно только после консультации с врачом. Должны быть учтены все нюансы.

Лечебное воздействие электрофореза

Если назначается лекарственный электрофорез, методика проведения, в принципе, любая принесет большую пользу, так как процедура производит следующий терапевтический эффект:

  • Снижает интенсивность воспалительных процессов.
  • Обладает противоотечным действием.
  • Снимает болевые ощущения.
  • Устраняет спазм мышечных волокон.
  • Действует успокаивающе на нервную систему.
  • Ускоряет регенерацию тканей.
  • Активизирует иммунную систему человека.

В момент процедуры эффект также зависит от доминирующего электрода. Если это катод, то:

  • Происходит расширение кровеносных и лимфатических сосудов.
  • Релаксация.
  • Нормализуется обмен веществ.
  • Стабилизируется работа желез внутренней секреции.
  • Стимулируется выработка биологически активных веществ.

Положительный электрод – анод — оказывает следующее воздействие:

  • Способствует выведению лишней жидкости из организма.
  • Обезболивает.
  • Убирает воспаление.

В пользе такой процедуры можно не сомневаться, но главное, чтобы были учтены все противопоказания, иначе это может привести к нежелательным последствиям.

Побочные эффекты электрофореза

Если процедура назначена врачом с учетом состояния пациента и его заболевания, то лекарственный электрофорез нежелательные эффекты дает достаточно редко. Чаще всего это аллергические реакции на лекарственный препарат, которые могут проявляться жжением, покраснением, сыпью и отечностью. После окончания процедуры все симптомы быстро исчезают.

Некоторые пациенты через несколько сеансов отмечают усиление болезненности, небольшое повышение температуры тела. Обычно к концу курса терапии все ощущения проходят без медицинского вмешательства.

Этапы проведения процедуры

Если назначено проведение процедуры лекарственного электрофореза, алгоритм должен быть следующим:

  1. Медсестра или врач перед процедурой должны обязательно проверить исправность аппарата.
  2. Посмотреть в карточке пациента назначения доктора.
  3. Подробно разъяснить, особенно если человек в первый раз делает электрофорез, какие ощущения могут быть.
  4. Помочь пациенту занять удобное положение.
  5. Удостовериться в целостности кожных покровов в месте наложения прокладки.
  6. Приготовить прокладки, соответствующие месту наложения, намочить их в теплой воде.
  7. Приложить их на тело больного.
  8. Сверху накладывается свинцовая пластина, которая будет соединяться проводом с аппаратом.
  9. Произвести расчет силы тока для процедуры.
  10. Проверить, чтобы регулятор интенсивности тока стоял в крайнем левом положении.
  11. Подключить прибор к сети.
  12. Переключатель шунта поставить на отметку «5», если пациентом является ребенок или процедура делается на голову, и «50» для взрослых пациентов и других частей тела.
  13. Постепенно увеличивать силу тока до необходимой величины.
  14. Если пациент процедуру переносит хорошо, то его можно накрыть, но предупредить, что при любых неприятных ощущениях он должен сообщить медсестре.
  15. Засечь время проведения электрофореза.
  16. После окончания регулятор силы тока поставить в положение «0».
  17. Отключить прибор от сети.
  18. Снять с тела пациента электроды и осмотреть кожу на наличие покраснений и раздражений.
  19. Пациенту напомнить, когда он должен прийти на следующую процедуру.

Этот алгоритм выполнения должна знать любая медицинская сестра.

Любые физиотерапевтические процедуры окажут существенную помощь в комплексной терапии, но только тогда, когда они назначаются с учетом патологии и индивидуальных особенностей пациента, а также выполняются качественно, грамотным специалистом. Не стоит пренебрегать электрофорезом, эта процедура поможет быстрее справиться с заболеванием.

Лекарственный электрофорез, принцип действия, показания, противопоказания, дозировка. — Детский массаж в Краснодаре, массаж и физиотерапия c выездом на дом

Электрофорез (phoresis — несение, перенесение, греч.) -перемещение в электрическом поле взвешенных в жидкости частиц, молекул. В физиотерапии — это метод введения в организм лекарственных веществ посредством постоянного электрического тока через кожные покровы или слизистые оболочки.

При этом имеется сочетанное воздействие постоянным электрическим током и лекарственным веществом.

Лекарственный электрофорез, это не просто сочетание эффектов гальванического тока и лекарственного вещества. В результате их взаимодействия усиливается влияние каждого из факторов, в результате этого наблюдается качественно новое воздействие. Ответная реакция зависит в первую очередь от фармакологических свойств лекарственного вещества.
Скорость движения лекарства через кожу в электрическом поле постоянного тока составляет около 1 см в час. За время процедуры лекарственное вещество проникает на небольшую глубину, образуя депо в коже, частично в подкожной клетчатке.

Метод лекарственного электрофореза имеет ряд особенностей и достоинств по сравнению с другими способами введения лекарств: 

1) дает возможность создать в патологическом очаге, расположенном поверхностно, высокую концентрацию лекарства, осуществить локальное воздействие;
2) лекарственные вещества, введенные этим способом, реже вызывают побочные реакции по сравнению с введенными энтерально и парэнтерально;
3) метод лечения безболезненный, не вызывает деформации кожи нарушений в ней микроциркуляции, отсутствует раздражение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта;
4) вводятся ионы или отдельные инградиенты лекарственных веществ, на лечебное действие которых расчитывают. Лекарства в ионной форме проявляют свою максимальную активность;
5) лекарственные вещества действуют на фоне изменений тканей, вызванных гальваническим током..

Лекарственные вещества, не растворимые в воде и спирте, вводят на среде ДМСО (диметилсульфоксид, димексид), которая является универсальным растворителем. Для электрофореза ферментов (лидаза, ронидаза, трипсин, химотрипсин) применяются буферные растворы.
В настоящее время используют небольшие концентрации лекарственных веществ, в основном до 5%.
Для объяснения механизма действия на внутренние органы лекарственных веществ, введенных методом электрофореза, используют учение об ионных рефлексах, разработанные А.Е. Щербаком. Согласно этому учению рецепторы кожи раздражаются ионами лекарственного вещества и постоянным электрическим током. При местном воздействии на кожу ионы лекарства оказывают влияние через вегетативные нервные пути на внутренние органы. С учетом этого действия электроды следует располагать на участках кожи, связанных вегетативной иннервацией с внутренними органами.

При поверхностно расположенных патологических процессах методом электрофореза можно создать достаточно высокую концентрацию лекарства непосредственно в очаге поражения, не насыщая им организм.

При заболеваниях внутренних органов используется «внутритканевой электрофорез» — способ элиминации лекарственного вещества из крови с помощью гальванического тока. Лекарство вводится в кровяное русло (обычно внутривенно капельно). Через некоторое время от начала введения лекарства начинается гальванизация соответствующего органа или ткани. Происходит элиминация лекарства из крови, протекающей через пораженный орган или ткань.

Показания к применению определяются фармакологическими свойствами лекарственного вещества с учетом показаний к применению гальванизации. Лекарственные вещества выбираются по тем же принципам, что и в фармакотерапии.

Противопоказания к применению те же, что и к гальванизации. Дополнительным противопоказанием является индивидуальная непереносимость лекарственного вещества.

Дозировка осуществляется так же, как и при гальванизации.

Основными приборами в нашей стране являются: Поток-1 и Элфор. Это аппараты хорошо себя зарекомендовали в клинических условиях при работе с большим потоком людей.

Электрофорез с новокаином, гидрокортизоном, димексидом: показания и противопоказания

Электрофорез – эффективный физиотерапевтический метод воздействия, в процессе которого на организм человека действуют электрические постоянные импульсы. С помощью техники возможно введение лекарственных средств через кожу или слизистые оболочки.

Электрофорез: механизм действия

Особенность техники заключается в том, что медикаментозные растворы попадают в ткани в виде заряженных частиц через межклеточные пространства и протоки потовых желез. В результате происходит увеличение эффективности от лечения.

К достоинствам метода относится:

  1. Снижение вероятности развития аллергических реакций.
  2. Увеличение срока действия вводимого вещества.
  3. Создается высокая местная концентрация без циркуляции лекарсв по всему организму, лидаза.
  4. Процедура является безболезненной.
  5. Возможность избавления от многих болезней без затрагивания ЖКТ.

Вместе с тем не все медикаменты могут быть введены таким способом. Есть и противопоказания к процедуре.

Показания

Этот вид лечения показан при большинстве болезней. Его используют в качестве вспомогательного или основного лечения. Чаще всего электрофорез и гальванизация назначается в неврологии для лечения неврозов, невралгий, радикулитов, органических заболеваниях нервной системы, простудных заболеваний дыхательной системы, уха при отитах, пневмонии, носа при ринитах. Возможно применение и в кардиологии для борьбы с ишемической и хронической болезнью вне стадии обострения.

В урологии средство применяется для лечения простатитов и воспалительных заболеваний мочевого пузыря. Хорошо помогает справляться с последствием ожогов, а также различных послеоперационных ран. Эффективно при лечении таких заболеваний кожи, как себорея, купероз, рубцы.

Может применяться техника для грудничков и  детей до 1 года при гипо- или гипертонусе мышц, неврологических нарушениях незначительной степени выраженности.

Отзывы и применение электрофореза при лечении разнообразных заболеваний:

Как проводится процедура?

Есть несколько техник для проведения электрофореза:

  • При ванночковом способе в емкость наливают раствор и добавляют необходимое лекарственное вещество. После этого пораженный участок тела погружается в жидкость.
  • Внутритканевая техника подразумевает введение перорально или внутривенно введение медикаментов и прикладывания электродов на больную зону. Особенно актуально при болезнях дыхательной системы (накладывается на воротниковую зону).
  • Полостной метод заключается в том, что во влагалище или анальное отверстие вводится раствор с лекарством. Затем электрод обратной полярности крепится на наружной поверхности тела. Техника актуальна при болезнях малого таза и толстого кишечника.

Обычно лекарство вводится пациенту с электрода, который несет такой же разряд, как у ионизированных частиц. Иона неметаллов и кислот притягиваются к катоду. Дозировка определяется с учетом показателя форетической подвижности состава и концентрации. Плотность тока устанавливается в зависимости от состояния организма.

Как проводится процедура

Лекарства и растворы

Для лечения с этой техникой возможно применение только тех препаратов, которые проникают через кожу. Каждое лекарство имеет свои показания:

  1. Атропин применяется при язвенной болезни, проблемах со зрением и бронхиальной астме. В процессе воздействия происходит снижение тонуса гладких мышц.
  2. Кальций необходим при заболеваниях, вызванных его недостатком. К ним относятся переломы, дисплазия, воспалительные заболевания во рту. Кальций обладает противоаллергическим, кровоостанавливающим и противовоспалительным действием.
  3. Эуфиллин эффективно справляется с гипертонией, нарушением кровообращения и межпозвоночных грыжах. Происходит уменьшение спазма гладких мышц, устраняется боль.
  4. Витамин В1 актуален при заболеваниях ЦНС, органов пищеварения, состояниях, связанных с дефицитом внимания. Витамин обладает противоаллергическим и противовоспалительным эффектом, принимает участие в работе многих органов и систем.

Как сделать электрофорез в домашних условиях, смотрите в нашем видео:

Лечебный эффект

При курсовом использовании техники происходит снижение интенсивности воспалительных процессов. Средство обладает противоотечным действием, снимает болевые ощущения, устраняет спазмы.

Эффект зависит и от доминирующего электрода. Например, если это катод, то расширяются лимфатические сосуды, нормализуется обмен веществ, стабилизируется работы желез внутренней секреции. Положительный электрод выводит лишнюю жидкость из организма, обладает обезболивающим действием.

Противопоказания и побочный эффект

К абсолютным противопоказаниям относится непереносимость тока, тяжелое состояние здоровья, высокая температура тела, туберкулез, плохая свертываемость крови. Нельзя проходить лечение людям с шизофренией, эпилепсией и некоторыми другими психическими заболеваниями.

К относительным противопоказаниям относится беременность, детский возраст (отдельные препараты), гипертония в стадии обострения. При назначении лекарства учитывается возраст пациента, чувствительность к электрофорезу, наличие острых и хронических болезней.

Побочные эффекты появляются редко, но сохраняется риск развития аллергии на применение отдельных препаратов. В редких случаях при длительном воздействии тока может появиться покраснение в месте наложения прокладки.

Физиотерапевтическая ценность

Электрофорез может оказать существенную помощь в комплексной терапии, но только при назначении с учетом патологии и индивидуальных особенностей пациента. Важно, чтобы процедуру проводил грамотный специалист. Электрофорез дает возможность ввести препараты в области, где отмечается нарушение микроциркуляции и кровообращения.

Положительной чертой техники является и низких уровень аллергических и побочных реакций. Благодаря современным аппаратам врач может регулировать интенсивность воздействия.

Электрофорез, методика проведения процедур, показания и противопоказания / OMEDVET

Электрофорез — метод введения лекарственных веществ в организм через кожу, слизистые оболочки при помощи постоянного тока.

Механизм действия электрофореза связан с распадом лекарственного вещества на ионы и накоплением его в коже, откуда с током крови и лимфы оно медленно посту­пает в организм, усиливая свои фармакологические дей­ствия. При электрофорезе одновременно действуют два фак­тора — лекарственный препарат и гальванический ток, что способствует поступлению лекарственного препарата в бо­лее активной форме. Можно одновременно вводить с раз­ных полюсов разные лекарственные растворы. Однако не каждые лекарственные вещества можно вводить в орга­низм методом электрофореза, так как некоторые из них под действием постоянного тока могут распадаться, изме­нять фармакологические свойства и оказывать вредное дей­ствие.

Показания. Подострые и хронические процессы, рев­матические и травматические поражения суставов, мышц, сухожилий, гайморит, фронтит, мастит, невралгии, неврит.

Противопоказания. Повышенная чувствительность к гальваническому току, острые гнойные воспаления, гемор­рагические диатезы, злокачественные новообразования, необратимые дегенеративные процессы.

Методика проведения электрофореза аналогична галь­ванизации, только в зависимости от заряда иона вводимо­го лекарственного вещества им смачивают гидрофильную прокладку с одинакового по заряду электрода. С проклад­ки положительного электрода (анода) вводятся ионы мно­гих металлов, а также положительные ионы сложных веществ, содержащих кальций, натрий, магний и т. д., с отрицательного (катода) — ионы кислых радикалов и от­рицательные ионы сложных веществ, содержащих хлор, йод, бром и т. д. Растворы большинства вводимых лекар­ственных веществ 1-5% -ной концентрации. В качестве ра­створителя применяют диметилсульфоксид (ДМСО) или ди­стиллированную воду, подкисленную соляной кислотой. Растворы антибиотиков и сульфаниламидных препаратов пригодны для применения в течение 4-7 дней. При введе­нии дорогостоящих лекарственных препаратов для гидро­фильной прокладки вместо фланелевых мешочков можно применить фильтровальную бумагу или небольших разме­ров марлю.

Основы практики, процедура, механизм действий

Автор

Викас Шривастава, MD Врач-резидент, Отделение дерматологии, Военно-морской медицинский центр Сан-Диего

Раскрытие: Ничего не разглашать.

Соавтор (ы)

Кендалл М. Иган, доктор медицины, FAAD Дерматолог, Медицинский центр по делам ветеранов; Дерматолог, Spruce Health, дерматолог, DermOne

Кендалл М. Иган, доктор медицинских наук, FAAD является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии, Американская медицинская ассоциация, Ассоциация военных дерматологов

Раскрытие информации: не раскрывать.

Специальная редакционная коллегия

Ричард П. Винсон, доктор медицины Ассистент клинического профессора, кафедра дерматологии, Центр медицинских наук Техасского технического университета, Медицинская школа Пола Л. Фостера; Консультант, Дерматология Маунтин-Вью, PA

Ричард П. Винсон, доктор медицинских наук, является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии, Техасская медицинская ассоциация, Ассоциация военных дерматологов, Техасское дерматологическое общество

Раскрытие: нечего раскрывать.

Аманда М. М. Окли, MBChB, FRACP Адъюнкт-профессор, кафедра медицины, клиническая школа Вайкато; Дерматолог, отделение дерматологии, больница Вайкато, Новая Зеландия

Аманда М.М. Окли, MBChB, FRACP является членом следующих медицинских обществ: Американская академия дерматологии, Американская дерматологическая ассоциация, Австралийское и новозеландское вульвовагинальное общество, Международное исследовательское общество по вульвовагинальным заболеваниям, Новозеландское дерматологическое общество, Королевский австралазийский колледж врачей

Раскрытие информации: Полученный доход в размере 250 долларов США или более от: Непосредственно в качестве сотрудника DermNet New Zealand, от нескольких фармацевтических компаний-спонсоров
Получено Консультационный сбор от MoleMap NZ за консультацию.по: MoleMap New Zealand.

Главный редактор

Уильям Д. Джеймс, доктор медицины Пол Р. Гросс, профессор дерматологии, заместитель председателя, директор программы резидентуры, факультет дерматологии, Медицинская школа Университета Пенсильвании

Уильям Д. Джеймс, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Американских Академия дерматологии, Общество следственной дерматологии

Раскрытие информации: Полученный доход в размере 250 долларов США или выше от: Elsevier; WebMD
Выступал в качестве спикера для различных университетов, дерматологических обществ и дерматологических факультетов.

Дополнительные участники

Гарольд С. Рабиновиц, доктор медицины Клинический профессор кафедры дерматологии Медицинского факультета Университета Майами

Раскрытие информации: раскрывать нечего.

Благодарности

Camille E Introcaso, MD Сотрудник службы эпидемической разведки, Центры по контролю и профилактике заболеваний

Camille E Introcaso, MD является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha и Американской академии дерматологии

Раскрытие информации: Ничего не нужно раскрывать.

Эллен Дж. Ким, доктор медицинских наук Доцент кафедры дерматологии Медицинской школы Пенсильванского университета, больница Пенсильванского университета

Эллен Дж. Ким, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Американская академия дерматологии, Фонд дерматологии, Общество медицинской дерматологии и Phi Beta Kappa

.

Раскрытие информации: Ничего не нужно раскрывать.

Майкл С. Лерер, доктор медицины Доцент кафедры дерматологии Пенсильванского университета

Майкл С. Лерер, доктор медицины, является членом следующих медицинских обществ: Alpha Omega Alpha, Американской академии дерматологии, Американского колледжа микрографической хирургии и кожной онкологии Мооса и Американского общества дерматологической хирургии

Раскрытие информации: Ничего не нужно раскрывать.

Ален Рук, доктор медицины Профессор отделения дерматологии, больница Пенсильванского университета

Раскрытие информации: Ничего не нужно раскрывать.

Благодарности

Взгляды, выраженные в этой рукописи, принадлежат авторам и не отражают официальную политику Министерства Военно-Морского Флота, Министерства Армии, Министерства обороны или правительства США. Авторы — сотрудники правительства США и военнослужащие.Эта работа была подготовлена ​​в рамках их служебных обязанностей. Раздел 17, USC, § 105 гласит, что «Защита авторских прав в соответствии с этим разделом недоступна для какой-либо работы правительства Соединенных Штатов». Раздел 17, USC, § 101 определяет работу правительства США как работу, подготовленную военнослужащим или служащим правительства США в рамках официальных обязанностей этого лица.

границ | Бромид этидия изменяет электрофоретическую подвижность CAG в агарозе • Альтернативные структуры ДНК CTG, полученные с помощью ПЦР

Введение

Расширение последовательностей ДНК с нестабильными тринуклеотидными повторами является генетической причиной серьезных заболеваний человека, включая миотоническую дистрофию 1 типа (DM1), болезнь Хантингтона (HD), атаксию Фридрейха (FRDA) и синдром ломкой Х-хромосомы (FRAXA; Pearson et al., 2005; Гомеш-Перейра и Монктон, 2006 г .; Чжао, Усдин, 2015). По крайней мере 15 из этих состояний, включая DM1, HD и многие спиноцеребеллярные атаксии (SCA), были связаны с экспансией триплетных повторов CAG • CTG (Gomes-Pereira and Monckton, 2006; Zhao and Usdin, 2015). Последующий патогенез, запускаемый расширениями повторов, варьирует от болезней и может опосредоваться разными молекулярными механизмами (Gatchel and Zoghbi, 2005). Среди них токсичность РНК была впервые описана при DM1 (Mankodi et al., 2000), мультисистемное расстройство, вызванное аномальной экспансией некодирующего CAG • CTG тринуклеотидного повтора ДНК (Brook et al., 1992). Помимо DM1, токсические транскрипты РНК участвуют в патогенезе других заболеваний распространения CAG • CTG, таких как SCA типа 8 (SCA8), SCA12, HD, болезнь Хантингтона, подобная-2 (HDL2) и эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса (FECD). ; Sicot et al., 2011; Sicot, Gomes-Pereira, 2013; Du et al., 2015).

