МКБ-10 код A02 | Другие сальмонеллезные инфекции
ICD-10
ICD-10 is the 10th revision of the International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems (ICD), a medical classification list by the World Health Organization (WHO).
It contains codes for diseases, signs and symptoms, abnormal findings, complaints, social circumstances, and external causes of injury or diseases.
ATC
The Anatomical Therapeutic Chemical (ATC) Classification System is used for the classification of active ingredients of drugs according to the organ or system on which they act and their therapeutic, pharmacological and chemical properties.
It is controlled by the World Health Organization Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology (WHOCC).
DDD
The defined daily dose (DDD) is a statistical measure of drug consumption, defined by the World Health Organization (WHO).
It is used to standardize the comparison of drug usage between different drugs or between different health care environments.
Сальмонеллезный энтерит — симптомы (признаки), лечение, лекарства
Раздел предназначен исключительно для медицинских и фармацевтических работников! Если Вы не являетесь медицинским и фармацевтическим работником — покиньте раздел! Условия использования
- Номер класса:
- I
- Наименование класса:
- Некоторые инфекционные и паразитарные болезни
- Номер блока:
- A00-A09
- Наименование блока:
- Кишечные инфекции
- Код заболевания:
- A02.
0
0САЛЬМОНЕЛЛЕЗ — острая инфекционная болезнь, вызываемая сальмонеллами; характеризуется разнообразными клиническими проявлениями, от бессимптомного носитель-ства до тяжелейших септических форм. Чаще протекает с преимущественным поражением органов пищеварения (гастроэнтериты, колиты).
Этиология, патогенез. Возбудитель — большая группа сальмонелл, насчитывающая в настоящее время около 2000 серотипов. Относительно часто у человека встречаются около 90 серотипов, причем 10 из них обусловливаю г 85-91 % всех сальмонеллезов человека. Сальмонеллы представляют собой грамотрицательные палочки, имеют жгутики, подвижны, хорошо растут на питательных средах; длительно (до нескольких месяцев) сохраняются во внешней среде, продуктах, а в некоторых из них (молоко, мясные продукты) способны размножаться, не изменяя внешнего вида и вкуса продуктов. Воротами инфекции является преимущественно слизистая оболочка тонкого кишечника, в котором сальмонеллы способны к внутриклеточному паразитированию в макрофагах и ретикулоцитах. При генерализованной форме сальмонеллы проникают в кровь, а при септической заносятся в различные органы, где образуются вторичные гнойные очаги. Выделяющийся сальмонеллами эндотоксин обусловливает многообразные повреждения внутренних органов. При тяжелых формах может развиться обезвоживание, а также инфекционно-токсический шок.
Симптомы, течение. Инкубационный период от 6 ч до 3 сут (чаще 12-24 ч). Наиболее распространенная гастроинтестинальная форма (раньше ее относили к пищевым токсикоинфекциям) начинается остро, с повышения температуры тела до 38-40 °С, озноба и симптомов общей интоксикации. Появляются также боль в подложечной области, тошнота, рвота, а спустя несколько часов — понос. Стул жидкий, водянистый, зловонный, до 10-15 раз в сутки. Тенезмов, ложных позывов, а также примеси крови в кале не отмечается. При обильном частом стуле и повторной рвоте может развиться синдром обезвоживания: жажда, олигурия, цианоз губ, запавшие глаза, сморщенная кожа, судороги, снижение АД.
Лихорадка длится 2-5 дней. При легкой форме заболевание ограничивается субфебрильной температурой, однократной рвотой и небольшим послаблением стула: все явления проходят через 1-2 дня.
Тифоподобная форма по своим проявлениям почти не отличается от брюшного тифа, диагноз уточняется после выделения гемокультуры сальмонелл. Наиболее тяжело протекает септическая форма сальмонеллеза. Она начинается остро, сопровождается резко выраженным токсикозом, лихорадка неправильного типа, с большими суточными размахами, повторными ознобом и потом, длится в течение многих недель. Заболевание плохо поддается антибиотикотерапии. Вторичные гнойные очаги часто развиваются в опорно-двигательном аппарате (остеомиелиты, артриты, спондилиты). Иногда наблюдаются септический сальмонеллезный эндокардит, аортит с последующим развитием аневризмы аорты, гнойные менингиты, реже возникают абсцессы печени, гнойный струмит, инфицированная киста яичника.
Колитическая форма сальмонеллеза сходна с острой дизентерией. Могут быть тенезмы, ложные позывы, примесь крови в испражнениях, катарально-геморрагический проктосигмоидит (по данным ректороманоскопии) и др.
Для диагностики, помимо клинических проявлений, имеют значение эпидемиологические предпосылки (групповой характер заболеваний, связь с определенным продуктом). Для лабораторного подтверждения диагноза наибольшее значение имеет выделение возбудителя (исследуют остатки пищи, рвотные массы, испражнения, кровь при генерализованных формах, гной при септических формах болезни).
Лечение. При гастроинтестинальной форме как можно раньше промывают желудок 2-3 л воды или 2% раствора гидрокарбоната натрия. Промывание проводят с помощью желудочного зонда до отхождения чистых промывных вод. При легких формах ограничиваются промыванием желудка, диетой и питьем солевых растворов. Обычно используют раствор следующего состава: натрия хлорида — 3,5 г, калия хлорида — 1,5 г, гидрокарбоната натрия — 2,5 г, глюкозы — 20 г на 1 л питьевой воды.
Количество жидкости должно соответствовать ее потерям (не более 3% массы тела).
При средней тяжести течения гастроинтестинальной формы сальмонеллеза, отсутствии рвоты и выраженных нарушений гемодинамики жидкость также можно вводить перорально. При нарастании обезвоживания регидратацию проводят так же, как и при холере.
При развитии инфекционно-токсического шока, помимо полиионных растворов, вводят гемодез, полиглюкин, реополиглюкин по 400-1000 мл, назначают 60- 90 мг преднизолона или 125-250 мг гидрокортизона в/а струйно, через 4- 6 ч переходят на капельное введение (до 120-300 мг преднизопона в сутки). Одновременно вводят дезоксикортикостерона ацетат по 5-10 мг в/м через каждые 12ч. Тифоподобные формы лечат так же, как брюшной тиф. При септических формах комбинируют длительное назначение ампициллина (4-6 г/сут) с хирургическим лечением гнойных очагов.
Прогноз. В большинстве случаев наступает выздоровление. У отдельных больных формируется хроническое бактерионосительство при всех клинических вариантах течения.
Профилактика. Ветеринарно-санитарный надзор за забоем скота, контроль за приготовлением и хранением мясных и рыбных блюд. Реконвалесценты выписываются после полного клинического выздоровления и проведения двукратного бактериологического исследования кала.
Администрация сайта не осуществляет деятельность в сфере медицинских услуг. Консультации и рекомендации носят лишь информационный характер и не являются полноценной медицинской помощью. Любая медицинская помощь осуществляется только в специализированных медицинских учреждениях. При любых недомоганиях обратитесь к врачу.
Профилактика сальмонеллеза
Чем опасен сальмонеллез?
Сальмонеллез — острое кишечное заболевание (ОКИ), которое характеризуется резким повышением температуры до 38-39С, болями в животе, рвотой и жидким стулом. Если вовремя не обратиться за медицинской помощью, результат этого заболевания может быть достаточно плачевный – рвота и жидкий стул приводят к обезвоживанию организма, из-за чего могут начаться проблемы с сердцем, а выделяющиеся токсины повреждают внутренние органы.
Это особенно опасно для пожилых людей и маленьких детей. А ведь болеют сальмонеллезом в основном они.
Сальмонеллез – это заболевание, которое вызывается разными видами бактерий (Сальмонеллы разных групп), которые живут в разных условиях. Поэтому нельзя трепетно относиться к продуктам из яиц и при этом спокойно есть не просоленное сало с полной уверенностью, что сальмонеллезом явно не заразитесь. Это не так.
Фактором передачи у заболевших сальмонеллезом могут быть куриные яйца, приготовленные в домашних условиях блюда-это яичница и омлеты, варенные всмятку яйца, а так же сырые куриные яйца. Возможно, заболеть от не прожаренных кур-гриль, салатов домашнего приготовления и теста, замешанного на яйцах. Если курица-гриль недожаренная – лучше откажитесь от нее, выбросьте или на крайний случай доведите до готовности уже дома. Поверьте, лечение обойдется гораздо дороже.
В единичных случаях факторами передачи было сырое козье молоко и свиное сало, молоко нужно кипятить, а сало – хорошо просаливать.
Несмотря на то, что куры и яйца – основной источник сальмонеллеза, выявить какого-то одного производителя (и, соответственно, принять меры) нельзя. Все продукты, послужившие источником заболевания, произведены разными производителями и в разных местах. Поэтому особую серьезность обретает фраза: «Ваше здоровье – только в Ваших руках».
Как же избежать сальмонеллеза?
Для этого достаточно соблюдать обычные правила гигиены и здравого смысла, которые с детства знакомы каждому. Эти правила относятся не только к сальмонеллезу, но и к остальным кишечным инфекциям и отравлениям в целом.
- После посещения туалета и перед едой нужно обязательно мыть руки с мылом.
- Нельзя есть полусырые продукты. Если Вы увидели, что мясо или курица недоваренные или недожаренные – не поленитесь, продолжите их приготовление. Это гарантирует не только Вашу безопасность, но и вкусовые качества блюда.
- Готовые продукты (особенно салаты, изделия с фаршем или с кремом) нужно хранить только в холодильнике. Иначе они могут просто испортиться, и Вы рискуете получить пищевое отравление.
- Сырые и готовые продукты обязательно нужно разделывать на разных досках и разными ножами. Даже если в сырой курице и живет какая-нибудь бактерия, она не выживет при варке или жарении. Но если на той же доске, где Вы разделывали курицу, сделать салат – все сальмонеллы с курицы окажутся в Вашей тарелке.
- Внимательно смотрите на сроки годности и условия хранения продуктов в магазинах. Если то же мясо хранится на витрине без охлаждения, на жаре, да еще и под солнцем – подумайте дважды и трижды, стоит ли Ваше здоровье того, чтобы им рисковать.
- Не покупайте продукты в магазине, где продавец на одних и тех же весах взвешивает кур и колбасу, то есть сырую и готовую продукцию. С курами ничего не случится, а вот такой колбасой очень легко отравиться.
- Если Вам показалось, что продукт подпорчен, а курица или мясо остались сырыми внутри – не ешьте. Выбросьте. Как бы ни было жалко.
- Мойте куриные яйца. Это очень важно. Причем мыть их нужно не непосредственно перед приготовлением, а сразу, как только Вы принесли их из магазина. И только потом уже закладывайте в холодильник на хранение. Часто бывают случаи, когда сальмонеллы заносятся на продукты вторично: остаются на полотенце для рук, лопаточке для готовки или на ноже, которым разбивали яйца. А итог все равно печальный.
- Не кормите маленьких детей яичницей. Заболевание опасно и протекает обычно достаточно тяжело. Не ешьте сырые яйца, если вы не уверены в их безопасности.
Иначе они могут просто испортиться, и Вы рискуете получить пищевое отравление.
Сальмонеллезный энтерит (A02.0) > Справочник заболеваний MedElement > MedElement
Сальмонеллезный гастрит — встречается редко. Клинические проявления:
— умеренные явления интоксикации;
— боли в эпигастральной области;
— тошнота;
— повторная рвота;
— поноса при этом варианте течения болезни не бывает.
Гастроэнтеритический вариант является наиболее частым клиническим вариантом сальмонеллезной инфекции. Характеризуется острым началом с появлением симптомов интоксикации и признаков поражения желудочно-кишечного тракта. Проявления достигают максимального развития в течение нескольких часов.
Во многих случаях отмечаются тошнота и рвота — чаще повторная, а не однократная, обильная, иногда неукротимая.
Стул жидкий, обильный, в основном сохраняет каловый характер, зловонный, пенистый, коричневого, темно-зеленого или желтого цвета. В некоторых случаях испражнения теряют каловый характер и могут напоминать рисовый отвар.
Живот, как правило, умеренно вздут. При пальпации отмечается болезненность в эпигастрииЭпигастрий — область живота, ограниченная сверху диафрагмой, снизу горизонтальной плоскостью, проходящей через прямую, соединяющую наиболее низкие точки десятых ребер.
, вокруг пупка, в илеоцекальной области; могут выявляться урчание, «переливание» в области петель тонкой кишки.
Гастроэнтероколитический вариант может иметь сходное с гастроэнтеритом начало, но далее в клинической картине все более отчетливо наблюдается симптомокомплекс колитаКолит — воспаление слизистой оболочки толстой кишки
. В данном случае сальмонеллез по своему течению напоминает острую дизентерию.
Начало заболевания острое — поднимается температуры тела и появляются симптомы интоксикации. С первых дней болезни стул частый, жидкий, с примесью слизи и иногда крови. Могут отмечаться тенезмыТенезмы — ложные болезненные позывы к дефекации, например при проктите, дизентерии
и ложные позывы.
При ректороманоскопии у больных обнаруживаются воспалительные изменения различной интенсивности: катаральные, катарально-геморрагические, катарально-эрозивные.
Лихорадка при гастроинтестинальной форме сальмонеллеза может быть постоянной, реже — ремиттирующей или интермиттирующей. В некоторых случаях заболевание протекает при нормальной или субнормальной температуре.
В патологический процесс часто вовлекается поджелудочная железа. Повышается активность амилазы в крови и моче. Иногда появляются клинические симптомы панкреатитаПанкреатит — воспаление поджелудочной железы
.
Класс I. Некоторые инфекционные и паразитарные болезни (A00-B99)
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 7 ноября 2012 г. № 622н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при сальмонеллезе легкого течения»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 января 2013 г. № 26614)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкая
Осложнение: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 10
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А02.0 Сальмонеллезный энтерит
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 7 ноября 2012 г. № 625н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при сальмонеллезе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 4 февраля 2013 г. № 26800)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 21
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А02.
0 Сальмонеллезный энтерит
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 7 ноября 2012 г. № 630н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при сальмонеллезе средне-тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 января 2013 г. № 26626)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средне-тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А02.0 Сальмонеллезный энтерит
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 730н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при острых кишечных инфекциях неустановленной этиологии средне-тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 14 февраля 2013 г. № 27088)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средне-тяжелая степень тяжести
Осложнения: без осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 7
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А09 Диарея и гастроэнтерит предположительно инфекционного происхождения
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г.
№ 731н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при острых кишечных инфекциях неустановленной этиологии легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 января 2013 г. № 26613)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: лёгкая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 6
Код по МКБX*(1)
Нозологические единицы
А09 Диарея и гастроэнтерит предположительно инфекционного происхождения
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 732н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при острых кишечных инфекциях неустановленной этиологии тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 января 2013 г. № 26608)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжёлая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 10
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А09 Диарея и гастроэнтерит предположительно инфекционного происхождения
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г.
№ 733н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при остром вирусном гепатите С средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 22 января 2013 г. № 26671)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 18
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
В17.1 Острый гепатит С1.
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 734н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при генерализованной форме сальмонеллеза»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 26 февраля 2013 г. № 27340)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: генерализованная
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: экстренная, неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 21
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А02.1 Сальмонеллезная септицемия
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 743н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при ветряной оспе средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 февраля 2013 г.
№ 27246)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
В01.2 + Ветряная оспа с пневмонией (J17.1)
В01.8 Ветряная оспа с другими осложнениями
В01.9 Ветряная оспа без осложнений
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 764н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 23 января 2013 г. № 26678)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 10
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
В00.0 Герпетическая экзема
В00.1 Герпетический везикулярный дерматит
В00.
2 Герпетический гингивостоматит и фаринготонзиллит
В00.8 Другие формы герпетических инфекций
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 765н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при кори средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 14 марта 2013 г. № 27679)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
В05.2+ Корь, осложненная пневмонией (J17.1*)
В05.3+ Корь, осложненная средним отитом (Н67.1*)
В05.4 Корь с кишечными осложнениями
В05.8 Корь с другими осложнениями
В05.9 Корь без осложнений
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 766н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при кори легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 29 декабря 2012 г. № 26490)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 7
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
В05 Корь
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г.
№ 769н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при краснухе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 января 2013 г. № 26632)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
В06.0 Краснуха с неврологическими осложнениями
В06.8 Краснуха с другими осложнениями
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 779н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при серозном менингите средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 22 января 2013 г. № 26664)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 15
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А87.0 Энтеровирусный менингит (G02.0*)
А87.2 Лимфоцитарный хориоменингит
А87.8 Другой вирусный менингит
А87.
9 Вирусный менингит неуточненный
В05.1 Корь, осложненная менингитом (G02.0*)
G00.8 Менингит, вызванный другими бактериями
G02.1 Менингит при микозах
G02.8 Менингит при других уточненных инфекционных и паразитарных болезнях, классифицированных в других рубриках
G03.0 Непиогенный менингит
G03.9 Менингит неуточненный
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 799н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при гастроэнтеритах вирусной этиологии тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 20 февраля 2013 г. № 27232)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А08.0 Ротавирусный энтерит
А08.1 Острая гастроэнтеропатия, вызванная возбудителем Норволк
А08.2 Аденовирусный энтерит
А08.3 Другие вирусные энтериты
А08.4 Вирусная кишечная инфекция неуточненная
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г.
№ 803н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при менингеальной форме клещевого вирусного энцефалита тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 11 февраля 2013 г. № 26953)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 21
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А84 Клещевой вирусный энцефалит
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 804н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при генерализованной форме менингококковой инфекции тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 30 января 2013 г. № 26749)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 30
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А39.0+ Менингококковый менингит (G01)
А39.1+ Синдром Уотерхауса-Фридериксена (Е35.
1)
А39.2 Острая менингококкемия
А39.3 Хроническая менингококкемия
А39.4 Менингококкемия неуточненная
А39.5+ Менингококковая болезнь сердца
А39.8 Другие менингококковые инфекции
А39.9 Менингококковая инфекция неуточненная
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 805н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при сальмонеллезе средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 20 февраля 2013 г. № 27231)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средней степени тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 12
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А02.0 Сальмонеллезный энтерит
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 806н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при коклюше средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 7 февраля 2013 г. № 26888)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ Х*(1)
Нозологические единицы
А37.
0 Коклюш, вызванный Bordetella pertussis
А37.1 Коклюш, вызванный Bordetella parapertussis
А37.9 Коклюш неуточненный
Приказ Министерства здравоохрания Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 807н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при острых кишечных инфекциях и пищевых отравлениях средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 25 марта 2013 г. № 27868)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 9
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А04.9 Бактериальная кишечная инфекция неуточненная
А05.0 Стафилококковое пищевое отравление
А05.2 Пищевое отравление, вызванное Clostridium perfringens
А05.3 Пищевое отравление, вызванное Vibrio parahaemolyticus
А05.4 Пищевое отравление, вызванное Bacillus cereus
А05.8 Другие уточненные бактериальные пищевые отравления
А05.9 Бактериальное пищевое отравление неуточненное
А09 Диарея и гастроэнтерит предположительно инфекционного происхождения
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г.
№ 808н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при холере средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 20 марта 2013 г. № 27782)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 11
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 809н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при холере легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 марта 2013 г. № 27807)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 9
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А00.1 Холера, вызванная холерным вибрионом 01, биовар eltor
А00.9 Холера неуточненная
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 810н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при холере тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 6 февраля 2013 г.
№26851)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А00.1 Холера, вызванная холерным вибрионом 01, биовар eltor
А00.9 Холера неуточненная
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 811н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при кори тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 7 марта 2013 г. № 27556)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 21
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
В05.0+ Корь, осложненная энцефалитом (G05.1)
В05.1+ Корь, осложненная менингитом (G02.0)
В05.2+ Корь, осложненная пневмонией (J17.1)
В05.3+ Корь, осложненная средним отитом (Н67.1)
В05.4 Корь с кишечными осложнениями
В05.
8 Корь с другими осложнениями
Приказ Министерства здравоохрания Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 812н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при кожно-бубонной форме чумы»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 25 марта 2013 г. № 27869)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: любая
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 35
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А20.0 Бубонная чума
А20.1 Целлюлярнокожная чума
А20.8 Другие формы чумы
А20.9 Чума неуточненная
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 813н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при легочной форме чумы»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 23 января 2013 г. № 26695)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: любая
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 45
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А20.
2 Легочная чума
А20.3 Чумной менингит
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 814н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при септической форме чумы»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 1 марта 2013 г. № 27420)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: любая
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 45
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А20.7 Септическая чума
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации
от 9 ноября 2012 г. № 815н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при кампилобактериозе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 31 января 2013 г. № 26775)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 816н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при псевдотуберкулезе и иерсиниозе средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 26 февраля 2013 г.
№ 27343)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А04.6 Энтерит, вызванный Yersinia enterocolitica
А04.8 Другие уточненные бактериальные кишечные инфекции
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 817н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при геморрагической лихорадке с почечным синдромом средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 26 февраля 2013 г. № 27328)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 21
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А98.5 Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г.
№ 818н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при геморрагической лихорадке с почечным синдромом тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 31 января 2013 г. № 26767)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 28
Код по МКБ Х*(1)
Нозологические единицы
А98.5 Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 819н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при геморрагической лихорадке с почечным синдромом легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 февраля 2013 г. № 27253)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А98.5 Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г.
№ 828н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при ветряной оспе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 4 февраля 2013 г. № 26806)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 21
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
В01.0 Ветряная оспа с менингитом (G02.0)
В01.1 Ветряная оспа с энцефалитом (G05.1)
В01.2 Ветряная оспа с пневмонией (J17.1)
В01.8 Ветряная оспа с другими осложнениями
В01.9 Ветряная оспа без осложнений
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 839н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при лептоспирозе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 5 апреля 2013 г. № 28020)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 28
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А27.
0 Лептоспироз желтушно-геморрагический
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 840н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при лептоспирозе средне-тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 18 февраля 2013 г. № 27143)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средне-тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 20
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А27.0 Лептоспироз желтушно-геморрагический
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 846н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при хронической надпочечниковой недостаточности»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 февраля 2013 г. № 27254)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: хроническая
Стадия: любая
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно, в дневном стационаре
Форма оказания медицинской помощи: плановая
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А39.
1 Синдром Уотерхауса-Фридериксена (Е35.1)
Е23.0 Гипопитуитаризм
Е23.1 Медикаментозный гипопитуитаризм
Е27.1 Первичная недостаточность коры надпочечников
Е27.2 Аддисонов криз
Е27.3 Медикаментозная недостаточность коры надпочечников
Е27.8 Другие уточненные нарушения надпочечников
Е27.9 Болезнь надпочечников неуточненная
Е31.0 Аутоиммунная полигландулярная недостаточность
Е71.3 Нарушения обмена жирных кислот
Е89.6 Гипофункция коры надпочечников (мозгового слоя), возникшая после медицинских процедур
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 876н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при хронических герпесвирусных инфекциях»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 1 февраля 2013 г. № 26784)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: хроническая
Стадия: обострение
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: в дневном стационаре
Форма оказания медицинской помощи: плановая
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
В00.8 Другие формы герпетических инфекций
В00.9 Герпетическая инфекция неуточненная
В25.0+ Цитомегаловирусная пневмония (J17.
1)
В25.8 Другие цитомегаловирусные болезни
В25.9 Цитомегаловирусная болезнь неуточненная
В27.0 Мононуклеоз, вызванный гамма-герпетическим вирусом
В27.1 Цитомегаловирусный мононуклеоз
В27.8 Другой инфекционный мононуклеоз
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 9 ноября 2012 г. № 879н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при листериозе легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 15 февраля 2013 г. № 27134)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 10
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А32 Листериоз
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 20 декабря 2012 г. № 1104н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при эшерихиозе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 5 марта 2013 г. № 27474)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 14
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А04.
0 Энтеропатогенная инфекция, вызванная Escherichia coli
А04.1 Энтеротоксигенная инфекция, вызванная Escherichia coli
А04.2 Энтероинвазивная инфекция, вызванная Escherichia coli
А04.3 Энтерогеморрагическая инфекция, вызванная Escherichia coli
А04.4 Другие кишечные инфекции, вызванные Escherichia coli
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 20 декабря 2012 г. № 1105н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при эшерихиозе легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 19 марта 2013 г. № 27750)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 7
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 20 декабря 2012 г. № 1129н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при скарлатине легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 20 марта 2013 г. № 27784)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 10
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А38 Скарлатина
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 20 декабря 2012 г.
№ 1130н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при коклюше тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 19 февраля 2013 г. № 27197)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 30
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А37.0 Коклюш, вызванный Bordetella pertussis
А37.9 Коклюш неуточненный
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 20 декабря 2012 г. № 1265н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при диарее и гастроэнтерите, предположительно инфекционных, средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 26 февраля 2013 г. № 27332)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средней степени тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 9
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А09 Диарея и гастроэнтерит
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г.
№ 1361н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при стрептококковой септицемии»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 30 января 2013 г. № 26757)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 20
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А40.0 Септицемия, вызванная стрептококком группы А
А40.1 Септицемия, вызванная стрептококком группы В
А40.2 Септицемия, вызванная стрептококком группы D
А40.3 Септицемия, вызванная Streptococcus pneumoniae
А40.8 Другие стрептококковые септицемии
А40.9 Стрептококковая септицемия неуточненная
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1362н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при скарлатине средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 15 марта 2013 г. № 27718)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 12
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
A38 Скарлатина
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г.
№ 1363н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при лептоспирозе легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 30 января 2013 г. № 26758)
Категория возрастная: дети
Пол: женский
Фаза: острая
Стадия: легкая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 10
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А27.0 Лептоспироз желтушно-геморрагический
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1368н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при менингококковой инфекции средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 1 февраля 2013 г. № 26777)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести
Осложнение: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 15
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А39.0+ Менингококковый менингит (G01)
А39.2 Острая менингококкемия
А39.
3 Хроническая менингококкемия
А39.4 Менингококкемия неуточненная
А39.5 Менингококковая болезнь сердца
А39.8 Другие менингококковые инфекции
А39.9 Менингококковая инфекция неуточненная
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1369н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при брюшном тифе средне-тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 11 февраля 2013 г. № 26972)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средне-тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 32
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А01.0 Брюшной тиф
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1370н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при брюшном тифе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 6 февраля 2013 г. № 26845)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелое течение
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 40
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А01.0 Брюшной тиф
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1371н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при дифтерии тяжелой степени тяжести (токсической)»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 11 февраля 2013 г. № 26952)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнение: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 40
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
A36.0 Дифтерия глотки
A36.1 Дифтерия носоглотки
А36.3 Дифтерия кожи
А36.8 Другая дифтерия
А36.9 Дифтерия неуточненная
A36.2 Дифтерия гортани
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1374н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при амебиазе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 20 марта 2013 г. № 27783)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 22
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А06 Амебиаз
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1379н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при амебиазе средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 15 февраля 2013 г. № 27131)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средней степени тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 16
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А06.0 Острая амебная дизентерия
А06.1 Хронический кишечный амебиаз
А06.2 Амебный недизентерийный колит
А06.7 Кожный амебиаз
А06.9 Амебиаз неуточненный
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1380н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при хронической бактериальной инфекции»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 18 февраля 2013 г. № 27145)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: хроническая
Стадия: обострение
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: в дневном стационаре
Форма оказания медицинской помощи: плановая
Средние сроки лечения (количество дней): 15
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А49.3 Инфекция, вызванная микоплазмой, неуточненная
А56.4 Хламидийный фарингит
А70 Инфекция, вызываемая Chlamydia psittaci
А74.0+ Хламидийный конъюнктивит (Н13.1)
А74.8 Другие хламидийные болезни
А74.9 Хламидийная инфекция неуточненная
В96.0 Mycoplasma pneumoniae [M.pneumoniae] как причина болезней, классифицированных в других рубриках
J15.7 Пневмония, вызванная Mycoplasma pneumoniae
J16.0 Пневмония, вызванная хламидиями
J20.0 Острый бронхит, вызванный Mycoplasma pneumoniae
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1406н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при кампилобактериозе средней степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 31 января 2013 г. № 26773)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средней степени тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 10
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А01.0 Брюшной тиф
А04.5 Энтерит, вызванный Campylobacter
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1417н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при скарлатине тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 25 марта 2013 г. № 27873)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелая степень тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 15
Код по МКБ Х*(1)
Нозологические единицы
А38 Скарлатина
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1435н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при брюшном тифе легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 7 марта 2013 г. № 27550)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкой степени тяжести
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 24
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А01.0 Брюшной тиф
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1436н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при дифтерии легкой степени тяжести (локализованной)»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 26 марта 2013 г. № 27896)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкой степени тяжести (локализованная)
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 12
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
A36.0 Дифтерия глотки
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1536н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при вирусном энцефалите, миелите»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 25 марта 2013 г. № 27861)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: острая
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 21
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А85 Другие вирусные энцефалиты, не классифицированные в других рубриках
А85.0 Энтеровирусный энцефалит (G05.1*)
А85.1 Аденовирусный энцефалит (G05.1*)
А85.8 Другие уточненные вирусные энцефалиты
А86 Вирусный энцефалит неуточненный
G05.1 Энцефалит, миелит и энцефаломиелит при вирусных болезнях, классифицированных в других рубриках
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1559н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при шигеллезе легкой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 марта 2013 г. № 27826)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: легкая степень тяжести
Осложнения: без осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 7
Код по МКБ Х*(1)
Нозологические единицы
А03 Шигеллез
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 24 декабря 2012 г. № 1560н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при листериозе тяжелой степени тяжести»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 25 марта 2013 г. № 27859)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелое течение
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 28
Код по МКБ Х*(1)
Нозологические единицы
А32 Листериоз
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 28 декабря 2012 г. № 1580н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при тяжелых формах шигеллеза»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 марта 2013 г. № 27817)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: тяжелые
Осложнения:
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 12
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А03 Шигеллез
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 28 декабря 2012 г. № 1582н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при средне-тяжелых формах шигеллеза»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 13 марта 2013 г. № 27656)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: среднетяжелые
Осложнения:
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная
Средние сроки лечения (количество дней): 10
Код по МКБ Х*(1)
Нозологические единицы
А03 Шигеллез
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 28 декабря 2012 г. № 1585н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи детям при дифтерии средней степени тяжести (распространенная и комбинированная формы)»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 21 марта 2013 г. № 27820)
Категория возрастная: дети
Пол: любой
Фаза: острая
Стадия: средняя степень тяжести (распространенная и комбинированная формы)
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: неотложная, экстренная
Средние сроки лечения (количество дней): 21
Код по МКБ X*(1)
Нозологические единицы
А36.0 Дифтерия глотки
А36.1 Дифтерия носоглотки
А36.2 Дифтерия гортани
А36.3 Дифтерия кожи
А36.8 Другая дифтерия
А36.9 Дифтерия неуточненная
Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 29 декабря 2012 г. № 1681н «Об утверждении стандарта специализированной медицинской помощи при лепре, активная стадия»
(Зарегистрировано в Минюсте РФ 5 марта 2013 г. № 27482)
Категория возрастная: взрослые
Пол: любой
Фаза: любая
Стадия: активная
Осложнения: вне зависимости от осложнений
Вид медицинской помощи: специализированная медицинская помощь
Условия оказания медицинской помощи: стационарно
Форма оказания медицинской помощи: плановая
Средние сроки лечения (количество дней): 180
Код по МКБ X *(1)
Нозологические единицы
А30 Лепра [болезнь Гансена]
Дисбактериоз — миф российской медицины
Тем не менее, как дань дремучим совковым традициям, «дисбактериоз» продолжает слетать с языка многих практикующих врачей, особенно педиатров. По-прежнему стандарты медосмотров малышей включают тестирование кала на «дисбактериоз». При этом давно известно, что искать корреляцию между составом флоры в кале и реальным ее соотношением в криптах кишечника — все равно, что гадать на кофейной гуще. Во-первых, основу кишечной флоры составляют бактероиды, которые не растут на питательных средах. Во-вторых, соотношение бактерий на выходе имеет очень мало общего с тем, что живет в кишке. В-третьих, все то время, пока вы собираете и несете ваши бесценные фекалии в лабораторию, жизнь в них не прекращается, и уже через несколько часов вся флора и фауна кала радикально видоизменяется. А потому все заключения о «преобладании патогенной флоры над нормальной» в таком анализе попросту смехотворны.
В общем, всем нам надо понимать, что такого самостоятельного заболевания, как дисбактериоз, в природе нет.
Существуют лишь ряд временных состояний организма (те же вирусные диареи или длительная антибиотикотерапия), которые могут привести к временному же дисбалансу нормальной флоры. При этом дисбаланс этот, как правило, не качественный, а количественный. В пример могу привести чрезмерный рост бактерии Clostridium difficile с развитием псевдомембранозного колита на фоне длительной терапии антибиотками.
Чаще же всего дискомфорт в животе обусловлен не мифическими заболеваниями, а совершенно реальным бунтом организма против всякой колы и прочей мак-дряни. Если вашего ребенка в животе не прекращается “шум и гам”, в первую очередь посмотрите, что он у вас ест.
У взрослых под «дисбактериозом» нередко скрываются синдром раздраженного кишечника, синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке, лактазная недостаточность, а также другие невыявленные состояния, при которых нарушается баланс кишечной флоры. Эти расстройства надо лечить, воздействуя на причину такого дисбаланса, а не сам дисбаланс, который является лишь следствием.
На теме дисбактериоза активно паразитируют различные производители кисломолочных продуктов питания, пробиотиков (препаратов с живыми бактериальными культурами) и пребиотиков (веществ, не перевариваемых человеком, но являющихся пищей для ряда бактерий).
Как я уже объяснил в колонке о кишечной флоре, бактерии пробиотиков могут становиться лишь транзитными колонистами, тогда как цель всех лечебных мероприятий заключается в восстановлении баланса СОБСТВЕННОЙ микрофлоры.
В ряду многочисленных препаратов для коррекции дисбактериоза хочу выделить особо абсурдный класс лекарств — бактериофаги. Бактериофаги — это такие вирусы, которые поражают бактерий. Когда-то ученые предложили использовать их против стафилококков, кишечных палочек и других возбудителей диарей. Однако исследования показали, что бактериофаги полностью разрушаются в желудке, и от таких препаратов во всем мире давно уже отказались. Точнее, во всем мире, кроме России — у нас эти псевдолекарства популярны и по сей день, и особенно хорошо неэффективные препараты лечат несуществующие дисбактериозы.
Если ваш врач уверенно заявляет, что ваша микрофлора разбалансирована, и вы вовсю уже «страдаете дисбактериозом», не паникуйте! Попытайтесь отыскать грамотного специалиста, который не станет жонглировать несуществующими диагнозами и назначать фуфломицины, а займется общепринятой диагностикой, которая позволит отличить инфекционную или органическую патологию кишечного тракта от физиологических и психосоматических расстройств. И не спешите разоряться в аптеках! Лучше сэкономьте деньги на полноценное питание себе и вашим детям, «подкормите» микрофлору естественным образом — здоровой пищей. Растительные волокна овощей, фруктов и зерновых — лучшая поддержка для
Сальмонеллез у взрослых и детей: симптомы, причины, лечение, диета
- Способы передачи сальмонелл
- Признаки сальмонеллёза на разных этапах протекания болезни
- Лечение сальмонеллёза
- Диета при сальмонеллёзе
- Предупреждение
- Лечение сальмонеллеза сорбентом Фильтрум
Сальмонеллёзом называют острую инфекцию, поражающую пищеварительную систему и возникающую по причине попадания в организм бактерии рода Сальмонелла. Она сопровождается гастритом, энтеритом, колитом, признаками интоксикации и обезвоживания. Реже наблюдается тифоподобное течение болезни.
Возбудитель заболевания – палочковидная бактерия. Она долго сохраняется в продуктах питания (например, в замороженном курином мясе – более года). При хранении яиц в холодильнике в течение месяца возбудитель проникает сквозь скорлупу, заражая внутреннее содержимое.
Чаще всего к инфицированию приводят яйца, подвергнутые недостаточной температурной обработке, а также молочные продукты и мясо. Сальмонеллёз может развиваться по двум различным сценариям, которые носят название гастроинтестинального и генерализованного. В отдельных случаях заражение и протекание болезни происходит без видимых признаков. Диагностировать болезнь можно путем выявления сальмонеллы в кале или рвотных массах пациента.
Способы передачи сальмонелл
Изначальным носителем возбудителя заболевания является сельскохозяйственный скот – коровы, свиньи, овцы и лошади. Не редкость – поражение сальмонеллами собак, кошек, мышей. Источником болезни могут стать также дикие птицы (например, утки), у которых сальмонеллёз обычно развивается без внешних проявлений. Эти виды могут долгие годы носить в себе бактерию и выделять её с мочой, твёрдыми испражнениями, слюной или молоком. Человек способен получить заражение в том случае, если он ухаживает за такими животными, участвует в их транспортировке или же занимается разделкой и хранением мяса. В последние 30 лет во всем мире постоянно растет инфицированность кур, как в домашних хозяйствах, так и на птицеводческих фермах.
Вторая причина заражения – контакт с человеком, который болен сальмонеллёзом или же является скрытым носителем этого заболевания. Передача бактерий происходит обычно фекально-оральным путём, когда сальмонеллы из кишечника инфицированного человека попадают в желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) здорового человека. Это возможно при недостаточной гигиене рук или при неосторожном уходе за больным пациентом. Заразиться можно и в таких общественных местах как больницы, детские сады и тесные офисные помещения, при использовании загрязненных суден, горшков, пеленальных столиков, полотенец и других бытовых предметов. Больной заразен максимум 3 недели, носитель может выделять бактерии в течение года.
Доказано, что сальмонеллез распространяется через помет голубей и других городских птиц, рассеиваясь в воздухе, поэтому не стоит подходить близко к голубиным стаям, а тем более разрешать это детям.
Наконец, многие люди заражаются сальмонеллёзом через пищу (мясо, птица, рыба, свежие овощи и фрукты, сладости, пиво). Особенно опасны изделия из фарша и мясные салаты.
В особой группе риска находятся младенцы до 12 месяцев. У них сальмонеллёз может перерасти в опасную генерализованную форму, которая с трудом поддаётся терапии. Со временем дети становятся всё менее подверженными сальмонеллёзу, однако вспышки этой инфекционной болезни возможны у людей любого возраста. Особенно часто это происходит в летнее время и при сезонных обострениях кишечных инфекций. Заболевание вызывает формирование иммунитета, который сохраняется менее года.
Признаки сальмонеллёза на разных этапах протекания болезни
При сальмонеллёзе период инкубации продолжается обычно от 6 часов до двух суток. Признаки сальмонеллеза определяются его формой, поэтому ниже приведена соответствующая классификация:
Гастроинтестинальный сальмонеллёз
Такая форма встречается чаще всего. Вначале болезнь развивается очень стремительно и похожа на пищевое отравление. У больного отмечается озноб, лихорадка, головная боль, ломота в теле. Постепенно добавляются симптомы расстройства ЖКТ – боль в центральной области живота, обильная рвота (сначала с частичками непереваренной пищи, а затем с желчью), понос (пенистый, слизистый, зловонный кал зелёного оттенка, а затем – водянистые фекалии). Частота стула постепенно увеличивается, а объем испражнений уменьшается. Пострадавший ощущает сухость в ротовой полости, и испытывает боль при нажатии на живот; появляется белый налет на языке, а также вздутие и урчание в животе. Понос прекращается только спустя несколько дней, поэтому человек испытывает сильную дегидратацию, сопровождающуюся вымыванием минеральных солей. Обмен веществ нарушается, появляются судороги и тахикардия, падает артериальное давление (АД). Возможно обморочное состояние и приступы головокружения, а также нервные расстройства. Через 5 дней после начала болезни состояние взрослого человека постепенно стабилизируется, однако полностью симптомы сальмонеллеза исчезают только к концу второй недели.
Лёгкая форма. Гастроинтестинальный сальмонеллёз у взрослых порой характеризуется слабо выраженными симптомами: температура тела не повышается, рвота мучает больного лишь эпизодически, а понос наблюдается всего 2-3 раза в день. В этом случае пик развития болезни приходится на первые или вторые сутки, а полное исчезновение симптомов сальмонеллеза у взрослых наступает через 3 дня после начала болезни.
Тяжёлая форма. В такой ситуации больного сильно знобит, рвота наблюдается очень часто, а позывы в туалет происходят до 20 раз в сутки. У пострадавшего сильно снижается давление, наступает выраженная слабость. Такая форма болезни имеет много общего с ходом развития дизентерии.
Тифоподобный сальмонеллёз
Вначале такой недуг очень напоминает гастроинтестинальный сальмонеллёз: больного знобит, у него появляются признаки выраженной интоксикации, в том числе возможны нарушения сознания, а также симптомы гастроэнтерита. Через несколько дней эти признаки ослабевают, но появляется волнообразная лихорадка, выраженная слабость и головная боль. Примерно через неделю после заражения возможно появление сыпи на животе, которая исчезает через двое-трое суток. Язык приобретает сероватый или коричневатый оттенок, кожа становится бледной, печень и селезёнка увеличиваются в размерах, и ощущается вздутие живота.
Септический сальмонеллёз. Это крайне редкая форма, которая характерна в основном для людей пожилого возраста, ослабленных больных и новорождённых младенцев. Симптомы включают длительный озноб, постоянную лихорадку, повышенную потливость, боли в мышцах и желтуху. Развивается плеврит, пневмония, эндокардит, абсцессы и флегмоны мягких тканей, пиелонефрит, цистит, иридоциклит.
Бессимптомный сальмонеллёз. Такой недуг развивается обычно в том случае, если в организм проникло лишь небольшое количество сальмонелл. Человек с крепким здоровьем способен достаточно быстро побороть болезнь, причём её симптомы отсутствуют.
Бактерионосительство. При такой форме заболевания человек не болен, но в его организме живут сальмонеллы, которые постепенно выходят с калом. Длительность такого течения может занимать от нескольких дней до трёх месяцев (острое носительство) или до года (хроническое носительство).
Код сальмонеллеза по МКБ-10 – А 02.0 (сальмонеллезный энтерит).
Детский сальмонеллёз
У детей период инкубации при сальмонеллёзе длится около четырёх суток, а конкретные симптомы и их интенсивность зависят от возраста ребёнка. Тяжелее всего это заболевание проходит у грудных младенцев и детишек младше 12 месяцев.
Симптомы сальмонеллеза у детей:
- В первые дни дети ощущают слабость и повышение температуры (до 39 °С).
- Малыши часто плачут, капризничают и отказываются от еды.
- Через 2-3 дня у ребёнка начинается диарея, и стул наблюдается примерно 10 раз в день. Внешний вид фекалий такой же, как и в других случаях сальмонеллёза (зелёный цвет, водянистость).
- К седьмому дню болезни в кале появляются прожилки крови. При отсутствии своевременного лечения сальмонеллеза у детей, заболевание может привести даже к летальному исходу.
- При появлении первых симптомов заболевания срочно обращайтесь к педиатру, а также постарайтесь оградить ребёнка от контакта с другими малышами.
- Выявление сальмонеллёза
Диагностика заболевания проводится путём исследования кала и рвотных масс больного. Исключение составляет генерализованная форма, когда на наличие бактерий проверяют кровь. В ряде случаев сальмонеллу можно обнаружить в желчи, а также в промывных водах желудка или кишечника.
Используются иммунологические реакции, подтверждающие наличие антигенов сальмонелл, например, иммуноферментный анализ на сальмонеллез, полимеразно-цепная реакция. Для подтверждения диагноза применяют серологическое выявление антител с интервалом в несколько дней. Также проводят посевы на питательные среды. Обязательно назначают санитарно-эпидемиологическую экспертизу, определяют круг заболевших, изымают и исследуют подозрительные продукты питания.
Необходимо также выявить степень обезвоживания. Для этого проводится анализ вязкости крови, кислотно-щелочного баланса и электролитного баланса. Оценить симптомы и назначить правильное лечение сальмонеллеза может только врач-инфекционист. Если сальмонеллёз протекает с осложнениями, то потребуется также проконсультироваться с кардиологом, урологом, нефрологом и другими профильными врачами (в зависимости от того, какие именно осложнения наблюдаются).
Лечение сальмонеллёза
Лечение сальмонеллеза у взрослых обычно проводится амбулаторно, при умеренном и тяжелом обезвоживании показан постельный режим. Сальмонеллез у детей часто лечат в стационаре. Используются:
- Этиотропное лечение (его цель – уничтожить возбудителя инфекции).
- Патогенетическое лечение включает несколько направлений:
- Регидратационное для восстановления баланса воды и солей в организме, устранения обезвоживания; это может быть внутривенное введение растворов или частый прием жидкости через рот.
- Дезинтоксикационное для освобождения крови и тканей от ядовитых продуктов жизнедеятельности сальмонелл и веществ, поддерживающих воспалительный процесс.
- Препараты с сорбентами: например, Фильтрум — для выведения продуктов жизнедеятельности бактерий из кишечника.
- Ферментные препараты: такие, как Микразим — для снижения нагрузки на пищеварительную систему.
- При тяжелых генерализованных формах лечение сальмонеллеза включает антибиотики из группы фторхинолонов.
- В период выздоровления показан прием пробиотиков.
Фильтрум относится к средствам патогенетической терапии, то есть прерывает процесс развития болезни, ускоряя выздоровление. Этот препарат с сорбентным действием собирает на поверхности своих частиц отходы жизнедеятельности и распада сальмонелл, а также продукты неполного переваривания питательных веществ. При сальмонеллезе Фильтрум принимают в течение 5 – 7 дней. Дозировка и количество приемов в течение суток зависят от возраста больного. Препарат быстро уменьшает выраженность вздутия живота, диареи, помогает улучшить общее самочувствие. Для того чтобы он не снизил эффективность принимаемых лекарств, его следует использовать за час до употребления других медикаментов.
Сотрудники пищевых предприятий и представители других подобных профессиональных групп при заражении сальмонеллёзом в обязательном порядке госпитализируются.
В случае госпитализации через 2 дня после завершения курса лечения больной сдает анализ кала, при отсутствии в нем сальмонелл его выписывают. Работники пищевой промышленности выписываются после двукратного отрицательного анализа. После выздоровления они должны проходить регулярный диспансерный осмотр.
Если больной лечится дома, его изоляция от других членов семьи не требуется. Однократно обследуют бывших в контакте детей, а также работников пищевых предприятий.
Диета при сальмонеллёзе
При таком заболевании необходимо убрать из рациона все продукты, которые способны раздражать ЖКТ, а также молочную продукцию. Голодание при сальмонеллёзе противопоказано, поскольку оно может сильно ослабить иммунитет и замедлить процесс восстановления ЖКТ.
Также важно не употреблять в пищу продукты, способствующие процессам брожения и содержащие грубую клетчатку (ржаной хлеб, цельное молоко, ряженку, йогурты, бобовые, свеклу, огурцы, квашеную капусту, редис, цитрусовые, груши, сливы, виноград, бульоны, жирное мясо и рыбу). Острая пища и спиртное тоже под запретом.
Предупреждение
Сальмонеллёза можно избежать, если в домашних условиях вы будете соблюдать ряд общих правил для предупреждения кишечных заболеваний:
- Тщательно мойте руки перед тем, как сесть за стол (это самое эффективное правило, и к нему нужно приучать детей ещё с раннего детства).
- Используйте разные ножи для разделки сырого мяса и рыбы. Разделочная доска тоже должна быть своя для мяса и для рыбы, а по окончании готовки её нужно каждый раз промывать и обдавать кипятком.
- Откажитесь от плохо прожаренного мяса. Любое мясо и птицу нужно подвергать термической обработке в течение как минимум 60 минут.
- Не употребляйте в пищу сырые яйца. Этот продукт рекомендуется варить в течение 20 минут, а если вам в качестве ингредиента понадобится сырое яйцо, то перед разбиванием его необходимо промыть с мылом.
- Кипятите молоко перед употреблением, не ешьте адыгейский сыр неизвестных производителей и не покупайте молочные продукты с рук или на рынке.
- Не посещайте сомнительные точки общепита, особенно в летнее время.
Лечение сальмонеллеза сорбентом Фильтрум
Важно: перед применением ознакомьтесь с инструкцией или проконсультируйтесь с лечащим врачом.
Генетический контроль устойчивости к сальмонеллезу и состоянию носительства сальмонелл у птиц: обзор | Genetics Selection Evolution
Бреннер Ф., Вильяр Р., Ангуло Ф., Токс Р., Сваминатан В: Номенклатура сальмонелл . J Clin Microbiol. 2000, 38: 2465-2467.
PubMed Central
CAS
PubMed
Google Scholar
Буве П., Фужера I, Гюзнье Ф., Гвибер Ф., Куас Дж., Ленорман П., Мец Л., Ракли С., Гримон П. Эпиднадзор за сальмонеллезом человека во Франции: последние данные национального арбитражного центра.Международный симпозиум по сальмонелле и сальмонеллезу; Плуфрагран, Франция. 2002, 411-416.
Google Scholar
Превост К., Магал П., Протаис Дж., Бомонт С. Влияние генетической устойчивости курицы к состоянию носителя Salmonella на частоту бактериального заражения: синергизм с вакцинацией. Vet Res. 2008, 39: 20-10.1051 / ветрес: 2007058.
Артикул
PubMed
Google Scholar
Lambert W, Knox C: Наследование устойчивости цыплят к брюшному тифу у кур. Iowa State J Sci. 1928, 2: 179-187.
Google Scholar
Робертс Э., карточка L: Наследование устойчивости животных к бактериальной инфекции. Иллинойс Сельское хозяйство Exper Sta Bull. 1935, 419: 467-493.
Google Scholar
Berthelot F, Beaumont C, Mompart F, Girard-Santosuosso O, Pardon P, Duchet-Suchaux M: Расчетная наследственность устойчивости salmonella enteritidis у кур к состоянию носителя слепой кишки.Poult Sci. 1998, 77: 797-801.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Girard-Santosuosso O, Lantier F, Lantier I, Bumstead N, Elsen JM, Beaumont C: Наследование восприимчивости к инфекции Salmonella enteritidis у домашних птиц и тест роли хромосомы, несущей NRAMP1 ген. Genet Sel Evol. 2002, 342: 211-219. 10.1186 / 1297-9686-34-2-211.
Артикул
Google Scholar
Бомонт С., Протаис Дж., Гийо Дж., Колин П., Про К, Миллет Н., Простите П.: Генетическая устойчивость к смертности суточных цыплят и кур-носителей после инокуляции Salmonella enteritidis . Avian Pathol. 1999, 28: 131-135. 10.1080 / 0307
.
Артикул
Google Scholar
Beaumont C, Protais J, Pitel F, Leveque G, Malo D, Lantier F, Plisson-Petit F, Colin P, Protais M, Roy PL, Elsen JM, Milan D, Lantier I, Neau A, Salvat G, Vignal A: Влияние двух генов-кандидатов на носительство Salmonella у домашней птицы.Poult Sci. 2003, 82: 721-726.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Ху Дж., Бамстед Н., Барроу П., Себастиани Дж., Олиен Л., Морган К., Д. М.: Устойчивость к сальмонеллезу у цыплят связана с NRAMP1 и TNC . Genome Res. 1997, 7: 693-704.
CAS
PubMed
Google Scholar
Kramer J, Malek M, Lamont S: Ассоциация двенадцати полиморфизмов генов-кандидатов и ответ на заражение Salmonella enteritidis у домашней птицы.Anim Genet. 2003, 34: 339-348. 10.1046 / j.1365-2052.2003.01027.x.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Кайзер М., Диб Н., Ламонт С. Микросателлитные маркеры, связанные с Salmonella enterica , вакциной против серовара Enteritidis, у молодых цыплят бройлерного кросса F1. Poult Sci. 2002, 81: 193-201.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Мариани П., Барроу П., Чанг Х., Гроенен М., Негрини Р., Бамстед Н.: Локализация в куриной хромосоме 5 нового локуса, определяющего устойчивость к сальмонеллезу. Иммуногенетика. 2001, 53: 786-791. 10.1007 / s00251-001-0387-7.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Tilquin P, Barrow P, Marly J, Pitel F, Plisson-Petit F, Velge P, Vignal A, Baret P, Bumstead N, Beaumont C: сканирование генома для выявления локусов количественных признаков, влияющих на Salmonella несущее состояние курицы.Genet Sel Evol. 2005, 37: 539-561. 10.1186 / 1297-9686-37-6-539.
PubMed Central
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Юнис Р., Хеллер Э., Хиллель Дж., Каханер А. Микросателлитные маркеры, связанные с локусами количественных признаков, контролирующими реакцию антител на Escherichia coli и Salmonella enteritidis у молодняка бройлеров. Anim Genet. 2002, 33: 407-414. 10.1046 / j.1365-2052.2002.00890.Икс.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Beaumont C, Chapuis H, Protais J, Sellier N, Menanteau P, Fravalo P, Velge P: Устойчивость к носителю Salmonella : отбор может быть эффективным, но реакция зависит от возраста животного. Genet Res. 2009, 91: 161-169. 10.1017 / S001667230
35.
Артикул
Google Scholar
DeVolt H, Quigley G, Byerly T: Исследования устойчивости к пуллорумным болезням у кур.Poult Sci. 1941, 20: 339-341.
Артикул
Google Scholar
Хатт Ф., Кроуфорд Р.: О разведении цыплят, устойчивых к болезни пуллорум, без контакта с ней. Canad J Genet Cytol. 1960, 2: 357-370.
Артикул
Google Scholar
Hutt F, Scholes J: XIII. Различия пород по восприимчивости к Salmonella pullorum . Poult Sci. 1941, 20: 342-352.
Артикул
Google Scholar
Prince W., Garren H: Исследование устойчивости цыплят белого леггорна к Salmonella gallinarum . Poult Sci. 1966, 45: 1149-1153.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Smith H: Восприимчивость цыплят различных пород к экспериментальной инфекции Salmonella gallinarum .Poultry Sci. 1956, 35: 701-705.
Артикул
Google Scholar
Бамстед Н., Барроу П.: Генетика устойчивости к Salmonella typhimurium у только что вылупившихся цыплят. Br Poult Sci. 1988, 29: 521-529. 10.1080 / 00071668808417078.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Bumstead N, Barrow P: Устойчивость к Salmonella gallinarum , S.pullorum и S. enteritidis в инбредных линиях кур. Птичий Дис. 1993, 37: 189-193. 10.2307 / 15.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Бамстед Н., Миллард Б., Барроу П., Кук Дж .: Генетические основы устойчивости к болезням у кур. Селекция сельскохозяйственных животных на устойчивость к болезням. Под редакцией: Оуэн Дж. 1991, Аксфорд Р: CAB International
Google Scholar
Гийо Дж, Бомонт С., Беллатиф Ф., Мулин С., Лантье Ф, Колин П., Протаис Дж .: Сравнение устойчивости различных линий домашней птицы к заражению Salmonella enteritidis . Vet Res. 1995, 26: 81-86.
CAS
PubMed
Google Scholar
Duchet-Suchaux M, Léchopier P, Marly J, Bernardet P, Delaunay R, Pardon P: Количественная оценка экспериментального носителя Salmonella enteritidis у цыплят леггорна B13.Птичий Дис. 1995, 39: 796-803. 10.2307 / 15
.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Duchet-Suchaux M, Mompart F, Berthelot F, Beaumont C, Léchopier P, Pardon P: Различия в частоте, уровне и продолжительности носительства слепой кишки между четырьмя беспородными линиями цыплят, инфицированных перорально Salmonella enteritidis . Птичий Дис. 1997, 41: 559-567. 10.2307 / 15.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Протаис Дж., Колин П., Бомонт С., Гийо Дж., Лантье Ф, Пардон П., Беннежан Г.: Линейные различия в устойчивости к инфекции Salmonella enteritidis PT4. Br Poult Sci. 1996, 37: 329-339. 10.1080 / 0007166
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Линделл К., Саид А., МакКейб Г. Оценка устойчивости четырех штаммов коммерческих кур-несушек к экспериментальной инфекции восьмым типом фага Salmonella enteritidis .Poult Sci. 1994, 73: 757-762.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Kramer J, Visscher A, Wagenaar J, Boonstra-Blom A, Jeurissen S: Характеристика врожденного и адаптивного иммунитета к инфекции Salmonella enteritidis PT1 у четырех линий бройлеров. Veterinary Immunoland Immunopathol. 2001, 79: 219-233. 10.1016 / S0165-2427 (01) 00261-6.
CAS
Статья
Google Scholar
van Hemert S, Hoekman A, Smits M, Rebel J: Иммунологическая и генная экспрессия реагирует на инфекцию Salmonella в кишечнике цыпленка. Vet Res. 2007, 38: 51-63. 10.1051 / ветрес: 2006048.
Артикул
PubMed
Google Scholar
Вон Л., Холт П., Мур Р., Гаст Р., Андерсон К.: Иммунный ответ сельскохозяйственных культур после заражения Salmonella Enteritidis у восьми коммерческих штаммов яйцеклетки и цыплят белого леггорна, свободных от специфических патогенов.Птичий Дис. 2009, 52: 79-87. 10.1637 / 7982-040907-Рег.
Артикул
Google Scholar
van Hemert S, Hoekman A, Smits M, Rebel J: ответы экспрессии генов на инфекцию Salmonella в кишечнике цыплят различаются между линиями. Vet Immunol Immunopathol. 2006, 114: 247-258. 10.1016 / j.vetimm.2006.08.007.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Chiang H, Swaggerty C, Kogut M, Dowd S, Li X, Pevzner I, Zhou H: Профилирование экспрессии генов в куриных гетерофилах с помощью стимуляции Salmonella enteritidis с использованием куриного микрочипа 44 K Agilent. BMC Genomics. 2008, 9: 526-10.1186 / 1471-2164-9-526.
PubMed Central
Статья
PubMed
Google Scholar
Zhou H, Lamont S: Глобальный профиль экспрессии гена после заражения Salmonella enterica серовар enteritidis в двух линиях цыплят с развитым кросс-кроссом F8.Cytogenet Genome Res. 2007, 117: 131-138. 10.1159 / 000103173.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Nerren J, Swaggerty C, Mackinnon K, Genovese K, He H, Pevzner I, Kogut M: Дифференциальная экспрессия мРНК птичьего толл-подобного рецептора 15 между гетерофилами из Salmonella -восприимчивых и — устойчивые куры. Иммуногенетика. 2009, 61: 71-77. 10.1007 / s00251-008-0340-0.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Abasht B, Kaiser M, Poel van der J, Lamont S: Генетические линии различаются по экспрессии гена Toll-подобного рецептора в селезенках цыплят, инокулированных Salmonella enterica сероваром Enteritidis. Poult Sci. 2009, 88: 744-749. 10.3382 / пс.2008-00419.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Чизмен Дж., Кайзер М., Чирачи С., Кайзер П., Ламонт С. Влияние породы на раннюю экспрессию мРНК цитокинов в селезенке и слепой кишке кур с инфекцией Salmonella enteritidis и без нее.Dev Comp Immunol. 2007, 31: 52-60. 10.1016 / j.dci.2006.04.001.
Артикул
PubMed
Google Scholar
Sadeyen JR, Trotereau J, Protais J, Beaumont C, Sellier N, Salvat G, Velge P, Lalmanach A-C: Состояние носителя Salmonella у кур: исследование устойчивости хозяина с помощью подхода экспрессии генов. Микробы заражают. 2006, 8: 1308-1314. 10.1016 / j.micinf.2005.12.014.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Swaggerty C, Kogut M, Ferro P, Rothwell L, Pevzner I., Kaiser P: Дифференциальная экспрессия мРНК цитокинов в гетерофилах, выделенных из Salmonella -резистентных и восприимчивых кур. Иммунология. 2004, 113: 139-148. 10.1111 / j.1365-2567.2004.01939.x.
PubMed Central
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Sadeyen JR, Trotereau J, Velge P, Marly J, Beaumont C, Barrow P, Bumstead N, Lalmanach AC: Состояние носителя Salmonella у цыплят: сравнение экспрессии генов иммунного ответа между восприимчивыми и устойчивыми животными .Микробы заражают. 2004, 6: 1278-1286. 10.1016 / j.micinf.2004.07.005.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Бамстед Н., Барроу П.: Генетика устойчивости к Salmonella typhimurium у только что вылупившихся цыплят. Br Poult Sci. 1998, 29: 521-529. 10.1080 / 00071668808417078.
Артикул
Google Scholar
Swaggerty C, Ferro P, Pevzner I, Kogut M: Гетерофилы связаны с устойчивостью к системным инфекциям Salmonella enteritidis у генетически различных линий кур.FEMS Immunol Med Microbiol. 2005, 43: 149-154. 10.1016 / j.femsim.2004.07.013.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Swaggerty C, Pevzner I, He H, Genovese K, Nisbet D, Kaiser P, Kogut M: отбор бройлеров с улучшенной врожденной иммунной реакцией для снижения заражения болезнетворными микроорганизмами на ферме. Пищевые болезнетворные микроорганизмы. 2009, 6: 777-783. 10.1089 / fpd.2009.0307.
CAS
Статья
Google Scholar
Swaggerty C, Pevzner I., Lowry V, Farnell M, Kogut M: Функциональное сравнение гетерофилов, выделенных из коммерческих цыплят-бройлеров. Птичий патол. 2003, 32: 95-102. 10.1080 / 03071000070769.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Kaiser M, Wing T, Lamont S: Влияние генетики, дозировки вакцины и поствакцинального интервала отбора проб на ранний ответ антител на вакцину Salmonella enteritidis у цыплят-бройлеров.Poult Sci. 1998, 77: 271-275.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Kaiser MG, Lakshmanan N, Wing T, Lamont SJ: Salmonella enterica Бремя серовара Enteritidis у цыплят-бройлеров, генетически связанных с реакцией антител к вакцине. Птичий Дис. 2002, 46: 25-31. 10.1637 / 0005-2086 (2002) 046 [0025: SESEBI] 2.0.CO; 2.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Bolder N, Janss L, Putirulan F, Wagenaar J: Устойчивость беспородных бройлерных линий к заражению Salmonella enteritidis . Avian Pathol. 2002, 31: 581-587. 10.1080 / 03071000024667.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Рой М.Ф., Мало Д.: Генетическая регуляция ответов хозяина на инфекцию Salmonella у мышей. Genes Immun. 2002, 3: 381-393. 10.1038 / sj.gene.6363924.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Vidal S, Tremblay M, Govoni G, Gauthier S, Sebastiani G, Malo D, Skamene E, Olivier M, Jothy S, Gros P: Локус Ity / Lsh / Bcg: естественная устойчивость к инфекции внутриклеточными паразитами устраняется нарушением гена Nramp1. J Exp Med. 1993, 182: 655-666. 10.1084 / jem.182.3.655.
Артикул
Google Scholar
Girard-Santosuosso O: Частичная консервация синтенической группы NRAMP1 млекопитающих на хромосоме 7 курицы.Геном мамм. 1997, 8: 614-616. 10.1007 / s003359
5.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Hu J, Bumstead N, Burke D, FA PdL, Skamene E, Gros P, Malo D: Генетическое и физическое картирование природного макрофагального белка 1, связанного с устойчивостью ( NRAMP1 ) у курицы. Геном мамм. 1995, 6: 809-815. 10.1007 / BF00539010.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Ху Дж, Бамстед Н., Скамен Э., Грос П., Мало Д.: Структурная организация, последовательность и экспрессия куриного гена NRAMP1 , кодирующего природный ассоциированный с устойчивостью белок макрофагов 1. ДНК Cell Biol. 1996, 15: 113-123. 10.1089 / dna.1996.15.113.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Leveque G, Forgetta V, Morroll S, Smith A, Bumstead N, Barrow P, Loredo-Osti J, Morgan K, Malo D. Аллельная вариация в TLR4 связана с восприимчивостью к Salmonella enterica serovar Typhimurium — инфекция цыплят.Заразить Imm. 2003, 71: 1116-1124. 10.1128 / IAI.71.3.1116-1124.2003.
CAS
Статья
Google Scholar
Ламонт С., Кайзер М., Лю В.: гены-кандидаты на устойчивость к колонизации цыплят Salmonella enteritidis , как обнаружено в новом генетическом кроссе. Vet Immunol Immunopathol. 2002, 87: 423-428. 10.1016 / S0165-2427 (02) 00064-8.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Лю В., Миллер М., Ламонт С.: Ассоциация полиморфизмов генов класса I и класса II MHC с вакциной или реакцией на провокацию Salmonella enteritidis у молодых цыплят. Иммуногенетика. 2002, 54: 582-590. 10.1007 / s00251-002-0495-z.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Карон Дж., Лоредо-Ости Дж., Ларош Л., Скамен Е., Морган К., Мало Д. Идентификация генетических локусов, контролирующих бактериальный клиренс при экспериментальной инфекции Salmonella enteritidis : неожиданная роль Nramp1 (Slc11a1) в стойкость инфекции у мышей.Genes Immun. 2002, 196-204. 10.1038 / sj.gene.6363850.
Google Scholar
Calenge F, Lecerf F, Demars J, Feve K, Vignoles F, Pitel F, Vignal A, Velge P, Sellier N, Beaumont C: QTL для устойчивости к носителю Salmonella подтвержден как в экспериментальных, так и в экспериментальных исследованиях. коммерческие куриные линии. Anim Genet. 2009, 40: 590-597. 10.1111 / j.1365-2052.2009.01884.x.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Ghebremicael S, Hasenstein J, Lamont S: Ассоциация кластерных генов интерлейкина-10 и ответ Salmonella у цыплят. Poult Sci. 2008, 87: 22-26. 10.3382 / пс.2007-00259.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Hasenstein J, Lamont S: Кластер гена куриного галлинацина, связанный с ответом Salmonella в продвинутой линии скрещивания. Птичий Дис. 2007, 51: 561-567. 10.1637 / 0005-2086 (2007) 51 [561: CGGCAW] 2.0.CO; 2.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Лю В., Кайзер М., Ламонт С. Полиморфизм гена макрофагального белка 1, связанный с природной резистентностью, и ответ на вакцину против или заражение Salmonella enteritidis у молодых цыплят. Poult Sci. 2003, 82: 259-266.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Malek M, Hasenstein J, Lamont S: Анализ цыплят TLR4 , CD28 , MIF , MD-2 и LITAF генов в популяции Salmonella enteritidis .Poult Sci. 2004, 83: 544-549.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Malek M, Lamont S: Ассоциация INOS , TRAIL , TGF-beta2, TGF-beta3 и генов IGL с ответом на Salmonella enteritidis у домашней птицы. Genet Sel Evol. 2003, 35: S99-S111. 10.1186 / 1297-9686-35-S1-S99.
PubMed Central
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Hasenstein J, Zhang G, Lamont S: Анализ пяти генов галлинацина и ответа salmonella enterica серовара Enteritidis у домашней птицы. Заражение иммунной. 2006, 74: 3375-3380. 10.1128 / IAI.00027-06.
PubMed Central
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Чжоу Х., Ламонт С. Связь шести генов-кандидатов с кинетикой ответа антител у кур. Poul Sci. 2003, 82: 1118-1126.
CAS
Статья
Google Scholar
Zhou H, Lamont S: ассоциация генов трансформирующего фактора роста бета с локусами количественных признаков для кинетики ответа антител у кур. Animal Genet. 2003, 34: 275-282. 10.1046 / j.1365-2052.2003.01007.x.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
van Hemert S, Hoekman A, Smits M, Rebel J: Ранние ответы экспрессии гена хозяина на инфекцию Salmonella в кишечнике цыплят с различным генетическим фоном, исследованные с помощью микрочипов кДНК и олигонуклеотидов.Комп. Биохим. Физиол. Часть D Геномика Протеомика. 2006, 1: 292-299. 10.1016 / j.cbd.2006.05.001.
Артикул
PubMed
Google Scholar
Zhang S, Lillehoj H, Kim C., Keeler CJ, Babu U, Zhang M: Транскрипционный ответ куриных макрофагов на Salmonella enterica serovar Enteritidis. Dev Biol (Базель). 2008, 132: 141-151.
CAS
Google Scholar
Кайзер М., Чизмен Дж., Кайзер П., Ламонт С. Экспрессия цитокинов в мононуклеарных клетках периферической крови цыплят после воздействия in vitro на Salmonella enterica серовара Enteritidis. Poult Sci. 2006, 85: 1907-1911.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Редмонд С., Чуаммитри П., Андреасен С., Палик Д., Ламонт С. Гетерофилы кур из коммерчески отобранных и неизбираемых генетических линий по-разному экспрессируют цитокины после воздействия Salmonella enteritidis .Vet Immunol Immunopathol. 2009, 132: 129-134. 10.1016 / j.vetimm.2009.05.010.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Абашт Б., Кайзер М., Ламонт С. Экспрессия гена толл-подобного рецептора в слепой кишке и селезенке цыплят продвинутой линии межкроссинга, инфицированных Salmonella enterica сероваром Enteritidis. Vet Immunol Immunopathol. 2008, 123: 314-323. 10.1016 / j.vetimm.2008.02.010.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Mackinnon K, He H, Nerren J, Swaggerty C, Genovese K, Kogut M: Профиль экспрессии толл-подобных рецепторов в желудочно-кишечном тракте 2-дневных цыплят-бройлеров, инфицированных Salmonella enteriditis . Vet Microbiol. 2009, 137: 313-319. 10.1016 / j.vetmic.2009.01.024.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Уигли П., Халм С., Бамстед Н., Барроу П.: исследования in vivo и in vitro генетической устойчивости к системному сальмонеллезу у курицы, кодируемой локусом SAL1.Микробы заражают. 2002, 4: 1111-1120. 10.1016 / S1286-4579 (02) 01635-0.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Файф М., Лосось Н., Хокинг П., Кайзер П.: Точное картирование локуса устойчивости к сальмонеллезу кур (SAL1). Animal Genet. 2009, 40: 871-877. 10.1111 / j.1365-2052.2009.01930.x.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Madrid L, Wang C, Guttridge D, Schottelius A, Baldwin A, Mayo M: Akt подавляет аптоптоз, стимулируя потенциал трансактивации RelA / p65 субъединицы NF-kappaB.Mol Cell Biol. 2000, 20: 1626-1638. 10.1128 / MCB.20.5.1626-1638.2000.
PubMed Central
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Ван З., Герштейн М., Снайдер М.: RNA-Seq: революционный инструмент для транскриптомики. Nat Rev Genet. 2009, 10: 57-63. 10.1038 / nrg2484.
PubMed Central
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Voorips R: MapChart: Программное обеспечение для графического представления карт связей и QTL.J Hered. 2002, 93: 77-78. 10.1093 / jhered / 93.1.77.
Артикул
Google Scholar
Kaiser MG, Lamont SF: микросателлиты, связанные с Salmonella enterica серовар Enteritidis Бремя селезенки и слепой кишки молодых цыплят-бройлеров F-1. Poult Sci. 2002, 81: 657-663.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Kramer J, Visscher A, Wagenaar J, Cornelissen J, Jeurissen S: Сравнение естественной устойчивости семи генетических групп мясных кур.Br Poult Sci. 2003, 44: 577-585. 10.1080 / 00071660310001616174.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Zhou H, Lamont S: Влияние гена MHC класса I и II курицы на кинетику ответа антител у взрослых цыплят. Иммуногенетика. 2003, 55: 133-140. 10.1007 / s00251-003-0566-9.
CAS
Статья
PubMed
Google Scholar
Salmonella enterica Serovar Typhimurium, лишенный гена hfq, обеспечивает защитный иммунитет против брюшного тифа у мышей
Abstract
Salmonella enterica является важным кишечным патогеном, и его различные серовары вызывают как системные, так и кишечные заболевания у людей и домашних животных.Появление штаммов Salmonella с множественной лекарственной устойчивостью, приводящее к увеличению заболеваемости и смертности, еще больше усложнило лечение. Было доказано, что живые аттенуированные вакцины превосходят убитые вакцины или субъединичные вакцины из-за их способности вызывать защитный иммунитет. Из различных стратегий, используемых для создания живых аттенуированных вакцинных штаммов, акцент постепенно смещается в сторону манипулирования генами-регуляторами вирулентности. Hfq представляет собой шаперон РНК, который опосредует связывание малых РНК с мРНК и помогает в посттранскрипционной регуляции генов у бактерий.В этом исследовании мы оценили эффективность штамма Salmonella Typhimurium Δ hfq в качестве кандидата для живой пероральной вакцины на мышиной модели брюшного тифа. Мутант с делецией Salmonella hfq сильно аттенуирован в культуре клеток и на животных моделях, что указывает на значительную роль Hfq в вирулентности бактерий. Оральная иммунизация мутантом с делецией Salmonella hfq эффективно защищает мышей от последующего перорального заражения вирулентным штаммом Salmonella Typhimurium.Более того, защита индуцировалась как при многократной, так и при однократной иммунизации. Штамм вакцины, по-видимому, безопасен для использования у беременных мышей, а защита опосредована увеличением количества Т-лимфоцитов CD4 + после вакцинации. Уровни сывороточного IgG и секреторного IgA в кишечных смывах, специфичных к липополисахариду и белку внешней мембраны, значительно повышались после вакцинации. Кроме того, мутант с делецией hfq продемонстрировал усиленную презентацию антигена дендритными клетками по сравнению со штаммом дикого типа.Взятые вместе, исследования на модели иммунизации мышей предполагают, что делеционный мутант Salmonella hfq может быть новым кандидатом живой оральной вакцины.
Образец цитирования: Allam US, Krishna MG, Lahiri A, Joy O, Chakravortty D (2011) Salmonella enterica Serovar Typhimurium Lacking hfq Ген обеспечивает защитный иммунитет против брюшного тифа мышей. PLoS ONE 6 (2):
e16667.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667
Редактор: Нияз Ахмед, Хайдарабадский университет, Индия
Поступила: 6 сентября 2010 г .; Принята к печати: 10 января 2011 г .; Опубликовано: 9 февраля 2011 г.
Авторские права: © 2011 Allam et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Эта работа была поддержана грантом Положение (2A) Десятый план (191 / MCB) от директора Индийского института науки, Бангалор, Индия, и Департамента биотехнологии (DBT 197 и DBT 172) на Поддержка инфраструктуры округа Колумбия со стороны ICMR (Центр перспективных исследований в области молекулярной медицины), DST-FIST (Департамент науки и технологий — грант поддержки инфраструктуры) и UGC (Университетская комиссия по грантам — особая помощь).США признают U.G.C. для общения. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Введение
Salmonella e — это грамотрицательные факультативные внутриклеточные патогены, вызывающие различные заболевания у нескольких хозяев с различным исходом заболевания. Род Salmonella состоит из двух различных видов: Salmonella bongori , комменсал хладнокровных животных, и Salmonella enterica . Salmonella enterica имеет 6 подвидов, и каждый подвид имеет ассоциированные серовары, которые различаются по антигенной специфичности и включают более 2500 сероваров [1]. Серотипы внутри подвида I ( S. enterica subsp. enterica ) ответственны за подавляющее большинство инфекций Salmonella у теплокровных животных [2]. Эти серотипы широко различаются по множеству характеристик, в первую очередь по диапазону хозяев, тяжести и типу заболевания, которое они обычно вызывают. S . enterica серовар Typhimurium является важной причиной пищевых отравлений и гастроэнтерита человека и имеет дополнительное значение в качестве модели брюшного тифа у человека на мышах. S. Инфекция Typhimurium часто приводит к летальному исходу, если ее не лечить у пациентов с ослабленным иммунитетом [2], [3].
S. enterica серовар Typhi ( S. Typhi) и S. enterica серовар Paratyphi ( S .Paratyphi) вызывают брюшной тиф и паратиф у людей; в основном в развивающихся и слаборазвитых странах.Они по-прежнему остаются серьезной проблемой общественного здравоохранения во многих частях мира. Ежегодное глобальное бремя брюшного тифа составляет около 21,2 миллиона случаев, а уровень смертности составляет ~ 2,2 миллиона человек в год во всем мире, тогда как паратиф составляет 5,4 миллиона случаев в год во всем мире [4], [5]. ВОЗ сообщает, что в некоторых развивающихся странах Азии и Африки ежегодная заболеваемость брюшным тифом может достигать 1%, а летальность достигает 10% [6].
Вакцинация практикуется уже много лет и является одним из наиболее эффективных методов борьбы с инфекционными заболеваниями, такими как брюшной тиф.В настоящее время во всем мире используются две лицензированные вакцины против Salmonella : полисахаридная вакцина Vi и живая аттенуированная вакцина Ty21a [7]. Typhim Vi — это очищенный антиген Vi из S. Typhi, и вакцинация Typhim Vi обеспечивает 55–75% защиты за одну разовую дозу [8]. Другой лицензированной вакциной против брюшного тифа является Vivotif Berna, которая представляет собой аттенуированный живой штамм Salmonella Typhi Ty21a, полученный путем химического мутагенеза родительского вирулентного штамма Salmonella Typhi Ty21 [9].Vivotif обладает высокой иммуногенностью, но важным практическим недостатком является его трех-четырехкратная дозировка, составляющая 2–6 × 10 9 КОЕ через день [10]. Большинство вакцин на основе Salmonella , созданных до настоящего времени, было создано путем удаления основных генов метаболического пути, островков патогенности или глобальных регуляторов. Salmonella , несущая мутации в SPI-2 [11], aroA [12], [13], hrtA [14], phoP [15], rpoS [16], rfaH [17], dam [18], [19] , [20], trxA [21], FoF 1 АТФаза [22] были протестированы в качестве кандидатов в вакцины на животных моделях.Основной проблемой при разработке живых аттенуированных вакцин Salmonella является создание безопасного, но иммуногенного вакцинного штамма.
Hfq представляет собой шаперон РНК, который играет жизненно важную роль в регулировании стабильности, а также трансляционной активности нескольких мРНК через небольшие некодирующие РНК. Первоначально Hfq был идентифицирован у E. coli как фактор хозяина, необходимый для репликации бактериофага Qβ [23]. Позже было обнаружено, что делеционный мутант E.coli hfq проявляет плейотропные фенотипы, которые включают снижение скорости роста, изменение морфологии, измененную чувствительность к УФ-свету и окислителям [24].В настоящее время показано, что Hfq препятствует трансляции основного сигма-фактора стресса, σ S (RpoS), в кишечных бактериях, а именно в кишечных бактериях E.coli и Salmonella [25], [26]. Hfq также стал ключевым игроком в контроле трансляции мРНК с помощью небольших некодирующих РНК (мРНК) [27]. Позже исследования показали, что Hfq участвует в патогенезе Salmonella благодаря своему влиянию на экспрессию и секрецию факторов вирулентности (независимо от σ S ), что приводит к ослаблению делеционного мутанта Salmonella hfq в системе культивирования клеток, как а также в мышиной модели [28].Глобальный микроматричный и протеомный анализ Salmonella Typhimurium, выращенного на борту космического челнока STS-115, выявил Hfq как глобальный регулятор, участвующий в реакции на условия космического полета [29]. Таким образом, становится очевидным, что Hfq представляет собой бактериальный РНК-связывающий белок, выполняющий множество важных физиологических ролей.
Целью настоящего исследования является оценка эффективности серовара Salmonella enterica Typhimurium, лишенного гена hfq , в качестве кандидата для живой оральной вакцины против инфекции Salmonella на модели сальмонеллеза мышей.Данные свидетельствуют о том, что STMΔ hfq способен вызывать защитные иммунные ответы против перорального заражения вирулентным штаммом Salmonella . Кроме того, вакцинация STMΔ hfq безопасна для беременных мышей. Защитный ответ, вызываемый мутантным штаммом, характеризуется увеличением общей популяции CD4 + Т-лимфоцитов, сывороточного IgG и антител к секретарю кишечника IgA.
Результаты
Конструкция мутанта с делецией Salmonella hfq и in vitro характеристика
Ген hfq был удален из Salmonella enterica серовара Typhimurium с использованием системы рекомбинации лямбда-красного [30], и мутанты были подтверждены с помощью ПЦР колоний с подтверждающими праймерами против последовательности, фланкирующей ген hfq (рисунок 1A).То же самое было подтверждено с использованием праймеров против кассеты канамицина (данные не показаны). Затем мы сравнили рост мутанта с делецией hfq с ростом STM-WT в богатой среде (LB) и определенной среде (минимальная среда). Хотя было обнаружено, что количество жизнеспособных бактерий одинаково для одинаковой OD обеих культур, мутант hfq достиг стационарной фазы позже, чем STM-WT, как в LB, так и в минимальной среде (данные не показаны).
Рисунок 1. STMΔ hfq сильно аттенуирован in vitro и in vivo (A) Генерация STMΔ hfq путем одностадийной инактивации гена.
Подтверждающая ПЦР, показывающая присутствие кассеты канамицина (1,5 Кб) в STMΔ hfq . (B) Внутриклеточная репликация штаммов STM-WT и STMΔ hfq в клеточных линиях INT-407, HT-29, CaCo-2 и RAW 264.7. Клетки инфицировали STMΔ hfq или STM-WT при MOI 10. Данные показывают кратное увеличение от 2 часов до 16 часов. Все эксперименты проводили в трех повторностях. (C&D) Нагрузки на органы STM-WT и STMΔ hfq . Две группы мышей (по 5 в каждой) были инфицированы 10 7 КОЕ / мышь перорально и умерщвлены на 4 (C) и 7 (D) день после инфицирования.Количество бактерий в селезенке, MLN и печени было показано как КОЕ / г массы тела со стандартными ошибками. Графики представляют два независимых эксперимента с аналогичными результатами. Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05; ** p <0,005) (критерий Стьюдента t и критерий Манна-Уитни U).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.g001
Salmonella сталкивается с двумя основными клетками в ходе своего патогенеза, а именно с эпителиальными клетками и клетками макрофагов, которые являются основными клетками, которые поддерживают рост бактерий in vivo [31].Заражение культивируемых фагоцитарных и эпителиальных клеток имитирует релевантные взаимодействия in vivo хозяин-патоген, бактериальную инвазию и внутриклеточное размножение. Таким образом, мы проверили внутриклеточную репликационную способность мутанта hfq в клеточных линиях эпителия человека и мышиных макрофагов. Мутант hfq очень дефектен по своей репликационной способности (в 3-5 раз) по сравнению с таковой WT во всех испытанных клеточных линиях, кроме CaCo-2. В клетках CaCo-2 мутант сильно аттенуирован, и разница в кратности репликации составляет ~ 15 раз (рис. 1B).Это означает, что мутант hfq ослаблен как в линиях макрофагов, так и в линиях эпителиальных клеток (рис. 1В).
Аттенуация мутанта с делецией
Salmonella hfq на модели мыши
Наблюдая за ослаблением STMΔ hfq в линиях эпителиальных и макрофагальных клеток, мы решили исследовать вирулентность мутантного штамма на мышиной модели брюшного тифа. Для анализа бактериальной колонизации в различных органах группу мышей BALB / c инфицировали перорально 10 7 КОЕ WT Salmonella и STMΔ hfq .Как показано на рис. 1C и D, нагрузка на органы STMΔ hfq была значительно ниже (≈100-1000 раз, p <0,05) по сравнению с STM-WT, 4 th день после инфицирования в селезенке, печени и брыжеечные лимфатические узлы. STMΔ hfq был полностью очищен к 7 -му дню после заражения, в отличие от STM-WT. Это свидетельствует о том, что мутант сильно аттенуирован и эффективно выводится из различных органов мышей.
Комплементация гена
hfq восстановила вирулентность STMΔ hfq
Ген hfq дикого типа клонировали в вектор pQE60 и полученную плазмиду pQE60 hfq трансформировали в штамм STMΔ hfq .WT, мутант и STMΔ hfq pQE60 hfq использовали для исследований комплементации в клеточных линиях, а также на мышиной модели. Комбинированный штамм вел себя как WT с точки зрения внутриклеточной репликации как в линиях клеток RAW 264.7, так и в INT-407, а также в модели на животных (рисунок S1 A&B). Бактериальная нагрузка в селезенке, печени и мезентериальных лимфатических узлах в единичный момент времени (4 -й день) предполагает, что tans-комплементация с геном hfq восстановила вирулентность мутанта (Рисунок S1 C).
Безопасность мутанта с делецией
Salmonella hfq
Чтобы определить степень влияния делеции hfq на вирулентность Salmonella , мы определили значения LD 50 с использованием STMΔ hfq у самок мышей BALB / c. Значение LD 50 дикого типа составляло 4 × 10 4 КОЕ для перорального введения. В случае мышей, инфицированных STMΔ hfq , LD 50 нельзя было оценить, потому что мыши не умерли даже после пероральной инокуляции максимальной дозой 10 9 КОЕ / мышь.Мыши, пережившие заражение STMΔ hfq , не проявляли никаких признаков болезни и оставались здоровыми на протяжении всего эксперимента.
Затем мы изучили выживаемость мышей после инфицирования мутантом с делецией STM hfq . Инфекция осуществлялась пероральным (10 8 ) или внутрибрюшинным путем (10 4 ), а выживаемость контролировалась в течение 3 недель. Заражение штаммом дикого типа любым путем приводило к раннему появлению симптомов у мышей с последующей смертью в течение десяти дней, тогда как 100% -ная выживаемость наблюдалась в случае мышей, инфицированных STMΔ hfq пероральным путем.Однако при внутрибрюшинной инфекции процент выживания мышей составил 70% в случае STMΔ hfq. (рис. 2A и B). Выжившие мыши оставались здоровыми до 7 недель (наблюдали только в течение 7 недель). Высокая аттенуация мутанта STMΔ hfq , вводимого пероральным путем, таким образом, делает его очень безопасным для инфекции у мышей.
Рисунок 2. Мутант STMΔ hfq очень безопасен для инфицирования на мышиной модели. (A и B) Кривые выживаемости.
Мышей инфицировали перорально (A) в дозе 10 8 или внутрибрюшинно (B) дозой 10 4 бактерий на мышь (n = 10), и мышей наблюдали дважды в день на предмет выживаемости.(C) Уменьшение фекального выделения STMΔ hfq . Мышей инфицировали перорально мутантными штаммами STM-WT или STMΔ hfq в дозе 10 7 бактерий / мышь. Неинфицированных мышей использовали в качестве контроля. Свежие фекальные гранулы собирали в указанные моменты времени, и их выделение определяли путем посева на культуральную среду. Данные представлены как количество бактерий на грамм веса свежих фекальных гранул. Показаны объединенные результаты двух экспериментов с 5 мышами в каждой группе.Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05) (критерий Стьюдента t и точный критерий Фишера).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.g002
Высокие уровни выделения штаммов Salmonella Typhimurium препятствовали их развитию в качестве живых вакцин Salmonella . Поэтому мы сравнили фекальное выделение STM-WT и вакцинного штамма STMΔ hfq на мышиной модели. Как показано на фиг. 2C, вакцинный штамм выделялся с фекалиями меньше, чем его аналог дикого типа.Выделение вакцинного штамма наблюдалось в течение 36 часов после введения, и не было обнаружено Salmonella , превышающих этот период времени. № Salmonellae были извлечены из фекалий наивных мышей. Наши результаты убедительно демонстрируют, что вакцинный штамм STMΔ hfq меньше выделяется с фекалиями.
STMΔ
hfq обеспечивает защиту от последующего заражения вирулентной Salmonella у мышей
Хорошая вакцина-кандидат должна быть аттенуированной, безопасной, иммуногенной и обеспечивать защиту от летального заражения при минимальной дозе прайминга.Продемонстрировав, что вакцинный штамм является аттенуированным и безопасным на мышиной модели Salmonella , затем мы исследовали способность ослабленного штамма STMΔ hfq создавать защитный иммунитет против вирулентной инфекции Salmonella . Мы следовали стратегии иммунизации, как показано на рисунке S2. Когорты из пяти мышей перорально примировали STMΔ hfq в дозе 10 3 , 10 4 или 10 5 бактерий / мышь с последующим введением двух бустерных доз (день 7 и 14).Контрольные мыши получали PBS. Все последующие этапы (заражение, умерщвление) выполнялись с перерывом в семь дней между ними. Через семь дней после последней бустерной дозы мышам вводили 10 7 КОЕ STM-WT пероральным путем для анализа инфильтрации органов. Для анализа выживаемости мышей заражали 10 8 КОЕ / мышь пероральным путем. В случае мышей, иммунизированных 10 3 STMΔ hfq и дважды иммунизированных той же дозой, мыши показали значительное снижение ( P = 0.0079) в бактериальной нагрузке при заражении по сравнению с органами контрольных непраймированных мышей (фиг. 3A). Однако все вакцинированные мыши умерли при заражении STM-WT, как и контрольные мыши-плацебо, в течение 10 дней (фиг. 3B). Затем мы увеличили как пероральную иммунизацию, так и бустерные дозы до 10 4 и 10 5 КОЕ / мышь. В случае мышей, примированных вакцинным штаммом 10 4 или 10 5 , наблюдалось существенное снижение ( P = 0.0079) в бактериальной нагрузке, и ни одна из вакцинированных мышей не умерла при заражении STM-WT (рис. 3C и D). Следовательно, мутант с делецией hfq обеспечивает защиту от последующего заражения вирулентным штаммом Salmonella .
Рисунок 3. Множественные иммунизации STMΔ hfq обеспечивают защиту от вирулентной Salmonella .
Группы из 5 мышей были иммунизированы перорально 10 3 (A&C), 10 4 или 10 5 (B&D) STMΔ hfq для двух бустерных доз с последующим контрольным заражением WT пероральным путем (для нагрузки на органы). : 10 7 и для анализа выживаемости: 10 8 WT) через 7 дней после последней бустерной дозы.Контрольные мыши получали PBS. Через 7 дней после заражения мышей умерщвляли и подсчитывали бактериальную нагрузку в различных органах с использованием прямых культур серийно разведенных гомогенизированных образцов. A&B отображает бактериальную нагрузку в различных органах, а C&D показывает кривые выживаемости. Представленный результат является одним из двух проведенных независимых экспериментов. Статистическая значимость была определена следующим образом * p <0,05; ** p <0,005 (U-критерий Манна-Уитни и точный критерий Фишера).
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0016667.g003
Еще одним важным фактором, определяющим эффективность живой аттенуированной пероральной вакцины, является количество доз. Итак, мы дополнительно оценили, достаточно ли однократной дозы примирования STMΔ hfq для защиты от заражения вирулентной сальмонеллой . Когорту из пяти мышей вакцинировали 10 8 КОЕ STMΔ hfq и заражали 10 7 бактериями дикого типа на мышь на 7 -й день после вакцинации.Мы наблюдали, что было в среднем 15-кратное снижение ( P = 0,0079) нагрузки на органы у мышей с однократной вакцинацией (рис. 4A). Более того, как показано на фиг. 4B, однократная доза вакцинации с последующим заражением через 7 дней STM-WT (10 8 ) привела к 100% выживаемости, тогда как невакцинированные мыши умерли в течение двух недель. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что однократная доза вакцинации STMΔ hfq может обеспечить защиту от вирулентной Salmonella .
Рисунок 4. Однократная вакцинация обеспечивает защиту от WT Salmonella и вызывает долговременную иммунологическую память.
мышей BALB / c вакцинировали перорально 10 8 КОЕ STMΔ hfq или PBS и заражали либо 10 7 КОЕ WT для оценки нагрузки на органы (A), либо 10 8 WT для оценка смертности (B). Через 7 дней после заражения мышей умерщвляли и подсчитывали бактериальную нагрузку. Для долговременной иммунологической памяти мышей заражали перорально через 52 дня вакцинации (C).В каждой группе по 5-6 мышей. Статистическая значимость была определена следующим образом * p <0,05 (U-критерий Манна-Уитни и точный критерий Фишера).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.g004
Индукция долговременной иммунологической памяти вакцинным штаммом STMΔ
hfq
Одной из проблем пероральной живой аттенуированной вакцины было отсутствие долговременной иммунологической памяти. Таким образом, мы исследовали способность мышей, вакцинированных однократной дозой (10 8 ), вызывать ответную реакцию через 52 дня после вакцинации (45 дней после клиренса).Невакцинированные зараженные мыши соответствующего возраста умерли в течение двух недель после заражения, тогда как вакцинированные зараженные мыши показали 100% выживаемость (фиг. 4С). Эти данные показывают, что STMΔ hfq способен вызывать долговременную иммунологическую память.
Вакцинный штамм
STMΔ
hfq безопасен для беременных мышей
Беременность — это временное состояние с ослабленным иммунитетом, которое ведет к повышенной восприимчивости к вторжению патогенов, что приводит к аборту и врожденным дефектам плода [32], [33], [34], [35].Таким образом, была изучена возможность прерывания беременности после заражения STMΔ hfq и WT на модели беременных мышей. Двум группам по десять мышей перорально вводили вакцинный штамм STM-WT и STMΔ hfq на 12-15 день беременности (средний период беременности) в дозе 10 8 . Мышей оценивали по рождению детенышей и их выживаемости каждый день после заражения. Мы обнаружили, что вирулентный штамм STM-WT вызвал смерть четырех мышей и вызвал аборт у трех других.Только три мыши нормально родили щенков; но 14 из 16 детенышей погибли в течение 48 часов после родов. С другой стороны, из 10 беременных мышей, которым вводили мутантный штамм STMΔ hfq , одна мышь умерла, но оставшиеся мыши родили нормальных здоровых детенышей, и детеныши оставались здоровыми до 7 недель (мониторинг только в течение 7 недель, таблица 1).
Пероральная вакцинация STMΔ
hfq увеличивает общее количество CD4 селезенки + Т-клеток
Чтобы изучить механизм, ответственный за защитный иммунитет, обеспечиваемый вакцинным штаммом, мы изучили статус популяции CD4 + и CD8 + Т-лимфоцитов у перорально инфицированных мышей (10 7 ).Полные спленоциты выделяли от наивных мышей и мышей, инфицированных либо STM-WT, либо STMΔ hfq в различные моменты времени (4 th и 7 th день после инфицирования) и окрашивали анти-CD4 + или анти-CD4 + или антигеном. -CD8 + специфические антитела. Хотя не наблюдалось значительных различий в популяции CD4 + Т-лимфоцитов у вакцинированных мышей на 4 -й день после заражения, было увеличение на 6% ( P = 0,003) в том же самом на 7 -й день после заражения. день после заражения по сравнению с таковым у мышей, инфицированных STM-WT (фиг. 5A и B).
Фигура 5. Проточный цитометрический анализ популяции CD4 + Т-клеток в селезенке на 4 -й день (A) и 7 -й день (B) после инфицирования.
Группу мышей инокулировали STM-WT или STMΔ hfq с дозой 10 7 бактерий на мышь. Неинфицированных мышей использовали в качестве контроля. Спленоциты выделяли на 4 и 7 день после инфицирования как от инфицированных, так и от контрольных мышей и окрашивали FITC-конъюгированными анти-CD4 MAb.Относительные уровни CD4 + Т-лимфоцитов измеряли с помощью FACS. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения BD Cell-Quest и представлены точечной диаграммой. Результаты представляют два независимых эксперимента. Каждая группа состояла из 4-5 мышей. Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05) (критерий Стьюдента t ).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.g005
Затем мы определили, влияет ли пероральная вакцинация STMΔ hfq (10 8 ) на статус CD4 + и CD8 + Популяция Т-лимфоцитов с пробой дикого типа или без нее (10 7 ).Полные спленоциты выделяли от наивных и вакцинированных мышей (через 7 -й день после вакцинации) и от невакцинированных-зараженных и вакцинированных-зараженных мышей (через 7 -й день после заражения). Мыши, вакцинированные STMΔ hfq , показали значительное увеличение ( P = 0,0129) популяции хелперных Т-клеток по сравнению с таковой у невакцинированных мышей. Уровень хелперных Т-клеток был значительно выше у вакцинированных зараженных мышей по сравнению с таковым у мышей, зараженных PBS ( P = 0.012) (Рисунок 6A и B). Однако в обоих случаях не было изменений в количестве Т-лимфоцитов CD8 + (рис. S3 и S4). Интересно, что мы наблюдали, что количество CD4 + Т-клеток было немного снижено с инфекцией STM-WT. Таким образом, наши результаты предполагают, что вакцинация индуцирует популяцию Т-лимфоцитов CD4 + и поддерживает ее даже после инфицирования без изменения уровней Т-лимфоцитов CD8 + .
Фигура 6. Анализ популяции Т-клеток CD4 + селезенки у вакцинированных и невакцинированных мышей с контрольным заражением или без него.
Группе мышей перорально вводили PBS или 10 8 STM Δ hfq бактерий, а затем заражали 10 7 КОЕ STM-WT на мышь. На 7 -й день после вакцинации и 7 -й день после заражения получали суспензию спленоцитов единичных клеток и окрашивали FITC-конъюгированными анти-CD4 MAb. Относительные уровни CD4 + Т-лимфоцитов измеряли с помощью FACS. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения BD Cell-Quest и представлены в виде точечной диаграммы (A) и гистограммы (B).Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05) (критерий Стьюдента t ). Каждая группа состояла из 4-5 мышей.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.g006
Вакцинация STMΔ
hfq увеличивает сывороточные уровни IFN-γ и IL-6
Цитокиновый профиль сыворотки после вакцинации указывает на тип вызванного иммунного ответа. Цитокины Th2 (IFN-γ, IL-2 и TNF-α) важны для клеточного иммунитета, тогда как цитокины Th3 (IL-4, IL-6 и IL-10) важны для увеличения продукции антител [36].Оценивали сывороточные уровни IFN-γ и IL-6 у вакцинированных (10 8 ) мышей и мышей, которым вводили PBS, с контрольным заражением или без него (10 7 ). У вакцинированных мышей уровень IFN-γ и IL-6 в сыворотке был выше, чем у мышей, которым вводили PBS ( P = 0,0029). Уровни сывороточного IL-6 и IFN-γ у вакцинированных мышей дополнительно повышались после заражения, оставаясь ниже, чем у невакцинированных зараженных мышей. (Рисунок 7A и B). Таким образом, наши данные показывают, что пероральная вакцинация STMΔ hfq увеличивает уровни IFN-γ и IL-6 в сыворотке и может косвенно помочь хозяину снизить количество вирулентных Salmonella .
Рисунок 7. Анализ сывороточных уровней цитокинов при однократной вакцинации.
(А) IFN-γ (B) ИЛ-6. Группе мышей перорально вводили PBS или STMΔ hfq (10 8 ), а затем заражали STM-WT (10 7 КОЕ / мышь) через 7 после вакцинации. Сыворотку собирали на 7 -й день после вакцинации (от не зараженных мышей) и 7 -й день после заражения (от зараженных мышей), и уровни цитокинов измеряли с помощью ELISA.Данные представляют два независимых эксперимента (n = 4-5). Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05; ** p <0,005) (критерий Стьюдента t ).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.g007
Вакцинация STMΔ
hfq заметно вызывает гуморальный иммунный ответ
Защита от Salmonella опосредуется через слизистые и сывороточные антитела (секреторный IgA и сывороточный IgG), а также клеточный иммунитет [37].Увеличение секреторного IgA, а также сывороточных антител IgG являются суррогатными маркерами защиты, обеспечиваемой эффективной пероральной вакциной-кандидатом [38]. Чтобы проверить, увеличивает ли вакцинация STMΔ hfq титры антител, мы измерили уровни антител в слизистой оболочке, а также сывороточные уровни антител у вакцинированных (10 8 ) по сравнению с контрольными мышами с заражением и без него (10 7 ). Мы определили уровни антител против двух поверхностных антигенов Salmonella , а именно LPS (рис. 8A и B) и белков внешней мембраны (OMP) (рис. 8C и D).Уровни IgA слизистой оболочки и сывороточного IgG заметно увеличились у вакцинированных мышей по сравнению с наивными мышами ( P <0,05). Титры антител оставались высокими в случае вакцинированных и зараженных мышей по сравнению с невакцинированными и зараженными мышами ( P <0,05). Вызванный гуморальный иммунный ответ сохранялся через 4 недели после иммунизации мутантным штаммом (фигура S5). Из наших результатов очевидно, что STMΔ hfq индуцирует эффективный гуморальный иммунный ответ.
Рисунок 8.Гуморальный иммунный ответ, вызванный однократной вакцинацией STMΔ hfq .
Группе мышей перорально вводили PBS или STMΔ hfq (10 8 ), а затем заражали STM-WT (10 7 КОЕ / мышь) на 7 день после вакцинации. Сыворотку и слизь кишечника собирали на 7 -й день после вакцинации (от не зараженных мышей) и 7 -й день после заражения (от зараженных мышей). Сывороточные IgG (B&D) и кишечные S-IgA (A&C) антитела, специфичные к LPS и OMP, измеряли с помощью ELISA.Образцы анализировали в трех экземплярах, и титр антител выражали как поглощение при 450 нм. Данные представляют два независимых эксперимента. Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05; ** p <0,005) (критерий Стьюдента t ). (n = 4-5).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.g008
STMΔ
hfq представлен лучше, чем STM-WT в анализе презентации антигена in vitro
Hopkins et al.в предыдущем исследовании сообщалось, что дендритные клетки интернализируют Salmonella сразу после инокуляции в желудочно-кишечном тракте мышей или инъекции в перевязанную петлю кишечника [39]. Дендритные клетки являются основными компонентами врожденной иммунной системы, которые способны запускать адаптивный иммунный ответ, действуя как антигенпрезентирующие клетки [40]. Дендритные клетки захватывают или отбирают образцы антигенов в периферической ткани, транспортируют антигены к лимфатическим узлам и представляют обработанные антигены Т-клеткам через молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC) [41].Таким образом, чтобы понять иммуногенность вакцинного штамма STMΔ hfq , мы сравнили стимуляцию пролиферации Т-клеток дендритными клетками костного мозга (BM-DC), которые инфицированы равным количеством STM-WT или STMΔ hfq . в анализе in vitro на пролиферацию Т-клеток (количество жизнеспособных клеток одинаково при заражении диким вирусом и мутантом). ДК, инфицированные STMΔ hfq , стимулировали пролиферацию Т-клеток до значительно ( P = <0,005) более высоких уровней, чем инфицированные STM-WT DC.Пролиферация лимфоцитов дополнительно усиливается с увеличением отношения DC к T-клеткам (рис. 9). Кроме того, жизнеспособность DC, инфицированных WT или STMΔ hfq , остается неизменной (данные не показаны). Это ясно демонстрирует, что вакцинный штамм STMΔ hfq представлен лучше, чем STM-WT.
Фигура 9. Повышенная презентация антигена STMΔ hfq дендитными клетками.
Дендритные клетки выделяли от мышей BALB / C и высевали из расчета 5 × 10 4 клеток / лунку в 96-луночные планшеты с плоским дном для культуры ткани.Мышей C57BL / 6 инфицировали STM-WT для предварительной стимуляции, и Т-лимфоциты выделяли в асептических условиях на 5 -й день. DC были инфицированы STM-WT и STMΔ hfq . Затем инфицированные ДК культивировали совместно с Т-лимфоцитами в соотношении (11) и (1∶10) в течение 72 часов, а затем подвергали пульсированию в течение 16 часов [ 3 H] тимидина (1 мкКи / лунку). . Включение [ 3 H] тимидина в пролиферирующие Т-клетки измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Пролиферацию Т-клеток представляли в количестве / мин с использованием бета-счетчика.Результаты являются репрезентативными для двух независимых экспериментов в тройном варианте. Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05) (критерий Стьюдента t ).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.g009
Обсуждение
В этом исследовании мы оценили эффективность сильно аттенуированного мутанта STMΔ hfq в качестве живой вакцины против сальмонеллеза на мышиной модели брюшного тифа. Мы сконструировали штамм S. с дефицитом hfq. Typhimurium и исследовали вирулентность этого штамма. У мутанта с делецией была нарушена его способность к внутриклеточной пролиферации, а также он был сильно аттенуирован in vivo после перорального инфицирования мышей BALB / c. Транс-комплементация гена hfq восстанавливала вирулентность мутанта. Эти результаты соответствуют работе Sittka et al. [28], где они сообщили, что мутант S. Typhimurium hfq был аттенуирован при внутрибрюшинной инфекции мышей BALB / c при конкуренции с родительским штаммом, и что восстановление бактерий также было низким после оральной инфекции.
Считается, что
Hfq прямо или косвенно регулирует по крайней мере 20% всех генов Salmonella , что указывает на то, что Hfq действует как истинный глобальный регулятор в Salmonella [42]. Hfq преимущественно влияет на экспрессию двух систем секреции третьего типа (T3SS), кодируемых островами патогенности (SPI) Salmonella , а именно SPI-1 и SPI-2. Salmonella использует эти системы секреции третьего типа (T3SS) для доставки эффекторов в клетки-хозяева, тем самым облегчая инвазию хозяина и внутриклеточное выживание [27], [28], [42].Гены, регулируемые Hfq, также включают многие гены, связанные с биосинтезом LPS, и транспортеры ABC [43], [44], которые очень важны для придания устойчивости к антимикробным пептидам. Hfq также регулирует поглощение и хранение железа в бактериях с помощью малых РНК. В доступной литературе показана многофункциональная роль Hfq в биологии Salmonella . Таким образом, мутант с делецией hfq был оценен на предмет его эффективности в качестве потенциального вакцинного штамма.
Наши данные ясно показывают, что мутант STMΔ hfq является эффективным кандидатом в оральную вакцину на мышиной модели и может вводиться как в бустерной, так и в однократной дозе.Вакцинация с последующим заражением значительно снизила бактериальную нагрузку по сравнению с невакцинированными мышами. Более того, бактериальная нагрузка полностью исчезла в течение 3 недель после заражения вакцинированных мышей (данные не показаны). Однако более низкая доза вакцины (10 3 , введенная дважды в бустерах) не могла спасти мышей от летального заражения диким вирусом из-за недостаточного примирования. Следовательно, когда доза иммунизации была увеличена до 10 4 или 10 5 , мыши показали 100% выживаемость.Кроме того, STMΔ hfq также обеспечивает долгосрочную защиту от проблем. Это говорит о том, что вакцинный штамм, вероятно, эффективен в индукции специфического адаптивного иммунного ответа, что приводит к долговременной защите от инфекции Salmonella .
Одной из основных ловушек живых аттенуированных штаммов оральных вакцин является загрязнение окружающей среды фекалиями, что, в свою очередь, связано с проблемами здоровья и безопасности. Исследования на людях-добровольцах различных вакцинных штаммов Salmonella Typhimurium показали большее выделение вакцинных штаммов с фекалиями [45], [46], [47].Степень выделения жизнеспособных Salmonella после пероральной инокуляции существенно различается между различными сероварами Salmonella . Вакцинные штаммы Salmonella Typhimurium демонстрируют заметно более высокую кишечную колонизацию и экскрецию в течение более длительного времени, чем те же самые штаммы вакцины Salmonella Typhi [48]. Уменьшение фекального выделения STMΔ hfq является дополнительным преимуществом в отношении его воздействия на окружающую среду.
Интересное наблюдение отличалось от STM-WT, инфекция STMΔ hfq не вызывала выкидыша у беременных мышей, и недавно родившиеся детеныши оставались здоровыми в течение нескольких недель.Это наблюдение намекает на безопасность использования вакцинного штамма у беременных мышей. До настоящего времени для вакцинации беременных животных вместо живых аттенуированных вакцин использовались только субъединичные, убитые или анатоксиновые вакцины из-за возможности передачи болезни плоду. Более того, эти вакцины не вызывают иммунитета слизистых оболочек. Аборты у беременных животных в поголовье из-за сероваров Salmonella приводят к огромным экономическим потерям [33]. Таким образом, можно рассмотреть возможность использования мутанта с делецией hfq для вакцинации живого поголовья.
Чтобы исследовать основы защитного иммунитета, создаваемого STMΔ hfq, , мы исследовали популяцию Т-клеток селезенки. Через 7 дней после инфицирования наблюдалось увеличение общего количества клеток CD4 + селезенки у мышей, инфицированных STMΔ hfq , по сравнению с наивными, а также инфицированными STM-WT мышами. CD4 + Т-клетки оказывают сильное влияние на защитный иммунитет, поскольку они помогают В-клеткам производить больше антител и генерировать Salmonella , специфичные для CD8 + Т-клеток [49], [50].Мы также наблюдали, что количество CD4 + Т-клеток было немного снижено с инфекцией STM-WT. Снижение количества Т-клеток вирулентной Salmonella Typhimurium может быть связано с индукцией апоптоза в зависимости от SPI-2 живыми бактериями [40], [51]. Это может быть не так с STMΔ hfq , поскольку система секреции третьего типа, кодируемая SPI-2, регулируется с понижением [27], [28], [42]. В нашем исследовании мы не наблюдали увеличения количества CD8 + T-клеток на ранней стадии инфекции, поскольку Salmonella существенно задерживает ответ CD8 + T-клеток до второй недели инфекции [52].Необходимы дальнейшие исследования на модели in vivo презентации антигена Salmonella , чтобы установить природу и специфичность увеличенных Т-клеток.
Было подтверждено, что ответ Th2 (IFN-γ и TNF-α) важен для подавления системного распространения Salmonella на начальных стадиях инфекции. Однако инфицирование некоторыми аттенуированными штаммами Salmonella может вызвать ответ Th3 [37], [53]. Продукция IFN-γ большим количеством Т-клеток и NK-клеток, специфичных для Salmonella , по крайней мере частично отвечает за повышение иммунитета против вторичных инфекций.Сообщалось, что уровни IFN-γ и IL-6 прямо пропорциональны тяжести инфекции у мышей, инфицированных S. Dublin [54]. Эти данные подтвердили наши выводы, согласно которым мы наблюдали снижение уровня IFN-γ и IL-6 у вакцинированных и зараженных мышей. Тем не менее, наблюдаемый уровень может эффективно очистить WT. У инфицированных WT мышей наблюдались более высокие уровни цитокинов, что можно было объяснить высокой вирулентностью и бременем штамма дикого типа [55], [56], тогда как вакцинация с последующим контрольным заражением показала более низкие уровни цитокинов, что, возможно, могло быть связано с более низкой нагрузкой WT. на органы после вакцинации [35], [56].По-видимому, оптимальный уровень цитокинов, который не является ни таким высоким, как у инфицированного дикого типа, ни таким низким, как у только вакцинированного, достаточен для обеспечения защитного иммунитета.
Инфекция животных с дефицитом В-клеток аттенуированной Salmonella показала вклад опосредованных антителами иммунных ответов в защиту от инфекции Salmonella [57]. У людей высокий уровень антиген-специфических антител Salmonella Typhi Vi коррелирует с защитой от инфекции.Эти два вывода предполагают, что гуморальный иммунный ответ важен для эффективного избавления от первичной инфекции Salmonella . В дополнение к LPS-специфическим антителам, OMP-специфические антитела также вносят вклад в приобретенную устойчивость к инфекции Salmonella , хотя и в меньшей степени. Иммунизация мышей очищенными OMP может защитить мышей от последующих инфекций Salmonella и индуцирует устойчивые ответы на всю жизнь без добавления адъюванта [58], [59].Кристина Гил-Круз и др. показали, что только антитела к OmpD могут уменьшить инфекцию, вызванную нетифоидной инфекцией Salmonella [60]. Более того, порины могут действовать как активаторы как врожденной, так и адаптивной иммунной системы. Отсутствие hfq ведет к хронической активации RpoE-опосредованного стрессового ответа оболочки, а также заметно увеличивает уровни OmpD [28]. В настоящем исследовании мы наблюдали, что вакцинация STMΔ hfq увеличивает LPS и OMP-специфические IgG-антитела в сыворотке, а также S-IgA в смывах кишечника.Как показано Michetti et al., Можно сделать вывод, что индуцированный S-IgA предположительно блокирует проникновение Salmonella на поверхность слизистой оболочки, возможно, за счет иммунного исключения [61]. Повышенный уровень сывороточного IgG может усиливать опосредованное Fc-рецептором и рецептором комплемента поглощение Salmonella фагоцитарными клетками и бактериальный клиренс из крови путем опсонизации.
STMΔ hfq , индуцированный защитный иммунитет, также может быть объяснен усиленной презентацией антигена мутаций с делецией hfq посредством DC.Cheminay et al. сообщили, что вирулентная Salmonella ингибирует MHC-II-зависимую презентацию антигена дендритными клетками и тем самым снижает активацию адаптивной иммунной системы. Эта способность ингибировать презентацию антигена зависит от способности патогена изменять транспорт или созревание Salmonella , содержащей вакуоль (SCV) внутри DC, что, в свою очередь, зависит от присутствия функционального SPI-2 и производства оксида азота. (НЕТ) [40]. Причина повышенной презентации вакцинного штамма STMΔ hfq может быть связана с отсутствием функционального SPI-2 [27], [28], [42] или сниженным образованием оксида азота (NO).
Hfq требуется для эффективной трансляции как сигма-фактора стационарной фазы RpoS (σ S ), так и сигма-фактора реакции оболочки на напряжение RpoE (σE) [62]. Coynault et al. сообщили, что у мутантов rpoS нарушена их способность колонизировать пейеровы пятна после оральной инфекции и они способны защищать восприимчивых мышей BALB / c от последующего перорального заражения вирулентным штаммом STM-WT [16]. Вакцины с пониженной способностью к сохранению in vivo наряду с хорошей иммуногенностью подходят для вакцины для человека, где побочные эффекты вакцинации являются серьезной проблемой.Пока наша работа велась, Карасова и др. сообщили, что мутант с делецией S. Enteritidis hfq был чувствителен к компонентам врожденной иммунной системы, таким как сыворотка и полимиксин B [63].
Таким образом, наша настоящая работа демонстрирует, что мутант с делецией Salmonella Typhimurium hfq может быть живой аттенуированной вакциной, при пероральном введении однократной дозой он может вызывать защитный иммунный ответ при последующем заражении вирулентной Salmonella .Не все аттенуированные штаммы Salmonellae могут быть хорошо представлены, и это стало камнем преткновения в создании успешной вакцины против Salmonella . Вакцинация мутантом с делецией hfq приводит к активному и специфическому защитному иммунитету. Наша работа убедительно свидетельствует о том, что мутант с делецией hfq может рассматриваться для вакцинации людей и экономически важного домашнего скота. Также потенциальное использование мутанта с делецией hfq в качестве гетерологичной системы доставки антигена представляется очень привлекательным вариантом, который все еще остается неизученным.
Материалы и методы
Заявление об этике
Вся работа с животными проводилась в соответствии с протоколом этики, утвержденным Комитетом по этике Центра животноводства. Номер этики CAF / ETHICS / 189/2010. Комитет по этике состоял из комитета по этике животных, в состав которого входили председатель, организатор и ученые.
Штаммы бактерий и условия роста
Salmonella Typhimurium 14028, использованная в данном исследовании в качестве родительского штамма дикого типа, была любезным подарком проф.Михаэль Хензель (Институт гигиены и медицинской микробиологии Макса фон Петтенкофера, Германия). Мутант с делецией Δ hfq был сконструирован в родительском штамме дикого типа. Бактерии выращивали при 37 ° C в бульоне Лурия (LB) в присутствии карбенциллина (50 мкг / мл) или канамицина (50 мкг / мл) по мере необходимости для отбора различных штаммов.
Линии эукариотических клеток и условия роста
клеток RAW 264.7 были любезным подарком профессора Анджали Каранде (Отдел биохимии Индийского института науки, Индия).Клетки INT-407, HT-29, HEK-293 и CaCo-2 были получены из Национального центра клеточных исследований (NCCS), Пуна, Индия. Все клеточные линии выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Sigma), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Sigma). Для роста клеток CaCo-2 в DMEM дополнительно добавляли 1X раствор незаменимых аминокислот. Все клетки поддерживали при 37 ° C в 5% углекислом газе.
Получение мутанта с делецией
hfq в Salmonella Typhimurium
Мутант hfq был создан с помощью стратегии одностадийной инактивации гена, как описано Дастенко и Ваннером [30].Вкратце, штамм STM 14028 трансформировали pKD46, несущей систему рекомбиназы лямбда-красного под индуцибельным промотором арабинозы. Трансформанты, несущие вспомогательную плазмиду pKD46, выращивали в LB с ампициллином (50 мкг / мл) и 10 мМ L-арабинозы (Sigma) до достижения OD 0,38–0,4 при 600 нм. Электрокомпетентные клетки получали путем трехкратной промывки клеток ледяной водой MilliQ и 10% глицерином. Продукты ПЦР, содержащие ген устойчивости к канамицину (из pKD4), фланкированный последовательностями выше и ниже гена hfq , амплифицировали с праймерами (HK1 и HK2) и электропорировали в штамм STM 14028, несущий pKD46.Электропорацию проводили в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad). Мутант был выбран по его способности расти на LB, содержащем канамицин, и это было подтверждено подтверждающими праймерами (HC1 и HC2), разработанными против фланкирующих локусов гена hfq , и внутренними праймерами (HI), разработанными против последовательности кассеты канамицина. В штамме STM-WT амплифицировали полосу размером 310 п.о., тогда как в штамме STMΔ hfq амплифицировали полосу 1,5 т.п.н. (соответствующую кассете канамицина).Полученный таким образом делеционный мутант был назван STMΔ hfq .
Последовательности праймеров, использованных в этом исследовании, следующие:
HK1: 5 ′ atggctaaggggcaatctttacaagatccgttcctggtgtaggctggagctgcttcg 3 ′
HK2: 5′ttattcagtctcttcgctgtcctgttgcgcagtagcatatgaatatcctcctta 3 ′
HC1: 5′gcatataaggaaaagaga3 ′
HC2: 5′gataaacagcgcgtgaac3 ′
HI: 5′cagaccgttcagctggat3 ′ (используется в качестве обратного праймера)
Конструирование
дополненного штамма hfq
Геномная ДНК
, выделенная из штамма Salmonella Typhimurium 14028, была использована в качестве матрицы для амплификации гена hfq с использованием специфичных для гена праймеров (вперед: 5’taggatccatggctaagg3 ‘и обратный: 5’cgcaagcttttattcagt3’).Амплифицированный продукт очищали и вставку вместе с очищенным вектором pQE60 расщепляли BamHI и Hind III. Расщепленный вектор и вставку лигировали и трансформировали в компетентные клетки E. coli DH5α и высевали на планшеты с LA-карбенциллином. Колонии подвергали скринингу на плазмиды, имеющие соответствующую вставку, путем рестрикционного переваривания. Очищенная плазмида, содержащая ген hfq , затем трансформировалась в электрокомпетентные клетки STMΔ hfq . Полученный штамм был назван штаммом pQE60 hfq .
Анализ внутриклеточной пролиферации
Различные клеточные линии, такие как RAW 264.7, INT-407, HT-29 и CaCo-2 в концентрации 1 × 10 5 до 2 × 10 5 на лунку высевали в 24-луночные планшеты за 12 часов до инфекционное заболевание. Для инфицирования клеток RAW 264.7 штамм S. Typhimurium выращивали до стационарной фазы в LB с соответствующим антибиотиком. Для инфицирования эпителиальных клеток культуры стационарной фазы разводили 1:33 в LB и выращивали в течение 3 часов (поздняя экспоненциальная фаза) до инфицирования для индукции кодируемых SPI-1 генов, необходимых для инвазии нефагоцитарных клеток.OD 600 культур довели до 0,3, и полученные бактериальные суспензии использовали для инфицирования клеток при множественности инфицирования (MOI) около 10. Планшеты центрифугировали при 1000 об / мин в течение 10 минут и инкубировали при 37 °. C в течение 25 мин. Затем клетки промывали PBS для удаления избытка бактерий и добавляли свежую среду, содержащую 100 мкг / мл гентамицина. Через 1 ч среду удаляли, а затем трижды промывали PBS, а затем добавляли среду, содержащую 25 мкг / мл гентамицина, и инкубировали в течение дополнительных периодов времени.После определенных периодов инкубации клетки лизировали 0,1% Triton X-100 (Sigma) и высевали в различных разведениях на агар LB, содержащий соответствующий антибиотик. Кратность внутриклеточной репликации рассчитывали путем деления внутриклеточной бактериальной нагрузки через 16 часов на внутриклеточную бактериальную нагрузку через 2 часа.
Заражение животных
Мышей BALB / c в возрасте от шести до восьми недель получали из Центрального животноводческого комплекса Индийского института науки, Бангалор, Индия, и содержали в условиях, свободных от определенных патогенов.Штаммы бактерий выращивали в течение ночи при 37 ° C при встряхивании (180 об / мин). Клетки центрифугировали, промывали, ресуспендировали в стерильном PBS и вводили мышам в указанных дозах. Сравнительный анализ нагрузки вакцинным штаммом дикого типа в различных органах проводили путем перорального инфицирования мышей дозой 10 7 бактерий / мышь. Через 4 -й и 7 -й день мышей умерщвляли с последующим выделением печени, селезенки и брыжеечных лимфатических узлов.Органы взвешивали и гомогенизировали в 1 мл PBS. Бактериальную нагрузку в органах определяли путем посева серийных разведений гомогената на чашки с агаром LB с селективным антибиотиком. КОЕ рассчитывали на грамм веса органа. Также все спленоциты выделяли для анализа популяции Т-лимфоцитов CD4 + и CD8 + .
Безопасность вакцинного штамма
Безопасность вакцинного штамма на модели мышей определяли путем инфицирования мышей дозой 10 8 бактерий / мышь (перорально) и 10 4 бактерий / мышь (внутрибрюшинно).Безопасность вакцинного штамма анализировали по сравнению с безопасностью штамма дикого типа, наблюдая за мышами два раза в день на предмет смертности и заболеваемости. То же самое было протестировано на беременных мышах, которые были инфицированы (10 8 бактерий / мышь) перорально на средней стадии беременности (12–14 дней беременности).
Фекальное выделение мутанта STM-WT и STMΔ
hfq
Когорты из пяти мышей были перорально инокулированы либо STM-WT, либо мутантом STMΔ hfq с дозой 10 7 бактерий.Свежие фекальные гранулы собирали каждые 12 часов до 4 -го дня и каждые 24 часа, начиная с 4 -го дня. Чтобы избежать высыхания фекальных гранул, мышей выращивали в клетках с бумагой Whatmann. Свежесобранные фекальные гранулы взвешивали и суспендировали в 1 мл PBS. Образцы центрифугировали при 1500 об / мин в течение 10 мин и высевали на планшеты с селективными антибиотиками. Данные представлены после нормализации КОЕ на грамм веса свежих фекальных гранул.
LD
50 определение
Самок мышей BALB / c в возрасте от шести до восьми недель не кормили в течение ночи перед инокуляцией.Для определения значений LD 50 группы из десяти животных были перорально инфицированы специфическим инокулятом для каждого штамма. Смерть животных регистрировалась до 3 недель.
Иммунизация мышей мутантным штаммом STMΔ
hfq
Иммунизация множественными бустерными дозами.
Когорты из пяти мышей были перорально примированы мутантным штаммом STMΔ hfq с дозой 10 3 , 10 4 или 10 5 бактерий / мышь с последующим введением двух бустерных доз на 7 th и 14 -й день.Контрольные мыши получали PBS (фигура S2). Все последующие этапы (заражение, умерщвление) выполнялись с перерывом в семь дней между ними. Через 7 дней введения второй бустерной дозы мышам вводили 10 7 STM-WT пероральным путем для анализа инфильтрации органов. Для анализа выживаемости мышей заражали 10 8 КОЕ / мышь пероральным путем.
Иммунизация однократной дозой.
Мышей вакцинировали однократной дозой STMΔ hfq (10 8 ), а затем заражали 10 7 STM-WT на 7 -й день после вакцинации.Мышей умерщвляли через 7 дней после заражения и определяли бактериальную нагрузку в печени, селезенке и мезентериальных лимфатических узлах, как описано выше. Для анализа выживаемости мышей перорально заражали 10 8 КОЕ дикого типа на мышь.
Индукция долговременной иммунологической памяти вакцинным штаммом STMΔ
hfq
Когорту из пяти мышей вакцинировали перорально однократной дозой 10 8 STMΔ hfq вакцинного штамма. Через 52 дня после вакцинации мышам вводили перорально 10 8 STM-WT на мышь.Контрольным мышам вводили PBS. После заражения вакцинированных и невакцинированных мышей ежедневно обследовали на заболеваемость и смертность.
Анализ сывороточных уровней цитокинов
Кровь собирали путем пункции сердца у мышей, иммунизированных однократной дозой, с контрольным заражением или без него. Сыворотку отделяли, и уровни цитокинов IFN-γ и IL-6 определяли с помощью ELISA (e-Bioscience) в соответствии с протоколом производителя.
Препарат кишечной слизи
Мышей голодали в течение 12 ч перед сбором кишечной слизи.Мышей скарифицировали, кишечную область собирали и разрезали на мелкие кусочки. Одна промывка PBS была проведена для удаления фекалий, кишечник был реверсирован, и слизь была собрана путем соскабливания щипцами. Собранную слизь центрифугировали при 12000 об / мин, и собранный супернатант использовали для оценки секреторного IgA.
Изоляция белка внешней мембраны (OMP)
Выделение OMP проводили методом Hamid et al. [64]. Вкратце, выращенную в течение ночи бактериальную культуру центрифугировали и осадок трижды промывали 10 мМ трис-HCl (pH 7.5), и осадок, эквивалентный 1,0 г сырого веса бактерий, экстрагировали 20 мл буфера для экстракции (10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 10 мМ ЭДТА и 6 М мочевина) в течение 1 ч при 4 ° C. Бактериальный экстракт подвергали диализу против воды MilliQ в течение 3 дней с частой заменой. Диализованный материал центрифугировали при 6000 об / мин в течение 1 ч. Собирали супернатант, содержащий поверхностные белки, и неочищенный образец OMP пропускали через колонку с полимиксином B-агарозой (Sigma) для удаления загрязненного эндотоксина. Уровни эндотоксина в очищенных белковых препаратах анализировали с помощью набора E-Toxate (Sigma).Очищенный образец OMP лиофилизировали и хранили при -20 ° C. Содержание белка в образцах измеряли методом оценки белка Брэдфорда.
Определение антител IgG и IgA в сыворотке крови и слизи кишечника
LPS- и OMP-специфических антител IgG и IgA в сыворотке и слизи кишечника анализировали с помощью ELISA. Очищенный LPS из Salmonella Typhimurium был получен от Sigma-Aldrich, где OMP были выделены, как описано ниже. Вкратце, планшет Nunc для ELISA покрывали 100 нг / лунку LPS или 500 нг / лунку OMP в 100 мкл 0.02% трихлоруксусная кислота (TCA). После 1 ч инкубации при 37 ° C лунки, покрытые LPS или OMP, промывали промывочным буфером (0,5% PBS-Tween-20) и блокировали в нем 3% BSA. После 1 ч инкубации лунки промывали и инкубировали с разведениями сыворотки в промывочном буфере (1∶10) в течение 1 ч при 37 ° C. Затем лунки промывали и добавляли 100 мкл анти-IgG и анти-IgA антител (Sigma), конъюгированных с HRP (1-10 000 разведений), с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 1 ч и добавлением 100 мкл раствора субстрата. впоследствии.После 15 мин инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл стоп-раствора и измеряли OD при 450 нм. В случае кишечной слизи после оценки по методу Брэдфорда брали равное количество белка.
Проточно-цитометрический анализ популяции Т-клеток
спленоцитов были изолированы в асептических условиях, и одноклеточные суспензии были получены путем их измельчения между предметными стеклами с шероховатой поверхностью с последующим лизисом эритроцитов с использованием буфера для лизиса эритроцитов (0,1 М NH 4 Cl, 1 мМ KHCO 3 , 1 мМ EDTA в H 2 О).Клетки окрашивали отдельно FITC-конъюгированным анти-CD4 (e-Biosciences) MAb или PE-конъюгированным анти-CD8 (e-Biosciences) MAb. После 1 ч инкубации при комнатной температуре клетки промывали PBS и один миллион (10 6 ) клеток отбирали для проточно-цитометрического анализа (BD FACS Canto-II). Данные анализировали с помощью программного обеспечения FACS Diva и Cell Quest Pro (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Очистка Т-лимфоцитов
Через пять дней после инфицирования аллогенных мышей C57BL / 6 STM-WT спленоциты получали путем инкубации небольших кусочков селезенки в бессывороточном, не содержащем кальция HBSS при 37 ° C в течение 45 минут.Этот препарат дезагрегировали осторожным пипетированием для получения суспензии одноклеточных. Затем клетки промывали HBSS и эритроциты лизировали 1X буфером для лизиса эритроцитов. Препараты фильтровали для удаления остатков и ресуспендировали в RPMI с 10% FCS. Клетки инкубировали в течение ночи, чтобы макрофаги прилипли. Неприкрепленные клетки переносили в свежую 30-миллиметровую чашку, которую покрывали очищенным козьим антителом против мышиного IgG (20 мкг / мл), и инкубировали в течение 6 часов. После 6 ч инкубации неприлипающие клетки отбирали для анализа.Чистоту Т-клеток проверяли с помощью FACS с использованием мышиных антител к CD3, конъюгированных с FITC (данные не показаны).
Получение и культивирование дендритных клеток
Дендритные клетки, полученные из костного мозга мышей, получали из костного мозга 6-8-недельных наивных мышей BALB / c для анализа презентации антигена, как описано Cheminay et al [40]. Вкратце, бедренные кости были отрезаны на концах, и костный мозг был промыт. Клетки вращали при 1000 об / мин в течение 10 минут и ресуспендировали в RPMI, содержащей 10 нг / мл GM-CSF (Peprotech), 10% инактивированной нагреванием FCS, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина. и культивировали в чашке для культуры ткани диаметром 90 мм.Наконец, после 5 дней культивирования среду собирали, суспендированные клетки извлекали и использовали для очистки с использованием магнитных шариков CD11c. Кроме того, с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией, было обнаружено, что клетки содержат> 90% CD11c + . Эти клетки были дополнительно проверены на маркеры созревания, такие как CD80 и CD86, и было обнаружено, что очищенные DC были незрелыми (данные не показаны). Очищенные ДК использовали для дальнейших экспериментов.
Анализ презентации антигена in vitro
Модифицированный метод Cheminay et al.последовали [40]. Вкратце, дендритные клетки выделяли из BALB / c, как описано ранее, и высевали с плотностью 5 × 10 4 клеток / лунку в 96-луночные планшеты с плоским дном для культивирования тканей. Бактериальное инфицирование DC проводили, как описано в анализе внутриклеточной пролиферации. Через двенадцать часов после инфицирования в каждую лунку добавляли очищенные Т-клетки селезенки аллогенных мышей C57BL / 6. Соотношение DC и Т-клеток поддерживалось на уровне 1∶10 и 1∶1. Клетки совместно культивировали в течение 72 часов, а затем обрабатывали импульсами в течение 16 часов с [ 3 H] тимидином (0.1 мкКи / лунку). Клетки собирали на фильтры из стекловолокна с использованием полуавтоматического сборщика клеток (Nunc, Дания). [ 3 H] тимидин измеряли в жидкостном сцинтилляционном счетчике (Rack Beta), и пролиферацию Т-клеток наносили на график как среднее количество / мин для трех лунок.
Статистика
Данные in vitro были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента с использованием сигма-графика. Тест Mann Whitney U проводили для эксперимента на мышах с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (Graph Pad Prism, San Diego, CA).Данные о смертности и выживаемости были проанализированы с использованием точного критерия Фишера. Результаты были определены как статистически значимые, когда было получено значение P менее 0,05.
Вспомогательная информация
Рисунок S1.
Комплементация штамма STMΔ hfq pQE60 hfq восстанавливает вирулентность. Внутриклеточная репликация STM-WT, STMΔ hfq и комплементарного штамма в клеточных линиях INT-407 (A) и RAW 264.7 (B). INT-407 и RAW 264.7 клеточных линий были инфицированы с MOI 10 и лизированы через 2 и 16 часов после инфицирования. Бактериальная кратная репликация рассчитывалась от 2 до 16 часов, как показано на графике. (C) Нагрузки на органы STM-WT, STMΔ hfq и дополнительный штамм. Три группы мышей (по 6 в каждой) инфицировали перорально 10 7 КОЕ / мышь каждым штаммом отдельно и умерщвляли на 4 -й день после инфицирования. Количество бактерий в селезенке, MLN и печени измеряли путем посева на соответствующие чашки с антибиотиками и отображали в виде КОЕ / г.wt со стандартными ошибками. Графики представляют два независимых эксперимента с аналогичными результатами. Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05; ** p <0,005) (критерий Стьюдента t и критерий Манна-Уитни U).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.s001
(TIF)
Рисунок S2.
Стратегия иммунизации, используемая для оценки вакцинного потенциала мутанта с делецией STMΔ hfq (A) стратегия множественной иммунизации; мышей примировали штаммом вакцины с последующим введением двух бустерных доз на 7 -й и 14 -й день, а затем заражали вирулентным штаммом Salmonella на 7 -й день после последней бустерной дозы.(B) Разовая доза вакцинации: мышей вакцинировали и затем заражали вирулентным штаммом Salmonella через 7 дней после вакцинации. Для анализа КОЕ мышей заражали 10 7 , а для анализа выживаемости 10 8 КОЕ WT.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.s002
(TIF)
Рисунок S3.
Проточный цитометрический анализ популяции CD8 + Т-клеток в селезенке на 4 -й день и 7 -й день после инфицирования.Группы мышей инокулировали STM-WT или STMΔ hfq с дозой 10 7 бактерий на мышь. Неинфицированных мышей использовали в качестве контроля. Спленоциты выделяли на 4 и 7 день после инфицирования как от инфицированных, так и от контрольных мышей и окрашивали PE-конъюгированными анти-CD8 MAb. Относительные уровни CD8 + Т-лимфоцитов измеряли с помощью FACS. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения BD Cell-Quest и представлены точечными графиками. Результаты представляют два независимых эксперимента.Каждая группа состояла из 4-5 мышей.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.s003
(TIF)
Рисунок S4.
Проточный цитометрический анализ селезенки CD8 + популяции Т-клеток у вакцинированных и невакцинированных мышей с заражением или без него. Группе мышей перорально вводили PBS или 10 8 STM Δ hfq , а затем через семь дней после вакцинации заражали 10 7 КОЕ STM-WT на мышь. На 7 -й -й день после вакцинации (от не зараженных мышей) и 7 -й -й день после заражения (от зараженных мышей) выделяли селезенку и получали суспензию единичных клеток спленоцитов с последующим окрашиванием FITC-конъюгированным анти-CD8 MAb.Относительные уровни CD8 + Т-лимфоцитов измеряли с помощью FACS. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения BD Cell-Quest и представлены в виде точечной диаграммы. Каждая группа состояла из 4-5 мышей.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.s004
(TIF)
Рисунок S5.
Определение сывороточных уровней IgG и S-IgA в кишечнике через 4 недели после однократной вакцинации. Группе мышей перорально вводили PBS или вакцинный штамм (10 8 ), сыворотку и кишечную слизь собирали через 4 недели после вакцинации.Сывороточные IgG (B&D) и кишечные S-IgA (A&C) антитела, специфичные к LPS и OMP, измеряли с помощью ELISA. Образцы анализировали в трех экземплярах, и титр антител выражали как поглощение при 450 нм. Представленный результат является одним из двух независимых экспериментов. Статистическая значимость была определена следующим образом: (* p <0,05; ** p <0,005) (критерий Стьюдента t ). (n = 5-6).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016667.s005
(TIF)
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Намрату, Сангиту, Ананталакшми и Дивья Пракаш за их критические предложения.Мы также благодарим доктора Уильяма Сурина за помощь в анализе FACS. Мы благодарим доктора К. Н. Баладжи за предоставленные нам гранулы полимиксиновой агарозы. Мы благодарим Gangamma за помощь в анализе LPS в образцах OMP. Благодарим предприятие Central Animal за предоставление нам животных.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: США, округ Колумбия, США. Проведены эксперименты: USA AL MGK OJ. Проанализированы данные: USA AL DC. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: DC.Написал рукопись: США, округ Колумбия.
Ссылки
- 1.
Andrews-Polymenis HL, Baumler AJ, McCormick BA, Fang FC (2010) Укрощение слона: Salmonella , биология, патогенез и профилактика. Заражение иммунной 78: 2356–2369. - 2.
Чан К., Бейкер С., Ким СС, Детвейлер С.С., Дуган Г. и др. (2003) Геномное сравнение сероваров Salmonella enterica и Salmonella bongori с использованием микроматрицы ДНК серовара Typhimurium S. enterica .J Bacteriol 185: 553–563. - 3.
Нагараджан А.Г., Баласундарам С.В., Дженис Дж., Карнам Дж., Эшвараппа С.М. и др. (2009) SopB серовара Salmonella enterica Typhimurium является потенциальным кандидатом на ДНК-вакцину в конъюгации с живыми аттенуированными бактериями. Vaccine 27: 2804–2811. - 4.
Crump JA, Luby SP, Mintz ED (2004) Глобальное бремя брюшного тифа. Bull World Health Organ 82: 346–353. - 5.
ДеРоек Д., Джодар Л., Клеменс Дж. (2007) Включение вакцинации от брюшного тифа в повестку дня глобального здравоохранения.N Engl J Med 357: 1069–1071. - 6.
Саги С.С., Паливал П., Бансал А., Мишра С., Хан Н. и др. (2006) Исследования иммуногенности и защитной эффективности DnaJ Salmonella Typhi против летальной инфекции Salmonella Typhimurium у мышей. Vaccine 24: 7135–7141. - 7.
Cheminay C, Hensel M (2008) Рациональный дизайн рекомбинантных вакцин Salmonella . Int J Med Microbiol 298: 87–98. - 8.
Keitel WA, Bond NL, Zahradnik JM, Cramton TA, Robbins JB (1994) Клинические и серологические реакции после первичной и бустерной иммунизации капсульными полисахаридными вакцинами Salmonella typhi Vi.Vaccine 12: 195–199. - 9.
Germanier R, Fuer E (1975) Выделение и характеристика мутанта Gal E Ty 21a Salmonella typhi : штамм-кандидат для живой пероральной вакцины против брюшного тифа. J Infect Dis 131: 553–558. - 10.
Иванов Б., Левин М.М., Ламберт PH (1994) Вакцинация против брюшного тифа: текущее состояние. Bull World Health Organ 72: 957–971. - 11.
Хан С.А., Стратфорд Р., Ву Т., МакКелви Н., Беллаби Т. и др. (2003) Salmonella typhi и S Производные Typhimurium, несущие делеции в ароматическом биосинтезе, и гены Salmonella Pathogenicity Island-2 (SPI-2) в качестве вакцин и векторов.Vaccine 21: 538–548. - 12.
Киркпатрик Б.Д., Маккензи Р., О’Нил Дж. П., Ларссон С. Дж., Буржуа А. Л. и др. (2006) Оценка серовара Typhi (Ty2 aroC-ssaV-) M01ZH09 Salmonella enterica с определенной мутацией на острове 2 патогенности Salmonella в качестве живой пероральной вакцины против брюшного тифа у людей-добровольцев. Vaccine 24: 116–123. - 13.
Hoiseth SK, Stocker BA (1981) Ароматозависимая Salmonella Typhimurium невирулентны и эффективны в качестве живых вакцин.Природа 291: 238–239. - 14.
Tacket CO, Sztein MB, Losonsky GA, Wasserman SS, Nataro JP и др. (1997) Безопасность живых штаммов вакцины Salmonella typhi для орального применения с делециями в htrA и aroC aroD и иммунный ответ у людей. Инфекция иммунной 65: 452–456. - 15.
Galan JE, Curtiss R 3rd (1989) Вирулентность и вакцинный потенциал мутантов phoP Salmonella Typhimurium. Microb Pathog 6: 433–443. - 16.
Coynault C, Robbe-Saule V, Norel F (1996) Вирулентность и вакцинный потенциал мутантов Salmonella, Typhimurium, дефицитных по экспрессии регулона RpoS (сигма S).Мол микробиол 22: 149–160. - 17.
Nagy G, Dobrindt U, Hacker J, Emody L (2004) Оральная иммунизация мутантом rfaH вызывает защиту от сальмонеллеза у мышей. Инфекция иммунной 72: 4297–4301. - 18.
Garcia-Del Portillo F, Pucciarelli MG, Casadesus J (1999) Мутанты ДНК-аденин-метилазы Salmonella Typhimurium обнаруживают дефекты секреции белка, клеточной инвазии и цитотоксичности М-клеток. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 11578–11583. - 19.Heithoff DM, Sinsheimer RL, Low DA, Mahan MJ (1999) Существенная роль метилирования аденина ДНК в бактериальной вирулентности. Наука 284: 967–970.
- 20.
Dueger EL, House JK, Heithoff DM, Mahan MJ (2001) Salmonella ДНК-мутанты аденинметилазы вызывают защитные иммунные ответы на гомологичные и гетерологичные серовары у кур. Заражение иммунной 69: 7950–7954. - 21.
Петерс С.Е., Патерсон Г.К., Бандуларатне Е.С., Нортен Х.С., Pleasance S и др.(2009) Salmonella enterica мутанты серовара Typhimurium trxA защищают от вирулентного заражения и вызывают меньшее воспаление, чем живой аттенуированный вакцинный штамм SL3261. Заражение иммунной 78: 326–336. - 22.
Нортен Х., Патерсон Г.К., Константино-Касас Ф., Брайант С.Е., Клэр С. и др. (2009) Salmonella enterica мутанты серовара Typhimurium, полностью лишенные АТФазы F (0) F (1), представляют собой новые живые аттенуированные вакцинные штаммы. Vaccine 28: 940–949. - 23.Franze de Fernandez MT, Eoyang L, August JT (1968) Фракция фактора, необходимая для синтеза Qbeta-РНК бактериофага. Природа 219: 588–590.
- 24.
Tsui HC, Leung HC, Winkler ME (1994) Характеристика широко плейотропных фенотипов, вызванных мутацией вставки hfq в Escherichia coli K-12. Mol Microbiol 13: 35–49. - 25.
Brown L, Elliott T (1996). Для эффективной трансляции сигма-фактора RpoS в Salmonella Typhimurium требуется фактор хозяина I, РНК-связывающий белок, кодируемый геном hfq.J Bacteriol 178: 3763–3770. - 26.
Muffler A, Fischer D, Hengge-Aronis R (1996) РНК-связывающий белок HF-I, известный как фактор-хозяин для репликации РНК фага Qbeta, необходим для трансляции rpoS в Escherichia coli. Гены Дев 10: 1143–1151. - 27.
Sittka A, Lucchini S, Papenfort K, Sharma CM, Rolle K и др. (2008) Глубокий анализ секвенирования малых некодирующих РНК и мишеней мРНК глобального посттранскрипционного регулятора Hfq. PLoS Genet 4: e1000163. - 28.
Sittka A, Pfeiffer V, Tedin K, Vogel J (2007) РНК-шаперон Hfq необходим для вирулентности Salmonella Typhimurium. Mol Microbiol 63: 193–217. - 29.
Wilson JW, Ott CM, Honer zu Bentrup K, Ramamurthy R, Quick L, et al. (2007) Космический полет изменяет экспрессию бактериальных генов и вирулентность и раскрывает роль глобального регулятора Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 16299–16304. - 30.
Даценко К.А., Ваннер Б.Л. (2000) Одностадийная инактивация хромосомных генов в Escherichia coli K-12 с использованием продуктов ПЦР.Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640–6645. - 31.
Гарсия-дель Портильо F (2001) Salmonella внутриклеточная пролиферация: где, когда и как? Микробы заражают 3: 1305–1311. - 32.
Пейчич-Карапетрович Б., Гурнани К., Рассел М.С., Финлей Б.Б., Сад С. и др. (2007) Беременность снижает врожденную иммунную резистентность к Salmonella Typhimurium, что приводит к быстрой летальной инфекции. J Immunol 179: 6088–6096. - 33.
Cagiola M, Severi G, Forti K, Menichelli M, Papa P и др.(2007) Аборт, вызванный сероваром Salmonella enterica Abortusovis (S. Abortusovis) у овец, связан с недостатком продукции IFN-гамма и может быть предотвращен путем иммунизации инактивированной вакциной S. Abortusovis. Vet Microbiol 121: 330–337. - 34.
Кришнан Л., Гильберт Л.Дж., Рассел А.С., Вегманн Т.Г., Мосманн Т.Р. и др. (1996) Беременность снижает устойчивость мышей C57BL / 6 к основной инфекции Leishmania и вызывает снижение антиген-специфического ответа на IFN-гамма и повышение продукции цитокинов Т-хелперов 2.J Immunol 156: 644–652. - 35.
Неги В.Д., Нагараджан А.Г., Чакравортти Д. (2010) Безопасная вакцина (DV-STM-07) против сальмонеллезной инфекции предотвращает аборт и обеспечивает защитный иммунитет беременным и новорожденным мышам. PLoS One 5: e9139. - 36.
Karem KL, Kanangat S, Rouse BT (1996) Экспрессия цитокинов в кишечной лимфоидной ткани после перорального введения аттенуированных вакцинных штаммов Salmonella . Vaccine 14: 1495–1502. - 37.
Mittrucker HW, Kaufmann SH (2000) Иммунный ответ на инфекцию Salmonella Typhimurium у мышей. J Leukoc Biol 67: 457–463. - 38.
Viret JF, Favre D, Wegmuller B, Herzog C, Que JU и др. (1999) Слизистые и системные иммунные ответы у людей после первичной и бустерной иммунизации перорально вводимыми инвазивными и неинвазивными живыми аттенуированными бактериями. Инфекция иммунной 67: 3680–3685. - 39.
Hopkins SA, Niedergang F, Corthesy-Theulaz IE, Kraehenbuhl JP (2000) Рекомбинантный вакцинный штамм Salmonella Typhimurium поглощается и выживает в дендритных клетках мышиного пятна Пейера.Cell Microbiol 2: 59–68. - 40.
Cheminay C, Mohlenbrink A, Hensel M (2005) Внутриклеточный Salmonella ингибирует презентацию антигена дендритными клетками. J Immunol 174: 2892–2899. - 41.
Баншеро Дж., Бриер Ф., Ко С., Даву Дж., Лебек С. и др. (2000) Иммунобиология дендритных клеток. Анну Рев Иммунол 18: 767–811. - 42.
Chao Y, Vogel J (2010) Роль Hfq в бактериальных патогенах. Curr Opin Microbiol. - 43.Ансон Ч., Юн Х., Порволлик С., Моттаз-Брюэр Х., Петритис Б.О. и др. (2009) Глобальный системный анализ мутантов с делецией Hfq и SmpB в Salmonella : последствия для вирулентности и глобальной трансляции белков. PLoS One 4: e4809.
- 44.
Moon K, Gottesman S (2009) Регулируемая PhoQ / P малая РНК регулирует чувствительность Escherichia coli к антимикробным пептидам. Мол микробиол 74: 1314–1330. - 45.
Angelakopoulos H, Hohmann EL (2000) Пилотное исследование phoP / phoQ-удаленного Salmonella enterica серовара Typhimurium, экспрессирующего уреазу Helicobacter pylori, на взрослых добровольцах.Infect Immun 68: 2135–2141. - 46.
Хиндл З., Чатфилд С.Н., Филлимор Дж., Бентли М., Джонсон Дж. И др. (2002) Характеристика производных Salmonella enterica , содержащих определенные мутации aroC, и Salmonella островка патогенности 2 мутации системы секреции типа III (ssaV) путем иммунизации здоровых добровольцев. Infect Immun 70: 3457–3467. - 47.
Коттон С.Н., Ланковски А.Дж., Скотт Н., Сисул Д., Чен Л.М. и др. (2006) Безопасность и иммуногенность аттенуированного серовара Salmonella enterica Typhimurium, доставляющего антиген Gag ВИЧ-1 через систему секреции Salmonella типа III.Vaccine 24: 6216–6224. - 48.
Абд Эль Гани М., Янсен А., Клэр С., Холл Л., Пикард Д. и др. (2007) Живые аттенуированные вакцины-кандидаты Salmonella enterica серотипа Typhimurium с пониженным выделением фекалий являются иммуногенными и эффективными оральными вакцинами. Заражение иммунной 75: 1835–1842. - 49.
Nauciel C (1990) Роль CD4 + T-клеток и Т-независимых механизмов в приобретенной устойчивости к инфекции Salmonella Typhimurium. J Immunol 145: 1265–1269. - 50.
Mastroeni P, Villarreal-Ramos B, Hormaeche CE (1992) Роль Т-клеток, TNF-альфа и IFN-гамма в восстановлении иммунитета к пероральному заражению вирулентной Salmonella e у мышей, вакцинированных живыми аттенуированными вакцинами aro- Salmonella . Microb Pathog 13: 477–491. - 51.
Srinivasan A, Nanton M, Griffin A, McSorley SJ (2009) Отбор активированных CD4 T-клеток во время брюшного тифа управляется генами вирулентности Salmonella .J Immunol 182: 7838–7845. - 52.
Луу Р.А., Гурнани К., Дудани Р., Каммара Р., ван Фаассен Х. и др. (2006) Задержка роста и сокращения ответа CD8 + Т-лимфоцитов во время инфицирования вирулентной Salmonella Typhimurium. J Immunol 177: 1516–1525. - 53.
Мацуи Х., Сузуки М., Иссики Й., Кодама С., Эгути М. и др. (2003) Пероральная иммунизация АТФ-зависимыми мутантами с дефицитом протеазы защищает мышей от последующего перорального заражения вирулентным сероваром Typhimurium Salmonella enterica .Заражение иммунной 71: 30–39. - 54.
Eckmann L, Fierer J, Kagnoff MF (1996) Генетически устойчивые (Ityr) и чувствительные (Itys) конгенные линии мышей демонстрируют сходные цитокиновые ответы после заражения Salmonella dublin. J Immunol 156: 2894–2900. - 55.
Mizuno Y, Takada H, Nomura A, Jin CH, Hattori H и др. (2003) Th2- и Th2-индуцирующие цитокины при инфекции Salmonella . Clin Exp Immunol 131: 111–117. - 56.Pie S, Truffa-Bachi P, Pla M, Nauciel C (1997) Th2-ответ у Salmonella Typhimurium-инфицированных мышей с высокой или низкой скоростью бактериального клиренса. Инфекция иммунной 65: 4509–4514.
- 57.
O’Brien AD, Scher I, Metcalf ES (1981) Генетически обусловленный дефект в образовании антител против Salmonella делает мышей CBA / N врожденной восприимчивостью к инфекции Salmonella Typhimurium. J Immunol 126: 1368–1372. - 58.
Секундино I, Лопес-Масиас С., Сервантес-Барраган Л., Гиль-Крус С., Риос-Сарабия Н. и др.(2006) Порины Salmonella вызывают устойчивый, пожизненный специфический бактерицидный ответ памяти на антитела. Иммунология 117: 59–70. - 59.
Singh SP, Williams YU, Benjamin WH, Klebba PE, Boyd D (1996) Иммунопротекция с помощью моноклональных антител к поринам и липополисахариду Salmonella Typhimurium. Microb Pathog 21: 249–263. - 60.
Gil-Cruz C, Bobat S, Marshall JL, Kingsley RA, Ross EA и др. (2009) Порин OmpD из нетифоидной Salmonella является ключевой мишенью для защитного ответа антител B1b-клеток.Proc Natl Acad Sci U S A 106: 9803–9808. - 61.
Michetti P, Mahan MJ, Slauch JM, Mekalanos JJ, Neutra MR (1992) Моноклональный секреторный иммуноглобулин A защищает мышей от перорального заражения инвазивным патогеном Salmonella Typhimurium. Infect Immun 60: 1786–1792. - 62.
Kulesus RR, Diaz-Perez K, Slechta ES, Eto DS, Mulvey MA (2008) Влияние РНК-шаперона Hfq на приспособленность и потенциал вирулентности уропатогенных Escherichia coli.Заражение иммунной 76: 3019–3026. - 63.
Карасова Д., Себкова А., Врбас В., Гавличкова Н., Сисак Ф. и др. (2009) Сравнительный анализ мутантов серовара Enteritidis Salmonella enterica с вакцинным потенциалом. Vaccine 27: 5265–5270. - 64.
Хамид Н., Джейн С.К. (2008) Характеристика белка внешней мембраны Salmonella enterica серовара Typhimurium, который обеспечивает защиту от брюшного тифа. Clin Vaccine Immunol 15: 1461–1471.
Идентификация свойств вирулентности у Salmonella Typhimurium DT104 с использованием Caenorhabditis elegans
Abstract
Salmonella enterica серовидный дефинитивный фаг Typhimurium типа DT104, устойчивый к нескольким антибиотикам, является одним из наиболее распространенных видов Salmonella среди людей во всем мире. Хотя несколько когортных исследований показывают, что DT104, несущий локус множественной лекарственной устойчивости (MDR) на геномном острове 1 сальмонеллы, является возможным гипервирулентным штаммом по сравнению со штаммами DT104 без MDR или другими серотипами Salmonella enterica , существующие экспериментальные данные относительно свойств вирулентности, связанных с МЛ область является спорной.Чтобы ответить на этот вопрос, мы сконструировали мутантный штамм DT104 с изогенной делецией MDR (∆MDR), SNS12, путем аллельного обмена и использовали Caenorhabditis elegans в качестве модели-хозяина для оценки различий в вирулентности между этими двумя штаммами. SNS12 проявлял пониженную вирулентность у C. elegans , и мы наблюдали повышенную колонизацию и пролиферацию кишечника C. elegans с помощью DT104. Иммунный ответ против DT104, несущего MDR, по-видимому, функционирует через неканонический путь развернутого белкового ответа (UPR), а именно путь белка, несущего прионоподобный (QN-богатый) домен (PQN), в ced-1 зависимым образом в C.elegans . Кроме того, мы также демонстрируем, что гены пути PQN и ген антимикробного пептида abf-2 экспрессируются на более высоких уровнях транскрипции у червей сразу после воздействия DT104, по сравнению с червями, подвергшимися воздействию SNS12. В целом, наши результаты предполагают, что область MDR Salmonella Typhimurium DT104 играет непосредственную роль в вирулентности против Caenorhabditis elegans.
Образец цитирования: Саху С.Н., Анриани Ю., Грим С.Дж., Ким С., Чанг З., Джозеф С.В. и др.(2013) Идентификация свойств вирулентности у Salmonella Typhimurium DT104 с использованием Caenorhabditis elegans . PLoS ONE 8 (10):
e76673.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076673
Редактор: Дипшиха Чакравортти, Индийский институт науки, Индия
Поступила: 12 декабря 2012 г .; Дата принятия: 21 августа 2013 г .; Опубликовано: 4 октября 2013 г.
Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.
Финансирование: Это исследование финансировалось за счет внутреннего финансирования Управления по контролю за продуктами и лекарствами. Спонсор не принимал участия в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.
Введение
Не брюшной тиф Salmonella enterica — одна из основных причин болезней пищевого происхождения во всем мире [1].Среди более чем 2 500 сероваров Salmonella enterica , Typhimurium является вторым по распространенности после Enteritidis среди инфекций человека во всем мире [2]. Salmonella enterica серовар Typhimurium дефинитивный фаг типа DT104 (далее DT104) [3], впервые выделенный в 1960-х годах, появился в 1990-х годах, поскольку было обнаружено, что многие изоляты этого штамма приобрели множественную лекарственную устойчивость, в частности, к ампициллину, хлорамфениколу, стрептомицину. , сульфаниламиды и тетрациклин (ACSSuT) [4].
Геномный остров 1 Salmonella (SGI1) представляет собой геномный остров размером 43 т.п.н., содержащий 44 открытые рамки считывания (ORF) [5]. Область множественной лекарственной устойчивости (MDR) DT104 локализована в сегменте 13 т.п.н. SGI1 [3,5,6]. Несколько когортных исследований показали, что DT104, несущий область MDR, является гипервирулентным штаммом по сравнению со штаммами DT104 без MDR или другими серотипами Salmonella enterica [7,8]. Повышенная вирулентность, по-видимому, не связана с повышенной инвазивностью, так как не наблюдалось значительного увеличения инвазивных свойств DT104 при тестировании в анализах культур тканей и на мышиной модели систематического сальмонеллеза [9–11].Напротив, инсерционная инактивация локуса MDR в DT104, как сообщается, снижает вирулентность у кур по сравнению с изогенным родительским штаммом [12].
Почвенная нематода C. elegans использовалась в качестве модели беспозвоночного хозяина для идентификации и оценки факторов вирулентности нескольких патогенов человека, включая Salmonella enterica Typhimurium [13] [14] [15]. Короткий жизненный цикл способствует быстрым генетическим экспериментам и является одним из основных преимуществ для исследователей, работающих с этим организмом. C. elegans яйца оплодотворяются внутри взрослого гермафродита и откладываются через несколько часов — примерно на стадии 40 клеток. Эмбрионы C. elegans развиваются быстро и вылупляются через 14 часов. Первая личиночная стадия завершается еще через 12 часов, и животные проходят четыре цикла линьки (L1-L4), прежде чем стать взрослыми. Когда животные достигают совершеннолетия, каждое из них производит около 300 потомков в течение 3-4 дней. Жизненный цикл зависит от температуры; C. elegans проходит репродуктивный жизненный цикл, от яйца до родителя-откладывающего яйца, в 5.5 дней при 15 ° C, 3,5 дня при 20 ° C и 2,5 дня при 25 ° C. При 22 ° C средняя продолжительность жизни C. elegans составляет примерно 2–3 недели, а время генерации — примерно 4 дня в лабораторных условиях.
Модель взаимодействия C. elegans — Salmonella Typhimurium хозяин-патоген была создана более десяти лет назад и представляет собой мощную систему для понимания механизмов вирулентности патогена и иммунного ответа хозяина [16–18]. Salmonella Typhimurium, как было показано, колонизирует и вызывает стойкую кишечную инфекцию у C.elegans , даже после ограниченного воздействия [16,18]. Было обнаружено, что несколько факторов патогена и хозяина имитируют модели инфекции на животных организмах более высокого порядка. Например, регулятор генов, связанных с вирулентностью Salmonella у позвоночных, система передачи сигналов PhoP / PhoQ, также был обнаружен в патогенезе Salmonella Typhimurium у C. elegans [16]. Кислотостойкость Salmonella способствует выживанию микроорганизма во время его прохождения через пищеварительный тракт и впоследствии защищает от кислой среды внутри лизосом [19].Гены fur-1 , ompR и rpoS из Salmonella , которые, как известно, участвуют в различных аспектах кислотостойкости при инфекции человека, также оказались важными для C. elegans инфекция [18]. Было также показано, что липополисахарид (ЛПС) необходим для индукции запрограммированной гибели клеток, а также для персистенции Salmonella в кишечнике C. elegans [17]. Недавно Bailey et al. показали, что способность Salmonella Typhimurium прикрепляться и выживать в макрофагах зависит от RamA, члена семейства транскрипционных регуляторов AraC / XylS.Он также необходим для колонизации у мышей и кишечника C. elegans [20]. В этом исследовании мы сконструировали делеционный мутант области множественной лекарственной устойчивости в DT104, названный SNS12, а затем оценили прямое участие области множественной лекарственной устойчивости (MDR) Salmonella Typhimurium DT104 в патогенности с использованием модели C. elegans . .
Материалы и методы
C. elegans и использованные штаммы бактерий
С.elegans штаммы N2 (изолят Бристоль дикого типа), SS104 glp-4 ( bn2 ) и ced-1 ( e1735 и e1754 ) мутантные штаммы были приобретены из Caenorhabditis Center ( CGC). Все штаммы, кроме SS104, поддерживали при 22 ° C. SS104 поддерживали при 16 ° C, что является допустимой температурой для этого термочувствительного стерильного мутанта C. elegans . Штаммы культивировали в среде обитания C. elegans (CeHM) в колбах для тканевых культур на платформенном шейкере [21].Нематод отбеливали (0,5 M NaOH, 1% гипохлорит) для сбора яиц, которые инкубировали в среде M9 в течение 24 часов, чтобы привести их к синхронизированной стадии L1, а затем переносили в CeHM. Для получения синхронизированных червей на стадии L4 червей L1 выращивали в течение дополнительных 72 часов в CeHM. В этом исследовании использовались Salmonella Typhimurium DT104 (дикий тип) и его изогенный мутант ΔMDR, SNS12 (DT104 ΔMDR, данное исследование) и E. coli OP 50, бактериальный пищевой штамм для C. elegans . .
Конструирование мутанта с делецией MDR в DT104
Для конструирования мутанта с делецией MDR для DT104, область SGI1 от 24 576 до 44 114 п.н. (GenBank, доступ AF261825.2), которая содержит область MDR 13 т.п.н., была удалена с использованием двух разных векторов клонирования, pUC19 и pTOPO. Верхний или левый фрагмент (от 24 576 до 26 435 п.н.) клонировали в pTOPO с использованием праймеров P1 и P2 (таблица 1), содержащих сайты рестрикции BamHI и PstI (рисунок S1). Нижний или правый фрагмент (от 41 379 до 44 114 п.н.) клонировали в pUC19 с использованием праймеров P3 и P4 (таблица 1), содержащих сайты рестрикции PstI и HindIII (фигура S1).Затем вышележащий фрагмент расщепляли из вектора pTOPO и лигировали с pUC19, которая уже содержала правильный фрагмент. Ген, передающий устойчивость к канамицину, Kan R , фланкированный с обеих сторон PstI, был расщеплен из плазмиды pUC4K (GE Healthcare Life Sciences) и вставлен в сайт PstI pUC19, содержащий лигированные левый и правый фрагменты (фигура S1). Вся область, содержащая левый фрагмент + Kan R + правый фрагмент, была расщеплена из pUC19 с использованием ферментов BamHI и HindIII (фиг. S1) и клонирована в суицидный вектор pMAK705 [22], содержащий устойчивость к хлорамфениколу (фиг. S1).Плазмида pMAK705 имеет чувствительный к температуре репликон (ориджин pSC101), который активен при 28 ° C и неактивен при 42–44 ° C. Полученную плазмиду электропорировали в целевой штамм Salmonella Typhimurium DT104 и очищали серийным пересевом. Путем нескольких раундов скрининга с использованием подходящих антибиотиков и контролируемой температуры мы выделили целевой рекомбинант и подтвердили обмен аллелями с помощью ПЦР и измерили минимальные ингибирующие концентрации (МИК) различных антибиотиков (таблица 2).
| Грунтовки | Последовательность | Источник | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Primer1 | GCGGATCCGCGAACTCTCTATCTCCTCT | Это исследование | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Primer2 | AAAACTGCAGGACCCGAACTTGATAACTGC | Это исследование | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Primer3 | AAAACTGCAGCAACCACCATTTCGCAGCAG | Это исследование | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Primer4 | CCCAAGCTTGTCAAAGCGGTAGCGGAAAC | Данное исследование | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ABF-2 (F) | CCATCGTGGCTGCCGACATCGACTTT | [13] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ABF-2 (R) | GAGCACCAAGTGGAATATCTCCTCCTC | [ 13] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| abu-11 (F) | CCAATCGCCCAGTGCCAATCATC | [24] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| abu-11 (R) | CTGAACATTGGTGTCTCTGTATTATG22 922G22 922G22 922G22 922G 222 922G22 922G 222 922G22 922 922 922 | [24] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| пан-актин (R) | CATCCCAGTTGGTGACGATA | [24] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| abu-1 (F) | CTACTTGCCGAAGCAACAAC | [24] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| pqn-54b (F) | TCAACCACAACAAACCCAGA | [24] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| pqn-543G22 922 922 922GTG72 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Антибиотик | DT104 | SNS12 | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AmiKacin (AMI) | 2 | 16 | <= 1 | |||||||||
| Цефтриаксон (AXO) | <= 0,25 | <= 0,25 | ||||||||||
| Цефалотин (CEP72 | 2 Хлорамфеникол (CHL) | > 32 | 4 | |||||||||
| Ципрофлоксацин (CIP) | <= 0.015 | <= 0,015 | ||||||||||
| Тиметоприм / сульфаметоксазол (СОТ) | 0,25 | <= 0,12 | ||||||||||
| Цефокситин (FOX) | 4 | Gentamy | Gentamy | Gentamy | Gentam | 1 | ||||||
| Канамицин (KAN) | <= 8 | > 64 | ||||||||||
| Налидиксовая кислота (NAL) | 4 | 4 | ||||||||||
| Сальфаметоксазол | Сальфаметоксазол | Сальфаметоксазол | ||||||||||
| Стрептомицин (STR) | 64 | <= 32 | ||||||||||
| Тетрациклин (TET) | > 32 | 8 | ||||||||||
| Цефтиофур (TIO) | 5 | 0,5 |
Таблица 2. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) нескольких антибиотиков против Salmonella enterica серотипа Typhimurium phagetype DT104 и его изогенного мутанта ΔMDR, SNS12.
C. elegans анализ выживаемости
Анализы выживаемости с использованием C. elegans проводили в соответствии со стандартными протоколами [16]. Вкратце, бактериальные лужайки для анализов выживаемости готовили инокуляцией 50 мкл ночной бактериальной культуры на среду для фактора роста нематод (NGM) в 6-сантиметровые чашки Петри.Планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре перед добавлением червей. В каждой экспериментальной группе было 60-80 синхронизированных червей. Эксперименты проводились при комнатной температуре 22 ° C, за исключением экспериментов с использованием SS104, которые проводились при 25 ° C. SS104 [ glp-4 (bn2 )], чувствительный к температуре стерильный мутантный штамм C. elegans , был использован в нескольких анализах выживаемости, чтобы избежать искажающих результатов из-за размножения червей, то есть червей второго поколения. Черви оценивали на выживаемость каждые 24 часа.Выживаемость животных строили с использованием кривых выживаемости Каплана-Мейера и анализировали с использованием метода Гехана-Бреслоу-Уилкоксона для вычисления значений P в GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., Ла-Хойя, Калифорния). Анализы выживаемости повторяли не менее трех раз (эксперименты), причем каждый эксперимент имел три повтора. Результаты каждого эксперимента анализировались отдельно. Кривые выживаемости, приводящие к значению p <0,05, считались значимыми. В первую очередь, анализы выживаемости также выполнялись с использованием синхронизированных червей L4 стадии SS104; однако некоторые эксперименты были повторены с использованием других личиночных стадий для подтверждения и подтверждения результатов экспериментов с использованием червей N2.Для всех экспериментов E. coli OP 50, нормальный бактериальный пищевой штамм, был включен в качестве контроля.
Количество кишечных бактерий
Для оценки степени колонизации червей DT104 синхронизированным червям на стадии N2 L1 давали возможность питаться либо Salmonella дикого типа, Typhimurium DT104, либо изогенным мутантом ΔMDR, SNS12, в течение 24 часов. После такого воздействия червей дважды промывали стерильным буфером M9, затем помещали в среду NGM с добавлением гентамицина (25 мкг / мл) на 20 мин для уничтожения бактерий, прикрепленных к червям снаружи.После того как червей дважды промывали буфером M9, их помещали на планшеты NGM, засеянные OP 50, и инкубировали в течение 48 часов. Аликвоты десяти червей из каждой группы обработки собирали в моменты времени 0, 24 часа и 48 часов и помещали в пробирку с завинчивающейся крышкой на 2 мл, содержащую 500 мкл стерильного буфера M9 с 1% Triton X-100. Червей механически разрушали с помощью взбивателя со стеклянными шариками (Mini-Bead Beater, Biospec Products, Bartlesville, OK). Объем доводили средой M9 до 1 мл, и серийные разведения высевали на агаризованную среду BHI.
Микроскопия
Живых нематод помещали на предметное стекло с агаром и закрывали покровным стеклом. Азид натрия использовался для обезболивания глистов. Червей на стадии L1 подвергали действию тестируемых бактерий на чашках с агаром NGM в течение 72 часов при 22 ° C. Кишечные пути исследовали каждые 24 часа с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 II (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).
Уровень транскрипции генов хозяина
Синхронизированные черви стадии L1 N2 были перенесены в C.elegans среды обитания (CeHM) и инкубировали в течение 24 часов. Червей промывали буфером M9 и переносили на планшеты NGM, засеянные DT104 или SNS12, и инкубировали при 22 ° C в течение 72 часов. Черви собирали через 1 час и через каждые 24 часа инкубации. Червей промывали буфером M9 и экстрагировали РНК с использованием TRIzol (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY). Остаточную геномную ДНК удаляли обработкой ДНКазой (Turbo DNA-free, Ambion, Austin, TX). Для каждой экспериментальной обработки для количественной ОТ-ПЦР были выполнены три независимых выделения РНК.кДНК синтезировали из 5 мкг общей РНК с использованием случайных гексамеров и обратной транскриптазы SuperScript II (Invitrogen / Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк). Количественную или в реальном времени ОТ-ПЦР выполняли с использованием премикса для количественной ПЦР SYBR Advantage (Clontech Laboratories, Маунтин-Вью, Калифорния) и ген-специфических олигонуклеотидных праймеров на световом цикле (BIO RAD, Hercules, Калифорния). Праймеры для qRT-PCR перечислены в таблице 1. Относительное кратное изменение (воздействия DT104 или SNS12 дикого типа по сравнению с OP 50) для транскриптов было рассчитано с использованием сравнительного анализа C T (2 -ΔΔCT ) метод [23].Пороги цикла амплификации определяли с помощью программного обеспечения Light Cycler (BIO RAD, Hercules, CA). Все образцы были проанализированы в трех экземплярах и нормализованы.
Результаты
Фенотип множественной лекарственной устойчивости (MDR) утрачен у мутанта DT104 с делецией MDR
Чтобы проверить прямое участие области MDR в вирулентности в Salmonella Typhimurium DT104, изогенный мутант был сконструирован с использованием аллельного обмена (рисунок S1). Чтобы подтвердить потерю устойчивости к антибиотикам в изогенном мутантном штамме ΔMDR DT104, SNS12, мутантный штамм и родительский штамм дикого типа были проанализированы на устойчивость к шестнадцати антибиотикам с использованием метода дисковой диффузии Кирби-Бауэра (таблица 2).Результаты ясно показывают, что DT104 устойчив к ампициллину, амоксициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаметоксазолу и тетрациклину, но изогенный мутант ΔMDR, SNS12, был устойчив только к канамицину в результате введения гена устойчивости к канамицину посредством аллельного обмена (Таблица 2, рисунок S1). Следует отметить, что образование мутации ∆MDR в штамме SNS12 не оказало значительного влияния на скорость роста по сравнению с родительским штаммом DT104 дикого типа (рис. S2).
Область MDR
Salmonella Typhimurium DT104 обладает свойствами вирулентности против C.elegans
Синхронизированная стадия L4 Черви C. elegans , которых кормили либо DT104 дикого типа, либо SNS12, демонстрировали значительно сокращенную продолжительность жизни (P <0,0001) по сравнению с червями, которых кормили E. coli OP 50 (рис. 1). Кроме того, при воздействии SNS12 на червей наблюдалась ослабленная реакция уничтожения по сравнению с червями, подвергавшимися воздействию DT104 дикого типа (P = 0,0071) (рис. 1), что указывает на то, что вирулентность усиливается при наличии области MDR. Подобные результаты наблюдались и на других личиночных стадиях, таких как L1 (Рисунок S3) или генотипах C.elegans подвергались воздействию DT104 и SNS12 (Таблица S1). Интересно, что хотя обе личиночные стадии продемонстрировали значительно сокращенную продолжительность жизни при воздействии DT104 дикого типа, черви стадии L1 оказались немного более чувствительными (P <0,0001; Рисунок S3), чем черви стадии L4 (необработанные данные всех независимых экспериментов показаны в таблице S1).
Рисунок 1. Salmonella Typhimurium DT104 убивает C. elegans значительно быстрее, когда присутствуют гены MDR.
L4 стадия гермафродита SS104 червей подверглись воздействию дикого типа Salmonella Typhimurium DT104 (- ● -), SNS12, изогенный мутант ΔMDR DT104 (- ■ -), и E.coli OP 50 (- ▲ -). P <0,001.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076673.g001
Гены МЛУ индуцируют колонизацию
Salmonella Typhimurium в кишечнике C. elegans
Для исследования скорости колонизации и пролиферации кишечных бактерий у C. elegans , черви N2 дикого типа на стадии L1 подвергались воздействию как DT104, так и SNS12. После воздействия в течение 24 часов бактериальная колонизация кишечника составляла порядка 10 4 КОЕ на червя для обоих штаммов бактерий (рис. 2).Однако, как показано на фиг. 2, степень пролиферации DT104 в кишечнике C. elegans значительно выше (p <0,0001), чем у SNS12, через 48 часов 72 часа. Практически идентичные результаты наблюдались при использовании в анализе червей SS104 стадии L4 (рис. S4). Эти результаты показывают, что DT104, обладающий локусом MDR, проявляет способность более эффективно колонизировать и, что более важно, пролиферировать в кишечнике C. elegans . Чтобы подтвердить результаты, наблюдаемые при подсчете количества интернализованных бактерий на чашках, гельминтов исследовали с помощью конфокальной микроскопии для определения степени колонизации кишечника.Это легко достигается для C. elegans благодаря его прозрачной природе. По сравнению с SNS12, а также с E. coli OP 50, черви, подвергшиеся воздействию DT104, демонстрировали значительное вздутие кишечника, что свидетельствует о размножении бактерий (рис. 3).
Рисунок 2. Колонизация Salmonella Typhimurium DT104 в кишечнике C. elegans усилена за счет генов МЛУ.
L1 стадия N2 черви подвергались воздействию DT104 (- ● -) и SNS12 (- ■ -), и степень колонизации определялась каждые 24 часа.Каждая точка данных представляет собой колониеобразующую единицу на одного червя (червь -1 КОЕ) из пула из 10 инфицированных червей. Горизонтальная черта указывает совокупное среднее геометрическое из трех независимых экспериментов.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076673.g002
Рис. 3. Колонизация кишечника C. elegans Salmonella Typhimurium DT104.
Изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии репрезентативных червей, подвергшихся воздействию DT104, SNS12 и E.coli OP 50. Белая стрелка показывает измельчение глотки, а желтая линия показывает степень вздутия кишечника.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076673.g003
Мутанты Ced-1 гиперчувствительны к инфекции DT104
C. elegans развил множество путей распознавания микроорганизмов и защиты от инфекции, и некоторые из них были идентифицированы. Например, мутанты с потерей функции гена ced-1 в C.elegans подвергаются иммунной недостаточности и быстро убиваются живыми бактериями, что указывает на то, что это компонент врожденного иммунного ответа [24]. Ced-1, гомологичный человеческому CD91, рецептору липопротеинов низкой плотности, был первоначально обнаружен как компонент пути запрограммированной клеточной гибели и функционирует в фагоцитарных клетках, способствуя поглощению клеточного трупа [25]. Чтобы выяснить, является ли ответ C. elegans против DT104, несущего область MDR, зависимым от ced-1 , мы подвергли DT104 червей дикого типа N2 и мутантов ced-1 ( e1735 ) и оценили их выживаемость. .Мы обнаружили, что мутанты ced-1 ( e1735 ) умирают значительно быстрее (P <0,0085), чем черви дикого типа, при воздействии DT104 (Рисунок 4). Аналогичные результаты наблюдались при использовании дополнительного мутанта ced-1 C Штамм S. elegans , , e1754 , использовали в анализе выживаемости (фигура S5). Эти результаты предполагают, что иммунный ответ C. elegans на воздействие DT104, вероятно, опосредуется через ced-1 .
Рисунок 4. Ced-1 мутант Черви C. elegans более чувствительны к уничтожению с помощью DT104.
Ced-1 мутантные черви с потерей функции [ ced-1 (e1735)] умирают значительно быстрее (P = 0,0085), чем черви N2 дикого типа, при воздействии Salmonella Typhimurium DT104. L4 стадия дикого типа N2 (- ● -) и ced-1 (e1735) (- ■ -) черви подвергались воздействию DT104 и ежедневно анализировались на выживаемость.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0076673.g004
Уровни экспрессии генов, несущих прионоподобный (QN-богатый) домен, и гена антимикробного пептида (AMP) после воздействия
Salmonella DT104
Ced-1 регулирует альтернативный путь развернутого белкового ответа (UPR), путь белка, несущего прионоподобный (QN-богатый) домен [26], который потенциально играет роль в врожденном иммунитете C. elegans [24] . Сообщается, что сверхэкспрессия генов, несущих прионоподобный (QN-богатый) домен, действует как защитный ответ у C.elegans против живых бактерий, таких как Salmonella enterica -опосредованная колонизация и уничтожение [24]. Кроме того, несколько генов антимикробных пептидов (AMP), таких как abf-2 и spp-1 , экспрессируются в глотке и кишечнике C. elegans и, как было показано, обладают антимикробной активностью [13,27-29 ]. Ген abf-2 , экспрессируемый в глотке [28] и гомологичный антибактериальному фактору ASABF из Ascaris suum , обладает широкой активностью против ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжей [13 , 28].Ген spp-1 кодирует ценопор, белок, содержащий домен сапонина (B), который является членом суперсемейства сапонин-подобных белков (SAPLIP). Он экспрессируется в кишечнике [30] и проявляет антимикробную активность против таких видов бактерий, как Salmonella Typhimurium и Pseudomonas aeruginosa [13,31].
Мы определили уровни транскрипции нескольких генов, несущих прионоподобный (QN-богатый) домен, а именно pqn-54, abu-1, abu-11 и генов антимикробного пептида (AMP), abf-2 и spp-1 у червей N2 дикого типа при воздействии DT104.Относительные уровни транскрипции всех генов, кроме spp-1 , были выше, когда черви подвергались воздействию DT104 или SNS12, по сравнению с E. coli OP 50 (Рисунок 5). Мы не обнаружили каких-либо существенных различий в уровнях экспрессии spp-1 (данные не показаны). Что касается различий между червями N2, подвергшимися воздействию DT104 и SNS12, мы наблюдали более высокую экспрессию в более ранние моменты времени воздействия, через 1 или 24 часа после воздействия, у червей, подвергшихся воздействию DT104 дикого типа (рис. 5). Было обнаружено, что эта тенденция зависит от интактной регуляции Ced-1 гена pqn-54 (Рисунок S6).Интересно, что эта тенденция меняется на противоположную через 48 часов, когда уровни экспрессии были выше у животных, подвергшихся воздействию SNS12 (рис. 5).
Рисунок 5. Антимикробный ответ на дикого типа Salmonella Typhimurium DT104.
Экспрессия (A) pqn-54 , (B) abu-1 , (C) abf-2 и (D) abu-11 генов червей N2 , как определено с помощью qRT- ПЦР при 1-часовом, 24-часовом и 48-часовом воздействии. Относительные уровни экспрессии (DT104 или SNS12 выше OP 50) показаны как кратные изменения (среднее ± стандартное.эрр.).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076673.g005
Обсуждение
В нескольких когортных исследованиях сообщалось, что инфекция устойчивым к антибиотикам Salmonella Typhimurium DT104, несущим локус MDR, коррелировала с увеличением частоты и тяжести заболевания [7,8]. Сообщалось, что инактивация области MDR в DT104 снижает вирулентность у кур [12]. Однако результаты исследований с использованием тестов на тканевых культурах и мышиной модели систематического сальмонеллеза показывают, что повышенная вирулентность DT104 не является следствием увеличения инвазивности [9–11].
В этом исследовании мы обнаружили, что черви, получавшие DT104, были убиты значительно быстрее, чем черви, которых кормили изогенным мутантом ΔMDR, SNS12 (рис. 1), что подтверждает, что устойчивый к антибиотикам DT104 более вирулентен. Хотя разница, по-видимому, незначительна, она была хорошо воспроизводимой, независимо от генотипа и личиночной стадии использованных червей (Таблица S1).
Персистирующая бактериальная инфекция в кишечнике многоклеточных животных является важным аспектом патогенеза, хотя лежащий в основе молекулярный механизм еще предстоит выяснить.Было показано, что рост и пролиферация бактерий в кишечнике C. elegans является важным признаком патогенного процесса [16,32]. Колонизация кишечника зависит как от способности интактных бактерий проникать в просвет кишечника [33], так и от способности выжить при реакции иммунной системы хозяина. Когда червей кормят пищевыми бактериями, E. coli OP 50, они переваривают почти все, и, как правило, в их кишечном просвете за пределами глотки бактерии не обнаруживаются.Но некоторые патогенные бактерии, такие как Salmonella Typhimurium [16], E. faecalis [32] и Vibrio cholerae (H. Cinar, неопубликованные данные), колонизируют кишечник C. elegans . Обнаружено, что черви с ослабленным иммунитетом восприимчивы к бактериальной колонизации и размножению, что приводит к более быстрому уничтожению червей [34–36]. Мы обнаружили, что скорость бактериальной колонизации и пролиферации значительно выше (P <0,0001) для DT104 дикого типа по сравнению с SNS12, мутантом ΔMDR, через 24-72 часа (рисунки 2 и 3), что указывает на то, что локус MDR имеет значительная прямая роль в S .Typhimurium-опосредованный патогенез у C. elegans , и эта роль наиболее вероятна в пролиферации кишечника.
Без дальнейших генетических исследований о точной роли локуса MDR в вирулентности изолятов DT104 можно только догадываться. Можно предложить несколько возможных объяснений, большинство из которых связано с присутствием определенного гена, кодирующего белок, в области MDR. Например, ген floR , который обеспечивает перекрестную устойчивость к хлорамфениколу и флорфениколу, кодирует мембранный белок эффлюксной помпы, который может обладать другими транспортными функциями [37].Существует также небольшое количество генных продуктов, а именно ORF1, 2, 5, 6, а также фрагмент гена groEL , кодируемый в области MDR, функции которых в настоящее время неизвестны. Гомология последовательностей указывает на возможность участия в регуляции ORF1 [38]. Вполне вероятно, что этот ген может быть компонентом регуляторной сети, которая контролирует экспрессию цитопатической коллагеназы, clg , которая кодирует SlyA, и, возможно, другие, еще не идентифицированные факторы [39,40].
Что касается ответа хозяина, мы обнаружили постоянно различающуюся тенденцию в уровне экспрессии нескольких генов, которые играют роль в врожденном иммунном ответе при воздействии DT104 и SNS12.Система передачи сигналов Unfolded Protein Response (UPR) представляет собой защитный механизм, который индуцируется в ответ на перегрузку развернутых белков в эндоплазматическом ретикулуме; он восстанавливает нормальное состояние клетки, останавливая трансляцию белка и увеличивая уровни молекулярных шаперонов, участвующих в сворачивании белка. Было обнаружено, что неканонический путь передачи сигналов UPR, путь, связанный с прионоподобным (QN-богатым) геном, несущим домен (PQN), отвечает за врожденный иммунитет у C. elegans и регулируется в ced-1. -зависимым образом [24].Кроме того, сообщается, что гены pqn / abu сверхэкспрессируются при воздействии S. enterica и необходимы для защиты C. elegans от гибели, опосредованной S. enterica [24] . В этом исследовании, используя анализ летальности C. elegans , мы показали, что мутанты ced-1 были более восприимчивы к инфекции DT104 по сравнению с червями дикого типа, что предполагает роль ced-1 против MDR. -опосредованная вирулентность (Рисунок 4 и Рисунок S5).Кроме того, мы обнаружили, что относительная экспрессия генов abu-1, abu-11 и pqn-54 значительно выше на уровне транскрипции при воздействии S дикого типа. Typhimurium DT104 через один час ( abu-11 ) или 24 часа ( pqn-54 и abu-1 ). Напротив, черви, подвергшиеся воздействию SNS12, показали более высокую экспрессию всех трех генов через 48 часов (рис. 5). Отсроченная экспрессия этих генов у червей после воздействия мутантного штамма SNS12 предполагает, что гены MDR в Salmonella оказывают значительное влияние на ранний иммунный ответ.Альтернативным объяснением является экспрессия и, возможно, секреция неидентифицированного фактора устойчивым к антибиотикам DT104, который может иметь общий эффект репрессии этих генов-хозяев у C. elegans . В целом, наши результаты предполагают, что ген ced-1 и путь развёрнутого белка PQN участвуют в иммунном ответе против воздействия Salmonella Typhimurium DT104 дикого типа у C. elegans , особенно на ранних стадиях инфекции.
Антимикробные пептиды хозяина (AMP) играют важную роль в борьбе с патогенезом. Сообщается об индукции нескольких антимикробных пептидов в кишечных эпителиальных клетках Панета [41–43] и в слизистой оболочке кишечника [44] после бактериальных инфекций, включая Salmonella Typhimurium. Микроорганизмам необходимо преодолеть АМФ-опосредованную защиту, чтобы установить стойкую инфекцию. Бактериальная колонизация в кишечнике напрямую коррелирует с экспрессией антимикробных пептидов C. elegans , таких как abf-2 и spp-1 [13].Мы обнаружили, что abf-2 высоко экспрессируется у червей N2 против воздействия как DT104 дикого типа, так и мутанта ΔMDR SNS12, хотя более высокий уровень транскрипта наблюдался раньше у DT104 (один час) по сравнению с SNS12 (48 часов) (Рисунок 5c). . Данные предполагают, что ген AMP, abf-2 , но не spp-1 , экспрессируется на более высоких уровнях у C. elegans при воздействии DT104, несущего область множественной лекарственной устойчивости (MDR).
В целом, наши результаты показывают, что гены множественной лекарственной устойчивости (MDR) Salmonella enterica Typhimurium DT104 непосредственно способствуют вирулентности этого организма у C.elegans . В частности, устойчивый к антибиотикам DT104, несущий локус MDR, продемонстрировал повышенное уничтожение C. elegans , а также гораздо более высокий уровень бактериальной колонизации и пролиферации в просвете кишечника червей. Мы также обнаружили, что иммунный ответ против этого генотипа Salmonella действует через путь ced-1 в C. elegans . Кроме того, мы наблюдали, что несколько генов, несущих прионоподобный (богатый QN) домен и антимикробный пептид (AMP), у C.elegans обнаруживают немедленный или ранний более высокий транскрипционный ответ на DT104 дикого типа по сравнению с его изогенным мутантом ΔMDR, что дополнительно подтверждает роль области MDR в вирулентности в DT104.
Вспомогательная информация
Рисунок S3.
Salmonella Typhimurium DT104 убивает C. elegans значительно быстрее, когда присутствуют гены MDR.
L1 стадия гермафродита SS104 подвергались воздействию дикого типа Salmonella Typhimurium DT104 (- ● -) и SNS12, изогенного мутанта ΔMDR DT104 (- ■ -).Р <0,0001.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076673.s003
(TIF)
Рисунок S4.
Salmonella Typhimurium DT104 в кишечнике C. elegans усиливается за счет генов МЛУ.
L4 черви стадии SS104 подвергались воздействию DT104 (- ● -) и SNS12 (- ■ -), и степень колонизации определялась каждые 24 часа. Каждая точка данных представляет собой колониеобразующую единицу на одного червя (червь -1 КОЕ) из пула из 10 инфицированных червей.Горизонтальная черта указывает совокупное среднее геометрическое из трех независимых экспериментов.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076673.s004
(TIF)
Рисунок S5.
Ced-1 мутант Черви C. elegans более чувствительны к уничтожению с помощью DT104.
Ced-1 мутантные черви с потерей функции [ ced-1 ( e1754 )] умирают значительно быстрее (P = 0,0001), чем черви дикого типа (N2), при воздействии Salmonella Typhimurium DT104 .На стадии L4 черви дикого типа N2 (- ● -) и ced-1 ( e1754 ) (- ■ -) подвергались воздействию DT104 и ежедневно анализировались на выживаемость.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076673.s005
(TIF)
Благодарности
Мы благодарны доктору Кэтрин Ли из Гарвардской медицинской школы за предоставленную плазмиду pMAK 705 и Томасу Блэку, CFSAN, FDA за техническую помощь.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: SNS YA SWJ HNC.Проведены эксперименты: СНС Я ЗЦ СК. Проанализированы данные: SNS YA SWJ HNC CG. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SNS YA SWJ HNC CG. Написал рукопись: SNS YA HNC CG SWJ.
Ссылки
- 1.
Слуцкер Л., Альтекруз С.Ф., Свердлов Д.Л. (1998) Болезни пищевого происхождения. Новые патогены и тенденции. Infect Dis Clin North Am 12: 199-216. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0891-5520 (05) 70418-9. PubMed: 94. - 2.
Gomez TM, Motarjemi Y, Miyagawa S, Käferstein FK, Stöhr K (1997) Сальмонеллез пищевого происхождения.Всемирная статистика здравоохранения, вопрос 50: 81-89. PubMed: 90.- 3.
Briggs CE, Fratamico PM (1999) Молекулярная характеристика кластера генов устойчивости к антибиотикам Salmonella typhimurium DT104. Антимикробные агенты Chemother 43: 846-849. DOI: https: //doi.org/10.1093/jac/43.6.846. PubMed: 10103189.- 4.
Threlfall EJ (2000) Epidemic salmonella typhimurium DT 104 — действительно международный мультирезистентный клон. J Antimicrob Chemother 46: 7-10. DOI: https: //doi.org/10.1093/jac/46.1.7. PubMed: 10882682.- 5.
Boyd DA, Peters GA, Ng L, Mulvey MR (2000) Частичная характеристика геномного острова, связанного с областью множественной лекарственной устойчивости Salmonella enterica Typhymurium DT104. FEMS Microbiol Lett 189: 285-291. DOI: https: //doi.org/10.1111/j.1574-6968.2000.tb09245.x. PubMed: 103.- 6.
Бойд Д., Петерс Г.А., Клокерт А., Бумедин К.С., Часлус-Данкла Э. и др. (2001) Полная нуклеотидная последовательность геномного островка длиной 43 килобазы, связанного с областью множественной лекарственной устойчивости серовара Typhimurium DT104 Salmonella enterica и ее идентификация в фаге типа DT120 и сероваре Agona.J Bacteriol 183: 5725-5732. DOI: https: //doi.org/10.1128/JB.183.19.5725-5732.2001. PubMed: 11544236.- 7.
Дэвис А., О’Нил П., Тауэрс Л., Кук М. (1996) Вспышка пищевого отравления Salmonella typhimurium DT104, связанная с употреблением в пищу говядины. Commun Dis Rep CDR Rev 6: R159-R162. PubMed: 82.
- 8.
Вильяр Р.Г., Мацек, доктор медицины, Саймонс С., Хейс П.С., Голдофт М.Дж. и др. (1999) Исследование инфекций, вызываемых Salmonella serotype typhimurium DT104 с множественной лекарственной устойчивостью, связанных с сыром из сырого молока в штате Вашингтон.JAMA 281: 1811-1816. DOI: https: //doi.org/10.1001/jama.281.19.1811. PubMed: 10340368.- 9.
Аллен К.А., Федорка-Крей П.Дж., Васкес-Торрес А., Суйемото М., Альтье С. и др. (2001) Оценка вирулентности Salmonella enterica серовара Typhimurium DT104 in vitro и in vivo. Infect Immun 69: 4673-4677. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.69.7.4673-4677.2001. PubMed: 11402014.- 10.
Карлсон С.А., Браунинг М., Феррис К.Э., Джонс Б.Д. (2000) Идентификация сниженной инвазивности тканевых культур среди множества устойчивых к антибиотикам Salmonella typhimurium DT104.Microb Pathog 28: 37-44. DOI: https: //doi.org/10.1006/mpat.1999.0322. PubMed: 10623562.- 11.
Carlson SA, Willson RM, Crane AJ, Ferris KE (2000) Оценка генотипов, вызывающих инвазию, и индуцированных антибиотиками гиперинвазивных фенотипов у Salmonella typhimurium DT104 с множественной устойчивостью к антибиотикам. Microb Pathog 28: 373-378. DOI: https: //doi.org/10.1006/mpat.2000.0355. PubMed: 10839974.- 12.
Randall LP, Woodward MJ (2001) Роль локуса mar в вирулентности Salmonella enterica серовара Typhimurium DT104 у кур.J Med Microbiol 50: 770-779. PubMed: 11549178.- 13.
Alegado RA, Tan MW (2008) Устойчивость к антимикробным пептидам способствует сохранению Salmonella typhimurium в кишечнике C. elegans. Cell Microbiol 10: 1259-1273. DOI: https: //doi.org/10.1111/j.1462-5822.2008.01124.x. PubMed: 18221392.- 14.
Aballay A, Ausubel FM (2002) Caenorhabditis elegans как хозяин для изучения взаимодействий хозяин-патоген. Curr Opin Microbiol 5: 97-101. doi: https: // doi.org / 10.1016 / S1369-5274 (02) 00293-X. PubMed: 11834377.- 15.
Курц CL, Ewbank JJ (2007) Инфекция в чашке: высокопроизводительный анализ бактериального патогенеза. Curr Opin Microbiol 10: 10-16. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.mib.2006.12.001. PubMed: 17178462.- 16.
Aballay A, Yorgey P, Ausubel FM (2000) Salmonella typhimurium размножается и вызывает стойкую инфекцию в кишечнике Caenorhabditis elegans. Curr Biol 10: 1539-1542. PubMed: 11114525.- 17.
Aballay A, Drenkard E, Hilbun LR, Ausubel FM (2003) Врожденный иммунный ответ Caenorhabditis elegans, запускаемый Salmonella enterica, требует интактного LPS и опосредуется сигнальным путем MAPK. Curr Biol 13: 47-52. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0960-9822 (02) 01424-0. PubMed: 12526744.- 18.
Labrousse A, Chauvet S, Couillault C, Kurz CL, Ewbank JJ (2000) Caenorhabditis elegans является модельным хозяином для Salmonella typhimurium. Curr Biol 10: 1543-1545.PubMed: 11114526.- 19.
Méresse S, Steele-Mortimer O, Finlay BB, Gorvel JP (1999) GTPase rab7 контролирует созревание вакуолей, содержащих Salmonella typhimurium, в клетках HeLa. EMBO J 18: 4394-4403. DOI: https: //doi.org/10.1093/emboj/18.16.4394. PubMed: 10449405.- 20.
Бейли А.М., Ивенс А., Кингсли Р., Коттелл Дж. Л., Уэйн Дж. И др. (2010) RamA, член семейства AraC / XylS, влияет как на вирулентность, так и на отток серовара Typhimurium Salmonella enterica.J Bacteriol 192: 1607-1616. DOI: https: //doi.org/10.1128/JB.01517-09. PubMed: 20081028.- 21.
Sprando RL, Olejnik N, Cinar HN, Ferguson M (2009) Метод ранжирования водорастворимых соединений в соответствии с их токсичностью с использованием Caenorhabditis elegans, комплексного параметрического анализатора и сортировщика объектов и аксенических жидких сред. Food Chem Toxicol 47: 722-728. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fct.2009.01.007. PubMed: 123.- 22.
Hamilton CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989) Новый метод создания делеций и замен генов в Escherichia coli.J Bacteriol 171: 4617-4622. PubMed: 2548993.- 23.
Шмитген Т.Д., Ливак К.Дж. (2008) Анализ данных ПЦР в реальном времени с помощью сравнительного метода C (T). Nat Protoc 3: 1101-1108. DOI: https: //doi.org/10.1038/nprot.2008.73. PubMed: 18546601.- 24.
Haskins KA, Russell JF, Gaddis N, Dressman HK, Aballay A (2008) Гены ответа развернутого белка, регулируемые CED-1, необходимы для врожденного иммунитета Caenorhabditis elegans. Dev Cell 15: 87-97. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.devcel.2008.05.006. PubMed: 18606143.- 25.
Zhou Z, Hartwieg E, Horvitz HR (2001) CED-1 представляет собой трансмембранный рецептор, который опосредует поглощение трупа клетки у C. elegans. Ячейка 104: 43-56. DOI: https: //doi.org/10.1016/S0092-8674 (01) 00190-8. PubMed: 11163239.- 26.
Урано Ф., Калфон М., Йонеда Т., Юн С., Кирали М. и др. (2002) Путь выживания Caenorhabditis elegans с блокированным ответом на развернутый белок. J Cell Biol 158: 639-646. doi: https: //doi.org/10.1083 / jcb.200203086. PubMed: 12186849.- 27.
Alegado RA, Campbell MC, Chen WC, Slutz SS, Tan MW (2003) Характеристика медиаторов микробной вирулентности и врожденного иммунитета с использованием модели патоген-хозяин Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol 5: 435-444. DOI: https: //doi.org/10.1046/j.1462-5822.2003.00287.x. PubMed: 12814434.- 28.
Като Ю., Айзава Т., Хосино Х., Кавано К., Нитта К. и др. (2002) abf-1 и abf-2, гены антимикробных пептидов ASABF-типа у Caenorhabditis elegans.Biochem J 361: 221-230. DOI: https: //doi.org/10.1042/0264-6021: 3610221. PubMed: 11772394.- 29.
Курц С.Л., Тан М.В. (2004) Регулирование старения и врожденного иммунитета у C. elegans. Ячейка старения 3: 185-193. DOI: https: //doi.org/10.1111/j.1474-9728.2004.00108.x. PubMed: 15268752.- 30.
Alper S, McBride SJ, Lackford B, Freedman JH, Schwartz DA (2007) Специфичность и сложность врожденного иммунного ответа Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol 27: 5544-5553. doi: https: // doi.org / 10.1128 / MCB.02070-06. PubMed: 17526726.- 31.
Evans EA, Kawli T, Tan MW (2008) Pseudomonas aeruginosa подавляет иммунитет хозяина, активируя инсулиноподобный сигнальный путь DAF-2 у Caenorhabditis elegans. PLOS Pathog 4: e1000175. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.ppat.1000175. PubMed: 180.- 32.
Гарсин Д.А., Сифри С.Д., Милонакис Э., Цинь X, Сингх К.В. и др. (2001) Простая модель-хозяин для определения грамположительных факторов вирулентности. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 10892-10897.DOI: https: //doi.org/10.1073/pnas.1698. PubMed: 11535834.- 33.
Эйвери Л., Штонда Б. Б. (2003) Пищевой транспорт в глотке C. elegans. J Exp Biol 206: 2441-2457. DOI: https: //doi.org/10.1242/jeb.00433. PubMed: 127. 003 9226 9226 9226003003003 19- 34.
Kerry S, TeKippe M, Gaddis NC, Aballay A (2006) Фактор транскрипции GATA, необходимый для иммунитета к бактериальным и грибковым патогенам. PLOS ONE 1: e77. DOI: https: //doi.org/10.1371/journal.pone.0000077. PubMed: 17183709.- 35.Singh V, Aballay A (2006) Путь фактора транскрипции теплового шока (HSF) -1, необходимого для иммунитета к Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 13092-13097. DOI: https: //doi.org/10.1073/pnas.0604050103. PubMed: 163.
- 36.
Tenor JL, Aballay A (2008) Консервативный Toll-подобный рецептор необходим для врожденного иммунитета Caenorhabditis elegans. EMBO Rep 9: 103-109. DOI: https: //doi.org/10.1038/sj.embor.7401104. PubMed: 17975555.- 37.
Arcangioli MA, Leroy Sétrin S, Martel JL, Chaslus-Dancla E (1999) Новый ген устойчивости к хлорамфениколу и флорфениколу, фланкированный двумя интегронными структурами в Salmonella typhimurium DT104.Письма о микробиологии FEMS 174: 327-332. DOI: https: //doi.org/10.1111/j.1574-6968.1999.tb13586.x.- 38.
Mulvey MR, Boyd DA, Olson AB, Doublet B, Cloeckaert A (2006) Генетика геномного острова сальмонелл 1. Microbes Infect 8: 1915-1922. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.micinf.2005.12.028. PubMed: 16713724.- 39.
Wu MT, Carlson SA, Meyerholz DK (2002) Цитопатические эффекты, наблюдаемые при экспрессии репрессированного гена коллагеназы, присутствующего в Salmonella и родственных патогенах: мимикрия цитотоксина из нескольких устойчивых к антибиотикам Salmonella enterica серотипа Typhimurium phagetype DT104.Microb Pathog 33: 279-287. DOI: https://doi.org/10.1006/mpat.2002.0535. PubMed: 124.- 40.
Carlson SA, McCuddin ZP, Wu MT (2005) SlyA регулирует опосредованный коллагеназой цитопатический фенотип у мультирезистентных сальмонелл. Microb Pathog 38: 181-187. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.micpath.2005.01.004. PubMed: 15797813.- 41.
Ayabe T, Satchell DP, Pesendorfer P, Tanabe H, Wilson CL et al. (2002) Активация альфа-дефенсинов клеток Панета в тонком кишечнике мышей.J Biol Chem 277: 5219-5228. DOI: https: //doi.org/10.1074/jbc.M1000. PubMed: 11733520.- 42.
Ayabe T, Wulff H, Darmoul D, Cahalan MD, Chandy KG et al. (2002) Модуляция секреции альфа-дефенсина клеток Панета с помощью mIKCa1, Ca2 + -активированного калиевого канала с промежуточной проводимостью. J Biol Chem 277: 3793-3800. DOI: https: //doi.org/10.1074/jbc.M107507200. PubMed: 11724775.- 43.
Ayabe T, Ashida T, Kohgo Y, Kono T (2004) Роль клеток Панета и их антимикробных пептидов во врожденной защите хозяина.Trends Microbiol 12: 394-398. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.tim.2004.06.007. PubMed: 15276616.- 44.
Salzman NH, Ghosh D, Huttner KM, Paterson Y, Bevins CL (2003) Защита от кишечного сальмонеллеза у трансгенных мышей, экспрессирующих дефенсин кишечника человека. Nature 422: 522-526. DOI: https: //doi.org/10.1038/nature01520. PubMed: 12660734.границ | Моделирование органоидов и энтероидов сальмонеллезной инфекции
Общее введение
Salmonella
Salmonella — грамотрицательные палочковидные и факультативные анаэробы принадлежат к семейству Enterobacteriaceae (Coburn et al., 2007). Согласно недавней классификации Международного кодекса номенклатуры бактерий, род Salmonella подразделяется на два разных вида, включая Salmonella enterica и Salmonella bongori , на основании их родства последовательностей 16S рРНК (Popoff et al., 2003). . Salmonella bongori (V) рассматривается как отдельный вид из-за его уникальных клинических характеристик (Fierer and Guiney, 2001). Salmonella enterica подразделяется на шесть подвидов: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) и indica. (VI), в основном на основании их геномной последовательности и биохимических свойств (Fierer and Guiney, 2001).Разнообразные биохимические свойства жгутиков, углеводов и липополисахаридов (ЛПС) S. enterica разделили их на более чем 2000 сероваров (Eng et al., 2015). Более 50% этих сероваров относятся к S. enterica подвида enterica, который ответственен за большинство инфекций у человека (Itri et al., 2017). Salmonella также классифицируется на основе их соматических (O), капсульных (K) и жгутиковых (H) антигенных детерминант (Brenner et al., 2000). Обычно используемая в клинических лабораториях классификация Salmonella основана на простых реакциях агглютинации на антитела или антисыворотки, специфичные к соматическим антигенам O, содержащим шесть серогрупп, обозначенных A, B, C1, C2, D и E (Eng et al., 2015).
Инфекции, вызванные Salmonella , остаются серьезным бременем для общественного здравоохранения во всем мире (Eng et al., 2015). Существует три основных типа сальмонеллеза: (1) локализованная кишечная инфекция (гастроэнтерит), (2) системная инфекция здоровых хозяев (брюшной тиф) и (3) системная инфекция хозяев с ослабленным иммунитетом (Griffin and McSorley, 2011; Hurley). и др., 2014). Штаммы Salmonella , вызывающие эти инфекции, разделяются на тифозные Salmonella и нетифоидные Salmonella (NTS) на основе клинических паттернов сальмонеллеза человека (Crump et al., 2015; Eng et al., 2015). Инфекция, вызванная брюшным тифом Salmonella , кажется более серьезной, при которой у пациентов проявляются продромальные симптомы, такие как головная боль, боль в животе и диарея (или запор), с последующим повышением температуры, что может выдержать инкубационный период в течение 1 недели или более (англ. и др., 2015). Штаммы тифа Salmonella обычно предназначены только для людей, вызывающих брюшной тиф (также называемый кишечной лихорадкой), в то время как штаммы NTS имеют более широкий диапазон хозяев и представляют зоонозные признаки (Gordon, 2011).Инфекция, вызванная брюшным тифом Salmonella , чаще всего встречается в развивающихся странах, включая многие регионы африканского и азиатского континентов. Заболевание вызывает 93,8 миллиона случаев заражения через пищу и 155 000 смертей ежегодно (Eng et al., 2015). Для сравнения, гастроэнтерит вызывается в основном S. enterica, Serovar Typhimurium ( Salmonella, Typhimurium) и Serovar Enteritidis, которые распространены даже в развитых странах (Eng et al., 2015). Клиническими признаками гастроэнтерита могут быть диарея, спазмы, и большинство пациентов обычно выздоравливают в течение 4-7 дней без лечения (Griffin and McSorley, 2011).Сальмонеллез передается в основном через пищу или воду, загрязненные фекалиями человека или животных (Crump et al., 2015). Сообщалось, что NTS передаются через зараженных животных и продукты животного происхождения (Crump et al., 2015). Смертность от тифа штаммами Salmonella может достигать 7% даже при использовании антибиотиков (Eng et al., 2015). Заболеваемость кишечной лихорадкой в США и странах Европы обычно низкая и составляет менее 10 на 100 000 ежегодно (Eng et al., 2015). Напротив, инвазивные инфекции, вызванные NTS, оцениваются в 3.4 миллиона человек, при этом в 2010 году во всем мире умерло 681 000 человек (Crump et al., 2015). До 57% этих болезней и смертей приходится на Африку (Crump et al., 2015). Большинство инфекций NTS происходит у животных, но также может наблюдаться у младенцев, маленьких детей, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом (Eng et al., 2015). Фактические случаи заражения Salmonella , по оценкам, намного выше, чем зарегистрированные числа, потому что более легкие случаи, вероятно, не диагностируются и не регистрируются, особенно в некоторых развивающихся странах (Hurley et al., 2014).
Было разработано множество тестов для диагностики инфекций, вызываемых Salmonella . Тест Видаля — это наиболее часто используемый диагностический тест, основанный на агглютинирующих антителах против Salmonella LPS (O) и жгутиков (H). Иммуноферментные анализы (ELISA) и электрофорез с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) иммуноблоттинга полезны для измерения антител в сыворотке пациентов. В последнее время для анализа бактериальных генов и белков использовались ПЦР, ПЦР в реальном времени и протеомные подходы (Kumar et al., 2012; Нигро и др., 2016). После диагностирования инфекции антибиотики можно использовать для лечения инфицированных пациентов с тяжелым гастроэнтеритом, в то время как для большинства более легких инфекций лечение антибиотиками не требуется (Boyle et al., 2007; Hurley et al., 2014). Две вакцины против брюшного тифа были лицензированы против кишечной лихорадки, обе подходят только для эндемической ситуации (Griffin and McSorley, 2011; Crump et al., 2015; Eng et al., 2015). Вакцины против инфекций NTS были разработаны недавно (Griffin and McSorley, 2011; Eng et al., 2015). В настоящее время безопасность пищевых продуктов от фермы к вилке и очистка муниципальной воды остаются наиболее эффективными мерами по борьбе с передачей Salmonella (Crump et al., 2015).
Детерминанты вирулентности, необходимые для S . Typhimurium похожи на таковые многих других кишечных патогенов: во-первых, ему необходимо успешно выжить во враждебной кислой среде желудка, прежде чем он сможет колонизировать тонкий кишечник. В кишечнике бактерии должны преодолевать барьер эпителиальных клеток кишечника и выживать внутри клеток-хозяев.Патогенный Salmonella spp. развивают сложные системы, которые позволяют организмам реагировать и выживать в желудке с низким pH (Foster, 1995) и достигать М-клеток и энтероцитов в тонком кишечнике (Takeuchi, 1967; Moulder, 1985; Lindquist et al., 1987; Nietfeld et al., 1992; Clark et al., 1994, 1996; Jones et al., 1994; Sansonetti and Phalipon, 1999). Salmonella Typhimurium обладает способностью проникать в нефагоцитарные эукариотические клетки и существовать как внутриклеточные паразиты внутри замкнутых вакуолей (Takeuchi, 1967; Moulder, 1985).Внутриклеточная среда предоставляет бактериям уникальную нишу для размножения и уклонения от иммунных ответов хозяина. Кроме того, S . Typhimurium способен выживать и размножаться внутри макрофагов (Buchmeier and Heffron, 1989).
Несколько исследований привели к идентификации генов, необходимых для патогенеза Salmonella , в частности, для инвазии Salmonella в нефагоцитарные клетки (Galán and Curtiss, 1989; Ochman et al., 1996; Shea et al., 1996; Блан-Потар и Гройсман, 1997; Вонг и др., 1998; Wood et al., 1998). Многие из этих генов и оперонов вирулентности расположены в крупных генетических элементах хромосомы Salmonella . Поскольку эти крупные элементы отсутствуют в хромосоме близкородственной Escherichia coli , их называют островами патогенности. Плазмиды вирулентности также способствуют выживанию Salmonella в макрофагах и вирулентности (Gulig, 1990; Guiney et al., 1994; Wallis et al., 1995). По крайней мере пять островов патогенности были идентифицированы у Salmonella (Galán and Curtiss, 1989; Ochman et al., 1996; Shea et al., 1996; Blanc-Potard and Groisman, 1997; Wong et al., 1998; Wood et al., 1998; Wood et al., 1996; Shea et al., 1996; Blanc-Potard and Groisman, 1997; Wong et al., 1998; Wood et al. al., 1998), которые способствуют вирулентности на определенных этапах инфекционного процесса. Salmonella Остров патогенности I (SPI1) является наиболее изученным. Он расположен на сантисоме 63 хромосомы Salmonella и имеет длину 43 т.п.н. SPI1 необходим для проникновения Salmonella в М-клетки (Clark et al., 1996) и эпителиальные клетки (Galán, Curtiss, 1989) кишечника. Это согласуется с тем фактом, что мутанты SPI1 обладают дефектной вирулентностью при пероральном введении, но не при систематическом введении (Galán and Curtiss, 1989). Мутанты, которые не способны проникать в эпителиальные клетки, оказались авирулентными в исследованиях с использованием модели брюшного тифа у мышей (Galán and Curtiss, 1989) и у телят (Watson et al., 1998; Tsolis et al., 1999, 2000). SPI2, SPI3 и SPI4 расположены на 31, 82 и 92 сантисоме хромосомы Salmonella соответственно.Гены этих трех островов необходимы для выживания и роста Salmonella в организме хозяина (Hensel et al., 1997, 1998; Shea et al., 1999; Vazquez-Torres et al., 2000). Первоначально было обнаружено, что SPI5 участвует в воспалении и секреции жидкости в кишечнике (Norris et al., 1998; Wood et al., 1998). Мы показали, что по крайней мере один ген на этом острове ( sopB ) также участвует в процессе инвазии Salmonella (Galan and Zhou, 2000).
SPI1 и SPI2 кодируют специализированные системы секреции и транслокации белков, называемые системой секреции типа III.Гены в SPI1 можно разделить на три группы: (1) одна включает гены, которые кодируют фактический аппарат секреции / транслокации; (2) вторая группа кодирует белки, которые секретируются и / или транслоцируются в клетки-хозяева; (3) третья группа участвует в регуляции генов. Аппарат секреции SPI1 был показан с помощью электронной микроскопии (Kubori et al., 1998), который, по-видимому, представляет собой «игольчатый комплекс», который подобен системе жгутиков бактерий как биохимически, так и структурно. Очищенные игольчатые комплексы состоят по крайней мере из трех белков, кодируемых SPI1 (PrgK, PrgH и InvG).Было показано, что мутации в prgK, prgH или invG отменяют секрецию панели S . Белки Typhimurium (SipA, SipB, SipC и др.). Транслокация этих бактериальных белков в эукариотические клетки-хозяева необходима для инвазии Salmonella в нефагоцитарные эпителиальные клетки. Сообщалось, что секреция требует контакта клетки-хозяина (Zierler and Galán, 1995). Однако эти белки секретируются в определенных лабораторных условиях в количествах, достаточных для облегчения их исследований в отсутствие клеток-хозяев.Эти секретируемые белки можно визуализировать с помощью SDS-PAGE из супернатантов S . Культуры Typhimurium в таких индуцирующих условиях. По крайней мере девять секретируемых белков были идентифицированы с использованием этого подхода, включая: AvrA, SipA, SipB, SipC, SipD, SopE, SopE2, SopB и SptP. Считается, что во время процесса инфекции эти белки перемещаются внутрь клетки-хозяина, где они взаимодействуют с компонентами клетки-хозяина, способствуя захвату бактериями (Galán, 1998, 1999).
Успешная инфекция Salmonella требует, чтобы бактерии получили преимущество в росте над кишечной микрофлорой, вызывая воспаление кишечника.Хотя по-прежнему сложно понять, как Salmonella достигает этого в кишечнике, несколько недавних исследований пролили свет на молекулярные механизмы, которые использует Salmonella . Сообщалось, что длинная цепь О-антигена в Salmonella дает преимущество роста в модели колита у мышей (Crawford et al., 2012). Было высказано предположение, что колит, индуцированный Salmonella , увеличивает концентрацию общих желчных кислот в просвете, а резистентность желчных кислот, опосредованная fepE (сборка О-антигена), отвечает за улучшение физической формы во время роста просвета воспаленного кишечника (Crawford et al. al., 2012). Кроме того, в поисках дополнительных сигналов, генерируемых во время воспаления, вызванного Salmonella , были идентифицированы метил-акцептирующие белки хемотаксиса (MCP), включая Trg, Tsr и Aer, для повышения приспособленности Salmonella в модели колита у мышей (Rivera -Chávez et al., 2013). Таким образом, становится очевидным, что Salmonella используют свои факторы вирулентности для индукции воспаления и выработки питательных веществ, происходящих от воспаления, чтобы вытеснить конкурирующие микробы в воспаленном кишечнике (Rivera-Chávez and Báumler, 2015).Кроме того, Salmonella способны использовать полученные из воспаления нитраты для анаэробного дыхания и конкуренции с комменсальными микробами в кишечнике с помощью трех нитратредуктаз, кодируемых генами narGHI, narZYV и napABC (Lopez et al. , 2015). Недавнее исследование также продемонстрировало, что нарушение комменсальной Clostridia увеличивает восприимчивость к инфекции Salmonella на мышиной модели (Rivera-Chávez et al., 2016).Это во многом связано с пониженным уровнем бутирата, продуцируемого производящими бутират Clostridia, что привело к усилению оксигенации в кишечнике, способствуя аэробному распространению Salmonella (Rivera-Chávez et al., 2016).
Современные модели для изучения
Salmonella
Многие экспериментальные модели были разработаны для изучения инфекций Salmonella , включая различные модели in vitro, ex vivo и in vivo (таблица 1). Чаще всего используются двумерные (2-D) модели иммортализованных клеточных линий, включая клетки кавказской аденокарциномы толстой кишки (Caco2) (Martinez-Argudo and Jepson, 2008), незрелые нормальные человеческие эпителиальные клетки кишечника плода (h5) ( Newburg et al., 2016), зрелые метастатические эпителиальные клетки толстой кишки человека (T84) (Newburg et al., 2016), нормальные эпителиальные клетки слизистой оболочки толстой кишки человека (NCM-460) (Newburg et al., 2016), клетки Microfold (или M клетки) (Martinez-Argudo and Jepson, 2008), мышиные макрофагальные клетки RAW 264.7 (Tang et al., 2012), клетки рака шейки матки (HeLa) (Fang et al., 2017) и модели кишечной ферментации (Le Blay et al., 2009). Кроме того, трехмерные (3-D) органотипические модели, полученные из линии клеток Int-407 (позже выяснилось, что это производное HeLa) и клеток колоректальной аденокарциномы человека (HT-29) (Nickerson et al., 2001; Höner Zu Bentrup et al., 2006). Известно, что сальмонеллез у людей, обезьян и телят поражает в первую очередь дистальный отдел подвздошной кишки и проксимальный отдел толстой кишки (Kinsey et al., 1976; Giannella et al., 1977; Wray and Sojka, 1978; McGovern and Slavutin, 1979; Samuel et al., ., 1980). Эти модели в значительной степени помогли генетическому, клеточно-биологическому и биохимическому анализу инфекционного процесса.
Таблица 1 . Модели заражения сальмонеллой.
Линии клеточных культур In vitro относительно просты в обслуживании и обеспечивают более устойчивую экологическую нишу для оценки выживаемости и репликации бактерий, чем у большинства животных-хозяев (Finlay and Brumell, 2000).Генетические манипуляции с этими клеточными линиями в значительной степени помогли исследованию того, как Salmonella взаимодействует с эпителиальными и макрофагальными клетками хозяина (Finlay and Brumell, 2000; Zhou, 2001, 2006; Zhou and Galán, 2001). Однако иммортализованным клеточным линиям не хватает сложности типов клеток и надежных иммунных компонентов, поэтому они не могут точно имитировать естественный процесс инфицирования (Finlay and Brumell, 2000). Например, процесс апоптоза в иммортализованных клетках регулируется иначе, чем в здоровых тканях (Finlay and Brumell, 2000).Кроме того, многие клетки млекопитающих не могут устойчиво сохранять свои первоначальные характеристики в течение длительного процесса культивирования (Finlay and Brumell, 2000). Например, могут возникать производные клетки (Foulke-Abel et al., 2014). Двумерные культуры иммортализованных клеток имеют только один тип клеток, что затрудняет имитацию сложной архитектуры слизистой оболочки in vivo (Yin et al., 2015).
Отсутствие подходящих моделей для тестирования воздействия противомикробных препаратов на энтеропатогены препятствует разработке новых противомикробных препаратов для борьбы с инфекциями Salmonella .Обычно используемые животные модели не могут воспроизводить микробиоту, обитающую в кишечнике человека, а большинство непрерывных моделей кишечной микробиоты человека имеют ограничения по микробному разнообразию, стабильности, плотности клеток и неспособны поддерживать долгосрочные исследования. Модель непрерывной ферментации кишечника in vitro была разработана, чтобы позволить бактериям расти в структурах биопленок, облегчая испытания новых противомикробных препаратов против инфекций Salmonella (Le Blay et al., 2009). В этой модели используется иммобилизованная детская фекальная микробиота и введение Salmonella в проксимальный отдел толстой кишки для получения высокой плотности бактерий в гелевых шариках и в стоках реактора. Условия роста позволяют защитить чувствительные бактерии от сдвига, кислородного стресса и ограничить вымывание и потерю менее конкурентоспособных бактерий. Ле Блей и др. успешно использовали эту модель для изучения эффектов двух антибиотиков на Salmonella и на динамическое изменение микробиоты.Их результат согласуется с данными in vivo , подтверждающими, что модель ферментации является многообещающей модельной платформой для разработки новых противомикробных препаратов против Salmonella .
Полностью дифференцированный, функциональный кишечный эпителий in vivo обладает уникальной организацией соединительного, внеклеточного матрикса и белков щеточной каймы, а также высоко локализованной продукцией муцина (Höner Zu Bentrup et al., 2006). Чтобы имитировать трехмерную архитектурную организацию кишечного эпителия, была разработана трехмерная органотипическая модель, которая лучше воспроизводит характеристики, связанные с кишечным эпителием in vivo (Nickerson et al., 2001; Höner Zu Bentrup et al., 2006). В этой органотипической модели используются монослойные культуры клеток Int-407 или HT-29 на основе биореактора RWV. В отличие от 2-D клеток, 3-D органотипическая модель имеет лучшую организацию соединительного, внеклеточного матрикса, белков щеточной каймы и высоколокализованную продукцию муцина (Höner Zu Bentrup et al., 2006). Однако трехмерная органотипическая модель не содержит ниш нормальных стволовых клеток, которые отвечают за обновление тканей кишечника. Чтобы обойти эти недостатки, ex vivo модели культур тканей, включая модель подвздошного эпителия теленка (Frost et al., 1997), человеческая кишечная in vitro модель органной культуры (IVOC) (Haque et al., 2004), модель ex vivo слизистой оболочки кишечника (Tsilingiri et al., 2012) и ex vivo незрелых Модель ткани кишечника человека (Newburg et al., 2016) была разработана, чтобы более точно имитировать окружение органа во время инфекции (Таблица 1). Несмотря на близкое сходство этих моделей ex vivo с клинической ситуацией в кишечнике, их короткое время жизни, трудоемкие настройки, широкая экспериментальная вариативность, ограниченная доступность клеток и ограниченное количество клеток препятствовали их потенциальному использованию в исследовании . Инфекции, вызванные сальмонеллой (Höner Zu Bentrup et al., 2006).
Животные модели часто используются для изучения механизмов вирулентности инфекций Salmonella (Santos et al., 2001). Животные обладают сложными типами клеток, архитектурными организациями и специализированными структурами органов. Что еще более важно, неповрежденная иммунная система животных имеет очевидные преимущества перед всеми другими моделями и поэтому считается наиболее близкой к клиническим условиям по сравнению с клеточными моделями in vitro или ex vivo моделями органов и тканей.C57BL / 6 (Barthel et al., 2003; Ren et al., 2009) и мыши BALB / c (Özkaya et al., 2012) чаще всего используются при заражении Salmonella . Модель лигированной подвздошной петли кролика используется в качестве модели in vivo для изучения инфекций Salmonella (Giannella et al., 1973). Эти нечеловеческие животные модели, включая приматов, лишь частично отражают процесс заболевания человека из-за присущих им отличий от людей (Hurley and McCormick, 2003; Firoz Mian et al., 2011).Чтобы обойти это ограничение, были разработаны «гуманизированные» мыши в качестве альтернативных платформ для изучения инфекционных заболеваний человека (Legrand et al., 2009). Этим мышам трансплантируют клетки или ткани человека, представляющие ограниченную среду человека, подходящую для инфекционных агентов. Например, гуманизированные мыши были получены путем трансплантации человеческих гемопоэтических стволовых клеток мышам с ослабленным иммунитетом. Этих мышей использовали для изучения S. enterica Serovar Typhi, заражение которым обычно ограничивается только людьми (Firoz Mian et al., 2011). Однако высокая стоимость гуманизированных мышей препятствует их широкому применению.
Первичные энтероиды и органоиды кишечника
Термин «энтероиды» относится к многодольчатым структурам с просветом, который развивается из кишечных стволовых клеток (циклических столбчатых клеток основания крипт и покоящихся стволовых клеток) около дна кишечных крипт (также называемых нишей кишечных стволовых клеток) или одиночных кишечных стволовых клеток. стволовые клетки путем образования почкующихся крипт (Stelzner et al., 2012). Они генерируют архитектуру in vivo и множественную дифференцировку исходного кишечного эпителия у млекопитающих (Dutta et al., 2017). Они были впервые получены из стволовых клеток кишечника мыши доктором. Клеверс и Сато в институте Hubrecht (Утрехт, Нидерланды) (Sato et al., 2009). Впоследствии та же группа успешно культивировала энтероиды человека (Sato et al., 2011). Рост этих кишечных стволовых клеток регулируется в основном Wnt, Notch, эпидермальными факторами роста (EGF) и сигнальными путями костных морфогенетических белков (BMP) in vivo (Sato and Clevers, 2013). Сигнальные пути Wnt и Notch играют важную роль в пролиферации стволовых клеток.Сигналы EGF оказывают сильное митогенное действие на стволовые клетки через их соответствующие рецепторы (EGFR). BMP оказывает угнетающее действие на стволовость. Noggin способствует формированию криптоподобных структур по бокам ворсинок (Sato and Clevers, 2013). Для образования энтероидов кишечные крипты, содержащие ниши стволовых клеток кишечника, отделяются от тканей кишечника обработкой ЭДТА. Эти крипты затем встраиваются в матригель с последующим добавлением коктейлей факторов, поддерживающих стволовость, таких как EGF, R-spondin-1, Noggin и Wnt3a.Крипты постепенно разовьются в трехмерные энтероиды, отображающие многие важные организации нормального кишечного эпителия (Рисунки 1A, B).
Рисунок 1 . Модель энтероида и ее потенциальное применение при изучении инфекций Salmonella . (A) Кишечные крипты можно выделить из хирургических срезов или биопсий с последующим культивированием в трехмерные энтероиды. (B) Энтероиды воспроизводят архитектуру здорового кишечника, содержащего домены ворсинок и крипт. (C) Энтероиды могут быть многообещающей экспериментальной моделью для изучения инфекций Salmonella для скрининга противомикробных препаратов, персонализированной медицины, механизмов вирулентности и взаимодействия бактерий с хозяином.
Энтероиды имеют много преимуществ по сравнению с традиционными моделями клеточных культур. Например, они могут постоянно расширяться и сохранять свою изначальную идентичность органов (Sato and Clevers, 2013). Кариотипирование обычно проводится для долгосрочных культур и демонстрирует генетическую стабильность энтероидов более чем через 15 поколений (Yin et al., 2014). Энтероиды также содержат слои просвета с доменами крипт и ворсинок, как в настоящем кишечнике (рис. 1В). Они содержат почти все типы кишечных эпителиальных клеток, включая кишечные стволовые клетки, клетки Панета, бокаловидные клетки, энтероэндокринные клетки и энтероциты (Sato and Clevers, 2013). Сообщалось, что определенные специфические типы кишечных клеток, такие как клетки пучка или М-клетки пейеровского пятна, могут быть дифференцированы от кишечных стволовых клеток в энтероидах путем добавления в среду rIL-4 / rIL-13 или Tnfsf11 (RankL), соответственно (de Lau и другие., 2012; Gerbe et al., 2016).
Индуцированные кишечные органоиды с просветом, напоминающим кишечник, также могут быть получены из плюрипотентных стволовых клеток (PSC) в определенных условиях культивирования (Stelzner et al., 2012; Dutta et al., 2017). Индуцированные кишечные органоиды из PSCs имеют кишечный эпителий и мезенхиму (Рисунок 3). Между тем индуцированные кишечные органоиды содержат большинство типов клеток, которые присутствуют в кишечнике человека (т.е. поляризованный монослой эпителиальных клеток с четкими апикальными и базальными сторонами, микроворсинки, клетки Панета, бокаловидные клетки, энтероэндокринные клетки и т. Д.) с доменом ворсинок и доменом крипты (Forbester et al., 2015). Для «созревания» индуцированных кишечных органоидов требуется несколько недель (Yin et al., 2015). Напротив, энтероидам, полученным из взрослых стволовых клеток (ASC), требуется всего несколько дней, чтобы вырасти в трехмерную структуру с замечательными доменами ворсинок и доменами крипт, напоминающими ткань кишечника in vivo (Yin et al., 2015). Кроме того, первичные энтероиды часто берут у людей с сопутствующими патологическими состояниями. Обычно «здоровые» ткани, прилегающие к пораженной ткани, могут нести патологические изменения и влиять на исход инфекций.
Считается, что трехмерная архитектура энтероидов имитирует структуру интактной ткани in vivo . Типичные трехмерные энтероиды развиваются как с апикальной, так и с базолатеральной стороны, расположенной правильно по направлению к просвету и снаружи энтероидов (рис. 2). Эта организация ставит задачу доставить инфекционные бактерии в просвет из-за пределов энтероидов (In et al., 2016). В большинстве случаев основным очагом инфекции является поляризованный эпителий, выстилающий просвет кишечника (Martinez-Argudo and Jepson, 2008).Однако трехмерная архитектура энтероидов ограничивает доступ патогенов к просветной эпителиальной поверхности. Чтобы преодолеть это, использовались микроинъекции для доставки кишечного патогена (например, аденовируса 2 мыши, MAdV-2) в просвет энтероидов (Wilson et al., 2017). Несмотря на поразительное сходство с тканями / органами, энтероидами можно экспериментально манипулировать аналогично классическим клеточным линиям. К ним относятся ПЦР, количественная ПЦР, вестерн-блоттинг, иммуногистохимия (ИГХ), трансдукция лентивируса и редактирование гена CRISPR / Cas9 (Miyoshi and Stappenbeck, 2013; Van Lidth de Jeude et al., 2015; Инь и др., 2015; Driehuis and Clevers, 2017). Это преимущество облегчило быстрое применение энтероидов.
Рисунок 2 . Принципиальная схема создания 2-D монослойных энтероидов.
трехмерных энтероидов можно заменить двумерными монослоями поверх мембран внутри трансвеллеров из-за очевидных временных и финансовых соображений. В этой установке трансвеллеры обеспечивают доступ к апикальным поверхностям двумерных монослоев (рис. 2) (Wang et al., 2017). Двухмерные монослои широко используются для изучения взаимодействий хозяин-патоген более контролируемым и воспроизводимым образом по сравнению с трехмерными энтероидами (Wang et al., 2017). Однако двумерные культуры можно поддерживать только в течение короткого периода времени, и они подходят для изучения начальных взаимодействий патоген / хозяин, которые длятся несколько часов. Напротив, 3D-культуры лучше подходят для изучения долгосрочных взаимодействий между хозяином и патогеном. Кроме того, 3D-культуры уникально подходят для моделирования вклада просвета (например, антимикробного ответа, активных форм кислорода и т. Д.), Поскольку было показано, что они переносят бактерии в течение нескольких дней без очевидного повреждения тканей (Wilson et al., 2017).
Энтероиды и кишечные органоиды для изучения
Salmonella Инфекция
Инфекция Salmonella — это динамический процесс, в котором бактерии сталкиваются со многими типами клеток и органов. Правильные модели in vitro необходимы для выявления патогенных детерминант, действующих на различных стадиях инфекции, и для разработки новых противомикробных препаратов против инфекций Salmonella (Le Blay et al., 2009). Определенные серовары Salmonella ограничены человеческими хозяевами или вызывают различные заболевания в зависимости от того, заражают ли они животных или людей.Одним из таких примеров является Salmonella Typhimurium (Forbester et al., 2015), которая вызывает гастроэнтерит у людей и тифоподобное заболевание у мышей, что затрудняет интерпретацию данных, полученных в экспериментах на мышах. Хотя для изучения Salmonella было создано множество клеточных линий, полученные из рака модели не могут воспроизводить сложную архитектуру кишечника и могут иметь другие физиологические характеристики по сравнению с нормальными тканями.
Было продемонстрировано, что iHO являются многообещающей моделью инфекции для Salmonella , и микроинъекция обычно используется для инокуляции Salmonella в просвет iHO (Forbester et al., 2015). IHOs нужно 1-2 месяца, чтобы «созреть», прежде чем они станут пригодными для экспериментов, а трехмерная эпителиальная структура окружена мезенхимой (Figure 3; Yin et al., 2015). Напротив, энтероиды легче приготовить и созреть за 4–7 дней (рис. 3).
Рисунок 3 . Сравнение iHOs и первичных энтероидов. (A) Процесс культивирования и особенности iHOs. (B) Процесс культивирования и особенности первичных энтероидов.
Инфекции, вызванные Salmonella , вызывают воспалительные реакции кишечника, включая инфильтрацию нейтрофилов и выработку провоспалительных цитокинов.Было показано, что секреция цитокинов увеличивалась на однослойных и трехмерных органотипических моделях эпителия толстой кишки человека (HT-29), а также на мышиной модели C57BL / 6 при заражении Salmonella (Höner Zu Bentrup et al., 2006 ; Ren et al., 2009). Кроме того, пациенты, инфицированные Salmonella , демонстрируют индукцию гамма-интерферона (IFN-γ) вместе с повышенным фактором некроза опухоли альфа (TNF-α) (Gal-Mor et al., 2012). Используя энтероиды мыши, полученные из крипт, Zhang et al. смогли воспроизвести воспалительные реакции, вызванные Salmonella (Zhang Y.G. et al., 2014). Кроме того, инфекция Salmonella индуцировала активацию ядерного фактора каппа-легкая цепь-энхансер активированных В-клеток (NF-κB) сигнального пути в энтероидах мыши, сопровождаемая экспрессией воспалительных цитокинов, включая TNF-α и IFN-γ ( Чжан К. и др., 2014). Это согласуется с результатами заражения iHO Salmonella , при котором гены, кодирующие провоспалительные цитокины, были активированы (Forbester et al., 2015). Более того, инфекция Salmonella значительно снизила экспрессию маркеров кишечных стволовых клеток, Lgr5 и Bmi 1 (Forbester et al., 2015). Значение и механизм этого снижения требуют дальнейшего исследования с использованием модели энтероидов.
Инвазия кишечного эпителия является важным этапом для вирулентности Salmonella (Galán and Curtiss, 1989; Galan and Zhou, 2000). Исследование с использованием энтероидов мышей, полученных из крипт (через 6 дней после пассажа), показало, что Salmonella быстро прикреплялись и вторгались в энтероиды (Zhang YG et al., 2014), что сопровождалось типичными морфологическими изменениями клеток-хозяев во время инвазии Salmonella . а также нарушение плотных контактов эпителия (Finlay et al., 1991; Галан и Чжоу, 2000; Zhang Y.G. et al., 2014). Кроме того, показано, что штаммы Salmonella дикого типа, микроинъектированные в просвет iHO, способны проникать в эпителиальный слой и продолжать движение внутри вакуолей, содержащих Salmonella . Напротив, мутант Salmonella invA , дефектный в аппарате инвазии острова 1 патогенности Salmonella , был менее способен вторгаться в эпителий iHO (Forbester et al., 2015). Кроме того, мышиные энтероиды использовали для изучения выживаемости и репликации Salmonella и обнаружили, что естественным образом секретируемые α-дефенсины клетками Панета в просвете подавляли рост Salmonella (Wilson et al., 2015). Этот результат согласуется с данными, полученными при использовании ex vivo кишечных крипт и ворсинок (Ayabe et al., 2000).
Chronic Salmonella Инфекции Typhi являются одним из факторов риска рака желчного пузыря (GBC) (Wistuba and Gazdar, 2004). Недавнее исследование показало, что инфекция Salmonella вызывала злокачественную трансформацию органоидов желчного пузыря мышей (Scanu et al., 2015). Интересно, что Scanu et al. обнаружили, что за трансформацию отвечает Salmonella -опосредованная активация митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и протеинкиназы B (PKB или AKT).Важно отметить, что результат исследования органоидов желчного пузыря мышей согласуется с наблюдениями у пациентов GBC (Scanu et al., 2015). В совокупности как iHO, так и энтероиды были успешно использованы для анализа патогенеза Salmonella . Энтероиды могут стать многообещающей экспериментальной платформой для исследования инфекций Salmonella для скрининга противомикробных препаратов и персонализированной медицины.
Уроки, извлеченные из исследований других энтеропатогенов
Обычные двухмерные монослойные культуры в значительной степени способствовали продвижению нашего понимания взаимодействий хозяин-патоген, несмотря на их ограничения в отношении одного типа клеток и их происхождения из опухоли (Duell et al., 2011). Известно, что разные патогены могут преимущественно инфицировать подмножество типов клеток и могут использовать разные молекулы хозяина для распространения своих инфекций. Кроме того, многие биологические процессы, которые вызывают иммунные ответы против патогенов, трудно, если вообще возможно, имитировать с использованием однослойных культур клеточных линий (Duell et al., 2011). Было показано, что многие инфекционные агенты заражают энтероиды (таблица 2), включая паразитов (Gerbe et al., 2016), ротавирус (Yin et al., 2015), норовирус (Ettayebi et al., 2016), Enterohemorrhagic Escherichia coli (In et al., 2016) и Salmonella (Zhang Y. G. et al., 2014; Scanu et al., 2015; Wilson et al., 2015).
Таблица 2 . Органоиды и энтероиды моделируют различные физиологические процессы кишечника и патологические процессы.
Ротавирус — основная причина гастроэнтерита и диареи во всем мире. Известно, что ротавирус нацелен на эпителиальные клетки кишечника человека, и было показано, что он инфицирует энтероиды человека (Foulke-Abel et al., 2014; Инь и др., 2015). Этот значительный прогресс преодолел тот факт, что ротавирус человека плохо реплицируется в трансформированных клеточных линиях. Кроме того, использование многих моделей на животных ограничено из-за ограничений ротавируса в диапазоне хозяев. Было показано, что ротавирусные инфекции приводят к физиологическому расширению просвета, что является признаком диареи, вызванной ротавирусом (Saxena et al., 2015). Лабораторно адаптированные штаммы ротавирусов и изоляты, полученные от пациентов, были способны инфицировать энтероиды как мыши, так и человека. Интересно, что энтероиды человека были более восприимчивы к ротавирусным инфекциям человека, чем энтероиды мыши (Yin et al., 2015). Более того, ротавирус, полученный от пациента, показал иную инфекционную способность в ответ на обычно используемые противовирусные препараты, включая рибавирин и IFNα, по сравнению с лабораторно адаптированным ротавирусом при инфицировании энтероидов человека (Yin et al., 2015). Ротавирус также индуцировал менее выраженную экспрессию генов, участвующих в врожденных иммунных ответах (интерферон-стимулированные гены, ISG), в энтероидах, чем в клетках Caco2 (Yin et al., 2015). В соответствии с клиническими данными пациентов, противовирусный эффект IFNα был меньше в энтероидах по сравнению с таковым в клетках Caco2 (Yin et al., 2015). Недавно энтероиды, полученные из трансгенных мышей, были успешно использованы для характеристики NOD-подобного рецептора (NLR) Nlrp9b-опосредованного инфламмасомой рестрикции ротавируса в эпителиальных клетках кишечника мышей (Zhu et al., 2017). Таким образом, энтероиды, полученные от различных трансгенных мышей, подчеркивают их способность вносить вклад в понимание молекулярных механизмов во время инфекций эпителиальных клеток кишечника.
Норовирус — еще один кишечный вирус, вызывающий тяжелый гастроэнтерит как у младенцев, так и у взрослых (Ettayebi et al., 2016). Известно, что культивируемые клеточные линии не поддерживают репликацию норовируса (Papafragkou et al., 2014). Трехмерная модель кишечника, полученная из клеток INT-407 и клеток Caco2, также не способствовала репликации норовируса (Papafragkou et al., 2014). Напротив, энтероиды, как было показано, поддерживали норовирусную инфекцию, и явные цитопатические эффекты (ЦПЭ) и вирусные частицы наблюдались при норовирусной инфекции. Репликация вируса была еще более выраженной при добавлении желчи в питательную среду. Недавно сообщалось, что энтероиды человека используются для изучения роли секретируемых альфа-дефенсинов во время инфицирования аденовирусом 2 мыши (Wilson et al., 2017).
Помимо вирусных исследований, энтероиды успешно использовались для изучения бактериальных патогенов, помимо Salmonella . Энтерогеморрагическая Escherichia coli (EHEC) вызывает болезни пищевого происхождения как в развивающихся, так и в промышленно развитых странах (In et al., 2016). Недавно энтероиды человека с добавлением нейтрофилов человека были созданы для изучения инфекций E. coli O157: H7 (Karve et al., 2017). В просвете энтероидов патогенный O157: H7 быстро реплицировался, в то время как комменсал E.coli — нет (Karve et al., 2017). Интересно, что инфекции O157: H7 способствовали привлечению нейтрофилов человека (Karve et al., 2017). Кроме того, энтероиды предоставили уникальную модель для изучения взаимодействия между кишечной микробиотой, кишечными патогенами и кишечной средой хозяина (Nigro et al., 2016).
Clostridium difficile ( C. difficile ), грамположительные облигатные анаэробные бактерии, повсеместно распространенные в природе, поражает толстую кишку человека у 2–5% взрослого населения.Дисбаланс нормальной кишечной флоры может увеличить вероятность заражения Clostridium . Бактерии могут вызывать диарею и воспаление у инфицированных пациентов через хорошо охарактеризованный энтеротоксин (, токсин C. difficile, , токсин A) и цитотоксин (, токсин C. difficile, , токсин B). IHIO, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека, использовали для изучения C. difficile и влияния токсинов. Было показано, что токсины играют важную роль в колонизации и разрушении эпителия iHIO, а также в потере параклеточной барьерной функции (Leslie et al., 2015).
Helicobacter pylori ( H. pylori ) Колонизация желудка человека была связана с хроническим гастритом, язвой и аденокарциномой. Для изучения патогенеза инфекции H. pylori были получены органоиды желудка человека из хирургических образцов тела желудка человека. Органоиды желудка демонстрируют типичные характеристики соответствующих им тканей, основанные на их гистологии, экспрессии маркеров и эуплоидии (Bartfeld et al., 2015). Эта система может быть использована для изучения других патологий желудка в дополнение к инфекции H. pylori .
Одним из интересных потенциальных способов использования энтероидов, полученных от пациентов, является оценка эффективности персонализированной медицины, такой как прецизионная химиотерапия для онкологических больных. Рой и др. успешно оценили эффекты митомицина-C, 5-фторурацила (5-FU), иринотекана, оксалиплатина, доксорубицина и паклитаксела на перитонеальные метастазы с использованием энтероидов (Roy et al., 2017). Энтероиды также использовались для моделирования различных физиологических процессов кишечника и заболеваний (таблица 2). Человеческие энтероиды использовались для изучения транспорта электролитов и кишечной жидкости с помощью анализа люминальной дилатации (Zachos et al., 2016). Энтероиды также внесли свой вклад в понимание муковисцидоза, вызванного мутациями в регуляторе трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR), с использованием анализа набухания (Dekkers et al., 2013). Более того, энтероиды использовались для моделирования колоректального рака и воспалительных заболеваний кишечника, включая язвенный колит и болезнь Крона (Matano et al., 2015; Янг и Рид, 2016; Noben et al., 2017). Наконец, потенциальная трансплантация энтероидов пациентам с кишечной недостаточностью (IF), опасным для жизни состоянием, еще больше расширила возможности использования энтероидов для лечения пациентов (Hong et al., 2017). Взятые вместе, энтероиды становятся надежными моделями инфекций для изучения как вирусных, так и бактериальных инфекций и могут играть ключевую роль в развитии персонализированной медицины для лечения инфекций и заболеваний человека.
Резюме и выводы
Сальмонеллез остается серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. Доступность различных моделей инфекции помогла выявить факторы вирулентности бактерий, вызывающие заболевания. Исследования с использованием этих моделей инфекции улучшили наше понимание того, как патогены задействуют свои факторы вирулентности для модуляции функций клетки-хозяина во время инфекции. Классические модели инфекции включают различные двумерные культуры иммортализованных клеток и модели на животных.Недавние успехи в исследованиях стволовых клеток помогли установить органоиды и энтероиды как жизнеспособные альтернативы многим устоявшимся моделям инфекции. Мы ожидаем, что модели органоидов и энтероидных инфекций будут играть ключевую роль в углублении понимания скрининга противомикробных препаратов, персонализированной медицины, механизмов вирулентности и взаимодействия патоген-хозяин.
Авторские взносы
Все перечисленные авторы внесли существенный, прямой и интеллектуальный вклад в работу и одобрили ее к публикации.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Список литературы
Аябе, Т., Сатчелл, Д. П., Уилсон, К. Л., Паркс, В. К., Селстед, М. Э., и Уэллетт, А. Дж. (2000). Секреция микробицидных альфа-дефенсинов кишечными клетками Панета в ответ на бактерии. Nat. Иммунол. 1, 113–118.DOI: 10.1038 / 77783
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Баррила Дж., Радтке А. Л., Краббе А., Саркер С. Ф., Хербст-Краловец М. М., Отт К. М. и др. (2010). Органотипические 3D-модели клеточных культур: использование сосудов с вращающимися стенками для изучения взаимодействий между хозяином и патогеном. Nat. Ред. Microbiol . 8, 791–801. DOI: 10.1038 / nrmicro2423
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бартфельд, С., Байрам, Т., Ван Де Ветеринг, М., Huch, M., Begthel, H., Kujala, P., et al. (2015). In vitro Экспансия эпителиальных стволовых клеток желудка человека и их ответы на бактериальную инфекцию. Гастроэнтерология 148, 126–136 e126. DOI: 10.1053 / j.gastro.2014.09.042
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бартфельд, С., Кливерс, Х. (2015). Органоиды как модель инфекционных заболеваний: культура органоидов желудка человека и мыши и микроинъекция Helicobacter pylori . J. Vis Exp. дой: 10,3791 / 53359. [Epub перед печатью].
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бартель, М., Хапфельмайер, С., Кинтанилья-Мартинес, Л., Кремер, М., Роде, М., Хогардт, М., et al. (2003). Предварительная обработка мышей стрептомицином дает модель Salmonella enterica Serovar Typhimurium Colitis, которая позволяет анализировать как патоген, так и хозяина. Заражение. Иммун. 71, 2839–2858. DOI: 10.1128 / IAI.71.5.2839-2858.2003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Blanc-Potard, A. B., and Groisman, E. A. (1997). Локус Salmonella selC содержит островок патогенности, опосредующий выживание внутримакрофагов. EMBO J . 16, 5376–5385. DOI: 10.1093 / emboj / 16.17.5376
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Boyle, E.C., Dombrowsky, H., Sarau, J., Braun, J., Aepfelbacher, M., Lautenschläger, I., et al. (2015). Перфузия ex vivo изолированного тонкого кишечника крысы как новая модель сальмонеллезного энтерита. г. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol. 310, G55 – G63. DOI: 10.1152 / ajpgi.00444.2014
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бреннер, Ф. В., Вильяр, Р. Г., Ангуло, Ф. Дж., Токс, Р., и Сваминатан, Б. (2000). Номенклатура сальмонелл. J. Clin. Микробиол . 38, 2465–2467.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Бухмайер, Н.А., и Хеффрон, Ф. (1989). Внутриклеточная выживаемость Salmonella typhimurium дикого типа и чувствительных к макрофагам мутантов в различных популяциях макрофагов. Заражение. Иммун . 57, 1–7.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Кларк, М. А., Джепсон, М. А., Симмонс, Н. Л., и Херст, Б. Х. (1994). Преимущественное взаимодействие Salmonella typhimurium с М-клетками Пейера мыши. Res. Микробиол . 145, 543–552. DOI: 10.1016 / 0923-2508 (94)
-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кларк, М.А., Рид, К.А., Лодж, Дж., Стивен, Дж., Херст, Б. Х., и Джепсон, М. А.(1996). Инвазия кишечных М-клеток мышей мутантами Salmonella typhimurium inv, сильно не способными проникать в культивируемые клетки. Заразить. Иммун . 64, 4363–4368.
Google Scholar
Кроуфорд, Р. У., Кестра, А. М., Винтер, С. Э., Ксавьер, М. Н., Цолис, Р. М., Толстиков, В., и др. (2012). Очень длинные цепи О-антигенов улучшают физическую форму при колите, вызванном сальмонеллой, за счет увеличения резистентности желчи. PLoS Pathog . 8: e1002918. DOI: 10,1371 / журнал.ppat.1002918
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Крамп, Дж. А., Сьелунд-Карлссон, М., Гордон, М. А., и Парри, К. М. (2015). Эпидемиология, клинические проявления, лабораторная диагностика, устойчивость к противомикробным препаратам и противомикробное лечение инвазивных инфекций Salmonella. Clin. Microbiol. Ред. . 28, 901–937. DOI: 10.1128 / CMR.00002-15
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
де Лау, В., Куяла, П., Schneeberger, K., Middendorp, S., Li, V. S., Barker, N., et al. (2012). М-клетки пейеровского пятна, полученные из стволовых клеток Lgr5 (+), нуждаются в SpiB и индуцируются с помощью RankL в культивируемых «мини-породах». Мол. Клетка. Биол . 32, 3639–3647. DOI: 10.1128 / MCB.00434-12
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Деккерс, Дж. Ф., Вигеринк, К. Л., Де Йонге, Х. Р., Бронсвельд, И., Янссенс, Х. М., Де Винтер-Де Гроот, К. М. и др. (2013). Функциональный анализ CFTR с использованием кишечных органоидов первичного муковисцидоза. Nat. Med . 19, 939–945. DOI: 10,1038 / нм. 3201
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Досталь А., Ганьон М., Чассар К., Циммерманн М. Б., О’махони Л. и Лакруа К. (2014). На адгезию сальмонелл, инвазию и клеточные иммунные ответы по-разному влияют концентрации железа в комбинированной модели клеток кишечной ферментации in vitro . PLoS ONE 9: e. DOI: 10.1371 / journal.pone.00
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Driehuis, E., и Кливерс, Х. (2017). Редактирование генома CRISPR / Cas 9 и его применение в органоидах. г. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol . 312, G257 – G265. DOI: 10.1152 / ajpgi.00410.2016
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дуэлл, Б. Л., Криппс, А. В., Шембри, М. А., и Улетт, Г. К. (2011). Модели сокультивирования эпителиальных клеток для изучения инфекционных заболеваний: преимущества и ограничения. J. Biomed. Biotechnol. 2011: 852419. DOI: 10.1155 / 2011/852419
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Анг, С.-K., Pusparajah, P., Ab Mutalib, N.-S., Ser, H.-L., Chan, K.-G., and Lee, L.-H. (2015). Salmonella: обзор патогенеза, эпидемиологии и устойчивости к антибиотикам. Фронт. Life Sci. 8, 284–293. DOI: 10.1080 / 21553769.2015.1051243
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Эттайеби К., Кроуфорд С. Э., Мураками К., Броуман Дж. Р., Карандикар У., Тенге В. Р. и др. (2016). Репликация норовирусов человека в энтероидах человека, полученных из стволовых клеток. Наука 353, 1387–1393.DOI: 10.1126 / science.aaf5211
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фанг, С. Б., Хуанг, К. Дж., Хуанг, К. Х., Ван, К. С., Чанг, Н. У., Пан, Х. Ю. и др. (2017). speG необходим для внутриклеточной репликации сальмонелл в различных клетках человека и влияет на метаболизм полиаминов и глобальные транскриптомы. Фронт. Microbiol. 8: 2245. DOI: 10.3389 / fmicb.2017.02245
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фирер, Дж.и Guiney, D.G. (2001). Различные признаки вирулентности, лежащие в основе различных клинических исходов инфекции Salmonella. J. Clin. Инвестируйте . 107, 775–780. DOI: 10.1172 / JCI12561
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Финли Б. Б. и Брумелл Дж. Х. (2000). Взаимодействие сальмонелл с клетками-хозяевами: от in vitro от до in vivo . Philos. Пер. R. Soc. Лондон. B. Biol. Sci . 355, 623–631. DOI: 10.1098 / rstb.2000.0603
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Финли, Б.Б., Рушковски С. и Дедхар С. (1991). Цитоскелетные перестройки, сопровождающие проникновение сальмонелл в эпителиальные клетки. J. Cell Sci. 99, 283–293.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Фироз Миан, М., Пек, Э. А., Ченовет, М. Дж., И Ашкар, А. А. (2011). Гуманизированные мыши восприимчивы к инфекции Salmonella typhi. Ячейка. Мол. Иммунол. 8, 83–87. DOI: 10,1038 / cmi.2010.52
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Форбестер, Дж.L., Goulding, D., Vallier, L., Hannan, N., Hale, C., Pickard, D., et al. (2015). Взаимодействие Salmonella enterica Serovar Typhimurium с кишечными органоидами, полученными из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Заражение. Иммун . 83, 2926–2934. DOI: 10.1128 / IAI.00161-15
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Foulke-Abel, J., In, J., Kovbasnjuk, O., Zachos, N.C., Ettayebi, K., Blutt, S.E., et al. (2014). Человеческие энтероиды как модель ex-vivo взаимодействий хозяин-патоген в желудочно-кишечном тракте. Exp. Биол. Med. (Maywood) 239, 1124–1134. DOI: 10.1177 / 1535370214529398
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фрост А. Дж., Бланд А. П. и Уоллис Т. С. (1997). Ранний динамический ответ эпителия подвздошной кишки теленка на Salmonella typhimurium. Вет. Патол . 34, 369–386. DOI: 10.1177 / 030098589703400501
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Галан, Дж. Э. (1999). Взаимодействие сальмонелл с клетками-хозяевами через систему секреции центисомы 63 типа III. Curr. Opin. Микробиол . 2, 46–50. DOI: 10.1016 / S1369-5274 (99) 80008-3
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Галан Дж. Э. и Кертисс Р. III. (1989). Клонирование и молекулярная характеристика генов, продукты которых позволяют Salmonella typhimurium проникать в клетки тканевой культуры. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 86, 6383–6387. DOI: 10.1073 / pnas.86.16.6383
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Галан, Дж.Э. и Чжоу Д. (2000). Достижение баланса: модуляция актинового цитоскелета сальмонеллой. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 97, 8754–8761. DOI: 10.1073 / pnas.97.16.8754
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гал-Мор, О., Суэц, Дж., Эльхадад, Д., Порволлик, С., Лешем, Э., Валински, Л. и др. (2012). Молекулярная и клеточная характеристика штамма вспышки Salmonella enterica Serovar Paratyphi и иммунного ответа человека на инфекцию. Clin. Вакцина Иммунол. 19, 146–156. DOI: 10.1128 / CVI.05468-11
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Gerbe, F., Sidot, E., Smyth, D. J., Ohmoto, M., Matsumoto, I., Dardalhon, V., et al. (2016). Клетки кишечного эпителиального пучка инициируют иммунитет слизистой оболочки 2 типа к паразитам-гельминтам. Природа 529, 226–230. DOI: 10.1038 / природа16527
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джаннелла, Р.А., Формал, С. Б., Даммин, Г. Дж., И Коллинз, Х. (1973). Патогенез сальмонеллеза. Изучение секреции жидкости, инвазии слизистой оболочки и морфологической реакции подвздошной кишки кролика. J. Clin. Инвестируйте . 52, 441–453. DOI: 10.1172 / JCI107201
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джаннелла Р. А., Роут В. Р. и Формал С. Б. (1977). Влияние индометацина на транспорт воды в кишечнике у инфицированных сальмонеллой макак-резусов. Заражение. Иммун .17, 136–139.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Гордон М.А. (2011). Инвазивная нетифоидная сальмонеллезная болезнь — эпидемиология, патогенез и диагностика. Curr. Opin. Заразить. Дис. 24: 484. DOI: 10.1097 / QCO.0b013e32834a9980
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гриффин, А. Дж., И МакСорли, С. Дж. (2011). Развитие защитного иммунитета к сальмонелле, патогену слизистых оболочек с системной повесткой дня. Mucosal Immunol. 4, 371–382.DOI: 10.1038 / mi.2011.2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гини Д. Г., Фанг Ф. К., Краузе М. и Либби С. (1994). Плазмидно-опосредованные гены вирулентности в нетифозных сероварах Salmonella. FEMS Microbiol. Lett . 124, 1–9. DOI: 10.1111 / j.1574-6968.1994.tb07253.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Haque, A., Bowe, F., Fitzhenry, R.J., Frankel, G., Thomson, M., Heuschkel, R., et al. (2004).Ранние взаимодействия серовара typhimurium Salmonella enterica с эпителиальными эксплантатами тонкого кишечника человека. Гут 53, 1424–1430. DOI: 10.1136 / gut.2003.037382
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Hensel, M., Shea, J. E., Raupach, B., Monack, D., Falkow, S., Gleeson, C., et al. (1997). Функциональный анализ ssaJ и оперона ssaK / U, 13 генов, кодирующих компоненты аппарата секреции типа III острова патогенности сальмонелл 2. Мол. Микробиол . 24, 155–167. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.1997.3271699.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хенсель М., Ши Дж. Э., Уотерман С. Р., Манди Р., Николаус Т., Бэнкс Г. и др. (1998). Гены, кодирующие предполагаемые эффекторные белки системы секреции типа III острова патогенности 2 сальмонелл, необходимы для бактериальной вирулентности и пролиферации в макрофагах. Мол. Микробиол . 30, 163–174. DOI: 10,1046 / j.1365-2958.1998.01047.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Höner Zu Bentrup, K., Ramamurthy, R., Ott, C.M, Emami, K., Nelman-Gonzalez, M., Wilson, J. W., et al. (2006). Трехмерные органотипические модели эпителия толстой кишки человека для изучения ранних стадий кишечного сальмонеллеза. Микробы заражают . 8, 1813–1825. DOI: 10.1016 / j.micinf.2006.02.020
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хонг, С.Н., Данн, Дж. К., Стелзнер, М., и Мартин, М. Г. (2017). Краткий обзор: потенциальное использование стволовых клеток кишечника для лечения пациентов с кишечной недостаточностью. Стволовые клетки Пер. Med. 6, 666–676. DOI: 10.5966 / sctm.2016-0153
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Херли Б. П. и Маккормик Б. А. (2003). Перевод результатов культур тканей в модели на животных: случай Salmonella typhimurium. Trends Microbiol . 11, 562–569.DOI: 10.1016 / j.tim.2003.10.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Херли Д., Маккаскер М. П., Фаннинг С. и Мартинс М. (2014). Взаимодействие сальмонеллы и хозяина — модуляция врожденной иммунной системы хозяина. Front Immunol 5: 481. DOI: 10.3389 / fimmu.2014.00481
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
In, J., Foulke-Abel, J., Zachos, N.C., Hansen, A.M, Kaper, J.B., Bernstein, H.D., et al. (2016).Энтерогеморрагическая Escherichia coli уменьшает слизь и межмикровиллярные мосты в колоноидах, полученных из стволовых клеток человека. Ячейка. Мол. Гастроэнтерол. Гепатол. 2, 48–62.e43. DOI: 10.1016 / j.jcmgh.2015.10.001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Итри, Ф., Монти, Д. М., Чино, М., Винчигуэрра, Р., Алтуччи, К., Ломбарди, А., и др. (2017). Выявление новых прямых белок-белковых взаимодействий путем облучения живых клеток фемтосекундными УФ-лазерными импульсами. Biochem. Биофиз. Res. Коммуна . 492, 67–73. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2017.08.037
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джонс Б. Д., Гори Н. и Фалькоу С. (1994). Salmonella typhimurium инициирует инфицирование мышей, проникая в специализированные эпителиальные М-клетки пейеровских бляшек и разрушая их. J. Exp. Med . 180, 15–23. DOI: 10.1084 / jem.180.1.15
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Карве, С.С., Прадхан, С., Уорд, Д. В., и Вайс, А. А. (2017). Органоиды кишечника моделируют реакцию человека на инфекцию, вызванную комменсалом и токсином шига, продуцирующим Escherichia coli . PLoS ONE 12: e0178966. DOI: 10.1371 / journal.pone.0178966
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кинси, М. Д., Даммин, Г. Дж., Формал, С. Б., и Джаннелла, Р. А. (1976). Роль измененной кишечной проницаемости в патогенезе сальмонеллезной диареи у макак-резусов. Гастроэнтерология 71, 429–434.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Кубори Т., Мацусима Ю., Накамура Д., Уралил Дж., Лара-Теджеро М., Сухан А. и др. (1998). Надмолекулярная структура системы секреции белков Salmonella typhimurium типа III. Наука 280, 602–605. DOI: 10.1126 / science.280.5363.602
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кумар, Г., Пратап, К. Б., Мишра, О. П., Кумар, К., и Нат, Г.(2012). Использование мочи с вложенной ПЦР, нацеленной на ген флагеллина (fliC), для диагностики брюшного тифа. J. Clin. Microbiol. 50, 1964–1967. DOI: 10.1128 / JCM.00031-12
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ле Блей, Г., Ритка, Дж., Зилер, А., и Лакруа, К. (2009). Новая модель in vitro кишечной ферментации для инфекции сальмонеллы в кишечнике ребенка. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 198–207. DOI: 10.1111 / j.1574-6941.2008.00625.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Легран, Н., Плосс, А., Баллинг, Р., Беккер, П. Д., Борсотти, К., Брезиллон, Н. и др. (2009). Гуманизированные мыши для моделирования инфекционных заболеваний человека: проблемы, прогресс и перспективы. Клеточный микроб-хозяин 6, 5–9. DOI: 10.1016 / j.chom.2009.06.006
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лесли, Дж. Л., Хуанг, С., Опп, Дж. С., Надь, М. С., Кобаяши, М., Янг, В.B., et al. (2015). Стойкость и выработка токсинов Clostridium difficile в органоидах кишечника человека приводит к нарушению параклеточной барьерной функции эпителия. Заражение. Иммун . 83, 138–145. DOI: 10.1128 / IAI.02561-14
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Линдквист Б. Л., Лебенталь Э., Ли П. К., Стинсон М. В. и Меррик Дж. М. (1987). Прилипание Salmonella typhimurium к энтероцитам тонкого кишечника крысы. Заражение. Иммун . 55, 3044–3050.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Лопес К. А., Ривера-Чавес Ф., Биндлосс М. Х. и Баумлер А. Дж. (2015). Периплазматическая нитратредуктаза NapABC поддерживает рост в просвете Salmonella enterica Serovar Typhimurium во время колита. Заражение. Иммун . 83, 3470–3478. DOI: 10.1128 / IAI.00351-15
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мартинес-Аргудо, И., Джепсон, М.А. (2008). Salmonella перемещается по модели М-клеток in vitro независимо от SPI-1 и SPI-2. Микробиология 154, 3887–3894. DOI: 10.1099 / mic.0.2008 / 021162-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Матано, М., Дате, С., Симокава, М., Такано, А., Фуджи, М., Охта, Ю. и др. (2015). Моделирование колоректального рака с использованием CRISPR-Cas9-опосредованной инженерии органоидов кишечника человека. Nat. Med . 21, 256–262. DOI: 10.1038 / нм. 3802
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Mathur, R., Oh, H., Zhang, D., Park, S.G., Seo, J., Koblansky, A., et al. (2012). Мышиная модель инфекции сальмонеллы тифа. Ячейка 151, 590–602. DOI: 10.1016 / j.cell.2012.08.042
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Миёси, Х., и Стаппенбек, Т.С. (2013). In vitro Расширение и генетическая модификация стволовых клеток желудочно-кишечного тракта в культуре сфероидов. Nat. Протоколы 8, 2471–2482. DOI: 10.1038 / nprot.2013.153
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ньюбург, Д. С., Ко, Дж. С., Леоне, С., и Нантакумар, Н. Н. (2016). Олигосахариды человеческого молока и синтетические галактозилолигосахариды содержат 3′-, 4- и 6′-галактозиллактозу и ослабляют воспаление в человеческих клетках T84, NCM-460 и h5 и кишечной ткани Ex vivo. Дж. Нутрь . 146, 358–367. DOI: 10.3945 / jn.115.220749
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Никерсон, К.A., Goodwin, T.J., Terlonge, J., Ott, C.M., Buchanan, K.L., Uicker, W.C., et al. (2001). Трехмерные сборки тканей: новые модели для изучения патогенеза серовара Salmonella enterica Typhimurium. Заражение. Иммун. 69, 7106–7120. DOI: 10.1128 / IAI.69.11.7106-7120.2001
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Нитфельд, Дж. К., Тайлер, Д. Э., Харрисон, Л. Р., Коул, Дж. Р., Латимер, К. С. и Кроуэлл, В. А. (1992). Инвазия энтероцитов в культивируемые эксплантаты слизистой оболочки тонкого кишечника свиней Salmonella choleraesuis. г. J. Vet. Res . 53, 1493–1499.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Нигро, Г., Хансон, М., Февр, К., Лекит, М., и Сансонетти, П. Дж. (2016). Органоиды кишечника как новый инструмент для изучения взаимодействия микробов с эпителием. Methods Mol. Биол. DOI: 10.1007 / 7651_2016_12. [Epub перед печатью].
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Нобен, М., Версток, Б., Де Брюйн, М., Хендрикс, Н., Ван Ассше, Г., Vermeire, S., et al. (2017). Культуры эпителиальных органоидов пациентов с язвенным колитом и болезнью Крона: действительно долгосрочная модель для изучения молекулярной основы воспалительного заболевания кишечника? Кишечник 66, 2193–2195. DOI: 10.1136 / gutjnl-2016-313667
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Норрис, Ф. А., Уилсон, М. П., Уоллис, Т. С., Галев, Э. Э., и Майерус, П. В. (1998). SopB, белок, необходимый для вирулентности Salmonella dublin, представляет собой инозитолфосфатфосфатазу. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 95, 14057–14059. DOI: 10.1073 / pnas.95.24.14057
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Охман, Х., Сончини, Ф. К., Соломон, Ф. и Гройсман, Э. А. (1996). Идентификация острова патогенности, необходимого для выживания сальмонелл в клетках-хозяевах. Proc. Natl. Акад. Sci. США . 93, 7800–7804. DOI: 10.1073 / pnas.93.15.7800
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Озкая, H., Акджан, А. Б., Айдемир, Г., Айдын Оз, С., Разия, Ю., Гаммон, С. Т. и др. (2012). Инфекции Salmonella typhimurium у мышей BALB / c: сравнение биолюминесценции тканей, культур тканей и клинических показателей мышей. Новый микробиол . 35, 53–59.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Папафрагку, Э., Хьюитт, Дж., Парк, Г. В., Грининг, Г., и Винже, Дж. (2014). Проблемы культивирования норовируса человека в трехмерных органоидных моделях культуры клеток кишечника. PLoS ONE 8: e63485.DOI: 10.1371 / journal.pone.0063485
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Попофф, М. Ю., Бокемюль, Дж., И Геслинг, Л. Л. (2003). Приложение 2001 (№ 45) к схеме Кауфмана-Уайта. Res. Microbiol. 154, 173–174. DOI: 10.1016 / S0923-2508 (03) 00025-1
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ren, Z., Gay, R., Thomas, A., Pae, M., Wu, D., Logsdon, L., et al. (2009). Влияние возраста на восприимчивость к инфекции Salmonella Typhimurium у мышей C57BL / 6. J. Med. Микробиол . 58, 1559–1567. DOI: 10.1099 / jmm.0.013250-0
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ривера-Чавес, Ф., и Баумлер, А. Дж. (2015). Пироманьяк внутри вас: метаболизм сальмонелл в кишечнике хозяина. Annu. Ред. Microbiol . 69, 31–48. DOI: 10.1146 / annurev-micro-0-104108
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ривера-Чавес, Ф., Винтер, С. Э., Лопес, К. А., Ксавьер, М.Н., Винтер М. Г., Нуччио С. П. и др. (2013). Сальмонелла использует энергетические такси, чтобы избавиться от воспаления кишечника. PLoS Pathog . 9: e1003267. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1003267
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ривера-Чавес, Ф., Чжан, Л. Ф., Фабер, Ф., Лопес, К. А., Биндлосс, М. Х., Олсан, Э. Е. и др. (2016). Истощение клостридий кишечника, продуцирующих бутират, вызывает аэробное распространение сальмонелл в просвете. Клеточный микроб-хозяин 19, 443–454.DOI: 10.1016 / j.chom.2016.03.004
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рой П., Кане-Журдан К., Аннеро М., Зажак О., Джелли М., Брутин С. и др. (2017). Органоиды как доклинические модели для повышения эффективности внутрибрюшинной химиотерапии для пациентов с колоректальным раком с перитонеальными метастазами: доклинические модели для улучшения HIPEC. Внутр. Дж. Фарм . 531, 143–152. DOI: 10.1016 / j.ijpharm.2017.07.084
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сэмюэл, Дж.Л., О’бойл, Д. А., Мазерс, В. Дж., И Фрост, А. Дж. (1980). Распространение сальмонелл в тушах нормального крупного рогатого скота при убое. Res. Вет. Sci . 28, 368–372.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Сансонетти, П. Дж., И Фалипон, А. (1999). М-клетки как порты входа для энтероинвазивных патогенов: механизмы взаимодействия, последствия для болезненного процесса. Семин. Иммунол . 11, 193–203. DOI: 10.1006 / smim.1999.0175
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сантос, Р.Л., Чжан, С., Цолис, Р. М., Кингсли, Р. А., Адамс, Л. Г., и Боймлер, А. Дж. (2001). Животные модели инфекций сальмонеллы: энтерит против брюшного тифа. Микробы заражают . 3, 1335–1344. DOI: 10.1016 / S1286-4579 (01) 01495-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сато, Т., и Клеверс, Х. (2013). Выращивание самоорганизующихся мини-кишок из одной стволовой клетки кишечника: механизм и применение. Наука 340, 1190–1194. DOI: 10.1126 / наука. 1234852
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сато Т., Станге Д. Э., Ферранте М., Фрис Р. Г., Ван Эс Дж. Х., Ван ден Бринк С. и др. (2011). Длительное распространение эпителиальных органоидов из толстой кишки, аденомы, аденокарциномы и эпителия Барретта человека. Гастроэнтерология 141, 1762–1772. DOI: 10.1053 / j.gastro.2011.07.050
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сато, Т., Фрис, Р.Г., Снипперт, Х. Дж., Ван Де Ветеринг, М., Баркер, Н., Штанге, Д. Э. и др. (2009). Единичные стволовые клетки Lgr5 строят структуры крипта-ворсинки in vitro без мезенхимальной ниши. Природа 459, 262–265. DOI: 10.1038 / nature07935
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Saxena, K., Blutt, S.E., Ettayebi, K., Zeng, X. L., Broughman, J. R., Crawford, S. E., et al. (2015). Кишечные энтероиды человека: новая модель для изучения ротавирусной инфекции человека, ограничения хозяина и патофизиологии. Дж. Вирол . 90, 43–56. DOI: 10.1128 / JVI.01930-15
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Scanu, T., Spaapen, R.M., Bakker, J.M., Pratap, C.B., Wu, L.E., Hofland, I., et al. (2015). Манипуляции сальмонеллами сигнальных путей хозяина провоцируют клеточную трансформацию, связанную с карциномой желчного пузыря. Cell Host Microbe 17, 763–774. DOI: 10.1016 / j.chom.2015.05.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ши, Дж.E., Beuzon, C.R., Gleeson, C., Mundy, R., and Holden, D. W. (1999). Влияние системы секреции острова 2 типа III патогенности Salmonella typhimurium на рост бактерий у мышей. Заражение. Иммун . 67, 213–219.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Shea, J. E., Hensel, M., Gleeson, C., and Holden, D. W. (1996). Идентификация локуса вирулентности, кодирующего систему секреции второго типа III у Salmonella typhimurium. Proc. Natl. Акад. Sci. U.S.A . 93, 2593–2597. DOI: 10.1073 / pnas.93.6.2593
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Стелцнер М., Хельмрат М., Данн Дж. К., Хеннинг С. Дж., Хоучен К. В., Куо К. и др. (2012). Номенклатура кишечных культур in vitro . г. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol . 302, G1359 – G1363. DOI: 10.1152 / ajpgi.00493.2011
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Такеучи, А.(1967). Электронно-микроскопические исследования экспериментальной сальмонеллезной инфекции. I. Проникновение Salmonella typhimurium в эпителий кишечника. г. Дж. Патол . 50, 109–136.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Tang, H.J., Chen, C.C., Zhang, C.C., Cheng, K.C., Chiang, S.R., Chiu, Y.H., et al. (2012). Использование карбапенемов против клинических, нетифозных изолятов Salmonella: результаты исследований in vitro и in vivo исследований на животных. Антимикробный.Агенты Chemother . 56, 2916–2922. DOI: 10.1128 / AAC.00110-12
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Цилингири, К., Барбоса, Т., Пенна, Г., Каприоли, Ф., Сонцони, А., Виале, Г. и др. (2012). Пробиотическая и постбиотическая активность в отношении здоровья и болезней: сравнение на новой поляризованной модели культуры органов ex-vivo . Кишечник 61, 1007–1015. DOI: 10.1136 / gutjnl-2011-300971
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Цолис, Р.М., Адамс, Л. Г., Фихт, Т. А., и Боймлер, А. Дж. (1999). Вклад факторов вирулентности Salmonella typhimurium в развитие диарейных заболеваний у телят. Заражение. Иммун . 67, 4879–4885.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Цолис, Р. М., Адамс, Л. Г., Хантман, М. Дж., Шерер, К. А., Кимбро, Т., Кингсли, Р. А., и др. (2000). SspA необходим для смертельной инфекции Salmonella enterica serovar Typhimurium у телят, но не является существенным при диарее. Заражение. Иммун . 68, 3158–3163. DOI: 10.1128 / IAI.68.6.3158-3163.2000
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Van Den Brink, G. R., and Heijmans, J. (2015). Протокол лентивирусной трансдукции и последующего анализа органоидов кишечника. J. Vis. Exp. e52531. DOI: 10.3791 / 52531
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Васкес-Торрес, А., Сюй, Ю., Джонс-Карсон, Дж., Холден, Д. У., Люсия, С. М., Динауэр, М. К. и др. (2000). Остров патогенности сальмонелл 2-зависимое уклонение фагоцитов от НАДФН-оксидазы. Наука 287, 1655–1658. DOI: 10.1126 / science.287.5458.1655
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уоллис, Т. С., Паулин, С. М., Плестед, Дж. С., Уотсон, П. Р. и Джонс, П. В. (1995). Плазмида вирулентности Salmonella dublin опосредует системные, но не кишечные фазы сальмонеллеза у крупного рогатого скота. Заражение. Иммун . 63, 2755–2761.
Google Scholar
Wang, Y., Disalvo, M., Gunasekara, D. B., Dutton, J., Proctor, A., Lebhar, M. S., et al. (2017). Самовосстанавливающийся монослой первичных эпителиальных клеток толстой или прямой кишки. Ячейка. Мол. Гастроэнтерол. Гепатол. 4, 165–182.e167. DOI: 10.1016 / j.jcmgh.2017.02.011
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уотсон, П. Р., Галев, Э. Э., Паулин, С. М., Джонс, П. В., и Уоллис, Т. С. (1998).Мутация invH, но не stn, снижает энтерит, вызванный сальмонеллой, у крупного рогатого скота. Заражение. Иммун . 66, 1432–1438.
Google Scholar
Уилсон, С.С., Бромм, Б.А., Холли, М.К., Винс, М.Э., Гоундер, А.П., Сул, Ю., и др. (2017). Альфа-дефенсин-зависимое усиление кишечной вирусной инфекции. PLoS Pathog . 13: e1006446. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1006446
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Уилсон, С.С., Токчи, А., Холли, М. К., Паркс, В. К., и Смит, Дж. Г. (2015). Органоидная модель тонкого кишечника неинвазивных взаимодействий кишечных патогенов и эпителиальных клеток. Слизистая. Иммунол. 8, 352–361. DOI: 10,1038 / mi.2014.72
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вонг, К. К., Макклелланд, М., Стиллвелл, Л. К., Сиск, Е. К., Терстон, С. Дж., И Саффер, Дж. Д. (1998). Идентификация и анализ последовательности хромосомного фрагмента размером 27 килобаз, содержащего остров патогенности Salmonella, расположенный на 92 минуте на карте хромосом Salmonella enterica serovar typhimurium LT2. Заражение. Иммун . 66, 3365–3371.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Вуд, М. В., Джонс, М. А., Уотсон, П. Р., Хеджес, С., Уоллис, Т. С., и Галев, Э. Э. (1998). Идентификация острова патогенности, необходимого для энтеропатогенности сальмонелл. Мол. Микробиол . 29, 883–891. DOI: 10.1046 / j.1365-2958.1998.00984.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рэй, К., и Сойка, В. Дж. (1978). Экспериментальная инфекция телят сальмонеллой тифимуриум. Res. Вет. Sci . 25, 139–143.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Инь, X., Фарин, Х.Ф., Ван Эс, Дж. Х., Кливерс, Х., Лангер, Р., и Карп, Дж. М. (2014). Независимые от ниши высокочистые культуры кишечных стволовых клеток Lgr5 + и их потомства. Nat. Методы 11, 106–112. DOI: 10.1038 / nmeth.2737
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Инь, Ю., Бийвелдс, М., Данг, В., Сюй, Л., Ван дер Эйк, А.А., Книппинг, К., и другие. (2015). Моделирование ротавирусной инфекции и противовирусная терапия с использованием первичных кишечных органоидов. Antiviral Res. 123, 120–131. DOI: 10.1016 / j.antiviral.2015.09.010
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Инь, Ю., Данг, В., Чжоу, X., Сюй, Л., Ван, В., Цао, В. и др. (2017). Ось PI3K-Akt-mTOR поддерживает ротавирусную инфекцию через 4E-BP1-опосредованный путь аутофагии и представляет собой противовирусную мишень. Virulence 9, 83–98. DOI: 10.1080 / 21505594.2017.1326443
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Yin, Y., Wang, Y., Dang, W., Xu, L., Su, J., Zhou, X., et al. (2016). Микофеноловая кислота эффективно подавляет ротавирусную инфекцию, создавая высокий барьер для развития резистентности. Противовирусное средство . 133, 41–49. DOI: 10.1016 / j.antiviral.2016.07.017
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zachos, N.C., Ковбаснюк, O., Foulke-Abel, J., In, J., Blutt, S.E., De Jonge, H.R., et al. (2016). Энтероиды / колоноиды человека и органоиды кишечника функционально повторяют нормальную физиологию и патофизиологию кишечника. J. Biol. Chem . 291, 3759–3766. DOI: 10.1074 / jbc.R114.635995
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zhang, K., Dupont, A., Torow, N., Gohde, F., Leschner, S., Lienenklaus, S., et al. (2014). Зависимая от возраста инвазия энтероцитов и формирование микроколоний сальмонеллами. PLoS Pathog .10: e1004385. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1004385
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чжан Ю. Г., Ву С., Ся Ю. и Сунь Дж. (2014). Система культивирования кишечных органоидов, инфицированных сальмонеллой, полученных из крипт, для взаимодействия между хозяином и бактериями. Physiol. Реп. 2: e12147. DOI: 10.14814 / phy2.12147
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чжоу Д. (2001). Коллективные усилия по модуляции актинового цитоскелета хозяина с помощью эффекторных белков, секретируемых сальмонеллами III типа. Trends Microbiol . 9, 567–569; обсуждение 569–570. DOI: 10.1016 / S0966-842X (01) 02227-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чжоу Д. (2006). «Бактериальная инвазия в нефагоцитарные клетки», в Molecular Paradigms of Infectious Disease , ред. К. А. Никерсон и М. Дж. Шурр (Нью-Йорк, Нью-Йорк: Springer Ecience + Business Media, LLC), 247–273.
Google Scholar
Чжоу Д. и Галан Дж. (2001). Проникновение сальмонелл в клетки-хозяева: совместная работа эффекторных белков, секретируемых типом III. Микробы заражают . 3, 1293–1298. DOI: 10.1016 / S1286-4579 (01) 01489-7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Zhu, S., Ding, S., Wang, P., Wei, Z., Pan, W., Palm, N. W., et al. (2017). Инфламмасома Nlrp9b ограничивает ротавирусную инфекцию в эпителиальных клетках кишечника. Природа 546, 667–670. DOI: 10.1038 / nature22967
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Цирлер М. К. и Галан Дж. Э. (1995).Контакт с культивируемыми эпителиальными клетками стимулирует секрецию белка инвазии сальмонеллы тифимуриум InvJ. Заражение. Иммун . 63, 4024–4028.
PubMed Аннотация | Google Scholar
Zou, W. Y., Blutt, S. E., Crawford, S. E., Ettayebi, K., Zeng, X. L., Saxena, K., et al. (2017). Кишечные энтероиды человека: новые модели для изучения желудочно-кишечных вирусных инфекций. Methods Mol. Биол. дой: 10.1007 / 7651_2017_1. [Epub перед печатью].
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
A Метаболит, продуцируемый кишечным комменсалом, обеспечивает устойчивость к колонизации к инфекции сальмонеллы
Основные моменты
- •
Состав микробиоты хозяина контролирует кишечную инфекцию Salmonella инфекцию
- •
- 9000tero продуцирование бактерий устойчивость к Salmonella
- •
Пропионат ограничивает Рост Salmonella путем нарушения гомеостаза внутриклеточного pH
Резюме
Микробиота кишечника обеспечивает устойчивость к колонизации против патогенов, ограничивая распространение патогенов и их распространение.Эти опосредованные микробиотой механизмы были ранее идентифицированы путем наблюдения потери устойчивости к колонизации после лечения антибиотиками или изменений в питании, которые серьезно нарушают сообщества микробиоты. Мы идентифицируем опосредованный микробиотой механизм устойчивости к колонизации против Salmonella enterica серовара Typhimurium ( S . Typhimurium) путем сравнения комменсальных сообществ высокой сложности с различными уровнями устойчивости к колонизации. Использование инбредных линий мышей с разной динамикой заражения и S. Typhimurium кишечная нагрузка, мы демонстрируем, что виды Bacteroides опосредуют устойчивость к колонизации против S . Typhimurium путем производства пропионата короткоцепочечных жирных кислот. Пропионат напрямую подавляет рост патогена in vitro , нарушая гомеостаз внутриклеточного pH, а химическое повышение уровня пропионата в кишечнике защищает мышей от S. Typhimurium. Кроме того, введение чувствительных мышей Bacteroides , но не мутанта, продуцирующего пропионат, придает устойчивость к S .Тифимуриум. Эта работа обеспечивает механистическое понимание роли индивидуализированных микробных сообществ в изменчивости передачи патогенов от хозяина к хозяину.
Ключевые слова
устойчивость к колонизации
Salmonella
пропионат
Bacteroides
метаболизм
кишечник
короткоцепочечные жирные кислоты
внутриклеточные патогенетические статьи
0)
Просмотреть аннотацию
© 2018 Elsevier Inc.
Рекомендуемые статьи
Цитирующие статьи
Наличие Salmonella AvrA в колоректальной опухоли и ее предшественниках в кишечнике мышей и в образцах человека
ВВЕДЕНИЕ
Желудочно-кишечный тракт является естественной средой обитания для динамичного и высококонкурентного микробного сообщества, которое постоянно контактирует с эпителиальными клетками кишечника. Хотя все больше данных свидетельствует о потенциальной роли микробов в развитии колоректального рака [1, 2], доказательства, подтверждающие прямую связь кишечных бактерий со спорадическим колоректальным раком человека, все еще ограничены. Salmonella enterica — это грамотрицательный факультативный анаэроб и внутриклеточный патоген как для людей, так и для животных, представляющий серьезную проблему для общественного здравоохранения во всем мире. По оценкам, более 1 миллиона человек в США заражаются инфекцией Salmonella ежегодно как заболевание пищевого происхождения [3]. Сероэпидемиологические исследования показали, что инфекция, не связанная с брюшным тифом Salmonella , намного выше (~ 600 раз), чем сообщалось на самом деле [4], от 56 на 1000 человеко-лет в Финляндии до 547 в Польше [5] и возрастает с годами [6] ].Хорошо известно, что давняя инфекция Salmonella увеличивает риск рака желчного пузыря [7–9]. Однако доказательства, прямо подтверждающие связь между инфекцией Salmonella и колоректальным раком у людей, немногочисленны.
Общим аспектом рака, связанного с инфекцией, является индукция хронического воспаления, которое может способствовать повреждению ДНК, пролиферации и миграции клеток с помощью различных механизмов, включая эпигенетические модификации [10, 11].Многие патогены, такие как Salmonella , используют систему секреции третьего типа (T3SS) для введения многочисленных факторов вирулентности, которые вызывают сильные провоспалительные реакции [12]. В то время как большинство бактерий вызывают воспаление у хозяина, некоторые патогенные бактерии также развили способность сдерживать воспалительный ответ, чтобы создать подходящую нишу для их выживания и размножения в хозяине, не убивая хозяина или клетки хозяина, которые они инфицировали. AvrA, эффекторный белок T3SS из Salmonella enterica, играет решающую роль в возникновении хронической инфекции [13–15].AvrA представляет собой белок 33 кДа и близкий гомолог семейству ацетилтрансфераз, экспрессируемых несколькими кишечными патогенами, включая YopJ / P в Yersinia pseudotuberculosis и VopA в Vibrio parahemalyticus [15]. AvrA оказывает противовоспалительное действие за счет ингибирования путей NF-κB и JNK, что приводит к снижению секреции медиаторов воспаления [16]. Более того, это ингибирование JNK ведет к подавлению апоптоза, особенно в контексте провоспалительного энтеропатогенного сальмонеллеза [13-15], и, таким образом, к увеличению продолжительности внутриклеточного выживания бактерий.
Мы обнаружили, что Salmonella AvrA обладает деубиквитинирующими свойствами [12], что приводит к активации пути β-катенина. Последующие исследования с использованием мышиных моделей показали, что инфицирование AvrA-экспрессирующим Salmonella увеличивает экспрессию Wnt и общего β-катенина, транскрипционную активность Wnt / β-катенина и количество стволовых клеток и пролиферативных клеток в инфицированной слизистой оболочке кишечника, что подчеркивает роль AvrA для поддержания стволовых клеток [17].В модели рака толстой кишки канцероген азоксиметан (АОМ) / воспалительный агент декстран-сульфат натрия (DSS) [18] заболеваемость колоректальной опухолью действительно значительно увеличилась у мышей, инфицированных AvrA + Salmonella , по сравнению с мышами без бактериального зондирования или инфицированных AvrA — Salmonella [18]. В наших предыдущих исследованиях мы подтвердили хроническую колонизацию AvrA-экспрессирующей Salmonella , но мы не исследовали локализацию белка AvrA в инфицированном кишечнике и опухоли.
Насколько нам известно, наличие бактериальной вирулентности AvrA никогда не исследовалось в образцах человека. Основная цель этого исследования — продемонстрировать присутствие и внутриклеточную локализацию AvrA в воспаленной колоректальной опухоли и ее предшественниках как в экспериментальных моделях инфекции на животных, так и в клинических образцах человека. Второстепенные цели заключались в том, чтобы протестировать эффективность недавно разработанного серологического анализа AvrA и определить присутствие антитела против AvrA Salmonella в образцах сыворотки мышей с хронической инфекцией.Кроме того, мы проверили присутствие гена AvrA в образцах фекалий здоровых людей, чтобы продвинуть этиологические исследования Salmonella AvrA в человеческой популяции.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Обнаруживаемое антитело против AvrA в сыворотке мышей через 10 недель после инфицирования AvrA-положительным
Salmonella
Мы разработали метод ELISA для проверки наличия антител против AvrA у мышей после заражения Salmonella . Сначала для титрования тестировали комбинации различных разведений антигена и антител.Затем анализ был применен к сыворотке мышей из долгосрочной экспериментальной модели инфекции Salmonella (рис. 1). В этих экспериментах мы использовали антитело против AvrA в качестве положительного контроля и 1% BSA в качестве отрицательного контроля. Как показано на рисунке 1, мы смогли обнаружить значительное повышение уровня антител против AvrA в сыворотке крови мышей через 10 недель после инфицирования AvrA-позитивным Salmonella . Мы также могли видеть значительно увеличенное значение оптической плотности (OD) антитела против AvrA у мышей после 27 недель инфицирования в модели воспаления (рис. 1A).Используя образцы мышей, инфицированных Salmonella , в модели рака толстой кишки AOM / DSS [18], мы смогли обнаружить значительно высокое значение антител против AvrA в сыворотке мышей через 45 недель после заражения Salmonella (рис. 1B).
Рис. 1. Измерение с помощью ELISA анти-AvrA белка в сыворотке мышей. ( A ) Мышей инфицировали мутантными штаммами Salmonella PhoP C AvrA — / AvrA + через желудочный зонд. Уровень анти-AvrA в сыворотке измерялся через 1, 3, 10 и 27 недель после инфицирования.( B ) Белок анти-AvrA сыворотки мыши в модели рака толстой кишки. Антитела против AvrA в сыворотке измеряли у мышей AOM / DSS через 45 недель после инфицирования Salmonella . Мы использовали антитело против AvrA в качестве положительного контроля и 1% BSA в качестве отрицательного контроля. * P <0,05, ** P <0,01, n = 3, по тесту Стьюдента t .
Расположение AvrA в толстой кишке
Salmonella инфицированных мышей
Иммуногистохимия (IHC) была использована для изучения расположения AvrA в Salmonella ser.Энтеритиды инфицировали толстую кишку мыши после инфицирования через 8 часов и 4 дня. У нас есть образцы, инфицированные штаммами Salmonella с AvrA или без него. Результаты показали ядерное окрашивание AvrA (коричневый цвет) в эпителиальных клетках в S . Группа энтеритов дикого типа (рис. 2). В S было обнаружено сильное ядерное окрашивание многих эпителиальных клеток и некоторых субэпителиальных стром. Энтеритиды AvrA + группа. В свою очередь, в S не было обнаружено положительного окрашивания AvrA.Энтеритиды AvrA — / — группы (рисунок 2).
Рисунок 2: ИГХ окрашивания AvrA в кишечнике мыши, инфицированной Salmonella Enteritidis. Мышей инфицировали диким типом Salmonella Enteritidis C50336, мутантом AvrA S.E-AvrA — и дополнительным штаммом S.E-AvrA + [43] через желудочный зонд. Иммуноокрашивание AvrA в ткани толстой кишки мыши через 8 часов и 4 дня после заражения Salmonella . n = 3 на группу.
В ободочной кишке мышей, хронически инфицированных Salmonella , мы смогли обнаружить положительное окрашивание на AvrA в ободочной кишке через 1, 3, 10 и 27 недель после инфицирования (рис. 3A).Эти данные указывают на стойкую экспрессию AvrA в толстой кишке, инфицированной Salmonella .
Рисунок 3: ИГХ окрашивания AvrA в кишечнике мыши с хронической инфекцией. ( A ) В толстой кишке мышей, синхронно инфицированных Salmonella , мы смогли обнаружить положительное окрашивание на AvrA в толстой кишке через 1, 3, 10 и 27 недель после инфицирования. Эти данные указывают на стойкую экспрессию AvrA в толстой кишке, инфицированной Salmonella . ( B ) AvrA в кишечнике мышей с хронической инфекцией и раком толстой кишки.Иммуноокрашивание AvrA в модели рака толстой кишки мыши с Salmonella , экспрессирующей AvrA, в модели рака толстой кишки у мышей. Шкала шкалы = 500 мкм. n = 3 на группу.
Присутствие AvrA в толстой кишке модели канцерогенеза у мышей с
Salmonella , экспрессирующим AvrA
В модели химического канцерогенеза AOM / DSS заболеваемость колоректальной опухолью действительно заметно увеличилась у AvrA + Salmonella мышей, не инфицированных мышами, по сравнению с мышами, не инфицированными Salmonella . бактериальный желудочный зонд или инфицированный AvrA — Salmonella [18].Мы обнаружили сильное ядерное окрашивание AvrA в толстой кишке с опухолью от мышей AOM + DSS + PhoP C AvrA — / AvrA + через 45 недель после инфицирования (фигура 3B). Напротив, экспрессия AvrA в опухолях от мышей, инфицированных группой AOM + DSS + PhoP C AvrA —, и мышей AOM + DSS без инфекции Salmonella отсутствует. Взятые вместе, мы подтвердили стойкое окрашивание AvrA в толстой кишке, инфицированной AvrA-экспрессирующими штаммами Salmonella (рис. 3B).
Экспрессия AvrA при воспалительных заболеваниях кишечника человека (ВЗК) и образцах толстой кишки
Затем мы исследовали присутствие белка AvrA в тканях опухоли ВЗК и колоректальной опухоли в клинических образцах человека. Мы обнаружили положительное окрашивание на AvrA, включая ядерное окрашивание на AvrA, в эпителиальных клетках кишечника пациентов с ВЗК (болезнь Крона и язвенный колит). Среди 27 основных категорий воспаления было только 6 официально диагностированных случаев ВЗК (5 болезнь Крона и 1 язвенный колит), остальные были обозначены как хроническое воспаление.Несмотря на это, эти ядра представляют инфильтрацию воспалительных клеток. Но у нас нет подробной информации о том, была ли ВЗК в активной стадии. Когда мы разделили эту группу на IBD и другое воспаление, средняя нормализованная оценка окрашивания AvrA была немного выше при IBD (2,26 ± 0,35SE), чем в других (1,91 ± 0,19SE), но разница не была статистически значимой.
Данные иммуногистохимии (ИГХ) нормальной слизистой оболочки человека и раковой ткани четко показывают плотное красное окрашивание AvrA в раковой ткани, включая ядра (рис. 4), тогда как окрашивание AvrA отрицательно в нормальной толстой кишке (низкая и высокая степень).
Фигура 4: ИГХ окрашивания AvrA в ткани человека при ВЗК и раке толстой кишки. Иммуноокрашивание AvrA в нормальной ткани человека, ткани опухоли IBD и толстой кишки. Шкала шкалы = 100 мкм.
Окрашивание AvrA в образцах ТМА человека
Три ТМА, выбранные для этого исследования, включали переменное количество гистологий колоректального рака в различных пропорциях, как показано в таблице 1. Примерно половина пациентов с уникальным колоректальным раком, разделенных на первичные опухоли ( n = 48), соседней нормальной слизистой ( n = 13) и метастазированных лимфатических узлов ( n = 14).Другая половина состояла из доброкачественных образований (34 аденомы и 27 воспалений) и нормальной слизистой оболочки без каких-либо колоректальных патологий ( n = 19). Как показано в таблице 2, после нормализации каждый массив показал идентичный средний балл окрашивания. По сравнению с нормальной слизистой оболочкой без какой-либо колоректальной патологии, прилегающая к раку слизистая оболочка имела статистически значимо более высокую среднюю нормализованную оценку окрашивания ( P = 0,018), в то время как сами первичные опухоли имели значительно более низкий средний балл ( P = 0.013). Доброкачественные новообразования и лимфатические узлы имели окраску, эквивалентную нормальной слизистой оболочке (таблица 3). Интересно, что мы также идентифицировали ядерное окрашивание AvrA в эпителиальных клетках кишечника пациентов с раком толстой кишки.
Таблица 1: Распределение колоректальных патологий ядер тканей, включенных в 3 тканевых микромассивы
Патология
ТМА слайды
-0459
-0458
CO809a-C051
BC05002a-E068
Всего
0003 Рак 9226
10
18
48
%
34.48
17,54
45,0
Метастаз узлов
N
03
9226 9226
03
03
%
13,79
0
15,0
Рак смежный
000 9223
4
13
%
15.52
0
10
Аденома
N
00 %
12,07
45,61
2,5
N
0004
N
9
27
%
17.24
21,05
12,5
Нормальная слизистая оболочка
N
4
4
%
6.9
15,79
15,0
Всего
003 9456 003 5 155
Таблица 2: Необработанные и нормализованные оценки окрашивания AvrA для трех слайдов ТМА
Имя ТМА
N 03 9456 03
Среднее значение 943 82
Медиана
Квартиль 1
Квартиль 3
CO803-036 945 945 945
CO803-036 945 945 .103
10,00
6,00
15,00
Нормализованное
1,771
00 CO809a-C051
57
Необработанный
2.158
1.00
0.00
2,00
Нормализованное
1,771
1,66
0,66
0,66
0000003 927300003003003 Необработанный
1,175
1,00
0,00
1,00
1 00063 03 Нормализованный
3 03 Нормализованный
3 03771
2,10
0,87
2,10
Таблица 3: Средние нормализованные баллы окрашивания по колоректальной патологии
000
1000000000000000000 00000 Нормализованное среднее значение боли
Стандартная ошибка
P -значения *
0 0 0 0 9226 922 0 0 0 1.372 0,125
0,0126
Метастаз узла
14
1,880
223
5
223
945 9223 9223 922 945 9223 9223 922
13
2,719
0,240
0,0177
Аденома
34
1.649
0,148
0,2070
Воспаление
27
1,988
0,166
0003 9226
1,963
0,198
—
- 2.
* Отличие от нормальной слизистой оболочки
Присутствие гена AvrA в RNA здоровых людей в образцах кала человека
Всего обнаружено небольшое разнообразие бактерий. 24 образца фекалий человека, но, как показано на рисунке 5, относительное количество сальмонелл составляет , по оценке Salmonella 16S-23S внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) по сравнению с универсальной бактериальной 16S РНК, заметно варьировалось от образца к образцу.Все эти образцы, за исключением трех (черные / темные полосы, № 18, 21 и 24), также показали амплификацию для Salmonella AvrA. Эти данные согласуются с высокой распространенностью антител против флагеллина Salmonella , обнаруженных в популяции столичного Детройта [19].
Рисунок 5: Амплификация Salmonella AvrA в образцах фекалий человека. Образцы ДНК человека ( n = 24) амплифицировали с помощью ПЦР в реальном времени. Были применены праймеры для универсальных бактериальных 16sРНК, Salmonella 16S-23S внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS), а также Salmonella AvrA.Мы обнаружили небольшие вариации в общей бактериальной 16S РНК, относительное количество Salmonella , оцененное ITS по универсальной бактериальной 16S РНК, заметно варьировалось от образца к образцу. Все эти образцы, за исключением трех (черные / темные полосы), также показали амплификацию Salmonella AvrA.
ОБСУЖДЕНИЕ
В нашем текущем исследовании мы впервые продемонстрировали присутствие белка Salmonella AvrA в слизистой оболочке толстой кишки мышей с экспериментальной инфекцией и клинических образцах человека.Кроме того, мы показали обнаруживаемое анти-AvrA-антитело в сыворотке мышей после инфицирования Salmonella с помощью ELISA. Используя ИГХ, мы обнаружили распределение AvrA в толстой кишке инфицированных Salmonella мышей и у инфицированных Salmonella мышей с раком толстой кишки. Кроме того, мы сообщили о присутствии белка AvrA при воспалительном заболевании кишечника и ткани колоректальной опухоли в клинических образцах человека. Образцы фекалий человека показали амплификацию Salmonella AvrA. Наше исследование предполагает новую роль бактериального белка, связанного с раком толстой кишки.
Наши данные ИГХ анти-AvrA показали, что AvrA чаще обнаруживается в прилегающих слизистых оболочках, чем в первичных опухолях. Не обязательно неожиданно, что патогены реже обнаруживаются в раковой ткани, чем в соседней нормальной слизистой оболочке. Присутствие бактерий может больше не быть необходимым после активации канцерогенных путей, как это видно в случае рака желудка, где H Pylori реже обнаруживается в запущенных предраковых поражениях, чем в менее запущенных [20]. Кроме того, изменение гликозилирования клеточной поверхности часто обнаруживается при различных формах рака [21], а также влияет на микробный состав кишечника [22].Недавно фермент, катализирующий гликозилирование, B4GALNT2, был связан с повышенной восприимчивостью к инфекции Salmonella [23], в то время как его экспрессия, как сообщается, подавляется при раке толстой кишки по сравнению с нормальной слизистой оболочкой [24]. Эти данные хорошо подтверждают наше наблюдение, что больше AvrA обнаруживается в прилегающей слизистой оболочке, чем в первичных опухолях.
Ген AvrA присутствует в большинстве изолятов Salmonella enterica, полученных от людей и животных. Это особенно характерно для нетифоидной Salmonella , поскольку сообщалось, что ее ген распространенности составляет 98–100% (514/523 и 185/185) [25, 26], тогда как у штаммов брюшного тифа он отсутствует.Напротив, известно, что экспрессия белка AvrA заметно варьируется в зависимости от клинических проявлений. Белок AvrA не часто продуцируется клиническими изолятами от системного заболевания, но часто обнаруживается в изолятах от ограниченного энтерита [27]. Наши данные о наличии AvrA в толстой кишке хронически инфицированных мышей указывают на постоянную функцию бактериальных белков в организме хозяина. Теперь ясно, что экспрессия AvrA регулируется посттранскрипционным образом и что транскрипция мРНК происходит конститутивно во всех AvrA-положительных штаммах [28], поскольку AvrA остается молчаливым при клонировании в E.coli [29]. Фактически, ряд протеобактериальных патогенов развили глобальные системы регуляции посттранскрипционной экспрессии генов для их различных факторов вирулентности, чтобы реагировать на изменения в окружающей среде и процветать в специализированных нишах хозяина, а Salmonella enterica оснащена Csr (регулятором накопления углерода). ) система, состоящая из малого РНК-связывающего белка (CrsA) и некодирующих РНК (CsrB / CsrC) [30]. Связывание CsrA с 5′-нетранслируемыми и / или ранними кодирующими областями мРНК изменяет трансляцию, оборот и / или удлинение транскрипта мРНК, что приводит либо к распаду, либо к стабилизации конкретных мишеней мРНК, в то время как CsrB / CsrC, содержащие несколько сайтов связывания CsrA, связываются и секвестрируют CsrA. , тем самым противодействуя активности CsrA [30, 31].Kerrinnes et al. [28] продемонстрировал, что избыточная экспрессия CsrA или CsrB останавливает экспрессию AvrA, но что конституциональная экспрессия CsrA необходима для экспрессии AvrA. Этот посттранскрипционный контроль AvrA подчеркивает необходимость изучения уровней его белка, а не уровней нуклеиновых кислот.
Расположение AvrA показано как в цитозоле, так и в ядрах. Предыдущие исследования обнаружили деубиквитиназные и ацетилтрансферазные свойства AvrA, приводящие к усилению регуляции пути передачи сигналов бета-катенина и модификации активности р53 [14, 15, 18], которые имеют решающее значение для инициации и прогрессирования колоректального рака.Убиквитинирование и деубиквитинирование фактически являются основными мишенями-хозяевами онковирусов человека, включая HPV, KSHV, EBV, HTLV1 и аденовирус [32]. Известные мишени-хозяева для AvrA O (треонин) — и N и (лизин) -ацетилирование включают MAPKK [13] и p53 [12, 33]. Ацетилирование критических аминокислотных остатков в MAPKK блокирует активность фосфорилирования MAPKK, таким образом подавляя нижестоящую N-концевую киназу c-Jun и сигнальные пути NF-κB [12]. Это, в свою очередь, может компенсировано активировать передачу сигналов STAT3 и воспаление, как показано на мышиной модели индуцированного AvrA колоректального канцерогенеза [34].С другой стороны, было показано, что ацетилирование р53 увеличивает его стабильность и транскрипционную активность [35]. Отдельно от роли эффектора AvrA в эпителиальных клетках кишечника, Salmonella SopB, другой эффектор с того же острова патогенности, трансформирует примированные эпителиальные клетки в М-клетки, способствуя колонизации и инвазии хозяина [36] Аутокринная активация RelB-экспрессирующих энтероцитов FAE с помощью активированного RANKL / RANK дополнительно направляет ЕМТ-регулирующий Slug фактора транскрипции, который отмечает трансдифференцировку эпителия в М-клетки.Основываясь на этих наблюдениях и наших текущих данных, AvrA может играть новую роль посредством посттрансляционных модификаций, связанных с раком толстой кишки. До сих пор неизвестно, как AvrA перемещается к ядрам и взаимодействует с генами / белками хозяина.
Ранее мы сообщали, что уровень антител против Salmonella flagellin был выше при колоректальном раке и предраковых заболеваниях, чем в контрольной группе в двух разных популяциях в США и Нидерландах, и что курение и потребление пищи (например, железа) являются одним из посредников. факторы, предполагающие возможную связь Salmonella с колоректальным раком [19].Тем не менее, информация о частотах устойчивой инфекции Salmonella после первоначального заражения в популяции все еще ограничена. Неясно, как AvrA играет свою роль в раке толстой кишки человека. В нашем предыдущем исследовании мы обнаружили, что AvrA может активировать путь бета-катенина в раковых клетках толстой кишки человека, таких как Caco2-BBE и HCT 116 [12, 14]. Наши неопубликованные данные также указывают на перекрытие ядерного окрашивания AvrA и β-катенина в образцах рака толстой кишки человека. Мы исследуем, использует ли бактериальный AvrA посттрансляционную модификацию основных белков, таких как β-катенин, в онкогенных путях, чтобы способствовать пролиферации клеток и колоректальному онкогенезу, в будущих исследованиях.
Насколько нам известно, это первое сообщение о присутствии белка AvrA Salmonella в образцах тканей человека, а также о том, что антитела против AvrA фактически обнаруживаются у инфицированных хозяев. Последнее открытие подтолкнет к исследованиям, чтобы выяснить, имеют ли люди, инфицированные AvrA-экспрессирующей Salmonella повышенный риск развития колоректального рака, с использованием преддиагностических сывороток из предполагаемых когорт.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы человека
Образцы ДНК человека, использованные для этого исследования, были частью деидентифицированных образцов из предыдущего исследования, в котором образцы стула были собраны в РНК позже у добровольцев, не страдающих раком, в столичном Детройте. Подробности, касающиеся исходного исследования, были опубликованы в другом месте [37-40]. Микроматрицы тканей человека (ТМА), использованные в нашем исследовании, были приобретены в US Biomax, Inc. (Biomax, Derwood, MD) и окрашены, как описано ранее [14, 18, 41, 42].
Животные и этическое положение
Мыши C57BL / 6 (самки, возраст 6–8 недель) были получены из лаборатории Джексона (лаборатория Джексона, Бар-Харбор, штат Мэн, США). Все работы с животными были одобрены Университетом Рочестера и Университетом Иллинойса в Чикагском комитете по животным ресурсам. Эвтаназию выполняли внутривенно пентобарбиталом натрия (100 мг на кг массы тела) с последующим смещением шейки матки. Все методы были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами комитетов по животным ресурсам.
Бактериальные штаммы и условия роста
Штаммы Salmonella , использованные в этом исследовании, включали мутантных штаммов Salmonella PhoP C AvrA — / AvrA + , мутантных Salmonella CA Enteritidis дикого типа AvrA — и дополнительный штамм SE-AvrA + (таблица 4 [43]). Бактериальные культуры получали инокуляцией 10 мл бульона Луриа-Бертани 0,01 мл культуры в стационарной фазе с последующей инкубацией в течение ночи (> 18 ч) при 37 ° C, как описано ранее [41, 44].
Таблица 4: штаммов Salmonella , использованных в данном исследовании
Штаммы | Характеристики | 000 00000 2 9226 9226 9226 9226 9226 | Salmonella Enteritidis дикого типа CMCC (B) 50336 [43] S.E- AvrA — C50336 AvrA-дефицитный мутант [43] SE- AvrA + Avr63-B-мутант C50336-мутант с дефицитом p2273 [43] PhoP C Непатогенный мутант-регулятор комплекса, полученный из дикого типа SL14028 [18, 41] 9226 945 — AvrA — мутация, полученная из PhoP C [18, 41] PhoP C AvrA r — 00 AvrA r — 9656 9 AvrA r — PhoP C AvrA — с комплементарной плазмидой, кодирующей AvrA [18, 41] |
|---|
ПЦР в реальном времени бактерий 16sRNA и
Salmonella
ПЦР в реальном времени была использована для амплификации универсальных бактериальных 16sRNA, Salmonella 16S-23S внутреннего транскрибируемого спейсера, а также Salmonella AvrA.Тотальную ДНК экстрагировали из человеческого фекального набора Qiagen Stool Kit (Qiagen, Hilden, Германия, а затем ДНК подвергали ПЦР в реальном времени (набор SYBR Green PCR, BioRad) с праймерами (Таблица 5). Процент экспрессии рассчитывали как отношение нормализованное значение каждого образца относительно соответствующей контрольной группы.Все реакции ПЦР в реальном времени проводили в трех экземплярах.
Таблица 5: Праймеры для ПЦР в реальном времени
Имя | последовательность 5 ‘- 3 ‘ |
|---|---|
Univ бактерии 16s F | TCCTACGGGAGGCAGCAGT |
Univ бактерии 16s R | GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT |
Salmonella ITS F | TATGCCCCATCGTGTAGTCAGAAC |
Salmonella ЕЕ R | TGCGGCTGGATCACCTCCTT |
сальмонеллы AVRA F | GAATGGAAGGCGTTGAATCTGC |
сальмонеллы AVRA R | GTTGTGCGCCTTGAGTATGTTTGTAA |
сальмонеллы — Модель инфицированных мышей
Эксперименты на животных проводили с использованием свободных от специфических патогенов самок мышей C57BL / 6.Воду и пищу удаляли за 4 часа до перорального введения через зонд 7,5 мг / мышь стрептомицина (100 мл стерильного раствора). После этого животным давали воду и корм ad libitum. Через двадцать часов после обработки стрептомицином воду и корм снова забирали на 4 часа, прежде чем мышей инфицировали 1 × 10 6 колониеобразующих единиц Salmonella (100-миллилитровая суспензия в HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнка) или обработали со стерильным HBSS (контроль) через желудочный зонд, как описано ранее [41, 44].После введения Salmonella через желудочный зонд образцы ткани собирали через 8 часов и 4 дня для краткосрочной модели и через 1, 3, 10, 27 недель для Salmonella -синхронно инфицированной модели.
Модель мышей, инфицированных Salmonella раком толстой кишки
Эксперименты на животных проводились с использованием конкретных свободных от патогенов самок мышей C57BL / 6 (Taconic) в возрасте 6-7 недель, как описано ранее [45] Вода и еда были изъяты ч перед пероральным зондом с 7,5 мг / мышь стрептомицина (100 мкл стерильного раствора).После этого животным давали воду и корм ad libitum . Через двадцать часов после обработки стрептомицином воду и корм снова забирали на четыре часа, прежде чем мышей инфицировали 1 × 10 6 КОЕ S. typhimurium (100 мкл суспензии в HBSS) или обработали стерильным HBSS (контроль). через желудочный зонд, как описано ранее. [46] После Salmonella через зонд вводили AOM / DSS следующим образом: азоксиметан (AOM), 10 мг / кг массы тела, внутрибрюшинная инъекция, 1% декстрансульфат натрия (DSS) в питьевой воде .Через 45 недель после заражения Salmonella были взяты образцы тканей.
Иммуногистохимия
Кишечные ткани были недавно собраны и залиты парафиновым воском после фиксации 10% нейтральным забуференным формалином. Иммуногистохимию проводили на залитых парафином срезах (4 мкм) толстой кишки. После подготовки слайдов, как описано ранее [14, 18, 41, 42], слайды инкубировали в 3% перекиси водорода в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы заблокировать активность эндогенной пероксидазы, с последующей инкубацией в течение 60 минут в 2% BSA в PBS, чтобы уменьшить неспецифический фон.Срезы инкубировали с антителом против AvrA при 4 ° C в течение ночи. Затем образцы инкубировали с козьими антителами против кроликов (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) в течение 1 часа при комнатной температуре. Антитело против AvrA было изготовлено на заказ, как описано ранее) [33].
Salmonella анти-AvrA-антитело иммуноферментный анализ
Salmonella AvrA-антитело в сыворотке мышей измеряли с использованием иммуноферментного иммуноферментного анализа AvrA-антитела.96-луночный планшет покрывали белком AvrA (1 мкг / мл) 4 — в течение ночи. Белок Salmonella AvrA был очищен в лаборатории Sun lab [33]. Покрытый планшет блокировали 1% BSA 4 ° в течение ночи. Мышиную сыворотку (100 мкл на лунку, разведение 1: 5) добавляли в лунку на 2 ч в инкубаторе 37 ° . После полной промывки добавьте 1: 300 разведенных HRP-конъюгированных козьих антимышиных антител (Bio-rad, Hercules, CA) в каждую лунку на 1 час в 37 ° . После полной промывки добавляли субстрат пероксидазы KPL SureBlue.Измерьте оптическую плотность каждой лунки при 450 нм. Мы использовали антитело против AvrA (1: 100 и 1: 1000) в качестве положительного контроля и 1% BSA в качестве отрицательного контроля. Антитело против AvrA было изготовлено на заказ и использовалось в наших предыдущих исследованиях для вестерн-блоттинга [47]. Пептид из 15 аминокислот [36] CGEEPFLPSDKADRY был разработан на основе последовательности AvrA aa № 216–230 (номер доступа в GenBank AE008830).
Статистический анализ
Обычно описательная статистика для непрерывных переменных выражалась как среднее ± стандартное отклонение (SD), категориальные переменные представлялись как частота и пропорция.Для оценок окрашивания AvrA сообщалось среднее значение, медиана и квартиль. Все статистические тесты были двусторонними. P Значения 0,05 или меньше считались статистически значимыми.
Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение в анализе ELISA (рис. 1). Различия между Salmonella и контрольными группами были проанализированы с помощью теста Стьюдента t с GraphPad Prism 5.
Оценки TMA были выполнены одним хорошо обученным ветеринарным патологом, имеющим более 30 лет опытаМаартен Босланд, профессор кафедры патологии UIC). ИГХ окрашивания AvrA первоначально оценивали как произведение интенсивности окрашивания (0, 1, 2, 3, 4 = отсутствие окрашивания, минимальная, слабая, умеренная, заметная интенсивность) и процента окрашенных клеток (1, 2, 3, 4, 5 = несколько разбросанных (случайные клетки), несколько разбросанных клеток, очаговые (одна или несколько областей или клеток), многоочаговые (несколько областей клеток), диффузные (большинство клеток), в диапазоне от 0 до 20. Из 168 оцененных ядер на трех слайдах ТМА гиперплазия ( n = 8) была исключена из-за слишком малого размера выборки в качестве единой диагностической категории.Далее мы взяли только одно из ядер с наивысшим баллом окрашивания для 5 парных образцов, полученных от одних и тех же пациентов, присутствующих на одних и тех же слайдах ТМА. В результате окончательная аналитическая проба состояла из 155 уникальных кернов. Сопоставление результатов трех слайдов ТМА выявило существенную вариабельность окраски между слайдами, в частности, гораздо более сильное окрашивание на 1-м слайде, гораздо более слабое на 2-м и даже более слабое на 3-м. Таким образом, чтобы объединить результаты трех слайдов ТМА, мы рассчитали нормализованные баллы окрашивания на основе относительного ранжирования окрашивания отдельных ядер внутри каждого слайда с использованием метода, описанного Бломом [48], который генерирует нормализованные баллы с центром на 0.Чтобы сделать все оценки положительными, каждый балл добавлялся к самому низкому баллу среди всех TMA. В результате окончательные нормализованные баллы варьировались от 0 до 4. Эти результаты были обобщены в таблице 2. Затем был использован дисперсионный анализ для проверки различий в средних нормализованных баллах по 5 различным колоректальным патологиям (воспаление, аденома, рак смежной слизистой оболочки, колоректальный рак и метастазирующие лимфатические узлы) из нормальной слизистой оболочки. Статистический анализ проводился с помощью SAS версии 9.4 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США).
Вклад авторов
Ронг Лу и Юнго Чжан: проектировать и проводить эксперименты, готовить рисунки, интерпретировать данные, а также готовить и редактировать рукопись. Маартен Босланд: IHC и патологический анализ, интерпретация данных и редакция рукописи. Инлинь Ся: Статистический анализ, интерпретация данных, подготовка и проверка рукописи. Икуко Като: Концепция исследования, сбор образцов, статистический анализ, интерпретация данных, а также подготовка и пересмотр рукописи.Джун Сун: Концепция и дизайн исследования, интерпретация данных, написание и редактирование рукописи, получение средств для поддержки исследования.
БЛАГОДАРНОСТЬ И ФИНАНСИРОВАНИЕ
Мы хотели бы поблагодарить Национальный институт здоровья / NIDDK за грант R01 DK105118 Джун Сун и онкологический центр UIC за поддержку ее исследований.
КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ
Конфликтов интересов нет.
ССЫЛКИ
1. Joossens M, Huys G, Cnockaert M, De Preter V, Verbeke K, Rutgeerts P, Vandamme P, Vermeire S.Дисбиоз фекальной микробиоты у пациентов с болезнью Крона и их здоровых родственников. Кишечник. 2011; 60: 631–7. https://doi.org/10.1136/gut.2010.223263.
2. Марчези Дж. Р., Дутиль Б. Е., Холл Н., Питерс У. С., Рулофс Р., Болей А., Тьялсма Х. К микробиому колоректального рака человека. PLoS ONE. 2011; 6: e20447. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020447.
3. Цианфлон NFC. Сальмонеллез и желудочно-кишечный тракт: больше, чем просто арахисовое масло. Текущие отчеты гастроэнтерологии.2008; 10: 424–31.
4. Kuhn KG, Falkenhorst G, Ceper TH, Dalby T., Ethelberg S, Molbak K, Krogfelt KA. Выявление нетифоидной сальмонеллы у людей с помощью ELISA: обзор литературы. J Med Microbiol. 2012; 61: 1–7. https://doi.org/10.1099/jmm.0.034447-0.
5. Falkenhorst G, Simonsen J, Ceper TH, van Pelt W, de Valk H, Sadkowska-Todys M, Zota L, Kuusi M, Jernberg C, Rota MC, van Duynhoven YT, Teunis PF, Krogfelt KA, Mølbak K Серологические кросс-секционные исследования заболеваемости сальмонеллой в восьми европейских странах: нет корреляции с заболеваемостью зарегистрированными случаями.BMC Public Health. 2012; 12: 523. https://doi.org/10.1186/1471-2458-12-523.
6. Симонсен Дж., Стрид М.А., Мёльбак К., Крогфельт К.А., Линнеберг А., Теунис П. Сероэпидемиология как инструмент для изучения заболеваемости сальмонеллами у людей. Эпидемиология и инфекция. 2008; 136: 895–902. https://doi.org/10.1017/S0
8807009314.
7. Гонсалес-Эскобедо Дж., Ла Перле К.М., Ганн Дж. С.. Гистопатологический анализ хронического носительства сальмонелл в гепатопанкреатобилиарной системе мышей. PLoS ONE.2013; 8: e84058. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0084058.
8. Gradel KO, Nielsen HL, Schonheyder HC, Ejlertsen T., Kristensen B, Nielsen H. Повышенный краткосрочный и долгосрочный риск воспалительного заболевания кишечника после гастроэнтерита, вызванного сальмонеллой или кампилобактерией. Гастроэнтерология. 2009; 137: 495–501. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2009.04.001.
9. Кумар С. Инфекция как фактор риска рака желчного пузыря. J Surg Oncol. 2006; 93: 633–9. https://doi.org/10.1002/jso.20530.
10.Купер Х., Адами Х.О., Трихопулос Д. Инфекции как основная предотвратимая причина рака человека. Журнал внутренней медицины. 2000; 248: 171–83. https://doi.org/10.1046/j.1365-2796.2000.00742.x.
11. Торговец JL. Воспаление, атрофия, рак желудка: соединение молекулярных точек. Гастроэнтерология. 2005; 129: 1079–82. http://dx.doi.org/10.1053/j.gastro.2005.07.038.
12. Сан Дж. Патогенные бактериальные белки и их противовоспалительные эффекты в эукариотическом хозяине. Противовоспалительные и противоаллергические средства в медицинской химии.2009; 8: 214–27. https://doi.org/10.2174/18715230978
86.
13. Джонс Р.М., Ву Х., Вентворт С., Луо Л., Кольер-Хьямс Л., Нейш А.С. Salmonella AvrA координирует подавление иммунной и апоптотической защиты хозяина посредством блокады пути JNK. Клеточный хозяин и микроб. 2008; 3: 233–44. http://dx.doi.org/10.1016/j.chom.2008.02.016.
14. Йе З, Петроф Э.О., Бун Д., Клауд Э.С., Сан Дж. Эффекторная регуляция AvrA сальмонеллы воспаления эпителиальных клеток толстой кишки путем деубиквитинирования. Am J Pathol.2007; 171: 882–92.
15. Ву Х, Джонс Р.М., Нейш А.С. Эффектор Salmonella AvrA обеспечивает выживание бактерий внутри клетки во время инфекции in vivo . Клеточная микробиология. 2012; 14: 28–39. https://doi.org/10.1111/j.1462-5822.2011.01694.x.
16. Лю Х, Лу Р., Ся Й, Ву С., Сан Дж. Эукариотические сигнальные пути, нацеленные на эффекторный белок сальмонелл AvrA при кишечной инфекции in vivo . BMC Microbiol. 2010; 10: 326. https://doi.org/10.1186/1471-2180-10-326.
17. Лю X, Лу Р., Ву С., Сан Дж. Регулирование сальмонеллой кишечных стволовых клеток через путь Wnt / β-катенин. Письма FEBS. 2010; 584: 911–6. http://dx.doi.org/10.1016/j.febslet.2010.01.024.
18. Лу Р, Ву С, Чжан Ю.Г., Ся И, Лю Х, Чжэн И, Чен Х, Шефер К.Л., Чжоу З., Биссоннетт М., Ли Л., Сан Дж. Энтеросолюбильный бактериальный белок AvrA способствует онкогенезу толстой кишки и активирует толстую кишку. сигнальный путь бета-катенина. Онкогенез. 2014; 3: e105. https://doi.org/10.1038/oncsis.2014.20.
19. Като И., Болей А., Кортман Г. А., Рулофс Р., Джурич З., Северсон Р. К., Тьялсма Х. Частичные ассоциации пищевого железа, курения и кишечных бактерий с риском колоректального рака. Nutr Cancer. 2013; 65: 169–77. https://doi.org/10.1080/01635581.2013.748922.
20. Муньос Н., Като И., Пераса С., Лопес Дж., Каррильо Е., Рамирес Х., Вивас Дж., Кастро Д., Санчес В., Андраде О, Буйатти Е., Оливер В. Распространенность предраковых поражений желудка в Венесуэле. Биомаркеры и профилактика эпидемиологии рака.1996; 5: 41–6.
21. Кристиансен М.Н., Чик Дж., Ли Л., Ануграхам М., Абрахамс Дж. Л., Пакер Н.Х. Гликозилирование белков клеточной поверхности при раке. Протеомика. 2014; 14: 525–46. https://doi.org/10.1002/pmic.201300387.
22. Штаубах Ф., Кунцель С., Бейнс А.С., Йи А., Макги Б.М., Бэкхед Ф., Бейнс Дж. Ф., Йонсен Дж. М.. Экспрессия гликозилтрансферазы B4galnt2, относящейся к группе крови, влияет на кишечную микробиоту мышей. ISME J. 2012; 6: 1345–55.
23. Рауш П., Штек Н., Суванди А., Зайдель Дж. А., Кюнцель С., Бхуллар К., Бейсик М., Блайх А., Йонсен Дж. М., Валланс Б. А., Бейнс Дж. Ф., Грассл Г. А..Экспрессия гена B4galnt2, относящегося к группе крови, изменяет восприимчивость к сальмонеллезной инфекции. PLoS Патогены. 2015; 11: e1005008. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005008.
24. Groux-Degroote S, Wavelet C, Krzewinski-Recchi MA, Portier L, Mortuaire M, Mihalache A, Trinchera M, Delannoy P, Malagolini N, Chiricolo M, Dall’Olio F, Harduin-Lepers A. B4GALNT2 ген Экспрессия контролирует биосинтез антигенов Sda и сиалил-Льюиса X в желудочно-кишечном тракте здорового и ракового человека.Международный журнал биохимии и клеточной биологии. 2014; 53: 442–9. http://dx.doi.org/10.1016/j.biocel.2014.06.009.
25. Huehn S, La Ragione RM, Anjum M, Saunders M, Woodward MJ, Bunge C, Helmuth R, Hauser E, Guerra B, Beutlich J, Brisabois A, Peters T., Svensson L, et al. Вирулотипирование и типирование устойчивости к противомикробным препаратам сероваров Salmonella enterica, имеющих отношение к здоровью человека в Европе. Пищевые патогены и болезни. 2009; 7: 523–35. https://doi.org/10.1089/fpd.2009.0447.
26. Prager R, Mirold S, Tietze E, Strutz U, Knüppel B, Rabsch W., Hardt WD, Tschäpe H. Распространенность и полиморфизм генов, кодирующих транслоцированные эффекторные белки, среди клинических изолятов Salmonella enterica. Международный журнал медицинской микробиологии. 2000; 290: 605–17. http://dx.doi.org/10.1016/S1438-4221(00)80009-0.
27. Streckel W, Wolff AC, Prager R, Tietze E, Tschäpe H. Профили экспрессии эффекторных белков SopB, SopD1, SopE1 и AvrA различаются в зависимости от системных, кишечных и эпидемических штаммов Salmonella enterica.Молекулярное питание и пищевые исследования. 2004; 48: 496–503. https://doi.org/10.1002/mnfr.200400035.
28. Kerrinnes T, Zelas ZBB, Streckel W, Faber F, Tietze E, Tschäpe H, Yaron S. CsrA и CsrB необходимы для посттранскрипционного контроля связанного с вирулентностью эффекторного белка AvrA Salmonella enterica. Международный журнал медицинской микробиологии. 2009; 299: 333–41. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijmm.2008.09.001.
29. Бен-Барак З., Штрекель В., Ярон С., Коэн С., Прагер Р., Чепе Х.Экспрессия гена эффекторного белка, ассоциированного с вирулентностью, avrA, зависит от регуляторной функции, специфичной для Salmonella enterica. Международный журнал медицинской микробиологии. 2006; 296: 25–38. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijmm.2005.08.004.
30. Тиммерманс Дж., Ван Мелдерен Л. Посттранскрипционная глобальная регуляция с помощью CsrA у бактерий. Клеточные и молекулярные науки о жизни. 2010; 67: 2897–908. https://doi.org/10.1007/s00018-010-0381-z.
31. Вакульскас CA, Potts AH, Babitzke P, Ahmer BMM, Romeo T.Регулирование бактериальной вирулентности с помощью систем Csr (Rsm). Обзоры микробиологии и молекулярной биологии. 2015; 79: 193–224. https://doi.org/10.1128/mmbr.00052-14.
32. Shackelford J, Pagano JS. Опухолевые вирусы и клеточные сигнальные пути: деубиквитинирование и убиквитинирование. Молекулярная и клеточная биология. 2004; 24: 5089–93. https://doi.org/10.1128/MCB.24.12.5089-5093.2004.
33. Wu S, Ye Z, Liu X, Zhao Y, Xia Y, Steiner A, Petrof EO, Claud EC, Sun J. Инфекция Salmonella typhimurium увеличивает ацетилирование p53 в эпителиальных клетках кишечника.Американский журнал физиологии. 2010; 298: G784 – G94. https://doi.org/10.1152/ajpgi.00526.2009.
34. Лу Р, Ву С., Чжан Ю.Г., Ся Й, Чжоу З., Като И., Донг Х., Биссоннетт М., Сунь Дж. Белок сальмонеллы AvrA активирует сигнальный путь STAT3 при раке толстой кишки. Неоплазия (Нью-Йорк, Нью-Йорк). 2016; 18: 307–16. https://doi.org/10.1016/j.neo.2016.04.001.
35. Reed SM, Quelle DE. p53 Ацетилирование: регулирование и последствия. Раки. 2015; 7: 30–69. https://doi.org/10.3390/cancers7010030.
36.Тахун А., Махаджан С., Пакстон Е., Мальтерер Дж., Дональдсон Д.С., Ван Д., Тан А., Гиллеспи Т.Л., О’Ши М., Роу А.Дж., Шоу Д.И., Галли Д.Л., Ленгелинг А. и др. Salmonella трансформирует эпителиальные клетки, связанные с фолликулами, в М-клетки, способствуя кишечной инвазии. Клеточный микроб-хозяин. 2012; 12: 645–56. https://doi.org/10.1016/j.chom.2012.10.009.
37. Yu YJ, Majumdar AP, Nechvatal JM, Ram JL, Basson MD, Heilbrun LK, Kato I. Отшелушенные клетки в стуле: источник для анализа биомаркеров рака желудочно-кишечного тракта на основе ПЦР с обратной транскрипцией.Биомаркеры эпидемиологии рака Пред. 2008; 17: 455–8. https://doi.org/10.1158/1055-9965.epi-07-2515.
38. Nechvatal JM, Ram JL, Basson MD, Namprachan P, Niec SR, Badsha KZ, Matherly LH, Majumdar AP, Kato I. Сбор фекалий, сохранение окружающей среды и экстракция ДНК для ПЦР-амплификации бактериальных и человеческих маркеров от человека. кал. J Microbiol Methods. 2008; 72: 124–32. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2007.11.007.
39. Като И., Бадша KZ, Лэнд С, Нечватал Дж. М., Матерли Л. Х., Тарка А. Л., Маджумдар А. П., Бассон М. Д., Рам Дж. Л..Маркеры ДНК / РНК для риска колоректального рака в консервированных образцах стула: пилотное исследование. Тумори. 2009; 95: 753–61.
40. Като И., Нечватал Дж. М., Дзинич С., Бассон М. Д., Маджумдар А. П., Рам Дж. Л.. Курение и другие личные характеристики как потенциальные предикторы популяций фекальных бактерий у людей. Med Sci Monit. 2010; 16: CR1–7.
41. Лу Р., Лю X, Ву С., Ся И, Чжан Ю.Г., Петроф Е.О., Клауд Е.К., Сан Дж. Последовательная активация пути бета-катенина эффекторным белком секреции сальмонеллы третьего типа AvrA в хронически инфицированном кишечнике.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2012; 303: G1113–25. https://doi.org/10.1152/ajpgi.00453.2011.
42. Лю X, Лу Р., Ву С., Сан Дж. Регулирование сальмонеллой кишечных стволовых клеток через путь Wnt / бета-катенин. FEBS Lett. 2010; 584: 911–6. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2010.01.024.
43. Lin Z, Zhang YG, Xia Y, Xu X, Jiao X, Sun J. Salmonella enteritidis Effector AvrA стабилизирует кишечные узкие соединения посредством пути JNK. J Biol Chem. 2016; 291: 26837–49. https: // doi.org / 10.1074 / jbc.M116.757393.
44. Лу Р., Ву С., Лю Х, Ся И, Чжан Ю. Г., Сун Дж. Хронические эффекты эффекторного белка секреции сальмонелл типа III AvrA in vivo . PLoS ONE. 2010; 5: e10505. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010505.
45. Дуан Й, Ляо А.П., Куппиредди С., Йе З, Чианцио М.Дж., Сан Дж. Активность бета-катенина отрицательно регулирует воспаление, вызванное бактериями. Lab Invest. 2007; 87: 613–24. https://doi.org/10.1038/labinvest.3700545.
46. Маккормик Б.А., Колган С.П., Делп-Арчер С., Миллер С.И., Мадара Дж.Л.Присоединение Salmonella typhimurium к монослоям кишечного эпителия человека: трансклеточная передача сигналов субэпителиальным нейтрофилам. J Cell Biol. 1993; 123: 895–907.
47. Ляо А.П., Петроф Э.О., Куппиредди С., Чжао Ю., Ся Й, Клауд Е.С., Сан Дж. Эффектор AvrA сальмонеллы типа III стабилизирует плотные контакты между клетками, подавляя воспаление в эпителиальных клетках кишечника. PLoS One. 2008; 3: e2369. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002369.
48. Блом Г. Статистические оценки и преобразованные бета-переменные.(Нью-Йорк: John Wiley & Sons, Inc.). 1958.
Устойчивость сальмонелл к антибиотикам. Изолировано из пресноводной среды разведения креветок в северо-восточном регионе Бразилии
В этом исследовании изучали наличие и устойчивость к антибиотикам Salmonella spp. в среде выращивания креветок в Северо-восточном регионе Бразилии. Пробы воды и донных отложений из двух хозяйств, выращивающих акклиматизированные к пресной воде Litopenaeus vannamei , были исследованы на наличие Salmonella .После этого было проведено серотипирование изолятов Salmonella , устойчивость к противомикробным препаратам была определена методом дисковой диффузии, а для резистентных изолятов было выполнено плазмидное лечение. Было подтверждено, что 30 (16,12%) из 186 изолятов являются Salmonella spp., Принадлежащими пяти сероварам: S . серовар Сенпол, S . серовар Infantis, S . серовар Панама, S . серовар Маделия и S . serovar Braenderup вместе с 2 подвидами: S.enterica serovar houtenae и S. enterica serovar enterica. Около двадцати трех процентов изолятов были устойчивы по крайней мере к одному антибиотику, а двадцать процентов были устойчивы по крайней мере к двум антибиотикам. Три штамма, выделенные из проб воды (пруд и водозаборный канал), показали множественную резистентность к ампициллину, тетрациклину, окситетрациклину и нитрофурантоину. У одного из них была плазмида с генами устойчивости к нитрофурантоину и ампициллину. Распространенность бактерий, патогенных для человека в среде разведения креветок, а также их картина устойчивости к лекарствам, выявленная в этом исследовании, подчеркивают необходимость более пристального внимания к этой области.
1. Введение
Растущий спрос на креветки на международном рынке стимулировал разведение креветок во внутренних водах за последние десятилетия. Разведение морских креветок, расположенных за много миль от океана, является новым и быстрорастущим сектором аквакультуры [1]. Однако креветки, выращиваемые как в соленой, так и в пресной воде, становятся все более уязвимыми для бактериальной инфекции из-за легкости, с которой патогены передаются в аквакультуре [2]. В результате многие фермеры неправильно используют антибиотики для предотвращения или лечения инфекций, что приводит к распространению устойчивых к противомикробным препаратам штаммов в водной среде [3].Увеличение числа штаммов, устойчивых к противомикробным препаратам, также связано с присутствием плазмид, содержащих гены устойчивости, обеспечивающих микробиологическим популяциям большую генетическую гибкость и позволяющих им адаптироваться и выживать во враждебных условиях [4]. Добавление антибиотиков в корм для креветок для профилактики, лечения инфекций или стимуляции роста также способствовало сохранению устойчивых и патогенных штаммов [5].
Рабочие креветочной фермы не только регулярно подвергаются воздействию антибиотиков, так как они смешиваются с кормом, но и уязвимы для заражения мультирезистентными инвазивными бактериями, такими как Salmonella spp.Пациентов с инфекцией Salmonella следует лечить антибиотиками, эффективными против этих бактерий [6, 7].
Целями этого исследования было изучение присутствия штаммов Salmonella в образцах окружающей среды креветочных хозяйств и определение профилей устойчивости к противомикробным препаратам среди изолированных штаммов из прудов и водозаборных каналов креветочных ферм в Северо-восточном регионе Бразилии.
2. Материалы и методы
2.1. Отбор проб
Пробы были собраны на двух фермах (A и B), выращивающих акклиматизированные в пресной воде Litopenaeus vannamei , расположенные в устье реки Жагуарибе (город Ягуаруана, штат Сир, Бразилия).Всего на креветочных фермах было отобрано сто двадцать образцов за два периода времени: с июня по декабрь 2007 года и с июня по сентябрь 2008 года. Количество образцов было одинаковым в оба периода, состоящих из воды (30) и отложений (30). ), из прудов и водозаборных каналов.
Отбор проб охватил полный цикл урожая. Воду (2 л) собирали в стерильные янтарные флаконы и фильтровали in loco через многослойный (пять) слой стерильной марли. Затем марлю погружали в 225 мл лактозного бульона и инкубировали в течение 24 часов при 35 ° C.
Каждая проба донных отложений состояла из четырех подвыборок из случайных мест внутри пруда или водозаборного канала, объединенных в одну однородную пробу. Аликвоту 25 г инокулировали в 225 мл лактозного бульона и инкубировали в течение 24 часов при 35 ° C.
2.2. Микробиологический анализ
Образцы обрабатывали на наличие Salmonella с использованием трехэтапной методики, описанной Уоллесом и Хаммаком [8]: обогащение бульоном Раппапорта-Вассилиадиса и бульоном тетратионата; нанесение на селективную среду; Кишечный агар Гектоен; и агар MacConkey (все Difco).Подозрительные колонии Salmonella отбирали из среды для посева и переносили на триптиказо-соевый агар (TSA), агар с тройным сахаром и железом (TSI), агар с лизиновым железом (LIA) и агар с сульфидноиндольной подвижностью (SIM) (все Difco). Изоляты с типичными реакциями были биотипированы для идентификации видов и подвидов Salmonella согласно Le Minor и Popoff [9], и они были серотипированы (серогруппы и серовары) с использованием тестов агглютинации антисывороток O и H, Институт Освальдо Круза, Род-Джерси, Бразилия [ 9].
2.3. Тест на чувствительность к противомикробным препаратам
Чувствительность к противомикробным препаратам определяли методом дисковой диффузии [10] с использованием имеющихся в продаже дисков, содержащих антибиотики (LABORCLIN, Бразилия): ампициллин (AMP; 10 μ г), тетрациклин (TET; 30 μ г). ), гентамицин (GEN; 10 μ г), хлорамфеникол (CHO; 30 μ г), флорфеникол (FLF; 30 μ г), ципрофлоксацин (CIP; 5 μ г), нитрофурантоин (NIT; 300 μ г) и налидиксовой кислотой (NAL; 30 μ г).Диски окситетрациклина (OTC; 30 мк г) готовили с использованием пустых дисков (6 мм, LABORCLIN), пропитанных раствором антибиотика [11]. Эти антибиотики были протестированы на предмет их использования в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве для профилактики и лечения заболеваний в Бразилии. Для контроля опыта использовали следующие референс-штаммы: Salmonella ser. Choleraesuis ATCC10708, Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 и Staphylococcus aureus ATCC25293.
Контрольные точки, рассматриваемые для флорфеникола и окситетрациклина, двух антибиотиков, обычно используемых в креветках для предотвращения и лечения вспышек инфекционных заболеваний, были одинаковыми для дисков хлорамфеникола и тетрациклина, соответственно, согласно CLSI [11].
2.4. Плазмидное лечение
Штаммы, устойчивые к более чем одному антибиотику, подвергали плазмидному лечению, как описано Molina-Aja et al. [12] с использованием бульона Лурия-Бертани (Difco) с добавлением 0,85% NaCl и 100 мкл г / мл акридинового оранжевого красителя.После обработки была проверена чувствительность к антибиотикам.
2,5. Определение ингибирующей и бактерицидной концентраций
Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) и минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли у штаммов, устойчивых к диффузии с антимикробным тест-диском (Кирби-Бауэр), в соответствии с техникой разбавления (макроразведения) бульона с использованием метода Мюллера-Хинтона. бульон, Difco CLSI [11].
3. Результаты
Salmonella spp.составляли 30 (16,12%) из 186 подозреваемых штаммов. Выявлено пять сероваров: S . сер. Сенпол (), S . сер. Infantis (), S . сер. Панама (), S . сер. Маделия () и S . сер. Braenderup (), а также два подвида S. enterica : houtenae () и enterica (). Большинство штаммов Salmonella поступило с фермы B () (Таблица 1).
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sw: проба воды Salmonella ; Ss: образец осадка Salmonella ; Sw11a *: субпопуляция. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Шесть из штаммов Salmonella были устойчивы к одному или нескольким из следующих антибиотиков: AMP, OTC, TET и NIT. Среди изолятов три штамма с множественной лекарственной устойчивостью (Sw15, Ss16 и Ss17) проявили устойчивость к трем классам антибиотиков (пенициллину, тетрациклину и нитрофурану).Штамм Salmonella сер. Панама (Sw11) была восприимчива ко всем антибиотикам в тесте на антибиотикограмму. Колонии изолятов (субпопуляция, штамм Sw11a) росли в зоне ингибирования тетрациклиновых дисков (TET и OTC) (таблица 1).
Результаты лечения плазмидой показали, что большая часть устойчивых к антибиотикам Salmonella проявляла устойчивый фенотип после инкубации с мутагенным агентом (акридиновый оранжевый), что указывает на то, что этот профиль, вероятно, кодируется хромосомными генами.Только один излеченный штамм Salmonella (Ss17) потерял устойчивость к AMP и NIT, что указывает на то, что эти гены связаны с плазмидами.
МИК для тетрациклинов (TET и OTC) варьировала от 32 мк г до 64 мк г для штаммов, выделенных из речной воды на ферме A (Sw3) и из воды входного канала (Sw10, Sw11 и Sw15) и донных отложений. на ферме B (Ss16 и Ss17). Для тетрациклинов MBC находится в диапазоне от 64 мк г до 1024 мк г (Sw10 и Sw11a *).MIC и MBC для AMP и NIT были выше 640 мк мкг / мл (таблица 2).
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sw: образец воды Salmonella ; Ss: образец осадка Salmonella; -: тест на этот антибиотик не проводился. Субпопуляция. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Обсуждение
Наличие Salmonella spp. в прибрежных и внутренних средах разведения креветок в северо-восточном регионе Бразилии было зарегистрировано несколькими авторами [13–15]. Присутствие этих бактерий в первую очередь связано со сбросом неочищенных сточных вод в местные водоемы, а также с повторным использованием водных ресурсов, таких как органические удобрения для орошения и аквакультуры [16].
В исследовании среды выращивания креветок и домашнего скота в Индии Bhaskar et al.[1] обнаружили Salmonella во всех образцах, но концентрации плохо коррелировали с бактериальными индикаторами фекального загрязнения. Это может означать, что Salmonella принадлежат к автохтонной микробиоте. По данным Reilly et al. [17], удобрение пруда необработанным навозом является основным источником заражения Salmonella в отложениях креветочных хозяйств. Однако бразильские фермеры, выращивающие креветок, не применяют эту практику; на самом деле, согласно Брито и др. [18], пруды в Северо-восточном регионе Бразилии удобряются в основном мочевиной и тройным суперфосфатом, реже нитратами, фосфатами и сульфатами.Таким образом, присутствие Salmonella в бразильской аквакультуре связано с присутствием сточных вод и / или выпасом животных на территории, окружающей ферму.
Сальмонеллез, вызывающий серьезную озабоченность в области общественного здравоохранения во всем мире, характеризуется высокими уровнями эндемичности и заболеваемости, и его особенно трудно контролировать из-за множества эпидемиологических параметров, связанных с множественными источниками инфекции и путями передачи на протяжении всего цикла заражения. болезнь [19].В Бразилии в период с 2000 по 2008 год было официально зарегистрировано пятнадцать вспышек пищевого сальмонеллеза, связанных с самыми разными источниками пищи [20].
Результаты этого исследования выявили две проблемы общественного здравоохранения: (1) наличие устойчивых штаммов Salmonella в культуре креветок на северо-востоке Бразилии и (2) возможность заражения людей Salmonella через потребление зараженных креветок, наряду с экономическими потерями в результате сокращения экспорта на международные рынки с высокими стандартами контроля патогенов в производственных и перерабатывающих системах.
Выделение устойчивых к антибиотикам штаммов может указывать на использование лекарств в этой водной среде. Непрерывное и неправильное использование этого антибиотика может увеличить заболеваемость и устойчивость устойчивых штаммов, тем самым ставя под угрозу безопасность пищевых продуктов для человека и создавая трудности в лечении сальмонеллеза человека. Во многих странах безответственное использование антибиотиков в животноводстве считается основной причиной повышенной устойчивости бактерий [21–23]. Фактически, Кабелло [24] обсуждал влияние избирательного давления остатков антибиотиков на микробный состав в отложениях прудов для аквакультуры.
Связывание антибиотика с частицами осадка задерживает его биоразложение и объясняет долгосрочное постоянство лекарств в окружающей среде. Препараты группы NIT были запрещены с 2003 года в ветеринарной практике и производстве пищевых продуктов (Министерство сельского хозяйства, Норма № 09) [25], и устойчивые к NIT бактерии все еще изолированы в отложениях креветочных хозяйств. Удалось проверить устойчивость к высоким концентрациям антибиотиков (NIT и AMP) среди Salmonella spp. изолированы на ферме B как из проб воды, так и из донных отложений (Таблица 2).
Следует отметить, что в этом исследовании также наблюдались устойчивые к внебиржевым рецептам штаммы Salmonella . Фактически, этот антибиотик широко используется фермерами, выращивающими креветок в этом регионе, для лечения бактериальных заболеваний в культуре креветок [26]. Из-за низкой абсорбции рекомендуемая доза в 5–10 раз превышает среднюю дозу, применяемую при оказании медицинской помощи. Таким образом, большая часть безрецептурных препаратов, вводимых в аквакультуру, неизбежно накапливается в отложениях прудов [27]. Тетрациклины и окситетрациклины имеют участки связывания для ионов металлов, особенно магния и кальция [28].Когда тетрациклины вводятся в соленой воде, связывание ионов может снизить биологическую активность [29]. Креветочные фермы, отобранные для этого исследования, находились в пресноводной среде, но вода на входе (из реки Жагуарибе) была умеренно жесткой, что указывает на относительное содержание ионов кальция и магния [30].