Кишечное кровотечение мкб: Ошибка 404. Файл не найден

Содержание

%d0%b6%d0%b5%d0%bb%d1%83%d0%b4%d0%be%d1%87%d0%bd%d0%be-%d0%ba%d0%b8%d1%88%d0%b5%d1%87%d0%bd%d0%be%d0%b5%20%d0%ba%d1%80%d0%be%d0%b2%d0%be%d1%82%d0%b5%d1%87%d0%b5%d0%bd%d0%b8%d0%b5 — с русского на все языки

Все языкиАбхазскийАдыгейскийАфрикаансАйнский языкАканАлтайскийАрагонскийАрабскийАстурийскийАймараАзербайджанскийБашкирскийБагобоБелорусскийБолгарскийТибетскийБурятскийКаталанскийЧеченскийШорскийЧерокиШайенскогоКриЧешскийКрымскотатарскийЦерковнославянский (Старославянский)ЧувашскийВаллийскийДатскийНемецкийДолганскийГреческийАнглийскийЭсперантоИспанскийЭстонскийБаскскийЭвенкийскийПерсидскийФинскийФарерскийФранцузскийИрландскийГэльскийГуараниКлингонскийЭльзасскийИвритХиндиХорватскийВерхнелужицкийГаитянскийВенгерскийАрмянскийИндонезийскийИнупиакИнгушскийИсландскийИтальянскийЯпонскийГрузинскийКарачаевскийЧеркесскийКазахскийКхмерскийКорейскийКумыкскийКурдскийКомиКиргизскийЛатинскийЛюксембургскийСефардскийЛингалаЛитовскийЛатышскийМаньчжурскийМикенскийМокшанскийМаориМарийскийМакедонскийКомиМонгольскийМалайскийМайяЭрзянскийНидерландскийНорвежскийНауатльОрокскийНогайскийОсетинскийОсманскийПенджабскийПалиПольскийПапьяментоДревнерусский языкПортугальскийКечуаКвеньяРумынский, МолдавскийАрумынскийРусскийСанскритСеверносаамскийЯкутскийСловацкийСловенскийАлбанскийСербскийШведскийСуахилиШумерскийСилезскийТофаларскийТаджикскийТайскийТуркменскийТагальскийТурецкийТатарскийТувинскийТвиУдмурдскийУйгурскийУкраинскийУрдуУрумскийУзбекскийВьетнамскийВепсскийВарайскийЮпийскийИдишЙорубаКитайский

 

Все языкиАнглийскийНемецкийНорвежскийКитайскийИвритФранцузскийУкраинскийИтальянскийПортугальскийВенгерскийТурецкийПольскийДатскийЛатинскийИспанскийСловенскийГреческийЛатышскийФинскийПерсидскийНидерландскийШведскийЯпонскийЭстонскийТаджикскийАрабскийКазахскийТатарскийЧеченскийКарачаевскийСловацкийБелорусскийЧешскийАрмянскийАзербайджанскийУзбекскийШорскийРусскийЭсперантоКрымскотатарскийСуахилиЛитовскийТайскийОсетинскийАдыгейскийЯкутскийАйнский языкЦерковнославянский (Старославянский)ИсландскийИндонезийскийАварскийМонгольскийИдишИнгушскийЭрзянскийКорейскийИжорскийМарийскийМокшанскийУдмурдскийВодскийВепсскийАлтайскийЧувашскийКумыкскийТуркменскийУйгурскийУрумскийЭвенкийскийБашкирскийБаскский

Дивертикулярная болезнь, дивертикулез толстой кишки

Дивертикулярная болезнь – заболевание, характеризующееся клиническими проявлениями разной степени выраженности, обусловленными наличием дивертикула или дивертикулеза, включая воспаление (дивертикулит) и его осложнения (перидивертикулит, абсцесс, перфорация, свищ, перитонит), а также кровотечение.

Дивертикулярная болезнь поражает преимущественно сигмовидную кишку, затем нисходящую ободочную кишку, менее часто правую по­ловину поперечной ободочной кишки и редко правые отделы ободочной кишки.

Этиология

До настоящего времени неизвестно, какой из факторов более важен для развития дивертикулов: анатомический дефект кишечной стенки или действие сил в полости кишки.

Обнаружено, что базальное внутриполостное давление у больных диверти­кулярной болезнью и у здоровых лиц одинаковое. Одна­ко пораженный дивертикулами сегмент кишки сокращается сильнее в ответ на прием пищи или действие фармакологиче­ских стимулов.

Другим важным этиологическим фактором может быть слабость кишечной стенки. Тонус мускулатуры толстой кишки с возрастом постепенно снижается, что, по-видимому, объясняет преимущественное поражение лиц пожилого возраста.

Таким образом, дивертикулярную болезнь можно объяснить периодическим значительным повышением внутриполостного давления, воздействующим на ослабленную возрастными изме­нениями стенку толстой кишки.

Классификация

Данное заболевание классифицируется следующим образом:

  1. Дивертикулярная болезнь без клинических проявлений.
  2. Дивертикулярная болезнь с клиническими проявлениями. Эта форма характеризуется симптомокомплексом, включающим боли в животе и различные нарушения функции кишечника.
  3. Дивертикулярная болезнь с осложненным течением:
    1. дивертикулит;
    2. перфорация;
    3. кровотечение;
    4. кишечная непроходимость;
    5. внутренние или наружные кишечные свищи.

Симптомы, клиническая картина дивертикулеза и диагностика заболевания

Дивертикулез толстой киш­ки может длительное время не проявляться, и его обнаруживают случайно при обследовании больных.

Основными симптомами клинически выраженного неосложненного дивертикулеза толстой кишки являются боли в животе и на­рушения функции кишечника. Боли в животе носят разнообраз­ный характер — от легкого покалывания до сильных коликообразных. Чаще всего они локализуются в нижней половине живота, особенно в левой подвздошной области или над лобком, т. е. в зоне расположения сигмовидной кишки. У части больных эти боли разнообразны не только но своему характеру, но и по локализации, в связи с чем врач не всегда связывает их с заболеванием толстой кишки. У ряда больных боли вызываются приемом пищи, что объясняется влиянием гастроколического реф­лекса.

Нарушение функции кишечника проявляется чаще в виде запо­ров, причем длительное отсутствие стула значительно усиливает болевой синдром. Иногда отмечается диарея, не носящая, однако, постоянного характера. Неред­ко больные жалуются на неустойчивый стул; иногда описанные симптомы сочетаются с тошнотой или рвотой.

Осложнения дивертикулеза проявляются обычно довольно ярко. Наиболее часто наблюдается дивертикулит — примерно у 1/3 больных дивертикулярной болезнью толстой кишки. Основные признаки дивертикулита — боли в животе, повышение температуры и лейко­цитоз. Появление двух последних признаков на фоне существовав­шего клинически выраженного или бессимптомного дивертикулеза позволяет отличить начавшееся воспаление от функциональных болей.

При распространении воспалительного процесса в виде параколита наряду с перечисленными симптомами отмечается образование инфильтрата, размеры которого колеблются от незначитель­ных, с трудом определяемых при пальпации до обширных очагов, занимающих всю левую половину живота. Прогрессирование воспа­лительного процесса может привести к абсцедированию с угрозой прорыва гнойника в брюшную полость. Стихание воспаления не всегда приводит к полному рассасыванию инфильтрата, и тогда индурация брыжейки или окружающих тканей симулирует опу­холь брюшной полости.

Сигмовидная кишка или другие отделы ободочной кишки в ре­зультате повторных атак дивертикулита, параколита или форми­рования абсцесса могут оказаться спаянными с соседними орга­нами. При этом абсцесс может вскрыться в мочевой пузырь, урет­ру, влагалище или тонкую кишку с образованием свищей.

Перфорация дивертикула встречается как при клинически вы­раженном, так и бессимптомном дивертикулезе ободочной кишки. Перфорация в свободную брюшную полость ведет к развитию бы­стро прогрессирующего перитонита, клинические проявления кото­рого не отличаются от таковых при других формах острого воспа­ления брюшины. Кишечная непроходимость при дивертикулезе толстой кишки носит характер обтурационной со всеми присущи­ми этой форме проявлениями. Одной из частых причин развития непроходимости при дивертикулезе является образование так на­зываемой псевдоопухоли.

Кишечное кровотечение, хотя и не имеет, как правило, профузного характера, но все же часто бывает настолько выраженным, что быстро привлекает внимание как самого больного, так и вра­чей.

При определении источника кровотечения возника­ют значительные трудности. Кровотечение из дивертикула наблю­дается и при бессимптомном течении заболевания, что создает еще большие диагностические затруднения. Наряду с явным кровотече­нием могут наблюдаться и скрытые его формы, проявляющиеся только анемией. Симптомы перечисленных осложнений хотя и довольно яркие, однако не носят специфического характера. В связи с этим определить причины их возникновения иногда бывает весь­ма трудно и для этого применяют комплексное обследование.

Клинические проявления дивертикулеза толстой кишки и его осложнений не могут служить основанием для установления точ­ного диагноза заболевания. Диагностика и дифференциальная диагностика дивертикулеза толстой кишки основывается на анализе клиниче­ских проявлений заболевания и результатах обязательного рентге­нологического и эндоскопического исследований толстой кишки.

Консервативное лечение дивертикулярной болезни

В настоящее время сформулированы следующие принципы лечения этого заболевания:

  1. бессимптомный дивертикулез толстой кишки, обнаруживаемый случайно, не требует специального лечения. Назначается диета, богатая растительной клетчаткой, отруби.
  2. при дивертикулезе с выраженными клиническими проявлениями применяют комплекс лечебных мероприятий:
    1. сбалансированная диета, содержащая большое количество растительной клетчатки, а при упорных запорах и жидкости;
    2. витамины;
    3. препараты, нормализующие функцию кишечника;
    4. при выраженном спастическом компоненте назначают спазмолитические средства, либо блокаторы кальциевых каналов (Децител), которые действуют селективно на стенку кишечника. При болевом синдроме назначают анальгетики, препараты морфина для этих целей противопоказаны, так как они повышают внутрикишечное давление;
    5. при наличии явлений дивертикулита требуют назначения антибиотиков;
    6. при диарее можно использовать противодиарейные средства;
    7. при наличии ферментативной недостаточности поджелудочной железы назначаются ферментативные препараты;
    8. при выявлении дисбактериоза целесообразно применение бактериальных препаратов (колибактерин, бифидумбактерин, бификол).

Хирургическое лечение

Существуют следующие показания к хирургическому лечению дивертикулярной болезни:

Экстренные:

  • перфорация дивертикула;
  • кишечная непроходимость;
  • профузное кровотечение.

Плановые:

  • образование хронического инфильтрата, симулирующего злокачественную опухоль;
  • внутренние и наружные свищи;
  • клинически выраженная дивертикулярная болезнь, неподдающаяся комплексному консервативному лечению.

Энтерит у собак — симптомы и лечение, формы болезни, анализы, прививки, питание и профилактика

Энтерит — это воспаление тонкой кишки. Причиной воспалительного процесса могут стать вирусы, бактерии, простейшие, гельминты, отравление, инородные тела и даже ряд медицинских препаратов. Это очень опасное заболевание, так как оно ведет к сильным болям, снижению аппетита или полному отказу от пищи, диарее, рвоте. Болезнь может затронуть любой отдел желудочно-кишечного тракта.

Как проявляется заболевание у собак?

Энтерит у собак имеет явную симптоматическую картину. Без специальных лабораторных анализов эту болезнь можно спутать с обычным отравлением. Среди общих симптомов стоит отметить:

  • вялость, слабость, безразличие к играм,

  • болезненность в области живота,

  • рвота пенистыми массами,

  • жидкий стул с неприятным запахом и примесью крови,

  • отсутствие аппетита,

  • истощение.

Как протекает болезнь у собак?

Выделяют два вида энтерита у семейства псовых: инфекционный и неинфекционный.

Неинфекционная форма болезни возникает при отравлении, ожоге слизистой, поедании несъедобных вещей, что приводит к травме. Иногда причинами энетрита могут выступать и патогенные бактерии. Такие случаи лечатся без осложнений, при своевременном обращении к ветеринарному врачу.

Возбудителями вирусного энтерита выступают парвовирус, коронавирус и чума плотоядных.

Самым опасным является парвовирусный энтерит у собак – он влечет за собой летальный исход в 80% случаев. При попадании вируса в организм собаки, происходит быстрое поражение кишечника. Слизистая кишечника разрушается, появляются эрозии, начинается некроз тканей. На этом парвовироз не останавливается и переходит к поражению сердечной мышцы. Поражается миокард, стенки сосудов и меняется состав крови — осложнения приводят к сердечной форме энтерита. Вирус вызывает сильнейшую интоксикацию организма. Возникает прямая угроза жизни собаки, счет идет на часы и требуется срочная профессиональная помощь.

Коронавирусный энтерит у взрослых собак оказывает более слабое влияние на организм и не затрагивает сердце питомца. Он может проявиться в острой форме со всеми сопутствующими симптомами, а может и пройти бесследно. Опасность представляет для щенков, иммунная система которых еще не окрепла. Взрослые особи практически не умирают от коронавируса. 

Чума плотоядных, а именно кишечная форма, так же как и парвовирус является очень опасным заболеванием и может привести к летальному исходу даже с учетом обращения ко врачу.

Какие осложнения вызывает энтерит у собак?

Не все четвероногие легко преодолевают эту болезнь, особенно при тяжелых формах и при несвоевременно оказанной ветеринарной помощи. В этом случае наступают осложнения в виде:

  • миокардитов,

  • повреждений стенки тонкого кишечника,

  • перитонита,

  • воспалительного процесса в печени и поджелудочной железе,

  • непроходимости кишечника.

Как диагностировать болезнь у собак?

При обнаружении любых симптомов энтерита у собаки, следует незамедлительно обратиться в ветеринарную клинику. Парвовироз и чума плотоядных очень опасны, и в большинстве случаев дорога каждая минута, чтобы избежать фатального исхода.

Диагностика осуществляется на основании исследований: УЗИ и анализов крови. Для более точного определения вида возбудителя проводят ИФА и ПЦР исследования.

Анализы на энтерит у собак помогут специалисту определить этиологию происхождения болезни, отличить его от других кишечных расстройств и назначить своевременное лечение.

Нельзя пытаться самостоятельно поставить диагноз собаке и начинать её лечение.

Лечение энтерита у собак

Лечебные действия могут осуществляться как в стационаре, так и дома. Все будет зависеть от степени запущенности заболевания. Взятые лабораторные анализы на энтерит покажут полную картину для назначения собаке необходимых медикаментов. Комплексная терапия назначается для:

  • истребление вируса,

  • очищение организма от токсинов,

  • повышение иммунитета,

  • восстановление работы ЖКТ,

  • восстановление водно-солевого баланса,

  • купирование рвоты и диареи.

Лечится болезнь индивидуально подобранным набором лекарств, которые будут эффективны в каждом конкретном случае. В зависимости от степени тяжести и виде возбудителя применяют следующие виды медикаментов:

  • Иммуноглобулин и противоэнтеровирусная сыворотка. Они останавливают размножение вирусов, способствуют усилению иммунных клеток.

  • Регидратационные растворы. Восстанавливают водно-солевой баланс и устраняют обезвоживание

  • Обезболивающие и спазмолитики. Облегчить болевой синдром.

  • Противорвотные. Чтобы становить обезвоживание организма.

  • Сорбенты. Для выведения вредных токсических веществ.

  • Сердечные препараты. Используются, если вирус затронул сердечную мышцу.

  • Антибиотики. Помогают исключить присоединение вторичной инфекции.

  • Кровоостанавливающие. Останавливают кровь при ее появлении в каловых и рвотных массах.

  • Пробиотики, витамины, глюкоза. Для скорейшего восстановления организма.

  • Антигельминтные препараты. Применяются, когда энтерит осложнен глистами.

Если ситуация не критичная, то ветеринар назначает домашнее лечение. Для эффективности проводимой терапии, нужно провести полную санитарную обработку помещения, а также приобрести собаке все новые вещи. Не все дезинфицирующие средства способны справиться с вирусами, вызывающими энтерит, поэтому лучше провести кварцевание помещения.

Как собака может заразиться?

Вирусный энтерит очень живуч и способен долгое время сохраняться в любых условиях. Ему не страшны ни перепады температуры, ни воздействия окружающей среды. Причины энтерита у собак таятся в вирусных микроорганизмах, которые живут в каловых, рвотных массах и слюне болеющего животного. Иногда, чтобы заразиться, достаточно только понюхать инфицированную особь. Но, чтобы ваш домашний питомец заразился, совершенно не обязательно иметь контакт с продуктами животного происхождения. В ряде случаев вирус может принести хозяин на обуви, и его действие начнется в организме уже в инкубационный период, когда еще нет явных клинических проявлений.

Вирусы, вызывающие энтерит, устойчивы к дезинфицирующим средствам, и могут долго сохраняться в жилом помещении. Это может послужить причиной повторного заболевания уже переболевшего питомца спустя какое-то время.

Перспективы течения энтерита у собаки

Вирусный энтерит развивается стремительно. Поэтому жизнь питомца в руках хозяина. Своевременно оказанная медицинская помощь в первые два дня снижает риски летального исхода. В ином случае статистика печальна: щенки умирают в 90% случаев, взрослые собаки в 50% случаев. Эти показатели относятся к парвовирозу. В случае с короновирусом ситуация немного лучше, но и тут случаются летальные исходы.

Как защитить своего питомца от болезни?

Наиболее эффективным способом защитить четвероногого друга от вирусного заболевания является прививка моно- и поливакциной. Щенки прививаются до 8 месяцев по специальной схеме, а после ежегодно для поддержания защиты. Благодаря этому риск заболевания снижается на 95%. Но если питомец вдруг заболел, то болезнь проходит в более легкой форме.

В случае неинфекционного энтерита надо внимательно следить за рационом домашнего животного, и уберечь его от употребления вещей домашнего обихода, непригодных к поеданию.

Как кормить собаку при энтерите?

Во время болезни питомца необходимо кормить кормом для чувствительного пищеварения (подобные лечебные корма есть у многих производителей и обычно маркируются пометкой gastrointestinal или I/D). Подобный корм легче усваивается питомцем и улучшает состояние животного.

Такой рацион должен снять все вопросы о том, чем кормить питомца после выздоровления. Переходить на привычный рацион питания нужно очень осторожно, не ранее чем через месяц с начала болезни.

Опасен ли энтерит собак для человека?

Часто приводящие своих питомцев хозяева интересуются: может ли передаться людям энтерит? Специалисты утверждают, что вирусы, вызывающие энтерит у собак, специфичны только для семейства псовых. Они не способны заразить хозяев. У людей тоже нередки случаи возникновения энтерита, в разной форме проявления, но для него характерны свои возбудители.

Передается ли собакам и кошкам энтерит?

Возбудители, вызывающие энтерит у собак, неспецифичны для кошек, так как относятся к разным семействам. Но если рядом живет несколько представителей псовых, то все они автоматически попадают в группу риска, и важно своевременно провести профилактические меры.

Какие прививки делают для профилактики?

В настоящее время существует огромное количество зарегистрированных вакцин от энтерита. Это зарубежные и отечественные вакцины, однокомпонентные и комплексные. Эффективнее прививать комплексными препаратами. Часто применяются вакцины Нобивак и Эурикан.

Вакцинация должна осуществляться ежегодно, перед процедурой рекомендуется прогнать гельминтов, для повышения иммунитета.

Если Ваш четвероногий друг испытывает симптомы, которые вызывают беспокойство и напоминают признаки энтерита у собак, стоит немедленно показать его врачу. Ветклиника АМВет принимает даже самых сложных пациентов и готова оказать скорую помощь, необходимую терапию и дать рекомендации о том, как лечить питомца в домашних условиях. Если вы находитесь в растерянности насчет состояния здоровья своего питомца, Вы можете задать вопрос специалисту в чате или позвонить по телефону +7(495)106-02-03

Транексамовая кислота при остром желудочно-кишечном кровотечении (исследование HALT-IT): план статистического анализа для международного рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования | Испытания

Первичный анализ

В ходе основных анализов будут сравниваться те, кому назначен ТХА, с теми, кому назначено плацебо на основе модифицированного намерения лечить, за исключением пациентов, которые не получили ни одной дозы назначенного исследуемого лечения. Мы представим результаты как оценки воздействия (относительные риски) с определенной точностью (95% доверительный интервал) (см. Дополнительный файл 1: Таблица S2).Кроме того, мы представим результаты первичного анализа с поправкой на все исходные ковариаты. Если исходные ковариаты связаны с результатом, поправка на любой случайный дисбаланс в исходном риске повысит статистическую мощность. Мы не будем приводить различия в рисках, потому что они не являются обобщающей мерой эффекта лечения и зависят от исходного риска. Эффект ТХА также будет исследован графически с использованием кумулятивных кривых заболеваемости, представленных с соответствующими отношениями рисков и логарифмическими значениями p (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S2) [49].Влияние TXA на смерть из-за кровотечения в исследовании HALT-IT будет установлено в контексте других исследований TXA при остром тяжелом кровотечении (исследования CRASH-2 и WOMAN).