CAG, ассоциированный с заболеванием • Тринуклеотидные повторы CTG крайне нестабильны в зародышевой линии и в соматических клетках, проявляя заметную тенденцию к дальнейшей экспансии.Поскольку более длинные повторы связаны с более тяжелым фенотипом и более ранним возрастом начала, смещенная к экспансии нестабильность повторов зародышевой линии объясняет феномен ожидания; при этом у последующих поколений наблюдается более ранний возраст начала и более серьезные симптомы. Кроме того, появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что тканеспецифический, возрастной и зависимый от экспансии соматический мозаицизм, скорее всего, способствует тканеспецифическим симптомам и прогрессированию заболевания при расстройствах распространения CAG • CTG (Kennedy et al., 2003; Уиллер и др., 2003; Свами и др., 2009; Моралес и др., 2012). В результате расшифровка молекулярных механизмов экспансии тринуклеотидных повторов не только поможет понять важные аспекты патогенеза заболевания, но также может открыть новые возможности для разработки новых терапевтических вмешательств (Gomes-Pereira and Monckton, 2006; López Castel et al. ., 2010).

Был предложен ряд различных молекулярных механизмов экспансии тринуклеотидных повторов, включая аберрантную репликацию ДНК, репарацию ДНК и / или гомологичную рекомбинацию ДНК (Richards and Sutherland, 1994; Richard and Pâques, 2000; Pearson et al., 2005; Гомеш-Перейра и Монктон, 2006 г .; Миркин, 2007; МакМюррей, 2010; Усдин и др., 2015). Несмотря на то, что они зависят от различных молекулярных событий, большинство предложенных механизмов объединяет одна общая тема: предположение о том, что повторяющиеся не-B-ДНК структуры, принятые одной или обеими цепями ДНК, участвуют в механизме генетической нестабильности, действуя как движущая сила расширения (Sinden, Wells, 1992; McMurray, 1999; Wells et al., 2005; Mirkin, 2006; Usdin et al., 2015). Вычислительные исследования предсказали необычные биофизические свойства последовательностей тринуклеотидных повторов (Baldi et al., 1999). В частности, тринуклеотидные повторы CAG • CTG образуют стабильные внутрицепочечные шпильки ДНК, не только in vitro (Gacy et al., 1995), но также в моделях клеток млекопитающих нестабильности CAG • CTG (Liu et al., 2010). Самое интересное, что была идентифицирована новая форма двухцепочечной структуры, отличной от B-ДНК. Плавление и повторный отжиг плазмидной ДНК или фрагментов генов, содержащих CAG • CTG-повторы, приводит к тому, что большая часть популяции ДНК принимает альтернативные конформации с замедленной подвижностью в нативных полиакриламидных гелях (Pearson and Sinden, 1996).Биохимические доказательства и данные электронной микроскопии согласуются с существованием структур со скользящей цепью ДНК (S-ДНК), образованных внутри триплетных повторов в линейных дуплексных молекулах (Pearson et al., 1997, 1998, 2002; Tam et al., 2003). ). Как склонность к образованию S-ДНК, так и сложность структур возрастают с увеличением длины пути чистого повтора (Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1997) и параллельны вероятности расширения повтора, предполагая критическую роль в механизм мутации размера повтора.В самом деле, уровни структур ДНК со скользящей цепью, выделенных иммунопреципитацией из разных тканей пациентов с DM1, коррелируют со степенью соматического мозаицизма (Axford et al., 2013). Такие структуры распознаются и связываются белком репарации ошибочного спаривания MSh3 (Pearson et al., 1997), что, возможно, способствует их удержанию и последующей экспансии повторов (Kovtun and McMurray, 2001; Savouret et al., 2004; Tomé et al., 2009). ; Guo et al., 2016). В дополнение к функциональному MSh3, по крайней мере четыре других компонента пути репарации ошибочного спаривания ДНК необходимы для обеспечения высоких уровней соматической экспансии CAG • CTG (Manley et al., 1999; ван Ден Брук и др., 2002; Гомеш-Перейра и др., 2004; Фойри и др., 2006; Сериола и др., 2011; Пинто и др., 2013; Томе и др., 2013; Моралес и др., 2016). Более того, прерывания последовательности в пределах чисто повторяющихся участков резко снижают склонность к образованию структур ДНК со скользящей цепью, а также гетерогенность формируемых структур (Pearson et al., 1998). Защитный эффект прерывания последовательности на образование альтернативных структур ДНК CAG • CTG параллелен стабилизирующему эффекту при DM1 (Musova et al., 2009; Braida et al., 2010; Botta et al., 2017), SCA1 (Chung et al., 1993; Chong et al., 1995), SCA2 (Choudhry et al., 2001) и SCA17 (Gao et al., 2008). Взятые вместе, эти наблюдения убедительно подтверждают роль структур со скользящей цепью в процессе экспансии CAG • CTG повторов.

ДНК, интеркалирующий краситель бромистый этидий, взаимодействует напрямую с ДНК и способен изменять структурные особенности, зависящие от последовательности, такие как хиральность, планарность и скручивание изогнутых сегментов ДНК (Brukner et al., 1997; Хаяси и Харада, 2007; Lipfert et al., 2010). Следовательно, бромид этидия может изменять структурные особенности альтернативных последовательностей тринуклеотидных повторов при добавлении к агарозным гелям. Мы исследовали влияние этого интеркалирующего красителя на конформационный метаболизм повторяющихся последовательностей CAG • CTG и разработали простой метод обнаружения присутствия альтернативных структур, не относящихся к B-ДНК, на основе дифференциальных электрофоретических профилей последовательностей тринуклеотидных повторов в агарозных гелях. в присутствии и в отсутствие бромистого этидия.

Материалы и методы

ПЦР-амплификация и анализ

Аллели DM1 одного размера, содержащие 5, 22, 44, 56 или 200 повторяющихся единиц CTG, были выделены последовательным разведением и амплификацией одной молекулы геномной ДНК человека с помощью ПЦР, как описано ранее (Gomes-Pereira et al., 2004). Затем эти аллели использовали в качестве входной ДНК (0,1–1 нг) в последующих стандартных амплификациях ПЦР с использованием ранее описанных олигонуклеотидных праймеров DM-A, DM-BR, DM-C, DM-DR, DM-ER, DM-H ( Monckton et al., 1995, 1997). ПЦР-амплификации, электрофорез в агарозном геле, блоттинг по Саузерну и гибридизацию выполняли, как описано ранее (Gomes-Pereira et al., 2004). Молекулярная линейка AmpliSize TM (лестница 50–2000 пар оснований; BioRad) или лестница GeneRuller 100 пар оснований (Thermo Scientific) и программное обеспечение Kodal Digital Science 1D (Kodak) использовались для количественной оценки электрофоретической подвижности и определения размеров ДНК. Все участники исследования были набраны с информированного согласия для генетических исследований миотонической дистрофии.

Электрофорез в неденатурирующем полиакриламидном геле

Неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) проводили в гелевом аппарате BioRad Protean II, используя 8% (мас. / Об.) Неденатурирующие гели акриламид / бис (29: 1), содержащие 10% (об. / Об.) глицерин в 1X TBE (90 мМ основание Trizma, 90 мМ ортоборная кислота, 2 мМ EDTA). Полимеризующие агенты NNN’N’- тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) и персульфат аммония (APS) добавляли до конечной концентрации 0,625% (об. / Об.) И 0.125% (мас. / Об.) Соответственно. Перед загрузкой гели уравновешивали, применяя 5 Vcm -1 в течение 90 минут с непрерывной рециркуляцией рабочего буфера 1X TBE при 4 ° C. Образцы ДНК разделяли при 10 Vcm -1 в течение 16 часов при 4 ° C с рециркуляцией буфера. Гель окрашивали 500 нМ бромистого этидия в 1X TBE в течение 20 мин при комнатной температуре. Разделенные образцы ДНК визуализировали с помощью УФ-трансиллюминатора (длина волны 254 нм) и фотографировали. Альтернативно, ДНК переносили из полиакриламидного геля на нейлоновую мембрану с помощью блоттинга по Саузерну «сквош» и гибридизовали с радиоактивно меченным CAG • CTG-содержащим зондом, как описано ранее (Gomes-Pereira et al., 2004). Молекулярная линейка AmpliSize TM (лестница 50–2000 пар оснований; BioRad) и программное обеспечение Kodal Digital Science 1D (Kodak) были использованы для количественной оценки электрофоретической подвижности и определения размера ДНК.

Экстракция ДНК из неденатурирующих полиакриламидных гелей

Полосы, соответствующие интересующим образцам ДНК, вырезали из полиакриламидного геля с помощью скальпеля при УФ-трансиллюминации. ДНК элюировали из фрагментов геля простой диффузией в 500 мкл 1X TE (10 мМ Tris • HCl pH 8.0,1 мМ EDTA) при 37 ° C в течение 48 часов. Линейный полиакриламид использовали в качестве носителя ДНК для осаждения очищенных гелем образцов ДНК, как описано ранее (Gaillard and Strauss, 1990).

Протоколы денатурирования и повторного отжига

видов ДНК, элюированных из неденатурирующего PAGE, были либо денатурированы нагреванием, либо подвергнуты протоколу повторного отжига. Процедура денатурации заключалась в нагревании ДНК при 100 ° C в течение 5 минут в присутствии 40% (об. / Об.) Формамида с последующим быстрым охлаждением на льду.Протокол повторного отжига включал начальную стадию плавления при 100 ° C в течение 5 минут с последующим медленным охлаждением до 18 ° C со средней скоростью -0,5 ° C в минуту. Плавление и охлаждение проводили в термоциклере Biometra Uno.

Результаты

Измененная электрофоретическая подвижность последовательностей тринуклеотидных повторов в присутствии бромида этидия

Чтобы исследовать возможное влияние бромистого этидия на биофизические свойства двухцепочечных последовательностей ДНК с тринуклеотидными повторами, мы проанализировали электрофоретические профили повторяющихся последовательностей CAG • CTG, происходящих из локуса DM1 в различных условиях.Последовательности ДНК, содержащие различное количество повторов CAG • CTG (в диапазоне от 5 до 200), были получены с помощью двух раундов амплификации ПЦР, причем оба цикла включали <30 циклов. Геномную ДНК человека первоначально амплифицировали с помощью ПЦР с малым пулом одиночных молекул (SP-PCR) с олигонуклеотидными праймерами DM-A и DM-BR (Monckton et al., 1995). Разделенные продукты ПЦР, содержащие участки CAG • CTG разного размера, впоследствии амплифицировали с помощью стандартной ПЦР с различными комбинациями олигонуклеотидных праймеров для создания фланкирующих областей разного размера.Образцы разделяли через 1,8% (мас. / Об.) Агарозные гели с или без 500 нМ бромистого этидия, как в геле, так и в буфере для электрофореза, и детектировали с помощью Саузерн-сквош-блот-гибридизации (Gomes-Pereira et al., 2004 ). В присутствии бромистого этидия продукты ПЦР мигрировали преимущественно как один основной вид ДНК и в большинстве случаев генерировали четкую и четко очерченную полосу (рис. 1А). Напротив, те же продукты амплификации, содержащие 22, 56 и 200 триплетных повторов, генерировали одну или две дополнительные медленно мигрирующие полосы в отсутствие бромида этидия для всех исследованных фланкирующих последовательностей (Фигуры 1A, B).Продукты ПЦР, содержащие только пять повторяющихся единиц, не давали множественных полос в одних и тех же условиях. 22 повторных продукта ПЦР генерировали один дополнительный медленно мигрирующий вид. Продукты ПЦР с 55 повторами генерировали одну, но очень широкую дополнительную полосу ДНК, которая могла представлять собой диффузный дублет. Самые длинные продукты ПЦР, содержащие 200 повторов CTG, дали два четко разделяемых медленно мигрирующих вида (полосы 2 и 3, рисунок 1B). Подобный эффект бромистого этидия на электрофоретическую подвижность расширенных последовательностей триплетных повторов через агарозные гели наблюдался для продуктов ПЦР, полученных из HD, SCA7, FECD / CTG18.1 и ERDA1 локусов (Braida et al., Неопубликованные наблюдения), что указывает на то, что это общий феномен для последовательностей повторов CAG • CTG.

Рис. 1. Влияние бромистого этидия на подвижность CAG • Последовательности CTG в агарозных гелях. (A) Присутствие / отсутствие бромистого этидия изменяет подвижность ПЦР-амплифицированного расширенного CAG • Повторения CTG во время электрофореза в агарозном геле. Продукты ПЦР, содержащие 5, 22, 56 или 200 повторов CAG • CTG были индивидуально выделены из локуса DM1 человека серийным разведением, затем амплифицированы с различными комбинациями DM-специфических олигонуклеотидных праймеров (DM-A, DM-H, DM- C, DM-BR, DM-DR и DM-ER) и разрешены через 1.8% (мас. / Об.) Агарозные гели с (слева) или без (справа) 500 нМ бромистого этидия как в геле, так и в рабочем буфере 1X TBE. Затем амплифицированные продукты детектировали с помощью Саузерн-блот-гибридизации «сквош». Авторадиограммы демонстрируют повышенную подвижность альтернативных расширенных конформеров CAG • CTG в агарозных гелях в присутствии бромистого этидия. Обратите внимание на многочисленные альтернативные продукты, наблюдаемые в отсутствие интеркалирующего химического вещества. Шкала слева представляет положение и размеры маркеров молекулярной массы в п.о. (M). (B) Отсутствие бромистого этидия в геле и рабочем буфере приводит к обнаружению дополнительных медленно мигрирующих видов во время электрофореза в агарозном геле расширенных последовательностей CAG • CTG. На авторадиограмме крупным планом показаны продукты ПЦР DM1, разделенные в агарозном геле в отсутствие бромистого этидия. Обратите внимание на положение предполагаемых структур B-ДНК (1) и структур, отличных от B-ДНК (2 и 3). (C) Интенсивные быстро мигрирующие полосы, наблюдаемые в отсутствие бромида этидия, демонстрировали ту же электрофоретическую подвижность, что и одиночная полоса, обнаруживаемая в присутствии бромида этидия.Отношение между относительной подвижностью в агарозном геле и фактическим размером ( п.н., кажущееся / п.н. фактическое ) видов ДНК показано для продуктов ПЦР, содержащих 22, 56 и 200 повторов. График показывает значительную разницу между электрофоретической подвижностью медленно мигрирующих видов ДНК, обнаруженной в отсутствие бромистого этидия, и одиночной полосой, обнаруженной в присутствии красителя (* p <0,05; *** p <0,001 ; односторонний дисперсионный анализ (ANOVA)). (D) Предварительная инкубация с бромидом этидия не устраняет дополнительных медленно мигрирующих видов во время электрофореза в агарозном геле расширенных CAG, амплифицированных с помощью ПЦР • Повторы CTG. Аллели DM1 с различным числом повторов амплифицировали с помощью ПЦР с использованием нескольких комбинаций олигонуклеотидных праймеров, указанных на рисунке над каждой полосой. Половину каждого продукта ПЦР инкубировали с 500 нМ бромистого этидия в течение более 48 часов перед электрофорезом и гибридизационным анализом. Авторадиографы не выявляют каких-либо заметных различий в электрофоретическом профиле между обработанными и необработанными образцами. (E) Бромид этидия модифицирует электрофоретическую подвижность CAG в агарозе • Продукты CTG, полученные путем объемной ПЦР-амплификации 20–100 нг матричной геномной ДНК. Последующее окрашивание бромидом этидия выявило медленно мигрирующие виды ДНК, содержащие 56 и 200 повторов CAG • CTG, которые не были обнаружены при добавлении красителя в гель и рабочий буфер.

Чтобы количественно оценить влияние бромистого этидия на электрофоретическую подвижность ПЦР-генерируемых последовательностей CAG • CTG в агарозных гелях, мы рассчитали соотношение между кажущимся размером видов ДНК и фактическим размером последовательности ( R = кажущихся п.н. / bp фактическое ), как описано ранее (Chastain et al., 1995). Этот рисунок служит оценкой аберрантной миграции ДНК относительно известного маркера размера молекулы. Мы сосредоточились на размерах повторов, которые генерировали медленно мигрирующие полосы (22, 56 и 200 повторов CAG • CTG), и обнаружили, что кажущееся соотношение п.н. / п.н. фактическое соотношение быстро мигрирующих видов ДНК (обнаружено в отсутствие бромистого этидия). ) существенно не отличался от одиночной полосы, обнаруженной в присутствии бромистого этидия. Напротив, медленно мигрирующие виды ДНК показали значительно более высокое соотношение пар оснований , кажущееся / bp , фактическое соотношение , показывая увеличение на ~ 5% и ~ 11% для продуктов ПЦР, содержащих 56 или 200 повторов CAG • CTG, соответственно (рис. 1C).Учитывая идентичную электрофоретическую подвижность быстро мигрирующих полос в отсутствие бромистого этидия и единственной полосы, обнаруженной при добавлении интеркалирующего красителя в гель и рабочий буфер, мы предположили, что первые представляют собой предполагаемые линейные молекулы B-ДНК. Более того, денситометрическая количественная оценка предполагаемых видов не-B-ДНК, обнаруженных в этом анализе, показала, что относительное количество быстро мигрирующих молекул B-ДНК снижалось с увеличением длины аллелей (рис. 2D). Другими словами, электрофоретический профиль продуктов амплификации в отсутствие бромистого этидия становится более сложным по мере удлинения повторяющейся последовательности.

Рис. 2. Анализ альтернативных структур ДНК CAG • CTG-содержащие продукты ПЦР с помощью электрофореза в нативном полиакриламидном геле (PAGE). (A) Обнаружение множества медленно мигрирующих видов во время нативного PAGE амплифицированного с помощью ПЦР расширенного CAG • CTG-повторов. Аллели DM1 разной длины амплифицировали с использованием олигонуклеотидных праймеров DM-A и DM-DR и разделяли через неденатурирующий 8% (мас. / Об.) Полиакриламидный гель, содержащий 10% (об. / Об.) Глицерина в отсутствие бромида этидия.Продукты ПЦР детектировали с помощью саузерн-блот-гибридизации. Авторадиография показывает наличие сложной картины из множества полос для каждого продукта ПЦР. (B) Те же продукты ПЦР, содержащие различное количество повторов CAG • CTG, были разделены с помощью нативного PAGE в отсутствие (вверху) или в присутствии (внизу) 500 нМ бромистого этидия в геле и рабочем буфере. Бромид этидия не влияет на обнаружение медленно мигрирующих видов ДНК в неденатурирующих полиакриламидных гелях. Показаны маркеры размера молекул в п.о. (M). (C) Более длинный CAG • Повторяющиеся продукты CTG перемещаются аномально быстро во время естественного PAGE. Отношение между кажущимся размером нативных видов в нативном полиакриламиде и их фактическим размером ( п.н., кажущееся / п.о. фактическое ) наносят на график в зависимости от количества повторов продуктов ПЦР. График показывает линейную зависимость ( r 2 = 0,986, p <0,001), что указывает на то, что увеличение электрофоретической подвижности за счет неденатурирующих полиакриламидных гелей увеличивается по мере удлинения повторяющегося тракта CAG • CTG. (D) Доля видов, не относящихся к B-ДНК, присутствующих в продуктах ПЦР-амплификации CAG • повторяющихся последовательностей CTG увеличивается с увеличением длины аллеля. Процент В-ДНК, обнаруженный в агарозных и неденатурирующих полиакриламидных гелях, оценивали денситометрическим анализом для каждого продукта ПЦР и наносили на график как функцию числа повторов CAG • CTG (логарифмическая шкала). Нелинейная регрессия указывает на снижение процента дуплекса B-ДНК, обнаруженного в агарозе ( r 2 = 0.989, p = 0,03) или в полиакриламидных гелях ( r 2 = 0,855, p = 0,02) по мере увеличения повторения.

Чтобы определить, являются ли интеркалирующие свойства бромида этидия per se ответственными за этот эффект, выбранные продукты ПЦР инкубировали с 500 нМ бромистого этидия в течение 48 часов перед электрофорезом. В этих условиях электрофорез в агарозном геле без добавления бромистого этидия к гелю или буферу привел к обнаружению тех же дополнительных медленно мигрирующих полос, которые наблюдались при полном отсутствии бромида этидия на любой стадии (рис. 1D).Эти данные предполагают, что бромид этидия способен изменять подвижность только структурных изомеров, образованных в последовательностях, расширенных CAG • CTG, когда они присутствуют в геле и рабочем буфере, и, по-видимому, не опосредует прямое взаимное превращение структурных изоформ.

Чтобы исключить возможность смешивания структурных артефактов, вносимых несколькими раундами амплификации ПЦР, мы проанализировали последовательности повторов, генерируемые прямой амплификацией 10–100 нг геномной ДНК от трансгенных мышей DM1, несущих 20, 55 или 260 CAG • Повторы CTG в организме человека Трансген DMPK (Gourdon et al., 1997; Seznec et al., 2000). Разделение продуктов ПЦР через агарозные гели, содержащие 500 нМ бромистого этидия, давало единичные резкие полосы ожидаемого размера. Напротив, пост-окрашивание гелей без бромида этидия выявило медленно мигрирующие виды ДНК с размерами повторов 55 CAG • CTG и выше (рис. 1E). Эти результаты демонстрируют, что бромид этидия обычно влияет на электрофоретическую подвижность CAG • повторяющихся последовательностей CTG, генерируемых протоколами ПЦР-амплификации.

