Симбионты человека: Полезные микробы внутри нас | Наука и жизнь

Полезные микробы внутри нас | Наука и жизнь

Наука и жизнь // Иллюстрации

‹

›

В теле человека примерно сто триллионов клеток, но лишь десятая часть из них — человеческие клетки. Остальные — микробы. Они населяют нашу кожу, живут в носоглотке, на всем протяжении кишечника. Конечно, они мельче человеческих клеток в 10-100 раз, но они сильно влияют на нашу жизнь.

Так выглядит под микроскопом бактерия, вызывающая язву желудка. Длинные жгутики на заднем конце позволяют ей не только плавать в содержимом желудка, но и «заякориваться» в его слизистой оболочке. Бактерия стимулирует секрецию соляной кислоты, желудок начинает сам себя переваривать, а бактерия питается продуктами этого самопереваривания. Тем не менее иногда она живет в желудке здоровых людей как безвредный симбионт и даже, по мнению некоторых ученых, приносит определенную пользу, защищая человека от пищевых отравлений.

Симбиоз с человеком явно полезен для бактерий: мы даем им укрытие с постоянными благоприятными условиями и обильной пищей. Но и они нам кое-что дают.

Наиболее наглядно вклад микроорганизмов выявляется в опытах, при которых подопытных животных освобождают от симбиотической микрофлоры. У мышей, извлеченных из чрева матери кесаревым сечением и воспитанных в стерильных условиях, кишечник сильно вздут. Предполагается, что для усвоения пищи без участия симбиотических микробов кишечник должен быть длиннее и толще. У безмикробных мышей длиннее микроскопические ворсинки, выстилающие внутреннюю стенку тонкого кишечника. Через эти ворсинки идет всасывание переваренной пищи. В стенке кишечника меньше микроскопических углублений, в которых обычно поселяются микробы. В кишечнике меньше клеток, обеспечивающих иммунитет. Уменьшено даже количество нервов, управляющих движениями кишок. Предполагается, что микробы в некоторой степени управляют развитием кишечника, создавая нужные для себя условия. Пример такого взаимодействия в развитии известен у бобовых растений: азотфиксирующие микроорганизмы из почвы вызывают у растения появление специальных клубеньков на корнях, в которых и поселяются. У растения есть соответствующие гены образования клубеньков, но эти гены не проявляются, если их не простимулируют бактерии.

Безмикробные мыши очень чувствительны к инфекции. Для того чтобы такую мышь заразить, достаточно сотни болезнетворных микробов, а для обычной мыши нужно сто миллионов. Бактерии, живущие в кишечнике обычных мышей, физически блокируют пришельцев и даже выделяют антибиотик для их уничтожения.

Бактерии, живущие в кишечнике человека, вырабатывают витамин К, не синтезируемый нашим организмом и необходимый для свертывания крови. Ряд других витаминов также поставляют нам кишечные бактерии. В кишечнике жвачных животных живут микробы, способные переваривать целлюлозу растений и превращать ее в глюкозу, львиная доля которой идет на питание самого животного. У некоторых морских животных в специальных железах обитают светящиеся бактерии, облегчающие своими световыми сигналами поиск жертвы или брачного партнера.

Недавно шведский микробиолог Стаффан Нормарк обнаружил, что чем-то полезна даже бактерия, вызывающая язву желудка. Ее роль в этой болезни открыта более десяти лет назад, но только сейчас становится ясно, почему эта бактерия встречается в желудке и у многих здоровых людей. Она вырабатывает антибиотик, защищающий от сальмонелл и других опасных микроорганизмов. Видимо, в принципе, это полезный симбионт, который иногда «сходит с ума» и вызывает изъязвления стенки желудка — возможно, у людей с пониженным иммунитетом.

Симбионт и судьба

Наталья Резник,
кандидат биологических наук
«Химия и жизнь» №8, 2017

Микроорганизмы, обитающие на и в макроорганизмах, — сегодня модная тема. Все знают, как важен микробиом кишечника для здоровья человека. Но есть микроскопические симбионты и у медоносной пчелы, и у клеща, и даже у корабельного червя.

Симбионтов можно уподобить солдатам невидимого фронта. Они помогают хозяину усваивать пищу и при этом, в отличие от паразитов, не портят ему здоровье и не вынуждают к самоубийственному поведению. Самый известный пример бесчинства паразитов — влияние простейшего Toxoplasma gondii на поведение зараженных грызунов. Запах кошачьей мочи становится чрезвычайно привлекательным для мышей и крыс, они замирают у пахучего места и становятся легкой добычей кошки — окончательного хозяина токсоплазмы (см. «Химию и жизнь» № 10, 2011). Плоский червь, трематода Diplostomum pseudospathaceum, заражает радужную форель Oncorhynchus mykiss, из которой должна попасть в кишечник птицы. Однако форели нужно время, чтобы выносить паразита. Если птица проглотит рыбу с трематодой, не достигшей инфекционной стадии, паразит просто погибнет. Поэтому незрелые паразиты берегут своего хозяина, и такая форель ведет себя осторожнее обычных рыб. Достигнув зрелости, трематода вынуждает форель мельтешить на виду у птицы, и она становится легкой добычей (M. Gopko et al. Deterioration of basic components of the anti-predator behavior in fish harboring eye fluke larvae // Behavioral Ecology and Sociobiology, 2017, 71, 68, doi: 10.1007/s00265-0172300-x). Паразиты управляют поведением муравьев, улиток, пауков и других животных, все известные примеры сложно перечислить (Frederic Thomas et el. Parasitic manipulation: where are we and where should we go? // Behavioural Processes, 2005, 68, 185–199, doi:10.1016/j.beproc.2004.06.010). Симбионты же незаметны, и о них обычно вспоминают лишь тогда, когда нормальное кишечное сообщество оказывается нарушено.

Пчела как модель человека?

Исследовать взаимодействие симбионта и хозяина очень непросто. Кишечные сообщества млекопитающих включают сотни видов, и определить вклад одного из них практически невозможно. Кроме того, состав микробиоты зависит от внешних условий и потому неустойчив.

Совершенно иная ситуация сложилась в кишечнике медоносной пчелы Apis mellifera. Его населяет всего девять доминирующих видов бактерий, относящихся к пяти группам: Snodgrassella, Gilliamella, Bifidobacterium и две линии Lactobacillus. Такая композиционная простота облегчает изучение. Все виды можно культивировать в лаборатории и заражать ими насекомых, свободных от симбионтов, то есть проводить сравнительное исследование.

Микрофлора медоносных пчел специализирована, она встречается только в кишечнике A. mellifera и в улье. Ее становление совпало с формированием пчелиной социальности, у одиночных пчел этих бактерий нет или они присутствуют в следовых количествах (Waldan K. Kwong et al. Dynamic microbiome evolution in social bees // Science Advances, 2017, 3, e1600513, doi: 10.1126/sciadv.1600513). Социальность обеспечивает постоянство состава микрофлоры. Пчелы живут большими группами и заглатывают бактерии, которые содержатся в экскрементах, на поверхностях внутри улья, а иногда и в пище, которую получают от других рабочих пчел (такое взаимное кормление называется трофоллаксисом).

Формирование микрофлоры происходит постепенно и строго соответствует пищевым потребностям пчелы в зависимости от ее возраста и статуса. Личинки поначалу свободны от бактерий, но их кормят рабочие пчелы: сперва маточным молочком (секретом специальных желез), затем медом, нектаром и пыльцой. В результате личинки обзаводятся бактериями из улья, корма и кишечника взрослых особей, но это сообщество неустойчиво. У юной пчелы, только вышедшей из куколки, кишечник чист, и бактерии появляются там в первые дни жизни, до того, как пчелы покинут улей. Микрофлора поселяется главным образом в тонкой и толстой кишке, в других отделах пищеварительного тракта бактерий мало (рис. 1).

Поскольку диета рабочих пчел богата сахарами и другими углеводами (нектаром, медом и пыльцой), большинство видов кишечных бактерий расщепляет эти соединения. Некоторые симбионты разлагают даже редкие сахара (маннозу, арабинозу, раффинозу, галактозу и лактозу), которые для пчел неперевариваемы и потенциально токсичны (Waldan K. Kwong, Nancy A. Moran. Gut microbial communities of social bees // Nature Reviews Microbiology, 2016, 14, 374–384, doi: 10.1038/nrmicro.2016.43).

У пчелиных маток и трутней микрофлора беднее. У трутней она сходна с микробиотой рабочих пчел, в ней много лактобацилл. В кишечнике личинок и маток в изобилии встречается специфическая бактерия Parasaccharibacter apium. Она также присутствует в железах рабочих пчел, которые кормят молочком матку и личинок. P. apium хорошо приспособилась к аэробным условиям и высокому содержанию сахара, токсичным для большинства кишечных симбионтов, и прекрасно себя чувствует в маточном молочке, нектаре и меде.

Изменения в составе кишечной микробиоты ухудшают здоровье хозяина, попустительствуют патогенам и увеличивают смертность. Микрофлору медоносных пчел много лет изучает профессор Техасского университета в Остине Нэнси Моран. Вместе с коллегами она исследовала влияние кишечной микробиоты на рост рабочей пчелы (Hao Zheng et al. Honeybee gut microbiota promotes host weight gain via bacterial metabolism and hormonal signaling // Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, 114, 4775–4780, doi: 10.1073/pnas.1701819114).

Роль микрофлоры познается в сравнении. Сравнивать нужно обычных и безмикробных насекомых. Чтобы их получить, куколок удаляют из улья, и они развиваются в стерильных лабораторных условиях. Часть вылупившихся пчел кормят стерильной пищей, и в их кишечнике не более 10 тысяч случайных бактерий. Другой группе насекомых дают корм, зараженный бактериями из кишечника рабочих пчел. У них формируется нормальная микрофлора, которую положено иметь здоровой пчеле. Обе группы насекомых в лабораторных условиях выживают одинаково, но безмикробные пчелы весят на 82% меньше, чем пчелы с нормальной микрофлорой и рабочие особи из обычного улья.

Рост, размножение, поведение и старение пчел находятся под контролем инсулиноподобных пептидов и двух рецепторов к ним. Кроме того, в инсулиноподобном пути участвует белок вителлогенин, регулирующий питание пчел. У A. mellifera с нормальной микробиотой гены этих белков экспрессируются активнее, чем у безмикробных, благодаря чему пчела увеличивает вес (рис. 2).

Чтобы пчела хорошо питалась, она должна чувствовать запах сахарозы. Эта чувствительность, а также трудовое поведение рабочих пчел находятся под контролем инсулиноподобного пути. Активируя этот путь, кишечная микробиота существенно повышает чувствительность пчел к сахарозе.

Экспрессию генов инсулиноподобного пути стимулирует высокое содержание аминокислот. Ими пчелу снабжают кишечные бактерии. Кроме того, симбионты пчелы синтезируют короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) — уксусную, пропионовую и масляную. Эти кислоты — результат ферментации сахаров — служат основным источником энергии для хозяина (и клеток кишечника, в частности). КЦЖК также влияют на нервную и иммунную системы пчелы, то есть на ее поведение и функции мозга.

Расщепляют углеводы и синтезируют КЦЖК в основном бактерии Gilliamella apicola, живущие в тонкой кишке, и Lactobacillus spp., облюбовавшие толстую кишку. Некоторые штаммы G. apicola разлагают даже пектин — компонент клеточной стенки пыльцевых зерен, которые пчелы своими силами переварить не могут, поскольку не вырабатывают пектиназы. Однако пыльца — важная часть их рациона, ее насекомые усваивают благодаря ферментам симбионтов.

Для успешной работы кишечным бактериям необходимы бескислородные условия, а меж тем кислород просачивается через стенку кишечника, и его концентрация может достигать 1%. Но у пчел есть специальный перехватывающий симбионт — Snodgrassella alvi. Он обитает у самой стенки, углеводы не расщепляет, а окисляет продукты метаболизма других бактерий: цитрат, малат, ацетат и молочную кислоту. При этом кислород расходуется и не проходит дальше в просвет кишечника, где живут анаэробные симбионты (рис. 2).

Кишечное микробное сообщество медоносных пчел специфично и хорошо организовано пространственно, бактерии помогают пищеварению хозяина, обеспечивают его здоровье и нормальное развитие. По мнению Нэнси Моран, эти особенности делают медоносную пчелу прекрасным объектом для изучения микробиоты человека, в том числе факторов, влияющих на формирование симбиотического сообщества. Однако пчелы — объект настолько уникальный, сложный и ценный, что достойны изучения сами по себе.

В кишечнике кровососа

В отличие от пчел, иксодовые клещи не вызывают ни симпатии, ни желания заботиться об их здоровье. Тем не менее состояние их кишечной микробиоты представляет практический интерес, поскольку определяет способность этих кровососов переносить ту или иную инфекцию.

Возбудители туляремии, болезни Лайма, риккетсиозов — все эти и другие патогены клещи поглощают вместе с кровью, которую высасывают из зараженных животных и затем передают людям. Однако клещ не шприц, в его кишечнике есть собственная микрофлора, с которой сталкивается всякая проглоченная бактерия.

Всосанная кровь попадает в обширную и разветвленную среднюю кишку (рис. 3). Она выстлана эпителиальными клетками, а сверху покрыта слизистым защитным слоем (перитрофиновым матриксом). Этот слой делает стенки кишечника непроницаемыми для бактерий, которые могут попасть в него вместе с кровью. Вовсе незачем, чтобы посторонние микроорганизмы просочились через кишечную стенку и отправились гулять по организму клеща. Формированию перитрофинового матрикса и синтезу его главного белка перитрофина способствует собственная кишечная микробиота. У иксодового клеща Ixodes scapularis ее составляют представители восьми родов: Acinetobacter, Pseudomonas, Rickettsia, Lysinibacillus, Cornybacterium, Staphylococcus, Enterococcus и Delftia. Они образуют биопленку, которая взаимодействует с клетками кишечного эпителия и стимулирует синтез гликопротеинов.

Между тем некоторым патогенам жизненно необходимо выбраться из кишечника! Такова, например, Anaplasma phagocytophilum — облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий у человека гранулоцитарный анаплазмоз. Больной страдает от лихорадки, мышечной и головной боли, у него резко сокращается количество всех клеток крови: эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов. Попав в кишечник I. scapularis, анаплазма проходит через его стенки и размножается в слюнных железах, ожидая своего часа.

Недавно американские исследователи под руководством профессора Йельского университета Эрола Фикрига показали, что анаплазма разрушает микробиоту клеща, повышая проницаемость его кишечника и соответственно шансы попасть в кровь человека (Nabil M. Abraham et al. Pathogen-mediated manipulation of arthropod microbiota to promote infection // Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, 114, E781–E790, doi: 10.1073/pnas.1613422114). Ученые провели множество экспериментов и вот что выяснили.

В организме I. scapularis анаплазма стимулирует работу гена iafgp и синтез гликопротеина IAFGP. Это антифриз, позволяющий клещу пережить холода. Но у IAFGP есть еще одно свойство — он механически связывается с аминокислотами пептидогликановой клеточной стенки грамположительных бактерий, нарушает ее структуру и тем препятствует образованию биопленки. Эрол Фикриг и его коллеги исследовали этот механизм на модельном объекте, золотистом стафилококке Staphylococcus aureus, и предполагают, что он справедлив и в отношении грамположительных бактерий кишечной микрофлоры клеща. Пептидогликановая оболочка состоит из N-ацетилмурамовой кислоты (NAM) и N-ацетилглюкозамина (NAG). Полимерные нити скреплены короткими пептидами из пяти аминокислот с D-аланином на конце. IAFGP связывается с D-аланином и мешает пептидам образовывать сшивки (рис. 4). Микробиота не погибает, однако ее состав меняется, в частности уменьшается доля энтерококков — одного из основных организаторов биопленки.

Возникший дисбактериоз влияет на взаимодействие микробиоты с эпителиальными клетками кишечника. В них снижается активность регулятора транскрипции STAT, контролирующего работу многих генов, в том числе ответственных за синтез перитрофина и других белков защитного матрикса. У личинок клещей, которых кормили кровью мышей, зараженных анаплазмой, толщина перитрофинового матрикса меньше, чем у личинок, получавших здоровую кровь.

Истончившийся матрикс повышает проницаемость кишечника. Сквозь него проходят даже крупные частицы декстрана, и анаплазма пройдет. Эксперименты показали, что, если заблокировать экспрессию перитрофиновых генов, вводя личинкам клещей антисмысловую РНК, численность анаплазмы в кишечнике и слюнных железах выше, чем в контрольных особях.

А. phagocytophilum — грамотрицательная бактерия, IAFGP не связывается с ее клеточной стенкой и ничем не мешает патогену, напротив, облегчает колонизацию, да еще помогает зараженному хозяину выжить холодной зимой.

Кто-то подумал, что нормализация кишечной микрофлоры иксодовых клещей сделает их менее активными переносчиками инфекции? Напрасно. Для анаплазмы, возможно, так и будет, однако в других случаях микробиота помогает патогенам. Возбудитель болезни Лайма, спирохета Borrelia burgdorferi, чувствует себя гораздо лучше, когда биопленка в кишечнике I. scapularis цела (Sukanya Narasimhan et al. Gut Microbiota of the Tick Vector Ixodes scapularis Modulate Colonization of the Lyme Disease Spirochete // Cell Host & Microbe, 2014, 15, 58–71, doi: 10.1016/j.chom.2013.12.001). Боррелиям не нужно покидать кишечник, они размножаются в его эпителиальных клетках, под защитой перитрофинового слоя, поэтому боррелии конкурируют с анаплазмой. Если клещ заражен одним возбудителем, колонизация вторым пройдет с большим скрипом. Эрол Фикриг не исключает, что зависимость между микробиотой и способностью переносить инфекцию существует и у других членистоногих, например у малярийных комаров. Все это будут изучать и думать, как воспользоваться новым знанием.

Перемена участи

Появление нового кишечного симбионта нередко кардинально меняет возможности хозяина, открывает перед ним новые горизонты, если это выражение уместно в отношении морских двустворчатых моллюсков. У них тоже есть симбионты, помогающие пищеварению, только они заселили жабры.

Мы хорошо знаем съедобных мидий, чинно фильтрующих взвешенный в воде планктон. Их родственники из того же семейства Mytilidae (мидиеобразные) живут на затонувших бревнах и китовых костях, ими же и питаются, используя раковину как скребок, с помощью которого вгрызаются в субстрат. А другие виды, мелкие и малоизученные, встречаются на значительных глубинах рядом с термальными источниками и холодными сипами — участками дна, где из глубин высвобождаются газы: метан и сероводород. Моллюску тут не выжить без симбиоза с автотрофными бактериями (то есть самостоятельно синтезирующими органические вещества из неорганики). Энергию для синтеза эти бактерии получают, окисляя сероводород, а углерод — из метана и растворенного в морской воде углекислого газа. Готовой органикой сероокисляющие симбионты снабжают хозяина, от которого получают кислород.

У Mytilidae, живущих на бревнах, другие симбионты. Они не синтезируют органические вещества, а получают их от хозяина, взамен же выделяют ферменты, которые поступают из жабр в пищеварительный тракт моллюска, где превращают целлюлозу в сахара. Однако именно в этих условиях двустворчатые моллюски пробрели новых симбионтов, позволивших им заселить термальные источники и сипы. Такую гипотезу еще в 2000 году предложил Даниэл Дистел, профессор Северо-Восточного университета (Бостон, США), исследуя крошечных митилид Idas washingtonia (Daniel L. Distel et al. Marine ecology: Do mussels take wooden steps to deep-sea vents? // Nature, 2000, 403, 725–726, doi: 10.1038/35001667). Эти существа длиной около 4 мм многотысячными колониями покрывают китовые скелеты и бревна, затонувшие на глубине один-два километра.

По мнению Даниэла Дистела, древесина и кости могут служить субстратом как для гетеротрофных, так и для сероокисляющих бактерий, поскольку при гниении белков выделяется сероводород, который привлекает автотрофов. Исследователи решили, что при разложении древесины он выделяется тоже, хотя в затонувших бревнах, состоящих в основном из целлюлозы, сере взяться вроде бы неоткуда. Тем не менее наряду с симбионтами, разрушающими древесину (ксилотрофами), ученые обнаружили в жабрах Idas сероокисляющих бактерий. Дистел и его коллеги предположили, что автотрофные симбионты живут и в других моллюсках, которые питаются древесиной и костями. Обзаведясь такими бактериями, животные получили возможность покинуть затонувшие бревна и поселиться вблизи газовых источников.

Пусть затонувшая древесина и не выделяет сероводород, но ее часто окружает гниющая органика. Во всяком случае, бревна и кости, пожалуй, единственные субстраты, способные обеспечить переход в новую среду обитания. Они разлагаются медленно, лет десять, потому что большинство придонных потребителей органики их не едят, и у моллюсков, живущих на этом субстрате, достаточно времени на рост и размножение. Кроме того, и древесина, и китовые скелеты обычны на морском дне и появились там задолго до того, как первые двустворчатые моллюски освоили окрестности геотермальных источников.

Недавно профессор Дистел получил новое подтверждение своей гипотезы. Вместе с коллегами из США, Филиппин и Франции он обнаружил автотрофного корабельного червя Kuphus polythalamia, навсегда сошедшего с корабля на илистые донные осадки филиппинских лагун (Daniel L. Distel et al. Discovery of chemoautotrophic symbiosis in the giant shipworm Kuphus polythalamia (Bivalvia: Teredinidae) extends wooden-steps theory // Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, E3652–E3658, doi: 10.1073/pnas.1620470114). И кормится он только тем, что пошлют ему симбионты.

Корабельные черви, они же двустворчатые моллюски Teredinidae, — известные разрушители древесины. Червями их назвали за вытянутую форму тела, а еще называют морскими термитами. Они обитают в мангровых зарослях, а также поселяются в деревянных постройках и деревянной обшивке кораблей. Частицы древесины — их единственный источник пищи. Среди ксилотрофных симбионтов корабельных червей преобладает вид Teredinibacter turnerae.

Найденный Даниэлом Дистелом и его командой моллюск K. polythalamia также принадлежит к семейству Teredinidae. Его описал еще Карл Линней в 1758 году, однако живьем не видел. Он и другие биологи веками довольствовались мертвыми экземплярами и фрагментами известкового чехла, в который этот моллюск упакован. Дистел посвятил поискам куфуса 20 лет, и наконец его усилия были вознаграждены — впервые удалось добыть живые экземпляры. Помогли в этом социальные сети. В 2010 году ученые исследовали моллюсков у филиппинских берегов в поисках соединений, которые можно использовать для создания новых лекарств. Работавший с ними студент рассказал, что видел на YouTube документальный ролик о том, как жители острова Минданао едят каких-то морских моллюсков, поскольку верят в их лечебные свойства. Эти моллюски считаются деликатесом, они закованы в панцирь и напоминают бивни, воткнутые в дно. Исследователи устремились к берегам Минданао и там за два сезона добыли пять экземпляров. Впервые они смогли описать живого куфуса (рис. 5).

Лагуну, где ловили моллюсков, много лет использовали для хранения бревен. Но куфусы в бревнах не живут, их извлекли с трехметровой глубины, из черной, богатой органикой донной грязи с большим количеством кусочков древесины. На одном конце тела — розовый сифон, который прокачивает воду, на другом безглазая голова. Тело животного упрятано в известковую запечатанную трубку, и это странно, потому что моллюск должен расти и питаться. Ученые предположили, что нижняя часть трубки время от времени разрушается. Вообще, она довольно плотная, потребовалось усилие, чтобы ее отбить.

Куфус поражает своими размерами: самый крупный экземпляр достигал 155 см в длину и 6 см в диаметре. Ученые сравнили его с бейсбольной битой. Большинство корабельных червей — существа мелкие и нежные. Удивительно, что моллюск так разъелся, при том что его пищеварительный тракт развит очень плохо, остатков пищи в нем нет, висцеральная масса (пищеварительная система, сердце и другие внутренние органы) маленькая, роющие мускулы слабы. Маловероятно, чтобы питание древесиной или другой органикой позволило ему вырасти до таких размеров, тем более что через запечатанную трубку пища в рот попасть не может. Если куфус и пользуется ртом, то крайне редко. Очевидно, питательными веществами его снабжают сероокисляющие автотрофные симбионты.

В жаберных клетках куфуса обнаружились бактерии с характерными включениями серы и карбоксисомами (это структуры, которые содержат ферменты, фиксирующие углерод). Они состоят в тесном родстве с сероокисляющими симбионтами морских простейших и беспозвоночных, живущих у термальных источников. Эти бактерии поглощают сероводород, выделяемый органикой со дна лагуны Минданао. Главный ксилотрофный симбионт корабельных червей Teredinibacter turnerae, который позволяет им переваривать древесину, в тканях куфуса практически отсутствует.

По данным молекулярного филогенетического анализа, ксилотрофные симбионты появились еще в жабрах общего предка Teredinidae и сестринского семейства древоядных двустворчатых моллюсков Xylophagaidae. Очевидно, куфус утратил адаптации к питанию целлюлозой, которыми обладали его предки, зато приобрел новые.

Эти новации изменили не только размер и анатомию вида, то и тип питания. Уже не хозяин снабжает симбиотических бактерий органическими веществами, а наоборот. Симбионты куфуса не нуждаются в его органическом углероде. Многие хемосинтетические эукариоты (двустворчатые моллюски родов Bathymodiolus, Idas, Thyasira, Solemya, Acharax и черви вестиментиферы) колонизируют как гидротермальные источники и холодные сипы, так и затонувшую древесину. Даниэл Дистел полагает, что именно жизнь на бревнах дала животным возможность обрести новых симбионтов и занять новую экологическую нишу. Всё-таки симбионт — это судьба.

Симбиотические бактерии влияют на поведение человека

Как отмечает New York Times, всего несколько лет назад идея о том, что бактерии-симбионты могут управлять нашим поведением, казалось абсурдной. Мозг надежно отгорожен от остального тела гематоэнцефалическим барьером, который пропускает только самые мелкие молекулы.

Тем не менее, исследователи раз за разом находили все новые свидетельства влияния микробиома на мозг.

В одном эксперименте мышам, с рождения лишенным микрофлоры, пересадили симбиотические бактерии от сородичей с мутацией, заставлявшей их много есть и прибавлять в весе. В результате подопытные мыши тоже начали активнее кормиться. Другие исследования показали, что грызуны без микробиома избегают сородичей из-за нарушения работы миндалины — области мозга, которая важна для обработки социальных эмоций.

У людей также были выявлены удивительные закономерности.

Например, в образцах стула детей с аутизмом отмечены необычные наборы микроорганизмов. Изменения в микробиоме характерны и для ряда других психических и нейродегенеративных заболеваний.

Впрочем, пока это лишь корреляции, но не причинно-следственные связи. Подтвердить влияние симбиотических бактерий на мозг должны эксперименты с фекальными трансплантатами, которые уже проводятся на животных. Кроме того, новые исследования выявят конкретные виды бактерий, оказывающих то или иное влияние на мозг. 

Бактерия-мизантроп

Например, исследование на мышах показало, что отсутствие в организме бактерии Lactobacillus reuteri делает животных менее социальными.

Предполагаемый механизм действия таков. Судя по всему, этот вид выделяет соединения, которые передают сигналы в нервные окончания кишечника. Затем сигнал по блуждающему нерву доходит до мозга, где изменяет выработку гормона окситоцина.

Другие бактерии могут посылать сигналы мозгу через кровоток.

Лечение едой

Знания о связях между симбиотическими бактериями и здоровьем мозга позволят разрабатывать новые методы терапии, уверены ученые. Например, врачи буду рекомендовать пациентам рацион, благоприятный для определенного вида симбионтов — а значит, и для лечения определенной болезни.

Исследования уже подтвердили, что кетогенная диета стимулирует размножение двух видов бактерий, которые защищают от эпилепсии.

Впрочем, пока эти разработки остаются на очень ранней стадии. Сначала исследователям придется убедить многочисленных скептиков, и лишь затем приступать к разработке «бактериальных лекарств».

Наиболее разрушительное воздействие на мозг может оказывать бактерия из ротовой полости, которая вызывает воспаление десен. Ученые утверждают, что, попадая в мозг, она вызывает накопление токсичных белков, что приводит к развитию болезни Альцгеймера.

Симбионты и паразиты человека статья по биологии

Симбионты и паразиты человека Бактериальные симбионты человека составляют его нормальную микрофлору. Они живут в кишечнике, на коже, на слизистых, обеспечивая либо защиту (конкурентным способом не давая другим, зловредным, бактериям заселить эти участки), либо участвуя в переваривании пищи и синтезировании некоторых, необходимых человеку витаминов. Мы уже упоминали симбионта человека кишечную палочку . Всего к нормальной микрофлоре человека относится около 500 видов бактерий. Если убить всех бактерий на коже или в кишечнике человека, то ничего хорошего из этого не получится. Роль нормальной микрофлоры изучена на стерильных животных. В специальных условиях выращивают животных (крыс или мышей), и смотрят, что с ними происходит в отсутствии бактерий. Надо отметить, что живут они не очень хорошо. Таким образом, каждый реальный человек – это не просто представитель вида Homo sapiens , а целая коллекция различных организмов. Кроме нормальной микрофлоры человека есть бактерии, являющиеся паразитами. От вирусных и бактериальных инфекций погибает людей больше, чем от самых кровопролитных войн. Борьба с вирусными инфекциями началась в 1796 году с открытия Дженнером вакцины против оспы. В 1885 году Луи Пастер впервые привил укушенного бешеной собакой мальчика от бешенства. Сейчас существуют вакцины, способные защитить человека от очень многих инфекций. Рассмотрим строение и жизненный цикл паразитических бактерий на примере возбудителей заболеваний, передающихся половым путем. Заболевания, передающиеся половым путем, вызываются бактериями, вирусами (т.е. одноклеточными) или грибами. В силу анатомических особенностей женщины больше подвержены инфицированию, чем мужчины. У женщин также легче диагонстировать эти заболевания. Ниже перечислены возбудители различных болезней. Половым путем также могут передаваться вирусы, например, вирус герпеса. Вирус герпеса вызывает образование пузырьков на коже, наполненных вирусными частицами («лихорадку»). Среди населения западных стран 70-90% инфицированы вирусом герпеса, у 30% бывают высыпания, у 10% — генитальные формы заболевания. Половым путем могут передаваться вирусы иммунодефицита человека (вызывает СПИД — синдром прогрессирующего муунодефицита), гепатита В и С (поражают печень), папилломавирусы (вызвают разрастания кожного эпителия и образование бородаок; некоторые виды проводируют развитие рака). Рассмотрим строение паразитических микроорганизмов. Возбудитель гонореи — гонококк — был открыт в 1879 году Нейсером (поэтому в честь открывателя латинское название этой бактерии — Neisseria gonorrhaea ). Гонококк относится к группе диплококков. Под микроскопом он выглядит как пара кофейных зерен, лежащих рядом. На рисунке изображена характерная картина неполного фагоцитоза: лейкоцит пытается уничтожить паразитов, но микроорганизм способен защититься от его действия, и переварить его лейкоцитам не удается. Гонококк имеет размер клетки 0.7х1.7 мкм и строение, характерное для одноклеточных. Среди возбудителей заболеваний, передающихся половым путем, ранее других были описаны гонококк, бледная спирохета и эукариотический орагнизм трихомонада. Долгое время, ели у больного имелись признаки мочеполовой инфекции, но ни один из этих трех возбудителей не был выявлен, ему ставили диагноз «неспецифический уретрит». Однако во второй половине ХХ века были найдены возбудители «неспецифического» воспаления. К ним относятся гарднерелла, хламидия, уреаплазма, микоплазма и некоторые другие виды. Вызываемые ими заболевания отличаются тем, что часто проходят малосимптомно, остаются незамеченными носителем и переходят в хроническую форму. Хотя бы один из этих возбудителей встречаются у 30-50% людей, у части людей (имеющих несколько половых партнеров) можно обнаружить целый «букет» возбудителей. До сих пор некоторые врачи считают, что эти бактерии неопасны. Это, неверно, давно уже показано, что эти бактерии являются не только возбудителями мочеполовых инфекций, одним из самых тяжелых осложнений которых является бесплодие, но и ряда общих заболеваний, просто устоявшиеся представления меняются медленно. Бактерия гарднерелла , вызывающее гарднереллез – воспалительное заболевание мочеполовых путей — была описана в середине двадцатого века. Гарднерелла немного крупнее гонококка, имеет характерное для прокариот строение. В препаратах, полученных от больных, клетки эпителия полового тракта выглядят как бы «приперченными»; эти перчинки — как раз и есть гарднереллы. Они также вызывают воспаление урогенитального тракта, и самым тяжелым последствием такого заболевания является бесплодие. Хламидия, внутриклеточный паразит, отличается от гонококка своим жизненным циклом и строением. Если гонококк – это внеклеточный паразит, т.е. он находится на тканях в промежутках между клетками, то хламидия неспособна жить вне клетки, и этим она сходна с вирусом. Вне клетки хламидия сохраняется в виде мелких частиц, называемых элементарными тельцами (0.2-0.3 мкм диаметром), которые являются инфекционными. Внутри клетки элементарные тельца увеличиваются в размерах и превращаются в ретикулярные тельца (размером 0.5-0.7 мкм). В таком виде они живут внутри клетки, используя в готовом виде питательные вещества. Хламидии также вызывают воспаление урогенитального тракта, но кроме этого хламидия давно известна, как возбудитель воспалительного заболевания глаз — трахомы. Течение хламидийной инфекции отличается тем, что со временем она генерализуется (распространяется из очага инфекции по всему Жизненный цикл вируса иммунодефицита человека характерен и для других вирусов, содержащих РНК, и встраивающих свой РНК-овый геном в геном хозяина. Можно выделить следующие стадии: — Вирус прикрепляется к рецепторам на поверхности клетки. — Вирус проникает внутрь клетки с помощью этих рецепторов и «раздевается» — снимает с РНК белковую оболочку. — На вирусной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) синтезирует на РНК копию ДНК. Ревертаза входит в состав вирусной частицы. Сначала синтезируется одна нить ДНК, потом РНК в этом комплексе разрушается РНКазой, и синтезируется вторая нить ДНК. — ДНК-копия вирусного генома проникает в ядро и встраивается в геном клетки. После этого вирус может там существовать несколько лет, ничем себя не проявляя. Это называется латентной фазой. — На встроенной в геном хозяина вирусной ДНК происходит транскрипция, синтезируются вирусные белки. Они запускают процессы, необходимые для обработки РНК и превращения ее в форму, которая входит в состав вирусных частиц. Затем происходит сборка инфекционных частиц. — Новые вирусные частицы выходят из клеток. После некоторого преобразования белков, входящих в состав варионов, частица становится инфекционной («созревает»), и цикл может повториться опять. Вероятность заражения ВИЧ при однократном воздействии Сексуальные контакты (вагинальные, анальные, оральные) 1,0% Переливание крови и препаратов из неё > 90% Парентерально (загрязнённые медицинские и др. инструменты) от 1,0% до 90% Ранения медперсонала загрязнёнными инструментами < 0,5 % Перинатальное (беременность, роды) инфицирование от 2-5% до 30% Защитные средства. Для защиты от инфицирования возбудителями заболеваний, передающихся половым путем, используют барьерные контрацептивы (мужские и женские презервативы), защитные кремы и капсулы (типа «Фарматекс» и «Патентекс», эффективно предохраняют от многих видов заболеваний, применяются до контакта, действие начинается через несколько минут после нанесения и продолжается несколько часов), жидкости, содержащие бактерицидные вещества (гибитан, мирамистин и др., применяются для профилактики сразу после контакта, спектр ограничен внеклеточными паразитами). Ко всем средствам защиты прилагается инструкция, которую необходимо соблюдать. Небактериальные инфекции урогенитального тракта Кроме бактериальных инфекций половым путем передаются также заболевания, вызываемые эукариотическими организмами – простейшими и грибами. К наиболее распространенным грибковым инфекциям, передающимся половым путем, относится кандидоз (молочница) – взывается дрожжеподобным грибком рода Candida. Воспаление мочеполового тракта вызвает трихомонада – простейшее одноклеточное. Как и все эукариоты, трихомонада имеет ядро, но, что интересно, у нее нет митохондрий. Энергообеспечивающие органеллы трихомонады называются гидрогеносомами. Они выделяют молекулярный водород и эффективны при недостатке кислорода, когда аэробное дыхание малодоступно. Гидрогеносомы являются эволюционными производными митохондрий, и это доказано тем, что в них нашли ДНК. Кроме трихомонад, их содержат некоторые другие простейшие. Трихомонада способна поглощать другие микроорганизмы. На фотографии внизу изображена трихомонада с гонококками, которые она захватила. Она при этом защищает их от действия антибиотиков, поэтому врач всегда учитывает, какое сочетание возбудителей обнаружено. Вначале нужно вылечить трихомоноз, и только затем бактериальные инфекции. Лечат эти инфекции с помощью антибиотиков. Первым был выделен антибиотик из плесневого гриба пенициллум. Открытие сделал в конце 1920-х гг. Александр Флеминг, сотрудинк лаборатории при больнице в Лондоне (Нобелевская премия по медицине 1945). Антибиотик назвали пенициллином, его применение спасло жизни многих людей. Пенициллин действует на мембраны бактерий. Он относится к классу бета-лактамных антибиотиков. В молекуле этих антибиотиков есть так называемая лактамное кольцо. Оно имитирует элемент бактериальной клеточной стенки, поэтому ферменты, которые строят клеточную стенку, связываются с молекулой антибиотика и ингибируются. В клеточной стенке бактерии появляются «дыры», и клетка может просто лопнуть. К антибиотикам этой группы относятся также цефалоспорины. Антибиотики других групп, в том числе тетрациклин, блокируют разные этапы синтеза белков на мРНК. Они действуют только на мелкие прокариотические рибосомы. У человека, также как и у других эукариотических организмов, рибосомы крупные. Но в митохондриях содержатся рибосомы прокариотического типа, и поэтому этот класс антибиотиков повреждает митохондрии. Обычно в первую очередь страдают митохондрии в клетках, работающих в среднем ухе, поэтому в качестве осложнений при лечении такими атибиотиками может развиться глухота. При лечении необходимо соблюдать рекомендованные дозы лекарства, и не использовать один за другим несколько антибиотиков с одинаковым побочным действием. Противогрибковые антибиотики воздействуют на мембрану клеток грибов, поскольку грибы – это эукариоты, и на рибосомы у них воздействовать трудно. Мембраны у них отличаются от мембран человеческих клеток, поэтому можно блокировать ее синтез. Список литературы М.В. ГУСЕВ, Л.А. МИНЕЕВА. МИКРОБИОЛОГИЯ учебник для студентов биологических специальностей университетов ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 1992 (http://phm.bio.msu.ru/edocs/micro/index.html )

Живущим в вашей толстой кишке тоже нужно здоровое питание

• Адам Резерфорд
• BBC Future

2 мая 2017

Автор фото, iStock

Чтобы сохранить здоровье и необходимое количество полезных бактерий в организме, мало просто есть йогурт с пробиотиками. Обозреватель BBC Future выяснил это, сдав один не очень приятный анализ.

Все началось с того, что не назовешь иначе как хитроумным изобретением. Это раскладывающийся лист с клейкими бумажками спереди и сзади, похожий на плоскую морскую звезду.

Бумажки приклеиваются к сидению унитаза. Закрепленный должным образом лист превращается в своеобразный гамак, на который и попадает образец для взятия пробы.

Готовясь к процедуре, я надел резиновые перчатки. Оставив свой биоматериал в «гамаке», я взял его пробу при помощи небольшой ложечки, закрепленной на внутренней стороне синей крышки от пробирки.

Затем я плотно завинтил крышку и завернул пластиковую пробирку в пакет со льдом, приготовленный мной заранее. Теперь ценный груз был готов к доставке.

А везти я его собрался в компанию Map My Gut, которая пообещала мне определить, какие именно микроорганизмы затаились в глубинах моего кишечника.

Результаты различных исследований, проведенных в последние годы, свидетельствуют о том, что микроорганизмы, живущие в нашей пищеварительной системе, намного более важны для нашего здоровья и самочувствия, чем считалось ранее.

Но вскоре я обнаружил, что мои собственные бактерии не слишком-то процветают, и что определенный рацион может полностью изменить нашу с ними общую жизнь.

Автор фото, SPL

Подпись к фото,

Methanobrevibacter помогает повысить усвояемость пищи

В кишечнике среднестатистического человека живет около тысячи различных видов бактерий.

Общее их количество определить затруднительно, но счет идет на триллионы, и почти все они выполняют полезную для нас работу.

Геном человека насчитывает около 20 000 генов, однако у живущих в нашем организме микроорганизмов в совокупности их примерно в 500 раз больше.

Это позволяет им справляться с довольно непростыми задачами: помогать переваривать пищу, вырабатывать витамины и минералы и даже предотвращать болезни, объединяясь в группы и уничтожая патогенные бактерии.

Но это лишь малая часть их работы; на самом деле от них зависит, кем мы являемся внутри и снаружи.

Как сказал мне Эд Янг, автор книги «Множества во мне» (I Contain Multitudes), «микробы помогают строить тело человека, они формируют и обновляют наши органы по мере того как мы стареем».

«Возможно, они даже могут влиять на наше поведение и образ мыслей. Многочисленные эксперименты на животных показали, что микроорганизмы в их кишечнике могут оказывать влияние на настроение, характер и устойчивость к тревоге и стрессу», — отмечает он.

Однако насколько эти результаты применимы к человеку, нам еще предстоит понять.

Наверняка известно лишь то, что микробиомы двух человек различаются намного больше, чем их геномы.

Состав микроорганизмов в организме человека зависит от истории его болезней, места жительства и рациона.

У каждого человека он индивидуален и может сильно отличаться даже у ближайших родственников.

Автор фото, Getty Images

Подпись к фото,

Некоторые продукты гораздо лучше стимулируют рост полезных бактерий в организме, чем йогурт

Именно поэтому мне пришлось опорожниться на бумажку и отнести кусочек биоматериала на анализ.

Признаюсь, что, входя в офис Тима Спектора, профессора генетики из больницы Святого Фомы, чтобы узнать результаты, я слегка нервничал.

Что я узнаю о таинственном внутреннем мире своих бактерий? Что именно прячется в моей толстой кишке?

Если честно, мой анализ был хуже некуда.

«Ваш результат намного ниже среднего. По разнообразию вы попадаете в 10% населения с самыми худшими результатами», — сказал мне Спектор с еле заметной ноткой радости в голосе. Радости, которую испытывает ученый, обнаружив какое-либо отклонение от нормы.

Он объяснил, что разнообразие — это один из главных факторов, влияющих на здоровье кишечника.

Дело в том, что разные микробы выполняют разные задачи, и чем более разнообразна эта рабочая сила, тем больше пользы мы получаем.

Но мало того, что мне недоставало разнообразия, так еще и группы бактерий, поселившиеся в моем кишечнике, были не самыми доброжелательными.

Анализ показал, что у меня в 65 раз больше Clostridium perfringens, чем у среднестатистического человека, и в 211 раз больше E. coli. Обе эти бактерии способны вызвать заболевания желудочно-кишечного тракта.

«Эти результаты указывают на то, что у вас очень нездоровый микробиом», — говорилось в выданном мне документе с результатами анализов.

Я, конечно же, мог бы попытаться оправдать себя тем, что был в командировке и, возможно, съел что-то сомнительное.

Однако Спектор заявил, что однократная инфекция вряд ли способна сильно сместить баланс в худшую сторону.

А как насчет полезных бактерий? Менее 100 видов бактерий способны вызвать инфекционные заболевания, в то время как тысячи видов микроорганизмов, живущих в кишечнике человека, как сказал бы писатель Дуглас Адамс, «практически безвредны».

Так как же у меня обстоят дела с теми, кто на моей стороне?

В самом начале списка «наиболее желательных» микроорганизмов находятся такие бактерии, как Akkermansia и труднопроизносимая Christensenellaceae. Обе помогают предотвратить набор веса.

Methanobrevibacter способствует лучшей усвояемости пищи, в результате чего вы можете есть меньше. Oxalobacter обеспечивает профилактику появления камней в почках.

Сколько этих полезных бактерий обнаружилось у меня? Ноль.

Итак, меня не просто причислили к самой худшей группе, но и прописали моему кишечнику строгий режим питания, пообещав отменить его только в том случае, если он хорошенько подумает о своем поведении и решит измениться.

Автор фото, SPL

Подпись к фото,

Clostridium perfringens связывают с возникновением заболеваний желудочно-кишечного тракта

Что же я могу предпринять, чтобы улучшить свой микробиом? По-видимому, самое главное — это разнообразие.

Чем разнообразнее ваше питание, тем больше видов бактерий поселится в вашем кишечнике.

Особенно полезны для поддержания здорового микробиома ферментированные пищевые продукты.

«Люди знают о живых йогуртах, но восточный кисломолочный напиток под названием кефир — это совершенно другой уровень: в нем в пять раз больше микроорганизмов», — сказал мне Спектор.

Население наших внутренностей также будет очень радо другим ферментированным продуктам, в том числе супу мисо и кимчхи (квашеной капусте).

Если для вас все это звучит слишком экзотично, то имейте в виду, что полезные продукты с высоким содержанием пищевых волокон — это чеснок, артишоки, бананы и цельные злаки.

А полифенолы, содержащиеся в красном винограде — излюбленная пища бактерий Akkermansia. Я считаю это неплохим поводом выпить бокал вина.

В рекламе пробиотиков говорится, что они помогают повысить содержание бактерий в кишечнике, но на самом деле тратить на них деньги вряд ли стоит.

Доказательств того, что эти бактерии задерживаются в организме достаточно долго для того, чтобы изменить микробиом, слишком мало.

Однако было доказано, что они полезны как для очень маленьких, так и для пожилых пациентов и могут использоваться для профилактики расстройства желудка при приеме антибиотиков.

Но моему кишечнику они уже вряд ли помогут.

С тех пор, как я сделал это шокирующее открытие, я полностью изменил свое питание. С момента получения результатов анализа прошло больше месяца, и в течение всего этого времени я не ел мяса.

Суп мисо заменил мне фрикадельки, а кимчхи — рыбу с картошкой. Несмотря на то, что банка с кимчхи пахнет, гм… прикольно, моя жена заставляет меня держать ее в сарае.

Только время покажет, смогут ли эти перемены оказать долговременное влияние на мой микробиом.

Но я знаю, что сейчас я ем не только для себя, но и для триллионов микроорганизмов, населяющих мое тело.

Надеюсь, этот строгий режим не продлится слишком долго.

Прочитать оригинал этой статьи на английском языке можно на сайте BBC Future.

Плоский червь отказался от рта из-за полезной бактерии. Рта у него нет, зато есть специальные клетки, в которых и живет полезный микроб — Наука

Микробы-симбионты внутри червей или моллюсков — явление не такое уж необыкновенное. Они есть, например, у червей, живущих на черных курильщиках, и у нескольких семейств двустворчатых моллюсков. Обычно симбионты помогают хозяину синтезировать органику, а тот их ест вместе с полезными продуктами, которые те создают. Есть симбионт и у червя Paracatenula.

Это маленький, всего в несколько миллиметров длиной, плоский червь, который живет на морском дне. В нем живут бактерии Candidatus Riegeria santandreae, которые составляют от трети до половины массы тела своего хозяина. Бактерия представляет собой хемоавтотрофный организм, то есть она окисляет неорганические вещества, чтобы получить энергию для синтеза органических. Ученые из Института морской микробиологии Общества Макса Планка в Бремене, Харальд Грубер-Водичка и его коллеги, исследовали червей и его симбионта, чтобы точно установить, как он устроен, чем занят в черве и насколько это важно для хозяина.

Ученые секвенировали геном бактерии. Оказалось, что он очень мал — всего 1,34 миллиона пар оснований. Для сравнения: геном свободноживущих бактерий из того же семейства, что и симбионт Rhodospirillaceae, состоит из 4,29—4,97 миллиона пар, а в человеческом более 6 миллиардов пар оснований. Анализ генома показал, что он практически полностью состоит из генов, полезных для хозяина: белки, которые он кодирует, нужны по большей части для окисления сульфидов и синтеза органических веществ. Масс-спектрометрия показала, что в основном это трегалоза — простой сахар, состоящий из двух остатков глюкозы, и полигидроксиалканоаты, полиэфиры, в виде которых микробы часто запасают углерод и энергию.

Микроскопия показала, что бактерия-симбионт живет внутри особых клеток тела червя — бактериоцитов, которые собраны в питательный орган — трофосому. Как оказалось, в отличие от других пар «хозяин—симбионт», у червя с микробом практически мир и согласие. Хозяин не ест бактерию, а только получает от нее провиант, который та выделяет с помощью везикул — пузырьков с синтезированными веществами, образующимися внутри клетки и потом раскрывающимися на мембране, выпуская содержимое в хозяина. В отличие от всех других симбионтов, микроб не только производит питательные вещества, но и запасает их для своего хозяина, причем столько, что тот может вообще не есть самостоятельно. У него даже нет ни рта, ни пищеварительной системы.

Изображение среза червя Paracatenula, сделанное с помощью конфокального лазерно-сканирующего микроскопа. Зеленым показаны симбиотические бактерии Candidatus Riegeria. Harald R. Gruber-Vodicka / PNAS

Сравнение генома микроба с геномом его родственников по семейству  показало, что вид Candidatus Riegeria santandreae возник не менее 500 миллионов лет назад. Это значит, что симбиоз червя и микроба, описанный в статье бременских ученых, самый древний из известных и возник на заре появления плоских червей.

Изученный авторами случай — пример уникальной гармонии хозяина с симбионтом. Ни одно другое животное не достигло такого плотного взаимодействия со своим подселенцем: геном бактерии сжался до необходимого хозяину объема, сожитель обитает в специально отведенных клетках, а хозяин взвалил на своего симбионта всю ответственность за накопление первичной энергии и фиксацию углерода. Более крепкий союз существует только между митохондриями и клетками эукариот. Кстати, митохондрии, возможно, и произошли от альфа-протеобактерий — того же класса, к которому относится и житель плоского червя.

 Максим Абдулаев

Защитить симбионтов – аналитический портал ПОЛИТ.РУ

В последнем номере журнала Nature опубликована работа, в которой описывается механизм, с помощью которого животные защищают во время инфекций полезных симбиотических бактерий, живущих в желудочно-кишечном тракте. По-видимому, этот механизм еще и вносит дополнительный вклад в борьбу с инфекциями.

У человека заболевшего, скажем, гриппом портится аппетит. Это всем хорошо известно на личном примере. Эта реакция свойственна не только человеку, но и животным. У нее есть вполне логичное объяснение: когда животное больно, ему выгоднее с точки зрения выживания не тратить энергию на поиск пищи, а расходовать ее на выздоровление. Кроме того, патогену тоже придется голодать вместе с новым хозяином, а это помогает избавиться от инфекции скорее.

Неприятность заключается в том, что бактериям желудочно-кишечного тракта тоже приходится тяжело, а когда животное выздоравливает, их помощь очень важна, чтобы снова набрать вес. Оказалось, что организм хозяина поддерживает своих симбионтов сахаром фукозой, который в тяжелые моменты оказывается прикреплен снаружи к эпителиальным клеткам тонкого кишечника. В таком виде бактерии могут им питаться.

У здоровых мышей никакой фукозы не вырабатывалось, но уже через пару часов после индукции у животных системного воспаления и начала добровольного голодания фукоза начинала появляться на поверхности клеток. За продукцию фукозы эпителиальными клетками отвечает белок фукозилтрансфераза 2, который кодируется геном FUT2. У мышей, лишенных обеих копий этого гена, оказалась интересная особенность. Пока все мыши были здоровы, мыши без гена FUT2 ничем не отличались от обычных мышей. После индукции воспаления все мыши совершенно одинаково не ели и худели. Зато когда воспаление закончилось, мыши с хотя бы одной функциональной копией гена, равно как и мыши с двумя копиями, набирали вес гораздо быстрее, чем мыши, у которых фермент фукозилтрансфераза 2 полностью отсутствовал. При этом никаких изменений в активности ферментов, вырабатываемых организмом хозяина, не произошло. Зато если мышам с активной фукозилтрансферазой 2 давали антибиотики, убивающие бактерии-симбионты, наблюдался такой же замедленный набор веса. Вывод однозначен: без фукозилтрансферазы 2 бактерии-симбионты плохо переживали воспаление и не могли после выздоровления выполнять свои функции.

В ходе исследования также выяснилось, что мышам, у которых отсутствовали оба гена FUT2, патогены, дополнительно присутствовавшие в желудочно-кишечном тракте, вредили гораздо сильнее. Во-первых, они активнее синтезировали белки, связанные с патогенностью. Во-вторых, авторы провели дополнительный эксперимент. Они заразили мышей условно патогенной бактерией Citrobacter rodentium. У здоровых мышей она обычно не вызывает проблем. Она и не вызывала: ни у мышей с фукозилтрансферазой 2, ни у мышей без фермента. Зато после индукции воспаления через четыре дня оказалось, что мыши, зараженные Citrobacter rodentium и лишенные фукозилтрансферазы 2, теряют вес гораздо быстрее. Вообще говоря, это довольно распространенная история, когда организм, ослабленный основным заболеванием, не выдерживает атаки какого-нибудь дополнительного патогена, который в нормальном состоянии не смог бы причинить вреда и вообще давно тут жил.

У человека часто бывает, что к вирусной инфекции присоединяется бактериальная. Бактерия жила у него в носоглотке давно, но иммунитет сдерживал ее натиск, пока не оказался ослаблен вирусом. Поэтому назначение антибиотиков при инфекции, которая начиналась как вирусная, часто бывает оправдано.

Таким образом, связанный с фукозой механизм поддержки эндосимбионтов, действует сразу в двух направлениях: первое – он помогает бактериям дожить до того времени как снова можно будет есть и быстрее восстановить организм, и второе – помогает отразить нападение дополнительных инфекций.

Интересно, что примерно у 20% людей отсутствуют функциональные копии генов, ответственных за выработку фукозы. Считается, что это связано с болезнью Крона, представляющей собой хроническое воспаление желудочно-кишечного тракта без особенных причин, и смертностью от сепсиса у маленьких детей. Из всего этого можно сделать вывод, что описанный механизм связан, в первую очередь, с таким эволюционно важным умением, как способность переносить инфекцию без потерь. С точки зрения приспособленности вида это почти также важно, как уметь с ней бороться.

Познакомьтесь с вашими новыми симбионтами: триллионы вирусов

В связи с появлением новых смертоносных вирусов в Саудовской Аравии и Китае трудно представить, что вирусы могут быть полезны для чего-либо. Легко забыть, что в самые здоровые дни мы являемся домом для триллионов, а может быть, и квадриллионов вирусов. И, по мнению группы калифорнийских ученых, эти вирусы — наши симбиотические партнеры, создающие вторую иммунную систему. Эти вирусы служат передовой защитой, не позволяя бактериям проникать в слизистую оболочку кишечника и вызывать смертельные инфекции.

Рассматриваемые вирусы гораздо менее известны, чем, скажем, вирусы гриппа или вирусы Эбола. Они известны как бактериофаги, что означает «поедатели бактерий». И все же бактериофаги (или для краткости фаги) гораздо более распространены, чем вирусы, заражающие людей. Они более распространены, чем все вирусы, поражающие каждое животное на Земле. Причина проста в арифметике: для размножения фагов гораздо больше хозяев, чем для вирусов, заражающих наши собственные клетки. Они в земле, в океанах, подо льдом и в воздухе.По некоторым оценкам, на Земле насчитывается 1031 фаг. Это делает фаги самой распространенной формой жизни, и точка.

Несмотря на то, что фаги есть повсюду, ученые впервые обнаружили их внутри человека. Феликс д’Эрелль, один из соавторов, столкнулся с ними во время лечения французских солдат во время Первой мировой войны. Он отфильтровал стул солдат, больных дизентерией, и выделил микроскопические частицы, которые могли убить вызывающие дизентерию бактерии. Идея о том, что у бактерий есть вирусы, казалась коллегам д’Эрелля надуманной, и только в 1930-х годах инженеры разработали микроскопы, достаточно мощные, чтобы их видеть и документировать их атаки на бактерии.Д’Эррель провел остаток своей жизни, пытаясь превратить фаги в медицинское оружие против бактериальных инфекций. «Фаговая терапия», как стали называть его метод, продолжает привлекать любопытных ученых спустя более шестидесяти лет после его смерти. Пока он не готов заменить антибиотики, фаготерапия начинает использоваться для дезинфекции пищи.

Для ученых, занимающихся фаговой терапией, фаги — это просто оружие, которое можно использовать в медицинской битве. Для сравнения: мы мало что знаем об этих фагах в природе — иными словами, о том, что фаги делают в нашей внутренней экосистеме.Откровенно говоря, это было слишком сложной проблемой. Если вы эколог, изучающий, как львы управляют популяциями своих жертв, вы можете отправиться в саванну и понаблюдать за львами. Вы можете пометить львов. Вы можете зачерпнуть львиный помет. Вирусы, которые живут внутри нашего тела и даже не вызывают болезни, для науки практически не видны.

Это начинает меняться. В последние годы наш внутренний мир микробов стал предметом массовых научных исследований. (Майкл Поллан опубликовал длинную статью о так называемом микробиоме в журнале New York Times Magazine на этой неделе; вот моя статья из прошлогоднего журнала New York Times .)

Ученые, изучающие микробиом, сосредоточили большую часть своих усилий на картировании разнообразия 100 триллионов бактерий в нашем организме. Отчасти причина практическая. Для проведения этих исследований ученые берут образцы кожи, слюну, стул и т. Д. И удаляют все, кроме фрагментов ДНК. Затем ученые определяют последовательность этих фрагментов и определяют их происхождение. Бактерии, у которых, как правило, намного больше геномов, чем у вирусов, таким образом распознать гораздо проще.

Это исследование выявило мир огромной сложности — мир, от которого зависит наше собственное благополучие. Наши резидентные бактерии расщепляют жесткие растительные вещества, синтезируют витамины и не дают вторгшимся патогенам захватить наши тела.

Но это не означает, что наш организм безоговорочно принимает микробиом. По мере того, как мы лучше узнаем микробиом, нам не следует вводить себя в заблуждение, думая о нем как о каком-то мудром ангеле-хранителе. Это орда из нескольких сотен видов микробов, орда, способная творить глупости.

Рассмотрим бактерии, выстилающие тонкие стенки толстого кишечника. Если бы они размножались самоотверженно, они в конечном итоге давили бы на стенку кишечника, давя на наши клетки и вклиниваясь между ними. Если они прорвутся, их унесет в кровоток, где они могут вызвать опасные инфекции.

Стенки нашего кишечника также загружены иммунными клетками, и они могут сделать такое нарушение еще более опасным. Они могут слишком остро реагировать, вызывая опасные уровни воспаления в кишечнике, создавая новую среду, которая может способствовать росту болезнетворных бактерий.

Чтобы избежать этой катастрофы, наши тела сдерживают микробиом. Одна стратегия, которую кишечные клетки используют для своей защиты, — это секретирование плотного слоя слизи. Хотя поверхность слизи обеспечивает множество вкусной пищи для бактерий, нижние уровни слизи настолько плотны, что микробы не могут проникнуть в нее. Наш кишечник также защищает себя от микробиома, выделяя молекулы, убивающие микробы, чтобы уничтожить любые бактерии, которые подходят слишком близко к тому, чтобы пробить стену. И когда патогены вторгаются, наш кишечник может усилить эту защиту, создавая больше противомикробных препаратов и даже более толстые слои слизи.

Но эти средства защиты не являются гарантией безопасности. В самом деле, некоторые патогены развили способность взламывать нашу защиту для собственной выгоды. Salmonella , например, изо всех сил вызывает воспаление в кишечнике. В токсичной среде, создаваемой иммунной системой, Salmonella превосходит другие бактерии. И когда иммунные клетки перемещаются в слизистую оболочку кишечника, чтобы атаковать, Salmonella совершает свое величайшее унижение: она вторгается в те самые иммунные клетки, которые должны защищать нас.

Однако если мы сосредоточимся только на взаимоотношениях между человеческими клетками и бактериями, мы упустим третьего главного игрока в нашей экосистеме кишечника. Фаги процветают в нашем кишечнике, атакуют бактерии и используют их для создания новых копий самих себя.

Фаги, как правило, специализируются на определенных штаммах бактерий. Чтобы вторгнуться в микроб-хозяина, они действуют как вор, используя ключ, чтобы проникнуть в запертый дом. Белки на поверхности фага связываются с белками клетки-хозяина, создавая проход, через который фаг может вводить свои гены.В этом видео ниже показано, как это выглядит, когда фаг под названием T4 вторгается в E. coli :

Эти тесные отношения между фагами и их жертвами превращают их в партнеров по коэволюции. Мутация, которая изменяет блокировку микроба, будет одобрена естественным отбором, потому что она делает ключ фага менее эффективным. (Мутация должна вызывать это изменение, не причиняя вреда самому микробу.) Фаги, в свою очередь, извлекают выгоду из мутаций, которые адаптируют свои ключи к новым замкам.

Эти гонки вооружений могут также помочь объяснить огромное разнообразие микробов в нашем кишечнике. Когда у одного штамма бактерий наблюдается популяционный бум, это также создает множество новых возможностей для размножения его фагов. В конце концов, фаги могут стать настолько многочисленными, что уничтожат популяцию-хозяин. Этот сбой может позволить другому штамму бактерий подняться и стать доминирующим — только для того, чтобы его фаги подавили его.

Но что, если между нами и фагами было скрытое партнерство? Что, если врагом нашего заклятого врага был наш друг?

Джереми Барр из Государственного университета Сан-Диего и его коллеги недавно изучили эту возможность в исследовании, которое они публикуют на этой неделе в журнале Proceeding of the National Academy of Sciences .Они начали свое исследование с простого, но глубокого наблюдения: по сравнению с другими частями кишечника слизистый слой забит фагами.

Это может быть просто вопрос хищников, идущих туда, где находится их добыча. Но когда Барр и его коллеги присмотрелись поближе, они обнаружили доказательства того, что наши собственные тела делают слизистый слой привлекательным домом для фагов.

Некоторые из этих доказательств приходят в виде крючков, которые растут на фагах. Чтобы понять, в чем заключалась их функция, ученые создали фаги, которые не были крючками.Не хуже они проникли в бактерии в чашке Петри. Таким образом, крючки не причастны к заражению, как их ключи. Следовательно, крючки должны иметь другую функцию.

Барр и его коллеги провели серию экспериментов, чтобы выяснить, что это за функция. Ответ кроется не в бактериях, а в нас самих. Крючки прекрасно приспособлены для захвата определенных молекул, составляющих нашу слизь, известных как гликопротеины муцина. Благодаря своим крючкам фаги, проходящие через наш кишечник, могут зацепиться за слизь, образуя вирусный ковер.

Чтобы увидеть, какой эффект имеет этот ковер, Барр и его коллеги провели еще одну серию экспериментов. Они создали две культуры клеток человека. В одной культуре клетка росла слоем и образовывала слой слизи. В другой культуре клетки не продуцировали слизи.

Затем ученые посеяли фаги на все культуры клеток. Они дали фагам время закрепиться, а затем смыли все фаги, которые все еще плавали на свободе. Наконец, ученые добавили бактерии поверх культур и дали им расти в течение четырех часов.

Различия между двумя культурами были резкими. Нормальные клетки улавливали большое количество фагов в своем слизистом слое, а вирусы убивали большинство бактерий. С другой стороны, клетки, которые не могли производить слизь, оказались без фагов, которые бы защищали их. Бактериальная популяция взорвалась, убив часть человеческих клеток под ней.

Что делает это открытие еще более увлекательным, так это то, как фаги цепляются за гликопротеины муцина. На первый взгляд, это может показаться худшей целью, на которую может пойти вирус.В вашем организме нет единственного вида гликопротеина муцина. Ученые выделили 19 видов, и их может быть намного больше. Разнообразие зависит от того, как мы их делаем. Во-первых, наши клетки производят белок; затем они украшают его сахаром в самых разных узорах. Крючок, позволяющий фагу захватить один гликопротеин, будет бесполезен для другого.

Похоже, фаги способны справиться с этим разнообразием. Оказывается, ген фагового крючка гораздо более подвержен мутации, чем другие его гены.Каждый раз, когда фаг производит новые вирусы, они создают новые формы, соответствующие различным гликопротеинам муцина.

Все это говорит о том, что фаги в нашем кишечнике выработали изощренную стратегию захвата слизистого слоя кишечника. Это позволяет им находить множество жертв для убийства. Для нас это может быть выигрышной стратегией, потому что фаги становятся дополнительной иммунной системой для нашего собственного тела. Бактерии оседают на верхнем слое слизи, питаются и растут. Но по мере того, как они распространяются к стенке кишечника, они сталкиваются с плотным барьером из фагов.Фаги убивают их и еще больше увеличивают их численность, создавая еще более мощный защитный барьер.

Ученые обнаружили вирусы у других видов, таких как грибы, растения и насекомые, которые помогают своим хозяевам. Возможно, мы сможем добавить себя в список хостов, которые зависят от своего собственного вирома. Если это новое исследование подтвердится, будет интересно увидеть, как далеко эволюция зашла в этом партнерстве. Многие виды, являющиеся хозяевами симбиотических микробов, делают все возможное, чтобы заботиться о своих обитателях.Некоторые насекомые даже выращивают специальные органы, чтобы содержать их. Приспосабливаем ли мы наш кишечник к выращиванию как можно большего количества фагов?

Ответы на эти вопросы могут в конечном итоге дать нам новый способ приблизиться к непреходящей мечте о фаговой терапии. Вместо того, чтобы проводить вторжение ударных войск в борьбу с инфекциями, возможно, нам стоит научиться помогать нашим фагам поддерживать свою тихую защиту.

(Подробнее о бактериофагах см. Мою книгу « Планета вирусов». )

Симбионт — обзор | Темы ScienceDirect

3.1.1 Облигатно унаследованные симбионты

Унаследованные симбионты — это те организмы, которые передаются от хозяина к его потомству. Таким образом, эти симбиотические организмы хорошо адаптированы к своему хозяину, поскольку они тесно связаны с ним. Некоторые из типичных характеристик этих симбионтов — это сокращение их геномов, вызванное потерей ненужных генов, обычно связанных со свободноживущим состоянием, а также их множественная адаптация к нише, представленной их хозяевами.

Azolla-Trichormus azollae : В симбиозе между водным папоротником Azolla и нитчатыми цианобактериями Trichormus azollae (ранее известными как Nostoc или Anabaena azollae ) (Baker et al., 2003), цианобионт унаследован от родительского растения, так как прикреплен к спорам папоротника (Rasmussen and Johansson, 2002). Когда растение достигает зрелости, клетки Trichormus располагаются в полости доли листа, в которой оно фиксирует азот (Peters, 1991). Внутри этой полости процент гетероцист возрастает до 25-30%, и весь цианобионт становится фотосинтетически неактивным (Peters, 1991). В этой полости, однако, обитает не только Trichormus , но также были обнаружены другие виды цианобактерий, скорее всего, факультативные симбионты и даже нецианобактериальные виды (Peters and Meeks, 1989).Однако предполагаемые цианобионты обладают характерными чертами унаследованных симбионтов.

Из различных штаммов, которые были выделены и культивированы из разных растений Azolla , был секвенирован только геном одной из этих бактерий, Trichormus (ранее Nostoc ) azollae 0708 (Ran et al., 2010). Геном этого штамма небольшой (5,49 Мбит / с) и имеет относительно высокий процент AT (61,7%). Кроме того, процент кодирующих генов довольно низок: только 52% всего генома, по прогнозам, кодирует функциональные гены (Meeks et al., 1988). Эта потеря функции повлияла в основном на синтез природных продуктов или специализированных метаболитов, механизмы передачи сигналов, а также системы репликации, рекомбинации и репарации ДНК (Ran et al., 2010). В то время как оперон nif у других нитчатых цианобактерий прерывается последовательностями вырезания в вегетативных клетках, у Trichormus отсутствуют эти элементы в генах fdxN и nifD (Meeks et al., 1988). Благодаря этому мутанты Trichormus , которые не могут дифференцировать гетероцисты, могут экспрессировать нитрогеназу в вегетативных клетках (Meeks et al., 1988). В целом, анализ Trichormus azollae 0708 показывает специализацию его генома для адаптации к его уникальной экологической нише, обеспечиваемой полостью лепестков листьев папоротника-хозяина.

Fungi- Nostoc : Различные грибы, в основном из филума Ascomycota, могут вступать в симбиотические отношения с цианобактериями. Большинство этих симбиозов, называемых двудольными цианолишайниками, образуются между грибами (фикобионт) и фотосинтезирующими цианобактериями или водорослями (фотобионт).Однако некоторые из этих симбиозов могут также включать третьего партнера цианобактерий, роль которого заключается в фиксации азота (цианобионт), уступая место трехкомпонентным цианолишайникам (Rikkinen, 2017; Honegger, 1991). В этих симбиозах симбиотический партнер или партнеры передаются через развитие новых слоевищ, выросших из пропагул. Внутри них цианобионт находится в цефалодиях, в которых осуществляется азотфиксирующая активность (Honegger, 1991; Rai, 2002). Подобно симбиозу Azolla , цефалодии цианолишайника также населены различными видами цианобактерий (Honegger, 1991).Хотя симбиоз между микобионтами и фотобионтами представляется строго обязательным (Stocker-Wörgötter and Hager, 2008), симбиоз между микобионтами и цианобионтами нельзя легко классифицировать как облигатный, поскольку некоторые из симбиотических штаммов, выделенных из цианолишайников, имеют физиологические особенности (Ahmadjian, 1993). ) и геномная характеристика (Gagunashvili, Andrésson, 2018), более близкая к характеристикам факультативных симбионтов.

Многие штаммы предполагаемого цианобионта были выделены и культивированы.Таксономическая идентификация штаммов цианобионтов с помощью анализа 16-й субъединицы гена рибосомной РНК (рРНК) показала, что эти цианобактерии принадлежат к Nostocales (O’Brien et al., 2005). Это было подтверждено, когда были получены два полных генома и четыре черновых варианта генома (Gagunashvili and Andrésson, 2018). Два полных генома: Nostoc sp. N6 и Nostoc sp. «Цианобионт Lobaria pulmonaria » был получен из двудольного цианолихена Peltigerambranacea и трехчастного цианоличника Lobaria pulmonaria соответственно.Три черновых варианта генома Nostoc sp. 210A, Nostoc sp. 213 и Nostoc sp. 232, были получены из P.mbranacea , а оставшаяся часть, Nostoc sp. « Peltigera malacea cyanobiont» был получен из Peltigera malacea . Размер генома этих организмов варьировался от 7,34 до 9,16 Мб, в среднем 8,43 Мб, а процент AT составил 58%. Nostoc sp. N6 имеет одну хромосому (8,2 мб) и 10 маленьких репликонов, семь кольцевых и три линейных.Этот штамм имеет функциональный оперон nif с двумя эксцизионными элементами в его гене nifD (7,5 и 29 т.п.н.) и одним в гене fdxN (36,7 т.п.н.). Nostoc sp. « Lobaria pulmonaria cyanobiont» имеет одну хромосому (7.06 Mb) и четыре кольцевых репликона. Этот штамм также имеет функциональный оперон nif , но только с одним эксцизионным элементом в его гене nifD (22,8 т.п.н.). Оба генома имеют ген hupL . Меньший размер генома Nostoc sp.«Цианобионт Lobaria pulmonaria », а также его высокая степень псевдогенизации и более низкая скорость роста указывают на то, что этот цианобионт, выделенный из трехраздельного цианолишайника, ведет более облигатный образ жизни. Nostoc sp. N6 наоборот, похоже, образует факультативный двусторонний симбиоз.

Porifera-Cyanobacteria : виды цианобактерий, обнаруженные в симбиозе с губками, очень разнообразны, включая Candidatus Synechococcus spongiarum , Synechococcus spp., Prochlorococcus spp., А также другие организмы, похожие на Aphanocapsa raspaigella , Synechocystis spp., Oscillatoria spongeliae , Leptolyngbya spp. Эти симбиозы распространены среди губок с представителями 22 отрядов, способных образовывать ассоциации с цианобактериями (Konstantinou et al., 2018). Существует четыре черновика геномов видов цианобактерий в ассоциации с губками (Gao et al., 2014; Burgsdorf et al., 2015).Эти геномы небольшие, с прогнозируемой средней длиной 2,2 Мбит / с, с немного низким процентом AT, в среднем 60,4% (Burgsdorf et al., 2015). Поскольку их геномы уменьшены и были обнаружены доказательства вертикальной передачи цианобионта, мы помещаем симбиоз Porifera-Cyanobacteria в этот раздел. Однако об этих симбиозах известно немного, и остается неизвестным, фиксирует ли цианобионт азот в рамках симбиотического партнерства.

Полисахаридные капсулы, снабжающие человеческий симбионт Bacteroides thetaiotaomicron для модуляции иммунных ответов на доминантный антиген в кишечнике

Введение

Многие кишечные бактерии человека синтезируют фазовые вариантные капсульные полисахариды (CPS) на своей поверхности (1).Хотя многие функции CPS остаются недостаточно изученными, известно, что CPS обладают иммуномодулирующим действием (2). Наиболее изученным иммунорегуляторным CPS является полисахаридная капсула A (PSA), которая является одной из восьми CPS, экспрессируемых в Bacteroides fragilis (3). PSA является цвиттерионным, и было показано, что очищенный PSA модулирует уровни цитокинов хозяина и индуцирует CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ регуляторные Т-клетки (T _regs ), которые защищают от различных моделей аутоиммунных воспалительных заболеваний (4-7) .В подтверждение этих открытий, другие бактерии, кодирующие цвиттерионный полисахарид из различных таксонов, индуцировали больше IL-10 и T _regs в мононуклеарных клетках человека, чем те, которые не содержат мотив цвиттерионного полисахарида (8). Нецвиттерионные капсулы также обладают противовоспалительными свойствами. Например, нейтрально заряженные полисахариды β-глюкан / галактан клеточной поверхности, которые были очищены из Bifidobacterium bifidum , индуцировали T _regs в кишечнике и подавляли воспаление в модели колита с переносом Т-клеток (9).Бактериальные капсулы также позволяют бактериям уклоняться от адаптивных иммунных ответов, поскольку штамм Bifidobacterium breve , экспрессирующий экзополисахарид, сохранялся дольше, чем акапсулярный штамм у мышей дикого типа (WT), но не у мышей с дефицитом В-клеток (10). В частности, капсулы могут маскировать бактериальные поверхностные агенты от воздействия на них антител, что приводит к более слабым ответам антител против покрытого экзополисахаридом штамма по сравнению с акапсулярным штаммом B. breve (10). Кроме того, капсулы могут способствовать взаимовыгодному состоянию толерантности с врожденной иммунной системой кишечника.Было показано, что как экзополисахарид из Bacillus subtilis , так и большой растворимый полисахарид, высвобождаемый из Helicobacter hepaticus , индуцируют противовоспалительные макрофаги M2 (11, 12). CPS от других патогенов, таких как Streptococcus pneumoniae , также могут подрывать распознавание врожденного иммунитета, препятствуя отложению комплемента и фагоцитозу бактерий (13, 14). В совокупности эти исследования показывают важность CPS во взаимодействиях между микробиотой и иммунитетом.

Ограничением текущих исследований является то, что они изучали небольшую группу капсул, экспрессируемых данной бактерией.В одном недавнем исследовании изучалась роль полного набора бактериальных капсул у одного вида путем индивидуальной экспрессии всех восьми капсул в Bacteroides thetaiotaomicron (15). Грамотрицательный анаэроб B. thetaiotaomicron — это модельный симбионт кишечника, который является заметным членом кишечной микробиоты взрослого человека и разрушает различные гликаны диеты, хозяина и микробов (16). B. thetaiotaomicron выделяет значительную часть своего генома — 182 гена в восьми различных геномных локусах — продукции CPS и экспрессирует восемь различных CPS (CPS1 – CPS8), толщина которых может составлять несколько сотен нанометров (17).Штамм B. thetaiotaomicron WT превзошел все одиночные экспрессирующие CPS штаммы у мышей C57BL / 6 без микробов, демонстрируя, что способность экспрессировать несколько CPS является преимущественной in vivo (15). Более высокие уровни продукции IgA коррелировали с увеличением количества штамма, экспрессирующего CPS5, предполагая, что CPS5 может способствовать уклонению от адаптивных иммунных ответов (15). Это исследование предоставило ключевое понимание роли CPS в конкурентной кишечной колонизации, но только изучило, как присутствие иммунной системы влияет на колонизацию среди одиночных CPS-экспрессирующих B.Ашхабад . Механизмы, с помощью которых полный набор CPS влияет на иммунные ответы, остаются плохо изученными.

Еще одним ограничением текущих исследований является то, что эти исследования только изучали, как сама CPS взаимодействует с иммунной системой. Неизвестно, могут ли CPS на бактериях модулировать иммунный ответ на доминантные бактериальные АГ. Прогрессу в этой области препятствует отсутствие модельной системы, в которой можно было бы исследовать Т-клеточный ответ CD4 ⁺ для конкретного симбионта кишечника.С нашей системой Т-клеток BθOM, которая состоит из трансгенных TCR CD4 ⁺ Т-клеток, специфичных для белка внешней мембраны (ОМ) в B. thetaiotaomicron , мы можем контролировать экспрессию доминантного B. thetaiotaomicron. Ag. Мы ранее охарактеризовали систему Т-клеток BθOM и показали, что Т-клетки BθOM специфичны для BT4295, липопротеина SusE / SusF OM, содержащегося в одном из многих локусов утилизации полисахаридов B. thetaiotaomicron (18).Мы также продемонстрировали, что Т-клетки BθOM функциональны in vivo, поскольку адоптивно перенесенные Т-клетки BθOM пролиферируют и дифференцируются в T _regs и эффекторные Т-клетки в толстой кишке, дренирующем толстую кишку лимфатическом узле (cdLN) и селезенке у здоровых мышей, колонизированных Б. thetaiotaomicron (18).

Используя нашу Т-клеточную систему BθOM (18) и полный набор одиночных CPS-экспрессирующих B. thetaiotaomicron (15), мы исследовали, все ли CPS на B. thetaiotaomicron модулируют иммунные ответы на доминантный B.thetaiotaomicron Ag. Акапсулярный штамм B. thetaiotaomicron (Acap) , в котором отсутствуют все CPS B. thetaiotaomicron , стимулировал Т-клетки BθOM сильнее, чем WT B. thetaiotaomicron , что позволяет предположить, что CPS могут регулировать взаимодействия между специфическими бактериальными АГ и иммунной системой. Затем мы выполнили, насколько нам известно, первое объективное исследование того, как полный набор CPS модулирует иммунные ответы хозяина на доминантный Ag, используя определенную симбионт-специфичную модельную систему Т-клеток.Хотя многие одиночные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron были антистимулирующими и подавляли иммунный ответ на доминантный Ag, мы идентифицировали несколько простимулирующих штаммов, которые активировали иммунную систему так же хорошо или лучше, чем Acap. Мы показываем, что, изменяя экспрессию CPS, даже на уровне везикул OM (OMV), бактерии могут контролировать доставку доминантных Ag, а также врожденные и адаптивные иммунные ответы. Мы показываем, что, регулируя доступность Ag, CPS также позволяют бактериям регулировать иммунные ответы in vivo, включая активацию Ag-специфических и поликлональных Т-клеток, а также клиренс доминантного Ag.Эти результаты демонстрируют, что способность динамически экспрессировать различные CPS позволяет бактериям модулировать иммунные ответы на доминирующие Ag.

Материалы и методы

Штаммы и условия культивирования

Единственные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron , использованные в этом исследовании, были получены и охарактеризованы ранее (15, 19). Штаммы обычно выращивали в среде TYG (10 г / л триптона, 5 г / л дрожжевого экстракта, 4 г / л d-глюкозы, 100 мМ KH ₂ PO ₄ , 8.5 мМ [NH ₂ ] ₄ SO ₄ , 15 мМ NaCl, 10 мкМ витамин К ₃ , 2,63 мкМ FeSO ₄ ⋅7H ₂ O, 0,1 мМ MgCl ₂ , 1,9 мкМ гематин, 0,2 мМ l-гистидин, 3,69 нМ витамин B ₁₂ , 413 мкМ l-цистеин и 7,2 мкМ CaCl ₂ ⋅2H ₂ O), минимальная среда (20 г / л триптон, 10 г / л дрожжевой экстракт, 5 г / л d-глюкозы, 8,25 мМ l-цистеина, 78 мкМ MgSO ₄ ⋅7H ₂ O, 294 мкМ KH ₂ PO ₄ , 230 мкМ K ₂ HPO ₄ , 1.4 мМ NaCl, 7,9 мкМ гемина [гематина], 4 мкМ резазурина, 24 мкМ NaHCO ₃ , 68 мкМ CaCl ₂ ⋅2H ₂ O) или на чашках агара с инфузией мозга и сердца (BHI), содержащими 10% лошади кровь (Quad Five, Rygate, MT) с гентамицином (200 мкг / мл) (планшеты BHI-blood-гентамицин). Бактерии обычно выращивали при 37 ° C в анаэробной камере Bactron IV (Sheldon Manufacturing) или в маленьком инкубационном контейнере BD GasPak EZ с пакетами-саше BD GasPak EZ Anaerobe Container System с индикатором. Б.thetaiotaomicron имеет другой сердцевинный олигосахарид вместо O Ag-повторяющейся единицы, обнаруженной в LPS, и производит липоолигосахарид, который также может стимулировать врожденный иммунитет. Каждый из отдельных штаммов, экспрессирующих CPS, был исследован на экспрессию липоолигосахаридов, и было показано, что они экспрессируют одинаковые уровни (20).

Для мечения GFP штаммов, продуцирующих CPS, плазмида, кодирующая экспрессию GFP, была интегрирована в хромосому каждого штамма, как описано ранее (21, 22).Вкратце, pir Escherichia coli S17-1 λ, содержащий вектор pWW3452 (22), выращивали до фазы midlog в среде Лурия-Бертани, содержащей ампициллин (300 мкг / мл), и штаммы, продуцирующие CPS, выращивали анаэробно до фазы midlog в TYG. средний. Клетки промывали и объединяли в соотношении ~ 1: 1 перед посевом на чашку с агаром BHI, содержащую 10% крови лошади (чаша с кровью BHI). После 1 дня аэробной инкубации при 37 ° C клеточную массу соскребали с планшета, и разведения высевали на планшеты с BHI-кровью, содержащие 200 мкг / мл гентамицина и 25 мкг / мл эритромицина.Через 2 дня анаэробного роста при 37 ° C колонии пересеивали на той же среде и выращивали в анаэробных условиях еще 2 дня. Изолированные колонии инокулировали в среду TYG для роста в течение ночи, и было подтверждено, что полученные культуры флуоресцируют при воздействии УФ-света.

Эксперименты на мышах

Все экспериментальные процедуры были выполнены с одобрения Комитета по изучению животных Вашингтонского университета. Всех мышей, не лишенных микробов, содержали в улучшенном помещении, свободном от специфических патогенов.Трансгенных мышей BθOM на фоне Rag1 ^{— / —} поддерживали путем скрещивания с нетрансгенными мышами Rag1 ^{— / —} (18). Мышей случайным образом распределяли по группам. Количество животных для каждого эксперимента было выбрано на основе минимального количества, необходимого в предыдущих исследованиях, чтобы наблюдать значительные изменения в показаниях, измеренных в каждом эксперименте. Использовали мышей в возрасте 6–12 недель разного пола, в зависимости от наличия, и ни одна из них не участвовала в каких-либо предыдущих экспериментах.Группы в рамках эксперимента были максимально сопоставимы по возрасту и полу.

Функциональный анализ стимуляции Т-клеток in vitro

Анализ стимуляции Т-клеток BθOM проводили, как описано ранее (18). Клетки костного мозга, выделенные из большеберцовой и бедренной костей мышей C57BL / 6, MyD88 ^{— / —} или FcRγ ^{— / —} , культивировали в M-CSF в течение 7 дней для дифференцировки в макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM). BMDM стимулировали IFN-γ в концентрации 2000 Ед / мл в среде I-10 (IMDM, 10% FBS, глутамин и гентамицин) и высевали на 96-луночный планшет из расчета 1 × 10 ⁵ клеток на лунку.Клетки промывали PBS через 24 часа и хранили в 100 мкл свежей среды I-10 без IFN-γ. Для дендритных клеток костного мозга (BMDC) клетки костного мозга культивировали в 10% супернатанте тирозинкиназы 3 (Flt3L) FBS и 5 нг / мл GM-CSF в течение 7 дней и высевали на 96-луночный планшет при 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. При использовании дендритных клеток (ДК) селезенки CD11c ⁺ спленоциты были обогащены ДК CD11c ⁺ с использованием микрогранул MACS CD11c и помещены на 96-луночный планшет из расчета 1 × 10 ⁵ клеток на лунку.Всего 5 × 10 ⁵ клеток, выделенных из селезенки и лимфатических узлов трансгенных мышей BθOM, или 1 × 10 ⁵ Т-клеточных гибридом BθOM или T-бластов BθOM с или без 10 мкг / мл B. thetaiotaomicron Затем добавляли Ab на лунку в 50 мкл плюс 50 мкл полулогарифмических разведений штаммов или OMV B. thetaiotaomicron . Единичные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron выращивали в 5 мл TYG-культуре при 37 ° C в течение ночи, а затем повторно инокулировали при 1:50 и выращивали до фазы midlog.Культуры промывали один раз и ресуспендировали в PBS перед добавлением в анализ. Через двадцать четыре часа супернатант, содержащий Т-клетки, переносили в свежий 96-луночный планшет и центрифугировали со скоростью 1200 об / мин. Клетки промывали буфером FACS и окрашивали на CD4, CD45.1 и CD69. Все образцы были обработаны на BD FACSCanto и проанализированы с помощью FlowJo.

Генерация Т-клеточных гибридом BθOM

Т-клеточные гибридомы BθOM были получены, как описано ранее (18). 2 мл B.thetaiotaomicron (штамм BT5482) в течение ночи центрифугировали и осаждали, промывали один раз в PBS, ресуспендировали в 1 мл PBS и использовали в качестве источника Ag для иммунизации. Равный объем смеси B. thetaiotaomicron / PBS эмульгировали с IFA и 50 мкл вводили в подушечки задних лап мышей C57BL / 6 (самцы). Через десять дней дренирующие подколенные лимфатические узлы были удалены, и одноклеточная суспензия из 2 × 10 ⁷ клеток была культивирована в 7 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, 2 мМ глутамина, 1 мМ HEPES, 1 мМ натрия. Пируват, 5 × 10 ^-5 M 2-ME, 50 мкг / мл гентамицина и 14 мкл B.thetaiotaomicron / PBS источник Ag (разведение 1: 500) в течение 3 дней. Взрывные Т-клетки BθOM собирали центрифугированием и сливали с партнером слияния Т-клеточной гибридомы BW5147 ^α-β- с использованием стандартного протокола (23).

Образование бластов Т-клеток BθOM

BMDM стимулировали IFN-γ в концентрации 2000 Ед / мл в среде I-10 (см. Выше) и высевали на 24-луночный планшет из расчета 5 × 10 ⁵ клеток на лунку. Через 24 часа клетки промывали PBS и хранили в 1 мл среды I-10. Один микромолярный пептид BθOM и 2 × 10 ⁵ изолированных Т-клеток CD4 ⁺ BθOM добавляли на лунку в 0.5 мл с 50 ЕД IL-2 и инкубировали в течение 6 дней при 37 ° C. Затем из супернатанта собирали бласты Т-клеток BθOM и добавляли в анализ макрофагальных клеток in vitro.

Количественный ELISA для BT4295

Уровни белка BT4295 в одиночных CPS-экспрессирующих штаммах B. thetaiotaomicron измеряли с помощью количественного ELISA, как описано ранее (18). Единичные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron выращивали в 5-мл TYG-культуре при 37 ° C в течение ночи, а затем повторно инокулировали при 1:50 и выращивали до фазы midlog.Образцы получали из эквивалентных количеств B. thetaiotaomicron из культур, измеренных по OD ₆₀₀ . Бактерии лизировали в 100 мМ детергенте CHAPS, инкубировали при перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) и хранили при 4 ° C в течение ночи. Планшет Immulon Two для ELISA покрывали в течение ночи очищенным анти-BT4295 Ab ERC11 в буфере для карбонатного покрытия (5 мкг / мл [значение pH 9,6]) при 4 ° C, промывали, блокировали буфером (PBS с 0,5% BSA и 0,1% Tween 20) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали и образцы добавляли на 2 ч при комнатной температуре, снова промывали, а затем добавляли анти-BT4295 Ab биотин-4E9 (5 мкг / мл) на 1 час при комнатной температуре.Планшеты снова промывали и добавляли разведение 1: 5000 для HRP стрептавидина на 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали, добавляли 100 мкл субстрата One-Step Ultra TMB в каждую лунку и определяли A ₄₅₀ . Неизвестные концентрации образцов определяли количественно путем сравнения со стандартной кривой белка rBT4295, выполненной в том же ELISA с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Анализ фагоцитоза живых клеток

BMDM высевали на 96-луночный планшет со стеклянным дном с № 1,5 покровное стекло и черная рамка (Cellvis) при 1 × 10 ⁵ клеток на лунку в среде I-10 в течение ночи.Клетки окрашивали 5 мкМ красителем CellTracker Orange CMTMR при 37 ° C в течение 30 минут, затем промывали. Клетки промывали и инкубировали в 150 мкл среды I-10. В каждую лунку добавляли пятьдесят микролитров разведения 1:31 одиночных CPS-экспрессирующих штаммов B. thetaiotaomicron , которые эндогенно экспрессировали GFP, с 10 мкг / мл B. thetaiotaomicron Ab или без него. Штаммы B. thetaiotaomicron , экспрессирующие один CPS и GFP, выращивали в 2-мл TYG-культуре при 37 ° C в течение ночи до середины логарифмической фазы.Культуры промывали один раз и ресуспендировали в PBS перед добавлением в анализ. Четыре часа спустя изображения были получены в той же z-плоскости с использованием микроскопа Olympus IX70 с масляным объективом 100 × / 1,4NA, конфокального сканирующего устройства Yokogawa с вращающимся диском и CMOS-камеры Hamamatsu Orca Flash5. Клетки поддерживали при 37 ° C с 5,0% CO ₂ в увлажненной камере Tokai Hit. Изображения были получены с помощью программного обеспечения NIS-Elements Advanced Research Software, а количество бактерий, захваченных на BMDM, было измерено вручную с помощью программного обеспечения Imaris.Всего было измерено 150 индивидуальных клеток для каждого проанализированного бактериального штамма, при этом 50 клеток были измерены за эксперимент в трех экспериментах.

Микроскопическое изображение капсул путем окрашивания индийскими чернилами

B. thetaiotaomicron Толщина капсулы измерялась путем окрашивания индийскими чернилами, как описано ранее (17). Образцы были взяты из свежих культур штаммов B. thetaiotaomicron , выращенных до поздней экспоненциальной фазы в среде TYG. Аликвоту свежей культуры в 10 мкл смешивали на предметном стекле с эквивалентным количеством индийских чернил и добавляли покровное стекло.Клетки визуализировали с помощью конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа Leica SP8, а толщину капсулы измеряли с помощью программного обеспечения Imaris и Fiji. Для каждого проанализированного бактериального штамма было измерено в общей сложности 200 отдельных клеток. Для каждой ячейки было проведено четыре измерения, которые были усреднены для получения единственной средней ширины капсулы.

Микроскопическое изображение капсул с помощью сканирующей электронной микроскопии

Образцы для быстрой заморозки и сканирующей электронной микроскопии глубокого травления получали, как описано ранее (17).Вкратце, 5 мл культур штаммов B. thetaiotaomicron , выращенных до поздней экспоненциальной фазы в среде TYG, осторожно центрифугировали. Каплю полученного бактериального осадка объемом 3 мкл наносили на тонкий слой фиксированного альдегидом вареного яичного белка (используемого для поддержки во время замораживания) и замораживали путем резкого нанесения образца на охлаждаемый жидким гелием медный блок с помощью морозильной машины Cryopress. . Замороженные образцы переносили в охлаждаемую жидким азотом установку для травления замораживанием Leica Ace 900, ломали и «глубоко травили» в течение 2 минут при -104 ° C.Затем образцы были реплицированы с вращением с нанесением платины размером ~ 3,5 нм под углом 20 ° над горизонтом и «подкреплением» пленкой из чистого углерода размером ~ 8,5 нм, нанесенной под углом 85 °. Реплики собирали на гексагональных сетках микроскопа с формварским углеродным покрытием 100 меш и отображали в микроскопе JEOL 1400 с присоединенной цифровой камерой Advanced Microscopy Techniques.

Генерация

B. thetaiotaomicron — специфических Abs

Мышей C57BL / 6 иммунизировали убитым CPS1 и бустировали, затем B-клетки селезенки сливали с P3Ag8.6.5.3 клетки миеломы для создания гибридом (24).

Анализ перекоса макрофагов и высвобождения цитокинов in vitro

BMDM или BMDC помещали на 96-луночный планшет из расчета 1 × 10 ⁵ клеток на лунку в среде I-10 в течение 1 часа при 37 ° C. Добавляли пятьдесят микролитров полулогарифмических разведений штаммов B. thetaiotaomicron или OMV. Единичные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron выращивали в 5-мл TYG-культуре при 37 ° C в течение ночи, а затем повторно инокулировали при 1:50 и выращивали до фазы midlog.Культуры промывали один раз и ресуспендировали в PBS перед добавлением в анализ. Через двадцать часов супернатант переносили в свежий 96-луночный планшет и окрашивали на IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ и IL-17A с использованием цитометрического набора шариков BD Cytometric Bead Array. Мышь T _H 1 / T _H 2 / T _H 17 Набор цитокинов. BMDM один раз промывали PBS, обрабатывали трипсином, переносили на свежий 96-луночный планшет, окрашивали поверхность CD11b, CD86, PD-L1 в течение 20 мин при 4 ° C, фиксировали и пермеабилизировали набором буферов для окрашивания фактора транскрипции Foxp3 в течение 1 ч при 4 ° C и внутриклеточно окрашивали индуцибельной NO-синтазой (iNOS) в течение 30 мин при 4 ° C.Все образцы были обработаны на BD FACSCanto и проанализированы с помощью FlowJo.

Генерация OMV

Двухлитровые B. thetaiotaomicron –TYG-культуры выращивали в течение ночи при 37 ° C в анаэробной камере и вращали при 6000 об / мин в течение 15 минут в напольной центрифуге Beckman (ротор 10.1) (25) . Супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Отфильтрованный супернатант центрифугировали, а затем центрифугировали в центрифуге Beckman (ротор 25,5) при 38 500 × г в течение 1 ч в полипропиленовых пробирках объемом 40 мл.Супернатант сливали, и осадок один раз промывали PBS путем центрифугирования на центрифуге Beckman (ротор 25,5) при 38 500 × g в течение 1 часа. Гранулы OMV суспендировали в PBS и объединяли. Концентрацию OMV в OMV определяли с помощью анализа белка Брэдфорда.

Экстракция очищенного CPS

Очищенный CPS1 экстрагировали фенольным методом горячей воды (17). Пять миллилитров ночных культур, выращенных в среде TYG, инокулировали в 250 мл минимальной среды с 0.5% глюкозы в течение 2 дней, центрифугировали, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Клетки ресуспендировали в 100 мл горячей воды, а затем добавляли равный объем фенола. Смесь перемешивали в течение 1 ч при 65 ° C, охлаждали при 4 ° C в течение ночи и центрифугировали. Водную фазу диализовали против деионизованной дистиллированной воды (отсечка 12–14 кДа), а затем лиофилизировали досуха. Препараты ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl (pH 7,4), 2,5 мМ MgCl2 и 0,5 мМ CaCl2, и добавляли РНКазу A и ДНКазу I перед тем, как образцы осторожно вращали в течение ночи при 37 ° C.Затем добавляли протеиназу К и образцы инкубировали в течение ночи при 65 ° C. После добавления фенола образцы встряхивали и центрифугировали. Водный слой снова диализовали, а затем лиофилизировали досуха.

BθOM и стимуляция поликлональных Т-клеток in vivo

Мышам Rag1 ^{— / —} вводили 0,66 мг / мл ципрофлоксацина, 2,5 мг / мл метронидазола и 20 мг / мл подслащенной сахаром смеси виноградного Kool-Aid во время питья вода в возрасте 3 недель в течение 2–3 недель. Затем мышам прекращали прием антибиотика и давали обычную воду в течение 4 дней перед введением через желудочный зонд 100 мкл B.thetaiotaomicron с концентрацией 1 × 10 ⁸ КОЕ на мл. Штаммы B. thetaiotaomicron были выращены в анаэробных условиях из одиночных изолятов в среде TYG при 37 ° C в течение 24 часов (26). Каждую культуру смешивали со стерильным PBS и глицерином до конечной концентрации 20% глицерина и замораживали при -80 ° C в одноразовых аликвотах. Через три дня после введения через желудочный зонд мышам Rag1 ^{— / —} вводили ретроорбитально 2 × 10 ⁵ BθOM Т-клеток, выделенных из периферических лимфатических узлов (аксиально, плечевых, паховых, поверхностных и глубоких шейных, поясничных и каудальных). , брыжеечные лимфатические узлы и селезенка.Клетки обогащали Т-клетками CD4 ⁺ путем отрицательной селекции с использованием самодельной смеси Abs (антимышиные Ter-119, CD11c, CD11b, CD8α, CD19, CD45R / B220, CD49b и CD24) и микрогранул с антибиотином. Фекальные гранулы получали на 0, 8 и 9 дни для определения колонизации. Через семь дней после переноса Т-клеток мышей умерщвляли и лейкоциты выделяли из собственной пластинки. Для экспериментов без микробов мышам C57BL / 6 без микробов вводили через желудочный зонд 100 мкл штаммов B. thetaiotaomicron из расчета 1 × 10 ⁸ КОЕ на мл, и лейкоциты также выделяли из собственной пластинки через 10 дней после желудочного зондирования.Толстую кишку и слепую кишку промывали PBS для удаления содержимого толстой кишки и удаляли жировую ткань. Кишечник разрезали продольно и латерально на свежеприготовленный 20 мл раствора для предварительного пищеварения (1 × HBSS без Ca ²⁺ и Mg ²⁺ , 10 мМ HEPES, 5 мМ EDTA, 5% FBS и 1 мМ DTT). Образцы инкубировали в течение 20 мин при 37 ° C при встряхивании при 220 об / мин, а затем встряхивали в течение 10 с. Ткань переносили в 20 мл свежего раствора для предварительного переваривания и инкубировали при встряхивании еще 20 мин.После перемешивания в течение 10 с ткань переносили в свежую пробирку, содержащую 20 мл 1 × HBSS без Ca ²⁺ и Mg ²⁺ и 10 мМ HEPES, и инкубировали при встряхивании в течение 20 минут. Ткань разрезали на мелкие кусочки с помощью тонких ножниц и обрабатывали в течение 30 минут в свежеприготовленном растворе для переваривания (1 × HBSS с Ca ²⁺ и Mg ²⁺ , 10 мМ HEPES, 5% FBS, 10 мг / мл ДНКазы. , и 5 мг / мл коллагеназы) при встряхивании со скоростью 200 об / мин. Ткань механически разрушали с помощью мягкого MACS Octo Dissociator (Miltenyi) с использованием программы m_intestine_01.Образцы фильтровали через фильтр 100 мкм. CDLN и селезенку удаляли и обрабатывали в суспензии отдельных клеток с использованием крышек для пробирок Эппендорфа и фильтровали через фильтр 70 мкм. Все образцы подсчитывали, окрашивали антителами против мышиного CD4, CD45.1, CD44, CD62L, Foxp3, IFN-γ и / или IL-17A и обрабатывали на BD FACSCanto.

Бактериальный клиренс in vivo

Всего мышам C57BL / 6 внутрибрюшинно вводили 1 × 10 ⁶ CPS1 или CPS8. Перитонеальную жидкость собирали через 0, 1, 2, 4, 6 или 8 ч после инъекции.Перитонеальную жидкость высевали на чашки с кровью BHI с 200 мкг / мл гентамицина при 37 ° C в анаэробной камере в течение 2 дней для определения КОЕ.

Количественная оценка и статистический анализ

Ни один из исследователей не был слеп к идентификации образцов во время любого из описанных экспериментов, и никакие образцы или измерения не были исключены из анализа. Для каждого эксперимента общее количество биологических повторов ( n ) указано в соответствующей легенде вместе с описанием того, что считается репликой (мыши, культуры реплик, титры Ab и т. Д.).), а также количество проведенных экспериментов. Программное обеспечение FlowJo v10.4.2 (FlowJo, LLC, Ashland, OR) использовалось для анализа всех экспериментов по проточной цитометрии. Статистический анализ выполняли в Prism Software v7 (GraphPad Software, La Jolla, CA). В экспериментах по визуализации живых клеток для получения изображений использовалось программное обеспечение NIS-Elements Advanced Research (Nikon, Токио, Япония), и поглощение B. thetaiotaomicron было подсчитано вручную в Imaris Software v8.4 (Oxford Instruments, Zurich, Швейцария).В экспериментах по конфокальной визуализации для захвата изображений использовалось программное обеспечение Leica Application Suite X (Leica Microsystems, Вецлар, Германия), а толщина капсулы B. thetaiotaomicron была измерена на Фиджи (Изображение J). Когда данные обычно не следовали нормальному распределению, для определения статистической значимости использовались непараметрические тесты (Манна – Уитни). Если не указано иное, статистическая значимость указана следующим образом: * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001, **** p <0,0001. Используемые статистические тесты указаны в легенде каждого рисунка.

Результаты

Большинство, но не все, одиночные CPS-экспрессирующие штаммы

B. thetaiotaomicron являются антистимулирующими и подавляют Ag-специфические адаптивные иммунные ответы

Чтобы определить, могут ли CPS регулировать иммунный ответ на доминантные АГ, мы сначала сравнили способность B. thetaiotaomicron WT и Acap, которой не хватает всех B.thetaiotaomicron CPSs для стимуляции BθOM CD4 ⁺ Т-клеток. Используя первичные CD11c ⁺ селезенки DC в качестве APC, мы обнаружили, что Acap стимулировал BθOM T-клетки сильнее, чем WT (рис. 1A). Мы предположили, что все CPS на B. thetaiotaomicron подавляют иммунный ответ на доминантный Ag, и исследовали способность полного набора из восьми одиночных CPS-экспрессирующих штаммов B. thetaiotaomicron стимулировать BθOM T-клетки. Самый одиночный CPS — экспрессирующий B.Штаммы thetaiotaomicron были антистимулирующими и слабо активированными Т-клетками BθOM, но один единственный CPS-экспрессирующий штамм B. thetaiotaomicron , CPS8, был простимулирующим и активировал Т-клетки BθOM аналогично или даже лучше, чем Acap в присутствии первичного CD11c ⁺ селезенки. ДК (рис. 1А). Штамм CPS7 также сильно стимулировался, но ранее было показано, что он очень слабо экспрессирует капсулу и, таким образом, действует по существу как Acap (15). Для дальнейшего исследования роли CPS на B.thetaiotaomicron , чтобы модулировать иммунный ответ на специфические бактериальные агенты, мы решили сосредоточиться на одном антистимулирующем CPS, CPS1, и одном простимулирующем CPS, CPS8. Используя эти две модели единичных CPS-экспрессирующих штаммов B. thetaiotaomicron , мы обнаружили, что эти различия в стимуляции BθOM Т-клеток также присутствовали, когда BMDM использовались в качестве APC (рис. 1B), расширяя наши выводы о том, что CPS на B. thetaiotaomicron по-разному изменяет ответы Т-клеток на доминантные АГ.Уровни белка BθOM T-клеточного Ag BT4295 статистически не различались между всеми одиночными CPS-экспрессирующими штаммами B. thetaiotaomicron , что исключает возможность того, что различия в стимуляции BθOM T-клеток были вызваны различиями в экспрессии Ag (рис. 1С). Эти данные демонстрируют, что бактерии могут модулировать адаптивные иммунные ответы на свои доминантные АГ, изменяя экспрессию CPS.

РИСУНОК 1.

Большинство КПС B. thetaiotaomicron ( B. theta ) обладают антистимулирующим действием и препятствуют распознаванию BθOM T-клетками доминантного Ag в B.Ашхабад . ( A ) Процент CD69-экспрессирующих Т-клеток BθOM после 24-часового культивирования с CD11c ⁺ селезенки, нагруженных B. thetaiotaomicron CPS1-8, WT или Acap ( n = 6, три эксперимента) . ( B ) Процент CD69-экспрессирующих Т-клеток BθOM после 24-часового культивирования с CPS1-8, WT или Acap, загруженными на BMDM ( n = 6, три эксперимента). ( C ) Концентрация в микрограммах на миллилитр белка BT4295, экспрессированного в CPS-8, WT и Acap ( n = 4, четыре эксперимента).

Антистимулирующие CPS на

B. thetaiotaomicron блокируют доступ иммунной системы к доминантному Ag

Мы предположили, что антистимулирующие одиночные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron подавляют Ag-специфические CD4 ⁺ Т-клеточные ответы, потому что CPS либо блокировать поглощение Ag, обработку Ag или представление Ag. Сначала мы использовали бласты Т-клеток BθOM, которые являются Т-клетками BθOM, которые были ранее активированы in vitro, чтобы проверить, являются ли антистимулирующие CPS на B.thetaiotaomicron препятствует представлению Ag. Бласты Т-клеток BθOM уже активировали костимулирующие молекулы, что позволяет нам проверить, блокируют ли CPS на B. thetaiotaomicron презентацию Ag, предотвращая экспрессию критических костимулирующих молекул на поверхности APC. Анализы стимуляции Т с бластами Т-клеток BθOM повторили наши результаты с первичными Т-клетками BθOM. Простимулирующий одиночный CPS-экспрессирующий B. thetaiotaomicron , включая CPS8 и Acap, сильно активировал Т-клеточные бласты BθOM.Антистимулирующие одиночные CPS-экспрессирующие B. thetaiotaomicron , включая CPS1, слабо активированные BθOM T-клеточные бласты, подтверждая, что антистимулирующие CPS на B. Используя Т-клеточные гибридомы BθOM, для активации которых требуется только стимуляция TCR, мы затем исследовали, блокирует ли B. thetaiotaomicron , экспрессирующие антистимулирующие CPS, процессинг Ag. Гибридомы BθOM T-клеток распознают только MHC класса II, нагруженные пептидом, и не нуждаются в какой-либо костимуляции, что позволяет нам проверить наличие CPS на B.thetaiotaomicron предотвращает процессинг и экспрессию комплексов пептид-MHC класса II на поверхности APC. Т-клеточные гибридомы BθOM также были сильно активированы B. thetaiotaomicron , экспрессирующими простимулирующие CPS, но слабо активировавшимися B. thetaiotaomicron с антистимулирующими CPS (Рис. 2B, Дополнительный Рис. 1B), демонстрируя, что антистимулирующие CPS на B. thetaiotaomicron не блокируют процесс обработки Ag. Чтобы определить, является ли антистимулирующий одиночный CPS — экспрессирующий B.Штаммы thetaiotaomicron ингибируют поглощение доминантных Ag APC, мы культивировали меченые BMDM с штаммами B. thetaiotaomicron , которые экспрессировали один CPS и GFP, и провели визуализацию живых клеток. Штаммы B. thetaiotaomicron с простимулирующими CPS, такими как CPS8 и Acap, были сильно фагоцитированы, тогда как штаммы B. thetaiotaomicron с антистимулирующими CPS, такими как CPS1, были плохо фагоцитированы (рис. 2C, 2D, дополнительный рисунок 1C, 1D), показывая, что г.thetaiotaomicron может контролировать доставку доминантного Ag в иммунную систему.

РИСУНОК 2.

Антистимулирующие CPS блокируют захват доминирующего Ag в B. thetaiotaomicron ( B. theta ), частично из-за толщины капсулы. ( A ) Процент бластов BθOM T, экспрессирующих CD69, после 24-часового культивирования с BMDM, нагруженным CPS1, CPS8 или Acap ( n = 6, три эксперимента). ( B ) Уровни IL-2 в пикограммах на миллилитр, продуцируемые гибридомами Т-клеток BθOM после 24-часового культивирования с BMDM, нагруженным CPS1, CPS8 или Acap ( n = 6, три эксперимента).( C ) Типичные изображения живых клеток и ( D ) количественная оценка поглощенных GFP-меченных CPS1, CPS8 или Acap на BMDM после 4-часового культивирования ( n = 150, три эксперимента). Шкала 5 мкм. ( E ) Процент CD69-экспрессирующих Т-клеток BθOM после 24-часового культивирования с BMDM, нагруженным CPS1, CPS8 или CPS1 и CPS8 в соотношении 1: 1 или 5: 1 ( n = 6, три эксперимента ). *** p = 0,0207. ( F ) Процент CD69-экспрессирующих Т-клеток BθOM после 24-часовой культивирования с BMDM, нагруженным CPS1, CPS8 или разведением 1: 100 CPS8 и различными концентрациями очищенного CPS1 ( n = 3, три эксперимента) .( G ) Типичные изображения и ( H ) количественная оценка толщины капсулы CPS1, CPS8 и Acap, окрашенных индийскими чернилами ( n = 200, три эксперимента). Шкала 2 мкм. ( I ) Микрофотографии, полученные с помощью быстрого замораживания, глубокого травления с помощью сканирующего электронного микроскопа CPS1, CPS8 и Acap B. thetaiotaomicron . Желтая линия указывает ширину каждой капсулы. Шкала 0,5 мкм. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Односторонний анализ ANOVA. * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Учитывая, что CPSs являются фазовыми вариантами и могут выделяться в окружающую среду (2), мы задались вопросом, могут ли одиночные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron также действовать в trans . Смешивание простимулирующего CPS8-экспрессирующего штамма B. thetaiotaomicron с антистимулирующим CPS1-экспрессирующим штаммом B. thetaiotaomicron или очищенной капсулой CPS1 не привело к снижению стимуляции BθOM Т-клеток (рис.2E, 2F), предполагая, что CPS1 не может ингибировать CPS8 на B. thetaiotaomicron в trans . Визуализация живых клеток BMDM, обработанных немеченым CPS1-экспрессирующим B. thetaiotaomicron , а также B. thetaiotaomicron , который экспрессировал CPS8 и GFP, показала, что CPS8-экспрессирующий B. thetaiotaomicron все еще легко поглощается BMDM в присутствии CPS1-экспрессирующий B. thetaiotaomicron (данные не представлены). Чтобы исключить возможность того, что CPS8-экспрессирующий B.thetaiotaomicron может усиливать захват и стимуляцию BθOM T-клетками CPS1-экспрессирующего B. thetaiotaomicron , мы также инкубировали BMDM с немеченым CPS8-экспрессирующим B. thetaiotaomicron и B. thetaiotaomicron , который экспрессировал CPS1 и GFP, и не обнаружили. увеличение поглощения CPS1-экспрессирующего B. thetaiotaomicron (данные не показаны). Эти данные окончательно демонстрируют, что антистимулирующий CPS1 и простимулирующий CPS8 не функционируют в trans , чтобы изменить B.thetaiotaomicron или стимуляция Т-клеток BθOM.

Затем мы использовали окрашивание индийскими чернилами и сканирующую электронную микроскопию с быстрым замораживанием и глубоким травлением, чтобы исследовать, влияет ли толщина CPS на их анти- и простимулирующие свойства. Как окрашивание индийскими чернилами, так и сканирующая электронная микроскопия показали, что CPS1 толще, чем CPS8, предполагая, что более толстые CPS, наряду с известными различиями в составе сахара (15), могут играть роль в препятствовании фагоцитозу APC (рис.1E – G). Взятые вместе, эти исследования демонстрируют, что, изменяя экспрессию CPS, бактерии могут контролировать способность врожденной и адаптивной системы получать доступ к доминантным Ag.

Fc-рецептор-зависимая оптимизация Ab может спасти иммунный доступ к доминантному Ag на

B. thetaiotaomicron с антистимулирующими CPS

Поскольку было показано, что абопсонизация увеличивает поглощение бактериями (13), мы предположили, что абопсонизация может преодолеть способность антистимулирующие CPS для блокирования доступа к доминантным агентам.Мы создали Ab A176, которые распознают B. thetaiotaomicron и представляют собой IgG2a, κ (дополнительный рис. 2A). Поскольку A176 связывается со всеми одиночными CPS-экспрессирующими B. thetaiotaomicron , A176 распознает Ag, который присутствует во всех штаммах B. thetaiotaomicron и не является уникальным для капсулы CPS1. Добавление A176 к нашему анализу стимуляции BθOM T-клеток позволило CPS1-экспрессирующему B. thetaiotaomicron теперь сильно активировать BθOM T-клетки (фиг. 3A, дополнительная фиг. 2B).Визуализация живых клеток продемонстрировала, что усиленная активация BθOM T-клеток B. thetaiotaomicron , экспрессирующая CPS1, в присутствии A176 была обусловлена ​​способностью A176 увеличивать поглощение экспрессирующего CPS1 B. thetaiotaomicron в BMDM (рис. 3B). , 3С). Добавление A176 не имело эффекта на активацию BθOM T-клеток с помощью CPS1-экспрессирующего B. thetaiotaomicron , когда селезеночные CD11c ⁺ DC использовались в качестве APC, что позволяет предположить, что A176, вероятно, увеличивал поглощение CPS1 через рецептор, присутствующий на BMDM, но не селезенку. CD11c ⁺ ДК (рис.3D). Поскольку было показано, что Abs увеличивают бактериальное поглощение через рецепторы Fc, мы протестировали механизм повышенного бактериального поглощения A176 с FcRγ ^{— / —} BMDM, которые лишены общей γ-цепи рецептора Fc и не экспрессируют какие-либо активирующие мышиные FcγR. (FcγRI, FcγRIII и FcγRIV). A176 больше не увеличивал стимуляцию BθOM T-клеток B. thetaiotaomicron в присутствии FcRγ ^{— / —} BMDM, демонстрируя, что A176 увеличивает захват CPS1 и стимуляцию BθOM T-клеток за счет абопсонизации через рецепторы Fc (рис.3E). Таким образом, иммунная система может преодолевать антистимулирующие CPS и восстанавливать доступ к доминантным Ag посредством зависимой от Fc рецептора Ab opsonization.

РИСУНОК 3.

Блокада доставки доминирующего Ag антистимулирующими CPS может быть преодолена путем опсонизации Ab через FcRγ. ( A ) Процент CD69-экспрессирующих T-клеток BθOM после 24-часового культивирования только с CPS1 или CPS1 + A176 Ab, загруженными в BMDM ( n = 6, три эксперимента). ( B ) Типичные изображения живых клеток и ( C ) количественная оценка поглощенного GFP-меченного CPS1 на BMDM после 4-часового культивирования с или без A176 Ab ( n = 150, три эксперимента).Шкала 5 мкм. ( D и E ) Процент CD69-экспрессирующих Т-клеток BθOM после 24-часового культивирования с CPS1 и A176 Ab, загруженными на (D) CD11c ⁺ селезеночные DC ( n = 6, три эксперимента) или (E) C57BL / 6 или FcRγ ^{— / —} BMDM ( n = 6, три эксперимента). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. * p <0,05, ** p <0,01, **** p <0,0001, тест Стьюдента t .

Все одиночные CPS, выражающие

B.thetaiotaomicron стимулирует врожденную иммунную систему через MyD88, но антистимулирующие CPS на B. thetaiotaomicron снижают активацию врожденной иммунной системы

Далее мы попытались определить, активируют ли одиночные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron врожденную иммунную систему. Ни один из одиночных CPS-экспрессирующих B. thetaiotaomicron не усиливал экспрессию костимулирующих молекул PD-L1 и CD86 в BMDM (дополнительная фиг. 3A). Несмотря на различия в захвате APC, все одиночные CPS-экспрессирующие B.thetaiotaomicron усиливал экспрессию iNOS в BMDM, который является воспалительным маркером M1 (рис. 4A, дополнительный рис. 3B) (27). Все одиночные CPS-экспрессирующие B. thetaiotaomicron также индуцировали BMDM и BMDC для высвобождения воспалительных цитокинов IL-6 и TNF (фиг. 4B, 4C, Supplemental Fig. 3C, 3D). Активация врожденной иммунной системы с помощью единственного CPS-экспрессирующего B. thetaiotaomicron зависела от пути MyD88, поскольку BMDM MyD88 ^{— / —} не перекосились на фенотип M1 и не высвобождали IL-6 и TNF (рис.4B, 4C, дополнительный рисунок 3B, 3C). Хотя штаммы B. thetaiotaomicron с антистимулирующими CPS активировали врожденную иммунную систему, они стимулировали врожденную иммунную систему слабее, чем штаммы B. thetaiotaomicron с простимулирующими CPS, и индуцировали меньше макрофагов M1 и воспалительных цитокинов (рис. 4A – C). ). Добавление A176 Ab не имело эффекта на искажение BMDM в сторону макрофагов M1 или высвобождение цитокинов IL-6 и TNF в присутствии CPS1-экспрессирующего B. thetaiotaomicron (дополнительный рис.2С, 2D). Чтобы изучить, какой врожденный рецептор может быть задействован в пути MyD88, мы протестировали BMDM с дефицитом TLR4. BMDM с дефицитом TLR4 идентично реагировал на BMDM WT (данные не показаны), указывая на то, что TLR4 не участвует. Эти результаты демонстрируют, что хотя все одиночные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron стимулируют врожденную иммунную систему через MyD88, антистимулирующие CPS могут помочь защитить B. thetaiotaomicron от полной активации врожденной иммунной системы.

РИСУНОК 4.

Все CPSs B. thetaiotaomicron ( B. theta ) стимулируют врожденную иммунную систему MyD88-зависимым образом, но антистимулирующие CPS активируют врожденную иммунную систему слабее, чем простимулирующие CPS. ( A ) Процент экспрессирующих iNOS C57BL / 6 или MyD88 ^{— / —} BMDM после 24-часового культивирования с CPS1, CPS8 или Acap ( n = 4, три эксперимента). ( B и C ) Уровни IL-6 и TNF в пикограммах на миллилитр, продуцируемые (B) C57BL / 6 или MyD88 ^{— / —} BMDM и (C) C57BL / 6 BMDC после 24-часового культивирования с CPS1, CPS8 или Acap ( n = 4–6, три эксперимента).Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Односторонний анализ ANOVA (A и B). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

Одиночные CPS-экспрессирующие OMV также регулируют иммунные ответы на доминантные АГ.

Хотя наши вышеупомянутые результаты использовали все B. клетки в кишечнике хозяина (19).OMV также содержат внешний слой CPS, но роль CPS в OMV остается малоизученной. Наиболее изученной CPS на OMV является PSA. Было показано, что OMV, содержащие PSA, обладают иммуномодулирующим действием, потому что OMV дикого типа, но не OMV, в которых отсутствует PSA (ΔPSA OMV), индуцируют CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ T _regs и предотвращают экспериментальный колит (28). Ограничением этого исследования является то, что тестировались только OMV ΔPSA, в которых отсутствует PSA, но которые все еще экспрессируют другие CPS. Поскольку наш BθOM T-клеточный Ag также присутствует на OMV, мы исследовали, могут ли отдельные CPS-экспрессирующие OMV регулировать иммунный ответ на доминантные Ag.В соответствии с нашими выводами, с использованием одиночных CPS-экспрессирующих B. thetaiotaomicron OMV с антистимулирующими CPS, такими как CPS1, слабо активировали BθOM T-клетки, тогда как OMV с простимулирующими CPS, такими как CPS8 и Acap, сильно активировали BθOM T-клетки ( Рис. 5А). Хотя OMV с антистимулирующим CPS1 или простимулирующим CPS8 не активировали костимулирующие молекулы CD86 и PD-L1 в BMDM (данные не показаны), они оба активировали врожденную иммунную систему, чтобы смещаться к макрофагам M1 и высвобождать воспалительные цитокины IL-6 и TNF в MyD88-зависимый способ (рис.5Б, 5С). Подобно целому B. thetaiotaomicron , экспрессирующему CPS1, OMV с антистимулирующим CPS1 активировали врожденную иммунную систему слабее, чем OMV с простимулирующим CPS8 (фиг. 5B, 5C). Поскольку A176 также связывается с OMV CPS1, мы добавили A176 в наш анализ стимуляции Т-клеток BθOM с OMV, содержащими антистимулирующий CPS1, но не обнаружили увеличения стимуляции BθOM T-клеток. Эти исследования, насколько нам известно, являются первым случаем, когда были описаны адаптивные и врожденные иммунные ответы полного набора CPS на OMV, и они демонстрируют, что CPS на уровне OMV также могут модулировать врожденные и адаптивные иммунные ответы на доминантный Ag.

РИСУНОК 5. CPS

OMV обладают аналогичным иммуномодулирующим действием на доминирующий Ag B. thetaiotaomicron , как и CPS на целые бактерии. ( A ) Процент CD69-экспрессирующих Т-клеток BθOM с OMV CPS1, CPS8 и Acap, загруженных в BMDM (CPS1 и CPS8: n = 7, три эксперимента; Acap: n = 3, два эксперимента). ( B ) Процент экспрессирующих iNOS C57BL / 6 или MyD88 ^{— / —} BMDM после 24-часового культивирования с CPS1 и CPS8 OMV ( n = 6, три эксперимента).( C ) Уровни IL-6 и TNF в пикограммах на миллилитр, продуцируемые C57BL / 6 или MyD88 ^{— / —} BMDM и после 24-часового культивирования с OMV CPS1 и CPS8 ( n = 6, три эксперимента) . Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. (B и C) Звездочки над линией CPS8 сравнивают CPS1 и CPS8. Звездочки над красными / синими треугольниками сравнивают CPS1 с MyD88 ^{— / —} CPS1 и CPS8 с MyDD8 ^{— / —} CPS8. * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001, **** p <0,000, односторонний дисперсионный анализ.

Единичные CPS-экспрессирующие

B. thetaiotaomicron модулируют Ag-специфические и поликлональные иммунные ответы in vivo

Затем мы оценили способность CPS на B. thetaiotaomicron регулировать иммунные ответы на доминантные Ag in vivo, используя наши ранее опубликованные Модель переноса Т-клеток BθOM (18). Мышей Rag1 ^{— / —} предварительно лечили антибиотиками в течение 2 недель, через зонд вводили антистимулирующий CPS1-экспрессирующий B.thetaiotaomicron или простимулирующий CPS8-экспрессирующий B. thetaiotaomicron в день 0, адоптивно переносили с Т-клетками BθOM на 3 день, а затем собирали на 10 день (дополнительная фиг. 4A). Хотя B. thetaiotaomicron , экспрессирующие CPS1 или CPS8, колонизировали мышей в равной степени (дополнительный рис. 4B), мы извлекли меньше T-клеток BθOM в собственной пластинке толстой кишки мышей, колонизированных CPS1-экспрессирующими B. thetaiotaomicron , чем с CPS8-экспрессирующими B. . thetaiotaomicron (рис.6А). Эти результаты согласуются с нашими результатами in vitro и дополнительно демонстрируют, что антистимулирующие CPS1-экспрессирующие B. thetaiotaomicron слабо активируют BθOM T-клетки, тогда как простимулирующие CPS8-экспрессирующие B. thetaiotaomicron сильно активируют BθOM T-клетки in vivo. Хотя не было различий в процентном содержании наивных CD44 ⁺ CD62L ^— или активированных CD44 ⁺ CD62L ^— BθOM Т-клеток (дополнительный рисунок 4C, 4D), CPS на B.thetaiotaomicron также направлял дифференцировку Ag-специфических Т-клеток, так как Т-клетки BθOM в толстой кишке дифференцировались в большее количество Т-клеток IFN-γ ⁺ IL-17A ⁺ Т-клеток в присутствии B. thetaiotaomicron , содержащего простимуляторный CPS8 (фиг. . 6B). Кроме того, экспрессирующий CPS8 B. thetaiotaomicron индуцировал больше эффекторного IFN-γ ⁺ IL-17A ^— T _H 1 и IFN-γ ^— L-17A ⁺ T _H 17 BθOM Т-клетки, тогда как CPS1-экспрессирующие B.thetaiotaomicron индуцировал больше Foxp3 ⁺ BθOM T _regs в толстой кишке, хотя эти тенденции не достигли статистической значимости (дополнительный рис. 4E – G). Эти исследования демонстрируют, что CPS на B. thetaiotaomicron могут контролировать доставку специфических бактериальных Ag и манипулировать Ag-специфическими иммунными ответами in vivo.

РИСУНОК 6.

CPS модулируют Ag-специфические и поликлональные Т-клеточные ответы in vivo. ( A ) Количество живых CD4 ⁺ CD45.1 ⁺ BθOM T-клеток и ( B ) процентное содержание BθOM IFN-γ ⁺ IL-17A ⁺ T-клеток в толстой кишке, cdLN и селезенке специфического свободного от патогенов Rag1 ^{— / —} мышам через зонд вводили CPS1 или CPS8 и адоптивно переносили Т-клетки BθOM через 3 дня ( n = 24 мыши, три эксперимента). ( C ) Число Т-клеток среди живых лейкоцитов, которые представляют собой CD3 ⁺ CD4 ⁺ в толстой кишке, cdLN и селезенке мышей без микробов, которым вводили через зонд CPS1 или CPS8 ( n = 20 мышей, два эксперимента ).Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. *** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05. Тест Манна – Уитни U для ненормально распределенных данных.

Поскольку BθOM T-клетки специфичны для одного Ag в B. thetaiotaomicron , мы затем попытались определить, может ли один CPS-экспрессирующий B. thetaiotaomicron также модулировать поликлональные иммунные ответы. Мы колонизировали мышей C57BL / 6 без микробов с помощью B. thetaiotaomicron , экспрессирующих CPS1 или CPS8.Десять дней спустя мы собрали Т-клетки из собственной пластинки толстой кишки, cdLN и селезенки. Хотя не было различий в дифференцировке Т-клеток (дополнительный рис. 4H – M), антистимулирующие CPS1-экспрессирующие B. thetaiotaomicron слабо активировали поликлональные Т-клетки, тогда как простимулирующие CPS8-экспрессирующие B. thetaiotaomicron сильно активировали поликлональные Т-клетки in vivo. в собственной пластинке толстой кишки (рис. 6С). Эти данные показывают, что, изменяя экспрессию CPS, бактерии также могут регулировать ответы поликлональных Т-клеток in vivo.

CPSs на

B. thetaiotaomicron контролируют клиренс B. thetaiotaomicron in vivo

При перфорации кишечника кишечные бактерии могут мигрировать в брюшную полость и распространяться в кровотоке (29). Поскольку сообщалось, что B. thetaiotaomicron вызывает сепсис и бактериемию (30, 31), мы затем исследовали функциональную роль CPS на B. thetaiotaomicron in vivo в брюшине. Мы вводили B. thetaiotaomicron , экспрессирующий CPS1 или CPS8 i.p., собрали перитонеальную жидкость через 4 часа и измерили B. thetaiotaomicron , остающееся в перитонеальной жидкости. CPS8-экспрессирующий B. thetaiotaomicron продемонстрировал повышенный клиренс бактерий из перитонеальной жидкости по сравнению с антистимулирующим CPS1-экспрессирующим B. thetaiotaomicron , вероятно, потому что антистимулирующий CPS1-экспрессирующий B. . Затем мы провели анализ бактериального клиренса в перитонеальной жидкости и обнаружили существенные различия в B.Клиренс thetaiotaomicron уже через 1 час после инъекции. Эти результаты подтвердили, что легко фагоцитируемый CPS8-экспрессирующий B. thetaiotaomicron выводится гораздо быстрее, чем плохо поглощаемый CPS1-экспрессирующий B. thetaiotaomicron (фиг. 7A). Таким образом, CPS на B. thetaiotaomicron также модулируют иммунные ответы на доминантный Ag, контролируя клиренс специфических бактериальных Ag in vivo.

РИСУНОК 7.

CPS контролируют клиренс доминирующего B.thetaiotaomicron Ag in vivo. Общее количество КОЕ в перитонеальной интерстициальной жидкости у мышей C57BL / 6, которым вводили 1 × 10 ⁶ КОЕ CPS1 или CPS8 внутрибрюшинно. и промыли через 0, 1, 2, 4, 6 или 8 часов. n = 90 мышей, три эксперимента. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. * p <0,05, *** p <0,001, **** p <0,0001, тест Стьюдента t .

Обсуждение

Бактерии экспрессируют множество различных поверхностных CPS, но функциональные последствия вариации фаз бактерий остаются плохо изученными.Известно, что КПС обладают иммуномодулирующим действием, но в текущих исследованиях изучались иммунные эффекты лишь нескольких КПС, таких как цвиттерионный ПСА, продуцируемый B. fragilis (32). В нашем недавнем исследовании изучалась роль полного набора CPS в конкурентной кишечной колонизации, но мы не изучали, как CPS на B. thetaiotaomicron влияют на иммунный ответ (15). Кроме того, текущие исследования сосредоточены на том, как сама CPS взаимодействует с иммунной системой (5, 28, 33).Остается неизвестным, могут ли CPS на бактериях регулировать иммунный ответ на специфические бактериальные агенты.

Наша симбионт-специфическая система Т-клеток в сочетании с полным набором одиночных CPS-экспрессирующих штаммов B. thetaiotaomicron дает возможность выяснить, могут ли иммунные ответы на доминантные АГ модулироваться CPS на бактериях. Наши результаты показывают критическую роль CPS на B. thetaiotaomicron в регулировании доступности Ag, а также врожденных и адаптивных иммунных ответов на специфические бактериальные Ag.Хотя многие одиночные CPS-экспрессирующие штаммы B. thetaiotaomicron были антистимулирующими, некоторые штаммы были простимулирующими и активировали BθOM T-клетки так же или лучше, чем Acap, у которого отсутствовали все B. thetaiotaomicron CPS. Штаммы B. thetaiotaomicron , экспрессирующие антистимулирующие CPS, подавляли стимуляцию Т-клеток BθOM путем блокирования поглощения доминантного Ag. Плохое поглощение B. thetaiotaomicron с антистимулирующими CPS может частично объясняться их более толстыми капсулами, но также может быть связано с различиями в составе CPS.Простимулирующий CPS8 состоит из 19% N-ацетилглюкозамина, 2% галактозы, 63% глюкозы, 14% маннозы и 1% глюкуроновой кислоты (15). Антистимулирующий CPS1 состоит из 22% N-ацетилглюкозамина, 33% глюкозы, 9% маннозы и 36% галактуроновой кислоты (15). Хотя CPS1 может быть более отрицательно заряженным из-за присутствия галактуроновой кислоты, которая может играть роль в плохом поглощении CPS1, этот анализ состава ограничен моносахаридами, присутствующими в очищенных капсулах B. thetaiotaomicron .CPS содержат много сложных углеводов, и потребуются дополнительные исследования, чтобы выяснить, почему некоторые CPS плохо фагоцитируются. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что CPS на бактериях контролируют доставку доминантных АГ в иммунную систему.

Плохое поглощение и стимуляция BθOM Т-клеток с помощью CPS1-экспрессирующих B. thetaiotaomicron может быть устранена зависимой от рецептора Ab opsonization через A176 Ab. Ab A176 связывается с B. thetaiotaomicron , но не является специфичным для CPS1, что позволяет предположить, что оно распознает эпитоп, который либо консервативен на всех восьми B.thetaiotaomicron или отсутствует на поверхности капсулы. A176 может повышать иммунное распознавание CPS1-экспрессирующего B. thetaiotaomicron с помощью нескольких механизмов. Например, A176 может маскировать поверхностную молекулу, которая ингибирует фагоцитоз, или стимулировать поверхностную молекулу, чтобы вызвать захват. Учитывая литературу, показывающую, что конформация Ab более важна для нейтрализации Ab в вирусах, чем эпитоп Ab или сродство связывания (34), мы предполагаем, что A176 может увеличивать фагоцитоз путем связывания с CPS1-экспрессирующим B.thetaiotaomicron в конкретной геометрической конфигурации, которая позволяет CPS1-экспрессирующему B. thetaiotaomicron поддаваться поглощению APC. Это также может объяснить неспособность A176 активировать стимуляцию Т-клеток BθOM в присутствии OMV, экспрессирующих CPS1. OMV имеют диаметр 20–250 нм и намного меньше, чем целые бактерии (35), поэтому A176 может быть не в состоянии сформировать оптимальную конфигурацию Ab для опсонизации OMV, экспрессирующих CPS1. Эти результаты показывают, что иммунная система может преодолеть способность CPS на B.thetaiotaomicron , чтобы блокировать фагоцитоз за счет генерации АТ, которые восстанавливают иммунный доступ к доминантным АГ посредством зависимой от Fc рецепторной опсонизации.

В дополнение к регулированию адаптивных иммунных ответов все одиночные CPS-экспрессирующие B. thetaiotaomicron активировали врожденную иммунную систему зависимым от MyD88 образом. Поскольку MyD88 находится ниже многих TLR и B. thetaiotaomicron , экспрессирующие антистимулирующие CPS, плохо усваиваются, мы предполагаем, что эти врожденные иммунные ответы в первую очередь обусловлены взаимодействиями между B.thetaiotaomicron и поверхностные рецепторы распознавания образов и могут представлять иммунную адаптацию для преодоления вариации фазы CPS, особенно для обнаружения антифагоцитарных бактерий. Хотя все одиночные CPS-экспрессирующие B. thetaiotaomicron активировали врожденную иммунную систему, B. thetaiotaomicron , экспрессирующие антистимулирующие CPS, активировали врожденную иммунную систему слабее, чем B. thetaiotaomicron , экспрессирующие простимулирующие CPS. Эти различия в активации врожденного иммунитета могут быть связаны с вариациями в составе CPS, особенно в присутствующих иммуномодулирующих молекулах, или способностью антистимулирующих CPS защищать иммуностимулирующие молекулы от активации врожденной иммунной системы.

Многие грамотрицательные бактерии выделяют OMV, которые могут доставлять бактериальные АГ к иммунным клеткам хозяина в кишечнике (19). Было показано, что CPS на OMV, такие как PSA на OMV B. fragilis , регулируют иммунную систему (28), но роль полного набора CPS в OMV еще не исследована. Мы показываем, что полный набор CPS на OMV B. thetaiotaomicron выполняет те же иммуномодулирующие роли, что и CPS на всем B. thetaiotaomicron . Все одиночные CPS-экспрессирующие OMV активировали врожденную иммунную систему, чтобы смещаться к макрофагам M1 и высвобождать воспалительные цитокины.OMV с антистимулирующими CPS активировали BθOM T-клетки и APC слабее, чем OMV с простимулирующими CPS. Эти результаты показывают, что полный набор CPS на OMV может также регулировать адаптивные и врожденные иммунные ответы на доминантные Ag.

Наконец, мы показываем, что CPS на B. thetaiotaomicron также могут модулировать иммунные ответы на доминантные АГ in vivo. В соответствии с нашими данными in vitro, антистимулирующий CPS1 плохо стимулировал Т-клетки BθOM, тогда как простимулирующий CPS8 сильно стимулировал T-клетки BθOM в нашей модели мышей с переносом Т-клеток BθOM.Экспрессия CPS на B. thetaiotaomicron также направляла дифференцировку BθOM T-клеток, поскольку BθOM T-клетки в толстой кишке преобразовывались в большее количество IFN-γ ⁺ IL-17A ⁺ T-клеток в присутствии B. CPS8. Роль этих T _H 1-подобных клеток T _H 17 плохо изучена, но было показано, что они играют важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, включая воспалительные заболевания кишечника (36).CPS на B. thetaiotaomicron также регулируют поликлональные иммунные ответы, поскольку стерильные мыши колонизировали антистимулирующие CPS1-экспрессирующие B. thetaiotaomicron слабо активированные поликлональные Т-клетки, тогда как простимулирующие CPS8-экспрессирующие B. thetaiotaomicron сильно активировали поликлональные T-клетки. Поскольку бактерии могут распространяться в брюшную полость при перфорации кишечника, мы затем исследовали роль CPS на B. thetaiotaomicron на модели перитонеальной инфекции.Легко фагоцитируемый B. thetaiotaomicron , экспрессирующий CPS8, быстрее выводился из брюшной полости по сравнению с плохо фагоцитируемым B. thetaiotaomicron , экспрессирующим CPS1, что позволяет предположить, что CPS на B. thetaiotaomicron также могут регулировать иммунные ответы во время перитонеальной инфекции. Кроме того, было обнаружено, что антистимулирующие и простимулирующие CPSs экспрессируются на B. thetaiotaomicron в образцах кишечника человека, демонстрируя, что CPS на B.thetaiotaomicron может также модулировать иммунные ответы на специфические бактериальные АГ в кишечнике человека (15). Учитывая обширную, неизученную вселенную структур CPS бактерий кишечника, мы считаем, что будущие исследования расширят известный лексикон взаимодействий бактериального полисахарида с иммунной системой и могут даже привести к открытию новых, биоактивных CPS для потенциального использования в качестве терапевтических средств.

Границы | Симбионт из кишечника человека Roseburia hominis способствует и регулирует врожденный иммунитет

Введение

Микробиота кишечника человека состоит из более чем 500–1000 различных филотипов, большинство из которых относятся к типам бактерий Bacteroidetes и Firmicutes (1).Успешные симбиотические отношения, возникающие в результате бактериальной колонизации кишечника человека, обеспечивают широкий спектр метаболических, структурных, защитных и других полезных функций. Иммунологическое значение микробиоты кишечника также хорошо известно; это особенно заметно у стерильных (GF) животных с нарушенной иммунной системой, которая, однако, может быть функционально восстановлена ​​путем введения кишечных комменсальных бактерий (2–4).

В отличие от продукции секреторного кишечного IgA, которая в основном обусловлена ​​микробной колонизацией per se (5, 6), развитие и дифференцировка Т-клеток требует колонизации специфическими комменсальными бактериями.Некоторые виды клостридий, такие как сегментированные нитчатые бактерии (SFB), по-видимому, являются мощными индукторами дифференцировки и созревания кишечных клонов клеток Th2, Th27 и Treg (7, 8). Недавние исследования показали, что кластеры клостридий IV и XIVa и измененная флора Шедлера могут индуцировать de novo генерацию Treg-клеток, в то время как моноколонизация Bacteroides fragilis может корректировать дисбаланс Th2 / Th3 у стерильных мышей путем стимулирования экспансия Treg-клеток (4, 9, 10).Эффекты комменсальных бактерий на пути дифференцировки Т-клеток различны и могут зависеть от определенного набора лигандов толл-подобных рецепторов (TLR), связанных с конкретными бактериями (11). Например, эффекты усиления Treg у B. fragilis реализуются через передачу сигналов TLR2 полисахаридом A (12).

Резкие изменения в составе микробиоты, влияющие на баланс симбионтов и патобионтов, были зарегистрированы при желудочно-кишечных расстройствах, таких как воспалительные заболевания кишечника.Например, болезнь Крона (БК) характеризуется большей относительной численностью Proteobacteria и сокращением других бактерий, таких как Bacteroidales и Clostridiales (13–17). Специфическое уменьшение Roseburia spp. у пациентов с БК также отмечалось (16, 18). Интересно, что этот микробный дисбиоз также связан с дисбалансом в популяциях эффекторных Т-клеток. Изменения микробиоты кишечника при язвенном колите (ЯК) не были охарактеризованы в той же степени.Только недавно исследование пациентов с ЯК показало, что Roseburia hominis вместе с Faecalibacterium prausnitzii значительно снижены при этом заболевании (16, 19). Оба вида показывают обратную корреляцию с активностью болезни. Предыдущие исследования показали противовоспалительное действие колонизации F. prausnitzii на хозяина (20). Гораздо меньше известно о R. hominis , который входит в кластер клостридий XIVa.

Полная последовательность ДНК и аннотация R.Геном hominis был описан ранее (21). В этой статье были исследованы реакции транскриптомов бактерий и хозяев на колонизацию R. hominis . Бактериальные ответы включали экспрессию генов, участвующих в колонизации и адаптации к среде кишечника мыши, в то время как ответы хозяина на колонизацию включали гены иммунитета и функции кишечника.

Материалы и методы

Бактериальные культуры

Roseburia hominis A2-183 ^T (= DSM 16839 ^T = NCIMB 14029 ^T ) и другие виды Roseburia поддерживали и выращивали на синтетической среде YCFA, как описано ранее (22).Штаммы Escherichia coli и Salmonella enterica культивировали в среде LB. Все манипуляции с культурой Roseburia проводили на анаэробной рабочей станции MACS-MG-1000 (Don Whitley Scientific) в атмосфере 80% N ₂ , 10% CO ₂ и 10% H ₂ при 37 ° C. .

Животные, план эксперимента и отбор образцов

экспериментов на животных без микробов были проведены в учреждении по разведению гнотобиотических грызунов INRA (платформа ANAXEM, Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, Франция).Мышей-самцов GF C3H / HeN разделили на контрольную ( N = 8) и экспериментальную ( N = 10) группы и поместили в клетки индивидуально. R. hominis A2-183 ^T (= DSM 16839 ^T = NCIMB 14029 ^T ) выращивали в анаэробных условиях при 37 ° C в среде YCFA. В дни 0, 1 и 2 животным в экспериментальной группе давали 10 ⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) R . hominis через желудочный зонд, а контрольным животным вводили 100 мкл среды YCFA.Образцы подвздошной, восходящей ободочной кишки и слепой кишки собирали на 14-й и 28-й дни. Животные GF TLR5KO (генетический фон C57BL / 6, N = 3) и C57BL / 6 ( N = 3) животные (Jouy-en-Josas ), и обычным животным TLR5KO (генетический фон C57BL / 6, N = 6) и животным Boy / J (конгенным C57BL / 6, N = 6) (Медицинский исследовательский центр, Университет Абердина) через зонд вводили живые культуры. из R. hominis для оценки его функционального значения. Мальчик / J (C57BL / 6 B6 Cd45.1) мыши были фоновым контролем для обычного TLR5K0. Они несут общий лейкоцитарный маркер CD45.1, но в остальном эквивалентны мышам C57BL / 6 дикого типа (23, 24). Двенадцать самок мышей C57BL / 6 (возраст 6 недель) использовали для оценки эффекта R. hominis во время DSS-индуцированного легкого колита. Трем мышам ежедневно вводили дозу путем прямого введения культуры R. hominis в течение всего 8 дней. Шести мышам вводили культуральную среду. Воздействие DSS длилось 4 дня (с 3 по 6 день).Трем мышам, получавшим дозу R. hominis , и трем контрольным мышам в течение этого периода предлагали стерильную воду, содержащую DSS (20 г / л). На 7 день этих мышей снова переводили на стерильную воду без DSS. Мышей подвергали эвтаназии и асептически препарировали на 9-й день. Двадцать две самки мышей C57BL / 6 (возраст 6 недель) использовали для оценки эффекта R. hominis во время DSS-индуцированного патологического колита. После периода акклиматизации 7-10 дней мышам ежедневно вводили 50 мкл (10 ⁹ КОЕ) R.hominis в питательной среде в течение 14 дней. Контрольным животным давали питательную среду. С 9 дня мышам давали DSS (молекулярная масса 50 кДа, 30 г / л) в питьевой воде в течение 6 дней. На 15-й день животных умерщвляли, а образцы тканей выполняли, как описано ранее. Управление и экспериментальные процедуры с животными были одобрены соответствующими местными комитетами по этике.

Анализ транскриптома

Бактериальная РНК из содержимого слепой кишки мыши была выделена и помечена dCTP-Cy3 или dCTP-Cy5 во время синтеза кДНК.Продукты ПЦР, амплифицированные из библиотеки малых фрагментов R. hominis (6000 клонов), использовали для создания дублирующих микрочипов на стеклянных предметных стеклах с использованием робота для определения матриц MicroGrid II TAS (BioRobotics). Гибридизацию микрочипов проводили на станции гибридизации GeneTAC (Genomic Solutions). Чтобы избежать возможных ошибок, использовались протоколы замены красителя и отдельной очистки РНК.

РНК мыши экстрагировали из тканей подвздошной и восходящей ободочной кишки и гибридизовали с GeneChip «NuGO Mouse Array» и GeneChip «Mouse Genome Array» (Affymetrix).Анализ данных проводился с использованием R и Bioconductor. Данные микроматрицы были отправлены в NCBI GEO (Gene Expression Omnibus) с регистрационным номером GSE25544.

Праймеры, специфичные для R. hominis 5′-CCCACTGACAGAGTATGTAATGTAC-3 ‘и 5′-GCACCACCTGTCACCAC-3’ использовали для количественной ПЦР анализов фекальных проб для подтверждения эффективности колонизации. Анализы выполняли с использованием системы 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) с Master Mix Power SYBR Green PCR (Applied Biosystems).Анализы RT-qPCR выполняли на образцах РНК подвздошной и толстой кишки для исследований экспрессии генов хозяина с использованием набора QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen) и QuantiTect Primer Assays (Qiagen).

Иммунофлуоресценция и гистология

FISH-анализы были выполнены с нейтральными забуференными, фиксированными формалином срезами кишечной ткани (толщиной 2 мкм) с зондами 16S рРНК, специфичными для домена бактерий (Cy3-меченый Eub338) и специфичными для штамма R. hominis A2-183. (FITC-маркированный GTACATTACATACTCTGTCAGTG).Бактерии визуализировались при увеличении x630. Иммунолокализацию флагеллина R. hominis исследовали в фиксированных метанолом мазках содержимого толстой кишки с использованием кроличьей антисыворотки против FlaA1 или анти-FlaA2 (Covalab) и ослиной антикроличьей сыворотки Alexa 488 (молекулярные зонды). Маркеры Т-клеток исследовали на последовательных срезах ткани кишечника (8 мкм), используя Ly6G-FITC, CD3-FITC, изоспецифический IgG (BD Biosciences) и дважды меченый FoxP3 Alexa Fluor 594 (Abcam) и CD3-FITC. Срезы кишечной ткани (4 мкм) также окрашивали гематоксилином / эозином.Полный поперечный разрез толстой кишки каждого животного визуализировали при увеличении × 200. Каждое поле зрения оценивалось по шкале от 0 до 4 в соответствии с методом, основанным на Ref. (25).

Эксперименты на клетках

Клетки Caco-2 и HT29 выращивали при 37 ° C в 75% увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ в 24-луночных планшетах. Перед любой обработкой клетки дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса и хранили в DMEM с добавлением 1-глутамина, селена и трансферрина в течение 24 часов.Эпителиальные клетки собирали после инкубации в течение 2 или 4 часов, а затем хранили в RNAlater для дальнейших анализов.

Клетки костного мозга собирали из бедренной и большеберцовой костей мышей C3H / HeN и C57BL / 6. Дендритные клетки костного мозга (BMDC) были созданы с помощью культуры Flt3L или GM-CSF, стимулированы 100 нг / мл флагеллина и проанализированы с помощью проточной цитометрии. Супернатанты собирали и тестировали на IL-10 и IL-12 с помощью наборов шариков для цитометрии (BD Bioscience).

Клетки из кишечника и брыжеечных лимфатических узлов (MLN) выделяли, как описано ранее (26), с небольшими модификациями.Вкратце, клеточные суспензии инкубировали со 100 ед. / Мл коллагеназы VIII (Sigma-Aldrich) в RPMI с добавлением 20% FBS при 37 ^o ° C в течение 20 минут (MLN) или 60 минут (кишечник). Суспензии отдельных клеток анализировали методом проточной цитометрии. Для смешанных лейкоцитарных реакций наивные CD4 ⁺ Т-клетки были очищены из основных лимфатических узлов и селезенок трансгенных мышей OTII с использованием набора MACs Miltenyi CD4 ⁺ для выделения Т-клеток в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные CD4 ⁺ Т-клетки совместно инкубировали с активированными флагеллином BMDC, полученными из Flt3L, в отсутствие или в присутствии пептида OVA323-339 (1 мкг / мл).Через 5 дней дифференцировку Т-клеток определяли с помощью проточной цитометрии.

Проточная цитометрия

Клетки собственной пластинки кишечника и клетки MLN метили CD4-FITC, CD25-APC (eBioscience), CD8-APC-Cy7, CD3-PerCP (Biolegend) и B220-BV570 (BD Biosciences). Мечение внутриклеточного FoxP3 проводили после внеклеточного окрашивания и фиксации / пермеабилизации клеток. Дендритные клетки, полученные из GM-CSF, были помечены CD11b-PerCP Cy5.5 (BD Biosciences), CD11c-PE-Cy7, IA / IE-APC-Cy7, CD80-PE, CD86-APC, CD8-FITC и B220- BV570 (Биолегенда).Дендритные клетки, происходящие из Flt3L, были помечены CD11c-PE-Cy7, CD11b- или Siglec-H-PerCP Cy5.5 (Biolegend), IA / IE-APC-Cy7, CD317-PE, CD40-Alexa Fluor 647, CD103-FITC. и B220-BV570. Т-клетки кокультуры метили CD4-PerCP Cy5.5 (BD Biosciences), CD127-PE-Cy7, CD73-APC, CD195 (CCR5) -FITC, CD62L-BV570 и CD25-APC-Cy7 (Biolegend).

Статистический анализ

Интенсивность пятен на микроматрицах была логарифмически преобразована, и к результатам микрочипов была применена нормализация по Лёссу.Данные RT-qPCR были преобразованы по логарифмической шкале с основанием 2 и проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа с порогом значимости P <0,05. Статистическая значимость между группами лечения оценивалась с использованием критерия Стьюдента t .

Более подробные протоколы доступны в SI «Материалы и методы» в дополнительных материалах.

Результаты

R. hominis отвечает на кишечную среду, активируя гены хемотаксиса, подвижности и мобилизации

Анализ генома

(рис. 1A) выявил, что около 5% всех генов связаны с хемотаксисом и функцией подвижности, включая четыре различных гена флагеллина, один из которых, расположенный в опероне жгутиков, связан с подвижностью жгутиков.

Рисунок 1 . Особенности последовательности генома Roseburia hominis и дифференциально экспрессируемых транскриптов в кишечнике мыши после моноассоциации с R. hominis . (A) Распределение категорий подсистем в геноме R. hominis согласно RAST. Наибольшее количество функций подсистемы относится к углеводам, аминокислотам и производным, а также к метаболизму белков. (B) Число дифференциально экспрессируемых генов в R.hominis -колонизированных мышей ( N = 5) по сравнению с контролем без микробов (GF) ( N = 4), идентифицированных с помощью микроматрицы Affymetrix. Гистограммы представляют количество генов, регулируемых в повышении или понижении у мышей после 14 и 28 дней колонизации. (C) Тепловая карта, созданная из дифференциально экспрессируемых генов с функциональной значимостью между GF и мышами, колонизировавшими R. hominis , через 14 и 28 дней.

Биомассу R. hominis вводили через желудочный зонд мышам GF C3H / HeN в течение трех дней подряд. R. hominis -колонизировал как подвздошную, так и толстую кишку, но в гораздо большем количестве был обнаружен в толстой кишке, до 1 × 10 ¹⁰ бактерий / г фекалий (Рисунок S1 в дополнительных материалах), и было обнаружено, что они тесно связаны с слизистая ободочной кишки.

Дифференциальную экспрессию гена в бактерии в ответ на ассоциацию с хозяином исследовали с использованием микроматрицы R. hominis . Бактериальная РНК была выделена в трех различных экспериментальных условиях, чтобы различить эффекты среды кишечника и компонентов рациона животных: (i) in vivo, , из слепой кишки моноассоциированных мышей; (ii) in vitro из бактерий, выращенных в присутствии диетических компонентов; и (iii) in vitro из бактерий, выращенных в культуре.

Колонизация мышей GF с помощью R. hominis коррелировала с повышенной экспрессией гена-хозяина, которая была самой высокой в ​​толстой кишке, особенно на 28 день после колонизации (рис. 1B). Количество дифференциально экспрессируемых генов в подвздошной кишке было очень низким на 28 день, что соответствовало снижению количества бактерий. Дифференциальные ответы транскриптомов в двух участках ткани и временных точках были проиллюстрированы четким разделением значимых транскриптов в анализе тепловой карты (рис. 1C).

Гены, экспрессирующиеся по-разному, были идентифицированы (in vivo против . In vitro ) с проверкой RT-qPCR, выполненной на 42 дифференциально экспрессируемых генах (таблицы S1 и S2 в дополнительном материале). Гены mobA, — и mobL , которые участвуют в переносе конъюгации / мобилизации, показали сильную повышающую регуляцию in vivo (фиг. 2A). Другие подсистемы, индуцированные кишечной средой, включали мембранный транспорт, в частности транспорт магния, а также подвижность и хемотаксис, включая множественные метил-акцептирующие белки хемотаксиса и гены жгутикового оперона (рис. 2В). R. hominis обладает множественными генами флагеллина: flaA1, flaA2, flaA3 и flaB . Экспрессия flaA1 и flaA2 в кишечной среде мышей была подтверждена вестерн-блоттингом и иммуноцитохимическим анализом (рис. 2С).

Рисунок 2 . Ответы Roseburia hominis на кишечную среду. (A) Количественная оценка с помощью RT-qPCR транскриптов R. hominis , участвующих в переносе конъюгации / мобилизации. R. hominis Образцы РНК: in vivo — выделены из моноассоциированных животных; in vitro; — выделен из культур, выращенных в среде YCFA; in vitro + диета — выделена из культур, выращенных на среде YCFA с добавлением мышиного корма. (B) Количественная оценка с помощью RT-qPCR транскриптов R. hominis , участвующих в подвижности и хемотаксисе. R. hominis Образцы РНК: in vivo — выделены из моноассоциированных животных; in vitro; — выделен из культур, выращенных в среде YCFA; in vitro + диета — выделена из культур, выращенных на среде YCFA с добавлением мышиного корма. (C) Вестерн-блоттинг белков R. hominis , выращенных in vitro в присутствии УФ-облученного стандартного корма для мышей. Мембрану иммуноокрашивали аффинно очищенным антителом 1, антисывороткой, специфичной к Fla2, и антителом против ДНК-гиразы A (дорожка 1: без диеты, дорожка 2: 0,01 г диеты / 10 мл культуры R. hominis , дорожка 3: 0,02). г диеты / 10 мл, полоса 4: 0,05 г диеты / 10 мл, полоса 5: 0,1 г диеты / 10 мл, полоса 6: 0,2 г диеты / 10 мл, полоса 7: 0,5 г диеты / 10 мл и полоса 8: 1 г диеты / 10 мл).Электронная микроскопия R. hominis показывает жгутики (черные стрелки). (D) Иммуноцитохимия с использованием антисывороток, специфичных для FlaA1 и FlaA2, проведенная на R. hominis из содержимого просвета моноколонизированных мышей и на R. hominis , выращенном in vitro . Исходное увеличение — 1000 раз. Результаты RT-qPCR представлены как кратное изменение. Статистическая значимость: * P <0,05, ** P <0,01 и *** P <0.001.

R. hominis влияет на врожденные сигнальные пути хозяина

Гены, участвующие в врожденном иммунитете и барьерной функции кишечника хозяина, были значительно индуцированы колонизацией R. hominis [Рисунок 1C; NCBI GEO (Gene Expression Omnibus), номер доступа GSE25544]. Процесс GO «врожденный иммунный ответ» (GO: 0045087) был активирован и включал связанные с TLR гены Tlr5, Tlr1 и Vnn1 . Повышенная регуляция Tlr5 представляла особый интерес, учитывая присутствие жгутиковых генов в геноме R.hominis и экспрессия соответствующих белков в кишечнике моноколонизированных мышей. Флагеллины могут играть роль в этом врожденном сигнальном пути, опосредуя врожденные и адаптивные иммунные ответы. Другие гены врожденного иммунитета, на которые влияет колонизация R. hominis , включали антимикробные пептиды Defb37, Pla2g3, Muc16 и Itln и гены функции кишечного барьера Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3 и Magi3 . Гены врожденного иммунитета, которые активируются в подвздошной кишке в ответ на R.hominis включал Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 и Tcfe2a . Мы также обнаружили отрицательную регуляцию пути NF-κB (GO: 0043124) с помощью R. hominis , что может способствовать иммунному гомеостазу, подавляя этот воспалительный каскад.

R. hominis Направляет пути Т-клеток

Иммунный ответ был основным путем, индуцированным R. hominis на 28 день в восходящей ободочной кишке моноассоциированных мышей. Пути, значительно затронутые в этой категории, были в основном вовлечены в функцию Т-клеток, включая передачу сигналов IL-10 и регуляцию функции Т-клеток с помощью CTLA-4 (Таблица S3 в дополнительных материалах).Семейство генов Ly6 также индуцировалось в восходящей ободочной кишке. В частности, продукт GPI-заякоренного гена Ly6g6c был активирован в 25 раз, а родственный ген Ly6g6e был активирован в два раза на 28 день. Большинство гематопоэтических клеток, включая нейтрофилы и плазматические дендритные клетки, экспрессируют один или несколько члены семейства Ly6. Повышенное присутствие клеток Ly6G ⁺ у мышей, колонизированных R. hominis , было подтверждено иммуноцитохимическим анализом (рис. 3А).

Рисунок 3 . Индукция FoxP3 ⁺ Treg клеток с помощью Roseburia hominis . (A) Иммунофлуоресцентный анализ клеток собственной пластинки, меченных (i) анти-Ly6G, (ii) анти-CD3 и (iii) анти-CD3 / анти-FoxP3, в восходящей ободочной кишке без микробов (GF) и R. hominis — обработанные мыши линии C3H / HeN. Данные представлены как количество положительных клеток на поле зрения у мышей GF ( N = 7–8) и R. hominis ( N = 8–10).Оригинальное увеличение × 630. Статистическая значимость: * P <0,05. (B) Иммунофлуоресцентный анализ клеток собственной пластинки восходящей ободочной кишки, меченных анти-CD3 и анти-FoxP3, в стерильных и стерильных R. hominis, моноколонизированных C3H / HeN ( N, = 8) и C57BL / 6 ( N = 3) мышей. (C) Анализ проточной цитометрии клеток FoxP3 ⁺ Treg в собственной пластинке обычных мышей, получавших в течение 14 дней мышей R. hominis : C3H / HeN (* P = 0.04 между контролем и обработкой R. hominis ) и мышей C57Bl / 6 (** P = 0,05 между контролем и обработкой R. hominis ). (D) Анализ проточной цитометрии FoxP3 ⁺ Tregs в собственной пластинке мышей с меткой FoxP3, обработанных в течение 8 дней с помощью R. hominis , с 4 днями лечения низкими дозами DSS или без лечения. Статистическая значимость: * P <0,005 контроль по сравнению с лечением DSS и ** P = 0,02 лечение DSS по сравнению с DSS ⁺ R.hominis лечение. (E) Графики проточной цитометрии клеток FoxP3 ⁺ Treg в собственной пластинке толстой кишки мышей, обработанных DSS, и мышей, обработанных DSS ⁺ R. hominis . Графики представляют три эксперимента. Стратегия стробирования для графиков FACS была следующей: FSC / SSC (удаление клеточного дебриса), живые / мертвые-SSC, синглеты (FSC-A / FSC-H), CD3 ⁺ CD8 ^— и CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ . Проценты рассчитывали как CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ клеток от общего количества CD4 ⁺ Т-клеток в каждом препарате.Клетки CD4 ⁺ были получены из стратегии стробирования CD3 ⁺ CD8 ^—.

В то время как на пути регуляции Т-клеток значительное влияние оказывала ассоциация с R. hominis , соответствующие эффекты на дифференцировку Т-клеток требовали дальнейшего исследования. Поэтому мы оценили количество дважды положительных клеток CD3 ⁺ FoxP3 ⁺ в собственной пластинке толстой кишки моноассоциированных мышей C3H / HeN. Значительное увеличение количества регуляторных Т-клеток (CD3 ⁺ FoxP3 ⁺ клетки) было обнаружено у стерильных мышей C3H / HeN и C56BL / 6, колонизированных R.hominis (Рисунки 3A, B).

Обычным мышам C3H / HeN и C57BL / 6 вводили зонд R. hominis в течение 14 дней для определения воздействия бактерии на Treg-клетки в lamina propria животных с нормальной микробиотой. Это лечение привело к небольшому, но значительному увеличению популяции CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ Т-клеток в C3H / HeN ( P = 0,04) и меньшему увеличению C57BL. / 6 мышей ( P = 0.05) по сравнению с неколонизированными мышами (рис. 3С). Хотя популяция Treg была индуцирована у обычных мышей после колонизации R. hominis в гомеостатических условиях, было неизвестно, может ли эта индукция поддерживаться в условиях легкого колита. Поэтому мы исследовали влияние бактерии на Treg-клетки собственной пластинки животных, которым вводили низкие дозы DSS. Мышей с меткой FoxP3 и C57BL / 6 колонизировали R. hominis в течение 2 дней перед обработкой низкой дозой DSS в течение 4 дней с последующими 2 днями чистой питьевой воды.Одно только лечение DSS значительно увеличивало популяцию CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ Т-клеток ( P = 0,02) (фигура 3D). Когда животных дополнительно обрабатывали R. hominis , наблюдалось дальнейшее значительное увеличение популяции CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ Т-клеток ( P = 0,02) по сравнению с DSS. (Рисунки 3D, E).

Роль

флагеллинов R. hominis в модуляции дифференцировки Т-клеток

Влияние бактерий на дифференцировку Т-клеток может отражать определенный набор лигандов TLR, отображаемых конкретной бактерией.Штаммы мышей TLR5KO (GF и обычные) и WT вводили через зонд с бактерией для оценки функционального значения R. hominis и его флагеллинов. Анализ дифференциально экспрессируемых генов у мышей TLR5KO и WT Boy / J, колонизированных R. hominis , показал, что, хотя на Т-клеточные пути все еще влияет событие колонизации у мышей TLR5KO, ответы были больше связаны с IL-4, IL-5. , Пути IL-6, IL-9, а не к IL-10 и CTLA-4 (Таблица S4 в дополнительных материалах).Кроме того, в отличие от моноассоциированных животных C3H / HeN и C57BL / 6 (рис. 3B) и обычных животных Boy / J (рис. 4B, C), количество дважды положительных CD3 ⁺ FoxP3 ⁺ клеток в lamina propria мышей TLR5KO не были увеличены из-за обработки R. hominis (фиг. 4A).

Рисунок 4 . Модуляция дифференцировки Т-клеток с помощью флагеллинов Roseburia hominis . (A) Количественная оценка клеток собственной пластинки в восходящей ободочной кишке, иммунофлуоресцентно меченных анти-CD3 и анти-FoxP3 в стерильных (GF) и R.hominis моноколонизированных мышей TLR5KO ( N = 2). (B) Графики проточной цитометрии клеток FoxP3 ⁺ Treg в собственной пластинке толстой и тонкой кишки и мезентериальных лимфатических узлах (MLN) обычных мышей TLR5KO и мышей Boy / J WT, получавших в течение 14 дней R. hominis . (C) Анализ проточной цитометрии клеток FoxP3 ⁺ Treg у обычных мышей TLR5KO и мышей Boy / J WT, получавших в течение 14 дней R. hominis : в собственной пластинке толстой кишки ( P = 0.01 между TLR5KO и WT), в собственной пластинке тонкой кишки ( P = 0,03 между TLR5KO и WT) и в MLN ( P = 0,33 между TLR5KO и WT).

Набор флагеллинов патогенных и комменсальных бактерий, включая рекомбинантные флагеллины R. hominis , использовали для сравнения их влияния на активацию сигнальных ответов в IEC и BMDC. Клетки Caco-2 обрабатывали одинаковыми концентрациями различных бактериальных флагеллинов (фиг. 5A).Флагеллин патогенного S. enterica серотипа Enteritidis (SE) индуцировал большую панель генов, чем флагеллины комменсальных E. coli K12 или R. hominis FlaA1. E. coli и R. hominis индуцировали сильный ответ и, имея аналогичный набор генов между ними, образовали отдельную кладу, отличную от SE. Напротив, FlaA2, как правило, не был провоспалительным и не активировал консервативную генную сигнатуру ( IL8, CXCL1, CXCL2 и CXCL10 ), которая индуцировалась другими рекомбинантными бактериальными флагеллинами.Фактически, набор затронутых генов был ближе к таковому у контрольных клеток и образовывал кластер, отделенный от других флагеллинов. FlaA1 из R. hominis индуцировал разные ответы в BMDC, полученных из Flt3L и GM-CSF, по сравнению с SE и K12 (Фигуры 5B, C). В частности, FlaA1 обладал уникальной способностью активировать расширенные Flt3L DC с усиленной регуляцией I-A / I-E и CD40 и продуцированием IL-10 BMDC у мышей C3H / HeN и C57BL / 6. Отношение IL-10 / IL-12 было особенно повышено в DC C57BL / 6 (фиг. 5D), которые оказались CD103 ⁺ Siglec-H ⁺ .Чтобы проверить, могут ли BMDC, активированные флагеллином, дифференцированно модулировать дифференцировку наивных Т-клеток, были выполнены смешанные культуры лейкоцитов CD4 ⁺ клеток OTII с BMDC, полученными из Flt3, стимулированными флагеллином. Данные показывают, что продукция IL-10 и IL-12 с помощью флагеллина, стимулированного соотношением BMDC, производным от Flt3, запускала дифференцировку наивных Т-клеток в направлении профиля Treg (фиг. 5E). В отличие от FlaA2, FlaA1 значительно увеличивал популяцию Treg в сокультурах Т-клеток.

Рисунок 5 .Эффекты флагеллина FlaA1 Roseburia hominis на эпителиальные клетки кишечника и дендритные клетки костного мозга мышей. (A) Тепловая карта дифференциально экспрессируемых генов в клетках Caco-2, обработанных различными бактериальными флагеллинами: от Salmonella enterica серотипа Enteritidis (SE), Escherichia coli K12 (K12) и R. hominis (FlaA1 и FlaA2). (B) Экспрессия CD40; IA / IE и CD103 с помощью CD11c ⁺ B220 ⁺ CD317 ⁺ Дендритные клетки, полученные из Flt3L из обычных C3H / HeN, контроль (синий) и через 24 ч инкубации с рекомбинантными флагеллинами (SE, K12, FlaA1, FlaA2; все в зеленом цвете) определяется методом проточной цитометрии.Гистограмма представляет данные трех экспериментов. (C) Частоты дендритных клеток, происходящих из Flt3L и GM-CSF из обычных C3H / HeN, стробированных на CD11c ⁺ B220 ⁺ CD317 ⁺ клеток и CD11c ⁺ CD11b ⁺ — B220 ⁺ — B220 902 клетки, обработанные различными рекомбинантными флагеллинами (SE, K12, FlaA1 и FlaA2). Результаты показаны как процент от общего количества живых и одиночных клеток, среднее значение ± стандартное отклонение для трех экспериментов. (D) Уровень цитокинов IL-10 и IL-12 измеряли с помощью цитометрических наборов гранул в супернатантах от контроля (нестимулированные DC; N = 3) и обработанных FlaA1 DC ( N = 3), полученных из C3H / HeN и C57BL / 6.Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистическая значимость: *** P <0,001. (E) Стимулированные флагеллином дендритные клетки, происходящие из Flt3, совместно культивировали с CD4 ⁺ Т-клетками в течение 5 дней и Т-клетки окрашивали для выявления экспрессии маркеров дифференцировки Т-клеток. График показывает процент активированных Treg-клеток. Статистическая значимость: ** P <0,01.

R. hominis ослабляет колит у мышей, получавших DSS

Эффекты Р.hominis на врожденный и адаптивный иммунитет побудили нас проверить его терапевтическую эффективность с использованием модели DSS на мышах (рис. S2 в дополнительных материалах; рис. 6). Группе лечения ежедневно вводили дозу R. hominis (~ 50 мкл, примерно 10 ⁹ КОЕ) через желудочный зонд в течение 14 дней, в то время как необработанная группа получала такое же количество среды для роста бактерий. Затем двум группам давали DSS с питьевой водой (молекулярная масса 50 кДа, 30 г / л), начиная с 8-го дня. На 15-й день мыши, получавшие DSS, без R.Добавление hominis имело сильное увеличение панели провоспалительных биомаркеров по сравнению с контрольными мышами, при этом уровни индукции генов варьировались от 4 до 49 раз (Фигура 6A). Индукция провоспалительных генов была значительно ниже у мышей, получавших R. hominis , по сравнению с контрольной группой, что указывает на сильную терапевтическую пользу перорального введения R. hominis . На 15 день тяжелое воспаление было обнаружено в восходящей ободочной кишке мышей, получавших DSS, без R.hominis , в то время как слизистая оболочка толстой кишки в группе, получавшей R. hominis , демонстрировала только низкий уровень воспаления, что согласуется со сниженной экспрессией провоспалительных генов (Фигуры 6B, C). Обработка R. hominis также уменьшала потерю веса у мышей, получавших DSS (фигура S3 и таблица S5 в дополнительных материалах).

Рисунок 6 . Roseburia hominis ослабляет воспаление в модели колита DSS. (A) DSS мышей, не получавших R.hominis ( N = 8) имел сильное повышение всех генов по сравнению с контрольными мышами ( N = 4), тогда как дифференциальная экспрессия генов была ниже у животных, леченных R. hominis ( N = 10). . Результаты RT-qPCR, полученные на 15 день, представлены как кратное изменение по сравнению с контролем. Статистическая значимость: *** P <0,001. (B) Гистопатологическая оценка ткани (25), представленная как средний процент полей зрения при заданной степени. Обработка DSS значительно изменила все поля зрения на 0, 2, 3 и 4 классах. R. hominis значительно уменьшил% полей зрения для патологии 4 степени ( P = 0,02) и увеличил% полей зрения для степени 0. Данные, полученные на 15 день, представлены как среднее ± стандартное отклонение. (C) Восходящая ободочная кишка (окрашенная гематоксилином / эозином) контрольных животных, обработанных DSS ⁺ R. hominis и обработанных DSS. Показанные изображения представляют собой репрезентативные поля зрения для каждой группы лечения с присвоенной оценкой в ​​скобках. Одиночная черная стрелка указывает на инфильтрацию клеток, а двунаправленная стрелка указывает на трансмуральную инфильтрацию.L, люмен. Оригинальное увеличение × 200. Масштабная шкала соответствует 50 мкм.

R. hominis Колонизация влияет на состав тела и экспрессию генов сытости

В следующей серии экспериментов мы исследовали метаболические изменения у хозяина и бактерии из-за ассоциации хозяин-микроб. Мыши, моноассоциированные с R. hominis , демонстрировали значительные метаболические изменения по сравнению с контрольными мышами GF. В частности, процессы GO: «негативная регуляция реакции на пищу» (GO: 0032096), «негативная регуляция аппетита» (GO: 0032099) и «регуляция секреции катехоламинов» (GO: 0050433) были подавлены в восходящем направлении. толстой кишки после колонизации R.hominis [NCBI GEO (Gene Expression Omnibus), номер доступа GSE25544]. В эти процессы вовлечены гены Agt, Cartpt, Cck и Cxcl12 с соответствующими индуцированными изменениями мРНК в диапазоне от 2 до 12 раз. Cck , в частности, играет важную роль в пищеварении и насыщении как подавитель голода. Экспрессия Gcg также подавлялась на этом участке кишечника.

Чтобы установить, имеют ли изменения транскрипции этих генов какое-либо физиологическое значение с точки зрения состава тела, был проведен анализ веса сухой тушки и липидного состава.Масса сухой тушки мышей, ассоциированных с R. hominis , была значительно больше, чем у животных GF (фигура 7A). Анализ липидов туши показал, что общее ожирение также было значительно выше у животных, колонизировавших R. hominis , на 14 день (фигура 7B).

Рисунок 7 . Roseburia hominis Колонизация влияет на гены насыщения и массу тела. Беспроблемных (GF) мышей-самцов C3H / HeN разделили на контрольную ( N = 8) и экспериментальную ( N = 10) группы.В дни 0, 1 и 2 животным в экспериментальной группе вводили ~ 10 ⁹ КОЕ R . hominis в среде YCFA (100 мкл) через зонд, в то время как контрольным животным вводили 100 мкл только среды YCFA. Анализировали сухую массу тела и содержание липидов в тушах. (A) Масса сухих туш мышей, ассоциированных с R. hominis , была значительно больше по сравнению с животными GF. (B) Анализ липидов туши показал, что общее ожирение также было значительно выше у R.hominis -ассоциированные животные на 14 день. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. (C) RT-qPCR анализ генов, участвующих в метаболизме бутирата.

Значительные метаболические изменения были также обнаружены на другой стороне спектра взаимодействия хозяин-микроб. В частности, экспрессия генов R. hominis , участвующих в продукции бутирата, усиливалась кишечной средой (фиг. 7C). Это были гены, кодирующие ацетил-КоА-ацетилтрансферазу, 3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу и фосфоенолпируваткарбоксикиназу.Стимулирующий эффект эпителиальных клеток хозяина на продукцию ацетата и бутирата R. hominis был дополнительно подтвержден в отдельных экспериментах in vitro (фигура S4 в дополнительных материалах). Бактериальные клетки, инкубированные с клетками Caco-2 и HT29, продуцировали значительно более высокие количества этих метаболитов по сравнению с контрольными клетками R. hominis , инкубируемыми в тех же условиях, но без эпителиальных клеток.

Обсуждение

Долгосрочная коэволюция взаимодействия хозяин-микроб, вероятно, привела к отбору функционально важных видов бактерий в кишечнике, большинство из которых не встречается в других экосистемах.В настоящее время имеется лишь ограниченная информация о вкладе отдельных членов микробного сообщества в функции кишечника, в частности, в развитие и регуляцию иммунитета слизистых оболочек.

Специфические функции некоторых кишечных бактерий, таких как B. fragilis и SFB, были исследованы в кишечнике мышей, чтобы определить их индивидуальный вклад в биологию Т-клеток, и было показано, что эти бактерии являются мощными индукторами Treg и клеток Th27 ( 4, 7, 8).Члены кластеров Clostridium IV и XIVa в последнее время привлекли больше внимания. Например, их присутствие в измененной флоре Шедлера и вклад смешанной культуры Clostridium spp. к дифференцировке Т-клеток (9, 10).

Мы сообщаем об успешной и стабильной моноассоциации R. hominis , строго анаэробного флагеллированного члена типа Firmicutes, в кишечнике мышей GF. Транскрипционные ответы R.hominis после моноколонизации можно отнести как к среде кишечника хозяина, так и к диете. К ним относятся подсистемы хемотаксиса и моторики. Роль подвижности и жгутикового аппарата в колонизации хозяина хорошо известна для патогенных бактерий, но меньше известно о роли флагеллинов в комменсальных бактериях. Гены, кодирующие функции подвижности клеток и, в частности, флагеллины, обычно экспрессируются в микробиоме кишечника с переменным и низким уровнем распространения (27). Кроме того, только часть микробиомов кишечника человека содержит детектируемые гены флагеллина (28).Мы показали, что флагеллинов R. hominis и экспрессируются в кишечной среде мышей. Экспрессия гена флагеллина, по-видимому, частично зависит от наличия определенных пищевых компонентов. Предыдущая работа показала, что экспрессия гена флагеллина родственного вида Roseburia inulinivorans действительно зависит от субстрата; его экспрессия выше в присутствии крахмала по сравнению с глюкозой, инулином или фруктаном (29).

Присутствие R. hominis в кишечнике индуцирует гены, участвующие в обеспечении барьерной функции кишечника и врожденного иммунитета.Плотные соединения, щелевые соединения и адгезивные соединения действуют, чтобы ограничить бактериальную транслокацию в субэпителиальный слой кишечника, и этим функциям могут способствовать кишечные бактерии (30). И CD, и UC характеризуются потерей барьерной функции и целостностью плотных контактов. Интересно, что дисбактериоз кишечной микробиоты при ЯК и БК связан со значительным сокращением R. hominis и F. prausnitzii (16, 19). Наши результаты об активном вкладе R.hominis на барьерную функцию кишечника подтверждает мнение, что его потеря у пациентов с БК или ЯК может иметь серьезные последствия. Комплексы плотных соединений могут активироваться рядом других комменсальных и пробиотических бактерий (31), потенциально способствуя улучшению состояния «дырявого кишечника» при этих заболеваниях.

Roseburia hominis индуцировала экспрессию таких генов, как Ly6g6c , а также путей, участвующих в регуляции Т-клеток. Наиболее затронутые пути Т-клеток включают пути, связанные с IL-10, ICOS и CTLA-4, которые все участвуют в дифференцировке Treg-клеток.Значительное увеличение CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ в толстой кишке наблюдалось у мышей, моноколонизированных с помощью R. hominis или у обычных мышей, получавших добавку из живой культуры R. hominis . Наши результаты дополняют недавние сообщения об эффектах дифференцировки Treg другими видами Clostridium (10, 32). Мы показали здесь, что единственный бактериальный штамм R. hominis A2-183 способен стимулировать разрастание Т-клеток слизистой оболочки и влиять на дифференцировку Т-клеток у моноассоциированных, обычных мышей и мышей, получавших DSS.

Представители рода Roseburia являются одними из наиболее распространенных подвижных видов бактерий в нормальной здоровой кишечной микробиоте человека (33). Флагеллины являются мощными иммуномодулирующими белками: жгутиковые бактерии, такие как R. hominis , могут активно взаимодействовать с иммунной системой хозяина. Другим важным следствием подвижности среди видов Roseburia является их способность проникать через слой слизи и прикрепляться к поверхности эпителиальных клеток кишечника хозяина (34).Это свойство считается очень желательной характеристикой, повышающей пробиотический потенциал бактерий (35). Близость к клеткам-хозяевам позволяет кишечным бактериям-комменсалам оказывать сильные физиологические эффекты, потенциально обращая вспять метаболические нарушения и контролируя воспаление, барьерную функцию кишечника и секрецию пептидов кишечника.

Передача сигналов флагеллина многими патогенными бактериями через рецепторы TLR5 хозяина вызывает сильный провоспалительный ответ, в основном за счет активации сигнального пути NF-κB (36).Однако численное преобладание жгутиковых комменсальных бактерий делает сильный провоспалительный сценарий маловероятным. Эти бактерии способны передавать сигналы флагеллина / TLR5, что важно для защиты хозяина и защиты от болезней, поскольку делеция TLR5 приводит к колиту (37). Присутствие генов флагеллина в геномах SFB (38, 39) может объяснить сильную индукцию Th27-клеток этими бактериями (7, 8).

Дифференциальная экспрессия флагеллинов R. hominis in vitro оказывает влияние на IEC и BMDC.Панель протестированных флагеллинов по-разному влияла на IEC и BMDC, хотя все структуры флагеллина включали консервативный домен Arg90, связанный с флагеллинами, которые связывают и активируют TLR5 (40), что предполагает, что другие свойства последовательности / структуры могут объяснять сигнальные ответы, опосредованные FlaA1. и FlaA2. Определенные комменсальные структуры флагеллина могут помочь направлять ответы иммунной толерантности через TLR5, экспрессируемые либо на CD103 ⁺ DC, либо на подмножествах Treg (23, 41, 42).Значимость передачи сигналов флагеллин-TLR5 в ответах Treg, индуцированных R. hominis , была дополнительно исследована с использованием мышей TLR5KO. Мы показали, что R. hominis -индуцированные CD3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ FoxP3 ⁺ клеток были значительно ниже у мышей TLR5KO, что указывает на то, что передача сигналов TLR5 / флагеллина является важным медиатором для распространения этого T подмножество ячеек. Иммуномодулирующие эффекты R. hominis были показаны на DSS-обработанных мышах.Хотя модель колита DSS обычно является независимой от Т-клеток, мы показали, что R. hominis индуцировал популяции регуляторных Т-клеток у этих животных. Другие противовоспалительные молекулы, такие как бутират, также могут способствовать иммунной толерантности и ограничивать повреждение тканей (43, 44). Еще одним эффектом короткоцепочечных жирных кислот, продуцируемых бактериями, является повышение эффективности преобразования пищи. Компоненты пищи, такие как полисахариды, которые плохо усваиваются хозяином, разлагаются бактериями и используются хозяином, что приводит к лучшему восстановлению энергии из рациона.Дифференциальная экспрессия генов сытости может быть еще одним фактором, способствующим увеличению веса и ожирению у животных, колонизированных R. hominis .

Таким образом, колонизация кишечника R. hominis вызвала индукцию специфических подмножеств генов как на бактериальной, так и на хозяйской стороне взаимодействия. В этом исследовании мы сосредоточились на передаче сигналов среди других молекулярных механизмов, чтобы объяснить природу этого перекрестного разговора. Передача сигналов TLR5 / флагеллина потенциально может управлять экспансией Treg-клеток через TLR5-зависимый механизм, и наши результаты предполагают потенциальную терапевтическую пользу R.hominis при лечении ЯК, который характеризуется потерей этой бактерии из кишечника (16).

Заявление об этике

Управление и экспериментальные процедуры с животными были одобрены соответствующими местными комитетами по этике в Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, Франция, и Медицинским исследовательским центром, Университет Абердина, Соединенное Королевство.

Авторские взносы

Исследования, разработанные AP, IM и RA; AP, IM, AT, AL, NC-B, VG-R, KG, EL, MD, AC, EM, VF, RI, GG и RA провели исследования; Данные анализа AP, IM, AL, GG и RA; Рукопись написали AP, IM, GG и RA.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Эндрю Гевиртца (Университет штата Джорджия, Атланта, Джорджия, США) и Адама Каннингема (Университет Бирмингема, Эджбастон, Бирмингем, Великобритания) за щедрое предоставление стерильных и обычных мышей TLR5KO соответственно.Авторы также хотели бы отметить значительный вклад Дениз Келли в начало работы, экспериментальную работу, интерпретацию результатов и написание рукописи, а также поддержку со стороны RESAS (Сельская и экологическая наука и аналитическая служба) Правительство Шотландии. EM и VF были поддержаны стипендиями сети начального обучения Марии Кюри, финансируемой ЕС (грант № 215532). Авторы выражают признательность профессору Гарри Флинту и доктору Сильвии Дункан за щедрую поддержку в микробиологической части этой работы.Также выражаем признательность за квалифицированную техническую поддержку Джиллиан Кэмпбелл и Полин Янг из RINH Genomics.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2017.01166/full#supplementary-material.

Сноски

Список литературы

1. Экбург П.Б., Бик Е.М., Бернштейн К.Н., Пурдом Э., Детлефсен Л., Сарджент М. и др. Разнообразие микробной флоры кишечника человека. Science (2005) 308 (5728): 1635–8. DOI: 10.1126 / science.1110591

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Макферсон AJ, Hunziker L, McCoy K, Lamarre A. Ответы IgA в слизистой оболочке кишечника против патогенных и непатогенных микроорганизмов. Микробы заражают (2001) 3 (12): 1021–35. DOI: 10.1016 / S1286-4579 (01) 01460-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Макферсон А.Дж., Мартиник М.М., Харрис Н.Функции Т-клеток слизистой оболочки в сдерживании местной комменсальной флоры кишечника. Cell Mol Life Sci (2002) 59 (12): 2088–96. DOI: 10.1007 / s000180200009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Мазманян С.К., Лю С.Х., Цианабос А.О., Каспер Д.Л. Иммуномодулирующая молекула симбиотических бактерий направляет созревание иммунной системы хозяина. Cell (2005) 122 (1): 107–18. DOI: 10.1016 / j.cell.2005.05.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7.Gaboriau-Routhiau V, Rakotobe S, Lecuyer E, Mulder I, Lan A, Bridonneau C и др. Ключевая роль сегментированных нитчатых бактерий в скоординированном созревании ответов Т-хелперных клеток кишечника. Иммунитет (2009) 31 (4): 677–89. DOI: 10.1016 / j.immuni.2009.08.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Иванов И.И., Атараши К., Манель Н., Броди Е.Л., Шима Т., Караоз У и др. Индукция кишечных клеток Th27 сегментированными нитчатыми бактериями. Cell (2009) 139 (3): 485–98.DOI: 10.1016 / j.cell.2009.09.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Geuking MB, Cahenzli J, Lawson MA, Ng DC, Slack E, Hapfelmeier S, et al. Бактериальная колонизация кишечника вызывает мутуалистические регуляторные Т-клеточные ответы. Иммунитет (2011) 34 (5): 794–806. DOI: 10.1016 / j.immuni.2011.03.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Atarashi K, Tanoue T., Shima T., Imaoka A., Kuwahara T., Momose Y, et al.Индукция регуляторных Т-клеток толстой кишки аборигенными видами Clostridium . Наука (2011) 331 (6015): 337–41. DOI: 10.1126 / science.1198469

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Раунд Дж. Л., Ли С. М., Ли Дж., Тран Дж., Джабри Б., Чатила Т. А. и др. Путь toll-подобного рецептора 2 устанавливает колонизацию комменсалом человеческой микробиоты. Наука (2011) 332 (6032): 974–7. DOI: 10.1126 / science.1206095

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.Франк Д. Н., Сент-Аманд А. Л., Фельдман Р. А., Boedeker EC, Harpaz N, Pace NR. Молекулярно-филогенетическая характеристика дисбаланса микробного сообщества при воспалительных заболеваниях кишечника человека. Proc Natl Acad Sci U S. A (2007) 104 (34): 13780–5. DOI: 10.1073 / pnas.0706625104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Scanlan PD, Shanahan F, Marchesi JR. Независимый от культуры анализ десульфовибрионов в дистальном отделе толстой кишки у здоровых людей, больных колоректальным раком и полипэктомированных лиц. FEMS Microbiol Ecol (2009) 69 (2): 213–21. DOI: 10.1111 / j.1574-6941.2009.00709.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Канг С., Денман С.Е., Моррисон М., Ю З., Дор Дж., Леклерк М. и др. Дисбиоз фекальной микробиоты у пациентов с болезнью Крона, выявленный с помощью пользовательского филогенетического микрочипа. Воспаление кишечника (2010) 16 (12): 2034–42. DOI: 10.1002 / ibd.21319

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16.Machiels K, Joossens M, Sabino J, De Preter V, Arijs I., Eeckhaut V, et al. Уменьшение количества видов, продуцирующих бутират, Roseburia hominis и Faecalibacterium prausnitzii определяет дисбактериоз у пациентов с язвенным колитом. Кишечник (2014) 63 (8): 1275–83. DOI: 10.1136 / gutjnl-2013-304833

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Геверс Д., Кугатасан С., Денсон Л.А., Васкес-Баеза И., Ван Треурен В., Рен Б. и др. Микробиом, ранее не получавший лечения, при впервые возникшей болезни Крона. Клеточный микроб-хозяин (2014) 15 (3): 382–92. DOI: 10.1016 / j.chom.2014.02.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Hedin CR, McCarthy NE, Louis P, Farquharson FM, McCartney S, Taylor K, et al. Измененная кишечная микробиота и фенотип Т-клеток крови характерны для пациентов с болезнью Крона и их здоровых братьев и сестер. Кишечник (2014) 63 (10): 1578–86. DOI: 10.1136 / gutjnl-2013-306226

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19.Тилг Х., Данезе С. Roseburia hominis : новый виновник патогенеза язвенного колита? Кишечник (2014) 63 (8): 1204–5. DOI: 10.1136 / gutjnl-2013-305799

CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Сокол Х., Пиньер Б., Ваттерлот Л., Лахдари О., Бермудес-Хумаран Л.Г., Гратаду Дж. Дж. И др. Faecalibacterium prausnitzii — это противовоспалительная комменсальная бактерия, выявленная при анализе микробиоты кишечника пациентов с болезнью Крона. Proc Natl Acad Sci U S. A (2008) 105 (43): 16731–6.DOI: 10.1073 / pnas.0804812105

CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Трэвис А.Дж., Келли Д., Флинт Г.Дж., Аминов Р.И. Полная последовательность генома кишечного симбионта человека Roseburia hominis . Объявление о геноме (2015) 3 (6): e1286–1215. DOI: 10.1128 / genomeA.01286-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Дункан Ш., Аминов Р. И., Скотт К. П., Луис П., Стэнтон Т. Б., Флинт Х. Дж. Предложение Roseburia faecis sp.nov., Roseburia hominis sp. ноя и Roseburia inulinivorans sp. nov., на основе изолятов фекалий человека. Int J Syst Evol Microbiol (2006) 56 (Pt 10): 2437–41. DOI: 10.1099 / ijs.0.64098-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Флорес-Лангарика А., Маршалл Дж. Л., Хичкок Дж., Кук С., Джобанпутра Дж., Бобат С. и др. Системная иммунизация флагеллином стимулирует CD103 + дендритные клетки слизистой оболочки и запускает Foxp3 + регуляторные Т-клетки и ответы IgA в мезентериальном лимфатическом узле. J Immunol (2012) 189 (12): 5745–54. DOI: 10.4049 / jimmunol.1202283

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Zhan T, Cao C, Li L, Gu N, Civin C.I, Zhan X. MIM регулирует перенос клеток костного мозга посредством модуляции поверхностной экспрессии CXCR4. Лейкоз (2016) 30 (6): 1327–34. DOI: 10.1038 / leu.2016.39

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Берг Д. Д., Дэвидсон Н., Кун Р., Мюллер В., Менон С., Холланд Г. и др.Энтероколит и рак толстой кишки у мышей с дефицитом интерлейкина-10 связаны с аберрантной продукцией цитокинов и CD4 (+) Th2-подобными ответами. J Clin Invest (1996) 98 (4): 1010–20. DOI: 10.1172 / JCI118861

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Монтелеоне I, Платт А.М., Яэнссон Э., Агаче В.В., Моват А.М. IL-10-зависимая частичная рефрактерность к стимуляции толл-подобных рецепторов модулирует функцию дендритных клеток слизистой оболочки кишечника. Eur J Immunol (2008) 38 (6): 1533–47.DOI: 10.1002 / eji.200737909

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Невилл Б.А., Шеридан П.О., Харрис Х.М., Кофлан С., Флинт Х.Дж., Дункан С.Х. и др. Провоспалительные белки флагеллина распространенных подвижных комменсальных бактерий в различных количествах присутствуют в кишечном микробиоме пожилых людей. PLoS One (2013) 8 (7): e68919. DOI: 10.1371 / journal.pone.0068919

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Цинь Дж., Ли Р., Раес Дж., Арумугам М., Бургдорф К.С., Маничан С. и др.Каталог микробных генов кишечника человека, созданный путем метагеномного секвенирования. Nature (2010) 464 (7285): 59–65. DOI: 10.1038 / nature08821

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Скотт К.П., Мартин Дж. К., Чассар К., Клергет М., Потрикус Дж., Кэмпбелл Дж. И др. Субстратно-зависимая экспрессия генов в Roseburia inulinivorans : важность индуцируемых ферментов в использовании инулина и крахмала. Proc Natl Acad Sci U S A (2011) 108 (Дополнение 1): 4672–9.DOI: 10.1073 / pnas.10000

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Укена С.Н., Сингх А., Дрингенберг Ю., Энгельхардт Р., Зайдлер Ю., Хансен В. и др. Пробиотик Escherichia coli Nissle 1917 подавляет проницаемость кишечника, улучшая целостность слизистой оболочки. PLoS One (2007) 2 (12): e1308. DOI: 10.1371 / journal.pone.0001308

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Уллувишева Д., Андерсон Р.К., Макнабб В.К., Моуган П.Дж., Уэллс Дж.М., Рой Н.К.Регулирование проницаемости плотных стыков кишечными бактериями и пищевыми компонентами. J Nutr (2011) 141 (5): 769–76. DOI: 10.3945 / jn.110.135657

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Нарушима С., Сугиура Ю., Осима К., Атараси К., Хаттори М., Суэмацу М. и др. Характеристика 17 штаммов индуцирующих регуляторные Т-клетки человеческого происхождения Clostridia . Кишечные микробы (2014) 5 (3): 333–9. DOI: 10.4161 / gmic.28572

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33.Аминов Р.И., Уокер А.В., Дункан С.Х., Хармсен Х.Дж., Веллинг Г.В., Флинт Х.Дж. Молекулярное разнообразие, культивирование и улучшенное обнаружение с помощью флуоресцентной in situ гибридизации доминантной группы кишечных бактерий человека, родственных Roseburia spp. или Eubacterium rectale . Appl Environ Microbiol (2006) 72 (9): 6371–6. DOI: 10.1128 / AEM.00701-06

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Ван ден Аббеле П., Белзер С., Гуссенс М., Клееребезем М., Де Вос В.М., Тас О. и др.Виды кластера XIVa Clostridium , продуцирующие бутират, специфически колонизируют муцины в модели кишечника in vitro . ISME J (2013) 7 (5): 949–61. DOI: 10.1038 / ismej.2012.158

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Чой Ю.Дж., Им Э., Чанг Х.К., Поулакис Ц., Ри Ш. TRIF опосредует индуцированную толл-подобным рецептором 5 передачу сигналов в эпителиальных клетках кишечника. J Biol Chem (2010) 285 (48): 37570–8. DOI: 10.1074 / jbc.M110.158394

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37.Singh V, Yeoh BS, Carvalho F, Gewirtz AT, Vijay-Kumar M. Склонность мышей с дефицитом TLR5 к развитию колита зависит от микробиоты. Кишечные микробы (2015) 6 (4): 279–83. DOI: 10.1080 / 194.2015.1060390

CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Пракаш Т., Осима К., Морита Х., Фукуда С., Имаока А., Кумар Н. и др. Полные последовательности генома сегментированных нитчатых бактерий крыс и мышей, мощный индуктор дифференцировки клеток Th27. Cell Host Microbe (2011) 10 (3): 273–84.DOI: 10.1016 / j.chom.2011.08.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Sczesnak A, Segata N, Qin X, Gevers D, Petrosino JF, Huttenhower C и др. Геном сегментированных нитчатых бактерий, индуцирующих клетки Th27, обнаруживает обширную ауксотрофию и адаптацию к кишечной среде. Клеточный микроб-хозяин (2011) 10 (3): 260–72. DOI: 10.1016 / j.chom.2011.08.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40.Юн С.И., Курнасов О., Натараджан В., Хонг М., Гудков А.В., Остерман А.Л. и др. Структурная основа распознавания и передачи сигналов TLR5-флагеллина. Science (2012) 335 (6070): 859–64. DOI: 10.1126 / science.1215584

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Креллин Н.К., Гарсия Р.В., Хадисфар О., Аллан С.Е., Штайнер Т.С., Левингс М.К. CD4 + Т-клетки человека экспрессируют TLR5, а его лиганд флагеллин увеличивает супрессивную способность и экспрессию FOXP3 в CD4 + CD25 + Т-регуляторных клетках. J Immunol (2005) 175 (12): 8051–9. DOI: 10.4049 / jimmunol.175.12.8051

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Kinnebrew MA, Buffie CG, Diehl GE, Zenewicz LA, Leiner I., Hohl TM, et al. Продукция интерлейкина 23 дендритными клетками CD103 (+) CD11b (+) кишечника в ответ на бактериальный флагеллин усиливает врожденную иммунную защиту слизистой оболочки. Иммунитет (2012) 36 (2): 276–87. DOI: 10.1016 / j.immuni.2011.12.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43.Smith PM, Howitt MR, Panikov N, Michaud M, Gallini CA, Bohlooly-Y M, et al. Микробные метаболиты, короткоцепочечные жирные кислоты, регулируют гомеостаз Treg-клеток толстой кишки. Science (2013) 341 (6145): 569–73. DOI: 10.1126 / science.1241165

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Фурусава Ю., Обата Ю., Фукуда С., Эндо Т.А., Накато Г., Такахаши Д. и др. Бутират комменсального микроба индуцирует дифференцировку регуляторных Т-клеток толстой кишки. Nature (2013) 504 (7480): 446–50.DOI: 10.1038 / природа12721

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

«Биолог» публикует данные о нематодах и симбионтах насекомых: UNM Newsroom

Любой, кто изучал биологию в средней школе, мог столкнуться с родом Drosophila . Это насекомое, также известное как плодовая муха или уксусная муха, ценится исследователями, потому что у них простой и плодовитый репродуктивный цикл, что позволяет легко изучать многие поколения за относительно короткое время.

Исследование Drosophila привело к лучшему пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе болезней человека, а также основных физиологических, иммунологических и неврологических свойств, сохраняемых между людьми и этими крошечными насекомыми. Но Drosophila имеет сложные отношения с другими организмами, которые обеспечивают его плодовитость, и новое исследование изучает эту связь, которая может происходить от сотен тысяч до миллионов лет назад.

Винс Мартинсон, доцент кафедры биологии ЕНД

В недавно опубликованном исследовании под названием Множественное происхождение облигатных нематод и симбионтов насекомых от клады бактерий, тесно связанных с патогенами растений , Винс Мартинсон, доцент кафедры биологии Университета Нью-Мексико, и его коллеги Стив Перлман, Райан Гаврилюк, Брент Гоуэн и Кейтлин Кертис из Университета Виктории и Джон Дженике из Университета Рочестера рассматривают Drosophila neotestacea и его связь с паразитами и симбионтами.

«Вкратце, мое исследование посвящено взаимодействию между животными (в основном насекомыми) и полезными микробными симбионтами. Многие беспозвоночные в своем выживании зависят от бактериальных мутуалистов, известных как облигатные симбионты, — объяснил Мартинсон. Например, тля зависит от бактериального симбионта ( Buchnera ), чтобы обеспечить незаменимыми аминокислотами, которые они не могут получить из своего растительного сока. Многие из этих фантастических историй о взаимоотношениях между насекомыми и бактериями были написаны Эдом Йонгом в его книге « Я вмещаю множество » 2016 года, в которой он показывает, насколько «повсеместно распространены и жизненно важны микробы… как люди разрушают эти партнерские отношения и каковы сейчас ученые. манипулируя ими в наших интересах.”

«Фактически, текущее исследование, опубликованное в PNAS, расширяет взаимодействие хозяина и микроба, известное в мухе Drosophila и системе паразитических нематод Howardula , которая была представлена ​​в I Contain Multitude », — добавил он. Обычно мухи, зараженные нематодами, обитающими в брюшке мух, имеют почти нулевую плодовитость. Тем не менее, муха приобрела бактериальный симбионт Spiroplasma , который специально нацеливается на нематод с помощью токсина, защищая муху от нематод.Таким образом, мухи, укрывающие Spiroplasma , имеют гораздо более высокую способность производить живое потомство, если на них паразитирует нематода.

В текущей статье PNAS Мартинсон и его коллеги обнаружили, что паразитическая нематода Howardula также имеет симбиотическую бактерию, которая кажется относительно молодой по отношению к другим отношениям между хозяином и симбионтом. Функция этого симбионта в настоящее время неизвестна, но проведенные ими эксперименты показали, что нематода не может жить без симбионта.Другими словами, это обязательные отношения.

«В то время как наиболее обязательные отношения симбионта и хозяина являются древними — сотни миллионов лет», по нашим оценкам, этот симбионт нематод очень молодой — возраст менее 500 тысяч лет. Это дает представление о ранних стадиях эволюции симбионта-хозяина », — пояснил Мартинсон. «Кроме того, мы обнаружили, что этот симбионт нематод является членом ранее неизвестной, но очень широко распространенной группы бактерий, связанных с беспозвоночными. Внутри этой бактериальной группы облигатный симбиоз с насекомыми-хозяевами независимо развивался, по крайней мере, еще три раза.”

Мартинсон сказал, что открытие этой широко распространенной группы симбиотических бактерий является первым шагом в исследовании лучших способов борьбы с болезнями как у людей, так и у сельского хозяйства. Symbiopectobacterium связаны с насекомыми, которые вызывают повреждение сельскохозяйственных культур и питаются кровью людей. Кроме того, они тесно связаны с бактериями, вызывающими мягкую гниль, которые являются массовыми патогенами растений во всем мире. Дальнейшие исследования этой группы бактерий могут выявить 1) способы борьбы или предотвращения повреждения растений бактериями мягкой гнили и 2) способы манипулирования или уничтожения беспозвоночных переносчиков болезней человека и растений.В целом, микробные симбионты обладают невероятным потенциалом в биотехнологии, потому что у них сложились тесные отношения с насекомыми и нематодами, которые оказывают огромное влияние на передачу болезней людям и растениям, отметил он.

«Мы уверены, что наша статья будет интересна исследователям, изучающим симбиоз и патогенность. Symbiopectobacterium — захватывающая модель для изучения эволюции симбиоза, поскольку он и его близкие родственники охватывают весь континуум взаимодействий паразит-хозяин, от свободно живущих, хорошо изученных, генетически поддающихся лечению патогенов, до культивируемых факультативно наследуемых симбионтов. способ обязать симбионтов.Кроме того, до сих пор описано лишь несколько облигатных симбиозов нематод », — заключил Мартинсон.

Martinson VG, Gawryluk RMR, Gowen BE, Curtis CI, Jaenike J, Perlman SJ. (2020) Множественное происхождение облигатных нематод и симбионтов насекомых от клады бактерий, тесно связанных с патогенами растений. Труды Национальной академии наук. PNAS впервые опубликован 30 ноября 2020 г .; https://doi.org/10.1073/pnas.2000860117

Изучение интегрированного действия и выражения человека и машины — Медиа-лаборатория Массачусетского технологического института

На протяжении всей истории мы увеличивали наши физические возможности с помощью машин.Концепции летательных аппаратов и идеи, лежащие в основе сегодняшних экзоскелетов, были записаны еще в 13 веке. Сегодня, когда технологии пронизывают все аспекты нашей жизни, легко представить себе более тесную интеграцию машин в задачи, которые мы выполняем. Этот тезис исследует видение людей и машин, которые симбиотически работают вместе над задачей посредством взаимодействия и сотрудничества. Это видение открывает множество возможностей между крайностями автономных роботов и систем «главный-подчиненный» через более сложные системы, в которых человек и машина взаимодействуют для выполнения действий и управления расширениями роботов.

В этой диссертации также сообщается о трех обширных экспериментах, каждый из которых состоит из нескольких итераций реальных, протестированных конструкций: серия роботов с дополнительным числовым управлением пальцами для повышения ловкости рук, серия совместных систем рисования человека и дрона, обеспечивающих новые выразительные способности, и серию полуавтоматических гитарных систем, обеспечивающих расширенное музыкальное выражение, а также новые возможности обучения инструментам. Исследования, проведенные с этими прототипами, дают представление о влиянии такой роботизированной интеграции на человека-пользователя: пользователя подталкивают к адаптации к новым условиям и повторной калибровке ожиданий, связанных с определенными входными действиями; разделение ролей позволяет пользователю исследовать и понимать опыт, выходящий за рамки его навыков или физических ограничений; а роботизированное расширение вдохновляет на активность, выходящую за рамки обычной практики пользователя.

Наконец, диссертация также определяет пространство дизайна и соответствующую терминологию для определения различных технических и дизайнерских решений для этих новых форм интеграции человека и робота. Я классифицирую некоторые из существующих подходов в зависимости от того, как координируются действия человека и робота и как управляются движения роботов. Я также предлагаю способы качественного описания взаимодействия между человеком и машиной с точки зрения того, как роботизированное расширение может повлиять на познание и поведение своего пользователя.Эксперименты с прототипами подтверждают и анализируются с помощью этих определений, а также обсуждают, как мы могли бы достичь новых или синергетических результатов с помощью роботизированных дополнений.

Симбионт Trill | Память Alpha

Трель симбионт

Дакс, симбионт трилл в 2370 году

Одан, симбионт трилл в 2367

« Она пришла навестить меня на Трилле, и я все еще был немного сбит с толку. Когда она вошла в мою комнату, я широко улыбнулся, посмотрел ей прямо в глаза и сказал: ‘Привет, мама, это я, Керзон .«Дела пошли под откос. «

Симбионт Трилл был разумной червеобразной формой жизни с планеты Трилл. В основном они жили в симбиозе внутри носителей, известных как триллы, гуманоидных существ, также обитающих на этой планете. Благодаря опыту, полученному от нескольких хозяев, многие симбионты приобрели выдающуюся репутацию по сравнению с другими видами, как триллы. Они были долгожителями по сравнению с большинством гуманоидных видов и могли легко прожить более 550 лет.

Физиология

Симбионты Триллы имели форму слезы и могли плавать в своих естественных водоемах, таких как Пещеры Мак’ала.Симбионты общались друг с другом с помощью электрических импульсов, передаваемых через молочную воду, в которой они обитали. У них также была ограниченная форма общения с некой Трилл, пока они не присоединились. (DS9: «Равновесие»)

Симбионт Trill соединился с новым хозяином посредством хирургической процедуры, в ходе которой он помещается в брюшную полость, где через узкую часть своего тела он соединяется с телом хозяина. После того, как симбионт соединялся более чем на девяносто три часа, симбионт становился зависимым от своего хозяина-трилла, и наоборот; без симбионта трилл умрет в течение нескольких часов, а симбионт не сможет ни вернуться в Пещеры Мак’ала (если присоединиться к нему впервые), ни пережить значительный период времени вне хозяина.(ДС9: «Дакс», «Инвазивные процедуры») Если предположить, что симбионт пережил неожиданную смерть носителя вдали от Трилла, он будет удален и стабилизирован для транспортировки неотложной медицинской помощи обратно в Трилл, чтобы соединить с другим подходящим хозяином. Однако, если состояние симбионта ухудшится до такой степени, что он умрет в пути, единственным способом спасти его жизнь будет присоединение к ближайшей не присоединившейся Трилле. (DS9: «Слезы пророков», «Тени и символы»; DIS: «Не забывай меня»)

После и во время присоединения симбионты забрали с собой все воспоминания своих предыдущих хозяев-трилл, так что после присоединения новый хозяин-трилл получил эти воспоминания.Мозг симбионта и хозяина мог общаться и, действительно, не функционировал отдельно. Анализ волновых паттернов мозга симбионта отдельно от хозяина был возможен, и до некоторой степени паттерны симбионта существенно не меняются от хозяина к хозяину. (ДС9: «Дакс») В случае Адиры, после завершения соединения с симбионтом Тала, сознание их любовника Грея, предыдущего хозяина симбионта, впоследствии постоянно появлялось для них как отдельная сущность.В сложной голопрограмме сознание Грея было распознано компьютером как отдельная сущность и способно проявиться как голограмма, видимая всем участникам программы. Перед закрытием программы Грей заявил, что они с Талом «застряли». (DIS: «Мусорщики», «Эта надежда — это ты, часть 2»)

Хотя людей можно было использовать в качестве хозяина для симбионта, симбионт не мог долго оставаться в их телах, не нанося физического вреда человеческому хозяину. (TNG: «Хозяин») Однако симбионт мог нормально выжить в частично трилловом хозяине.(ДС9: «Дети времени»)

К 31 веку стало возможным навсегда объединить людей и симбионтов. Это была практика, которая вызвала сопротивление и крайнее неодобрение, иногда жестокое, со стороны некоторых сторон общества Трилл, как это испытала Адира Тал. (DIS: «Не забывай меня»)

Общество

Симбионты Trill полагались на Trill, чтобы выжить через хозяев. Комиссия по симбиозу наблюдала за объединением червеобразных симбионтов и гуманоидных трелей.Через Комиссию о симбионтах заботились Стражи Трилл, и они имплантировались только в Триллы, которые прошли тщательный процесс тестирования, гарантируя, что новый хозяин обладает высоким интеллектом, уравновешенным характером и не отвергнет симбионта. (DS9: «Дакс», «Инвазивные процедуры», «Равновесие»)

В 24 веке около 500 симбионтов становились доступными для присоединения каждый год по сравнению с примерно 5 000 трилл, становящихся посвященными в год. Относительно небольшое количество симбионтов привело к тому, что общество триллов скрывало от своего основного населения тот факт, что практически 50% населения были пригодны для присоединения, и, следовательно, общее мнение в 24 веке заключалось в том, что только один из каждых 1000 трелей был пригоден для присоединения. .Это было сделано из-за беспокойства и страха за симбионтов, поскольку считалось, что разумные виды могут рассматриваться как просто призы или товары, за которые нужно бороться. (DS9: «Равновесие»)

Хотя около 500 симбионтов становились доступными каждый год для присоединения, это, естественно, не представляло бы всю популяцию симбионтов, так как по крайней мере некоторым из них пришлось бы оставаться несоединенными в Пещерах Мак’ала для размножения вида. Что касается того, как объединенный симбионт может воспроизводить потомство естественным образом вместе с себе подобными, Рональд Д.Мур заявил: « Мы установили, что симбионты действительно периодически возвращаются в подземные бассейны, и именно там они, вероятно, производят потомство. » ( AOL chat, 1997)

До середины 24 века не было широко известно, что триллы на самом деле являются объединенным видом, так как это считалось частным делом. Новым хозяевам часто приходилось выдвигать ложные истории о том, почему у него или у нее были определенные воспоминания о предыдущих хозяевах. Эта истинная природа стала известна Объединенной Федерации планет в 2367 году, когда мужчина-хозяин посла Одана в то время умер, вынудив Комиссию послать нового хозяина, Карила, на USS Enterprise -D для присоединения.Беверли Крашер стала первым доктором Звездного Флота, который изучил и осуществил этот процесс. (TNG: «Хозяин»)

В какой-то момент своей долгой жизни Сфера узнала о симбионтах и ​​их способности сливаться с гуманоидными носителями, и информация об этом была загружена в USS Discovery в 2257 году. Вскоре после путешествия в 32-й век и после того, как узнал, что это Адира присоединилась к симбионту Тала, капитан Сару получил доступ к данным Сферы, чтобы узнать больше об этом виде. (ДИС: «Люди Земли»)

Симбионты

Обряды и церемонии

Приложения

Игры

Справочная информация

Для TNG: «The Host» Майкл Уэстмор основал дизайн симбионта на теле гусеницы, прикрепленной к голове осьминога.(«Пришельцы Майкла Уэстмора: второй сезон», DVD DS9, сезон 2, специальный фильм) Было добавлено несколько извилин, чтобы устройство выглядело так, как будто у симбионта много мозгового вещества. В голову симбионта был вставлен воздушный пузырь, который начал пульсировать, создавая впечатление, что симбионт жив. Голова также была окрашена флуоресцентной краской, благодаря чему она светилась под воздействием черного света во время операции. ( Звездный путь: Пришельцы и артефакты , стр. 117)

Для второго появления симбионта в пилотном эпизоде ​​ Star Trek: Deep Space Nine «Эмиссар» Майкл Уэстмор значительно изменил дизайн.По его словам, симбионт был «все еще в том же духе по форме», хотя обновленная версия была меньше, чем его предшественник. ( Официальный Star Trek: Deep Space Nine Magazine , выпуск 1, стр. 28) « Одна [причина изменения симбионта] заключалась в том, чтобы придать ему более обтекаемый вид […] То, как эта [измененная версия] был разработан, он был почти как округлый треугольник с этими маленькими щупальцами, которые могли загибаться назад, — пояснил Уэстмор. « И если нанести на него много KY Jelly всякий раз, когда мы будем делать эффекты, он будет скользить намного легче. »(« Пришельцы Майкла Уэстмора: второй сезон », DVD DS9, сезон 2, специальный фильм)

Библия серии Star Trek: Deep Space Nine гласит: « Симбионт — это беспозвоночное, андрогинное существо, живущее внутри хозяина. Он выглядит как невысокая толстая змея. Много веков назад симбионты жили под землей [ …] [до присоединения к хозяевам] из-за экологической катастрофы. «[1]

В первом черновом варианте сценария «Trials and Tribble-ations» была установлена ​​гипотетическая эволюционная связь между трилльскими симбионтами и триблами, поскольку некоторые ксенобиологи, по-видимому, предположили, что симбионты произошли от триблеров.