Первичный результат

Смерть в результате кровотечения в течение 5 дней после рандомизации является первичным исходом. Как указано в разделе «Изменение первичного исхода» выше, причина смерти назначается местными следователями, которые описывают события, приведшие к смерти. Описания причин смерти просматриваются главным исследователем (который не знает назначения лечения) и запрашиваются, если требуется дополнительная информация, чтобы подтвердить, вызвана ли смерть кровотечением или другой причиной.Кроме того, из-за двойного слепого характера исследования на кодирование причины смерти не может повлиять рандомизированная группа пациента. Для получения дополнительных сведений см. Сопроводительную информацию в разделе «Изменение основного результата».

Вторичные исходы

Мы оценим влияние ТХА на следующие вторичные исходы. Не скорректированный анализ будет представлен в основном тексте, и хотя мы не ожидаем каких-либо базовых дисбалансов, чтобы дополнить нескорректированный анализ и потенциально повысить статистическую мощность (если ковариаты связаны с результатом), мы представим результаты анализов, скорректированных для всех исходных ковариат. в приложении.

Повторное кровотечение

Повторное кровотечение обычно возникает примерно у 10–25% пациентов с острым желудочно-кишечным кровотечением и связано с повышенным риском смерти из-за кровотечения [50]. Клинический диагноз повторного кровотечения ставится лечащим врачом на основании любого из следующих критериев, определенных в руководстве по сбору данных. Эти критерии повторного кровотечения были рекомендованы методологической структурой для испытаний желудочно-кишечного кровотечения после международной консенсусной конференции [51]:

  • Гематемезис или кровавый назогастральный аспират> 6 ч после эндоскопии

  • Мелаена после нормализации цвета стула

  • Гематохезия после нормализации цвета стула или после мелены

  • Развитие тахикардии (ЧСС> 110 ударов в минуту) или гипотонии (САД <90 мм рт.ст.) после ≥ 1 часа гемодинамической стабильности (т.е. отсутствие тахикардии или гипотонии) при отсутствии альтернативного объяснения гемодинамической нестабильности, например сепсиса, кардиогенного шока или приема лекарств

  • Падение гемоглобина> 2 г / дл после двух последовательных стабильных значений (снижение <0,5 г / дл) ≥ С интервалом 3 часа

  • Тахикардия или гипотензия, которая не проходит в течение 8 часов после индексной эндоскопии, несмотря на соответствующую реанимацию (при отсутствии альтернативного объяснения), связанную со стойкой меленой или гематохезией

  • Постоянное снижение гемоглобина> 3 г / дл в течение 24 часов, ассоциированных с персистирующей меленой или гематохезией

Следует отметить, что пациенты могут продолжать иметь гемодинамическую нестабильность, падение уровня гемоглобина или постоянное меленовое или ректальное кровотечение в течение нескольких часов и даже дней после остановки кровотечения, что затрудняет эти пациенты. категоризировать; однако эти критерии скорее указывают на повторное кровотечение, чем на уравновешивание [51].

Большинство повторных кровотечений, как правило, происходит в течение 5 дней после индексного кровотечения [35,36,37]. Мы полагаем, что ТХА будет наиболее эффективным для снижения риска повторного кровотечения вскоре после индексного кровотечения, когда концентрации препарата в плазме крови выше уровня, необходимого для ингибирования фибринолиза [52]. Чтобы оценить, снижает ли TXA повторное кровотечение, мы проанализируем влияние на раннее повторное кровотечение в течение 5 дней после рандомизации (см. Дополнительный файл 1: Таблица S2).

Хотя повторное кровотечение наиболее часто встречается в течение первых 5 дней после индексного кровотечения, ТХА метаболизируется в течение примерно 2 дней после рандомизации, при этом концентрация в плазме крови падает ниже уровня, необходимого для ингибирования фибринолиза, в течение примерно 24 часов.Таким образом, мы изучим влияние на повторное кровотечение в течение 24 часов после рандомизации. Мы предполагаем, что ТХА будет менее эффективен при позднем повторном кровотечении через несколько дней или недель после отмены препарата. Чтобы исследовать это, мы оценим влияние TXA на повторное кровотечение в течение 28 дней (см. Дополнительный файл 1: Таблица S2). Если наша гипотеза верна, включение поздних повторных кровотечений должно ослабить лечебный эффект.

Смерть из-за кровотечения в течение 24 часов и 28 дней

Транексамовая кислота будет выведена в течение примерно 2 дней после рандомизации, при этом уровни в плазме крови упадут ниже уровней, необходимых для ингибирования фибринолиза, в течение примерно 24 часов.Кроме того, пациенты с острым желудочно-кишечным кровотечением быстро умирают, причем многие из них умирают из-за кровотечения в течение первого дня. Данные других исследований показывают, что именно здесь будет наблюдаться наибольшая польза от лечения. Таким образом, мы проанализируем влияние ТХА на смертность от кровотечений в течение 24 часов после рандомизации. И наоборот, поскольку может быть более слабый эффект лечения в отношении поздних смертей из-за кровотечений, которые происходят через несколько дней или недель после рандомизации, мы также проанализируем влияние на смерть из-за кровотечений в течение 28 дней после рандомизации (см. Дополнительный файл 1: Таблица S2) .Мы ожидаем увидеть меньший эффект лечения при включении поздних смертей от кровотечений из-за разбавления до нуля.

Смертность

Мы проанализируем влияние ТХА на общую и специфическую смертность через 28 дней. Конкретные причины смерти, подлежащие анализу, включают смерть в результате кровотечения, тромбоза, органной недостаточности, пневмонии, сепсиса, злокачественных новообразований и других причин (см. Дополнительный файл 1: Таблица S3). Мы также рассмотрим временное распределение причин смерти по дням с момента рандомизации, используя гистограмму частот (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S3).Основываясь на его механизме действия и данных крупных рандомизированных исследований, мы не ожидаем, что TXA снизит смертность от причин, не связанных с кровотечением, таких как рак или сепсис, или снизит позднюю смертность от кровотечений.

Эндоскопические, радиологические и хирургические процедуры при кровотечении из ЖКТ

Мы оценим влияние ТХА на диагностические и терапевтические эндоскопические и радиологические процедуры и хирургические вмешательства (см. Дополнительный файл 1: Таблица S5). Остается неясным, снижает ли ТХА необходимость хирургического вмешательства при желудочно-кишечном кровотечении [41].В крупных исследованиях ТХА при послеродовом и травматическом кровотечении не было доказательств влияния хирургических вмешательств, за исключением лапаротомии при кровотечении [39, 40]. Если ТХА уменьшает желудочно-кишечное кровотечение, это может снизить потребность в некоторых эндоскопических, радиологических и хирургических процедурах. Хотя мы не ожидаем, что ТХА повлияет на диагностические эндоскопические и радиологические процедуры, запланированные во время госпитализации и рандомизации, существует потенциал для уменьшения потребности в диагностических процедурах, запланированных после реанимации и, следовательно, после рандомизации [43].Точно так же терапевтические процедуры и хирургические вмешательства, запланированные и предпринятые после постановки диагноза, также могут быть подвержены влиянию ТХА. Невозможно просмотреть процедуры по времени, поскольку эта информация не была записана, и, хотя тип процедуры можно использовать как приблизительное указание времени, терапевтические или хирургические процедуры, запланированные примерно во время рандомизации, все же могут снизить оценку эффекта до нулевой.

Переливание крови

Поскольку переливание крови в основном определяется кровопотерей до рандомизации, мы не ожидаем увидеть заметного снижения потребности в переливании крови с использованием ТХА [43].Протоколы об основных кровотечениях определяют тип и объем компонентов крови, которые пациенты получают, на основании клинических признаков, таких как артериальное давление и предполагаемая кровопотеря. Кроме того, систематическая ошибка выживаемости может привести к более высоким показателям переливания крови в группе TXA. В соответствии с этим систематический обзор ТХА при желудочно-кишечных кровотечениях не выявил снижения трансфузий [41]. Хотя ТХА может снизить количество переливаний при кровопотере после рандомизации, например после повторного кровотечения мы не собирали данные о дате и времени переливания.Любое влияние на поздние переливания, вероятно, будет затушевано ранними переливаниями для оценки потери крови до рандомизации. Мы оценим влияние ТХА на использование цельной крови или эритроцитов, замороженной плазмы и тромбоцитов, сравнивая частоту переливаний и среднее количество перелитых единиц (эквивалент для взрослых) (см. Дополнительный файл 1: Таблица S5).

Тромбоэмболические события

В ходе метаанализа индивидуальных данных пациентов исследований WOMAN и CRASH-2 были обнаружены доказательства уменьшения частоты инфаркта миокарда с помощью ТХА (OR = 0,64, 95% ДИ 0,43–0,97; p = 0,037) и отсутствие доказательств повышенного риска фатальных событий окклюзии сосудов (OR 0,73, 95% CI 0 · 49–1 · 09; p = 0 · 120) или других нефатальных событий. [53].Хотя это открытие обнадеживает, мы не можем исключить возможность некоторого повышенного риска при применении ТХА, особенно потому, что пациенты с желудочно-кишечным кровотечением старше, чем пациенты с травматическим или послеродовым кровотечением, и у многих из них есть множественные сопутствующие заболевания. Пожилой возраст связан с прокоагуляционным гемостатическим профилем, включая повышенный уровень фибриногена и ингибитора активатора плазминогена 1, а также сокращение времени свертывания [54,55,56]. Систематический обзор ТХА для лечения кровотечений из верхних отделов ЖКТ не обнаружил доказательств разницы в риске тромбоэмболических событий, но недостаточная мощность [41].Мы изучим влияние ТХА на фатальную и нефатальную тромбоэмболию легочной артерии, тромбоз глубоких вен, инсульт и инфаркт миокарда (см. Дополнительный файл 1: Таблица S6).

Осложнения

Мы проанализируем влияние ТХА на почечную, печеночную и дыхательную недостаточность, сердечные приступы, сепсис, пневмонию и судороги (см. Дополнительный файл 1: Таблица S6). Если ТХА снижает смертность из-за кровотечения, пациенты в группе транексама в среднем будут жить дольше и, следовательно, могут подвергаться большему риску таких осложнений, как сепсис, пневмония и органная недостаточность.Как правило, смерть из-за кровотечения обычно наступает вскоре после начала кровотечения, тогда как инфекции и органная недостаточность возникают через несколько дней. С другой стороны, если ТХА снижает кровотечение, это может уменьшить печеночную недостаточность, поскольку кровотечение может привести к ухудшению функции печени. Хотя есть доказательства того, что высокие дозы ТХА могут вызывать судороги, мы не ожидаем увеличения количества приступов при применении низких доз в ходе исследования.

Возможности самообслуживания

Возможности пациентов самостоятельно заботиться о себе будут измеряться с использованием Индекса независимости Каца в повседневной деятельности (Katz ADL) [57].Эффективность участников по шести функциям (купание, одевание, туалет, перемещение, воздержание и кормление) оценивается во время выписки из больницы для рандомизации или в больнице через 28 дней после рандомизации. Каждой функции, которую человек может выполнять независимо, присваивается 1 балл, и они суммируются для получения общего балла. Оценка 6 указывает на полное функционирование, 4 — на умеренное нарушение, а 2 или менее — на тяжелое функциональное нарушение. Мы ожидаем, что снижение кровопотери у пациентов, получающих ТХА, приведет к меньшим функциональным нарушениям.Тем не менее, вполне возможно, что пациенты в группе лечения будут выписываться быстрее, что может скрыть улучшение способности к самообслуживанию во время выписки. Чтобы оценить эту гипотезу, мы сравним разницу в средних показателях Katz ADL у выживших в группах TXA и плацебо, а также долю пациентов без нарушений (6), с легкими и умеренными нарушениями (3-5) или с тяжелыми нарушениями (0 –2), (см. Дополнительный файл 1: Таблица S6).

Дни, проведенные в отделении интенсивной терапии или отделении с высокой степенью зависимости

Мы проанализируем влияние TXA на количество дней, проведенных в отделении интенсивной терапии (ICU) или отделении с высокой степенью зависимости (HDU).Мы сравним разницу в среднем количестве дней, проведенных в ОИТ или HDU в группах TXA и плацебо (см. Дополнительный файл 1: Таблица S6). Поскольку количество коек в этих отделениях может быть ограничено, мы можем не увидеть влияния на этот показатель результата.

Неблагоприятные события

Будут представлены данные о количестве нежелательных явлений (НЯ), серьезных нежелательных явлений (СНЯ) и подозреваемых неожиданных серьезных нежелательных реакциях (SUSAR), о которых сообщалось в срок до 28 дней после рандомизации. Мы представим сводную таблицу в дополнительном файле 1, чтобы описать тип НЯ, предпочтительный термин (PT) в Медицинском словаре нормативной деятельности (MedDRA), класс системного органа MedDRA (SOC), а также количество случаев и исходов (полностью восстановлено, выздоровел с осложнениями или умер) в группах ТХА и плацебо.С событиями, сгруппированными по MedDRA SOC, мы сравним частоту событий между экспериментальными группами, используя нескорректированную модифицированную модель регрессии Пуассона (см. Дополнительный файл 1: Таблица S7). НЯ с доказательством того, что они могут усиливаться ТХА (т. Е. Судороги и тромбоэмболические события), будут анализироваться на индивидуальной основе, а также повторяющиеся эпизоды желудочно-кишечного кровотечения, зарегистрированные как НЯ.

Анализ подгрупп

Мы проведем следующие анализы подгрупп для определения первичного исхода смерти от кровотечения: время до лечения, место кровотечения, причина кровотечения и клиническая оценка по шкале Рокалла.Мы подгоним условия взаимодействия с рандомизированной группой в модель регрессии Пуассона с устойчивой дисперсией ошибок сэндвич-оценки [58]. Тесты взаимодействия (тест Вальда) будут использоваться для изучения того, различается ли эффект лечения (если таковой имеется) в этих подгруппах. Результаты будут представлены в виде нескорректированных и скорректированных оценок эффекта с мерой точности (95% доверительный интервал) и значением p для теста на взаимодействие (см. Дополнительный файл 1: Таблица S4). За исключением времени до лечения, требуется статистически значимая гетерогенность между подгруппами, как определено тестом взаимодействия p , а не только статистическая значимость результата в конкретной подгруппе [59].

Хотя группа лечения рандомизирована внутри подгрупп, факторы, определяющие подгруппы, не рандомизированы. С переменными подгруппы связаны несколько базовых характеристик. Например, раннее лечение коррелирует с характеристиками кровотечения и характеристиками пациента (см. Рис. 2), некоторые из которых дают более высокий клинический балл по Роколлу, что позволяет предположить, что пациенты с более тяжелым кровотечением получают лечение раньше. Поскольку эти факторы также связаны со смертностью, они потенциально могут затруднить взаимосвязь между временем до лечения и эффектом лечения.

Рис. 2

Потенциальные смешивающие факторы в подгрупповом анализе времени до лечения

Если доказано, что ТХА эффективен, а лечебный эффект варьируется в зависимости от времени лечения, есть возможность вмешаться вовремя до лечения, чтобы увеличить лечебный эффект. Хотя мы не можем вмешаться в определение места кровотечения, причины кровотечения или клинической шкалы Рокалла, мы заинтересованы в установлении причинного взаимодействия этих факторов с лечебным эффектом, а не просто в оценке гетерогенности эффекта.Таким образом, мы скорректируем все анализы подгрупп с учетом потенциальных искажающих факторов [60]. Выбор потенциальных искажающих факторов основан на обзоре неслепых данных в рамках исследования на сегодняшний день, чтобы определить прогностические исходные характеристики, которые связаны с переменными подгруппы. Потенциальные искажающие факторы включают возраст, время до лечения, САД, ЧСС, признаки шока, место кровотечения, подозрение на активное кровотечение, сопутствующее заболевание печени и подозрение на кровотечение из варикозно расширенных вен. Признаки шока могут быть коллинеарны ЧСС или артериальному давлению, и подозрение на кровотечение из варикозно расширенных вен может коллинеарно с сопутствующим заболеванием печени — в этом случае признаки шока и подозрение на кровотечение из варикозно расширенных вен не будут включены в модели.Окончательные модели еще предстоит определить, потому что интересующий результат — это эффект лечения, а связь между потенциальными искажающими факторами и эффектом лечения не может быть оценена до разблокирования.

Время до лечения (≤ 3 ч,> 3 ч)

Испытания ТХА при травматических и послеродовых кровотечениях доказывают, что раннее лечение (в течение 3 часов от начала кровотечения) дает наибольшую пользу, а позднее лечение неэффективно [39, 53, 61]. Таким образом, мы планируем провести анализ подгруппы эффекта лечения, стратифицированного по времени лечения.У пациентов с желудочно-кишечным кровотечением симптомы могут проявляться не сразу, поэтому время появления симптомов может неточно отражать время начала кровотечения. Поэтому время до лечения может быть недооценено. Поскольку немногие пациенты получают лечение на ранней стадии (в течение 3 часов), может быть низкая мощность для обнаружения взаимодействия, если оно существует. Таким образом, мы будем анализировать время до лечения как категориальную (≤ 3 ч,> 3 ч) и как непрерывную переменную, потому что последняя сохранит больше информации, поэтому должна иметь больше возможностей. Однако ограничение времени моделирования для лечения как непрерывной переменной заключается в необходимости указать форму связи.Чтобы оценить нелинейность, мы подберем модель логистической регрессии и воспользуемся тестом отношения правдоподобия. Будут отмечены любые различия между двумя подходами.

Существуют убедительные предшествующие доказательства того, что следует ожидать взаимодействия времени до лечения, при этом раннее лечение дает большую пользу, а позднее лечение оказывается неэффективным и, возможно, даже вредным [53, 61]. Таким образом, для подгруппового анализа времени до лечения нам не требуются столь веские доказательства против нулевой гипотезы однородности, как мы обычно можем требовать.Большинству исследований не хватает мощности для выявления неоднородности эффектов лечения, и отсутствие статистически значимого взаимодействия не означает, что общий эффект лечения распространяется на всех пациентов. В связи с предшествующими доказательствами того, что раннее лечение более эффективно, мы рассмотрим анализ подгруппы времени до лечения в контексте существующих данных (в частности, данных испытаний CRASH-2 и WOMAN) о взаимодействии времени до лечения и полагаться больше на научное суждение, чем на статистические тесты.

Место кровотечения (верхний желудочно-кишечный тракт, нижний желудочно-кишечный тракт)

Мы исследуем влияние ТХА на смерть из-за кровотечения, стратифицированного по локализации (верхний и нижний желудочно-кишечный тракт). Данные свидетельствуют о том, что частота повторного кровотечения и смертности после кровотечений из верхних и нижних отделов желудочно-кишечного тракта схожи [34], и нет оснований ожидать, что эффект ТХА будет существенно различаться в зависимости от места кровотечения в желудочно-кишечном тракте. Если нет убедительных доказательств против нулевой гипотезы однородности эффектов (например, p <0.01), общий относительный риск будет считаться наиболее надежным ориентиром для приблизительного эффекта лечения для всех пациентов.

Подозрение на кровотечение из варикозно расширенных вен и сопутствующее заболевание печени (да, нет / неизвестно)

Исходы острого желудочно-кишечного кровотечения зависят от причины кровотечения. Варикозное кровотечение связано с самым высоким риском повторного кровотечения и смерти. Варикозное расширение вен пищевода — это расширенные подслизистые вены, которые обычно развиваются из-за портальной гипертензии, часто из-за цирроза печени. Гемостаз нарушается у пациентов с заболеванием печени, потому что многие из про- и антикоагуляционных факторов и компонентов фибринолитической системы продуцируются печеночными паренхиматозными клетками в печени, хотя общая сумма эффектов обсуждается [62,63,64] .Любой результирующий дисбаланс в коагуляции или фибринолизе может изменить антифибринолитическую активность ТХА; однако направление этого потенциального эффекта еще предстоит определить. Мы изучим влияние ТХА на смерть из-за кровотечения у пациентов с подозрением на кровотечение из варикозно расширенных вен и сопутствующее заболевание печени по сравнению с другими или неизвестными причинами кровотечения. Если нет убедительных доказательств против нулевой гипотезы однородности эффектов (т.е. p <0,01), общий относительный риск будет считаться наиболее подходящей мерой воздействия.

Клиническая шкала Рокалла (1–2, 3–4, 5–7)

Мы будем оценивать эффект ТХА, стратифицированный по клинической (до эндоскопии) шкале Рокалла, широко используемой системе оценки риска желудочно-кишечного кровотечения. Оценка рассчитывается на основе возраста, сопутствующих заболеваний, признаков шока, ЧСС и САД, которые являются независимыми предикторами смертности. Хотя шкала Rockall изначально была разработана для кровотечений из верхних отделов ЖКТ [17], также было показано, что они позволяют прогнозировать смертность при кровотечениях из нижних отделов желудочно-кишечного тракта [34]. Мы не ожидаем, что лечебный эффект будет зависеть от оценки Рокалла.Если нет убедительных доказательств взаимодействия ( p <0,01), мы представим общий относительный риск как наиболее подходящую меру эффекта.

Отсутствующие данные

На основании данных, собранных на сегодняшний день, мы ожидаем, что потери для последующего наблюдения будут минимальными (т.е. менее 1% недостающих данных о первичном исходе). Любые пропущенные значения будут сообщены, но не вменены.

План статистического анализа для международного рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования

Ливерпуль, Ливерпуль, Великобритания.

8

Факультет медицины и медицинских наук, Университет

, Ноттингем, Медицинский центр Куинса, Ноттингем NG7 2UH, Великобритания.

9

Отделение

гастроэнтерологии, Медицинский факультет, Университетская больница, Западный

Университет

, Лондон, Канада.

10

Департамент эпидемиологии и биостатистики,

Western University, Лондон, ON, Канада.

11

Медицинский университет Равалпинди

и Лондонская школа гигиены и тропической медицины (RMU-LSHTM)

Collaboration, Комната № 294, Больница Святой семьи, Саид Пур Роуд, Равалпинди,

Пакистан.

12

Департамент медицины, Больничное отделение III, Медицинское отделение III,

Jail Road, Лахор, Пакистан.

13

Transfusion Medicine, NHS Blood и

Transplant, Оксфорд, Великобритания.

14

Отделение гематологии Оксфордского университета

Больницы NHS Foundation Trust, Оксфорд, Великобритания.

15

Radcliffe Department of

Medicine, Оксфордский университет, и Oxford BRC Hematology Theme, Oxford,

UK.

16

Отделение гастроэнтерологии, Royal Wolverhampton NHS Trust,

Wolverhampton, UK.

Получено: 1 февраля 2019 г. Принято: 8 июля 2019 г.

Источники

1. Button LA, Roberts SE, Evans PA, Goldacre MJ, Akbari A, Dsilva R, et al.

Госпитализированная заболеваемость и летальность в связи с кровотечением из верхних отделов желудочно-кишечного тракта с

1999–2007 гг .: исследование связи рекордов. Алимент Pharmacol Ther. 2011; 33: 64–76.

2. Hippisley-Cox J, Coupland C.Прогнозирование риска кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта

и внутричерепного кровотечения с помощью антикоагулянтов: когортное исследование для получения и

для проверки баллов QBleed. BMJ. 2014; 349: g4606.

3. Theocharis GJ, Thomopoulos KC, Sakellaropoulos G, Katsakoulis E,

Nikolopoulou V. Изменяющиеся тенденции в эпидемиологии и клинических исходах

острых кровотечений из верхних отделов желудочно-кишечного тракта в определенной географической области в

Греции. J Clin Gastroenterol. 2008. 42: 128–33.

4. Чернихоу П., Хочайн П., Ноусбаум Дж. Б., Раймонд Дж. М., Руделли А., Дупас Дж. Л.,

и др. Эпидемиология и течение острого кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта

в четырех географических регионах Франции. Eur J Gastroenterol

Hepatol. 2000; 12: 175–81.

5. van Leerdam M, Vreeburg E, Rauws EA, Geraedts AA, Tijssen JG, Reitsma J,

et al. Острое кровотечение из верхних отделов желудочно-кишечного тракта: изменилось ли что-нибудь?: Анализ временных тенденций

заболеваемости и исходов острых кровотечений из верхних отделов желудочно-кишечного тракта между 1993/1994 гг.

и 2000.Am J Gastroenterol. 2003. 98: 1494–149.

6. Хрейнссон Дж. П., Калайцакис Э., Гудмундссон С., Бьорнссон Э. С.. Верхний

Желудочно-кишечное кровотечение: частота, этиология и исходы в популяционных условиях

. Сканд Дж Гастроэнтерол. 2013. 48: 439–47.

7. Лайне Л., Ян Х., Чанг С.-С., Датто С. Тенденции частоты госпитализаций

и смерти от желудочно-кишечных осложнений в США с 2001 по 2009 год.

Am J Gastroenterol. 2012; 107: 1190–5.

8. Wuerth BA, Rockey DC. Изменения эпидемиологии верхних

желудочно-кишечных кровотечений за последнее десятилетие: общенациональный анализ.

Dig Dis Sci. 2018; 63: 1286–93.

9. Abougergi MS, Travis AC, Saltzman JR. Уровень госпитальной смертности от кровоизлияния в верхние отделы ЖКТ

снизился за 2 десятилетия в Соединенных Штатах: по общенациональному анализу

. Gastrointest Endosc. 2015; 81: 882–8 e1.

10. Херншоу С.А., Логан Р.Ф., Лоу Д., Трэвис СПЛ, Мерфи М.Ф., Палмер К.Р.

Острое кровотечение из верхних отделов желудочно-кишечного тракта в Великобритании: характеристики пациентов,

диагнозов и исходы по результатам аудита 2007 года в Великобритании. Кишечник. 2011; 60: 1327–35.

11. Окленд К., Гай Р., Уберой Р., Хогг Р., Мортенсен Н., Мерфи М. Ф. и др. Острое кровотечение из нижних отделов желудочно-кишечного тракта

в Великобритании: характеристики пациентов, вмешательства и результаты

результатов первого общенационального аудита. 2016.

12. Ди Фиоре Ф., Леклер С., Мерль В., Эрве С., Дюамель С., Дюпа Дж. Л. и др.

Изменения в характеристиках и исходе острого кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта

Кровоизлияние: сравнение эпидемиологии и практики между

1996 и 2000 в многоцентровом французском исследовании.Eur J Gastroenterol

Hepatol. 2005; 17: 641–7.

13. Эль-Сераг HB, Everhart JE. Повышение выживаемости после кровотечения из варикозно расширенных вен более

за 11-летний период в Департаменте по делам ветеранов. Am J Gastroenterol.

2000; 95: 3566–73.

14. Карбонелл Н., Пауэлс А., Серфати Л., Фурдан О., Леви В. Г., Поупон Р. Повышение выживаемости

после кровотечения из варикозно расширенных вен у пациентов с циррозом печени за последние два

десятилетия. Гепатология. 2004; 40: 652–9.

15.McCormick PA, O’Keefe C. Улучшение прогноза после первого кровотечения из варикозно расширенных вен

за четыре десятилетия. Кишечник. 2001; 49: 682–5.

16. Lanas A, Aabakken L, Fonseca J, Mungan ZA, Papatheodoridis GV,

Piessevaux H, et al. Клинические предикторы неблагоприятных исходов среди пациентов

с кровотечением из верхних отделов желудочно-кишечного тракта не из варикозно расширенных вен в Европе. Алимент

Pharmacol Ther. 2011; 33: 1225–33.

17. Роколл Т.А., Логан РФ, Девлин Х.Б., Нортфилд ТК. Оценка риска после острого кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта

.Кишечник. 1996; 38: 316–21.

18. Van Leerdam ME. Эпидемиология острого кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта.

Лучшая Практика Рес Клин Гастроэнтерол. 2008; 22: 209–24.

19. Робертс С.Е., Баттон Л.А., Уильямс Дж. Дж. Прогноз после кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта

. PLoS One. 2012; 7 (12): e49507. https://doi.org/10.13

71 / journal.pone.0049507.

20. Джайрат В., Томпсон Дж., Кахан BC, Дэниел Р., Херншоу С.А., Трэвис СПЛ и др.

Плохие исходы у госпитализированных пациентов с желудочно-кишечным кровотечением:

влияние исходного риска, тяжести кровотечения и процесса оказания помощи.Am J

Гастроэнтерол. 2014; 109: 1603–12.

21. Кавиани М.Дж., Пирастехфар М., Азари А., Саберифирузи М. Этиология и исход

пациентов с кровотечением из верхних отделов желудочно-кишечного тракта: исследование, проведенное на юге Ирана.

Саудовская Дж. Гастроэнтерол. 2010; 16: 253–9.

22. Угиагбе Р., Ому Эму С. Этиология кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта в

, Обучающая больница Бенинского университета, юг-юг Нигерии. Нигер

J Surg Sci. 2016; 26: 29.

23.Wang J, Cui Y, Wang J, Chen B, He Y, Chen M. Клинические эпидемиологические характеристики

и тенденции изменения кровотечений из верхних отделов желудочно-кишечного тракта за

за последние 15 лет. Чжунхуа Вэй Чанг Вай Кэ За Чжи. 2017; 20: 425–31.

24. Минакари М., Бадихиан С., Джалалпур П., Себгатоллахи В. Этиология и исход

у пациентов с кровотечением из верхних отделов желудочно-кишечного тракта: исследование с участием 4747 пациентов в

центральном регионе Ирана. J Gastroenterol Hepatol. 2017; 32: 789–96.

25. Ким Дж. Дж., Шейбани С., Парк С., Буксбаум Дж., Лайне Л. Причины кровотечений и

исходов у пациентов, госпитализированных с кровотечением из верхних отделов желудочно-кишечного тракта. J

Клин Гастроэнтерол. 2014; 48: 113–8.

26. Хасан Аль-Дхолеа MHH, Мохсен Мохаммед Аль-Макдад ASM, Мохаммед

Аль-Хайми MA, Makky MTA, Абделла Хасан Балфаких OS, Ахмед ВАМ и др.

Детерминанты и исход острого кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта в

Йемен. J Gastrointest Dig Syst.2014; 04: 1–4.

27. Элвакил Р., Реда М.А., Абдельхакам С.М., Гораба Д.М., Ибрагим В.А. Причины и

исход кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта в отделении неотложной эндоскопии

университетской больницы Айн-Шамс. J Egypt Soc Parasitol. 2011; 41: 455–67.

28. Алема О.Н., Мартин Д.О., Окелло Т.Р. Эндоскопические данные у

пациентов с желудочно-кишечным кровотечением в верхних отделах желудочно-кишечного тракта в больнице Лакор, северная Уганда. Afr

Health Sci. 2012; 12: 518–21.

29. Цзян И, Ли И, Сюй Х, Ши И, Сон Й, Ли Ю.Факторы риска кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта

, требующего госпитализации. Int J Clin Exp Med. 2016; 9 (2): 4539–44.

30. Гадо А., Абдельмохсен А., Эбейд Б., Аксон А. Клинические исходы острого желудочно-кишечного кровотечения

у пациентов, госпитализированных в государственную больницу

в Египте. Саудовская Дж. Гастроэнтерол. 2012; 18:34.

31. Залтман К., Соуза Х.С., Кастро М.Э., Собрал, М.Д. Ф., Диас П.К., Лемос В. Младший. Верхний

желудочно-кишечное кровотечение в бразильской больнице: ретроспективное исследование

эндоскопических записей.Арк Гастроэнтерол. 2002; 39: 74–80.

32. Каямба В., Синкала Е., Мванамакондо С., Соко Р., Кавимбе Б., Амади Б.,

et al. Тенденции в диагностике верхних отделов желудочно-кишечного тракта за четыре десятилетия в

Лусаке, Замбия: ретроспективный анализ результатов эндоскопии. BMC

Гастроэнтерол. 2015; 15: 127.

33. Шер Ф., Уллах Р.С., Хан Дж., Мансур С.Н., Ахмед Н. Частота различных

причин кровотечения из верхних отделов желудочно-кишечного тракта с использованием эндоскопической процедуры в больнице третичного уровня

.Pak Armed Forces Med J. 2014.

34. Квак М.С., Ча Дж. М., Хан Й. Дж., Юн Дж. Й., Чон Дж. У., Шин Х. П. и др. Клинические исходы

кровотечения из нижних отделов желудочно-кишечного тракта не лучше, чем у

кровотечений из верхних отделов желудочно-кишечного тракта. J Korean Med Sci. 2016; 31: 1611–6.

35. Hsu P-I, Lin X-Z, Chan S-H, Lin C-Y, Chang T-T, Shin J-S и др. Кровотечение

факторов риска язвенной болезни для повторного кровотечения и последовательные изменения в

эндоскопических данных. Gtut. 1994; 35: 746–9.

36. Northfield TC. Факторы, предрасполагающие к повторному кровотечению после острого

желудочно-кишечного кровотечения. Br Med J. 1971; 1: 26–8.

37. Смит Дж. Л., Грэм Д. Я. Кровоизлияние из варикозно расширенных вен: критическая оценка выживаемости

анализ. Гастроэнтерол Ам Гастроэнтерол доц. 1982; 82: 968–73.

38. Кер К., Эдвардс П., Перел П., Шакур Х., Робертс И. Влияние транексамовой кислоты на хирургическое кровотечение

: систематический обзор и кумулятивный метаанализ. BMJ.2012; 344: e3054.

39. ЖЕНЩИНЫ, соавторы исследования. Влияние раннего введения транексамовой кислоты на

смертность, гистерэктомию и другие заболевания у женщин с послеродовым кровотечением

(ЖЕНЩИНА): международное рандомизированное двойное слепое плацебо-

контролируемое исследование. Ланцет. 2017; 389: 2105–16.

40. Сотрудники исследования CRASH-2, Шакур Х., Робертс И., Баутиста Р., Кабальеро Дж., Коутс

Т и др. Влияние транексамовой кислоты на смерть, сосудистые окклюзионные события и

Brenner et al.Испытания (2019) 20: 467 Страница 12 из 13

У мышей с дефицитом ERAP1 снизилось количество регуляторных Т-клеток 1-го типа и развились скелетные и кишечные особенности анкилозирующего спондилита

Процедуры на животных

Все эксперименты были выполнены на C57BL / 6 (WT) или Глобальные мыши с нокаутом C57BL / 6 по ERAP1 (ERAP1 — / — ), которые были любезным подарком от доктора Кеннета Рока (профессора Медицинской школы Массачусетского университета). Все мыши, использованные в экспериментах, были выращены в домашних условиях. Все процедуры на животных были рассмотрены и одобрены EHS, IBC и IACUC Мичиганского государственного университета (http: // iacuc.msu.edu.proxy1.cl.msu.edu/) и соответствует руководящим принципам NIH (номер AUF: 02 / 13-045-00). Уход за мышами осуществлялся в соответствии со стандартами PHS и AAALAC.

мкКТ-изображение и оценка анкилоза

Позвонки собирали, фиксировали и сканировали с использованием системы микрокомпьютерной томографии (мкКТ) GE Explore Locus, как описано ранее 49 . Сканирование было выполнено с использованием разрешения вокселей 20 мкм, полученного из 720 изображений. Были использованы приращение угла луча 0,5, сила луча 80 пик кВ и 450 мкА.Каждый запуск включал соответствующий возрасту WT и ERAP — / — шипов, а также калибровочный фантом для стандартизации и согласованности. Изображения изоповерхности были созданы с использованием среднего автопорогового значения 1009 для отделения кости от мягкой ткани с использованием программного обеспечения MicroView. Правая и левая стороны поясничных позвонков 6 (L6) оценивались отдельно, и оценки были усреднены для расчета среднего балла по анкилозу. «0» представляет морфологию WT L6; a 1 представляет начало синдесмофита, растущего от L6 0.5–1 мм длиной; 2 — синдесмофит протяженностью 1-2 мм; а 3 представляет собой мостиковый синдесмофит, простирающийся на 2 мм и контактирующий с подвздошной костью, но не слитый с S1; а цифра 4 — полностью сросшийся стык. Репрезентативные оценки показаны на рис. 1а.

Анализ трабекулярной кости S1 позвонка был выполнен с использованием расширенной области интереса, созданной с использованием шлицев в поперечной плоскости, очерчивая всю длину тела позвонка, за исключением внешней кортикальной кости. Для отделения кости от костного мозга использовались средние пороговые значения 1232 для крестца.Минеральная плотность костной ткани, ее содержание, объемная доля кости, толщина трабекул, интервалы и числовые значения, а также репрезентативные изображения изоповерхности были получены с использованием программного обеспечения GE Healthcare MicroView. Измерения костей были слепыми до окончательного анализа.

Индекс AS

Индекс AS был рассчитан путем суммирования среднего балла по анкилозу и назначенного балла МПК, где 325–300 мг / см3 получили балл 1, 299–275–2, 274–250–3 и <250 –4.

Оценка эрозии

SI-суставов оценивали и оценивали на предмет эрозий с помощью программного обеспечения MicroView в сагиттальной плоскости, где «0» представлял гладкий сустав; «1» — сустав с легкими эрозиями; а «2» — эрозии размером> 1 мм или> 3 эрозии в одном суставе.Оба сустава SI оценивались отдельно и усреднялись.

Эксперименты с DSS-индуцированным колитом

Самцов мышей в возрасте 8 недель лечили 3% DSS (MP Biologicals), растворенным в стерильной дистиллированной воде. Мышам давали DSS в стерильной питьевой воде ad libitum в течение 1-7 дней эксперимента (контрольные получали только стерильную воду), а затем обычную воду до конца исследования. Растворы DSS готовили свежими в день 0 и 3. Вес тела, консистенцию стула и наличие крови в стуле определяли ежедневно, как описано ранее 50 .Исходный клинический балл определяли в день 0. Процедуры подсчета баллов выполнялись следующим образом. Потеря веса относительно исходного уровня: 0 — нет потери веса; 1, 1–5% потеря веса; 2, 5–10% потеря веса; 3, потеря веса 10–20%; и 4 — потеря веса> 20%. Баллы по стулу определялись следующим образом: 0 — гранулы правильной формы; 1, стул полуформой, не прилегающий к анальному отверстию; 2, пастообразный и полуформированный стул, приставший к анальному отверстию; 3, жидкий стул, прилипший к анусу. Баллы по кровотечению определялись следующим образом: 0 — без крови; 1, заметны незначительные следы крови в кале; 2, видимые следы крови в стуле; 3 — видимые следы крови и темный стул без ректального кровотечения; 4, сильное ректальное кровотечение.DAI был рассчитан путем сложения показателей массы тела, консистенции стула и ректального кровотечения и деления общего числа на 3.

Анализ микробного сообщества

Образцы фекалий были отправлены компании Microbiome Insights на сухом льду, которая выполнила секвенирование и анализ. . Гены 16S (область V4) секвенировали на приборе Illumina MiSeq. Необработанные файлы Fastq были отфильтрованы по качеству и сгруппированы в 97% похожих OTU с использованием программного конвейера mothur [http://www.mothur.org]. 3,23428 × 10 5 бактериальных считываний высокого качества.В окончательном наборе данных было 3469 OTU (включая те, которые встречались один раз со счетом 1) и диапазон чтения 1,1499 × 10 4 и 1,9824 × 10 4 . Считывания высокого качества были классифицированы с использованием Greengenes (v. 18_9) в качестве справочной базы данных. Численность OTU была объединена по родам и нанесена на график как относительная численность. Численность OTU была суммирована с помощью индекса Брея-Кертиса, и был проведен неметрический анализ многомерной шкалы (NMDS) для визуализации сходства микробиома на графиках ординации.Перестановочный многомерный дисперсионный анализ (PERMANOVA) с поправкой Бонферрони использовался для расчета значимых различий между группами.

Гистология

Срезы толстой кишки получали от DSS-обработанных мышей WT или ERAP1 — / — на 7 день, фиксировали, окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и оценивали, как описано ранее 22 . Мыши получили 0–3 балла за воспаление, где 1, 2 и 3 соответствовали лимфоцитарной инфильтрации эпителия, слизистой оболочки и трансмуральному воспалению, соответственно.Затем толстую кишку оценивали от 0 до 3 баллов для патологических изменений архитектуры кишечника, причем 1, 2 и 3 балла соответствовали очаговым эрозиям, обширным эрозиям и обширным изъязвлениям с грануляционной тканью, соответственно.

Колючки собирали, фиксировали в течение 48-72 часов и дополнительно обрабатывали для H&E и иммуногистохимии, как описано ниже.

Обычное окрашивание гематоксилином и эозином

Образцы тканей, предварительно зафиксированные в 10% нейтральном забуференном формалине, были обработаны и подвергнуты вакуумной инфильтрации парафином на тканевом процессоре Sakura VIP 2000; с последующей установкой на станцию ​​заливки ThermoFisher HistoCentre III.После охлаждения блоков излишки парафина были удалены с краев, помещены на ротационный микротом Reichert Jung 2030 и повернуты, чтобы обнажить образец ткани. После облицовки блок охлаждают и нарезают мелкие срезы размером 4–5 микрон. Срезы сушили в инкубаторе для предметных стекол при 56 ° C, чтобы гарантировать прилипание к предметным стеклам в течение 2–24 часов, не превышая эту температуру, которая потенциально может разрушить антигенные компоненты. Слайды были извлечены из инкубатора и окрашены стандартным методом гематоксилина и эозина следующим образом: две смены ксилола — по 5 минут каждое, две смены абсолютного этанола — по 2 минуты каждое, две смены 95% этанола — по 2 минуты каждое, проточный кран промыть водой в течение 2 минут, выдержать гематоксилин (Диагностика рака — Дарем, Северная Каролина) в течение 1 ½ минуты, а затем сразу 10–15 секунд дифференцировать в 1% водной ледяной уксусной кислоте и проточной водопроводной воде в течение 2 минут, чтобы улучшить детализацию ядер.После завершения проточной водопроводной воды слайды были помещены в одну смену 95% этанола — 2 минуты, 1% спиртовой эозин-флоксин В — 2 минуты для окрашивания цитоплазмы, одну смену 95% этанола на 2 минуты, четыре смены 100% этанола. –2 минуты каждая, четыре смены ксилола –2 минуты каждая с последующим закрытием синтетической монтажной среды для постоянного удерживания и визуализации с помощью световой микроскопии.

