Контроль эффективности стерилизации: Индикаторы и методы контроля стерилизации

Содержание

Контроль стерилизации

 

 

Методы
контроля эффективности
стерилизации

В комплексе мероприятий по
стерилизации изделий медицинского назначения важное значение имеет организация и
проведение контроля за ее эффективностью. Используемые до настоящего времени
методы и средства контроля не всегда позволяют выявить дефекты стерилизации, что
влечет за собой повышение уровня внутрибольничных инфекций.

Контроль эффективности работы
стерилизационного оборудования осуществляется физическими, химическими и
биологическим (бактериологическим) методами. Надежность этих методов неодинакова.
Физические и химические методы предназначены для оперативного контроля и
позволяют контролировать соблюдение параметров режимов паровой, газовой,
воздушной стерилизации, температуру, давление, экспозицию. Недостаток этих
методов заключается в том, что они не могут служить доказательством эффективной
стерилизации. Достоверным для определения эффективности является только
бактериологический метод.

Физические методы

Физические методы контроля
осуществляются с помощью средств измерения температуры (термометры, термопары),
давления (манометры, мановакуумметры) и времени (таймеры). Современные
стерилизаторы оснащены также записывающими устройствами, фиксирующими отдельные
параметры каждого цикла стерилизации.

Химические методы

В течение десятков лет для
проведения химического контроля применялись химические вещества, изменяющие свое
агрегатное состояние или цвет при температуре, близкой к температуре
стерилизации (бензойная кислота для контроля паровой стерилизации, сахароза,
гидрохинон и ряд других веществ — для контроля воздушной стерилизации). При
изменении цвета и расплавлении указанных веществ результат стерилизации
признавался удовлетворительным. Однако многолетние наблюдения и данные
литературы указывают, что при удовлетворительных результатах химического
контроля с помощью названных индикаторов, бактериологический контроль в ряде
случаев (до 12%) выявляет неудовлетворительный результат стерилизации.

Кроме того, эти вещества имеют существенный
недостаток. Переход их в другое агрегатное состояние не дает представления о
продолжительности воздействия температуры, при которой происходит их
расплавление.

Принимая во внимание недостаточную достоверность
использования указанных индикаторов для контроля, а также значительную
трудоемкость и неудобство их практического применения, в 70-х годах были
разработаны химические индикаторы, изменение цвета которых происходит при
воздействии температуры, принятой для данного режима, в течение времени,
необходимого для стерилизации. По изменению окраски этих индикаторов можно
судить о том, что основные параметры процесса стерилизации — температура и время
— выдержаны. Длительное применение таких индикаторов показало их высокую
надежность.

Более сложные индикаторы предназначены для контроля
критических параметров процесса стерилизации. Критическими параметрами являются:
для парового метода стерилизации — температура, время воздействия данной
температуры, водяной насыщенный пар; для воздушного метода стерилизации —
температура и время воздействия данной температуры; для газовых методов
стерилизации — концентрация используемого газа, температура, время воздействия,
уровень относительной влажности; для радиационной стерилизации — полная
поглощенная доза.

До конца 80-х годов не существовало стандартов на
выпускаемые различными фирмами химические индикаторы и не было попыток
классифицировать их. Лишь в 1995 году международная организация по
стандартизации (ISO) опубликовала документ «Стерилизация
медицинских изделий. Химические индикаторы. Часть 1».

С января 2002 года в России введен в действие ГОСТ Р
ИСО 11140-1 «Стерилизация медицинской продукции. Химические индикаторы. Общие
требования». Согласно этому документу химические индикаторы распределены на
шесть классов.

 

Индикаторы 1-го класса являются индикаторами
(«свидетелями») процесса. Примером такого индикатора является термоиндикаторная
лента, наклеиваемая перед проведением стерилизации на текстильные упаковки или
стерилизационные коробки. Изменение цвета ленты указывает, что упаковка
подверглась воздействию процесса стерилизации. Такие же индикаторы могут
помещаться в наборы хирургических инструментов или операционного белья.

2-й класс индикаторов предназначен для
использования в специальных тестовых процедурах, например, при проведении теста
Бовье-Дика (Bowie-Dick test). Этот тест не
контролирует параметры стерилизации, он оценивает эффективность удаления воздуха
из камеры парового стерилизатора.

Индикаторы 3-го класса являются индикаторами
одного параметра. Они оценивают максимальную температуру, но не дают
представления о времени ее воздействия. Примерами такого рода индикаторов
являются описанные выше химические вещества.

4-й класс — это многопараметровые индикаторы.
Они содержат красители, изменяющие свой цвет при сочетанном воздействии
нескольких параметров стерилизации, чаще всего — температуры и времени. Примером
таких индикаторов служат термовременные индикаторы для контроля воздушной
стерилизации.

5-й класс — интегрирующие индикаторы. Эти
индикаторы реагируют на все критические параметры метода стерилизации.
Характеристика этого класса индикаторов сравнивается с инактивацией
высокорезистентных микроорганизмов.

6-й класс — индикаторы-эмуляторы. Эти
индикаторы должны реагировать на все контрольные значения критических параметров
метода стерилизации.

Биологический метод

Наряду с физическими и химическими применяется
бактериологический метод контроля стерилизации. Он предназначается для контроля
эффективности стерилизационного оборудования. До недавнего времени для контроля
паровой и воздушной стерилизации использовались пробы садовой земли, содержащей
микроорганизмы, высокорезистентные к воздействию стерилизующих факторов. Однако
устойчивость микроорганизмов в различных пробах неодинакова, что не позволяет
стандартизировать результаты контроля.

В настоящее время для проведения бактериологического
контроля используются биотесты, имеющие дозированное количество спор
тест-культуры. Контроль эффективности стерилизации с помощью биотестов
рекомендуется проводить 1 раз в 2 недели. В зарубежной практике принято
применять биологическое тестирование не реже 1 раза в неделю.

В ряде случаев возникает необходимость проведения
контроля с помощью биотестов каждой загрузки стерилизатора. Прежде всего, речь
идет о стерилизации инструментов, используемых для выполнения сложных
оперативных вмешательств, требующих применения высоконадежных стерильных
материалов. Каждая загрузка имплантируемых изделий также должна подвергаться
бактериологическому контролю. При этом использование простерилизованных
материалов задерживается до получения отрицательных результатов контроля. Тех же
принципов при определении периодичности контроля рекомендуется придерживаться в
отношении газовой стерилизации, являющейся по сравнению с другими методами более
сложной.

Индикаторы и интеграторы

 

Индикаторы 1-го класса.

Обычно выпускаются в виде свернутых в рулон клейких лент
(наподобие скотча) с нанесенным на их лицевую поверхность
химическим индикатором (в виде полосок или
надписей). Применяются для удобства отличия изделий,
подвергнутых процессу стерилизации, от нестерильных.

 Кусочки ленты наклеиваются
на подготовленные к стерилизации упаковки, контейнеры, свертки.
Могут применяться для закрепления краев упаковочных материалов.

Должны
характеризоваться
отчетливым необратимым изменением цвета индикатора, нанесенного
на полоски.
 

 

 

Индикаторы 2-го класса.

Самый характерный
представитель этого класса индикаторов — индикатор теста Бовье-Дика
(Bowie-Dick). Он предназначен для
испытания эффективности вакуумной системы парового стерилизатора.
Выполняемый ежедневно, этот тест должен первым сигнализировать о
неисправности стерилизатора. Тест не определяет качество стерилизации
как таковое, но является неотъемлемой частью всесторонней программы
гарантии стерилизации. С помощью теста пользователь определяет, что
вакуумная стадия стерилизатора удаляет достаточное количество воздуха до
введения пара в камеру, а также проверяется герметичность камеры в
течение цикла стерилизации. Другими словами, с помощью теста Бовье-Дика
можно оценить равномерность распределения пара в камере стерилизатора.

 Индикатор теста представляет собой лист бумаги с
нанесенным на него сложным рисунком из химического состава, изменяющего
свой цвет под воздействием насыщенного водяного пара. Лист размещается
внутри стопки текстильных изделий при проведении стандартного цикла
стерилизации. Сейчас выпускаются так называемые «пакеты Бовье-Дика», в
которых контрольный лист размещен между листами плотной фильтровальной
бумаги, имитирующей стопку текстиля. Такие пакеты можно использовать при
пустой камере стерилизатора или вместе со стерилизуемым, например,
инструментарием.

Неудачный
результат проявляется более светлым цветом в центре образца чем по краям,
либо неравномерным изменением цвета рисунка.
Положительным результат считается при однородном изменении цвета рисунка
по всему листу индикатора.

Вариантом теста Бовье-Дика является
Хеликс-тест (Helix-test).

 

 

Индикаторы 3-го класса.

Термохимический индикатор представляет собой
стеклянную трубку с химическим веществом, изменяющим
свое агрегатное состояние или цвет при температуре, близкой к
температуре стерилизации. В современном виде это — полоска
бумаги,
на которую нанесена термоиндикаторная краска.
Определение параметров,
достигнутых в процессе стерилизации,
основано на изменении цвета термоиндикаторной
краски при достижении «температуры
перехода»,
строго определенной для каждой краски.

Такие индикаторы применялись (да, наверное, применяются и до сих пор)
для контроля воздушной стерилизации.

 

 

Индикаторы 4-го класса.

Они отличаются от предыдущего класса
только тем, что индикаторная краска меняет свой цвет только в течении
определенного времени воздействия контролируемого фактора. Поэтому чаще
всего маркируются двумя цифрами, например: 180-60 (180 градусов, 60
минут).

 

 

 

Индикаторы 5-го класса.

Эти индикаторы уже называются
интеграторами.

Цвет контрольной метки
интегратора должен необратимо изменяться
в ходе стерилизации только при соответствии всех критических параметров
примененного процесса необходимым требованиям. К
примеру, при температуре 132-1350С цвет метки
полностью изменится в течение от 3,0 до 3,5 минут
при условии воздействия на интегратор насыщенного
водяного пара. Аналогично
работают интеграторы этиленоксидной стерилизации.

Одновременные испытания химических
интеграторов и биологических индикаторов показали, что цвет химического
индикатора изменяется не раньше, чем пройдет время, необходимое для
полного уничтожения контрольных микроорганизмов биологического
индикатора.

Цветной стандарт для сравнения
должен быть напечатан на каждой полоске интегратора.

 

 

Индикаторы 6-го класса.

Теоретически эти индикаторы (эмуляторы)
реагируют на все, а не только на критические параметры процесса
стерилизации. Но, честное слово, я не представляю себе, на что еще можно
реагировать в камере парового стерилизатора, кроме как на температуру,
давление и пар… На свет, что ли?

Зато они дороже.

 

Биологические индикаторы.

Они представляют
собой пластиковый контейнер с крышечкой, содержащий хрупкую ампулу с
восстанавливающей средой и бумажную полоску, зараженную спорами
контрольных микроорганизмов. Индикатор
размещается непосредственно в стерилизационной камере, либо
закладывается в контейнеры и упаковки, предназначенные к стерилизации, в
процессе их подготовки. Никаких предварительных манипуляций с
индикатором производить не требуется — он полностью готов к применению.
После окончания стерилизационного цикла индикатор должен быть извлечен и
подвергнут инкубации для контроля инактивации содержащихся в нем спор
микроорганизмов. После извлечения из камеры
стерилизатора надо раздавить
находящуюся внутри ампулу и инкубировать
при рекомендованной температуре в течение необходимого времени
— обычно это 18 — 24 часа.  Ошибка стерилизации
проявляется изменением цвета и/или помутнением среды.

 

 

Современные методы контроля стерилизующей аппаратуры uMEDp

Автором проанализированы правила использования автономных биологических индикаторов для контроля удаления воздуха в паровых стерилизационных камерах (согласно МУК 4.2.1990-05).

Интенсивное развитие высокотехнологичных инвазивных методов диагностики и лечения наряду с широким распространением микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью определяет необходимость непрерывного совершенствования систем надзора и контроля. Совершенствование системы дезинфекционных и стерилизационных мероприятий предусмотрено требованиями современного отечественного законодательства, а именно Национальной концепцией профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), утвержденной главным государственным санитарным врачом РФ 6 ноября 2011 г.

Согласно положениям Федерального закона «Об основах охраны здоровья граждан в РФ» № 323 от 21.11.2011 (ст. 90 и 96) требования к безопасности медицинских изделий (МИ) едины для всех МИ как однократного применения, изготавливаемых на промышленных предприятиях, так и изделий многократного применения, подвергающихся обработке в медицинских организациях (ГОСТ PИСО 13683-2000 «Стерилизация медицинской продукции. Требования к валидации и текущему контролю»).

В современном стерилизационном отделении организации, осуществляющей медицинскую деятельность (ООМД), в качестве методов контроля стерилизующей аппаратуры используются физические, химические и биологические методы контроля.

К физическим средствам контроля относятся приборы контроля физических параметров стерилизации: манометры, термометры, термопары, таймеры. Согласно требованиям ГОСТ P ИСО 13683-2000 (ГОСТ ISO 11140-1 «Химические индикаторы паровой стерилизации»), эффективность процесса в цикле стерилизации оценивают по установленным физическим параметрам.

В качестве химических средств контроля применяются индикаторы, изготовленные по ГОСТ ISO 11140-1 (МУК 4.2.1990-05 «Контроль удаления воздуха в паровых стерилизационных камерах»), которые подразделяются на шесть классов. Для ежедневного контроля параметров режимов паровой стерилизации необходимо использовать химические индикаторы 4–6 классов. Также вышеуказанные химические индикаторы можно применять для выполнения теста индикаторного химического (ТЕСТ ИХ) согласно МУК 4.2.1990-05.

Одной из первых научных работ по контролю эффективности стерилизации МИ в упаковках в нашей стране является докторская диссертация П. И. Бухмана 1898 г. «Об обеспложивании перевязочного материала в упаковках». В качестве биологического индикатора автор использовал споры Bacillus antracis, закрепленные на нитях по Коху, при этом автор уделял особое внимание предварительному испытанию стойкости бактерий к стерилизующему агенту (текучему пару) перед применением биологического контроля.

В 1957 г. при проведении углубленного изучения свойств спор термофильных бактерий рода Bacillus британские ученые Maclofflin, Kelsey и Breiber предложили использовать в качестве тест-микроорганизмов для биологического контроля эффективности паровой стерилизации споры B. Stearothermophilus.

В СССР к середине 1980-х гг. в качестве тест-культуры для контроля эффективности паровой стерилизации опытным путем на основе зарубежных и собственных исследований были выбраны споры B. Stearothermophilus (ВКМ В-718). Устойчивость B. Stearothermophilus к текучему пару 98–100 °С составляет не менее 11 часов. Под давлением сухого насыщенного пара 1,1 кгс/см2 из 200 штаммов м/о только 44 (22,5 %) сохранили жизнеспособность после 2–5 минут воздействия. Полученные данные, касающиеся резистентности свежевыделенных штаммов, свидетельствовали о возможности использования последних в качестве тест-культур при отработке режимов и оценке эффективности стерилизации ИМН различными методами и средствами (СанПиН 2.1.3.2630-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность»).

В настоящее время в качестве биологического метода контроля применяются споры микроорганизмов из рода Geobacillus, наиболее устойчивые к конкретной стерилизационной технологии.

Согласно требованиям СанПиН 2.1.3.2630-10 биологический контроль стерилизующей аппаратуры осуществляется в централизованных стерилизационных ООМД не реже двух раз в год. При этом ООМД заключает договор с организацией, выполняющей биологический контроль (ГОСТ Р 51935-2002 «Стерилизаторы паровые большие»). Однако по вполне понятным причинам руководителям эпидемиологической службы ЛПУ и отделений стерилизации хотелось бы быть уверенными в эффективности параметров режимов паровой стерилизации чаще, чем раз в шесть месяцев. С этой целью возможно использование автономных биологических индикаторов при проведении теста индикаторного биологического (ТЕСТ ИБ) согласно МУК 4.2.1990-05.

Для этих целей потребуется:

  1. Стандартная контрольная упаковка из 16 хлопчатобумажных простыней весом 7,5 ± 0,5 кг согласно требованиям ГОСТ Р 51935-2002 (СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарноэпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами»).

  2. Автономные биологические индикаторы.

  3. Инкубатор.

  4. Инструкция по применению автономных биологических индикаторов (рис. 1).

Для осуществления ТЕСТ ИБ биологические индикаторы размещаются в геометрическом центре стандартной контрольной упаковки. Стандартная контрольная упаковка размещается предварительно разогретой в камере парового стерилизатора максимально близко к дренажному отверстию (в корзине, на нижней полке загрузочного стеллажа или на специальной подставке), при этом она не должна касаться краев дна и стенок стерилизационной камеры (рис. 2). Остальной объем стерилизационной камеры заполняется стерилизуемыми изделиями.

Далее осуществляется стандартный стерилизационный цикл согласно инструкции производителя стерилизатора, который состоит из:

удаления воздуха;

собственно стерилизации;

постстерилизационной сушки.

По окончании стерилизационного цикла контрольная упаковка извлекается из камеры парового стерилизатора (рис. 3), а биологические индикаторы – из центра контрольной упаковки (рис. 4).

После остывания до комнатной температуры биологические индикаторы помещаются в инкубатор, в процессе установки биологического индикатора разламывается внутренняя ампула с индикаторной средой (рис. 5). Биологические индикаторы, использованные в контроле, дополняются одним контрольным, который не был в камере парового стерилизатора (рис. 6).

Инкубация автономных биологических индикаторов осуществляется в течение 48 часов (рис. 7).

По истечении времени инкубации индикаторы извлекаются из инкубатора, и по изменению цвета индикаторной среды можно судить о наличии или отсутствии роста тестультуры в исследуемых пробирках (рис. 8). Результаты ТЕСТ ИБ могут быть зафиксированы в форме 257У. Пробирки с отсутствием роста тест-культуры останут ся изначального синеиолетового цвета; в пробирке с наличием роста тест-микроорганизма цвет индикаторной метки изменится на лимонно-жeлтый.

Таким образом, осуществление ТЕСТ ИБ в ЦС ООМД не представляет особых трудностей для персонала отделений стерилизации. Согласно требованиям МУК 4.2.1990-05 тест ИБ должен осуществляться раз в две недели. Согласно требованиям производителя биологические индикаторы с инактивированной тест-культурой возможно утилизировать как отходы класса А по СанПиН 2.1.7.2790-10, индикаторные пробирки с ростом тест-культуры необходимо утилизировать как отходы классаБ по СанПиН 2.1.7.2790-10.

Использование автономных биологических индикаторов для осуществления ТЕСТ ИБ в централизованных стерилизационных ООМД позволяет персоналу отделений осуществлять биологический контроль эффективности работы паровых стерилизаторов и дает сотрудникам централизованной стерилизационной информацию о микробиологической эффективности паровой стерилизации гораздо чаще, чем два раза в год. Также возможно для осуществления ТЕСТ ИБ использовать автономные биологические индикаторы быстрого чтения, позволяющие получить информацию о микробиологической эффективности стерилизации в трудностерилизуемой точке уже через 1–4 часа.

Индикаторы — Фармстандарт-Медтехника


Одним из способов профилактики и снижения уровня ИСМП является качественная и эффективная дезинфекция и стерилизация. Поэтому контроль за данными процессами является основополагающим и важным аспектом в ЛПУ. В РФ принят целый ряд нормативных документов, которые регламентируют проведение контроля.


Контроль эффективности работы оборудования и самого процесса стерилизации осуществляется с помощью физического, химического и бактериологического методов. Физические и химические методы предназначены для оперативного контроля и позволяют определить соблюдение параметров режимов паровой, газовой, воздушной стерилизации (температуру, давление, экспозицию).

Сегодня мы остановимся на химическом методе контроля процесса стерилизации, а именно на текущем контроле с помощью химических индикаторов 4 класса.


В течение нескольких десятилетий для проведения химического контроля применялись химические индикаторы стерилизации (1 класс), изменяющие свое агрегатное состояние или цвет при температуре, близкой к температуре стерилизации (бензойная кислота для контроля паровой стерилизации; сахароза, гидрохинон и ряд других веществ — для контроля воздушной стерилизации). При изменении цвета индикатора результат стерилизации признавался удовлетворительным. Однако наблюдение и многолетний практический опыт показали, что при удовлетворительных результатах химического контроля бактериологический контроль в ряде случаев выявлял нестерильные пробы. Кроме того, использование этих веществ для контроля стерилизации (бензойная кислота, сахароза, гидрохинон и др) не дает полной информации о важнейших условиях процесса стерилизации. Переход данных веществ в другое агрегатное состояние не позволяет выявить продолжительность воздействия температуры, при которой происходит их расплавление.


Принимая во внимание недостаточную достоверность использования указанных индикаторов для контроля, а также значительную трудоемкость и неудобство их практического применения, в 70-х годах были разработаны химические индикаторы паровой стерилизации, изменение цвета которых происходит при воздействии температуры, принятой для данного режима, в течение времени, необходимого для стерилизации (3 класс). По изменению окраски этих индикаторов можно судить о том, что основные параметры процесса стерилизации — температура и время — выдержаны. И уже позже, в начале 90-х, появились индикаторы 4 класса, которые предназначены для контроля критических параметров процесса стерилизации. Критическими параметрами являются: для парового метода стерилизации — температура, время воздействия данной температуры, водяной насыщенный пар; для воздушного метода стерилизации — температура и время воздействия данной температуры; для газовых методов стерилизации — концентрация используемого газа, температура, время воздействия, уровень относительной влажности.


До конца 80-х годов не существовало стандартов, регламентирующих требования, предъявляемые к химическим индикаторам стерилизации. Лишь в 1995 году международная организация по стандартизации (ISO) опубликовала документ «Стерилизация медицинских изделий. Химические индикаторы. Часть 1».


С 2001 года он был введен в действие в России — ГОСТ Р ИСО 11140-1 «Стерилизация медицинской продукции. Химические индикаторы. Общие требования», где регламентированы требования, предъявляемые к химическим индикаторам всех классов.


Уже более двадцати лет ЛПУ используют химические индикаторы для контроля процесса паровой и воздушной стерилизации 4 класса. При этом долгие годы на российском рынке были представлены индикаторы только одного отечественного производителя. Со временем их количество увеличилось и несколько отечественных компаний стали заниматься производством химических индикаторов в России. Позже появилась зарегистрированная продукция импортного производства, но она не получила широкого распространения из-за дорогой стоимости. Все это время каждый производитель повторял уже существующие индикаторы, описанные в ГОСТ, контролирующие те или иные критические переменные, придумывая лишь новые названия.


На сегодняшний день на рынке великое множество индикаторов 4 класса по типу стерилизации, режимам и т.д., огромное количество названий и модификаций, в которых нередко путаются лечебные организации. Появление на российском рынке индикаторов 4 класса торговой марки DGM Steriguard для паровой и воздушной стерилизации решило немало проблем, с которыми сталкивались потребители. Индикаторы не только отвечают нормативным документам, принятым в РФ, производятся по новым современным технологиям, но имеют одну уникальную особенность: они являются универсальными.


Индикаторы для контроля паровой гравитационной стерилизации могут использоваться на 2 режима одновременно (120°C 45 минут, 132°C 20 минут). Индикаторы для контроля паровой форвакуумной стерилизации уникальны тем, что один тип индикатора может использоваться сразу на три режима (121°C 20 минут, 126°C 10 минут, 134°C 5,7 минут), а также внутри и снаружи упаковок. Индикаторы для контроля воздушной стерилизации (180 °C 60 минут) могут использоваться как внутри укладок, так и снаружи.


Это позволяет медицинскому персоналу использовать минимальное количество модификаций тех или иных индикаторов. 3 типа индикаторов DGM Steriguard могут использоваться как на несколько режимов одновременно, так и внутри/снаружи укладки. Это упрощает работу среднего медицинского персонала, сокращает время на подготовку и закладку индикаторов.


Индикаторы торговой марки DGM Steriguard отвечают всем требованиям нормативных документов РФ (имеются декларации соответствия качества, регистрационные удостоверения и инструкции, заверенные ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора).


Для получения более подробной информации об оборудовании Вы можете
связаться с нами любым из способов, указанных в разделе «Контакты».



Перейти

Способы контроля стерилизации. — Студопедия

Контроль качества стерилизации. Он предусматривает определение её эффективности и параметров.

Надёжность воздушной стерилизации зависит от конструкции стерилизатора, его исправности, схемы и объёма загрузки, используемой защитной упаковки, применяемых методов оперативного и периодического контроля, подготовки обслуживающего персонала.

Проблема надёжности особенно актуальна при эксплуатации аппаратов устаревших типов, при отсутствии доступных методов проверки стерилизации.

Контроль эффективности стерилизации осуществляют бактериологическим методом и химическими термовременными индикаторами.

Бактериологический метод контроля в воздушном стерилизаторе проводят с помощью биотеста — объекта из определённого материала, обсеменённого тест-микроорганизмами. В качестве носителей используют небольшой флакон, содержащий споры B.Licheniformis. Контроль проводят в соответствии с утверждённой методикой. Существуют и готовые сертифицированные тесты со спорами B.Licheniformis и цветными питательными средами, позволяющими провести бактериологический контроль непосредственно в ЦСО при наличии в нём термостата.

Контроль воздушной стерилизации химическими термовременными индикаторами проводят для оперативной проверки её качества с помощью химических веществ, точка плавления которых соответствует температуре стерилизации. Этот метод не очень надёжный, ибо не даёт представления о времени воздействия горячего воздуха на изделие. Он носит ориентировочный характер и не гарантирует достижения стерильности.

Надежность оперативного контроля существенно повышается при использовании индикаторов интегрированного действия, в частности индикаторы фирмы «Винар» ИС-160 и ИС-180, изменяющих окраску до цвета эталона только при воздействии на них температуры стерилизации в течение всей стерилизационной выдержки. Полоски индикатора закладывают в контрольные точки стерилизатора при каждом цикле обработки. Если его окраска после стерилизации в какой-либо точке светлее эталона, все изделия считаются нестерильными.

Пакеты из пергаментной бумаги, используемые для упаковки, при стерилизации в современной аппаратуре имеют подобный индикатор, нанесённый в фабричных условиях.

Надежность паровой стерилизации зависит от нескольких факторов: соблюдения условий эксплуатации, точности контрольно-измерительных приборов, установленных на стерилизаторе, полноты удаления воздуха из стерилизуемых изделий, герметичности камеры стреилизатора.

Определение эффективности бактериологическим методом в паровом стерилизаторе осуществляется тестами, содержащими споры Bacillus stearothermophilus в соответствии с методикой, утвержденной МЗ РФ. Оперативный контроль паровой стерилизации проводят химическими индикаторами интегрированного действия (термовременными). Индикаторы плавления (тиомочевина, бензойная кислота и др.), которые всё ещё используются в некоторых ЛПУ, не могут быть индикаторами стерильности, поскольку регистрируют только температуру, но не учитывают время стерилизации. Индикаторы фирмы «Винар» (ИС-120 и ИС-132) изменяют окраску до эталона только при воздействии на них заданной температуры в течение всей стерилизационной выдержки. При каждом цикле полоски индикатора закладываются в контрольные точки стерилизатора. Если его окраска в какой-нибудь точке светлее эталона, все изделия считаются нестерильными.

Биологические индикаторы контроля качества стерилизации

Биологические индикаторы (БИ), согласно определению ANSI/AAMI и ISO, это тест-системы, содержащие жизнеспособные микроорганизмы, обеспечивающие определенную устойчивость к конкретному процессу стерилизации. Биологический индикатор предоставляет информацию о том, были ли выполнены необходимые условия для уничтожения определенного количества микроорганизмов для данного процесса стерилизации, обеспечивая уровень уверенности в этом процессе. Эндоспоры, или бактериальные споры, — это микроорганизмы, которые в основном используются в БИ. Они считаются одними из самых жизнеспособных. Кроме того, бактериальные споры выбираются для конкретного процесса стерилизации на основании их известной устойчивости (резистентности) к этому процессу. Например, споры Geobacillus stearothermophilus демонстрируют высокую устойчивость к воздействию пара и плазмы перекиси водорода и поэтому используются в БИ, контролирующих эти процессы стерилизации.

 

Преимущества биологических индикаторов в процессе стерилизации

Биологические индикаторы, в зависимости от конкретного типа, могут использоваться для различных процессов стерилизации с использованием пара, перекиси водорода, этиленоксида и других.

Несколько факторов, таких как опыт оператора, подготовка загрузки и состояние стерилизатора, могут влиять на цикл стерилизации. БИ обеспечивают прямое определение летальности процесса, и поэтому использование БИ для регулярного мониторинга стерилизаторов дает уверенность в эффективности процесса стерилизации.

БИ обычно используются в устройствах контроля процесса (УКП/PCD — process challenge device), которые предназначены для имитирования наиболее сложных изделий, подвергаемых стерилизации. Результат использования БИ в рамках этой задачи демонстрирует, что стерилизатор эффективен в уничтожении большого количества высокоустойчивых бактериальных спор, предоставляя пользователям определенный уровень уверенности в процессе стерилизации.

 

Процедура тестирования биологических индикаторов

Биологический индикатор состоит из материала-носителя, на который нанесены бактериальные споры с определенной устойчивостью к процессу стерилизации. Материал носителя заключен в стеклянную оболочку или флакон. БИ подвергается стерилизации, а затем инкубируется при определенных условиях, чтобы определить, выжили ли какие-либо споры после процесса стерилизации. Если споры не выживают, и роста не происходит испытание считается пройденным. Если обнаружен рост, то тест провален.

Персонал всегда должен следовать инструкциям по применению (IFU — instruction for use) при использовании биологических индикаторов для контроля стерилизации независимо от типа и программы процесса.

 

Биологические индикаторы для стерилизации паром (автоклавирование)

Биологические индикаторы (внутри УКП) часто используются для рутинного мониторинга, квалификации и контроля загрузки парового стерилизатора. Биологические индикаторы предназначены для демонстрации того, были ли условия во время парового (автоклавного) цикла достаточными для достижения определенного уровня инактивации микроорганизмов. Для паровой стерилизации БИ обычно используются внутри УКП. AAMI ST79: 2017* рекомендует использовать УКП еженедельно, желательно ежедневно, для мониторинга работы стерилизаторов и в каждой загрузке, содержащей имплантаты.

УКП, содержащее БИ и/или химический индикатор, должно быть помещено в наиболее труднодоступное место камеры. В паровом стерилизаторе это обычно находится на нижней полке рядом со сливом. По завершению цикла УКП извлекается и БИ инкубируются. После инкубации считывается результат. Инкубаторы обеспечат окончательный результат стерилизации: «пройдена» или «не пройдена» в течение определенного периода времени.

 

Согласно AAMI ST79:2017, УКП, содержащие биологические индикаторы, должны использоваться для рутинного мониторинга циклов паровой стерилизации по крайней мере еженедельно, предпочтительно ежедневно, и в каждой загрузке, содержащей имплантаты. Сотрудники, проводящие стерилизацию должны следовать указаниям производителя для надлежащего размещения в стерилизаторе УКП, содержащего БИ.

 

Помимо рутинного контроля стерилизатора, УКП, содержащие БИ, также используются для других задач, перечисленных ниже:

  • Регулярный мониторинг загрузки изделий, не относящихся к имплантатам
  • Рутинный мониторинг загрузок с имплантатами. AAMI ST79: 2017 рекомендует использовать УКП, содержащее БИ и интегрирующий индикатор 5 типа. Персонал, проводящий стерилизацию, также может использовать УКП, содержащий БИ и химический индикатор 6 типа. В любом случае загрузки, содержащие имплантаты, должны быть помещены на карантин до тех пор, пока не будут известны результаты инкубации БИ, за исключением случаев чрезвычайной ситуации
  • Квалификация стерилизаторов после установки, перемещения, капитального ремонта, неисправности и сбоев процесса стерилизации
  • Периодические проверки качества продукции

 

Биологические индикаторы для стерилизации плазмой перекиси водорода

Биологические индикаторы также используются для мониторинга процессов стерилизации плазмой перекиси водорода. Плазменные стерилизаторы часто включают несколько циклов, предназначенных для эффективной стерилизации широкого спектра хирургических инструментов и устройств, и биологический индикатор для плазменной стерилизации должен быть использованы в каждом из таких циклов. Биологические индикаторы для контроля стерилизации перекисью водорода включают автономные биологические индикаторы, тестовые пакеты или испытательные пакеты. AAMI ST58: 2013 рекомендует использовать УКП с БИ ежедневно, желательно каждый цикл, для контроля стерилизаторов и в каждой загрузке, содержащей имплантаты.

 

Типы биологических индикаторов для процессов стерилизации

Существуют различные типы биологических индикаторов в зависимости от потребностей и процесса стерилизации. Наиболее распространенным типом являются автономные биологические индикаторы (АБИ). Эти индикаторы объединяют материал-носитель со спорами и питательной средой в один флакон, устраняя необходимость асептического переноса. После стерилизации флакон активируется, позволяя спорам смешаться с питательной средой, и инкубируется, чтобы обеспечить рост спор. Некоторые конструкции АБИ используют систему обнаружения на основе ферментов, которая может определять ферментативную активность быстрее, с более коротким временем инкубации.

Независимо от конструкции, биологические индикаторы используются во время процессов паровой, плазменной или этиленоксидной стерилизации для гарантии эффективности и летальности процесса.

 

Где купить биологические индикаторы?

Медицинские учреждения и производители должны приобретать БИ в надежном и доступном источнике для легкого повторного заказа. Биологические индикаторы можно приобрести у компаний, предлагающих материалы для стерилизации и профилактики инфекций. Факторы, которые могут учитываться при принятии решения о приобретении биологических индикаторов, включают: время инкубации, фирменное наименование, стоимость, ассортимент и разнообразие продуктов, валидируемые области применения и простоту использования.

Рекомендуется использовать ISO 11138-7: 2019 для получения дополнительной информации о выборе поставщика.

 

* – ANSI / AAMI ST79: 2017 Комплексное руководство по стерилизации паром и обеспечению стерильности в медицинских учреждениях. Ассоциация по продвижению медицинского приборостроения; 2017.

Стерилизации контроль. — это… Что такое Стерилизации контроль.?

Стерилизации контроль.
Стерилизации контроль.

Эффективность С. контролируется механическими, хим. и биол. методами. Механический контроль состоит в визуальном и инструментальном контроле за всеми параметрами стерилизации. Измерительная аппаратура, в свою очередь, должна периодически контролироваться в государственном метрологическом учреждении. Хим. контроль проводят с помощью хим. индикаторов, изменяющих цвет или плавящихся при достижении определенного уровня температуры, влажности, концентрации стерилизующего агента. Наружные индикаторы в виде стерилизационной ленты (окрашенной или нет) наносят на упаковку простерилизованного предмета, они указывают на то, что предмет прошел стерилизацию, внутренние хим. индикаторы свидетельствуют о том, были ли стерилизуемые объекты подвергнуты действию одного или нескольких условий стерилизации, но не о стерильности объекта. Показатели внутренних хим. индикаторов снимаются после окончания стерилизации. Биол. контроль прямо указывает, произошло уничтожение микробов в процессе стерилизации или нет, т. е. стерильный или нестерильный объект. Для паровой стерилизации в качестве биол. индикатора (БИ) используют споры В. stearotbermophilus(100 тыс.- 1 млн), для стерилизации этиленоксидом -В.subtilis в таком же количестве. Менее стандартные результаты дает «споровая почва». Упаковки для размещения Б И должны быть сконструированы таким образом, чтобы их обработка была более затруднена по сравнению с др. предметами для стерилизации, а количество и устойчивость Б И превышала аналогичные показатели микроорганизмов, находящихся в стерилизуемых объектах. Все это вместе взятое повышает коэффициент безопасности стерилизации. После стерилизации БИ извлекают из упаковки и проверяют споры на выживаемость с помощью микробиол. техники или по изменению цвета специальной упаковки. Контроль хим. стерилизации, а также стерильности различных материалов проводят посевом в сахарный бульон Хоттингера, тиогликолевую среду и в бульон Сабуро кусочков стерилизуемых материалов или смывов с предметов; мелкие предметы выборочно погружают в среды; пробирки, матрацы заполняют средами. Отсутствие роста в ходе 14-дневной инкубации при 37°С в сахарном бульоне и тиогликолевой среде и при 20 — 22°С бульона Сабуро свидетельствует о стерильности материала; появление роста хотя бы в одной из сред — нестерильности всей партии. Материалы, подвергнутые хим. стерилизации, перед посевом несколько раз отмывают стерильной водой от стерилизанта или засевают на среды с его нейтрализатором.

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

.

  • Стеригмы
  • Стерилизация газовая.

Смотреть что такое «Стерилизации контроль.» в других словарях:

  • контроль стерилизации — Определение эффективности стерилизации, осуществляемое бактериологическим контролем стерилизации, и определение параметров стерилизации, осуществляемое физическим или химическим контролем стерилизации. [ГОСТ 25375 82] Тематики стерилизация и… …   Справочник технического переводчика

  • контроль стерильности — Определение наличия микроорганизмов, способных к размножению, на изделиях, подвергнутых стерилизации. [ГОСТ 25375 82] Тематики стерилизация и дезинфекция …   Справочник технического переводчика

  • контроль рождаемости — Политика ограничения численности населения экономическими средствами, а также путем контрацепции и стерилизации …   Словарь по географии

  • Контроль Рождаемости (Birth Control) — применение контрацепции или стерилизации (мужской или женской) для предотвращения нежелательных беременностей. Источник: Медицинский словарь …   Медицинские термины

  • КОНТРОЛЬ РОЖДАЕМОСТИ — (birth control) применение контрацепции или стерилизации (мужской или женской) для предотвращения нежелательных беременностей …   Толковый словарь по медицине

  • бактериологический контроль стерилизации — Контроль стерилизации, осуществляемый биотестом стерилизации. [ГОСТ 25375 82] Тематики стерилизация и дезинфекция …   Справочник технического переводчика

  • Программа стерилизации животных — Программа стерилизации  метод регулирования численности уличных и диких животных, направлена на снижение их численности. Проблема уличных животных существует во многих крупных городах мира в той или иной степени в зависимости от… …   Википедия

  • химический контроль стерилизации (дезинфекции) — Контроль параметров стерилизации (дезинфекции), проводимый с помощью химических тестов стерилизации (дезинфекции) или путем определения количества стерилизующего (дезинфицирующего) агента. [ГОСТ 25375 82] Тематики стерилизация и дезинфекция …   Справочник технического переводчика

  • термический контроль стерилизации (дезинфекции) — Физический контроль стерилизации (дезинфекции), проводимый с помощью средств измерения температуры. [ГОСТ 25375 82] Тематики стерилизация и дезинфекция …   Справочник технического переводчика

  • физический контроль стерилизации (дезинфекции) — Контроль параметров стерилизации (дезинфекции), проводимый с помощью соответствующих средств измерения. [ГОСТ 25375 82] Тематики стерилизация и дезинфекция …   Справочник технического переводчика

Контроль качества и эффективности дезинфекции и стерилизации

Для профилактики инфекционных заболеваний в помещениях осуществляют контроль качества дезинфекции. Мероприятия по дезинфекции проводятся визуальными, химическими и бактериологическим методами. Нередко этими методами пользуются одновременно.

Метод визуального контроля определяет своевременность дезинфекции, имеющиеся основания, спектр мероприятий и объем работ по стерилизации предметов, объектов и помещений.

Химический контроль дезинфекции и стерилизации выбирают, когда нужно определить содержание веществ и соответствие инструкции. В данном методе важно установить, когда и кем был приготовлен раствор, определяют качество стерилизации поверхностей эпидемиологически опасных предметов – посуды, мебели, помещения, бытовых предметов, которые следует увлажнить во время уборки хлорсодержащими растворами.

Бактериологический контроль качества стерилизации и дезинфекции предполагает снятие проб с бытовых предметов, предметов одежды, постельного белья, мебели и поверхностей. Данный метод специалистами осуществляется без предупреждения рабочего персонала. Его цель — контроль эффективности дезинфекции и всех мероприятий, проводимых в дошкольных, школьных, медицинских и общесвтенных учреждениях.

Контроль качества дезинфекции осуществляется комиссией специалистов санитарно-эпидемиологической станции в установленные сроки, либо без предупреждения. Цель таких мероприятий – свести к минимуму и предотвратить возникновение очагов опасных инфекционных заболеваний среди населения. Эти мероприятия проводятся в три этапа:

1. проверка уровня чистоты поверхностей, увлажненность и защита приборов;
2. смотр режима стерилизации включает в себя учет температуры раствора, равномерности увлажнения поверхностей, качество распыления средства, его концентрацию и специфику и проводится с привлечением специалистов;
3. данный этап предполагает проверку качества дезинфекции со вниманием на специфику производства, определенных особенностей и остановки предприятия, где осуществляется контроль.

Опыт проведения контроля качества стерилизации и дезинфекции показывает, что такие мероприятия позволяют избежать и предотвратить непоправимые ситуации, которые могут угрожать жизни и здоровью населения. Поэтому они являются обязательными для поликлиник, предприятий общепита и детских учреждений.

Эффективность методов стерилизации и их влияние на электрохимическое поведение простой углеродистой стали

Минимизация загрязнения контрольных обработок в исследованиях микробиологической коррозии (MIC) имеет решающее значение. Процедуры стерилизации металла не должны изменять поверхность или влиять на внутреннюю восприимчивость металла к коррозии, в то же время адекватно дезактивируя биологическую активность. Однако в литературе нет единого мнения относительно таких процедур, отчасти из-за отсутствия общепринятой методологии.В этом исследовании оцениваются различные методы стерилизации углеродистой стали с точки зрения практичности, эффективности и влияния на электрохимический отклик металла. Были оценены три процедуры стерилизации с использованием i) сухого тепла, ii) этанола или iii) глутаральдегида в качестве стерилизующих агентов. Несмотря на то, что все подходы к стерилизации были одинаково эффективны в удалении микроорганизмов и спор с поверхности металла, сухой нагрев при 170 ° C в инертной атмосфере был определен как наиболее удобный метод стерилизации с точки зрения практичности и стабильности электрохимической реакции металла.Стерилизация углеродистой стали в 75 об.% Этанола и глутарового альдегида, а также в спирте с последующим пламенем не рекомендуется из-за большого разброса реакции коррозии, вызванного воздействием стерилизационной среды.

Исследования коррозии, вызванной микробиологическим воздействием (MIC), посвящены роли микроорганизмов в электрохимических процессах, ведущих к коррозии. 1–3 Поскольку бактерии и грибки взаимодействуют с поверхностью металла и окружающей средой, они могут «инициировать, облегчить или ускорить реакцию коррозии, не изменяя ее электрохимическую природу.» 4 Повсеместная природа некоторых микроорганизмов может стать проблемой для исследований МПК, где заражение видами с различными метаболическими способностями может изменить результат экспериментов. Таким образом, минимизация заражения чужеродными микроорганизмами для поддержания микробного сообщества, которое должным образом отражает желаемый микробный состав (т.е. это образец окружающей среды или конкретно определенное сообщество) имеет решающее значение для исследования МПК.

Большинство компонентов, используемых в исследовании MIC (т.е. стеклянная посуда, реакторы или электрохимические ячейки и растворы) можно стерилизовать в соответствии со стандартными процедурами стерилизации 5 , используемыми микробиологами; однако в литературе нет единого мнения относительно процедур стерилизации металлических образцов. В идеальной ситуации метод стерилизации должен уничтожать все микроорганизмы и споры на металле, но не должен изменять его поверхность или влиять на внутреннюю восприимчивость металла к коррозии.

В обзоре литературы, посвященном более чем 200 статьям, посвященным MIC углеродистых и низколегированных сталей, было выявлено более 20 различных процедур стерилизации металлических образцов, Таблица I.Некоторые из методов, описанных в литературе, варьируются от автоклавирования стальных заглушек внутри водонепроницаемых контейнеров, погружения заглушек в 70 об.% Этилового спирта и их сжигания перед инокуляцией, 6 до погружения в раствор хлора с концентрацией 2000 ч. / Млн (т. Е. Примерно в 4000 раз больше уровень остаточного хлора, необходимый для обработки природной морской воды) 7–9 в течение 30 минут с последующей обработкой глутаральдегидом в течение ночи. 10 Другие использовали тонкодисперсные суспензии Mg (OH) 2 и ацетон высокой чистоты; 11 погружение на ночь в 70 об.% Этанола с последующей асептической сушкой на воздухе; 12 Термическая обработка в течение 9 часов при 130 ° C в стеклянных стаканах, покрытых алюминиевой фольгой; 13 или использование ультрафиолета. 14

Таблица I. Краткое изложение методологий стерилизации в исследованиях MIC для простых углеродистых сталей. Методы описаны в том виде, в каком они появляются в литературе. Было изучено более 200 работ, посвященных МПК углеродистых сталей. В этот список входят только документы, описывающие процедуры стерилизации достаточно подробно, чтобы их можно было воспроизвести в других лабораториях.

Купон из углеродистой стали

Авторы (год) Сплав Процедуры стерилизации / подготовки металла (после полировки, если применимо)
Бук и Гайлард (1991) 6 BS970 (MS-II), SAE1020 (MS-I), BS316 (SS-II), AISI304L (SS-I) Заготовки автоклавированы в водонепроницаемых контейнерах; Перед воздействием бактериальных культур стали погружали в спирт 70 об.%, прокаливали, помещали в стерильные универсальные флаконы и давали остыть.
Кастаньеда и Бенеттон (2008) 21 SAE-1018 (UNS G10180). Купоны стерилизовали в 70 об.% Растворе этанола в течение 30 мин и выдерживали в стерильном ламинарном потоке воздуха перед погружением в электрохимические ячейки до использования.
de França и другие (1996) 68 Нержавеющая сталь AISI 304 (UNS S30400). Купоны, помещенные в полевые условия, не стерилизовались; однако для проверки прямого воздействия морской воды металлические купоны помещали в колбы, содержащие 100 мл морской воды, и стерилизовали при 120 ° C в течение 20 минут.
Дорси и другие (2005) 10 Зонды датчиков с многоэлектродной матрицей и контрольные купоны UNS G10180 в контуре потока Проточная петля была «стерилизована» циркуляцией раствора хлора с концентрацией 2000 ч. / Млн в течение 30 минут с последующей обработкой неокисляющим биоцидом (глутаральдегидом) в течение ночи. После стерилизации в воду также добавляли небольшое количество глутаральдегида, чтобы обеспечить дополнительную защиту от загрязнения в течение первых дней тестирования.
Eckert и другие (2006) 69 Купоны изготовлены из трубной стали класса API 5L X42 Купоны очищали ультразвуком в абсолютном этаноле и, наконец, промывали ацетоном. После очистки купоны были упакованы в индивидуальные полиэтиленовые пакеты в среде сухого азота для предотвращения контакта с влагой. Купоны не подвергались воздействию воздуха непосредственно перед установкой в ​​тестовую систему.
Edyvean и другие (1992) 70 Нержавеющая сталь AISI 316 (UNS S31600) как часть модифицированных устройств Роббинса (MRD) MRD были стерилизованы путем заполнения их 2.5 об.% Хлорноватистой кислоты (технический отбеливатель) и выдерживают 2 часа; затем их промывали стерильной деионизированной водой.
Гонсалес-Родригес и другие (2008) 22 Купоны на низкоуглеродистую сталь AISI 1018 (UNS G10180) Очищенные купоны стерилизовали этанолом перед воздействием экспериментальной среды
ГУ и др. (1998) 23 Купон из нержавеющей стали AISI 316 (UNS S31600) в составе ячеек EIS Внутренняя и внешняя поверхности ячеек EIS стерилизовали 70 об.% Этанолом и сушили при комнатной температуре в стерильном вытяжном шкафу с ламинарным потоком.
Li и другие (2001) 24 SAE 1018 (UNS G10180) Купоны были обезжирены спиртом, а затем промыты стерилизованной деионизированной водой. Электроды стерилизовали 70 об.% Спирта в течение 2 часов, а затем хранили на чистом столе до использования.
Лугаускас и др. (2009) 11 Сталь низкоуглеродистая, состав (мас.%): 0,05–0,12 С, 0,003–0,10 Cu, <0,07 P Купоны обрабатывали тонкой суспензией Mg (OH) 2 и ацетоном высокой чистоты для минимизации начального загрязнения поверхности питательными веществами из окружающей среды.
Миянага и другие (2007) 14 Состав купонов углеродистой стали (мас.%): 99,71 Fe, 0,03 C, 0,01 Si, 0,19 Mn, 0,013 P, 0,0017 N, 0,026 Al Поверхность купона дезинфицировали трансиллюминатором в течение 5 мин.
Пэн и Парк (1994) 71 Состав купонов стали (мас.%): Si 0,01, P 0,01, Mn 0,19, S 0,01, Fe 99,78 Купоны обезжиривали 100 об.% Этанолом, промывали ацетоном и дистиллированной водой, сушили с помощью воздуходувки N 2 и хранили в эксикаторе перед использованием; Для инактивации микроорганизмов в незасеваемый раствор добавляли глутаральдегид.
Роден и др. (2000) 72 Низкоуглеродистая сталь Чистые купоны помещали в пробирки, которые стерилизовали при 170 ° C в течение 3 часов.
Ройер и Унц (2002) 73 Музыкальная пружинная стальная проволока (диаметр 0,216 мм, ASTM A228 / A228M) Проволоки погружали в ванны с ацетоном и 1,5 н. HCl на 15 мин. Очищенные проволоки пропускали через пробки из бутилкаучука, а выступающие области с обеих сторон покрывали антикоррозийным лаком.Затем систему пробка / проволока прикрепляли к бутылям с сывороткой со стерильной средой и продували N 2 .
Stadler и другие (2008) 13 Чистое железо (Armco), углеродистая сталь ST37, нержавеющая сталь AISI 304 (UNS S30400) Купоны в тефлоновых держателях поместили в стеклянный стакан, накрыли алюминиевой фольгой и стерилизовали термической обработкой в ​​течение 9 часов при 130 ° C. Дальнейшая работа, требующая стерильных условий, выполнялась на чистом столе.
Незнакомец-Йоханнесен (1987) 74 Листы стальные окрашенные Планшеты стерилизовали погружением в 0.1 об.% Перекиси водорода перед инокуляцией
Танджи и другие (2002) 75 Состав купонов из углеродистой стали (мас.%) 99,71 Fe, 0,03 C, 0,19 Mn, 0,017 S, 0,013 P и 0,01 Si, закрепленных в эпоксидной смоле Перед прикреплением к эпоксидной смоле полированные купоны очищали ультразвуком в ацетоне в течение 15 минут, сушили на воздухе и хранили в эксикаторе.
Валенсия-Кантеро и другие (2003) 76 Высокоуглеродистая сталь (1 мас.% C) и обычная углеродистая сталь (0.015–0,020 мас.% C) Купоны из высокоуглеродистой стали очищали путем замачивания в ацетоне в течение 30 минут, а затем чистили зубной щеткой, используя модификацию метода Haruta et al. (1991). Купоны из углеродистой стали очищали с использованием небольшой модификации метода Bryant et al. (1991), подвергали обработке ультразвуком в лимонной кислоте (5 мас. / Об.%) В течение 5 мин, а затем промывали в дистиллированной воде в течение 1 мин. Купоны обжигали и взвешивали, затем помещали в закрытые культуральные пробирки, содержащие богатую солью культуральную среду V9.
Вен и др. (2006) 77 Цилиндрический купон C1018 (UNS G10180), используемый в качестве рабочего электрода в биореакторе Биореактор автоклавировали перед каждым запуском.
Юань и Пехконен (2007) 12 Нержавеющая сталь AISI 304 (UNS S30400) Купоны промывали трижды деионизированной водой с последующим обезжириванием ацетоном, затем стерилизовали погружением в 70 об.% Этанола на 8 часов и сушили в асептических условиях на воздухе.Вновь приготовленные образцы немедленно подвергали воздействию тестовой среды.

Важно отметить, что методы, перечисленные в Таблице I, примерно соответствуют тому же количеству статей, явно описывающих процедуры стерилизации в разделе «Методология» рукописи. Действительно, большинство рассмотренных документов не описывают процедуры стерилизации достаточно подробно, чтобы их можно было воспроизвести в других лабораториях. Вероятно, что увеличение количества исследованных статей приведет к увеличению этих показателей.Более того, до настоящего времени не проводилось систематических исследований воздействия метода стерилизации на поверхность металла и соответствующей реакции на коррозию.

Основная цель этой работы состояла в том, чтобы определить наиболее удобный метод стерилизации простой углеродистой стали с точки зрения практичности в типичных лабораторных условиях, эффективности и влияния таких процедур на электрохимический отклик металла. Учитывая, что электрохимический и коррозионный отклик в данной среде зависит от состояния поверхности образца, электрохимический отклик изучали с использованием одной и той же среды до и после стерилизации.Следовательно, различия могут быть напрямую связаны с изменениями состояния поверхности, вызванными стерилизационной обработкой.

Подготовка металлических образцов

Электрохимические испытания были проведены на цилиндрических образцах из гладкой низкоуглеродистой стали UNS G10180 (AISI 1018) в холоднокатаном и отожженном состоянии с приблизительной площадью 5 см 2 . Перед стерилизацией образцы подвергали мокрой шлифовке до зернистости 600 с использованием бумаги SiC, очищали ультразвуком в этиловом спирте с крепостью 200, промывали ацетоном и деионизированной водой и, наконец, сушили с использованием сжатого аргона.Образцы временно хранили в эксикаторе и использовали в течение 24 часов.

Купоны, использованные для определения эффективности процедур стерилизации, были приготовлены в соответствии с теми же шагами; однако для этой задачи использовались плоские стальные купоны UNS G10100 (AISI 1010) с приблизительной открытой площадью 7 см. 2 . Существуют минимальные различия в содержании углерода и микроструктуре между UNS G10100 и UNS G10180 (Таблица II), незначительные для целей настоящего исследования. 15,16

Таблица II. Номинальный состав сплава (мас.%).

UNS AISI S
обозначение обозначение С млн (макс.) (макс)
G10100 1010 0,08 — 0,13 0,30 — 0,60 0,040 0.050
G10180 1018 0,15 — 0,20 0,60 — 0,90 0,040 0,050

Методы стерилизации

Методы стерилизации, использованные в этом исследовании, обобщены в Таблице III. Эти методы были выбраны из-за (а) их широкого использования в микробиологических лабораториях и / или медицинских учреждениях, (б) их практичности или удобства для применения в стандартных лабораторных условиях, включая возможность относительно длительного хранения стерилизованных купонов ( я.е. более 24 часов) вместо немедленного использования, (c) их a priori эффективность и (d) их потенциальные вредные эффекты — или их отсутствие — на металлы. Например, паровая стерилизация (то есть в автоклаве) не была выбрана из-за известного разрушающего воздействия влажного тепла на углеродистую сталь, 17 , а также из-за того, что изоляция купона на герметичном контейнере перед автоклавированием может снизить эффективность метода за счет ограничения подачи пара. -контакт с микроорганизмами, который необходим для оптимальной стерилизации в автоклаве. 18 Аналогичным образом по аналогичным причинам избегали использования окислителей, таких как соединения хлора (например, растворы гипохлорита натрия) или растворы пероксида водорода. 7,9

Таблица III. Методы стерилизации.

Сухое тепло Герметичный контейнер, воздух
Герметичный контейнер, аргон
Этиловый спирт 75 об.% Быстрое погружение с последующим пламенем
Ночное погружение, 15 часов
Ночное погружение, 18 часов
Глутаральдегид 2 об.% Ночное погружение, 15 часов

Как показано в таблице III, один из выбранных методов включал использование сухого тепла (т.е.е. сушильная печь). Несмотря на то, что основными недостатками сухого тепла для стерилизации являются медленное проникновение тепла и скорость уничтожения микробов, это надежный метод стерилизации, обычно используемый в медицинских учреждениях. 19,20 Наиболее часто используемые зависимости времени от температуры: 170 ° C в течение 60 минут, 160 ° C в течение 120 минут и 150 ° C в течение 150 минут; Время разогрева и охлаждения следует прибавить к общему времени. 20 Для этого исследования образцы обрабатывали при 170 ° C в течение 3 часов (т.е.е. включая время нагрева и охлаждения) в зависимости от температурного профиля духового шкафа. Хотя газовый состав атмосферы, в которой экспонируется образец, не влияет на убивающую эффективность метода, 20 он может повлиять на свойства поверхности образца при нагревании, возможно, влияя на коррозионную реакцию образца. Более того, само тепло может способствовать образованию поверхностных оксидов. Поэтому образцы для электрохимических испытаний нагревали в сухом виде в двух различных атмосферных условиях: i) фильтрованный воздух и ii) инертная атмосфера аргона.

Для проведения стерилизации сухим жаром 100 мл термостойкие стеклянные колбы, содержащие полированные чистые купоны, промывали в течение примерно одного часа. Промывка проводилась через отверстие в термостойкой резьбовой крышке колб, которая имела перегородки из политетрафторэтилена и силикона, которые были термостойкими до 180 ° C. Температурный профиль печи был установлен перед стерилизацией. Температурный профиль был получен с использованием термопар, помещенных внутри колб, расположенных в центре пробирки.Во время стерилизации сухим жаром образцы располагались на плато печи. После стерилизации колбы оставались закрытыми до тестирования.

Другой метод стерилизации заключался в использовании раствора этилового спирта в воде в качестве химического дезинфицирующего средства. В медицинских учреждениях растворы этилового спирта в воде (60–90 об.%) Обладают быстрым бактерицидным, туберкулоцидным, фунгицидным и вирулицидным действием. 19 Было обнаружено, что водные растворы более эффективны для денатурирования белков, чем этиловый спирт с концентрацией 200, хотя они могут не обладать спороцидным действием и не могут проникать в богатые белками материалы. 19 Следуя методологиям, описанным в литературе, например, 6,12,21–24 и личному общению с другими исследователями MIC в Университете Акрона, было выбрано 25 три времени воздействия. Первые два заключались в погружении истертых чистых купонов в 75 об.% Раствор этанола на 15 или 18 часов, пытаясь воспроизвести то, что в литературе называется выдержкой «в течение ночи». Более короткое время погружения приводило к проблемам с загрязнением в прошлых экспериментах с MIC. 25 Третий метод, т.е. погружение в 75% -ный раствор этилового спирта с последующим обжигом, представляет собой традиционный метод стерилизации металлического оборудования, такого как петли и пинцеты, в микробиологических лабораториях. В обоих случаях после длительного или быстрого погружения купоны необходимо было немедленно использовать для электрохимических испытаний.

Третий и последний метод стерилизации заключался в использовании раствора глутаральдегида. По словам Рутала и других, 19 активированных водных растворов глутарового альдегида (т.е. щелочные растворы) получили признание в качестве дезинфицирующего и химического стерилизующего средства в медицинских учреждениях из-за их микробицидных свойств и некоррозионного действия на оборудование. Обычно 2 об.% Растворы глутаральдегида, забуференные до pH 7,5–8,0, эффективны для уничтожения микроорганизмов; однако требуется длительное время выдержки. 19 Кроме того, рекомендуются особые меры безопасности из-за известных опасностей для здоровья, связанных с воздействием глутарового альдегида. 19 Таким образом, для этого метода купоны погружали в 2 об.% Водный раствор глутарового альдегида (пентан-1,5-диал), pH 8.0, в течение 15 часов. После погружения купоны нужно было сразу использовать для электрохимических испытаний. Как и в случае с этиловым спиртом, время воздействия было выбрано так, чтобы повторить воздействие «в течение ночи». 10

Эффективность методов стерилизации

Эффективность всех процедур стерилизации определялась на основании способности культивировать микроорганизмы после обработки купонов следующим образом. В прямом методе стерилизованные образцы инкубировали в течение 3-5 дней в кислородных условиях при комнатной температуре в стерильной богатой среде (Luria-Bertani, далее LB, бульон, содержащий -на литр-5.0 г дрожжевого экстракта (YE), 10,0 г триптона и 10,0 г NaCl, pH 7,4), которые стерилизовали отдельными партиями автоклавированием. 19 Перенос купона на стерилизованную среду проводили в стерильных условиях. Контроли включали колбы, содержащие (i) стерилизованную среду и без купонов (контроль 1) и (ii) стерилизованную среду и нестерилизованные купоны (контроль 2). Стеклянную посуду, а также все другие инструменты перед использованием стерилизовали автоклавированием и погружением в этанол с последующим обжигом непосредственно перед использованием. 19

После инкубации рост микробов определяли с использованием двух независимых методов: i) спектрофотометрии и ii) флуоресцентной микроскопии. Для спектрофотометрии оптическую плотность определяли при длине волны 600 нм для всех стерилизационных обработок и контролей. Кроме того, проходящий свет использовали в сочетании с окрашиванием DAPI (4 , 6-диамидино-2-фенилиндол) на инкубированных средах после каждой обработки и контролей для наблюдения за клетками под флуоресцентным микроскопом.Это синее флуоресцентное пятно (максимум возбуждения при 358 нм и максимум испускания при 461 нм), широко используемое в флуоресцентной микроскопии, специфично окрашивает ДНК. 26 Более подробную информацию об этих двух методологиях можно найти в другом месте. 27

Для второго независимого подтверждения эффективности стерилизации был использован метод непрямой обратной стерилизации. Преднамеренно загрязненные чистые, еще не отполированные купоны стерилизовали теми же методами, которые описаны выше.Перед стерилизацией купоны погружали в культуру Escherichia coli ATCC25404, выращенную в течение ночи в аэробных условиях в бульоне LB. После стерилизации купоны инкубировали и тестировали на рост бактерий в соответствии с процедурой прямого метода. Для этого подхода контроли включали колбы, содержащие (i) стерилизованную среду и без купонов (контроль 3) и (ii) стерилизованную среду и намеренно загрязненные купоны (контроль 4).

Электрохимические методы

Растворы для электрохимических испытаний

Синтетическая среда, используемая для проверки коррозионной реакции металла после процедур стерилизации, имела химический состав, аналогичный растворам, используемым для роста обычных бактерий обрастания, 28 , за исключением того, что нет Были включены исходники C.YE не добавляли к электролитам, используемым в электрохимических испытаниях, поскольку было показано, что YE влияет на измерения коррозии. 29 Состав раствора (на литр): 3,0 г NaNO 3 , 0,7 г KH 2 PO 4 , 0,3 г MgSO 4 . 7H 2 0, 0,01 г CaCl 2 .2H 2 O, 0,02 г FeSO 4 .7H 2 0, 0,5 г NaCl, 0,01 г MnCl 2 .4H 2 O и 2 мл следов элементное решение.Состав раствора микроэлементов был (на литр): 0,75 г MnSO 4 .H 2 O, 0,75 г ZnSO 4 .7H 2 0, 0,15 H 3 BO 3 , 0,08 г FeCl 3 .6H 2 O, 0,08 г CoCl 2 .6H 2 O, 0,075 CuSO 4 .5H 2 O и 0,05 г Na 2 MoO 4 .2H 2 O. Во время тестирования pH раствора оставался в пределах 4,50–4,70.

Отдельный набор образцов был протестирован в 0.1 M NaCl pH 4,50 для сравнения коррозионной активности синтетической среды и электролита, обычно используемого при исследованиях коррозии.

Электрохимические испытания

Электрохимические измерения проводились с использованием стандартной трехэлектродной матрицы. Платиновая сетка использовалась в качестве противоэлектрода, а насыщенный каломельный электрод (SCE) использовался в качестве электрода сравнения. Электрод сравнения был подключен к раствору через капилляр Луггина диаметром 1 мм, расположенный на расстоянии 2–3 мм от образца.Все тесты проводились с использованием обычного потенциостата. Для каждого метода стерилизации использовали минимум четыре образца, а четыре дополнительных купона использовали в качестве нестерилизованных контролей (контроль 5). Косвенная оценка изменений состояния поверхности, вызванных каждой стерилизационной обработкой, была получена путем сравнения реакции коррозии между стерилизованными и нестерилизованными образцами.

Электрохимические испытания включали:

Испытания потенциодинамической поляризации — наклоны Тафеля

Испытания потенциодинамической поляризации были выполнены для определения значений наклона Тафеля, необходимых для скорости коррозии (C.Р.) расчеты. 30–34 Испытания проводились после достижения стабильного, т. Е. ± 10 мВ, потенциала холостого хода (E OC ), которое обычно возникало после 1 часа воздействия, при скорости сканирования 0,167 мВ / с. Потенциал сканировали от -200 мВ до +200 мВ относительно E OC .

Измерения потенциодинамического поляризационного сопротивления

Измерения потенциодинамического поляризационного сопротивления были выполнены в соответствии со спецификацией ASTM f G59 со следующими модификациями. 35 Испытания проводились после стабилизации потенциала свободной коррозии, что обычно длилось 60 минут. Измерения потенциодинамического поляризационного сопротивления проводились при скорости сканирования 0,167 мВ / с. 36 В этом отношении рекомендованная стандартом скорость сканирования 0,167 мВ / с была достаточно низкой, чтобы минимизировать гистерезис, 37,38 и намного ниже максимальной скорости сканирования, предложенной Мансфельдом, Кендигом и Таунли. 36,39 Диапазон потенциалов +/- 25 мВ по сравнению сЕ ОС . Значения поляризационного сопротивления (R P ) были получены как наклон графика зависимости потенциала от плотности тока при i = 0. Затем значения 35,39,40 R P были использованы для расчета скорости коррозии с помощью прибора Штерна. -Уравнение Гири. 35,40 Тафелевые уклоны использовались в качестве исходных данных для этого расчета; более подробная информация об этих расчетах представлена ​​в разделе «Результаты». 39–41

Неэлектрохимические методы

Датчики электрического сопротивления (ER)

Прибор ER был использован для оценки скорости коррозии углеродистой стали в растворах этанола и глутаральдегида.Исследования проводились с использованием зонда из углеродистой стали UNS G10100 (AISI 1010) с геометрией проволочная петля. Зонды экспонировались 20 дней. Ожидаемое время отклика, то есть минимальное время, в течение которого происходит надежное, измеримое изменение, зонда составляло от 2 до 6 дней, в зависимости от ожидаемой скорости коррозии. 42,43 Изменения электрического сопротивления были пересчитаны в значения скорости коррозии с использованием рекомендаций производителя.

Измерение изменения массы во время изотермической термообработки

Изотермическая термообработка была проведена для определения кинетики окисления материала.Использовались прямоугольные образцы из углеродистой стали UNS G10100 (AISI 1010) с приблизительной площадью 8 см 2 . Были оценены пять различных температур: 180, 300, 400, 500 и 600 ° C. Все тесты проводились в двух экземплярах. Образцы помещали в печь при комнатной температуре. Затем печь нагревали до желаемой температуры и поддерживали ее в течение 2 часов. После этого печь выключали, и образцы оставляли охлаждаться в печи. Образцы взвешивали на аналитических весах с точностью до 0.1 мг для определения потери или набора веса из-за различных термических обработок.

Воспроизводимость и статистический анализ

Тесты для оценки эффективности различных методов стерилизации были проведены в трех экземплярах (прямой подход) и в двух экземплярах (непрямой подход).

Все электрохимические измерения повторяли как минимум в четырех повторностях. Дополнительное испытание было проведено, когда наблюдался большой разброс значений скорости коррозии (например, этанол).

Учитывая, что измерения потенциодинамического поляризационного сопротивления могут либо недооценивать, либо переоценивать поляризационное сопротивление в зависимости от направления поляризации, 44–46 каждое измерение потенциодинамического поляризационного сопротивления повторялось 6 раз для каждого образца, 3 раза в прямом направлении и 3 раза. в обратном направлении, проверяя минимальный гистерезис между сканированиями.Для каждого образца указанные значения R P представляют собой среднее значение этих 6 измерений. Термические обработки для определения кинетики окисления простой углеродистой стали проводили в двух экземплярах.

Диапазон использовался для оценки вариабельности результатов, учитывая, что количество повторяющихся независимых значений, n , было небольшим, т. Е. n <12. Диапазон, w , определяется как разница между максимальные и минимальные значения в наборе значений реплицируемых данных. 47 Как объяснено в ASTM G16, w не делает никаких предположений о распределении ошибок, учитывая его непараметрический характер. Поскольку во всех случаях n <12 и предполагая стандартное распределение, стандартное отклонение S было приблизительно равно: 47

Таблица IV суммирует все контрольные случаи, описанные в этом исследовании. Контроли 1–4 — это контрольные условия, используемые для оценки эффективности различных процедур стерилизации. Контроль 5 представляет собой контрольные условия для всех электрохимических испытаний.

Таблица IV. Сводка контрольных испытаний.

Контроль 1 Среда стерилизованная, без купонов; прямой подход к стерилизации.
Контроль 2 Нестерилизованные купоны; прямой подход к стерилизации.
Контроль 3 Среда стерилизованная, без купонов; подход к обратной стерилизации.
Контроль 4 Загрязненные купоны, без дальнейшей стерилизации; подход к обратной стерилизации.
Контроль 5 Как полированные купоны, использованные при электрохимических испытаниях; стерилизация не применяется. Синтетическая среда.

Результаты процедуры прямой стерилизации показаны на рисунке 1. На рисунке 1a показаны средние значения оптической плотности, измеренные при 600 нм для образцов, стерилизованных в соответствии с подходом прямой стерилизации, тогда как на рисунке 1b показаны эти значения для метода обратной стерилизации. В обоих случаях образцы были сгруппированы по методу стерилизации.

Приблизить

Уменьшить

Сбросить размер изображения

Рис. 1. Средние значения оптической плотности, измеренные при 600 нм для образцов, используемых в (а) для подтверждения эффективности прямой и (б) обратной стерилизации. Планки погрешностей соответствуют значениям стандартного отклонения. Отклонение меньше, чем символы для точек, не имеющих полос погрешностей. Стрелка указывает на лечение, при котором после инкубации наблюдался рост бактерий. Результаты сгруппированы по методу стерилизации.

На рис. 2 сравниваются диаграммы потенциодинамического поляризационного сопротивления, снятые в прямом направлении для основных процедур стерилизации с контролем (контроль 5). Среднее сопротивление поляризации шести последовательных измерений, трех в прямом направлении и трех в обратном направлении, также включено в каждый рисунок для сравнения.

Приблизить

Уменьшить

Сбросить размер изображения

Рисунок 2. Типичные кривые потенциодинамического поляризационного сопротивления UNS G10180 для основных процедур стерилизации, снятые в прямом направлении: (а) контрольная 5 — пунктирная линия — и сухой жар (Ar) и (б) этанол (18 ч), этанол (пламя) и глутаральдегид . Значения R P , показанные на рисунках, представляют собой среднее значение шести последовательных сканирований, трех в прямом направлении и трех в обратном направлении. Все тесты проводились в синтетической среде.

Значения сопротивления поляризации в Ом.см 2 были получены с использованием стандартного программного обеспечения для анализа коррозии, как:

, где ɛ — E-E OC в вольтах 46,48,49 .

На рис. 3 сравниваются кривые анодной и катодной поляризации для основных процедур стерилизации с контролем 5. Для каждого повтора наклоны Тафеля оценивались с использованием стандартного программного обеспечения для анализа коррозии. Наклоны анодного тафеля были определены на расстоянии не менее 50 мВ от E OC , что дало максимальную ошибку 2
примерно 7%. 50 Значения наклона анодного тафеля соответствовали значениям, полученным Stern и Weisert. 51 Поскольку катодные кривые во всех случаях находились под контролем массопереноса, рис. 3, катодные тафелевские наклоны были аппроксимированы как β c . Учитывая, что коэффициент Штерна-Гири, B:

В

преобладает меньший из двух тафелевых уклонов, B уменьшается до B = β a /2,303 при катодном контроле массопереноса. 40,52

Приблизить

Уменьшить

Сбросить размер изображения

Рисунок 3. Типичные графики анодной и катодной потенциодинамической поляризации UNS G10180 для основных процедур стерилизации: (a) контроль 5, сухой нагрев (Ar) и глутаральдегид и (b) контроль 5, этанол (18 часов) и этанол (пламя). Все тесты проводились в синтетической среде.

Плотность тока коррозии i Corr в мкА / см 2 впоследствии была определена как:

и преобразовать в скорости коррозии в мм / год с использованием: 53

, где EW — эквивалентный вес корродирующего вещества в граммах на эквивалент, а ρ — плотность сплава в г / см 3 .EW и ρ были приблизительно равны 27,97 г / экв и 7,87 г / см 3 , соответственно. 54

Сопротивление раствора, R S , измеряли на отдельном наборе образцов, подвергнутых воздействию синтетической питательной среды или 0,1 М NaCl, pH = 4,50, с использованием спектроскопии электрохимического импеданса (EIS). Результаты EIS показали, что среднее значение R S составило 8,4 ± 1,8 Ом. В наиболее консервативном случае, то есть при самом высоком R S и самом низком R P , R S составлял менее 3% от общего удельного сопротивления (R T ) со средним значением менее 1.5%. Таким образом, вклад R S в i corr не учитывался, т.е.R P >> R S .

Скорости коррозии для всех повторений каждого метода стерилизации, оцененные с помощью потенциодинамического поляризационного сопротивления, показаны на рисунке 4. Средние скорости коррозии, установившееся состояние E OC , E OC стандартное отклонение, анодный и катодный тафелевские наклоны, а также минимальные и максимальные значения, диапазон и стандартное отклонение показаны в таблице V.Для сравнения также включены скорости коррозии образцов UNS G10180 (AISI 1018) в 0,1 NaCl при pH 4,50 и контрольные значения скорости коррозии углеродистой стали в газированной свежей 55,56 и морской воде 57,58 . Во всех случаях результаты были сгруппированы по методу стерилизации.

Приблизить

Уменьшить

Сбросить размер изображения

Рис. 4. Значения скорости коррозии, определенные методом потенциодинамического поляризационного сопротивления.Результаты сгруппированы по методу стерилизации. Скорости коррозии в пресной воде 55,56 и морской воде 57,58 добавлены для справки. Короткие горизонтальные линии указывают среднюю скорость коррозии.

Таблица V. Измерения скорости коррозии, полученные методом потенциодинамического поляризационного сопротивления.

Лечение AVG OCP (V SCE , SCE) STD E OC (мВ SCE ) AVG Анодный тафелевый наклон, β a (В / декада) AVG Катодный тафелевский наклон, β c (В / декада) Среднее значение C.Р. (мм / г) Макс. C.R. (мм / год) Мин. C.R. (мм / год) C.R. Range, w (мм / год) C.R. STD, S (мм / год)
Контроль 5 -0,693 8,1 0,093 0,797 0,847 0,715 0,132 0,0660
Сухое тепло (Ar) -0,678 3,3 0,092 0.692 0,751 0,586 0,165 0,0825
Сухое тепло (воздух) -0,674 7,4 0,083 0,578 0,762 0,403 0,360 0,1800
75 об.% Этанола, 15 часов -0,687 10,7 0,107 0,644 0,822 0.495 0,327 0,1635
75 об.% Этанола, 18 часов -0,677 70,64 0,111 0,461 0,879 0,030 0,849 0,379
75 об.% Этанол, пламя -0,679 56,7 0,108 0,323 0,631 0,106 0.524 0,234
2 об.% Глутарового альдегида -0,664 4,4 0,099 0,449 0,593 0,208 0,385 0,1925
0,1 М NaCl pH 4,50 -0,548 13,6 0,057 0,234 0,284 0,136 0,148 0,074

Скорость коррозии UNS G10100 (AISI 1010) в 75 об.% Этанола и 2 об.% Глутарового альдегида, измеренная с помощью зонда ER с проволочной петлей, показана на рисунке 5.На рисунке 5 вертикальная пунктирная линия указывает время отклика датчика. Поскольку время отклика датчика ER зависит от ожидаемой скорости коррозии, 43 было рассчитано консервативное время отклика, предполагая, что средняя скорость коррозии составляет 0,05 мм / год. Точки данных, взятые ниже времени отклика зонда, обозначены пунктирными символами. Наконец, на рис. 6 показано изменение веса в зависимости от температуры.

Приблизить

Уменьшить

Сбросить размер изображения

Рисунок 5. Скорость коррозии UNS G10100 в 75 об.% Этанола или 2 об.% Глутарового альдегида, как указано. Измерения коррозии проводились с использованием серийного ER-зонда с проволочной петлей.

Приблизить

Уменьшить

Сбросить размер изображения

Рис. 6. Увеличение веса UNS G10100 при воздействии воздуха печи в зависимости от температуры.

Эффективность стерилизации

Все методы стерилизации дезактивировали микроорганизмы на поверхности металла.Растворы после обработок прямой стерилизацией не показали разницы в оптической плотности (ОП) по сравнению со стерилизованной средой, не содержащей купонов (контроль 1, рис. 1а). Кроме того, микроорганизмы не были обнаружены под микроскопом. Только растворы из нестерилизованных контролей (контроль 2, рис. 1а) показали повышенную оптическую плотность; Позже присутствие микроорганизмов было подтверждено визуально под микроскопом.

Тесты обратной стерилизации, в которых микроорганизмы намеренно росли на поверхности, предоставили дополнительные доказательства эффективности различных обработок, использованных в этом исследовании.Никакой разницы в оптической плотности питательной среды не наблюдалось почти во всех методах стерилизации по сравнению с колбами, содержащими исключительно стерилизованную среду (контроль 3, рисунок 1b). Позже отсутствие микроорганизмов было подтверждено под оптическим микроскопом. Единственной обработкой, которая показала небольшое увеличение оптической плотности, было сухое тепло. Микроорганизмы не были обнаружены с помощью микроскопии, а скорее присутствовали остатки высушенной в печи биопленки, которые образовались во время преднамеренного загрязнения, которое привело к несколько более высокому OD в среде LB.

Как и ожидалось, у загрязненных контролей (контроль 4, рис. 1b) была повышенная оптическая плотность, связанная с микробным заражением, что позже было подтверждено оптической микроскопией.

Поскольку при методе прямой стерилизации образцы были погружены в богатую питательную среду, вполне вероятно, что микроорганизмы, которые нельзя культивировать в этом обычно используемом бульоне, могли выжить в процессе стерилизации. В этом случае прямой подход не обнаружил бы присутствие таких микроорганизмов.Однако эффективность методов стерилизации также оценивалась с помощью обратной процедуры, определяя их эффективность в уничтожении живых бактерий (т.е. E. coli, ATCC25404). Представленные здесь результаты предполагают, что все методы стерилизации удаляли живые бактерии с поверхности металла, когда намеренно загрязнен. Более того, контаминация действительно имела место в необработанном контрольном случае, но не в стерилизованных образцах, что означает, что все методы стерилизации были способны уничтожить не только живые микроорганизмы, но и, как минимум, все те, которые можно культивировать в LB бульон.Использование различных питательных сред и дополнительных методов обнаружения, таких как независимые от культуры подходы к обнаружению активности, может дать дополнительную информацию об эффективности стерилизации, которая выходит за рамки данной работы.

Электрохимические испытания

Понимание влияния стерилизационной обработки на коррозионное поведение сплава имеет решающее значение для исследований MIC. Идеальная стерилизационная обработка эффективно убивает все живые микроорганизмы и споры на поверхности без изменения состояния поверхности образца, оцениваемого здесь по электрохимическому отклику материала.Следовательно, скорости коррозии должны быть в среднем одинаковыми, с разбросом (оцениваемым с использованием диапазона) в пределах вариабельности необработанного контроля. В этом отношении большой разброс скорости коррозии добавляет источник ошибок и может привести к неверной интерпретации данных.

Все процедуры стерилизации в некоторой степени повлияли на электрохимический отклик материала (рис. 4). Влияние процедуры стерилизации на скорость коррозии было более выраженным, чем на E OC , Таблица V.Тем не менее, E OC в этаноле (18 часов) и этаноле с последующим пламенем дал наибольший разброс. Воздействие 75% этанола в течение 18 часов и этанола с последующим пламенем приводило к стандартным отклонениям, которые были, соответственно, в 8,7 и 7,0 раз выше, чем у контроля 5.

Скорость коррозии образцов, обработанных сухим жаром в атмосфере инертного аргона, имела среднее значение. скорость коррозии, а также диапазон и стандартное отклонение, аналогичные значениям w и S контроля (т.е.е. w = 0,165 против 0,132 мм / год и S = ​​0,0825 против 0,0660 соответственно или на 25% выше, чем в контроле), контроль 5. Образцы, обработанные сухим жаром на воздухе, напротив, показали небольшое снижение средней скорости коррозии; однако диапазон 0,360 мм / год и стандартное отклонение 0,18 мм / год были в 2,7 раза выше, чем у контроля 5.

Стерилизация в 75% этаноле оказала заметное влияние на коррозию, которая зависела от времени стерилизации. Средняя скорость коррозии через 15 часов была ниже, чем в контроле (контроль 5), с диапазоном и стандартным отклонением, аналогичным таковому при сухом нагреве на воздухе.Однако стерилизация купонов в этаноле в течение 18 часов привела к наибольшей изменчивости данных с разницей между максимальной и минимальной скоростью коррозии почти на порядок. Стерилизация пламенем дала наибольшее снижение средней скорости коррозии со значением w 0,524 мм / год и S 0,262 мм / год, что в 4 раза выше, чем в контроле (контроль 5). Наконец, образцы, стерилизованные 2 об.% Глутаровым альдегидом, показали среднюю скорость коррозии, аналогичную таковой при 18-часовой стерилизации в 75 об.% Этаноле, и значительную изменчивость при w = 0.385 мм / год и S = ​​0,1925 мм / год.

Большой разброс, вызванный стерилизацией в 75 об.% Этанола и 2 об.% Глутарового альдегида, можно частично объяснить коррозионной активностью среды по отношению к углеродистой стали. В большинстве случаев воздействие 75 об.% Этанола и 2 об.% Глутарового альдегида приводило к появлению видимых пятен ржавчины и обесцвечиванию электролита через 15 часов. Оценка скорости коррозии с использованием зондов ER в 75 об.% Этанола и 2 об.% Глутарового альдегида была проведена, чтобы попытаться объяснить эти наблюдения.

Хотя консервативное время отклика датчика, рассчитанное здесь, было больше, чем фактический период стерилизации, скорость коррозии использовалась как индикатор коррозионной активности окружающей среды.В связи с этим, скорости коррозии, оцененные измерениями датчика ER, выполненными после периода начальной стабилизации датчика (рис. 5), находились в диапазоне от 0,025 до 0,075 мм / год (от 0,985 до 2,955 миль в год). Эти незначительные скорости коррозии составляют 20% и 60% от принятой скорости коррозии углеродистой стали в газированной, тихой (т.е. движущейся со скоростью менее 0,6 м / с) морской воде 57,58 .

Влияние состава электролита

В дополнение к эффекту стерилизационной обработки необходимо учитывать влияние электролита, используемого для испытаний на коррозию.Исследования МПК обычно проводятся с использованием сложных электролитов, которые добавляют значительное количество компонентов, необходимых для стимулирования роста микробов. Как обсуждали Webster and Newman, 59 , коррозионная активность этих богатых питательными веществами синтетических сред может сильно отличаться от коррозионной активности реальной рабочей среды, например пресная и морская вода.

Рисунок 4 показывает, что скорость коррозии углеродистой стали (контроль 5) в комплексном растворе, используемом здесь, была в среднем в 3,4 раза выше, чем в 0.1 М раствор NaCl тестировали при том же значении pH, равном 4,50. Хотя краткосрочные лабораторные эксперименты в смоделированных средах не могут быть использованы для прогнозирования долгосрочных скоростей коррозии в естественных средах, показательно сравнить краткосрочное поведение углеродистой стали в синтетическом электролите, используемом в этом исследовании, с долгосрочным поведением. в пресной и морской воде. 37,60 Скорость коррозии в стерильной синтетической среде была в 8 раз выше, чем заявленные средние скорости коррозии углеродистой стали в пресной воде 55,56 и 6.В 35 раз быстрее, чем заявленные значения для углеродистой стали в естественной морской воде. 57,58 Сравнение скорости коррозии по результатам расследования MIC с типичной скоростью коррозии при эксплуатации может ввести в заблуждение. Отрицательный контроль, то есть контроль без микроорганизмов, в реальной стерильной синтетической среде необходим, чтобы отделить действие микроорганизмов от воздействия неорганических и органических веществ, добавленных в электролит. В связи с этим некоторые соединения могут либо усиливать коррозию (например, Fe 3+ и NO 3 ), действуя как добавленные окислители, либо замедлять / ингибировать кинетику растворения за счет образования поверхностных защитных пленок (например,г. фосфаты). 61,62 Добавки YE также влияют на результаты коррозии. 29

Кинетика окисления

Данные, представленные выше, позволяют предположить, что сухой жар был наиболее удобной процедурой стерилизации углеродистой стали. Однако продолжительный нагрев при умеренно повышенных температурах потенциально может изменить свойства поверхности и микроструктуру стали. Дополнительные испытания были проведены для определения максимально допустимой температуры стерилизации сухим жаром.

Как видно на рисунке 6, даже при воздействии воздуха образование оксидов было минимальным во время стерилизации сухим жаром, учитывая относительно низкие температуры процедуры. Точно так же на рис. 6 показано, что прибавку в весе из-за окисления можно было измерить с помощью аналитических весов только при температурах выше 400 ° C. Увеличение веса при окислении углеродистой стали и железа зависит от количества холодной обработки и методов подготовки образцов, таких как электрополировка или механическое шлифование. 63 Несмотря на это, увеличение веса образцов, подвергшихся воздействию температур выше 400 ° C, в разумных пределах соответствовало значению, ожидаемому с использованием закона параболического роста с коэффициентами, указанными в литературе. 64–66 Для образцов, подвергшихся воздействию температуры 400 ° C или выше, скорость коррозии в испытательном растворе резко снизилась (не показано), вероятно, из-за образования защитных оксидов. Рост оксидов не должен быть проблемой априори при стерилизации углеродистой стали при температуре 150–180 ° C.

Использование стерилизации сухим жаром для других сплавов

На основании результатов, представленных здесь, может возникнуть соблазн предположить, что стерилизация сухим жаром в инертной атмосфере может быть использована для других сплавов.Несмотря на то, что на основе кинетики системы Fe-C-Mn не ожидается никаких микроструктурных изменений углеродистой стали из-за стерилизационной обработки при температуре от 150 до 180 ° C, хорошо известно, что продолжительный нагрев при умеренно повышенной температуре может вызвать рост зерна и старение. дисперсионно-твердеющих сплавов, таких как деформируемые алюминиевые сплавы. 67 Хотя стерилизация сухим жаром в инертной атмосфере должна одинаково хорошо работать как с углеродистыми и низколегированными сталями, так и с большинством нержавеющих сталей и сплавов на основе никеля, нагрев в диапазоне 150–180 ° C может привести к дисперсионному упрочнению, например.g., большинство деформируемых алюминиевых сплавов, используемых в аэрокосмической промышленности. 67 Эффект возможных микроструктурных изменений из-за процедуры стерилизации должен быть принят во внимание при исследовании MIC.

На основании представленных здесь доказательств были сделаны следующие выводы:

  • Все методы стерилизации были одинаково эффективны в удалении микроорганизмов и спор с поверхности металла, что было определено напрямую, путем культивирования в бульоне LB, и косвенно, путем определения эффективности уничтожения живых микроорганизмов на преднамеренно загрязненных поверхностях.
  • Все методы стерилизации представляют собой источник ошибок, определяемых измерениями линейной поляризации. В этой публикации представлена ​​методология, которой могут следовать другие лаборатории для оценки эффекта альтернативных методов стерилизации в конкретных лабораторных условиях.
  • Сухое нагревание при 170 ° C в течение 60 минут (плюс время нагрева и охлаждения) в инертной атмосфере было наиболее удобным методом стерилизации углеродистой стали с точки зрения практичности и стабильности реакции металла на его применение.
  • Хотя стерилизация сухим жаром в инертной атмосфере должна быть одинаково подходящей для всех углеродистых, низколегированных и большинства нержавеющих сталей, а также сплавов на основе никеля, продолжительный нагрев при 150–180 ° C может привести к микроструктурным изменениям некоторых стойких к старению сплавы.
  • Стерилизация углеродистой стали в 75 об.% Этанола и 2 об.% Глутарового альдегида, а также в спирте с последующим пламенем не рекомендуется из-за большого разброса электрохимического отклика, вызванного воздействием стерилизационной среды.

Авторы благодарят профессора Лу-Кванг Джу, профессора Рикардо М. Карранса, Роберта Миллера II, Хуа Ванга и Альваро Родригеса за их советы и техническую помощь в проекте.

Эта работа связана с Национальным центром образования и исследований по коррозии и характеристикам материалов (NCERCAMP) в Университете Акрона и Министерством обороны США по техническому сотрудничеству в области коррозии при поддержке Министерства обороны США по политике и надзору в области коррозии через инженерные исследования и разработки. Центр / Исследовательская лаборатория строительства армии США, грант W9132T-11-0002, и через Академию ВВС США по соглашению номер FA7000-10-2-0013.

Биологические индикаторы для стерилизации | Центр знаний

Что такое биологические индикаторы?

Биологические индикаторы (BI), как определено ANSI / AAMI и ISO, представляют собой тест-системы, содержащие жизнеспособные микроорганизмы, обеспечивающие определенную устойчивость к определенному процессу стерилизации. Биологический индикатор предоставляет информацию о том, были ли выполнены необходимые условия для уничтожения определенного количества микроорганизмов для данного процесса стерилизации, обеспечивая уровень уверенности в этом процессе.Эндоспоры или бактериальные споры — это микроорганизмы, которые в основном используются в БИ. Они считаются одними из самых сложных для убийства. Кроме того, споры бактерий выбираются для определенного процесса стерилизации на основании их известной устойчивости к этому процессу. Например, споры Geobacillus stearothermophilus демонстрируют высокую стойкость к пару и испаренной перекиси водорода и поэтому используются в биологических инкубаторах, которые контролируют эти процессы стерилизации.

Ознакомьтесь с нашими биологическими индикаторами

Преимущества биологических индикаторов в процессе стерилизации

Биологические индикаторы, в зависимости от конкретного типа, могут использоваться для различных процессов стерилизации с использованием пара, газообразного пероксида водорода, оксида этилена и др.

Несколько факторов, таких как опыт оператора, подготовка загрузки и состояние стерилизатора, могут повлиять на цикл стерилизации. БИ обеспечивают прямую оценку летальности процесса, и поэтому использование БИ для регулярного мониторинга стерилизаторов обеспечивает уверенность в эффективности процесса стерилизации.

BI обычно используются в устройствах контроля процесса (PCD), которые предназначены для представления наиболее сложных продуктов, которые обычно обрабатываются. Промежуточный результат для BI в рамках этой определенной задачи демонстрирует, что стерилизатор эффективен в уничтожении большого количества высокорезистентных бактериальных спор, обеспечивая пользователям уровень уверенности в процессе стерилизации.

Процедура тестирования биологических индикаторов

Биологический индикатор состоит из материала-носителя, на который нанесены споры бактерий с определенной устойчивостью к процессу стерилизации. Материал-носитель заключен в пергамин или флакон. BI подвергается процессу стерилизации, а затем инкубируется в определенных условиях роста, чтобы определить, выжили ли какие-либо споры в процессе. Если споры не выживают, они не растут, и тест считается пройденным.Если обнаружен рост, тест считается неудачным. 1

Независимо от типа процесса или применения, персонал стерильной обработки должен всегда следовать инструкциям производителя по применению (IFU) при использовании биологического индикатора для мониторинга процессов стерилизации.

Биологические индикаторы для стерилизации паром (автоклавы)

Биологические индикаторы (внутри УКП) часто используются для текущего контроля, аттестации и контроля загрузки парового стерилизатора.Биологические индикаторы предназначены для демонстрации того, были ли условия во время цикла (автоклав) адекватными для достижения определенного уровня микробной инактивации. Для паровой стерилизации BI обычно используются в PCD, и AAMI ST79: 2017 рекомендует использовать PCD еженедельно, предпочтительно ежедневно, для контроля стерилизаторов и в каждой загрузке, содержащей имплантаты.

PCD, содержащий BI и / или химический индикатор , следует размещать в наиболее трудном месте камеры.В паровом стерилизаторе он обычно находится на нижней полке возле слива. По завершении цикла PCD извлекается, а BI инкубируется. После инкубации считывается результат BI. Инкубаторы или считыватели предоставят окончательный результат прохождения или неудачи в течение указанного периода времени.

Согласно AAMI ST79: 2017 2 , PCD, содержащие биологические индикаторы, должны использоваться для рутинного мониторинга циклов стерилизации паром по крайней мере еженедельно, предпочтительно ежедневно и в каждой загрузке, содержащей имплантаты.Персонал отделения стерильной обработки должен следовать инструкциям производителя по правильному размещению PCD, содержащего BI, в стерилизаторе.

Помимо текущего контроля стерилизатора, PCD, содержащие BI, также используются для других приложений, перечисленных ниже:

  • Регулярный мониторинг неимплантационных нагрузок
  • Регулярный контроль нагрузки на имплант. AAMI ST79: 2017 рекомендует использовать PCD, содержащий интегрирующий индикатор BI и 5-го типа. Персонал стерильной обработки также может использовать PCD, содержащий химический индикатор типа 6 и BI.В любом случае партии, содержащие имплантаты, должны быть помещены в карантин до тех пор, пока не станут известны результаты BI, за исключением экстренных ситуаций.
  • Аттестация стерилизаторов после установки, перемещения, капитального ремонта, неисправности и сбоев процесса стерилизации
  • Периодические проверки качества продукции

Биологические индикаторы стерилизации паром перекисью водорода

Биологические индикаторы также используются для мониторинга процессов стерилизации испарением перекиси водорода (VHP).Стерилизаторы с испарением перекиси водорода часто включают несколько циклов, предназначенных для эффективной стерилизации широкого спектра хирургических инструментов и устройств, и биологический индикатор стерилизации VHP должен быть валидирован для использования в каждом цикле. Биологические индикаторы для мониторинга стерилизации перекисью водорода включают автономные биологические индикаторы, тестовые пакеты или контрольные пакеты. AAMI ST58: 2013 рекомендует использовать PCD с BI ежедневно, предпочтительно каждый цикл, для контроля стерилизаторов и при каждой загрузке, содержащей имплантаты.

Типы биологических индикаторов процессов стерилизации

Существуют различные типы биологических индикаторов в зависимости от необходимости и процесса стерилизации. Наиболее распространенным типом является автономный биологический индикатор (SCBI). Эти индикаторы объединяют материал-носитель со спорами и питательной средой в одном флаконе, устраняя необходимость в асептическом переносе. 1 После стерилизации флакон активируется, позволяя спорам смешиваться со средой для выращивания, и инкубируется для обеспечения роста спор.В некоторых конструкциях SCBI используется система обнаружения на основе ферментов, которая может быстрее определять активность ферментов с более коротким временем инкубации.

Независимо от конструкции, биологические индикаторы используются во время процесса стерилизации паром, процесса стерилизации перекисью водорода или процесса этиленоксида, чтобы гарантировать эффективность и летальность процесса.

Где купить биологические индикаторы?

Медицинским учреждениям следует приобретать BI из надежных и доступных источников, чтобы их можно было легко сделать повторным заказом.Биологические индикаторы можно приобрести в компаниях, предлагающих средства для стерилизации и профилактики инфекций . Факторы, которые могут быть учтены при принятии решения о том, какие биологические индикаторы покупать, включают время инкубации, торговую марку, стоимость, ассортимент и разнообразие продуктов, проверенные приложения и простоту использования. См. ISO 11138-7: 2019 для получения дополнительной информации о выборе поставщика.

1 https://university.steris.com/course/indicators-disinfection-and-sterilization/

2
ANSI / AAMI ST79: 2017 Всеобъемлющее руководство по стерилизации паром и обеспечению стерильности в медицинских учреждениях.Ассоциация развития медицинского оборудования; 2017

Использование физических методов для борьбы с микроорганизмами — Микробиология

Цели обучения

  • Понимать и сравнивать различные физические методы контроля роста микробов, включая нагревание, охлаждение, замораживание, обработку под высоким давлением, сушку, лиофилизацию, облучение и фильтрацию

На протяжении тысячелетий люди использовали различные физические методы микробного контроля для консервирования продуктов .Общие методы контроля включают, среди прочего, применение высоких температур, облучение, фильтрацию и осушение (сушку). Многие из этих методов неспецифически убивают клетки путем разрушения мембран, изменения проницаемости мембран или повреждения белков и нуклеиновых кислот путем денатурации, деградации или химической модификации. В этом разделе описаны различные физические методы, используемые для борьбы с микробами.

тепло

Нагревание — одна из наиболее распространенных и старейших форм борьбы с микробами.Используется в простых техниках, таких как приготовление пищи и консервирование . Тепло может убить микробы, изменяя их мембраны и денатурируя белки. Точка термической смерти (TDP) микроорганизма — это самая низкая температура, при которой все микробы гибнут за 10-минутное воздействие. Различные микроорганизмы по-разному реагируют на высокие температуры, при этом некоторые (например, эндоспорообразователи, такие как C. botulinum ) более терпимы к теплу. Аналогичный параметр, время тепловой смерти (TDT) , представляет собой время, необходимое для уничтожения всех микроорганизмов в образце при заданной температуре.Эти параметры часто используются для описания процедур стерилизации с использованием сильного нагрева, таких как автоклавирование . Кипячение — один из старейших методов борьбы с микробами влажным теплом, и он, как правило, довольно эффективен при уничтожении вегетативных клеток и некоторых вирусов. Однако кипячение менее эффективно убивает эндоспоры; некоторые эндоспоры способны выдержать до 20 часов кипячения. Кроме того, кипение может быть менее эффективным на больших высотах, где точка кипения воды ниже, и поэтому время кипения, необходимое для уничтожения микробов, больше.По этим причинам кипячение не считается полезным методом стерилизации в лабораторных или клинических условиях.

Для стерилизации в лаборатории или клинике можно использовать множество различных протоколов нагрева, и эти протоколы можно разделить на две основные категории: стерилизация сухим жаром и стерилизация влажным теплом . Лабораторная асептическая техника обычно включает некоторые протоколы стерилизации сухим жаром с использованием прямого воздействия высокой температуры, например стерилизацию посевных петель.Сжигание при очень высоких температурах уничтожает все микроорганизмы. Сухой жар также может применяться в течение относительно длительного периода времени (не менее 2 часов) при температуре до 170 ° C с использованием стерилизатора сухого нагрева, такого как духовка. Однако стерилизация влажным теплом обычно является более эффективным протоколом, поскольку она проникает в клетки лучше, чем сухим теплом.

Рис. 1. (a) Стерилизация петли, часто называемая «зажиганием петли», является обычным компонентом асептической техники в микробиологической лаборатории и используется для сжигания любых микроорганизмов на петле.(b) В качестве альтернативы можно использовать бактерициератор для уменьшения аэрозолизации микробов и устранения наличия открытого пламени в лаборатории. Это примеры стерилизации сухим жаром путем прямого воздействия высокой температуры, способной к сжиганию. (кредит А: модификация работы Ань-Хюэ Ту; кредит Б: модификация работы Брайана Форстера)

Автоклавы

Автоклавы полагаются на стерилизацию влажным жаром. Они используются для повышения температуры выше точки кипения воды для стерилизации предметов, таких как хирургическое оборудование, от вегетативных клеток, вирусов и особенно эндоспор, которые, как известно, выдерживают температуры кипения, не повреждая предметы.Чарльз Чемберленд (1851–1908) разработал современный автоклав в 1879 году, работая в лаборатории Луи Пастера . Автоклав до сих пор считается наиболее эффективным методом стерилизации. За пределами лабораторий и клинических учреждений большие промышленные автоклавы под названием retort s позволяют проводить стерилизацию влажным теплом в больших масштабах.

Как правило, воздух в камере автоклава удаляется и заменяется увеличивающимся количеством пара, захваченного в замкнутой камере, что приводит к увеличению внутреннего давления и температуры выше точки кипения воды.Два основных типа автоклавов различаются способом удаления воздуха из камеры. В автоклавах самотечного вытеснения пар вводится в камеру сверху или с боков. Воздух, который тяжелее пара, опускается на дно камеры, где вытесняется через вентиляционное отверстие. Полное вытеснение воздуха затруднено, особенно при больших нагрузках, поэтому для таких нагрузок могут потребоваться более длительные циклы. В предвакуумных стерилизаторах воздух полностью удаляется с помощью высокоскоростного вакуума перед подачей пара в камеру.Поскольку воздух удаляется более полно, пар может легче проникать в завернутые предметы. Многие автоклавы могут работать как под действием силы тяжести, так и с предварительным вакуумом, используя первый для обеззараживания отходов и стерилизации сред и неупакованной стеклянной посуды, а второй — для стерилизации упакованных инструментов.

Рисунок 2. (a) Автоклав обычно используется для стерилизации в лаборатории и в клинических условиях. Путем вытеснения воздуха в камере увеличивающимся количеством пара может быть достигнуто повышение давления и температура, превышающая 100 ° C, что обеспечивает полную стерилизацию.(b) Исследователь программирует автоклав для стерилизации образца. (кредит a: модификация работы Кортни Харрингтон; кредит b: модификация работы Lackemeyer MG, Kok-Mercado Fd, Wada J, Bollinger L, Kindrachuk J, Wahl-Jensen V, Kuhn JH, Jahrling PB)

Стандартные рабочие температуры для автоклавов составляет 121 ° C или, в некоторых случаях, 132 ° C, обычно при давлении от 15 до 20 фунтов на квадратный дюйм (psi). Продолжительность воздействия зависит от объема и природы стерилизуемого материала, но обычно составляет 20 минут или более, при этом для больших объемов требуется более длительное время воздействия для обеспечения достаточной теплопередачи к стерилизуемым материалам.Пар должен напрямую контактировать с стерилизуемыми жидкостями или сухими материалами, поэтому контейнеры оставляют неплотно закрытыми, а инструменты неплотно оборачивают бумагой или фольгой. Ключ к автоклавированию заключается в том, что температура должна быть достаточно высокой, чтобы уничтожить эндоспоры для достижения полной стерилизации.

Рис. 3. Белые полоски на ленте автоклава (левая пробирка) становятся темными во время успешного запуска автоклава (правая пробирка). (кредит: модификация работы Брайана Форстера)

Поскольку стерилизация так важна для безопасных медицинских и лабораторных протоколов, контроль качества имеет важное значение.Автоклавы могут быть оснащены регистраторами для регистрации значений давления и температуры, достигнутых во время каждого цикла. Кроме того, внутренние индикаторы различных типов следует автоклавировать вместе с стерилизуемыми материалами, чтобы гарантировать достижение необходимой температуры стерилизации. Одним из распространенных типов индикаторов является использование термочувствительной ленты для автоклава , которая имеет белые полосы, которые становятся черными при достижении соответствующей температуры во время успешной работы автоклава.Этот тип индикатора относительно недорогой и может использоваться при каждом запуске. Однако автоклавная лента не указывает продолжительность воздействия, поэтому ее нельзя использовать в качестве индикатора стерильности.

Другой тип индикатора, биологический индикатор спор, использует либо полоску бумаги, либо жидкую суспензию эндоспор Geobacillus stearothermophilus , чтобы определить, уничтожены ли эндоспоры в процессе. Эндоспоры облигатной термофильной бактерии G. stearothermophilus — золотой стандарт, используемый для этой цели из-за их чрезвычайно высокой термостойкости. Биологические индикаторы спор также можно использовать для проверки эффективности других протоколов стерилизации, включая этиленоксид, сухой жар, формальдегид, гамма-излучение и плазменную стерилизацию перекисью водорода с использованием либо G . stearothermophilus , Bacillus atrophaeus, B. subtilis, или спор B. pumilus .

В случае проверки функции автоклава, эндоспоры инкубируются после автоклавирования, чтобы гарантировать отсутствие жизнеспособных эндоспор.Рост бактерий после прорастания эндоспор можно отслеживать с помощью тестов биологических индикаторов спор , которые обнаруживают кислотные метаболиты или флуоресценцию, продуцируемую ферментами, полученными из жизнеспособных G. stearothermophilus . Третий тип автоклавного индикатора — это трубка Diack , стеклянная ампула, содержащая термочувствительную таблетку, плавящуюся при надлежащей температуре стерилизации. Полоски со спорами или пробирки Диака используются периодически, чтобы гарантировать правильную работу автоклава.

Пастеризация

Хотя полная стерилизация идеальна для многих медицинских применений, она не всегда практична для других применений и может также повлиять на качество продукта. Кипячение и автоклавирование не являются идеальными способами контроля роста микробов во многих пищевых продуктах, поскольку эти методы могут нарушить консистенцию и другие органолептические (сенсорные) качества пищи. Пастеризация — это форма микробиологического контроля пищевых продуктов, при которой используется тепло, но при этом пища не становится стерильной.Традиционная пастеризация убивает болезнетворные микроорганизмы и снижает количество вызывающих порчу микробов, сохраняя при этом качество пищевых продуктов. Процесс пастеризации был впервые разработан Луи Пастером в 1860-х годах как метод предотвращения порчи пива и вина. Сегодня пастеризация чаще всего используется для уничтожения чувствительных к нагреванию патогенов в молоке и других пищевых продуктах (например, яблочном соке и меде). Однако, поскольку пастеризованные пищевые продукты не стерильны, они со временем испортятся.

Методы пастеризации молока уравновешивают температуру и продолжительность обработки. Один метод, высокотемпературная кратковременная пастеризация (HTST) , подвергает молоко воздействию температуры 72 ° C в течение 15 секунд, что снижает количество бактерий при сохранении качества молока. Альтернативой является пастеризация при сверхвысокой температуре (UHT) , при которой молоко подвергается воздействию температуры 138 ° C в течение 2 или более секунд. Пастеризованное молоко UHT можно долго хранить в герметичных емкостях без охлаждения; однако очень высокие температуры изменяют белки в молоке, вызывая небольшие изменения вкуса и запаха.Тем не менее, этот метод пастеризации выгоден в регионах, где доступ к охлаждению ограничен.

Рис. 4. Два разных метода пастеризации, HTST и UHT, обычно используются для уничтожения патогенов, связанных с порчей молока. (кредит слева: модификация работы Марка Хиллари; кредит справа: модификация работы Керри Чешика)

Подумай об этом

  • Как в автоклаве достигается температура выше точки кипения?
  • Как можно сравнить начало порчи между HTST-пастеризованным и UHT-пастеризованным молоком?
  • Почему кипячение не используется в качестве метода стерилизации в клинических условиях?

Холодильное и морозильное оборудование

Так же, как высокие температуры эффективны для контроля роста микробов, воздействие низких температур также может быть простым и эффективным методом микробного контроля, за исключением психрофилов , которые предпочитают низкие температуры (см. Температура и рост микробов).Холодильники, используемые на домашних кухнях или в лаборатории, поддерживают температуру от 0 ° C до 7 ° C. Этот температурный диапазон подавляет микробный метаболизм, значительно замедляя рост микроорганизмов и помогая сохранять охлажденные продукты, такие как продукты питания или медицинские принадлежности. Некоторые типы лабораторных культур могут быть сохранены в холодильнике для дальнейшего использования.

Замораживание ниже –2 ° C может остановить рост микробов и даже убить чувствительные организмы. По данным Министерства сельского хозяйства США (USDA), единственные безопасные способы размораживания замороженных продуктов — это в холодильнике, погружении в холодную воду, заменяемую каждые 30 минут, или в микроволновой печи, поддерживая продукты при температуре, не способствующей росту бактерий. .Кроме того, остановленный рост бактерий может возобновиться в размороженных продуктах, поэтому с размороженными продуктами следует обращаться как со свежими скоропортящимися продуктами.

Бактериальные культуры и медицинские образцы, требующие длительного хранения или транспортировки, часто замораживают при сверхнизких температурах –70 ° C или ниже. Эти сверхнизкие температуры могут быть достигнуты путем хранения образцов на сухом льду в морозильной камере со сверхнизкой температурой или в специальных резервуарах с жидким азотом , которые поддерживают температуру ниже −196 ° C.

Рис. 5. Культуры и другие медицинские образцы можно хранить в течение длительного времени при сверхнизких температурах. (а) Морозильник со сверхмалой температурой поддерживает температуру -70 ° C или ниже. (b) Еще более низкие температуры могут быть достигнуты путем замораживания и хранения в жидком азоте. (кредит а: модификация работы «Expert Infantry» / Flickr; кредит б: модификация работы Министерством сельского хозяйства США)

Подумай об этом

  • Убивает ли еда в холодильнике бактерии?

Давление

Воздействие высокого давления убивает множество микробов.В пищевой промышленности обработка под высоким давлением (также называемая паскализацией ) используется для уничтожения бактерий, дрожжей, плесени, паразитов и вирусов в пищевых продуктах при сохранении качества пищевых продуктов и продлении срока хранения. Применение высокого давления от 100 до 800 МПа (атмосферное давление на уровне моря составляет около 0,1 МПа) достаточно для уничтожения вегетативных клеток путем денатурации белка, но эндоспоры могут выдержать это давление.

В клинических условиях гипербарическая кислородная терапия иногда используется для лечения инфекций.В этой форме терапии пациент дышит чистым кислородом под давлением, превышающим нормальное атмосферное давление, обычно от 1 до 3 атмосфер (атм). Это достигается помещением пациента в барокамеру или подачей сжатого кислорода через дыхательную трубку. Гипербарическая оксигенотерапия помогает увеличить насыщение кислородом тканей, которые становятся гипоксическими из-за инфекции и воспаления. Эта повышенная концентрация кислорода усиливает иммунный ответ организма за счет увеличения активности нейтрофилов и макрофагов, лейкоцитов, которые борются с инфекциями.Повышенный уровень кислорода также способствует образованию токсичных свободных радикалов, которые подавляют рост чувствительных к кислороду или анаэробных бактерий, таких как Clostridium perfringens , частая причина газовой гангрены . При инфекциях C. perfringens гипербарическая кислородная терапия также может снизить секрецию бактериального токсина, вызывающего разрушение тканей. Гипербарическая кислородная терапия, по-видимому, также повышает эффективность лечения антибиотиками.К сожалению, некоторые редкие риски включают кислородное отравление и воздействие на нежные ткани, такие как глаза, среднее ухо и легкие, которые могут быть повреждены повышенным давлением воздуха.

Обработка под высоким давлением обычно не используется для дезинфекции или стерилизации фомитов. Хотя приложение давления и пара в автоклаве эффективно для уничтожения эндоспор, именно достигнутая высокая температура, а не непосредственно давление, приводит к гибели эндоспор.

Полоса неудачных попыток

Однажды весной 2015 года в понедельник у женщины из Огайо началось нечеткое двоение в глазах; Трудность глотания; и опущенные веки.Ее срочно доставили в отделение неотложной помощи местной больницы. Во время обследования у нее начались спазмы в животе, тошнота, паралич, сухость во рту, слабость лицевых мышц, затрудненная речь и дыхание. На основании этих симптомов был активирован центр управления инцидентами в больнице, и официальные органы здравоохранения штата Огайо были уведомлены о возможном случае ботулизма. Тем временем другие пациенты с подобными симптомами стали появляться в других местных больницах. Из-за подозрения на ботулизм антитоксин был доставлен в эти медицинские учреждения в течение ночи из центра контроля заболеваний для введения пострадавшим пациентам.Первый пациент умер от дыхательной недостаточности в результате паралича, а примерно половине оставшихся жертв потребовалась дополнительная госпитализация после введения антитоксина, при этом, по крайней мере, двум потребовались аппараты ИВЛ для дыхания.

Должностные лица общественного здравоохранения расследовали каждый из случаев и определили, что все пациенты накануне посетили одно и то же церковное угощение. Более того, они проследили источник вспышки до картофельного салата, приготовленного из домашнего консервированного картофеля. Скорее всего, картофель консервировали в кипящей воде — метод, который позволяет эндоспорам Clostridium botulinum выжить. C. botulinum продуцирует ботулинический токсин, нейротоксин, который часто оказывается смертельным при проглатывании. По данным CDC, случай в Огайо стал крупнейшей вспышкой ботулизма в Соединенных Штатах почти за 40 лет.

Для уничтожения эндоспор C. botulinum требуется минимальная температура 116 ° C (240 ° F), что намного выше точки кипения воды. Эта температура может быть достигнута только в автоклаве, который рекомендуется для домашнего консервирования продуктов с низким содержанием кислоты, таких как мясо, рыба, птица и овощи.Кроме того, CDC рекомендует кипятить домашние консервы примерно за 10 минут перед употреблением. Поскольку ботулотоксин термолабилен (это означает, что он денатурируется под действием тепла), 10 минут кипячения сделают нефункциональным любой ботулотоксин, который может содержать пища.

Рисунок 6. (а) Clostridium botulinum является возбудителем ботулизма. (b) Для домашнего консервирования рекомендуется использовать автоклав, поскольку эндоспоры C. botulinum могут выдерживать температуры выше точки кипения воды.(кредит a: модификация работы Центров по контролю и профилактике заболеваний; кредит b: модификация работы Национального центра консервирования домашней еды)
Чтобы узнать больше о правильных методах консервирования в домашних условиях, посетите веб-сайт CDC.

Высыхание

Сушка, также известная как сушка или обезвоживание, — это метод, который тысячелетиями использовался для консервирования таких продуктов, как изюм, чернослив и вяленое мясо. Это работает, потому что все клетки, включая микробы, нуждаются в воде для своего метаболизма и выживания.Хотя сушка контролирует рост микробов, она может не убить все микробы или их эндоспоры, которые могут начать снова расти, когда условия станут более благоприятными и содержание воды восстановится.

В некоторых случаях продукты сушат на солнце, полагаясь на испарение для достижения высыхания. Сублимационная сушка или лиофилизация — это еще один метод осушения, при котором предмет быстро замораживается («мгновенно замораживается») и помещается под вакуум, чтобы вода терялась при сублимации. Лиофилизация сочетает в себе воздействие низких температур и высыхание, что делает ее весьма эффективной для контроля роста микробов.Кроме того, лиофилизация наносит меньший ущерб предмету, чем обычное высушивание, и лучше сохраняет исходные качества предмета. Лиофилизированные предметы можно хранить при комнатной температуре, если они упакованы соответствующим образом, чтобы предотвратить накопление влаги. Лиофилизация используется для консервирования в пищевой промышленности, а также в лаборатории для длительного хранения и транспортировки микробных культур.

Содержание воды в пищевых продуктах и ​​материалах, называемое активностью воды , можно снизить без физического высушивания путем добавления растворенных веществ, таких как соли или сахара.При очень высоких концентрациях солей или сахаров количество доступной воды в микробных клетках резко снижается, поскольку вода будет поступать из области с низкой концентрацией растворенного вещества (внутри клетки) в область с высокой концентрацией растворенного вещества (вне клетки). Многие микроорганизмы не выживают в условиях высокого осмотического давления. Мед, например, на 80% состоит из сахарозы, среды, в которой очень мало микроорганизмов способно расти, что устраняет необходимость в охлаждении.Соленое мясо и рыба, такие как ветчина и треска, соответственно, были критически важными продуктами до достижения возраста холодильника . Фрукты консервировали, добавляя сахар, делая джемы и желе. Однако некоторые микробы, такие как плесень и дрожжи, как правило, более терпимы к высыханию и высокому осмотическому давлению и, таким образом, все еще могут загрязнять эти типы пищевых продуктов.

Рис. 7. (а) Добавление растворенного вещества создает гипертоническую среду, вытягивая воду из клеток. (б) Некоторые продукты можно сушить напрямую, например изюм и вяленое мясо.Остальные продукты сушат с добавлением соли, как в случае соленой рыбы, или сахара, как в случае с вареньем. (кредит а: модификация работы «Брюса Блауса» / Wikimedia Commons; изюминка кредита: модификация работы Кристиана Шнеттелькера; кредитный отрывок: модификация работы Ларри Якобсена; кредит соленая рыба: модификация работы «Фотограф» / Викимедиа Commons; Credit jam: модификация работы Кима Беккера)

Подумай об этом

  • Как добавление соли или сахара в пищу влияет на ее водную активность?

Радиация

Радиация в различных формах, от высокоэнергетического излучения до солнечного света, может использоваться для уничтожения микробов или подавления их роста. Ионизирующее излучение включает рентгеновские лучи, гамма-лучи и пучки электронов высокой энергии. Ионизирующее излучение достаточно сильно, чтобы проникнуть в клетку, где оно изменяет молекулярные структуры и повреждает компоненты клетки. Например, ионизирующее излучение вызывает двухцепочечные разрывы в молекулах ДНК. Это может непосредственно вызвать возникновение мутаций ДНК, или могут возникнуть мутации, когда клетка попытается восстановить повреждение ДНК. По мере накопления этих мутаций они в конечном итоге приводят к гибели клеток.

Рентгеновские лучи и гамма-лучи легко проникают в бумагу и пластик и поэтому могут использоваться для стерилизации многих упакованных материалов. В лаборатории ионизирующее излучение обычно используется для стерилизации материалов, которые нельзя автоклавировать, таких как пластиковые чашки Петри и одноразовые пластиковые петли для посева. В клинических условиях ионизирующее излучение используется для стерилизации перчаток, внутривенных трубок и других изделий из латекса и пластика, используемых для ухода за пациентами. Ионизирующее излучение также используется для стерилизации других типов чувствительных к теплу материалов, используемых в клинической практике, включая ткани для трансплантации, фармацевтические препараты и медицинское оборудование.

В Европе широко используется гамма-облучение для консервов , хотя в Соединенных Штатах оно медленно приживается. Упакованные сушеные специи также часто подвергаются гамма-облучению. Из-за их способности проникать в бумагу, пластик, тонкие листы дерева и металла, а также ткани, необходимо соблюдать большую осторожность при использовании рентгеновских лучей и гамма-излучения. Эти типы ионизирующего излучения не могут проникать через толстые слои железа или свинца, поэтому эти металлы обычно используются для защиты людей, которые могут быть потенциально подвержены воздействию.

Другой тип излучения, неионизирующее излучение , обычно используется для стерилизации и потребляет меньше энергии, чем ионизирующее излучение. Не проникает в клетки или упаковку. Ультрафиолетовый (УФ) свет является одним из примеров; он вызывает образование димера тимина s между соседними тиминами в одной цепи ДНК. Когда ДНК-полимераза сталкивается с димером тимина, она не всегда включает соответствующие комплементарные нуклеотиды (два аденина), и это приводит к образованию мутаций, которые в конечном итоге могут убить микроорганизмы.

Ультрафиолетовый свет

может эффективно использоваться как потребителями, так и лабораторным персоналом для контроля роста микробов. Ультрафиолетовые лампы в настоящее время обычно включаются в системы очистки воды для использования в домашних условиях. Кроме того, туристы обычно используют небольшие портативные ультрафиолетовые лампы для очистки воды от естественной среды перед употреблением. Бактерицидные лампы также используются в хирургических кабинетах, шкафах биологической безопасности s и переносных колпаках, обычно излучающих ультрафиолетовый свет с длиной волны 260 нм.Поскольку УФ-свет не проникает через поверхности и не проходит через пластик или стекло, клетки должны подвергаться прямому воздействию источника света.

Солнечный свет имеет очень широкий спектр, который включает УФ и видимый свет. В некоторых случаях солнечный свет может быть эффективным против определенных бактерий как из-за образования димеров тимина под действием УФ-света, так и из-за образования продуктов реактивного кислорода, индуцированных в небольших количествах под воздействием видимого света.

Рис. 8. (a) УФ-излучение вызывает образование димеров тимина в ДНК, что приводит к летальным мутациям в облученных микробах.(б) Бактерицидные лампы, излучающие УФ-свет, обычно используются в лаборатории для стерилизации оборудования.

Подумай об этом

  • Каковы два преимущества ионизирующего излучения как метода стерилизации?
  • Как эффективность ионизирующего излучения сравнивается с эффективностью неионизирующего излучения?

Облученная пища: вы бы ее съели?

Из всех способов предотвращения порчи продуктов и болезней пищевого происхождения гамма-облучение может быть самым неаппетитным.Хотя гамма-облучение является проверенным методом устранения потенциально вредных микробов из пищевых продуктов, общественность еще не поверила этому. Однако большая часть их опасений связана с дезинформацией и плохим пониманием основных принципов излучения.

Наиболее распространенный метод облучения заключается в воздействии на пищу кобальта-60 или цезия-137 путем пропускания их через радиационную камеру на конвейерной ленте. Пища не контактирует напрямую с радиоактивным материалом и сама не становится радиоактивной.Таким образом, отсутствует риск облучения радиоактивным материалом при употреблении в пищу продуктов, облученных гамма-излучением. Кроме того, питательные свойства облученных продуктов существенно не меняются, за исключением потери некоторых витаминов, которая также усугубляется длительным хранением. Изменение вкуса или запаха может происходить в облученных пищевых продуктах с высоким содержанием жира, таких как жирное мясо и молочные продукты, но этот эффект можно свести к минимуму, используя более низкие дозы радиации при более низких температурах.

В США CDC, Агентство по охране окружающей среды (EPA) и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) сочли облучение безопасным и эффективным для различных видов мяса, птицы, моллюсков, свежих фруктов и овощей, яиц в скорлупе, и специи и приправы.Гамма-облучение пищевых продуктов также одобрено для использования во многих других странах, включая Францию, Нидерланды, Португалию, Израиль, Россию, Китай, Таиланд, Бельгию, Австралию и Южную Африку. Чтобы облегчить беспокойство потребителей и способствовать усилиям по обучению, облученные продукты теперь четко маркируются и маркируются международным символом облучения, называемым «радура». Принятие со стороны потребителей, похоже, растет, о чем свидетельствуют несколько недавних исследований.

(а) Пищевые продукты подвергаются гамма-излучению при прохождении по конвейерной ленте через радиационную камеру.(b) Гамма-облученные продукты должны иметь четкую маркировку и иметь символ облучения, известный как «радура». (кредит a, b: модификация работы Министерства сельского хозяйства США)

Ультразвуковой

Использование высокочастотных ультразвуковых волн для разрушения клеточных структур называется ультразвуковой обработкой . Применение ультразвуковых волн вызывает быстрые изменения давления во внутриклеточной жидкости; это приводит к кавитации , образованию пузырьков внутри клетки, которые могут разрушить клеточные структуры и в конечном итоге вызвать лизис или коллапс клетки.Обработка ультразвуком полезна в лаборатории для эффективного лизирования клеток с целью высвобождения их содержимого для дальнейших исследований; За пределами лаборатории обработка ультразвуком используется для очистки хирургических инструментов, линз и множества других предметов, таких как монеты, инструменты и музыкальные инструменты.

Фильтрация

Фильтрация — это метод физического отделения микробов от образцов. Воздух обычно фильтруется через высокоэффективные воздушные фильтры для твердых частиц (HEPA) . Фильтры HEPA имеют эффективный размер пор 0.3 мкм, достаточно маленький, чтобы улавливать бактериальные клетки, эндоспоры и многие вирусы, когда воздух проходит через эти фильтры, почти стерилизуя воздух с другой стороны фильтра. Фильтры HEPA имеют множество применений и широко используются в клинических условиях, в автомобилях и самолетах и ​​даже в домашних условиях. Например, их можно найти в пылесосах, системах отопления и кондиционирования воздуха, а также в очистителях воздуха.

1 мкм), когда частица заклинивает между волокнами. Диффузия (<0,01) - это когда частица перемещается между волокнами."data-media-type =" image / jpeg "> Рис. 10. (a) HEPA-фильтры, подобные этому, удаляют микробы, эндоспоры и вирусы при прохождении через них воздуха. (b) Схема HEPA-фильтра. (предоставлено a : модификация работы CSIRO; кредит b: модификация работы «LadyofHats» / Мариана Руис Вильярреаль)

Шкафы биологической безопасности

Шкафы биологической безопасности — хороший пример использования НЕРА-фильтров. HEPA-фильтры в шкафу биологической безопасности s (BSC) используются для удаления твердых частиц из воздуха, которые либо попадают в шкаф (воздухозаборник), либо покидают шкаф (выпуск воздуха), либо обрабатывают как воздухозаборник, так и выхлоп.Использование HEPA-фильтра для забора воздуха предотвращает попадание загрязняющих веществ из окружающей среды в BSC, создавая чистую зону для работы с биологическими материалами. Использование вытяжного HEPA-фильтра предотвращает заражение лаборатории патогенами в лаборатории, тем самым обеспечивая безопасную рабочую зону для персонала лаборатории.

Существует три класса BSC: I, II и III. Каждый класс разработан для обеспечения разного уровня защиты лабораторного персонала и окружающей среды; BSC II и III также предназначены для защиты материалов или устройств в шкафу.В таблице ниже суммирован уровень безопасности, обеспечиваемый каждым классом BSC для каждого BSL.

Биологические риски и BSC
Оценка биологического риска BSC Класс Защита персонала Охрана окружающей среды Защита продукта
BSL-1, BSL-2, BSL-3 I Есть Есть Нет
BSL-1, BSL-2, BSL-3 II Есть Есть Есть
BSL-4 III; II при использовании в номере костюма с костюмом Есть Есть Есть

BSC класса I защищают лабораторных работников и окружающую среду от низкого или умеренного риска воздействия биологических агентов, используемых в лаборатории.Воздух втягивается в шкаф, а затем фильтруется перед выходом через вытяжную систему здания. BSC класса II используют направленный воздушный поток и частичные барьерные системы для сдерживания инфекционных агентов. BSC класса III предназначены для работы с высокоинфекционными агентами, подобными тем, которые используются в лабораториях BSL-4 . Они газонепроницаемы, и материалы, входящие в шкаф или выходящие из него, должны проходить через систему с двойными дверцами, позволяющую обеззараживать промежуточное пространство между использованиями. Весь воздух проходит через один или два HEPA-фильтра и систему сжигания воздуха, а затем выходит прямо на улицу (не через вытяжную систему здания).Персонал может работать с материалами внутри шкафа класса III, используя длинные резиновые перчатки, прикрепленные к шкафу.

В этом видео показано, как проектируются BSC, и объясняется, как они защищают персонал, окружающую среду и продукт.

Фильтрация в больницах

Фильтры

HEPA также широко используются в больницах и хирургических кабинетах для предотвращения заражения и распространения переносимых по воздуху микробов через системы вентиляции. Системы фильтрации HEPA могут быть спроектированы как для целых зданий, так и для отдельных помещений.Например, ожоговые отделения, операционные или изоляционные отделения могут потребовать специальных систем фильтрации HEPA для удаления условно-патогенных микроорганизмов из окружающей среды, поскольку пациенты в этих палатах особенно уязвимы для инфекции.

Мембранные фильтры

Фильтрация также может использоваться для удаления микробов из жидких образцов с помощью мембранной фильтрации . Мембранные фильтры для жидкостей работают аналогично фильтрам HEPA для воздуха. Обычно мембранные фильтры, используемые для удаления бактерий, имеют эффективный размер пор 0.2 мкм, что меньше среднего размера бактерии (1 мкм), но фильтры с меньшими размерами пор доступны для более специфических нужд. Мембранная фильтрация полезна для удаления бактерий из различных типов термочувствительных растворов, используемых в лаборатории, таких как растворы антибиотиков и растворы витаминов. Большие объемы культуральной среды также можно стерилизовать фильтрованием, а не автоклавировать для защиты термочувствительных компонентов. Часто при фильтрации небольших объемов используются шприцевые фильтры , но вакуумные фильтры обычно используются для фильтрации больших объемов.

Рисунок 11. Мембранные фильтры бывают разных размеров в зависимости от объема фильтруемого раствора. (а) Большие объемы фильтруются в таких единицах. Раствор пропускается через фильтр при подключении устройства к вакууму. (б) Меньшие объемы часто фильтруются с использованием шприцевых фильтров, которые устанавливаются на конце шприца. В этом случае раствор проталкивается нажатием на поршень шприца. (кредит а, б: модификация работы Брайана Форстера)

Подумай об этом

  • Будет ли мембранная фильтрация с 0.Фильтр 2 мкм, скорее всего, удалит вирусы из раствора? Объяснять.
  • Назовите хотя бы два распространенных использования HEPA-фильтрации в клинических или лабораторных условиях.

Резюме: Физические методы борьбы с микроорганизмами

В таблицах ниже приведены физические методы управления, обсуждаемые в этом разделе.

Таблица 1. Методы контроля с использованием тепла
Метод Условия Режим действия Пример использования
Кипячение 100 ° C на уровне моря Денатурирует белки и изменяет мембраны Приготовление пищи, личное использование, приготовление некоторых лабораторных сред
Сухой жарочный шкаф 170 ° C в течение 2 часов Денатурирует белки и изменяет мембраны, обезвоживание, обезвоживание Стерилизация термостойкого медицинского и лабораторного оборудования и посуды
Сжигание Воздействие пламени Уничтожить сжиганием Петля пламенная, микроинсинератор
Автоклав Стандартные настройки: 121 ° C в течение 15–40 минут при давлении 15 фунтов на кв. Дюйм Денатурирует белки и изменяет мембраны Стерилизация микробиологических сред, термостойкого медицинского и лабораторного оборудования и других термостойких предметов
Пастеризация 72 ° C в течение 15 секунд (HTST) или 138 ° C в течение ≥ 2 секунд (UHT) Денатурирует белки и изменяет мембраны Предотвращает порчу молока, яблочного сока, меда и других легко перевариваемых жидкостей
Таблица 2.Методы контроля с использованием холода
Метод Условия Режим действия Пример использования
Холодильное оборудование от 0 ° C до 7 ° C Подавляет метаболизм (замедляет или останавливает деление клеток) Консервация пищевых продуктов или лабораторных материалов (растворов, культур)
Замораживание Ниже −2 ° C Останавливает метаболизм, может убивать микробы Долгосрочное хранение пищевых продуктов, лабораторных культур или медицинских образцов
Таблица 3.Методы управления давлением
Метод Условия Режим действия Пример использования
Обработка под высоким давлением Воздействие давления 100–800 МПа Денатурирует белки и может вызывать лизис клеток Консервация продуктов
Гибербарическая оксигенотерапия Вдыхание чистого кислорода при давлении 1–3 атм. Подавляет метаболизм и рост анаэробных микробов Лечение некоторых инфекций (например,г., газовая гангрена)
Таблица 4. Методы контроля с использованием Dessication
Метод Условия Режим действия Пример использования
Простое обезвоживание Сушка Подавляет метаболизм Сухофрукты вяленое
Уменьшить активность воды Добавление соли или воды Подавляет метаболизм и может вызывать лизис Соленое мясо и рыба, мед, джемы и мармеладки
Лиофилизация Быстрое замораживание в вакууме Подавляет метаболизм Консервация пищевых продуктов, лабораторных культур или реагентов
Таблица 5.Методы радиационного контроля
Метод Условия Режим действия Пример использования
Ионизирующее излучение Воздействие рентгеновских лучей или гамма-лучей Изменяет молекулярные структуры, вводит двухцепочечные разрывы в ДНК Стерилизация специй и термочувствительных лабораторных и медицинских изделий; используется для стерилизации пищевых продуктов в Европе, но не получил широкого распространения в США.
Неионизирующее излучение Воздействие ультрафиолета Вводит димеры тимина, приводя к мутациям Поверхностная стерилизация лабораторных материалов, очистка воды
Таблица 6.Методы контроля с использованием ультразвуковой обработки
Метод Условия Режим действия Пример использования
Обработка ультразвуком Воздействие ультразвуковых волн Кавитация (образование пустого пространства) разрушает клетки, лизируя их Лабораторные исследования по лизису клеток; чистка ювелирных изделий, линз и оборудования
Таблица 7. Методы контроля с использованием фильтрации
Метод Условия Режим действия Пример использования
Фильтрация HEPA Использование высокоэффективного воздушного фильтра (HEPA) с фильтром 0.Размер пор 3 мкм Физически удаляет микробы из воздуха Лабораторные шкафы биологической безопасности, операционные, изоляторы, системы отопления и кондиционирования, пылесосы
Мембранная фильтрация Использование мембранного фильтра с размером пор 0,2 мкм или меньше Физически удаляет микробы из жидких растворов Удаление бактерий из термочувствительных растворов, таких как витамины, антибиотики и сред с термочувствительными компонентами

Ключевые концепции и резюме

  • Тепло — широко используемый и высокоэффективный метод контроля роста микробов.
  • Стерилизация сухим жаром Протоколы обычно используются в лабораторных асептических методах. Однако стерилизация влажным теплом обычно является более эффективным протоколом, поскольку он проникает в клетки лучше, чем сухой жар.
  • Пастеризация используется для уничтожения патогенов и уменьшения количества микробов, вызывающих порчу пищевых продуктов. Высокотемпературная краткосрочная пастеризация обычно используется для пастеризации молока, которое будет охлаждено; сверхвысокотемпературная пастеризация может использоваться для пастеризации молока для длительного хранения без охлаждения.
  • Охлаждение замедляет рост микробов; замораживание останавливает рост, убивая некоторые организмы. Лабораторные и медицинские образцы можно замораживать на сухом льду или при сверхнизких температурах для хранения и транспортировки.
  • Обработка под высоким давлением может использоваться для уничтожения микробов в продуктах питания. Гипербарическая оксигенотерапия для увеличения насыщения кислородом также используется для лечения некоторых инфекций.
  • Desiccation уже давно используется для консервирования продуктов и ускоряется за счет добавления соли или сахара, которые снижают активность воды в продуктах питания.
  • Лиофилизация сочетает в себе воздействие холода и сушку для длительного хранения пищевых продуктов и лабораторных материалов, но микробы остаются и могут быть регидратированы.
  • Ионизирующее излучение , включая гамма-излучение, является эффективным способом стерилизации термочувствительных и упакованных материалов. Неионизирующее излучение , как и ультрафиолетовый свет, не может проникать через поверхности, но полезно для стерилизации поверхностей.
  • Фильтрация HEPA обычно используется в больничных системах вентиляции и шкафах биологической безопасности в лабораториях для предотвращения передачи переносимых по воздуху микробов. Мембранная фильтрация обычно используется для удаления бактерий из термочувствительных растворов.

Множественный выбор

Какой из следующих методов вызывает лизис клеток из-за кавитации, вызванной быстрыми локальными изменениями давления?

  1. микроволновая печь
  2. гамма-облучение
  3. ультрафиолетовое излучение
  4. обработка ультразвуком

[показать-ответ q = ”544035 ″] Показать ответ [/ показать-ответ]
[скрытый-ответ a =” 544035 ″] d.Обработка ультразвуком вызывает лизис клеток из-за кавитации, вызванной быстрыми локальными изменениями давления. [/ Hidden-answer]

Какой из следующих терминов используется для описания времени, необходимого для уничтожения всех микробов в образце при данной температуре?

  1. Д-значение
  2. точка термической смерти
  3. время термической смерти
  4. время десятичной редукции

[показать-ответ q = ”9 ″] Показать ответ [/ показать-ответ]
[скрытый-ответ a =” 9 ″] c.Время термической смерти описывает время, необходимое для уничтожения всех микробов в образце при заданной температуре. [/ Hidden-answer]

Какой из следующих методов микробного контроля на самом деле не убивает микробы и не подавляет их рост, а вместо этого физически удаляет их из образцов?

  1. фильтрация
  2. обезвоживание
  3. лиофилизация
  4. неионизирующее излучение

[раскрыть-ответ q = ”677638 ″] Показать ответ [/ раскрыть-ответ]
[скрытый-ответ a =” 677638 ″] а.Фильтрация на самом деле не убивает микробы и не препятствует их росту, а вместо этого физически удаляет их из образцов. [/ Hidden-answer]

Заполните бланк

В автоклаве давление на ________ увеличивается, чтобы пар достиг температуры выше точки кипения воды.

[show-answer q = ”224047 ″] Показать ответ [/ show-answer]
[hidden-answer a =” 224047 ″] В автоклаве давление на пар увеличивается, чтобы дать пару температуры выше точки кипения воды.[/ hidden-answer]

Верно / Неверно

Ионизирующее излучение может проникать через поверхности, а неионизирующее излучение — нет.

[show-answer q = ”64519 ″] Показать ответ [/ show-answer]
[hidden-answer a =” 64519 ″] Верно [/ hidden-answer]

Протоколы стерилизации влажным жаром требуют использования более высоких температур в течение более длительных периодов времени, чем протоколы стерилизации сухим жаром.

[show-answer q = ”332341 ″] Показать ответ [/ show-answer]
[hidden-answer a =” 332341 ″] Неверно [/ hidden-answer]

Подумай об этом

  1. В чем преимущество пастеризации HTST по сравнению со стерилизацией? В чем преимущество УВТ-лечения?
  2. Как добавление соли или сахара помогает сохранить пищу?
  3. Что более эффективно при уничтожении микробов: автоклавирование или замораживание? Объяснять.
  4. В 2001 году эндоспоры Bacillus anthracis , возбудителя сибирской язвы, были отправлены правительственным чиновникам и информационным агентствам по почте. В ответ Почтовая служба США начала облучать почту ультрафиолетовым светом. Была ли это эффективная стратегия? Почему или почему нет?

Быстрые методы тестирования эффективности стерилизационных фильтрующих мембран

Abstract

Валидация стерилизационных мембран является неотъемлемой частью обеспечения эффективного и безопасного использования систем микрофильтрации.Здесь валидация относится к производству стерильного фильтрата для стерилизующих мембран в условиях контрольного испытания. Текущие методы проверки требуют 48 часов культуры, чтобы результаты стали доступными, что приводит к задержкам в производственном процессе и задержкам контроля качества (QC). В этой работе сравниваются четыре метода получения данных теста с заражением фильтром с желаемой чувствительностью теста в течение 24 часов с использованием биолюминесцентных и флуоресцентных рекомбинантных штаммов тестируемого организма Brevundimonas diminuta .Эти методы должны обеспечить возможность реализации более быстрых режимов тестирования QC для фильтров.

Стерильность фармацевтических препаратов имеет решающее значение для гарантии их безопасного использования. Однако, когда термолабильные продукты, например инсулин, нельзя окончательно стерилизовать автоклавированием, микрофильтрация является хорошей неинвазивной альтернативой. Отказ фильтра может привести не только к небезопасным фармацевтическим и пищевым продуктам, но и к потере доходов в промышленности. Введение в организм пациентов загрязняющих веществ, например бактерий и пирогенов из парентеральных препаратов, может привести к летальному исходу.Следовательно, для обеспечения эффективности стерилизации необходимы эффективные методы проверки фильтров. Целью этого проекта было сокращение времени тестирования целостности бактерий.

В настоящее время фильтры проходят испытание с использованием одной из самых маленьких известных бактерий, Brevundimonas diminuta ATCC 19146. Тест позволяет обнаруживать 1 КОЕ на фильтрат, что может быть большим объемом. Для мембран с размером пор 0,2 мкм, пригодных для стерилизации, фильтрат не должен содержать возбуждающих организмов в соответствии с нормативными требованиями (9).Тестирование с вызовом требует 48 часов для развития колонии, а временная задержка создает проблемы для производителей фильтров. Молекулярные ДНК-тесты, например, методы ПЦР и гибридизации зондов, полезны и быстры для подсчета бактерий, но эти методы не обязательно подтверждают жизнеспособность обнаруженных организмов, они дороги и технически сложны.

Здесь мы сообщаем о создании рекомбинантного B. diminuta , несущего гены, кодирующие бактериальную люциферазу (13) или зеленый флуоресцентный белок (GFP) (5).Эти рекомбинанты были протестированы вместе с различными системами обнаружения на их пригодность для улучшения быстрых анализов целостности фильтров.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактерии и плазмиды.

Использованные бактерии и плазмиды показаны в таблице. Для экспериментов по клонированию все бактерии выращивали с использованием бульона Лурия и агара Лурия (16), и все антибиотики поставлялись компанией Sigma (Пул, Великобритания). Ферменты были поставлены Life Technologies (Gibco BRL).

ТАБЛИЦА 1

Бактерии и плазмиды, использованные в этом исследовании

  • p Американская коллекция типовых культур
  • 920BS4 pBSLLUX2
  • 72 pBSLLUX2
  • 72 Это исследование генов (13)
  • Штамм или плазмида Источник или ссылка Комментарии
    E.coli DH5α Американская коллекция типовых культур supE44 Δlac U169 (φ80 lacZ ΔM15) hsd R17 recA1 gyrA96 thi-1 relA1 (16)
    RP4; pir лизоген (15)
    B. diminuta ATCC 19146 Pall Europe Limited Фильтровать тестовый штамм (2)
    pSfi390 S.Swift pUC18 (16), содержащий lux генов из P. luminescens ATCC 29999 (13)
    pUTLUXAB G. Stewart RP4 oriT, плазмида R6K, резистентность к Tn 5 : содержащая гена luxAB из Vibrio harveyi (6)
    pVAGFP S. Taylor Плазмида pVAGFP, содержащая мутантный ген GFP (5)
    pBSLGFP1 Настоящее исследование pBSL204 с геном gfp (5)
    pBSL204 Департамент молекулярной клеточной биологии, Утрехт, Нидерланды Tn 5 :: кассета устойчивости к тетрациклину (1)
    Конструирование плазмид.

    pBSLLUX2 содержит гены luxABCDE (13) из Photorhabdus luminescens из pSfi390 (С. Свифт [Ноттингемский университет], неопубликованные данные), клонированные в сайт Eco RI pBSL204 (1). pBSLGFP1 имеет gfp (5) из pVAgfp (S. Taylor [Leicester University], неопубликованные данные), клонированный в сайт Bam HI pBSL204. Вся ДНК была получена методом щелочного лизиса (16) с использованием Escherichia coli S17-1λ pir в качестве хозяина для pBSL204 и E.coli DH5α в качестве хозяина для pSfi390 и pVAgfp. Рекомбинантные плазмиды трансформировали в E. coli с помощью электропорации (16). Рекомбинанты отбирали на агаре Лурия, содержащем тетрациклин (5 мкг / мл) и ампициллин (50 мкг / мл).

    Биолюминесцентные рекомбинанты идентифицировали с помощью рентгеновской пленки (Bio-Rad) в течение 10 минут, а флуоресцентные рекомбинанты выявляли на селекционных планшетах путем визуального осмотра с использованием эпифлуоресцентной микроскопии (Zeiss) при увеличении × 25.

    Ориентацию вставки гена в рекомбинантные плазмиды определяли рестрикционным перевариванием Bst XI и двойным расщеплением Not I / Nde I для pBSLLUX2 и pBSLGFP1 соответственно.Сайты Bst, XI в pBSLLUX2 были идентифицированы с использованием данных Alexeyev et al. (1) и Мейген и Ситтнер (13) (инвентарный номер GenBank {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «M

    «, «term_id»: «155411», «term_text»: «M

    «}} M

    ). Сайты Not I и Nde I в pBSLGFP1 были идентифицированы с использованием данных Alexeyev et al. (1) и Cormack et al. (5) (инвентарный номер GenBank {«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: «U73901», «term_id»: «1658074», «term_text»: «U73901»}} U73901) .Было показано, что ориентация клонированных генов находится в направлении от 5 ‘к 3’ относительно дистального конца транспозона, Tn 5 . Такая ориентация позволяет инициировать транскрипцию клонированных генов с промотора B. diminuta после встраивания в хромосому.

    Трансформация

    B. diminuta.

    Плазмиды pUTLUXAB (6), pBSLLUX2 и pBSLGFP1 были введены в B. diminuta путем фильтрования между донором ( E.coli S17-1λpir) и реципиент (6). Рекомбинанты отбирали на агаре Луриа, содержащем тетрациклин (5 мкг / мл) и рифампицин (50 мкг / мл), и инкубировали в течение 72 часов при 30 ° C. Биолюминесцентные и флуоресцентные рекомбинантные колонии идентифицировали, как описано выше. Биолюминесценцию рекомбинантов, полученных из спариваний pUTLUXAB, индуцировали добавлением 10 мкл 1% (об. / Об.) Деканаля (Sigma) в этаноле к крышке чашки Петри.

    Биолюминесценция рекомбинантов, дающих наиболее сильные сигналы на рентгеновской пленке, была подтверждена и количественно определена с помощью микротитровального планшета с использованием люминометра Luminoskan RS (Labsystems, Бейзингсток, Великобритания), в котором 10 мкл 1% (об. / Об.) Деканального раствора в этанол добавляли в каждую лунку перед измерением.Флуоресценцию производных рекомбинантов B. diminuta :: pBSLGFP1 определяли количественно с использованием флуороспектрофотометра (модель RF1501; Shimadzu) с низким усилением.

    Характеристика

    рекомбинантов B. diminuta .

    Биохимические испытания рекомбинантных штаммов B. diminuta с использованием тест-наборов API 20 NE и API ZYM (Biomerieux) проводили в соответствии с инструкциями производителя. Были проведены тесты на каталазу и оксидазу, окрашивание по Граму и тесты на подвижность с использованием метода висящей капли (4).Все тесты проводились параллельно с B. diminuta ATCC 19146 в качестве контроля дикого типа.

    Размер клеток определяли с помощью просвечивающей электронной микроскопии с использованием метода фиксации уранилацетатом (14). Размер также косвенно измеряли с использованием стандартного протокола контрольного заражения (2). Для этого все бактериальные штаммы выращивали в физиологическом растворе лактозы (SLB) (хлорид натрия [7,6 г / литр] и лактоза [0,39 г / литр]) статически в течение 24 часов при 30 ° C и использовали для проверки мембран фильтров (размер пор , 0.2 и 0,45 мкм; Pall) в стерильном фильтродержателе Sterilfil (Millipore). Фильтраты пропускали через стерильную предварительно аттестованную мембрану для анализа с размером пор 0,1 мкм, которую инкубировали с TSA в течение 48 ч при 30 ° C, как описано ранее (2).

    Скорости роста рекомбинантного и дикого типа B. diminuta определяли в триптическом соевом бульоне (Oxoid) при 30 ° C со встряхиванием (200 об / мин). Количество жизнеспособных клеток определяли серийным разведением в 0,9% (мас. / Об.) Физиологическим раствором и нанесением на TSA.

    Анализ гидрофобности присоединения бактерий к углеводородам (7) проводили путем оценки распределения B.диминута в n -октан. Относительный чистый заряд клеток определяли методом электростатической хроматографии взаимодействия (7) с использованием катионита CM-S CL-6B и анионообменной смолы DEAE-S CL-6B (Pharmacia).

    Биолюминесцентное обнаружение с помощью камеры с зарядовой связью (ПЗС) Nightowl.

    Рекомбинантные штаммы B. diminuta (pUTLUXAB и pBSLLUX2) выращивали в триптическом соевом бульоне при 30 ° C в течение 24 часов при встряхивании (200 об / мин). Культуру разбавляли физиологическим раствором до 50 бактерий на мл, и различные объемы пипетировали в фильтродержатель Sterilfil (Millipore), содержащий 10 мл физиологического раствора, и фильтровали через фильтр 0.Мембрана Durapore (Millipore) с размером пор 22 мкм с использованием вакуума (0,7 × 10 5 Па). Каждую мембрану помещали на TSA, и измерения биолюминесценции проводились через различные интервалы времени.

    Мембраны сканировали на биолюминесценцию с использованием четырех комбинаций настроек сканирования с камерой CCD (EG&G Wallac Berthold, Wildbad, Germany). Во всех случаях дистанция фокусировки была установлена ​​на расстоянии 77 мм от мембраны и выбрано низкое разрешение.

    Все мембраны сканировали в течение 1 или 60 мин (с вычитанием фона и без него) через 6–48 ч инкубации на TSA при 30 ° C.Для всех методов обнаружения с использованием B. diminuta (pUTLUXAB) светообразование индуцировали путем воздействия на колонии 10 мкл 10% (об. / Об.) Деканаля в этаноле, добавленных к крышке чашки Петри. Количество видимых колоний на тестовой мембране определяли невооруженным глазом после 48 ч инкубации. Чувствительность обнаружения для каждой мембраны рассчитывалась в соответствии с методом, изложенным Линардакисом и Хачатряном (11). Истинно положительным был световой сигнал, обнаруженный через 24 часа, и рост, видимый глазом, через 48 часов.Ложноотрицательный результат — колония без детектируемой люминесценции через 24 часа, но которая была видна через 48 часов.

    Биолюминесцентное обнаружение с помощью ПЗС-камеры рабочей станции Nucleovision.

    B. diminuta (pUTLUXAB) использовали для оценки чувствительности обнаружения микроколоний с помощью рабочей станции Nucleovision (Nucleotech Ltd.). Все мембранные препараты были выполнены, как описано для системы Nightowl, за исключением использования черных мембран Isopore с размером пор 0,2 мкм (Millipore). Тестовые мембраны инкубировали на TSA при 30 ° C в течение 48 часов и сканировали в течение 1, 5 и 20 минут после инкубации в течение 12-48 часов.Все параметры сканирования были предварительно заданы для машины. Пустые контрольные мембраны сканировали через 12-48 ч инкубации. Чувствительность рассчитывалась как для системы Nightowl.

    Биолюминесцентное измерение люминометром Bioprobe.

    Тестовые мембраны были приготовлены, как описано для системы Nightowl. По меньшей мере 10 образцов мембран в асептических условиях помещали на стерилизованную метанолом тестовую пластину (Hughes Whitlock, Monmouth, United Kingdom) и снимали показания, используя время сбора света 30 с.Количество видимых колоний на тестовой мембране определяли через 48 ч инкубации. Десять контрольных пустых мембран были протестированы для расчета пределов фонового шума для люминометра. Пределы фона рассчитывали как среднее значение люминесценции плюс два стандартных отклонения (SD).

    Эпифлуоресцентное обнаружение

    микроколоний B. diminuta (pBSLGFP1).

    Тестовые культуры и мембраны получали, как описано для Nightowl, с использованием черных мембран Isopore с размером пор 0,2 мкм.Мембраны проверяли на наличие флуоресцентных микроколоний с помощью эпифлуоресцентной микроскопии после инкубации при 30 ° C на TSA в течение 0, 12, 24 и 48 часов. Использовали общее увеличение × 25, источник света на парах ртути (Zeiss) и флуоресцентный светофильтр (Zeiss). Чувствительность рассчитывалась как для Nighttowl, за исключением того, что истинно положительным результатом была флуоресцентная микроколония, видимая через 24 часа.

    Статистический анализ.

    Все статистические тесты (односторонний дисперсионный анализ) были выполнены с использованием Graphpad Instat (8).

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Конструирование биолюминесцентных и флуоресцентных

    штаммов B. diminuta .

    Плазмиды pBSLGFP1 и pBSLLUX2 были сконструированы, как описано в разделе «Материалы и методы», для обеспечения возможности вставки gfp и luxABCDE в хромосому B. diminuta после спаривания на фильтре. Десять из каждого набора рекомбинантов B. diminuta , дающих наиболее сильные сигналы на рентгеновской пленке, были отобраны для дальнейшего анализа биолюминесценции, как описано в разделе «Материалы и методы».Из этих экспериментов два штамма, которые производили самую сильную биолюминесценцию после 24 и 48 часов инкубации, были выбраны для быстрого тестирования с заражением фильтром и были обозначены ab5 (pUTLUXAB) и ae3 (pBSLLUX2). Было обнаружено, что штамм ab5 примерно в 200 раз более биолюминесцентный, чем штамм ae3 после 48 часов инкубации.

    Рекомбинант, полученный из pBSLGFP1, был выбран с использованием эпифлуоресцентной микроскопии. Не все рекомбинанты давали одинаковый уровень флуоресценции, и поэтому 10 рекомбинантов с наибольшей флуоресценцией были отобраны для дальнейшего анализа, как указано в разделе «Материалы и методы».Штаммом, дающим наиболее сильную флуоресценцию после 24 и 48 ч инкубации, был штамм gf3. Следовательно, этот штамм был выбран для экспресс-тестирования фильтра.

    Характеристика

    рекомбинантных штаммов B. diminuta .

    Рекомбинантный штамм B. diminuta сравнивали со штаммом B. diminuta дикого типа ATCC 19146, используемым в настоящее время для тестирования заражения. Рекомбинантные штаммы ab5, ae3 и gf3 были идентичны дикому типу в 43 диагностических тестах, описанных в разделе «Материалы и методы».Размер клеток определяли с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Не было значительной разницы ( P > 0,05) в размерах рекомбинантных организмов и организмов дикого типа. В таблице показаны средние размеры клеток для всех штаммов B. diminuta .

    ТАБЛИЦА 2

    Сводка характеристических испытаний a

    B. diminuta штамм Длина клетки (мкм) Ширина клетки (мкм) Время генерации (ч) % Соблюдение :


    Октан ДЭАЭ-Сефароза CM-Сефароза
    Дикий тип 1.05 (0,05) 0,52 (0,09) 0,99 (0,01) 16,7 (2,2) 96,8 (1,5) 32,1 (3,2)
    ae3 1,04 (0,05) 0,51 (0,09) ) 1,01 (0,04) 18,0 (1,4) 90,7 (13,2) 30,9 (1,7)
    ab5 1,03 (0,07) 0,42 (0,09) 0,97 (0,06) 17,8 (1,4) 95,9 (1,1) 31,5 (2,2)
    gf3 1.02 (0,09) 0,43 (0,05) 0,95 (0,07) 18,1 (2,5) 96,6 (1,6) 30,1 (1,9)

    Поскольку на размер ячейки может влиять скорость роста, рассчитано среднее время генерации. Не было существенной разницы ( P > 0,05) в средних временах генерации рекомбинантных организмов и организмов дикого типа (таблица). Чистый заряд и гидрофобность могут влиять на адсорбцию бактериальных клеток на фильтрующей среде, но существенной разницы не было ( P > 0.05) в сетевом заряде клетки или гидрофобности рекомбинантных организмов и организмов дикого типа (таблица).

    Проверочные тесты фильтров.

    Чтобы продемонстрировать пригодность рекомбинантных штаммов для тестирования с заражением фильтром, их сравнивали в условиях теста с заражением фильтром. Фильтры Палла (размер пор 0,2 и 0,45 мкм) заражали суспензиями клеток рекомбинантного и дикого типа B. diminuta . Эффективность удерживания штаммов сравнивали с использованием значения log уменьшения.Ни одна из проблем стерилизующих фильтров с размером пор 0,2 мкм не привела к появлению бактерий в фильтратах контрольных тестов.

    При испытании фильтров с размером пор 0,45 мкм не было существенной разницы ( P > 0,05) в удерживании различных штаммов B. diminuta . Средние значения логарифма снижения по меньшей мере из 12 экспериментов составили 5,54 ± 1,99, 6,58 ± 4,03, 6,04 ± 2,17 и 6,80 ± 4,76 для штаммов ab5, ae3 и gf3 и дикого типа, соответственно.

    Методы детекции биолюминесценции.(i) ПЗС-камера Nightowl.

    С штаммами B. diminuta ae3 и ab5 и штаммами B. diminuta дикого типа , действующими в качестве отрицательного контроля, были протестированы четыре комбинации параметров сканирования камеры CCD, как описано в разделе «Материалы и методы». Биолюминесцентные микроколонии отображались камерой в виде белых точек на черном фоне (рис.), И положение этих сигналов впоследствии сравнивалось с положением колоний, обнаруживаемых глазом через 48 часов роста. Никаких сигналов биолюминесценции на мембранах не обнаружено после 6 и 18 ч инкубации, независимо от параметров сканирования.После 48 ч инкубации все колонии, видимые невооруженным глазом, были обнаружены биолюминесценцией; т.е. чувствительность составляла 100% для каждой деформации, независимо от параметра сканирования. В таблице показана чувствительность обнаружения шести тестовых мембран после 24 ч инкубации. Как видно, чувствительность обнаружения была максимальной при использовании времени сканирования 1 мин. Остальные параметры сканирования не повлияли на чувствительность. Биолюминесценция не была обнаружена ни на каких мембранах с организмом B. diminuta дикого типа после 48 ч инкубации: на этих двух мембранах было 6 и 82 колонии.

    Сканы Nightowl, полученные с той же тестовой мембраны через 24 (а) и 48 (б) ч инкубации с использованием штамма ab5. Через 24 часа биолюминесцентные микроколонии были видны в виде белых точек на черном фоне. В этом примере 12 сигналов были обнаружены после 48 часов инкубации (b), но после 24 часов инкубации были обнаружены только 9 биолюминесцентных сигналов (a).

    ТАБЛИЦА 3

    Чувствительность обнаружения системы Nightowl при различных параметрах сканирования a

    Вычитание фона Время сканирования (мин) No.микроколоний, обнаруженных после 24-часовой инкубации b Чувствительность (%)
    Нет 1 3, 4, 7, 8, 9, 18 71.9
    Да 1 3, 4, 7, 8, 9, 18 71,9
    Да 60 3, 3, 4, 7, 5, 12 54,3
    Нет 60 3, 3, 4, 7, 5, 12 54,3

    Поскольку B.diminuta , продуцирующий деканальный, ae3, был примерно в 200 раз менее биолюминесцентным, чем штамм, требующий экзогенного деканального, ab5, чувствительность обнаружения этих двух штаммов сравнивали с использованием оптимальных параметров сканирования. Двенадцать образцов мембран сканировали на наличие биолюминесцентных микроколоний штаммов ae3 и ab5. После 48 ч инкубации чувствительность составила 100%. Через 24 часа чувствительность упала ниже 100%. Как видно из таблицы, через 24 часа инкубации средние значения SD чувствительности составили 83.9 ± 18,0% и 77,0 ± 19,3% для штаммов ab5 и ae3 соответственно. Значимой разницы в этих средних значениях не было ( P > 0,05). Из данных в таблице можно сделать вывод, что отказ фильтра, приводящий к обнаружению двух колоний по росту через 48 часов, будет обнаружен в течение 24 часов с использованием штамма ab5 и системы Nightowl.

    ТАБЛИЦА 4

    Чувствительность обнаружения для всех используемых методов обнаружения

    100

    900 100

    45,8

    068

    2068 50.0

    доwl c

    2068

    2068 100

    Метод Число видимых колоний через 48 часов % Чувствительность через 24 часа
    Эпифлуоресцентная микроскопия

    0006 94.7
    58 100
    43 93,0
    39 94.9
    35 97,15

    35 97,155

    91 96.6
    23 100
    21 100
    19 100
    100
    8 100
    7 85.7
    5 100
    4 100
    3 100
    100
    1 100
    1 100
    Nucleovision b 66 53.0
    49 65,3
    40 92,5
    35 85,7
    3 42,42068

    42,42068
    21 57,1
    16 87,5
    15 80.0
    14 92,9
    11 90,9
    10 30,0
    10 1005
    10 100 68 90.0
    7 100
    6 100
    5 80,0
    4 100
    2 100
    2 100
    1 100
    1 100
    66 77,3
    57 73,7
    46 84,8
    26 34.6
    22 72,7
    15 100
    10 50,0
    10 90,0572068

    10 90,0572068 88,9
    8 87,5
    4 100
    4 75,0
    Nightowl (ab5) 920 920 9007
    64 81,3
    33 51,5
    25 84,0
    25 1005 9007

    100
    12 75,0
    12 100
    6 83,3
    4 100 4 100
    2 50
    (ii) ПЗС-камера Nucleovision.

    Для тестирования характеристик биолюминесцентных штаммов с альтернативной системой камеры CCD использовалась камера Nucleovision CCD. Биолюминесценция не была обнаружена после инкубации мембран в течение 12 и 18 часов при времени сканирования 1, 5 или 20 минут. После инкубации мембран в течение 24 часов, только слабая биолюминесценция была обнаружена после времени сканирования 20 мин из-за накопления фонового шума, и только слабые сигналы были обнаружены при времени сканирования 1 мин. Однако при времени сканирования 5 мин были обнаружены сильные сигналы биолюминесценции.Сигналы биолюминесценции не были обнаружены на какой-либо мембране отрицательного контроля с использованием организма B. diminuta дикого типа через 24 или 48 ч инкубации: на этих двух мембранах было 10 и 63 колонии.

    После 48 ч инкубации мембран чувствительность обнаружения составила 100% при сканировании в течение 5 мин. Как видно из таблицы, в течение 24 часов требуемая чувствительность для определения неудачной попытки проверки фильтра была получена с двумя мембранами с одной микроколонией. Пример карты сканирования, полученной после 24 ч инкубации, показан на рис.. Таблица показывает, что через 24 часа инкубации средняя чувствительность ± стандартное отклонение составила 80,1 ± 22,7% для всех образцов мембран. Не было существенной разницы ( P > 0,05) в чувствительности обнаружения штамма ab5 камерой Nucleovision CCD и системой Nightowl и штамма ae3 системой Nightowl.

    Пример сканирования Nucleovision после 24 часов инкубации штамма ab5. Все четыре колонии, обнаруженные невооруженным глазом после 48 ч инкубации, можно было обнаружить через 24 ч с помощью камеры CCD.

    (iii) Люминометр Bioprobe.

    Также был протестирован люминометр Bioprobe. Эта система была выбрана потому, что у нее другой принцип измерения биолюминесценции по сравнению с камерой CCD. Здесь биолюминесценция от фильтра рассчитывается как единичное значение, а не как пятна свечения. Небиолюминесцентный штамм B. diminuta дикого типа давал люминесценцию (среднее ± стандартное отклонение) 13,0 ± 5,6 относительных световых единиц (RLU), из которых было ниже пределов фонового шума, рассчитанных с использованием пустых мембран после 24 часов инкубации на TSA. (24.2 RLU). Обнаружена значимая корреляция ( P <0,0001) между log 10 RLU и log 10 КОЕ для обоих тестовых штаммов и обоих времен инкубации (рис.). После 6 ч инкубации пределы обнаружения составляли около 1500 и 2000 КОЕ на мембрану для штаммов ab5 и ae3 соответственно. Следовательно, чувствительность обнаружения, необходимая для тестирования фильтров, не была достигнута после 6 часов инкубации. Через 24 часа удалось обнаружить меньшее количество колоний на мембране. Пределы обнаружения при измерении биолюминесценции были рассчитаны как примерно 1 и 4 КОЕ на мембрану для штаммов ab5 и ae3 соответственно.Таким образом, после 24 ч инкубации пределы обнаружения для обоих штаммов были близки к идеальному пределу обнаружения для тестирования с заражением фильтром (одна колония на мембрану).

    Пример калибровочного графика для B. diminuta (pUTLUXAB) после 24 часов инкубации. Пределы фонового шума показаны на графике пунктирной линией.

    (iv) Детектирование эпифлуоресценции.

    Эпифлуоресцентная микроскопия использовалась для оценки потенциала штамма gf3 для обнаружения микроколоний. Время инкубации 0 и 12 ч было недостаточным для обнаружения микроколоний при увеличении × 25, × 160 и × 400.Все колонии (100%) выявлялись при 25-кратном увеличении на мембранах через 48 ч инкубации. Таблица показывает, что через 24 часа инкубации средняя чувствительность ± стандартное отклонение составила 98,1 ± 3,7%. Это была значительно большая чувствительность, чем была получена для штамма ae3 с системой Nightowl ( P <0,01) или со штаммом ab5 с системой Nucleovision ( P <0,05). Однако он не отличался значительно ( P > 0,05) от чувствительности обнаружения штамма ab5 системой Nightowl.

    На каждой из двух мембран, на которых одна колония росла через 48 часов инкубации, одна микроколония была обнаружена эпифлуоресценцией через 24 часа инкубации (таблица). Таким образом, можно было достичь требуемой чувствительности обнаружения, необходимой для определения неудачных попыток проверки фильтра.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Эти эксперименты показали, что система mini-Tn 5 (1) подходит для клонирования и экспрессии генов бактериальной биолюминесценции и gfp в B.diminuta . Для рекомбинантных штаммов наблюдался диапазон интенсивности биолюминесценции и флуоресценции, предположительно отражающий силу промотора в сайте вставки в геноме B. diminuta . Штаммы, продуцирующие самую сильную интенсивность света позволили обнаружить одну микроколонию на фильтрующих мембранах после 24 ч инкубации на TSA.

    Поскольку такие фенотипы, как размер клеток, поверхностная гидрофобность и поверхностные заряды, влияют на задержку бактерий фильтрами, были проведены тесты для сравнения этих свойств у рекомбинантов и B.diminuta . Никаких существенных различий для этих фенотипов не наблюдалось для рекомбинантных штаммов и штаммов дикого типа, что позволяет предположить, что все штаммы будут сравнительно удерживаться фильтрующими мембранами. Это было подтверждено, так как не было значительной разницы в удерживании рекомбинантных штаммов и штаммов дикого типа в стандартных условиях тестирования с заражением фильтром с установленными мембранами (размер пор 0,2 и 0,45 мкм). Эти результаты подтвердили, что рекомбинантные штаммы подходят для тестирования с заражением фильтром.

    Целью работы было разработать метод обнаружения отказов в тесте с вызовом фильтра с большей быстротой, чем 48 часов, необходимых в настоящее время, с использованием существующей методологии (2). Успех уменьшил бы временную задержку, налагаемую на испытания контроля качества и процесс производства фильтров. Ранее Уотерхаус (18) достигал обнаружения> 100 КОЕ на фильтрат в течение 2 часов с помощью окрашивания клеток и эпифлуоресцентной микроскопии, но более высокая чувствительность (от 10 до 100 КОЕ на фильтрат) через 5 часов была достигнута с помощью люминесценции АТФ.Хотя эти методы были быстрыми, желаемая чувствительность 1 КОЕ на фильтрат не была достигнута, и не было быстрого способа подтвердить идентичность тест-бактерий для обнаружения ложноположительных результатов. Напротив, в экспериментах, описанных в этой работе, желаемая чувствительность 1 КОЕ на тестовый фильтрат контрольного заражения была получена с использованием биолюминесцентных и флуоресцентных штаммов B. diminuta , с использованием различных методов обнаружения и, кроме того, рекомбинантных штаммов B. diminuta предусмотрена встроенная система идентификации тест-бактерий.Это связано с тем, что большинство загрязняющих бактерий из окружающей среды не проявляют биолюминесценции или не обладают сильной флуоресценцией. Кроме того, обнаружение микроколоний подтвердило, что обнаруженные бактерии были культивируемыми и жизнеспособными, как это требовалось для теста (2).

    Три коммерчески доступные системы были оценены на предмет их пригодности для использования в тестировании с заражением фильтром с биолюминесцентным B. diminuta . Было мало выбора между системами с точки зрения их чувствительности и скорости обнаружения, но каждая система имела свои преимущества и недостатки при использовании для этих тестов.Все системы смогли обнаружить от одной до двух микроколоний через 24 часа, что является значительным улучшением скорости по сравнению со стандартным методом. Однако ни один из них раньше не достигал удовлетворительных характеристик обнаружения.

    Используя люминометр Bioprobe, можно было только обнаружить> 10 3 тестовых бактерий на фильтрат на мембранах в течение 6 часов, но желаемая чувствительность была достигнута с использованием штамма ab5 только после 24 часов инкубации. Люминометр Bioprobe обычно используется для обнаружения бактерий по люминесценции АТФ; однако в этих экспериментах его применяли для обнаружения бактериальной биолюминесценции на мембранах, и он давал желаемую чувствительность через 24 часа.Люминометр Bioprobe не был оптимизирован для измерения бактериальной биолюминесценции; однако его электронику можно отрегулировать, и это может повысить чувствительность обнаружения. Одним из недостатков люминометра Bioprobe было то, что подсчет микроколоний на мембранах зависел от интерполяции стандартной кривой. Таким образом, каждая обнаруженная область света не могла быть отнесена к определенной микроколонии, и было невозможно точно определить количество ложноположительных результатов; поэтому для оценки ложных срабатываний полагаются на статистические средства.Это меньшая проблема, когда биолюминесценция определяется камерой CCD. Здесь возможность локализовать пятно люминесценции на сканированных изображениях позволяет последующее отнесение микроколоний к этому месту, что позволяет точно определять количество ложных срабатываний, хотя и только через 48 часов после тестирования. Однако это преимущество должно быть уравновешено большой разницей в стоимости системы Bioprobe и систем камеры CCD.

    Были оценены две системы CCD-камер, и не было статистической разницы в их чувствительности при обнаружении любого биолюминесцентного штамма после 24 часов инкубации.Система Nucleovision позволила обнаружить один организм на фильтрат через 24 часа по сравнению с двумя на фильтрат с помощью системы Nightowl.

    Масуко удалось обнаружить 70% биолюминесцентных Photobacterium sp. на мембранах через 1 ч с помощью ПЗС-камеры Hamamatsu Argus 100 VM-3 (12). Эта скорость не была достигнута с использованием протестированных здесь камер. Неясно, было ли это следствием сравнения естественных биолюминесцентных бактерий с рекомбинантными бактериями или из-за чувствительности камеры.Производители камер используют разные критерии для проверки чувствительности, что затрудняет абсолютные сравнения. Возможно, в будущем появится возможность повысить быстродействие, используя камеру CCD, соединенную с микроскопом. Единичные клетки биолюминесцентных бактерий могут быть непосредственно обнаружены с помощью такой системы (17).

    В качестве альтернативы биолюминесценции флуоресценцию GFP оценивали как средство быстрого обнаружения микроколоний. Примечательной особенностью этой системы была более высокая чувствительность обнаружения (98.1%) была достигнута с помощью оценки эпифлуоресценции через 24 часа, чем с помощью системы камеры CCD. Более высокая чувствительность метода эпифлуоресценции, по-видимому, является следствием способности оператора увеличивать и непосредственно визуализировать флуоресцентные микроколонии, что позволяет более точно определить световой сигнал, исходящий от колонии. Эпифлуоресценция не требовала интерпретации карт сканирования и настройки параметров сканирования и использовала эпифлуоресцентный микроскоп, который обычно используется в микробиологических лабораториях.Недостатками этого метода по сравнению с методом биолюминесценции были более длительное время, необходимое для сбора данных, и, как следствие, усталость оператора. В будущем, возможно, появится возможность увеличить скорость обнаружения с помощью альтернативных методов, например, проточной цитометрии, которая использовалась для обнаружения флуоресцентных клеток с чувствительностью 100 грамм-отрицательных клеток на мл за 30 мин (3). , или конфокковая микроскопия (10).

    В заключение, использование любого из рекомбинантов привело к значительной экономии времени, необходимого для получения индикации отказа фильтра, по сравнению со стандартным методом.В целом использование штамма gf3 B. diminuta в сочетании с флуоресцентной микроскопией было признано лучшим методом для быстрого тестирования удерживания на фильтре. Метод был быстрым, точным и недорогим. Каждая из биолюминесцентных систем давала приемлемые характеристики, но система Nightowl была намного дороже двух других, без видимого прироста производительности. Из биолюминесцентных систем система Nucleovision пользуется успехом в качестве лабораторной системы на основе чувствительности и простоты использования для оператора.Наконец, одно из преимуществ системы Bioprobe, которое следует учитывать, — это ее портативность, которая позволяет использовать ее вне лаборатории — особенность, которой нет ни у кого из других.

    Использование физических методов для борьбы с микроорганизмами

    Цели обучения

    • Понимать и сравнивать различные физические методы контроля роста микробов, включая нагревание, охлаждение, замораживание, обработку под высоким давлением, сушку, лиофилизацию, облучение и фильтрацию

    На протяжении тысячелетий люди использовали различные физические методы микробного контроля для консервирования продуктов .Общие методы контроля включают, среди прочего, применение высоких температур, облучение, фильтрацию и осушение (сушку). Многие из этих методов неспецифически убивают клетки путем разрушения мембран, изменения проницаемости мембран или повреждения белков и нуклеиновых кислот путем денатурации, деградации или химической модификации. В этом разделе описаны различные физические методы, используемые для борьбы с микробами.

    тепло

    Нагревание — одна из наиболее распространенных и старейших форм борьбы с микробами.Используется в простых техниках, таких как приготовление пищи и консервирование . Тепло может убить микробы, изменяя их мембраны и денатурируя белки. Точка термической смерти (TDP) микроорганизма — это самая низкая температура, при которой все микробы гибнут за 10-минутное воздействие. Различные микроорганизмы по-разному реагируют на высокие температуры, при этом некоторые (например, эндоспорообразователи, такие как C. botulinum ) более терпимы к теплу. Аналогичный параметр, время тепловой смерти (TDT) , представляет собой время, необходимое для уничтожения всех микроорганизмов в образце при заданной температуре.Эти параметры часто используются для описания процедур стерилизации с использованием сильного нагрева, таких как автоклавирование . Кипячение — один из старейших методов борьбы с микробами влажным теплом, и он, как правило, довольно эффективен при уничтожении вегетативных клеток и некоторых вирусов. Однако кипячение менее эффективно убивает эндоспоры; некоторые эндоспоры способны выдержать до 20 часов кипячения. Кроме того, кипение может быть менее эффективным на больших высотах, где точка кипения воды ниже, и поэтому время кипения, необходимое для уничтожения микробов, больше.По этим причинам кипячение не считается полезным методом стерилизации в лабораторных или клинических условиях.

    Для стерилизации в лаборатории или клинике можно использовать множество различных протоколов нагрева, и эти протоколы можно разделить на две основные категории: стерилизация сухим жаром и стерилизация влажным теплом . Лабораторная асептическая техника обычно включает некоторые протоколы стерилизации сухим жаром с использованием прямого воздействия высокой температуры, например стерилизацию посевных петель.Сжигание при очень высоких температурах уничтожает все микроорганизмы. Сухой жар также может применяться в течение относительно длительного периода времени (не менее 2 часов) при температуре до 170 ° C с использованием стерилизатора сухого нагрева, такого как духовка. Однако стерилизация влажным теплом обычно является более эффективным протоколом, поскольку она проникает в клетки лучше, чем сухим теплом.

    Рис. 1. (a) Стерилизация петли, часто называемая «обжигом петли», является обычным компонентом асептической техники в микробиологической лаборатории и используется для сжигания любых микроорганизмов на петле.(b) В качестве альтернативы можно использовать бактерициератор для уменьшения аэрозолизации микробов и устранения наличия открытого пламени в лаборатории. Это примеры стерилизации сухим жаром путем прямого воздействия высокой температуры, способной к сжиганию. (кредит А: модификация работы Ань-Хюэ Ту; кредит Б: модификация работы Брайана Форстера)

    Автоклавы

    Автоклавы полагаются на стерилизацию влажным жаром. Они используются для повышения температуры выше точки кипения воды для стерилизации предметов, таких как хирургическое оборудование, от вегетативных клеток, вирусов и особенно эндоспор, которые, как известно, выдерживают температуры кипения, не повреждая предметы.Чарльз Чемберленд (1851–1908) разработал современный автоклав в 1879 году, работая в лаборатории Луи Пастера . Автоклав до сих пор считается наиболее эффективным методом стерилизации. За пределами лабораторий и клинических учреждений большие промышленные автоклавы под названием retort s позволяют проводить стерилизацию влажным теплом в больших масштабах.

    Как правило, воздух в камере автоклава удаляется и заменяется увеличивающимся количеством пара, захваченного в замкнутой камере, что приводит к увеличению внутреннего давления и температуры выше точки кипения воды.Два основных типа автоклавов различаются способом удаления воздуха из камеры. В автоклавах самотечного вытеснения пар вводится в камеру сверху или с боков. Воздух, который тяжелее пара, опускается на дно камеры, где вытесняется через вентиляционное отверстие. Полное вытеснение воздуха затруднено, особенно при больших нагрузках, поэтому для таких нагрузок могут потребоваться более длительные циклы. В предвакуумных стерилизаторах воздух полностью удаляется с помощью высокоскоростного вакуума перед подачей пара в камеру.Поскольку воздух удаляется более полно, пар может легче проникать в завернутые предметы. Многие автоклавы могут работать как под действием силы тяжести, так и с предварительным вакуумом, используя первый для обеззараживания отходов и стерилизации сред и неупакованной стеклянной посуды, а второй — для стерилизации упакованных инструментов.

    Рис. 2. (a) Автоклав обычно используется для стерилизации в лаборатории и в клинических условиях. Путем вытеснения воздуха в камере увеличивающимся количеством пара может быть достигнуто повышение давления и температура, превышающая 100 ° C, что обеспечивает полную стерилизацию.(b) Исследователь программирует автоклав для стерилизации образца. (кредит а: модификация работы Кортни Харрингтон; кредит б: модификация работы Лакемейер М.Г., Кок-Меркадо Ф.д., Вада Дж., Боллинджер Л., Киндрачук Дж., Валь-Йенсен В., Кун Дж. Х., Джарлинг П.Б.)

    Стандартные рабочие температуры автоклавов составляют 121 ° C или, в некоторых случаях, 132 ° C, обычно при давлении от 15 до 20 фунтов на квадратный дюйм (psi). Продолжительность воздействия зависит от объема и природы стерилизуемого материала, но обычно составляет 20 минут или более, при этом для больших объемов требуется более длительное время воздействия для обеспечения достаточной теплопередачи к стерилизуемым материалам.Пар должен напрямую контактировать с стерилизуемыми жидкостями или сухими материалами, поэтому контейнеры оставляют неплотно закрытыми, а инструменты неплотно оборачивают бумагой или фольгой. Ключ к автоклавированию заключается в том, что температура должна быть достаточно высокой, чтобы уничтожить эндоспоры для достижения полной стерилизации.

    Рис. 3. Белые полоски на ленте автоклава (левая пробирка) становятся темными во время успешного запуска автоклава (правая пробирка). (кредит: модификация работы Брайана Форстера)

    Поскольку стерилизация так важна для безопасных медицинских и лабораторных протоколов, контроль качества имеет важное значение.Автоклавы могут быть оснащены регистраторами для регистрации значений давления и температуры, достигнутых во время каждого цикла. Кроме того, внутренние индикаторы различных типов следует автоклавировать вместе с стерилизуемыми материалами, чтобы гарантировать достижение необходимой температуры стерилизации. Одним из распространенных типов индикаторов является использование термочувствительной ленты для автоклава , которая имеет белые полосы, которые становятся черными при достижении соответствующей температуры во время успешной работы автоклава.Этот тип индикатора относительно недорогой и может использоваться при каждом запуске. Однако автоклавная лента не указывает продолжительность воздействия, поэтому ее нельзя использовать в качестве индикатора стерильности.

    Другой тип индикатора, биологический индикатор спор, использует либо полоску бумаги, либо жидкую суспензию эндоспор Geobacillus stearothermophilus , чтобы определить, уничтожены ли эндоспоры в процессе. Эндоспоры облигатной термофильной бактерии G. stearothermophilus — золотой стандарт, используемый для этой цели из-за их чрезвычайно высокой термостойкости. Биологические индикаторы спор также можно использовать для проверки эффективности других протоколов стерилизации, включая этиленоксид, сухой жар, формальдегид, гамма-излучение и плазменную стерилизацию перекисью водорода с использованием либо G . stearothermophilus , Bacillus atrophaeus, B. subtilis, или спор B. pumilus .

    В случае проверки функции автоклава, эндоспоры инкубируются после автоклавирования, чтобы гарантировать отсутствие жизнеспособных эндоспор.Рост бактерий после прорастания эндоспор можно отслеживать с помощью тестов биологических индикаторов спор , которые обнаруживают кислотные метаболиты или флуоресценцию, продуцируемую ферментами, полученными из жизнеспособных G. stearothermophilus . Третий тип автоклавного индикатора — это трубка Diack , стеклянная ампула, содержащая термочувствительную таблетку, плавящуюся при надлежащей температуре стерилизации. Полоски со спорами или пробирки Диака используются периодически, чтобы гарантировать правильную работу автоклава.

    Пастеризация

    Хотя полная стерилизация идеальна для многих медицинских применений, она не всегда практична для других применений и может также повлиять на качество продукта. Кипячение и автоклавирование не являются идеальными способами контроля роста микробов во многих пищевых продуктах, поскольку эти методы могут нарушить консистенцию и другие органолептические (сенсорные) качества пищи. Пастеризация — это форма микробиологического контроля пищевых продуктов, при которой используется тепло, но при этом пища не становится стерильной.Традиционная пастеризация убивает болезнетворные микроорганизмы и снижает количество вызывающих порчу микробов, сохраняя при этом качество пищевых продуктов. Процесс пастеризации был впервые разработан Луи Пастером в 1860-х годах как метод предотвращения порчи пива и вина. Сегодня пастеризация чаще всего используется для уничтожения чувствительных к нагреванию патогенов в молоке и других пищевых продуктах (например, яблочном соке и меде). Однако, поскольку пастеризованные пищевые продукты не стерильны, они со временем испортятся.

    Методы пастеризации молока уравновешивают температуру и продолжительность обработки. Один метод, высокотемпературная кратковременная пастеризация (HTST) , подвергает молоко воздействию температуры 72 ° C в течение 15 секунд, что снижает количество бактерий при сохранении качества молока. Альтернативой является пастеризация при сверхвысокой температуре (UHT) , при которой молоко подвергается воздействию температуры 138 ° C в течение 2 или более секунд. Пастеризованное молоко UHT можно долго хранить в герметичных емкостях без охлаждения; однако очень высокие температуры изменяют белки в молоке, вызывая небольшие изменения вкуса и запаха.Тем не менее, этот метод пастеризации выгоден в регионах, где доступ к охлаждению ограничен.

    Рис. 4. Два разных метода пастеризации, HTST и UHT, обычно используются для уничтожения патогенов, связанных с порчей молока. (кредит слева: модификация работы Марка Хиллари; кредит справа: модификация работы Керри Чешика)

    Подумай об этом

    • Как в автоклаве достигается температура выше точки кипения?
    • Как можно сравнить начало порчи между HTST-пастеризованным и UHT-пастеризованным молоком?
    • Почему кипячение не используется в качестве метода стерилизации в клинических условиях?

    Холодильное и морозильное оборудование

    Так же, как высокие температуры эффективны для контроля роста микробов, воздействие низких температур также может быть простым и эффективным методом микробного контроля, за исключением психрофилов , которые предпочитают низкие температуры (см. Температура и рост микробов).Холодильники, используемые на домашних кухнях или в лаборатории, поддерживают температуру от 0 ° C до 7 ° C. Этот температурный диапазон подавляет микробный метаболизм, значительно замедляя рост микроорганизмов и помогая сохранять охлажденные продукты, такие как продукты питания или медицинские принадлежности. Некоторые типы лабораторных культур могут быть сохранены в холодильнике для дальнейшего использования.

    Замораживание ниже –2 ° C может остановить рост микробов и даже убить чувствительные организмы. По данным Министерства сельского хозяйства США (USDA), единственные безопасные способы размораживания замороженных продуктов — это в холодильнике, погружении в холодную воду, заменяемую каждые 30 минут, или в микроволновой печи, поддерживая продукты при температуре, не способствующей росту бактерий. .Кроме того, остановленный рост бактерий может возобновиться в размороженных продуктах, поэтому с размороженными продуктами следует обращаться как со свежими скоропортящимися продуктами.

    Бактериальные культуры и медицинские образцы, требующие длительного хранения или транспортировки, часто замораживают при сверхнизких температурах –70 ° C или ниже. Эти сверхнизкие температуры могут быть достигнуты путем хранения образцов на сухом льду в морозильной камере со сверхнизкой температурой или в специальных резервуарах с жидким азотом , которые поддерживают температуру ниже −196 ° C.

    Рис. 5. Культуры и другие медицинские образцы можно хранить в течение длительного времени при сверхнизких температурах. (а) Морозильник со сверхмалой температурой поддерживает температуру -70 ° C или ниже. (b) Еще более низкие температуры могут быть достигнуты путем замораживания и хранения в жидком азоте. (кредит а: модификация работы «Expert Infantry» / Flickr; кредит b: модификация работы USDA)

    Подумай об этом

    • Убивает ли еда в холодильнике бактерии?

    Давление

    Воздействие высокого давления убивает множество микробов.В пищевой промышленности обработка под высоким давлением (также называемая паскализацией ) используется для уничтожения бактерий, дрожжей, плесени, паразитов и вирусов в пищевых продуктах при сохранении качества пищевых продуктов и продлении срока хранения. Применение высокого давления от 100 до 800 МПа (атмосферное давление на уровне моря составляет около 0,1 МПа) достаточно для уничтожения вегетативных клеток путем денатурации белка, но эндоспоры могут выдержать это давление.

    В клинических условиях гипербарическая кислородная терапия иногда используется для лечения инфекций.В этой форме терапии пациент дышит чистым кислородом под давлением, превышающим нормальное атмосферное давление, обычно от 1 до 3 атмосфер (атм). Это достигается помещением пациента в барокамеру или подачей сжатого кислорода через дыхательную трубку. Гипербарическая оксигенотерапия помогает увеличить насыщение кислородом тканей, которые становятся гипоксическими из-за инфекции и воспаления. Эта повышенная концентрация кислорода усиливает иммунный ответ организма за счет увеличения активности нейтрофилов и макрофагов, лейкоцитов, которые борются с инфекциями.Повышенный уровень кислорода также способствует образованию токсичных свободных радикалов, которые подавляют рост чувствительных к кислороду или анаэробных бактерий, таких как Clostridium perfringens , частая причина газовой гангрены . При инфекциях C. perfringens гипербарическая кислородная терапия также может снизить секрецию бактериального токсина, вызывающего разрушение тканей. Гипербарическая кислородная терапия, по-видимому, также повышает эффективность лечения антибиотиками.К сожалению, некоторые редкие риски включают кислородное отравление и воздействие на нежные ткани, такие как глаза, среднее ухо и легкие, которые могут быть повреждены повышенным давлением воздуха.

    Обработка под высоким давлением обычно не используется для дезинфекции или стерилизации фомитов. Хотя приложение давления и пара в автоклаве эффективно для уничтожения эндоспор, именно достигнутая высокая температура, а не непосредственно давление, приводит к гибели эндоспор.

    Полоса неудачных попыток

    Однажды весной 2015 года в понедельник у женщины из Огайо началось нечеткое двоение в глазах; Трудность глотания; и опущенные веки.Ее срочно доставили в отделение неотложной помощи местной больницы. Во время обследования у нее начались спазмы в животе, тошнота, паралич, сухость во рту, слабость лицевых мышц, затрудненная речь и дыхание. На основании этих симптомов был активирован центр управления инцидентами в больнице, и официальные органы здравоохранения штата Огайо были уведомлены о возможном случае ботулизма. Тем временем другие пациенты с подобными симптомами стали появляться в других местных больницах. Из-за подозрения на ботулизм антитоксин был доставлен в эти медицинские учреждения в течение ночи из центра контроля заболеваний для введения пострадавшим пациентам.Первый пациент умер от дыхательной недостаточности в результате паралича, а примерно половине оставшихся жертв потребовалась дополнительная госпитализация после введения антитоксина, при этом, по крайней мере, двум потребовались аппараты ИВЛ для дыхания.

    Должностные лица общественного здравоохранения расследовали каждый из случаев и определили, что все пациенты накануне посетили одно и то же церковное угощение. Более того, они проследили источник вспышки до картофельного салата, приготовленного из домашнего консервированного картофеля. Скорее всего, картофель консервировали в кипящей воде — метод, который позволяет эндоспорам Clostridium botulinum выжить. C. botulinum продуцирует ботулинический токсин, нейротоксин, который часто оказывается смертельным при проглатывании. По данным CDC, случай в Огайо стал крупнейшей вспышкой ботулизма в Соединенных Штатах почти за 40 лет.

    Для уничтожения эндоспор C. botulinum требуется минимальная температура 116 ° C (240 ° F), что намного выше точки кипения воды. Эта температура может быть достигнута только в автоклаве, который рекомендуется для домашнего консервирования продуктов с низким содержанием кислоты, таких как мясо, рыба, птица и овощи.Кроме того, CDC рекомендует кипятить домашние консервы примерно за 10 минут перед употреблением. Поскольку ботулотоксин термолабилен (это означает, что он денатурируется под действием тепла), 10 минут кипячения сделают нефункциональным любой ботулотоксин, который может содержать пища.

    Рис. 6. (a) Clostridium botulinum является возбудителем ботулизма. (b) Для домашнего консервирования рекомендуется использовать автоклав, поскольку эндоспоры C. botulinum могут выдерживать температуры выше точки кипения воды.(кредит а: модификация работы Центров по контролю и профилактике заболеваний; кредит б: модификация работы Национального центра консервирования домашней еды)

    Чтобы узнать больше о правильных методах консервирования в домашних условиях, посетите веб-сайт CDC.

    Высыхание

    Сушка, также известная как сушка или обезвоживание, — это метод, который тысячелетиями использовался для консервирования таких продуктов, как изюм, чернослив и вяленое мясо. Это работает, потому что все клетки, включая микробы, нуждаются в воде для своего метаболизма и выживания.Хотя сушка контролирует рост микробов, она может не убить все микробы или их эндоспоры, которые могут начать снова расти, когда условия станут более благоприятными и содержание воды восстановится.

    В некоторых случаях продукты сушат на солнце, полагаясь на испарение для достижения высыхания. Сублимационная сушка или лиофилизация — это еще один метод осушения, при котором предмет быстро замораживается («мгновенно замораживается») и помещается под вакуум, чтобы вода терялась при сублимации. Лиофилизация сочетает в себе воздействие низких температур и высыхание, что делает ее весьма эффективной для контроля роста микробов.Кроме того, лиофилизация наносит меньший ущерб предмету, чем обычное высушивание, и лучше сохраняет исходные качества предмета. Лиофилизированные предметы можно хранить при комнатной температуре, если они упакованы соответствующим образом, чтобы предотвратить накопление влаги. Лиофилизация используется для консервирования в пищевой промышленности, а также в лаборатории для длительного хранения и транспортировки микробных культур.

    Содержание воды в пищевых продуктах и ​​материалах, называемое активностью воды , можно снизить без физического высушивания путем добавления растворенных веществ, таких как соли или сахара.При очень высоких концентрациях солей или сахаров количество доступной воды в микробных клетках резко снижается, поскольку вода будет поступать из области с низкой концентрацией растворенного вещества (внутри клетки) в область с высокой концентрацией растворенного вещества (вне клетки). Многие микроорганизмы не выживают в условиях высокого осмотического давления. Мед, например, на 80% состоит из сахарозы, среды, в которой очень мало микроорганизмов способно расти, что устраняет необходимость в охлаждении.Соленое мясо и рыба, такие как ветчина и треска, соответственно, были критически важными продуктами до достижения возраста холодильника . Фрукты консервировали, добавляя сахар, делая джемы и желе. Однако некоторые микробы, такие как плесень и дрожжи, как правило, более терпимы к высыханию и высокому осмотическому давлению и, таким образом, все еще могут загрязнять эти типы пищевых продуктов.

    Рис. 7. (a) Добавление растворенного вещества создает гипертоническую среду, вытягивая воду из клеток. (б) Некоторые продукты можно сушить напрямую, например изюм и вяленое мясо.Остальные продукты сушат с добавлением соли, как в случае соленой рыбы, или сахара, как в случае с вареньем. (кредит а: модификация работы «Брюса Блауса» / Wikimedia Commons; изюминка кредита: модификация работы Кристиана Шнеттелькера; кредитный отрывок: модификация работы Ларри Якобсена; кредит соленая рыба: модификация работы «Фотограф» / Викимедиа Commons; кредитная пробка: модификация работы Кима Беккера)

    Подумай об этом

    • Как добавление соли или сахара в пищу влияет на ее водную активность?

    Радиация

    Радиация в различных формах, от высокоэнергетического излучения до солнечного света, может использоваться для уничтожения микробов или подавления их роста. Ионизирующее излучение включает рентгеновские лучи, гамма-лучи и пучки электронов высокой энергии. Ионизирующее излучение достаточно сильно, чтобы проникнуть в клетку, где оно изменяет молекулярные структуры и повреждает компоненты клетки. Например, ионизирующее излучение вызывает двухцепочечные разрывы в молекулах ДНК. Это может непосредственно вызвать возникновение мутаций ДНК, или могут возникнуть мутации, когда клетка попытается восстановить повреждение ДНК. По мере накопления этих мутаций они в конечном итоге приводят к гибели клеток.

    Рентгеновские лучи и гамма-лучи легко проникают в бумагу и пластик и поэтому могут использоваться для стерилизации многих упакованных материалов. В лаборатории ионизирующее излучение обычно используется для стерилизации материалов, которые нельзя автоклавировать, таких как пластиковые чашки Петри и одноразовые пластиковые петли для посева. В клинических условиях ионизирующее излучение используется для стерилизации перчаток, внутривенных трубок и других изделий из латекса и пластика, используемых для ухода за пациентами. Ионизирующее излучение также используется для стерилизации других типов чувствительных к теплу материалов, используемых в клинической практике, включая ткани для трансплантации, фармацевтические препараты и медицинское оборудование.

    В Европе широко используется гамма-облучение для консервов , хотя в Соединенных Штатах оно медленно приживается. Упакованные сушеные специи также часто подвергаются гамма-облучению. Из-за их способности проникать в бумагу, пластик, тонкие листы дерева и металла, а также ткани, необходимо соблюдать большую осторожность при использовании рентгеновских лучей и гамма-излучения. Эти типы ионизирующего излучения не могут проникать через толстые слои железа или свинца, поэтому эти металлы обычно используются для защиты людей, которые могут быть потенциально подвержены воздействию.

    Другой тип излучения, неионизирующее излучение , обычно используется для стерилизации и потребляет меньше энергии, чем ионизирующее излучение. Не проникает в клетки или упаковку. Ультрафиолетовый (УФ) свет является одним из примеров; он вызывает образование димера тимина s между соседними тиминами в одной цепи ДНК. Когда ДНК-полимераза сталкивается с димером тимина, она не всегда включает соответствующие комплементарные нуклеотиды (два аденина), и это приводит к образованию мутаций, которые в конечном итоге могут убить микроорганизмы.

    Ультрафиолетовый свет

    может эффективно использоваться как потребителями, так и лабораторным персоналом для контроля роста микробов. Ультрафиолетовые лампы в настоящее время обычно включаются в системы очистки воды для использования в домашних условиях. Кроме того, туристы обычно используют небольшие портативные ультрафиолетовые лампы для очистки воды от естественной среды перед употреблением. Бактерицидные лампы также используются в хирургических кабинетах, шкафах биологической безопасности s и переносных колпаках, обычно излучающих ультрафиолетовый свет с длиной волны 260 нм.Поскольку УФ-свет не проникает через поверхности и не проходит через пластик или стекло, клетки должны подвергаться прямому воздействию источника света.

    Солнечный свет имеет очень широкий спектр, который включает УФ и видимый свет. В некоторых случаях солнечный свет может быть эффективным против определенных бактерий как из-за образования димеров тимина под действием УФ-света, так и из-за образования продуктов реактивного кислорода, индуцированных в небольших количествах под воздействием видимого света.

    Рис. 8. (a) УФ-излучение вызывает образование димеров тимина в ДНК, что приводит к летальным мутациям в облученных микробах.(б) Бактерицидные лампы, излучающие УФ-свет, обычно используются в лаборатории для стерилизации оборудования.

    Подумай об этом

    • Каковы два преимущества ионизирующего излучения как метода стерилизации?
    • Как эффективность ионизирующего излучения сравнивается с эффективностью неионизирующего излучения?

    Облученная пища: вы бы ее съели?

    Из всех способов предотвращения порчи продуктов и болезней пищевого происхождения гамма-облучение может быть самым неаппетитным.Хотя гамма-облучение является проверенным методом устранения потенциально вредных микробов из пищевых продуктов, общественность еще не поверила этому. Однако большая часть их опасений связана с дезинформацией и плохим пониманием основных принципов излучения.

    Наиболее распространенный метод облучения заключается в воздействии на пищу кобальта-60 или цезия-137 путем пропускания их через радиационную камеру на конвейерной ленте. Пища не контактирует напрямую с радиоактивным материалом и сама не становится радиоактивной.Таким образом, отсутствует риск облучения радиоактивным материалом при употреблении в пищу продуктов, облученных гамма-излучением. Кроме того, питательные свойства облученных продуктов существенно не меняются, за исключением потери некоторых витаминов, которая также усугубляется длительным хранением. Изменение вкуса или запаха может происходить в облученных пищевых продуктах с высоким содержанием жира, таких как жирное мясо и молочные продукты, но этот эффект можно свести к минимуму, используя более низкие дозы радиации при более низких температурах.

    В США CDC, Агентство по охране окружающей среды (EPA) и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) сочли облучение безопасным и эффективным для различных видов мяса, птицы, моллюсков, свежих фруктов и овощей, яиц в скорлупе, и специи и приправы.Гамма-облучение пищевых продуктов также одобрено для использования во многих других странах, включая Францию, Нидерланды, Португалию, Израиль, Россию, Китай, Таиланд, Бельгию, Австралию и Южную Африку. Чтобы облегчить беспокойство потребителей и способствовать усилиям по обучению, облученные продукты теперь четко маркируются и маркируются международным символом облучения, называемым «радура». Принятие со стороны потребителей, похоже, растет, о чем свидетельствуют несколько недавних исследований.

    (a) Пищевые продукты подвергаются гамма-излучению при прохождении по конвейерной ленте через камеру излучения.(b) Гамма-облученные продукты должны иметь четкую маркировку и иметь символ облучения, известный как «радура». (кредит a, b: модификация работы Министерства сельского хозяйства США)

    Ультразвуковой

    Использование высокочастотных ультразвуковых волн для разрушения клеточных структур называется ультразвуковой обработкой . Применение ультразвуковых волн вызывает быстрые изменения давления во внутриклеточной жидкости; это приводит к кавитации , образованию пузырьков внутри клетки, которые могут разрушить клеточные структуры и в конечном итоге вызвать лизис или коллапс клетки.Обработка ультразвуком полезна в лаборатории для эффективного лизирования клеток с целью высвобождения их содержимого для дальнейших исследований; За пределами лаборатории обработка ультразвуком используется для очистки хирургических инструментов, линз и множества других предметов, таких как монеты, инструменты и музыкальные инструменты.

    Фильтрация

    Фильтрация — это метод физического отделения микробов от образцов. Воздух обычно фильтруется через высокоэффективные воздушные фильтры для твердых частиц (HEPA) . Фильтры HEPA имеют эффективный размер пор 0.3 мкм, достаточно маленький, чтобы улавливать бактериальные клетки, эндоспоры и многие вирусы, когда воздух проходит через эти фильтры, почти стерилизуя воздух с другой стороны фильтра. Фильтры HEPA имеют множество применений и широко используются в клинических условиях, в автомобилях и самолетах и ​​даже в домашних условиях. Например, их можно найти в пылесосах, системах отопления и кондиционирования воздуха, а также в очистителях воздуха.

    Рис. 10. (a) HEPA-фильтры, подобные этому, удаляют микробы, эндоспоры и вирусы при прохождении через них воздуха.(б) Схема фильтра HEPA. (кредит а: модификация работы CSIRO; кредит б: модификация работы «LadyofHats» / Мариана Руис Вильярреаль)

    Шкафы биологической безопасности

    Шкафы биологической безопасности — хороший пример использования НЕРА-фильтров. HEPA-фильтры в шкафу биологической безопасности s (BSC) используются для удаления твердых частиц из воздуха, которые либо попадают в шкаф (воздухозаборник), либо покидают шкаф (выпуск воздуха), либо обрабатывают как воздухозаборник, так и выхлоп.Использование HEPA-фильтра для забора воздуха предотвращает попадание загрязняющих веществ из окружающей среды в BSC, создавая чистую зону для работы с биологическими материалами. Использование вытяжного HEPA-фильтра предотвращает заражение лаборатории патогенами в лаборатории, тем самым обеспечивая безопасную рабочую зону для персонала лаборатории.

    Существует три класса BSC: I, II и III. Каждый класс разработан для обеспечения разного уровня защиты лабораторного персонала и окружающей среды; BSC II и III также предназначены для защиты материалов или устройств в шкафу.В таблице ниже суммирован уровень безопасности, обеспечиваемый каждым классом BSC для каждого BSL.

    Биологические риски и BSC
    Оценка биологического риска BSC Класс Защита персонала Охрана окружающей среды Защита продукта
    BSL-1, BSL-2, BSL-3 I Есть Есть Нет
    BSL-1, BSL-2, BSL-3 II Есть Есть Есть
    BSL-4 III; II при использовании в номере костюма с костюмом Есть Есть Есть

    BSC класса I защищают лабораторных работников и окружающую среду от низкого или умеренного риска воздействия биологических агентов, используемых в лаборатории.Воздух втягивается в шкаф, а затем фильтруется перед выходом через вытяжную систему здания. BSC класса II используют направленный воздушный поток и частичные барьерные системы для сдерживания инфекционных агентов. BSC класса III предназначены для работы с высокоинфекционными агентами, подобными тем, которые используются в лабораториях BSL-4 . Они газонепроницаемы, и материалы, входящие в шкаф или выходящие из него, должны проходить через систему с двойными дверцами, позволяющую обеззараживать промежуточное пространство между использованиями. Весь воздух проходит через один или два HEPA-фильтра и систему сжигания воздуха, а затем выходит прямо на улицу (не через вытяжную систему здания).Персонал может работать с материалами внутри шкафа класса III, используя длинные резиновые перчатки, прикрепленные к шкафу.

    В этом видео показано, как проектируются BSC, и объясняется, как они защищают персонал, окружающую среду и продукт.

    Фильтрация в больницах

    Фильтры

    HEPA также широко используются в больницах и хирургических кабинетах для предотвращения заражения и распространения переносимых по воздуху микробов через системы вентиляции. Системы фильтрации HEPA могут быть спроектированы как для целых зданий, так и для отдельных помещений.Например, ожоговые отделения, операционные или изоляционные отделения могут потребовать специальных систем фильтрации HEPA для удаления условно-патогенных микроорганизмов из окружающей среды, поскольку пациенты в этих палатах особенно уязвимы для инфекции.

    Мембранные фильтры

    Фильтрация также может использоваться для удаления микробов из жидких образцов с помощью мембранной фильтрации . Мембранные фильтры для жидкостей работают аналогично фильтрам HEPA для воздуха. Обычно мембранные фильтры, используемые для удаления бактерий, имеют эффективный размер пор 0.2 мкм, что меньше среднего размера бактерии (1 мкм), но фильтры с меньшими размерами пор доступны для более специфических нужд. Мембранная фильтрация полезна для удаления бактерий из различных типов термочувствительных растворов, используемых в лаборатории, таких как растворы антибиотиков и растворы витаминов. Большие объемы культуральной среды также можно стерилизовать фильтрованием, а не автоклавировать для защиты термочувствительных компонентов. Часто при фильтрации небольших объемов используются шприцевые фильтры , но вакуумные фильтры обычно используются для фильтрации больших объемов.

    Рис. 11. Мембранные фильтры бывают разных размеров в зависимости от объема фильтруемого раствора. (а) Большие объемы фильтруются в таких единицах. Раствор пропускается через фильтр при подключении устройства к вакууму. (б) Меньшие объемы часто фильтруются с использованием шприцевых фильтров, которые устанавливаются на конце шприца. В этом случае раствор проталкивается нажатием на поршень шприца. (кредит а, б: модификация работы Брайана Форстера)

    Подумай об этом

    • Будет ли мембранная фильтрация с 0.Фильтр 2 мкм, скорее всего, удалит вирусы из раствора? Объяснять.
    • Назовите хотя бы два распространенных использования HEPA-фильтрации в клинических или лабораторных условиях.

    Резюме: Физические методы борьбы с микроорганизмами

    В таблицах ниже приведены физические методы управления, обсуждаемые в этом разделе.

    Таблица 1. Методы контроля с использованием тепла
    Метод Условия Режим действия Пример использования
    Кипячение 100 ° C на уровне моря Денатурирует белки и изменяет мембраны Приготовление пищи, личное использование, приготовление некоторых лабораторных сред
    Сухой жарочный шкаф 170 ° C в течение 2 часов Денатурирует белки и изменяет мембраны, обезвоживание, обезвоживание Стерилизация термостойкого медицинского и лабораторного оборудования и посуды
    Сжигание Воздействие пламени Уничтожить сжиганием Петля пламенная, микроинсинератор
    Автоклав Стандартные настройки: 121 ° C в течение 15–40 минут при давлении 15 фунтов на кв. Дюйм Денатурирует белки и изменяет мембраны Стерилизация микробиологических сред, термостойкого медицинского и лабораторного оборудования и других термостойких предметов
    Пастеризация 72 ° C в течение 15 секунд (HTST) или 138 ° C в течение ≥ 2 секунд (UHT) Денатурирует белки и изменяет мембраны Предотвращает порчу молока, яблочного сока, меда и других легко перевариваемых жидкостей
    Таблица 2.Методы контроля с использованием холода
    Метод Условия Режим действия Пример использования
    Холодильное оборудование от 0 ° C до 7 ° C Подавляет метаболизм (замедляет или останавливает деление клеток) Консервация пищевых продуктов или лабораторных материалов (растворов, культур)
    Замораживание Ниже −2 ° C Останавливает метаболизм, может убивать микробы Долгосрочное хранение пищевых продуктов, лабораторных культур или медицинских образцов
    Таблица 3.Методы управления давлением
    Метод Условия Режим действия Пример использования
    Обработка под высоким давлением Воздействие давления 100–800 МПа Денатурирует белки и может вызывать лизис клеток Консервация продуктов
    Гибербарическая оксигенотерапия Вдыхание чистого кислорода при давлении 1–3 атм. Подавляет метаболизм и рост анаэробных микробов Лечение некоторых инфекций (например,г., газовая гангрена)
    Таблица 4. Методы контроля с использованием Dessication
    Метод Условия Режим действия Пример использования
    Простое обезвоживание Сушка Подавляет метаболизм Сухофрукты вяленое
    Уменьшить активность воды Добавление соли или воды Подавляет метаболизм и может вызывать лизис Соленое мясо и рыба, мед, джемы и мармеладки
    Лиофилизация Быстрое замораживание в вакууме Подавляет метаболизм Консервация пищевых продуктов, лабораторных культур или реагентов
    Таблица 5.Методы радиационного контроля
    Метод Условия Режим действия Пример использования
    Ионизирующее излучение Воздействие рентгеновских лучей или гамма-лучей Изменяет молекулярные структуры, вводит двухцепочечные разрывы в ДНК Стерилизация специй и термочувствительных лабораторных и медицинских изделий; используется для стерилизации пищевых продуктов в Европе, но не получил широкого распространения в США.
    Неионизирующее излучение Воздействие ультрафиолета Вводит димеры тимина, приводя к мутациям Поверхностная стерилизация лабораторных материалов, очистка воды
    Таблица 6.Методы контроля с использованием ультразвуковой обработки
    Метод Условия Режим действия Пример использования
    Обработка ультразвуком Воздействие ультразвуковых волн Кавитация (образование пустого пространства) разрушает клетки, лизируя их Лабораторные исследования по лизису клеток; чистка ювелирных изделий, линз и оборудования
    Таблица 7. Методы контроля с использованием фильтрации
    Метод Условия Режим действия Пример использования
    Фильтрация HEPA Использование высокоэффективного воздушного фильтра (HEPA) с фильтром 0.Размер пор 3 мкм Физически удаляет микробы из воздуха Лабораторные шкафы биологической безопасности, операционные, изоляторы, системы отопления и кондиционирования, пылесосы
    Мембранная фильтрация Использование мембранного фильтра с размером пор 0,2 мкм или меньше Физически удаляет микробы из жидких растворов Удаление бактерий из термочувствительных растворов, таких как витамины, антибиотики и сред с термочувствительными компонентами

    Ключевые концепции и резюме

    • Тепло — широко используемый и высокоэффективный метод контроля роста микробов.
    • Стерилизация сухим жаром Протоколы обычно используются в лабораторных асептических методах. Однако стерилизация влажным теплом обычно является более эффективным протоколом, поскольку он проникает в клетки лучше, чем сухой жар.
    • Пастеризация используется для уничтожения патогенов и уменьшения количества микробов, вызывающих порчу пищевых продуктов. Высокотемпературная краткосрочная пастеризация обычно используется для пастеризации молока, которое будет охлаждено; сверхвысокотемпературная пастеризация может использоваться для пастеризации молока для длительного хранения без охлаждения.
    • Охлаждение замедляет рост микробов; замораживание останавливает рост, убивая некоторые организмы. Лабораторные и медицинские образцы можно замораживать на сухом льду или при сверхнизких температурах для хранения и транспортировки.
    • Обработка под высоким давлением может использоваться для уничтожения микробов в продуктах питания. Гипербарическая оксигенотерапия для увеличения насыщения кислородом также используется для лечения некоторых инфекций.
    • Desiccation уже давно используется для консервирования продуктов и ускоряется за счет добавления соли или сахара, которые снижают активность воды в продуктах питания.
    • Лиофилизация сочетает в себе воздействие холода и сушку для длительного хранения пищевых продуктов и лабораторных материалов, но микробы остаются и могут быть регидратированы.
    • Ионизирующее излучение , включая гамма-излучение, является эффективным способом стерилизации термочувствительных и упакованных материалов. Неионизирующее излучение , как и ультрафиолетовый свет, не может проникать через поверхности, но полезно для стерилизации поверхностей.
    • Фильтрация HEPA обычно используется в больничных системах вентиляции и шкафах биологической безопасности в лабораториях для предотвращения передачи переносимых по воздуху микробов. Мембранная фильтрация обычно используется для удаления бактерий из термочувствительных растворов.

    Множественный выбор

    Какой из следующих методов вызывает лизис клеток из-за кавитации, вызванной быстрыми локальными изменениями давления?

    1. микроволновая печь
    2. гамма-облучение
    3. ультрафиолетовое излучение
    4. обработка ультразвуком

    Показать ответ

    г. Обработка ультразвуком вызывает лизис клеток из-за кавитации, вызванной быстрыми локальными изменениями давления.

    Какой из следующих терминов используется для описания времени, необходимого для уничтожения всех микробов в образце при данной температуре?

    1. Д-значение
    2. точка термической смерти
    3. время термической смерти
    4. время десятичной редукции

    Показать ответ

    г. Время термической смерти описывает время, необходимое для уничтожения всех микробов в образце при заданной температуре.

    Какой из следующих методов микробного контроля на самом деле не убивает микробы и не подавляет их рост, а вместо этого физически удаляет их из образцов?

    1. фильтрация
    2. обезвоживание
    3. лиофилизация
    4. неионизирующее излучение

    Показать ответ

    а.Фильтрация фактически не убивает микробы и не препятствует их росту, а вместо этого физически удаляет их из образцов.

    Заполните бланк

    В автоклаве давление на ________ увеличивается, чтобы пар достиг температуры выше точки кипения воды.

    Покажи ответ

    В автоклаве приложение давления к пару увеличивается, чтобы позволить пару достичь температуры выше точки кипения воды.

    Верно / Неверно

    Ионизирующее излучение может проникать через поверхности, а неионизирующее излучение — нет.

    Протоколы стерилизации влажным жаром требуют использования более высоких температур в течение более длительных периодов времени, чем протоколы стерилизации сухим жаром.

    Подумай об этом

    1. В чем преимущество пастеризации HTST по сравнению со стерилизацией? В чем преимущество УВТ-лечения?
    2. Как добавление соли или сахара помогает сохранить пищу?
    3. Что более эффективно при уничтожении микробов: автоклавирование или замораживание? Объяснять.
    4. В 2001 году эндоспоры Bacillus anthracis , возбудителя сибирской язвы, были отправлены правительственным чиновникам и информационным агентствам по почте.В ответ Почтовая служба США начала облучать почту ультрафиолетовым светом. Была ли это эффективная стратегия? Почему или почему нет?

    Процесс стерилизации (автоклавы) | Eurotherm by Schneider Electric

    Процесс стерилизации (автоклавы) | Eurotherm by Schneider Electric

    Добро пожаловать на веб-сайт US

    Мы обнаружили, что вы можете предпочесть сайт RU. При необходимости используйте раскрывающийся список языков выше, чтобы изменить свой выбор.

    Оставайтесь на этой территории

    На протяжении истории люди использовали огонь для очистки предметов.

    Тепло, выделяемое при воздействии высоких температур, разрушает мембраны и денатурирует белки и нуклеиновые кислоты. Однако прожиг немного чрезмерен для повседневного использования.

    Передающиеся агенты (такие как споры, бактерии и вирусы) можно удалить путем стерилизации. Это отличается от дезинфекции, при которой удаляются только те организмы, которые могут вызвать заболевание.

    Некоторые из методов, используемых для стерилизации:

    • Автоклавы: высокоэффективные и недорогие. Не подходит для термочувствительных предметов.
    • Духовки с горячим воздухом: неэффективны по сравнению с автоклавами.
    • Оксид этилена: Подходит для термочувствительных предметов, но оставляет токсичные остатки на стерилизованных предметах.
    • Низкотемпературный пар и формальдегид: эффективны для инструментов с полостями или трубчатыми отверстиями.
    • Спорицидные химические вещества: часто используются в качестве дезинфицирующих средств, но могут также стерилизовать инструменты, если используются в течение длительного времени.
    • Облучение: Гамма-лучи и ускоренные электроны отлично подходят для стерилизации.
    • Газовая плазма. Предпочтительный принцип стерилизации — нагревание, автоклав является наиболее широко используемым методом стерилизации.

    В сушильном шкафу требуется два часа при 160 ° C для уничтожения спор бактерии Clostridium botulinium (связанной с консервированными продуктами). Используя насыщенный пар, те же споры уничтожаются всего за пять минут при 121 ° C, что доказывает, что влажное тепло более эффективно, чем сухое.

    Проектирование и управление автоклавами

    Чтобы быть эффективными против спорообразующих бактерий и вирусов, автоклавы должны:

    • Наличие пара в прямом контакте со стерилизуемым материалом (т.е. загрузка предметов очень важна).
    • Создайте вакуум, чтобы вытеснить весь воздух, изначально присутствующий в автоклаве, и заменить его паром.
    • Внедрите хорошо продуманную схему управления отводом пара и охлаждением, чтобы нагрузка не погибла.

    Эффективность процесса стерилизации зависит от двух основных факторов. Один из них — это время термической смерти, то есть время, в течение которого микробы должны подвергнуться воздействию определенной температуры, прежде чем все они умрут. Второй фактор — это точка термической смерти или температура, при которой все микробы в образце погибают.

    Пар и давление обеспечивают передачу в организм достаточного количества тепла для их уничтожения. Последовательность импульсов отрицательного давления используется для вакуумирования всех возможных воздушных карманов, в то время как проникновение пара максимизируется за счет применения последовательности положительных импульсов

    Типичные циклы давления, используемые в автоклавах:

    1.Цикл для тканей, собранных фильтрующих элементов и отходов.

    2. Цикл для лабораторной пластмассовой и стеклянной посуды.

    3. Цикл в основном используется для выбрасываемых грузов.

    Эффективность процесса можно подтвердить, наблюдая за изменением цвета индикаторной ленты, которая часто наклеивается на упаковки или продукты, подлежащие автоклавированию. Также можно использовать биологические индикаторы, такие как свидетельства. Они содержат споры Bacillus sterothermophilus, которые являются одними из самых сложных организмов, которые необходимо уничтожить в автоклаве.После запуска в автоклаве внутреннее стекло флакона Attest разбивается, и споры попадают в дифференциальную жидкую среду. Если автоклав уничтожил споры, среда остается синего цвета. В противном случае споры метаболизируются, вызывая изменение цвета на желтый после двух дней инкубации при 56 ° C.

    Таким образом, система управления должна обеспечивать гибкость в том, как достигается точное и повторяемое управление стерилизацией, и должна включать следующие функции:

    • Точное регулирование контура с программированием профиля уставки
    • Система управления рецептами для простой параметризации
    • Последовательный контроль для сложных стратегий управления
    • Безопасный сбор онлайн-данных из системы стерилизации для анализа и сбора доказательств
    • Локальный дисплей оператора с четкой графикой и контролируемым доступом к параметрам

    EyconTM Visual Supervisor — идеальное решение для этого приложения .

    Файлы cookie и конфиденциальность

    На нашем веб-сайте используются файлы cookie, предоставленные нами и третьими сторонами. Некоторые файлы cookie необходимы для работы веб-сайта, в то время как другие могут быть изменены вами в любое время, в частности те, которые позволяют нам понять производительность нашего веб-сайта, предоставляют вам функции социальных сетей и улучшают работу с соответствующим контентом и Реклама. Вы можете принять их все или задать предпочтения.

    Принять все

    Отклонить все

    Необходимые файлы cookie

    Необходимые файлы cookie необходимы для правильной работы нашего веб-сайта и не могут быть отключены.Они отправляются на ваш компьютер или устройство, когда вы запрашиваете определенное действие или услугу, например при входе в систему, заполнении формы или настройке файлов cookie. Если вы настроите свой браузер на блокировку этих файлов cookie или предупреждение об этих файлах cookie, некоторые части нашего веб-сайта не будут работать.

    Сохранить настройки

    Биологические и химические индикаторы | STERIS Life Sciences

    ->

    {{#if SubcategoryDescription}}
    {{{SubcategoryDescription}}}
    {{еще}}
    {{{SucategorySummary}}}
    {{/если}}

    {{#with (поиск../Items (math @index «-» 1))}}
    {{#if YTVideo}}

    Посмотреть видео

    {{/если}}

    {{#if TechnicalData}}
    Технические данные
    {{еще}}
    Технические данные
    {{/если}}

    {{#if Обзор}}
    Обзор продукта
    {{еще}}
    Обзор продукта
    {{/если}}

    Посмотреть продукт
    {{/с}}

    {{#if YTVideo}}

    Посмотреть видео

    {{/если}}

    {{#if TechnicalData}}
    Технические данные
    {{еще}}
    Технические данные
    {{/если}}

    {{#if Обзор}}
    Обзор продукта
    {{еще}}
    Обзор продукта
    {{/если}}

    Посмотреть продукт

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *