Мкб 10 эндометрит: Хронический эндометрит » Акушерство и Гинекология

МКБ-10 код O85 | Послеродовой сепсис

ICD-10

ICD-10 is the 10th revision of the International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems (ICD), a medical classification list by the World Health Organization (WHO).

It contains codes for diseases, signs and symptoms, abnormal findings, complaints, social circumstances, and external causes of injury or diseases.

ATC

The Anatomical Therapeutic Chemical (ATC) Classification System is used for the classification of active ingredients of drugs according to the organ or system on which they act and their therapeutic, pharmacological and chemical properties.

It is controlled by the World Health Organization Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology (WHOCC).

DDD

The defined daily dose (DDD) is a statistical measure of drug consumption, defined by the World Health Organization (WHO).

It is used to standardize the comparison of drug usage between different drugs or between different health care environments.

Медицинские процедуры по профилям заболеваний:

Лечение взрослого населения с болезнями уха, горла, носа

(класс VIII, Х по МКБ-10)

• Хронический отит;
• Хронический ринит;
• Хронический назофарингит;
• Хронический тонзилит;
• Хронический ларингит;
• Хронический ларинготрахеит;
• Хронический синусит;

Методы лечения:

• Прием минеральной воды;
• Ванны ароматические, минеральные, сухо-воздушные, газовые;
• Воздействие лечебной грязью;
• Души- циркулярный, подводный душ-массаж;
• Физиопроцедуры-ДДТ, СМТ, эл.п.УВЧ, электрофорез лекарственных средств, УФО, ДМВ, СМВ, НИЛИ, магнитотерапия, дарсонвализация, гальвановоздействие, индуктотермия.
• Аэрозольтерапия, аэрофитотерапия, аэроионотерапия;
• Спелеовоздействие;
• ЛФК в зале, терренкур;
• Психотерапия.

Лечение взрослого населения с болезнями эндокринной системы, расстройствами питания и нарушениями обмена веществ.

(класс IV по МКБ-10) 

• Диффузный эндемический зоб;
• Хронический тиреоидит;
• Эутиреоидный зоб;
• Сахарный диабет;
• Ожирение;
• Нарушение толерантности к глюкозе;
• Нарушение обмена пуринов……..;
• Нарушение минерального обмена.

Методы лечения:

• Прием минеральной воды;
• Ванны ароматические, минеральные, сухо-воздушные, вихревые, минеральные;газовые
• Души-циркулярный, Шарко, подводный душ-массаж;
• Физиопроцедуры-электрофорез лекарственных средств, электросон, СМТ, НИЛИ, магнитотерапия, индуктотермия, СМВ, ультразвук
• ЛФК в зале, бассейне, терренкур;
• Психотерапия. 

Лечение взрослого населения с болезнями кожи и подкожной клетчатки.

(класс XII по МКБ-10) 

• Атопический дерматит;
• Псориаз.

Методы лечения:

• Прием минеральной воды;
• Ванны-газовые, минеральные, суховоздушные;
• Обертывания;
• Парафиновая маска на кожу;
• Аэроионотерапия;
• Спелеовоздействие;
• Физиопроцедуры-эл.п.УВЧ, электросон, ультразвук, ДМВ, СМВ, индуктотермия, НИЛИ, магнитотерапия;
• Воздействие климатом, терренкур;
• Психотерапия. 

Лечение взрослого населения с болезнями нервной системы.

(класс VI по МКБ-10) 

• Последствия перенесенного менингита;
• Заболевания и последствия травм спинного и головного мозга;
• Поражение нервов, корешков,сплетений,полиневропатии
• Хроническая головная боль напряжения. 

Методы лечения:

• Прием минеральной воды;
• Воздействие лечебной грязью, парафином;
• Ванны-минеральные, газовые, вихревые, суховоздушные;
• Души-циркулярный, подводный душ-масаж;
• Физиопроцедуры-СМТ, ультразвук, ДМВ, ДДТ, магнитотерапия, НИЛИ, СМВ, индуктотермия, эл.п.УВЧ, КВЧ, электрофорез лекарственных средств, дарсонвализация.
• ЛФК в зале, бассейне, терренкур;
• Массаж;
• Психотерапия. 

Лечение взрослого населения с болезнями мочеполовой системы.

(класс XIV по МКБ-10) 

• Хронический цистит;
• Хронический простатит;
• Хронический сальпингоофорит
• хронический эндометрит;
• Вторичное бесплодие. 

Методы лечения:

• Прием минеральной воды;
• Воздействие лечебной грязью, парафином;
• Душ циркулярный;
• Ванны-минеральные, суховоздушные, ароматические, газовые;
• Физиопроцедуры-СМТ, ультразвук, ДМВ, ДДТ, магнитотерапия, НИЛИ,эл п УВЧ, электорофорез лекарственных средств, электросон;
• ЛФК в зале, бассейн, терренкур;
• Массаж, подводный душ-массаж;
• Психотерапия;
• Ректальное воздействие НИЛИ при болезнях мужских половых органов;
• Введение тампонов при болезнях женских половых органов.

Лечение взрослого населения с болезнями системы кровообращения

(класс IX по МКБ-10) 

• Хроническая ревматическая болезнь сердца;
• Гипертоническая болезнь;
• Ишемическая болезнь сердца:
• Последствия цереброваскулярных болезней;
• Атеросклероз артерий конечностей;
• Варикозное расширение вен нижних конечностей. 

Методы лечения: 

• Прием минеральной воды;
• Ванны-вихревые, газовые, минеральные, ароматические, суховоздушные, жемчужные;
• Души-циркулярный, подводный душ-массаж;
• Физиопроцедуры-НИЛИ, дарсонвализация, ДМВ, магнитотерапия, гальвановоздействие, СМТ, электросон, ДДТ, ультразвук, СМВ;
• Массаж;
• ЛФК в зале, бассейне, терренкур;
• Психотерапия. 

Лечение взрослого населения с болезнями костно-мышечной системы и соединительной ткани.

(класс XIII по МКБ-10) 

• Артропатии
• Ревматоидный артрит;
• Подагра;
• Полиостеоартроз;
• Сколиоз;
• Остеохондроз позвоночника. 

Методы лечения: 

• Прием минеральной воды;
• Воздействие лечебной грязью, парафином;
• Ванны-ароматические, газовые, минеральные, суховоздушные, вихревые;
• Физиопроцедуры-СМТ, ДДТ, ДМВ,эл п УВЧ, электрофорез лекарственных средств, ультразвук, индуктотермия, НИЛИ, магнитотерапия, СМВ;
•  Массаж, подводный душ-массаж;
• ЛФК в зале, бассейне, терренкур; 

Лечение взрослого населения с болезнями органов пищеварения.

(класс XI по МКБ-10) 

• Эзофагит;
• Язвенная болезнь желудка и 12п.кишки;
• Хронический гастрит, дуоденит.
• Синдром раздраженного кишечника;
• Хронический гепатит;
• Хронический холецистит;
• Хронический панкреатит;
• Постхолецистэктомический синдром; 

Методы лечения:

• Прием минеральной воды;
• Воздействие лечебной грязью, парафином;
• Ванны-газовые, минеральные, суховоздушные;
• Душ-циркулярный, подводный душ-массаж;
• Физиопроцедуры-СМТ, ДДТ,эл п УВЧ, электрофорез лекарственных средств, ультразвук, НИЛИ, ДМВ, индуктотермия, КВЧ, магнитотерапия, электросон, СМВ;
• Массаж;
• ЛФК в зале, бассейне, терренкур;
• Психотерапия;
• Введение лекарственных средств с помощью клизмы. 

Лечение взрослого населения с болезнями органов дыхания,

(класс X по МКБ-10) 

• Хронический бронхит;
• Пневмония  в фазе реконвалесценции;
• Хроническая обструктивная болезнь легких;
• Бронхиальная астма. 

Методы лечения: 

• Ванны-ароматические, газовые, минеральные, суховоздушные;
• Душ-циркулярный, подводный душ-массаж;
• Воздействие лечебной грязью;
• Физиопроцедуры-СМТ, ДДТ,эл п УВЧ, электрофорез лекарственных средств, электросон, индуктотермия, ДМВ;
• Аэроионотерапия, аэрозольтерапия, аэрофитотерапия;
• Спелеовоздействие;
• Массаж;
• ЛФК в зале, бассейне, терренкур;
• Психотерапия. 

 Лечение взрослого населения с психическими расстройствами  и расстройствами  поведения.

(класс V по МКБ-10) 

• Вегетососудистая дистония; 

Методы лечения: 

• Ванны-газовые, вихревые, жемчужные, минеральные, суховоздушные;
• Души-циркулярный, подводный душ-массаж;
• Физиопроцедуры-электрофорез лекарственных средств, электросон, НИЛИ, магнитотерапия, СМТ, ультразвук, дарсонвализация, ДМВ, СМВ, эл пУВЧ;
• ЛФК в зале, бассейне, терренкур;
• Массаж;
• Психотерапия.

Приказ Министерства здравоохранения РФ от 28 сентября 2020 г. N 1029н «Об утверждении перечней медицинских показаний и противопоказаний для санаторно-курортного лечения» — Детская городская поликлиника №1

Метроэндометрит код по мкб 10 у взрослых

Примечание. В рубрики O88.-, O91.- и O92.- включены перечисленные ниже состояния, даже если они возникают во время беременности и родов.

Исключены:

• психические расстройства и расстройства поведения, связанные с послеродовым периодом (F53.-)
• акушерский столбняк (A34)
• послеродовая остеомаляция (M83.0)

Послеродовой(ая):

• эндометрит
• лихорадка
• перитонит
• сепсис

При необходимости идентифицировать инфекционный агент используют дополнительный код (B95-B98).

Исключены:

• акушерская пиемическая и септическая эмболия (O88.3)
• сепсис во время родов (O75.3)

При необходимости идентифицировать инфекционный агент используют дополнительный код (B95-B98).

Исключена: инфекция во время родов (O75.3)

Включены: во время родов, родоразрешения и в послеродовом периоде.

Исключены:

• акушерская эмболия (O88.-)
• венозные осложнения при беременности (O22.-)

Включена: легочная эмболия во время беременности, родов или в послеродовом периоде.

Исключена: эмболия, осложняющая аборт, внематочную или молярную беременность (O00-O07, O08.2)

Включены: перечисленные состояния во время беременности, послеродового периода или лактации

Алфавитные указатели МКБ-10

Внешние причины травм — термины в этом разделе представляют собой не медицинские диагнозы, а описание обстоятельств, при которых произошло событие (Класс XX. Внешние причины заболеваемости и смертности. Коды рубрик V01-Y98).

Лекарственные средства и химические вещества — таблица лекарственных средств и химических веществ, вызвавших отравление или другие неблагоприятные реакции.

В России Международная классификация болезней 10-го пересмотра (МКБ-10) принята как единый нормативный документ для учета заболеваемости, причин обращений населения в медицинские учреждения всех ведомств, причин смерти.

МКБ-10 внедрена в практику здравоохранения на всей территории РФ в 1999 году приказом Минздрава России от 27.05.97 г. №170

Выход в свет нового пересмотра (МКБ-11) планируется ВОЗ в 2022 году.

Сокращения и условные обозначения в Международой классификации болезней 10-го пересмотра

БДУ — без других указаний.

НКДР — не классифицированный(ая)(ое) в других рубриках.

† — код основной болезни. Главный код в системе двойного кодирования, содержит информацию основной генерализованной болезни.

* — факультативный код. Дополнительный код в системе двойного кодирования, содержит информацию о проявлении основной генерализованной болезни в отдельном органе или области тела.

Весь контент iLive проверяется медицинскими экспертами, чтобы обеспечить максимально возможную точность и соответствие фактам.

У нас есть строгие правила по выбору источников информации и мы ссылаемся только на авторитетные сайты, академические исследовательские институты и, по возможности, доказанные медицинские исследования. Обратите внимание, что цифры в скобках ([1], [2] и т. д.) являются интерактивными ссылками на такие исследования.

Если вы считаете, что какой-либо из наших материалов является неточным, устаревшим или иным образом сомнительным, выберите его и нажмите Ctrl + Enter.

Эндометрит – воспаление слизистой оболочки матки полимикробной этиологии. Эндометрит во время родов (хориоамнионит) – полимикробная инфекция плодных оболочек и амниотической жидкости.

Острый эндометрит и эндомиометрит не относятся к часто встречающимся заболеваниям, требующим от врача оказания экстренной помощи.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]

Код по МКБ-10

Эпидемиология

Частота встречаемости эндометрита после самопроизвольных физиологических родов – 1–5%, после патологически протекающих – 4–6%, после операции кесарева сечения – свыше 12%. Хориоамнионит развивается у 0,78–1% женщин. У каждой 5-й роженицы хориоамнионит переходит в послеродовой эндометрит.

По наблюдениям, острые эндометриты и эндомиометриты диагностируются в 2,1 % случаев всех заболеваний или в 9,7 % – среди острых воспалительных процессов верхних отделов полового аппарата. Воспаления матки в структуре воспалительных заболеваний внутренних половых органов встречаются еще реже (0.9 %). Эндометриты часто сочетаются с поражением придатков матки, при этом яркие клинические проявления аднексита могут завуалировать признаки воспалительного процесса в матке, что безусловно отражается на статистических данных.

[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]

Причины эндометрита

Полимикробное заболевание, которое может быть вызвано стафилококками, стрептококками, грамотрицательными палочками семейства Enterobacteriaceae и неспорообразующими анаэробами; редко микоплазмами, хламидиями, вирусами. Наиболее частые возбудители – условно-патогенные аэробные и анаэробные бактерии.

Первично возникший воспалительный процесс, ограниченный пределами матки, обычно развивается вследствие восхождения инфекции через шеечный канал. При этом интактный эндоцервикальный барьер могут преодолевать такие высоковирулентные микроорганизмы, каким является гонококк. Обычно же проникновение бактерий в ткани эндо- и миометрия происходит при нарушении целостности шеечного барьера при самопроизвольных и искусственных абортах, диагностических выскабливаниях слизистой оболочки шейки и тела матки, введение ВМК и других внутриматочных вмешательствах. Гематогенное, лимфогенное и контактное распространение инфекции на ткани стенки матки наблюдается значительно реже. Эндомиометрит в подобных случаях обязательно сочетается с воспалительными процессами внутренних половых органов иной локализации.

[17], [18], [19], [20], [21]

Симптомы эндометрита

Симптомы острого эндометрита во многом обусловлена характером возбудителя заболевания, возрастом и состоянием здоровья женщины, особенностями предшествующих манипуляций на матке.

Гонорейный эндометрит в качестве изолированного заболевания наблюдается нечасто: в 7,1 % случаев восходящей гонореи. Обычно заболевают молодые женщины, ведущие активную, часто беспорядочную половую жизнь. Начало воспалительного процесса в матке может быть спровоцировано родами, абортом, любыми внутриматочными манипуляциями. Однако, как указывалось выше, развитие, гонорейного эндометрита возможно при интактном цервикальном барьере. В подобных случаях начальные проявления заболевания, как правило, возникают в первые 14 дней менструального цикла и у части больных имеют достаточно выраженный характер: боль в нижних отделах живота, недомогание, головная боль, повышение температуры тела. Значительно чаще острый гонорейный эндометрит манифестирует только кровотечениями в виде затянувшейся менструации либо в виде кровяных выделений, появившихся через несколько дней после окончания месячных. Выделения нередко принимают сукровичный или гноевидный характер.

Общее состояние больных обычно оценивается как удовлетворительное. Пульс соответствует температуре тела. Живот остается мягким, безболезненным при пальпации, иногда отмечается умеренная болезненность над лоном. Вздутия кишок нет, симптомы раздражения брюшины отсутствуют. При осмотре наружных половых органов, влагалища и экзоцервикса можно выявить признаки гонорейного поражения нижних отделов мочеполового аппарата: уретрита, эндоцервицита, воспаления выводных протоков больших желез преддверия влагалища. Бимануальное исследование дает возможность определить обычное состояние шейки матки, некоторую болезненность тела матки, отсутствие изменений в придатках и параметрии. При первом обследовании больной до начала лечения необходимо произвести забор материала из уретры, цервикального канала и прямой кишки для бактериоскопического и бактериологического исследования.

Практическому врачу, работающему в отделении ургентной гинекологии, часто приходится иметь дело с больными, страдающими острым эндометритом после самопроизвольного или искусственного аборта.

В отечественном акушерстве самопроизвольным абортом принято считать прерывание беременности до 28-недельного срока. Выкидыш, совершившийся в первые 16 нед, т. е. до сформирования плаценты, называется ранним; после этого срока – поздним. Эндометрит может осложнить самопроизвольный выкидыш любого срока.

Искусственное прерывание беременности в настоящее время производят разными методами:

1. так называемый мини-аборт, осуществляемый с помощью вакуум-аспирации при задержке месячных от 7 до 20 дней;
2. традиционный аборт, производимый до 12-недельного срока путем расширения шейки матки и удаления плодного яйца кюреткой или вакуум-отсосом;
3. поздний аборт, выполняемый по медицинским показаниям с помощью интраамниалыюго введения гипертонических растворов, внутривенного вливания простагландинов или окситоцина, операции малого кесарева сечения.

Все эти виды абортов могут осложняться острым эндометритом, частота которого зависит от срока и метода прерывания беременности, степени кровопотери, адекватности обезболивания. К предрасполагающим факторам относят общие заболевания (патология сердечно-сосудистой, дыхательной, мочевыделительной, эндокринной и других систем и органов), воспалительные процессы половых органов в прошлом.

Во много раз чаще эндометриты и эндомиометриты являются осложнением искусственных криминальных абортов, производимых вне больничного учреждения.

Нарушение целостности шеечного барьера, значительные дефекты эндометрия позволяют возбудителям инфекции достаточно легко проникать в ткани стенки матки. Их рост поддерживают фибрин, сгустки крови, очаги некроза и возможное присутствие элементов плодного яйца. В качестве возбудителей острых послеабортных эндометритов в настоящее время выступают как аэробы (энтерококки, кишечная палочка, стрептококки группы В, стафилококки), так и анаэробы (бактероиды, фузобактерии, пептококки, пептострептококки). Чаще из полости матки высеваются энтерококки и Е. coli, бактероиды и фузобактерии. Тяжесть заболевания во многом зависит от характера микрофлоры и степени бактериальной обсёмененности полости матки. Острый эндометрит с тяжелой формой клинического течения, как правило, обусловлен внедрением аэробно-анаэробных ассоциаций: кишечной палочки, стрептококка группы В, фузобактерии, пептококка и пептострептококка в различных сочетаниях. Бактериальная обсемененность превышает 10 4 КОЕ/мл. Значение хламидийной инфекции в развитии острого эндометрита после искусственного, аборта до сих пор точно не .определено. Большинство исследователей считают, что клиника воспалительного процесса, обусловленного хламидиями, характеризуется более затяжным течением и менее выраженной симптоматикой. Микоплазмы могут быть этиологическим фактором эндометрита после любых виутриматочных вмешательств, в том числе после искусственного аборта, еще чаще – после самопроизвольного выкидыша, который не столь уж редко ими провоцируется.

Симптомы острого эндометрита или эндомиометрита после аборта имеет довольно типичную картину. Заболевание начинается на 2-5-е сутки после вмешательства, при этом раннее проявление симптомов свидетельствует о более тяжелом течении его. Общее состояние женщины ухудшается, нередки ознобы. Повышается температура тела от субфебрильных цифр до выраженной гипертермии. Появляются боли в нижних отделах живота, иррадиирующие в крестец или в паховые области. Больная жалуется на гноевидные или кровянисто-гнойные выделения из половых путей, причем обильное гнойное, слизисто-гнойное, гнойно-сукровичное отделяемое указывает на возможную хламидийную инфекцию; гнилостный характер жидких гноевидных, иногда пенистых, выделений свидетельствует о вероятности анаэробной флоры. При наличии остатков плодного яйца может быть довольно значительное кровотечение.

Внешний вид больных зависит от степени интоксикации и кровоиотери. Однако в большинстве случаев они имеют обычный цвет кожных покровов; влажный язык; тахикардию, соответствующую температуре тела. Бледность, выраженная тахикардия, гипотония являются следствием сильного кровотечения. Серый колорит кожи говорит об интоксикации. Живот остается мягким, болезненным при пальпации нижних отделов.

Гинекологическое исследование позволяет определить обычной формы болезненную матку, находящуюся в состоянии субинволюции. При наличии в полости матки остатков плодного яйца малых сроков беременности наружный зев шейки матки остается приоткрытым, при поздних выкидышах шеечный канал свободно пропускает палец, за внутренним зевом можно пальпировать ткани плодного яйца и сгустки крови. Тело матки имеет шаровидную форму, инволюция ее значительно задерживается. Патологические изменения придатков и параметрия отсутствуют Во время первого обследования до назначения антибактериальной терапии необходимо произвести забор материала для выявления возбудителей заболевания. Клинический анализ крови характеризуется умеренным лейкоцитозом и повышением СОЭ.

Как правило, эндометрит, явившийся осложнением самопроизвольного или искусственного аборта, произведенного в больничных условиях, при своевременно начатой и адекватной терапии протекает благоприятно и. ликвидируется в течение недели. Однако нельзя упускать из вида возможность распространения инфекции и развития такого тяжелейшего осложнения, каким является септический (или бактериально-токсический) шок.

Эндометрит после криминальных вмешательств протекает тяжелее, что объясняется массивным поступлением микрофлоры в матку, возможным механическим и химическим повреждением стенок матки, токсическим воздействием используемых для прерывания беременности веществ на организм женщины, а также поздним обращением за медицинской помощью подобного контингента больных. Указанные моменты могут способствовать распространению инфекции, вплоть до ее генерализации, и поэтому требуют от врача четких действий и мобилизации всех необходимых средств и методов терапии.

В связи с распространением внутриматочных противозачаточных средств практическим врачам нередко приходится иметь дело с больными, у которых воспалительный процесс половых органов развивается при ВМК. Наличие ВМК облегчает трансцервикальное прохождение бактерий, а реакция тканей вокруг контрацептива способствует острому течению воспалительного процесса с быстрым абсцедированием.

В своей повседневной практике врач может встретить вторичное гнойное поражение матки – пиометру, которая возникает вследствие сужения перешейка или шеечного канала раковой опухолью, миомой, полипом, эндометриозом. У женщин, находящихся в менопаузе, к сужению шеечного канала может приводить сенильная атрофия. Нередко задержка гнойного экссудата в полости матки протекает скрытно, не давая клинической картины. Однако весьма часто женщины поступают в стационар с жалобами на высокую лихорадку с ознобами и резкую боль в нижних отделах живота; гнойные выделения из половых путей могут отсутствовать или быть скудными вследствие затруднения оттока их из полости матки. При гинекологическом осмотре обнаруживают атрофичную или обычную шейку матки и увеличенное, круглое, мягко- или тугоэластической консистенции тело матки. Преодоление маточным зондом препятствия в цервикальном канале или перешейке способствует оттоку гноя и подтверждает диагноз пиометры. Однако, помня о возможной злокачественной природе сужения шейки или перешейка матки, необходимо с помощью кюретки взять материал для гистологического исследования. Также обязателен забор гнойного отделяемого для бактериологического исследования и определения чувствительности микрофлоры к антибиотикам.

[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]

Рубрика МКБ-10: N71.0

Содержание

Определение и общие сведения [ править ]

Острый эндометрит – воспаление слизистой оболочки матки с поражением главным образом базального (росткового, камбиального) слоя эндометрия. Если воспалительный процесс распространяется по лимфатическим сосудам и капиллярам в мышечный слой, то развивается метроэндометрит.

Острый эндометрит и метроэндометрит диагностируют в 2,1% случаев всех гинекологических заболеваний.

Различают специфические и неспецифические эндометриты.

Этиология и патогенез [ править ]

Острый эндометрит может быть обусловлен бактериальной, вирусной, паразитарной, грибковой, микоплазменной, а также протозойной и спирохетозной инфекциями. Нередко наблюдают ассоциации из 3-4 анаэробов с 1-2 аэробами. Возросло значение хламидийной инфекции и генитального герпеса (ГГ).

Первичный воспалительный процесс обычно развивается вследствие инфицирования восходящим путем, чаще при нарушении целостности шеечного барьера после самопроизвольных и искусственных абортов, диагностических выскабливаний слизистой оболочки шейки и тела матки, введения ВМК и других внутриматочных вмешательствах. Интактный цервикальный барьер могут преодолевать высоковирулентные микроорганизмы, такие как гонококк. Воспалительную реакцию характеризуют расстройства микроциркуляции и выраженная экссудация (серозно-гнойный, гнойный экссудат). Гистологическая картина: отек и нейтрофильная инфильтрация эндометрия, при присоединении анаэробной микрофлоры – некротическая деструкция.

Клинические проявления [ править ]

Клинические признаки острого эндометрита возникают, как правило, на 3-4-й день после инфицирования. Повышается температура тела, появляется озноб. Беспокоят боли внизу живота, иррадиирующие в крестец или пах. Выделения из половых путей чаще серозно-гноевидные. Возможны сукровичные выделения в течение длительного времени, что связано с задержкой регенерации слизистой оболочки. Значительное кровотечение обычно возникает при задержке остатков плодного яйца после аборта. Острый гонорейный эндометрит часто начинается кровотечением в виде затянувшейся менструации либо в виде кровянистых выделений, появившихся через несколько дней после ее окончания.

Острые воспалительные болезни матки: Диагностика [ править ]

В анамнезе отмечают проведенные накануне внутриматочные вмешательства или использование ВМК. Начальные признаки гонорейного эндометрита появляются, как правило, в первые 14 дней менструального цикла (при интактном цервикальном барьере).

Общее состояние обычно удовлетворительное. При гинекологическом обследовании: матка умеренно увеличена, чувствительна при пальпации, особенно по бокам (по ходу крупных сосудов). При задержке в полости матки остатков плодного яйца после самопроизвольного аборта на раннем сроке беременности наружный зев шейки матки приоткрыт, при поздних самопроизвольных абортах – свободно пропускает палец.

В анализах крови: лейкоцитоз, сдвиг лейкоцитарной формулы влево, увеличение СОЭ, С-реактивный белок.

При микроскопии вагинального мазка, окрашенного по Граму, оценивают:

• состояние вагинального эпителия;

• состав микрофлоры (количественная и качественная оценка по морфотипам и тинкториальным свойствам).

С поверхности внутриматочного контрацептива (ВМК) после его удаления берут материал для бактериоскопического и цитологического исследований.

Для диагностики ИППП (Инфекции, передающиеся преимущественно половым путем) используют ПЦР (Полимера́зная цепна́я реа́кция), латекс-агглютинацию, иммунофлюоресцентный анализ и культуральный метод.

Для уточнения диагноза проводят УЗИ.

Дифференциальный диагноз [ править ]

Дифференцальную диагностику проводят с внематочной беременностью, острым аппендицитом, функциональными тазовыми болями.

Острые воспалительные болезни матки: Лечение [ править ]

Назначают постельный режим на весь период лихорадки; диету, богатую витаминами и легкоусваеваемую и не нарушающую функций кишечника; периодически холод на низ живота.

В острой стадии эндометрита применяют комбинированное антибактериальное лечение, например комбинации цефалоспоринов 3-4-го поколения и метронидазола, линкозамидов и аминогликозидов 2-3-го поколения. В качестве монотерапии можно применять ингибиторзащищенные аминопенициллины (амоксициллин + клавулановая кислота) и карбапенемы (имипенем + циластатин, меропенем). При подозрении на хламидийную инфекцию дополнительно назначают доксициклин или макролиды. Дозы и продолжительность применения антибиотиков зависят от тяжести заболевания. По показаниям проводят инфузионную терапию, десенсибилизирующее, общеукрепляющее лечение. Для улучшения оттока из полости матки применяют утеротоники в сочетании со спазмолитиками. Внутриматочный лаваж с анти септическими растворами (нитрофурал, диоксидин) применяют при эндометрите после аборта на позднем сроке.

Если эндометрит развился на фоне ВМК, необходимо его удалить. Инструментальное опорожнение полости матки производят в случае задержки остатков плодного яйца после аборта.

Если признаки клинического улучшения отсутствуют в течение 72 ч от начала лечения, диагноз уточняют и решают вопрос о радикальном хирургическом вмешательстве.

Острая стадия эндометрита продолжается 8-10 дней. При адекватном лечении процесс завершается выздоровлением, реже переходит в подострую и хроническую формы.

Профилактика [ править ]

Необходимо обязательное исследование влагалищного биотопа перед различными внутриматочными вмешательствами, предварительная санация по показаниям. Перед инвазивными вмешательствами целесообразно назначение превентивного антибактериального лечения. При использовании ВМК (внутриматочной контрацепции) опасность развития воспалительных заболеваний особенно высока в 1-й месяц и через 2 года после введения контрацептива.

От клинических аспектов к иммунопатогенезу и патобиологии

Эндометрит можно разделить на инфекционные и неинфекционные причины, однако в клинической практике они часто возникают в сочетании с другой. Клинические признаки этих двух типов эндометрита могут быть неразличимы, за исключением того, что в первый тип вовлечены микроорганизмы. Кроме того, на сегодняшний день существует ограниченное количество контролируемых исследований, сравнивающих инфекционный эндометрит с неинфекционным эндометритом у кобыл [36,37].Кобылы с дефектной репродуктивной анатомией (например, плохая форма вульвы, разорванный вестибуловагинальный сфинктер, вентральная мешочка матки, нарушение сократимости матки, недостаточность шейки матки и атрофированные складки эндометрия) более склонны к аспирации воздуха или накоплению жидкости или мочи во влагалище и матке. , которые делают кобылу одновременно предрасположенной к инфекционному и неинфекционному эндометриту [20,38]. Кроме того, кобылы с компетентным иммунным ответом и функциональной анатомией репродуктивного тракта способны спонтанно избавляться от инфекций (т.например, кобылы, устойчивые к эндометриту), тогда как кобылы с недостаточным иммунным ответом могут быть неспособны бороться с развитием инфекции или могут иметь стойкое воспаление [31,32,33,39].

2.1. Инфекционный эндометрит

Инфекционный эндометрит играет важную роль в снижении фертильности лошадей [40,41]. Микроорганизмы, включая патогенные или условно-патогенные бактерии и грибы, могут получить доступ к матке во время размножения. В то время как резистентная кобыла должна быстро реагировать на присутствие микроорганизмов, неадекватный иммунный ответ и нарушение оттока маточной жидкости (например,g., из-за висящей матки, тугой шейки матки или нарушения сократимости миометрия) может привести к инфекции [42,43]. Эндометрит в основном связан с аэробными бактериями [40]; однако анаэробы также могут проникать в матку [44]. Интересно, что ретроспективные отчеты выявили, что 25-60% кобыл, не забеременевших, имеют бактериальную инфекцию матки [45,46]. В клинических случаях наиболее часто выделяемые бактерии, связанные с эндометритом, — это Streptococcus , за которыми следуют колиформные бактерии, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus [20,42,47,48,49] ().Среди всех причин острого и хронического эндометрита преобладают Streptococcus equi подвидов zooepidemicus ( Streptococcus zooepidemicus ) и Escherichia coli [50,51]. Стоит отметить, что Streptococcus zooepidemicus также вызывает скрытые глубоко засеянные инфекции в эндометрии кобыл, что делает их устойчивыми к традиционной терапии [52].

Таблица 1

Обычные бактерии и грибы, выделенные из маток кобыл, страдающих эндометритом.G +: грамположительный; G-: грамотрицательные.

Грибки реже связаны с эндометритом (1–5%) и могут возникать сами по себе или в сочетании с бактериями [54]. Aspergillus и Candida являются наиболее распространенными родами, но другие виды также выявляются реже (например, Mucor sp) [49,53,54] (). Следует отметить, что грибковый эндометрит обычно возникает как условно-патогенная инфекция и выявляется после многократного применения внутриматочных противомикробных препаратов [53,55,56].

Кобылы, чувствительные к PBIE, склонны к развитию хронических инфекций, и некоторые из этих инфекций вызваны способностью бактерий и грибов производить биопленку [57,58,59].Биопленка представляет собой сложную совокупность микроорганизмов и их секретов (то есть внеклеточный матрикс полимерных веществ) [60], которая дает микроорганизмам способность уклоняться от иммунной системы [61,62,63,64]. Биопленка работает как барьер для распространения противомикробных препаратов, и это ограниченное проникновение приводит к устойчивости к противомикробной терапии, особенно по сравнению с планктонной бактериальной инфекцией (бактерии без биопленки) [65,66,67].

Переход бактерий от стадии планктона к стадии биопленки достигается с помощью сигнальной молекулы бактериальной клетки циклического ди-GMP [68,69], который регулирует выработку экзополисахаридов альгината, Pel и Psl [70,71,72].Стоит отметить, что и Pel, и Psl участвуют в прикреплении бактерий к клеточному или неклеточному субстрату, а также в прикреплении микроколонии к субстрату и стабилизации внеклеточной ДНК для поддержки биопленки [73,74,75,76 , 77]. Примерно 80% бактерий, выделенных из матки лошади, способны производить биопленку [58,59,78,79]. Иммунитет хозяина и микросреда, как известно, играют роль в образовании биопленок в других системах организма, таких как ротовая полость [80,81]; однако еще предстоит определить, как эти факторы способствуют образованию биопленок и патогенезу эндометрита в матке лошади [58,78,82].

Ранее считалось, что среда матки самок млекопитающих стерильна [83,84,85]; однако это утверждение было оспорено после публикации проекта «Микробиом человека» (2007), который показал, что полость матки содержит уникальный микробиом [83,85,86]. У лошадей матка поддерживает умеренно разнообразный микробиом, и ее состав, по-видимому, в значительной степени совпадает с микробными популяциями, обнаруженными на внешней шейке матки os [87]. Такое общность популяций микробов между краниальным влагалищем и маткой у кобыл можно объяснить открытой шейкой матки и тесным сообщением между просветом матки и краниальным влагалищем во время течки [88].Микробиом матки изменяется в зависимости от стадии эстрального цикла и исследований [89, 90]. В одном исследовании [87] микробиота, управляемая Proteobacteria, была первичной популяцией, тогда как в другом исследовании сообщалось о более разнообразном микробиоме, включая Proteobacteria, Firmicutes, Bacterioidetes и Actinobacteria [91].

Микробиом матки женщин и коров, страдающих эндометритом, отличается от такового у здоровых самок [92], что позволяет предположить, что эндометрит связан с дисбиозом комменсального микробиома [88].Инвазия в полость матки у кобыл и других млекопитающих в основном происходит в результате восходящей миграции из влагалища [86,93], в связи с одной или несколькими репродуктивными проблемами, как описано выше. Роль резидентного микробиома матки в предотвращении инфекции, ее потенциальные взаимодействия с эмбрионом и потенциальная роль в потере беременности у лошадей не выяснены. Точно так же роль терапии маточных инфекций в восстановлении здорового баланса в микробиоме матки у лошадей не изучалась.

2.3. Врожденный иммунный ответ на эндометрит

Местный врожденный иммунный ответ немедленно активируется после распознавания антигена и передачи сигнала эпителиальными клетками слизистой оболочки эндометрия [28,30]. Обнаружение посторонних частиц вызывает активацию врожденной иммунной системы, которая является первой линией защиты. Основные функции врожденной иммунной системы: (1) рекрутировать иммунные клетки к участкам инфекции посредством активации различных цитокинов, включая хемокины, (2) активировать каскад комплемента, чтобы способствовать очищению от мертвых клеток, (3) вызывать активацию адаптивной иммунной системы через презентацию антигена и (4) действовать как физический барьер для вторгающихся организмов и частиц.Многие из этих функций были изучены на предмет их участия в заболевании эндометрита, обзор которых представлен здесь.

Считается, что это самое древнее звено иммунной системы, система комплемента используется для неспецифического увеличения фагоцитарного клиренса поврежденных клеток и микробов [113]. Комплемент вносит важный вклад в опсонизирующую активность маточного секрета и хемотаксис воспалительных клеток, предшествующий воспалительной реакции [114]. В классическом пути комплемента субъединица C4 связывается с IgM / IgG-ассоциированным C1q, инициируя ферментативное расщепление C4 на C4a и C4b и C2 на C2a и C2b [115] ().Ассоциация C4b с C2b активирует конвертазу C3. После этого C3 конвертаза расщепляет C3 на C3a и C3b [116], а затем C3a способствует привлечению лейкоцитов и дальнейшей активации комплемента [117,118]. Кроме того, связывание C3b с C4b активирует конвертазу [119, 120]. Тогда как C4b, так и C3b могут связываться с микробными поверхностями или дополнительными иммуноглобулинами [121]. Конвертаза C5 расщепляет C5 на C5a и C5b, что приводит к конформационным изменениям и активации терминального пути, что способствует образованию комплекса атаки на мембрану (MAC) [122].МАК синтезируется посредством взаимодействий между C5b и другими терминальными компонентами (например, C6, C7, C8 и C9) и лизирует целевую клетку (клетки), создавая поры в плазматической мембране [123]. Каскад комплемента также может запускаться альтернативным путем, который влечет за собой связывание белка C3b непосредственно с антигенами [124]. Интересно, что активация этой системы была обнаружена в ответ на разведение лошади. Было обнаружено, что сперматозоиды лошадей индуцируют каскад комплемента, приводящий к увеличению C3b и C5a, лейкотриенов и простагландинов, все из которых приводят к хемотаксису PMN в матке [125, 126, 127].

Классические и альтернативные пути активации комплемента, происходящие в просвете матки кобыл после оплодотворения. C1q: компонент комплемента 1; C2: дополнение 2; C3: Дополнение 3; C4: дополнение 4; C5: Дополнение 5; C6: дополнение 6; C7: дополнение 7; C8: Дополнение 8; IgG: иммуноглобулин G; IgM: иммуноглобулин М; МАК: комплекс мембранной атаки.

Кроме того, фактор расщепления комплемента C3b был обнаружен в секрете матки как у устойчивых, так и у восприимчивых популяций кобыл [128,129,130].Различные классы иммуноглобулинов (например, IgA, IgG и IgM) также были идентифицированы в секретах матки кобыл. В дополнение к их связи с комплементом, эти молекулы, как полагают, играют важную роль в презентации антигена Т-клеткам [131, 132, 133, 134, 135]. Интересно, что при сравнении устойчивой и восприимчивой кобылы не было обнаружено различий в отношении экспрессии или продукции различных субъединиц комплемента или иммуноглобулинов, что позволяет предположить, что они играют ограниченную роль в патогенезе восприимчивости к PBIE [2,136].

Микробы и инородные частицы (такие как белки сперматозоидов и семенной плазмы) также обнаруживаются посредством их презентации антигена рецепторам распознавания образов (PRR), расположенным в эпителиальных клетках эндометрия [29,137,138]. Эти клетки, наряду с иммунными клетками (например, тканевыми макрофагами, NK-клетками и нейтрофилами), которые они рекрутируют, производят различные типы цитокинов, включая хемокины. Хемокины дополнительно привлекают лейкоциты к месту воспаления, в то время как другие цитокины позволяют дифференцироваться и активировать другие хемотаксированные иммунные клетки [139, 140].В совокупности эти клетки образуют физический и иммунологический барьер на слизистой оболочке матки [141].

Toll-подобные рецепторы, семейство трансмембранных белков, экспрессируемых в клетках млекопитающих [142,143,144,145], играют главную роль в распознавании этого антигена [146]. В этой роли антигенпрезентирующие клетки (ACP), в основном дендритные, макрофаги и NK-клетки, экспрессируют молекулы, распознающие эти паттерны [97, 147]. Патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) распознаются TLR эндометриальных и сторожевых клеток, чтобы начать воспалительную реакцию [148].Было показано, что воздействие грамотрицательных бактерий или липополисахаридов (ЛПС) на эти клетки усиливает экспрессию TLR типов 2 и 4 у мышей, кроликов и крупного рогатого скота [61, 62, 63, 64]. Экспрессия TLR эндометрием после взаимодействия со спермой до сих пор полностью не выяснена, особенно потому, что сперма не стерильна, а внутреннее бактериальное загрязнение может быть причиной противоречивых результатов в литературе. Toll-подобный рецептор типа 4 в первую очередь распознает LPS, продуцируемый грамотрицательными бактериями, тогда как TLR2 реагирует на липопептиды грамположительных бактерий, которые могут проникать в матку во время размножения [149, 150].Известно, что TLR2 и TLR4 увеличиваются в матках кобыл, устойчивых к PBIE, после инокуляции Escherichia coli [29]. Кроме того, работа на других видах показывает, что человеческие и мышиные сперматозоиды экспрессируют TLR2 и TLR4, хотя это не было подтверждено на лошадях [151]. У крупного рогатого скота, исследований in vitro показали, что сперма может стимулировать транскрипцию провоспалительных цитокинов, включая хемокины (TNFα, IL1β, CXCL8) и простагландин E, и активировать локальную систему комплемента (C3), опосредованную TLR2 / 4 [152, 153, 154].

Другая группа PRR — это NOD-подобные рецепторы (NLR), которые отвечают за внутриклеточное обнаружение патогенов [155]. NOD-подобные рецепторы экспрессируются во многих типах клеток, включая иммунные клетки и эпителиальные клетки, хотя некоторые члены семейства NLR экспрессируются в основном в фагоцитах, включая макрофаги и нейтрофилы. Генетическая вариация этих генов может предрасполагать людей к нескольким воспалительным заболеваниям [155, 156]; однако роль NLR в патогенезе эндометрита у лошадей не выяснена.

Рецепторы распознавания образов могут реагировать на широкий спектр антигенов и затем активировать провоспалительные цитокины [157, 158, 159], чтобы регулировать иммунный ответ [160, 161]. Активация TLR является ключевым событием в инициации воспалительного каскада [148], который стимулирует ядерный фактор каппа-бета (NF-κB). Ядерный NF-κB состоит из пяти субъединиц (RelA {p65}, RelB, ReL, p50, p52) и может активироваться врожденными (т.е. каноническими) или адаптивными (т.е. альтернативными) иммунными путями [162].Канонический путь запускается микроорганизмами и провоспалительными цитокинами (например, IL1 и TNFα) [162]. Запуск этого пути влечет за собой активацию RelA- или cRel- [163], которые регулируются IkB-киназой β (IKKβ) посредством фосфорилирования ингибиторов kB (IkB) [164]. Киназы IkB являются ключевыми регуляторами пути NF-κB [165]; наоборот, в альтернативном пути NF-κB активируется другими биопродуктами, такими как лимфотоксин β, лиганд CD40, фактор активации В-клеток и активатор рецептора NF-κB [166, 167, 168, 169, 170, 171].Активация комплекса RelB / p52 и IkB киназы α необходима на этом пути для фосфорилирования и процессинга предшественников p52 p100 [166] ().

Канонические и альтернативные пути активации ядерного фактора каппа-бета (NF-kB) в эндометрии кобыл. BAFF: фактор активации В-клеток; CD40: кластер дифференцировки 40; СОХ-2: циклооксигеназа-2; IFN1: интерфероны 1 типа; IL1: интерлейкин 1; IL6: интерлейкин 6; ЛПС: липополисахариды; LTβ: лимфотоксин β; MyD88: первичный ответ миелоидной дифференцировки 88; NF-κB: ядерный фактор каппа-бета; NOD: нуклеотид-связывающий и олигомеризационный домен; PAMP: молекулярные структуры, связанные с патогенами; PRR: рецепторы распознавания образов; RelA / p50 и RelB / p52: субъединицы комплекса NF-κB; Rip2: белок 2, взаимодействующий с рецептором; TLR2: Toll-подобные рецепторы типа 2; TLR4: Toll-подобные рецепторы типа 4; TNFα: фактор некроза опухоли альфа; TRIF: интерферон-β, содержащий адаптер, индуцирующий TIR-домен; TRAF6: фактор, связанный с рецептором 6.

Путь NF-κB затем активирует гены, кодирующие провоспалительные цитокины, включая хемокины и циклооксигеназу-2 (COX-2) [148, 172]. Цитокины и ЦОГ-2 сигнализируют иммунным клеткам, модулируя острый воспалительный ответ [173]. Экспрессия генов членов обоих семейств NLR и TLR повышается после внутриматочной инокуляции Escherichia coli у кобыл. Кроме того, несколько связанных с иммунитетом путей передачи сигналов, включая митоген-активируемую протеинкиназу, сигнальные пути NF-κB и TNFα и путь взаимодействия цитокин-цитокиновый рецептор, также были обогащены после инокуляции Escherichia coli [29 ].Следует отметить, что еще предстоит определить, вызывает ли сперма подобный иммунный ответ на микроорганизмы.

Подмножество этих PRR требует одновременного связывания с другими рецепторами эндогенной клеточной поверхности для активации. Например, когда TLR4 связывается с CD14, последующее обнаружение LPS изменяет последующие воспалительные реакции [138, 172]. После распознавания антигена привлечение адаптерных белков вместе с MyD88-зависимым каскадом приводит к секреции провоспалительных цитокинов или TIR-домен-содержащего адаптер-индуцирующего интерферон-β (TRIF) -зависимого каскада, что приводит к продукции интерферонов типа 1 (IFN) в дополнение к воспалительным цитокинам, включая хемокины [138, 172].MyD88-зависимый каскад индуцирует IL-1R-ассоциированное киназное семейство киназ и, следовательно, активацию убиквитин-зависимой киназы TNFR-ассоциированным фактором 6 [174, 175]. Убиквитин-зависимая киназа индуцирует активацию NF-κB и индукцию неспецифического иммунного ответа посредством транскрипции NF-κB [176].

Первоначально цитокины синтезируются как промолекулы, которые необходимо активировать. Многие типы молекул могут активировать цитокины (например, эластазу, катепсины, металлопротеиназы и трипсин).Однако каспазы, большое семейство эволюционно консервативных протеаз, играют эту роль более широко, чем другие молекулы [177]. Например, семейство каспаз-1 (т.е. каспазы-1, -4, -5, -11, -12 и -14) в первую очередь участвует в регуляции активации цитокинов [177], а семейство каспаз-3 (например, каспазы -3 и -7) могут активировать провоспалительные цитокины [178,179,180]. В частности, каспаза-1 активирует IL1β, который конститутивно экспрессируется и активируется в эндометрии кобыл после экспериментальной бактериальной инокуляции [29], а также синтезируется при стимуляции NF-κB [173].Под действием простагландин-эндопероксидсинтазы, особенно ЦОГ-2, при воспалении происходит синтез простагландинов [181]. У лошади было отмечено увеличение экспрессии ЦОГ-2 в эндометрии после воздействия семенной плазмы или разбавителя [182], а также локальное повышение концентрации простагландина F2 альфа (PGF2α) в матке нормальных кобыл через 16 часов. после разведения [30].

За счет синтеза простагландинов и провоспалительных цитокинов, в основном интерлейкина 1 (IL1), интерлейкина 6 (IL6) и фактора некроза опухоли альфа (TNFα), происходит активация эндотелиальных клеток сосудов.Это приводит к сужению артериол и расширению венул на пораженном участке, тем самым увеличивая проницаемость сосудов и просачивая экссудат в интерстиций, вызывая местный отек [183]. Экспрессия в эндометрии различных провоспалительных интерлейкинов, включая интерлейкин 1β (IL1β), хемокиновый лиганд 8 (CXCL8, ранее известный как IL8) и TNFα, выше у восприимчивых к PBIE кобыл, чем у устойчивых кобыл, даже до воздействия антигена. . Это увеличение числа восприимчивых кобыл также отмечается после заражения патогенами или спермой [31,182,184].

При изменении проницаемости сосудистого эндотелия начинаются клеточные реакции. Эндотелиальные клетки сосудов увеличивают экспрессию Р-селектина через воспалительный стимул, который связывается с L-селектином на поверхности нейтрофилов, вызывая хемотаксис [185]. Затем нейтрофилы продуцируют интегрины, которые связываются с молекулами адгезии на эндотелиальных клетках до полной остановки и прикрепления к стенкам кровеносных сосудов [186]. После обнаружения инородного материала нейтрофилы мигрируют из эндометрия в просвет матки в течение 30 минут [11] и имеют пик воспалительной реакции через 6–12 часов [2] ().Кобылы, восприимчивые к PBIE, испытывают повышенную нейтрофилию через 2 и 12 ч после размножения по сравнению с устойчивыми кобылами [16]. Помимо фагоцитоза, нейтрофилы также секретируют дополнительные цитокины и хемотаксические медиаторы, вызывая дальнейшее воспаление [186]. Затем лейкоциты выделяют простагландины, которые способствуют сократимости миометрия и помогают физическому очищению матки у здоровой кобылы [187].

Обзор динамики цитокинов эндометрия у кобыл, резистентных и восприимчивых к эндометриту, с момента непосредственно до (0 часов) до 24 часов после оплодотворения.

Нейтрофилы — первая линия иммунных клеток, которая реагирует на распознавание антигена врожденным иммунитетом. Помимо фагоцитоза и высвобождения литических ферментов в ответ на антигены и патогены, нейтрофилы образуют внеклеточные ловушки нейтрофилов (NET). Нейтрофильные внеклеточные ловушки представляют собой ДНК-ассоциированные молекулы с антимикробными и иммуномодулирующими свойствами [188], которые индуцируются различными воспалительными агентами, такими как активные формы кислорода [189], комплексы антитело-антиген [190], CXCL8, липополисахарид и форбол-миристат. -ацетат [191].Антимикробная активность NET, называемая NETosis, обусловлена ​​разрывом нейтрофилов и высвобождением гранул, позволяя их хроматину контактировать с антигенами и другими иммунными клетками [192]. Некоторые ферменты (например, эластаза, белок 3, катепсин G и миелопероксидаза) и гистоны играют роль в НЕТозе [193,194,195,196]. Образование NETs является дополнительным механизмом уничтожения бактерий, которые могут вызывать эндометрит у кобыл [197].

При обострении это усиление провоспалительных сигналов и привлечение иммунных клеток может привести к повреждению тканей.Следовательно, необходимы механизмы для прекращения процесса разрешения воспалительного процесса. Увеличение противовоспалительных или плейотропных цитокинов отмечается уже через 2-6 часов после разведения устойчивой кобылы [16] (). Они реализуют свои свойства, подавляя выработку провоспалительных медиаторов, конкурируя за провоспалительные рецепторы или вызывая гибель клеток [198]. Интерлейкин-10 (IL10), антагонист -1R (IL1RN), -4 (IL4) и -13 (IL13) считаются противовоспалительными и играют важную роль в прекращении этого воспалительного ответа [14,199,200,201].Хорошо задокументировано, что IL1RN играет роль в балансировании про- и противовоспалительных эффектов, потому что этот цитокин конкурирует с IL1 за связывание с рецепторами IL1, что предотвращает связывание IL1α и IL1β [202]. Обычно IL10 синтезируется относительно поздно в воспалительной реакции и действует как общий противовоспалительный эффектор, снижая транскрипцию провоспалительных цитокинов моноцитами и макрофагами [203, 204].

Кроме того, хотя IL6 изначально является провоспалительным в ответ, его функция является плейотропной из-за его способности активировать различные рецепторы и пути, чтобы действовать как противовоспалительные средства на более поздних этапах воспалительного процесса.Исследование показало, что инициация этих противовоспалительных цитокинов у восприимчивых кобыл нарушена [16]. Через 6 часов после заражения спермой в эндометрии устойчивой кобылы наблюдалось увеличение экспрессии IL10, IL1RN и IL6 [16]. Восприимчивые кобылы имели значительно более низкую экспрессию этих цитокинов, что указывает на неспособность вызвать их ответ [184]. Авторы предположили, что эта неспособность вызвать противовоспалительный ответ приводит к длительному воспалительному ответу эндометрия у кобыл, восприимчивых к PBIE.

Сообщалось, что помимо недостаточного производства противовоспалительных цитокинов, у восприимчивых кобыл нарушалась сократимость миометрия. Исследование показало, что кобылы, чувствительные к PBIE, имеют другой ответ миометрия на бактериальную нагрузку по сравнению с устойчивыми кобылами, и это включает частоту, продолжительность и интенсивность сокращений [205]. Интересно, что сократимость миометрия тесно связана с передачей сигналов в иммунной системе и, в частности, с индукцией цитокинами оксида азота (NO).Вырабатываемый индуцибельной синтазой оксида азота, NO представляет собой кальций-независимую широко распространенную сигнальную молекулу, которая вызывает расслабление гладких мышц [206, 207]. Интересно, что провоспалительные медиаторы, такие как IL1 и IFNα, приводят к усилению транскрипции этой молекулы [206]. Считается, что это снижение активности гладких мышц препятствует очищению матки у кобыл, восприимчивых к PBIE [10].

Многочисленные исследования изучали роль NO в предрасположенности к эндометриту лошадей. Исследования, проведенные с эксплантатами эндометрия лошадей, показали дозозависимый ответ на стимуляцию NO, хотя снижение ответа было отмечено в образцах с более низким качеством эндометрия [208].У восприимчивых кобыл происходит усиленная регуляция как экспрессии, так и активности NO [10,35,209]. Длительное и непредсказуемое увеличение провоспалительных цитокинов, таких как IL1β, может быть причиной этого увеличения активности NO, что приводит к расслаблению гладких мышц и снижению активности миометрия, все из которых вносят вклад в патофизиологию PBIE.

Стадия эстрального цикла (т.е. высокая или низкая концентрация прогестерона) также играет роль в иммунном ответе матки у кобыл [210].При преобладании прогестерона матка лошади очень восприимчива к инфекциям, тогда как при преобладании эстрогена матка более способна избавляться от инфекций [210]. Например, экспрессия сывороточного амилоида A (SAA) и противовоспалительного IL10 увеличивалась через 3 часа после бактериальной инокуляции при диэструсе, но не повышалась во время течки [30, 211].

Интересно, что матриксные металлопротеиназы (ММП) типов 2 и 9 значительно активируются через 5 часов после инокуляции Streptococcus zooepidemicus как в течке, так и в диэструсе [212].Матричные металлопротеиназы участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса (ВКМ) [213] и модулируются тканевыми ингибиторами ММП (ТИМП), которые также были идентифицированы в эндометрии кобыл и женщин [212, 214]. Активность ТИМП-2 снижается при индуцированном эндометрите у кобыл [212]. Было высказано предположение, что тонкий баланс между ТИМП и ММП играет роль в развитии фиброза и дегенерации эндометрия у кобыл [212], но это все еще спорно [215]. Стоит отметить, что кобылы, восприимчивые к PBIE, обычно проявляют фиброз эндометрия и другие дегенеративные изменения, такие как модификации типа отложения коллагена [216].

Патогенез и этиология фиброза эндометрия у кобыл остаются плохо изученными. Известно, что MMP и TIMP регулируют отложение коллагена и другие компоненты ECM, связанные с фиброзом [217, 218, 219, 220]. Кроме того, компоненты NET (например, миелопероксидаза, эластаза и катепсин G) также активируют коллаген 1 и 3 типов и трансформирующий фактор роста β1 [221, 222, 233]. Кроме того, экспрессия в эндометрии IL1β и IL6 повышается во время прогрессирования фиброза эндометрия у кобыл [224]. Исследования in vitro показали профибротические эффекты IL1β в эндометрии и других тканях [220, 225, 226]. Недавнее исследование in vitro показало, что IL1β и IL6 модулируют продукцию ECM, MMP и TIMP в клетках эндометрия лошадей и могут быть важными регуляторами в патогенезе фиброза [227]. По-видимому, может существовать связь между воспалением и развитием фиброза эндометрия, при котором IL1β и IL6 увеличивают экспрессию компонентов ECM, таких как MMPs [227].

Кроме того, эпителиальные клетки эндометрия продуцируют антимикробные пептиды (например, дефенсины, элафин, кателицидин, лактоферрин и лизоцим), что способствует неспецифической деградации как микробов, так и сперматозоидов [228]. Помимо микробиоцидной активности, эти белки влияют на индукцию цитокинов, хемотаксис и пролиферацию клеток и модулируют как врожденный, так и приобретенный иммунитет [211]. Противомикробные пептиды регулируются наличием бактерий, стадией эстрального цикла и воспалением.К ним относятся факторы, дестабилизирующие стенки бактериальных клеток, такие как дефенсины, лизоцим и секретируемая фосфолипаза A2 [229, 230], и факторы, которые ингибируют бактериальные ферменты, такие как ингибитор секреторной лейкопротеазы, который также известен как антимикробный пептид 2 нейтрофилов лошадей [231, 232, 233]. Многие из этих антимикробных белков увеличиваются в эндометрии восприимчивой популяции кобыл, включая ингибитор секреторной лейкопротеазы, лошадиный β-дефенсин, лактоферрин и лизоцим [28, 234].Поскольку многие из этих белков также продуцируются в гранулах нейтрофилов, неизвестно, связано ли это увеличение с защитным механизмом внутри эндометриальных желез восприимчивой кобылы или с повышенной нейтрофилией, вызванной длительными воспалительными процессами.

Белки острой фазы также были исследованы на предмет их участия и диагностических возможностей при эндометрите, поскольку они являются системными маркерами воспаления у лошади [235 236 237]. Сывороточный амилоид А, гаптоглобин и фибриноген были исследованы [238].Было показано, что гистологически нормальный эндометрий кобылы конститутивно экспрессирует мРНК SAA на умеренных уровнях [239]. Существует противоречивая информация относительно определяемого системного ответа SAA на эндометрит. Одно исследование показало, что циркулирующие SAA и фибриноген увеличиваются через 3 и 12 часов после инокуляции Escherichia coli , и это увеличение коррелирует с экспрессией SAA в эндометрии [240]. Напротив, другое исследование не обнаружило изменений в концентрациях SAA после разведения с замороженной / размороженной спермой [30].Остается определить, была ли эта разница вызвана типом используемого заражения или ограниченным размером выборки. Следует отметить, что при сравнении восприимчивых и устойчивых кобыл не было замечено никаких различий в концентрации или экспрессии циркулирующих SAA [199].

От клинических аспектов до иммунопатогенеза и патобиологии

Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, x ДЛЯ СОВРЕМЕННОГО ОБЗОРА 13 из 41

142. Wira, C.R .; Fahey, J.V .; Sentman, C.L .; Пиоли, П.А.; Шен, Л. Врожденный и адаптивный иммунитет в женских половых органах

тракта: клеточные реакции и взаимодействия. Иммунол. Ред. 2005, 206, 306–335.

143. Farage, M.A .; Miller, K.W .; Герберик, Г.Ф .; Saito, F.H .; Ledger, W.J .; Виткин, С.С. Врожденный иммунитет в нижних отделах слизистой оболочки женщин

. J. Steroids Horm. Sci. 2011, 2, 2.

144. An, H .; Yu, Y .; Чжан, М .; Xu, H .; Qi, R .; Ян, X .; Liu, S .; Wang, W .; Guo, Z .; Guo, J .; и другие. Участие

передачи сигнала

ERK, p38 и NF-κB в регуляции экспрессии генов TLR2, TLR4 и TLR9, индуцированной липополисахаридом

в дендритных клетках мыши.Иммунология 2002, 106, 38–45.

145. Chen, C .; Zibiao, H .; Мин, З .; Shiyi, C .; Ruixia, L .; Jie, W .; SongJia, L. Характер экспрессии Toll-подобных

рецепторов (TLR) в различных органах и влияние липополисахарида на экспрессию TLR 2 и 4 в репродуктивных органах

самок кроликов. Dev. Комп. Иммунол. 2014, 46, 341–348.

146. Silva, E .; Leitão, S .; Henriques, S .; Ковалевски, М.П .; Hoffmann, B .; Ferreira-Dias, G .; Lopes da Costa, L .;

Матеус, Л.Транскрипция генов TLR2, TLR4, лигандов LPS и ферментов синтеза простагландинов регулируется на

в матке собак с комплексом кистозная гиперплазия эндометрия-пиометра. J. Reprod. Иммунол. 2010,

84, 66–74.

147. Swangchan-Uthai, T .; Lavender, C.R.M .; Cheng, Z .; Fouladi-Nashta, A.A .; Wathes, D.C. Временной ход

защитных механизмов в эндометрии крупного рогатого скота в ответ на липополисахарид. Биол. Репродукция. 2012, 87, 135.

148. Тернер М.L .; Healey, G.D .; Шелдон И.М. Иммунитет и воспаление в матке. Репродукция. Внутренний. Anim.

2012, 47, 402–409.

149. Janeway, C.A., Jr .; Меджитов Р. Распознавание врожденного иммунитета. Анну. Rev. Immunol. 2002, 20, 197–216.

150. Souza-Fonseca-Guimaraes, F .; Adib-Conquy, M .; Кавайон, Дж. М. Естественные клетки-киллеры (NK) в антибактериальном

врожденном иммунитете: ангелы или дьяволы? Мол. Med. 2012, 18, 270–285.

151. Takeda, K .; Акира, С. Сигнальные пути TLR.Семин. Иммунол. 2004, 16, 3–9.

152. Chow, J.C .; Янг, D.W .; Голенбок, Д.Т .; Христос, W.J .; Гусовский, Ф. Толл-подобный рецептор-4 опосредует

липополисахарид-индуцированную передачу сигнала. J. Biol. Chem. 1999, 274, 10689–10692.

153. Sheldon, I.M .; Cronin, J .; Goetze, L .; Donofrio, G .; Schuberth, H.J. Определение послеродовой болезни матки и

механизмов инфекции и иммунитета в женских половых путях крупного рогатого скота. Биол. Репродукция.2009, 81,

1025–1032.

154. Fujita, Y .; Михара, Т .; Окадзаки, Т .; Shitanaka, M .; Кушино, Р .; Ikeda, C .; Negishi, H .; Liu, Z .; Richards, J.S .;

Шимада, М. Толл-подобные рецепторы (TLR) 2 и 4 на сперматозоиде человека распознают бактериальные эндотоксины и опосредуют

апоптоз. Гм. Репродукция. 2011, 26, 2799–2806.

155. Akthar, I .; Suarez, S .; Morillo, V.A .; Сасаки, М .; Ezz, M.A .; Takahashi, K.I .; Shimada, M .; Marey, M.A .;

Миямото, А. Сперма проникает в железы преовуляторных эксплантатов эндометрия крупного рогатого скота и вызывает воспаление.

Репродукция 2019, 159, 181–192.

156. Ezz, M.A .; Marey, M.A .; Elweza, A.E .; Kawai, T .; Heppelmann, M .; Pfarrer, C .; Balboula, A.Z .; Монтазер,

А .; Imakawa, K .; Заабель, С.М .; и другие. Сигнальный путь TLR2 / 4 опосредует индуцированное спермой воспаление в

эпителиальных клетках эндометрия крупного рогатого скота in vitro. PLoS ONE 2019, 14, DOI: 10.1371 / journal.pone.0214516.

157. Elweza, A.E .; Ezz, M.A .; Acosta, T.J .; Талукдер, А.К .; Shimizu, T .; Hayakawa, H .; Шимада, М.; Imakawa,

K .; Zaghloul, A.H .; Миямото, А. Апровоспалительный ответ эпителиальных клеток эндометрия крупного рогатого скота на

активных сперматозоидов in vitro. Мол. Репродукция. Dev. 2018, 85, 215–226.

158. Franchi, L .; Warner, N .; Виани, К .; Нуньес, Г. Функция Nod-подобных рецепторов в распознавании микробов и защите хозяина

. Иммунол. Ред. 2009 г., 227, 106–128.

159. Inohara, N .; Chamaillard, M .; McDonald, C .; Нуньес, Г. Белки NOD-LRR: роль в микробных взаимодействиях хозяина

и воспалительных заболеваниях.Анну. Rev. Biochem. 2005, 74, 355–383.

160. Mariathasan, S .; Weiss, D.S .; Ньютон, К .; McBride, J .; О’Рурк, К .; Русе-Гирма, М .; Lee, W.P .; Weinrauch,

Y .; Monack, D.M .; Диксит, В. Криопирин активирует воспаление в ответ на токсины и АТФ. Природа

2006, 440, 228–232.

161. Barbé, F .; Дуглас, Т .; Салех, М. Достижения в биологии Nod-подобных рецепторов (NLR). Фактор роста цитокинов Ред.

2014, 25, 681–697.

162. Шредер К.; Tschopp, J. Инфламмасомы. Cell 2010, 140, 821–832.

163. Benko, S .; Magalhaes, J.G .; Philpott, D.J .; Жирардин, С. NLRC5 ограничивает активацию воспалительных путей

. J. Immunol. 2010, 185, 1681–1691.

164. Cui, J .; Zhu, L .; Xia, X .; Wang, H.Y .; Legras, X .; Hong, J .; Ji, J .; Shen, P .; Zheng, S .; Chen, Z.J .; и другие. NLRC5

негативно регулирует пути передачи сигналов интерферона NF-κB и I типа. Cell 2010, 141, 483–496.

165.Лоуренс Т. Путь ядерного фактора NF-kappaB при воспалении. Харб Холодного источника. Перспектива. Биол. 2009,

KRAS Активация и сверхэкспрессия SIRT1 / BCL6 способствует патогенезу эндометриоза и устойчивости к прогестерону

-5 [pii] (1999).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

Границы | Пептидогликан отключает опосредованное TLR2 распознавание сперматозоидов и запускает локализацию сперматозоидов в эндометрии крупного рогатого скота

Введение

У всех млекопитающих слизистая оболочка эндометрия обладает уникальной способностью бороться с патогенами, аллогенными сперматозоидами и полуаллогенными эмбрионами. ).Для достижения этого кажется вероятным, что матка оснащена эффективной и строго контролируемой врожденной иммунной системой слизистой оболочки, которая может по-разному реагировать на эти различные антигены (4). Эпителий эндометрия экспрессирует высококонсервативные специфические рецепторы распознавания образов (PRR), которые могут распознавать патогены через молекулярные паттерны, связанные с патогенами (PAMP), и повреждения тканей через молекулярные паттерны, связанные с повреждениями (DAMP) (5). Среди PRR Toll-подобные рецепторы (TLR) эффективно распознают практически все бактерии или их PAMP и вызывают ранний иммунный ответ, что приводит к экспрессии медиаторов воспаления (6).Следовательно, иммунные клетки (в основном полиморфноядерные клетки, PMN) привлекаются к месту инфекции, обеспечивая фагоцитоз вторгшихся микроорганизмов или фрагментов клеток (7, 8). Выявление этих ранних иммунологических механизмов в эндометрии во время патофизиологических состояний будет иметь первостепенное значение для оптимальной фертильности.

В частности, бактериальный пептидогликан (PGN) представляет собой липопептид-полимер, формирующий большую часть сухой массы бактерий G + ve (90%) и G-ve (20%), в то время как липополисахарид (LPS) составляет оставшуюся часть G -ve бактериальная клеточная стенка и является более сильным эндотоксином (9).ЛПС был обнаружен в крови и маточной жидкости коров с легким и тяжелым эндометритом (10), в то время как информация об уровнях PGN в просвете матки при клиническом и субклиническом эндометрите у коров отсутствует. При распознавании высокие уровни PGN / LPS активируют путь TLR2 / 4 и запускают каскады внутриклеточной передачи сигнала, которые стимулируют пагубное воздействие на иммунные ответы хозяина за счет высвобождения потенциально летального набора медиаторов воспаления (11). Однако устойчиво низкие уровни PGN (LPS) могут поддерживать хронические регуляторные эффекты на иммунный баланс хозяина, вероятно, из-за секреции противовоспалительных цитокинов (12, 13).

Спаривание или искусственное оплодотворение (AI) вызывает преходящие воспалительные реакции в эндометрии нескольких видов и характеризуется физиологическим притоком PMN в просвет матки для удаления бактерий, мертвой спермы и остатков тканей (14). Как и бактерии, сперматозоиды фагоцитируются с помощью PMN либо непосредственно через прикрепление клеток к клеткам, либо через внеклеточные ловушки нейтрофилов, которые захватывают сперматозоиды и препятствуют их подвижности (15). Считается, что быстрое удаление сперматозоидов предотвращает приобретенный иммунный ответ против сперматозоидов у маток, поскольку это критически важно для восприимчивости эндометрия и преимплантационного развития эмбриона (14).Наши недавние исследования показали, что активная, но не инактивированная нагреванием сперма стимулировала временную экспрессию мРНК воспалительных генов в эпителиальных клетках эндометрия быка (BEEC) (16) посредством запуска сигнальных путей TLR2 / 4 (17), которые увеличивали фагоцитоз PMN в отношении сперматозоидов in vitro (16). Более того, в модели ex vivo , сперма крупного рогатого скота преимущественно мигрировала в железы эндометрия « сенсоры сперматозоидов » и инициировала воспалительную реакцию, связанную с присутствием PMNs вместе со спермой (18).

Поскольку эндометрий крупного рогатого скота распознает PGN / LPS и сперму через пути TLR2 / 4 (5, 17), это исследование было направлено на изучение конкурентных и патофизиологических взаимодействий во время совместного воздействия на слизистую оболочку эндометрия сперматозоидов в присутствии или в отсутствие. ПГН / ЛПС. Наши первоначальные наблюдения показали, что только низкие уровни PGN, но не LPS, блокируют индуцированные спермой воспалительные реакции в BEEC in vitro. Более того, недавно было сообщено, что взаимодействие сперматозоидов с иммунологической защитой матки опосредовано в основном железистым эпителием (18).Соответственно, мы использовали модель ex vivo интактных эксплантатов эндометрия крупного рогатого скота, чтобы исследовать влияние очень малых количеств PGN на место и динамику взаимодействия сперматозоидов со слизистой оболочкой матки в условиях, которые больше напоминают in vivo . Насколько нам известно, этот тип конкурентного перекрестного взаимодействия не был описан, и, таким образом, понимание его основных механизмов может иметь важные трансляционные последствия в контексте иммунологии репродуктивных слизистых оболочек.

Материалы и методы

Этическое разрешение

Комитет по экспериментам на животных при Университете сельского хозяйства и ветеринарной медицины Обихиро одобрил все экспериментальные протоколы и методы (разрешение № 27-74).

Дизайн эксперимента

Для описания воздействия патогенных лигандов TLR2 / 4 (PGN / LPS) на иммунных перекрестных помех между сперматозоидами и маткой , мы использовали исследования in vitro и ex vivo , описывающие возможные различные способы экспозиция.

In Vitro Study

Первоначально, чтобы исследовать конкурентное взаимодействие LPS / PGN и сперматозоидов с эпителием эндометрия, субконфлюентные монослои BEEC (90%) стимулировали PGN (LPS) на высоком уровне (100 и 1000 нг / мл ^{— 1} ) или низких (1, 10 и 100 пг / мл ^-1 ) концентраций в течение 24 часов с последующим совместным культивированием со спермой (5 × 10 ⁶ мл ^-1 ) в течение 6 часов. Основываясь на результатах, больше внимания было уделено влиянию низких концентраций PGN на воспаление, вызванное сперматозоидами в BEEC.Чтобы оценить прямую реакцию BEEC на только PGN, BEEC подвергались воздействию различных концентраций PGN в зависимости от времени. Более того, компоненты каскада MAPK, запускаемые сперматозоидами, оценивались после предварительного воздействия PGN. Для активации или блокирования пути TLR2 использовали агонист TLR2 (pam3Cys) или антагонист (CU-CPT22) соответственно. Кондиционированные среды (CM) из совместной культуры сперматозоидов и BEEC после предварительного воздействия PGN собирали и использовали для заражения периферических PMN, выделенных от зрелых здоровых коров.Впоследствии были измерены иммунные ответы PMN и фагоцитарная активность в отношении сперматозоидов. Руководствуясь нашими предыдущими исследованиями (16–18), мы оценили транскрипты мРНК TNFA, IL1B, IL8, PGES1, TLR2 и TLR4 в качестве кандидатов на биомаркеры воспаления на протяжении всего исследования (рис. 1A).

Рисунок 1 Схематическое изображение дизайна эксперимента исследования: (A) in vitro модель . Первоначально мы исследовали конкурентное взаимодействие LPS / PGN и сперматозоидов с эпителием эндометрия с помощью ОТ-ПЦР.Основываясь на результатах, мы уделили больше внимания влиянию низких концентраций PGN на вызванное спермой воспаление в эпителии эндометрия. В качестве основного эксперимента субконфлюэнтные монослои BEEC (90%) стимулировали PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов с последующим совместным культивированием со спермой (5 × 10 ⁶ мл ^-1 ) для 6 ч. Влияние PGN на индуцированные спермой иммунные ответы в BEEC оценивали с помощью ОТ-ПЦР. Позже компоненты каскада MAPK, запускаемые спермой, в BEEC оценивали с помощью вестерн-блоттинга.Кондиционированную среду (CM) из совместной культуры спермы и BEEC после предварительного воздействия PGN собирали и использовали для заражения периферических PMN, выделенных от зрелых здоровых коров, в течение 2 часов. Впоследствии были измерены иммунные ответы PMN и фагоцитарная активность в отношении сперматозоидов (A) . Для оценки прямого ответа BEEC только на PGN, BEEC подвергались воздействию различных концентраций PGN в разные моменты времени. Для активации или блокирования пути TLR2 использовали агонист TLR2 (pam3Cys) или антагонист (CU-CPT22) соответственно. (B) ex vivo модель . Модель эксплантата интактного эндометрия использовалась для изучения мест взаимодействия и динамики сперматозоидов с эпителием эндометрия. Мы исследовали иммунные ответы и гистоморфологию, индуцированные спермой в ткани эндометрия в присутствии PGN. Кроме того, мы использовали трехмерную визуализационную микроскопию с высоким разрешением, чтобы проследить динамику и прикрепление сперматозоидов после освещения митохондриями JC-1 их средних частей (B) .

Ex Vivo Study

Использование изолированных монослоев BEEC может быть скомпрометировано нарушением архитектуры эндометрия и высвобождением DAMP во время обработки ткани, что может помешать изучению механизмов врожденного иммунитета и воспаления в эндометрии крупного рогатого скота ( 19).Таким образом, модель ex vivo интактных эксплантатов эндометрия крупного рогатого скота также использовалась для исследования способности PGN влиять на участки и динамику взаимодействий сперматозоидов с эпителием эндометрия. Наряду с анализом индуцированных спермой иммунных ответов и изменений в архитектуре тканей эндометрия, использовалась трехмерная микроскопия с высоким разрешением для отслеживания динамики и прикрепления сперматозоидов после освещения митохондриями JC-1 их средних частей (рис. 1B).

Взятие образцов матки от животных

Было подтверждено, что здоровая матка крупного рогатого скота до овуляции свободна от каких-либо патологических повреждений во время рутинной работы на бойне (16).Свежие образцы от животных были немедленно переданы в лабораторию и обработаны в строгих асептических условиях для культур клеток и органов.

Обработка спермы для совместного культивирования

Соломинки со спермой были получены от трех высокоплодородных быков голштинской породы, принадлежащих Генетической ассоциации Хоккайдо, Хоккайдо, Япония, где сбор и обработка спермы проводились с соблюдением строго контролируемых гигиенических мер, и в семени, как правило, доказывалось отсутствие любые бактериальные загрязнения.Соломинки со спермой обрабатывались по ранее описанному методу (16). Вкратце, девять соломинок (по три соломинки от каждого быка) размораживали на водяной бане при 38,5 ° C в течение 30 с, объединяли и трижды промывали, используя среду Тирода с альбумином, лактатом и пируватом (Sp-TALP). Трехмерный анализ движения с высоким разрешением с помощью компьютерной системы анализа сперматозоидов-анализа подвижности сперматозоидов ( CASA-SMAS) (DITECT, FHK, Токио, Япония) подтвердил подвижность сперматозоидов> 70%. Кроме того, прямой эффект природных и синтетических агонистов / антагонистов TLR2 на подвижность сперматозоидов оценивался в различные моменты времени (0, 30, 60 и 120 мин).Промытые сперматозоиды использовали для совместного культивирования с BEEC или интактными эксплантатами эндометрия.

Культура

BEEC

Выделение и культивирование

BEEC проводили в соответствии с ранее описанным протоколом (16) с небольшими модификациями. Клетки примировали преовуляторными уровнями эстрадиола (E2) (1 нг / мл ^-1 ) и прогестерона (P4) (50 пг / мл ^-1 ) до достижения слияния. Конфлюэнтность и неповрежденную целостность определяли с использованием выходных данных фракции площади (AF) на основе клеточной прозрачности и границ ( ImageJ software Version1.51j8). Чистоту эпителиальных клеток> 98% оценивали с использованием моноклональных антител против цитокератина (анти-цитокератин 8 + 18; ab53280, Abcam, Tokyo, Japan). Оптимальная жизнеспособность меченных аннексином V клеток была подтверждена с помощью FACS (Cell Sorter SH800S, Sony Biotechnology Inc., Ботелл, Вашингтон, США). Виментин-отрицательное окрашивание указывало на отсутствие загрязнения стромальными клетками. Более того, анализ FACS подтвердил отсутствие контаминации иммунных клеток с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином маркера гемопоэтических клеток мыши против CD45 (MA1-81458; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

Патогенные лиганды TLR2 / 4

Использовали сверхчистый полимерный PGN из G + ve Staphylococcus aureus (InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния, США) и ЛПС из G -ve Escherichia coli O55: B5 (Sigma-Aldrich) в качестве естественных лигандов TLR2 и TLR45 соответственно для лечения и совместного культивирования.

Активация и блокировка пути TLR2

Для активации агонистом TLR2 (17) субконфлюентные монослои BEEC предварительно подвергали действию pam3Cys-Ser- (Lys) 4, синтетического аналога триацилированной N-концевой части бактериального PGN. (ab142085, Abcam) (10 мкг мл ^-1 ) в течение 24 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 6 часов.Для блокирования антагонистом TLR2 (20) BEEC предварительно инкубировали с CU-CPT22, синтетическим блокатором TLR2 (Merck, Дармштадт, Германия) (0,1 мкМ = 36,24 нг / мл ^-1 ), в течение 3 часов перед экспонированием. к PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 6 часов.

ПЦР в реальном времени

РНК

экстрагировали из клеток с использованием реагента Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), как сообщалось ранее (17). Выделенную РНК количественно определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop Spectrophotometer 2000c (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), и чистоту каждого образца оценивали по соотношению A260 / A280.Синтез кДНК был выполнен в соответствии с ранее описанным протоколом (21) с небольшими изменениями. Сначала выполняли стадию обработки ДНКазой с использованием набора RQ1 RNase-Free DNase (Promega, Madison, WI, USA) для удаления остаточной геномной ДНК и других загрязняющих веществ. Экстрагированную РНК (1 мкг) инкубировали в течение 30 мин при 37 ° C в термоциклере (Eppendorf, Гамбург, Германия) с первой смесью, состоящей из 1 мкл RQ1-свободной ДНКазы, 10 × реакционный буфер, 2 мкл RQ1. ДНКаза, не содержащая РНКаз (1 ед. / Мкл), и вода, не содержащая нуклеаз (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), до конечного объема 10 мкл с последующим добавлением 1 мкл стоп-раствора ДНКазы RQ1 в течение 10 мин при 65 °. C, чтобы прекратить реакцию.КДНК первой цепи синтезировали в соответствии с коммерческим протоколом, описанным в наборе обратной транскриптазы SuperScript ^® II (Invitrogen). Вкратце, обработанную ДНКазой РНК инкубировали при 65 ° C в течение 5 минут со второй смесью, состоящей из 1,5 мкл 3 мкг / мкл случайного праймера, 1,5 мкл 10 мМ смеси нуклеотидов для ПЦР (dNTP) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN , США) и воду, свободную от нуклеаз, до конечного объема 18 мкл. Затем третья смесь, состоящая из 6 мкл 5 × буфера для первой цепи, 3 мкл 0.1 М дитиотреитол и 1,5 мкл 40 единиц / мкл рекомбинантного ингибитора рибонуклеазы (Toyobo, Осака, Япония) добавляли в каждую пробирку, затем инкубировали при 42 ° C в течение 2 минут с последующим добавлением 0,2 мкл 200 единиц / мкл SuperScript. ™ II Обратная транскриптаза и термоциклер были запрограммированы на 25 ° C в течение 10 минут, 42 ° C в течение 50 минут и 70 ° C в течение 15 минут. Синтезированную кДНК хранили при -30 ° C. Уровни экспрессии мРНК выбранных нами генов определяли с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Токио, Япония).Проще говоря, всего 10 мкл реакционной смеси, состоящей из 2 мкл / образец синтезированной кДНК, 5 мкл QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN, Hilden, Германия), 0,2 мкл целевых пар праймеров (дополнительная таблица 1) и 2,8 мкл Готовили воду, не содержащую нуклеаз (Invitrogen). Затем была запущена программа амплификации с начальной стадией денатурации при 95 ° C в течение 15 минут, за которой следовали 40 циклов денатурации при 95 ° C в течение 15 секунд, отжиг при 51-55 ° C (в зависимости от каждого праймера) в течение 30 сек, удлинение при 72 ° C в течение 20 сек.Пары праймеров были разработаны с помощью Primer Express ^® Software v3.0.1 (Thermo Scientific). Вычисленные пороги цикла (Ct) были экспортированы в Microsoft ^® Office Excel, нормализованы с использованием ACTB (β-актин) в качестве домашнего гена, а метод сравнения дельта-дельта порогов был использован для количественной оценки кратного изменения между образцами (22 ). Все реакции были повторены трижды. Каждый запуск включал реакцию отрицательного контроля (NCT), контроль без обратной транскрипции РНК (NRT) и контроль с отрицательной обратной транскриптазой (MRT).

Иммуноблоттинг

BEEC предварительно подвергали воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 1 часа. Вкратце, образцы белка из лизированных BEEC экстрагировали электрофорезом в полиакриламидном геле с SDS (10%) и блоттингом, следуя инструкциям производителя антител. Неспецифические сайты блокировали, и мембраны инкубировали с первичными антителами против белков-мишеней TLR2, расположенных ниже по течению, запускаемых спермой (17) ( Дополнительная таблица 2).Интенсивность полос анализировали с помощью анализатора Gel-Pro (Media Cybernetics, Rockville, MD, США).

Культивирование PMN

Зрелые PMN от здоровых животных выделяли, как описано ранее (23). Жизнеспособность PMN, окрашенных йодидом пропидия (PI), составляла 99%, а чистота популяции составляла> 98% по оценке с помощью анализа FACS. PMN (7,0 × 10 ⁶ клеток на мл ^-1 ) инкубировали в CM сперматозоида-BEEC в течение 2 часов для определения экспрессии гена PMN про- и противовоспалительных цитокинов.

PMN Phagocytosis Assay

In vitro фагоцитоз сперматозоидов, вызванных PMNs, зараженными сперматозоидами-BEEC CM, был измерен, как подробно описано ранее (23), с небольшими изменениями. Уровень PMN с поглощенной спермой рассматривался как фагоцитарный индекс (PA). Подсчет 1000 PMN с фагоцитированной спермой проводился независимо двумя наблюдателями.

Ex vivo Совместное культивирование эксплантатов органов

Ex vivo органные эксплантаты эндометрия из преовуляторной матки культивировали в соответствии с ранее подробным протоколом (18, 19) с небольшими модификациями.Свежие интактные эксплантаты эндометрия предварительно подвергали воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 3 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 3 часов. Микроскопически исследованные эксплантаты сохраняли типичную гистоморфологию и адекватную жизнеспособность тканей, что подтверждено с помощью срезов тканей гематоксилином и эозином (H&E) (24) и экспрессией мРНК апоптозной каспазы 3 (25).

Histopathology

Фиксированные образцы были последовательно обезвожены этанолом, очищены до ксилолового сдвига и снова парафинизированы при 65 ° C в рамках стандартной методики FFPE, подробно описанной ранее (26).Срезы (толщиной 3 мкм) из эксплантатов ex vivo органов эндометрия окрашивали H&E. Полуколичественный подсчет гистоморфологических изменений проводился слепым методом в 10 полях, выбранных случайным образом с каждого предметного стекла для каждого животного, как описано ранее (27).

Иммуноокрашивание

Иммуноокрашивание использовали для оценки и сайт-специфической локализации экспрессии целевого воспалительного (TNFA) и сигнального (TLR2) белка-биомаркера, как описано ранее (17), с небольшими модификациями.Вкратце, срезы (3 мкм) инкубировали с первичными антителами против каждой белковой мишени (дополнительная таблица 3). Отрицательный (пропущенное первичное антитело) и соответствующий изотипу (изотип-IgG) контрольные ткани сравнивали для выявления неспецифического связывания и ложноположительной экспрессии. Система 3D-сканирования с высоким разрешением в сочетании с универсальным флуоресцентным микроскопом (Keyence, BZ-X800, Осака, Япония) использовалась для локализации распределения белков TNFA и TLR2 в ткани эндометрия. Фильтры BZ-X GFP (OP-87763), BZ-X RED (OP-87765) и BZ-X DAPI (OP-87762) были установлены для зеленой, красной и синей длин волн соответственно.Анализ средней интенсивности флуоресценции (MFI) и интегральной плотности (IntDen) произвольно выбранных полей был скорректирован в значения общей флуоресценции клеток (CTCF) после вычитания фоновой флуоресценции для полуколичественной оценки (28).

Визуализация сперматозоидов, меченных JC-1

Ex vivo органные эксплантаты эндометрия предварительно подвергали действию PGN / pam3Cys (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 3 часов. Сперматозоиды предварительно инкубировали с митохондриальным красителем JC-1 (AdipoGen, Сан-Диего, Калифорния, США) (6.4 мкМ) в течение 15 мин для мечения и визуализации сперматозоидов в эксплантах (18). Меченные JC-1 сперматозоиды (5 × 10 ⁶ ) культивировали совместно с эксплантатами, подвергнутыми воздействию PGN, и поведение и локализация сперматозоидов отслеживались в пределах от 5 до 30 минут. Полностью сфокусированное трехмерное изображение высокого разрешения с использованием универсального эпифлуоресцентного микроскопа (Осака, Япония), оснащенного терморегулируемой пластиной (TPi-SQX, Tokai Hit, Япония), использовалось для просмотра динамики и локализации сперматозоидов. в эксплантах. Во время записи фокус был отрегулирован, чтобы визуализировать все сперматозоиды, прикрепленные к железам и поверхностному эпителию.Видео, записанные через 30 минут, оценивали на количество сперматозоидов, локализованных в железах матки и в поверхностном эпителии, с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 1.51j8) (18).

Измерение кластера дифференцировки 44 (CD44) экспрессии мРНК и интенсивности флуоресценции в эндометрии крупного рогатого скота

Анализ RT-PCR был использован для проверки возможности экспрессии клетками эндометрия молекулы клеточной адгезии (CD44) в BEEC и эксплантатах. Иммунофлуоресцентный анализ с использованием кроличьих поликлональных антител к CD44 (1:50, 15675-1-AP, Proteinintech, США) (дополнительная таблица 3) использовали для подтверждения накопления CD44, особенно в железах эндометрия.

Анализ блокирования CD44

Эксплантаты эндометрия подвергали воздействию нейтрализующего антитела против CD44 (1: 500) (28) в течение 3 часов, промывали, подвергали воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 3 часов, а затем совместно -культивирован спермой, меченной JC-1. Записанные в течение 30 минут видео анализировали на количество сперматозоидов, связанных с железами и поверхностным эпителием, с помощью программного обеспечения ImageJ . Аналогичным образом, BEEC подвергали воздействию антитела против CD44 в течение 3 часов, промывали, подвергали воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов, а затем совместно культивировали со спермой в течение 6 часов с последующим анализом RT-PCR. для обнаружения проверенных генов.

Статистика

Мы обозначили животное как статистическую единицу, и данные по крайней мере трех-четырех повторных экспериментов были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Программное обеспечение GraphPad Prism 8.0 (Ла-Холла, Калифорния, США) использовалось для анализа различий между группами путем выполнения одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим пост-сравнительным тестом Бонферрони (> две группы) или t-тестом для двух выборок (две группы) со значительными различиями при ( * P <0,05, ** P <0.01 или *** P <0,001).

Результаты

Низкие концентрации PGN, но не LPS, подавляют индуцированные спермой воспалительные реакции в BEEC

Для исследования конкурентного взаимодействия PGN / LPS и сперматозоидов с эпителием эндометрия, BEEC подвергались воздействию PGN / LPS при высоких (100 и 1000 нг / мл ^-1 ) или низких концентрациях (1, 10 и 100 пг / мл ^-1 ) в течение 24 часов с последующим добавлением спермы в течение следующих 6 часов. Результаты показали, что совместное культивирование сперматозоидов с BEEC увеличивает экспрессию мРНК воспалительных цитокинов (TNFA и IL1B), воспалительных хемокинов (IL8) и PGES1 в BEEC.Более того, высокие концентрации LPS, независимо или в сочетании со спермой, значительно увеличивали уровни транскрипции тестируемых генов в BEEC по сравнению с только сперматозоидами (дополнительный рисунок 1A). Кроме того, предварительное воздействие на BEEC низкими уровнями LPS-индуцированных воспалительных реакций в BEEC, но не препятствует последующему воспалению, вызванному спермой, в BEEC (рис. 2A). Высокие концентрации PGN увеличивали уровни транскрипции тестируемых генов в BEECs ( Дополнительная фигура 1B ) .Тем не менее, низкие концентрации PGN не вызывали каких-либо значительных воспалительных реакций в BEEC (за исключением PGN 100 мкг / мл ^-1 ), они подавляли вызванное спермой изобилие экспрессии воспалительных генов в BEEC, и этот эффект был максимальным при PGN. (10 мкг / мл ^-1 ) (Рисунок 2B).

Рисунок 2 Низкие уровни PGN, но не LPS, подавляли стимулирующий эффект сперматозоидов на транскрипцию основных воспалительных цитокинов, хемокинов, PGES1 и TLR2 в BEEC.Субконфлюэнтные монослои BEEC подвергались воздействию (A), LPS (1, 10 и 100 мкг / мл ^-1 ) или (B) PGN (1, 10 и 100 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 ч с последующим совместным культивированием со спермой (5 × 10 ⁶ клеток мл ^-1 ) в течение 6 часов. Уровни транскрипции мРНК основных воспалительных генов ( TNFA, IL1B, IL8, PGES1, TLR2 и TLR4 ) количественно оценивали с помощью анализа ПЦР в реальном времени. Животное было обозначено как статистическая единица, и данные были получены из 3 повторных независимых экспериментов с использованием BEEC из 3 различных маток (3 лунки / обработка / эксперимент), представленных как среднее ± SEM.Звездочки обозначают значительную разницу (* P <0,05 ** P <0,01 или *** P <0,001) между различными группами лечения по сравнению с контрольной группой при каждой концентрации PGN / LPS. Звездочкой обозначена значительная разница (* P <0,05) между группами «сперма» и «PGN + сперма».

PGN-индуцированные немедленные и преходящие воспалительные реакции в BEEC

Здесь мы исследовали влияние прямого воздействия PGN (10, 100 и 1000 мкг / мл ^-1 ) на кинетику воспаления в BEEC в различные моменты времени (0 , 1, 3, 6, 12 и 24 ч).Результаты показали, что PGN дозозависимым образом начал повышать уровень транскриптов тестируемых генов через 1 час, затем ответ достиг своего пика через 3 часа, он начал спадать через 6 часов и полностью исчез через 12 часов. до 24 ч. Кроме того, PGN постоянно поддерживал высокие уровни транскрипции генов IL10 и TGFB1 через 1, 3, 6, 12 часов и снижались через 24 часа (Рисунок 3).

Рис. 3 PGN индуцирует временную повышающую регуляцию транскрипции основных про- и противовоспалительных маркеров в BEEC.Субконфлюэнтные монослои БЭК подвергали воздействию различных пикограммовых концентраций (10, 100 и 1000 пг / мл ^-1 ) PGN в разные моменты времени (0, 1, 3, 6, 12 и 24 ч). Экспрессию мРНК основных про- и противовоспалительных маркеров оценивали с помощью анализа RT-PCR. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 независимых экспериментов с использованием эпителиальных клеток из 3 различных маток (3 лунки / лечение / эксперимент). Звездочки обозначают значительную дисперсию (* P <0,05 ** P <0,01 или *** P <0.001) между различными группами концентраций PGN (пг / мл) по сравнению с контрольной группой (0 пг / мл) в каждый момент времени.

PGN-активируемое фосфорилирование JNK, вызванное спермой, как нижележащая мишень каскада передачи сигнала TLR2 в BEEC

Лигирование рецепторов TLR4 к их специфическому агонисту стимулирует два различных пути: MyD88-зависимый путь и TRIF-зависимый путь, в то время как лигирование TLR2 стимулирует только MyD88-зависимый путь (11). В нашем исследовании мы сосредоточились на уровнях фосфорилирования p38MAPK, ERK1 / 2 и JNK как нижестоящих мишеней MyD88-зависимых сигнальных путей и IRF3 как нижестоящих мишеней TRIF-зависимых сигнальных путей.БЭК предварительно подвергали воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов, промывали и затем совместно культивировали со спермой в течение 1 часа. Затем мы проанализировали уровни фосфорилирования p38MAPK, ERK1 / 2, JNK и IRF3 в качестве нижестоящих мишеней сигнальных путей TLR2 / 4, запускаемых спермой в BEEC (17). Анализ иммуноблоттинга показал, что либо PGN, либо сперма стимулировали уровни фосфорилирования p38MAPK, ERK1 / 2 и JNK в BEEC, тогда как PGN в сочетании со спермой предотвращали индуцированное спермой фосфорилирование компонента JNK в BEEC.Ни сперматозоиды, ни PGN не стимулировали фосфорилирование IRF3 в BEEC (рис. 4).

Рис. 4 Комбинация PGN нарушала инициируемое спермой фосфорилирование JNK в эпителии эндометрия. Субконфлюэнтные монослои BEEC подвергали воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 1 часа. Был проведен вестерн-блоттинг для оценки уровней фосфорилирования компонентов каскада митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) в клетках эндометрия.Экспрессия специфических антител против (A) P38 митоген-активированной протеинкиназы (p38MAPK), (B) фосфорилированной внеклеточной киназы, регулируемой сигналом (pERK1 / 2), (C) c-Jun N-концевой киназы ( JNK), (D) ядерный фактор, каппа-легкая цепь-энхансер активированных В-клеток (NF κ B), (E) Оценивали фосфоинтерфероновый регулирующий фактор 3 (pIRF3) и использовали β-актин. в качестве контроля загрузки в разных группах. Значение под каждым образцом указывает на кратное изменение уровня белка по сравнению с контролем.Интенсивность полос анализировали с помощью анализатора Gel-Pro (Media Cybernetics, Rockville, MD, США). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 независимых экспериментов с использованием эпителиальных клеток из 3 различных маток (3 лунки / лечение / эксперимент). Звездочки обозначают значительную разницу (* P <0,05) между различными группами по сравнению с контрольной группой.

Активация пути TLR2 блокировала индуцированный спермой воспалительный ответ в BEEC

Вышеупомянутые результаты побудили нас предположить, что сигнальный путь TLR2 является общей системой распознавания для распознавания PGN и сперматозоидов в BEEC.Чтобы выяснить это, монослои БЭК подвергали воздействию синтетического агониста TLR2 (pam3Cys; 10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 6 часов. Pam3Cys полностью блокирует экспрессию мРНК BEEC медиаторов воспаления в ответ на сперматозоиды (рис. 5A) по аналогии с PGN, и это может дополнительно подтвердить, что TLR2 является центральным путем распознавания сперматозоидов.

Рис. 5 Активация пути TLR2 подавляет стимулирующий эффект сперматозоидов на транскрипцию воспалительных цитокинов, в то время как блокада TLR2 устраняет подавляющий эффект PGN на вызванное спермой воспаление в BEEC. (A) Активация BEEC с помощью pam3Cys (синтетический агонист TLR2). Субконфлюэнтные монослои BEEC подвергали действию pam3Cys (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 6 часов. (B) Блокировка TLR2 синтетическим антагонистом TLR2. BEEC предварительно подвергали воздействию CU-CPT22 (0,1 мкМ = 36,24 нг / мл ^-1 ) в течение 3 часов с последующим воздействием PGN (10 пг / мл ^-1 ) в течение 24 часов перед совместным культивированием со спермой в течение 6 часов. . Экспрессию мРНК основных воспалительных генов оценивали с помощью анализа RT-PCR.Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 независимых экспериментов с использованием эпителиальных клеток из 3 различных маток (3 лунки / лечение / эксперимент). Звездочки обозначают значительную разницу (* P <0,05 ** P <0,01 или *** P <0,001) между различными группами по сравнению с контрольной группой.

Блокирование пути TLR2 устранило PGN-супрессивный эффект на воспалительные реакции на сперматозоиды BEEC

Аналогичным образом мы использовали синтетический антагонист TLR2 (CU-CPT22) для блокирования пути TLR2 в BEEC.Монослои БЭК подвергали воздействию CU-CPT22 в течение 3 часов, промывали и подвергали воздействию PGN в течение 24 часов перед совместным культивированием со спермой в течение 6 часов. Интересно, что блокатор TLR2 восстановил запускаемую спермой транскрипцию тестируемых генов, которая подавлялась PGN (рис. 5B). Эти находки могут означать, что передача сигналов TLR2 может быть общим путем для распознавания PGN и сперматозоидов в BEEC.

PGN подавляет стимулирующее воздействие кондиционированной среды сперматозоидов-BEEC на экспрессию гена PMN и фагоцитарное поведение

Наши предыдущие исследования документально подтвердили, что CM-BEEC сперматозоида усиливает фагоцитарную активность PMN в отношении сперматозоидов (16).Соответственно, в текущем исследовании BEEC подвергались воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов, промывались и совместно культивировались со спермой в течение 6 часов. Затем использовали сперматозоид-BEEC CM для стимуляции периферически выделенных зрелых PMN в течение 2 часов, а затем оценивали их воспалительные реакции. Кроме того, эти PMN культивировали со спермой в течение 1 часа для анализа фагоцитоза. Культивирование PMN в сперматозоиде-BEEC CM резко увеличивало экспрессию различных провоспалительных генов и мРНК C3 . Однако предварительное воздействие PGN блокировало эти ответы и увеличивало экспрессию противовоспалительных генов ( IL10 и TGFB1 ) в PMN (рис. 6A).В то же время инкубация PMN в CM сперматозоидов-BEEC увеличивала фагоцитарную активность PMN в отношении сперматозоидов. Напротив, предварительное воздействие PGN подавляло фагоцитоз сперматозоидов PMN (Фигуры 6B, C ) . Эти результаты предполагают, что секретом эндометрия , полученный из совместной культуры PGN-sperm-BEEC, может нарушать врожденные иммунные ответы PMN на сперму.

Фигура 6 (A) PGN подавляет стимулирующее воздействие среды, кондиционированной BEEC, на транскрипцию основных про- и противовоспалительных генов PMN in vitro .Зрелые PMN (7 × 10 ⁶ клеток на мл ^-1 ), выделенные из циркулирующей крови здоровых коров, заражали в течение 2 часов в CM, полученном из BEEC, подвергали воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 24 часов. промывали и культивировали со спермой в течение 6 часов. Экспрессию мРНК различных генов количественно оценивали с помощью анализа RT-PCR. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 независимых экспериментов, где звездочки обозначают значительную разницу (* P <0,05, или ** P <0,01) между различными группами по сравнению с контрольной группой. (B) PGN подавляло стимулирующее воздействие среды, кондиционированной сперматозоидами BEEC, на фагоцитарную активность PMN. Точно так же зрелые PMN (7 × 10 ⁶ клеток на мл ^-1 ) заражали в этой КМ в течение 2 часов с последующим совместным культивированием со спермой (7 × 10 ⁶ клеток на мл ^-1 ) в течение 1 часа. оценивали фагоцитоз. (B) Репрезентативные изображения фагоцитоза PMN для сперматозоидов. Увеличение: 200 × (левая панель) и 400 × (правая панель). (Контроль; C, PGN; P, сперма; S и PGN + сперма; P + S).Стрелки указывают на PMN, фагоцитирующие сперматозоиды. Масштабная линейка = 20 мкм. (C) Коэффициент фагоцитоза был независимо оценен двумя наблюдателями для 1000 клеток с использованием универсальной системы визуализации эпифлуоресценции с высоким разрешением (Keyence, BZ-X800, Осака, Япония). Результаты являются репрезентативными для 3 независимых испытаний с использованием 3 различных здоровых животных. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM со звездочкой, обозначающей значительную разницу (* P <0,05 ) между различными группами по сравнению с контрольной группой.Звездочкой обозначена значительная разница (* P <0,05) между группами «сперма» и «PGN + сперма».

PGN-блокированные воспалительные реакции в тканях эндометрия, вызванные спермой

Ex Vivo

Для дальнейшего подтверждения нашей гипотезы эксплантаты эндометрия подвергались воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 3 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 3 часов. 3 ч. Результаты RT-PCR показали, что PGN подавляет индуцированную спермой транскрипцию тестируемых генов в эксплантатах эндометрия (фигура 7A).Результаты иммунофлуоресценции показали, что совместное культивирование спермы с эксплантами увеличивает среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) экспрессированных белков TNFA и TLR2 в железистом эпителии (GE) и поверхностном эпителии (SE). В то время как добавление PGN к системе совместного культивирования сперматозоидов и эксплантатов устраняет MFI белков TNFA и TLR2 в этих специфических сайтах (Фигуры 7B-E). Эти данные дополнительно подтверждают ключевую связь между ответами эндометрия на PGN и сперму, возможно, через путь TLR2.

Рис. 7 PGN подавляет вызванные спермой изменения воспалительных генов и экспрессии белков, а также гистоморфологию в эксплантатах эндометрия ex vivo . (A) ПЦР-анализ в реальном времени уровней транскрипции мРНК стимулированных спермой воспалительных генов после воздействия PGN. Свежие преовуляторные эксплантаты подвергали воздействию PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 3 часов с последующим совместным культивированием со спермой в течение 3 часов. Оценивали экспрессию мРНК различных воспалительных генов.Звездочка обозначает значительную разницу (*** P <0,001) между различными группами по сравнению с контрольной группой, и данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. (B) Иммунофлуоресцентный анализ кандидата воспалительного маркера (TNFA) в ex vivo органных эксплантатах эндометрия. Иммуноокрашивание подтвердило интенсивное накопление TNFA (зеленый) в UG и поверхностном эпителии (SE) (стрелки) по сравнению со стромой (S) в группе «S», и это было отменено в группе «P + S». (C) Полуколичественная оценка скорректированной общей флуоресценции клеток (CTCF) TNFA была основана на средней интенсивности флуоресценции (MFI) и интегрированной плотности (IntDen) с помощью программного обеспечения ImageJ , выраженных в произвольных единицах флуоресценции (AU). DAPI был установлен как ядерное контрастное пятно (синий). Нормальный кроличий IgG заменял первичное антитело в отрицательном контроле (C-). (D) Иммунофлуоресцентный анализ сигнального маркера (TLR2) в ex vivo органных эксплантатах эндометрия.Иммуноокрашивание подтвердило интенсивное накопление TLR2 (красный), индуцированное спермой (группа «S»), особенно в UG и SE (стрелки), по сравнению со стромой (S) и по сравнению с группой C и другими обработанными группами (P и P + S). ). (E) Полуколичественная оценка скорректированной общей флуоресценции клеток (CTCF) TLR2, выраженной в произвольных единицах флуоресценции (AU). Сигнал флуоресценции регистрировали с использованием универсальной системы визуализации эпифлуоресценции с высоким разрешением (Keyence, BZ-X800, Осака, Япония). Фильтры BZ-X GFP (OP-87763), BZ-X RED (OP-87765) и BZ-X DAPI (OP-87762) были установлены для зеленой, красной и синей длин волн соответственно.Были оценены случайные изображения из 3 независимых экспериментов (с использованием 3 различных здоровых предовуляторных маток от 3 разных животных), и результаты были статистически проанализированы, где звездочки обозначают значительную дисперсию (* P <0,05 и *** P <0,001) между различными группами при сравнении с контрольной группой, и данные представлены как среднее ± SEM. Увеличение: 200 ×. Масштабная линейка = 50 мкм. (F) Репрезентативные микрофотографии, показывающие тонкую воспалительную реакцию, вызванную спермой в группе «S», представленную обратимым повреждением ткани эндометрия, особенно в маточных железах (UG), поверхностном эпителии (SE) или отверстии железы (GO) (короткие стрелки), но не в строме (S).Полуколичественный балл гематоксилина и эозина (H&E) для эпителиальной дегенерации (G), и (H), легкой нейтрофильной инфильтрации (PMN) (стрелки) в UG использовали для количественной оценки степени патогистологических изменений по сравнению с другими группами (C, P и P + S), где звездочки обозначают значительную дисперсию ( *** P <0,001 ) ± SEM. Увеличение: 400 ×. Масштабная линейка = 200 мкм.

PGN Abrogated Sperm-индуцированное повреждение ткани и рекрутирование PMN в эндометриальные железы

Гистоморфология маточных эксплантатов показала, что сперма вызвала легкую степень обратимого повреждения ткани (дегенерацию эпителия) в железистом эпителии и слизистой оболочке, с заметными инфильтрациями PMN маточные железы.С другой стороны, добавление PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в систему совместного культивирования сперматозоидов и эксплантатов полностью блокировало индуцированные спермой изменения в архитектуре тканей эндометрия (Рисунки 7F-H).

PGN Повышенное прикрепление сперматозоидов к железам эндометрия и поверхностному эпителию

Для анализа динамики сперматозоидов ex vivo интактных эксплантатов ткани эндометрия подвергались воздействию PGN (0 или 10 мкг / мл ^-1 ) в течение 3 часов с последующим прямым воздействием. -культура со спермой, меченной JC-1.Уже через 5 минут сканирующая эпифлуоресцентная микроскопия показала, что огромное количество сперматозоидов сосредоточено в основном в железах, и их жгутики продолжают биться до 30 минут. Предварительное воздействие PGN заметно увеличивало локализацию сперматозоидов в железах и, соответственно, в поверхностном эпителии (рис. 8D и дополнительное видео 1, 2). Кроме того, обработка эксплантов pam3Cys (10 мкг / мл ^-1 ) запускала прикрепление сперматозоидов к эпителию эндометрия (дополнительное видео 3).

Рис. 8 Кластер дифференцировки 44 (CD44) экспрессируется в эндометрии крупного рогатого скота и вовлечен в массивное прикрепление сперматозоидов к железам эндометрия и просветному эпителию, вызванное PGN. (A) Анализ RT-PCR выявил повышенную экспрессию мРНК CD44 в BEEC in vitro (a.1) и в ткани эндометрия ex vivo (a.2). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 независимых экспериментов с использованием эпителиальных клеток или эксплантатов из 3 различных маток (3 лунки / лечение / эксперимент). Звездочки обозначают значительную дисперсию ( * P <0,05 или *** P <0,001 ). (B) Иммунофлуоресцентный анализ молекулы клеточной адгезии (CD44) в ex vivo органных эксплантатах эндометрия.Иммуноокрашивание подтвердило интенсивное накопление CD44 (красный) (стрелки), индуцированное PGN + спермой (группа «P + S»), особенно в UGs и в SE (стрелки) по сравнению со спермой «S» и другими группами (C и P). . Увеличение: 200 ×. Масштабная линейка = 50 мкм. (C) Полуколичественная оценка скорректированной общей флуоресценции клеток (CTCF) CD44, выраженного в UG в виде произвольных единиц флуоресценции (AU). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 независимых экспериментов с использованием эксплантатов из 3 различных маток (3 лунки / лечение / эксперимент).Звездочки обозначают значительную дисперсию ( ** P <0,01 или *** P <0,001 ). (D) PGN вызвал массивную ассоциацию сперматозоидов с железами матки (стрелки) и поверхностным эпителием (SE) (стрелки) по сравнению с контролем (сперма). Результатом было предварительное воздействие на эксплантаты эндометрия поликлональных антител против CD44 кролика в течение 3 часов с последующим воздействием PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в течение 3 часов и совместным культивированием со спермой в течение 3 часов (Ab + P + S). в минимизации PGN-триггерного прикрепления сперматозоидов (P + S) в эксплантатах эндометрия, и большая часть сперматозоидов активно высвобождалась и обнаруживалась, что они свободно плавают на поверхностном эпителии (Ab + PGN + S) (дополнительное видео 4).Увеличение: 200 ×. Масштабная линейка = 200 мкм. (E) Программное обеспечение ImageJ (версия 1.51j8) использовалось для подсчета локализованных сперматозоидов в (дополнительные видео 1 и 2). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 3 независимых экспериментов с использованием эксплантатов из 3 различных маток. Звездочки обозначают значительную разницу (*** P <0,001) между различными группами по сравнению с контролем (только для спермы).

PGN-триггерное прикрепление сперматозоидов к слизистой оболочке эндометрия

через Усиление кластера дифференцировки 44 (CD44)

Мы предполагаем, что адгезионная молекула CD44 участвует в PGN-триггерной локализации сперматозоидов в железах эндометрия и поверхностном эпителии.Анализ RT-PCR показал, что комбинация PGN со спермой усиливает экспрессию мРНК CD44 как в BEEC, так и в моделях эксплантатов (фиг. 8A). Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил соответствующее увеличение экспрессии белка CD44, особенно в железах и поверхностном эпителии (Фигуры 8B, C ) . Кроме того, добавление нейтрализующего антитела против CD44 минимизировало прикрепление сперматозоидов к этим уникальным участкам, и казалось, что сперматозоиды свободно перемещаются по поверхностному эпителию (Фигуры 8D, E , и дополнительное видео 4).Результаты предполагают, что CD44 играет основную роль в инициируемом PGN прикреплении большого количества сперматозоидов к слизистой оболочке эндометрия.

Обсуждение

Поверхности слизистой оболочки женских половых путей являются первой линией защиты от потенциально патогенных микроорганизмов. Действительно, матка не является полностью стерильной полостью, как это считалось классически; Недавно использование секвенирования 16S рРНК предоставило несколько доказательств того, что слизистая оболочка эндометрия человека богата микробиотой с преобладанием Lactobacillus (> 90% Lactobacillus spp.) и незначительные изменения комменсальной колонизации матки могут отрицательно повлиять на местный иммунитет, восприимчивость эндометрия и фертильность (29–31). Наше исследование предоставляет доказательства того, что присутствие следов патогенного PGN десенсибилизирует слизистую оболочку эндометрия для распознавания сперматозоидов и, таким образом, предотвращает запускаемые спермой иммунные ответы в эпителии эндометрия, в основном через MyD88-зависимый путь передачи сигналов TLR2. Следовательно, воспалительный ответ и фагоцитарная активность PMN в отношении сперматозоидов были заблокированы.Более того, PGN интенсивно увеличивает прикрепление сперматозоидов к железам эндометрия и поверхностному эпителию через активацию молекулы адгезии CD44. Результаты продемонстрировали, что при легких патофизиологических условиях присутствие остатков PGN нарушает временное физиологическое воспаление, вызванное спермой в эпителии эндометрия, что, возможно, приводит к нарушению очищения матки и последующей восприимчивости и развитию эмбриона.

Инициирование врожденных иммунных ответов через сигнальный путь TLR зависит от природы стимула, времени стимуляции и поверхностей взаимодействия на их внеклеточном домене, который активирует множественные сигнальные адаптерные белки по крайней мере двумя различными путями, MyD88-зависимый путь (используется все TLR) и TRIF-зависимый путь (используется только TLR3 и TLR4) (11, 32, 33).Ранее мы сообщали, что сперма индуцирует провоспалительные ответы в BEECs через сигнальный путь TLR2 / 4 (17). В настоящем исследовании стимуляция BEEC высокими концентрациями агонистов TLR4, LPS, независимо или в сочетании со спермой, вызвала резкие воспалительные реакции в BEEC по сравнению со спермой. Кроме того, предварительное воздействие на BEEC низких уровней LPS вызывало легкие воспалительные реакции в BEEC, но не влияло на последующее воспаление, вызванное спермой, в BEEC.ЛПС — это высокоэффективный эндотоксин (9), который напрямую связывается с внеклеточным доменом TLR4 и быстро стимулирует широкий спектр нижестоящих сигнальных каскадов (в течение нескольких минут), что приводит к инициированию зависящих от времени воспалительных реакций в клетках эндометрия. (17, 34). В то время как сперматозоиды вызывают слабые и временные воспалительные реакции в клетках эндометрия, и их взаимодействие с доменом TLR4 может опосредоваться эндогенными лигандами (17). Таким образом, мы предполагаем, что TLR4-опосредованное распознавание сперматозоидов эндометрием или LPS может генерироваться посредством различных внутриклеточных сигнальных каскадов и нижестоящих адаптерных белков.Дальнейшие исследования необходимы для идентификации различных и / или взаимодействующих нижестоящих адапторных молекул пути передачи сигналов TLR4, запускаемых сперматозоидами или LPS в эпителии эндометрия.

Интересно, что наши данные показали, что низкие концентрации агониста TLR2, PGN, не вызывают каких-либо значительных воспалительных реакций в BEEC, но они полностью блокируют вызванное спермой воспаление в BEEC, что позволяет предположить, что существует решающая связь между ответами эндометрия на PGN и сперма, возможно, через путь TLR2.Однако способность высоких концентраций PGN независимо вызывать воспалительные реакции в BEEC может маскировать их подавляющий эффект на вызванные спермой иммунные ответы в BEEC в сочетании со спермой. Аналогичным образом, добавление PGN (10 мкг / мл ^-1 ) в культуру BEEC, примированную уровнями E2 и P4 на лютеиновой стадии, с последующим совместным культивированием со спермой, явно подавляло индуцированные спермой воспалительные реакции в BEEC (дополнительный рисунок 2). ), что означает, что подавляющий эффект PGN на вызванное спермой воспаление в BEEC не было связано с уровнями половых стероидов.Более того, наши выводы о том, что предварительное или совместное воздействие BEEC на PGN (10 мкг / мл ^-1 ) блокировало воспалительные реакции BEEC на сперматозоиды (дополнительный рисунок 3), показывают, что PGN может конкурентно занимать и блокировать связывание сперматозоидов с TLR2. и тем самым препятствует иммунным ответам, вызванным сперматозоидами, в BEEC (35). Это может быть связано с высоким сродством PGN к связыванию с рецепторами TLR2 (36). Более того, результаты показали, что в зависимости от дозы PGN стимулировал транскрипцию воспалительных цитокинов через 1 час, достиг пика через 3 часа, начал спадать через 6 часов и полностью исчез через 12-24 часа.Интересно, что паттерн воспаления эндометрия, индуцированного PGN, был относительно аналогичен паттерну, вызванному синтетическим агонистом TLR2, pam3Cys (17), а также спермой (16), что снова указывает на то, что путь TLR2 участвует в PGN и системе восприятия сперматозоидов. в БЭК. Кроме того, PGN постоянно повышал уровень транскрипции IL10 и TGFB1 до 12 часов и снижался через 24 часа. Эти результаты ясно показывают, что PGN вызывает быстрые и временные воспалительные реакции в BEEC, которые исчезают по мере разрешения амплитуды воспаления и достигают исходного уровня через 24 часа.Посредством этого процесса BEEC могут находиться в состоянии инактивации из-за относительного истощения их воспалительных депо (37), тем самым теряя свою способность воспринимать и отвечать на сигналы сперматозоидов через TLR2 (аутокринный эффект ) . Хотя сперматозоиды экспрессируют рецепторы TLR2 (38), наши данные показали, что предварительное воздействие на сперматозоиды PGN не препятствовало последующему воспалению, вызванному спермой, в BEECs in vitro (дополнительная фигура 4 ) , демонстрируя, что TLR2 сперматозоидов не являются участвует в подавляющем эффекте PGN на иммунные ответы сперматозоидов в эпителии эндометрия.

Анализ иммуноблоттинга показал, что либо PGN, либо сперматозоиды стимулировали уровни фосфорилирования p38MAPK, ERK1 / 2 и JNK как нижестоящих мишеней MyD88-зависимых сигнальных путей в BEEC, в то время как они не стимулировали фосфорилирование IRF3 как нижестоящих мишеней TRIF- зависимые сигнальные пути. Это предполагает, что передача сигналов TLR2, в частности MyD88-зависимый путь, действует как общий путь для распознавания PGN и сперматозоидов в BEEC. Результаты показали, что комбинация PGN со спермой предотвращает индуцированное спермой фосфорилирование JNK в BEEC.JNK представляет собой связанный со стрессом адаптерный белок (39, 40), необходимый для активации фактора транскрипции (AP-1) и, следовательно, усиления воспалительного сигнала (41). Эта тонкая модуляция передачи сигналов TLR2, индуцированная PGN, может нарушить весь каскад передачи сигнала TLR2, запускаемый сперматозоидами, и запустить новый дифференцированный инертный путь, который нарушает выработку воспалительных цитокинов / хемокинов и ослабляет реактивность BEEC на сперматозоиды (42, 43) . Тем не менее, активация или блокировка пути TLR2 с использованием его синтетического агониста или антагониста предотвращает индуцированный спермой воспалительный ответ и эффект PGN соответственно, что дополнительно подтверждает, что BEEC распознают сигналы сперматозоидов в основном через путь TLR2.Учитывая, что MyD88-зависимый путь является общим путем для TLR2 и TLR4 (11) вместе с тем фактом, что агонист и антагонист TLR2 могут индуцировать частичную перекрестную толерантность с путем TLR4 (44, 45), технически очень сложно прояснить этот вопрос. потенциальный вклад всего сигнального комплекса TLR2 / 4 в распознавание сперматозоидов эпителием эндометрия, который заслуживает дальнейших исследований.

Осеменение вызывает кратковременные физиологические воспалительные реакции в эндометрии, характеризующиеся рекрутированием ПЯН в просвет матки в течение 2–12 часов после осеменения (14, 46), что является первым важным врожденным иммунным ответом на удаление бактерий, избытка / мертвой спермы и обломки тканей и эти реакции усиливают восприимчивость эндометрия и преимплантационное развитие эмбриона (14).Следовательно, устойчивые или чрезмерные и постоянные уровни локально инфильтрированных PMN, наблюдаемые при патофизиологических состояниях, включая субклинический эндометрит (SE) (47), могут нарушить очищение матки и последующую восприимчивость эмбрионов. Наши результаты показали, что CM сперматозоидов-BEEC индуцировал провоспалительные реакции в PMN, как паракринный эффект секретома сперматозоида и эндометрия, в то время как предварительное воздействие PGN блокировало эти ответы и увеличивало экспрессию мРНК противовоспалительных генов ( IL10 и TGFB1 ).Соответственно, инкубация PMN в CM сперматозоидов-BEEC увеличивала фагоцитарную активность PMN для сперматозоидов, в то время как предварительное воздействие PGN снижало ее. Ингибирующее действие предварительного воздействия PGN на фагоцитоз PMN для сперматозоидов может быть связано с повышением экспрессии мРНК IL10 и TGFB1 , факторов, подавляющих фагоцитоз PMN (48), и подавлением экспрессии мРНК C3 , фактор стимуляции фагоцитоза PMN (49), в PMNs. Более того, PGN блокирует индуцированную спермой активацию экспрессии мРНК IL8 в PMN, сильном хемоаттрактанте для PMN (47).В целом, эти результаты частично могут объяснить молекулярный механизм, с помощью которого присутствие следов PGN во время инфекции матки оказывает пагубное влияние на взаимодействия сперматозоида и эндометрия за счет блокирования физиологического воспаления эндометрия, вызванного спермой, тем самым предотвращая приток транзиторных PMN и фагоцитоз. для спермы, что может быть причиной снижения фертильности при легких инфекциях. Действительно, было показано, что отсутствие инфильтрации PMNs в просвет матки через 4 часа после осеменения было связано с пониженным уровнем оплодотворения у коров с SE (50).

В том же контексте, используя ex vivo интактных эксплантатов эндометрия крупного рогатого скота, мы обнаружили, что PGN явно блокирует индуцированные спермой воспалительные реакции в ткани эндометрия. Кроме того, сперма вызвала легкую степень обратимого повреждения ткани (дегенерацию эпителия) в железистом и поверхностном эпителии с инфильтрацией PMN в основном в маточные железы, что указывает на то, что воспаление, вызванное спермой, не повреждает ткань эндометрия (51). Однако добавление PGN полностью блокировало вызванные спермой изменения в архитектуре тканей эндометрия.Эти наблюдения подтвердили наш основной вывод о том, что TLR2 является центральной системой распознавания сперматозоидов в эпителии эндометрия, особенно в железах. Следовательно, нарушение системы TLR2 с помощью PGN может быть связано с нефункциональной системой чувствительности слизистой оболочки к сперматозоидам, тем самым блокируя временные воспалительные реакции сперматозоидов в эндометрии крупного рогатого скота.

Было показано, что активные сперматозоиды не связываются с поверхностным эпителием слизистой оболочки эндометрия, а проникают и обнаруживаются в железах (18).Неожиданно мы обнаружили, что PGN значительно увеличивает прикрепление сперматозоидов к железам эндометрия и, соответственно, к поверхностному эпителию. Напротив, предварительная обработка тканей эндометрия LPS не изменяла прикрепления сперматозоидов к эпителию эндометрия. Учитывая это, PGN может индуцировать экспрессию CD44 через путь TLR2 (52), который обладает мощными адгезионными свойствами (53) и экспрессируется в резервуаре сперматозоидов для поддержки прикрепления сперматозоидов к эпителию яйцевода (54, 55). Таким образом, мы предположили, что CD44 может играть ключевую роль в этом PGN-инициируемом прикреплении сперматозоидов к эпителию эндометрия.Наши результаты показали, что PGN вместе со спермой увеличивают экспрессию CD44 в маточных железах и поверхностном эпителии. Интересно, что добавление нейтрализующего антитела против CD44 в совместную культуру PGN-сперматозоидов и эксплантата уменьшало прикрепление сперматозоидов к железам и поверхностному эпителию, но не устраняло подавляющее действие PGN на вызванное спермой воспаление ) . Аналогичным образом было показано, что во время оплодотворения кумулюсные клетки овулировавших комплексов кумулюс-ооцит экспрессируют CD44 для распознавания фрагментов гиалуронана, генерируемых из сперматозоидов, и, таким образом, воспалительные реакции в кумулюсных клетках индуцируются по TLR2 / 4-зависимому пути при добавлении нейтрализующего антитела к CD44 не влияли на воспаление, вызванное сперматозоидами в кумулюсных клетках (56).Ранее мы сообщали, что в зависимости от дозы сперма вызывает провоспалительные реакции в BEEC in vitro (16). Следовательно, мы предполагаем, что PGN блокирует TLR2-опосредованную систему восприятия сперматозоидов независимо от ее способности увеличивать прикрепление сперматозоидов к эпителию эндометрия через повышающую регуляцию экспрессии CD44 в ткани эндометрия. Способность PGN запускать прикрепление сперматозоидов к эпителию эндометрия вместе с его способностью блокировать индуцированную спермой экспрессию мРНК PGES1 , которая участвует в сократительной способности матки (57), может нарушать транспорт сперматозоидов и очищение матки.

В совокупности наши результаты могут служить доказательством концепции механизмов, лежащих в основе конкурентных патофизиологических взаимодействий во время либо оплодотворения умеренно инфицированной матки «до контакта», либо инфекции во время оплодотворения «совместное воздействие». Следы PGN, полученные практически от всех бактерий, нарушают чувствительную систему сперматозоидов и впоследствии вызывают воспалительные реакции в эндометрии крупного рогатого скота, что, в свою очередь, может мешать фертильности. Предлагаемые механизмы включают в себя десенсибилизированную систему врожденного иммунитета слизистой оболочки посредством модуляции MyD88-зависимого пути передачи сигналов TLR2, инактивации локально инфильтрирующих иммунных поглотителей спермы, PMN и запуска прикрепления сперматозоидов к ткани эндометрия, тем самым нарушая очищение матки и восприимчивость эмбриона.Однако, помимо наших исследований in vitro, и ex vivo, , важным следующим шагом будут дальнейшие исследования in vivo для понимания патофизиологии матки in vivo и ее пагубного воздействия на фертильность, например, посредством снижения зачатия. темп.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, представленные в этом исследовании, можно найти в онлайн-репозиториях. Названия репозитория / репозиториев и номера доступа можно найти в статье / Дополнительных материалах.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом экспериментов на животных при Университете сельского хозяйства и ветеринарной медицины Обихиро (разрешение № 27–74).

Вклад авторов

Исследование разработало IFE. WG, AAR, MaS и AM инициировали дизайн исследования, а MAM, MAZ, IA, TK, MoS и FN помогли в реализации. IFE и MAM предоставили статистический анализ. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантами на научные исследования (16H05013, 17F17407 и 20H03122) от Японского общества содействия науке (JSPS), Японской ассоциации новых технологий в животноводстве и фондов поощрения животноводства Японская гоночная ассоциация (JRA). IE получил стипендию для прохождения докторской программы от Министерства высшего образования Египта.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Мюррея Клейтона, Университет Висконсин-Мэдисон, США, за его интенсивную коррекцию английского языка, и Genetics Hokkaido за их щедрые поставки соломинок для спермы, используемых во всех экспериментах.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.619408/full#supplementary-material

Дополнительное видео 1 | Окрашивание митохондрий JC-1 освещает средние части сперматозоидов, связанные с поверхностью желез эндометрия.После добавления сперматозоидов в преовуляторные эксплантаты органов эндометрия ex vivo , сперма агрегировалась в отверстии железы через 5 мин (и снова через 30 мин) и (Фигура 7А). Видео флуоресценции снимали с помощью фильтра BZ-X RED (OP-87765), а затем использовали программное обеспечение ImageJ (версия 1.51j8) для подсчета локализованных сперматозоидов. Подсчет девяти полей с одинаковым размером кадра.

Дополнительное видео 2 | PGN (природный лиганд TLR2) запускал массивную ассоциацию сперматозоидов с железами и просветным эпителием в эксплантатах эндометрия ex vivo. Большие скопления подвижных жизнеспособных сперматозоидов с бьющимися хвостами, скопившиеся в маточных железах (UD) и между железами (в поверхностном эпителии) (SE). Видео было снято через 5 минут (и снова через 30 минут) после добавления спермы после 3-часового предварительного воздействия PGN (10 мкг / мл ^-1 ).

Дополнительное видео 3 | pam3Cys (синтетический лиганд TLR2) запускает массивную ассоциацию сперматозоидов с железами и просветным эпителием в эксплантатах эндометрия ex vivo. Большие скопления подвижных жизнеспособных сперматозоидов с бьющимися хвостами, скопившиеся в маточных железах (UD) и между железами (в поверхностном эпителии) (SE).Видео было снято через 5 минут (и снова через 30 минут) после добавления сперматозоидов после 3-часового предварительного воздействия pam3Cys (10 мкг / мл ^-1 ).

Дополнительное видео 4 | Блокирование CD44 предотвращает вызванную PGN ассоциацию сперматозоидов в маточных железах (UD) и поверхностном эпителии (SE) в эксплантатах эндометрия ex vivo. Видео было снято через 5 минут (и снова через 30 минут) после добавления спермы после 3-часовой предварительной обработки CD44 Ab и 3-часовой предварительной обработки PGN (10 мкг / мл ^-1 ).Было обнаружено, что большинство сперматозоидов, выпущенных из UG и SE, свободно плавают на SE, показывая нормальную подвижность и жизнеспособность.

Ссылки

1. Schjenken JE, Moldenhauer LM, Zhang B, Care AS, Groome HM, Chan HY, et al. МикроРНК miR-155 необходима для размножения регуляторных Т-клеток, чтобы обеспечить устойчивую устойчивость к беременности у мышей. Mucosal Immunol (2020) 13 (4): 609–25. DOI: 10.1038 / s41385-020-0255-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4.Quayle AJ. Врожденный и ранний иммунный ответ на заражение патогеном в женских половых путях и центральная роль эпителиальных клеток. J Reprod Immunol (2002) 57: 61–79. DOI: 10.1016 / s0165-0378 (02) 00019-0

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Тернер М.Л., Кронин Дж. Г., Хили Г. Д., Шелдон И. М.. Эпителиальные и стромальные клетки эндометрия крупного рогатого скота играют роль в врожденном иммунитете и инициируют воспалительные реакции на бактериальные липопептиды in vitro через Toll-подобные рецепторы TLR2, TLR1 и TLR6. Эндокринология (2014) 4: 1453–65. doi: 10.1210 / en.2013-1822

CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Schaefer TM, Desouza K, Fahey JV, Beagley KW, Wira CR. Экспрессия Toll-подобного рецептора (TLR) и TLR-опосредованная продукция цитокинов / хемокинов эпителиальными клетками матки человека. Иммунология (2004) 112 (3): 428–36. doi: 10.1111 / j.1365-2567.2004.01898.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Габлер К., Фишер К., Дриллих М., Эйнспанье Р., Хойвизер В.Зависящая от времени экспрессия мРНК выбранных провоспалительных факторов в эндометрии первородящих коров в послеродовом периоде. Репрод Биол Эндокринол (2010) 8: 152. doi: 10.1186 / 1477-7827-8-152

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Чапваня А., Мид К.Г., Фоли С., Нарсианди Ф., Эванс А.С., Доэрти М.Л. и др. Послеродовой воспалительный ответ эндометрия: нормальное физиологическое событие с потенциальными последствиями для фертильности крупного рогатого скота. Reprod Fert Dev (2012) 24: 1028–39.doi: 10.1071 / RD11153.8

CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Де Техада Г.М., Хайнбокель Л., Феррер-Эспада Р., Хайне Х., Александр К., Барсена-Варела С. и др. Липопротеины / пептиды — это вызывающие сепсис токсины бактерий, которые можно нейтрализовать синтетическими антиэндотоксиновыми пептидами. Sci Rep (2015) 5: 14292. doi: 10.1038 / srep14292

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Домен MJ, Joop K, Sturk A, Bols PE, Lohuis JA. Взаимосвязь между внутриматочным бактериальным заражением, уровнем эндотоксина и развитием эндометрита у послеродовых коров с дистоцией или задержкой плаценты. Териогенология (2000) 54 (7): 1019–32. doi: 10.1016 / s0093-691x (00) 00410-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Chi H, Barry SP, Roth RJ, Wu JJ, Jones EA, Bennett AM и др. Динамическая регуляция про-и противовоспалительных цитокинов с помощью MAPK-фосфатазы 1 (MKP-1) в ответах врожденного иммунитета. Proc Natl Acad Sci U S A (2006) 103 (7): 2274–9. DOI: 10.1073 / pnas.0510965103

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.Касиваги И., Морита Р., Счичита Т., Комай К., Саеки К., Мацумото М. и др. Smad2 и Smad3 обратно регулируют аутоиндукцию TGF-β в дендритных клетках, активированных Clostridium butyricum. Иммунитет (2015) 43: 65–79. doi: 10.1016 / j.immuni.2015.06.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Марей М.А., Юсеф М.С., Лю Дж., Морита К., Сасаки М., Хаякава Х. и др. Ангиотензин II увеличивает фагоцитоз сперматозоидов нейтрофилами in vitro : возможная физиологическая роль в яйцеводе крупного рогатого скота. Mol Reprod Dev (2016) 83 (7): 630–9. doi: 10.1002 / mrd.22672

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Эльвеза А., Эзз М.А., Акоста Т.Дж., Талукдер А.К., Симидзу Т., Хаякава Х. и др. Провоспалительный ответ эпителиальных клеток эндометрия крупного рогатого скота на активную сперму in vitro . Mol Reprod Dev (2018) 85 (3): 215–26. doi: 10.1002 / mrd.22955

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Ezz MA, Marey MA, Elweza AE, Kawai T., Heppelmann M, Pfarrer C, et al.Сигнальный путь TLR2 / 4 опосредует индуцированное спермой воспаление в эпителиальных клетках эндометрия крупного рогатого скота in vitro . PloS One (2019) 14 (4): e0214516. doi: 10.1371 / journal.pone.0214516

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Akthar I, Suarez S, Morillo VA, Sasaki M, Ezz MA, Takahashi KI, et al. Сперма попадает в железы преовуляторных эксплантатов эндометрия крупного рогатого скота и вызывает воспаление. Репродукция (2020) 159: 181–92. DOI: 10.1530 / REP-19-0414

CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Borges ÁM, Healey GD, Sheldon IM. Эксплантаты интактного эндометрия для моделирования врожденного иммунитета и воспаления крупного рогатого скота ex vivo . Am J Reprod Immunol (2012) 67 (6): 526–39. doi: 10.1111 / j.1600-0897.2012.01106.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Грабовски М., Бермудес М., Рудольф Т., Шрибар Д., Варга П., Мургейтио М.С. и др. Идентификация и проверка нового двойного низкомолекулярного антагониста TLR2 / 8. Biochem Pharmacol (2020) 177: 113957. doi: 10.1016 / j.bcp.2020.113957

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Yousef MS, Marey MA, Hambruch N, Hayakawa H, Shimizu T., Hussien HA, et al. Связывание сперматозоидов с эпителиальными клетками яйцевода усиливает экспрессию TGFB1 и IL10 в эпителиальных клетках, а также нейтрофилов in vitro: простагландин E2 в качестве основного регулятора противовоспалительного ответа в яйцеводе крупного рогатого скота. PloS One (2016) 11 (9): e0162309.doi: 10.1371 / journal.pone.0162309

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Schefe JH, Lehmann KE, Buschmann IR, Unger T., Funke-Kaiser H. Количественный анализ данных RT-PCR в реальном времени: современные концепции и новая формула «различия C T в экспрессии генов». Int J Mol Med (2006) 84 (11): 901–10. doi: 10.1007 / s00109-006-0097-6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Марей М.А., Мацукава Х., Сасаки М., Эзз М.А., Юсеф М.С., Такахаши К.И. и др.Эпителиальные клетки яйцевода крупного рогатого скота подавляют фагоцитарную активность нейтрофилов в отношении сперматозоидов, но не в отношении бактерий in vitro: иммунофлуоресценция и электронно-микроскопические наблюдения. Histol Histopathol (2020) 35 (6): 589–97. doi: 10.14670 / HH-18-172

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Zhang S, Mao W., Li Q, Gao R, Zhang Y, Gao L, et al. Влияние концентрации простагландина E2 на экспрессию фактора роста и пролиферацию клеток в эксплантатах эндометрия крупного рогатого скота и их кинетические характеристики. Reprod Domest Anim (2018) 53 (1): 143–51. doi: 10.1111 / rda.13083

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Suvarna KS, Layton C, Bancroft JD. Теория и практика гистологических методов Бэнкрофта . 8-е издание. Лондон: Эльзевир (2019). п. 139–52. doi.org/10.1016/C2015-0-00143-5.

Google Scholar

27. Мерриам А.А., Сюй Х, Дэвиссон Р.Л., Сонс Д.Л., Дуглас Северная Каролина. 901: Изменения пути комплемента в модели преэклампсии у мышей. Am J Obstet Gynecol (2017) 1: S514–5. doi: 10.1096 / fj.201701008R

CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Ран X, Чжоу П., Чжан К. Аутофагия играет важную роль в опосредовании стволовости и новой двойной функции EIG121 как в регуляции аутофагии, так и в регуляции стволовости клеток JEC карциномы эндометрия. Int J Oncol (2017) 51 (2): 644–56. doi: 10.3892 / ijo.2017.4047

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Беннер М., Ферверда Г., Йустен И., ван дер Молен Р.Г.Как микробиота матки может быть ответственна за рецептивный плодородный эндометрий. Обновление Hum Reprod (2018) 24 (4): 393–415. doi: 10.1093 / humupd / dmy012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Franasiak JM, Werner MD, Juneau CR, Tao X, Landis J, Zhan Y, et al. Микробиом эндометрия во время переноса эмбриона: секвенирование следующего поколения рибосомной субъединицы 16S. J Assist Reprod Genet (2016) 33 (1): 129–36. doi: 10.1007 / s10815-015-0614-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31.Chen C, Song X, Wei W, Zhong H, Dai J, Lan Z и др. Континуум микробиоты женских репродуктивных путей и его связь с заболеваниями, связанными с маткой. Нац Коммуна (2017) 8 (1): 875. DOI: 10.1038 / s41467-017-00901-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Ronni T, Agarwal V, Haykinson M, Haberland ME, Cheng G, Smale ST. Общие поверхности взаимодействия цитоплазматического домена toll-подобного рецептора 4 стимулируют множественные ядерные мишени. Mol Cell Biol (2003) 23 (7): 2543–55.doi: 10.1128 / mcb.23.7.2543-2555.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Эль-Заят С.Р., Сибайи Х., Маннаа Ф.А. Активация толл-подобных рецепторов, передача сигналов и нацеливание: обзор. Bull Natl Res Cent (2019) 43: 187. doi: 10.1186 / s42269-019-0227-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Кронин Дж. Г., Тернер М. Л., Гетце Л., Брайант К. Э., Шелдон И. М.. Toll-подобный рецептор 4 и MYD88-зависимые механизмы передачи сигналов врожденной иммунной системы важны для ответа на липополисахарид эпителиальными и стромальными клетками эндометрия крупного рогатого скота. Biol Reprod (2012) 86 (2): 51. doi: 10.1095 / biolreprod.111.092718

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Wang JE, Dahle MK, McDonald M, Foster SJ, Aasen AO, Thiemermann C, et al. Пептидогликан и липотейхоевая кислота при грамположительном бактериальном сепсисе: рецепторы, передача сигнала, биологические эффекты и синергизм. Shock (2003) 20 (5): 402–14. doi: 10.1097 / 01.shk.00000

.01859.0d

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36.Ваки Д., Мицудзава Х., Мураками С., Сано Х., Кониси М., Акино Т. и др. Внеклеточный домен toll-подобного рецептора 2 напрямую связывает пептидогликан, полученный из золотистого стафилококка. J Biol Chem (2002) 27: 24315-20. doi: 10.1074 / jbc.M107057200

CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Ван Дж., Форд Х.Р., Гришин А.В. NF-κB-опосредованная экспрессия MAPK фосфатазы-1 является ранней стадией десенсибилизации к лигандам TLR в энтероцитах. Mucosal Immunol (2010) 5: 523–34.doi: 10.1038 / mi.2010.35

CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Фудзита Ю., Михара Т., Окадзаки Т., Шитанака М., Кушино Р., Икеда С. и др. Toll-подобные рецепторы (TLR) 2 и 4 сперматозоидов человека распознают бактериальные эндотоксины и опосредуют апоптоз. Hum Reprod (2011) 26 (10): 2799–806. doi: 10.1093 / humrep / der234

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Fang L, Wu HM, Ding PS, Liu RY. TLR2 опосредует фагоцитоз и аутофагию через сигнальный путь JNK в RAW264, стимулированном Staphylococcus aureus.7 сот. Cell Signal (2014) 26: 806–14. doi: 10.1016 / j.cellsig.2013.12.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Johnnidis JB, Harris MH, Wheeler RT, Stehling-Sun S, Lam MH, Kirak O, et al. Регуляция пролиферации клеток-предшественников и функции гранулоцитов с помощью микроРНК-223. Nature (2008) 451 (7182): 1125–9. DOI: 10.1038 / nature06607

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Вентура Дж. Дж., Кеннеди Нью-Джерси, Лэмб Дж. А., Флавелл Р. А., Дэвис Р. Дж..c-Jun Nh3-терминальная киназа необходима для регуляции AP-1 фактором некроза опухоли. Mol Cell Biol (2003) 23 (8): 2871–82. doi: 10.1128 / mcb.23.8.2871-2882.2003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Ламан Дж. Д., Берт А., Пауэр С., Дзиарски Р. Бактериальный пептидогликан как фактор хронического воспаления головного мозга. Trends Mol Med (2020) 26 (7): 670–82. doi: 10.1016 / j.molmed.2019.11.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43.Троха К., Надь П., Пивовар А., Лаззаро Б. П., Хартли П. С., Бучон Н. Нефроциты удаляют пептидогликан, полученный из микробиоты, из системной циркуляции для поддержания иммунного гомеостаза. Иммунитет (2019) 51 (4): 625–37. doi: 10.1016 / j.immuni.2019.08.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Гейзель Дж., Каль Ф., Мюллер М., Вагнер Х., Киршнинг К. Дж., Аутенриет И.Б. и др. IL-6 и созревание определяют толерантность к агонистам TLR2 и TLR4 и перекрестную толерантность дендритных клеток. J Immunol (2007) 179 (9): 5811–8. doi: 10.4049 / jimmunol.179.9.5811

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. ЛеБлан ММ. Достижения в диагностике и лечении хронического инфекционного и пост-спариванного эндометрита у кобыл. Reprod Domest Anim (2010) 45 (Приложение 2): 21–7. doi: 10.1111 / j.1439-0531.2010.01634.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Cronin JG, Kanamarlapudi V, Thornton CA, Sheldon IM.Сигнальный преобразователь и активатор транскрипции-3 лицензирует Toll-подобный рецептор 4-зависимого интерлейкина (IL) -6 и продукцию IL-8 через IL-6 рецептор-положительную обратную связь в клетках эндометрия. Mucosal Immunol (2016) 9 (5): 1125–36. DOI: 10.1038 / mi.2015.131

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Ройлидес Э., Кацифа Х., Цапариду С., Стергиопулу Т., Пантелиадис К., Уолш Т.Дж.. Интерлейкин 10 подавляет фагоцитарную и антигифальную активность нейтрофилов человека. Cytokine (2000) 12 (4): 379–87. doi: 10.1111 / j.1574-695X.1996.tb00084.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Adhikary G, Sun Y, Pearlman E. Терминальная киназа C-Jun Nh3 (JNK) является важным медиатором воспаления роговицы, индуцированного Toll-подобным рецептором 2. J Leukoc Biol (2008) 83 (4): 991–7. doi: 10.1189 / jlb.1107783

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Kaufmann TB, Drillich M, Tenhagen BA, Forderung D, Heuwieser W.Распространенность субклинического эндометрита крупного рогатого скота через 4 часа после осеменения и его влияние на частоту зачатия в первый раз. Териогенология (2008) 71 (2): 385–91. DOI: 10.1016 / j.theriogenology.2008.08.005

PubMed Реферат | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Чу П.Й., Ли К.С., Райт П.Дж.. Дегенерация и апоптоз клеток эндометрия у суки. Териогенология (2006) 6-7: 1545–9. doi: 10.1016 / j.theriogenology.2006.01.018

CrossRef Полный текст | Google Scholar

52.Сенбанджо LT, Chellaiah MA. CD44: многофункциональный рецептор адгезии на клеточной поверхности, регулятор развития и метастазирования раковых клеток. Front Cell Dev Biol (2017) 7:18. eCollection 2017. doi: 10.3389 / fcell.2017.00018.eCollection2017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Thorne RF, Legg JW, Isacke CM. Роль трансмембранного и цитоплазматического доменов CD44 в координации адгезионных и сигнальных событий. J Cell Sci (2004) 117 (Pt 3): 373–80.doi: 10.1242 / jcs.00954

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Tienthai P, Yokoo M, Kimura N, Heldin P, Sato E, Rodriguez-Martinez H. Иммуногистохимическая локализация и экспрессия рецептора гиалуроновой кислоты CD44 в эпителии яйцевода свиньи во время эструса. Репродукция (2003) 125 (1): 119–32. doi: 10.1530 / rep.0.1250119

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Абэ Т., Фукухара Т., Вен Х, Ниномия А., Морииси К., Маэхара Й и др.CD44 участвует в индукции IP-10 в клетках, реплицирующих РНК HCV, посредством взаимодействия с TLR2 и гиалуронаном. J Virol (2012) 86 (11): 6159–70. doi: 10.1128 / JVI.06872-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

56. Шимада М., Янаи Ю., Окадзаки Т., Нома Н., Кавасима И., Мори Т. и др. Фрагменты гиалуроновой кислоты, генерируемые гиалуронидазой, секретируемой сперматозоидами, стимулируют продукцию цитокинов / хемокинов через пути TLR2 и TLR4 в кумулюсных клетках овулированных КОК, что может способствовать оплодотворению. Разработка (2008) 135 (11): 2001–11. doi: 10.1242 / dev.020461

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рекомендации по использованию озоновой терапии (O3) в лечении эндометриоза

Александр А., Коро Л., Парадизо Р., Далл’аглио Р., Александр А. М., Фрашини Ф. и Спаггиари П. Г. (2011). Лечение симптоматических дегенеративных патологий поясничного отдела позвоночника с помощью комбинированных консервативных биохимических методов лечения.Acta neurochirurgica. Приложение, 108, 127–135. https://doi.org/10.1007/978-3-211-99370-5_20

Алпай З., Саед Г. М. и Даймонд М. П. (2006). Женское бесплодие и свободные радикалы: потенциальная роль в спаечном процессе и эндометриозе. Журнал Общества гинекологических исследований, 13 (6), 390–398. https://doi.org/10.1016/j.jsgi.2006.05.002

Аталлах, Н. А., Кастро, А. А. Revisão sistemática da literatura e metanálise: a melhor forma de evidência para tomada de decisão em saúde e a maneira mais rápida de atualização terapêutica.Disponível em: http://www.epm.br/Cochrane

Анзолин, Ана Паула и Бертол, Чариз Даллазем. (2018). Ozonioterapia como terapêutica integrationtiva no tratamento da osteoartrose: uma revisão sistemática. БрДжП, 1 (2), 171-175. https://dx.doi.org/10.5935/2595-0118.20180033

Аугуля, А., Масторакос, Г., Ламбриноудаки, И., Христодулакос, Г., и Креатсас, Г. (2009). Роль оксидативного стресса в бесплодии, связанном с эндометриозом. Гинекологическая эндокринология: официальный журнал Международного общества гинекологической эндокринологии, 25 (2), 75–81.https://doi.org/10.1080/095135485012

Барбоса, Кириак Барра Феррейра, Коста, Неуза Мария Бруноро, Альфенас, Рита де Касия Гонсалвес, Де Паула, Сержиу Оливейра, Миним, Валерия Паула Родригес и Брессан, Жозефина. (2010). Estresse oxidativo: Conceito, implações e fatores modulatórios. Revista de Nutrição, 23 (4), 629-643. https://doi.org/10.1590/S1415-52732010000400013

Базо, М., Мальзи, П., Кортез, А., Розо, Г., Амуял, П., и Дараи, Э.(2007). Точность трансвагинальной сонографии и ректальной эндоскопической сонографии в диагностике глубокого инфильтрирующего эндометриоза. Ультразвук в акушерстве и гинекологии: официальный журнал Международного общества ультразвука в акушерстве и гинекологии, 30 (7), 994–1001. https://doi.org/10.1002/uog.4070

Беллелис, П., Диас, Дж. А., мл., Подгаек, С., Гонсалес, М., Баракат, Е. К., и Абрао, М. С. (2010). Эпидемиологические и клинические аспекты тазового эндометриоза — серия случаев.Revista da Associacao Medica Brasileira (1992), 56 (4), 467–471. https://doi.org/10.1590/s0104-42302010000400022

Боччи В. (1999). Биологические и клинические эффекты озона. Есть ли будущее у озонотерапии в медицине ?. Британский журнал биомедицинских наук, 56 (4), 270–279.

Боччи В. (2006). Правда ли, что озон всегда токсичен? Конец догмы. Токсикология и прикладная фармакология, 216 (3), 493–504. https://doi.org/10.1016/j.taap.2006.06.009

Боччи, В., Занарди, И., и Травагли, В. (2011). Кислород / озон как медицинская газовая смесь. Критическая оценка различных методов проясняет положительные и отрицательные аспекты. Исследования медицинских газов, 1 (1), 6. https://doi.org/10.1186/2045-9912-1-6

Боччи В. А., Занарди И. и Травагли В. (2011). Озон, действующий на кровь человека, вызывает горметическую зависимость доза-реакция. Журнал трансляционной медицины, 9, 66. https://doi.org/10.1186/1479-5876-9-66

Бинда, М.М., Молинас, С. Р., и Конинкс, П. Р. (2003). Реактивные формы кислорода и образование адгезии: клинические последствия для предотвращения адгезии. Репродукция человека (Оксфорд, Англия), 18 (12), 2503–2507. https://doi.org/10.1093/humrep/deg481

Брейди, Н., Изади, М., Суреда, А., Джонаиди-Джафари, Н., Банки, А., Набави, С. Ф., и Набави, С. М. (2018). Терапевтическая значимость озонотерапии при дегенеративных заболеваниях: основное внимание уделяется диабету и боли в спине. Журнал клеточной физиологии, 233 (4), 2705–2714.https://doi.org/10.1002/jcp.26044

Булун С. Э. (2009). Эндометриоз. Медицинский журнал Новой Англии, 360 (3), 268–279. https://doi.org/10.1056/NEJMra0804690

Да Брой, М. Г. и Наварро, П. А. (2016). Окислительный стресс и качество ооцитов: этиопатогенные механизмы минимального / легкого бесплодия, связанного с эндометриозом. Исследования клеток и тканей, 364 (1), 1–7. https://doi.org/10.1007/s00441-015-2339-9

Дэвис, Колин Дж.а; Макмиллан, Линдсейб Боль при эндометриозе: эффективность медикаментозного и хирургического лечения, Текущее мнение в акушерстве и гинекологии: декабрь 2003 г. — Том 15 — Выпуск 6 — стр. 507-512

Ди Паоло, Н., Боччи, В., и Гаджотти, Э. (2004). Озонотерапия. Международный журнал искусственных органов, 27 (3), 168–175. https://doi.org/10.1177/03

80402700303

Джуричич, Д., Валпотич, Х., и Самарджия, М. (2015). Профилактика и терапевтический потенциал озона в буйатрии: современные знания.Наука о воспроизводстве животных, 159, 1–7. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2015.05.017

Дуричич, Д., Валпотич, Х., Дура Лая, И., и Самарджия, М. (2016). Сравнение внутриматочных антибиотиков и озона в медицинских целях у овец с задержкой плаценты и после акушерской помощи. Размножение домашних животных = Zuchthygiene, 51 (4), 538–540. https://doi.org/10.1111/rda.12715

Fauconnier, A., Fritel, X., & Chapron, C. (2009).Отношения entre endométriose et algie pelvienne chronique: quel est le niveau de preuve? [Эндометриоз и тазовая боль: эпидемиологические данные о взаимосвязи и последствиях]. Гинекология, акушерство и оплодотворение, 37 (1), 57–69. https://doi.org/10.1016/j.gyobfe.2008.08.016

Франсиско, Вивиан Виейра, Д’Ипполито, Джузеппе, Сильва, Глаусиа Паласио де Андраде э, Безерра, Александр Серхио де Араужо и Сейнфельд, Якоб. (2005). Превосходство артефактов в экзаменах по магнетическому обмену делает живое использование секвенсии GRASE: Comparvel com as melhores seqüências rápidas ?.Радиология Бразилейра, 38 (5), 323-328. https://doi.org/10.1590/S0100-39842005000500003

Герра XV, Лимонта Ю.Н., Контрерас И.Х., Фрейре Р.Л., Рамирес AMP. Resultados de los costos en ozonoterapia. Преподобный Кубана Энфермер 1999; 15 (2): 104-108.

Гупта, С., Гольдберг, Дж. М., Азиз, Н., Голдберг, Э., Крайцир, Н., и Агарвал, А. (2008). Патогенетические механизмы бесплодия, связанного с эндометриозом. Фертильность и бесплодие, 90 (2), 247–257. https://doi.org/10.1016 / j.fertnstert.2008.02.093

Хан, Дж., Оливейра, Дж., И Бок, П. (2017). Не влияет на ядерный эритроид 2, связанный с фактором 2 (Nrf2), без сахарного диабета. Клинические и биомедицинские исследования, 37 (3). Получено с https://seer.ufrgs.br/hcpa/article/view/73

.

Эрнандес OD, Гонсалес RC. Ozonoterapia en úlceras flebostáticas. Rev Cubana Cir 2001; 40 (2): 123-129.

Сюй, А.Л., Хачикян, И., и Страттон, П.(2010). Инвазивные и неинвазивные методы диагностики эндометриоза. Клиническое акушерство и гинекология, 53 (2), 413–419. https://doi.org/10.1097/GRF.0b013e3181db7ce8

Джозеф, Дж., Аметепе, Э. С., Харибабу, Н., Агбаяни, Г., Кришнан, Л., Блейс, А., и Сад, С. (2016). Ингибирование АФК и активация воспалительных цитокинов с помощью FoxO3a способствует выживанию против Salmonella typhimurium. Nature Communications, 7, 12748. https://doi.org/10.1038/ncomms12748

.

Каспар, Дж.В., Нитур, С. К., и Джайсвал, А. К. (2009). Nrf2: передача сигналов INrf2 (Keap1) при окислительном стрессе. Свободнорадикальная биология и медицина, 47 (9), 1304–1309. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2009.07.035

Кеннеди, С., Бергквист, А., Чапрон, К., Д’Хуг, Т., Дунсельман, Г., Греб, Р., Хаммельшой, Л., Прентис, А., Саридоган, Э., и ESHRE Специальная группа по разработке рекомендаций по эндометриозу и эндометрию (2005). Руководство ESHRE по диагностике и лечению эндометриоза.Репродукция человека (Оксфорд, Англия), 20 (10), 2698–2704. https://doi.org/10.1093/humrep/dei135

Кобаяси, Э., Судзуки, Т., Фунаяма, Р., Нагашима, Т., Хаяси, М., Секин, Х., Танака, Н., Моригути, Т., Мотохаши, Х., Накаяма, К., И Ямамото, М. (2016). Nrf2 подавляет воспалительную реакцию макрофагов, блокируя транскрипцию провоспалительных цитокинов. Nature Communications, 7, 11624. https://doi.org/10.1038/ncomms11624

Лемос, Н.А., Арбо, Э., Скалько, Р., Вейлер, Э., Роза, В., и Кунья-Филхо, Дж. С. (2008). Снижение уровня антимюллерова гормона и изменение когорты фолликулярных яичников у бесплодных пациентов с легким / минимальным эндометриозом. Фертильность и бесплодие, 89 (5), 1064–1068. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2007.04.048

Лусс, Дж. К., Ван Лангендонкт, А., Дефрер, С., Рамос, Р. Г., Колетт, С., и Доннез, Дж. (2012). Эндометриоз брюшины — воспалительное заболевание. Границы биологических наук (элитное издание), 4, 23–40.https://doi.org/10.2741/358

Мол, Л. В., Морризон, Дж. Э., Шоллмейер, Т., Алкатаут, И., и Меттлер, Л. (2014). Хирургическая терапия эндометриомы яичника: частота рецидивов и наступления беременности. JSLS: Журнал Общества лапароэндоскопических хирургов, 18 (3), e2014.00223. https://doi.org/10.4293/JSLS.2014.00223

Мело, В. Л., Са, С. П. К., Пассос, М. Б. П., Феррейра, Х. Б. душ С., Алочиу, К. В., Сардинья, М. Т. М. У., и Кристовам, Б. П.(2020). Озониотерапия, реализующая пело Enfermeiro на imunomodulação em paciente com «Craurose vulvar»: relato de Experência. Исследования, общество и развитие, 9 (8). https://doi.org/10.33448/rsd-v9i8.6153

Менендес-Сеперо С. Общие протоколы, основанные на доказательствах. Труды 5-й встречи WFOT; 2016 18-20 ноября; Мумбаи, Индия. J Ozone Ther. 2018; 2 (2). DOI: 10.7203 / jo3t.2.2.2018.11125

Менгарда, К. В., Пассос, Э. П., Пикон, П., Коста, А.Ф. и Пикон П. Д. (2008). Validação de versão para o português de questionário sobre qualidade de vida para mulher com endometriose (Анкета профиля здоровья при эндометриозе — EHP-30) [Проверка бразильской версии опросника качества жизни для женщин с эндометриозом на португальском языке (Анкета профиля здоровья при эндометриозе — EHP) -30)]. Revista brasileira de ginecologia e obstetricia: revista da Federacao Brasileira das Sociedades de Ginecologia e Obstetricia, 30 (8), 384–392. https: // doi.org / 10.1590 / s0100-72032008000800003

Мерфи А. А., Сантанам Н., Моралес А. Дж. И Партхасарати С. (1998). Лизофосфатидилхолин, хемотаксический фактор моноцитов / Т-лимфоцитов, повышается при эндометриозе. Журнал клинической эндокринологии и метаболизма, 83 (6), 2110–2113. https://doi.org/10.1210/jcem.83.6.4823

Пачеко, Хосе Фернандо, Диаш, Рожериу, Силва, Марсия Гимарайнш да, Тристан, Андреа да Роша и Де Лука, Лауривал Антониу.(2003). Prevenção de aderências pélvicas: estudo experimental em ratas com differentes modalidades terapêuticas. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, 25 (5), 359-364. https://doi.org/10.1590/S0100-72032003000500009

Pereira A.S. и другие. (2018). Metodologia da pesquisa científica. Санта-Мария, RS: UFSM, NTE, 2018. Disponível em: https://repositorio.ufsm.br/bitstream/handle/1/15824/Lic_Computacao_Metodologia-Pesquisa-Cientifica.pdf?sequence=1. Доступ: 17 августа 2020 г.

Пекорелли А., Боччи В., Аквавива А., Бельмонте Г., Гарди К., Вирджили Ф., Чикколи Л. и Валаччи Г. (2013). Активация NRF2 участвует в активации озонированной сыворотки крови человека HO-1 в эндотелиальных клетках. Токсикология и прикладная фармакология, 267 (1), 30–40. https://doi.org/10.1016/j.taap.2012.12.001

Ре, Л., Мартинес-Санчес, Г., Бордиккья, М., Малканги, Г., Поконьоли, А., Моралес-Сегура, М. А., Ротшильд, Дж., И Рохас, А. (2014).Связан ли эффект предварительного кондиционирования озоном с путем активации Nrf2 / EpRE in vivo? Предварительный результат. Европейский журнал фармакологии, 742, 158–162. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2014.08.029

Ресио-дель-Пино, Эулалия, Ариас-Серрано, Марица, Родригес-дель-Рио, Магалис и Гарридо, Мария-де-лос-Анджелес. (1999). Aspectos de la ozonoterapia en pacientes con neuropatía periférica epidémica. Revista Cubana de Enfermería, 15 (2), 114–118. Recuperado en 07 de agosto de 2020, de http: // scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-0319199

00010&lng=es&tlng=es.

Пересмотренная классификация эндометриоза Американского общества репродуктивной медицины: 1996 г. (1997). Фертильность и бесплодие, 67 (5), 817–821. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(97)81391-x

Рудер, Э. Х., Хартман, Т. Дж., Блумберг, Дж., И Голдман, М. Б. (2008). Окислительный стресс и антиоксиданты: воздействие и влияние на женскую фертильность. Обновление репродукции человека, 14 (4), 345–357.https://doi.org/10.1093/humupd/dmn011

Рашворт, С. А., Зайцева, Л., Мюррей, М. Ю., Шах, Н. М., Боулз, К. М., и МакЭван, Д. Дж. (2012). Высокая экспрессия Nrf2 при остром миелоидном лейкозе человека обусловлена ​​NF-κB и лежит в основе его устойчивости к химиотерапии. Кровь, 120 (26), 5188–5198. https://doi.org/10.1182/blood-2012-04-422121

Шуг, Т. Т., Сюй, К., Гао, Х., Перес-да-Силва, А., Дрейпер, Д. В., Фесслер, М. Б., Пурушотам, А., и Ли, X. (2010).Миелоидная делеция SIRT1 индуцирует воспалительную передачу сигналов в ответ на стресс окружающей среды. Молекулярная и клеточная биология, 30 (19), 4712–4721. https://doi.org/10.1128/MCB.00657-10

Тиммулаппа, Р. К., Ли, Х., Рангасами, Т., Редди, С. П., Ямамото, М., Кенслер, Т. В., и Бисвал, С. (2006). Nrf2 является критическим регулятором врожденного иммунного ответа и выживаемости во время экспериментального сепсиса. Журнал клинических исследований, 116 (4), 984–995. https://doi.org/10.1172 / JCI25790

Травагли В., Занарди И., Бернини П., Непи С., Тенори Л. и Боччи В. (2010). Влияние обработки крови озоном на профиль метаболитов в крови человека. Международный журнал токсикологии, 29 (2), 165–174. https://doi.org/10.1177/10^809360069

Вибан-Хэнслер Р., Леон-Фернандес О.С., Фахми З. Системное применение озона, обширная аутогемотерапия и ректальная инсуффляция, оцененные в соответствии с Международной классификацией доказательной медицины.Новая основа возмещения медицинских расходов частным и социальным страхованием [аннотация]. Труды Всемирной конференции по озонотерапии в медицине, стоматологии и ветеринарии. Анкона (Италия). 22–23–24 сентября 2017 года. J Ozone Ther. 2019; 3 (4): 78. DOI: 10.7203 / jo3t.3.4.2019.15550

Ван Г., Токушиге Н., Маркхэм Р. и Фрейзер И. С. (2009). Богатая иннервация глубоко инфильтрирующего эндометриоза. Репродукция человека (Оксфорд, Англия), 24 (4), 827–834.https://doi.org/10.1093/humrep/den464

Уайкс, К. Б., Кларк, Т. Дж., И Хан, К. С. (2004). Точность лапароскопии в диагностике эндометриоза: систематический количественный обзор. BJOG: международный журнал акушерства и гинекологии, 111 (11), 1204–1212. https://doi.org/10.1111/j.1471-0528.2004.00433.x

Ю, Г., Лю, X., Чен, З., Чен, Х., Ван, Л., Ван, З., Цю, Т., и Вен, X. (2016). Озонотерапия может ослабить тубулоинтерстициальное повреждение у крыс с аденин-индуцированной ХЗП, опосредуя Nrf2 и NF-κB.Иранский журнал фундаментальных медицинских наук, 19 (10), 1136–1143.

Мери, З., Гарг, Б., Мозли-ЛаРю, Р., Мозли, А. Р., Смит, А. Х., и Чжан, Дж. (2019). Озонотерапия: потенциальное терапевтическое дополнение для улучшения женского репродуктивного здоровья. Медицинские газовые исследования, 9 (2), 101–105. https://doi.org/10.4103/2045-9912.260652

Зобель Р., Мартинец Р., Иванович Д., Рошич Н., Станчич З. и др. (2014) Внутриутробное введение озона для внутриутробного введения озона для улучшения фертильности у симментальского крупного рогатого скота, улучшающего фертильность у симментальского скота.Ветеринарский архив 84 (1): 1-8.

95 N-Ацетилцистеин как потенциальное средство лечения стойкого эндометрита, вызванного разведением лошадей

Устойчивый эндометрит, индуцированный разведением (PBIE), является основной причиной бесплодия у кобыл. Преходящее воспаление матки — нормальная реакция на размножение; однако кобылы, чувствительные к PBIE, своевременно не избавляются от этого воспаления. Воспаление матки во время опускания эмбриона из яйцеводов в конечном итоге приводит к ранней гибели эмбриона и клинически рассматривается как бесплодие.Выявлено несколько факторов риска PBIE, включая возраст, паритет, анатомическое строение, такое как плохое строение промежности и фиброз шейки матки, а также другие аномалии репродуктивного тракта. N-ацетилцистеин (NAC), муколитик, используемый для лечения эндометрита у кобыл, обладает противовоспалительными свойствами, влияет на воспалительные цитокины и является мягким ингибитором синтазы оксида азота. Повышенное содержание оксида азота, вызывающее расслабление гладких мышц и изменение воспалительных цитокинов, было зарегистрировано у кобыл PBIE.Целью нашего исследования было определить, снижает ли лечение NAC уровень оксида азота и воспалительных цитокинов, тем самым устраняя PBIE. Рандомизированное слепое клиническое испытание с перекрестным дизайном было проведено с использованием восприимчивых к PBIE кобыл (n = 10). Перед включением в исследование кобыл проверяли на бактериальный эндометрит, и использовали только кобыл с отрицательными бактериальными культурами. Никаких других обработок кобылам не применяли, пока они участвовали в исследовании. Внутриматочная инфузия 180 мл 3.3% NAC выполняли за 12 часов до осеменения, когда присутствовал фолликул> 35 мм. У кобыл брали пробы на цитологию эндометрия и эндометриальную жидкость для определения уровней воспалительных цитокинов (ELISA) и оксида азота (колориметрический анализ) через 12 и 72 часа после осеменения. Биопсии эндометрия брали в те же моменты времени после осеменения, чтобы определить экспрессию гена воспалительных цитокинов с помощью количественной ПЦР. Клинические признаки отека эндометрия и объем внутриматочной жидкости оценивали через 12, а затем каждые 24 часа после оплодотворения.Статистическую оценку данных проводили с использованием дисперсионного анализа с повторными измерениями. Воспаление матки, определяемое по процентному количеству нейтрофилов при цитологическом исследовании эндометрия (P = 0,0006), и экспрессия гена интерлейкина 6 (P = 0,003) были наивысшими через 12 часов. Отек матки был максимальным через 12 и 24 часа (P = 0,02), а объем маточной жидкости был максимальным через 24 часа (P = 0,02). Интересно, что уровни белка интерлейкина-6 не соответствовали экспрессии гена и были максимальными через 72 часа. В этом клиническом исследовании предварительное внутриматочное лечение NAC не влияло на уровни оксида азота, экспрессию генов цитокинов или клинические признаки PBIE.Однако картина воспаления, отмеченная в этом исследовании, соответствует описанной у кобыл PBIE. Тем не менее, оценка воспалительных цитокинов как на уровне гена, так и на уровне белка в разные моменты времени после ИИ в сочетании с клиническими признаками будет способствовать пониманию изменений уровней воспалительных цитокинов у кобыл, восприимчивых к PBIE.

Оценка удаленного мониторинга отела молочного скота как нового инструмента управления отелом | BMC Veterinary Research

Животные

Это исследование проводилось на молочной ферме, расположенной в Умбрии, регионе с умеренным климатом в центральной Италии (42 ° 95 ′ с.ш., 12 ° 39 ′ в.д.), в течение 4 лет.Всего для включения в анализ было доступно 984 записи [19]. Здоровые коровы и телки голштино-фризской породы, включенные в исследование, имели свободный доступ к общему смешанному рациону, состоящему из кукурузного силоса (9,20% CP, 45,90% NDF и 27% ADF), овсяного сена (8,70% CP, 61,30% NDF и 38,20%. ADF), пшеничная солома (4,60% CP, 78,90% NDF и 48,40% ADF) и концентрат (28,50% CP, 20,20% NDF и 9,70% ADF) в соотношении 17,3: 43,2: 22,9: 16,6 соответственно (по сухому веществу ). Доступна пищевая добавка, содержащая витамины и минералы.Животные были разделены на группы телок и повторнородящих коров в зависимости от их потомства и включены в исследование по следующим критериям:

• Возраст отела ограничен 22–30 месяцами для телок и 31–75 месяцев для повторнородящих коров;

• Диапазон четности от 1 (телки) до 5;

• Оценка состояния тела [20] из 3.75 ± 0,50 и 3,50 ± 0,25 (среднее ± стандартное отклонение) для телок и многоплодных коров соответственно;

• Нет патологий репродуктивной системы (при отелах и в послеродовом периоде).

Чтобы соответствовать вышеуказанным критериям, 392 животных были исключены по разным причинам (Рисунок 1).

Рисунок 1

Блок-схема, изображающая шаги, используемые для отбора животных, подходящих для исследования, и их подразделения на группы.

Были сохранены только новорожденные (одиночные или близнецы) от маток, которые на 50% состояли из голштинской или фризской породы без какого-либо известного компонента мясных пород. Всего осталось 592 записи (Рисунок 1). Подопытные животные были размещены в стойле для отела в условиях хорошей подстилки.

План эксперимента

План эксперимента включал шесть групп (рис. 1). Одна группа (H) состояла из телок (n = 360) и далее подразделялась на три подгруппы, первая из которых состояла из животных, находящихся под наблюдением с помощью устройства GSM (группа HMO, n = 60), вторая подгруппа из которых не наблюдалась и родила в тот же период времени, что и группа ОПЗ (группа HCB, n = 60), а третья подгруппа не наблюдалась и размещалась в сухой зоне с постоянным пометом (группа HUN, n = 240) .Вторая группа (M) состояла из 232 повторнородящих коров, разделенных на три подгруппы, первая из которых контролировалась с помощью устройства GSM (группа MMO, n = 60), вторая из которых не наблюдалась и рожала в тот же период времени, что и группа MMO (группа MCB, n = 60), а третья подгруппа не контролировалась и размещалась в сухой зоне с постоянным подстилкой (группа MUN, n = 112). Данные из групп HCB, HUN, MCB и MUN служили контролем; У этих неконтролируемых животных уровень помощи при отелах варьировался от некоторых (от 8 до 8).С 00:00 до 4:00) на небольшую помощь при отелах (одним человеком до конца дня). В течение всего экспериментального периода два раза в месяц использовалось программное обеспечение для управления фермой для случайного выбора животных на основе ожидаемой даты отела [19]. Только коровы, отелившиеся в течение 15 дней, были включены в исследование путем случайного распределения в одну из групп. Животные, отелившиеся в стойле для отела (HMO, HCB, MMO и MCB), были объединены в пары для анализа, тогда как все остальные коровы, отелившиеся в сухой зоне, были включены в группы HUN или MUN на основе паритета.Если отобранные животные не отелятся в течение 15 дней, они не включались в результаты.

Экспериментальная деятельность проводилась в соответствии с руководящими принципами по использованию животных для экспериментов, установленными Законодательным декретом Италии 116/92, и была одобрена Этическим комитетом Университета Перуджи и Министерством здравоохранения Италии.

Оценка до родов и применение внутривлагалищного GSM-устройства

Животных переводили в стойло для отела при появлении признаков неизбежного отела, таких как расслабление крестцово-седалищных связок, развитие вымени, увеличение вульвы и разглаживание морщин вульвы.Прототип был вставлен в краниальную часть влагалища за 3 ± 1 день до предполагаемого отела. Система состояла из внутривлагалищного устройства, которое выдвигалось на втором этапе отела и активировало радиопередатчик, который, в свою очередь, отправлял кодированный сигнал (433 МГц) на интегрированную систему приемника, подключенную к автонаборному устройству GSM (Sinclair, Mondialtec). Srl, Рим, Италия). Предупреждающее устройство для обнаружения доставки состояло из зонда, состоящего из двух штабелируемых частей: основания и цилиндрического бункера (рис. 2).Основание состояло из системы крепления, которая прикрепляла устройство к стенке влагалища, в то время как контейнер содержал физические датчики и передатчик, способный сигнализировать, когда устройство покидает тело животного. Передатчик отправил радиосигнал, декодированный принимающей станцией, которая активировала автоматический набор номера GSM.

Рисунок 2

Прототип интравагинального устройства, использованного в экспериментах.

Сарай для отела состоял из крытых участков (8 × 4 м) и отдельного места для размещения приемника GSM и передатчика.Приемник и автонабор находились в пределах 30 м от места отела. Пол коровника был засыпан пшеничной соломой, которую меняли ежедневно.

Акушерская и неонатальная помощь

Для контрольных животных (группы HCB, HUN, MCB и MUN) данные, относящиеся к акушерской и неонатальной помощи, не были доступны с точностью, поскольку отелы не наблюдались систематически; следовательно, степень трудности отела не могла быть определена. Фактически, только общая потребность в помощи при отеле, мертворождении, задержке плодных оболочек (FMR) и пролапсе матки была установлена ​​точно, потому что большинство отелов происходили ночью или не наблюдались, а персонал стойла не был обучен распознавать и регистрировать степень дистоции.

Для групп, контролируемых GSM, после активации радиочастотного сигнала было проведено физическое обследование родов и плода, положения и осанки, а также степени раскрытия шейки матки; эти данные были записаны. Во время фазы изгнания регистрировали развитие плода следующим образом: выпячивание вульвы передних ног, прохождение головы и полное изгнание.

Продолжительность родов, время от активации тревоги до изгнания плода, также регистрировалась. Согласно Ломбарду и др. ., дистоция была определена как отсроченные или затрудненные роды [21]. Процесс отела был разделен на пять категорий от 0 до 4 в зависимости от причины дистоции, где степень 0 означает эуттоцию или отсутствие необходимости в помощи; 1 = задержка второго периода родов; 2 = неправильное положение плода; 3 = диспропорция плода и таза; и 4 = стеноз вульвы или шейки матки и перекрут матки. Помощь при отеле оказывалась при задержке второго периода родов более чем на 90 мин с момента срабатывания сигнализации.Ведение дистоции проводилось в соответствии с признанными акушерскими процедурами [22, 23]. После предварительного изучения данных и определения постепенного увеличения трудности отела, категория 1 была объединена с 2 в единую категорию 1, определенную как «легкая дистоция», а категория 3 была объединена с 4, чтобы сформировать новую степень 2 (« тяжелая дистоция »).

Новорожденные телята из групп HMO и MMO были подвергнуты клиническому обследованию и балльной системе APGAR по шкале от 0 до 2, и полученные пять значений затем суммировались, давая оценку APGAR от 0 до 10; эти критерии используются в качестве мнемонического учебного пособия [24].Новорожденных HMO и MMO кормили молозивом в течение 50 ± 10 мин после отела.

Оценка послеродовых заболеваний

В послеродовой период данные о частоте мертворождений и репродуктивных заболеваний у всех коров были извлечены из базы данных фермы [19]. Мертворождение регистрировалось в случае смерти теленка непосредственно перед, во время или в течение первых 48 ч после родов [25]. Данные о послеродовых заболеваниях, таких как инфекции матки, FMR, выпадение матки, молочная лихорадка или кисты яичников, регистрировались в соответствии с признанными определениями [23].Термин «инфекции матки» включает как метрит, так и эндометрит [26].

Статистический анализ

Репродуктивные характеристики, такие как средний интервал от отела до зачатия и количество осеменений на одно зачатие за 4-летний период, были извлечены из базы данных фермы [19]. Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения SPSS [27], и различия считались значимыми при P ≤ 0,05.

Для оценки различий между наблюдаемыми группами (HMO vs. MMO), среднее время применения интравагинального устройства, продолжительность родов и отела, а также баллы APGAR сравнивались с использованием одномерной модели дисперсионного анализа (ANOVA). Статистический анализ был проведен для количества применений искусственного оплодотворения (ИО) на зачатие и интервала от отела до оплодотворения с учетом в качестве основных факторов паритета коров (телки против повторнородящих), условия мониторинга отела (отслеживание во время отела). коровник, не отслеживаемый в стойле для отела и не контролируемый в сухой зоне) и их взаимодействие, используя следующий общий протокол линейной модели:

, где:

μ = общее среднее

P _i = паритет (1, первородящие; 2 , повторнородящие)

M _j = мониторинг отела (1, под наблюдением; 2, без посторонней помощи в стойле для отела; 3, без посторонней помощи в сухой зоне)

ϵ _ijk = остаточная ошибка

Различия между средними значениями сравнивались с процедура наименее значимых отличий.

Учитывая, что условия мониторинга отела значительно повлияли на количество отелов и интервал от отела до зачатия, и что паритет значительно повлиял на интервал от отела до зачатия, данные также сравнивались между каждой из шести групп с целью установить роль дисперсии между ними с использованием ANOVA с F-критерием Райана – Эйнота – Габриэля – Велша.