Иммуногистохимия — первичные антитела к IL23, F4 / 80, IgM, TNFα

Образцы декальцинировали в 14% EDTA, обрабатывали, заливали в парафин и делали срезы на роторном микротоме со скоростью 4 мкс.Срезы помещали на предметные стекла, покрытые 2% 3-аминопропилтриэтоксисиланом, и сушили при 56 ° C в течение ночи. Затем предметные стекла депарафинизировали в ксилоле и гидратировали с помощью этилового спирта нисходящей степени очистки до дистиллированной воды. Слайды помещали в буферный раствор Трис с pH 7,4 (Scytek Labs — Logan, UT) на 5 минут для регулирования pH. После TBS предметные стекла подвергали индуцированному нагреванием извлечению эпитопа с использованием Scytek Citrate Plus Retrieval pH 6,0 (см. Дополнительную таблицу 2) или ферментного извлечения (см. Дополнительную таблицу 2) с последующими промывками в нескольких сменах дистиллированной воды.Эндогенную пероксидазу блокировали с использованием бани 3% перекиси водорода / метанола в течение 30 минут с последующей промывкой проточной и дистиллированной водой. После предварительной обработки стандартные этапы окрашивания микрополимерных комплексов были выполнены при комнатной температуре на IntelliPath ™ Flex Autostainer. За всеми этапами окрашивания следовали промывания в буфере для автоматической промывки TBS (Biocare Medical — Concord, Калифорния). После блокирования неспецифического белка с помощью Rodent Block M (Biocare) в течение 5 или 10 минут; срезы инкубировали со специфическими первичными веществами (см. дополнительную таблицу 2) в нормальном разбавителе антител (NAD-Scytek) и инкубировали 60 минут.Микрополимерные (Biocare) реагенты затем применяли для указанных инкубаций (см. Дополнительную таблицу 2) с последующим развитием реакции с Romulin AEC ™ (Biocare) (см. Дополнительную таблицу 2) и контрастным окрашиванием гематоксилином Cat (см. Дополнительную таблицу 2).

Выделение лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов

Ткани селезенки или лимфатических узлов были физически повреждены (пропусканием через сито 40 мкм) с последующим лизисом эритроцитов с использованием 2 мл буфера для лизиса ACK (Invitrogen) на образец.Затем клетки дважды промывали полной средой RPMI (RPMI 1640 (Invitrogen) с добавлением 10% FBS, 1% PSF (пенициллин, стрептомицин, фунгизон)), ресуспендировали и подсчитывали.

Проточная цитометрия

Для окрашивания поверхности 2 миллиона клеток инкубировали с блоком Fcγ (BD Biosciences) и соответствующими антителами на льду в течение 45 минут и дважды промывали буфером FACS. Для внутриядерного окрашивания после окрашивания и промывки поверхности фиксировали 4 миллиона клеток и окрашивали внутриядерными антителами с использованием набора буферов для факторов транскрипции BD Pharmingen (BD Bioscience) в соответствии с протоколом производителя.

Для внутриклеточного окрашивания 4 миллиона спленоцитов высевали в 96-луночный планшет в присутствии 50 мкг / мл PMA (Calbiochem) и 1 мкг / мл иономицина (Calbiochem) в течение 30 минут, после чего 1 мкл / лунку GolgiPlug ( BD Biosciences), и клетки инкубировали в течение дополнительных 5,5 часов. Клетки дважды промывали буфером FACS и окрашивали поверхность, как указано выше, после чего использовали набор BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization (BD Biosciences) в соответствии с протоколом производителя.

Список используемых антител: PECy7-anti-CD4 (BD Biosciences), APC-Eflur780-anti-CD3 (eBioscience), Alexa488-anti-CD25 (Invitrogen), Pacific Blue-anti-Foxp3 (Invitrogen), APC-anti -IL-10 (BioLegend), PECy7-anti-CD49b (Invitrogen), PE-anti-Lag3 (BioLegend), PE-anti-F4 / 80 (eBioscience), Pacific Blue-anti-CD8 (BD Biosciences), APC- Cy7-anti-CD11b (BD Biosciences), PECy7-anti-CD11c (BD Biosciences), BV650-anti-Qa2 (BD Biosciences), FITC-anti-CD45RB (BD Biosciences), все в концентрации 4 мкг / мл.Живые / мертвые фиксируемые Aqua Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) использовали в соответствии с протоколом производителя для исключения мертвых клеток из анализа.

Данные были собраны на приборе BD LSR II и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star).

Анализ дифференцировки Tr1

Спленоциты и лимфоциты выделяли из селезенки и лимфатических узлов 4 мышей WT и 4 мышей ERAP1 — / — . Клетки из обеих тканей обрабатывали до однородной одноклеточной суспензии и объединяли. Наивные CD4 + Т-клетки выделяли из этой клеточной смеси с использованием набора для выделения Т-клеток MACS Mouse Naïve CD4 + (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя.Клетки помещали в полную среду RPMI из расчета 1 × 10 5 клеток / лунку в 96-луночный планшет с высоким связыванием, предварительно покрытый 2 мкг / мл mAb против CD3 (BioLegend) и 2 мкг / мл mAb против CD28 ( БиоЛегенда). В указанные лунки добавляли IL-27 (Peprotech) в концентрации 25 нг / мл. Супернатант собирали из культур через 96 часов, после чего среду заменяли средой, содержащей 0,1 мкг / мл PMA (Calbiochem), 1 мкг / мл иономицина (Calbiochem), 0,2 мкл / лунку GolgiPlug (BD Biosciences) и 1,95 мкМ Monesin. (Сигма Олдрич).Через 5 часов клетки собирали, промывали и окрашивали.

Эксперименты по перекрестному воспитанию

ERAP1 — / — и клетки для разведения WT были установлены одновременно для синхронизации беременностей. При обнаружении физических признаков беременности маток снимали с производителей и помещали отдельно. В течение 48 часов после рождения детенышей ERAP1 — / — перевели кормящим самкам WT (CF ERAP1 — / — ), и наоборот, детенышей WT перевели к самкам ERAP1 — / — (CF WT).Также были созданы контрольные клетки, в которых детенышей WT переносили в разные самки WT, а детенышей ERAP1 — / — переводили в разные самки ERAP1 — / — . Щенки были отлучены от груди к 28-дневному возрасту. В возрасте 14 недель мышей умерщвляли, их шипы собирали и фиксировали для мкКТ и гистологического анализа. Среднее пороговое значение для контрольных мышей дикого типа (948) использовали для анализа S1 губчатой ​​кости животных, подвергшихся перекрестному воспитанию, и контрольных животных с использованием мкКТ. Образцы фекалий собирали в возрасте 4 и 14 недель и замораживали в жидком азоте.

Статистика

Весь статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7. Статистические тесты, выполненные для каждого набора данных, и уровни значимости указаны в подписях к рисункам.

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Роль кишечной микробиоты в ишемическом инсульте

1. Введение

Ишемия головного мозга приводит к повреждению головного мозга, вызванному кратковременной, постоянной или очаговой или глобальной остановкой мозгового кровотока, что может привести к стойкому неврологическому дефициту, слабоумию или смерти [1 , 2].Ишемия мозга у людей, называемая инсультом, является глобальной проблемой здравоохранения, которая в настоящее время стала второй по значимости причиной смерти и третьей по частоте причиной инвалидности во всем мире [3]. У людей инсульт классифицируется как ишемический или геморрагический на основании основной невропатологии [3]. На ишемические инсульты приходится 85% всех случаев, а на геморрагические инсульты — около 15% [3]. Ишемический инсульт в основном вызван окклюзией средней мозговой артерии, которая вызывает повреждение паренхимы головного мозга в пораженной области с последующим нейровоспалительным и иммунным ответом [1,4,5].Повреждение мозга в результате ишемического инсульта является результатом сложной серии нейропатофизиологических и невропатологических событий, включая эксайтотоксичность, окислительный стресс, нейровоспаление, апоптоз, выработку амилоида и дисфункцию тау-белка [4,5,6,7,8,9,10, 11]. Постишемический мозг характеризуется накоплением амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков с последующим развитием деменции [9,10,11,12,13]. Следовательно, это станет серьезной проблемой общественного здравоохранения, при которой заболеваемость и распространенность в ближайшие несколько десятилетий достигнут масштабов эпидемии, если болезнь не удастся предотвратить или замедлить.Хотя инсульт увеличивает неврологический дефицит при деменции, инфекции являются основной причиной смерти от инсульта [14]. Документально подтверждено, что около 90% случаев инсульта связаны с поведенческими факторами, включая плохое питание, низкую физическую активность и курение, а также с метаболическими факторами, включая диабет, ожирение, гиперлипидемию и гипертензию [15]. Согласно глобальным исследованиям болезней, инсульт был и будет очень серьезной проблемой для здоровья; негативное влияние которого будет расти по мере старения населения мира [16].Кроме того, существует механистическая взаимосвязь между церебральной ишемией, врожденными и адаптивными иммунными клетками и внутричерепным атеросклерозом, а также кишечной микрофлорой в модификации ответа мозга на ишемическое повреждение. Экспериментальные исследования выявили клеточные и тканевые механизмы, связанные с повреждением при инсульте; механизмы, которые идентифицировали новые пути повреждения, которые еще не были точно описаны. После инсульта до 50% пациентов испытывают желудочно-кишечные осложнения, включая запор, дисфагию, желудочно-кишечное кровотечение и недержание стула [17,18,19,20].Желудочно-кишечные осложнения после инсульта влияют на плохие результаты лечения пациентов, включая отсроченный исход, повышенную смертность и прогрессирующий неврологический дефицит. Недавно несколько исследований также показали, что нарушение микрофлоры кишечника также может быть фактором риска инсульта и влиять на прогноз после инсульта [15,21]. Кроме того, другие исследования показали значительное влияние микробиома кишечника на патогенез различных цереброваскулярных заболеваний [22]. Микрофлора кишечника человека состоит из десятков триллионов бактерий, около 1000 видов известных бактерий и около трех миллионов генов, что в 150 раз больше, чем геном человека [22].Мозг и кишечник связаны нейронной сетью, образуя сложную ось кишечник-мозг-кишечник с сильными двусторонними взаимодействиями. Все больше данных указывает на то, что микрофлора кишечника является важным фактором в развитии, последствиях и лечении инсульта. Ишемический инсульт также меняет состав микрофлоры кишечника. И наоборот, микрофлора кишечника может влиять на исход инсульта и играть роль в его развитии. С клинической точки зрения риск инсульта сегодня остается огромной проблемой.Считается, что пищеварительный тракт является основным органом иммунного ответа, который богат иммунными клетками и отвечает за более 70% активности всей иммунной системы [15]. Все больше данных свидетельствует о том, что энтерит наряду с иммунным ответом играет важную роль в нейропатофизиологии инсульта, что может стать важной терапевтической мишенью при лечении последствий инсульта [23]. Было показано, что кишечная микрофлора играет важную роль в регуляции иммунной системы [15].Также было показано, что кишечная микрофлора является важным фактором в развитии и последствиях инсульта на модели мышей [24,25,26,27]. Кроме того, инсульт обычно вызывает дисфункцию кишечника, дисбактериоз кишечной микрофлоры и кишечное кровотечение, а также сепсис кишечного происхождения, что ухудшает прогноз [15]. Желудочно-кишечные осложнения, вызванные инсультом [17,18,19,20], сосуществуют с плохими исходами после инсульта (например, повышенная смертность, ухудшение неврологических функций и замедленное время восстановления) [15,19,21,24,28,29].Однако менее известным вторичным эффектом инсульта является дисбактериоз кишечной микробиоты. Известно, что дисбаланс микрофлоры кишечника способствует возникновению нейроповеденческих проблем, нейровоспаления и ухудшению исходов инсульта [28,29]. О характеристиках микрофлоры кишечника больных, перенесших инсульт, информации мало [30]. Часто эти осложнения отрицательно сказываются на исходах инсульта. Недавние исследования постулировали роль оси мозг-кишечник в возникновении дисбактериоза кишечной микрофлоры и различных осложнений и отрицательных исходов постишемии [31,32,33].В этом обзоре мы представляем наше недавнее понимание взаимодействия между кишечным микробиомом и мозгом при определении течения ишемического инсульта и раскрываем связанные пути, которые могут быть многообещающими терапевтическими целями. В этом обзоре также обсуждаются текущие исследования производства и роли триметиламин-н-оксида, его связи с инсультами и другими патогенными механизмами инсульта, а также терапевтические стратегии на основе триметиламин-н-оксида.

2. Постишемический мозг по сравнению с кишечной микробиотой

Исследования показывают влияние микрофлоры кишечника на исход инсульта у хозяина, обращая внимание на двустороннюю связь по оси мозг-кишечник [28,34].Рост Bacteroidetes после ишемии подтвержден на обезьянах [35]. Увеличение численности Bacteroidetes также было обнаружено через три дня после возникновения ишемического инсульта у мышей, что считается характерным признаком постинсультного дисбактериоза [28]. Напротив, клиническое исследование, в котором образцы стула брали в течение двух дней после госпитализации, показало снижение уровня Bacteroidetes у пациентов с острым ишемическим инсультом и преходящей ишемической атакой [36]. При исследовании обезьян после очаговой ишемии головного мозга было обнаружено повышенное относительное количество Prevotella, что позволяет предположить, что этот тип может быть связан с воспалительной реакцией после инсульта [35].У обезьян после локальной ишемии головного мозга наблюдалось снижение относительных уровней Faecalibacterium, Streptococcus, Lactobacillus и Oscillospira [35]. Виды Faecalibacterium и Oscillospira признаны основным источником бутирата в организме хозяина [37,38]. Бутират, короткоцепочечная жирная кислота, играет ключевую роль в поддержании целостности кишечного барьера, подавляет выработку провоспалительных цитокинов и считается терапевтической мишенью при заболеваниях головного мозга [39]. Снижение концентрации бутирата в плазме у обезьян после очаговой церебральной ишемии наблюдалось в течение 6–12 месяцев, что, вероятно, было связано со снижением уровней Faecalibacterium и Oscillospira [35].Снижение уровня короткоцепочечных жирных кислот в плазме у обезьян после очаговой церебральной ишемии с выживаемостью 6–12 месяцев указывает на то, что хронический дисбактериоз кишечника также может влиять на выработку короткоцепочечных жирных кислот. важный тип пробиотических бактерий-хозяев, обладал пониженным относительным уровнем после инфаркта мозга у обезьян [35]. Было доказано, что добавление лактобацилл улучшает когнитивные функции, настроение и уменьшает воспаление, связанное со старением [40,41,42].Деменция и депрессия после инсульта — частые осложнения у животных и выживших после инсульта [43,44,45] с одновременным хроническим системным и церебральным воспалением [4,5]. Вопрос о том, полезны ли добавки Lactobacillus для пациентов, перенесших инсульт, открыт и должен быть исследован в будущих клинических испытаниях. Также было обнаружено, что относительный уровень численности Streptococcus снижается после церебральной ишемии. Род Streptococcus включает пробиотические бактерии, такие как Streptococcus thermophilus [46], и патогенные бактерии, такие как Streptococcus pneumoniae [47].В настоящее время точная роль кишечных стрептококков в инфарктах головного мозга требует уточнения в будущих исследованиях. Было обнаружено, что повышенный уровень липополисахаридов в крови вызывает нейровоспаление головного мозга, нарушения гематоэнцефалического барьера, отек мозга и затрудняет выживание после инсульта [48]. Это коррелирует с увеличением липополисахарида в плазме у постишемических обезьян, особенно через 6 и 12 месяцев после инсульта [35]. Таким образом, липополисахарид может играть важную роль в хроническом системном воспалении после инсульта, что подтверждается повреждением барьера слизистой оболочки кишечника и морфологическим повреждением слизистой оболочки кишечника после ишемии.Поврежденный барьер слизистой оболочки кишечника, вероятно, связан с повышенным высвобождением липополисахарида из кишечника в кровоток. Было подтверждено, что провоспалительные цитокины IFN-g, IL-6 и TNF-α были повышены в плазме до 12 месяцев после очаговой ишемии головного мозга, что позволяет предположить, что системное воспаление хронически сохраняется после инсульта [35]. Эти наблюдения позволяют предположить, что после инфаркта головного мозга развивается не только дисбактериоз кишечной микрофлоры, но и хроническое системное воспаление.Корреляционные исследования также показали, что повышенные уровни липополисахаридов плазмы или воспалительных цитокинов и чрезмерный рост Bacteroidetes тесно связаны [35]. Мы можем сделать вывод, что хроническая системная воспалительная реакция после инсульта может повлиять на мозг, поскольку было доказано, что эта воспалительная реакция связана с когнитивными нарушениями, ухудшением обучения и памяти, депрессией и тревогой [40]. Провоспалительные цитокины, выделяемые из кишечника в кровоток, напрямую взаимодействуют с мозгом, усиливая патологические изменения [40].Таким образом, кишечная микробиота после инсульта и хроническое системное воспаление могут быть терапевтическими целями при лечении инсульта. Было показано, что удаление кишечных бактерий с помощью начального лечения антибиотиками ухудшает исход постишемической мыши [28,29]. . Было обнаружено, что у мышей состав микрофлоры слепой кишки изменялся после локальной церебральной ишемии, выявляя специфические изменения у Peptococcaceae и Prevotellaceae, которые коррелировали со степенью повреждения [25]. Также было показано, что дисбиоз влияет на исход ишемического инсульта, подавляя движение эффекторных Т-клеток из кишечника к лептоменингам на модели локальной ишемии головного мозга [34].Несколько исследований микрофлоры у пациентов с инсультом показали, что дисбактериоз кишечника связан с системным воспалением и пониженным уровнем триметиламин-н-оксида [36,49,50]. Ишемический инсульт у пациентов был связан с более условно-патогенными микроорганизмами, такими как Enterobacter, Megasphaera и Oscillibacter, и в меньшей степени с полезными типами, такими как Bacteroides, Prevotella и Faecalibacterium [36]. Затем было обнаружено, что инсульт был независимо связан с повышением уровня атопобиума и Lactobacillus ruminis и снижением уровня Lactobacillus sakei [50].В другом исследовании у пациентов с инсультом был дисбактериоз кишечной микрофлоры с повышенным уровнем Escherichia, Bacteroidetes, Megamonas, Parabacteroides и Ruminococcus [15]. У пациентов с высоким риском инсульта было отмечено обогащение условно-патогенных микроорганизмов сниженным уровнем бутират-продуцирующих бактерий [21]. У пациентов с инсультом наблюдалось значительное увеличение уровней Odoribacter, Akkermansia, Ruminococcaceae, Flavobacteriaceae и Victivallis [15]. Odoribacter, Akkermansia, Ruminococcaceae и Victivallis — хорошо известные продуценты короткоцепочечных жирных кислот, включая ацетат, пропионат и бутират [21,51,52,53].У пациентов с легким инсультом уровень Enterobacter, Pyramidobacter и Lachnospiraceae повысился [15]. Напротив, у пациентов с тяжелым инсультом увеличивалось количество Ruminococcaceae и Christensenellaceae [15]. Эти наблюдения предполагают, что кишечная флора участвует в инсульте человека и коррелирует с его тяжестью. Однозначно было обнаружено, что короткоцепочечные жирные кислоты продуцируются повышенным содержанием Odoribacter и Akkermansia у пациентов с инсультом [15]. Более ранние исследования показали, что изменение микробиологического состава, вызванное инсультом, было связано с увеличением Akkermansia muciniphila и чрезмерным количеством видов Clostridial у мышей после инсульта [27].Напротив, наблюдалось снижение Аккермансии у пациентов, перенесших инсульт [49]. Другое исследование показало, что Аккермансия значительно увеличивалась у пациентов, перенесших инсульт [15]. Сообщалось, что Akkermansia muciniphila использует муцин для производства ацетата высокого уровня, который может использоваться производящими бутират Ruminococcaceae для стимуляции производства бутирата [21]. Другое исследование показало, что уровень Odoribacter, продуцента бутирата, принадлежащего к типу Bacteroidetes, также увеличивался после инсульта у пациентов [15].Это указывает на то, что одновременный рост этих двух бактерий может способствовать производству бутирата. Бутират является предпочтительным источником энергии для эпителиальных клеток и поддерживает здоровье эпителия [54]. Бутират может также влиять на уровень экспрессии генов, стимулируемых Akkermansia muciniphila, в эпителиальных клетках [55]. Поэтому некоторые считают, что Akkermansia может играть ключевую роль в заживлении ран, повышая уровень бутирата, что привело к фиксации целостности эпителия у мышей после инсульта [27].Кроме того, Akkermansia muciniphila может индуцировать выработку слизи и экспрессию Reg3γ в толстой кишке, что приводит к ремоделированию микрофлоры [56]. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования для определения возможной роли Аккермансии и Одорибактера у пациентов, перенесших инсульт.

3. Постишемический амилоид и тау-белок по сравнению с кишечными амилоидами

Амилоидные пептиды или амилоидные волокна (фигурного типа), связанные с формированием семян для агрегации амилоида головного мозга, могут продуцироваться некоторыми видами Enterobacter и грибами [57, 58,59].Микробные амилоиды запускают зарождение амилоидных агрегатов с огромным накоплением и вызывают воспалительную реакцию [60,61]. В отсутствие микрофлоры кишечника у трансгенных мышей наблюдалось снижение накопления амилоида [62]. Кроме того, было замечено, что агрегация амилоида in vitro может подавляться короткоцепочечными жирными кислотами, продуцируемыми кишечной микрофлорой [63]. Впоследствии бактериальный эндотоксин отвечает за нейровоспаление, вызывая образование амилоидных фибрилл [64,65].Некоторые бактерии, такие как Escherichia coli, продуцируют амилоид [65], но связь этого амилоида с нейродегенерацией в головном мозге после ишемии не выяснена. Следует добавить, что бактериальный грамотрицательный липополисахарид поддерживает отложение амилоида в мозге мышей, пагубно влияя на когнитивные функции [66]. Неизвестно, как бактериальные амилоиды взаимодействуют с другими нейропатологическими механизмами в постишемическом мозге, такими как посттрансляционные изменения тау-белка, образование β-амилоидного пептида, нейровоспаление и цереброваскулярная дегенерация.Когда проницаемость кишечного барьера увеличивается, бактериальные амилоиды попадают в системный кровоток, вызывая воспаление в головном мозге и вызывая ухудшение памяти у мышей [67]. Эти наблюдения показывают, что бактериальные амилоиды могут играть ключевую роль в усилении иммунореакции и зародышеобразования амилоидных агрегатов в постишемии мозга. Амилоид, продуцируемый микробиомом, может влиять на амилоидогенез при нейродегенеративных заболеваниях [68]. Эти наблюдения недавно были подтверждены данными in vitro и in vivo [69,70].Микробные амилоиды могут контролировать воспаление мозга и уровни β-амилоидного пептида, влияя на глиоз мозга [4,5,68,69,70]. Измененная бактериальная флора может влиять на уровень бактериальных амилоидов и метаболитов в плазме и, следовательно, может выступать в качестве триггера в начале и обострении нейродегенерации в постишемическом мозге. Данные метаанализа показывают, что метаболиты кишечника могут усугублять нейровоспаление. агрегация амилоида и тау-белка при нейродегенеративных заболеваниях головного мозга [71].Микробиота кишечника участвует в секреции более 100 метаболитов, но их вклад в нейропатогенез постишемического мозга не доказан [72]. Валериана, изомасляная, изовалериановая, масляная, уксусная, пропионовая и муравьиная кислоты влияют на развитие нейродегенеративных заболеваний, воздействуя на активность астроцитов и микроглии и уменьшая нейровоспаление, агрегацию амилоидных и тау-белков [73,74]. Было обнаружено, что микрофлора кишечника хозяина влияет на гомеостаз микроглии в головном мозге, что приводит к явным дефектам микроглии с незрелым фенотипом у стерильных животных, что в конечном итоге приводит к нарушению врожденных иммунных ответов [75].Попытка повторно колонизировать сложную микрофлору частично восстановила физиологические характеристики микроглии [75]. Таким образом, это наблюдение предполагает, что микрофлора кишечника может контролировать созревание, функцию и активацию микроглии и, следовательно, в случае нарушения микрофлоры кишечника, созревание микроглии и ее потенциал для фагоцитоза амилоида и тау-белка, который накапливается после ишемии, ограничены. Исследования in vitro показали, что пропионовая, валериановая и масляная кислоты ингибируют олигомеризацию β-амилоид- (1-40) -пептида [63].Однако при оценке влияния метаболитов кишечной микробиоты на агрегацию β-амилоид- (1–42) -пептида было показано, что только валериановая кислота ингибирует образование амилоидных олигомеров [63]. Напротив, исследование превращения β-амилоидных пептидов в β-амилоидные пептидные фибриллы показало, что как масляная, так и валериановая кислоты ингибируют превращение мономера β-амилоид- (1-40) -пептида в нитчатый β- амилоидный пептид [63]. Зависимость от типа кишечного метаболита указывает на то, что увеличение количества полезных метаболитов, продуцируемых кишечной флорой и особенно противовоспалительными бактериями, может способствовать удалению тау-белка и амилоида из ткани мозга после ишемии.

4. Триметиламин-н-оксид и инсульт

Триметиламин-н-оксид является побочным продуктом микрофлоры кишечника, тесно связанным с инсультом [76]. Кроме того, триметиламин-н-оксид напрямую связан с плохими результатами лечения пациентов с ишемическим повреждением головного мозга, независимо от традиционных факторов риска [76,77]. Ограниченное количество исследований предполагает, что триметиламин-н-оксид играет защитную роль, но другие исследования показывают, что триметиламин-н-оксид является индикатором нарушенного гомеостаза, а не причинным или защитным фактором [78,79].В настоящее время в литературе имеется относительно мало исследований о связи между триметиламин-н-оксидом и инсультом. Клинические испытания в китайской популяции пациентов с гипертонией показали, что повышенные уровни триметиламин-н-оксида были связаны с повышенным риском первого инсульта [80]. Кроме того, пациенты с пониженным содержанием фолиевой кислоты и высоким содержанием триметиламин-н-оксида имели самую высокую частоту инсультов [80]. У пациентов после первого инсульта повышенный уровень триметиламин-н-оксида был связан с риском повторного инсульта.Эта взаимосвязь сохранялась даже после поправки на традиционные цереброваскулярные факторы риска и исходную тяжесть инсульта. Кроме того, концентрация триметиламин-н-оксида в сыворотке тесно связана с количеством провоспалительных моноцитов [81]. Клинические испытания у пациентов после инсульта и транзиторной ишемической атаки показали значительный дисбактериоз микрофлоры кишечника. Важно отметить, что пациенты с инсультом и транзиторной ишемической атакой имели более низкие концентрации триметиламин-н-оксида в плазме по сравнению с контрольными случаями с бессимптомным атеросклерозом.Авторы объяснили, что они изучали уровень триметиламин-н-оксида у пациентов, у которых уже был инсульт или транзиторная ишемическая атака — уровень триметиламин-н-оксида был явно низким по сравнению с предыдущим западным исследованием — и лечение инсульта или транзиторной ишемической атаки может снизить уровень триметиламин-н-оксида [36]. Многоцентровое исследование предоставило доказательства того, что концентрация триметиламин-n-оксида в сыворотке крови до стентирования сонной артерии была значительно выше в случаях, когда на диффузно-взвешенном изображении после стентирования были обнаружены новые повреждения, по сравнению с пациентами, у которых не было новых повреждений.После корректировки возможных мешающих факторов повышенные уровни триметиламин-н-оксида в крови служили независимым предиктором новых поражений на диффузно-взвешенном изображении после стентирования сонной артерии. Кроме того, повышенные концентрации триметиламин-н-оксида в плазме повышают толщину интима-медиа сонной артерии у пациентов с риском диабета 2 типа независимо от инсулинорезистентности, ожирения печени и висцерального ожирения. Когда образ жизни был в значительной степени изменен, толщина интима-медиа сонной артерии была значительно уменьшена у пациентов, испытывающих наибольшее снижение (> 20%) уровней триметиламин-н-оксида [82].Триметиламин-н-оксид отвечает за старение нейронов, дисфункцию синапсов и снижение синаптической пластичности [83]. Триметиламин-н-оксид может играть роль в патологии болезни Альцгеймера как фактор, способствующий заболеваниям сосудов головного мозга. Фактически, сосудистый риск часто встречается у пациентов с болезнью Альцгеймера, а цереброваскулярные события часто связаны с патологией болезни Альцгеймера [84].

6. Выводы

Мы представили документально подтвержденную роль микробиома кишечника в развитии и восстановлении после экспериментальной церебральной ишемии и инсульта (рис. 1).Хотя хорошо известно, что микробиом влияет на многочисленные метаболические и иммунологические аспекты церебральной ишемии, наше понимание того, как именно микробиом модулирует функцию мозга до и после церебральной ишемии, все еще ограничено. Исследования оси кишечник-мозг в основном сосредоточены на взаимосвязи между составом микробиома кишечника и прогрессированием заболевания. Хотя за последние несколько лет был достигнут значительный прогресс, из обзора доступных публикаций становится ясно, что еще многое предстоит прояснить в отношении связи кишечного микробиома с инсультом.Тем не менее, основным препятствием для клинической трансляции результатов исследования микробиома является большая вариабельность кишечных микробиомов пациентов, которую нелегко воспроизвести с помощью животных моделей. Тем не менее, лечение на основе микробиома может иметь огромное влияние на улучшение исходов после инсульта в будущем [34,87,88]. Как уже было показано выше, микрофлора кишечника тесно связана с активностью иммунной системы [15] и последующая модуляция нейровоспаления и исходов инсульта [28,29].Возникает вопрос о предполагаемых механизмах действия микрофлоры. Как уже упоминалось, микробные метаболиты, принадлежащие к короткоцепочечным жирным кислотам, ацетату, бутирату и пропионату, воздействуют на иммунные клетки через рецепторы свободных жирных кислот. Таким образом, они модулируют иммунные и воспалительные реакции. Примечательно, что через эти рецепторы короткоцепочечные жирные кислоты могут регулировать активность симпатической нервной системы [89]. Кроме того, было документально подтверждено, что короткоцепочечные жирные кислоты ингибируют гистоновые деацетилазы, которые, среди прочего, ответственны за снижение выработки провоспалительного фактора некроза опухоли и снижение активности ядерного фактора каппа B (фактора транскрипции).Очевидно, нарушение регуляции микрофлоры кишечника посредством перечисленных выше механизмов может влиять на иммунные и воспалительные реакции, в том числе наблюдаемые в центральной нервной системе [89]. Нарушение регуляции кишечной микробиоты связано с воспалительным заболеванием кишечника [90]. В экспериментальной модели этого заболевания у мышей была повышена экспрессия металлопротеиназы-9 матрикса толстой кишки, что привело к изменениям в фекальном микробиоме [91]. Существует связь между воспалительным заболеванием кишечника и инсультом, и ось кишечник-мозг-микробиота, скорее всего, двунаправленно вовлечена в этот феномен [92].Таким образом, возникает возможность того, что матриксная металлопротеиназа 9 может участвовать в предполагаемых механизмах микрофлоры.

Наконец, поскольку исследование роли оси кишечник-мозг при инсульте находится в зачаточном состоянии, более широкое понимание области инсульта, текущие модели грызунов и исследуемые области порождают целостные вопросы для исследователей, на которых они могут сосредоточиться. в будущем.

Таншинон IIA защищает от индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS-) колита у мышей путем модуляции инфильтрации и активации нейтрофилов

Нейтрофилы играют решающую роль в инициировании и поддержании воспаления кишечника.Однако традиционные методы лечения, нацеленные на нейтрофилы, могут нарушить нормальную защиту хозяина. Недавно было обнаружено, что таншинон IIA действует непосредственно на нейтрофилы. Таким образом, мы стремились изучить, может ли Tanshinone IIA защитить от экспериментального колита посредством модуляции нейтрофилов. Мы индуцировали колит у мышей C57BL / 6, давая 3% декстрансульфат натрия (DSS) перорально, и тем временем мы ежедневно лечили мышей таншиноном IIA внутрибрюшинно. Тяжесть колита оценивали путем расчета индекса активности заболевания (DAI) и гистологических параметров.Измеряли инфильтрацию и активацию нейтрофилов в толстой кишке мышей. Кроме того, было определено, оказывает ли таншинон IIA прямое влияние на миграцию и активацию нейтрофилов in vitro. Наши данные показали, что Tanshinone IIA значительно уменьшил тяжесть DSS-индуцированного колита у мышей, о чем свидетельствует снижение DAI и улучшение воспаления толстой кишки. Кроме того, Tanshinone IIA уменьшал нейтрофильную инфильтрацию слизистой оболочки кишечника и активацию, а также снижал воспалительные цитокины толстой кишки у мышей, получавших DSS.Кроме того, было продемонстрировано, что таншинон IIA значительно подавляет миграцию и активацию нейтрофилов. Эти результаты предоставляют убедительные доказательства того, что Tanshinone IIA обладает терапевтическим потенциалом для облегчения воспалительного колита у мышей, который, возможно, опосредован иммуномодуляцией нейтрофилов.

1. Введение

Язвенный колит (ЯК), основная форма воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), представляет собой хроническое и рецидивирующее воспалительное заболевание толстой кишки, которое возникает в результате аномального взаимодействия между микрофлорой толстой кишки и иммунными клетками слизистой оболочки в генетически обусловленном состоянии. восприимчивый хозяин [1–3].Этиология и патогенез ЯК до конца не выяснены. Недавние исследования показывают, что трансмуральная инфильтрация лейкоцитов в основном способствует инициированию и поддержанию воспаления кишечника и последующему разрушению и изъязвлению слизистой оболочки [4, 5]. Нейтрофилы, основные инфильтрирующие воспалительные клетки, служат защитой первой линии от вторжения микроорганизмов или повреждения тканей, обеспечивая защиту человеческого тела от этих поражений [6, 7]. Значительная нейтрофильная инфильтрация слизистой оболочки кишечника всегда наблюдалась как при колите у человека, так и у мышей, включая миграцию нейтрофилов через эпителий кишечника, накопление нейтрофилов в воспаленном кишечнике, высвобождение огромных количеств активных форм кислорода (АФК) и перепроизводство воспалительных цитокинов [ 8].Однако чрезмерная или стойкая инфильтрация нейтрофилов неблагоприятна и участвует в патогенезе различных воспалительных заболеваний, включая ЯК. Очистка тканевых нейтрофилов важна для разрешения воспаления и для поддержания тканевого гомеостаза [9]. Сообщалось, что истощение нейтрофилов снижает тяжесть заболевания в экспериментальных моделях колита, что подтверждает ключевую патогенную роль нейтрофилов [10, 11]. Однако этот подход остается частично успешным и может иметь побочные эффекты, такие как нарушение защиты хозяина от инфекции.Таким образом, изучение новых стратегий для модулирования инфильтрации или активации нейтрофилов без изменения их обычных защитных функций хозяина может обеспечить привлекательные методы лечения ЯК.

Таншинон IIA (рис. 1 (а)) представляет собой натуральный экстракт, выделенный из Salviae miltiorrhizae , китайского лекарственного растения, традиционно используемого для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, болезни Альцгеймера и фиброза печени [12, 13]. Известно, что таншинон IIA обладает противовоспалительным и антиоксидантным действием и проявляет защитное действие при различных воспалительных состояниях [13, 14].Особый интерес представляет недавнее исследование Robertson et al. сообщили, что Tanshinone IIA обладает выраженными эффектами в индукции апоптоза нейтрофилов и стимулировании обратной миграции нейтрофилов [12]. Учитывая этиологическую роль нейтрофилов в воспалении кишечника, мы намеревались изучить, имеет ли Tanshinone IIA защитную роль против экспериментального колита посредством модуляции функций нейтрофилов.

В этом исследовании мы демонстрируем, что Tanshinone IIA может облегчить индуцированный декстрансульфатом натрия (DSS-) колит у мышей.Благоприятные эффекты таншинона IIA достигаются за счет подавления миграции и активации нейтрофилов в воспаленных тканях и подавления выработки провоспалительных цитокинов. Наши исследования показывают, что Таншинон IIA может быть новым терапевтическим средством от колита.

2. Материалы и методы
2.1. Животные

Самцы мышей C57BL / 6 в возрасте 8–10 недель были получены из Центра лабораторных животных Столичного медицинского университета (Пекин, Китай). Мышей содержали в стандартных клетках в определенных условиях, свободных от патогенов.Все экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Столичного медицинского университета и соответствовали институциональным руководящим принципам по уходу и использованию лабораторных животных.

2.2. Схема эксперимента для индукции колита и лекарственного вмешательства

Для индукции колита DSS (40 кДа, Sigma Aldrich, США) растворяли в стерильной воде до конечной концентрации 3% и вводили мышам в виде питьевой воды в течение 7 дней подряд [15 ].Животные отрицательного контроля получали только воду. В другой серии экспериментов таншинон IIA (Sigma Aldrich, США) растворяли в ДМСО и вводили мышам внутрибрюшинно ежедневно в дозе 200 мг / кг в течение 7 дней во время индукции колита. Контрольные мыши получали только такую ​​же дозу носителя. Дозы Tanshinone IIA были выбраны на основании наших предварительных экспериментов. Индекс активности заболевания (DAI) оценивался ежедневно во время курса лечения, который рассчитывался путем оценки изменений веса животных, наличия фекальной крови / ректального кровотечения, диареи и смертности [16].На 8-й день мышей умерщвляли и толстую кишку удаляли для дальнейшего анализа.

2.3. Гистологический анализ

Для гистологического анализа толстую кишку мышей фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обрабатывали и заливали парафином. 5 срезов ткани толщиной мкм и толщиной мкм окрашивали гематоксилином и эозином (HE) с использованием стандартных методик. Гистологическая тяжесть колита оценивалась слепым методом с использованием установленной гистологической системы баллов: (а) повреждение эпителия (0 баллов = нет, 1 балл = минимальная потеря бокаловидных клеток, 2 балла = значительная потеря бокаловидных клеток, 3 балла = минимальная). потеря крипт и значительная потеря бокаловидных клеток, и 4 балла = обширная потеря крипт) и (b) инфильтрация воспалительных клеток (0 баллов = нет, 1 балл = инфильтрация вокруг оснований крипт, 2 балла = инфильтрация в слизистой оболочке, 3 балла = обширная инфильтрация слизистой с отеком, и 4 балла = инфильтрация подслизистой оболочки) [17].Общий балл варьировался от минимум 0 до максимум 8. Оценка проводилась двумя исследователями, которые не знали о группах лечения.

2.4. Анализ целостности кишечного барьера

Целостность кишечного барьера измеряли, как описано ранее [16, 17]. Вкратце, мышам вводили 200 мкл л FITC-декстрана (молекулярная масса, 4 кДа; Sigma-Aldrich) в дозе 600 мг / кг массы тела через желудочный зонд. Кровь собирали через 4 ч путем ретроорбитального кровотечения. Концентрацию FITC-декстрана в сыворотке определяли с помощью флуориметра (возбуждение, 490 нм; эмиссия, 530 нм).Последовательно разведенный FITC-декстран использовали для построения стандартной кривой. Животных умерщвляли сразу после кровотечения и готовили криосрезы толстой кишки для исследования с помощью флуоресцентной микроскопии.

2,5. Определение нейтрофилов, проникающих в толстую кишку

Для обнаружения инфильтрированных нейтрофилов толстую кишку отделяли от мышей и фиксировали в 4% параформальдегиде при 4 ° C в течение ночи с последующей криозащитой в 20% сахарозе, а затем заключали в смесь соединения OCT и ткани. замораживающая среда.8 криосрезов толщиной мкм и толщиной мкм окрашивали крысиным антимышиным Ly6G (2 μ, мкг / мл, BD Biosciences) в течение ночи при 4 ° C, а затем инкубировали с FITC-конъюгированным ослиным анти-крысиным IgG (1: 200, Invitrogen) в течение 1 ч при комнатной температуре. Эти срезы помещали в монтажную среду Vectashield (Vector Laboratories) и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

ММР-8 (матриксная металлопротеиназа-8) представляет собой нейтрофил-специфическую коллагеназу, которая способствует проникновению и привлечению нейтрофилов в ткани [11, 18].Поэтому мы выполнили дополнительное измерение инфильтрации нейтрофилов, используя вестерн-блот-анализ экспрессии MMP-8 в толстой кишке мышей. Вкратце, замороженные ткани толстой кишки взвешивали и гомогенизировали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% додецилсульфат натрия (SDS), 0,5% дезоксихолат натрия и коктейльные ингибиторы протеаз. Гомогенаты центрифугировали при 12000 × g при 4 ° C в течение 20 мин, супернатанты собирали и хранили при 80 ° C. Концентрации белка в супернатантах определяли с использованием метода Брэдфорда.Аликвоты белков по 20 мг фракционировали на 12% геле полиакриламид-SDS. После электрофоретического разделения белки переносили на мембрану из ПВДФ. Мембрану блокировали забуференным трис-HCl физиологическим раствором (TBS), содержащим 5% обезжиренного молока, с последующей инкубацией с первичными антителами MMP-8 (1: 1000, abcam) или β -актина (1: 1000, abcam). Затем мембрану обрабатывали вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (1: 2000, abcam). Связывание антител визуализировали с помощью хемилюминесцентной системы ECL (Pierce Biotech Inc., Иллинойс, США) и короткое экспонирование мембраны рентгеновскими пленками. Полученные сигналы количественно оценивали с помощью сканера изображений (Bio-Rad Biotech, Калифорния, США) и программного обеспечения для анализа изображений (Bio-Rad Biotech, Калифорния, США).

2.6. Определение активации нейтрофилов

Мы количественно оценили степень активации нейтрофилов путем измерения активности МПО и продукции АФК в толстой кишке мышей, соответственно. Вкратце, толстую кишку рассекали, промывали холодным физиологическим раствором и разрезали на мелкие кусочки. Образцы гомогенизировали в 50 мМ фосфатном буфере и центрифугировали при 12000 × g при 4 ° C в течение 20 мин.Мы проанализировали активность МПО, фермента, встречающегося почти исключительно в нейтрофилах, с использованием коммерческого набора (BioVision, Калифорния, США) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Кроме того, мы определили уровни ROS в гомогенатах толстой кишки с использованием набора для внутриклеточного анализа ROS (Cell Biolabs, Сан-Диего, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, лизаты инкубировали с 50 М 2 ‘, 7’-дихлородигидрофлуоресцеиндиацетатом (DCFH-DA) при 37 ° C в течение 1 часа. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью флюоресцентного планшет-ридера при возбуждении 480 нм / эмиссии 530 нм.

2.7. Измерение цитокинов толстой кишки

Мы количественно определили уровни IL-1 β , IL-6, IL-10 и TNF- α в гомогенатах толстой кишки мышей с помощью мультиплексного иммуноанализа ProcartaPlex (Luminex) на системе Bio-Plex 200. с программным обеспечением Bio-Plex Manger 5.0 в соответствии с протоколом производителя.

2,8. Выделение нейтрофилов и анализ миграции in vitro

Периферическую кровь мышей собирали в пробирки, покрытые 5 мМ EDTA, путем пункции сердца.После лизиса эритроцитов нейтрофилы выделяли методом центрифугирования в градиенте фиколла [19]. Чистоту нейтрофилов оценивали с помощью окрашивания по Райту-Гимзе, и было обнаружено, что она составляет более 95%.

Очищенные нейтрофилы применяли в анализе миграции, как описано ранее [19]. Вкратце, всего 5 × 10 5 нейтрофилов помещали в верхнюю камеру трансвеллеров (фильтр с размером пор 5 мкм, м; Corning Inc., Корнинг, Нью-Йорк, США) и CXCL1 (250 нг / мл; R&D Systems ) добавляли в нижние лунки.Среду RMPI 1640 без CXCL1 использовали в качестве отрицательного контроля. Таншинон IIA растворяли в ДМСО и добавляли к нейтрофилам до конечной концентрации 10 мг / мл. Затем трансвеллеры инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C с 5% CO 2 . Нейтрофилы, мигрировавшие в нижние лунки, отображали под микроскопом и подсчитывали с помощью гемоцитометра.

2.9. Анализ активации нейтрофилов in vitro

Нейтрофилы предварительно обрабатывали с или без LPS (1 μ г / мл) в DMEM с 10% FBS в течение 1 ч при 37 ° C с 5% CO 2 .Между тем, таншинон IIA растворяли в ДМСО и добавляли к нейтрофилам с конечной концентрацией 10 мг / мл. Клетки после обработки собирали и гомогенизировали в буфере для лизиса. Затем гомогенаты центрифугировали при 10000 × g при 4 ° C в течение 20 мин, и супернатанты анализировали на активность MPO и множественные цитокины (IL-1 β , IL-6, IL-10 и TNF- α ) как описано выше.

Кроме того, продукцию ROS в нейтрофилах измеряли с использованием DCFH-DA (Cell Biolabs, Сан-Диего, Калифорния, США) в качестве флуоресцентного зонда методом проточной цитометрии, следуя инструкциям производителя.Вкратце, обработанные нейтрофилы собирали и инкубировали с 10 мкл M DCFH-DA в течение 30 минут в темноте при 37 ° C. После промывания PBS клетки анализировали с помощью проточной цитометрии (BD, FACS Calibur, Сан-Хосе, Калифорния, США) на продукцию ROS.

2.10. Статистический анализ

Все значения были выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Односторонний дисперсионный анализ ANOVA использовался для оценки различий между группами. Результаты считались статистически значимыми при. Все статистические анализы были рассчитаны с использованием Graph Pad Prism.

3. Результаты
3.1. Таншинон IIA облегчает тяжесть вызванного DSS колита у мышей

В этом исследовании мы использовали мышиную модель, зараженную DSS, чтобы проверить, может ли таншинон IIA предотвращать воспаление кишечника. После 7-дневного перорального введения DSS у мышей развилось значительное воспаление кишечника, проявляющееся резкой потерей веса, кровавой диареей и укорочением толстой кишки, по сравнению с контрольными мышами, получавшими только воду, у которых не было никаких признаков воспаления.Примечательно, что внутрибрюшинное лечение таншиноном IIA заметно снизило клинические показатели вызванного DSS колита у мышей (DSS + таншинон IIA) по сравнению с контролем с носителем (DSS + носитель), который включал меньшую потерю веса тела, меньше диареи или меньше. фекальное кровотечение (рисунок 1 (б)). Гистологический анализ толстой кишки показал, что индукция DSS приводила к типичным признакам воспаления, характеризующимся значительным разрушением эпителия, изъязвлениями слизистой оболочки, потерей бокаловидных клеток и инфильтрацией массивных воспалительных клеток по сравнению с мышами, не получавшими DSS.Напротив, лечение таншиноном IIA вызывало заметное улучшение гистологических показателей, о чем свидетельствовали умеренные воспалительные инфильтраты с только очаговой эрозией слизистой оболочки у мышей (рисунки 1 (c) и 1 (d)).

3.2. Таншинон IIA улучшает кишечную проницаемость у мышей, получавших DSS

Поскольку нарушение кишечной проницаемости является важным признаком течения DSS-индуцированного колита, мы проверили, влияет ли таншинон IIA на кишечную проницаемость у мышей. Мы кормили мышей FITC-декстраном через желудочный зонд, а через 4 часа мы измерили их сывороточные уровни FITC-декстрана для оценки кишечной проницаемости.Он показал, что сывороточные уровни FITC-декстрана у мышей, получавших DSS, были значительно выше, чем у контрольных мышей, тогда как совместное лечение таншиноном IIA вызывало заметное снижение сывороточных уровней FITC-декстрана (рис. 2 (а)). Флуоресцентный микроскопический анализ криосрезов кишечника мышей не выявил флуоресцентной инфильтрации FITC-декстрана у контрольных мышей, тогда как более высокий уровень интенсивности флуоресценции наблюдался в тканях толстой кишки мышей, обработанных DSS. Напротив, ткани толстой кишки мышей, получавших Tanshinone IIA + DSS, показали заметно сниженный уровень интенсивности флуоресценции (рис. 2 (b)).В совокупности эти данные показали, что лечение DSS вызывало нарушение целостности слизи у мышей, что приводило к увеличению проницаемости кишечного барьера, тогда как Tanshinone IIA улучшал проницаемость кишечника у мышей, получавших DSS, тем самым обеспечивая защиту от воспаления.

3.3. Таншинон IIA снижает инфильтрацию кишечных нейтрофилов

Чтобы определить, принимают ли нейтрофилы непосредственное участие в опосредовании DSS-индуцированного колита, мы проанализировали инфильтрацию нейтрофилов слизистой оболочки.С этой целью мы сначала выполнили иммунофлуоресцентное окрашивание Ly6G, специфического маркера нейтрофилов, в криосрезов толстой кишки мышей. По сравнению с контрольными мышами, получавшими только воду, наблюдалось резкое увеличение Ly6G-положительных клеток вокруг области слизистой оболочки мышей, получавших DSS, что указывает на заметную нейтрофильную инфильтрацию. Напротив, у мышей, получавших таншинон IIA + DSS, было меньше клеток Ly6G + в тканях слизистой оболочки (Фигуры 3 (a) и 3 (b)). Кроме того, мы проанализировали экспрессию MMP-8 с помощью вестерн-блоттинга, чтобы дополнительно оценить инфильтрацию нейтрофилов в тканях толстой кишки мышей.Он показал, что индукция DSS вызвала значительную экспрессию ММР-8 в толстой кишке у мышей по сравнению с контролем, тогда как экспрессия ММР-8 была заметно ниже в тканях толстой кишки мышей, получавших таншинон IIA + DSS (фиг. 3 (c)). Взятые вместе, это предположило, что инфильтрация нейтрофилов произошла во время DSS-индуцированного колита, в то время как Tanshinone IIA значительно уменьшил инфильтрацию нейтрофилов, о чем свидетельствует снижение экспрессии Ly6G и MMP-8, соответственно.

3.4. Таншинон IIA подавляет активацию кишечных нейтрофилов

Мы также проанализировали активность МПО в толстой кишке, специфический маркер активации нейтрофилов, у мышей, получавших DSS.Он показал, что активность МПО заметно увеличивалась после введения DSS мышам, что свидетельствует о значительной активации тканевых нейтрофилов, тогда как активность МПО была намного ниже у мышей, получавших таншинон IIA + DSS (рис. 4 (а)), что позволяет предположить, что таншинон IIA ингибирует активацию нейтрофилов. Считается, что активация нейтрофилов приводит к высвобождению АФК и продукции воспалительных цитокинов, оба из которых участвуют в воспалении кишечника. Следовательно, мы измерили уровни ROS и воспалительных цитокинов (IL-1 β , IL-6, IL-10 и TNF- α ) в тканях толстой кишки мышей.Он показал, что уровни ROS и этих цитокинов были значительно увеличены у мышей, получавших DSS, по сравнению с контрольной группой, тогда как Tanshinone IIA подавлял уровни ROS (Рисунок 4 (b)) и цитокинов (Рисунок 4 (c)). в тканях толстой кишки мышей, получавших DSS, что дает больше доказательств того, что Tanshinone IIA может ингибировать активацию нейтрофилов.

3.5. Таншинон IIA блокирует миграцию нейтрофилов и ингибирует активацию нейтрофилов In vitro

Затем мы изучили, зависит ли опосредованная таншиноном IIA защита главным образом от его ингибирующего действия на нейтрофилы.Мы изолировали нейтрофилы мыши и инкубировали клетки в присутствии или в отсутствие таншинона IIA. Во-первых, нейтрофилы стимулировали с помощью CXCL1 для измерения миграции клеток, и, как и ожидалось, результаты показали, что таншинон IIA оказывает значительное ингибирующее действие на индуцированную CXCL1 миграцию нейтрофилов (фиг. 5). Во-вторых, нейтрофилы обрабатывали LPS в течение 60 минут, чтобы вызвать их активацию, что оценивалось путем определения активности MPO и высвобождения ROS, а также продукции воспалительных цитокинов.Результаты показали, что обработка LPS индуцировала более высокие уровни MPO и ROS в клетках, тогда как совмещение Tanshinone IIA приводило к снижению уровней MPO и ROS (Фигуры 6 (a) и 6 (b)). Кроме того, таншинон IIA обладал заметным ингибированием цитокинов в этих клетках (фиг. 6 (c)). В совокупности эти данные показали, что таншинон IIA может ингибировать миграцию и активацию нейтрофилов in vitro, что согласуется с результатами экспериментов in vivo.

4. Обсуждение

Целью этого исследования было определить, может ли Tanshinone IIA уменьшать заболеваемость на мышиной модели колита за счет специфического воздействия на нейтрофилы и, таким образом, иметь потенциал в качестве терапии в клинической практике.ВЗК возникает в результате сложного взаимодействия генетических, микробных факторов и факторов окружающей среды и включает две основные формы: язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) [1, 2, 20]. В свете ЯК он в основном характеризуется рецидивирующим воспалением кишечника, часто связанным с болью в животе, диареей, кровью в стуле и потерей веса [2, 21]. Признано, что в патогенезе ЯК участвует неспособность разрешить воспаление. Актуальность дисрегулируемого удаления нейтрофилов из тканей и неудачного разрешения воспаления была подтверждена [11, 18, 22].С механической точки зрения нейтрофилы являются первыми задействованными эффекторами острого воспалительного ответа, которые защищают человека-хозяина от вторжения микроорганизмов или повреждения тканей [7]. Однако чрезмерное или постоянное накопление нейтрофилов может привести к нежелательным результатам. Недавние исследования показывают, что устойчивый и непрерывный приток нейтрофилов к воспаленным тканям может вызывать повреждение слизистой оболочки кишечника за счет высвобождения различных медиаторов воспаления, таких как АФК и провоспалительные цитокины, а повреждение слизистой оболочки кишечника дополнительно стимулирует инфильтрацию нейтрофилов, образуя порочный круг [21]. , 23].Следовательно, мощные эффекторные функции нейтрофилов следует строго контролировать, чтобы избежать подавляющего или стойкого воспаления. Однако традиционные подходы к противовоспалительной терапии, направленной на нейтрофилы, имеют свои недостатки. Например, антитела или антагонисты хемокинов, которые предназначены для блокирования миграции нейтрофилов из сосудистой сети в ткани или для полного удаления нейтрофилов, могут ослабить защиту хозяина от инфекции и привести к неожиданно пагубным результатам [7].Следовательно, очень желательно разработать подходы, которые способны ингибировать сверхактивацию нейтрофилов, при этом сохраняя при этом их основные защитные функции хозяина.

Недавно Robertson et al. показали, что Tanshinone IIA, соединение, полученное из китайской лекарственной травы, сильно ускоряет разрешение воспаления, вызывая апоптоз нейтрофилов и способствуя обратной миграции нейтрофилов [12]. Это интересное открытие может раскрыть новую стратегию лечения воспаления.Действительно, было показано, что таншинон IIA эффективен на ряде моделей воспалительных заболеваний, включая LPS-индуцированное повреждение легких у мышей. Сообщается, что таншинон IIA обладает различной биологической активностью, включая антиоксидантные, антифибротические, антимутагенные и антиканцерогенные свойства [12, 14, 24]. Предполагается, что эффекты таншинона IIA на моделях воспалительных заболеваний зависят от ингибирования факторов транскрипции, таких как ядерный фактор- κ B (NF- κ B), активирующий белок 1 (AP-1) и сигнал преобразователь и активатор транскрипции 1 (STAT1) [12, 13], но не были отнесены к действию на один тип клеток.Фармакологические эффекты таншинона IIA, которые только что были идентифицированы на нейтрофилы, могут играть особую роль в его защитном эффекте против воспалительных заболеваний.

DSS представляет собой гепариноподобный полисахарид, который широко используется для индукции острого и хронического колита у животных [15, 25]. Эта модель демонстрирует несколько характеристик, напоминающих человеческий ЯК, включая потерю веса, тяжелую диарею, ректальное кровотечение, изъязвление и потерю эпителия, а также лейкоцитарную инфильтрацию преимущественно в дистальном отделе толстой кишки.В настоящем исследовании мы использовали модель колита, вызванного DSS, для оценки защитных эффектов таншинона IIA у мышей. Наши данные показали, что рекрутирование и активация нейтрофилов были заметными в слизистой оболочке толстой кишки мышей, получавших DSS, и были связаны с активацией ROS и высокими уровнями воспалительных цитокинов в тканях, которые с наибольшей вероятностью участвовали в инициации и прогрессировании заболевания. . Введение Tanshinone IIA значительно улучшило клинические признаки колита у мышей.Кроме того, наши данные показали, что наблюдалось резкое снижение инфильтрации и активации нейтрофилов в тканях толстой кишки мышей, получавших DSS плюс таншинон IIA, что сопровождалось снижением уровней ROS и воспалительных цитокинов, что могло объяснить эффективность таншинона IIA против воспаления кишечника.

Для дальнейшего усиления эффекта таншинона IIA в модуляции нейтрофилов с целью блокирования каскадов воспаления мы протестировали функции таншинона IIA в ингибировании индуцированной CXCR1 миграции нейтрофилов in vitro.Аналогичным образом, мы исследовали влияние таншинона IIA на ингибирование LPS-стимулированной активации нейтрофилов, о чем судили по снижению продукции MPO, ROS и воспалительных цитокинов. Все результаты анализов in vitro соответствовали экспериментам in vivo.

В совокупности представленные здесь данные подтверждают, что Tanshinone IIA может быть привлекательной альтернативой для лечения колита путем модуляции нейтрофилов. Новые данные о противовоспалительном действии таншинона IIA позволяют предположить, что его можно применять для профилактики и лечения различных нейтрофильных воспалительных заболеваний.

Конфликт интересов

Авторы заявили об отсутствии потенциального конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81441103, 81570504 и 81572825) и частично профинансирована Национальной программой поддержки науки и технологий Китая (2013BAI04B01).

Генная терапия тромбоцитов улучшает гемостатическую функцию у собак с дефицитом интегрина αIIbβ3

Существует несколько хорошо охарактеризованных наследственных генетических дефектов, которые влияют на различные аспекты функции тромбоцитов (активация, адгезия, агрегация, передача сигнала, накопление гранул), которые обычно проявляются сами собой. клинически как неспособность остановить кровотечение (1).Об одной из наследственных аномалий тромбоцитов, тромбастении Гланцмана (ГТ) (тромбастения, что означает «слабые тромбоциты»), впервые сообщил швейцарский педиатр Эдвард Гланцманн в 1918 году (2). Хотя GT — очень редкое заболевание, встречающееся у ≈1: 1 000 000 человек во всем мире, исследовательские усилия привели к характеристике более 170 различных генетических аномалий внутри тромбоцит-специфического интегрина αIIbβ3 (также известного как комплекс гликопротеинов GPIIb-IIIa и INTGA2BB3). , что приводит к количественной и качественной недостаточности рецептора на поверхности тромбоцитов (http: // sinaicentral.mssm.edu/intranet/research/glanzmann/menu). Поскольку αIIbβ3 является основным рецептором адгезивного лиганда фибриногена, унаследованные молекулярные дефекты αIIbβ3 предотвращают агрегацию тромбоцитов в месте повреждения сосудов для восстановления поврежденных кровеносных сосудов (3). В результате у пациента возникают эпизоды сильных периодических кожно-слизистых кровотечений, которые начинаются при рождении и повторяются на протяжении всей жизни человека. Это заболевание особенно опасно для жизни, когда пациенты испытывают желудочно-кишечное кровотечение или сильное кровотечение, вызванное травмой.Текущие варианты лечения GT — это переливание нормальных тромбоцитов человека или использование терапевтических агентов (Amicar, Novo7, транексамовая кислота) для остановки чрезмерного кровотечения (4). К сожалению, у пациентов часто вырабатываются антитела и разрушаются перелитые тромбоциты, а кровоостанавливающие средства обычно чрезвычайно дороги, а их положительные эффекты относительно недолговечны. Аллогенный трансплантат костного мозга успешно используется для восстановления гемостаза у собак и людей с ГТ (5, 6), хотя человеческих доноров, совместимых с лейкоцитарным антигеном, трудно найти, а донорский трансплантат vs.несоответствие хозяина вызывает неблагоприятные побочные эффекты, что делает этот вариант лечения спорным. Мы предположили, что аутологичный трансплантат гемопоэтических стволовых клеток, трансдуцированных генами, кодирующими нормальный интегрин αIIb или β3, может быть идеальным подходом для коррекции GT, поскольку синтез de novo биологически нормального интегрина αIIbβ3 в мегакариоцитах должен обеспечивать доставку всего рецептора в клетку. поверхность, чтобы позволить тромбоцитам участвовать в заживлении ран. Это подтверждается недавним успехом использования переноса гена интегрина β2 гемопоэтическими стволовыми клетками для генерации экспрессии αLβ2, αMβ2 и αXβ2 на лейкоцитах для коррекции дефицита адгезии лейкоцитов у собак (CLAD) (7).

Ранее мы сообщали, что трансдукция мобилизованных G-CSF стволовых клеток периферической крови (G-PBC) онкоретровирусным вектором, кодирующим интегрин β3, вызвала de novo синтез жизнеспособных комплексов интегрина αIIbβ3 на мегакариоцитах, полученных от пациентов с GT человека (8). Затем мы показали, что функцию тромбоцитов можно скорректировать в мышиной модели GT путем трансплантации костного мозга, трансдуцированного лентивирусным вектором, кодирующим β3 (9). Текущее исследование расширяет эти знания, демонстрируя разработку клинически значимой стратегии переноса генов в G-PBC для коррекции функции тромбоцитов и улучшения гемостаза в рамках модели GT на крупных животных.Для достижения этой цели мы использовали линию Great Pyrenees, пораженную GT в результате вставки 14 нуклеотидов в экзон 13 и дефекта сплайсинга в интроне 13 гена интегрина αIIb (10). Это вызывает сдвиг рамки считывания αIIb и преждевременное усечение субъединицы, что приводит к дефициту αIIbβ3 на поверхности тромбоцитов и потере функции тромбоцитов. Собачий GT практически идентичен человеческому GT по своей клинической картине, характеризующейся тяжелыми периодическими эпизодами пурпуры, носового кровотечения, кровоизлияния в десны и желудочно-кишечного тракта.Таким образом, результаты этого исследования должны предоставить обширную информацию о потенциальной возможности генной терапии GT у человека. Результаты и обсуждение . Вектор самоинактивируется, поскольку энхансер / промотор (U3) был удален из 3′-вирусного LTR (U3 / R / U5), а 889-нуклеотидный фрагмент промотора гена αIIb человека был использован для нацеливания на транскрипцию. внутри мегакариоцитов.Этот промотор связывает факторы Ets и GATA, обеспечивая высокий уровень транскрипции гена мегакариоцитов, и имеет репрессорную область, которая ингибирует экспрессию в других клонах (11). Поскольку не известно, что экспрессия αIIb обеспечивает преимущество роста мегакариоцитов, конструкция лентивируса имеет другую кассету кДНК, кодирующую промотор гена вируса стволовых клеток мыши, управляющий экспрессией лекарственно-устойчивого белка, P140K метилгуанинметилтрансферазы (MGMT), что позволяет in vivo обогащение гемопоэтических стволовых клеток, трансдуцированных лентивирусами (12).

Рис. 1.

Лентивирусная трансдукция GT CD34 + PBC генерирует экспрессию интегрина αIIbβ3 на тромбоцитах. ( A ) Схема вектора лентивируса ВИЧ типа 1, αIIb- (M) WPT. 5′-LTR не поврежден ( слева, , синий прямоугольник), тогда как энхансер / промотор U3 вирусного 3′-LTR ( справа, , синий прямоугольник) был удален, чтобы позволить промотору гена интегрина αIIb (большая серая стрелка) действовать. прямой мегакариоцит-специфический синтез интегрина αIIb (маленький желтый кружок) у собак GT с дефицитом αIIb.Промотор гена αIIb связывает факторы транскрипции GATA и Ets для экспрессии генов высокого уровня в мегакариоцитах, а также имеется репрессорная область, которая ингибирует экспрессию генов в других клонах. Промотор вируса стволовых клеток мыши (маленькая серая стрелка) использовали для управления неспецифической по клону экспрессии выбираемой лекарственным средством, биологически стабильной формы белка репарации ДНК, MGMT (желтый овал), чтобы обеспечить in vivo обогащение трансдуцированного лентивирусом гематопоэтического ствола. клетки. WPRE повысил эффективность экспрессии трансгена (зеленый ромб).( B ) Иммунофлуоресцентные гистограммы проточной цитометрии тромбоцитов, выделенных из циркулирующей цельной крови реципиентов трансплантата. Репрезентативная гистограмма от собаки C через 0,5 года после трансплантации (Tx, черная линия) показала, что MFI (в скобках) для тромбоцитов, окрашенных конъюгированным с флуорохромом неспецифическим Ig ( верхний левый ), оставался отрицательным и равным αIIb (- / -, бирюзовый; +/−, серый; + / +, синий) контрольные животные. Примечательно, что MFI для тромбоцитов, окрашенных антителами, специфичными для интегрина αIIb ( верхний правый ), β3 ( нижний левый ) и комплекс αIIbβ3 ( нижний правый ), показал, что трансплантированная собака C экспрессировала αIIb, β3 и αIIbβ3 на поверхность на промежуточных уровнях MFI по сравнению с MFI тромбоцитов из контроля αIIb (- / -, + / -, + / +).MFI у собак с трансплантатом составлял ≈6% от нормального уровня, при этом комплекс специфических антител указывал, что на поверхности тромбоцитов присутствовало ≈5000 рецепторов αIIbβ3. ( C ) Эффективность трансдукции и продолжительность экспрессии αIIbβ3 определяли с помощью иммунофлуоресцентного анализа проточной цитометрии, измеряя процент тромбоцитов с MFI над фоновыми уровнями, наблюдаемыми у собаки αIIb (- / -) в присутствии насыщающих антител, специфичных для αIIb, β3 и αIIbβ3 (используются в B ) незадолго до трансплантации собак A, B и C до 2, 4 и 5 лет после трансплантации, соответственно.Собаки с GT A, B и C получили аутологичный трансплантат CD34 + PBC, несущий лентивирус, кодирующий интегрин αIIb и лекарственно-устойчивый белок (P140K MGMT), а затем трижды лечили цитотоксическими препаратами, включая O 6 -BG (100 мг) и кармустин (0,25 мг / кг, 0,40 мг / кг и 0,45 мг / кг соответственно) (синие стрелки). Процент тромбоцитов, экспрессирующих αIIbβ3, стабилизировался до ≈10% от общей популяции тромбоцитов у собак A, B и C.

Гематопоэтические стволовые клетки собак были мобилизованы из костного мозга в периферическую кровь с цитокинами (G-CSF и стволовыми клетками). клеточный фактор), а аферез ПБЦ проводился без неблагоприятных инцидентов, как описано ранее в исследованиях in vitro с участием пациентов с GT (8).Мононуклеарные лимфоциты выделяли с помощью Ficoll Paque Plus (GE Healthcare) из продукта афереза, а затем собачьи антиген-положительные клетки CD34 очищали иммуномагнитной селекцией (13). Результаты, представленные в таблице 1, суммируют условия аутологичной трансплантации четырех собак GT, которым давали ≈2,5 × 10 6 αIIb-трансдуцированных PBC на килограмм массы тела при чистоте 88% для собачьего антигена CD34 + .

Таблица 1.

Условия аутологичной трансплантации αIIb-CD34 + PBC

Немиелоаблативный режим кондиционирования перед трансплантацией был использован для создания ниши в костном мозге для приживления вновь трансплантированных клеток.Интенсивность режима кондиционирования определяется уровнем, при котором доза становится токсичной для органов. Более ранние исследования, проведенные на нормальных моделях собак, продемонстрировали, что стабильный аллогенный смешанный гемопоэтический химеризм донор / хозяин может быть безопасно установлен путем введения сублетальной дозы 200 сГр облучения всего тела с последующей временной иммуносупрессией микофенолятмофетилом и циклоспорином после основного комплекса гистосовместимости идентичного костного мозга. трансплантация (14).Однако этот предтрансплантационный режим кондиционирования казался неподходящим для животных с GT, потому что одна из четырех собак умерла от неконтролируемого внутреннего кровотечения вскоре после аллогенной трансплантации костного мозга (5). Это осложнение было подтверждено, когда одно из животных, включенных в наше исследование (собака D), умерло от внутричерепного кровоизлияния через 3 недели после аутологичной трансплантации ПБЦ, трансдуцированного αIIb (Таблица 1). В результате новый режим кондиционирования, состоящий из очень низкой дозы облучения всего тела 100 сГр, был проведен двум собакам без происшествий (таблица 1).В качестве альтернативного подхода одной собаке безопасно вводили умеренную дозу бусульфана в дозе 4 мг / кг (препарат, предпочтительно токсичный для гемопоэтических стволовых клеток) для подготовки перед трансплантацией, как описано в недавнем исследовании, которое продемонстрировало успешное использование бусульфана в дозе 10 мг / кг. кг для переноса гена гемопоэтических стволовых клеток для коррекции CLAD (7).

Иммунофлуоресцентный анализ с использованием моноклональных антител, распознающих αIIb, β3 и комплекс αIIbβ3, показал, что рецептор может генерироваться на поверхности субпопуляции тромбоцитов периферической крови после трансдукции и трансплантации ПБЦ, трансдуцированных αIIb, собакам с GT (рис.1 B , черный козырек). Как и ожидалось, низкий уровень нормального β3 был обнаружен на поверхности тромбоцитов от αIIb-дефицитных собак [средняя интенсивность флуоресценции (MFI) = 15], потому что предыдущие исследования пациентов с GT с дефектами αIIb показали, что β3 может спариваться с интегрином αv -субъединица для образования рецептора витронектина (αvβ3) на тромбоцитах (фиг.1 B , нижний левый ) (15). Гистограммы для αIIb (рис.1 B , верхний правый ) и комплекса αIIbβ3 (рис.1 B , нижний правый ) показывают, что скромный уровень рецепторов (≈5000) сформирован на поверхности генетически модифицированных тромбоцитов, поскольку MFI составлял 6% от уровня комплекса интегрина, обнаруженного на нормальных тромбоцитах собаки αIIbβ3 (+ / +) (80000 рецепторов) при насыщающих концентрациях антител.Данные демонстрируют успешный синтез рекомбинантной нормальной субъединицы αIIb человека, которая образует стабильный комплекс с эндогенным β3 собаки и перемещается на поверхность тромбоцитов собаки. Неизвестно, можно ли улучшить уровень поверхностных рецепторов с помощью собачьего αIIb для переноса гена PBC. В этом исследовании использовался лентивирусный вектор, кодирующий человеческий αIIb, поскольку он имеет очень высокое сходство ≥83% с нуклеотидом собачьего αIIb и выведенными аминокислотными последовательностями. Сравнение даже достигает 92–100% в β-пропеллере, где рецептор связывается со своим лигандом (16).Это дополнительно подтверждается демонстрацией того, что химерный человеческий рецептор αIIb – собачий β3 сформировал структуру, которая распознается комплексно-специфическим антителом (7E3), которое, как ранее было показано, распознает эндогенные рецепторы αIIbβ3 как человека, так и собак, что позволяет предположить, что Рецепторы человека и собаки очень похожи по структуре (17).

После трансдукции лентивируса и трансплантации ПБЦ каждое животное получало три курса комбинации препаратов (O 6 -бензилгуанин и кармустин), которые, как известно, токсичны для нетрансдуцированных гемопоэтических стволовых клеток, чтобы обеспечить in vivo обогащение ПБЦ, генетически модифицированного с помощью лекарственно-устойчивый белок P140K MGMT, который ранее использовался другими (рис.1 С , синие стрелки) (18). Это привело к значительному увеличению количества тромбоцитов, экспрессирующих αIIbβ3 (максимум 30-40%), которое стабилизировалось на уровне ≈10% от общей популяции тромбоцитов у собак с трансплантатами A, B и C. Интегрин αIIbβ3 был обнаружен с помощью иммунофлуоресценции. на подмножестве тромбоцитов в течение 2, 4 и 5 лет соответственно, что указывает на долгосрочное приживление значительной популяции родительских или родительских гематопоэтических клеток в компартменте костного мозга собак A, B и C (рис.1 С ).

Отличительной чертой GT является неспособность тромбоцитов агрегировать при стимуляции физиологическими агонистами активации тромбоцитов (19). В качестве теста на улучшение функции тромбоциты периферической крови собирали у каждой собаки, чтобы определить, может ли комплекс интегрина αIIbβ3 активироваться, связываться с фибриногеном и образовывать агрегаты тромбоцитов ex vivo. Как и у людей, тромбоциты от собак GT (- / -) не сумели агрегироваться по сравнению с тромбоцитами животных-носителей (+/-) и нормальными (+ / +), которые значительно агрегировались при стимуляции in vitro смесью агонистов активации тромбоцитов [ADP , адреналин и пептид активации собачьего рецептора тромбина (TRAP) 1, -3 и -4] (рис.2 А ). Примечательно, что все три собаки GT, которым трансплантирован αIIb-трансдуцированный PBC, содержали подмножество тромбоцитов (≈10%), которые демонстрировали измеримую способность к агрегации после активации смесью агонистов (фиг. 2 A ). Обратите внимание, что этот результат согласуется с процентом тромбоцитов, которые были обнаружены, экспрессирующие интегрин αIIbβ3, с помощью анализа проточной цитометрии (фиг. 1 C ). Результат этого анализа показывает, что внутриклеточные пути, ведущие к передаче сигналов интегрина αIIbβ3 наизнанку, действовали в тромбоцитах GT, которые экспрессировали αIIbβ3 на своей поверхности.

Рис. 2.

Функция интегрина / тромбоцитов была скорректирована у реципиентов CD34 + PBC, трансдуцированных αIIb. ( A ) Агрегацию измеряли после инкубации промытых тромбоцитов с фибриногеном и смесью активационных агонистов (АДФ, адреналин и собачьи TRAP1, -3 и -4). Тромбоциты, выделенные из циркулирующей цельной крови собак с дефицитом αIIb (- / -), не смогли агрегировать, тогда как тромбоциты, собранные от контрольных животных αIIb (+/-, + / +), агрегировали почти до 100% с использованием идентичных концентраций агонистов и условий реакции.Тромбоциты от αIIb-трансдуцированных CD34 + реципиентов аутологичного трансплантата PBC A, B и C агрегированы в прямой корреляции с процентом тромбоцитов, экспрессирующих αIIbβ3 на своей поверхности (рис. 1 C ). Аналогичные результаты наблюдались для каждой собаки с трансплантатом, по крайней мере, в шести отдельных экспериментах. ( B ) Анализ адгезии выполняли ex vivo, чтобы определить, была ли скорректирована передача сигнала интегрина извне-внутрь, инициированная взаимодействием αIIbβ3 с иммобилизованным фибриногеном в трансплантате A, B или C тромбоцитов.Промытые тромбоциты αIIb (+ / +, — / -) контрольных собак A, B и C помещали на иммобилизованный фибриноген 100 мкг / мл и позволяли распространяться в течение 45 минут при 37 ° C. Тромбоциты αIIb (+ / +) связываются и заметно распространяются на фибриноген, тогда как тромбоциты αIIb (- / -) не могут прикрепиться к фибриногену. Напротив, тромбоциты собак A, B и C при трансплантации связываются и распространяются на покрытых фибриногеном пластинах. Этот результат представляет три отдельных эксперимента. (Увеличение, 400 ×.) ( C ) Кровь собирали у каждого животного, смешивали с человеческим тромбином, чтобы дать возможность сформироваться фибриновому сгустку, а затем образцы инкубировали при 37 ° C в течение до 24 часов.Фотографии, сделанные через 3–6 часов после добавления тромбина, показывают, что нормальные образцы αIIb (+ / +) и носителя αIIb (+/–) оттягивают значительное количество сгустка, поскольку плазма становится легко видимой в пробирке. Напротив, фибриновый сгусток крови оставался неизменным в образце контрольной собаки αIIb (- / -) GT. Напротив, кровь от собак A, B и C опосредовала значительную ретракцию фибринового сгустка, аналогичную положительному контролю. Это изображение представляет результаты для собак A, B и C из трех, семи и восьми отдельных экспериментов, соответственно, выполненных в течение 2, 4 и 5 лет после трансплантации ПБЦ, как описано в документе Материалы и методы .

Тромбоциты помещали в планшет для культуры ткани, обработанный фибриногеном, чтобы определить, может ли вновь экспрессированный интегрин αIIbβ3 прикрепиться к его главному лиганду, фибриногену, что приведет к распространению тромбоцитов. Как и ожидалось, тромбоциты от нормальной собаки (+ / +) прилипли и распространились по покрытой фибриногеном поверхности (фиг. 2 B ). Напротив, тромбоциты GT (- / -) не смогли прилипнуть к планшетам, покрытым фибриногеном (фиг. 2 B ). Иными словами, тромбоциты от трансплантатов собак A, B и C (рис.2 B ) показали улучшенную способность прикрепляться и распространяться на иммобилизованном фибриногене, указывая на то, что передача сигналов извне внутрь через интегрин αIIbβ3 была функциональной.

Еще одна торговая марка человеческого GT — неспособность тромбоцитов пациента отводить фибриновый сгусток. Циркулирующие тромбоциты периферической крови от собак-реципиентов ПБЦ, трансдуцированных αIIb, A, B и C были способны опосредовать заметную ретракцию фибринового сгустка, аналогичную нормальному (+ / +) контролю-носителю (+/-), тогда как отрицательный контроль (- / -) не удалось втянуть сгусток.Этот результат показывает, что функция тромбоцитов улучшилась (рис. 2 C ).

Был проведен анализ времени кровотечения из слизистой оболочки щеки, чтобы определить, достаточен ли текущий уровень эффективности трансдукции гена (10% тромбоцитов циркулирующей крови, экспрессирующих 6% нормальных уровней рецептора αIIbβ3) для восстановления сосудистого повреждения in vivo (рис. А ). Как и у пациентов с GT, анализ кровотечений у контрольных собак GT (- / -) показал, что у всех животных (независимо от возраста) наблюдалось продолжительное время кровотечения, требующее вмешательства в экспериментальной конечной точке 20 мин (рис.3 A , Верх ). Подобно людям, GT собаки имеют тенденцию терять меньшее количество крови (хотя и больше, чем нормальный уровень) по мере взросления. Рис. 3 A показывает, что собаки GT в возрасте <2,5 года потеряли ≈2,5 г крови, тогда как собаки GT в возрасте> 2,5 лет потеряли ≈1 г крови за 20 минут (рис. 3 A , Top ). Примечательно, что наблюдалось значительное снижение количества потерянной крови (≤135-кратное уменьшение) и заметное улучшение времени кровотечения, начиная с 6 месяцев после трансплантации ПБЦ у собак A, B и C, что соответствовало наличию тромбоцитов. экспрессирующие αIIbβ3.В частности, у собаки А время кровотечения уменьшилось до 9 минут (Рис.3 A , Top ), у собаки B улучшилось в среднем до 7 минут (Рис.3 A , Middle ), а кровотечение время для собаки C уменьшилось в среднем до 5 минут (Рис. 3 A , Bottom ). Интересно, что этот результат совпал с наблюдением значительно меньшего количества синяков на ногах собак A, B и C после трансплантации ПБЦ, трансдуцированного αIIb, что демонстрирует очевидный признак улучшения гемостатической функции у этих животных (рис.3 В ). В совокупности наши результаты демонстрируют, что перенос гена гемопоэтического PBC скорректировал фенотип GT.

Рис. 3.

Улучшение гемостатической функции приводит к коррекции фенотипа GT. ( A ) Анализ BMBT выполняли для измерения количества крови, потерянной на лист фильтровальной бумаги каждые 15 с после выполнения стандартизированного разреза на верхней губе каждой собаки и регистрации продолжительности кровотечения до экспериментальной конечной точки 20 мин. Как сообщалось ранее, нормальные собаки с αIIb (+ / +) кровоточат в течение ≈3 мин и теряют очень небольшое количество крови с помощью этого анализа (36).Как и у пациентов с GT, у каждой собаки αIIb (- / -) наблюдалось продолжительное кровотечение до экспериментальной конечной точки 20 мин ( Вверху слева, ). Молодые (≤ 2 лет) GT-собаки обычно теряли ≈2,5 г крови, тогда как взрослые собаки (в возрасте 2,5–5,0 лет) имели тенденцию терять меньше крови (≈1,0 г). Примечательно, что собаки с трансплантатом A ( верхний правый ), B ( средний ) и C ( нижний ) показали заметное сокращение времени кровотечения до 9, 5 и 4 минут соответственно. Аналогичным образом наблюдалось 20-кратное ( A ), 100-кратное ( B ) и 135-кратное ( C ) снижение кровопотери, что коррелировало с присутствием тромбоцитов, экспрессирующих αIIbβ3.Такой результат наблюдался через 2, 4 и 5 лет после трансплантации соответственно. ( B ) Синяки (петехии, стрелка) на ногах значительно уменьшились для каждого реципиента трансплантата, что продемонстрировано путем сравнения фотографий, сделанных до и после трансплантации для собак A ( Top ), B ( Middle ) и C ( Низ ).

Чтобы определить, развили ли реципиенты трансплантата PBC гуморальный ответ антител на вновь экспрессированный αIIb, нормальные тромбоциты αIIb (+ / +) инкубировали с плазмой каждой собаки с трансплантатом, и наличие связанных с тромбоцитами антител оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентной лампы. анти-собачий Ig.Буфер без плазмы использовали в качестве отрицательного контроля, а моноклональные антитела к комплексу интегрина αIIbβ3 (7E3) служили в качестве положительного контроля. Гистограмма на фиг. S1 A показала, что (разведенная 1:10) плазма собаки B вырабатывала относительно высокоаффинное антитело, которое реагировало с нормальными тромбоцитами собак и мышей αIIbβ3 (+ / +). Однако плазма собаки B не реагировала с тромбоцитами αIIbβ3 (- / -). Как и ожидалось, плазма собаки B также распознавала нормальные тромбоциты человека αIIbβ3 (+ / +) по сравнению с отрицательным контролем с буфером.Этот результат указывает на то, что ответ антител был специфическим для эпитопа на αIIb или комплекса αIIbβ3, который является высококонсервативным для разных видов. Собака А имела антитела с низким сродством к нормальным тромбоцитам собак, тогда как плазма собаки С не реагировала с тромбоцитами собак. Дальнейший анализ (фиг. S1 B ) показал, что Ig, выделенный из плазмы B собаки, обладал способностью ингибировать агрегацию нормальных тромбоцитов собаки в зависимости от концентрации.

Внутривенный Ig (ВВИГ) оказался эффективным для лечения людей, у которых развивается иммуноопосредованная тромбоцитопения (20).Таким образом, IVIG вводили собаке B, чтобы исследовать, может ли он ослабить приобретенный иммунный ответ на комплекс αIIbβ3 и облегчить разрушение генетически измененных тромбоцитов. Проточный цитометрический анализ показал немедленное снижение уровня Ig в плазме, который реагировал с нормальными тромбоцитами собак, после двух инъекций IVIG (рис. S1 C , коричневая стрелка). В результате также наблюдалось заметное увеличение количества тромбоцитов, экспрессирующих αIIbβ3. Титр антител оставался низким и демонстрировал незначительную реактивность с тромбоцитами, экспрессирующими αIIbβ3 в течение 2 лет.Осложнение развилось, когда у собаки B наблюдалось резкое увеличение количества лейкоцитов (рис. S2 A ), тяжелая тромбоцитопения (рис. S2 B ) и опасная для жизни гемолитическая анемия после проведения ежегодной вакцинации (рис. S1 C и S2 A и B , пурпурная стрелка). Этот результат указывает на то, что это нежелательное явление не было вызвано трансплантацией ПБЦ, трансдуцированных αIIb, поскольку разрушение не было направлено конкретно на трансдуцированные тромбоциты.Этот вывод подтверждается документацией о возникновении тяжелых реакций после вакцинации собак и людей (21–23). Неожиданно мы обнаружили, что введение вакцины также напрямую коррелировало со значительным увеличением титра антител к αIIbβ3 (фиг. S1 C ). Это представляет собой потенциально серьезное и ранее нераспознанное осложнение для протоколов переноса генов, которое требует дальнейшего исследования. К счастью, гемолитическая анемия и тромбоцитопения, а также иммунный ответ на αIIbβ3 уменьшились, когда собаке B назначали прерывистый режим лечения иммунодепрессантами, состоящими из преднизона, циклоспорина и ВВИГ (рис.S1 C и S2 A и B , коричневые и зеленые стрелки).

За состоянием здоровья каждого животного в течение нескольких лет следили, чтобы определить, является ли перенос гена PBC безопасным и жизнеспособным подходом к лечению GT. Геномная ДНК была выделена из лейкоцитов периферической крови, собранных у собак A, B и C через 2, 4 и 5 лет после трансплантации, соответственно, чтобы исследовать, вызывает ли лентивирус αIIb инсерционный мутагенез, как сообщалось для пациентов, перенесших перенос гена ретровируса. для коррекции Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита.Присутствие лентивирусного вектора было подтверждено успешной ПЦР-амплификацией пострегуляторного элемента вируса гепатита сурка (WPRE) из ДНК собак A, B и C (фиг. S3 A ). Это согласуется с обнаружением продукта трансгена на поверхности тромбоцитов. Анализ для обнаружения конкретных сайтов встраивания лентивируса в геном показал, что для собаки A было идентифицировано восемь отдельных вставок, в то время как расположение лентивируса не могло быть картировано для собаки B, и два сайта вставки были обнаружены для собаки C (рис.S3 B и Таблица S1). Анализ показал, что лентивирус предпочитает интегрироваться в отрицательной ориентации, обычно в области, не кодирующие гены. У собаки А было три лентивирусных вставки в ранних интронах идентифицируемых генов, хотя ни один из генов, по-видимому, не является онкогеном или запускает неопластические события. Результат геномного анализа согласуется с наблюдением за общим хорошим здоровьем всех собак и оценкой ежегодных мазков периферической крови, подтверждающих нормальную морфологию и количество циркулирующих кроветворных клеток.Наши результаты показывают, что онкогенез не произошел ни у одного из животных в конечной точке эксперимента. Всегда будет возможность возникновения инсерционного мутагенеза, потому что рекомбинантный лентивирусный вектор случайным образом вставлен в геном.

Таким образом, наши результаты подтверждают возможность нацеливания на тромбоциты с помощью генетической терапии, что открывает путь к лучшему лечению пациентов с наследственными дефектами кровотечения тромбоцитов и потенциально широким спектром нарушений, учитывая, что тромбоциты играют роль во многих клеточных процессах ( 24).В целом, эта работа показала, что мобилизованный цитокинами ПБЦ может быть безопасно собран и подвергнут генетическим манипуляциям и реинфузии крупному животному с наследственным нарушением свертываемости крови. Этот результат привел к успешному использованию лентивирусного вектора под транскрипционным контролем промотора гена интегрина αIIb , который скорректировал функцию в субпопуляции тромбоцитов на уровне, способном улучшить гемостаз в течение по меньшей мере 5 лет. Подобно генетически модифицированным тромбоцитам у реципиентов трансплантата собак GT, пациенты с GT 2 типа экспрессируют 5-20% остаточных уровней αIIbβ3 на поверхности тромбоцитов.Тем не менее, большинство зарегистрированных случаев заболевания людей также характеризовались молекулярно-генетическими дефектами в αIIbβ3, которые отрицательно влияют на структуру / функцию интегрина, что приводит к длительному кровотечению (25). Напротив, мы наблюдали, что 10% тромбоцитов от реципиентов трансплантата GT собаки могут быть модифицированы для экспрессии нормальной формы человеческого αIIb, которая успешно связывается с нормальным (эндогенно экспрессируемым) собачьим β3 с образованием функционального рецепторного комплекса интегрина. Этот результат, в дополнение к нашим предыдущим исследованиям, показывающим улучшенную гемостатическую функцию мегакариоцитов, культивируемых в тканях GT человека, сконструированных для экспрессии пониженных уровней αIIbβ3 (8), дает возможное объяснение того, почему генетическая модификация тромбоцитов GT для экспрессии низкого уровня нормального αIIbβ3 привела к для улучшения гемостатической функции у собак.Конечно, еще предстоит определить, будет ли этот уровень нормального αIIbβ3 достаточным для улучшения гемостаза у пациентов с GT. Между тем, мы показали возможность генной терапии GT на крупных животных. Мы также узнали, что выбор лекарств in vivo важен для коррекции неконтролируемого кровотечения. Примечательно, что иммуноопосредованное разрушение тромбоцитов GT, экспрессирующих интегрин αIIbβ3, не было обнаружено у двух собак. Однако ответ антител на трансгенный продукт привел к осложнениям у одного животного (особенно после введения вакцины), которые уменьшились, но не исчезли с помощью временной иммуносупрессивной терапии.

Материалы и методы

Собаки.

Характеристика молекулярного дефекта в αIIb, приводящего к GT в Великих Пиренеях, была описана ранее (10). Как и у пациентов, диагноз GT был установлен по продолжительному времени кровотечения, неспособности тромбоцитов агрегировать с физиологическими агонистами активации тромбоцитов и неспособности отвести фибриновый сгусток. Тромбоциты собак содержали <5% определяемого αIIbβ3, что соответствует типу 1 GT. Лицензированный ветеринар-лабораторный ветеринар регулярно проверял здоровье собак.Все протоколы были одобрены комитетами по уходу за животными и их использованию Медицинского колледжа Висконсина и Обернского университета.

Лентивирусный вектор.

Вектор генетического переноса αIIb- (M) WPT происходит из остова лентивируса ВИЧ типа 1 (Д. Троно, Женевский университет, Швейцария) (26). Кассету кДНК субклонировали в остов лентивируса, кодирующий фрагмент промотора гена интегрина αIIb от нуклеотида -889 до +35, чтобы направлять мегакариоцит-специфичную транскрипцию (9, 27) нормальной полноразмерной субъединицы интегрина αIIb.Конструкция также содержит тканеспецифический промотор гена из вируса мышиных стволовых клеток, управляющий транскрипцией выбираемого лекарственным средством белка репарации ДНК (P140K) MGMT (Б. Соррентино, Исследовательский центр Сент-Джудс, Нэшвилл, Теннесси) (28). Правильная последовательность гена кассеты кДНК была подтверждена нуклеотидным анализом. Рекомбинантный лентивирус получали путем временной котрансфекции трех плазмид, как описано ранее (9). Вирус собирали, концентрировали в 500 раз и хранили при -80 ° C до использования, как описано (27).Титр вируса определяли с помощью ОТ-ПЦР, как недавно описано (29). Репликационно-компетентные вирионы были подтверждены отсутствием в запасах с помощью анализов восстановления маркеров (8).

Антитела.

Ab, конъюгированные с фикоэритрином (PE) с β3 (CD61), FITC-конъюгированные Ab с αIIb (CD41) и стандарты изотипов (PE-IgG, FITC-IgG) были получены от BD Biosciences. FITC-анти-β3 и изотипический контроль были от Dako. Ab «7E3» (17), распознающее αIIbβ3 и αvβ3, было подарком Б. Коллера (Университет Рокфеллера, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк).Ab к собачьему αIIb «2F9» (30) было получено от S. Burstein (Университет Оклахомы, Оклахома-Сити, Оклахома). Ab к собачьему CD34 «1H6» (13) было приобретено в Онкологическом исследовательском центре Фреда Хатчинсона (Сиэтл, Вашингтон).

CD34

+ Выделение, трансдукция и трансплантация КПБ.

Собакам ежедневно вводили собачий рекомбинантный G-CSF (10 мкг / кг в день) и собачий рекомбинантный фактор стволовых клеток (5 мкг / кг в день) (Gift of Amgen, Thousand Oaks, CA). Сбор мобилизованных цитокинами PBC проводили на третий день с использованием сепаратора клеток крови COBE Spectra.Мононуклеарные ПБЦ выделяли из продукта для афереза ​​с помощью Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). CD34 + PBC отбирали с конъюгированным с биотином антителом 1H6 и иммуномагнитными шариками против биотина на магнитном сепараторе клеток Automacs (Miltenyi Biotec).

CD34 + PBC трансдуцировали лентивирусом αIIb- (M) WPT аналогично ранее описанному протоколу (31). Вкратце, 4 × 10 6 клеток на лунку в стерильном шестилуночном планшете (Falcon-Becton Dickinson), покрытом 20 мкг / см 2 RetroNectin (Takara Shuzo), инкубировали с 1 лентивирионом αIIb- (M) WPT. на клетку в X-Vivo 10 с 20% FCS и rhIL-3, rcaIL-6, rcaSCF, rhTPO и лигандом rhflk2 / flt3.Приблизительно 2,5 × 10 6 αIIb-трансдуцированных CD34 + ПБЦ / кг и 2,5 × 10 8 CD34 (-) ПБЦ вводили в головную вену каждого реципиента аутологичного трансплантата, предварительно подготовив немиелоаблативную дозу 4 мг / кг. бусульфан или облучение всего тела 100 сГр с использованием ортовольтного рентгеновского аппарата Pantac 320, как описано ранее (5, 32).

Обогащение in vivo CD34, трансдуцированного лентивирусом,

+ PBC.

Собакам трижды вводили 100 мг O 6 -бензилгуанина (Sigma Aldrich) в сочетании с 0.26, 0,41 или 0,45 мг / кг кармустина (Bristol-Myers Squibb) для стимулирования in vivo обогащения PBC, трансдуцированного лекарственно-устойчивой формой (P140K) MGMT, как описано ранее (18).

Сбор крови.

Кровь собирали в вакуумную пробирку, содержащую 7,5% антикоагулянт EDTA, как описано ранее (5). Промытые тромбоциты выделяли из крови, которую наслаивали на Fico / Lite для тромбоцитов (Atlanta Biologicals) и использовали непосредственно для проточной цитометрии или анализа функции тромбоцитов, как сообщалось ранее (9).

Проточная цитометрия.

Иммуноцитометрический анализ использовали для определения количества рецепторов интегрина на поверхности тромбоцитов и эффективности трансдукции тромбоцитов в присутствии уровней насыщения Ab до αIIbβ3, как описано ранее (9).

Агрегация тромбоцитов.

Агрегацию промытых тромбоцитов измеряли, как описано ранее (9). Вкратце, агрегацию инициировали добавлением 0,15 мг / мл растворимого фибриногена пика 1 (Enzyme Research Laboratories) (33) и смеси агонистов активации тромбоцитов, состоящей из 100 мкМ АДФ, 20 мкМ адреналина (BioData) и 250 мкМ каждого собачьего TRAP ( 1, SFFLKN-Nh3; 3, TRFGAP-Nh3; 4, SFPGQP-Nh3) (34) синтезированы нашей лабораторией Protein Core.Агрегацию контролировали с помощью профилографа агрегации тромбоцитов PAP-4 и анализировали с помощью программного обеспечения интерфейса данных (BioData).

Распространение тромбоцитов на иммобилизованном фибриногене.

Анализ распространения тромбоцитов выполняли, как описано ранее (35). Вкратце, 5 × 10 6 / мл промытых тромбоцитов инкубировали при 37 ° C в течение 45 мин на восьмикамерных предметных стеклах для культивирования тканей (Becton Dickinson), покрытых фибриногеном (100 мкг / мл). Образцы помещали в монтажную среду Vectashield (Vector Laboratories), и изображения получали с помощью камеры Photometrics SenSys из трех последовательных полей с использованием микроскопа Zeiss Axioscop с масляно-иммерсионным объективом Zeiss 100x (1.3 N.A.) и проанализированы с помощью программного обеспечения Metamorph (Universal Imaging).

Втягивание сгустка крови.

Анализы ретракции выполняли, как описано ранее (5). Вкратце, кровь (0,5 мл) набирали непосредственно в шприц, содержащий 4,5 мл холодного изотонического раствора, и осторожно перемешивали. Смесь (2,0 мл) добавляли в стеклянные пробирки, содержащие 0,1 мл 10 ед / мл человеческого тромбина (Chrono-Log). Пробирки помещали при 4 ° C на 30 мин, а затем переносили на водяную баню 37 ° C. Фотографии были сделаны камерой Nikon DX через 3, 4, 5, 6 и 24 часа после добавления тромбина.Способность тромбоцитов втягивать сгусток напрямую сравнивали путем визуализации ретракции сгустков крови из контрольных образцов αIIb (- / -, + / -, + / +).

Время кровотечения слизистой оболочки рта (BMBT).

BMBT определяется как время, необходимое для прекращения кровотечения из разорванной губы (разрез 1 мм) у собаки, находящейся под седативным действием (медетомидином или дексмедитомидином), как описано ранее (36). Вкратце, на губе каждой собаки делали один разрез с помощью автоматического устройства для разрезов (Surgicutt; ITC), и кровь собирали на стерильную фильтровальную бумагу (Surgicutt) каждые 15 с, пока кровотечение не остановилось или не достигло экспериментальной конечной точки 20. мин.

7.10 Ссылки

7.10 Ссылки

7.10 Ссылки

Берлин 1997
Берлин JA. Влияет ли ослепление читателей на результаты метаанализов? Исследовательская группа по метаанализу ослепления Пенсильванского университета. The Lancet 1997; 350: 185-186.

Бушеми 2006
Бушеми Н., Хартлинг Л., Вандермейер Б., Тьосволд Л., Классен Т.П. Однократное извлечение данных привело к большему количеству ошибок, чем двойное извлечение данных при систематических обзорах. Журнал клинической эпидемиологии 2006; 59: 697-703.

Коллетт 1994
Коллетт Д. Моделирование данных о выживаемости в медицинских исследованиях . Лондон: Чепмен и Холл, 1994.

.

Купер 1989
Купер Х., Риббл Р.Г. Влияние на результаты поиска литературы для интегративных обзоров исследований. Знание 1989; 10: 179-201.

датчанин 1998
Датчанин А.В., Шнайдер Б.Х.Целостность программы в первичной и ранней вторичной профилактике: выходят ли последствия реализации из-под контроля? Обзор клинической психологии 1998; 18: 23-45.

Дикс 1997a
Дикс Дж. Вы уверены, что это стандартное отклонение? (часть 1). Кокрановские новости 1997; Выпуск № 10: 11-12. (Доступно по адресу www.cochrane.org/news/newsletters/cochrane-news).

Дикс 1997b
Дикс Дж. Вы уверены, что это стандартное отклонение? (часть 2). Кокрановские новости 1997; Выпуск № 11: 11-12. (Доступно по адресу www.cochrane.org/news/newsletters/cochrane-news).

Дерри 2000
Дерри С., Локи Ю.К. Риск желудочно-кишечного кровотечения при длительном применении аспирина: метаанализ. BMJ 2000; 321: 1183-1187.

Dusenbury 2003
Дюзенбери Л., Бранниган Р., Фалько М., Хансен В.Б. Обзор исследований верности реализации: значение для профилактики злоупотребления наркотиками в школах. Исследования в области санитарного просвещения 2003; 18: 237-256.

Совместная группа исследователей раннего рака молочной железы 1990
Совместная группа исследователей раннего рака молочной железы. Лечение рака груди на ранней стадии. Том 1: Всемирные свидетельства 1985-1990 гг. . Оксфорд (Великобритания): Oxford University Press, 1990. (Доступно на сайте www.ctsu.ox.ac.uk).

Эдвардс 2002
Эдвардс П., Кларк М., ДиГусеппи К., Пратап С., Робертс И., Венц Р.Идентификация рандомизированных контролируемых испытаний в систематических обзорах: точность и надежность записей скрининга. Статистика в медицине 2002; 21: 1635-1640.

Гётче 2007
Gøtzsche PC, Hróbjartsson A, Maric K, Tendal B. Ошибки извлечения данных в метаанализах, в которых используются стандартизованные разности средних. JAMA 2007; 298: 430-437.

Джадад 1996
Джадад А.Р., Мур Р.А., Кэрролл Д., Дженкинсон С., Рейнольдс DJM, Гаваган Д.Д., МакКуэй Х.Оценка качества отчетов о рандомизированных клинических испытаниях: необходимо ли ослепление? Контролируемые клинические испытания 1996; 17: 1-12.

Джонс 2005
Джонс А.П., Реммингтон Т., Уильямсон ПР, Эшби Д., Смит Р.Л. В Кокрановских систематических обзорах была обнаружена высокая распространенность, но низкое влияние ошибок извлечения данных и отчетности. Журнал клинической эпидемиологии 2005; 58: 741-742.

Ламли 2004
Ламли Дж., Оливер СС, Чемберлен С., Окли Л.Меры по прекращению курения во время беременности. Кокрановская база данных систематических обзоров 2004, выпуск 4. Арт. №: CD001055.

Макленнан 2000
МакЛеннан Дж. М., Шекли Ф., Хит П. Т., Дикс Дж. Дж., Фламанк С., Герберт М., Гриффитс Х., Хацманн Э., Гойлав С., Моксон ER. Безопасность, иммуногенность и индукция иммунологической памяти менингококковой конъюгированной вакциной серогруппы C у младенцев: рандомизированное контролируемое исследование. JAMA 2000; 283: 2795-2801.

Meade 1997
Мид Миссури, Ричардсон У. Выбор и оценка исследований для систематического обзора. Annals of Internal Medicine 1997; 127: 531-537.

Мохер 2001
Мохер Д., Шульц К.Ф., Альтман Д.Г. Заявление CONSORT: пересмотренные рекомендации по повышению качества отчетов рандомизированных исследований в параллельных группах. Ланцет 2001; 357: 1191–1194. (Доступно на www.consort-statement.org).

Орвин 1994
Орвин Р.Г. Оценка решений по кодированию. В: Cooper H, Hedges LV (редакторы). Справочник по синтезу исследований . Нью-Йорк (Нью-Йорк): Фонд Рассела Сейджа, 1994.

Оксман 1993
Oxman AD, Guyatt GH. Наука обзора исследований. Анналы Нью-Йоркской академии наук 1993; 703: 125-133.

Пармар 1998
Пармар МКБ, Торри В., Стюарт Л.Получение сводной статистики для выполнения метаанализа опубликованной литературы по конечным точкам выживаемости. Статистика в медицине 1998; 17: 2815-2834.

Акция 1994
Сток WA. Систематическое кодирование для синтеза исследований. В: Cooper H, Hedges LV (редакторы). Справочник по синтезу исследований . Нью-Йорк (Нью-Йорк): Фонд Рассела Сейджа, 1994.

Тирни 2007
Тирни Дж. Ф., Стюарт Л. А., Герси Д., Бёрдетт С., Сидс М.Практические методы включения сводных данных о времени до события в метаанализ. Trials 2007; 8: 16.

Tramèr 1997
Tramèr MR, Reynolds DJ, Moore RA, McQuay HJ. Влияние скрытой дублирующей публикации на метаанализ: тематическое исследование. BMJ 1997; 315: 635-640.18.

фон Эльм 2004
фон Эльм Э, Полья Г, Вальдер Б, Трамер MR. Различные модели дублирования публикации: анализ статей, используемых в систематических обзорах. JAMA 2004; 291: 974-980.

Уильямсон 2002
Уильямсон PR, Смит CT, Hutton JL, Marson AG. Обобщенный мета-анализ данных с указанием времени до события. Статистика в медицине 2002; 21: 3337-3351.

Занчетти 1999
Занчетти А., Ханссон Л. Риск большого желудочно-кишечного кровотечения при приеме аспирина (ответ авторов).

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *