Окраска по гомори: Окраска по Гомори

МАЛЛОРИ МЕТОДЫ — Большая Медицинская Энциклопедия

МАЛЛОРИ МЕТОДЫ (F. B. Mallory, амер. патологоанатом и гистолог, 1862—1941) — способы многоцветной окраски срезов, применяемые в гистологической технике гл. обр. для выявления волокнистых структур соединительной ткани и нейроглии.

В 1900 г. Ф. Маллори предложил оригинальный метод окраски срезов, который лучше удается после фиксации их в смесях, содержащих сулему или бихромат калия. Срезы после промывания окрашивают 3 мин. в 0,1% водном р-ре кислого фуксина, быстро промывают дистиллированной водой и обрабатывают 3—5 мин. 1% водным р-ром фосфорно-молибденовой к-ты, ополаскивают водой и окрашивают 1—2 мин. в смеси, состоящей из анилинового синего водорастворимого — 0,5 г, оранжевого Ж — 2 г, щавелевой к-ты — 2 г, дистиллированной воды — 100 мл (смесь нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют). По окончании окраски срезы промывают в воде, дифференцируют в 96% спирте и, проведя через абсолютный спирт и ксилол, заключают в канадский бальзам. Коллагеновые и ретикулиновые волокна окрашиваются в темно-синий цвет, амилоид, слизь, гиалин — в синий, ядра клеток — в оранжево-красный, ганглиозные нервные клетки, осевые цилиндры нервных волокон и нейроглия — к фиолетовый, эритроциты, мякотные оболочки нервов — в желтый или желто-красный, мышечные волокна — в ярко-оранжевый, роговое вещество эпидермиса — в ярко-красный цвет. Нередко перед окраской срезов по М. м. рекомендуют окрасить ядра клеток кармином. Из модификаций Маллори методов наиболее распространена азановая окраска (см.).

Ф. Маллори предложен несколько иной метод для выявления глиальных структур (1901). Тонкие кусочки мозга фиксируют 24 часа в жидкости Ценкера, промывают 24 часа в проточной воде и заливают в парафин. Депарафинированные срезы помещают на 5 — 10 мин. в 0,25% р-р перманганата калия, промывают в дистиллированной воде и на 10—20 мин. погружают в 5% р-р щавелевой к-ты. Затем срезы промывают и 12—24 часа окрашивают в фосфорно-вольфрамовом гематоксилине Маллори: 0,1 г гематоксилина растворяют при нагревании в 80 мл дистиллированной воды, по охлаждении добавляют 20 мл 10% р-ра фосфорно-вольфрамовой к-ты и 0,2 мл перекиси водорода. При этом ядра клеток и волокна нейроглии окрашиваются в синий цвет, нервные волокна — в розовый, соединительная ткань — в коричневокрасный.

Кроме того, волокна соединительной ткани окрашиваются в синий цвет молибденовым гематоксилином Маллори: гематоксилин 1 г, фосфорно-молибденовая к-та 2 г, дистиллированная вода 100 мл, 1% р-р перманганата калия 5 мл. Окраска парафиновых срезов после фиксации по Ценкеру или по Гелей продолжается 12—24 часа, затем срезы ополаскивают, дифференцируют 96% спиртом, обезвоживают абсолютным спиртом и через ксилол заключают в бальзам.

В 1905 — 1908 гг. Ф. Маллори разработал оригинальный рецепт квасцового гематоксилина и описал способы выявления в тканях гиалина, амилоида, гемофусцина, солей железа, меди, свинца и др.

См. также Гистологические методы исследования.

Библиография: Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., с. 503 и др., М., 1969; Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники, с. 176, Л., 1969; Mallory F. В. Pathological technique, Philadelphia — b., 1938.

Я. E. Хесин.

Пневмоцистная пневмония 2 — Практика гистолога

МИНИСТЕРСТВО ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

97 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР

СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКИХ И КРИМИНАЛИСТИЧЕСКИХ ЭКСПЕРТИЗ

ЦЕНТРАЛЬНОГО ВОЕННОГО ОКРУГА

Начальник 97 ГЦ СМи КЭ (ЦВО) — Пудовкин Владимир Васильевич.

Авторы-составители:

1.              Детюченко Валерий Павлович, гражданский персонал ВС РФ, заведующий патологоанатомическим отделением филиала № 10 ФБУ «354 ОВКГ» МО РФ, имеющий высшее медицинское образование, специальную подготовку по патологической анатомии, стаж работы по специальности с 1989 года, высшую квалификационную категорию;

2.              Филиппенкова Елена Игоревна, врач — судебно-медицинский эксперт отдела судебно-медицинской экспертизы 97 Государственного центра судебно-медицинских и криминалистических экспертиз (Центральный военный округ), стаж экспертной работы с 1996г., высшая квалификационная категория.

СЛУЧАЙ ДИАГНОСТИКИ ПНЕВМОЦИСТНОЙ ПНЕВМОНИИ

НА ФОНЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ.

Пневмоцисту с 1988г. причисляют к царству грибов. Распространение повсеместное, входит в состав нормальной микробиоты человека, заселяя его лёгкие с раннего детства.

По Е.С.Белозерову, Ю.И.Буланькову (2006): пневмоциста имеет тонкую капсулу, может быть округлой или серповидной формы, её при световой микроскопии ошибочно можно принять за дрожжи или эритроциты. Инфекционная единица P.carinii — спорозоит, в ткани лёгкого превращающийся в трофозоит, размножающийся делением. Передаётся пневмоциста контактным путём. P.carinii — внеклеточный паразит со строгим тропизмом к лёгочной ткани, в просвете альвеол она осуществляет весь жизненный цикл. В результате жизнедеятельности P.carinii в лёгких происходит инфильтрация стенки альвеол мононуклеарами, а интерстициальной ткани — плазматическими клетками. Микроскопически пневмоцисты обнаруживаются в экссудате каждой альвеолы. Всё это приводит к 10-20-кратному увеличению альвеолярной стенки, обусловливающему альвеолярно-капиллярный блок с клиникой тяжёлой дыхательной недостаточности.Пневмоцистная пневмония относится к одной из распространённых суперинфекцией ВИЧ/СПИД, к поздним СПИД — ассоциированным заболеваниям, развивается у больных с выраженным иммунодефицитом, когда количество CD4+ лимфоцитов падает ниже 200 в 1 мкл.

По Р.А. Аравийскому, Н.Н. Климко, Н.В. Васильевой (2004) возбудитель Pneumocystis jiroveci (прошлое название Pneumocystis carinii) в отличие от других микромицетов Р. jiroveci не растёт на обычных питательных срезах in vitro, отсутствие эргостерола в клеточной мембране делает его нечувствительным к полиеновым и азольным антимикотикам. Отличаются нестойкостью клеточной стенки, малым количеством РНК-генов, а также особым механизмом вариации поверхностных антигенов.

Распространение: повсеместное, входит в состав нормальной микробиоты человека.

Характеристика возбудителя: Pneumocystis jiroveci не культивируется на искусственных питательных средах, растёт в культуре лёгочной ткани куриных эмбриолнов, а также в культуре фибробластов эмбриональной лёгочной ткани человека. Практически в настоящее время изучению доступны лишь тканевые формы возбудителя, полученные из патологического материала (гистологические срезы, БАЛ, мокрота). При рутинных методах окраски (гематоксилин-эозин) скопления возбудителя в тканях определяются как однообразные ячеистые массы. Диагностически значимые зрелые формы пневмоцист хорошо выявляются при импрегнации по Гомори — Грокотт, при окраске толуидиновым синим, тионином, при окраске по методу Бауэра. По Грамму пневмоцисты окрашиваются непостоянно.

Морфологически зрелые пневмоцисты представляют собой округлые клетки до 10 мкм в диаметре с плотной многослойной клеточной стенкой гетерополисахаридной природы. В зрелых пневмоцистах видны базофильные внутриклеточные тельца (аскоспоры). Вокруг зрелых пневмоцист сосредоточено большое количество молодых форм (трофозоидов), имеющих лабильные очертания, а также промежуточные формы —прецисты с более тонкой, чем у цист, стенкой. По мере созревания внутриклеточные тельца заполняют зрелые цисты, их оболочка разрывается, и внутриклеточные тельца выталкиваются в окружающие ткани, превращаясь в трофозоиды. Материнские клетки приобретают чашевидные или полулунные очертания и постепенно дегенерируют.

Патоморфология пневмоцистной пневмонии характеризуется двумя особенностями:

Заболевание: пневмоцистоз, обычно возникающий у иммуноскомпрометированных больных, чаще всего при СПИДе, злокачественных новообразованиях, применении иммуносупрессовров, у детей младшего возраста. Инфицирование ингаляционным путём. Основной клинический вариант пневмоцистоза — пневмония, характеризующаяся лихорадкой, выраженной прогрессирующей дыхательной недостаточностью, сухим непродуктивным кашлем.

На рентгенограммах — интерстициальная инфильтрация. Очаговые и деструктивные изменения а также плеврит не характерны. Экстрапульмональные поражения при пневмоцистозе встречаются относительно редко. P. jiroveci чувствителен к каспофунгину, а также к некоторым антибактериальным препаратам, например, к тримоксазолу.

Результаты микроскопии мокроты и БАЛ могут быть ложноотрицательными, поэтому у больного с высокой вероятностью пневмоцистной пневмонии необходимо проводить повторные исследования окрашенных мазков.

Методы диагностики:

— рентгенография или КТ лёгких;

— бронхоскопия, получение БАЛ, биопсия очагов поражения;

— микроскопия окрашенных мазков-отпечатков биоптатов, БАЛ, мокроты;

— гистологическое исследование биопсийного материала.

Стеклопрепараты представил Детюченко Валерий Павлович, заведующий патологоанатомическим отделением филиала № 10 ФБУ «354 ОВКГ» МО РФ).

Труп женщины 37 лет. ВИЧ — инфицирована около 10 лет назад. Смерть на фоне прогрессирующей дыхательной недостаточности.

Окраска на амилоид — Практика гистолога

Морфологическая диагностика амилоидоза (по В.В.Серову, М.А.Пальцеву).

Макроскопическая диагностика амилоидоза: при действии на ткань люголевского раствора и 10% серной кислоты амилоид приобретает сине-фиолетовый или грязно-зеленый цвет.

Микроскопическая диагностика амилоида:

а) при окраске гематоксилином и эозином амилоид представлен аморфными эозинофильными массами;

б) при окраске конго красным (специфическая окраска на амилоид) амилоид окрашивается в кирпично-красный цвет;

в) при просмотре окрашенных конго красным препаратов в поляризационном микроскопе обнаруживается двухцветность — дихроизм: красноватое и зелено-желтое свечение;

г) при просмотре окрашенных тиофлавином Т препаратов в люминесцентном микроскопе обнаруживаетсяспецифическое зеленое свечение.

При выраженном амилоидозе органы увеличиваются, становятся очень плотными и ломкими, на разрезе приобретают сальный вид.

Амилоидоз печени (по В.В.Серову, М.А.Пальцеву).

• Печень большая, плотная, светлая с сальным блеском на разрезе.
• Амилоид откладывается по ходу синусоидов в дольках, в стенках сосудов.
• Приводит к атрофии гепатоцитов и развитию печеночной недостаточности; при затруднении венозного оттока в связи с поражением центральных вен может сопровождаться портальной гипертензией.

Амилоидоз почек (по В.В.Серову, М.А.Пальцеву).

• Почки большие, белые, плотные, на разрезе с сальным блеском.
• Амилоид откладывается в клубочках (базальные мембраны капилляров, мезангий), в тубулярных базальных мембранах, в стенках сосудов, строме.
• Сопровождается развитием нефротического синдрома, в финале приводит к амилоидному сморщиванию почек и развитию хронической почечной недостаточности.

Амилоидоз селезенки (по В.В.Серову, М.А.Пальцеву).

• Амилоид откладывается в лимфоидных фолликулах, которые приобретают на разрезе вид полупрозрачных зерен — саговая селезенка (I стадия) или диффузно по всей пульпе — сальная селезенка (II стадия).

Окраска конго красным (Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л. Перова. — М.: Медицина, 1996.):

Затем обезвоживают, просветляют, заключают в смолу.

Результат: амилоид кирпично-красного цвета,ядра клеток — синеватые.

Можно вначале окрасить ядра гематоксилином, отдифференцировать в солянокислом спирте, а затем окрашивать конго красным.

Гистохимическая идентификация углеводов

ГИСТОХИМИЯ УГЛЕВОДОВ

Биологическая роль углеводов многообразна. 

В организме они выполняют опорные и энергетические функции, некоторые углеводы являются составными частями биологически важных соединений (АТФ, циклической АМФ, нуклеиновых кислот, гепарина, витамина С и др.). Гликопротеиды как специфический компонент иммуноглобулинов играют важную роль в иммунных механизмах, определяя антигенную активность сывороточных и клеточных факторов. Кроме того, продукты расщепления углеводов используются для синтеза практически всех классов соединений в живой клетке.

Классификация углеводов

В живой клетке углеводы существуют в форме моно-, олиго- и полисахаридов. В гистологических препаратах они сохраняются практически только в виде полисахаридов: во всяком случае только полисахариды могут быть с достоверностью выявлены гистохимически. Правда, возможно также гистохимическое выявление глюкозы и витамина С.

Общепринятой классификации полисахаридов не существует. 

Для практических гистохимических целей достаточно разделить полисахариды на гомо- и гетерополисахариды.

Гомополисахариды построены из остатков молекул моносахаридов, главным образом пентозы и гексозы, соединенных между собой кислотными мостиками. Гомополисахаридами являются крахмал, инулин, клетчатка, гликоген. К ним с определенными оговорками можно также отнести хитин и полигалактуроновую кислоту.

Гетерополисахариды разделяют на гликозаминогликаны (ГАГ) и гликопротеины. К кислым гликозаминогликанам ГАГ относят гиалуроновую кислоту, молекула которой построена из остатков глюкуроновой и уксусной кислот и гексозамина; хондроинин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, кератан-сульфат, гепаритин-сульфат, гепарин, молекулы которых содержат остатки гексозамина, глюкуроновой или уроновой кислот, серной и уксусной кислот в различных сочетаниях. В тканях кислые ГАГ, кроме гепарина, находятся в соединении с белками. Такие комплексы, в которых к белковому стержню присоединены полисахаридные цепи, носят название «протеогликаны». Все эти соединения входят в состав матрикса соединительной ткани, крови, синовиальной жидкости, слизи.

Гликопротеины являются белками, к молекуле которых ковалентно присоединены олигосахариды: гексозы, гексозамины, сиаловые кислоты, фукозы и др. Такие соединения являются составной частью клеточных мембран, слизистых секретов желез, сывороточных белков, ферментов, гормонов, «неколлагеновых белков» соединительной ткани и т.д.

Гистохимическая идентификация углеводов

Выявление углеводов основано, как правило, на методах общего анализа химических групп. Используются методы окисления, метахроматическое окрашивание основными красителями, реакции связывания коллоидных металлов, выявление базофилии, окрашивание кармином, реакции блокирования и превращения реакционноспособных групп, методы ферментативного гидролиза, радиоавтографию, иммуногистохимию.

Методы окисления 1,2-гликолей до альдегидов

Реакция Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция)

Метайодная кислота селективно окисляет и расщепляет -С=С-связи не только в 1,2-окси-, но также в 1-окси-2-амино-1-окси-2-алкиламино- и 1-окси-2-кетогруппах. 

В результате этого образуется одна кетогруппа или две альдегидные группы, как, например, в глюкозе. Альдегидные группы реагируют с реактивом Шиффа (фуксин-сернистой кислотой) точно так же, как и в реакции Фельгена. С помощью этого метода выявляют все соединения, содержащие оксигруппы, которые в результате окисления метайодной кислоты могут превращаться в альдегидные группы. Однако в гистологических срезах практически лишь гликоген и гликопротеины, сохраняющиеся в достаточных количествах, могут быть выявлены с помощью ШИК-реакции. Гликоген можно дифференцировать от гликопротеинов путем переваривания в амилазе или диастазе.

Для окисления -С-С-связей в полисахаридах предпринимались попытки использовать, помимо одной кислоты, другие окислители-хромовую кислоту, перманганат калия, тетраацетат натрия и т.д. Наиболее удачной является модификация ШИК-реакции, предложенная А.Л. Шабадашем (1949).

1. Материал фиксируют в 10 % формалине, жидкостях Карнуа, Ценкера, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллирован­ной воды.

3. При комнатной температуре срезы окисляют 0,5—1 % водным раствором орто- или метайодной кислоты в течение 2 —10 мин.

Окисление можно также проводить по Шабадашу в 0,001—0,01 М метаперйодате калия или натрия в течение 7 — 25 мин. 

Раствор хранят в темноте. 

Рабочую концентрацию этого раствора и продолжительность инкубации в ней подбирают в зависимости от объекта.

4. Промывают в дистиллированной воде 10 мин.

5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 10-30 мин при комнатной температуре в темноте. 

——————————————————————————————

6. Срезы промывают сернистой водой (600 мл дистиллированной воды + 30 мл 10 % пиросульфита калия + 30 мл 1 н. со­ляной кислоты) три раза по 2 мин. 

Сернистую воду можно так­же готовить (непосредственно до проведения реакции) по рекомендации А.Л. Шабадаша следующим образом: 

к 200 мл дистиллированной воды добавить 10 мл 10 % раствора натрия гидросульфита 

и 10 мл 1 н. соляной кислоты.

7. Тщательно промывают в проточной и дистиллированной воде, ядра можно докрасить 0,5 % светлым зеленым или кислым гемалауном.

8. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, заключают в бальзам.

Результат: 

углеводы, содержащие гексозу, окрашиваются в красно-лиловый цвет, гликоген — в более интенсивный темно-красный.

Контроль: 

расщепление гликогена амилазой или диастазой, реакция ацетилирования для блокирования гидроксильных групп.

Примечание: 

необходимо пользоваться химически чистой посудой, стеклянными палочками; нельзя работать с металлическими крючками или иголками; окрашивание срезов в реактиве Шиффа следует проводить в темноте.

Метахроматическое окрашивание кислых гликозаминогликанов

Метахромазия — это изменение спектров поглощения используемых красителей. 

Метахромазию можно получить при использовании очень широкого набора красителей (табл. 2).

Пригодность красителя для выявления метахромазии определяется тем, насколько ортохроматический и метахроматический максимумы поглощения отдалены друг от друга.

В гистохимии под метахромазией подразумевают практически только явления, наблюдающиеся при использовании красителей тиазиновой группы, а именно те изменения окраски от синего через фиолетовый до красного, которые происходят при окрашивании тканей разбавленными водными растворами красителей названной группы.

Типичным примером метахромазии служит окрашивание тиазиновыми красителями (тионин, толуидиновый синий и т.п.) лаброцитов (тучных клеток), при котором гранулы этих клеток окрашиваются в фиолетово-красный цвет, тогда как другие структуры воспринимают оригинальный синий цвет красителя.

Метахроматическое окрашивание не связано ни с определенной химической структурой, ни с определенным химическим соединением, а обусловлено плотностью анионов на поверхности молекулы субстрата, а также степенью ионизации. Наличие метахромазии свидетельствует только о наличии некоторой минимальной плотности свободных отрицательных поверхностных зарядов на молекулах субстрата. В животной ткани метахроматически окрашиваются главным образом кислые ГАГ, характеризующиеся высокой молекулярной массой и большим количеством свободных анионных групп (R=0=SO-3, R-0=HPO-3, R=COO-).

Все приемы подготовки срезов и следующей за окрашиванием обработки влияют на метахромазию, поэтому предпочтительнее использовать криостатные срезы с непродолжительной последующей фиксацией. Окрашенные срезы перед обезвоживанием и заключением в бальзам рекомендуется предварительно просматривать в дистиллированной воде под покровным стеклом. Существуют также методы сохранения метахромазии в постоянных препаратах [Кутах Г.Н., Шубич М.Г., 1965].

Реакции связывания коллоидных металлов

Подобно основным (катионным) красителям, катионы некоторых металлов также образуют соединения с анионами кислых ГАГ. С этой целью используют коллоидные растворы золота, тория, платины, железа, а также ионы бария и висмута. Торий, платину, барий и висмут применяют главным образом для кон­трастирования кислых ГАГ в электронно-микроскопической гистохимии.

В светооптической гистохимии применяется в первую очередь метод Хэйла, основанный на связывании в кислой среде (рН < 2) коллоидных мицелл гидроксида железа (III) с карбоксильными и сульфоновыми группами кислых ГАГ и последующем выявлении связанного железа с помощью гексацианоферрата (ферроцианида) калия в реакции берлинской лазури. Нуклеиновые кислоты и белки также могут связывать коллоидный гидроксид железа, но при более высоких значениях рН.

Выявление кислых гликозаминогликанов с помощью 

коллоидного железа (модификация реакции Хэйла по Грауманну—Клаусу)

1. Материал фиксируют в забуференном 10 % формалине, жидкостях Карнуа, Жандра, спирт-формоле (лучше пользоваться безводными фиксаторами) и заливают в парафин; возможна обработка срезов без фиксации или криостатных срезов.

2. Срезы депарафинируют и через ряд спиртов убывающей концентрации доводят до дистиллированной воды. Обработку свежих криостатных срезов начинают с п. 3. Фиксированные срезы хорошо промывают в дистиллированной воде.

3. Помещают срезы на 10 мин в раствор коллоидного железа, подкисленного уксусной кислотой (маточного раствора 10 час­тей, 96-99 % уксусной кислоты 4 части). 

Маточный раствор: 

750 мл дистиллированной воды доводят до кипения и добавляют 12 мл 32 % раствора трихлорида железа. Образовавшийся гидроксид железа можно хранить в течение 1 мес.

4. Промывают в 2 сменах 5 % уксусной кислоты по 5 мин в каждой.

5. Срезы помещают в свежеприготовленный раствор, включающий 30 мл 2 % гексацианоферрата калия + 60 мл 1 % соляной кислоты на 10 мин.

6. Срезы проводят через 2 смены дистиллированной воды по 2 мин.

7. Обезвоживают в ряду спиртов возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

структуры, в которых содержатся кислые ГАГ, окрашиваются в синий цвет.

Реакция Хэйла специфична для выявления свободных кислотных групп, например эфиров серной и фосфорной кислот, свободных гидроксильных групп уроновой и моноаминодикарбоновой кислот белков. Специфичность метода Хэйла для выявления кислых мукоидных веществ следует контролировать с помощью вспомогательных реакций. Ложную положительную реакцию, обусловленную присутствием железа в тканях, можно исключить путем обработки контрольных срезов в растворе гексацианоферрата калия и соляной кислоты (5-й этап данного метода).

Реакцию связывания железа можно комбинировать с ШИК-реакцией. 

В этом случае после п. 6 следует окисление метайод­ной кислотой. 

В результате этого кислые ГАГ окрашиваются в темно-синий цвет, белковые структуры — в светло-синий, а нейтральные гликопротеины — в красный цвет различных оттенков. Эта комбинация двух методов позволяет получить контрастную гистологическую картину при исследовании ткани почек и кожи.

Окраска альциановым синим

В гистохимической практике используют несколько фталоцианиновых красителей:

альциановые синие — 8 GX, 8 SX, 8 GS, 8 GN, 5 GX, 150,

альциановые зеленые — 2 GX, 3 ВХ, 

люксоловый прочный синий, астрасиний и др. 

Альциановый синий обладает большими преимуществами по сравнению с другими красителями кислых мукоидных веществ, прежде всего быстротой окрашивания и простотой применения. Прослеживается параллель между окрашиванием альциановым синим и метахромазией при изменении рН и концентрации красителя. На соответствующих объектах могут быть получены хорошие результаты в случае прижизненного окрашивания альциановым синим.

Окраска альциановым синим при рН 2,5

1. Материал фиксируют в формалине, формалин-этаноле, смесях Ценкера, Буэна, Карнуа и заливают в парафин (можно использовать криостатные срезы).

2. Депарафинированные срезы окрашивают в свежеотфильтрованном 

1 % растворе альцианового синего 8 GX в 3 % уксусной кислоте (рН 2,5) в течение 30 мин.

3. Промывают в проточной воде в течение 5 мин.

4. Обезвоживают в ряду спиртов возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

слабокислые сульфатированные ГАГ (гиалуроновая кислота) и сиалогликопротеины приобретают темно-синюю окраску. 

Сильнокислые сульфатированные ГАГ окрашиваются слабо или совсем не окрашиваются.

Окраска альциановым синим при рН 1,0

1. Срезы помещают в дистиллированную воду.

2. Окрашивают в 1 % растворе альцианового синего 8 GX в 0,1 н. соляной кислоте (рН 1,0) в течение 30 мин.

3. Просушивают фильтровальной бумагой.

4. Обезвоживают в этаноле, проводят через ксилол, заклю­чают в бальзам.

Результат: 

окрашиваются только сульфатированные ГАГ.

Примечание. 

Вместо альцианового синего 8 GX можно использовать альциановый синий 8 GN, альциановый зеленый 3 ВХ или альциановый зеленый 2 GX. Для окрашивания очень кислых мукоидных веществ рекомендуется модификация окраски альциановым синим по Гомори.

Окраска метиленовым синим

Тиазиновый краситель метиленовый синий позволяет отделить кислые ГАГ от нейтральных гликопротеинов и дифференцировать сульфатные, фосфатные и карбоксильные группы путем выявления их базофилии при различных рН. Степень базофилии определяется наличием свободных анионов полисахаридов. По мере снижения рН интенсивность окрашивания отдельных структур снижается. Это явление носит название «экстинкция» (от лат. extinctio — гашение).

В присутствии электролитов, таких как соляная кислота, хлорид натрия и калия, окрашивание альциановым синим усиливается. При концентрациях хлорида магния ниже 0,3 М альциановый синий связывается кислыми ГАГ, содержащими сульфатированные и карбоксильные группы, а при концентрациях хлорида магния 0,8 М и выше окрашиваются исключительно вещества, содержащие S04-группы.. Эти факты свидетельствуют о ведущей роли электростатических сил при связывании альцианового синего с субстратом.

Для определения экстинкции метиленового синего можно использовать растворы 0,0005-0,005 М (приблизительно 0,1 — 0,01 %) метиленового синего в веронал ацетатном буфере или ацетатном буфере Михаэлиса при различных рН (от 2,6 до 8,0 с интервалами 0,5).

Наибольший интерес представляют значения рН ниже 4,0, так как анионные группы белков, прежде всего карбоксильные группы, значительно осложняющие интерпретацию результатов, теряют свой заряд. При рН 3,0 метиленовый синий связывается также нуклеиновыми кислотами, но для них характерна другая локализация, и их можно дифференцировать с помощью специфических реакций. Кроме того, их окрашивание можно ослабить путем добавления хлорида магния к раствору красителя. Вместо метиленового синего можно использовать растворы (0,02 %) азура А в HCl-фосфатном или фосфат-цитратном буфере.

К.С. Митин (1966) показал, что коллагеновые волокна не окрашиваются метиленовым синим при рН 5,0-6,0,а основное вещество средней оболочки аорты, построенное из хондроитин -сульфатов, обладает метахромазией при рН 2,5-3,0, интима обесцвечивается при рН 4,0, а лаброциты (тучные клетки) и нейроны окрашиваются в фиолетовый цвет при рН 1,5 — 2,0.

Окраска рутениевым красным

Рутениевый красный давно используют в световой микроскопии для окрашивания пектина, растительных муцинов, целлюлозы, крахмала, инулина и лигнина, гранул лаброцитов, основного вещества хряща и т.д. Специфичность этого окрашивания невысока, однако благодаря методу контрастирования рутениевым красным по Лафту значительно дополнены сведения о гликокаликсе-слое мукоидов, окружающих плазмалемму. При использовании этого метода на первом этапе образуется связь между катионом рутениевого красного и анионными группами кислых ГАГ, при этом субстрат окрашивается в красный цвет. Электронно-микроскопическое контрастирование происходит при последующей обработке тетраоксидом осмия в окислительно-восстановительной реакции, катализируемой рутениевым красным, при которой низшие окислы осмия осаждаются на окисленном субстрате. Поскольку рутениевый красный плохо проникает в ткани, его рекомендуется добавлять прямо в фиксирующую смесь.

Контрастирование рутениевым красным по Лафту

1. Кусочки ткани фиксируют в растворе глутарового альдегида и рутениевого красного 

(0,5 мл 3,6 % глутарового альдегида+0,5 мл 0,5 М какодилатного буфера рН 7,3 + 0,5 мл 0,15-0,3 % водного раствора рутениевого красного) в течение 1 ч при 4 °С.

2. Промывают в 0,15 М какодилатном буфере 3 раза по 3 мин.

3. Дополнительно фиксируют в течение 3 ч при 20 °С в следующем растворе: 

0,5 мл 5 % тетраоксида осмия + 0,5 мл 0,2 М какодилатного буфера рН 7,3+0,5 мл 0,15-0,3 % раствора рутениевого красного.

4. Быстро промывают в буферном растворе, обезвоживают в спиртах, заливают в эпоксидную смолу.

Результат: 

контрастируются полианионы с умеренной и высокой плотностью заряда, представленные в тканях главным образом внеклеточными кислыми ГАГ.

Для очистки рутениевого красного рекристаллизацией 1 г рутениевого красного помещают в 10 мл 0,5 н. раствора аммиака при 60 °С. Нерастворимый остаток отделяют от горячего раствора центрифугированием. Надосадочную жидкость остужают до 0 °С. Образующийся при этом осадок промывают водой, охлажденной до 0 °С, спиртом и диэтиловым эфиром, а затем высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Окраска кармином по Бесту

Классическая ШИК-реакция и различные ее модификации, направленные на выявление гликогена, не могут быть рекомендованы для всех случаев, особенно если ткань содержит вещества, имеющие ту же локализацию, что и гликоген, дающие положительную ШИК-реакцию: мукопротеиды, гликопротеиды и ненасыщенные липиды. В таких случаях лучшие результаты может дать карминовый метод Беста, хотя применение этого чисто эмпирического метода трудно «примирить» со строгими гистохимическими требованиями.

Действующим началом природного кармина является карминовая кислота. Ее способность окрашивать гликоген зависит от ряда не до конца понятых физических и стереохимических факторов. Для лучшей сохранности гликогена в первоначальных прописях рекомендовалась заливка в целлоидин, однако можно использовать и парафиновые срезы, если перед перенесением в раствор Беста покрыть их тонким слоем целлоидина. Целлоидирования срезов можно избежать, фиксируя ткань в жидкости Марчи в течение 12-20 ч при 4 °С, промывая затем при 4 °С в течение 10-12 мин в 30 % спирте, инкубируя также при 4 «С в красящем растворе кармина и после дифференцирования быстро обезвоживая в двух сменах абсолютного ацетона.

При использовании этого метода необходимо проводить контрольные реакции с перевариванием гликогена амилазой, диастазой или слюной.

1. Материал фиксируют по Лилли, Жандру, Россману, Кар­нуа, Шабадашу, Буэну или в 100% спирте; заливают в парафин; можно также использовать целлоидиновые или замороженные срезы.

2. Депарафинированные срезы доводят до абсолютного спирта.

3. Целлоидируют срезы в 1 % растворе целлоидина (в смеси равных частей спирта и эфира) в течение 2 мин.

4. Просушивают срезы на воздухе, уплотняют в 70 % спирте и помещают в дистиллированную воду.

5. Проводят интенсивное окрашивание ядер в гемалауне по Майеру или в гематоксилине по Эрлиху.

6. Промывают в дистиллированной воде, в случае необходимости дифференцируют в солянокислом спирте и снова промывают в воде.

7. Окрашивают в растворе кармина в течение 10-30 мин. 

Маточный раствор кармина: 2 г кармина, 1 г карбоната калия и 5 г хлорида калия растворяют в 60 мл дистиллированной воды и кипятят несколько минут на слабом огне. 

Раствор после охлаждения фильтруют и добавляют в него 20 мл раствора аммиака (плотность 0,880). Раствор готов к непосредственному применению, его можно хранить в темной колбе в течение нескольких недель, в холодильнике — до 3 мес. 

Красящий раствор кармина: 20 мл профильтрованного маточного раствора кармина + 30 мл раствора аммиака + 30 мл метанола (сохранность несколько дней).

8. Переносят срезы непосредственно в смесь для дифференцирования (40 мл метанола + 50 мл абсолютного этанола + 100 мл дистиллированной воды). 

Дифференцируют в двух порциях до тех пор, пока видимые глазом следы красителя перестанут выхо­дить из среза в раствор-от нескольких секунд до нескольких минут.

9. Промывают в 80 % спирте, обезвоживают в абсолютном спирте, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат:

гликоген окрашивается в интенсивный красный цвет, ядра — в темно-синий.

Контрольные реакции в гистохимии углеводов

Описанные методы выявления углеводов являются в основном лишь реакциями на химические группы. Для установления специфичности проведенной реакции и для дифференциальной локализации полисахаридов используют методы блокирования реакционноспособных групп и ферментативного гидролиза.

Кислые группы (карбоксильные, фосфатные и сульфатные) можно блокировать метилированием в растворах метанол-НС1, метанол-тионилхлорида и метанол-метилиодида. В результате этого ослабляются базофилия и метахромазии элементов ткани.

Метилирование по Белло—Гайеру

1. Депарафинированные срезы промывают в двух сменах абсолютного спирта, а затем в двух сменах абсолютного метанола.

2. Помещают срезы при 24С на 4-6 ч в следующий рас­твор: 1 мл тионилхлорида медленно добавляют в 50 мл абсолютного метанола (перед использованием раствор можно хранить в течение ночи). Контрольные срезы-без обработки тионилхлоридом.

3. Промывают в 70 % спирте и дистиллированной воде.

4. Проводят соответствующее окрашивание.

Результат: 

6-часовая обработка полностью устраняет базофилию ткани. 

Базофилия цитоплазмы, обусловленная СООН-группами и РНК, снимается через 30 мин, а базофилия, обусловленная присутствием сульфатированных ГАГ, — через 4 ч.

Для дифференциации кислых ГАГ и нейтральных гликопротеинов обычно используют переваривание гиалуронидазой инейраминидазой.

Гиалуронидаза В, выделенная из культур пневмококков, стрептококков, стафилококков и Clostridium welchii, расщепляет гиалуроновую кислоту, а гиалуронидаза А, полученная из семенников быка, гидролизует, помимо гиалуроновой кислоты, еще и хондроитинсульфаты А и С.

Удаление кислых гликозаминогликанов 

путем ферментативного гидролиза с гиалуронидазой

1. Материал фиксируют в одной из смесей, рекомендованных для фиксации полисахаридов, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды через ряд спиртов убывающей концентрации.

3. Обрабатывают срезы в течение 4 —6 ч при 37 °С следующим раствором: 0,3 — 0,6 мг/мл гиалуронидазы из семенников в 0,1 н. фосфатном или ацетатном буфере (рН 6,0). 

Контрольные срезы инкубируют в буфере в таких же условиях.

4. Окрашивают контрольные срезы и срезы, обработанные в растворе гиалуронидазы, 0,1 % раствором толуидинового синего в течение 1-2 ч.

5. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

6. Заключают в глицерин-желатин или после обезвоживания и просветления в ксилоле в бальзам.

Результат: 

метахроматическое окрашивание в контрольных срезах и отсутствие его в срезах, обработанных гиалуронидазой, свидетельствуют о наличии гиалуроновой кислоты или хондроитинсульфатов А и С.

Нейраминидаза (сиалидаза, выделенная из культуральных сред Clostridium perfringens и Vibrio cholerae, а также из противогриппозной вакцины) селективно удаляет из гистологических

срезов сиаловую кислоту, уменьшая окраску ШИК-позитивных гликопротеинов, а также ослабляя метахромазию.

Следует учитывать, что буферный раствор, не содержащий нейраминидазы, может переводить в раствор значительную часть связанной нейраминовой кислоты в составе сиаломукоидов.

Ферментативное переваривание гликогена на гистологических срезах проводят с помощью диастазы, амилазы или слюны. 

Обычно используют диастазу солода по Лилли, которая катализирует гидролиз гликогена, главным образом до дисахарида мальтозы.

Ферментативный гидролиз диастазой 

для удаления гликогена по Лилли

1. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды.

2. Обрабатывают в 0,1-1 % растворе диастазы солода на изотоническом растворе хлорида натрия при комнатной температуре в течение 2 ч или при 37 «С 30-40 мин.

3. Промывают в дистиллированной воде и проводят окрашивание на гликоген 

(ШИК-реакция или окрашивание кармином по Бесту).

Результат: 

вещества, которые в прямом опыте окрашиваются при ШИК-реакции или кармином по Бесту, но исчезают из среза после обработки диастазой, следует считать гликогеном.

Примечание. 

Различия между молекулами гликогена с разветвленными и неразветвленными цепями могут быть выявлены в срезах путем их обработки 0,5 % (b-амилазой в 0,004 М ацетатном буфере (рН 5,0) вместо 

a-амилазы. (b-Амилаза расщепляет только молекулы с разветвленными цепями.

Книга: Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии — Коллектив Авторов

Загрузка. Пожалуйста, подождите…

MERCK для микроскопии

ПРЕДЛОЖЕНИЕ MERCK ДЛЯ МИКРОСКОПИИ (оригинальная брошюра)

MERCK предлагает более 300 современных продуктов для клеточной диагностики.
Это наборы для:

• Бактериологии,
• Цитологии,
• Гематологии,
• Гистологии;

А также красители и разносторонние сопутствующие продукты.

Бактериология

Процедура окрашивания – это, обычно, первый шаг в диагностике бактериологических образцов. Мы предлагаем хороший ассортимент продуктов для ручного и автоматического окрашивания с помощью готовых растворов или реактивов для самостоятельного приготовления, основанных на классических или модифицированных методах.

• Специфичные и чувствительные результаты окрашивания достигаются за короткое время,
• Методики протестированы и обеспечивают легкое исполнение, позволяют избежать лишних стадий и сэкономить время,
• Преимущество реактивов для бактериологии — долгий срок хранения,
• Продукты произведены в соответствии с DIN 9001 ISO и DIN EN ISO 13485

Окрашивающие растворы, наборы, красители

Цитология

Окрашивающие растворы, наборы, красители

Окрашивание по Папаниколау используется как стандартный метод в цитологии. Мерк предлагает полный ассортимент продуктов как для ручного так и автоматического классического метода. Вы сможете выбрать окрашивающие растворы Папаниколау, полагаясь на любой вкус и опыт в гинекологической и негинекологической цитологии. Набор для быстрого окрашивания, основанный на модифицированном методе Папаниколау, можно использовать для всех типов цитологического материала. Надежные, высококачественные продукты для цитологии обеспечивают:

ü      Высокую воспроизводимость, постоянный состав от партии к партии;

ü      Блестящее окрашивание, стабильный результат

ü      Сокращенное время анализа и минимум трудозатрат

ü      Высокую емкость готовых растворов для обеспечения максимального числа обработанных образцов и экономию средств

ü      Длинный срок годности растворов как в запечатанных, так и в открытых флаконах

ü      Продукты зарегистрированы в Центральной Европе, о чем свидетельствует маркировка на упаковке

Красители

Красители используются в микроскопии, когда необходимо визуализировать компоненты клеток и тканей животного или растительного происхождения. Красители для микроскопии используют, в основном, в цитологии, гистологии и микробиологии, а также, при анализе текстильных волокон, бумаги и других технических продуктов. Красители Certistain химически проанализированы в соответствии с жесткими спецификациями, которые подтверждают все эксплуатационные характеристики продукта.

Мы можем смело заявить следующие преимущества данных продуктов:

• Непротиворечивый результат
• Постоянство состава от партии к партии
• Высокое качество
• Маркировка Европейского Совета (CE)

Гематология

Классические методы окрашивания могут быть использованы для всех типов гематологического материала, когда интересны обзор и детализация образца.

Отдельно от повсеместно использующихся растворов и смесей красителей для получения сопоставимых результатов предлагаем Вам наборы экспресс-окрашивания и контрастирования.

Для определения и классификации лейкемии предлагаются удобные ферментные цитохимические наборы.

Все продукты могут быть охарактеризованы как:

• Безупречная воспроизводимость и постоянство состава от партии к партии
• Высокое качество, яркое окрашивание, стабильный результат
• Упаковка и продуктовый дизайн обеспечивают удобную эксплуатацию
• Долгий срок хранения всех продуктов даже после открывания упаковки
• Продукты зарегистрированы Советом Европы о чем свидетельствует соответствующая маркировка

Гистология

Наборы, красители и реактивы

H&E окрашивание (гематоксилин и эозин) – это стандартный метод окрашивания в гистологии. Огромное количество специальных красителей используется для проявления отдельных участков в разрезе ткани. Поэтому в ежедневной практике используются специальные методики, такие как трехцветное окрашивание, PAS, серебряные методы, окрашивание жиров. Долгое время уровень технического развития гистологических лабораторий вынуждал использовать самостоятельно приготовленные растворы. Сегодня становится все более и более привычным использование специальных растворов.

Преимущества продуктов:

• Экономия времени и трудозатрат
• Постоянство состава от партии к партии
• Выдающийся результат с высокой воспроизводимостью
• Продукты зарегистрированы Советом Европы, о чем свидетельствует соответствующая маркировка

Сопутствующие продукты

Необходимо пройти множество этапов и использовать различных реактивов до момента, когда исходный биоматериал сможет быть изучен на предметном стекле микроскопа. Фиксирующие агенты, защищающие биоматериал при изучении, необходимы для хорошего и самодостаточного процесса нанесения на предметное стекло. Заливочная среда в гистологии соединяет различные реактивы для заливки и гистопроцессинга так, что материал может быть разрезан спустя какое-то время.

Красители, окрашивающие растворы и наборы вносят цвет в исследуемые структуры биоматериала. В некоторых случаях необходимо проводить дифференцированный диагноз для получения правильного конечного результата. Иммуногистохимия – это один из альтернативных методов. Диагностические средства – это различные иммуногистологические наборы и антисыворотка.

Среды для заключения в гистопрепарат – это слайды, смонтированные с помощью различных сред, в зависимости от используемых методов и реагентов.

Другие гисто/цито реактивы, такие как, декальцифинирующие растворы или иммерсионные масла также принадлежат к данной группе продуктов.

Преимущества:

• Безопасность в применении
• Воспроизводимость результатов
• Постоянство состава от партии к партии
• Маркировка CE

Rapidmicrobiology Набор для окрашивания метенамином серебром Гомори для обнаружения грибов

Окрашивание серебром — распространенный специальный метод окрашивания, используемый в медицинских лабораториях. Окраска Gomori’s Methenamine Silver (GMS) используется для выявления грибков и бактерий. Грибы и бактерии становятся черными, а все остальное окрашивается в зеленый цвет светло-зеленым раствором SF.

Используя краситель GMS, альдегиды, образующиеся в результате окисления 1,2-гликолей периодной кислотой, визуализируются с помощью раствора нитрата серебра бората метенамина.Альдегидные группы восстанавливают ионы серебра в щелочном диапазоне pH до металлического серебра, которое выглядит черным. Цвет серебряных отложений можно еще больше усилить обработкой раствором хлорида золота, который образует комплекс серебра и золота. Использование раствора хлорида золота также предотвращает неспецифическое окрашивание фона. Избыток нитрата серебра смывают раствором тиосульфата натрия.

Важным этапом в технике окрашивания метенамином серебром в Гомори является раствор нитрата серебра бората метенамина в водяной бане при температуре прибл.52 ° C в течение 35-45 мин. Подогретый красящий раствор дает блестящие и интенсивные результаты окрашивания. Подробная процедура доступна на вкладыше, входящем в комплект для окрашивания.

При желании технику окрашивания метенамином серебром Гомори можно также выполнить в микроволновой печи. Был разработан протокол микроволн, который определяет время контакта для раствора нитрата серебра бората метенамина только 2 мин. Предварительно раствор нужно излучать в течение 55 секунд мощностью 600 Вт. Протокол микроволн предоставляется по запросу.

Серебряное покрытие Метернамин в соотв. to Gomori kit гарантирует легкое окрашивание серебра и предлагает дополнительно:

• высокая воспроизводимость результатов
• идеальная визуализация аргентафиновых структур
• Набор содержит все необходимые для реакции реагенты
• В набор входит компонент бората метенамина в форме удобной таблетки
• простая и надежная процедура
• доступен экономящий время микроволновый протокол
• удобный размер упаковки — набор из полиэтиленовых бутылок 100 мл
• комплект на 10 операций окрашивания, всего до 50 окрашенных препаратов
• разработан, испытан и произведен в соответствии с DIN ISO 9001

ГОМОРИ ТРИХРОМ

ГОМОРИ ТРИХРОМ

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ ГОМОРИСКИЙ ПРОТОКОЛ ТРИХРОМНОГО ПЯТНА
(МОДИФИКАЦИЯ ЭНГЕЛЯ-КАННИНГЕМА)

ПРИНЦИП:

Одноступенчатый трихром Гомори — это окрашивание
процедура, сочетающая окрашивание плазмы (хромотроп 2R) и
краситель соединительного волокна (быстрый зеленый FCF) в фосфорновольфрамовой кислоте
раствор, в который была добавлена ​​ледяная уксусная кислота.

ТРЕБУЕТСЯ ОБРАЗЕЦ:

Щелкнуть замороженными поперечнополосатыми мышцами человека. (Использовать
изопентановый метод замораживания, описанный ранее.)

МЕТОД:

Фиксация: Нет, используйте быстро замороженную ткань.

Техника: Cut 10-16 микрон (12 м)
срезы в криостате из замороженной биопсии. Прикрепите один или несколько разделов
к No.1, квадратное покровное стекло 22 мм.

Оснащение:

Стойка для окрашивания керамики — Thomas Scientific # 8542-E40

Чашка для окрашивания Columbia — Thomas Scientific # 8542-C12

Чашка для окрашивания Columbia (банка) — Thomas Scientific # 8542-E30

Щипцы

Латексные перчатки

Реактивы:

Ледяная уксусная кислота — Fisher A507-500, КОРРОЗИОННОЕ
хранить при комнатной температуре

Chromotrope 2R — Sigma C3143, РАЗДРАЖАЮЩИЙ,
хранить при комнатной температуре

Деионизированная вода

Fast Green FCF — сертифицирован, Sigma F7258,
НЕОБХОДИМЫЕ ПЕРЧАТКИ И МАСКА, Хранить при комнатной температуре.

Harris Hematoxylin Stain, подкисленный, — Lerner
Лаборатории * №1931382, склад в помещении

Permount — Fisher SP15-100, ГОРЯЧИЙ
ОПАСНОСТЬ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ

Фосфорновольфрамовая кислота, свободная кислота, — Sigma
P4006, КОРРОЗИОННОЕ, хранить при комнатной температуре.

Реагент спирт, ACS — гистохимический
Fisher A962-4 или HPLC A995 ВОСПЛАМЕНЯЮЩИЙСЯ, ТОКСИЧНЫЙ, ТЕРАТОГЕННЫЙ ,
хранить при комнатной температуре в легковоспламеняющемся шкафу

Ксилолы — Fisher # HC700-1GAL, ВОСПЛАМЕНЯЮЩИЕСЯ ,
хранить при комнатной температуре в легковоспламеняющемся шкафу)

Решения:

I.Пятно трихрома Гомори

Хромотроп 2R 0,6 г

Фаст зеленый FCF 0,3 г

Фосфорновольфрамовая кислота 0,6 г

Деионизированная вода 100 мл

Уксусная кислота ледяная 1,0 мл

Отрегулируйте pH вышеуказанной смеси до 3,4, используя 1 N NaOH.

Хранить при комнатной температуре, готовить еженедельно.

Топ 20 бесплатных раскрасок Супер Марио онлайн для печати

Лицом к лицу с Марио Лицом к лицу с Марио Супер Марио и гоночная машина Супер Марио и гоночная машина Марио и Баузер Бой Марио и Баузер Бой Марио и Купа Трупа Марио и Купа Трупа Супер Марио и принцесса Пич Супер Марио и принцесса Пич Марио и летающий шлем Марио и летающий шлем Марио в образе Санта-Клауса Марио в образе Санта-Клауса Марио ломает столб Марио ломает столб Марио в костюме медоносной пчелы Марио в костюме медоносной пчелы Марио едет на велосипеде Марио едет на велосипеде Марио едет на Йоши Марио едет на Йоши Изображение Марио, бросающего баскетбольный мяч Изображение Марио, бросающего баскетбольный мяч Марио, бросающий огненный шар Марио, бросающий огненный шар Марио с огненным шаром Марио с огненным шаром Марио и Луиджи Изображение Марио и Луиджи Картинка Братья Марио Раскраски Братья Марио Раскраски Братья Марио Счастливые Фото Марио Счастливая Ма rio Pics Mario Color Pages Mario Color Pages Super Mario Images Super Mario Images Йоши — антропоморфный динозавр Йоши — антропоморфный динозавр

Рекомендуемые статьи:

Сегодня у детей есть так много возможностей для изучения своей творческой стороны.От компьютерных игр до консолей — все технологические чудеса у них под рукой. Тем не менее, родители находят утомительной задачей удерживать своих детей в творческой деятельности, особенно во время праздников или выходных.

Вам утомительно держать сына или дочь занятыми дома? Хотите внимательно следить за своими малышами? Без проблем! У нас есть простой и увлекательный вариант — дайте вашим детям раскраски для рисования.

Ваши дети хорошо относятся к вымышленным персонажам из комиксов и игр.Было бы благоразумно дать им раскраски с супер Марио. Этот тупой персонаж, ставший синонимом зарождения компьютерных игр, по-прежнему доступен в современных версиях в нескольких увлекательных компьютерных играх.

Топ-20 раскраски Супер Марио для детей:

Супер Марио — один из самых популярных сюжетов для раскраски. Дети любят заполнять раскраски Супер Марио яркими цветами. В этой статье вы найдете несколько раскрасок Супер Марио, изображающих их как в юмористической, так и в реалистичной манере.Ниже перечислены 20 раскрасок Супер Марио для печати, которые не оставят равнодушными ваших детей:

1. Марио, бросающий мяч:

На этой красивой картинке изображен персонаж Марио, который наклоняется назад и держит мяч, чтобы бросить его. Поскольку на этой картинке не так много элементов, вашим детям будет легко рисовать.

[Прочитано: Раскраски Симпсоны ]

2. Марио стоит рядом с гоночной машиной:

На этой фотографии изображен знаменитый игровой персонаж Марио, гордо стоящий с гоночной машиной.Автомобиль шикарный, и ваши дети могут использовать яркие контрастные оттенки, чтобы раскрасить его.

3. Марио, бросающий огненный шар с сердитым лицом:

Это отклонение от обычного веселого Марио. На этой картинке изображен Марио, бросающий во врага огненный шар. Выражение его лица вызывает гнев. Раскрасить эту картинку просто, так как единственный другой объект, который можно использовать помимо тела и платья Марио, — это пламя.

[Читать: Раскраски Паровозик Томас ]

4.Марио, бросающий огненный шар в сторону:

Это еще одна фотография, на которой Марио бросает огненный шар в противника, но на этой фотографии он показан сбоку. Боковая грань выглядит менее сердитой, а огненный шар не очень жестокий или большой.

[Прочитано: Angry Birds Coloring Pages ]

5. Лицом к лицу с Марио:

Это также одна из раскрасок супер Марио, на которой Марио изображен спереди. Он бежит, и его зрительный контакт находится на уровне зрителя. Других предметов на картинке нет, поэтому наполнение ее цветом не займет у малышей много времени.

6. Марио стоит с счастливым лицом:

Эта картинка, вероятно, идеальна, если вы хотите познакомить своих детей с идеей раскраски. В нем только Марио, а вокруг нет никаких предметов. Он стоит впереди с улыбкой. Картина определенно имеет приятный фактор.

[Читать: Smurf Coloring Pages ]

7. Марио стоит с рабочим:

Эту картинку можно подарить ребенку, когда он или она уже нарисовали несколько раскрасок.В нем Марио виден рядом с высоким коллегой. Есть намек на естественный фон. Любой ребенок, знакомый с игрой, определит это.

[Прочитано: Handy Manny Coloring Pages ]

8. Марио с Луиджи в смешном настроении:

Это еще одна классная раскраска Марио, которую вы можете подарить своим детям. На нем изображены Марио, стоящий рядом с Луиджи. Кажется, они оба в хорошем настроении. Марио показывает на пальцах знак победы.

9. Марио верхом на дружелюбном динозавре:

Эта картинка идеально подходит, чтобы привлечь внимание самого суетливого ребенка и соблазнить его раскрасить страницы.На нем изображен Марио верхом на дружелюбном динозавре.

[Прочитано: Раскраски Элвин и бурундуки, ]

10. Марио ломает столб:

Это еще одна картинка, на которой показан Марио в действии. Оказывается, он ломает столб и выглядит очень разгневанным. Два маленьких существа брошены в стороны. В небе летит крылатый детеныш динозавра. Картина обязательно понравится вашим детям рисовать.

11. Марио и Боузер:

Баузер (также известный как Купа) — персонаж видеоигры и главный антагонист франшизы Nintendo о Марио.В Японии персонаж носит имя Даймао или «Великий Король Демонов». Он — безусловный лидер черепахоподобной расы Купа и главный соперник Марио. Баузер хочет жениться на принцессе Пич, победить Марио и завоевать Грибное королевство. Баузер считается «самым успешным персонажем видеоигр». Панцирь черепахи Баузера имеет острые шипы, что придает ему характерный вид.

На этом снимке мы видим Марио и Баузера в одном кадре. Баузер прыгает на Марио, который просто ждет, чтобы атаковать его с топором.В картине присутствует действие, что делает ее динамичной и очень интересной.

12. Марио и Купа Троопа:

Эта маленькая черепаха по имени Купа Трупа имеет привычку временно втягиваться в свой панцирь. Это позволяет Марио использовать его в качестве снаряда, когда ему нужно атаковать своих врагов. Можете ли вы представить себе маленькую черепаху, превращающуюся в потенциальное оружие войны?

Эту картинку просто раскрасить, и ваш малыш с удовольствием наполнит ее своими любимыми оттенками.

13. Одет как медоносная пчела:

Ваш ребенок должен был присутствовать на конкурсе костюмов в школе. На что был похож ваш малыш — на фею, бабочку или медоносную пчелу? Ваш ребенок сразу же поймет эту картинку, если он одет как медоносная пчела для своей школьной культурной программы. Ему обязательно понравится раскрасить Марио в костюме медоносной пчелы.

Вы также можете научить своего ребенка, как медоносная пчела собирает нектар с цветов и хранит его в улье.Именно из улья мы получаем чистый мед. Пчелы также выращиваются отдельно на пасеках. Те, кто работает на пасеках, должны пользоваться специальной защитой, чтобы избежать болезненных укусов пчел. Эта раскраска также может служить эффективным средством обучения.

14. Марио как Санта-Клаус:

Рождество не за горами? Вы просили своего ребенка составить список того, что он хочет от Санта-Клауса? Первый вопрос, который обязательно задаст ваш ребенок, кто такой Дед Мороз? Так что будьте готовы с этим ответом:

Современная фигура Санта-Клауса образована от голландской фигуры Синтерклааса.Эта фигура Sinterklass основана на житийных сказках об исторической личности христианского епископа и дарителя Святого Николая. Санта-Клаус, широко известный как Санта, — персонаж легендарного, исторического и фольклорного происхождения. Он приносит подарки хорошим детям 24 декабря или в канун Рождества. В некоторых странах Европы дети получают подарки 6 декабря или в День Святого Николая.

Расскажите ребенку истории о детстве и о том, как вы праздновали Рождество. Ваш маленький ангелок будет рад получить подарки от Деда Мороза, услышав ваши детские воспоминания.Вы можете подарить ребенку праздничное настроение, раскрасив эту страницу, на которой изображен Марио в костюме Санта-Клауса. Также попробуйте выполнить некоторые из его желаний от имени Санта-Клауса. Выдуманный персонаж Санта-Клауса обязательно зажжет его воображение, и он будет слишком взволнован, чтобы спать. Вы всегда можете сказать своему ребенку, что Санта-Клаус придет дарить подарки, только когда он или она спит.

15. Марио на велосипеде:

Марио наслаждается поездкой на велосипеде на картинке. Его счастливое лицо показывает, что он действительно наслаждается поездкой.Если ваш ребенок неравнодушен к автомобилям и велосипедам и любит собирать плакаты с такими же изображениями, эта картина идеально ему подойдет. Он будет рад раскрасить эту страницу. Не забудьте прикрепить его как плакат для детской комнаты с автомобилями и велосипедами. Присутствие Марио на этой фотографии делает ее еще более особенной.

16. Марио и летающий шлем:

Это очень забавная картинка, на ней показано, как Марио пытается летать, используя шлем. На шлеме есть крошечное крылышко, которое помогает Марио летать.На нем также есть солнцезащитный козырек и буква «М». Марио одет в костюм и держит широко вытянутую руку. Он выглядит взволнованным, когда летает в этом специальном шлеме.

Первый вопрос, который задаст ребенку, где взять такой шлем? Ну, этот шлем с крыльями — ценное владение Марио. Вы можете увидеть Марио в этом шлеме в телесериалах или комиксах. Эта картинка обязательно станет увлекательной раскраской. Это будет держать вашего ребенка занятым на несколько часов.

17.Tip the Cap:

Наконечник шляпы — это акт опрокидывания или снятия шляпы или кепки в качестве культурного выражения признания, уважения, благодарности, приветствия, простого приветствия и признательности между двумя людьми. Этот обычай был очень популярен в Великобритании и постепенно завоевал популярность в остальной Европе и Америке. На этой фотографии мы видим, как Марио опускает кепку, чтобы поприветствовать вас. На крышке написана буква М. Ваш ребенок запомнит, что имя Марио начинается с М. Если Марио — любимый персонаж видеоигры вашего ребенка, вы должны прикрепить эту страницу как плакат после того, как ваш ребенок завершит раскраску.Также оцените его художественные работы, поскольку это повысит его уровень уверенности. Ваш ребенок также научится гордиться своей работой.

18. Верхом на Йоши:

Полное имя Йоши — Т. Йошисаур Мунчакупас, это вымышленный антроморфный динозавр, которого также иногда называют драконом. Йоши появляется в серии видеоигр Super Mario, опубликованной Nintendo. Йоши — помощник Марио и Луиджи. Марио часто садится на Йоши, и они путешествуют вместе.

Ваш ребенок обязательно будет широко улыбаться, раскрашивая этот веселый и милый рисунок Йоши.Мы видим, как Йоши наслаждается попкорном в театре. Сможете угадать, какой фильм он смотрит? Почему на его лице возбужденное выражение? Эта реалистичная настройка позволяет легко связать эту картинку.

19. Super Mario Galaxy:

Super Mario Galaxy — трехмерный платформер, разработанный Nintendo EAD Tokyo. Марио, звездный игрок в игре, отправляется на поиски принцессы Пич и спасения Вселенной от главного антагониста игры Боузера. Уровни — это галактики, заполненные второстепенными планетами и мирами, и в этой игре также есть эффекты гравитации и новые бонусы.Эта игра очень популярна среди детей. Яркие цвета планет и звезд захватывают их воображение. На этой картинке мы видим Марио посреди галактики, полной крошечных звезд.

Этот рисунок дает широкие возможности для максимального проявления творческих способностей. Только не позволяйте ребенку придерживаться цветных карандашей, вы можете научить его использовать разноцветные тюбики с блестками, чтобы картинка выглядела реалистично и ярко. Разноцветные камни на звездах могут придать этой картине новое измерение. Так что просто повеселитесь, раскрасьте эту страницу и приклейте ее в комнату вашего ребенка.Он будет рад продемонстрировать свои артистические способности своим друзьям и всем гостям, которые будут посещать ваш дом.

20. Марио и принцесса Пич:

Принцесса Пич — персонаж франшизы Nintendo о Марио. Персонаж принцессы Пич был создан Сигэру Миямото. Она — главная героиня и принцесса вымышленного Грибного королевства. Она постоянно находится под атакой главного злодея игры Боузера и часто оказывается девушкой в ​​беде. Ее спасает Марио, который влюбляется в нее.Здесь мы видим Марио и его любовный интерес принцессу Пич вместе. Вы можете нарисовать несколько сердечек, чтобы показать, что в воздухе витает романтика!

В то время как некоторые дети начинают раскрашивать только в три года, некоторых других нужно уговаривать и побуждать брать эти цветные карандаши. Раскрашивание не только заставляет вашего малыша учиться самостоятельно принимать решения, но и питает его воображение. Это также улучшает его моторику. Он знакомится с именами анимированных персонажей. В целом, раскрашивание — это всегда полезный опыт обучения!

Захватили ли эти бесплатные распечатанные онлайн-раскраски Супер Марио внимание вашего ребенка, ведь раскрашивать эти страницы тоже интересно и просто! Так чего же вы ждете? Загрузите эти раскраски Супер Марио и распечатайте их бесплатно прямо сейчас.Не забудьте поделиться своей раскраской Super Mario в разделе комментариев ниже.

ОТКАЗ ОТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ: Считается, что все изображения, найденные здесь, находятся в «общественном достоянии». Мы не намерены нарушать какие-либо законные интеллектуальные права, права на произведения искусства или авторские права. Все отображаемые изображения неизвестного происхождения. Если вы являетесь полноправным владельцем любого из размещенных здесь изображений / обоев и не хотите, чтобы они отображались или вам требуется соответствующий кредит, свяжитесь с нами, и мы немедленно сделаем все необходимое для того, чтобы изображение стало быть удаленным или предоставить кредит там, где это необходимо.