Пцр это: О методах тестирования на коронавирус

О методах тестирования на коронавирус

Москва сегодня является лидером среди мировых городов по тестированию горожан на выявление коронавирусной инфекции. Для этого в столице используются самые современные методы диагностики: ПЦР и ИФА (ИХЛА).

О ПЦР-диагностике

ПЦР (полимеразная цепная реакция) – метод, который позволяет выявить присутствие вируса в организме. Для исследования берется мазок из носа и ротоглотки.

Такое тестирование проводится всем жителям с симптомами ОРВИ, пациентам с пневмонией, проживающим с людьми, у которых уже был подтвержден диагноз «коронавирусная инфекция», а также всем пациентам некоронавирусных стационаров Москвы.

Анализ может быть взят врачом поликлиники на дому, в амбулаторном КТ центре или в стационаре.

Всего на сегодняшний день в Москве сделано более 1,7 млн. ПЦР-тестов.

Согласно требованиям Роспотребнадзора, если у пациента выявлен коронавирус, для выписки и подтверждения выздоровления необходимо два отрицательных результата.

В соответствии с указом Мэра Москвы, работодатели обязаны ПЦР методом тестировать на коронавирус не менее 10% сотрудников, физически посещающих предприятия, каждые две недели.

Об ИФА-тестировании

ИФА (ИХЛА) (иммуноферментный и иммунохемилюминесцентный анализ) – это лабораторное исследование по крови из вены, с помощью которого выявляют иммунный ответ к вирусу.

Анализ показывает количество антител IgM и IgG. Иммуноглобулины М говорят об активном иммунном ответе, то есть о том, что человек сейчас болеет коронавирусом. Иммуноглобулины G говорят о том, что человек уже переболел, и у него выработался иммунитет к вирусу.

Всего с начала применения метода ИФА уже проведено более 235 тысяч исследований. Из них более 18 тысяч тестов были сделаны для пациентов нековидных отделений стационаров.

ИФА-исследования проходят:

• все сотрудники медицинских организаций Департамента здравоохранения – еженедельно,
• пациенты стационаров – в день госпитализации,
• пациенты дневных стационаров и КТ-центров – при первом обращении,

• пациенты поликлиник (по направлению врача),

Москва также дополнительно обеспечивает проведение ИФА-тестов пациентам медицинских организаций Московской области – до 10 тыс. исследований в сутки. На сегодня для них проведено уже более 15 тысяч тестов.

С 15 мая на ИФА-тестирование в городские поликлиники приглашаются москвичи в рамках исследования формирования иммунитета к коронавирусу. Массовое ИФА-тестирование позволит выявить три категории людей:

• Бессимптомных носителей, у которых болезнь никак не проявляется, но они могут заражать других, не подозревая об этом.
• Пациентов с легкой и средней степенью течения болезни, у которых с момента заражения прошло две недели. За это время коронавирус мог опуститься в легкие, и обычный ПЦР-тест может его не обнаружить.
• Жителей столицы, которые переболели COVID-19 и выработали иммунитет к вирусу.

Пока принять участие в скрининге можно только по приглашению. Участники определяются методом случайной выборки среди всех возрастных групп и городских административных округов. Жителям, выбранным для исследования, приходит смс или e-mail. Тем, у кого подтвержден коронавирус, как и тем, кто болен ОРВИ, такие приглашения не приходят.

В сообщении указана ссылка для онлайн записи в пункт забора крови — запись доступна в течение 3 дней. Возможность сдачи теста всеми желающими в данный момент прорабатывается. Пока отрабатывается логистика и схема работы. Первоначально приглашение было направлено группе из 70 тысяч человек, на сегодняшний день приглашений было отправлено уже порядка 300 тыс.

Пришли и сдали анализ – более 27 тыс. человек, записано еще порядка 10 тыс. чел.

Во всех 30 поликлиниках, на базе которых проходит тестирование, действуют строгие правила работы. Сдача крови проводится только по предварительной записи, что позволяет избежать очередей в медицинских учреждениях и не допустить распространения коронавирусной инфекции. Перед кабинетами установлены стойки, на которых администраторы печатают направления – это сокращает время ожидания внутри кабинета.

С начала распространения коронавируса в поликлиниках приняты все необходимые меры безопасности: установлены бактерицидные лампы закрытого типа для обеззараживания воздуха, антисептики для рук, не менее двух раз в сутки проводится дезинфекция всех помещений, нанесены отметки для соблюдения 1,5-метровой дистанции, по возможности оборудован отдельный вход для пациентов с признаками ОРВИ.

Также в рамках государственно-частного партнерства Москва готова будет в ближайшее время в пределах имеющихся мощностей лабораторий предоставить их часть работодателям, которые в инициативном порядке захотят методом ИФА протестировать сотрудников на иммунитет. Работодатели должны будут самостоятельно организовать забор крови и ее доставку в установленный день в одну из лабораторий Департамента здравоохранения города Москвы (заранее определенную для работодателя). Предварительно необходимо будет подключиться к информационной системе «Реестр направлений и учет результатов исследований на COVID-19» для формирования электронных направлений на анализ, поскольку в городе данный процесс автоматизирован. Подробный порядок взаимодействия будет представлен Департаментом здравоохранения в ближайшее время.

О совместном применении тестов

Два вида тестов наилучшим образом работают совместно. ПЦР-диагностика позволяет поймать заболевание на ранней стадии, увидеть вирус, когда он находится в носоглотке. При этом ПЦР-тесты имеют немаленький процент ложных результатов при более поздних стадиях заболевания. В то же время ИФА-тестирование может служить как дополнительный инструмент. Такие тесты помогают выявить заболевания, когда с момента заражения уже прошло 2 недели и вирус опустился в легкие. В сочетании с КТ-диагностикой ИФА позволяет быстро определить наличие изменений в легких и применить необходимую терапию.

Как выявляют вирус COVID-19 с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени?

Вирус — это микроскопическая совокупность генетического материала, окруженного молекулярной оболочкой. Генетический материал может быть представлен либо ДНК, либо РНК. 

ДНК — это состоящая из двух цепей молекула, которая встречается во всех организмах, таких как животные, растения и вирусы, и содержит генетический код или алгоритм того, как эти организмы строятся и развиваются.

РНК обычно представляет собой состоящую из одной цепи молекулу, которая копирует, транскрибирует и передает части генетического кода белкам, чтобы они могли синтезировать и выполнять функции, которые поддерживают жизнь и развитие организмов. Существуют различные типы РНК, которые выполняют копирование, транскрибирование и передачу.

Некоторые вирусы, такие как коронавирус (SARS-CoV-2), содержат только РНК, что означает, что они полагаются на проникновение в здоровые клетки для размножения и выживания. Оказавшись внутри клетки, вирус использует свой собственный генетический код (РНК в случае коронавируса) чтобы взять под контроль и «перепрограммировать» клетки так, чтобы они стали фабриками по производству вирусов.  

Для того чтобы при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени выявить на раннем этапе присутствие в организме вируса, такого как коронавирус, ученым необходимо преобразовать РНК в ДНК. Этот процесс называется «обратной транскрипцией». Это делается потому, что только ДНК можно копировать (или амплифицировать), что и является ключевой частью процесса ОТ-ПЦР в реальном времени, применяемого для выявления вирусов.

Ученые амплифицируют определенную часть транскрибируемой вирусной ДНК в сотни тысяч раз. Амплификация важна, поскольку вместо того, чтобы пытаться найти ничтожное количество вируса среди миллионов цепей генетической информации, ученые имеют достаточно большое количество заданных участков вирусной ДНК, чтобы точно подтвердить, что вирус присутствует.

Биолог объяснила, почему ПЦР-тесты не выявляют наличие COVID-19

https://ria.ru/20201017/koronavirus-1580228232.html

Биолог объяснила, почему ПЦР-тесты не выявляют наличие COVID-19

Биолог объяснила, почему ПЦР-тесты не выявляют наличие COVID-19

Длительную пневмонию при отрицательном ПЦР-тесте на COVID-19 можно объяснить тем, что вирус спустился из носоглотки в легкие, сообщила РИА Новости профессор… РИА Новости, 17.10.2020

2020-10-17T03:05

2020-10-17T03:05

2020-10-17T11:45

распространение коронавируса

коронавирус в россии

коронавирус covid-19

россия

общество

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdn23.img.ria.ru/images/07e4/09/1c/1577906924_0:160:3072:1888_1920x0_80_0_0_f17d4569584c612f454db814ee9227b3.jpg

МОСКВА, 17 окт — РИА Новости. Длительную пневмонию при отрицательном ПЦР-тесте на COVID-19 можно объяснить тем, что вирус спустился из носоглотки в легкие, сообщила РИА Новости профессор Школы системной биологии Университета Джорджа Мейсона Анча Баранова.По ее словам, вирус стал перемещаться по организму гораздо быстрее. Баранова предположила, что это связано с новыми мутациями, и не исключила, что подобный эффект также может наблюдаться из-за того, что тесты стали делать «позже».Она пояснила, что если вируса в носоглотке человека уже нет, ПЦР-тест, для которого мазки берутся из носоглотки, не сможет его определить. Таким образом, складывается ситуация, когда вирус в легких содержится, но результат анализа отрицательный.»Если сильно постараться, то определить наличие коронавируса можно, есть другие анализы. Есть, например, бронхоальвеолярный лаваж, но это, мягко говоря, ужасно неприятный анализ. Во время этой процедуры человек испытывает чувства, как будто захлебывается, тонет, умирает”, — добавила Баранова.Определить наличие патогена позволяет и анализ кала, в ходе которого выделяется ДНК. Однако в этом случае трудно автоматизировать процесс, а при нынешних масштабах коронавирусной эпидемии диагностические лаборатории едва справляются и с простыми анализами, отметила биолог.Нередки ситуации, когда ПЦР-тест дает отрицательный результат, а у человека несколько недель длится пневмония. Это может быть связано с действием антител.Биолог уточнила, что битва организма с вирусом продолжится в легких, но обнаружить там вирус невозможно.»Когда битва происходит в легких, погибают не только вирусы, страдают и наши ткани. Их повреждение развитию пневмонии только помогает. Такого иммунного ответа достаточно, чтобы дать отрицательный тест, но недостаточно, чтобы избавиться от заболевания. У пневмонии может быть вирусная, бактериальная или еще какая-то природа. Надо разбираться”, — сказала Баранова. ПЦР-тестирование — мазок из носоглотки — считается самым надежным методом выявления COVID-19. По словам эксперта Центра молекулярной диагностики ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора Михаила Лебедева, экспресс-тесты также подходят для исследований, но они не всегда способны определить наличие иммуноглобулина М — антител, появление которых указывает на начало инфекции.

россия

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2020

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdn24.img.ria.ru/images/07e4/09/1c/1577906924_171:0:2902:2048_1920x0_80_0_0_811bba9b634015ea105293cb37797b6a.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

коронавирус в россии, коронавирус covid-19, россия, общество

МОСКВА, 17 окт — РИА Новости. Длительную пневмонию при отрицательном ПЦР-тесте на COVID-19 можно объяснить тем, что вирус спустился из носоглотки в легкие, сообщила РИА Новости профессор Школы системной биологии Университета Джорджа Мейсона Анча Баранова.

По ее словам, вирус стал перемещаться по организму гораздо быстрее. Баранова предположила, что это связано с новыми мутациями, и не исключила, что подобный эффект также может наблюдаться из-за того, что тесты стали делать «позже».

«Вместо того, чтобы при первом кашле скакать на сдачу анализа, человек выжидает денька два-три в самоизоляции — а вдруг пронесет. И при этом все время горло полощет, в нос себе капает всякое. От заболевания это не спасет, но вот из носоглотки коронавирус вытеснит», — сказала биолог.

Она пояснила, что если вируса в носоглотке человека уже нет, ПЦР-тест, для которого мазки берутся из носоглотки, не сможет его определить. Таким образом, складывается ситуация, когда вирус в легких содержится, но результат анализа отрицательный.

«Если сильно постараться, то определить наличие коронавируса можно, есть другие анализы. Есть, например, бронхоальвеолярный лаваж, но это, мягко говоря, ужасно неприятный анализ. Во время этой процедуры человек испытывает чувства, как будто захлебывается, тонет, умирает”, — добавила Баранова.

23 апреля 2020, 10:43ИнфографикаГолыми руками не возьмешь: чего боится новый коронавирус

Определить наличие патогена позволяет и анализ кала, в ходе которого выделяется ДНК. Однако в этом случае трудно автоматизировать процесс, а при нынешних масштабах коронавирусной эпидемии диагностические лаборатории едва справляются и с простыми анализами, отметила биолог.

Нередки ситуации, когда ПЦР-тест дает отрицательный результат, а у человека несколько недель длится пневмония. Это может быть связано с действием антител.

«Допустим, человек переболел бессимптомно или в очень легкой форме в апреле-июне. В организме появились антитела. Их не особо много, победить вирус не хватит, но они есть. При повторном заражении в сентябре антитела начинают бороться с вирусом там, где его больше всего: неподалеку от входных ворот инфекции, в верхних дыхательных путях, и там могут победить его, вывести. А на весь организм этих антител просто не хватит», — предположила Баранова.

Биолог уточнила, что битва организма с вирусом продолжится в легких, но обнаружить там вирус невозможно.

«Когда битва происходит в легких, погибают не только вирусы, страдают и наши ткани. Их повреждение развитию пневмонии только помогает. Такого иммунного ответа достаточно, чтобы дать отрицательный тест, но недостаточно, чтобы избавиться от заболевания. У пневмонии может быть вирусная, бактериальная или еще какая-то природа. Надо разбираться”, — сказала Баранова.

ПЦР-тестирование — мазок из носоглотки — считается самым надежным методом выявления COVID-19. По словам эксперта Центра молекулярной диагностики ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора Михаила Лебедева, экспресс-тесты также подходят для исследований, но они не всегда способны определить наличие иммуноглобулина М — антител, появление которых указывает на начало инфекции.

Что такое ПЦР-анализ?

Что такое ПЦР-анализ?

ПЦР — это метод лабораторной диагностики, направленный на выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Трёхбуквенный вариант — это аббревиатура названия «полимеразная цепная реакция». Собственно, в этом названии и отражается суть метода, но для того, чтобы разобраться, придётся основательно вспомнить школьный курс биологии.

Но сначала – немного истории. Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии. Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.

В литературе очень часто встречается такое образное описание ПЦР: это метод, с помощью которого учёные могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. В принципе, очень точное описание. Если продолжать сравнение, то игла – это небольшой участок генетического материала микроорганизма, а стог сена – это организм человека, в котором данный микроорганизм поселился.

Что показывает анализ ПЦР

Анализ позволяет обнаружить присутствие генетического материала инфекционных возбудителей. ПЦР в гинекологии и в урологии широко применяется для выявления скрытых и труднодиагностируемых инфекций. В том числе выполняется ПЦР и на ВИЧ.

Принцип работы

За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК — двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики – правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе.

У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) – своя ДНК, причём для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК, но и её фрагменты можно находить с помощью ПЦР.

Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий.

Один цикл ПЦР длится около трёх минут, количество копий растёт в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.

Достоинства

Теория – это, безусловно, замечательно, но что мы имеем на выходе? Какую практическую выгоду получает человек, когда отправляется на поиски вредоносных микроорганизмов, вооруженный ПЦР?

• Безусловно, одно из главных достоинств — это универсальностьметода. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем.
• Следующий плюс — высокая специфичность. В материале, направленном на исследование, определяется уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Таким образом, можно говорить, что специфичность метода достигает 100%. Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа.
• Метод обладает высочайшей чувствительностью – мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя.
• Несомненное преимущество метода – оперативность. Постановка реакции занимает несколько часов, таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет всего один день.
• При помощи ПЦР определяют возбудителя , а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.

Это важно! Как подготовиться к сдаче ПЦР-теста

В условиях сохранения рисков распространения новой коронавирусной инфекции Роспотребнадзор напоминает, что при сдаче ПЦР-теста необходимо соблюдать определенные рекомендации.

Что будет, если есть или пить перед сдачей мазков для теста ПЦР?

По инструкции к наборам для ПЦР-исследования на SARS-CoV-2 взятие мазков рекомендуется проводить не раньше 3–4 часов после последнего приема пищи. Почему это важно?

Коронавирус SARS-Cov-2 живет внутри эпителиальных клеток. Для ПЦР-исследования важно получить мазок с достаточным количеством инфицированных клеток. В момент проглатывания еды эпителиальные клетки механически слущиваются пищевым комком с поверхности слизистой оболочки. Если взять мазок сразу после еды, в пробирку может попасть недостаточное количество инфицированных клеток. В этом случае пациент может получить ложноотрицательный результат анализа. То же самое касается питья. Вода смывает с поверхности миндалин, задней стенки глотки инфицированные клетки.

Можно ли пользоваться лекарственными средствами в нос и горло (капли, спреи, антисептики) перед сдачей мазков?

Перед взятием мазков ни в коем случае нельзя использовать лекарственные средства для местного применения (капли, спреи и др.)! После их применения количество вируса на слизистой снижается и увеличивается вероятность получения ложноотрицательных результатов ПЦР-теста.

Можно ли употреблять алкоголь перед сдачей теста ПЦР и как это повлияет на результат?

Алкоголь содержит этиловый спирт (этанол), который также входит в состав многих антисептических средств. По рекомендациям Роспотребнадзора, для эффективного антисептического действия в составе дезинфицирующего средства должно быть не менее 60–80 % этилового спирта. Хотя в состав спиртных напитков (обычно) входит меньше этанола, чем необходимо для дезинфекции, но после приема алкоголя вероятность выявления коронавируса в мазке также может снизиться.

Почему нельзя чистить зубы перед сдачей теста ПЦР?

Основная цель на этапе взятия мазков для ПЦР-исследования – получить биологический материал с достаточным количеством клеток, пораженных коронавирусом. Применение любых очищающих средств для полости рта снижает количество вируса в получаемом мазке. Зубная паста может содержать антисептические компоненты. Попадание ее остатков в пробирку с мазком может мешать проведению анализа. Кроме того, чистка зубов требует еще и дополнительного полоскания рта, что также не рекомендовано перед забором биоматериала.

Применение косметики (помады, блески и бальзамы для губ) может повлиять на результат теста?

Материал для исследования берут не из полости рта, а из зева и носоглотки. Если соблюдать все правила взятия мазка и не прикасаться зондом к губам, то наличие декоративной косметики не должно помешать получению адекватного материала для ПЦР-теста. Но при случайном попадании в пробу косметические средства могут замедлить ПЦР-реакцию. Поэтому лучше декоративную косметику нанести уже после того, как мазок был взят.

Откуда все-таки берут мазок – из зева или носоглотки?

И из зева, и из носоглотки. Входными воротами для вируса SARS-CoV-2 являются верхние дыхательные пути. После попадания на слизистые носо- и ротоглотки (зева) вирус начинает размножаться в эпителиальных клетках. Поэтому в конце инкубационного периода и в первые дни клинических проявлений наиболее информативными являются мазки именно из этих областей. Для исследования мазок берут с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. При взятии мазка из носоглотки зонд вводят по наружной стенке носового хода на достаточную глубину. Мазок, взятый со слизистой преддверия носа, может не выявить РНК коронавируса SARS-CoV-2.

Важно!

Минимум за 3 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) нельзя: принимать пищу, пить, чистить зубы, полоскать рот / горло, использовать спрей-освежитель для ротовой полости, жевать жевательную резинку, курить.

Минимум за 3 часа до взятия мазков из носоглотки нельзя: промывать нос, использовать спреи, капли, мази для носа.

За два дня до взятия мазка рекомендуется отказаться от употребления спиртных напитков!

Подготовка пациента к ПЦР-диагностике

Общие рекомендации по подготовке к ПЦР-диагностике

Помните, что достоверные результаты можно получить только в том случае, если соблюдать несложные рекомендации, приведенные ниже!

1. За сутки до сдачи анализа исключить интимную близость.

При взятии мазка:

• Для женщин — не брать мазок перед началом менструации.
• Для мужчин — перед взятием материал воздержаться от мочеиспускания в течение полутора-двух часов.

Рекомендации по подготовке к сдаче анализов на инфекции, передаваемые половым путем

В некоторых случаях заболевания протекают так, что их трудно выявить. То есть, человека практически ничего не беспокоит, но в то же время он болен и ему необходимо лечение. Для того, чтобы точно выявить заболевание, передаваемое половым путем, необходимо придерживаться нескольких несложных правил, соблюдение которых обеспечит наилучшую выявляемость:

1. Перед сдачей материала на исследование потерпите пару часов, воздержитесь от мочеиспускания. Это необходимо для того, чтобы инфекция скопилась в нужном для выявления количестве.
2. Воздержитесь от возможной интимной близости в течение  суток, предшествующих сдаче ПЦР-анализов. Это также необходимо для того, чтобы инфекция скопилась в нужном количестве в предстательной железе или влагалище.
3. Женщины по возможности сдают анализы на ПЦР-диагностику на 4-5 день менструального цикла. Это обеспечивает наилучшую выявляемость инфекций.

Настоятельно рекомендуется провести так называемую провокацию перед забором анализов на ПЦР-диагностику. Эту процедуру проводит лечащий врач или сам пациент по рекомендации врача. Она заключается в небольшом потреблении слабоалкогольных напитков и острой пищи для временного ослабления иммунной системы человека.

ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний

ПЦР — диагностика (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, который основывается на исследовании генетического материала человека (ДНК и РНК). В зависимости от цели исследования используются кровь, слюна, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы.

ПЦР — анализ

Часто бывает, что различные по своей природе вирусы могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. ПЦР анализ позволяет определить наличие возбудителя, даже при минимальном содержании его штаммов в биологическом материале, а в отдельных случаях, выявляет даже единичные клетки вирусов или бактерий. Определяется вирус, природа его появления, устанавливается сила его воздействия на организм и количество имеющихся микробов в организме. Эта информация важна для лечащего врача при выборе лекарственных препаратов и назначении методов лечения.

В настоящее время ПЦР тест позволяет выявлять все известные современной медицине вирусные заболевания. В том числе даже те, которые могут годами «жить» в организме человека и не проявлять себя, ожидая наиболее комфортных условий для своей «работы». Диагностика «растущих» длительное время возбудителей особенно актуальна в гинекологии и урологии.

В медицинской лаборатории «Синэво» можно пройти ПЦР — диагностику по следующим заболеваниям:

Гепатит B и C

Проведение ПЦР — диагностики необходимо здесь в силу того, что вирус гепатитов имеет продолжительный инкубационный период (до 180 дней) и достаточно серьезные последствия, вплоть до летального исхода.

ИППП

Заболевания, передающиеся половым путем: уреплазмол половых органов, хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз. Коварство заключается в том, что симптомы данных заболеваний зачастую на ранних стадиях «стерты». Эта группа заболеваний опасна тем, что может вызвать у женщин бесплодие, оказывает серьезное влияние на течение беременности, увеличивает риск развития рака шейки матки. У мужчин снижается подвижность и жизнеспособность сперматозоидов, вызывая мужское бесплодие, поражается мочеиспускательный канал и развивается простатит. Увеличиваются риски заболевания генитальным герпесом, а так же ВИЧ/СПИД. Пакет 18.1 «Обследование на ИППП».

Сдать анализ рекомендуется и супругам, желающим родить здорового ребенка. Ведь только ПЦР — диагностика позволяет выявить скрытые инфекции в организме и предотвратить их проникновение в организм плода.

Герпес

Опасное и устойчивое заболевание. Зачастую болезнь не системна и протекает долгие годы в неактивном режиме. При этом возможны проявления, похожие на симптомы герпеса. Но истекают они так быстро, что не возможно точно поставить диагноз традиционным способом. Опасность герпеса в том, что он может поражать центральную нервную систему и стать причиной развития менингита и энцефалита. См. услуги ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (соскоб) и ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (кровь, качественное определение).

Тест на отцовство

Благодаря ПЦР — диагностике инфекции выявляются на начальном этапе их развития, что способствует скорейшему выздоровлению и предотвращению серьезных осложнений.

Что такое ПЦР? — Science Learning Hub

ПЦР — это сокращение для простой, но очень полезной процедуры в молекулярной биологии, которая называется олимераза p c hain r eaction . Это метод, используемый для амплификации интересующего сегмента ДНК или получения множества копий. Другими словами, ПЦР позволяет получить миллионы копий определенной последовательности ДНК из изначально небольшого образца — иногда даже одной копии. Это важнейший процесс для ряда генетических технологий, который, по сути, позволил разработать ряд новых технологий.

Как работает ПЦР?

ПЦР имитирует то, что происходит в клетках, когда ДНК копируется (реплицируется) до деления клетки, но ее проводят в контролируемых условиях в лаборатории. Используемая машина называется просто ПЦР-машиной или термоциклером. Пробирки, содержащие интересующую смесь ДНК, помещают в машину, и машина меняет температуру в соответствии с каждым этапом процесса.

Стандартные ингредиенты в смеси:

• интересующий сегмент ДНК
• специфические праймеры
• термостойкий фермент ДНК-полимераза
• четыре различных типа нуклеотидов ДНК
• соли, необходимые для создания подходящей среды для фермент действовать.

Что такое процесс ПЦР?

Шаг 1: денатурация

Как и в случае репликации ДНК, две цепи двойной спирали ДНК необходимо разделить.

Разделение происходит за счет повышения температуры смеси, в результате чего водородные связи между комплементарными цепями ДНК разрываются. Этот процесс называется денатурацией.

Этап 2: Отжиг

Праймеры связываются с последовательностями ДНК-мишени и инициируют полимеризацию.Это может произойти только после того, как температура раствора будет понижена. С каждой нитью связывается один праймер.

Шаг 3: Расширение

Новые цепи ДНК создаются с использованием исходных цепей в качестве шаблонов. Фермент ДНК-полимераза объединяет свободные нуклеотиды ДНК. Этот фермент часто представляет собой Taq-полимеразу, фермент, первоначально выделенный из термофильных бактерий, называемых Thermus aquaticus. Порядок добавления свободных нуклеотидов определяется последовательностью нуклеотидов в исходной (матричной) цепи ДНК.

Результатом одного цикла ПЦР являются две двухцепочечные последовательности целевой ДНК, каждая из которых содержит одну новую цепь и одну исходную цепь.

Цикл повторяется много раз (обычно 20–30), поскольку для большинства процессов с использованием ПЦР требуется большое количество ДНК. Чтобы получить около миллиарда копий, требуется всего 2–3 часа.

Технология ПЦР все еще развивается. Постоянно совершенствуются и совершенствуются используемые процессы и инструменты, позволяющие адаптировать процесс к потребностям специалистов.Например, разрабатываются и используются новые методы и усовершенствования, особенно когда требуется количественное определение ДНК в образце. Новые методы включают ПЦР в реальном времени или количественную ПЦР (qPCR) и цифровую PCR (dPCR). В кПЦР амплификация ДНК отслеживается в реальном времени, что позволяет количественно определять целевую ДНК на протяжении всего процесса. ЦПЦР — это новый, более совершенный подход, который разбивает процесс ПЦР на множество более мелких этапов. Он предлагает повышенную точность, более надежные измерения и абсолютный количественный анализ очень маленьких или смешанных образцов.

Природа науки

Развитие новых технологий, таких как ПЦР, позволяет делать новые открытия. Могут быть разработаны и другие технологии. См. Для чего используется ПЦР? для некоторых примеров того, как используется ПЦР, и различных типов исследований и процессов, которые возможны благодаря этому.

Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Справочная информация

Стандартная полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод in vitro , который позволяет одной короткой области молекулы ДНК (возможно, одному гену) многократно копироваться полимеразой Taq .Из одной копии ДНК (шаблона) исследователь может создать тысячи идентичных копий, используя простой набор реагентов и базовый цикл нагрева и охлаждения (денатурации и отжига). Процесс стал автоматизированным с открытием термостойкой ДНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq) . Полимераза Taq может выдерживать множество циклов нагрева и охлаждения, которые денатурируют ДНК-полимеразы других видов.

В дополнение к матричной ДНК и полимеразе Taq для ПЦР требуются свободные нуклеотиды [dNTP; аденин (A), цитозин (C), гуанин (G), тимин (T)] в равном молярном соотношении.Для этого также требуются два уникальных одноцепочечных олигонуклеотидных (олиго) праймера для ДНК, которые отжигаются с областями выше (5 ’) и ниже (3’) сегмента ДНК, подлежащего амплификации. Когда эти реагенты объединяются в подходящем буфере, серия стадий нагревания (денатурации) и охлаждения (отжига) позволяет полимеразе Taq копировать ДНК между олигопраймерами. Этот метод молекулярной биологии создает несколько микрограммов целевой ДНК из нескольких нанограмм матричной ДНК с помощью нескольких циклов денатурации, отжига и синтеза.После завершения ПЦР продукт может быть проверен по размеру с помощью

гель-электрофорез.

Протокол видео

Посмотрите видео с протоколом ниже, чтобы узнать, как проводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Базовая программа ПЦР

1. Начальная денатурация в течение 2 минут при 94 ° C: Эта стадия инициации нагревает двухцепочечную матричную цепь ДНК до точки, когда цепи начинают денатурировать и водородные связи между парами нуклеотидных оснований разрываются.Первоначальный этап денатурации обычно выполняется при 94–98 ° C.

2. Денатурация 30 секунд при 94 ° C: Продолжающаяся денатурация двухцепочечной ДНК.

3. Праймеры для отжига в течение 30 секунд при 55 ° C: Прямой и обратный праймеры стабильны в этом диапазоне температур для отжига с каждой из однонитевых цепей матрицы ДНК. ДНК-полимераза также достаточно стабильна, чтобы теперь связываться с последовательностью ДНК праймера.

4. Удлинение ДНК в течение 1 минуты при 72 ° C: Полимераза Taq имеет оптимальную температуру около 70-75 ° C, поэтому этот этап позволяет ДНК-полимеразе синтезировать и точно и быстро удлинить новую цепь ДНК-мишени.

5. Повторить шаги 2-4 25-30 раз.

6. Окончательное удлинение в течение 5 минут при 72 ° C: Окончательное удлинение для заполнения любых выступающих концов вновь синтезированных нитей.

Перечень материалов

Реагенты на каждые 50 мкл ПЦР:

• Тонкостенная пробирка для ПЦР
• Ведро для льда
• 2 мкл матричной ДНК (10 нг-500 нг)
• 5 мкл 10-кратного буфера Taq с MgCl ₂
• 1 мкл смеси dNTP (10 мМ каждая нота)
• 2,5 мкл прямого праймера (10 мкМ в исходном состоянии)
• 2,5 мкл обратного праймера (10 мкМ в исходном состоянии)
• 36.8 мкл стерильно dH ₂ O
• 0,2 мкл ДНК-полимеразы Taq (5 единиц / мкл)
• ПЦР-машина
• Агарозный гель

Процедура

Дизайн праймеров и ПЦР

1. Грунтовки для дизайна. См. Наш протокол о том, как создавать праймеры.

   Примечание: Primer3 — отличный ресурс для выбора грунтовок.

2. Поместите тонкостенные ПЦР-пробирки на лед

3. Настройте реакцию на 50 мкл (держите все реагенты на льду):

   Примечание: Если вы проводите несколько ПЦР, сэкономьте время, создав «мастер-микс», который минимизирует количество необходимых вам небольших объемов пипетировать.Если вы используете одну и ту же матричную ДНК для всех своих реакций, матричную ДНК можно добавить в мастер-микс. Прямой и обратный праймеры НЕ ДОБАВЛЯЮТ к мастер-миксу.

4. Поместите реакционные пробирки в ПЦР-машину.

5. Установите температуру отжига на 5 ° C ниже температуры плавления праймера (Tm).

6. Установите шаг расширения на 1-2 минуты на килобазу продукта в зависимости от того, используете ли вы полимеразу с возможностью корректуры.

   Примечание: См. Инструкции производителя для получения конкретных инструкций о времени продления и температурах.

7. Начальная денатурация в течение 2 минут при 94 ° C.

8. Денатурация в течение 30 секунд при 94 ° C.

9. Отжиг праймеров в течение 30 секунд при 55 ° C (или на 5 ° C ниже Tm).

10. Удлините ДНК в течение 2 минут при 72 ° C.

11. Повторите шаги 8-10 для 25-30 циклов.

12. Окончательное удлинение в течение 5 минут при 72 ° C.

13. Выполните 2 мкл геля, чтобы проверить размер и концентрацию продукта ПЦР.

Приготовление мастер-микса

14. Умножьте объем каждого реагента на количество отдельных ПЦР, которые вы хотите провести, и добавьте 10% дополнительных, чтобы учесть ошибку пипетирования. В этом примере у нас есть 7 различных реакций (7 уникальных пар праймеров), поэтому мы умножаем каждый объем на 7.

15. В одной пробирке объемом 1,5 мл объедините следующее:

16. Смешайте содержимое, осторожно пипетируя несколько раз вверх и вниз. Держите трубку на льду.

17. Добавьте прямой и обратный праймеры в тонкостенные пробирки для ПЦР.

    Примечание: Сделайте это перед добавлением мастер-микса, чтобы вы знали, что праймеры были добавлены, нанесите пипеткой прямой праймер на одну сторону стенки пробирки, а обратный праймер — на другую.

18. Добавьте мастер-микс в тонкостенные пробирки для ПЦР. Поместите 50 мкл — 2,5 мкл (прямой праймер) — 2,5 мкл (оборотный праймер) = 45 мкл объема мастер-микса для добавления в каждую пробирку для ПЦР.

19. Прикрепите верхние части к пробиркам для ПЦР, осторожно постучите по каждой пробирке, чтобы вся жидкость опустилась на дно, прежде чем помещать ее в аппарат для ПЦР.

Праймеры для разбавления

Большинство людей заказывают праймеры у компании, которая синтезирует и отправляет их в виде лиофилизированного порошка.Затем исследователю необходимо восстановить свои праймеры в жидкости, обычно стерильной dH ₂ O. Чтобы приготовить 100 мкМ любого праймера, добавьте количество мкл dH ₂ O, равное количеству наномолей ДНК, умноженному на 10. Например, если длина вашей лиофилизированной ДНК составляет 38,5 нм, добавьте 385 мкл воды.

После приготовления 100 мкМ массы немедленно сделайте рабочую концентрацию каждого праймера (10 мкМ), разбавив смесь 1:10. Например, добавьте 100 мкл исходного грунтовочного раствора к 900 мкл dH ₂ O.

Советы и часто задаваемые вопросы

• Если ваша целевая последовательность ДНК является GC-богатой, увеличьте время денатурирования.

• Ваши 5 ’и 3’ грунтовки должны иметь одинаковую температуру плавления (Tm). Установите температуру отжига на 5 ° C ниже, чем Tm ваших праймеров. Если вы получаете неспецифические продукты ПЦР, постепенно увеличивайте температуру отжига на 1-2 ° C.

• Скорость синтеза ДНК ~ 1-2 т.п.н. / мин. Время продления можно регулировать в соответствии с длиной целевой последовательности.

• Как создать праймеры? См. Нашу справочную страницу о том, как создавать праймеры для получения подробных инструкций, и ознакомьтесь с нашим протоколом клонирования плазмид с помощью ПЦР, чтобы узнать, как создавать праймеры для целей клонирования.

• Что мне делать, если мой ПЦР не работает? Попробуйте добавить 1 мкл 25 мМ MgCl ₂ и / или 1 мкл ДМСО в каждую реакцию.Идеальная установка для этого шага устранения неполадок — выполнить одну реакцию для каждого и одну реакцию для обоих. MgCl ₂ действует как дополнение к количеству, поставляемому буферным раствором, который, как известно, образует градиент при замораживании. ДМСО помогает при денатурации ДНК, особенно для матриц с высоким содержанием ГХ.

• Что конкретно делает каждый ингредиент?

  Шаблон ДНК содержит часть ДНК, которую мы хотим амплифицировать для анализа и манипуляции.Для эффективной работы ПЦР важно, чтобы матричная ДНК и праймер дополняли друг друга.

  Taq Буфер с MgCl ₂ обеспечивает оптимальную и стабильную химическую среду для адекватной работы ДНК-полимеразы. Двухвалентные катионы, такие как Mg ²⁺ и Mn ²⁺ , стабилизируют буферный раствор. Эти катионы также можно использовать для мутагенеза ДНК, опосредованного ПЦР. Более высокая концентрация катионов увеличивает частоту ошибок ДНК-полимеразы.

  Деоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP) представляют собой строительные блоки, добавляемые по одному к новой цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы.

  Прямой и обратный праймеры гибридизуются и комплементарны 3 ’концам смысловой и антисмысловой цепей матричной ДНК. Это нити нуклеиновой кислоты, которые являются отправными точками для удлинения и синтеза ДНК.

  Taq ДНК-полимераза — это особая ДНК-полимераза, которая может выдерживать радикальные изменения температуры во время типичной ПЦР.ДНК-полимераза имеет оптимальную температуру около 70 ° C и является молекулой, ответственной за синтез ДНК.

  Стерильный dH ₂ O используется для заполнения оставшихся 50 мкл реакционной смеси. Его способности к растворителю и буферу обеспечивают подходящую среду для реакции амплификации ДНК.

Что такое ПЦР? — Руководство для начинающих

ПЦР — это методика современных лабораторий молекулярной биологии.Если вам нужно скопировать, секвенировать или количественно оценить ДНК, вам нужно знать ПЦР. Короче говоря, ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это биохимический метод, который использует термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК, и он был изобретен во вспышке вдохновения ученым, проезжающим по шоссе 128 из Сан-Франциско в Мендосино.

В этой статье дается краткий базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или относительно плохо знакомы с ПЦР, то это для вас.(И даже если у вас есть опыт работы с ПЦР, его стоит прочитать, чтобы освежиться, и, возможно, получить пару советов!).

Основные ингредиенты для ПЦР:

Полимераза

Полимеразы — это ферменты, которые в определенных условиях могут собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была обременительной, поскольку высокие температуры, необходимые для денатурирования ДНК, убивали бы полимеразы. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы нужно было вручную добавлять в реакцию — дорогостоящее мероприятие.Однако в современной ПЦР это не проблема, поскольку полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух источников термофильных бактерий: Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus . Эти полимеразы, соответственно Taq (произносится как «липкость») и Pfu (произносится как «P-F-U»), легко выдерживают высокие температуры, связанные с реакцией ПЦР. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu разработаны для обеспечения скорости, точности, процессивности (способности выполнять длинные чтения) и их способности читать шаблоны GC-rich.Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на «все, что у вас в морозилке», а выбирайте лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд ПЦР. Также поговорите со своим местным торговым представителем, так как они часто могут выдать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.

Шаблон ДНК

Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша матричная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК, но независимо от качества вашего источника.Чем более неповрежденной и чище ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно от 1 до 1 нг плазмидной ДНК или от 1 до 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.

Грунтовки

Праймеры

— это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей матричной ДНК. Вам нужно будет создать одну «прямую» грунтовку и одну «обратную» грунтовку. Ваш прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как последовательность вашей ДНК-матрицы 5´-3´.Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратным комплементом вашей матричной ДНК. Как правило, длина праймеров составляет 18–22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, температура плавления ваших грунтовок. Температура плавления ваших грунтовок должна составлять 54-60 ° C и быть максимально похожей друг на друга. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитать температуру отжига праймеров, и большинство компаний, производящих праймеры, предоставляют такие калькуляторы.

Нуклеотиды

Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий ДНК. Для большинства ДНК-ПЦР вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания / оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их должным образом — не используйте морозильную камеру с функцией автоматического размораживания.

Буфер

Большинство коммерческих полимераз поставляются со своим идеальным буфером. Эти буферы не только обеспечивают правильный pH, но и всегда содержат добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирующую, ренатурирующую и полимеразную активность ДНК. Подробнее об этих добавках мы поговорим в следующей статье.

Термоциклирование:

Здесь происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляются в пробирку для ПЦР, и пробирка подвергается термоциклированию.Когда впервые была изобретена ПЦР, для достижения термоциклирования отдельные пробирки для ПЦР вручную перемещали между нагретыми водяными банями. (И вы думаете, что ваша работа на скамейке утомительна!) Теперь, благодаря изобретению «Мистер. Cycles », первой машины для термоциклирования, регулирование температуры теперь осуществляется автоматически с помощью термоциклеров. Ниже приведен типичный профиль термоциклера для ПЦР:

1. Инициализация

На этой стадии реакцию нагревают до 94-96 ° C в течение от 30 секунд до нескольких минут.Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции ПЦР. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую ​​полимеразу, и для денатурирования вашей ДНК-матрицы. Имейте в виду, что если содержимое GC в вашем шаблоне велико, вам может потребоваться выполнить очень длинный шаг инициализации.

2. Денатурация (повторение 15-40 раз)

На этой стадии реакцию нагревают до 94-98 ° C в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжечь друг друга на следующем шаге.

3. Отжиг (15-40 раз)

На этом этапе температура реакции быстро понижается до 50-64 ° C на 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований Ватсона-Крика с ДНК-шаблоном. Но достаточно высоки, чтобы образовывались только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже температуры плавления пары праймеров.Также на этом этапе ваша полимераза связывается с комплексом ДНК праймер / матрица. Хотя ваша полимераза не начнет считывать, пока температура не будет повышена на следующем шаге.

4. Удлинение или удлинение (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе ваша реакция быстро нагревается до 72-80 ° C. Это когда ваша полимераза начнет читать (в направлении 5´-3´) и копировать вашу матричную ДНК (в направлении 3´-5´). Более высокая температура на этом этапе снижает неспецифические взаимодействия праймер / матрица ДНК, тем самым повышая специфичность вашей реакции.Однако точная температура будет зависеть от предпочтений вашей полимеразы, поэтому ознакомьтесь с информацией на упаковке. Продолжительность этого шага зависит от того, какой длины будет ваша копия ДНК. Обычно ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Таким образом, вам необходимо выделить не менее 1 минуты на продление на 1000 баз. В конце этой инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.

Шаги 2-4 повторяются 15-40 раз

Это правда, что чем больше циклов вы запрограммируете, тем больше копий ДНК вы создадите.Однако есть верхний предел. В какой-то момент количество доступных свободных нуклеотидов становится ограниченным, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте с ездой на велосипеде. Меньше, но хороший чистый продукт ПЦР предпочтительнее большого количества грязного продукта.

5. Окончательное удлинение

Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этой стадии реакцию выдерживают при 70-74 ° C в течение нескольких минут. (Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на этапе удлинения или удлинения.Этот шаг позволяет полимеразам завершить чтение той нити, на которой они в настоящее время находятся. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.

6. Окончательная задержка

Теперь ваша реакция завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи или когда вы отступили; Рекомендуется запрограммировать термоциклер на температуру продукта ПЦР 4 ° C до вашего возвращения. В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт или перенести его в более подходящее место для длительного хранения, например, в холодильник.

Удачи и счастливой ПЦР!

Вам это помогло? Тогда поделитесь, пожалуйста, со своей сетью.

В чем разница между ПЦР, ОТ-ПЦР, КПЦР и ОТ-КПЦР?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это относительно простой и широко используемый метод молекулярной биологии для амплификации и обнаружения последовательностей ДНК и РНК. По сравнению с традиционными методами клонирования и амплификации ДНК, которые часто могут занимать несколько дней, ПЦР требует всего несколько часов.ПЦР очень чувствительна и требует минимального количества матрицы для обнаружения и амплификации конкретных последовательностей. Основные методы ПЦР далеко продвинулись по сравнению с простым обнаружением ДНК и РНК. Ниже мы представили обзор различных методов ПЦР и реагентов, которые мы предоставляем в Enzo Life Sciences для ваших исследовательских нужд. Мы стремимся помочь ученым быстро получить доступ к реактивам ПЦР для использования в их следующем исследовательском проекте!

ПЦР

Для стандартной ПЦР все, что вам нужно, это ДНК-полимераза, магний, нуклеотиды, праймеры, матрица ДНК для амплификации и термоциклер.Механизм ПЦР так же прост, как и его цель: 1) двухцепочечная ДНК (дцДНК) денатурируется нагреванием, 2) праймеры выравниваются с одиночными цепями ДНК и 3) праймеры удлиняются ДНК-полимеразой, в результате чего образуются две копии оригинала. Нить ДНК. Процесс денатурации, отжига и удлинения в течение ряда температур и времен известен как один цикл амплификации. Каждый этап цикла должен быть оптимизирован для используемой матрицы и набора праймеров. Этот цикл повторяется примерно 20-40 раз, после чего амплифицированный продукт может быть проанализирован.ПЦР широко используется для амплификации ДНК для последующего экспериментального использования. ПЦР также применяется в генетическом тестировании или для обнаружения патогенной ДНК.

Поскольку ПЦР — высокочувствительный метод и для отдельных реакций требуются очень небольшие объемы, рекомендуется приготовление мастер-микса для нескольких реакций. Мастер-микс необходимо хорошо перемешать, а затем разделить по количеству реакций, чтобы каждая реакция содержала одинаковое количество фермента, dNTP и праймеров. Многие поставщики, такие как Enzo Life Sciences, также предлагают смеси для ПЦР, которые уже содержат все, кроме праймеров и матрицы ДНК.

Области, богатые гуанином / цитозином (GC-богатые), представляют проблему в стандартных методах ПЦР. Последовательности с высоким содержанием GC более стабильны, чем последовательности с более низким содержанием GC. Более того, GC-богатые последовательности имеют тенденцию образовывать вторичные структуры, такие как шпильки. В результате двойные цепи, богатые GC, трудно полностью разделить во время фазы денатурации. Следовательно, ДНК-полимераза не может беспрепятственно синтезировать новую цепь. Более высокая температура денатурации может улучшить это, а корректировки в сторону более высокой температуры отжига и более короткого времени отжига могут предотвратить неспецифическое связывание праймеров с высоким содержанием GC.Дополнительные реагенты могут улучшить амплификацию GC-богатых последовательностей. ДМСО, глицерин и бетаин помогают разрушить вторичные структуры, вызванные взаимодействиями GC, и тем самым облегчить разделение двойных цепей.

ПЦР горячего старта

Неспецифическая амплификация — это проблема, которая может возникнуть во время ПЦР. Большинство ДНК-полимераз, используемых для ПЦР, лучше всего работают при 68–72 ° C. Следовательно, выбранная температура расширения должна находиться в этом диапазоне. Однако фермент может быть в меньшей степени активен и при более низких температурах.При температурах, которые намного ниже температуры отжига, праймеры имеют тенденцию к неспецифическому связыванию, что может привести к неспецифической амплификации, даже если реакция проводится на льду. Этого можно избежать, используя ингибиторы полимеразы, которые отделяются от ДНК-полимеразы только при достижении определенной температуры. Ингибитор может быть антителом, которое связывает полимеразу и денатурирует при начальной температуре денатурации.

ОТ-ПЦР

ПЦР с обратной транскрипцией или ОТ-ПЦР позволяет использовать РНК в качестве матрицы.Дополнительный шаг позволяет обнаруживать и амплифицировать РНК. РНК обратно транскрибируется в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы. Качество и чистота матрицы РНК имеют важное значение для успеха ОТ-ПЦР. Первым этапом ОТ-ПЦР является синтез гибрида ДНК / РНК. Обратная транскриптаза также выполняет функцию РНКазы Н, которая разрушает РНК-часть гибрида. Затем молекула одноцепочечной ДНК дополняется ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью обратной транскриптазы в кДНК.Эффективность реакции первой цепи может повлиять на процесс амплификации. С этого момента стандартная процедура ПЦР используется для амплификации кДНК. Возможность превратить РНК в кДНК с помощью ОТ-ПЦР имеет много преимуществ. РНК одноцепочечная и очень нестабильная, что затрудняет работу с ней. Чаще всего он служит первым шагом в кПЦР, который определяет количество транскриптов РНК в биологическом образце.

КПЦР и ОТ-КПЦР

Количественная ПЦР (кПЦР) используется для обнаружения, характеристики и количественного определения нуклеиновых кислот во многих областях.Обычно в RT-qPCR транскрипты РНК количественно определяют путем их обратной транскрипции сначала в кДНК, как описано выше, а затем проводят qPCR. Как и в стандартной ПЦР, ДНК амплифицируется в 3 повторяющихся этапа: денатурация, отжиг и удлинение. Однако в кПЦР флуоресцентная маркировка позволяет собирать данные по мере продвижения ПЦР. Этот метод имеет много преимуществ благодаря доступным методам и химическим свойствам.

В КПЦР на основе красителя (обычно зеленого цвета) флуоресцентное мечение позволяет количественно определять амплифицированные молекулы ДНК с использованием красителя, связывающего дцДНК.Во время каждого цикла измеряется флуоресценция. Сигнал флуоресценции увеличивается пропорционально количеству реплицированной ДНК, и, следовательно, ДНК количественно определяется в «реальном времени». Недостатки кПЦР на основе красителя заключаются в том, что одновременно можно исследовать только одну мишень и что краситель будет связываться с любой ds-ДНК, присутствующей в образце.

При кПЦР на основе зондов в каждом образце можно одновременно обнаружить множество мишеней, но для этого требуется оптимизация и разработка зонда, специфичного для мишени, используемых в дополнение к праймерам.Доступно несколько типов конструкций зондов, но наиболее распространенным типом является зонд для гидролиза, который включает использование флуорофора и гасителя. Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) предотвращает испускание флуорофора через гаситель, пока зонд не поврежден. Однако во время реакции ПЦР зонд гидролизуется во время удлинения праймера и амплификации конкретной последовательности, с которой он связан. Расщепление зонда отделяет флуорофор от гасителя и приводит к увеличению флуоресценции, зависящему от амплификации.Таким образом, сигнал флуоресценции от реакции qPCR на основе зонда пропорционален количеству целевой последовательности зонда, присутствующей в образце. Поскольку количественная ПЦР на основе зонда более специфична, чем КПЦР на основе красителей, эта технология часто используется в диагностических анализах количественной ПЦР.

Более подробную информацию можно найти на нашем веб-сайте: AMPIGENE® PCR & qPCR Solutions. Миссия Enzo — предоставлять недорогие, легко адаптируемые и эффективные решения для диагностического рынка. Наша платформа AMPIPROBE® использует новый дизайн ПЦР для количественного определения нуклеиновых кислот для клинически значимых мишеней.Наши анализы легко адаптируются для лабораторного использования и экономичны без ущерба для качества и производительности. Совместимые с открытыми платформами ПЦР, анализы AMPIPROBE® могут быть проверены на существующем оборудовании, что устраняет необходимость в капитальных затратах.

В сводной таблице ниже представлены продукты ПЦР, доступные для ПЦР, ОТ-ПЦР и количественной ПЦР. Нажмите на интересующий продукт, чтобы получить дополнительную информацию, или обратитесь в нашу службу технической поддержки для получения дополнительной помощи.
Ознакомьтесь с нашими 10 советами по успешной КПЦР в реальном времени!

Полимеразная цепная реакция

— обзор

Полимеразная цепная реакция — обзор

Основы ПЦР | Thermo Fisher Scientific

ПЦР — это биохимический процесс, позволяющий за короткое время амплифицировать одну молекулу ДНК до миллионов копий.Амплификация достигается с помощью серии из трех этапов: (1) денатурация , в которой матрицы двухцепочечной ДНК нагревают для разделения цепей; (2) отжиг , при котором короткие молекулы ДНК, называемые праймерами, связываются с фланкирующими областями целевой ДНК; и (3) расширение , в котором ДНК-полимераза удлиняет 3′-конец каждого праймера вдоль цепей матрицы. Эти шаги повторяются («циклически») 25–35 раз для экспоненциального получения точных копий целевой ДНК ( Рисунок 1 ).

На протяжении многих лет фундаментальные принципы ПЦР оставались неизменными, но методы развивались с огромным улучшением характеристик ДНК-полимераз и реагентов, а также инновациями в инструментах и ​​пластиковых сосудах, в которых проходят реакции.

Рис. 1. Три этапа ПЦР — денатурация, отжиг и удлинение — как показано в первом цикле, и экспоненциальная амплификация целевой ДНК с повторением циклов.

ДНК-полимеразы

являются критическими компонентами ПЦР, поскольку они синтезируют новые комплементарные цепи из одноцепочечных ДНК-матриц. Все ДНК-полимеразы обладают 5 ‘→ 3′ полимеразной активностью, которая представляет собой включение нуклеотидов для удлинения праймеров на их 3’-концах в направлении от 5 ’к 3’ (, рис. 2, ).

На заре ПЦР фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I из E.coli была использована для создания новых дочерних цепей [3]. Однако этот фермент E. coli является термочувствительным и легко разрушается при высоких денатурирующих температурах, которые предшествуют этапам отжига и удлинения. Таким образом, фермент необходимо пополнять на этапе отжига каждого цикла на протяжении всего процесса.

Открытие термостабильных ДНК-полимераз оказалось важным достижением, открывшим огромные возможности для улучшения методов ПЦР, обеспечивая более длительную стабильность реакций.Одной из наиболее известных термостабильных ДНК-полимераз является ДНК-полимераза Taq , выделенная из термофильных бактерий Thermus aquaticus в 1976 г. [5,6]. В первом отчете 1988 г. [7] исследователи продемонстрировали, что ДНК-полимераза Taq сохраняет активность при температуре выше 75 ° C, что делает возможным непрерывный цикл без ручного добавления свежего фермента, что позволяет автоматизировать рабочий процесс. Кроме того, по сравнению с ДНК-полимеразой E. coli ДНК-полимераза Taq продуцировала более длинные ампликоны ПЦР с более высокой чувствительностью, специфичностью и выходом.По всем вышеупомянутым причинам ДНК-полимераза Taq была названа «Молекулой года» журналом Science в 1989 г. [8].

Рис. 2. ДНК-полимераза, удлиняющая 3′-конец праймера ПЦР в направлении от 5 ‘к 3’.

Хотя ДНК-полимераза Taq значительно улучшила протоколы ПЦР, фермент все же имел некоторые недостатки. Taq ДНК-полимераза относительно нестабильна при температуре выше 90 ° C во время денатурации цепей ДНК. Это особенно проблематично для матриц ДНК с высоким содержанием GC и / или прочными вторичными структурами, которые требуют более высоких температур для разделения. У этого фермента также отсутствует корректирующая активность; следовательно, ДНК-полимераза Taq может неправильно включать нуклеотиды во время амплификации. Если точность последовательности имеет решающее значение, ампликоны ПЦР с ошибками нежелательны для клонирования и секвенирования.Кроме того, склонность к ошибкам ДНК-полимеразы Taq способствует ее неспособности в целом амплифицировать фрагменты длиной более 5 т.п.н. Чтобы преодолеть такие недостатки, постоянно разрабатываются более эффективные ДНК-полимеразы, чтобы использовать возможности ПЦР в различных биологических приложениях (узнайте больше о характеристиках ДНК-полимеразы).

.