Какой аппарат для электрофореза лучше: Как выбрать аппарат для гальванизации и электрофореза?

Содержание

Аппарат для электрофореза своими руками.

Электрофорез лекарственный (гальваноионотерапия) — это лечебный метод воздействия на организм постоянным током и лекарственными
веществами, вводимыми при его помощи через кожу или слизистые оболочки.

Предлагаемый аппарат для электрофореза представляет собой регулируемый стабилизатор тока (рис.1).

Аппарат содержит понижающий трансформатор Т1, двухполупериодный выпрямитель VD1 — VD4, конденсатор фильтра и токовый стабилизатор на

транзисторах VT1 — VT3. Регулировка тока при сеансе электрофореза осуществляется резистором R6, а его величину определяют

миллиамперметром РА1. На выходе вторичной обмотки трансформатора Т1 устанавливается напряжение 24 — 26 В.


Для повышения электробезопасности при пользовании электрофорезом требуется тщательное изготовление понижающего трансформатора. Так

как вторичная цепь потребляет около 300 мВт, ее толщина провода выбирается из соображений удобства ее намотки (чтобы не

оборвалась и разместилась на каркасе). Между первичной и вторичной обмотками укладывается хорошая межобмоточная изоляция — 3 — 4 слоя

лакоткани.


Корпус аппарата электрофореза лучше сделать из диэлектрика: пластмассы или дерева. На передней панели аппарата размещаются клеммы,

миллиамперметр, тумблер включения сети и переменный резистор.

Вся электронная схема электрофореза располагается на плате из фольгированного стеклотекстолита (рис.2). Монтаж осуществляется со

стороны фольги, которая разрезается на токонесущие части резаком.

После сборки, по эталонному амперметру при коротком замыкании между выходными клеммами, подбирается резистор шунта R3. Полное

отклонение стрелки прибора должно быть 5 мА.


Электродами служат две свинцовые пластинки 30 х 50 мм, толщиной 0,5 — 0,8 мм. Пластинки при процедурах вставляются в мешочки из белой

бязевой ткани.


Место наложения электродов при электрофорезе, полярность, количество лекарства и требуемая величина тока определяются

физиотерапевтом.


Транзисторы можно заменить на любые p-n-p структуры, выдерживающие напряжения 40-60 В (например КТ3107А,Б).

Партин А.

РЛ 1993/06

«Электрофорез дома».

Вверх

Обзор методов лечения артрита физиотерапией


При заболевании артритом воспаляется, в первую очередь, внутренняя суставная оболочка. Также процесс воспаления может затронуть и другие структуры: хрящ, суставную капсулу, сухожилия и связки. Поэтому при артрите, практически всегда, возникают болевые ощущения, а также нарушается и подвижность самого сустава.

Физиотерапия при артрите


Главной целью лечения артрита является сохранность функций пораженного сустава и устранение болевых ощущений. Традиционным методом снятия болевого синдрома, при лечении артрита, является применение нестероидных противовоспалительных препаратов, а одним из эффективных методов при его комплексном лечении, в соответствии со стандартом, является магнитотерапия при артрите, процедуры которой воздействуют крайне положительно на сустав. Конечно же самолечением заниматься не следует и в лечении артрита потребуется помощь специалиста. Врач назначит необходимое лечение, подобрав оптимальные для больного комплекс лечебной физкультуры и необходимые процедуры. Только выполняя все его рекомендации удастся добиться того, что боль пройдёт и поражённый сустав станет лучше справляться со своими функциями.


Главным образом, физиотерапия при артрите применяется комплексно с другими различными методами лечения, дополняя их. Но иногда, лечение артрита физиотерапией может быть и единственным методом, например, при противопоказаниях или каких-либо ограничениях в приёме лекарств.


Виды физиотерапии при артрите и его некоторых разновидностях

  • Электрофорез.
  • УВЧ (ультравысокие частоты).
  • Магнитотерапия.
  • Фонофорез.
  • Ультрафиолетовое (УФ) облучение.
  • Транскутанная электростимуляция.
  • Мануальная терапия.
  • Специальный массаж.
  • Лечебные ванны.
  • ЛФК — лечебная физкультура.
  • Парафинотерапия: ванночки и специальные аппликации.


Так как причины заболевания артритом могут быть различного происхождения, то от этого и будет зависеть выбор физиотерапевтических процедур и упражнений ЛФК.


Подагрический артрит. Хороший лечебный эффект от физиотерапии наступает при УФ-облучении: при обострении назначается УФ-облучение суставов, а в ремиссионной фазе проводится общее облучение ультрафиолетом. Представляется целесообразным комплексное применение грязелечебных ванн, вместе с использованием ультравысоких частот.


Используются также, при подагрическом артрите, и электрофорез анальгина, новокаина, ацетилсалициловой кислоты и салицилата натрия. При возникновении дегенеративных суставных изменений проводится электрофорез лидазы в растворе новокаина, гиалуронидазы или ронидазы.


У больных подагрическим артритом с суставными изменениями, носящими в основном пролиферативный характер, отличный целебный физиотерапевтический эффект даёт ультразвук, применяемый в области заболевших артритом суставов, а также в области рефлексогенных зон.


Травматический артрит. Виды процедур физиотерапии назначаются с учётом того, какой длительности период времени прошёл после получения травмы.


Как-то, в период 2…6 дня целесообразным представляется проведение физиотерапии с помощью УВЧ. В тот же период времени заболевания артритом проводится магнитотерапия с помощью специальных лечебных приборов, генерирующих различные виды переменных электромагнитных полей специальных форм, которое приводит к снижению отёка и улучшению микроциркуляции крови.


При возникновении синовита, на 5…7 день заболевания артритом, назначается фонофорез с гидрокортизоном.


На заключительном же этапе лечения артрита применяются йодобромные или сероводородные ванны, в сочетании с аппликациями озокерита, парафина или целебных грязей.


Стоит отметить, что в домашних условиях, в острый период заболевания артритом, представляется целесообразным применение сеансов хладотерапии, в сочетании, в период первых трёх дней заболевания артритом, с сеансами магнитотерапии. Далее, начиная с четвёртого дня заболевания, хладотерапия отменяется полностью и остаются только сеансы магнитотерапии.


Данный метод применим в домашних условиях и по отношению к подагрическому артриту.

Физиотерапия с карипаином в неврологии и ортопедии Алан Клиник Ижевск


Ведущими российскими и зарубежными учеными совместно с фармацевтами разработан и успешно применяется новый неоперативный метод патогенетического лечения заболеваний позвоночника и суставов – лечения причины, а не только следствия – лечение ферментными препаратами, содержащими протеолитический фермент Папаин со вспомогательной группой активных веществ.


Физиолечение с Карипаином – высокоэффективный метод лечения при хронической и начальной стадиях заболеваний опорно-двигательного аппарата, устранения контрактур и келоидных рубцов.

Физиотерапия с Карипаином применяется для лечения заболеваний:

  • дискогенный радикулит
  • межпозвонковые грыжи
  • протрузии
  • остеохондроз
  • артрит
  • артроз
  • плечелопаточный периартрит
  • неврит лицевого нерва
  • келоидные рубцы
  • контрактуры

Физиотерапия с Карипаином в комплексном лечении неврологических и ортопедических заболеваний оказывает как общее, так и местное действие:

  • противовоспалительное, рассасывающее, местноанестезирующее;
  • улучшает кровоснабжение тканей и проводимость периферических нервных волокон;
  • нормализует функциональное состояние центральной и вегетативной нервных систем;
  • улучшает кровоснабжения и обмена веществ в мозге;
  • ускоряет регенерацию поврежденных структур.

Применение физиотерапии в Центре Неврологии и Ортопедии «Алан Клиник»


Физиотерапия с Карипаином  может проводиться двумя способами: при помощи электрофореза или фонофореза.

Процедура с Карипаином при помощи электрофореза (введение препарата с помощью электрического тока низкой силы)


Раствор с препаратом наносится на фильтровальную бумагу белого цвета, размещенную на прокладках электрода. Положительный полюс с препаратом  накладывается на пораженное место, в зависимости  от этого второй – отрицательный электрод , чаще с эуфиллином ,накладывается  либо на плечи, либо на поясницу, либо на любую другую область  тела в зависимости от назначений врача. На электроды подается ток определенной силы (зависит от заболевания и назначений доктора), тем самым способствуя проникновению препарата к очагу.

Процедура с Карипаином при помощи фонофореза (введение препарата с помощью ультразвука)


Раствор Карипаина и новокаина, наш доктор наносит (шприцом) каплями на пораженную область с последующим растиранием. Затем кладется небольшой слой вазелинового масла, чтобы обеспечить нужный контакт для передачи тканям ультразвуковых колебаний.


При лечении поврежденного позвоночника наш доктор водит излучателем вдоль позвоночного столба, но не посередине, а отступив на 1,5-2 см от центральной оси по так называемым паравертебральным линиям. Ультразвуковая головка передвигается медленно при помощи круговых и продольных движений одновременно по поврежденным областям, где нанесен Карипаин, покрытый слоем вазелинового масла. Необходимое количество процедур на один курс лечения  определяет лечащий врач. 


В редких случаях возможно временное обострение основного заболевания, тогда возможен перерыв в приеме процедур на срок до 2-5 дней, с последующим продолжением курса физиотерапии. Однако не следует забывать, что процедуры должны проводиться под строгим динамическим контролем лечащего врача, только врач может принять решение о приостановке и возобновлении лечения.

кабинет в Ростове-на-Дону. Лечение физиотерапией


Физиотерапевтические методы лечения в лечебно-восстановительном комплексе клинико-диагностического центра «ДАВИНЧИ» представлены широким спектром всех факторов воздействия с использованием новейшей современной аппаратуры. Здесь работают высокопрофессиональные и опытные специалисты. Физиотерапия применяется как метод монотерапии и в комплексе с медикаментозным лечением, практикуется индивидуальный подбор лечебно-восстановительных программ.


Выбор метода лечения в физиотерапии зависит от каждого конкретного пациента и назначается только по индивидуальным показаниям, потому как особенную роль играет специфика заболевания, его стадия, возраст пациента и другие факторы.


Показания для лечения


При отсутствии противопоказаний на лечение принимаются пациенты по поводу заболеваний:

Физиотерапевтические методы лечения:


  • Лазерная терапия


    Способствует обновлению клеток, включению механизмов саморегуляции, ускорению заживления пораженных мест, предотвращению перехода болезни в хроническую стадию.


  • Магнитотерапия


    С помощью этого физиотерапевтического метода оказывается общее оздоравливающее воздействие на организм, происходит улучшение артериального давления, стабилизируется работа внутренних органов. Цена магнитотерапии приведена на странице с ценами.


  • Термотерапия


    Успокаивает, снимает боль, обладает противовоспалительным и антисептическим действием, стимулирует выработку в организме биологически активных веществ.


  • Электрофорез


    Суть метода заключается в нанесении лечебного вещества на прокладку электродов. Под воздействием электрического поля лекарство быстрее попадает в организм и лучше им усваивается. С ценой электрофореза вы можете ознакомиться на соответствующей странице.


  • Ультразвуковая терапия


    Используется в чистом виде и в виде фонофореза лекарственных веществ при  различных патологиях.


  • Фототерапия


    Лечение УФО кожных, воспалительных, простудных, неврологических заболеваний.


  • Светотерапия


    Лечение видимым светом без УФО при заболеваниях не допускающих воздействия ультрафиолета.


Приоритетное направление клинико-диагностического центра «ДАВИНЧИ» – это восстановление и поддержание здоровья у людей любого возраста с различными заболеваниями по доступной цене.


Все процедуры, и контроль за эффективностью назначенного лечения в нашем клинико-диагностическом центре осуществляются врачом-физиотерапевтом.

  • Наименование услуги

    Цена


  • Врачи по направлению


Почему стоит выбрать нас

  • ЗНАНИЯ, ОПЫТ И КВАЛИФИКАЦИЯ
    Все врачи регулярно проходят обучение в ведущих российских и зарубежных клиниках и мероприятиях
  • СОБСТВЕННАЯ ЛАБОРАТОРИЯ
    Выполнение анализов в максимально короткие сроки по доступным ценам.
  • ТЕХНИЧЕСКАЯ ОСНАЩЕННОСТЬ
    Кабинеты оснащены современным оборудованием ведущих мировых производителей
  • ПЕРВОПРОХОДЦЫ И ИННОВАТОРЫ
    Мы первыми внедряем многие современные технологии в Ростове-на-Дону. (5D УЗИ, эстетическая гинекология и анрология, фотодинамическая терапия, радиотермометрия, вакуумная аспирационная биопсия, Fotona4D)

Отзывы о нас на Флампе



Мы на карте

Отзывы об услуге

Аппарат для гальванизации и электрофореза



Необычные схемы

Электролечение — это пропускание постоянного или импульсного электрического тока через участок тела человека. Организм представляет собой электролит (проводник второго рода), поэтому под действием тока в его тканях происходит распад молекул на положительные и отрицательные ионы, то есть гальванизация.

При прохождении тока в организме человека начинаются сложные процессы, которые при правильно выбранном режиме дают лечебный эффект: нормализуется давление, улучшается кровообращение, стимулируются функции желез внутренней секреции и т.п. Гальванизацией лечат гипертонию, бронхиальную астму, гастрит, язву желудка, радикулит, атеросклероз, кожные и другие заболевания.

Помимо гальванизации, для лечения используется и электрофорез, когда с помощью электрического тока в организм человека вводятся лекарственные препараты. Получается двойная польза — лечение гальваническим током и одновременно введение лекарств непосредственно в область больного органа. Продолжительность гальванических процедур — 10.15 минут, их количество— 10…20.

Лекарственный препарат для электрофореза, место наложения электродов и режим должен назначить врач.

При установке величины тока больной ориентируется, прежде всего, на свои ощущения. При правильно выбранном токе он испытывает легкое покалывание и жжение в местах наложения электродов. При усиливающихся болях силу тока необходимо уменьшить.

Электроды лучше всего изготовить из свинца в виде гладких пластинок толщиной 0,5… 1,0 мм и площадью 150.. .200 см2. Сам прибор можно разместить в подходящем корпусе. На переднюю панель вынесены- выключатель сети, миллиамперметр, контрольная лампочка, регулятор тока, переключатель пределов миллиамперметра (5 и 50 мА) с параллельным переключением витков вторичной обмотки трансформатора и выходные клеммы. При электрофорезе между телом и электродом прокладывают сложенную в несколько слоев салфетку из байки или бязи, пропитанную лекарственным препаратом, а сверху электрода укладывают небольшой мешочек с песком для лучшего контакта с выбранным участком тела.

Детали. Т1 — силовой трансформатор мощностью 12…15 Вт. Резисторы R1, R2 — типа МЛТ, R3 — проволочный. Измерительный прибор РА1 — с пределом 5 мА. При подключении шунта RS1 предел увеличивается до 50 мА.

Для налаживания прибора вместо тела человека к электродам подключают резистор сопротивлением 500 Ом (мощностью 2 Вт) — это среднее значение сопротивления участка тела. Поворачивая ручку R3, устанавливают нужные пределы лечебного тока по РА1.

Е.Рябичко

Литература

1 Клячкин Л.М. Физиотерапия

 

Руководство по выбору оборудования для гель-электрофореза

: типы, характеристики, применение

Оборудование для гель-электрофореза, инструменты и материалы для отдельных нуклеиновых кислот или белков в зависимости от размера, электрического заряда и других физических свойств. Гель-электрофорез полезен в судебной медицине, биохимии, генетике, микробиологии и других приложениях, требующих анализа размера и характеристик молекул нуклеиновых кислот и белков. Электрофорез белков также является распространенным методом анализа плазмы крови в медицинских целях.Электрофорез часто используется как подготовительный метод перед клонированием, секвенированием ДНК, саузерн-блоттингом, полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и анализом с помощью масс-спектрометрии.

Описание процесса

Перед тем, как начать электрофорез, пользователь готовит и охлаждает жидкий гель, выливает его в лоток и прикрепляет зубчатым гребнем для разделения каждого отдельного образца. Затем к затвердевшему гелю добавляется буферная жидкость, содержащая проводящие ионы, чтобы поддерживать ток и поддерживать постоянный pH.Пользователь вводит окрашенную нуклеиновую кислоту или образец белка в гель, и источник питания пропускает через него электрический ток. Более крупные и длинные молекулы медленно перемещаются между отрицательным и положительным полюсами питания, в то время как более мелкие и короткие молекулы перемещаются быстрее. Таким образом, молекулы разного размера образуют в геле отдельные полосы, которые анализируют или сравнивают с другими кислотными цепями.

Гель действует как противоконвективная и просеивающая среда в процессе электрофореза. Как противоконвективное вещество, он подавляет тепловыделение, вызванное протеканием тока.Как сито, гель замедляет движение молекул и сохраняет окончательное разделение благодаря своей матричной структуре.

Видео ниже предоставляет общий обзор процесса гель-электрофореза, как описано выше.

Видео предоставлено: Грег Петерсон / Общественный колледж Кирквуда / CC BY-SA 4.0

Денатурирование по сравнению с исходным

Гель для электрофореза может быть денатурирующим или нативным в зависимости от предполагаемого анализа.Денатурация нарушает естественную структуру анализируемого вещества и заставляет кислоты и белки разворачиваться в простые цепочки за счет добавления химических веществ в буферный раствор. Типичными денатурирующими добавками являются мочевина для нуклеиновых кислот и додецилсульфат натрия (SDS) для белков.

Влияние SDS на белковую цепь.

Изображение предоставлено: Колледж Дэвидсон

Нативный электрофорез сохраняет естественную структуру аналита во время разделения, что позволяет проводить более сложный биомолекулярный анализ.Молекулярные комплексы остаются сгруппированными или свернутыми, поскольку они существуют в образце. Этот процесс часто бывает более сложным и непредсказуемым из-за сложности определения влияния формы и размера молекулы на ее подвижность.

Размеры

Электрофорез может быть одно- или двумерным. Одномерный электрофорез включает одно разделение, как описано выше, в то время как двумерный процесс добавляет второе разделение для классификации молекул по другому параметру. Свойства разделения молекул включают массу, изоэлектрическую точку или сложную массу в естественном состоянии.Поскольку молекулы вряд ли будут похожи по двум различным свойствам, двухмерный электрофорез обычно является более эффективным методом разделения по сравнению с одномерным.

Типы процессов

Существует несколько конкретных типов процессов электрофореза, классифицируемых по типу геля, типу разделения или типу денатурирующего детергента.

Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) — один из наиболее распространенных методов разделения нуклеиновых кислот и белков, чаще всего по массе.Как следует из названия, PAGE использует полиакриламидный гель, который идеально подходит для разделения белков, но также обеспечивает высокую разрешающую способность для небольших фрагментов ДНК.

SDS-PAGE — это обычный процесс электрофореза белков, в котором в качестве денатурирующего агента используется SDS. Его приложения включают определение молекулярной массы, идентификацию белков, определение чистоты образца, определение наличия дисульфидных связей, а также обнаружение или оценку генетического разнообразия в образце.

Изоэлектрическая фокусировка (IEF) разделяет молекулы по электрическому заряду и часто сочетается с SDS-PAGE в двухмерном процессе, включающем разделение по изоэлектрической точке с последующей массой.В процессе IEF амфолит добавляют к акриламидному гелю с иммобилизованным градиентом pH (IPG). Белки в геле IPG будут мигрировать в диапазоны pH, соответствующие их изоэлектрической точке. Двумерный IEF / SDS-PAGE используется для анализа сложных смесей белков или поведения тканей, частичной характеристики белков, сравнения различных физиологических состояний одной и той же ткани и очистки белков для дальнейшего анализа.

Типы оборудования

Комплексные системы

Полные наборы или наборы для электрофореза включают большинство расходных материалов, необходимых для процесса.Они могут включать комбинацию лотков для геля, красителей, наборов образцов и материалов для анализа. Некоторые полностью автоматизированные системы включают в себя источник питания и программное обеспечение для анализа, так что пользователю нужно только предоставить образцы аналита.

Тип процесса, такой как SDS-PAGE и IEF, и ориентация — два общих метода описания систем. Хотя PAGE и IEF представляют собой схожие процессы, в них используется разное оборудование и аксессуары. Например, системы IEF могут включать требуемый раствор амфолита или специализированное устройство для приготовления геля или образцов.

Ориентация системы может быть вертикальной или горизонтальной. Горизонтальные (также известные как планшетные) лотки имеют прямоугольную форму и идеально подходят для анализа проб большого объема. Вертикальные системы используют столбчатые гели и лотки для анализа различных небольших количеств образцов. Горизонтальные системы иногда считаются предпочтительными из-за их способности равномерно распределять тепло по всей поверхности геля. Неравномерное распределение тепла может вызвать искривление молекулярных полос, что приведет к эффекту «улыбки», как показано справа.

Компоненты

Компоненты для электрофореза часто продаются и приобретаются отдельно. Обычное оборудование включает красители, лотки, источники питания, электроды, кабели, гелевые смеси, сушилки для гелей и химические вещества, такие как денатурирующие агенты, отвердители гелей и амфолиты.

Выбор подходящего геля наиболее важен для процесса электрофореза. Гели наслоены на верхний укладывающийся гель и нижний разделяющий / разделяющий гель. Укладывающий слой имеет низкое содержание акриламида и низкий pH, в то время как разделяющий слой имеет более высокую концентрацию акриламида и более высокий pH.Различия между двумя слоями приводят к более высокому разрешению и более четким полосам для более легкого измерения.

В процессе электрофореза используются три типа гелей:

  • Гели агарозы имеют низкое разрешение, но большой диапазон разделения. Они используются при анализе фрагментов ДНК.
  • Полиакриламидные гели используются для анализа белков и мелких фрагментов ДНК.
  • Гели крахмала образованы из частично гидролизованного картофельного крахмала.Они немного более непрозрачны, чем агароза или полиакриламид, и используются для электрофореза белков.

Список литературы

Davidson College — SDS-PAGE

GE Healthcare Life Sciences — Электрофорез

Изображение кредита:

Терра Универсал | Протокол онлайн

Электрофорез в агарозном геле: оборудование и процедура — видео и стенограмма урока

Коробка для геля и источник питания

После отливки гель помещается в устройство, называемое коробкой для геля.Электроды — один положительный и один отрицательный — находятся на каждом конце гелевого бокса. Лунки всегда ориентированы дальше от положительного электрода. Это гарантирует, что молекулы ДНК в лунке должны проходить через большую часть агарозного геля, обеспечивая, таким образом, достаточно времени для разделения.

Противоположно заряженные электроды расположены на каждом конце гелевого бокса.

Воздух не является хорошим проводником электричества, поэтому мы покрываем гель буфером для электрофореза.Буфер для электрофореза представляет собой солевой раствор. Это не поваренная соль, но ионы соли могут нести электрический заряд, как и соленая вода. Соль в буфере для электрофореза замыкает цепь между положительным и отрицательным электродами.

Когда электроды гелевого бокса подключены к источнику питания, электричество проходит через электрическую цепь, заставляя отрицательно заряженные молекулы ДНК перемещаться в агарозный гель. Молекулы ДНК продолжают двигаться через агарозу к положительному электроду, пока присутствует электрический ток.Напомним, что более короткие молекулы ДНК проходят через агарозу быстрее, чем более длинные молекулы ДНК. Таким образом, электрофорез в агарозном геле разделяет различные фрагменты ДНК в зависимости от размера.

Загрузочный буфер и передняя часть красителя

Напомним, что мы используем другой вид буфера, называемый загрузочным буфером, в образцах ДНК. Загрузка буфера придает образцам ДНК цвет и плотность, поэтому их можно вставить в лунки геля.

После загрузки образцов электрический ток, подаваемый от источника питания, перемещает не только образцы ДНК через гель, но и молекулы красителя.Обратите внимание на появившиеся цветные линии. Эти линии не представляют собой фрагменты ДНК. Эти линии представляют краситель в загрузочном буфере, который использовался для визуализации образцов на этапе загрузки.

Загрузочный буфер добавляется к образцам ДНК.

Самая быстрая линия окраски обычно называется фронтом окраски. Поскольку ДНК невидима до стадии окрашивания бромистым этидием, это представляет собой вторую функцию загрузки буфера — средство отслеживания хода экспериментов по электрофорезу.Ученые используют переднюю часть красителя, чтобы гарантировать, что ДНК, которую они хотят проанализировать, случайно не оторвется от конца геля. Обычно выбирают краситель, который работает быстрее, чем фрагменты ДНК. Следовательно, пока краситель все еще виден, ДНК все еще находится в агарозном геле.

Бромид этидия и УФ-бокс

После завершения прогона геля агарозный гель можно вынуть из гелевого бокса и смочить в растворе бромистого этидия. Напомним, что бромистый этидий используется для визуализации ДНК.Молекулы бромида этидия интеркалируют или вставляют между азотистыми основаниями в молекуле ДНК.

Поскольку бромистый этидий флуоресцирует при воздействии ультрафиолетового света, гель необходимо поместить в УФ-бокс для визуализации фрагментов ДНК. Чтобы защитить себя от ультрафиолета, ученые обычно рассматривают гель через стеклянный экран или надевают защитные очки.

Обратите внимание, что все фрагменты ДНК одинакового размера выглядят в геле как одна флуоресцентная полоса. Чем больше молекул накапливается в одном и том же месте геля, тем толще и ярче полоса.

Гель помещают в УФ-бокс, чтобы можно было визуализировать фрагменты ДНК.

Краткое содержание урока

Таким образом, гель-электрофорез — это лабораторная процедура, используемая для разделения биологических молекул с помощью электрического тока. Вместе с гелевым боксом и источником питания можно использовать агарозный гель для разделения молекул ДНК по размеру. Загрузочный буфер позволяет ученым вставлять образцы ДНК в лунки агарозного геля.

После начала процедуры электрофореза краситель в загрузочном буфере образует фронт красителя, который используется для определения того, когда процедура завершена. После завершения процедуры электрофореза гель агарозы можно пропитать раствором бромида этидия для визуализации полос ДНК на УФ-боксе.

Результат обучения

По завершении этого урока вы сможете объяснить, почему и как проводится электрофорез в агарозном геле.

Что вам нужно знать

Всякий раз, когда вы изучаете белки и нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) в лаборатории, есть большая вероятность, что вы будете анализировать образцы с помощью гель-электрофореза.В конце концов, это один из самых эффективных методов, которые вы можете использовать для отделения интересующего вас белка, ДНК и РНК от смеси. В результате гель-электрофорез широко используется во многих областях наук о жизни, горнодобывающей промышленности и пищевой промышленности.

Гель-электрофорез: как это работает?

Если вы хотите разделить представляющие интерес белки или нуклеиновые кислоты с помощью этого метода, вам необходимо пропустить образцы через гелевый аппарат, который содержит катод на одном конце, анод на другом и платформу, которая удерживает пористую гелевая матрица в середине (обычно агарозный или акриламидный гель).Соответствующий буфер добавляется для создания градиента заряда при приложении электрического тока. А поскольку гель может нагреваться при нанесении заряда, буфер помогает сохранять гель в прохладном состоянии и предотвращает его перегрев.

Поскольку и белки, и нуклеиновые кислоты имеют однородный общий отрицательный заряд, эти молекулы будут естественным образом перемещаться к положительному электроду при приложении электрического тока. Поскольку более мелкие молекулы могут легко перемещаться через поры гелевой матрицы, можно ожидать, что они будут перемещаться через гелевую матрицу быстрее, чем более крупные молекулы.Когда процесс будет завершен, вы увидите несколько отличных, красивых полос белков и нуклеиновых кислот, разделенных на основе их молекулярных масс.

Горизонтальный и вертикальный электрофорез: понимание их различий

По сути, существует два основных типа гель-электрофореза, которые вы можете использовать для своих целей: горизонтальный гель-электрофорез и вертикальный гель-электрофорез. Хотя обе системы следуют схожей теории гель-электрофореза, между ними есть некоторые ключевые различия.Чем отличаются эти системы и когда следует выбирать одну из них? Давайте взглянем.

Ориентация и буферная система. Одно из ключевых различий между двумя системами — их ориентация. При горизонтальном гель-электрофорезе гелевую матрицу отливают горизонтально и погружают в непрерывно работающий буфер, в то время как при вертикальном гель-электрофорезе гель ориентирован вертикально, а буферная система является прерывистой.

Кроме того, в вертикальной гелевой системе используются две камеры — верхняя камера с катодом и нижняя камера с анодом.Обе камеры содержат электроды, создающие необходимое электрическое поле. Затем немного геля заливается между двумя установленными стеклянными пластинами, так что нижняя часть геля погружается в буфер в одной камере, а верхняя часть погружается в буфер в другой камере. При приложении электрического тока небольшое количество буфера перемещается вниз по камере через гель. Поскольку буфер протекает исключительно через гель, вы можете полностью контролировать градиенты напряжения на протяжении всего процесса разделения.Это означает, что вы можете рассчитывать на более эффективное разделение и большее разрешение при использовании системы вертикального электрофореза.

Лари. Горизонтальный гель-электрофорез использует агарозный гель, а вертикальный гель-электрофорез — акриламидный гель. Гели агарозы имеют более крупные поры (от 100 до 500 нм в диаметре), в то время как акриламидные гели имеют более мелкие поры (от 10 до 200 нм в диаметре). Акриламид нельзя использовать для горизонтального гель-электрофореза, поскольку в этом методе гель подвергается воздействию атмосферного кислорода.Как вы, возможно, знаете, присутствие кислорода ингибирует полимеризацию акриламида и препятствует образованию геля. Однако вы можете использовать акриламидный гель для вертикального гель-электрофореза, поскольку буфер протекает только через гель, а отдельные отсеки не подвергаются воздействию кислорода воздуха.

Когда использовать тот или иной метод. Горизонтальный гель-электрофорез в основном используется для разделения смесей, содержащих молекулы ДНК и РНК, а вертикальный гель-электрофорез идеально подходит для разделения белков.

Связанные блоги

Арне Тизелиус | Лабораторная медицина

Арне Тизелиус (1902-1971)

Арне Тизелиус (1902-1971)

Арне Тизелиус родился в Стокгольме, Швеция, 10 августа 1902 года. После смерти отца в 1906 году его семья переехала в Гетеборг, Швеция, где Интерес Тиселиуса к химии был вдохновлен учителем. Он продолжил изучать химию в Упсальском университете в 1921 году под руководством Теодора Сведберга. В 1924 году он получил степень магистра химии, физики и математики и стал научным сотрудником компании Dr.Лаборатория Сведберга по физической химии. Доктор Сведберг понял, что коллоиды можно разделить не только с помощью ультрацентрифуги, но и путем миграции через электрические поля в процессе, называемом электрофорезом. Хотя Тизелиус внес вклад в развитие ультрацентрифугирования, его главным интересом был электрофорез, в рамках которого он продолжил работу по электрофорезу, опубликованную его наставником. 1 Сведберг поощрял эти исследования, но сам продолжал концентрироваться на своей работе с ультрацентрифугой, что позволило Тизелиусу свободно развивать свои методы электрофореза.

Вместе со Сведбергом Тизелиус опубликовал в 1926 году статью, в которой они описали устройство для электрофореза с использованием U-образной трубки, которая позволяла мигрирующим границам белка сопровождаться поглощением ультрафиолета. 2 В своей докторской диссертации, озаглавленной «Метод подвижных границ в изучении электрофореза белков», которая была защищена и опубликована в 1930 году, 2 Тизелиус описывает усовершенствования, внесенные им в аппарат для электрофореза, которые позволили ему однажды разделять материалы. считается гомогенным, включая сыворотку. 3 Хотя он описал электрофорез искусственных смесей, включая фикоэритрин и белок Бенс-Джонса, 3 разделения не дали четких полос, поэтому полезность таких методов в то время не была ясна.

Получив степень доктора наук, Тизелиус рассмотрел варианты продолжения работы над химическими компонентами биологических материалов в перспективной области биохимии. Однако он не смог продолжить свою работу в этой области из-за отсутствия в то время академических кафедр биохимии в Швеции.Однако в Упсальском университете была должность по неорганической химии. По этой причине Тизелиус скорректировал свои исследовательские интересы, чтобы сделать его более подходящим кандидатом на должность в неорганической химии. Это привело его к работе с кристаллами цеолита, которые представляют собой микропористые алюмосиликатные минералы, обнаруженные там, где вулканические породы и слои пепла вступают в реакцию со щелочной грунтовой водой. Эти минералы образуют очень правильные структуры, которые можно использовать в качестве молекулярных сит, что позволяет разделять молекулы в первую очередь по размеру.Этот процесс адсорбции, аналогично разделению белков на основе их физических характеристик, очень похож на электрофорез. Эти исследования побудили Тизелиуса поехать в Принстонский университет в США, чтобы работать с Х.С. Тейлором над явлениями адсорбции. Он получил стипендию Фонда Рокфеллера за свои исследования в период с сентября 1934 года по август 1935 года. Именно в Принстоне Тизелиус получил поддержку от множества ученых, которые были знакомы с его ранней работой со Сведбергом.Он покинул Соединенные Штаты с планами систематического изучения источников ошибок при электрофорезе.

Адсорбция — это метод разделения белков, используемый в естественных физических, биологических и химических системах. Он используется в промышленности и науке для разделения материалов на основе их физических свойств. Обычное промышленное применение — использование активированного угля и синтетических смол для очистки воды. Распространенное некоммерческое применение — использование цеолита в рыбных мисках для буферизации загрязняющего аммиака.Адсорбция — это процесс, при котором определенные адсорбаты (материалы, которые проходят через насадочную колонку) селективно переносятся из жидкости (растворимой фазы) на поверхность нерастворимых твердых частиц для облегчения разделения материалов.

По возвращении в Швецию Тизелиус модернизировал электрофоретическую U-образную трубку и обнаружил ряд простых модификаций, которые позволили использовать более мощный электрический ток для лучшего разделения сложных белков. Чтобы продемонстрировать это улучшенное разрешение, Тиселиус получил образец сыворотки, диализовал его, используя буферный раствор, а затем пропустил его через свой прибор.В течение 2 часов сыворотка разделилась на 4 полосы, которые называются альбуминовой, альфа-, бета- и гамма-областями. Ранее были признаки этих отдельных и отличных компонентов; однако такое четкое разделение было выполнено впервые. Документ об этой основополагающей работе был отправлен в биохимический журнал, который отклонил его, потому что он был слишком «физическим». 4 Тем не менее, он появился в Transactions of the Faraday Society, 5 и получил немедленную и положительную поддержку ученых всего мира.Тизелиус продолжил свою работу с Элвином Кабатом 6 и обнаружил, что гамма-область сывороточного электрофореза полностью состоит из антител. Количественные аспекты электрофореза были позже изменены Oliver Smithies 7 с использованием концентрированных крахмалов и Hjertén 8 с использованием агаровых гелей. Использование геля агарозы, которое сегодня используется в электрофорезе, было разработано Хьертеном во время работы в лаборатории Тизелиуса. Электрофорез сегодня используется в лабораториях клинической химии для анализа сыворотки, мочи и спинномозговой жидкости для диагностики рака (например, множественной миеломы), аутоиммунных заболеваний, заболеваний почек и гемоглобинопатий, а также других приложений.

Хроматография — это разделение смесей (подвижная фаза) путем пропускания их через неподвижную фазу (например, кристаллы декстрана или цеолита) для разделения анализируемых веществ, подлежащих измерению.

Направление научных исследований изменилось во время Второй мировой войны, и эти изменения коснулись Швеции, несмотря на ее нейтральный статус во время войны. Тизелиус обратил свое внимание на хроматографию, потому что считал, что электрофорез может не обладать специфичностью для разделения многочисленных компонентов биологических материалов. 4 Поскольку хроматография использовалась не более чем для выделения ферментов, Тизелиус сосредоточился на разделении биологических материалов. В своих ранних работах по хроматографии Тизелиус использовал активированный уголь в качестве стационарной фазы. Он нашел несколько полезных приложений для этой техники, но они не оправдали его ожиданий. Во время войны его лабораторию попросили разработать средство сублимационной сушки плазмы для использования в военных целях. Эта задача подходила им, учитывая их опыт работы с белками.Шведская корпорация производителей сахара также попросила их определить причину загрязнения экстрактов свеклы. Тизелиус обнаружил, что слизистая примесь, мешающая их фильтрам, была декстраном, полисахаридом, продуцируемым Leuconostoc mesenteroides . В попытке найти реагент, который мог бы специфически реагировать на этот полисахарид, лаборатория Тизелиуса иммунизировала кроликов декстраном. Однако даже в больших дозах они не могли вызвать иммунный ответ. Два биохимика, участвовавшие в исследованиях плазмы и декстрана, поняли, что такое нереактивное вещество, как декстран, может быть полезным в качестве заменителя сыворотки.Они успешно вводили большое количество декстрана кроликам, собакам и, наконец, людям, но все же не смогли вызвать иммунную реакцию. Шведская фармацевтическая компания Pharmacia, которая только что переехала в Упсалу, в конечном итоге произвела декстран только для этого клинического применения. Его клиническое использование по сей день впечатляет. Он используется как антитромботическое (антиагрегантное) средство для снижения вязкости крови и как расширитель объема при анемии. Джеркер Порат и Пер Флодин из лаборатории Тизелиуса применили сшитый декстран для электрофореза.Поняв, что колонки связанного декстрана (сефадекса) могут действовать как хроматография на молекулярных ситах (адсорбционные колонки) без электрического тока, они смогли разделить сложные растворы в зависимости от их молекулярного размера. В 1947 году Тизелиус и Фредерик Сэнгер опубликовали статью об использовании адсорбции для разделения инсулина на 4 компонента в 1947 году. 9 В 1948 году Тизелиус получил Нобелевскую премию по химии за свои работы в области электрофореза и адсорбционного анализа, особенно за его открытие гетерогенной природы белков сыворотки.

Тиселиус сыграл активную роль в реорганизации шведских научных исследований после Второй мировой войны. Он стал председателем Шведского совета по естественным наукам (1946–1950) и председателем исследовательского комитета Шведского онкологического общества (1951–1955). Он был избран президентом Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и занимал эту должность с 1951 по 1955 год. Он стал членом Нобелевского комитета по химии в 1947 году и занимал пост президента Нобелевского фонда с 1960 по 1964 год. .

Доктор Тизелиус женился на Ингрид Маргарете в 1930 году, и у них было двое детей, Ева и Пер. Он умер в Упсале 29 октября 1971 года от сердечного приступа. Тизелиус был пионером в разработке методов электрофореза и адсорбции, используемых в прикладной и базовой химии, включая электрофоретическое разделение сыворотки, что сделало его одним из великих деятелей лабораторной медицины.

Список литературы

1

.

Измерение подвижности яичного альбумина при различной кислотности

.

Дж. Ам Хем Соц

.

1924

;

46

:

2700

. ( См. Также Svedberg T, Jette ER. Катафорез белков. J Am Chem Soc .1923; 45: 954.) 2

.

Новый метод определения подвижности белков.

.

Дж. Ам Хем Соц

.

1926

;

48

:

2272

.3

.

Метод подвижных границ исследования электрофореза белков.

.

Нет a Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis

.

1930

;

7

(серия IV):

1

.4,

.

Отражения с обеих сторон прилавка.

.

Анну Рев Биохим

.

1968

;

37

:

1

,5

.

Новый аппарат для электрофоретического анализа коллоидных смесей.

.

Труды общества Фарадея

.

1937

;

33

:

524

,6

.

Электрофорез иммунной сыворотки.

.

Наука

.

1938

;

87

:

416

,7

.

Генетический контроль некоторых белков сыворотки у нормальных людей.

.

Природа

.

1955

;

176

:

1265

,8

.

Препарат агарозных сфер для хроматографии молекул и частиц.

.

Biochim Biophys Acta

.

1964

;

79

:

393

,9

.

Нобелевские лекции по химии: 1942–1962

.

Амстердам

:

Издательская компания Эльзевир

;

1964 г.

.

© Американское общество клинических патологов

Анализ затрат и выгод системы мультикапиллярного электрофореза

Современные лаборатории геномики требуют высокой производительности, рентабельности, чувствительности обнаружения и высокого разрешения. Однако многие из этих лабораторий используют традиционные методы, требующие часов или дней утомительных процедур, которые могут привести к человеческим ошибкам для получения результатов. Кроме того, эти системы не так рентабельны, как кажутся.

Микрожидкостные, миниатюрные цифровые системы генетического анализа, программное обеспечение и расходные материалы для приложений тестирования биологических материалов от eGene Inc . (Ирвин, Калифорния) обнаруживают, количественно определяют, идентифицируют и характеризуют ДНК и РНК с высокими показателями специфичности и чувствительности, автоматизируя рутинные и нестандартные лабораторные и производственные процедуры, критически важные для безопасности, разработки, качества и производительности продукции. Генетический анализатор HDA-GT12 ™ представляет собой экономичную многоканальную систему капиллярного электрофореза для высокочувствительного обнаружения с высоким разрешением.В настольной системе используется механизм флуоресценции для обнаружения нуклеиновых кислот. Расходный многоканальный картридж с капиллярным гелем, используемый с системой, может автоматически вводить и анализировать 12 стрипов одновременно менее чем за 10 минут или 96-луночный планшет за 1 час. Систему можно легко использовать в исследовательских или промышленных лабораториях для различных видов геномного анализа.

Капиллярный электрофорез, управляемый электрическим полем, выполняется в капиллярах из плавленого кварца с узкими отверстиями и позволяет быстро разделить сотни различных соединений.Таким образом можно разделить почти все большие и малые молекулы и даже целые организмы. Методика может быть оптимизирована для многих типов разделения, особенно в ситуациях, когда другие методы разделения жидкой фазы ограничены или непрактичны.

Высокая напряженность электрического поля разделяет молекулы в зависимости от разницы в заряде, размере и гидрофобности. Конец капилляра погружают в пробирку с образцом и прикладывают давление, вакуум или напряжение. Капиллярный электрофорез имеет очень высокую эффективность, позволяя разделять сотни компонентов одновременно.Он требует минимальных количеств пробы, легко автоматизируется, может использоваться количественно и потребляет ограниченное количество реагентов.

Однако некоторые доступные в настоящее время системы капиллярного электрофореза полагаются на дорогие и неэффективные источники света, которые ограничивают миниатюризацию оптической системы обнаружения. Другие системы имеют только один капилляр, в то время как третьи обладают поликапиллярными функциями, которые дороги и сложны в эксплуатации.

Таблица 1 — Сравнительная таблица времени рабочего процесса

За счет уменьшения сложности механического / оптического выравнивания, расхода геля / буфера, времени разделения и стоимости одного цикла, eGene упростила, ускорила производственный процесс своей системы капиллярного электрофореза, и более рентабельно.Основанный на новой запатентованной системе детектирования мультиплексной флуоресценции с твердотельными источниками света и микрооптическими коллекторами, картридж, содержащий отдельные каналы разделения со встроенным химическим реагентом, и программное обеспечение, которое контролирует прибор и проверяет качество результатов, Система обеспечивает анализ с высоким разрешением с коротким временем выполнения и минимальным расходом образцов и реагентов.

Система HDA-GT12 сокращает время разделения с 2 или 3 часов до 10 минут. Это исключает трудоемкие процедуры ручной загрузки образцов, визуального осмотра, анализа данных, фотосъемки и ведения записей.Система допускает минимальное вмешательство человека, тем самым снижая вероятность человеческой ошибки (см. Таблица 1 ).

Система предоставляет несколько приложений на одной инструментальной платформе. Он объединяет загрузку образца, электрофорез и анализ данных за один этап. Автоматическая обработка образцов освобождает руки для загрузки образцов. Система снижает трудозатраты и увеличивает производительность лаборатории. Это также снижает количество ошибок при ручной обработке.

Сменный гелевый картридж системы исключает необходимость приготовления геля.Система на основе картриджей проста в использовании и эффективна. Это экономит время и увеличивает производительность.

Чувствительность обнаружения составляет всего 0,1 нг / мкл. Система HDA-GT12 предлагает быстрый анализ со средним периодом времени от 7 до 10 минут, необходимым для анализа 12 проб. Пользователи могут получить картину электрофореза с высоким разрешением для 96 образцов в течение 0,5–1,3 часа, увеличивая производительность лаборатории. Разрешение с помощью системы составляет до фрагментов ДНК длиной от 1 до 5 пар оснований. Это обеспечивает уверенность в интерпретации данных.

Доступны форматы просмотра электрофореграммы и геля. Несколько вариантов просмотра данных обеспечивают гибкость при работе с обоими типами данных. Мощные и удобные инструменты анализа собирают цифровые данные для качественного и количественного анализа. Данные просты в использовании и представлении, а инструменты упрощают анализ.

Высокая пропускная способность — главное преимущество системы, которая предлагает 4-, 8- и 12-канальные капиллярные картриджи для работы с пробами различной емкости. Результат — гибкость в пропускной способности.Компактная система помещается на лабораторном столе, экономя много места.

Был проведен анализ затрат для сравнения системы HDA-GT12 с другими типами систем электрофореза. При обычном электрофорезе в агарозном геле 12 образцов общее время, необходимое для приготовления геля, загрузки образцов, разделения, окрашивания и документирования, колеблется от 101 до 191 мин, не считая времени, необходимого для приготовления буферов. Для того же разделения 12 образцов с системой HDA-GT12 требуется 10.2 мин, как показано в Таблице 1.

Стоимость инструментов для электрофореза в пластинах в геле аналогична стоимости инструментов для системы HDA-GT12, но разница заключается в эффективности. Когда затраты на электронные прецизионные весы, микроволновую печь, блок электрофореза, источник питания, горизонтальный шейкер, систему документации геля, персональный компьютер и автоматический дозатор рассчитываются для 12 образцов, стоимость составляет 25 636 долларов США. Для установки для электрофореза на 96 образцов общая сумма еще выше. Стоимость полностью автоматизированной системы HDA-GT12 сопоставима (см. Таблица 2 ).

Таблица 2 — Стоимость обычного гель-электрофореза 12 образцов *

Затраты на рабочую силу для систем с агарозным гелем намного превышают затраты на систему HDA-GT12, поскольку время, необходимое для анализа, намного больше (101–191 мин для агарозного геля по сравнению с 10,2 мин для системы HDAGT12). Для использования системы геля агарозы необходимо приобретать многочисленные расходные материалы. Хотя стоимость одного образца составляет всего несколько долларов, можно приобрести около десятка отдельных предметов. Таким образом, стоимость одного образца с агарозным гелем составляет 3 доллара.12–5,62 доллара за 12 образцов и 1,56–2,81 доллара за 24 образца. Система HDA-GT12, для которой требуется только картридж, может разделять 12 или 24 образца по цене 0,55 доллара США за образец, включая стоимость рабочей силы.

Таким образом, система HDA-GT12 демонстрирует экономическую эффективность по сравнению с другими системами электрофореза. Предпочтительнее использовать плоские гелевые системы, которые аналогичны по цене, но гораздо менее эффективны и точны с точки зрения стоимости и расхода реагентов. Он также выгодно отличается от дорогих автоматизированных систем, которые стоят более чем в три раза дороже, но при этом обладают меньшей эффективностью.

Д-р Амирханян — исполнительный вице-президент, а д-р Лю — главный исполнительный директор, eGene Inc ., 17841 Fitch, Ирвин, Калифорния

, США; тел .: 949-250-8686; факс: 949-250-8833; электронная почта: [электронная почта защищена]. Д-р Гуттман — руководитель, а д-р Сантаи — научный сотрудник лаборатории Хорватии биоразделительных наук, Институт Инсбрука, Австрия. Лаборатория Хорватии предоставила подробный анализ сравнительных процедур электрофореза.

Гель-электрофорез | Пути с течением времени

Гели агарозы обеспечивают простой метод анализа препаратов ДНК.Молекулы ДНК имеют одинаковое соотношение заряд / масса, что придает аналогичные электрофоретические свойства линейным молекулам ДНК различной длины. Мы будем использовать термин «молекула» для обозначения линейного фрагмента ДНК, но имейте в виду, что одна «молекула» ДНК может содержать последовательности нескольких генов или частей генов.

Агарозные гели представляют собой пористые матрицы
Несколько факторов влияют на миграцию ДНК через агарозные гели
Флуоресцентные интеркалирующие агенты используются для визуализации молекул ДНК в гелях
Стандарты используются для оценки размеров молекул ДНК

Гели агарозы представляют собой пористые матрицы

Агароза — это полисахарид, очищенный от красных водорослей или морских водорослей.Агароза более очищенная (и значительно более дорогая!), Чем агар, который получают из тех же морских водорослей. Молекулы агарозы представляют собой длинные линейные полимеры повторяющегося дисахарида D-галактозы и 3,6-ангидро-α-L-галактопиранозы (справа). Типичная молекула агарозы содержит более ста субъединиц. Агароза, используемая для электрофореза, была высокоочищенной. В процессе очистки удаляются примеси, которые могут мешать работе ферментов, используемых в молекулярном клонировании, такие как эндонуклеазы рестрикции
.В процессе также генерируется препарат агарозы с желаемыми электрофоретическими свойствами и минимальной фоновой флуоресценцией, что важно для визуализации молекул ДНК.

Молекулы агарозы способны образовывать гели с относительно определенными размерами пор из-за химических свойств молекул агарозы. Агароза демонстрирует гистерезис — ее температура плавления выше, чем температура гелеобразования. Молекулы агарозы растворяются при температуре около 90 ° C, образуя беспорядочные клубки в растворе. Гели образуются при понижении температуры примерно до 40 ° C.По мере образования геля молекулы агарозы сначала собираются в спиральные волокна, которые затем объединяются, образуя сети суперспиральных спиралей, стабилизированных водородными связями. Размер пор, который обычно составляет от 50 до 200 нм, зависит от концентрации агарозы. По мере увеличения концентрации агарозы средний диаметр поры уменьшается.

Несколько факторов влияют на миграцию ДНК через агарозные гели

Из-за отрицательного заряда фосфатных остатков в основной цепи ДНК молекулы ДНК движутся к положительному полюсу (аноду) аппарата для электрофореза.Фактическая скорость миграции молекул ДНК в конкретном эксперименте зависит от множества факторов. Некоторые из этих факторов присущи молекулам ДНК, в то время как другие факторы относятся к электрофоретическим условиям. Внутренние факторы включают длину и конформацию анализируемых молекул ДНК. В пределах определенного диапазона размеров, определяемого условиями геля, скорость миграции линейных молекул ДНК обратно пропорциональна log 10 (количество пар оснований).Миграция более структурированных молекул ДНК, таких как суперспиральные плазмиды, гораздо менее предсказуема. Скорость миграции этих более структурированных ДНК зависит от плотности спиралей, наличия зазубрин и других структурных особенностей.

На скорость миграции молекул ДНК в агарозных гелях также влияет состав геля. Скорость миграции молекулы ДНК снижается по мере увеличения концентрации агарозы в геле. Исследователи обычно регулируют концентрацию агарозы, чтобы оптимизировать разрешение молекул ДНК в пределах определенного диапазона размеров.Два буфера, обычно используемые в лабораториях, TAE (трис: ацетат: EDTA) и TBE (трис: борат: EDTA), также влияют на скорость электрофореза.

Из-за этой присущей изменчивости исследователи ВСЕГДА включают ряд стандартов ДНК с известными размерами в тот же гель, что и анализируемые образцы. Важно отметить, что эти стандарты должны иметь аналогичную структуру (например, линейную или суперспиральную) и подвергаться тем же химическим модификациям, что и анализируемые образцы ДНК.

Флуоресцентные интеркалирующие агенты используются для визуализации молекул ДНК в гелях

Нуклеиновые кислоты визуализируются флуоресцентными красителями, которые прочно связываются с ДНК.Красители представляют собой интеркалирующие агенты, которые вставляются в спираль ДНК и в структурированные области одноцепочечных нуклеиновых кислот. Флуоресценция этих красителей увеличивается на порядок, когда они связывают нуклеиновые кислоты, поэтому фоновая флуоресценция на агарозных гелях обычно низкая. В этом классе мы будем использовать бромид этидия (EtBr) для визуализации фрагментов ДНК. EtBr поглощает свет в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне и излучает оранжевый свет. Гели просматривают с помощью специальных трансиллюминаторов, содержащих УФ-свет.EtBr — это светочувствительное соединение, поэтому запасы хранятся в темноте.

Стандарты используются для оценки размеров молекул ДНК

На рисунке справа показана полоса от окрашенного EtBr 1% агарозного геля, содержащего стандарты размера ДНК. Лестница размером 1 кб, показанная в этом студенческом геле, представляет собой запатентованную смесь линейных фрагментов ДНК размером от 0,5 до 10 килобаз (кб). Интенсивность окрашивания полос на агарозных гелях отражает количество ДНК в полосе, поскольку EtBr интеркалирует довольно равномерно по длине линейных молекул ДНК.Как вы можете видеть, эта конкретная смесь содержит одинаковые количества каждого фрагмента ДНК, за исключением фрагмента размером 3 т.п.н., который имеет на ~ 2,5 больше ДНК, чем другие фрагменты. Более высокая интенсивность фрагмента размером 3 т.п.н. служит полезным маркером ориентации в ситуациях, когда более мелкие фрагменты могли выходить за пределы геля или когда некоторые маркеры плохо отделяются друг от друга. (Это обычное дело!)

Обратите внимание, что самые короткие молекулы на геле лучше отделены друг от друга, чем более длинные молекулы.Продукты ПЦР, которые вы будете анализировать в этой лаборатории, в основном находятся в диапазоне 400–1000 пар оснований. Чтобы увеличить разрешение этих молекул, мы будем использовать 1,25% гели агарозы. (Это снизит разрешение более крупных молекул ДНК). Также обратите внимание, что меньшие полосы кажутся более размытыми на окрашенном геле, потому что они больше подвержены влиянию случайной диффузии, поскольку они мигрировали через сеть полимеров агарозы.

Вернуться к началу

Модуль электрофореза

Модуль электрофореза

Кэрол Беннетт и Брайан Хардкасл

Лето 1995 г.

Введение

Обоснование модуля

учителя по всей стране выразили готовность
участвовать в реструктуризации естественнонаучного образования.Уже много лет
научное сообщество попросило нацию задуматься о
потребность в ученых и научно-грамотных гражданах в нашем
мир, управляемый технологиями. Сочетание меняющихся требований
в нашем обществе и новые взгляды на преподавание и обучение
привлек широкий круг заинтересованных сторон в сфере образования (педагогов,
родители, общественные и бизнес-лидеры) к реализации
что мы должны реформировать нашу систему образования.

Образование должно воспитывать у студентов врожденное любопытство, желание
учиться и позволять им исследовать и понимать сложный
взаимодействия в окружающем мире.Знание концепций
и методы науки необходимы для подготовки студентов к полному
участие в нашем разнообразном современном обществе. Научный
грамотность является национальной целью, как указано в проекте Project 2061,
Наука для всех американцев
и Америка 2000 .

Как указано в 1992 г. Национальными учителями естествознания.
Текст ассоциации, The Content Core , типичный для США.
научная программа препятствует настоящему обучению не только
чрезмерный акцент на фактах, но по самой своей структуре, которая препятствует
студентов от установления ценных связей между фактами.Самый
научные программы в средних школах США организованы в
то, что обычно называют «слоеным пирогом». Ясно, что как
Как передает НГТА, настало время образовательного здания
факты и слоеный пирог нужно разобрать. Акцент на фактах
механического заучивания и трудностей, с которыми студенты сталкиваются в
схватив теоретические соображения без знания
опыт удерживает многих от продолжения в науке.

Вашингтонский государственный университет (WSU) при поддержке
Национальный научный фонд разработал Институт
Естественнонаучное и математическое образование через инженерное дело
Опыт.Цель которого — пригласить к сотрудничеству
учителя средней школы в области инженерии. Работая с
профессора и аспиранты преподавателей WSU получат
понимание и оценка области инженерии, в то время как
формулировка занятий для класса, иллюстрирующих
связь между разработкой и реальным применением. Этот
проект согласовывается с текущими усилиями по увеличению
естественнонаучная и математическая грамотность по всей территории Соединенных Штатов.

Представленный модуль является результатом работы, проделанной в области химии.
инженер в Университете штата Вашингтон с доктором Корнелиусом
Айвори и доктор Кван Хи Ким. Проект ориентирован на биохимические
разделения с использованием электрофореза в агарозном и полиакриламидном геле.
Основные области применения — биологические и биохимические.
исследования, химия белков, фармакология, судебная медицина,
клинические исследования, ветеринария, а также контроль пищевых продуктов
как молекулярная биология.

Биотехнологии

Биотехнология — это применение данных и методов
техника и технологии для изучения и решения проблем
относительно живых организмов. Одна область, которая приобретает много
признание — идентификация неизвестных белков с помощью различных
молекулярные свойства. В большинстве случаев молекулы различаются
относительно размера, веса, конфигурации или чистого электрического заряда.
Электрофорез, гель-фильтрационная хроматография и тонкослойная
хроматография (ТСХ) — это методы, которые работают, используя преимущества
тонких различий в этих свойствах.

Электрофорез

Электрофорез — это процесс измерения миграции
ионы в электрическом поле. Это достигается путем размещения пары
электродов в водном растворе белка или аминокислоты.
Один из типов электрофоретического разделения называется изоэлектрическим.
фокусировка или ИЭФ. Изоэлектрическая фокусировка происходит в pH
градиент и может использоваться только для амфотерных веществ, таких как
пептиды и белки. PH, при котором аминокислота имеет чистую
нулевой заряд называется изоэлектрической точкой .Этот pH равен
учитывая символ pI. В этой ячейке анионы мигрируют в сторону
анод, а катионы мигрируют к катоду. На его изоэлектрической
точка, аминокислота не перемещается ни к одному из электродов в
ячейка для электрофореза. Изоэлектрическая точка данной аминокислоты
кислота — физическая константа.

Тип электрофоретического разделения, продемонстрированный в
модуль называется зонным электрофорезом. В этом процессе
гомогенная буферная система используется в течение всего времени разделения
и диапазон, обеспечивающий постоянное значение pH.Расстояние
покрыты в течение определенного срока, являются мерой
электрофоретическая подвижность различных веществ.

Понимание кислотно-основного поведения аминокислот и
также белков, важен по двум причинам. Во-первых, это помогает
нам, чтобы понять растворимость этих молекул как функцию
pH. Хотя аминокислоты обычно хорошо растворяются в воде,
растворимость минимальна в изоэлектрической точке. Кристаллизовать
аминокислота или белок, pH водного раствора составляет
доводится до pI, и вещество осаждается, фильтруется,
и собрал.Этот процесс известен как изоэлектрический.
осадки. Во-вторых, знание изоэлектрических точек позволяет нам
прогнозировать, каким образом компоненты смесей аминокислот или
белки мигрируют в электрическом поле.

Электрофоретическое разделение можно проводить с использованием различных
сред. При бумажном электрофорезе бумажная полоска, пропитанная
с водным буфером заданного pH служит мостиком
между двумя электродными камерами. Образец аминокислоты или
белок наносится как пятно.Когда электрический потенциал
наносится на электродные камеры, аминокислота или белок
молекулы мигрируют к электроду, несущему противоположный
плата. Молекулы с высокой плотностью заряда движутся быстрее
чем с низкой плотностью заряда. Любая молекула уже в
изоэлектрическая точка остается в начале координат. После расставания
готово, полоска просушена. В случае бумаги
электрофорез, бумага опрыскивается красителем, чтобы
отдельные компоненты видны.Краситель, наиболее часто используемый для
аминокислоты — нингидрин.

Электрофоретическое разделение можно также проводить с использованием крахмала,
агар, некоторые пластмассы и ацетат целлюлозы в качестве твердых носителей.
Этот метод чрезвычайно важен в биохимических исследованиях,
а также бесценный инструмент в клинической химии.
лаборатория. В 1949 году Линус Полинг сделал открытие, открывшее
путь к пониманию серповидноклеточной анемии в
молекулярный уровень. Он заметил, что существует значительный
разница между нормальным взрослым гемоглобином (Hb A) и серповидно-клеточным
гемоглобин (Hb S).При pH 6,9 Hb A имеет чистый отрицательный заряд и
Hb S имеет чистый положительный заряд и при электрофорезе при этом pH
Hb A движется к положительному электроду, а Hb S — к положительному электроду.
отрицательный электрод.

Секвенирование ДНК или считывание последовательности оснований ДНК вдоль
его длина, теперь может быть достигнута. При секвенировании ДНК
радиоактивная метка добавляется к одноцепочечной ДНК. ДНК
разделены на четыре группы, которые подвергаются разным химическим воздействиям.
лечения.Химическая обработка разбивает ДНК на части
что при разделении показывает положение баз на
оригинальная прядь. Кусочки ДНК разделяются утилизацией
электрофоретических методик.

ДНК-дактилоскопия набирает популярность во время последнего
три года. Снятие отпечатков пальцев ДНК использует тот факт, что
большие части человеческого генома состоят из повторяющихся
последовательности различной длины, не кодирующие белки.

Дактилоскопия ДНК работает путем взятия небольшого образца ДНК человека
который был разрезан рестрикционным ферментом. Результирующий
фрагменты разделяются по размеру в процессе
электрофорез. Полосы, полученные при использовании электрофореза
затем сравниваются и измеряются с любым другим человеком в
мир.

Голы

Общие цели

Первая цель этого модуля — предоставить студентам
серия развивающих занятий, которые дадут им опыт
при разделении различных растворов с помощью электрофореза.Вторая цель модуля — предоставить студентам
практика в применении информации в реальном мире
настройка, генерация и анализ данных, синтез и
разработка альтернативного протокола, а также группового и самостоятельного
оценка исследовательского опыта.

Цели обучения учащихся

К концу этого модуля студенты должны уметь:

  1. Используйте микропипетку и измеряйте объемы в
    микролитры.
  2. Установите аппарат, который будет разделять раствор на
    электрофорез.
  3. График и прогноз молекулярной массы неизвестного
    белки / аминокислоты или наоборот, используя график
    программа.
  4. Анализировать образцы белков / аминокислот в зависимости от заряда и
    миграция, пройденное расстояние и молекулярный вес с использованием
    гель-электрофорез.
  5. Сравните и сопоставьте использование хроматографии и
    электрофорез как метод разделения
    вещества.

Брайан Хардкасл
Средняя школа Ривер-Ридж,
8929 Martin Way E.
Лэйси, Вашингтон 98516
(360) 493-9604

Кэрол Беннет
Средняя школа Gaither High School
16200 N. Dale Mabry Hwy
Тампа, Флорида 33618
(813) 975-7340


Гель-электрофорез

Абстрактные

Электрофорез применяется в биологии, биохимии.
исследования, химия белков, фармакология, судебная медицина,
клинические исследования, ветеринария и качество пищевых продуктов
контроль.Арне Тизелиус получил Нобелевскую премию в 1948 году за
разработка этой техники подвижных граничных систем для
разделение электрофорезом в 1939 г.

Под действием электрического поля заряженные частицы
мигрируют к противоположно заряженному электроду. Из-за различных
заряд и масса разных молекул движутся с разной скоростью и
разделены на фракции. Подвижность — характеристика
параметра каждой заряженной молекулы и зависит от pK
стоимость заряженной группы и ее размер.На него влияет
тип молекулы, концентрация, pH раствора, температура
и напряженность поля, а также характер материала поддержки
во время электрофореза. Буферы используются для обеспечения постоянного
pH. Буферные ионы переносятся так же, как и другие ионы, поэтому
буферные концентрации относительно велики по сравнению с
материалы разделены. т.е. буферы могут быть 0,1 М, тогда как только 10 мкг
белок используется. Поскольку относительная подвижность каждого вещества
зависит от многих переменных, расстояние миграции равно
по сравнению со стандартом, который используется в том же экспериментальном
бег.

В настоящее время в качестве поддерживающей среды чаще всего используются гели.
для электрофореза, хотя целлюлозные волокна или тонкие слои
кремнезем. Их можно использовать в тонких капиллярных трубках.
или в виде пленки на стеклянных или пластиковых пластинах. Есть три основных
видов гель-электрофореза:

  • Зональный электрофорез с использованием гомогенного буфера.
    Пройденное расстояние полностью зависит от молекулярной
    мобильность.Этот модуль демонстрирует этот медицинский сканер, который может
    отдельные красители, белки или пептиды, ДНК.
  • Изотахофорез (ИТП) с использованием прерывистого буфера
    система. Ионизированный образец перемещается между
    «быстрый» лидирующий электролит и
    «медленный» завершающий. Этот метод используется в
    количественный анализ и не будет рассматриваться в данном
    модуль.
  • Изоэлектрическая фокусировка с использованием градиента pH.Этот
    метод используется только для амфотерных веществ, таких как
    пептиды и белки. Молекулы движутся навстречу
    электроды, пока они не достигнут части градиента pH
    где их чистый заряд равен нулю. Это изоэлектрический
    точки, и электрическое поле больше не влияет на
    молекула. Этот метод чаще всего используется в
    качественный анализ для разделения смесей веществ.

Этот модуль включает несколько экспериментов с использованием зонного геля.
электрофорез.

  • Используется 1% агарозный гель из-за его простоты
    препарата и нетоксичных характеристик. Гели агарозы
    может разделять молекулы размером более 10 нм. размер пор в
    эти гели имеют диапазон от 150 нм при 1% до 500 нм при 0,16%.
    Изменение размера пор позволяет разделить больший диапазон
    молекулярного размера. Поскольку агароза мутнеет в
    растворы> 1% обычно используется только при разделении
    белков с высоким молекулярным весом в исследованиях или
    коммерческие приложения.Этот модуль знакомит с гелем
    сначала электрофорез с агарозными гелями и красителями, потому что
    его большей простоты приготовления, а затем приводит к большему количеству
    сложный материал с использованием полиакриламидных гелей.
  • Разделители полиакриламидного геля, разработанные Raymond &
    Вайнтрауб в 1959 г. разрешил больший контроль размера пор за счет
    варьируя как сшивающий агент между
    акриламидные цепи и варьируя соотношение катализатора.Акриламид в больших количествах: сшивающий агент производит
    меньшие размеры пор и лучшее разделение
    молекулы меньшего размера. Меньший размер пор также дает
    более резкие полосы молекул внутри геля. Полиакриламид
    гели имеют преимущество использования тонких гелей, которые позволяют
    более быстрое разделение, более четкие полосы, более быстрое окрашивание
    после отделения и лучшая эффективность окрашивания. Тем не мение,
    одно из возможных соображений, используемых в школах, заключается в том, что
    акриламид указан как нейтотоксин и, следовательно, должен быть
    бережно обрабатывается инструктором, который делает инвентарь
    препараты.

ССЫЛКИ:

Hames, B. D., & Rickwood, D. Editors. лари
Электрофорез белка; Практический подход
. 2-е изд.,
IRL Press, NY, 1990.

Вестермайер, Реймер, Электрофорез в практике , VCH
Publishers, Inc., Нью-Йорк, 1993.

Schultz, B. & Hutchinson, N. Фред Хатчинсон Рак
Исследовательский центр, SEP Dye Tchr WN, сентябрь 1994 г.

Классная среда: химия средней школы, обычная или
продвинутый

Размер группы зависит от активности, как указано в каждом разделе.

Обучающая стратегия

Представляем установку с использованием электролиза хлорида меди (II).
Студенты должны работать в парах или поодиночке, так как это оборудование очень
недорого. Ион меди + перемещается к катодному электроду и
видно. Ионы хлорида перемещаются к аноду и хлору.
можно почувствовать запах. Предложите учащимся решить задачу о том, как ионы могут быть
замедлился (с гелем). Перейти к концепции
электрофорез с использованием гелей.Выявить студенческие прогнозы, о которых
типы молекул будут перемещаться быстрее.

Перейти к приготовлению геля и электрофорезу с использованием красителей.
Студенты достаточно хорошо владеют этой техникой, чтобы работать с ней.
полиакриламидные гели. Деятельность с использованием микропипетки может быть
вводили перед активностью геля с красителями или с белками.
Студентам не обязательно использовать микропипетки с красителем.

Временной интервал:

Четыре 50-минутных урока с учетом предшествующей практики с
микропипец, если деятельность прекращается электрофорезом красителя

День 1 — Знакомство с концепцией электрофореза через
электролиз.

День 2 — Продемонстрируйте технику наливания геля. Студенты
приготовьте агарозные растворы и разлейте гель на помеченные чашки.
(Если время ограничено, приготовьте агарозу и согрейте в горячем
водяная баня на плите.)

День 3 — Студенты устанавливают коробки с гелем, добавляют буфер, загружают
лунки, проведите электрофорез и запишите результаты.

День 4 — Учащиеся сравнивают результаты и оценивают информацию.Обсудите вопросы анализа, возникшие в ходе эксперимента.

День 5 — (Необязательно) Симуляция класса для использования данных
для определения молекулярной массы белков

Школы, продолжающие занятия с использованием полиакриламида
гели и белки или ДНК относятся к временным рамкам в этом модуле
раздел.


Введение в движение ионов в растворе,
Электролиз

Абстрактные

Когда через раствор пропускают электрический ток
содержащих ионы (заряженные атомы), происходит электролиз.Эти ионы
перемещаются к электродам и либо теряют электроны, либо получают
электроны становятся нейтральными.

Материалы

0,2 ​​M CuCl 2 , лист ацетата, аппарат для электролиза,
2 карандаша, аккумулятор на 9 вольт, зажим для аккумулятора и провод с изображением аллигатора
зажимы на концах.

Протокол

  1. Добыть материалы и собрать электролизный аппарат.
    1. Прикрепите фиксатор к аккумулятору.
    2. Подсоедините зажимы типа «крокодил» к одному концу каждого
      карандаш так, чтобы зажим касался
      графитовая точка, а не дерево.
  2. Налейте небольшую лужицу (около 1-1 1/2 дюйма) меди (II)
    хлорид на ацетатном листе.
  3. Вставьте электроды-карандаши в раствор, как показано на рисунке.
    как можно дальше друг от друга. Убедитесь, что графитовые точки
    в растворе.
    (Если острие карандаша сломалось, высушите и
    заточите.)
  4. Обратите внимание на любые изменения, происходящие на катоде. (-
    заряжен, черный провод) Ищите красноватые, коричневые отложения на
    один электрод.
  5. Обратите внимание на любые изменения, происходящие рядом с анодом. (+ заряжено,
    красный провод) ВНИМАТЕЛЬНО почувствуйте запах газа, выделяемого
    направляя пары к носу, и осторожно вдохните.
  6. Как только сделаете наблюдения, остановите электролиз.
    вынув электроды из жидкости.
  7. Промойте электроды и вытрите их, прежде чем возвращаться к
    складской площади.
  8. Смойте раствор хлорида меди в канализацию и просушите
    ацетат.

Аналитический вопрос

  1. Какое вещество представляет собой красновато-коричневый налет на
    катод?
  2. Почему ион Cu 2+ попал на этот электрод?
  3. Какое вещество вышло на аноде? Какой ион
    ездил на этом электроде?

добавочный номер

  1. Молекулы белка заряжаются в кислой или основной
    решения.Если белок становится + заряженным, что
    электрод будет ли он двигаться? Что, если это станет —
    вместо этого взимает плату?
  2. Ионы, такие как Cu 2+ и Cl 1- путешествуют
    очень быстро к электродам. Как бы скорость
    белки с молекулярной массой в тысячи сравнивают
    с ионом меди (II) и ионом хлорида?
  3. Ученые могут разделять белки аналогичным методом
    называется электрофорезом, потому что более тяжелые молекулы движутся
    медленнее и преодолевайте меньшее расстояние в заданном
    время.Метод, называемый «гель-электрофорезом».
    использует гелевую матрицу из длинных запутанных молекул. Это делает
    более крупным молекулам еще труднее путешествовать
    и помогает разделению. Следующим вашим занятием будет гель
    электрофорез. Посмотрите ссылку и посмотрите, как ДНК
    молекулы разделены.

ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ПО ПРАКТИКЕ MICROPIPET

Абстрактные

Большинство разделений белков происходит в очень мелком масштабе и используют
микроколичество жидкостей.Это требует от вас манипулирования
портативный инструмент, называемый микропипеткой. Эта деятельность будет
ознакомит вас с их использованием и даст быстрый способ
проиллюстрируйте, правильно ли вы их используете.

Материалы:

Комплект с пеноблоком для пластиковых микроцентрифужных пробирок красного цвета,
зеленый, синий и желтый пищевые красители, 4 пустые микроцентрифужные пробирки, пипетка
наконечники, фильтровальная бумага, микропипетка

Протокол:

  1. Использование микропипетки
    1. Установка объема
      1. Посмотрите на микропипетку, чтобы определить
        диапазон громкости, 0.5 мкл — 10 мкл или 2 мкл — 20
        uL
      2. Узнайте у своего инструктора, если это
        пипетка имеет настройку блокировки громкости. Если так,
        отпустите фиксатор, как показано.
      3. Поверните ручку управления, чтобы выбрать
        необходимый объем. ДВОЙНАЯ ПРОВЕРКА.
    2. Присоедините наконечник пипетки.
    3. Держите пипетку большим пальцем на кнопке разблокировки.
      и в вертикальном положении. НИКОГДА НЕ НАЛИВАЙТЕ ЖИДКОСТЬ
      БЕЗ НАКОНЕЧНИКА НА ПИПЕТКУ. НИКОГДА НЕ ЛАЙТ
      НАКОНЕЧНИК ДОБАВИТЬ ЖИДКОСТЬ.
    4. Заполнение:
      1. Нажмите кнопку управления до первый
        останавливаться.
      2. Погрузите наконечник дозатора на 2 мм в
        жидкость.
      3. Дайте кнопке управления скользить назад медленно .
      4. Выдвиньте наконечник по внутренней стороне
        контейнер.
      5. Удалите любые внешние капли с наконечника.
        тканью без ворса.
    5. Дозирование
      1. Огромный наконечник в жидкость.
      2. Медленно нажмите кнопку управления полностью
        для активации функции продувки.
    6. Извлечь наконечник.
  2. Попрактикуйтесь в использовании пипетки с пробами воды, чтобы
    комфортно с ощущением остановки кнопки управления.
  3. Формирование четырех новых цветов:
    1. Поместите 3 мкл образца основных цветов красителя (красный,
      зеленый, синий и желтый) на фильтровальной бумаге и
      отметьте пятна карандашом.
    2. Используйте приведенную ниже таблицу, чтобы смешать требуемый мл
      основные цвета в правильной чистой пустой микропробирке.

      Красный Зеленый Синий Желтый
      бирюзовый 5 мкл 15 мкл
      Роза 15 мкл 5 мкл
      Оранжевый 6 мкл 14 мкл
      Шартрез 2 мкл 18 мкл
    3. Смешайте все красители в одну каплю на дне
      каждой микропробирки.(Используйте вихревой миксер или очистите
      пластиковая зубочистка)
    4. Поместите образец смешанных цветов объемом 3 мкл на
      тот же кусок фильтровальной бумаги, на который вы положили
      основные цвета.
  4. Очистить.
    1. Промойте микроцентрифужную пробирку смесью
      цвета
      (бирюзовый, розовый, оранжевый и
      шартрез) дистиллированной водой.
    2. Заменить чистые пробирки в комплекте для следующей группы.
    3. Очистить территорию.
    4. Замените микропипетку, как показано. По вашему
      инструктор.
  5. Прикрепите фильтровальную бумагу к листу бумаги с помощью
    имя и дата выставления оценок.

Вопросы для анализа:

  1. Сравните размеры пятен на фильтровальной бумаге.В
    размеры пятен должны быть одинаковыми, если ваша техника
    верно.
  2. Сравните цвета, производимые для бирюзового, розового, оранжевого и
    шартрез со стандартом. Это также указывает на вашу
    способность следовать указаниям и обращаться с микропипеткой
    правильно.

Как сделать гелевую пластину

Абстрактные

Электрофорез включает заряженные молекулы, движущиеся в геле.
матрица запутанных молекул.В этом случае гель представляет собой агарозный гель.
производное от водорослей. Подготовьте гель, отмерив количество
твердого вещества и добавление его в буферный раствор. После нагрева до
растворить твердое вещество, необходимое для наливания горячей жидкости в стакан
планшет, а затем сформируйте в геле небольшие прорези, называемые лунками. Гель
затвердеет и может быть использован завтра.

Материалы

Весы

Сантиграммы, весы для лодок или бумаги, порошок агарозы, 1X
Буфер TAE, градуировка, микроволновая печь или электрическая плита, горячие перчатки, стакан
стержень для перемешивания, стакан или колба 125 мл, защитные очки, 5 «x 5»
стеклянный планшет, гребешок для формирования лунок, небольшое количество буфера

Протокол

  1. Добавить 0.50 г твердого порошка агарозы на 50 мл буфера в химическом стакане
    или колбу.
  2. Нагрейте до растворения всех частиц — около 30 сек.
    до 1 минуты после закипания раствора удалить все
    газ. (Используйте плиту или микроволновую печь.) При использовании микроволновой печи
    нагревайте сначала 45 секунд, затем нагревайте с шагом 10 секунд
    во избежание закипания жидкости.
  3. Держите колбу на водяной бане 60 o C до готовности.
    для использования.
  4. Этикетка на нижней стороне стеклянной пластины для идентификации. Место
    стеклянная пластина на ровной поверхности этикеткой вниз.
  5. Используя стеклянную палочку для перемешивания в качестве направляющей, осторожно налейте горячий
    раствор агарозы вниз стержнем так, чтобы гель располагался
    сначала по внешним краям. Заполните центр в последнюю очередь. В
    гель на краю остывает первым, а поверхностное натяжение позволяет
    больше геля в середине. Если вы не будете осторожны, гель
    будет стекать стекло.Если вы попали в аварию, позвольте
    немного остудить и соскоблить. Поместите гель обратно в стакан.
    и повторно нагреть.
  6. Немедленно поместите гребешок в гель примерно на полпути от
    один конец. Используйте диаграмму на листе отделения красителя как
    руководство.
  7. Дайте гелю застыть 10 мин. Добавьте несколько мл буфера на
    поверхность затвердевшего геля и аккуратно снимите гребешок с одного
    стороной вперед и держите гребень под наклоном.
  8. Хранить в контейнере или сумке Ziploc для использования завтра в качестве
    направлен.

Разделение молекул красителя с помощью геля
Электрофорез

Аннотация:

В этом мероприятии несколько биологических красителей будут помещены в гель.
лунки и разделены с помощью гель-электрофореза. Красители
заряжен и будет двигаться либо к катоду, либо к аноду на
разные скорости. Таким образом, смесь красителей можно идентифицировать, если
по сравнению с образцами окраски отдельных красителей.

Материалы: на группу 4

901 линейка 12 мм

бокс для электрофореза блок питания (делится на 2 группы)
Планшет с 1% агарозным гелем, приготовленный вчера 200 мл 1X буфера TAE
маркер и лист ацетата промокательная бумага
pH-бумага
образцов красителя пластиковая пленка
Наконечники для микропипеток и микропипетки или микропипетки Beral
пипетка
А.Образцы красителя для прогона ИЛИ B. Образцы красителей для испытаний
1. бромфеноловый синий 1. бромкрезоловый зеленый
2. метиленовый синий 2. кристально-фиолетовый
3. Оранжевый G 3.флуороцен
4. красный пищевой краситель 4. краситель пищевой красный
5. синий пищевой краситель 5. синий пищевой краситель
6. зеленый пищевой краситель 6. зеленый пищевой краситель
7. желтый пищевой краситель 7.желтый пищевой краситель
8. смесь красителей или натуральный краситель 8. смесь красителей или натуральный краситель

Протокол

  1. Установите аппарат для электрофореза рядом с источником питания, как
    показывает инструктор.

    1. Измерьте pH буфера TAE
    2. Добавить 1X TAE буфер в буферные лунки
  2. Получите приготовленный гель.Осторожно выдвиньте его из
    Сумку Ziploc и поместите на место в
    аппарат для электрофореза, предложенный вашим
    инструктор.
  3. Получите образцы красителей
    1. Получите образцы красителей для вашей группы с помощью пипетки 20
      мкл каждого красителя из класса, поставляемого в
      маркированная соответствующим образом микропробирка. Это от 15 мкл до
      нагрузка в колодец плюс немного доп.
    2. Использование микропипетки со специальным наконечником для загрузки или
      микропипеткой Beral добавьте небольшие образцы (около 15
      мкл) в каждую прорезь геля.
    3. В таблице данных внимательно запишите, какой краситель
      в каком слоте.
    4. Если у вас есть коммерческий электрофорез
      аппарата, переходите к шагу 5.
      Если у вас некоммерческий аппарат, сделайте
      следующего:

      1. Положите два бумажных полотенца толщиной так, чтобы
        этот один конец задрапирован на краю
        гель, а другой погружается в
        буфер хорошо.Это сделает электрический
        связь между ними. Повторите на
        другая сторона геля. См. Диаграмму ниже
      2. Дважды проверьте буферный раствор, чтобы
        уверен, что расстояние очень мало
        (менее 2 дюймов) между верхом
        поверхность раствора и пластина геля.
        При необходимости добавьте еще раствора.

    5. Когда все образцы загружены, закройте крышку на
      коробку с гелем или используйте пластину из оргстекла, поставляемую в качестве
      крышка.
    6. Студенческие группы поделятся источниками питания. Соединять
      электроды к гелевой коробке и силовой
      питание, соединяющее красный к + и черный к -. Перемена
      на блоке питания и выставил его на 100 вольт.Проверять
      выход в миллиамперах. Электрофорез 10 мин.
      общий.
    7. Наблюдать и записывать изменения положения красителя в
      гель через 5 минут в вашем техническом паспорте.
    8. Примерно через 10 минут отключает питание. Отключите
      электроды
      и откройте коробку с гелем.

      1. Измерьте pH буфера на каждом конце
        коробки.
      2. Извлеките гелевую деку и гель.Поместите их
        на лабораторном столе на полиэтиленовой пленке,
        стирание лишнего буфера.
      3. Запишите свои наблюдения в свои данные
        стол.
    9. Сделайте постоянный учет своего геля, выполнив
      ONE из следующих.

      1. Поместите кусок ацетатного листа поверх
        гель.Используя перманентный маркер,
        отметьте лунки и каждое пятно краски. Примечание
        + и — заканчиваются.
      2. Положите лист промокательной бумаги поверх
        гель и нажмите прямо вниз примерно на 5
        сек. Краситель перейдет из геля в
        промокательная бумага.
    10. Поместите гель в пластиковый пакет Ziploc, чтобы
      сушка.
    11. Измерьте расстояние, на котором каждый образец красителя
      ездил на геле. Вы можете использовать ацетат
      лист или гель для этого. Измерьте в мм от
      нижний край лунки до центра красителя
      пятно, место. Запишите данные.
    12. Замените оборудование, как указано. Не выбрасывайте
      буфер. Поместите в контейнер с надписью «Б / У
      буфер »для повторного использования в следующем периоде.


Отчет лаборатории красителей для гель-электрофореза

Имя ________________________
Аккуратно запишите все данные чернилами.

Образец № Краситель Расстояние
Поехали
(мм)
на который
полюс
(+ или -)
Наблюдения
1
2
3
4
5
6
7
8
Данные pH Черный конец (-) Красный конец (+)
pH перед прогоном геля
pH после прогона геля

Аналитические вопросы

  1. Запишите наблюдения геля через 5 минут после
    электрофорез.
  2. Нарисуйте точную иллюстрацию результатов геля на
    назад.
  3. На какой электрод было выполнено большее количество образцов
    запустить?
  4. Сравните результаты окрашивания пищевых продуктов с результатами другой группы. Был
    расстояние одинаковое для разных марок красного
    пищевой краситель? Предложите причину.
  5. Какие красители, по-видимому, состояли из более чем одного
    пигмент?
  6. Если ваша группа работала со смесью, какие красители были в
    образец? Приведите доказательства, подтверждающие ваш ответ.
  7. Какие молекулярные свойства использовал гель
    электрофорез для разделения молекул?
  8. Если вас попросили улучшить разделение этих
    красители, какие переменные вы можете изменить в
    ваш эксперимент?
Группа А После электрофореза

Отрицательный полюс

Положительный полюс

Группа B После электрофореза

Отрицательный полюс

Положительный полюс


Определение молекулярной массы
Неизвестный белок

Абстрактные

Белки перемещаются через гели во время электрофореза при различных
скорости, потому что они имеют разную молекулярную массу.Это было
установлено, что по мере прохождения белков через гели расстояние
проходимость данного белка пропорциональна логарифму 10
молекулярной массы. Это линейная зависимость, но
более тяжелые белки проходят гораздо меньшее расстояние.

Каждый раз, когда ученый проводит гель-электрофорез на
белков он / она использует стандартную смесь, которая называется
«маркер». Молекулярный вес белков в этом
смеси известны и могут использоваться для определения веса для
неизвестные образцы.Когда даны данные для белков известного веса
в стандарте вы сможете определить молекулярную массу
неизвестного после того, как вы построите график данных и используете их для создания
интерполяции.

Материалы:

миллиметровая бумага, прямая кромка, калькулятор

Белок Мол. Вес,
Дальтон
Лог 10 Мол.
Вес
Пройденное расстояние,
см
Миозин 201 000 0.58
бета-галактозидаза 134 000 0,82
Бычий сывороточный альбумин 81 000 1,14
Карбоангидраза 41 500 1,53
Ингибитор трипсина сои 31 800 1.70
Лизоцим 17 900 2,05
Апротинин 7 700 2,55
Цитохром C 2,32
Гемоглобин 4.36

Протокол

  1. Определите log 10 молекулярной массы
    белки, входящие в стандартную смесь.
  2. Изобразите данные аккуратно на миллиметровой бумаге.
    1. Логарифм 10 молекулярной массы равен
      традиционно наносится на ось Y и
      пройденное расстояние по оси X.
    2. Планируйте приращения по каждой оси для распределения
      переменных на графике как можно больше.
    3. Когда точки расставлены правильно, присоединяйтесь к ним
      с прямой « best fit »
      строку, которую вы можете указать с этими данными. Линия
      должен пройти через происхождение.
  3. Используя эту строку, определите журнал 10
    молекулярная масса белка с учетом расстояния
    путешествовал.
  4. Рассчитайте молекулярную массу каждого белка, найдя
    антилог этих значений.
  5. Найдите правильный молекулярный вес и определите свой
    процентная ошибка.

Разделение белков

Использование полиакриламидного геля
Электрофорез

Аннотация:

Полиакриламидные гели впервые были использованы для электрофореза в
1959. Они химически инертны и механически стабильны. К
химическая сополимеризация мономеров акриламида с
сшивающий реагент прозрачный прозрачный гель, проявляющий очень
получается небольшой электроосмос.Размер пор может быть точно
и воспроизводимо регулируется общей концентрацией акриламида
и степень сшивки.

Пробы белка пропускают через гель для укладки перед
переход в гелевую фазу. В геле для укладки протеин
концентрируется, потому что растворитель прерывается. Этот
ступень концентрирования увеличивает полученное окончательное разрешение.

Студентам будет поручено сделать гель из определенной поры
размер на основе процентного содержания используемого полиакриламида
(5% -15%).Калейдоскоп белка-маркера будет использоваться в качестве
сравнение известных неизвестных белков. Студенты будут строить журнал
молекулярной массы белков в зависимости от расстояния
путешествовал (см.) в геле. На основе этой информации студенты будут
определить на основе их графической информации молекулярную
веса белков образцов.

После получения известных значений этих белков студенты будут
вычислить их процентную ошибку и определить жизнеспособные источники
ошибка.

В качестве расширения к этой лабораторной работе студентов попросят разработать
градиентный гель, 5% -15%, для получения более полного
разделение.

Обучающая стратегия:

В этом упражнении учащиеся произведут разделения белков.
с использованием пор разного размера. Эти гели будут размещены так, чтобы каждый
студент может увидеть процентное содержание полиакриламида по сравнению с качеством
и количество разделения. Затем студентам будет предложено
сделать выводы из этих данных.Этот формат поддается
управляемый индуктивный процесс расследования. Используя индуктивный запрос,
процессы наблюдения, вывода, классификации, формулирования
гипотезы и прогнозы все отточены или подкреплены
опыты.

После завершения первой части лабораторного опыта студенты будут
вас попросят разработать систему, которая приведет к градиенту геля.
Целью этого является постепенное уменьшение размера пор.
для «улавливания» большего количества белков на протяжении всего разделения.В
процесс, разработанный студентами, будет проанализирован для
эффективность основана на разделении низкомолекулярных и высокомолекулярных
весовые белки. Этот метод решения проблем подразумевает определенное
степень свободы исследовать проблему и прийти к
возможное решение.

Стандартные решения:

РЕШЕНИЕ A — Акриламид-BIS, 30: 0,8; 300 грамм
акриламид + 8 граммов N’-N’-бисметиленакриламида.Макияж до
1000 мл с водой; Акриламид от Biorad.
РЕШЕНИЕ B —181,5 г Трис (Биорад) + 500
мл воды. Довести pH до 8,8 с помощью HCl. Составить до 1 литра с
вода (1,5М).
РЕШЕНИЕ C — 10% SDS в воде. SDS от
Biorad.
РЕШЕНИЕ D —60 грамм Трис + 400 мл воды.
Довести pH примерно до 6,8 с помощью HCl. Довести до 1 литра водой
(0.5М).
РЕШЕНИЕ E —10% Персульфат аммония (AP)
сделано ежедневно.

Внимание !!! АКРИЛАМИД ЯВЛЯЕТСЯ МОЩНЫМ
НЕЙРОТОКСИН. Избегайте вдыхания акриламидной пыли. Контакт с кожей с
акриламидные растворы и пипетирование раствора акриламида
следует

строго избегать !

Электрофорез включает применение потенциально
опасное напряжение в резервуарах с гелем и гелем.Никогда
при прикосновении к какой-либо части установки для электрофореза
после подачи тока на устройство.

Протокол:

Шаг 1: Определение времени гелеобразования

  1. Время гелеобразования для рабочего буфера и укладывающегося геля
    должно быть от 15 до 30 минут. Для этого
    возникает соотношение между полиакриламидным гелем и
    инициатор (TEMED) и перекрестный линкер (AP) должны быть
    определенный.Рекомендуется, чтобы инструктор
    предварительно определите подходящие соотношения. (ПОДСКАЗКА: в 40 мл
    гель мы добавили 50 мкл AP и 10 мкл TEMED)

Шаг 2: Запас геля для бега

  1. Ниже приводится общая формула приготовления 15% геля.
    Все расчеты основаны на этих процентах с
    Результирующий объем 40 мл.
    Гель для бега 15%
    Раствор A — 20 мл
    Раствор B — 10 мл
    Решение C—.4 мл
    долить воду до 40 мл

Шаг 3: Герметизация коробки с гелем (следующие инструкции
для вертикального контейнера с гелем) (см. «Электрофорез
Красители », представляющий пример горизонтального пробега)

  1. Соберите коробку для геля с помощью распорок и зажимов.
  2. Количество геля, необходимое для герметизации коробки, зависит от
    габариты агрегата. В качестве общего руководства следующие
    применяется.Экстракт 10 мл. запаса геля для бега и
    разлить в колбу на 50 мл.
  3. Добавьте сшивающий агент и инициатор в соответствующих соотношениях.
    (Для ускорения процесса запечатывания увеличение на 20%
    инициатор может быть использован)
  4. Лучший способ запечатать коробку — наклонить коробку с гелем.
    и налейте жидкий герметизирующий гель в основу. Можно также
    заклейте основу коробки, а затем заполните пространство
    между пластинами.Осторожность!! Есть возможность
    вытягивание геля при снятии ленты. Ты вероятно
    мог бы оставить это и все будет хорошо.
  5. После затвердевания дна коробки небольшой слой
    додецилсульфата натрия (SDS) может оставаться в верхней части
    гель-уплотнение. Просто слейте лишний SDS.
  6. Положите коробку на бок и закройте, следуя той же процедуре.
    в b и c. На этот раз введите гель-уплотнение между
    стеклянные тарелки.Примерно на 0,2 см выше распорки должно быть
    достаточно.

Шаг 4: Гель для бега

  1. Извлеките оставшиеся 10 мл жидкого геля и
    поместить в колбу на 50 мл.
  2. Добавить заранее определенные количества инициатора и катализатора, перемешать
    и обойтись. Заполните до точки, чтобы белки
    перемещаться через 1 см укладывающегося геля после того, как расческа
    вставлен. Дайте застыть.

Шаг 5: Укладочный гель

  1. Ниже приводится формула подготовки штабелирования.
    гель. Залейте гель для укладки только перед использованием (чтобы
    поддерживать градиент pH между штабелированием и работой
    гели): не забудьте перед
    заливка геля для укладки!

Укладочный гель
Решение A— 1.3 мл
Раствор D — 2,5 мл
Раствор C — 0,1 мл
Вода — 6,0 мл
AP — 0,1 мл
ТЕМЕД — 10 мкл

  1. Извлеките и распределите вышеуказанный рецепт для штабелирования
    гель в колбе на 50 мл. Смешайте и нанесите пипеткой гель для укладки.
    заполнение общего объема пространства между
    стеклянные тарелки.
  2. Вставьте гребешок, дайте застыть.

Шаг 6: Подготовка образцов белка (См. Учителей
руководство для образцов рекомендаций)

  1. Поместите 5 мг каждого белка в небольшую микропробирку.
  2. Добавьте 3,3 мл воды. Это будет ваше стандартное решение для
    каждый белок!
  3. На каждый белок поместите 10 мкл исходного раствора + 10 мкл
    вода + 20 мкл (2x) GSB + 5 мкл B-меркаптоэтанола в
    микропробирка.
  4. Поместите микропробирки из «3» в кипящую воду на 2 минуты.

    2x
    Буфер для образцов GSB-Gel

    Раствор D ———————— 2,5 мл
    Решение C ———————— 2.0 мл
    Глицерин ————————- 2,0 мл
    0,1% бромфенолового синего ——— 1,0 мл
    Вода ————————— 2,3 мл
    Развести образец, предпочтительно в воде, 1: 1 с 2x GSB.
    Добавьте бета-меркаптоэтанол до конечной концентрации 10%.

Шаг 7: Загрузка образцов и запуск геля

  1. Снимите гребешок.
  2. Заполните лунки рабочим буфером.При этом заполняем
    верхний и нижний резервуары с рабочим буфером.
  3. Внесите 15 мкл каждого образца в лунку. Убедись в
    заменяйте наконечник дозатора после каждой загрузки. Заполните колодец
    снизу вверх! * Не забудьте использовать маркер, который будет использоваться
    метод сравнения. Калейдоскоп (Биорад) — хороший
    маркер. (См. Диаграмму с указанием цвета полосы в зависимости от молекулярной массы.)
    Калейдоскоп

    Protein Band Цвет ремешка Молекулярный вес
    Миозин Синий 201 000
    B-галактозидаза пурпурный 134 000
    Бычий сывороточный альбумин Зеленый 81 000
    Карбоангидраза фиолетовый 41 500
    Ингибитор трипсина сои оранжевый 31 800
    Лизоцим Красный 17 900
    Апротинин Синий 7 700
  4. Подключите охлаждающие линии, если они есть.
  5. Присоедините электроды и запустите гель при 60 В (прибл.
    40 миллиампер) через гель для укладки.
  6. Как только образцы начнут стекать в текучий гель
    увеличиваем напряжение до 150 Вольт.
  7. Запускайте гель до тех пор, пока образцы не окажутся в пределах 2 мм от уплотнения.
    внизу коробки. Отключите питание. Отключить
    электроды. (Также отключите охлаждающие линии, если
    в наличии)

Следующие шаги включают приготовление геля для
анализ данных.Рекомендуется вообще носить перчатки.
раз.

Шаг 8: Крепление геля

  1. Ниже приводится рецепт приготовления фиксирующего раствора.

    Крепление
    Решение

    200 мл этанола
    40 мл уксусной кислоты
    200 мл воды

  2. Поместите гель в чашку из пирекса.
  3. Залейте фиксирующим раствором гель.
  4. Гель должен находиться в фиксирующем растворе 30 минут.

Шаг 9: Метод окрашивания гелем (с использованием кумасси синего)

  1. Ниже приводится рецепт окрашивания.
    решение.

    Окрашивающий раствор
    1,1 г Кумасси Синий (Биорад)
    200 мл метанола
    40 мл HOAc
    200 мл воды
    (Вакуумный фильтр перед использованием)
    Этот раствор можно использовать 5 раз, прежде чем выбросить

  2. Поместите гель в пластину из пирекса.Добавьте красящий раствор
    пока гель не покроется.
  3. Время от времени встряхивайте. Время окрашивания 30 минут.

Шаг 10: Удаление геля

  1. Ниже приводится рецепт обесцвечивания.
    решение.

    Раствор для обезвоживания
    7,5% уксусная кислота
    10% этанол

  2. Удалите пятно с посуды, стараясь не сломать
    гель.
  3. Промойте гель один раз в деионизированной воде.
  4. Дестейн, добавив в блюдо 300 мл Дестейнинга.
    Решение.
  5. При добавлении обесцвечивающего раствора белок
    полосы должны быть сразу видны. Это должно улучшить
    со временем.
  6. Destain 2x 30 минут.

Шаг 11: Гель для фотографирования

  1. Поместите гель на кусок обертки Saran.Используйте белый
    фон, чтобы помочь в просмотре полос белка.
  2. Поместите линейку (шкала в сантиметрах) рядом с образцом и
    фотография.
  3. Если камера недоступна, попросите учащихся использовать график
    бумагу для описания результатов. (Убедитесь, что они
    следить за масштабом)
  4. Выбросьте обернутые гели Saran в корзину для мусора, когда
    завершенный.

Студенты должны построить график относительной мобильности по сравнению с
бромфеноловый синий (RBPB) для каждого из меченых белков.Данные
генерируются с начала работы геля. Студенты будут
построить график зависимости RBPB от логарифма молекулярной массы для каждого
белковый маркер. Молекулярная масса неизвестных полос белка
затем можно определить. После определения студенты будут
рассчитать процентную ошибку для известных значений белка
группы. Затем студенты будут выполнять стандартную
Процедура лабораторной презентации определяется следующим: (
учащиеся должны иметь 10% -15% известных значений их
расчетные молекулярные массы)

Вопросы

  1. В чем преимущество полиакриламидного геля
    электрофорез с использованием агарозных гелей? Список два
    факторы.
  2. Как определяется процентное содержание полиакриламида в вашем геле?
    сравнить с другими, использующими те же самые и разные
    проценты (с точки зрения качества и количества протеина
    разделение)?
  3. Какой процент полиакриламида оказался лучшим?
    использовались при разделении?
  4. Спланируйте эксперимент, который покажет больший диапазон
    разделения. Будьте готовы изложить свою гипотезу.

Выводы

  • Резюме лабораторного опыта: выделите электрофоретическое средство
    техника применена
  • Объяснение наблюдений: на основе ваших исследований и
    общие научные знания объясните, что указано в вашем
    качественное резюме.
  • Источники ошибок: перечислите три возможных источника ошибок в
    вашу лабораторию и как они повлияют на результат.

Анализ данных и расширение

После обсуждения результатов в классе концепция использования
линейный градиент будет генерироваться динамически или воронкообразным
учителем.Студентам выдадут два шприца объемом 10 см3,
различные трубки, зажимы и т. д., необходимые для создания линейного градиента
гель. Студентам также будет предоставлен отрывок из статьи Electrophoresis.
in Practice
Райнера Вестермайера (1993), обобщающего
эффект от использования линейного градиента.

После тестирования своей системы группы будут вывешивать свои результаты.
Затем последует групповая презентация, где каждая группа объяснит
их система и результаты. Каждый член группы будет
назначен конкретный раздел презентации: (1) Обсуждение
дизайна; (2) Представление данных; (3) Сравнение данных с
априорные нелинейные градиенты; и (4) Источники ошибок, а также
выделение областей улучшения дизайна.


Руководство для учителя
для
Разделение белков
Использование полиакриламидного геля
Электрофорез

Ответы на текстовые вопросы:

  1. (a) Легче последовательно регулировать размер пор
    с полакриламидными гелями, (б) Лучшее применение
    градиентные гели с полиакриламидными гелями. * Студенты могут
    иметь множество ответов, касающихся их лаборатории
    последовательность тоже.
  2. Студенты заметят, что оптимальный процент
    полиакриламидный гель зависит от молекулярной
    веса использованных белков.
  3. Зависит от данных
  4. Студент создал

Заметки учителя

В применяемой здесь электрофоретической технике используются
полиакриламидные гели. Этот метод использует различия в
размер молекулы и заряд для целей разделения.Гель
компоненты не заряжаются и могут изменяться известным способом для
производят гели с различными размерами пор. Эффективная пора
радиус 0,5-3,0 нм можно получить, регулируя общий
концентрация акриламида и концентрация сшивки
реагент в смеси для полимеризации. Сшивающие агенты прочие
чем BIS / акриламид, которые имеют преимущество
что они могут быть включены в гель, а затем
сшивающие связи легко разрушаются.Таким образом, можно
повторно растворить часть геля, содержащую макромолекулу
интерес.

Гелеобразование происходит медленнее при более низких значениях pH, поскольку
свободная форма основания требуется, чтобы катализировать реакцию.
Скорость полимеризации сильно зависит от температуры, поэтому
температура должна поддерживаться постоянной.

Электрофорез белков
Поскольку белки амфотерные, pH электрофореза
систему следует выбирать с учетом изоэлектрических точек
белки, которые необходимо разделить.

В системе электрофореза в этом эксперименте используется
детергент, додецилсульфат натрия (SDS). Система SDS включает
концентрирование образцов белка в очень тонкие слои с помощью
прерывистый градиент напряжения, а затем электрофорез на
колонка из полиакриламидного геля. Шаг концентрации увеличивает
получено окончательное разрешение.

Принципы электрофореза
Белок концентрируется, потому что растворитель
прерывистый.Растворы хлорида и глицина
электрофоретически последовательно. Движение ионов (ток)
должны быть одинаковыми во всей системе. При подаче напряжения
глицин и хлорид будут двигаться к положительному электроду.
Эта стадия концентрирования называется «укладкой» и происходит
в верхнем геле.

Трекинговый краситель добавлен к белку или верхнему буферу
перед электрофорезом. Обладает подвижностью, зависящей от
pH в этой области и является промежуточным между хлором и
глицин.Принято указывать на относительную подвижность
вещества на геле как отношение расстояния, пройденного
вещество, которое путешествует следящий краситель.

Ссылки: Freidfelder, pp 211-234
Оригинальная литература: Шапиро, Виннела и Майзель
Ссылки: Comm. 28 , 815 (1967)


Электрофорез ДНК с использованием агарозного геля

(Понимание роли рестрикционных ферментов)

Аннотация:

Электрофорез в агарозе — стандартный метод разделения,
идентификация и очистка фрагментов ДНК и РНК.Для разделения нуклеиновых кислот используются горизонтальные гели:
агарозный гель лежит прямо в буфере. Это предотвращает гель
от высыхания. Гели окрашиваются бромистым этидием и
полосы видны в УФ-свете.

Используя белки, называемые рестрикционными ферментами, гены можно разрезать на
специфические последовательности ДНК. Более 75 различных видов
рестрикционные ферменты известны, и каждый из них
«распознает» и разрезает ДНК по определенной последовательности.В
точность этих ферментов поразительна. Они не будут резать
последовательность, отличная от той, которую они распознают, даже если пять из
шесть пар оснований идентичны их сайту узнавания.
Рестрикционные ферменты позволяют разрезать ДНК на фрагменты.
которые можно изолировать, разделить и проанализировать.

Обучающая стратегия:

Совместное обучение увеличивает достижения, стимулирует
когнитивное развитие, способствует активному обучению, увеличивает
чувство собственного достоинства и способствует положительному отношению к школе.Бизнес и промышленность все чаще требуют, чтобы люди работали
вместе в производственных командах или в группах по решению проблем.
Поэтому важно научиться эффективно работать в группе;
совместные группы по решению проблем в химической лаборатории помогают
студенты развивают и оттачивают свои навыки.

Студенты будут работать в лабораторных группах по два человека. После завершения они
будут координировать представление данных, как описано в
выводы, с другой командой.Презентации студентов будут
оценивается по шкале для выставления баллов за выпускной проект по рубрике
используется в средней школе Ривер-Ридж, Лейси, Вашингтон.

* Компании продают предварительно вырезанную ДНК из ассортимента
рестрикционные ферменты. Их можно купить, чтобы сэкономить на подготовке.
время!

Протокол:

Шаг 1: тарелок LB и бульон

  1. Смешать в колбе на 1000 мл (растворять не нужно)
    следующие вещества; 5 г триптона, 2.5 г дрожжей
    Экстракт, 5 г NaCl, 7,5 г агара, 500 мл воды.
  2. Автоклав на медленном выхлопе в течение 30 минут.
  3. Остудить 15 минут.
  4. Добавьте 500 мкл ампициллина.
  5. Залить тарелки.
  6. Подожгите пузыри.
  7. После застывания пластин просушите крышки салфеткой.
    комната для культивирования с вентилятором и бактерицидной лампой.
  8. Для приготовления бульона LB без агара и автоклава.
    все 30 минут на медленном выхлопе.
  9. Разлить по 100 мл виалам и снова автоклавировать.

Шаг 2: Выращивание культур

  1. Добавьте 100 мкл ампициллина к 100 мл LB.
  2. Внесите пипеткой 5 мл LB в каждую культуральную пробирку и засевайте.
  3. Выращивайте в течение ночи в теплой комнате на шейкере.
  4. Храните оставшиеся LB в холодильнике.

Шаг 3: Мини-подготовка образцов

  1. Вращение вниз 1.5 мл культуры в течение 30 секунд при прибл.
    32000 об. / Мин. Удалите и слейте жидкость.
  2. суспендировать бактериальный осадок в 150 микролитрах
    STET (2x) и 150 мкл стерильной воды путем нанесения
    жидкость вверх и вниз по пипетке. Тритон — это
    моющее средство, разрушающее липидный слой, составляющий
    внешняя мембрана. Помещая клетки в сахарозу с высоким содержанием
    окружающей среды поток жидкости в ячейке идет из внутренней
    к внешнему созданию механического напряжения.В конце концов, из-за
    при увеличении напряжения внутренняя клеточная стенка разрывается.
  3. Добавьте десять микролитров лизоцима (20 мг / мл) и кипятите 45 минут.
    секунд. Лизоцим переваривает углеводную мембрану
    (пептидогликан).
  4. Центрифуга пять минут (32000 об / мин) при комнатной температуре.
    ДНК и РНК образуют осадок.
  5. Этикетка нового набора пробирок и пипетки 300 мкл
    изопропанол в каждую пробирку.
  6. Удалите жидкость из 4 и поместите пипеткой в ​​пробирки.
    содержащий изопропанол. Переверните пробирку, чтобы перемешать. В
    изопропанол вызывает осаждение ДНК и РНК
    из раствора.
  7. Центрифуга десять минут (комнатная температура достаточна, но
    более холодные вращения имеют тенденцию давать лучшие результаты) при 32000 об / мин.
    Слить жидкость.
  8. Добавьте 750 мкл холодного 70% этанола. Обратить на полоскание
    гранулы.Центрифуга в течение пяти минут (32000 об / мин).
  9. Сушите гранулы в быстросъемном пылесосе в течение 10-15 минут. Если
    не доступен оставьте образец в вытяжном шкафу на ночь.
  10. Взвесьте гранулы в 50 микролитрах стерильной воды.
    Перемешайте, набрав раствор в пипетку и
    дозирование. (Слишком большое перемешивание пипеткой приведет к срезанию
    ДНК) Этот раствор представляет собой непереваренный
    ДНК.

Шаг 4: Расщепление ДНК с использованием рестрикционного фермента

  1. Возьмите микропробирку и налейте десять микролитров
    непереваренная ДНК.Добавьте два микролитра универсального буфера,
    два микролитра HindIII, EcoRI или другого ограничения
    фермент в микропробирку. На короткое время центрифугировать, чтобы
    смешать содержимое. Этот раствор представляет собой переваренный
    ДНК. (См. «Рекомендуемую таблицу дозирования.
    Образцы »в качестве руководства)

Шаг 5: Подготовка агарозного геля

  1. Приготовьте 1% раствор агарозы.Для небольшой гелевой смеси 0,5 г
    агароза в 49,5 мл буфера ТАЕ. Для большего двойного геля
    количества.
  2. Разогрейте в микроволновой печи буферный раствор агарозы / ТАЕ в колбе.
    покрытый сарановой пленкой до полного растворения (начать с 1,5
    минут на максимуме).
  3. Перелейте раствор в лоток для геля. (Вы можете записать
    края лотка для геля, чтобы гель стал гуще).
    вставьте расческу.
  4. Дать застыть (прибл.30 минут), затем снимите гребешок.
  5. Поместить в буферный ящик. Убедитесь, что гель слегка
    покрыт буфером.
  6. Извлечь десять микролитров раствора, содержащего ДНК, воду.
    и буфер для образцов геля из образца (см. справочную таблицу
    для данных). Загрузите образцы в лунки.
  7. Присоедините катод (отрицательный электрод) к боковой стороне
    ящик, ближайший к колодцам.
  8. Запустите гель при 100 вольт в течение одного часа или пока краситель не станет
    примерно 2/3 геля.

Предлагаемый стол для дозирования образцов

ПУТЬ на геле Трубка с маркировкой Образец Образец (объем) Вода GSB (5X) 10 микролитров
1 1 неразрезанная ДНК 5 мкл 3 мкл 2 мкл 10 мкл
2 2 разрезанная ДНК + EcoR1 5 мкл 3 мкл 2 мкл 10 мкл
3 3 разрезанная ДНК + HindIII 5 мкл 3 мкл 2 мкл 10 мкл
4 4 разрезанная ДНК + неизвестно r.е. 5 мкл 3 мкл 2 мкл 10 мкл
5 5 разрезанная ДНК + смесь 2 ферментов 5 мкл
2,5×2
3 мкл 2 мкл 10 мкл
6 6 1 Kb ДНК-лестница 5 мкл 3 мкл 2 мкл 10 мкл

Шаг 6: Протокол окрашивания / обесцвечивания

  1. Окрашивайте гель в бромистом этидии примерно пять раз.
    минут.
  2. Дестин в воде (или TAE, если гель будет использоваться повторно).
  3. Фотогель в УФ-свете рядом с линейкой (5.6,
    второй).

Концентрации раствора:

TBE (10x) Буфер 1 л
108г Трис
55 г борной кислоты
50 мл 0,5 М ЭДТА
Смешайте все в колбе Эрленмейера с мешалкой. Автоклав.

DEPC h3O 2L
2 л наночистой воды
100 мкл DEPC
Перемешать и автоклавировать.

STET (2x) 100 мл
16% глюкозы или сахарозы (32 мл 50%)
100 мМ Tris-Cl pH8 (10 мл 1M)
100 мМ ЭДТА pH8 (20 мл 0,5 М)
1% Тритон х-100 (1 мл 100%)
наночистая вода (33 мл)
Перемешайте и стерилизуйте, затем профильтруйте.

TAE (50x) Буфер 1 л
242г Трис
57,1 мл уксусной кислоты
100 мл 0,5 М ЭДТА
Смешайте все в колбе Эрленмейера с мешалкой.Автоклав.

ЭДТА (0,5 М) 1 л
186,1 г NaEDTA. 2ч30
ок. 20 г NaOH
Растворите NaOH прибл. 800 мл воды и pH до 8. Медленно добавьте
ЭДТА при перемешивании мешалкой на слабом огне. Отрегулируйте pH до
8 и автоклав.

1% агарозный гель
25 мл 1x TAE
2,5 г агарозы
растворить и дегазировать раствор, поместив смесь в
микроволновая печь для коротких серий прибл.20с

Бромид этидия раствор. 200 мл
(Считается мутагеном)
Разбавляйте раствор до появления светло-оранжевого оттенка.

Учащиеся должны назначить размеры полосам ДНК, которые они
см. использование рестрикционной карты фаговой лямбда-ДНК в качестве руководства.
Студенты должны записывать свои результаты в свои дневники до
построение графиков выборок на основе журнала размера маркера по сравнению с
пройденное расстояние (см). По этим данным студенты должны определить
размеры маркеров для лент производства Bamh2.

Вопросы

  1. Как повлияет на ваш гелевый узор использование двух
    рестрикционные ферменты.
  2. Некоторые группы были более интенсивными (четкость), чем другие. Какие
    как вы думаете, значение этого есть?
  3. Рестрикционные ферменты производятся различными видами
    бактерии. Как бактерии используют ферменты?

Выводы

  • Резюме лабораторного опыта: выделите электрофоретическое средство
    техника применена
  • Объяснение наблюдений: на основе ваших исследований и
    общенаучные знания объяснят ваши качественные
    данные.
  • Источники ошибок: перечислите три возможных источника ошибок в
    вашу лабораторию и как они повлияют на результат.

Анализ данных и расширение:

Каждая группа из четырех студентов будет разделена на две лаборатории.
станции (две группы по две). Группе будет предоставлен образец
ДНК, которая была расщеплена с использованием HindIII, EcoRI и
БамХИ (хотя можно использовать и другие). Небольшие группы из двух человек будут
запустить гель, используя тот же набор условий, чтобы сравнить
их результаты, когда они будут завершены.Каждая большая группа из четырех человек будет
учитывая образец, содержащий один аналог (EcoR1) или (HindIII) и
один непохожий рестрикционный фермент. Группы опубликуют свои результаты
во время групповой презентации, объясняющей сходства и
различия в данных, сгенерированных с использованием плакатной техники.
Каждому члену группы будет назначен определенный раздел
презентация: (1) Краткое изложение лабораторного опыта, (2) Презентация
данных, (3) Сравнение данных и (4) Источники ошибок с
практическое применение.


Руководство для учителя
для
Электрофорез ДНК
,00
Использование геля агарозы
(Понимание роли рестрикционных ферментов)

Ответы на текстовые вопросы:

  1. Студенты должны видеть больше полос, связанных с микшированием
    двух рестрикционных ферментов.
  2. Брайан проверь свои фотографии
  3. Бактерии используют рестрикционные ферменты как средство защиты
    против вирусов!

* Примечание: Чтобы упростить подготовку, компании
продавать предварительно разрезанную ДНК с помощью различных рестрикционных ферментов.Это
немного дороже, но можно сэкономить время!

Размеры маркеров
EcoRI —

  1. 21266 * (слабые полосы при нагревании)
  2. 7421
  3. 5804
  4. 5643
  5. 4878
  6. 3540 *

HindIII —

  1. 27,500 присутствует без обогрева
  2. 23,130 левый рычаг
  3. 9416
  4. 6682
  5. 4361 правый рычаг
  6. 2322
  7. 2027
  8. 564 слабый
  9. 125 «

Соответствующие концентрации агарозы для разделения ДНК
Фрагменты разного размера

Агароза% —- Эффективный диапазон разрешения линейной ДНК
Фрагменты (кб)

0.5% ____________________________________ от 30 до 1
0,7% ____________________________________ от 12 до 0,8
1,0% ____________________________________ от 10 до 0,5
1,2% _____________________________________ от 7 до 0,4
1,5% _____________________________________ от 3 до 0,2

* 1 Кб ДНК-лестница подходит для линейной проклейки
фрагменты двухцепочечной ДНК размером от 500 до 12 т.п.н. Группы
каждая лестница содержит от 1 до 12 повторов ДНК длиной 1,018 п.н.
фрагмент.Помимо этих 12 лент, лестница содержит
векторные фрагменты ДНК размером от 75 до 1636 п.н.

** Существует также продукт под названием DNA Mass Ladder (патент
ожидает рассмотрения) подходит для оценки массы неизвестной ДНК
образцы окрашиванием бромистым этидием. Лестница состоит из
эквимолярная смесь шести тупых фрагментов от 100 до 2000 п.н.
Электрофорез 4 мкл лестницы масс ДНК дает полосы
содержащие 200, 120, 80, 40, 20 и 10 нг (всего 470 нг) ДНК.


Приложение А

Изготовление гелевых коробок недорого

Материалы

Для каждой установки гелевого бокса у вас должно быть:

два небольших контейнера для буферов (пластик
предпочтительно, стаканов будет достаточно)
Стеклянная пластина 5 дюймов x 5 дюймов (желательно пластина)
пластиковый квадрат для поднятия стеклянной гелевой пластины на высоту
буферные емкости
два электрода (карандаши с мягким графитом доступны в
художественный магазин, изделия из нержавеющей стали или платины)
мягкие белые бумажные полотенца или
хроматографическая бумага, служащая солевым мостиком между лунками
и гель
Покрытие из оргстекла для предотвращения высыхания геля и сохранить
Студент пальцы в сторону

Все гелевые боксы состоят из двух лунок для буферного раствора,
приподнятая площадка для размещения гелевых пластин и двух электродов.Немного геля
коробки содержат гелевую пластину или лоток, погруженные в буферный раствор,
но мы не сочли это удовлетворительным. Абсорбирующие белые бумажные полоски
может быть помещен одним концом в буферный отсек, а другой
накинуть на край гелевой пластины так, чтобы
подключение сделано.

Автор обнаружил, что небольшой контейнер Rubbermaid емкостью 1-1 / 2 кварты
был удовлетворительным. Два небольших пластиковых контейнера (по 225 мл каждый)
размещены на противоположных концах, чтобы служить буферными лунками.Любой маленький
пластиковые детали могут быть помещены между этими двумя лунками в качестве опоры
для стеклянной пластинки с гелем. Автор использовал перевернутый
пластиковая корзина. Необязательно размещать все эти более мелкие
компоненты в большем контейнере, но это приводит к стабильности и
безопасность.

Автор попробовал графитовые карандаши в качестве электродов и обнаружил
их удовлетворительно на короткий срок. Если вы хотите повторить это
много лет экспериментируйте, получайте полосы или стержни из нержавеющей стали
из хозяйственного магазина для использования в качестве катода.Платиновая проволока
лучший выбор для анода, но не нужен для красителя
разделение Если вы используете платиновую проволоку, достаточно диаметра 0,25 мм.
и стоит около 25 долларов за 25 см. Выбранные электроды могут быть
приклеены к противоположным сторонам большего контейнера. Если у вас есть
платиновые электроды от аппарата Хоффмана, они также должны
хватит. Следует выбрать любой способ закрепления электродов.

Наконец, вам нужна абсорбирующая бумага, которая будет служить солевым мостиком.
между буферными лотками и гелем.Вдвое больше бумажных полотенец для
больший поток ионов. Накройте полотенцем противоположные концы геля.
пластина. Заполните буферные лунки достаточным количеством раствора, чтобы свести к минимуму
расстояние между буферным раствором и гелевой пластиной. Это предотвращает
сушка полотенца. Автор нашел недорогие белые бумажные полотенца.
вполне удовлетворительно и намного дешевле, чем хроматография
бумага. Промокательная бумага, купленная в магазинах канцелярских товаров, кажется,
быть слишком устойчивым к току и не рекомендуется.

Чтобы помочь студентам загружать лунки в планшет с гелем, с узким наконечником
Насадки Eppendorf очень удобны, но можно использовать микронасадки.
пластиковые пипетки Бераля или пипетки Пастера с вытянутыми стеклянными наконечниками
до меньшего диаметра.


ПРИЛОЖЕНИЕ B

Рекомендации учителей по электролизу

Классная среда:

Студенты должны работать в парах.

Материалы

На каждую пару учеников нужно:

одна батарея 9 В
один зажим для аккумулятора (можно недорого приобрести в Radio Shack в
упаковки по 6 шт.)
одна пара зажимов типа «крокодил» для подключения от зажима аккумулятора к
карандаши
один ацетатный лист
два карандаша, каждый заостренный с обоих концов, чтобы служить
электроды
примерно 5 мл 0.2M CuCl 2
бумажное полотенце для очистки электродов

Батарея крепче, если можно разрезать аллигатора.
зажимные соединители, доступные в Radio Shack, пополам и припаять
отрежьте концы зажима аккумулятора, как показано на лабораторной схеме. Один раз
подготовленные, комплекты для занятий служат годами. (Автор использовал
так же установил за 8 лет без проблем. Батареи хватает на 5-6
лет.)

Ответы на вопросы анализа:

  1. Медь осажденная в твердом состоянии.
  2. Ионы меди заряжены положительно и притягиваются к
    отрицательный электрод, потому что противоположные заряды притягиваются.
  3. Вещество, выделяющееся на аноде, представляет собой газообразный хлор. В
    Ион хлорида попал на электрод, потому что у него
    противоположный заряд.

Ответы на добавочные номера

  1. Положительно заряженные белки будут двигаться в сторону
    катод. Отрицательно заряженные белки будут двигаться в сторону
    анод.
  2. Ионы можно замедлить, используя вещество, которое их улавливает
    такие как гель или спутанные полимеры. Белки с большим
    молекулярная масса будет двигаться медленнее. (Воспользуйтесь аналогией
    попытки достать камешек из миски с прозрачным супом
    или снизу тарелки приготовленных спагетти.)
  3. ДНК

  4. также разделяют с помощью гель-электрофореза. ДНК
    цепь заряжена отрицательно из-за фосфата
    группы и движется к аноду.

Приложение C

Инструкции для учителя по практическому занятию Micropipet

Абстрактные

Студенты осваивают технику использования микропипеток при приготовлении
четыре цвета из четырех основных пищевых красителей.

Обучающая стратегия

Большинство разделений белков происходит в очень мелком масштабе и используют
микроколичество жидкостей. Это требует умения манипулировать
ручные инструменты, называемые микропипетками.Эта деятельность будет
знакомит студентов с их использованием и предлагает быстрый метод
определение, правильно ли они их используют.

Материалы:

микропипетки, пластиковые микроцентрифуги или вихревой миксер (Eppendorf)
микропробирки, наконечники для пипеток, глицерин, дистиллированная или деионизированная вода,
фильтровальная бумага, пищевые красители (красный, зеленый, синий и желтый),
Листы пенополистирола размером 6 футов на 6 дюймов для использования в качестве держателей микроцентрифуг, вортекс
миксер или пластмассовые зубочистки для перемешивания

Подготовка учителя

  1. Приготовление базового раствора красителя для наборов из 8 занятий
    1. Смесь 4.0 мл желаемого пищевого красителя и 4,0 мл
      вода дистиллированная
    2. Добавьте к смеси 16 мкл глицерина и перемешайте.
      тщательно. (Предпочтительно вихревой смеситель)
    3. Разделите каждый цветной раствор на 8 помеченных
      микропробирки.
  2. Для каждой группы учеников подготовьте комплект, состоящий из:
    1. Лист пенополистирола или кусок пенопласта, который будет действовать как
      Держатель микропробирок, содержащий:

      • 4 пустые микроцентрифужные пробирки;
      • 4 промаркированных микроцентрифужных пробирки, каждая с одной
        из четырех основных цветов
    2. 1 микропипетка
    3. фильтровальная бумага

Особые примечания:

  1. Наконечники Micropipet можно промывать и использовать повторно.
  2. Будут подготовлены бирюзовые, розово-оранжевые и зеленовато-желтые цвета.
  3. Сравнение пятен на фильтровальной бумаге указывает на
    способности ученика правильно дозировать 3 мкл.
  4. Приготовьте эталон, чтобы вы могли сравнить их чирок, розу,
    оранжевый и шартрез цвета. Это также указывает на их
    умение пользоваться микропипетками.

Приложение D

Рекомендации учителей по приготовлению геля

Сокращения:

  1. Приготовьте раствор агарозы раньше и согрейте (70 o C
    для агарозы, 60 o C для желатина Knox) ​​в воде
    ванна на плите.Если гель остынет слишком сильно, он
    затвердеть. Если он слишком горячий, гель слишком долго
    остудить и затвердеть.
  2. Желатин Knox можно заменить агарозой , используя
    красители только
    . Если вы заменяете, 3% — 5% будет
    необходимо для гелеобразования (одна упаковка на 1 стакан воды
    представляет собой 2,9% раствор. Этот гель превратится в золь
    (жидкое) состояние быстрее, если используется слишком большое напряжение
    во время электрофореза, если у вас нет метода
    охлаждение геля.Если вы используете этот гель НЕ ПРЕВЫШАЙТЕ
    100 В ПО ЛЮБОЙ ПРИЧИНЕ
    . Если гель тает,
    В системе может произойти короткое замыкание. (Этот автор
    использовались 3% -ные растворы, но у 5% вероятность плавления ниже.)
  3. Гребни могут быть изготовлены из оргстекла. Каждый зуб 6,25 мм
    широкий. Толщина оргстекла на коммерческих гребнях
    0,75 мм. Расческу можно вырезать из высокой плотности
    бутылки для молока из полиэтиленовых галлонов, если нет оргстекла
    доступный.Они действительно делают очень узкие прорези, но будут
    хватит. Помните, что зубы не должны уходить полностью.
    через гель. Схема приводится ниже.


Приложение E

Инструкции для учителей в лаборатории красителей

Обучающая стратегия

Классная среда: Химия средней школы

Этот вид деятельности олицетворяет открытое обучение, поэтому сопротивляйтесь
желание сказать слишком много в начале.Убедитесь, что студенты
понять технику. Студенты могут приготовить смесь красок для
другая группа для идентификации.

Предварительная подготовка учителя к гель-электрофорезу с
красители

  • Необходимое оборудование для класса 32 (8 групп по 4)

    DC
    Источники питания для электрофореза (100 В или выше) Некоторые
    могут использоваться 2 или более группами
    остатки
    плита или микроволновая печь для нагрева геля
    8 стеклянных пластин размером около 5 дюймов на 5 дюймов, 8 листов ацетата
    и маркеры или 8 листов промокательной бумаги
    8 термостойких перчаток (по желанию)
    8 коробок с гелем для электрофореза (коммерческие или сконструированные как
    в Приложении А)
    Ассортимент красителей (Приложение F)

Преподаватель Время на подготовку — примерно 2-3 часа
Приготовьте красители, как указано в Приложении D, или купите в коммерческих
источники, перечисленные в Приложении E

Рабочий буфер, 1X TAE (0.4М трис-ацетат; с 0,001 млн
ЭДТА)
Это более удобно приготовить, используя раствор 50X TAE.
и разбавление 40 мл раствора 50X водой до конечного объема.
2 литра. Во многих коробках с гелем используется примерно 125-200 мл 1X буфера.
буфер можно повторно использовать несколько раз, если он полностью перемешан между
работает
.

Рецепт концентрата 50X TAE

242 г Трис-основания, доступного от Sigma Chemical Co., Флинн
или Фрей
57,1 мл ледяной уксусной кислоты
100 мл 0,5 М ЭДТА, pH 8

(Эта масса изготовлена ​​из динатриевой соли EDTA и pH сбалансирована с использованием
pH-метр или pH-бумага и HCl.) Сделайте 1 литр деионизированным
или дистиллированная вода. Этот раствор реагента также можно купить.

Вы можете заранее приготовить несколько практических гелей и
использовать один урок для студентов, чтобы попрактиковаться в дозировании и
загрузочные лунки в этих гелях.

Если учащиеся используют микропипетки и подсказки, они нуждаются в предварительном
инструкция и практика, как указано в стратегии. При использовании
вытащили пипетки Пастера или пипетки Берала с микронаконечником, найдите время, чтобы
проинструктируйте их, как ими пользоваться, чтобы получить очень небольшой размер выборки.

Ответы на вопросы анализа

  1. Ответы будут разными. Направления окраски указаны в Приложении.
    F.
  2. Ответы будут разными. Направления окраски указаны в Приложении.
    Ф.
  3. На + электрод попадает больше образцов. Они часто
    анионы солей.
  4. Красные красители должны быть разными, поэтому расстояние
    ездил должно меняться.
  5. Студенты могут быть удивлены тем, что желтый краситель имеет желтый и
    красный и синий — это синий с небольшим количеством красного. Зеленый
    желтый и синий.
  6. Если электрофорез проводится достаточно долго, они могут
    различать смеси.Иначе нет.
  7. Свойства заряда и молекулярной массы используются для
    разделите их.
  8. Гели с меньшими отверстиями обеспечивают лучшее разделение. Более
    концентрированные гели имеют отверстия меньшего размера. Бег
    электрофорез в течение более длительного времени помогает разделению геля
    тарелка достаточно длинная, чтобы ее можно было использовать. (Гели агарозы дадут
    результаты лучше, чем у желатина Knox.)

Приложение F Красители для электрофореза красителей

Предлагаются следующие красители.Некоторые из них обычно используются как
кислотно-основные индикаторы и др. являются биологическими пятнами. Попробуй использовать
некоторые из них являются катионными, а некоторые — анионными.

Краситель Переход к какому полюсу
бромкрезоловый зеленый + (анод)
пурпурный бромкрезол +
бромфеноловый синий +
кристально-фиолетовый (генциановый фиолетовый) — (катод)
эозин Y +
флюороцен +
м-крезол пурпурный +
метиловый зеленый _
метиленовый синий _
0-крезол красный +
оранжевый G +
фенол красный +
сафранин O _
ксилолцианол +

Другие предложения: меркурохром, пищевые красители, чернила, пасха
яичные красители, связующие красители, экстракты цветов, сок капусты, сок свеклы,
ягодный сок, йод.Этому автору не удалось
промышленный краситель, краситель Рит. Консервированный свекольный сок работал очень хорошо и
ученики должны увидеть две цветные полосы: ярко-розовую и бледную.
апельсин. Чтобы использовать любой из первых, попробуйте подготовить относительно
темный экстракт путем измельчения растительного материала в ступке и пестике
или в блендере с минимальным количеством воды. Процедить перед употреблением.

Студенческие группы могут делать простую смесь красителей, но смеси +
& — красители легко выпадают в осадок.Все миксы должны быть
отрицательно или все положительно заряжены.

Приготовьте красители в 0,25% растворе (25 мг / 10 мл). Добавьте 1 мл
глицерин, чтобы сделать смесь более густой, чтобы облегчить загрузку геля
колодцы. При приготовлении смесей красителей необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать появления красителя.
беспорядок и избегайте вдыхания порошков. Используйте фартук и перчатки и работайте
в хорошо проветриваемом помещении. Растворы красителей можно приобрести в
коммерческие источники, перечисленные в Приложении H.


Приложение G

Стратегия учителя
Определение молекулярной массы неизвестного белка

Обучающая стратегия

В этом упражнении по решению проблем предлагаются классы различных
способность определять молекулярную массу.Для студентов с
несколько предварительных навыков, выполните задание, как указано на стр. 19
который дает данные о расстоянии. Должны быть предоставлены расширенные классы.
только с диаграммой ниже, которая имитирует полученные данные
на гель-электрофорез этих белков. Студенты должны измерить
сами расстояния, как это сделал бы химик-исследователь.
Они получат большую погрешность. Световые линии
добавлен для облегчения измерения, но не будет ни на одном геле. В
полоса миоглогина изогнута в виде «улыбки», чтобы имитировать то, что
иногда возникает по краям геля.Также второй свет
полоса предназначена для гемоглобина, который может фрагментироваться на
половинки.


Приложение H

Источники материалов

Bio-Rad
Источник белков, микропипетки и наконечники
Наконечники для пипеток с тонким наконечником для инъекций в лунки, кат. # 223-9915 \

Предварительно окрашенные стандарты калейдоскопа, № по каталогу 161-0324; 90 долларов за 500
м L

Flinn Scientific
П.О. Box 219
Батавия, Иллинойс 60510-9958
Телефон 800-451-1261

Источник комплектов

  • Молекулярная масса белков с 3 белками, SDS и
    агароза, № по каталогу FB0308; 96,25 долл. США
  • Набор геля агарозы с красителями; Кот. # FB 0300; 56
  • долл. США

Источник красителей: приобретается отдельно

  • оранжевый G, бромкрезоловый зеленый, бромкрезоловый пурпурный, фенол
    красный, метоловый красный, метиленовый синий, кристаллический фиолетовый

Источник концентрированного буфера для электрофореза 50X TAE

  • Раствор агарозы, растопить и залить
  • красок для электрофореза

Frey Scientific , 905 Hickory Lane, P.О. Box 8101,
Мэнсфилд, Огайо 44901-8101,

  • PH 800-225-FREY
  • Набор «Электрофоретические свойства нативных белков»,
    # F18888, 85
  • долл. США

  • Набор для вводного электрофореза, # F18879, 50 долларов США (включает
    6 красителей, гель, агароза и буфер)
  • Набор для определения молекулярной массы белков, № F18887,
    85
  • долл. США

Источник трис-глицина, буфер SDS, полиакриламид, гели
реагент, краситель кумасси для белков, белковая агароза,

Видео по электрофорезу

Sigma Chemical
П.О. Box 14508
Сент-Луис, MO 63178-9916

Источник агарозы, белков и красителей х.ч., платина
провод

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.