Выявление альтернативных структур ДНК CAG • Последовательностей CTG в нативном полиакриламидном геле-электрофорезе

Чтобы подтвердить присутствие альтернативных структур, не относящихся к B-ДНК, в продуктах ПЦР, последовательности, амплифицированные с олигонуклеотидными праймерами DM-A и DM-DR, были разделены через нативный 8% (мас. / Об.) Полиакриламидный гель с 10% ( об. / об.) глицерин, и детектировали с помощью Саузерн-блот-гибридизации «сквош».Хотя каждый продукт ПЦР генерировал одну полосу после электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия (рис. 1А), сложные электрофоретические профили, состоящие из интенсивной быстро мигрирующей полосы и серии новых, близко расположенных видов ДНК, наблюдались на нативных полиакриламидные гели (рис. 2А). Интересно, что присутствие бромистого этидия в геле и / или рабочем буфере не сильно влияло на подвижность альтернативных последовательностей ДНК через нативные полиакриламидные гели (рис. 2В).Паттерны аномально мигрирующих продуктов были очень похожи на те, которые ранее были описаны для фрагментов генов или плазмид, содержащих триплетные повторы, после протоколов денатурации и ренатурации (Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1998).

Как сообщалось ранее, основная полоса, обнаруженная для каждого продукта ПЦР, мигрировала быстрее, чем ожидалось для предполагаемой двухцепочечной молекулы B-ДНК через нативные полиакриламидные гели (Chastain et al., 1995; Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1998). Чтобы количественно оценить этот эффект и оценить аберрантную миграцию ДНК относительно известных маркеров размера молекул, мы использовали соотношение кажущихся пар оснований / фактическое пар оснований для каждого продукта ПЦР при нативном ПААГ, как описано (Chastain et al., 1995). Для основной быстро мигрирующей полосы соотношение варьировалось от 0,95 для продукта ПЦР, содержащего пять повторов CTG (что соответствует увеличению подвижности на ~ 5%), до 0,78 для самого длинного повтора (что соответствует увеличению подвижности на ~ 22%).В целом, длина повтора составляет ~ 99% вариации в соотношениях , кажущихся / bp , фактических ( r 2 = 0,986, p <0,001; Рисунок 2C), что позволяет предположить, что их быстрая мобильность последовательности в нативных полиакриламидных гелях тесно зависят от размера повторов и, вероятно, связаны с повышенной гибкостью тракта тринуклеотидных повторов, как предполагалось ранее (Chastain and Sinden, 1998). Дополнительные полосы с более низкой подвижностью определяли электрофоретические картины, которые были аналогичными для всех проанализированных длин триплетных повторов.Медленно мигрирующие продукты характеризовались широким диапазоном соотношений размеров ( п.н., кажущихся / п.н., фактических ), варьирующих от ~ 1,3 до ~ 2,6, что, вероятно, представляет собой дискретные изоформы ДНК (Таблица 1). Примечательно, что медленно мигрирующая полоса, полученная из самого короткого продукта ПЦР (5 повторов CAG • CTG), показывала соотношение размеров п.н. кажущихся / п.н. фактических 1,56, тогда как более длинные аллели (22, 46 и 56 повторов) давали рост полосам с соотношением размеров до ~ 2,5. Это наблюдение может указывать на то, что соответствующая альтернативная структура не может быть сформирована с таким низким числом повторов.Самый длинный продукт амплификации (200 CAG • CTG) давал неоднородную картину, и поэтому было трудно точно определить полосы. Небольшие различия между соотношениями, описанными здесь, и соотношениями, описанными другими авторами, могут быть объяснены зависимостью подвижности от длины и природы последовательностей ДНК, фланкирующих триплетный повтор (Tam et al., 2003).

Таблица 1. Относительная подвижность CAG • CTG-содержащих продуктов ПЦР через нативные полиакриламидные гели.

Предполагая, что полоса быстрой подвижности представляет собой линейный дуплекс B-ДНК (Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1998), был проведен денситометрический анализ в попытке количественно оценить склонность различных размеров повторов к принятию альтернативной S-ДНК. (Рисунок 2D). Эти данные показали, что доля линейной дуплексной ДНК уменьшается с увеличением длины повтора, достигая плато около 50 повторяющихся единиц CAG • CTG. Нелинейный регрессионный анализ показал, что количество повторов в каждом фрагменте объясняет очень высокую долю вариации фракции не-B ДНК, обнаруженной в обеих агарозах ( r 2 = 0.99, p = 0,02) и нативные полиакриламидные гели ( r 2 = 0,85, p = 0,03). Это наблюдение подтверждает, что удлинение повторяющегося тракта увеличивает склонность к образованию структур S-ДНК, как описано в более ранних сообщениях (Pearson et al., 1998).

Подтверждение сворачивания S-ДНК в CAG • Последовательности CTG

Сходство между электрофоретическими профилями, наблюдаемыми при электрофорезе продуктов ПЦР в нативных полиакриламидных гелях, и предыдущими сообщениями о S-ДНК (Pearson and Sinden, 1996; Pearson et al., 1998) является убедительным свидетельством того, что структуры не-B-ДНК со скользящей цепью уже присутствовали в полученных продуктах ПЦР. Дополнительную экспериментальную поддержку получали путем плавления и повторного отжига ДНК, очищенной от отдельных полос, собранных из неденатурирующих полиакриламидных гелей. Отдельные полосы были выделены из двух продуктов ПЦР, содержащих 22 или 56 повторов CAG • CTG, поскольку они давали отдельные четкие отдельные полосы, легко очищаемые из геля (Фигуры 3A, B). Для каждого вида ДНК, полученного из одной полосы, был проведен анализ денатурации и повторного отжига с последующим проведением нативного PAGE.Все очищенные гелем виды ДНК мигрировали в виде отдельных полос (фиг. 3A, B, дорожки U), подтверждая их высокую стабильность на протяжении процедур элюирования и осаждения. Плавление ДНК в присутствии формамида привело к обнаружению двух полос ДНК с очень низкой подвижностью (фиг. 3A, B, дорожки F), которые соответствуют либо линейной одноцепочечной ДНК, либо агрегации ДНК, образующейся во время денатурации. Напротив, инкубация с бромидом этидия перед ПААГ не изменила характер миграции очищенных в геле видов ДНК (рис. 3С), подтверждая, что интеркалирующий химикат не может взаимно преобразовывать структурные изоформы ДНК.Полный набор аномально мигрирующих полос, наблюдаемых для исходного продукта ПЦР, был восстановлен после повторного отжига отдельных изолированных полос (Фигуры 3A, B, дорожки R). Наблюдение за тем, что протокол повторного отжига привел к образцу продуктов, который был очень похож на тот, который ранее наблюдался в исходных продуктах ПЦР, дополнительно подтвердил, что обнаруженные медленно мигрирующие виды ДНК соответствуют S-ДНК, образованной во время повторной гибридизации ДНК. пряди.

Рисунок 3.Генерация множества альтернативных структур ДНК после повторного отжига очищенного гелем CAG • Изомеры повторяющейся последовательности CTG . Продукты ПЦР, содержащие (A) 22 или (B) 56 CAG • Повторы CTG амплифицировали с олигонуклеотидными праймерами DM-A и DM-DR. ДНК экстрагировали из отдельных полос после нативного PAGE (полосы 1–4, черные стрелки) и повторно электрофорезировали (дорожки, отмеченные U, неденатурированные). Образцы дуплексной ДНК плавили при 100 ° C в присутствии 40% (об. / Об.) Формамида, обнаруживая полосы одноцепочечной ДНК с низкой подвижностью (дорожки, обозначенные F, формамид).В качестве альтернативы образцы ДНК денатурировали при 100 ° C, а затем повторно отжигали путем медленного снижения температуры в течение 3 часов (дорожки, помеченные R, повторный отжиг), получая сложную структуру полос, ранее наблюдаемую в исходном продукте ПЦР. (C) Инкубация изолированных видов ДНК с 500 нМ бромистого этидия перед повторным электрофорезом не изменила подвижность отдельных полос, экстрагированных из продуктов ПЦР с 56 повторами CAG • CTG. Показаны маркеры размера молекул в п.о. (M).

Создание альтернативных структур с помощью ПЦР-амплификации

Принимая во внимание нашу гипотезу о том, что дополнительные полосы, наблюдаемые при электрофорезе в агарозном геле и нативном PAGE, представляют конформации S-ДНК, принятые CAG • повторяющиеся структуры CTG, наши результаты показывают, что структуры, не относящиеся к B-ДНК, образуются в стандартных условиях цикла ПЦР (амплификация <30 циклы). Чтобы подтвердить, что ПЦР-амплификация достаточна для получения альтернативных структур ДНК, в качестве матрицы во второй реакции амплификации с теми же олигонуклеотидными праймерами использовали разведения очищенных гелем образцов ДНК, полученных из отдельных полос и несущих 22 повтора CAG • CTG.Образцы ДНК анализировали с помощью нативного PAGE до и после второго раунда амплификации ПЦР (рис. 4). Продукты, полученные в результате второй реакции амплификации, мигрировали в виде сложной структуры гетерогенных полос, демонстрируя электрофоретические профили, очень похожие на профили, обнаруженные в исходном продукте ПЦР, а также в соответствии с протоколом повторного отжига. Таким образом, амплификация образцов ДНК, полученных из локуса DM1 человека стандартными методами ПЦР, генерирует сложную смесь альтернативных конформаций ДНК, которые взаимно превращаются после протоколов денатурации и повторного отжига.

Рис. 4. Создание альтернативных структур ДНК с помощью ПЦР-амплификации . Образцы ДНК, содержащие 22 повторяющихся единицы CAG • CTG, элюировали из четырех полос (полосы 1–4, черные стрелки), вырезанных из нативного 8% (мас. / Об.) Полиакриламидного геля под УФ-светом, и использовали в качестве матриц для второй ПЦР. усиление. Каждый образец ДНК повторно подвергали электрофорезу до (дорожки, обозначенные Т, матрица) и после второй амплификации ПЦР (дорожки, обозначенные P, продукт ПЦР). В результате амплификации получился сложный узор полос, очень похожий на тот, который наблюдался в исходном продукте ПЦР (дорожка, обозначенная P0), из которого была извлечена матрица.Показаны маркеры размера молекул в п.о. (M).

Обсуждение

Молекулярный механизм (ы) мутации размера тринуклеотидного повтора, связанной с заболеваниями человека, вероятно, включает уникальные структурные свойства, связанные с последовательностями ДНК простых тринуклеотидных повторов. Формирование структур ДНК, таких как шпильки и спиральная ДНК, может влиять на нормальный метаболизм ДНК и приводить к необычной биологии, связанной с триплетными повторами (Mitas, 1997; Sinden et al., 2002; Mirkin, 2006).Мы разработали простой метод на основе агарозного геля для определения наличия альтернативных структур, отличных от B-ДНК, заимствованных двухцепочечными последовательностями ДНК, содержащими более пяти тринуклеотидных повторяющихся единиц CAG • CTG. Медленно мигрирующие виды ДНК, представляющие неортодоксальные конформации ДНК, принятые CAG • CTG-содержащими молекулами, легко обнаруживаются электрофорезом в агарозном геле в отсутствие бромистого этидия. В присутствии бромистого этидия одни и те же продукты разрушаются и мигрируют как единый вид ДНК.Важно отметить, что мы показали, что высокие уровни таких альтернативных структур образуются за счет небольшого количества циклов (<30) во время ПЦР-амплификации низких концентраций матричной ДНК, а также стандартной ПЦР-амплификации тысяч последовательностей геномной ДНК-матрицы. Поэтому настоятельно рекомендуется точный размер продуктов ПЦР, содержащих повторы CAG • CTG, с помощью электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Исключение бромистого этидия из гелей и рабочих буферов приводит к обнаружению дополнительных видов ДНК, которые могут быть неправильно классифицированы как мутантные аллели, что приводит к переоценке частот мутаций и / или неправильной диагностике пораженного статуса.

Пониженная подвижность дополнительных полос в геле, наблюдаемая в отсутствие бромистого этидия, согласуется с ожидаемой для ДНК, содержащей изгибы, введенные из трех- и четырехсторонних соединений, генерируемых петлевой цепью, характерной для структур ДНК со скользящей цепью ( Pearson et al., 1998). Бромид этидия внедряется в ДНК и способен раскручивать неповторяющиеся последовательности ДНК, дестабилизируя взаимодействия тонкого стэкинга (Brukner et al., 1997; Hayashi and Harada, 2007; Lipfert et al., 2010) и увеличивая их подвижность за счет агарозных гелей (Brukner et al., 1997). Следовательно, при добавлении к агарозному гелю и буферу для электрофореза бромид этидия, скорее всего, модифицирует миграцию структурных изоформ повторяющихся последовательностей CAG • CTG, расслабляя дуплекс и увеличивая гибкость изгиба. Интересно, что бромид этидия не изменяет подвижность структурных изоформ через нативные полиакриламидные гели, в которых нормальные триплетные повторы B-ДНК имеют тенденцию проявлять повышенную подвижность (Chastain et al., 1995; Честейн и Синден, 1998; Williams et al., 1999). Более высокое разрешение полиакриламидных гелей может объяснить большую сложность электрофоретических профилей и более высокие уровни не-B-ДНК, обнаруженных по сравнению с электрофорезом в агарозном геле. Похоже, что агарозные гели способны разделять только B-ДНК из гетерогенного подмножества видов, отличных от B-ДНК, тогда как полиакриламидные гели разрешают различные формы молекул, отличных от B-ДНК.

Для всех проанализированных продуктов повторной ПЦР CAG • CTG значительная часть продуктов мигрировала в нативные полиакриламидные гели в виде широкого распределения видов с подвижностью, эквивалентной более чем двукратному их фактическому размеру.Предыдущие анализы с помощью электронной микроскопии показали, что две дополнительные цепи с одинаковым количеством повторов, спаренных вне регистра, образуют гомодуплексные вторичные структуры S-ДНК в случайных местах по всему тракту повторов, вызывая медленную миграцию и гетерогенную популяцию продукты (Pearson et al., 1998; рисунок 5). Тем не менее, обнаружение различных структурных изомеров не привело к равномерно распределенному смазыванию продуктов: предпочтение было отдано определенным вариантам подвижности, которые наблюдались в виде дискретных полос, что указывает на то, что многие изомеры имеют почти идентичную электрофоретическую подвижность, как предполагалось ранее (Pearson and Sinden, 1996; Pearson и другие., 1998, 2002). Учитывая возможность проскальзывания ДНК-полимеразы и образования теневых полос во время ПЦР-амплификации последовательностей тринуклеотидных повторов (Wu et al., 1998; Hunter et al., 2005; Mulero et al., 2006; Olejniczak and Krzyzosiak, 2006; Blanco et al., al., 2008; Gibb et al., 2009), гетеродуплексные двухцепочечные продукты ДНК также могут образовываться. Следовательно, по крайней мере, некоторые виды ДНК, обнаруженные с помощью нативного PAGE, могут соответствовать структурам промежуточной ДНК со скользящей цепью (SI-ДНК), образованным повторным отжигом одноцепочечных тринуклеотидных последовательностей с различным числом повторов (рис. 5).

Рисунок 5. Альтернативные структуры ДНК. (A) Схематическое изображение гомодуплекса B-ДНК. (B) Модели возможных структурных изомеров S-ДНК, генерируемых денатурацией и повторным отжигом вне регистра комплементарных цепей тринуклеотидных повторов. Участки с петлей могут иметь переменный размер и / или количество, и они могут располагаться по всему повторяющемуся тракту. (C) Генерация вариантов повторов малого размера путем проскальзывания ДНК-полимеразы во время ПЦР (теневые полосы).Денатурация и повторный отжиг вне регистра генерируют гомо- и гетеродуплексные двухцепочечные структуры ДНК. Тонкие линии представляют уникальную последовательность, фланкирующую ДНК. Толстые цветные линии представляют собой комплементарные последовательности ДНК, расширенные CTG и CAG.

Интересно, что короткие длины повторов, которые не связаны с заболеванием (5 и 22 CAG • CTG повторяющиеся единицы), также обладают потенциалом генерировать стабильные альтернативные структуры in vitro . Таким образом, способность сворачиваться в конформации не-B-ДНК как таковая не отличает длинные нестабильные патогенные повторы от коротких стабильных повторов.Важно отметить, что более длинные связанные с заболеванием повторы демонстрируют, однако, более высокую склонность к образованию структур ДНК со скользящей цепью, что оценивается по проценту линейной B-ДНК, обнаруженной с помощью нативного PAGE. Более того, ранее предполагалось, что длинные повторяющиеся участки образуют альтернативные структуры с значительно более длительным сроком службы (Gacy et al., 1995). Долгоживущие стабильные вторичные структуры могут рассматриваться как субстраты для механизма увеличения размера повторов, который включает промежуточные звенья ДНК со скользящей цепью, которые распознаются и восстанавливаются путем репарации ошибочного спаривания ДНК (Gomes-Pereira and Monckton, 2006; López Castel et al., 2010; McMurray, 2010), тем самым объясняя, почему расширение происходит с большей частотой при длинных повторах, но не при коротких повторах. Распознавание несовпадений опосредуется изгибом ДНК (Wang et al., 2003; Sass et al., 2010; Hura et al., 2013). Таким образом, можно ожидать, что соединения, такие как бромид этидия, которые интеркалируют в ДНК и изменяют свойства изгиба, изменят распознавание ошибочного спаривания и динамику тринуклеотидных повторов. Стабилизация расширенных повторов CAG • CTG в системе культуры клеток мыши с нестабильной ДНК с помощью бромистого этидия (Gomes-Pereira and Monckton, 2004) может быть, по крайней мере частично, следствием воздействия интеркалирующего химического вещества на структурную структуру ДНК. биология.Более глубокое понимание структур ДНК триплетных повторов и молекулярных механизмов расширения триплетных повторов может облегчить разработку новых путей терапии, основанных на изменении динамики ДНК.

Описанный здесь анализ открывает новые возможности для изучения альтернативных структур ДНК, заимствованных последовательностями тринуклеотидных повторов in vivo . Электрофорез в агарозном геле расщепленного геномного CAG • CTG-содержащая ДНК в отсутствие бромистого этидия может выявить не-B-ДНК структуры, сформированные in vivo при детекции с помощью саузерн-блот-гибридизации.Действительно, возможно, что присутствие / отсутствие бромида этидия в агарозных гелях может влиять на электрофоретическую миграцию и мазки, обнаруживаемые в настоящее время при диагностической гибридизации геномной ДНК по Саузерну. В соответствии с этой гипотезой, уникальное взаимодействие между бромидом этидия, последовательностями геномных тринуклеотидных повторов и их электрофоретической подвижностью было зарегистрировано для CGG • Расширения повторов CCG: бромид этидия снижает подвижность фрагментов геномной ДНК, происходящих из локуса синдрома ломкой Х (Cummins, 1997; Нолин и др., 2008). Противоположный эффект интеркалирующего красителя на подвижность геномных CGG • ДНК CCG и продуктов CAG • CTG, генерируемых ПЦР, остается невыясненным. Это может зависеть от нуклеотидной последовательности самого повтора, различных типов структур, отличных от B-ДНК, принятых CGG • CCG или CAG • CTG-повторов, их химического взаимодействия с бромидом этидия или структурных изменений, специфически вносимых при амплификации ПЦР. Следуя этим результатам, и во избежание возможности неправильного определения размера расширенных аллелей, необходимо тщательно рассмотреть вопрос о включении бромистого этидия в диагностические и исследовательские процедуры.Хотя предлагается исключить бромистый этидий из анализа хрупкой X-Саузерна (Cummins, 1997; Nolin et al., 2008), мы предлагаем включать бромид этидия в геле и рабочем буфере.

Авторские взносы

МГ-П: экспериментальная работа, сбор данных и подготовка рисунков. MG-P и DGM: дизайн / интерпретация исследования, анализ данных и подготовка рукописи.

Финансирование

Мы хотели бы поблагодарить Институт профилактической медицины Листера, Великобритания; Wellcome Trust, Великобритания (номер гранта: 057180) и Fundação para a Ciência e Tecnologia и Fundação Calouste Gulbenkian, Португалия (номер стипендии: Praxis XXI / BD / 18593/98) за финансовую поддержку.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарны Группе динамических мутаций и Маршаллу Старку из Университета Глазго за полезные обсуждения в ходе этой работы.

Список литературы

Аксфорд, М. М., Ван, Ю. Х., Накамори, М., Заннис-Хаджопулос, М., Торнтон, К. А., и Пирсон, К. Э. (2013). Обнаружение проскальзывающих ДНК в тринуклеотидных повторах локуса болезни миотонической дистрофии I типа в тканях пациента. PLoS Genet. 9: e1003866.DOI: 10.1371 / journal.pgen.1003866

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Балди П., Брунак С., Шовен Ю. и Педерсен А. Г. (1999). Структурная основа триплетных повторяющихся расстройств: вычислительный анализ. Биоинформатика 15, 918–929. DOI: 10.1093 / биоинформатика / 15.11.918

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бланко, С., Суарес, А., Гандиа-Пла, С., Гомес-Льоренте, К., Антунес, А., Гомес-Капилья, Х.A., et al. (2008). Использование капиллярного электрофореза для точного определения CAG-повторов, вызывающих болезнь Хантингтона. Дизайн олигонуклеотидов без теневых полос. Сканд. J. Clin. Лаборатория. Инвестировать. 68, 577–584. DOI: 10.1080 / 00365510801

1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ботта А., Росси Г., Маркаурелио М., Фонтана Л., Д’Апис М. Р., Бранкати Ф. и др. (2017). Идентификация и характеристика 5′-прерываний CCG в комплексе DMPK расширенных аллелей. Eur. J. Hum. Genet. 25, 257–261. DOI: 10.1038 / ejhg.2016.148

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брайда, К., Стефанатос, Р. К., Адам, Б., Махаджан, Н., Смитс, Х. Дж., Ниль, Ф. и др. (2010). Вариант CCG и повторы GGC в пределах CTG резко изменяют динамику мутаций и, вероятно, вносят вклад в необычные симптомы у некоторых пациентов с миотонической дистрофией 1 типа. Hum. Мол. Genet. 19, 1399–1412. DOI: 10.1093 / hmg / ddq015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брук, Дж.D., McCurrach, M.E., Harley, H.G., Buckler, A.J., Church, D., Aburatani, H., et al. (1992). Молекулярная основа миотонической дистрофии: экспансия тринуклеотидного (CTG) повтора на 3′-конце транскрипта, кодирующего член семейства протеинкиназ. Cell 68, 799–808. DOI: 10.1016 / 0092-8674 (92) -5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Честейн, П. Д. II, Эйхлер, Э. Э., Канг, С., Нельсон, Д. Л., Левен, С. Д., и Синден, Р. Р. (1995). Аномальная быстрая электрофоретическая подвижность ДНК, содержащей триплетные повторы, связанные с генами болезней человека. Биохимия 34, 16125–16131. DOI: 10.1021 / bi00049a027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чонг, С. С., МакКолл, А. Э., Кота, Дж., Субрамони, С. Х., Орр, Х. Т., Хьюз, М. Р. и др. (1995). Гаметическая и соматическая тканеспецифическая гетерогенность расширенного SCA1 CAG-повтора при спиноцеребеллярной атаксии 1 типа. Nat. Genet. 10, 344–350. DOI: 10.1038 / ng0795-344

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чоудри, С., Мукерджи, М., Шривастава, А. К., Джайн, С., и Брахмачари, С. К. (2001). Нестабильность CAG-повторов в локусе SCA2: закрепление прерываний CAA и связанных однонуклеотидных полиморфизмов. Hum. Мол. Genet. 10, 2437–2446. DOI: 10.1093 / hmg / 10.21.2437

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чанг, М. Ю., Ранум, Л. П., Дювик, Л. А., Сервадио, А., Зогби, Х. Ю. и Орр, Х. Т. (1993). Доказательства механизма, предрасполагающего к нестабильности CAG-повторов из поколения в поколение при спиноцеребеллярной атаксии I типа. Nat. Genet. 5, 254–258. DOI: 10.1038 / ng1193-254

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Камминс, Дж. Х. (1997). Уникальное изменение электрофоретической подвижности фрагментов, расширенных хрупкой X, в присутствии бромистого этидия. Тех. Советы онлайн 2, 84–86. DOI: 10,1016 / s1366-2120 (08) 70044-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Du, J., Aleff, R.A., Soragni, E., Kalari, K., Nie, J., Tang, X., et al.(2015). Токсичность РНК и ошибочное совпадение при общем заболевании глаз — эндотелиальной дистрофии роговицы. J. Biol. Chem. 290, 5979–5990. DOI: 10.1074 / jbc.m114.621607

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фойри, Л., Донг, Л., Савуре, К., Юбер, Л., те Риле, Х., Жуниен, К. и др. (2006). Msh4 является лимитирующим фактором в формировании разрастаний CTG между поколениями у трансгенных мышей DM1. Hum. Genet. 119, 520–526. DOI: 10.1007 / s00439-006-0164-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гейси, А.М., Гёлльнер, Г., Юранич, Н., Макура, С., и МакМюррей, К. Т. (1995). Тринуклеотидные повторы, которые увеличиваются при заболевании человека, образуют шпильки in vitro . Ячейка 81, 533–540. DOI: 10.1016 / 0092-8674 (95)

-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гао, Р., Мацуура, Т., Кулбо, М., Цюльке, К., Накамура, К., Расмуссен, А., и др. (2008). Нестабильность расширенных повторов CAG / CAA при спиноцеребеллярной атаксии 17 типа. Eur.J. Hum. Genet. 16, 215–222. DOI: 10.1038 / sj.ejhg.5201954

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гибб А. Дж., Хуэлл А. Л., Симмонс М. К. и Браун Р. М. (2009). Характеристика переднего заикания в ПЦР AmpFlSTR ® SGM Plus ® . Sci. Правосудие 49, 24–31. DOI: 10.1016 / j.scijus.2008.05.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гомеш-Перейра, М., Форчун, М. Т., Ингрэм, Л., МакЭбни, Дж. П., и Монктон, Д. Г. (2004). Pms2 является генетическим энхансером тринуклеотидного CAG • Соматический мозаицизм CTG-повторов: влияние на механизм экспансии триплетных повторов. Hum. Мол. Genet. 13, 1815–1825. DOI: 10,1093 / hmg / ddh286

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гомеш-Перейра, М., и Монктон, Д. Г. (2004). Химически индуцированное увеличение и уменьшение скорости расширения триплетного повтора CAG • CTG. Nucleic Acids Res. 32, 2865–2872. DOI: 10.1093 / nar / gkh612

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гомеш-Перейра, М., и Монктон, Д. Г. (2006). Химические модификаторы нестабильных расширенных простых последовательностей повторяются: что идет вверх, могло упасть. Mutat. Res. 598, 15–34. DOI: 10.1016 / j.mrfmmm.2006.01.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гурдон, Г., Радвани, Ф., Лия, А. С., Дурос, К., Бланш, М., Абитбол, М., и другие. (1997). Умеренная межпоколенческая и соматическая нестабильность повтора 55-CTG у трансгенных мышей. Nat. Genet. 15, 190–192. DOI: 10.1038 / ng0297-190

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Guo, J., Gu, L., Leffak, M., and Li, G.-M. (2016). MutSβ способствует размножению тринуклеотидных повторов путем привлечения ДНК-полимеразы β к зарождающимся (CAG) n или (CTG) n шпилькам для подверженного ошибкам синтеза ДНК. Cell Res. 26, 775–786.DOI: 10.1038 / cr.2016.66

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаяси, М., Харада, Ю. (2007). Прямое наблюдение обратимого раскручивания одиночной молекулы ДНК, вызванного интеркалированием бромистого этидия. Nucleic Acids Res. 35: e125. DOI: 10.1093 / nar / gkm529

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хантер, Дж. М., Кроуз, А. Б., Лесорт, М., Джонсон, Г. В., и Детлофф, П. Дж. (2005). Проверка расширения соматических CAG-повторов фракционированием до ПЦР. J. Neurosci. Методы 144, 11–17. DOI: 10.1016 / j.jneumeth.2004.10.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хура, Г. Л., Цай, К.-Л., Кларидж, С. А., Мендилло, М. Л., Смит, Дж. М., Уильямс, Г. Дж. И др. (2013). Конформации ДНК при репарации ошибочного спаривания исследуются в растворе с помощью рассеяния рентгеновских лучей на нанокристаллах золота. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 110, 17308–17313. DOI: 10.1073 / pnas.1308595110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кеннеди, Л., Эванс, Э., Чен, К. М., Крейвен, Л., Детлофф, П. Дж., Эннис, М. и др. (2003). Резкое увеличение длины тканеспецифичных мутаций является ранним молекулярным событием в патогенезе болезни Хантингтона. Hum. Мол. Genet. 12, 3359–3367. DOI: 10.1093 / hmg / ddg352

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Липферт, Дж., Клинхаут, С., и Деккер, Н. Х. (2010). Измерение торсионного связывания малых молекул с помощью магнитного пинцета. Nucleic Acids Res. 38, 7122–7132.DOI: 10.1093 / nar / gkq598

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю Г., Чен X., Бисслер Дж. Дж., Синден Р. Р. и Леффак М. (2010). Репликационно-зависимая нестабильность шпилек (CTG) • (CAG) повторов в клетках человека. Nat. Chem. Биол. 6, 652–659. DOI: 10.1038 / nchembio.416

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лопес Кастель, А., Клири, Дж. Д., и Пирсон, К. Э. (2010). Повторяющаяся нестабильность как основа болезней человека и потенциальная цель терапии. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 165–170. DOI: 10.1038 / nrm2854

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Манкоди А., Логиджиан Э., Каллахан Л., Макклейн К., Уайт Р., Хендерсон Д. и др. (2000). Миотоническая дистрофия у трансгенных мышей, экспрессирующих увеличенный повтор CUG. Наука 289, 1769–1773. DOI: 10.1126 / science.289.5485.1769

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мэнли, К., Ширли, Т.Л., Флаэрти, Л., и Мессер, А. (1999). Дефицит Msh3 предотвращает соматическую нестабильность in vivo CAG-повтора у трансгенных мышей с болезнью Хантингтона. Nat. Genet. 23, 471–473. DOI: 10.1038 / 70598

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МакМюррей, К. Т. (1999). Вторичная структура ДНК: общий и причинный фактор распространения болезней человека. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 96, 1823–1825. DOI: 10.1073 / pnas.96.5.1823

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Монктон, Д.Г., Кулбоу, М. И., Ашизава, К. Т., Сицилиано, М. Дж., И Каски, К. Т. (1997). CTG-повторы гипермутируемой миотонической дистрофии у трансгенных мышей. Nat. Genet. 15, 193–196. DOI: 10.1038 / ng0297-193

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Монктон, Д. Г., Вонг, Л. Дж., Ашизава, Т., и Каски, К. Т. (1995). Соматический мозаицизм, расширение зародышевой линии, реверсия зародышевой линии и сокращение между поколениями у мужчин с миотонической дистрофией: анализ ПЦР небольшого пула. Hum. Мол. Genet. 4, 1–8. DOI: 10.1093 / hmg / 4.1.1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моралес, Ф., Коуту, Дж. М., Хайэм, К. Ф., Хогг, Г., Куэнка, П., Брейда, К. и др. (2012). Соматическая нестабильность расширенного триплетного повтора CTG при миотонической дистрофии 1 типа является наследственным количественным признаком и модификатором тяжести заболевания. Hum. Мол. Genet. 21, 3558–3567. DOI: 10.1093 / hmg / dds185

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моралес, Ф., Васкес, М., Сантамария, К., Куэнка, П., Корралес, Э., и Монктон, Д. Г. (2016). Полиморфизм гена репарации ошибочного спаривания MSh4 связан с уровнями соматической нестабильности расширенного повтора CTG в ДНК крови пациентов с миотонической дистрофией 1 типа. Ремонт ДНК 40, 57–66. DOI: 10.1016 / j.dnarep.2016.01.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мулеро, Дж. Дж., Чанг, К. У., и Хеннесси, Л. К. (2006). Характеристика продукта заикания N + 3 в локусе тринуклеотидного повтора DYS392. J. Forensic Sci. 51, 1069–1073. DOI: 10.1111 / j.1556-4029.2006.00227.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мусова, З., Мазанец, Р., Крепелова, А., Элер, Э., Валес, Дж., Яклова, Р. и др. (2009). Очень нестабильные прерывания последовательности CTG-повтора в гене миотонической дистрофии. Am. J. Med. Genet. А 149А, 1365–1374. DOI: 10.1002 / ajmg.a.32987

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нолин, С.Л., Дин, X. Х., Хаук, Г. Э., Браун, В. Т., и Добкин, К. (2008). Аллели с полной мутацией ломкой Х-хромосомы, состоящие из нескольких аллелей: влияние на распространение CGG-повторов. Am. J. Med. Genet. А 146А, 60–65. DOI: 10.1002 / ajmg.a.32087

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Олейничак М. и Кшизосяк В. Дж. (2006). Генотипирование простых повторов последовательности — пересмотр факторов, участвующих в генерации теневых полос. Электрофорез 27, 3724–3734.DOI: 10.1002 / elps.200600136

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пирсон, К. Э., Эвел, А., Ачарья, С., Фишел, Р. А., и Синден, Р. Р. (1997). Человеческий MSh3 связывается со структурами ДНК с тринуклеотидными повторами, связанными с нейродегенеративными заболеваниями. Hum. Мол. Genet. 6, 1117–1123. DOI: 10.1093 / hmg / 6.7.1117

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пирсон К. Э. и Синден Р. Р. (1996). Альтернативные структуры в дуплексной ДНК, образованные внутри тринуклеотидных повторов миотонической дистрофии и ломких Х-локусов. Биохимия 35, 5041–5053. DOI: 10.1021 / bi9601013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пирсон, К. Э., Там, М., Ван, Й.-Х., Монтгомери, С. Е., Дар, А. С., Клири, Дж. Д. и др. (2002). ДНК со скользящей цепью, образованной длинными (CAG) • (CTG) повторами: выскальзывающие повторы и скользящие соединения. Nucleic Acids Res. 30, 4534–4547. DOI: 10.1093 / nar / gkf572

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пирсон, К.Э., Ван, Ю. Х., Гриффит, Дж. Д., и Синден, Р. Р. (1998). Структурный анализ ДНК со скользящей цепью (S-ДНК), образованной в (CTG) n. (CAG) n повторы из локуса миотонической дистрофии. Nucleic Acids Res. 26, 816–823. DOI: 10.1093 / nar / 26.3.816

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пинто, Р. М., Драгилева, Э., Кирби, А., Ллорет, А., Лопес, Э., Сент-Клер, Дж. И др. (2013). Гены репарации несоответствия Mlh2 и Mlh4 модифицируют нестабильность CAG у мышей с болезнью Хантингтона: общегеномный подход и подходы-кандидаты. PLoS Genet. 9: e1003930. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1003930

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сасс, Л. Э., Ланьи, К., Венингер, К., и Эри, Д. А. (2010). Одномолекулярный FRET TACKLE выявляет очень динамичные несовпадающие комплексы ДНК-MutS. Биохимия 49, 3174–3190. DOI: 10.1021 / bi1u

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Savouret, C., Garcia-Cordier, C., Megret, J., te Riele, H., Жуниен, К., и Гурдон, Г. (2004). MSh3-зависимые герминальные экспансии CTG-повторов непрерывно продуцируются в сперматогониях трансгенных мышей DM1. Mol. Клетка. Биол. 24, 629–637. DOI: 10.1128 / mcb.24.2.629-637.2004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сериола, А., Спитс, К., Симард, Дж. П., Хилвен, П., Хентдженс, П., Пирсон, К. Э. и др. (2011). ЧЭСК Хантингтона и миотонической дистрофии: подавляющая регуляция нестабильности тринуклеотидных повторов и экспрессия механизма восстановления несоответствия при дифференцировке. Hum. Мол. Genet. 20, 176–185. DOI: 10.1093 / hmg / ddq456

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Seznec, H., Lia-Baldini, A. S., Duros, C., Fouquet, C., Lacroix, C., Hofmann-Radvanyi, H., et al. (2000). Трансгенные мыши, несущие большие геномные последовательности человека с расширенными повторами CTG, очень похожи на DM CTG-повторы, межпоколенческую и соматическую нестабильность. Hum. Мол. Genet. 9, 1185–1194. DOI: 10.1093 / hmg / 9.8.1185

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сикот, Г., и Гомеш-Перейра, М. (2013). Токсичность РНК в моделях болезней человека и животных: от открытия нового механизма до разработки многообещающих методов лечения. Biochim. Биофиз. Acta 1832, 1390–1409. DOI: 10.1016 / j.bbadis.2013.03.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сикот, Г., Гурдон, Г., и Гомеш-Перейра, М. (2011). Миотоническая дистрофия, когда простые повторы выявляют сложные патогенные образования: новые открытия и будущие проблемы. Hum.Мол. Genet. 20, R116 – R123. DOI: 10.1093 / hmg / ddr343

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Синден Р. Р., Потаман В. Н., Уссачева Э. А., Пирсон К. Э., Любченко Ю. Л. и Шляхтенко Л. С. (2002). Структуры ДНК с триплетными повторами и генетические заболевания человека: динамические мутации из динамической ДНК. J. Biosci. 27, 53–65. DOI: 10.1007 / bf02703683

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Свами, М., Hendricks, A. E., Gillis, T., Massood, T., Mysore, J., Myers, R.H., et al. (2009). Соматическое распространение CAG-повтора болезни Хантингтона в головном мозге связано с более ранним возрастом начала заболевания. Hum. Мол. Genet. 18, 3039–3047. DOI: 10.1093 / hmg / ddp242

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Там, М., Эрин Монтгомери, С., Кекис, М., Дэвид Столлар, Б., Прайс, Г. Б., и Пирсон, К. Э. (2003). Скользящие (CTG) • (CAG) повторы локуса миотонической дистрофии: зондирование поверхности антителами против ДНК. J. Mol. Биол. 332, 585–600. DOI: 10.1016 / s0022-2836 (03) 00880-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Tomé, S., Holt, I., Edelmann, W., Morris, G.E., Munnich, A., Pearson, C.E., et al. (2009). Мутация домена АТФазы MSh3 влияет на CTG • Нестабильность повтора CAG у трансгенных мышей. PLoS Genet. 5: e1000482. DOI: 10.1371 / journal.pgen.1000482

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Томе, С., Симард, Дж. П., Слин, М. М., Холт, И., Моррис, Г. Э., Войцехович, К. и др. (2013). Экспрессия тканеспецифического белка репарации ошибочного спаривания: MSh4 выше, чем MSH6 во многих тканях мыши. Ремонт ДНК 12, 46–52. DOI: 10.1016 / j.dnarep.2012.10.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Усдин, К., Хаус, Н. К., Фройденрайх, К. Х. (2015). Повторяющаяся нестабильность во время репарации ДНК: выводы из модельных систем. Crit. Rev. Biochem. Мол.Биол. 50, 142–167. DOI: 10.3109 / 10409238.2014.999192

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

van Den Broek, W. J., Nelen, M. R., Wansink, D. G., Coerwinkel, M. M., te Riele, H., Groenen, P. J., et al. (2002). Поведение соматической экспансии (CTG) (n) повтора у мышей с нокаутом миотонической дистрофии по-разному зависит от белков восстановления несоответствия Msh4 и Msh6. Hum. Мол. Genet. 11, 191–198. DOI: 10.1093 / hmg / 11.2.191

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Х., Янг, Ю., Скофилд, М. Дж., Ду, К., Фридман, Ю., Ли, С. Д. и др. (2003). Изгибание и разгибание ДНК под действием MutS регулируют распознавание и специфичность несоответствия. Proc. Natl. Акад. Sci. U S A 100, 14822–14827. DOI: 10.1073 / pnas.2433654100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уэллс, Р. Д., Дере, Р., Хеберт, М. Л., Напьерала, М., и Сон, Л. С. (2005). Развитие механизмов генетической нестабильности, связанных с наследственными неврологическими заболеваниями. Nucleic Acids Res. 33, 3785–3798. DOI: 10.1093 / nar / gki697

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уиллер В. К., Лебель Л. А., Врбанак В., Тид А., Те Риле Х. и Макдональд М. Э. (2003). Ген репарации несоответствия Msh3 изменяет время раннего заболевания полосатого тела Hdh (Q111). Hum. Мол. Genet. 12, 273–281. DOI: 10.1093 / hmg / 12.3.273

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уильямс, Л. К., Хегде, М. Р., Эррера, Г., Стэплтон, П. М., и Лав, Д. Р. (1999). Сравнительный полуавтоматический анализ (CAG) повторов в гене болезни Хантингтона: использование внутренних стандартов. Mol. Клетка. Зонды 13, 283–289. DOI: 10.1006 / mcpr.1999.0248

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ву Х., Чжан С. и Сяо К. (1998). Теневые полосы при ПЦР-амплификации тринуклеотидных повторов и их устранение. Чжунхуа И Сюэ И Чуань Сюэ За Чжи 15, 42–45.

PubMed Аннотация | Google Scholar

факторов, влияющих на предел количественного определения электрофореза сывороточного белка

Предпосылки

Электрофорез сывороточного белка (SPEP) используется для количественной оценки моноклонального компонента сыворотки или М-белка, для диагностики и мониторинга моноклональных гаммопатий.Значительная неточность и неточность создают проблемы при описании малых М-белков. Используя терапевтическую сыворотку с добавлением моноклональных антител и объединенный бета-мигрирующий М-белок, мы стремились оценить ограничения и вариабельность SPEP в 16 лабораториях на трех континентах.

Методы

Сыворотки с нормальной, гипо- или гипергаммаглобулинемией были дополнены даратумумабом, Дара (катодная миграция) или элотузумабом, Эло (мигрирующая центральная гамма) с концентрациями от 0,125 до 10 г / л (n = 62) вместе с с бета-мигрирующей выборкой (n = 9).Получив общий белок (обратный биурет, Siemens), лаборатории вслепую проанализировали образцы в соответствии со своими стандартными рабочими процедурами SPEP и иммунофиксации (IFE) или иммуносубтракции (ISUB). Шестнадцать лабораторий сообщили о методе перпендикулярной капли (PD) для выделения М-белка, в то время как 10 использовали метод тангенциальной фильтрации (TS). Средний процент извлечения 80–120% был установлен как приемлемый. Рассчитан межлабораторный% CV.

Результаты

Фон гамма-глобулина, характер миграции и концентрация — все это влияет на точность и точность количественного определения М-белков с помощью SPEP.По мере увеличения фона неточность увеличивается, а точность снижается, что приводит к завышению количественной оценки М-белка, что особенно заметно в образцах с гипергаммой и более заметно при PD. Катодно мигрирующие М-белки были связаны с меньшей неточностью и более высокой точностью по сравнению с М-белками, мигрирующими по центральной гамма-области, что объясняется повышенным вкладом гамма-фона в М-белки, мигрирующие в середине гамма-фракции. При более низких концентрациях М-белка наблюдается большая неточность и потеря точности.

Выводы

Это исследование предполагает, что количественное определение чрезвычайно низких концентраций М-белков, хотя и возможно, не может обеспечить адекватную точность между лабораториями.

Введение

Основанные на секреции моноклонального иммуноглобулина (М-белка), пролиферативные нарушения плазматических клеток классифицируются как моноклональные гаммопатии и включают множественную миелому (ММ), макроглобулинемию Вальденстрема (WM), амилоидоз (AL), отложение легких цепей. болезнь (LCDD), синдром POEMS и предраковые заболевания, такие как моноклональная гаммопатия неопределенного значения (MGUS) и тлеющая множественная миелома (SMM).Из-за широкого спектра проявлений заболевания идентификация М-белка с помощью электрофореза белков сыворотки (SPEP) может быть первым ключом к диагностике моноклональной гаммопатии с последующим изотипированием с помощью иммунофиксации (IFE) или иммуносубтракции (ISUB). SPEP и IFE / ISUB являются незаменимыми клиническими тестами для диагностики, стратификации риска и терапевтического мониторинга моноклональных гаммопатий [1], [2], [3].

В нормальной сыворотке SPEP дает широкую гамма-фракцию с гауссовым распределением из-за миллионов клонов плазматических клеток, которые секретируют иммуноглобулины в сыворотку.При моноклональных гаммопатиях М-белки визуализируются как ограниченная область миграции в электрофоретическом паттерне, которая может быть определена и определена количественно [4]. Миграция М-белков довольно неоднородна; в когорте из 1027 пациентов с ММ миграция М-белков была распределена в следующем порядке: 54% М-белков находились в гамма-фракции, 12% в бета-гамма-мостике, 13% в бета-фракции и 1 % во фракции альфа-2, добавляя до 80%, в то время как 2% случаев были биклональными, 8% гипогаммаглобулинемическими и 11% были нормальными при анализе электрофореза белков сыворотки и мочи [5].Панель анализов, сочетающих SPEP с IFE / ISUB, свободные легкие цепи сыворотки (FLC), электрофорез мочи и IFE / ISUB, имеет наивысшую степень клинической чувствительности для диагностики этих нарушений [6].

После постановки диагноза моноклональной гаммопатии пациенты будут находиться под наблюдением до конца их жизни с использованием либо визуализационных исследований, биопсии костного мозга и, скорее всего, повторных измерений сыворотки, либо анализа мочи, который выявил заболевание. Ответ на терапию с течением времени связан с уменьшением размера М-белка.Низкая аналитическая точность SPEP хорошо известна при измерении низких концентраций М-белков (<10 г / л). Каждая лаборатория решает, можно ли сообщать о таких низких концентрациях М-белков количественно или качественно. Затем за тестированием SPEP часто следует IFE / ISUB [2], [7], [8], [9]. Пациенты могут получать терапию в разных учреждениях в течение болезни, а образцы сыворотки пациента могут быть отправлены в разные лаборатории с различными методами анализа и методами гейтинга.Неточное количественное определение малых М-белков может повлиять на тенденцию или классификацию критериев ответа.

SPEP можно проводить с использованием агарозного геля (AGE) или капиллярного электрофореза (CZE). Количественное определение М-белка достигается путем интеграции пика М-белка в электрофореграмму. В настоящее время используются два метода: перпендикулярное падение (PD) и тангенциальный сбор (TS) (рис. 1A). Количественное определение с помощью PD опосредуется размещением вертикальных ворот на анодном и катодном пределе М-белка, интегрируя общую площадь под кривой.Поскольку измерение ЧР включает поликлональное основание, рекомендуется не проводить измерения, когда пик составляет <1/4 от основания [10]. Признавая это ограничение в методе частичного разряда, лаборатории приняли стратегии для ограничения неточности измерений, выполняя измерения только тогда, когда пик составлял не менее одной четверти общего фона гамма-фракции. TS проводит линию, соединяющую анодную и катодную точки отклонения М-белка, где пик М-белка встречается с поликлональным фоном, и объединяет только треугольную область над линией, за исключением лежащих в основе поликлональных иммуноглобулинов.Schild et al. сообщали о точности по проценту восстановления (измеренному по отклонению 25% от известного абсолютного значения) с PD как 15 г / л и 1,5 г / л с TS с использованием 50 случаев и серийных разведений сывороток [11]. Опрос клинических лабораторий в 38 странах в 2018 году показал, что 521 из 674 из них используют PD (77%), а 61 из 674 (9%) применяют TS для рутинного количественного определения моноклональных белков. Другие респонденты использовали другие негелевые методы для количественного определения М-белка, такие как количественное определение иммуноглобулинов или сывороточный FLC [12].

Рисунок 1:

Типичные электрофорезы электрофореза белков сыворотки.

(A) Показаны методы перпендикулярного падения и тангенциального скимминга для количественного определения моноклонального белка, мигрирующего в гамма-фракции. (B) Характер миграции и различные фоны гамма-фракции могут повлиять на возможность точного количественного определения М-белка. Концентрации 10 г / л и 2,0 г / л показаны для иллюстрации влияния поликлонального фона на количественный анализ. Дара (даратумумаб) иллюстрирует М-белок, который мигрирует в конце гамма-фракции, ближе к катоду, в то время как Эло (элотузумаб) иллюстрирует М-белок, который мигрирует в центре гамма-фракции.Примерно одна треть моноклональных IgA мигрирует в бета-фракции. Показано, что концентрации 10 г / л и 5 г / л иллюстрируют влияние совместно мигрирующих белков на фон, влияющее на количественное определение в бета-фракции. Показанные электрофореграммы были получены с использованием AGE на системе Helena.

Хотя SPEP и IFE / ISUB являются универсально используемыми клиническими анализами, отсутствует стандартизация со значительными различиями между лабораториями в их практике отчетности.Фактически, существует ограниченное руководство и рекомендации для сообщения о моноклональных гаммопатиях с помощью SPEP и IFE / ISUB, в частности, предел количественного определения (LOQ) для этих анализов, когда M-белок слишком мал для точного количественного определения. И SPEP, и IFE / ISUB уже несколько десятилетий доступны в клинических лабораториях. В последнее время нормативная среда для валидации тестов стала более жесткой. Официальные исследования для документирования LOQ и предела обнаружения (LOD) этих анализов могли быть недоступны.Кроме того, хотя Международная рабочая группа по миеломе (IMWG) дала конкретные рекомендации по обнаружению, мониторингу и последующему наблюдению за моноклональными белками, она не дала рекомендаций в отношении аналитических методологий [13], [14].

Гетерогенность М-белка и количество фона в гамма-фракции SPEP являются дополнительными факторами, способствующими отсутствию универсального LOQ. При меньшем уровне фона, таком как тот, который наблюдается в образцах с гипогаммаглобулинемией, М-белок будет легче идентифицировать.Напротив, если имеется высокий фон, наблюдаемый при гипергаммаглобулинемии, М-белок может быть ни видимым, ни количественно определяемым, даже если он присутствует в относительно больших концентрациях (рис. 1B). Здесь мы представляем исследование, которое было предпринято для более четкого определения вариабельности количественной оценки М-белков. Это исследование сравнивает SPEP и качественное изотипирование — каждым из IFE / ISUB — а также сравнивает разные лаборатории, каждая из которых использует свои соответствующие методологии. Сюда входят М-белки с разными концентрациями, разными фонами гамма-фракций и разными моделями миграции.Кроме того, были охарактеризованы LOQ для анализа M-белка с помощью SPEP и LOD для SPEP и IFE / ISUB для конкретных методологий в попытке упорядочить руководящие принципы отчетности между учреждениями и обеспечить гармонизацию анализов между лабораториями, инициатива, поддерживаемая Международной федерацией Клиническая химия и управляется подгруппой по гармонизации отчетов по электрофорезу белков и количественному определению малых белков.

Материалы и методы

Материалы и образцы

Пулы проб большого объема с М-белками в различных фоновых гамма-фракциях были подготовлены в количестве, достаточном для совместного использования в 16 различных учреждениях (дополнительная таблица 1).Вкратце, образцы, содержащие гамма-мигрирующие М-белки, получали путем добавления известных количеств терапевтических моноклональных антител (mAb), даратумумаба (Dara) (Darzalex, Janssen Pharmaceutical) или элотузумаба (Elo) (Empliciti, Bristol-Myers Squibb) в объединенные сыворотки. Пулы были подготовлены опытным технологом в соответствии со стандартными процедурами подготовки, и после пилотного исследования (данные не показаны) повышенные концентрации считались истинной ценностью М-белка для целей этого исследования.Подобные исследования с Dara и Elo проводились в сывороточном матриксе в прошлом с приемлемым восстановлением [15]. Оба изотипа IgGκ, Dara и Elo, представляют M-белки в гамма-фракции с различными паттернами миграции, поскольку Dara мигрирует в верхней части гамма-фракции (катодно), тогда как Elo мигрирует в центре гамма-фракции при гель-электрофорезе. и на анодном конце гамма-области по CZE. Важно отметить, что концентрации Дара и Эло, использованные в этом исследовании, были выбраны так, чтобы представлять небольшие моноклональные белки, постоянно наблюдаемые в клинической лаборатории.

Фармацевтические препараты Дара и Эло приобретены в аптеке Mayo Clinic. Стерильные, запечатанные флаконы Dara были представлены в растворе 20 мг / мл. Раствор разбавляли 1: 2 гипо-, нормальной или гипергамма-сывороткой с получением препарата сыворотки с добавлением Дара 10 мг / мл (10 г / л). Elo был предоставлен в виде лиофилизированного порошка в стерильном запечатанном флаконе. Порошок восстанавливали 2 мл воды для реагентов до конечной концентрации 150 мг / мл. Раствор разбавляли 1:15 гипо-, нормальной или гипергамма-сывороткой с получением препарата сыворотки с добавлением Эло 10 мг / мл (10 г / л).Важно отметить, что каждая протестированная концентрация в диапазоне от 0,125 г / л до 10 г / л была индивидуально приготовлена ​​из раствора Дара 20 мг / мл или раствора Эло 150 мг / мл в каждом из бассейнов. На протяжении всего периода приготовления стандарта серийные разведения не проводились. Фармакопея США и руководящие принципы Международной конференции по гармонизации (ICH), которым во всем мире следуют фармацевтические отрасли, рекомендуют пороговые значения для сообщения о примеси деградации (0,1%) и ее идентификации (1%) [16].

Были подготовлены три различных пула сыворотки с тремя интенсивностями гамма-фракции: нормальный, гипо- и гипергамма фон.Была приобретена нормальная гамма-сыворотка (EMD Millipore), а гипо- и гипергамма-сыворотки представляли собой пулы, приготовленные из деидентифицированных остаточных сывороток пациентов с аналогичным фоном (одобрение Institutional Review Board IRB 17-001526). Все остаточные сыворотки, использованные для исследования, были ранее протестированы с помощью SPEP и IFE и оказались отрицательными на присутствие каких-либо эндогенных М-белков. Конечный препарат нормального гамма-пула имел измерение общего белка 68 г / л (альбумин 36 г / л, альфа-1 3 г / л, альфа-2 8 г / л, бета 10 г / л и гамма-фракция 11. г / л).Гипогаммаглобулинемические остаточные сыворотки с общим гамма <5 г / л были объединены, чтобы получить гипопул с общим белком 57 г / л (альбумин 31 г / л, альфа-1 3 г / л, альфа-2 11 г / л, бета 8 г / л и гамма-фракция 4 г / л). Наконец, гипергаммаглобулинемические остаточные сыворотки с общей гамма> 17 г / л были объединены, чтобы получить гипер-пул с общим белком 78 г / л (альбумин 35 г / л, альфа-1 3 г / л, альфа-2 10 г / л). L, бета 10 г / л и гамма-фракция 20 г / л). Образцы, содержащие бета-мигрирующий М-белок, состояли из сыворотки от одного пациента с М-белком изотипа IgAλ.Исходная концентрация бета-мигрирующего M-белка IgA, измеренная с помощью AGE с использованием системы Helena с PD, составляла 59 г / л с чистой концентрацией общего IgA 54 г / л, как определено в Mayo Clinic с использованием нефелометрии (Siemens BNII, Siemens Санитаров). Разведения чистого образца от 25 г / л до 0,5 г / л были приготовлены с нормальной сывороткой с использованием концентрации SPEP M-spike только в качестве базовой концентрации.

Тестирование SPEP и IFE / ISUB

Аликвоты образцов были закрыты и отправлены в испытательные лаборатории замороженными на сухом льду, и лабораториям было рекомендовано хранить образцы в замороженном состоянии (-20 ° C или ниже) до тестирования.Лабораториям было дано указание анализировать образцы вместе с образцами пациентов в соответствии со стандартной рабочей процедурой их учреждения для SPEP и IFE / ISUB. Лабораториям был предоставлен общий IgG (нефелометрия, Siemens BNII) и общий белок (обратный биурет, Siemens Advia 1200) для всех образцов, чтобы помочь в определении оптимальных разведений для тестирования и уменьшить вариабельность этой части тестирования.

Академические учреждения получили два набора образцов, и им было предложено провести на всех образцах с минимальным SPEP и, если возможно, повторить измерение в другой день.Кроме того, академические лаборатории с достаточным объемом образца попросили выполнить образцы с помощью вторичного метода SPEP (если он доступен) и выполнить IFE / ISUB для изотипирования M-белков. Отраслевые участники получили пять наборов образцов, и их попросили запускать все образцы как минимум один раз в день в течение 5 дней или два раза в день, если объем достаточен как для SPEP, так и для IFE / ISUB. Sharepoint, веб-платформа для совместной работы, была настроена для связи со всеми участниками исследования с доступом к шаблону Excel для ввода результатов вместе с используемыми методологиями SPEP и IFE / ISUB и производителем.

Анализ данных

Все результаты были собраны и проанализированы клиникой Mayo Clinic. Точность количественного определения определялась процентным извлечением, и диапазон 80–120% был эмпирически установлен как приемлемый. Межлабораторная неточность была определена как целевой показатель CV не более 20%. LOQ определяли по самой низкой концентрации М-белка в пределах допустимого диапазона восстановления и CV ≤20%. LOD для SPEP и IFE / ISUB определяли консервативно как самую низкую концентрацию М-белка, при которой все проанализированные образцы содержали М-белок качественно.

Результаты

Распространение метода

Вместе с представителями в Австралии, Новой Зеландии, Италии, Великобритании, Нидерландах, Эстонии, США и Канаде, 16 лабораторий сообщили о своей методологии SPEP и IFE / ISUB, использованной для анализа набора слепых образцов из более 3000 уникальных образцов. аликвоты сыворотки. В этом исследовании были представлены четыре различные системы SPEP: платформа AGE от Helena Laboratories (Бомонт, Техас, США), вторая платформа AGE, коммерциализированная Helena Biosciences Europe (Великобритания), а также платформы AGE и CZE от Sebia (Sebia Inc. ., Франция) (таблица 1). В каждом методе применялись методы стробирования как PD, так и TS. Для лабораторий, представивших более одного метода SPEP, был отмечен их основной метод анализа, используемый в повседневной клинической практике, а дополнительный анализ был определен как дополнительный метод. Исключением из этого правила была компания Sebia Inc., у которой оба метода указаны как основные, добавив к 17 указанным основным методам.

Таблица 1: Распределение методологий

учреждений для электрофореза сывороточного белка и иммунофиксации / иммуносубтракции.

908 908

908 908 1

E

E

E

Северная Америка Европа Австралия
SPEP
908 908 9016 908 AGE Хелена AGE

Первичный 1 1 1
Дополнительный 1
TS — 908 908

Дополнительный 1
Sebia AGE
PD
Основной 908 1 908 1 90 815
TS
Первичный 1
Дополнительный 1 10 10
Первичный 1 5 2
Доп.
Дополнительный 4 1
IFE / ISUB
Хелена 908 908 1

908 16 908
Пента 1
Себиа
Моно 2 5 2
Penta 1 908 2

908

Наиболее представленным методом был CZE из Sebia с использованием PD (n = 8), за ним следовали Sebia CZE с TS (n = 7), Sebia AGE и Helena AGE с PD (n = 4), Sebia AGE с TS , (n = 2), и, наконец, Helena AGE с TS (n = 1).Только две из семи лабораторий использовали Sebia CZE с TS в качестве основного метода. Кроме того, ни одна из лабораторий-участниц не использовала Helena AGE с TS на регулярной основе. Для изотипирования М-белка большинство лабораторий использовали IFE и применяли моновалентные антисыворотки на платформе Sebia (n = 9), а затем ISUB от Sebia (n = 3), моновалентные антисыворотки на платформе Helena (n = 2), и пятивалентная антисыворотка, примененная к платформам Helena или Sebia (n = 1 каждая).

Факторы, влияющие на эффективность метода

Каждый метод и соответствующие им методы стробирования показали заметные различия в количественной оценке.Существует общая потеря точности, а также внутрилабораторная и межлабораторная точность, поскольку концентрация М-белка снижается независимо от метода (рис. 2; подробные статистические сведения о производительности каждого метода см. В дополнительных таблицах 2–7). . Однако степень отклонения от истинной концентрации М-белка, воспроизводимость и факторы, влияющие на точность количественного определения, различаются в зависимости от метода гейтирования М-белка, интенсивности поликлонального фона и характера миграции М-белка.

Рис. 2:

Повышенное выделение М-белка методом электрофореза сывороточного белка.

Каждая линия представляет отдельную систему SPEP и метод стробирования. Ожидаемая концентрация М-белка отложена по оси x в зависимости от экспериментально полученного значения, выраженного как средний процент восстановления (столбики ошибок представляют% CV для каждого повторного измерения). Красные пунктирные линии представляют допустимый диапазон извлечения 80–120%. (A) Образцы с добавками Дара на трех фонах гамма-фракции на левой панели.На правой панели увеличено восстановление от 0% до 200%. (B) Образцы с добавлением Elo на трех фонах гамма-фракции на левой панели. На правой панели увеличено восстановление от 0% до 200%. (C) Образец бета-мигрирующего М-белка на левой панели. На правой панели увеличено восстановление от 0% до 200%. PD — перпендикулярная капля; TS, тангенциальный скимминг; AGE, электрофорез в агарозном геле; CZE, капиллярный зональный электрофорез.

Метод гейтирования М-белка

Гейтирование М-белков низкой концентрации с помощью PD приводит к переоценке М-белка, тогда как TS приводит к занижению.Это подтверждается на Рисунке 2 путем сравнения ожидаемых концентраций Дара и Эло (ось x) с измеренными значениями, выраженными как относительное извлечение по оси y. Для иллюстрации образцы с добавлением 10 или 2 г / л Dara на фоне нормальной гамма-фракции и проанализированные с помощью Sebia CZE с PD показали среднее извлечение (% CV) 99% (3,2%) и 171% (7,6%), соответственно. , тогда как анализ, проведенный Sebia CZE с TS, показал среднее восстановление (% CV) 85% (4,0%) и 76% (7,4%), соответственно (Рисунок 2A, центральные панели и дополнительные таблицы 6 и 7).Событие переоценки и занижения было также замечено в образцах с добавлением Эло (Рисунок 2B) и в образце с бета-миграцией (Рисунок 2C), где извлечение (% CV) бета-образца с концентрацией 25 г / л мигрирующий образец M-белка IgA, измеренный с помощью Helena AGE PD, составил 102% (1,7%), тогда как выход (% CV) образца 5,0 г / л составил 151% (11,6%). Извлечение (% CV) того же образца, проанализированного Sebia CZE с TS, составило 88% (4,5%) и 78% (29%), соответственно (Рисунок 2C). В отличие от фармацевтических препаратов, полученных для Дара и Эло, которые имели концентрацию, предоставленную производителем, концентрация бета-мигрирующего М-белка оценивалась с использованием значения M-spike, полученного ведущей лабораторией, которая использовала AGE PD.Для этого конкретного образца, если концентрация IgA, полученная нефелометрическим методом, используется для определения точности количественного определения вместо значения M-spike, Helena AGE с PD теперь остается точным только до 14 г / л, а Sebia CZE с TS увеличится. точность до 2,3 г / л (дополнительный рисунок 1).

Хотя разные методы гейтирования приводят к противоположным отклонениям от допустимого диапазона, по мере уменьшения концентрации М-белка на степень потери точности влияют другие факторы, которые усугубляют потерю точности, связанную с низкой концентрацией белка.

Интенсивность поликлонального фона в гамма-фракции

Это особенно актуально при использовании ФД. По мере увеличения концентрации гамма-фракции точность и прецизионность существенно снижается. Об этом свидетельствует разница в средних показателях восстановления (% CV) между образцами с гипо-, нормальным и гипергаммальным индексом (рис. 2A, B). В образцах с добавлением 10 г / л Dara, проанализированных Helena AGE с PD, восстановления (% CV) были следующими: гипогамма 89% (2.6%), нормальный 97% (2,5%) и гипергамма 116% (5,1%) (дополнительная таблица 2). Аналогичное восстановление наблюдалось при анализе Sebia CZE с PD при той же концентрации: 90% (2,8%), 99% (3,2%) и 122% (6,4%), соответственно (дополнительная таблица 6). И точность, и точность ухудшаются по мере увеличения относительной доли гамма-фона для всех методов. Эффект дополнительно усугубляется образцами с более низкими концентрациями М-белков. В образцах, содержащих 2,0 г / л Dara и проанализированных Helena AGE с PD, восстановление (% CV) составило: гипогамма 123% (7.6%), нормальные 157% (8,2%) и гипергамма 311% (10%). То же самое было замечено в образцах с добавлением Эло; для 2,0 г / л Эло выздоровление (% CV) составило: гипогамма 135% (7,9%), нормальная 216% (14%) и гипергамма 388% (12%), и аналогично для Sebia CZE с PD (дополнительная таблица 6 ). Ошибка в количественном определении PD пропорционально увеличивается с гамма-фоном и обратно пропорциональна концентрации M-белка.

Техника стробирования TS менее чувствительна к влиянию интенсивности гамма-фракции (рис. 3A, B).В образцах с добавлением 10 г / л Dara, проанализированных Sebia CZE с TS (дополнительная таблица 7), извлечение (% CV) было ближе к целевому, чем PD, с 83% (3,3%) в гипо-, 84% (4,0%) в норме и 88% (5,9%) в образцах гипергаммы. Даже при более низких концентрациях недовосстановление было схожим и не имело тенденций, о чем свидетельствует анализ 2 г / л Dara, проведенный Sebia CZE с TS с извлечениями (% CV) следующим образом: гипогамма 78% (18%), нормальное значение 77 % (7,4%) и гипергамма 80% (20%). То же самое было замечено в образцах с добавками Эло.В образцах, содержащих 10 г / л Elo и проанализированных Sebia CZE с TS, восстановления (% CV) были следующими: гипогамма 80% (3,3%), нормальная 79% (3,8%) и гипергамма 81% (6,0%). %). В образцах, содержащих 2,0 г / л Эло, восстановления (% CV) составили: гипогамма 74% (10%), нормальная 82% (14%) и гипергамма 80% (19%). Это предполагает постоянное отрицательное смещение для TS, а не пропорциональное положительное смещение, как это наблюдается с PD.

Рисунок 3:

Пределы количественного определения для электрофореза сывороточного белка и пределы обнаружения для всех методов.

Зеленые клетки представляют все образцы, в которых отклонение от нормы было выявлено и количественно определено с помощью SPEP и / или качественно обнаружено с помощью SPEP. Количество образцов, обозначенное как соотношение (процент), которые были стробированы и определены количественно с помощью SPEP и / или качественно обнаружены с помощью SPEP в клетках персикового цвета. Эритроциты представляют собой образцы, в которых не было выявлено никаких отклонений от нормы. (A) Образцы с шипами Дара. (B) Образцы с Эло-шипами. (C) Бета-мигрирующие образцы.

Схема миграции М-белка

Положение М-белка, даже в пределах гамма-фракции, влияет на точность и точность количественного определения.Это показано путем сравнения образцов с шипами Дара (катодно-мигрирующими) с образцами с шипами Эло (мигрирующими по центру на AGE и анодными в CZE). В целом, М-белки, которые мигрируют ближе к катоду и меньше в центральной части гамма-фракции, имеют более высокую точность и точность, поскольку они меньше подвержены влиянию поликлонального гамма-фона. В образцах, содержащих 10 г / л Dara или Elo и проанализированных Helena AGE с PD, восстановления (% CV) на различных фоновых гамма-фракциях были следующими: гипогамма 89% (2.6%) и 95% (3,1%), нормальные 97% (2,5%) и 112% (5,4%) и гипергамма 116% (5,1%) и 150% (4,7%) соответственно (рис. 2A, B). Разница в точности становится более очевидной при уменьшении концентрации М-белка. Учитывая значительно меньшее влияние фона гамма-фракции на технику TS, на TS также меньше влияет расположение М-белка внутри гамма-фракции. Дара и Эло имели схожие восстановления (% CV) от 79% до 88% (3,3–6,0%) при измерении Sebia CZE с TS в трех тестируемых гамма-фонах при добавлении 10 г / л Dara или Elo.

Предел количественного определения

Для каждого типа образца был рассчитан LOQ и определен как самая низкая концентрация М-белка в пределах допустимого диапазона извлечения 80–120% с CV ≤20% (Таблица 2). В рамках каждого метода (платформа плюс метод гейтирования) существуют вариации LOQ, которые зависят от интенсивности фона гамма-фракции и характера миграции М-белка. При оценке LOQ для всех платформ (Helena AGE, Sebia AGE и Sebia CZE) со стробированием PD на него влиял гамма-фон.Образцы с добавками Дара на гипо-, нормальном и гипергамма-фоне, измеренные на Helena AGE с использованием PD, составляли 3 г / л, 5 г / л и 10 г / л соответственно. На LOQ также влиял характер миграции М-белка, при этом образцы с добавлением Dara имели более низкий LOQ по сравнению с образцами с добавлением Elo. В образцах с добавками Дара и Эло на фоне нормальной гамма-фракции, измеренной Helena AGE с использованием PD, LOQ составлял 5 г / л и 8 г / л, соответственно. При PD в некоторых случаях, например, при измерении Sebia AGE образцов с добавкой Elo на фоне нормальной и гипергамма фракции, приемлемый LOQ не был получен в диапазоне тестируемых концентраций и был отмечен как> 10 г / л.Это означает, что ни один из образцов не имел одновременно приемлемого извлечения (80–120%) и приемлемого% CV (≤20%).

Таблица 2:

Расчетный предел количественного определения для электрофореза сывороточного белка.

Hyper4 Hyper

Нормальный LOQ

908.0

908

Dara Elo Beta
Hypo Normal Hyper4
Helena AGE
PD 3.0 5,0 10 4,0 8,0 > 10 13
TS > 10 > 10 > 10 > 1014 > 1014 >

> 25
Sebia AGE
PD 1.0 5.0 8.0 2.0 > 10 > 10 10

8,0 2,0 ​​ > 10 > 10 10 > 25
Себия CZE
PD 2,0 ​​ 5,0 14 > 10
TS 1,0 5,0 2,0 ​​ 6,0 > 10 8,0 13

Для платформ, где TS был увеличен между гипо- и нормальные гамма-фракции таким же образом, как и при PD; однако LOQ был улучшен при настройке фона гипергаммы.LOQ для образцов с добавкой Dara на фоне гипо-, нормального и гипергамма, измеренный на Sebia CZE с использованием TS, составлял 1 г / л, 5 г / л и 2 г / л, соответственно. Образцы с добавкой Dara показали более низкий LOQ по сравнению с образцами с добавлением Elo с использованием TS: 5 г / л и> 10 г / л, соответственно. LOQ не был получен для образцов Dara или Elo с любым из гамма-фона для Helena AGE с использованием TS-стробирования. LOQ для бета-мигрирующего образца составлял 13 г / л как для Helena AGE с PD, так и для Sebia CZE с TS, но не удалось определить с помощью Helena AGE с TS или Sebia AGE с помощью методов TS.

Решение ввести M-белок в SPEP

Поскольку использовалась каждая лабораторная стандартная рабочая процедура и критерий LOQ не был предварительно определен, было обычным наблюдать, что M-белки количественно определялись (или ограничивались) ниже LOQ найден по результатам исследования. Решение лаборатории ввести М-белок во многом зависит от его концентрации. До концентраций 2 г / л для образцов с гамма-добавками и 7,5 г / л для бета-образцов все М-белки были заблокированы и представлены количественно (рис. 3).Ниже этих концентраций количество лабораторий, выбирающих выход, постепенно уменьшалось. Неоднородность лабораторных методов гейтирования можно оценить на Рисунке 4. Четыре лаборатории выполнили SPEP от Helena AGE с PD, причем три из четырех были основным методом лаборатории. Для каждой лаборатории концентрация М-белка, при которой было решено прекратить стробирование, различалась. Лаборатория, которая применяла этот метод в качестве дополнительного, достигла самой низкой концентрации и имела самый высокий уровень избыточного извлечения (360%) по сравнению с другими лабораториями, которые прекратили работу при более высоких концентрациях, например лаборатория 4, которая прекратила выход на уровне 2 г / л. и имел восстановление 148%.

Рис. 4:

Методы межлабораторного стробирования.

Самая низкая концентрация М-белка, которая была зафиксирована в пробе с добавкой Дара на фоне нормальной гамма-фракции для каждого метода с соответствующим восстановлением. Лаборатории, отмеченные (*), являются результатами лабораторий, в которых данный метод не был их основным методом. PD — перпендикулярная капля; TS, тангенциальный скимминг; AGE, электрофорез в агарозном геле; CZE, капиллярный зональный электрофорез.

По мере увеличения фона гамма-фракции количество лабораторий стробирования уменьшалось.Количество закрытых образцов при 0,5 г / л Dara для гипо-, нормального и гипер- составляло 57/82 (70%), 50/82 (61%) и 24/82 (30%), соответственно (Рисунок 3A). Влияние интенсивности гамма-фракции на решение о гейте наблюдалось только в образцах с М-белком <2 г / л. Выше этой концентрации влияние фона не оказывает большого влияния на решение о гейт. Более того, характер миграции играет роль в принятии решения о пропускании М-белков с низкой концентрацией даже внутри гамма-фракции.Лаборатории с большей вероятностью будут пропускать М-белки с низкой концентрацией, если они мигрируют более централизованно внутри гамма-фракции. Это очевидно из различий между количеством закрытых М-белков между образцами Dara, катодно-мигрирующими и Elo, центрально-мигрирующими, с шипами. При 0,3 г / л при нормальном гамма-фоне только 3/74 (4%) образцов Dara были заблокированы, в то время как 33/74 (45%) образцов Elo были заблокированы (рис. 3A, B). Влияние модели миграции отсутствовало в образцах гипогаммы, так как разница между количеством закрытых выборок между Дара и Эло была незначительной.

Обсуждение

Несмотря на то, что существует ряд клинических руководств по диагностике, мониторингу и лечению моноклональных гаммопатий, эти руководящие принципы уделяют лишь незначительное внимание лабораторным аспектам электрофореза белков, что приводит к отсутствию стандартов отчетности [17]. Здесь мы провели международное многоцентровое исследование с использованием единого общего набора образцов, чтобы объективно определить ограничения в количественном определении малых М-белков путем определения LOQ для конкретных методов и вариативности методов отчетности между лабораториями в целях гармонизации и стандартизации в рамках данной области.

В настоящее время для мониторинга пациентов с моноклональными гаммопатиями рекомендуется использовать тот же метод в одной лаборатории для улучшения воспроизводимости и сопоставимости серийных измерений [17], [18], [19]. Межлабораторные различия сильно повлияют на уход за пациентом, если пациент получит результаты из разных лабораторий. Таким образом, стандартизация количественных результатов необходима для определения тенденций результатов между лабораториями. Стандартизация количественного определения SPEP является сложной задачей из-за большой разнородности методологий и техники стробирования, как показано в этом исследовании.Давать универсальные рекомендации по использованию одного метода и техники гейтирования непрактично, учитывая разнообразие различных систем здравоохранения и гематологических практик, доступных технологий в каждой стране и затрат / ресурсов, необходимых для адаптации и изменения существующих инструментов. Кроме того, это может привести к необходимости повторного базового обследования пациентов с помощью нового метода, что не только отнимет много времени для лаборатории, но также может вызвать путаницу для клинической службы и руководства.Тем не менее, знание ограничений текущего метода вашего учреждения или метода, рассматриваемого для реализации, является полезным и ценным. В будущих публикациях по этой теме, подробное описание метода тестовой системы, используемой для выводов, должно быть принято во внимание исследователями в этой области.

Это исследование количественно оценило влияние четырех основных факторов, которые влияют на точность и точность количественного определения M-белков: концентрация M-белка, интенсивность фона гамма-фракции, миграция M-белка и метод стробирования.В результате в методах, применяющих ФД, стробирование малых М-белков приводит к завышенной оценке со смещением, пропорциональным гамма-фону и обратно пропорциональным концентрации М-белка. Завышенная оценка объясняется вкладом поликлонального фона внутри ворот. По мере того, как концентрация M-белка снижается, гораздо более значительное включение фона в ворота и, следовательно, сообщаемое значение M-белка. То же самое верно для бета-мигрирующих образцов, М-белков, которые мигрируют в центре гамма-фракции, и М-белков, присутствующих на гипергаммаглобулинемическом фоне.При сравнении всех методов, которые применяли PD (например, Helena AGE [n = 4], Sebia AGE [n = 4], Sebia CZE [n = 8]), Sebia AGE показала превосходную точность и LOQ по сравнению с методами TS. были применены. Это было верно для всех образцов, протестированных в этом исследовании.

TS стробирование М-белков с низкой концентрацией привело к недооценке с постоянным отрицательным смещением для TS, а не с пропорциональным смещением, как это наблюдается с PD. Однако степень отклонения от допустимого диапазона и цели не была такой значительной, как при PD.Подобные результаты были также замечены в других исследованиях [11]. М-белки с более высокой концентрацией, управляемые TS, могут быть точно отделены от поликлонального фона. При использовании М-белков с более низкой концентрацией TS не только удаляет фон, но также удаляет часть М-белка. Оказалось, что на TS не так сильно влияет интенсивность гамма-фона или миграция внутри гамма-фракции. LOQ постоянно увеличивался по мере увеличения гамма-фракции при использовании стробирования PD, тогда как LOQ при стробировании с TS увеличивался между гипо- и нормальным гамма-образцами, а затем снижался при настройке гипергамма-фона.Это показывает, что TS имеет лучшую эффективность, чем PD в условиях гипергаммаглобулинемии. Однако одновременное обнаружение гипергаммаглобулинемии и моноклонального белка имеет низкую распространенность, поскольку гипергаммаглобулинемия присутствует в аутоиммунных, воспалительных или инфекционных процессах, тогда как моноклональный белок присутствует в предзлокачественных или злокачественных состояниях. Лаборатории должны прокомментировать уровень гамма-глобулинов в фоновом режиме, чтобы помочь оценить неопределенность и указать возможные ассоциации с такими клиническими состояниями.При сравнении всех методов TS (т.е. Helena AGE [n = 1], Sebia AGE [n = 2] и Sebia CZE [n = 7]), Sebia CZE показал лучшие результаты с лучшим LOQ для каждого типа образцов.

Мы считаем, что эти проблемы с измерениями отражают тот факт, что М-белки имеют архитектуру, напоминающую треугольник с пиком наверху и непрерывно расширяющимся к основанию. Поскольку точки разграничения как для PD, так и для TS расположены там, где M-белок имеет заметное отклонение, они будут недооценивать M-белки, если вообще нет поликлональных иммуноглобулинов.В нашем исследовании в условиях гипогаммаглобулинемии оба метода недооценивают М-спайк, потому что М-спайк расширяется ниже этой точки по мере того, как он распространяется до исходного уровня. Как показывают наши данные, PD имеет то преимущество, что перпендикулярное падение к базовой линии включает лежащий в основе поликлональный материал, который, по крайней мере, частично компенсирует разницу в гипогаммаглобулинемической сыворотке. По мере того, как M-белок уменьшается, а поликлональные гамма-глобулины увеличиваются, относительное количество лежащего в основе поликлонального материала становится основным фактором, приводящим к извлечению 150% или выше.TS, измеряя площадь над разграничениями, происходящую на более миниатюрном конце M-шипа, последовательно занижает количество M-белка, как показано в нашем исследовании. Несмотря на стабильно низкое восстановление, когда поликлональный фон становится основным фактором (<4 г / л в нормальных или гипергаммаглобулинемических образцах), TS обеспечивает стабильное восстановление по сравнению с первоначальным измерением. У обоих методов есть достоинства и недостатки. Однако при наблюдении за пациентом не следует переключаться с одного метода.

Обычно утверждается, что минимальная концентрация для количественного определения составляет 1 г / л, с учетом того, что количественное определение М-белков на этом уровне неточно и неточно [17]. М-белки <1 г / л, видимые на SPEP, не следует определять количественно, поскольку измерение ненадежно и, следовательно, должно быть представлено качественно. Эти рекомендации были разработаны, когда единственным вариантом измерения М-белка с помощью электрофореза было использование ФД. Хотя этот метод обладал достоинством простоты и хорошо работал с большими М-белками и когда нормальная продукция иммуноглобулинов подавлялась, с маленькими М-белками и поликлональным фоном, большая часть включенных измерений была фоном [2].Здесь мы показываем, что многие лаборатории вводят и количественно регистрируют М-белки с концентрациями намного ниже 1 г / л. Полученное значение неточно и может не отражать состояние болезни пациента. Лаборатории по-прежнему не достигают аналитически приемлемого уровня, о чем свидетельствует несоответствие между практикой стробирования и рассчитанными LOQ. Хотя LOQ считается количественной аналитической чувствительностью SPEP, отклонение от нормы в гамма- или бета-фракции было визуально снижено до медианы в 16 раз ниже (диапазон: в 2–100 раз ниже), чем зарегистрированный LOQ, что характеризует LOD для системы SPEP (таблица 2).

Существуют две ситуации, когда измерение М-белка с низкой концентрацией может иметь место клинически: при первоначальном диагнозе, при обнаружении небольшого количества М-белка, не поддающегося количественной оценке, и при мониторинге терапевтического ответа. В таких ситуациях лаборатория сталкивается с выбором между количественной оценкой и сообщением аналитически неточного результата или качественным отчетом как небольшой аномалией, наблюдаемой на SPEP и отраженной на IFE / ISUB. В первоначальной диагностической пробе, в которой обнаружено какое-либо отклонение от нормы М-белка, рекомендуется длительный мониторинг прогрессирования заболевания.Большинство пациентов с моноклональной гаммопатией имеют относительно небольшой моноклональный пик, не имеют клинических симптомов и имеют диагноз MGUS. Эта ситуация может быть обычным явлением, поскольку моноклональные гаммопатии были обнаружены у 1% населения старше 50 лет и у 3% людей в возрасте 70 лет и старше со случайными находками. Может быть важно идентифицировать и контролировать этих пациентов, поскольку в 20–25% случаев серьезное заболевание, такое как MM, WM или первичный системный AL, может развиться в течение длительного периода наблюдения. В результате длительного наблюдения нет ничего плохого в том, что при первичной диагностике не указывается числовое значение.Количественный результат может быть дан только тогда, когда М-белок достаточно велик для точного количественного определения.

Более того, при терапевтическом мониторинге, когда пациент реагирует на терапию и наблюдается существенное снижение концентрации М-белка, можно встретить небольшой не поддающийся количественному определению М-белок. Фактически, международные руководящие принципы для классификации ответа миеломы рекомендуют использовать dFLC (разница между вовлеченным и не вовлеченным FLC) вместо концентрации M-белка, определенной денситометрическим анализом, если сывороточный M-белок <10 г / л.Если соотношение FLC становится нормальным, то требуется IFE / ISUB для дальнейшего мониторинга присутствия или отсутствия M-белка [20]. Прекращение количественного определения, когда количество М-белка слишком мало для точного отчета, приемлемо, поскольку отчеты SPEP и IFE / ISUB должны содержать адекватную информацию, позволяющую оценить очень хороший частичный ответ (VGPR), полный ответ (CR) и строгий полный ответ. (sCR). Различие между критериями ответа VGPR и CR зависит от эффективности IFE / ISUB для демонстрации отсутствия М-белка, если он был ранее обнаружен.Следовательно, практика запрета гейтирования М-белков, которые экспрессируются на низких уровнях, является достаточной, поскольку о М-белке можно сообщить качественно. Отсюда клиническая служба может отслеживать эти качественные результаты вместо количественного мониторинга, который может быть неточным. Кроме того, в эпоху терапевтических mAb стало обычным видеть небольшие моноклональные полосы каппа IgG в SPEP и IFE / ISUB, которые не обязательно представляют исходный клон болезни, и включение полосы в качестве M-белка может изменить критерии ответа. для пациентов, проходящих лечение, если терапевтические mAb не могут быть точно дифференцированы от исходного клона болезни с последующим тестированием.Качественный отчет о терапевтическом mAb без распознавания отличия от исходного клона будет иметь аналогичный эффект и может означать отсутствие CR для пациента.

Количественное определение М-белков в бета-области часто может быть проблематичным, поскольку М-белок может совместно мигрировать и быть скрытым другими факторами, такими как С3-комплемент или трансферрин внутри фракции, что затрудняет их количественную оценку. Поскольку бета-мигрирующий образец был объединен от одного пациента и не был получен из добавленных mAb, исходную концентрацию в неразбавленном виде определяли дома (клиника Mayo, Рочестер, Миннесота, США) с использованием Helena AGE с PD и общим IgA.Следовательно, все результирующие значения, полученные с помощью других методов, следует сравнивать относительно Helena AGE с PD и изменять тенденции в пределах разбавлений каждого метода, чтобы получить доступ к потере точности, поскольку ни один метод не является истинным. И Helena AGE с PD, и Sebia CZE с TS показали хорошую точность до 10 г / л. Скорее всего, это связано со специфической миграцией этого М-белка, пик которого отделяется от остальной части бета-фракции. Одним из способов повышения точности М-белков с низкой концентрацией является количественная оценка изотип-специфичных классов иммуноглобулинов [21].Это может быть особенно полезно, когда бета-мигрирующие IgA перекрываются с другими белками.

Сложно сделать вывод о том, какая методология наиболее чувствительна. Во-первых, чувствительность при обнаружении может зависеть от читателя, а не от методологии, поскольку некоторые лаборатории более консервативны в отношении того, что они называют М-белком, и не все методы были запущены и прочитаны в одной лаборатории и одним и тем же читателем. Кроме того, в показаниях могла быть некоторая систематическая ошибка, поскольку в набор слепых проб не было включено отрицательных проб.Читатель, возможно, ожидал, что все присланные образцы содержат М-белок, поскольку в начальном письме с сообщением для участников, если оно было передано технологам, излагались детали плана исследования. Истинное значение добавок Дара и Эло в пулах зависело от концентрации, указанной во флаконах с фармацевтическими препаратами, без дополнительной проверки ведущей лабораторией, помимо измерения общего белка и общего IgG до и после приготовления пулов. Можно принять во внимание небольшую погрешность при подготовке стандартов.Другим ограничением исследования является то, что, вероятно, эксперименты проводились за короткий период времени, с одним оператором, и особое внимание было уделено гейтированию и обнаружению М-белков, и результаты могли быть лучше, чем те, которые наблюдаются в рутинной практике.

В заключение, большое многоцентровое исследование SPEP и IFE / ISUB было выполнено с использованием единого общего набора образцов. Исследование демонстрирует отсутствие точности и точности количественного определения М-белков с низкой концентрацией наряду с другими факторами, влияющими на эффективность анализа.Понимая ограничения, лаборатории могут стать более консервативными в том, что они делают для количественной оценки и отчетности.


Автор, ответственный за переписку: Мария Алиса Виейра Виллрих, доктор философии, отделение клинической биохимии и иммунологии, отделение лабораторной медицины и патологии, клиника Майо, 200 First Street SW, Рочестер, Миннесота 55905, США, тел .: + 1-507- 284-2511


Авторы хотели бы посвятить эту работу Джиллиан Р. Тейт, умершей 4 декабря 2018 г.Тейт был ученым в Отделении химической патологии, патологии Квинсленда, Королевского Брисбена и женской больницы, Брисбен, QLD, Австралия, и председателем рабочей группы по стандартизации отчетов о малых моноклональных белках с помощью электрофореза с IFCC во время исследования. дизайн и исполнение. Хотя ей не удалось увидеть окончательную рукопись этой работы, исследование не было бы завершено без ее вклада в дизайн исследования, руководства со всеми участниками и неоценимого наставничества.Авторы хотели бы поблагодарить Программу обеспечения качества RCPA (Сент-Леонардс, Новый Южный Уэльс, Австралия), доктора Луизу Винхолт за расходы на доставку материалов во все лаборатории в Австралии и профессора Марио Плебани из Департамента лабораторной медицины Университета. -Больница Падуи (Падуя, Италия) для координации распространения образцов в Италии. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Дэвида Л. Мюррея, доктора медицины, доктора философии (клиника Мэйо, Рочестер, Миннесота, США) и доктора Майкла Линдена, доктора медицины, доктора философии (Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота, США) за критическое прочтение. рукописи и содержательные комментарии.Технологи, которые выполнили прогоны SPEP, IFE и ISUB и интерпретировали гели, получили глубокую благодарность от авторов здесь: Корри де Кэт Анджелино (Медицинский центр Университета Радбауд), Йок Леонг (Отделение химической патологии Королевской больницы Мельбурна), Анферни Ценг (Патология Квинсленда). , Королевский Брисбен и женская больница), Меган Рэй (Госпиталь Королевского принца Альфреда), Карла Леммерт и Кристин Бернс (Патология здоровья Нового Южного Уэльса), Маргарита Берарди (общая лаборатория, университетская больница Кареджи, Флоренция), Маддалена Марини и Лавиния Николини (лаборатория клинической химии) , Университет Вероны), Риккардо Альбертини и Тициана Босони (Клиника Servizio Analisi Chimico, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Павия, Италия), Татьяна Тверская и Галина Трофимова (Лаборатория клинической химии, Медицинский центр Северной Эстонии), Стейси Авондет и Джеральд Окей ( ARUP Laboratories), Дональда Джакерио и Терезы Нурми (Лаборатория клинической иммунологии, Мичиганский университет) и Эми Марриот t (Helena Biosciences Europe).

Ссылки

1. Katzmann JA. Панели для скрининга моноклональных гаммопатий: время меняться. Clin Biochem Rev 2009; 30: 105–11. Искать в Google Scholar

2. Керен Д.Ф., Шредер Л. Проблемы измерения моноклональных белков в сыворотке крови. Clin Chem Lab Med 2016; 54: 947–61. Искать в Google Scholar

3. Willrich MA, Katzmann JA. Требования к лабораторным исследованиям для диагностики и последующего наблюдения за множественной миеломой и связанными с ней дискразиями плазматических клеток. Clin Chem Lab Med 2016; 54: 907–19.Искать в Google Scholar

4. Керен Д.Ф. Белковый электрофорез в клинической диагностике. Лондон, Нью-Йорк: Арнольд; Oxford University Press, 2003, 402 с. Поиск в Google Scholar

5. Кайл Р.А., Герц М.А., Витциг Т.Э., Lust JA, Лейси М.К., Диспензиери А. и др. Обзор 1027 пациентов с впервые диагностированной множественной миеломой. Mayo Clin Proc, 2003; 78: 21–33. Поиск в Google Scholar

6. Кацманн Дж. А., Кайл Р. А., Бенсон Дж., Ларсон Д. Р., Снайдер М. Р., Похоть Дж. А. и др. Скрининговые панели для выявления моноклональных гаммопатий.Clin Chem 2009; 55: 1517–22. Поиск в Google Scholar

7. Кацманн Дж. А., Снайдер М. Р., Раджкумар С. В., Кайл Р. А., Терно TM, Бенсон Дж. Т. и др. Долгосрочные биологические вариации M-спайка электрофореза белков сыворотки, M-спайка мочи и количественного определения свободных легких цепей моноклональной сыворотки: значение для мониторинга моноклональных гаммопатий. Clin Chem 2011; 57: 1687–92. Поиск в Google Scholar

8. Миллс Дж. Р., Кольхаген М. С., Дасари С., Вандербум П. М., Кайл Р. А., Кацманн Дж. А. и др. Комплексная оценка M-белков с использованием обогащения нанотел в сочетании с масс-спектрометрией MALDI-TOF.Clin Chem 2016; 62: 1334–44. Искать в Google Scholar

9. Мюррей Д.Л., Рю Э., Снайдер М.Р., Кацманн Дж. Количественное определение моноклональных белков сыворотки: взаимосвязь между электрофорезом в агарозном геле и иммунонефелометрией. Clin Chem 2009; 55: 1523–9. Поиск в Google Scholar

10. Кацманн Дж., Керен Д. Стратегия выявления и отслеживания моноклональных гаммопатий. В: Detrick B, Schmitz JL, Hamilton RG. Руководство по молекулярной и клинической лабораторной иммунологии. Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press, 2016: 112–24.Искать в Google Scholar

11. Schild C, Wermuth B, Trapp-Chiappini D, Egger F, Nuoffer JM. Надежность количественной оценки М-белка: сравнение двух методов интеграции пиков на Capillarys 2. Clin Chem Lab Med 2008; 46: 876-7. Поиск в Google Scholar

12. Гензен Дж. Р., Мюррей Д. Л., Абель Дж., Менг К. Х., Балтаро Р. Дж., Роадс Д. Д. и др. Скрининг и диагностика моноклональных гаммопатий: международный обзор лабораторной практики. Arch Pathol Lab Med 2018; 142: 507–15. Искать в Google Scholar

13.Раджкумар С.В., Димопулос М.А., Палумбо А., Блейд Дж., Мерлини Г., Матеос М.В. и др. Международная рабочая группа по миеломе обновила критерии диагностики множественной миеломы. Lancet Oncol 2014; 15: e538–48. Поиск в Google Scholar

14. Кумар С., Пайва Б., Андерсон К.С., Дьюри Б., Ландгрен О., Моро П. и др. Критерии консенсуса Международной рабочей группы по миеломе для оценки ответа и минимальной остаточной болезни при множественной миеломе. Lancet Oncol 2016; 17: e328–46. Искать в Google Scholar

15.Миллс Дж. Р., Кольхаген М. С., Виллрих М.А., Курелис Т., Диспензиери А., Мюррей Д.Л. Универсальное решение для исключения ложноположительных результатов при миеломе из-за вмешательства терапевтических моноклональных антител. Кровь 2018; 132: 670–2. Искать в Google Scholar

16. Фармакопея США. Национальный формуляр. Глава 476 и Глава 1086. Роквилл, Мэриленд: Фармакопейная конвенция США, Inc.; 1979. Поиск в Google Scholar

17. Тейт Дж., Колдуэлл Дж., Дэйли Дж., Гиллис Д., Дженкинс М., Йованович С. и др.Рекомендации по стандартизированной отчетности по электрофорезу белков в Австралии и Новой Зеландии. Энн Клин Биохим 2012; 49: 242–56. Искать в Google Scholar

18. Тейт Дж., Пантегини М. Стандартизация — теория и практика. Clin Biochem Rev 2007; 28: 127–30. Искать в Google Scholar

19. Тейт Дж. Р., Керен Д. Ф., Молли П. Глобальный призыв к оружию для клинических лабораторий — согласованное количественное определение и отчетность по моноклональным белкам. Clin Biochem 2018; 51: 4–9. Искать в Google Scholar

20.Димопулос М., Кайл Р., Ферманд Дж. П., Раджкумар С. В., Сан-Мигель Дж., Чанан-Хан А. и др. Консенсусные рекомендации по стандартным следственным действиям: отчет консенсусной группы 3 Международного семинара по миеломе. Кровь 2011; 117: 4701–5. Искать в Google Scholar

21. Тейт Дж. Р., Грациани М. С., Молли П., Мерлини Г. Электрофорез белков и свободные легкие цепи сыворотки в диагностике и мониторинге нарушений плазматических клеток: лабораторные исследования и текущие разногласия. Clin Chem Lab Med 2016; 54: 899–905.Поиск в Google Scholar

Дополнительные материалы

Онлайн-версия этой статьи предлагает дополнительные материалы (https://doi.org/10.1515/cclm-2019-1104).

Получено: 2019-10-25

Принято: 2019-12-02

Опубликовано онлайн: 2020-01-15

Опубликовано в печати: 2020-03-26

© 2020 Walter de Gruyter GmbH, Берлин / Бостон

Установка и удаление внутриматочных спиралей

БРЕТТ ЭНДРЮ ДЖОНСОН, M.D., Методистский медицинский центр Чарльтона, Даллас, Техас

Am Fam Physician. , 1 января 2005 г .; 71 (1): 95-102.

Внутриматочная спираль (ВМС) является эффективным противозачаточным средством для многих женщин. Медь-высвобождающая ВМС может использоваться в течение 10 лет до замены и является хорошим выбором для женщин, которые не могут или предпочитают не использовать гормональные контрацептивы. Однако у некоторых женщин наблюдается учащение менструальной кровопотери и дисменорея. Выделяющая прогестин ВМС может использоваться в течение пяти лет.Он может уменьшить меноррагию и дисменорею, хотя у некоторых женщин в первые месяцы после введения препарата усиливаются кровянистые выделения и кровотечения. Идеальные кандидаты на использование ВМС — это рожавшие женщины, состоящие в стабильных моногамных отношениях. Беременность, необъяснимое вагинальное кровотечение и образ жизни, подвергающий женщину риску заболеваний, передающихся половым путем, являются противопоказаниями к использованию ВМС. ВМС можно ввести в любое время менструального цикла, если женщина не беременна. Перед введением необходимо бимануальное исследование и зондирование матки, чтобы определить положение матки и глубину полости матки.ВМС вводится в матку в соответствии с индивидуальными протоколами, при этом нити обрезаются по длине, чтобы пациентка могла проверить положение устройства. Изгнание может происходить с обоими типами ВМС.

В течение многих лет внутриматочная спираль (ВМС) была средством контрацепции для женщин. В 1995 году ВМС использовали 11,9% женщин репродуктивного возраста во всем мире, но только 1,5% женщин в Северной Америке.1 Потенциальной причиной такой разницы в использовании является негативное восприятие ВМС, созданных в результате связанных с этим осложнений. с Dalkon Shield.

Dalkon Shield — это ВМС, представленная в 1970 году и отозванная в 1975 году. Она была связана со значительной частотой воспалительных заболеваний органов малого таза (PID), поскольку считалось, что ее мультифиламентные нити могут переносить бактерии в матку и маточные трубы.

Сегодня две ВМС одобрены для использования в Соединенных Штатах: устройство для высвобождения меди (ParaGard) и устройство для высвобождения гормонов (Mirena). Обе ВМС имеют моноволоконные нити, которые сводят к минимуму риск передачи бактерий.

ВМС, выделяющая медь (рис. 1), представляет собой Т-образное полиэтиленовое устройство с открытой площадью поверхности меди 380 мм2 на его плечах и штоке. Высвободившиеся ионы меди препятствуют подвижности сперматозоидов и вызывают реакцию с инородным телом, которая приводит к образованию спермицидной среды.2 Сульфат бария был добавлен к полиэтиленовой подложке, чтобы сделать устройство рентгеноконтрастным. В основании ВМС расположен пластиковый шарик диаметром 3 мм, через который проходит моноволоконная нить. После установки ВМС может оставаться на месте до 10 лет.

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 1

Внутриматочная спираль с высвобождением меди (ParaGard) и устройство для введения. Печатается с разрешения FEI Women’s Health.


Рисунок 1

Внутриматочная спираль с высвобождением меди (ParaGard) и устройство для введения. Печатается с разрешения FEI Women’s Health.

Гормон-высвобождающая ВМС (рис. 2) представляет собой рентгеноконтрастное устройство Т-образной формы с 52 мг левоноргестрела на руках и стержне.Прогестин выделяется из расчета 20 мкг в день. Считается, что левоноргестрел сгущает цервикальную слизь, создавая барьер для проникновения сперматозоидов через шейку матки, а также может остановить овуляцию и истончить слизистую оболочку матки. После установки ВМС может оставаться на месте до пяти лет.

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 2

Гормон-высвобождающая внутриматочная спираль (Мирена) и устройство для введения. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.


Рисунок 2

Гормон-высвобождающая внутриматочная спираль (Мирена) и устройство для введения.Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.

Данные противоречат друг другу в отношении того, какой механизм в первую очередь отвечает за эффективность ВМС. Результаты недавнего обзора показали, что механизмы действия до и после оплодотворения играют роль как в ВМС3 [Уровень доказательности B, систематический обзор исследований] ВМС, высвобождающая медь, так и ВМС, высвобождающая гормоны, были показаны в клинические испытания должны дать 99,2% и 98% эффективности, соответственно, в предотвращении беременности за один год обычного использования.4,5

Противозачаточные эффекты ВМС обратимы после удаления. Результаты недавнего исследования показывают, что длительное использование ВМС (т.е. более 78 месяцев [6,5 лет]) может быть связано с повышенным риском ухудшения фертильности.6 [Уровень доказательности C, проспективное когортное исследование]

Рекомендуемый пациент Профиль и противопоказания

ВМС предназначены для беременных женщин, состоящих в стабильных, взаимно моногамных отношениях, без ВЗОМТ в анамнезе. Хотя это и не противопоказано для этой группы, у нерожавших женщин, как правило, наблюдается более высокая частота изгнания и неудач, а также более сложное введение, потому что у них полость матки меньше.7

Женщины, подвергшиеся риску заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), имеют больше шансов заболеть ВЗОМТ. Анамнез ВЗОМТ предполагает риск повторного заражения, хотя отдаленный анамнез не исключает полностью выбора ВМС. Научная рабочая группа Всемирной организации здравоохранения пришла к выводу, что женщины, которые были беременны после возникновения ВЗОМТ и в настоящее время не подвержены риску заражения, могут быть кандидатами на ВМС.1

Гормон-высвобождающая ВМС может принести пользу женщинам с анемией, меноррагией или дисменорея.8 Хотя существует больший риск появления мажущихся или нерегулярных кровотечений в течение первых трех месяцев после введения этого устройства, этот риск значительно снижается через 12 месяцев после введения 9

Обе ВМС классифицируются как категория беременности X. Противопоказания приведены в Таблица 1.4,5,7,10,11

Просмотр / печать таблицы

ТАБЛИЦА 1

Противопоказания к установке ВМС
15, если не возникла последующая внутриутробная беременность 3

15

0 в анамнезе

914 9709 или септический аборт в предыдущие три месяца

9102 9102 9102 9102 9102 9102 9102 9102 9102 9102 9102 Заболевание или рак печени *

70

70

03

Острое заболевание печени или рак печени *

Карцинома груди *

Подтвержденная или подозреваемая беременность

Аллергия на медь †

Генитальный актиномикоз

В анамнезе внематочная беременность 3

В анамнезе, если не возникла внематочная беременность 3

Иммунодефицитное расстройство ders

Иммуносупрессивная терапия

Желтуха *

Известное или подозреваемое злокачественное новообразование таза

Не диагностированное вагинальное кровотечение

Патология матки

Болезнь Вильсона †

Карцинома груди *

Подтвержденная или подозреваемая беременность

Аллергия на медь †

3

История внематочной беременности

Воспалительные заболевания органов малого таза, если не наступила последующая внутриутробная беременность

Нарушения иммунодефицита

Известное или подозреваемое злокачественное новообразование органов малого таза

Множественные половые партнеры для пациента или ее партнера

Послеродовой эндометрит или септический аборт000 в предыдущие три месяца

Патология матки

Болезнь Вильсона †

Меры предосторожности

ВМС можно вводить в любой момент во время менструального цикла.Документация об отрицательном результате теста на беременность является разумной. Введение может быть выполнено во время менструации, чтобы обеспечить дополнительную уверенность в том, что женщина не беременна.

Если введение планируется во время лютеиновой фазы, следует использовать другое негормональное противозачаточное средство до наступления следующей менструации. Тест на беременность может быть сделан, но пациентка должна знать, что тест на беременность в это время не всегда может исключить раннюю беременность.

Не следует вводить ВМС женщине с ЗППП.Американский колледж акушеров и гинекологов рекомендует провести гинекологический осмотр перед установкой для скрининга на хламидиоз и гонорею.12 [Уровень доказательности C, консенсус / рекомендации экспертов]

Обычное профилактическое назначение антибиотиков не требуется.13 [Уровень доказательности A, высокое качество метаанализ] Исследования продемонстрировали, что использование профилактических антибиотиков во время введения ВМС не приносит почти никакой пользы. Доксициклин (вибрамицин) или эритромицин могут использоваться для профилактики.10,12

По данным Американской кардиологической ассоциации, антибиотикопрофилактика у пациентов с риском эндокардита не требуется перед установкой или удалением ВМС.14 [Уровень доказательности C, рекомендации экспертов / консенсуса]

Подготовка пациента

Врач должен обсудить с пациентом: риски и преимущества ВМС и, при необходимости, других форм контрацепции. Пациентка должна ознакомиться с информационными материалами, предоставленными производителем, и иметь возможность обсудить со своим врачом любые проблемы.Информированное согласие может быть получено после выполнения этих шагов.

Введение нестероидного противовоспалительного препарата (например, от 600 до 800 мг ибупрофена [мотрина]) за час до введения может облегчить дискомфорт. Врач должен проинструктировать пациента о том, как найти нити ВМС. Женщине необходимо находить нити, чтобы проверять положение ВМС после каждой менструации. Пациентке следует попросить позвонить в офис своего врача, если она когда-либо не сможет найти нити ВМС.

Вставка

ВМС, высвобождающая медь

Перед процедурой необходимо собрать надлежащее оборудование (таблица 2). Затем следует провести бимануальное исследование в нестерильных перчатках для определения положения матки.

Просмотр / печать таблицы

ТАБЛИЦА 2

Оборудование для введения ВМС
52

003 Long

003 Ножницы для наложения швов

0

9000 стерильная процедура влагалищное зеркало

Цервикальный зубчик

Ватные шарики, смоченные антисептическим раствором или повидон-йодом

Кольцевые пинцеты

Стерильные и нестерильные смотровые перчатки

Стерильный пакет для ВМС с ВМС

Маточный звук

ТАБЛИЦА 2

Оборудование для введения ВМС

Цервикальный тенакулум

антисептик с ватным тампоном

ватные тампоны

Ножницы для длинных швов

Кольцевые пинцеты

Стерильные и нестерильные смотровые перчатки

Процедура стерильной ВМС со стерильной ложкой

Стерильное влагалищное зеркало

Маточный звук

Плечи ВМС должны быть загнуты в трубку для введения настолько, чтобы они удерживались.Это можно сделать до начала процедуры, проработав стерильную упаковку (рисунок 3).

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 3

Плечи высвобождающей медь внутриматочной спирали загнуты в трубку для введения. Печатается с разрешения FEI Women’s Health.


Рис. 3

Плечи высвобождающей медь внутриматочной спирали сложены во вводную трубку. Печатается с разрешения FEI Women’s Health.

Стерильная техника, включая стерильные перчатки, необходима во время процедуры, чтобы свести к минимуму риск контаминации или инфекции. Шейку матки и прилегающие своды влагалища следует обильно промыть антисептическим раствором. Хлоргексидина глюконат (Hibiclens) можно использовать, если у пациента аллергия на йод.

Врач должен стабилизировать шейку матки во время введения ВМС с помощью тенакулюма. Для минимизации дискомфорта можно использовать местную анестезию, например, 5-процентный гель лидокаина (ксилокаин), вводимый в цервикальный канал, или парацервикальную блокаду.

Для определения глубины полости матки следует использовать стерильный маточный звук. Следует избегать контакта с влагалищем или лезвиями зеркала. Маточный звук имеет выпуклый конец, чтобы предотвратить перфорацию. Альтернативой звуку матки является аспиратор эндометрия, который используется для взятия биоптата эндометрия. Адекватная глубина матки составляет от 6 до 9 см и должна быть зарегистрирована в истории болезни пациента. ВМС не следует вводить, если глубина матки менее 6 см.

Врач должен использовать стерильные перчатки для извлечения ВМС из стерильной упаковки. Синий фланец должен быть совмещен с плечами ВМС и установлен на расстоянии, на котором проводился зондирование матки. Затем следует поместить белый стержень для введения в трубку для введения на конце, противоположном плечам ВМС, и приблизить его к шарику в основании ВМС.

Затем врач должен ввести ВМС в матку до тех пор, пока фланец не будет соприкасаться с зевом шейки матки. Прозрачную трубку вставки следует оттянуть назад на стержне введения примерно на 2 см, чтобы рычаги можно было раздвинуть до положения «Т» (рис. 4).Трубку следует продвигать медленно, чтобы обеспечить правильное положение ВМС (рис. 5). Врач должен удалить стержень для введения, удерживая трубку для введения на месте (рис. 6), а затем удалить трубку для введения и зажим. Наконец, нити, выходящие из устья шейки матки, следует обрезать до длины 3 см. Длина нитей во влагалище должна быть записана в истории болезни пациента для дальнейшего использования.

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 4

Плечи высвобождающей медь внутриматочной спирали высвобождаются.Печатается с разрешения FEI Women’s Health.


Рисунок 4

Плечи высвобождающей медь внутриматочной спирали освобождены. Печатается с разрешения FEI Women’s Health.

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 5

Вставная трубка выдвинута для установки высвобождающей медь внутриматочной спирали. Печатается с разрешения FEI Women’s Health.


Рис. 5

Вставная трубка выдвинута для установки высвобождающей медь внутриматочной спирали.Печатается с разрешения FEI Women’s Health.

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 6

Стержень для введения высвобождающей медь внутриматочной спирали извлечен. Печатается с разрешения FEI Women’s Health.


Рисунок 6

Стержень для введения высвобождающей медь внутриматочной спирали извлечен. Печатается с разрешения FEI Women’s Health.

ГОРМОНАЛЬНАЯ ВМС

Как и в случае с медьвыделяющей ВМС, перед процедурой необходимо собрать необходимое оборудование (таблица 2) для введения гормон-высвобождающей ВМС.Затем следует провести бимануальное исследование в нестерильных перчатках, чтобы определить положение матки. Стерильная техника использования стерильных перчаток необходима во время самой процедуры, чтобы свести к минимуму риск заражения или инфекции. Шейку матки и прилегающую слизистую влагалища следует обильно промыть антисептическим раствором. Хлоргексидина глюконат можно использовать, если у пациента аллергия на йод.

Врач должен стабилизировать шейку матки во время введения ВМС с помощью тенакулюма.Для минимизации дискомфорта можно использовать местную анестезию, например, введение 5-процентного геля лидокаина в цервикальный канал или парацервикальную блокаду.

Для определения глубины полости матки следует использовать стерильный маточный звук или аспиратор эндометрия. Следует избегать контакта с влагалищем или лезвиями зеркала. Адекватная глубина матки составляет от 6 до 9 см и должна быть зарегистрирована в истории болезни пациента. ВМС не следует вводить, если глубина матки менее 6 см.

Врач должен открыть стерильную упаковку ВМС, надеть стерильные перчатки, взять устройство для введения, содержащее ВМС, и осторожно высвободить нити из-за ползунка, позволяя им свободно висеть. Ползунок должен располагаться в верхней части ручки, ближайшей к ВМС. Глядя на вводную трубку, врач должен убедиться, что руки устройства расположены горизонтально. В противном случае их необходимо выровнять стерильно (рис. 7). Врач должен потянуть за обе нити, чтобы втянуть ВМС в трубку для введения так, чтобы ручки на концах рычагов закрывали открытый конец устройства для введения (рис. 8).Резьба должна быть плотно закреплена в щели на конце ручки (Рисунок 9), а фланец должен быть установлен на глубину, измеряемую звуком (Рисунок 10).

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 7

Плечи внутриматочной спирали, высвобождающей гормон, выровнены в горизонтальное положение при извлечении устройства из упаковки. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.


Рис. 7

Плечи внутриматочного устройства, высвобождающего гормон, выровнены в горизонтальное положение при извлечении устройства из упаковки.Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 8

Внутриматочное устройство, высвобождающее гормоны, втягивается в трубку для введения. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.


Рис. 8

Внутриматочная спираль, высвобождающая гормон, втягивается в трубку для введения. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.

Посмотреть / распечатать Рисунок

Рисунок 9

Нити плотно закреплены в щели.Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.


Рис. 9

Нити плотно закреплены в щели. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.

Посмотреть / распечатать Рисунок

Рисунок 10

Фланец отрегулирован на глубину звука. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.


Рис. 10

Фланец отрегулирован на глубину звука. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.

Врач должен ввести ВМС, крепко удерживая ползунок за верхнюю часть ручки и осторожно вводя устройство для введения в цервикальный канал. Вставную трубку следует продвинуть в матку до тех пор, пока фланец не окажется на расстоянии примерно 1,5–2 см от внешнего зева шейки матки, обеспечивая достаточно места для открытия плечей ВМС. Удерживая устройство для введения в устойчивом положении, врач должен освободить руки ВМС, потянув ползунок назад, пока верхняя часть ползунка не достигнет приподнятой горизонтальной линии на ручке (рис. 11).Устройство для введения следует осторожно ввести в полость матки, пока фланец не коснется шейки матки.

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 11

Ползунок отводится назад, чтобы достичь отметки. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.


Рис. 11

Ползунок отводится назад, чтобы достичь отметки. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.

Теперь ВМС должна быть расположена в верхней части глазного дна.Затем врач освобождает ВМС, полностью потянув ползунок вниз, при этом удерживая устройство для введения в нужном положении. Потоки будут освобождены автоматически (рисунок 12). Устройство для введения следует удалить из матки. Наконец, нити, выходящие из устья шейки матки, следует обрезать до длины от 2 до 3 см. Длина нитей во влагалище должна быть записана в истории болезни пациента для дальнейшего использования.

Просмотр / печать Рисунок

Рисунок 12

Устройство для введения извлекается, а внутриматочная спираль высвобождается.Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.


Рис. 12

Устройство для введения извлекается, а внутриматочная спираль высвобождается. Перепечатано с разрешения Berlex, Inc.

Производители обеих ВМС создали практические комплекты, которые могут помочь врачам научиться устанавливать ВМС.

Побочные эффекты

После введения любого устройства следует запланировать контрольный визит после следующих менструаций, чтобы устранить любые проблемы или побочные эффекты, убедиться в отсутствии инфекции и проверить наличие струн.

Наиболее частыми побочными эффектами ВМС являются спазмы, аномальное маточное кровотечение и изгнание (Таблица 3) .4,5,7,11,12 Побочные эффекты, связанные с высвобождением гормонов ВМС, включают аменорею, угри, депрессию, вес. усиление, снижение либидо и головная боль. Сообщается, что в первый год частота отказов составляет от 1 до 2 процентов.1

Посмотреть / распечатать таблицу

ТАБЛИЦА 3

Побочные эффекты или осложнения от ВМС

9802 9802 9802 9802 9802 9802 9802 9802 9802 9802 9702 9802 9802 9702 9802 9802 9702 9802 9802 9802 9802 9802 9802 9802

70

Побочные эффекты или комп. Связь с ВМС

Спазмы

Смещенные нити 15

908

Внематочная беременность

Внедрение или фрагментация ВМС

Изгнание

Бесплодие 15

Бесплодие

Тубо-яичниковое повреждение

Перфорация матки или шейки матки

Вагинальное кровотечение с анемией или без нее

70

Внедрение или фрагментация ВМС

Спазмы

Смещенные нити

Внематочная беременность

Инфекции органов малого таза

Септицемия во время беременности

Тубо-яичниковое повреждение

9

Вазовагальная реакция (при введении)

Если нитей ВМС вообще нет, следует провести тест на беременность.Если результат отрицательный, можно аккуратно ввести в цервикальный канал цитощетку, чтобы определить местонахождение нитей. Если этот метод не дал результатов, для определения местоположения ВМС можно использовать рентгенографию или ультразвуковое исследование. Перфорация матки, которая с большей вероятностью произойдет во время введения устройства, составляет от 0,1 до 0,3 процента.11

Если результаты теста на беременность положительны, эктопическая имплантация должна быть исключена. Если нити видны и беременность наступила на ранней стадии, ВМС можно удалить, но с риском прерывания беременности.Если струны не видны, следует выполнить УЗИ, чтобы определить ВМС для удаления.

Удаление

ВМС следует удалить по истечении срока годности, когда у пациента появятся противопоказания, когда побочные эффекты не исчезнут, или по запросу пациента. Лечение дисплазии шейки матки может отличаться в зависимости от наличия ВМС. Кольпоскопия может быть выполнена, но ВМС следует удалить, если выполняется эксцизионная процедура.

ВМС удаляют, надежно зажимая нити у внешнего зева кольцевыми щипцами.Тракцию следует проводить от шейки матки. Если сопротивление обнаружено, от удаления следует отказаться до тех пор, пока не будет определено, почему ВМС не двигается. Глубоко внедренную ВМС, возможно, придется удалить гистероскопически.

SARCLISA® (изатуксимаб-irfc) | Страница не найдена

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ

SARCLISA противопоказан пациентам с тяжелой гиперчувствительностью к
изатуксимаб-irfc или к любому из его вспомогательных веществ.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Реакции, связанные с инфузией

Серьезные реакции, связанные с инфузией, в том числе опасные для жизни анафилактические
реакции, произошедшие с лечением SARCLISA. К серьезным признакам и симптомам относятся:
остановка сердца, артериальная гипертензия, гипотензия, бронхоспазм, одышка, ангионевротический отек и
припухлость.

По данным ICARIA-MM, ВСД наблюдались у 38% пациентов, получавших SARCLISA,
помалидомид и дексаметазон (Isa-Pd). Все IRR начались во время первого SARCLISA
настой и рассасываются в тот же день в 98% случаев.

В IKEMA реакции, связанные с инфузией, возникали у 46% пациентов, получавших
SARCLISA, карфилзомиб и дексаметазон (Isa-Kd).В рукаве Иса-Кд
Связанные с инфузией реакции возникали в день инфузии в 99% случаев. В
пациенты, получавшие Isa-Kd, 95% из тех, у кого возникла реакция, связанная с инфузией
испытал это во время первого цикла лечения. Все реакции, связанные с инфузией
разрешено: в тот же день в 74% эпизодов и на следующий день в 24% эпизодов.
эпизоды.

Наиболее частые симптомы (≥5%) инфузионной реакции при ИКАРИА-ММ и
IKEMA (N = 329) включала одышку, кашель, заложенность носа и тошноту. Анафилактический
реакции возникли менее чем у 1% пациентов. Чтобы снизить риск и серьезность
IRR, премедикация пациентов перед инфузией SARCLISA с ацетаминофеном,
H 2 антагонисты, дифенгидрамин или его аналог и дексаметазон.

Регулярно контролируйте жизненно важные функции в течение всей инфузии SARCLISA. Для пациентов
с реакциями степени ≥2, прервите инфузию SARCLISA и предоставьте соответствующие медицинские
управление. Для пациентов с реакциями 2 или 3 степени, если симптомы улучшаются до
степень ≤1, перезапустите инфузию SARCLISA на половине начальной скорости инфузии, с
поддерживающий уход по мере необходимости и тщательное наблюдение за пациентами.Если симптомы не повторяются
через 30 минут скорость инфузии можно увеличить до начальной, а затем
увеличивается постепенно. Если симптомы не улучшаются до степени ≤1 после
прерывание инфузии SARCLISA, сохраняется или ухудшается, несмотря на соответствующие
лекарства или требуют госпитализации, навсегда прекратить прием SARCLISA и
установить соответствующий менеджмент.Окончательно прекратите прием SARCLISA, если
возникает анафилактическая реакция или опасная для жизни (степень 4) ВСД, и возникает
соответствующее управление.

нейтропения

SARCLISA может вызвать нейтропению.

У пациентов, получавших Isa-Pd, нейтропения встречалась у 96% пациентов и степени злокачественности.
3-4 нейтропения возникла у 85% больных.Нейтропенические осложнения возникли в
30% пациентов, включая фебрильную нейтропению (12%) и нейтропенические инфекции
(25%), определяемая как инфекция с одновременной нейтропенией ≥3 степени. Самый частый
нейтропенические инфекции включали инфекции верхних дыхательных путей (10%),
нижние дыхательные пути (9%) и мочевыводящие пути (3%).

У пациентов, получавших Isa-Kd, нейтропения встречалась у 55% ​​пациентов, с
нейтропения 3-4 степени у 19% пациентов (3 степень у 18% и 4 степень у 1,7%).
Нейтропенические осложнения возникли у 2,8% пациентов, в том числе лихорадочные.
нейтропения (1,1%) и нейтропенические инфекции (1,7%).

Периодически во время лечения контролировать полный анализ клеток крови.Рассмотрим использование
антибиотиков и противовирусной профилактики во время лечения. Наблюдать за пациентами с
нейтропения при признаках инфекции. В случае нейтропении 4 степени отложите SARCLISA.
доза до восстановления числа нейтрофилов не менее 1,0 × 10 9 / л, и
обеспечьте поддерживающую терапию с факторами роста в соответствии с инструкциями учреждения.Снижение дозы SARCLISA не рекомендуется.

Вторичные первичные злокачественные новообразования

Частота вторичных первичных злокачественных новообразований увеличивается у пациентов, получавших
Схемы, содержащие SARCLISA. Общая частота вторичных первичных злокачественных новообразований
у всех пациентов, подвергшихся воздействию SARCLISA, было 3.6%.

В ИКАРИА-ММ вторичные первичные злокачественные новообразования встречались у 3,9% пациентов в
Группа Isa-Pd и 0,7% пациентов в группе Pd.

В IKEMA вторичные первичные злокачественные новообразования возникли у 7% пациентов в группе Isa-Kd.
и у 4,9% пациентов в группе Kd.

Наиболее частые (≥1%) вторичные первичные злокачественные новообразования в ICARIA-MM и IKEMA (N = 329)
включали рак кожи (4% при схемах, содержащих SARCLISA, и 1.5% с
сравнительные схемы) и солидные опухоли, кроме рака кожи (1,8% с
Схемы, содержащие SARCLISA и 1,5% со схемами сравнения). Все пациенты с
рак кожи продолжил лечение после резекции рака кожи.

Наблюдать за пациентами на предмет развития вторичных первичных злокачественных новообразований.

Помехи при лабораторных испытаниях

Вмешательство в серологическое тестирование (непрямой антиглобулин
Тест)

SARCLISA связывается с CD38 на красных кровяных тельцах (эритроцитах) и может давать ложноположительный результат.
непрямой антиглобулиновый тест (непрямой тест Кумбса).Непрямой антиглобулиновый тест
был положительным во время лечения Isa-Pd у 68% испытуемых пациентов, а во время
Лечение Иса-Кд у 63% пациентов. У пациентов с положительным непрямым
антиглобулиновый тест, переливание крови проводилось без доказательств
гемолиз. Лечение SARCLISA не повлияло на типирование ABO / RhD.

Перед первой инфузией SARCLISA проведите анализы крови и скрининговые
Пациенты, принимающие SARCLISA.Рассмотрите возможность фенотипирования перед началом SARCLISA.
лечение. Если лечение SARCLISA уже началось, сообщите об этом в банк крови.
что пациент получает SARCLISA и что SARCLISA вмешивается в кровь
Тест на совместимость может быть решен с использованием эритроцитов, обработанных дитиотреитолом. Если
требуется экстренное переливание, несовместимые ABO / RhD-совместимые эритроциты могут быть
дано в соответствии с практикой местных банков крови.

Вмешательство в электрофорез сывороточного протеина и
Иммунофиксации

SARCLISA представляет собой моноклональное антитело IgG к каппа, которое может быть случайно обнаружено на
как электрофорез белков сыворотки, так и иммунофиксации, используемые для клинических
мониторинг эндогенного М-белка. Эти помехи могут повлиять на точность
определение полного ответа у некоторых пациентов с белком каппа миеломы IgG.

Эмбриофетальная токсичность

Основываясь на механизме действия, SARCLISA может причинить вред плоду при введении
беременной женщине. SARCLISA может вызвать истощение иммунных клеток плода и снижение
плотность костной ткани. Сообщите беременным женщинам о потенциальном риске для плода. Посоветуйте сук
с репродуктивным потенциалом использовать эффективный метод контрацепции во время
лечение SARCLISA и в течение не менее 5 месяцев после последней дозы.В
Комбинация SARCLISA с помалидомидом противопоказана беременным женщинам.
потому что помалидомид может вызвать врожденные дефекты и смерть будущего ребенка. Ссылаться на
информация о назначении помалидомида по применению во время беременности.

ПОБОЧНЫЕ РЕАКЦИИ

В комбинации с помалидомидом и дексаметазоном: наиболее частое побочное действие.
реакциями (≥20%) были инфекции верхних дыхательных путей, реакции, связанные с инфузией,
пневмония и диарея.Наиболее частые гематологические лабораторные отклонения (≥80%)
снижение гемоглобина, нейтрофилов, лимфоцитов и
снижение тромбоцитов.

В комбинации с карфилзомибом и дексаметазоном: наиболее частое побочное действие.
реакциями (≥20%) были инфекции верхних дыхательных путей, реакции, связанные с инфузией,
утомляемость, гипертония, диарея, пневмония, одышка, бессонница, бронхит, кашель,
и боли в спине.Наиболее частые гематологические лабораторные отклонения (≥80%) были
снижение гемоглобина, лимфоцитов и тромбоцитов.

Серьезные побочные реакции возникли у 62% пациентов, получавших Isa-Pd. Серьезный
побочные реакции у> 5% пациентов, получавших Isa-Pd, включали пневмонию
(26%), инфекции верхних дыхательных путей (7%) и фебрильная нейтропения (7%).Фатальный
побочные реакции возникли у 11% пациентов (те, что возникли более чем у 1% пациентов).
больных пневмонией и другими инфекциями [3%]).

Серьезные побочные реакции возникли у 59% пациентов, получавших Isa-Kd. Большинство
частые серьезные побочные реакции у> 5% пациентов, получавших Isa-Kd, были
пневмония (25%) и инфекции верхних дыхательных путей (9%).Побочные реакции с
летальный исход во время лечения был зарегистрирован у 3,4% пациентов в Isa-Kd.
группа (у более чем 1% пациентов пневмония встречалась у 1,7%
сердечная недостаточность у 1,1% пациентов).

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ОСОБОМ НАСЕЛЕНИИ

Из-за возможности серьезных побочных реакций у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, от
изатуксимаб-irfc, вводимый в сочетании с Pd, кормящим женщинам не рекомендуется
кормить грудью во время лечения SARCLISA.

См. Полную информацию о предписании.

Нажмите здесь, чтобы
узнать больше о приверженности Санофи борьбе с контрафактом
наркотики.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *