Acinetobacter lwoffii: Acinetobacter Lwoffii — an overview

Microbiological, Pathogenetic and Resistant Properties

49

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ МИКРОБИОЛОГИИ

resistant clones from an ancestral susceptible genetic pool. PLoS

ONE. 2010; 5: 10034.

35. Eveillard M., Kempf M., Belmonte O., Pailhoriеs H., Joly-

Guillou M.L. Reservoirs of Acinetobacter baumannii outside the

hospital and potential involvement in emerging human communi-

ty-acquired infections. Int. J. Infect. Dis. 2013; 17 (10): 802–805.

36. Retailliau H.F., Hightower W.A., Dixon R.E., Allen J.R. Aci-

netobacter calcoaceticus: a nosocomial pathogen with an unusual

seasonal pattern. J. of Infect. Dis. 1979; 139: 371–375.

37. Tomaras A.P., Dorsey C.W., Edelmann R.E., Actis L.A. Attach-

ment to and biofilm formation on abiotic surfaces by Acinetobacter

baumannii: involvement of a novel chaperone-usher pili assembly

system. Microbiol. 2003; 149: 3473–3484.

38. Smani Y., McConnell M.J., Pachon J. Role of fibronectin in the

adhesion of Acinetobacter baumannii to host cells. PLoS One. 2012;

7 (4): 33073.

39. Cerqueira G.M., Peleg A.Y. Insights into Acinetobacter baumannii

pathogenicity. IUBMB Life. 2011; 63 (12): 1055–1060.

40. Mihara K., Tanabe T., Yamakawa Y., Funahashi T., Nakao H.,

Narimatsu S., Yamamoto S. Identification and transcriptional

organization of a gene cluster involved in biosynthesis and trans-

port of acinetobactin, a siderophore produced by Acinetobacter

baumannii ATCC 19606T. Microbiol. 2004; 150: 2587–2597.

41. Brade H., Galanos C. Biological activities of the lipopolysac-

charide and lipid A from Acinetobacter calcoaceticus. J. Med.

Microbiol. 1983; 16 (2): 211–214.

42. Kwon S.O., Gho Y.S., Lee J.C., Kim S.I. Proteome analysis

of outer membrane vesicles from a clinical Acinetobacter baumannii

isolate. FEMS Microbiol. Lett. 2009; 297 (2): 150–156.

43. Grotiuz G., Sirok A., Gadea P., Varela G., Schelotto F. Shiga

toxin 2-producing Acinetobacter haemolyticus associated with

a case of bloody diarrhea. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 3838–3841.

44. Choi C.H., Lee J.S., Lee Y.C., Park T.I., Lee J.C. Acinetobacter

baumannii invades epithelial cells and outer membrane protein A

mediates interactions with epithelial cells. BMC Microbiol. 2008;

8: 216.

45. Qiu H., KuoLee R., Harris G., Van Rooijen N., Patel G.B.,

Chen W. Role of macrophages in early host resistance to respira-

tory Acinetobacter baumannii infection. PLoS One. 2012; 7: 40019.

46. Russo T.A., Beanan J.M., Olson R., MacDonald U., Cox A.D.,

St Michael F., Vinogradov E.V., Spellberg B., Luke-Marshall N.R.,

Campagnari A.A. The K1 capsular polysaccharide from Aci-

netobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive

immunization. Infect Immun. 2013; 81 (3): 915–922.

47. Rodriguez-Bano J., Marti S., Soto S., Fernandez-Cuenca F.,

Cisneros J.M., Pachon J., Pascual A., Martínez-Martínez L.,

McQueary C., Actis L.A., Vila J. Biofilm formation in Acineto-

bacter baumannii: associated features and clinical implications.

Clin. Microbiol. Infect. 2008; 14 (3): 276–278.

48. McQueary C.N., Actis L.A. Acinetobacter baumannii biofilms:

variations among strains and correlations with other cell proper-

ties. J. Microbiol. 2011; 49 (2): 243–250.

49. Choi A.H., Slamti L., Avci F.Y., Pier G.B. and Maira-Litran T.

The pgaABCD locus of Acinetobacter baumannii encodes the pro-

duction of poly-beta-1-6-N-acetylglucosamine, which is critical

for biofilm formation. J. Bacteriol. 2009; 191: 5953–5963.

50. Smith M.G., Gianoulis T.A., Pukatzki S., Mekalanos J.J., Orn-

ston L.N., Gerstein M., Snyder M. New insights into Acinetobacter

baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing

andtransposon mutagenesis. Genes Dev. 2007; 21 (5): 601–614.

51. Горбич Ю.Л., Карпов И.А. Клинические особенности Acineto-

bacter baumannii-ассоциированных инфекций. Клиническая

инфектология и паразитология. 2012; 1 (1): 34–45.

52. Wisplinghoff H., Bischoff T., Tallent S.M., Seifert H., Wenzel R.P.

Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of

24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.

Clin. Infect. Dis. 2004; 39: 309–317.

53. Bergogne-Berezin E., Joly-Guillou M.L., Vieu J.F. Epidemiol-

ogy of nosocomial infections due to Acinetobacter calcoaceticus.

J. Hosp. Infect. 1987; 10 (2): 105–113.

54. Miller R.M., Polakavetz S.H., Hornick R.B., Cowley R.A. Analy-

sis of infections acquired by the severely injured patient. Surg.

Gynecol. Obstet. 1973; 137 (1): 7–10.

55. Trottier V., Segura P.G., Namias N., King D., Pizano L.R. Out-

comes of Acinetobacter baumannii infection in critically ill burned

patients. J. Burn. Care Res. 2007; 28: 248–254.

56. Charnot-Katsikas A., Dorafshar A.H., Aycock J.K., David M.Z.,

Weber S.G., Frank K.M. Two cases of necrotizing fasciitis due to

Acinetobacter baumannii. J. Clin. Microbiol. 2009; 47: 258–263.

57. Olut A.I., Erkek E. Early prosthetic valve endocarditis due to

Acinetobacter baumannii: a case report and briefreview of the lit-

erature. Scand. J. Infect. Dis. 2005; 37 (11–12): 919–921.

58. Palabiyikoglu I., Tekeli E., Cokca F., Akan O., Unal N. Nosoco-

mial meningitis in a university hospital between 1993 and 2002.

J. Hosp. Infect. 2006; 62: 94–97.

59. Hoffmann S., Mabeck C. E., Veisgaard R. Bacteriuria caused bv

Acinetobacter calcoaceticus biovars in a normal population and

in general practice. J. Clin. Microbiol. 1982; 16: 443–451.

60. Henao-Martinez A.F., González-Fontal G.R., Johnson S. A case

of community-acquired Acinetobacter junii-johnsonii cellulitis.

Biomedica. 2012; 32 (2): 179–181.

61. Linde H.J., Hahn J., Holler E., Reischl U., Lehn N. Septicemia

due to Acinetobacter junii. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 2696–2697.

62. Rathinavelu S., Zavros Y., Merchant J.L. Acinetobacter lwoffii

infection and gastritis. Microbes Infect. 2003; 5 (7): 651–657.

63. Chen C.H., Wu S.S., Huang C.C. Two case reports of gastroen-

doscopy associated Acinetobacter baumannii bacteremia. World

J. Gastroenterol. 2013; 19 (18): 2835–2840.

64. Gaynes R., Edwards J.R. Overview of nosocomial infections

caused by gram-negative bacilli. Clin. Infect. Dis. 2005; 41: 848–

854.

65. Maragakis L.L., Perl T.M. Acinetobacter baumannii: epidemiology,

antimicrobial resistance, and treatmentoptions. Clin. Infect. Dis.

2008; 46 (8): 1254–1263.

66. Levin A.S., Levy C.E., Manrique A.E., Medeiros E.A., Costa S.F.

Severe nosocomial infections with imipenem-resistant Acineto-

bacter baumannii treated with ampicillin / sulbactam. Int. J. Anti-

microb. Agents. 2003; 21 (1): 58–62.

67. Briggs S., Ellis-Pegler R., Raymond N., Thomas M., Wilkinson L.

Gram-negative bacillary meningitis after cranial surgery or trauma

in adults. Scand. J. Infect. Dis. 2004; 36: 165–173.

68. Zarrilli R., Giannouli M., Tomasone F., Triassi M., Tsakris A.

Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: the molecular

epidemic features of an emerging problem in health care facilities.

J. Infect. Dev. Ctries. 2009; 3 (5): 335–341.

69. Тапальский Д.В., Мозгова А.В., Козлова А.И. Чувствитель-

ность госпитальных изолятов Acinetobacter baumannii к анти-

биотикам и их комбинациям. Клиническая микробиология

и антимикробная химиотерапия. 2014; 16 (2): 37.

70. Справочник по антимикробной терапии. Под ред. Р.С. Коз-

лова, А.В. Дехнича. Смоленск: МАКМАХ. 2010. 416 с.

71. Peleg A.Y., Seifert H., Paterson D.L. Acinetobacter baumannii:

emergence of a successful pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 2008;

21: 538–582.

72. Robledo I.E., Aquino E.E., Sante M.I., Santana J.L., Otero D.M.,

Leon C.F., Vazquez G.J. Detection of KPC in Acinetobacter spp. in

Puerto Rico. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54: 1354–1357.

73. Bonnin R.A., Nordmann P., Potron A., Lecuyer H., Zahar J.R.,

Poirel L. Carbapenem-hydrolyzing GES-type extended-spectrum

beta-lactamase in Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents

Chemother. 2011; 55 (1): 349–354.

74. Kempf M., Rolain J.M. Emergence of resistance to carbapenems

in Acinetobacter baumannii in Europe: clinical impact and thera-

peutic options. Int. J. Antimicrob. Agents. 2012; 39 (2): 105–114.

Особенности распространения заболеваний, вызванных Acinetobacter spp., в детском многопрофильном стационаре

1Морозовская детская городская клиническая больница Департамента здравоохранения города Москвы; 2Российская медицинская академия последипломного образования, Москва

Проведен ретроспективный анализ 332 историй болезни, в том числе 43 – из отделений хирургического профиля, 17 – из отделения офтальмологии, 22 – из отделения оториноларингологии, 29 – из отделения реанимации и интенсивной терапии, 28 – из отделений соматического профиля (22 – из педиатрических отделений, 3 – из отделения онкогематологии и гематологии и 3 – из неврологических отделений) и 193 – из инфекционных отделений, за период с 2008 по 2012 г. Всего за 5 лет зарегистрировано 332 случая заболеваний, вызванных Acinetobacter spp., в том числе 218 заносов и 114 случаев внутрибольничного заражения. Среднее значение уровня внутрибольничной заболеваемости ацинетобактериозом за 5 лет составило 0,63‰. За 5 лет среди выделенных Acinetobacter spp. при заносах преобладал Acinetobacter lwoffii (54%), а при внутрибольничных случаях заражения – Acinetobacter baumannii (50%).

В последние годы Acinetobacter spp. стал часто встречаться как возбудитель инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи (ИСМП). В стационарах Европы и Северной Африки, как и в Российской Федерации, циркулируют несколько клонов полиантибиотикорезистентных Acinetobacter spp. [1]. На 45-й Междисплинарной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy – ICAAC) бактерии рода Acinetobacter spp. были образно охарактеризованы как «грамотрицательные MRSA» [2]. С первых описаний в 70-е годы Acinetobacter spp. в качестве нозокомиального патогена характеризовался высокой резистентностью ко многим известным антибиотикам, причем распространенность резистентности приобретает все большие масштабы. Исходы инфекций, вызванных Acinetobacter spp., неблагоприятны, так как нет эффективных препаратов для лечения такого рода заболеваний. Ацинетобактеры очень трудно поддаются эрадикации. Так, в медицинском центре Тель-Авива меры по эрадикации MRSA и Clostridium difficile были успешными, но справиться с Acinetobacter spp. не удаётся [1–3].

Бактерии рода Acinetobacter – неспорообразующие, грамотрицательные, свободно живущие в окружающей среде. Установлено их широкое распространение в окружающей среде, пищевых продуктах и среди населения. Acinetobacter spp. является также одним из древних микроорганизмов, извлеченных из мозга юкагирского мамонта [4, 5]. Род Acinetobacter включает несколько видов, среди которых чаще выделяется A. baumannii, в большинстве случаев вызывающий заболевания у тяжелобольных со сниженным иммунитетом. Данный микроорганизм может являться причиной инфекций дыхательных путей (синусит, трахеобронхит, пневмония), кровотока (сепсис, эндокардит естественных и искусственных клапанов), мочевыводящих путей, инфекции в области хирургических вмешательств, инфекций кожи и мягких тканей (включая некротизирующий фасциит), нервной системы (менингит, вентрикулит, абсцесс мозга), интраабдоминальных (абсцессы различной локализации, перитонит) и инфекций опорно-двигательного аппарата (остеомиелит, артрит) [6].

В целом следует сказать, что Acinetobacter spp., является в настоящее время часто встречающимся возбудителем ИСМП, поражающим преимущественно тяжелобольных иммуноскомпрометированных пациентов. Он хорошо адаптирован к обитанию в госпитальной среде и обладает высокой резистентностью к большинству антисептических и антимикробных препаратов. В то же время Acinetobacter spp. является представителем нормальной микрофлоры организма человека [1, 7, 8]. В связи с этим возникает необходимость оценить его роль как возбудителя воспалительных заболеваний у детей.

Цель работы – выявить особенности распространения Acinetobacter spp. в детском многопрофильном стационаре и определить частоту заболеваемости ИСПМ, вызванными Acinetobacter spp.

Материалы и методы

Исследования проведены в Морозовской детской городской клинической больнице Департамента здравоохранения города Москвы за период с 2008 п…

Мартынова А.М., Ющенко Г.В.

Acinetobacter (ацинетобактер) baumannii, lwoffii, spp

Acinetobacter – повсеместно распространенный, свободно живущий, сапрофитный микроорганизм, обитающий у здоровых людей на коже, в кишечнике и урогенитальном тракте. Эти микробы обычно колонизируют участки кожного покрова на ногах и в паху. Чаще всего бактерии вызывают внутрибольничные инфекции, имеющие вялотекущий характер, а также пищевые токсикоинфекции и диарею путешественников. Большинство микробов рода Acinetobacter чрезвычайно устойчивы к проводимой терапии.

В 1911 году микробиолог из Голландии Мартин Виллем Бейеринк впервые выделил из почвы бактерии кокковидной формы, способные утилизировать ацетат кальция в качестве источника энергии. Он назвал их Micrococcus calcoaceticus. Спустя несколько лет были описаны свойства этих микробов: неподвижность, неспособность окислять углеводы и редуцировать нитраты. Многие авторы описывали подобные микроорганизмы. В 1954 году официально открыли род Acinetobacter, в который были включены только оксидазонегативные микроорганизмы. Термин «ацинетобактер» в переводе с древнегреческого языка означает «неподвижная бактерия», лишенная флагеллярных органелл движения — жгутиков.

Acinetobacter spp. до недавнего времени считали малопатогенными микроорганизмами. Современные ученые доказали, что при определенных условиях вирулентность микробов повышается. Это приводит к развитию тяжелых инфекционных процессов – менингита и септицемии. С 2017 года ацинетобактеры стали официально относиться к классу опасных бактерий, что обусловлено их резистентностью к современным противомикробным средствам.

Acinetobacter spp. встречается в различных природных объектах: воде, почве, стоках. A. baumannii — клинически значимый представитель данного рода. Он является типичным возбудителем внутрибольничной инфекции. У тяжелых больных A. baumannii вызывает пневмонию, трахеобронхит, сепсис, уретрит, раневую инфекцию.

Рост полирезистентных штаммов ацинетобактерий — серьезная проблема современной медицины. В настоящее время появились бактерии, устойчивые ко всем основным группам антибиотиков. Они с трудом поддаются элиминации из организма. Ученые-медики активно ведут поиск профилактических мер и разрабатывают новые медикаменты, активные в отношении таких возбудителей.

Этиология

Ацинетобактер — род неферментирующих микроорганизмов из семейства Moraxellaceae.

• Acinetobacter baumannii

  Морфология. Acinetobacter — плеоморфные короткие и округлые палочковидные бактерии, способные приобретать форму кокков при определенных условиях. Они являются аспорогенными, капсульными и неподвижными. Некоторые штаммы демонстрируют «дергающуюся» подвижность – движение рывками за счет полярно расположенных фимбрий. Фимбрии и капсула имеются не у всех представителей данного рода. В ядре бактерий содержится циркулярно замкнутая молекула ДНК.

• Тинкториальные свойства. Бактерии окрашиваются по Грамму в красный цвет и располагаются в мазке парами, короткими цепочками или беспорядочными скоплениями.
• Физиологические свойства. Ацинетобактер – хемоорганотроф с окислительным метаболизмом, строгий аэроб. Этот микроб характеризуются универсальной активностью метаболизма, обеспечивающей его удивительную экологическую пластичность. В качестве источника питания ацинетобактерии используют разнообразные вещества – простые углеводы, нефть, ткани организма человека. Бактерии проявляют высокую липолитическую активность.
• Биохимические свойства. Ацинетобактер — неферментирующий микроорганизм. Он не образует индол, сероводород и оксидазу, является каталазопозитивным и оксидазонегативным. Большинство штаммов разлагают сахара с образованием кислоты.
• Культуральные свойства. Acinetobacter растут на простых питательных средах. Им не требуются факторы роста. Обычно используют для культивирования минеральные среды с единственным источником энергии – этанолом, ацетатом или лактатом. Селективная среда для ацинетобактерий — Лидс-агар1, а также хромогенный агар CHROMagar, UriSelect. Некоторые штаммы могут продуцировать слизь, бледно-желтый и светло-серый пигмент. Температурный оптимум 30—32 °С.
• Антигенные свойства. Ацинетобактер имеет капсульный К-антиген, устойчивый к нагреванию, и соматический О-антиген, вступающий в межвидовые перекрестные реакции агглютинации.
• Факторы патогенности: белки-адгезины; пили; экзотоксин – липополисахарид клеточной стенки; эндотоксин, вызывающий гибель и разрушение лейкоцитов; ферменты: фосфолипаза, ДНК-аза, сериновая протеаза, аминопептидаза, уреаза и кислая фосфатаза. Капсула подавляет эффективность фагоцитарных реакций и облегчает адгезию к эпителию, а способность к секреции бактериоцинов обеспечивает колонизацию.
• Резистентность. Ацинетобактерии устойчивы к детергентам, высушиванию и обезвоживанию. Они чувствительны к кипячению и большинству хлорсодержащих дезинфицирующих средств.

Эпидемиология

Ацинетобактерии охотно заселяют любые биотопы с минимально подходящими для них условиями и контаминируют самые разнообразные объекты. Штаммы бактерий обнаруживают во всех образцах почвы и воды, на коже и слизистых оболочках верхних дыхательных путей здоровых людей.

Бактерии рода Acinetobacter выделяют также из пастеризованного молока, замороженных продуктов, воздуха стационаров и смывов с различного медицинского оборудования. Они обладают низкой вирулентностью и являются нормальными обитателями организма человека. Появление микробов в большом количестве на коже, в мокроте или моче указывает не на развитие инфекционного процесса, а на колонизацию или контаминацию.

Источником и резервуаром инфекции являются инфицированные и больные люди, а также контаминированные предметы. Распространение бактерий осуществляется воздушно-капельным, контактно-бытовым, гематогенным путями.

Факторы, предрасполагающие к развитию инфекции:

1. Экстренная госпитализация,
2. Тяжелые сопутствующие заболевания — гематологические, онкологические, эндокринные,
3. Длительная ИВЛ,
4. Ингаляционное введение препаратов,
5. Инвазивные медицинские манипуляции — введение катетеров и зондов, трахеостомия,
6. Недоношенные и новорожденные дети в первую неделю жизни,
7. Лечение цитостатиками или гормонами,
8. Перенесенные операции и трансплантации,
9. Долгое стационарное лечение,
10. Мужской пол и пожилой возраст.

Для ацинетобактерной инфекции характерна сезонность вспышек в летний сезон, что связано с увеличением колонизации кожи микробами за счет потливости.

A. baumannii – микроб, обитающий преимущественно в водных объектах: искусственных и естественных водоемах. На сухой поверхности бациллы сохраняют свою жизнеспособность в течение месяца. В лечебно-профилактических учреждениях ацинетобактер колонизирует растворы многоразового использования.

Acinetobacter spp. вызывают назокомиальные инфекции у истощенных, физически ослабленных или умственно отсталых больных. Микробы обладают тропностью к эпителию респираторного и урогенитального трактов, ликвору, крови, перитонеальной жидкости. У иммуноскомпрометированных больных обычно развиваются пневмонии, бактериемия, септицемия, менингит, эндокардит, абсцессы мозга и легких, эмпиема плевры, медиастенит, перитонит.

В стационарных условиях A. baumannii колонизирует:

• Постельные принадлежности, белье, предметы мебели, водопроводные краны,
• Медицинскую аппаратуру — ИВЛ, инфузоматы, тонометры, термометры, системы переливания крови, катетеры,
• Перчатки, маски, халаты и прочие принадлежности медперсонала,
• Разнообразные растворы,
• Материалы для медицинских манипуляций — гидротерапии, операций, катетеризации, трахеостомии, люмбальной пункции.

Симптоматика

Ацинетобактерии – условно-патогенный микроорганизм, вызывающий инфекционный процесс только при снижении иммунной защиты.

Acinetobacter вызывает:

1. Воспаление органов дыхания — придаточных пазух носа, трахеи и бронхов, легких,
2. Инфицирование крови — бактериемию, септицемию,
3. Патологию урогенитального тракта — цистит, уретрит,
4. Поражение кожи и мягких тканей,
5. Болезни ЦНС — воспаление мозговых оболочек и абсцессы мозга,
6. Патологию внутрибрюшного пространства – абсцессы, перитонит,
7. Заболевания костей и суставов – остеомиелит, артрит,
8. Поражение глаз – неблагоприятно протекающие эндофтальмиты и кератиты.

A. calcoaceticus — возбудитель воспалительных процессов в легочной ткани, урогенитальном тракте, крови. A. junii вызывает у больных бактериемию и сепсис, гнойное воспаление подкожно-жировой клетчатки. A. lwoffii и A. pittii — возбудители гастрита и колита, а A. haemolyticus — кровавой диареи.

Инфекции кровотока, вызванные A. baumannii протекают в форме бактериемии или сепсиса. Входными воротами являются внутрисосудистые катетеры. Микробы могут проникать в кровь из имеющихся очагов – мочевыводящих путей, инфицированных мягких тканей, ожоговых поверхностей, органов брюшной полости и ЦНС. Молниеносная бактериемия проявляется выраженной лихорадкой, сосудистым коллапсом, петехиями, массивными подкожными кровоизлияниями. При отсутствии эффективной терапии у 30% пациентов развивается инфекционно-токсический шок.

При инфицировании дыхательных путей развиваются нозокомиальные пневмонии, которые характеризуются одновременным поражением нескольких сегментов, формированием полостей, плевральным выпотом, образованием бронхоплевральной фистулы. У больных на фоне тяжелой интоксикации появляется удушающий кашель с гнойной мокротой, одышка, дыхание становится шумным с влажными хрипами. Ацинетобактерная пневмония имеет тяжелое течение и с трудом поддается лечению. Нередко она заканчивается смертью больных.

A. baumannii – значимый патоген, инфицирующий ожоговые поверхности и послеоперационные раны. Инфекции кожи и мягких тканей часто осложняются бактериемией. Этот микроб является возбудителем назокомиального менингита и абсцедирования мозгового вещества. У больных возникают характерные признаки: интоксикация, очаговая симптоматика, менингеальные знаки. На коже появляется петехиальная сыпь, в ликворе — плейоцитоз, увеличение уровня белка и молочной кислоты, снижение глюкозы.

Ацинетобактерии в более редких случаях вызывают:

• Перитонит у лиц на диализе;
• Инфицирование мочевыводящих путей при катетеризации мочевого пузыря и нефролитиазе;
• Воспаление желчевыводящих путей после их дренирования;
• Остеомиелиты и артриты, обусловленный травматическим повреждением или установкой имплантатов;
• Поражения глаз, обусловленные инфицирование контактных линз.

Диагностика

Основным диагностическим методом ацинетобактерной инфекции является бактериологический. Он заключается в правильном заборе материала, быстрой его доставке в лабораторию, идентификации выделенного возбудителя, определении его этиологической значимости и чувствительности к антибактериальным средствам.

Материал отбирают до начала противомикробной терапии непосредственно из очага инфекции с соблюдением правил асептики, предупреждающих его контаминацию посторонней микрофлорой. Отбор осуществляют стерильным ватным тампоном, который помещают в специальные транспортные среды. Жидкий биоматериал помещают в стерильные и плотно закрывающиеся контейнеры. Пробы доставляют в лабораторию не позднее 1,5–2 ч от момента отбора.

Материал засевают на жидкие и плотные питательные среды, инкубируют в термостате и учитывают результаты. На плотных средах образуются гладкие, непрозрачные, блестящие, мелкие колонии. На КА через 48 ч формируются выпуклые серовато-белые колонии, иногда окруженные зоной гемолиза. Микроскопическое исследование заключается в изучении окрашенного препарата под световым микроскопом. В мазках из нативного материала доминируют кокки и коккобациллы, а в мазках из культур — палочковидные формы. Ацинетобактерии относятся к грамотрицательным микробам. После выделения чистой культуры проводят идентификацию возбудителя по биохимическим свойствам. Ацинетобактер не ферментирует лактозу и окисляет глюкозу до кислоты.

Обнаружение ацинетобактерий в мокроте в количестве 106 КОЕ/мл – диагностически значимый критерий. В бронхиальном смыве это количество составляет 104 КОЕ/мл, а в моче 105 КОЕ/мл.

Лечение

Лечение ацинетобактерной инфекций — серьезная проблема, актуальность которой растет с каждым днем. Это связано с увеличением частоты встречаемости микробов, повышением их резистентности к лекарствам и снижением эффективности проводимой терапии.

Этиотропное противомикробное лечение заключается в применении следующих препаратов:

1. «Имипенема» или «Меропенема»,
2. «Амикацина»,
3. «Ципрофлоксацина»,
4. «Левофлоксацина»,
5. «Ампициллин/сульбактама»,
6. «Цефоперазон/сульбактама»,
7. «Полимиксина»,
8. «Тетрациклина»,
9. «Рифампицина»,
10. «Тайгециклина».

При необходимости используют комбинации:

• «Цефоперазон/сульбактам» и «Амикацин»,
• «Имипенем» и «Амикацин».

Выбор антибиотика основывается на результатах антибиотикограммы.

При локализованных абсцессах, вызванных этими микроорганизмами, необходимо применять хирургическое дренирование.

Acinetobacter spp. – достаточно проблематичный возбудитель тяжелых состояний и заболеваний, встречающихся в пульмонологической и терапевтической практике. Бактерии вызывают нозокомиальную пневмонию и муковисцидоз, а также целые ряд внебольничных патологий. Эти микроорганизмы обладают природной устойчивостью и приобретенной резистентностью. Большинство штаммов имеют мультирезистентность — устойчивость к основным группам антибиотиков. Члены научного медицинского общества ведут активное наблюдение за состоянием чувствительности таких микробов, создают формуляры и стандарты применения противомикробных средств.

Профилактические мероприятия

Специфическая профилактика ацинетобактерной инфекции в настоящее время не разработана. Неспецифические профилактические мероприятия имеют большое значение, поскольку микроорганизмы имеют высокую резистентность к антибиотикам. Они быстро вырабатывают новые механизмы устойчивости.

В основе профилактических мероприятий госпитальной инфекции лежат принципы и нормы инфекционного контроля.

Мероприятия, предупреждающие инфицирование ацинетобактером :

1. Проведение дезинфекционных и антисептических процедур в медучреждениях,
2. Исключение контактов с больными людьми,
3. Использование средств индивидуальной защиты в местах массового скопления людей в эпидемически опасный период,
4. Соблюдение индивидуальных гигиенических норм медперсоналом,
5. Рациональное назначение антибиотиков с учетом данных антибиотикограммы,
6. Своевременная санация очагов хронической инфекции – лечение кариеса, тонзиллита, синуситов,
7. Укрепление иммунитета – закаливание, питание растительной и молочнокислой пищей, занятия спортом, оптимальный режим труда и отдыха, полноценный сон, прогулки на свежем воздухе,
8. Поддержание чистоты тела и жилища, регулярное проветривание комнат, влажная уборка в общественных помещениях с хлорсодержащими дезинфектантами,
9. Плановое прохождение врачебных осмотров,
10. Прием витаминно-минеральных комплексов в весенний и осенний периоды.

Acinetobacter — род микроорганизмов, вызывающих преимущественно внутрибольничную инфекцию и поражающих тяжелобольных пациентов. Эти условно-патогенные микробы являются нормальными обитателями различных локусов человеческого организма. При определенных условиях они активно размножаются и вызывают заболевания внутренних органов и систем, которые требуют проведения специфического противомикробного лечения. Прогноз и исход ацинетобактериальной инфекции зависят от патогенности штамма, активности иммунной системы макроорганизма, своевременности и грамотности назначенного лечения.

Видео: ацинетобактер в программе “Жить здорово!”

Мнения, советы и обсуждение:

Катетерная бактериемия и Acinetobacter lwoffii с множественной лекарственной устойчивостью — Том 13, номер 2 — февраль 2007 г. — Журнал Emerging Infectious Diseases

Редактору: Acinetobacter видов повсеместно распространены в окружающей среде. В последнее время появились некоторые виды, в частности A . baumannii , стали важными внутрибольничными патогенами из-за их стойкости в больничной среде и широкой структуры устойчивости к противомикробным препаратам ( 1 , 2 ).Они часто связаны с клиническими заболеваниями, включая бактериемию, пневмонию, менингит, перитонит, эндокардит, а также инфекции мочевыводящих путей и кожи ( 3 ). Эти состояния чаще встречаются у пациентов с ослабленным иммунитетом, у пациентов, поступающих в отделения интенсивной терапии, у тех, у кого есть внутривенные катетеры, и у тех, кто получает искусственную вентиляцию легких ( 4 , 5 ).

Роль A . baumannii при внутрибольничных инфекциях было зарегистрировано ( 2 ), но клиническое действие других видов Acinetobacter не исследовалось. А . lwoffii (ранее A . calcoaceticus var. lwoffii ) является комменсальным организмом кожи, ротоглотки и промежности, проявляющим тропизм к слизистой оболочке мочевыводящих путей ( 6 ). Несколько корпусов А . Сообщалось о lwoffii бактериемии ( 3 , 5 — 7 ). Мы сообщаем о 4-летнем (2002–2005) ретроспективном исследовании 10 пациентов с A . lwoffii бактериемия поступила в клиническую больницу на 600 коек в центральной Италии.

У всех 10 пациентов был иммунодефицит; 8 использовали внутрисосудистый катетер (периферический или центральный), а 2 использовали мочевой катетер. Культуры крови пациентов анализировали с помощью системы BacT / ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Франция). Изоляты были идентифицированы как A . lwoffii с использованием системы Vitek 2 и системы API 20NE (обе от компании bioMérieux).

Восприимчивость к 10 A . lwoffii изолятов 18 противомикробных препаратов были определены методом микробульона в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI, ранее NCCLS) ( 8 ).Испытываемыми препаратами были амикацин, ампициллин-сульбактам, азтреонам, цефепим, цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон, ципрофлоксацин, гентамицин, имипенем, левофлоксацин, меропенем, офлоксацин, пиперациллин-тетрациллин-тетрациллин, от терацилпроциллина до пиперациллина, пиперациллин-тетрациклоприл. МИК была определена как самая низкая концентрация лекарственного средства, которая предотвращала видимый рост бактерий. Критерии интерпретации для каждого протестированного препарата были такими, как в рекомендациях CLSI ( 8 ). А . lwoffii , устойчивые к> 4 классам препаратов, были определены как изоляты с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).

А . lwoffii изолятов были генотипированы с помощью гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) для определения их эпидемиологического родства. Хромосомную ДНК расщепляли с помощью Sma I ( 9 ) и анализировали с помощью аппарата CHEF DR II (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Паттерны PFGE были классифицированы как идентичные, похожие (отличались на 1–3 полосы) или разные (отличались более чем на 4 полосы) ( 10 ).

Среди 10 A . lwoffii изолятов, 6 были чувствительны ко всем лекарствам, кроме цефалоспоринов (цефепим, цефотаксим, цефтазидим и цефтриаксон) и азтреонама.Остальные 4 изолята были МЛУ: 3 были чувствительны только к имипенему (МПК 1–4 мкг / мл), меропенему (МПК 1–2 мкг / мл) и амикацину (МПК 2–4 мкг / мл). Четвертый штамм МЛУ был чувствителен к имипенему (МИК 2 мкг / мл), меропенему (МИК 2 мкг / мл), амикацину (МИК 4 мкг / мл) и ципрофлоксацину (МИК 1 мкг / мл). Выявлено семь профилей устойчивости к противомикробным препаратам (таблица).

Анализ макроограничения A . Изоляты lwoffii идентифицировали 8 различных типов PFGE. Два штамма МЛУ (штаммы 2 и 3 в таблице), которые были изолированы от пациентов в разных палатах, и 2 штамма без МЛУ (штаммы 8 и 9), которые были выделены от пациентов в одном отделении, имели схожие паттерны PFGE и идентичные фенотипы устойчивости.Эти данные свидетельствуют о внутрибольничной передаче. Девять из 10 пациентов выжили после удаления катетера или лечения соответствующими противомикробными препаратами. Эти результаты подтверждают, что катетер-связанный А . lwoffii бактериемия у хозяев с ослабленным иммунитетом связана с низким риском смерти ( 4 , 6 ).

Это исследование идентифицировало A . lwoffii Штаммы МЛУ, вызывающие бактериемию у катетеризованных пациентов с ослабленным иммунитетом.Наши данные согласуются с данными из предыдущих отчетов о роли катетеров как основного источника A . lwoffii инфекций.

верхний

Принадлежность к авторам: * Ospedale Santa Maria Goretti, Latina, Italy; † Istituto di Scienze dell’Alimentazione, Авеллино, Италия; ‡ Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, Анкона, Италия;

Выводы, выводы и мнения, высказанные авторами, пишущими для этого журнала, не обязательно отражают официальную позицию U.S. Министерство здравоохранения и социальных служб, Служба общественного здравоохранения, Центры по контролю и профилактике заболеваний или аффилированные с авторами учреждения. Торговые наименования используются только для идентификации и не подразумевают одобрения какой-либо из вышеперечисленных групп.

Границы | Идентификация лама-гламы как резервуара для Acinetobacter lwoffii

Введение

Семейство южноамериканских верблюдовых (SACs) включает четыре вида: ламы ( Lama glama ), альпака ( Lama pacos ), гуанако ( Lama guanicoe ) и викунью ( Vicugna vicugna ).Этих животных разводят ради мяса и меха, а также в качестве домашних и терапевтических животных, что делает их все более востребованными во всем мире. Таким образом, очевидно, что их санитарный статус следует тщательно изучить, включая оценку ПАК как потенциальных переносчиков болезней другим животным или даже людям.

Принимая во внимание тесный контакт, который могут иметь SAC с людьми, и принимая во внимание, что они обычно разводятся вместе с крупным рогатым скотом, лошадьми, овцами и свиньями, необходимо контролировать болезни, передаваемые через жидкости и фекалии.Сообщалось о появлении респираторно-условно-патогенных микроорганизмов у южноамериканских верблюдов (SAC), и поэтому их следует контролировать, например, с помощью серологических тестов. Однако многие исследования показали, что использование серологических тестов на верблюдах заслуживает дальнейшего анализа. Например, глобальное исследование инфекционных заболеваний, проведенное в семействе Camelidae в течение 80-х годов, показало, что наиболее частой оппортунистической бактерией, связанной с респираторными заболеваниями, была Pasteurella multocida (Fassi-Fehri, 1987).В этом исследовании авторы обнаружили 47% носителей и 80% серопозитивных животных для P. multocida среди верблюдов Старого Света (верблюдов и дромадеров), что указывает на отсутствие корреляции между прямым анализом и серологией.

В течение 2008 г. МЭБ опубликовало отчет «Болезни верблюдовых». В этом отчете была предложена классификация, сгруппировавшая значительные заболевания (вирусные, бактериальные или паразитарные) у SAC и верблюдовых в три категории в зависимости от их распространенности и знания об их патогенности.В этом списке Pasteurella был единственным бактериальным агентом, обнаруженным в SAC, а также у крупного рогатого скота. Пастереллез был отнесен к группе III (легкое заболевание), восприимчивость к которой неизвестна. Кроме того, не было доступно серологических тестов для выявления этого патогена (OIE, 2008). Хотя в отчете МЭБ за 2010 год Pasteurella ассоциировался с геморрагической септицемией, некоторые авторы сообщили о вспышке P. multocida и Mannheimia haemolytica в Перу, которая привела к острой пневмонии (Rosadio et al., 2011; Гусман и др., 2013). Эти отчеты содержат существенную информацию, подтверждающую, что пастерелез может быть гораздо более серьезным заболеванием, чем предполагают отчеты МЭБ.

Принимая во внимание контекст, настоящее исследование было направлено на анализ возникновения носоглоточной колонизации L. glama респираторными бактериями, принадлежащими к жанрам Acinetobacter, Pasteurella и Mannheimia , а также для оценки значения серологии для клинических исследований. диагноз.Оценка колонизации проводилась путем анализа материала, взятого из носоглоточных мазков. Затем колонии идентифицировали с помощью MALDI / TOF-MS. Серологический анализ проводили как с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), так и вестерн-блоттинга с использованием белкового экстракта, полученного из культивированных изолятов. Анализы ELISA были разработаны для анализа существования корреляции между присутствием специфических антител к целому белковому экстракту и прямым культивированием мазков из носа, а анализы вестерн-блоттинга были выполнены для оценки того, существует ли корреляция только с некоторыми белками из экстракта.Чтобы оценить его эффективность и полезность, использованные здесь серологические тесты были затем оценены с использованием большего набора образцов, полученных в нескольких регионах Аргентины.

Материалы и методы

Животные и образцы

Исследование проводилось на 36 здоровых ламах ( L. glama ) из Ла-Хояда, Санта-Мария, Катамарка, Аргентина, в возрасте от 1 до 3 лет. Животные содержались в стаде из более чем 200 особей, паслись вместе с КРС и овцами.Ни во время, ни после проведения протокола ранее не сообщалось о респираторных заболеваниях или неожиданных смертельных исходах для этого стада. Образцы из носоглотки были взяты — по одному от каждого животного — в стерильные транспортные тампоны со средой Amies (Copan Italia, Брешиа, Италия) и хранили при 4 ° C до микробиологического анализа. Все образцы крови были взяты путем пункции бедренной вены. Образцам крови давали возможность свернуться при комнатной температуре, и сыворотки отделяли центрифугированием, разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C до использования.

Дополнительный серологический анализ был проведен с использованием образцов из ранее созданного банка сывороток, содержащих коллекцию образцов сыворотки L. glama из различных регионов Аргентины (провинции Буэнос-Айрес, Сан-Луис, Чубут, Жужуй и Энтре-Риос). . Банк также включал 14 образцов сыворотки из L. guanicoe . Все эти образцы были собраны путем пункции яремной вены или бедренной артерии в ходе долгосрочной кампании, проводившейся с 2004 по 2014 год. Образцы сыворотки хранили при -20 ° C до использования и анализировали с помощью серологических анализов, описанных в соответствующем разделе этой работы. .

Микробиологическая культура и анализ

образцов из носоглотки помещали на мозг-сердечный агар (BHA) и кровяной агар (лаборатории Britania, Буэнос-Айрес, Аргентина). Колонии были отобраны на основании их морфологических характеристик, выбрав те, которые показали высокое сходство с колониями Acinetobacter / Pasteurella / Mannheimia (маленькие, прозрачные и четко очерченные колонии). Все изоляты субкультивировали из исходных культур в 5% -ном агаре с кроличьей кровью и инкубировали в аэробных условиях при 37 ° C в течение 24 часов.Вкратце, биохимические характеристики каждой колонии оценивали по продукции индола, каталазной реакции, окрашиванию по Граму, чувствительности к пенициллину (10 МЕ / мл) и стрептомицину (10 мкг / мл) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк, США). и их развитие в хромогенном агаре (Chromobrit IU, Britania Laboratories, Буэнос-Айрес, Аргентина), сравнивая их с известными положительными культурами (идентификация фенотипического профиля и секвенирование 16S рРНК, Macrogen Inc., Корея). Биохимические реакции наблюдались после инокуляции 1-2 колоний чистой культуры.

Колонии, соответствующие биохимическим характеристикам Acinetobacter / Pasteurella / Mannheimia , были отобраны для дальнейшей идентификации. Колонии отбирали, если они были положительными по следующим критериям: реакция на индол, реакция на каталазу, окрашивание по Граму (отрицательный результат , бациллококки ), чувствительность к антибиотикам и положительный результат на развитие в хромогенном агаре. Образец, известный как P. multocida , был обработан в качестве положительного контроля, а изолят, полученный из верхушки легкого, был использован в качестве отрицательного контроля, поскольку он демонстрировал рост в форме коричневых колоний (следовательно, несовместимые без анализируемых микроорганизмов).

Идентификация микроорганизмов проводилась с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации — времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI / TOF-MS). Вкратце, масс-спектры получали с использованием спектрометра MALDI-TOF MS в линейном положительном режиме (Microflex, Bruker Daltonics, Массачусетс, США). Стандарт бактериального теста (Bruker Daltonics, Массачусетс, США) использовали для калибровки прибора. Идентификацию бактерий проводили с использованием соответствующей библиотеки и программного обеспечения (MALDI Biotyper library 3.0 и MALDI Biotyper версии 3.1, Bruker Daltonics, Массачусетс, США). Как указано производителем и сообщается в другом месте (Alatoom et al., 2012), пороговые значения для идентификации были следующими: баллы от 2,00 до 3,00, считающиеся «идентификацией с высокой степенью достоверности»; оценка от 1,70 до 1,99, что считается «идентификацией с низкой достоверностью»; и оценка ниже 1,7 считается «ненадежной».

Препарат антигена для иммуноанализа

Антигены для иммуноанализов получали из изолированных и идентифицированных колоний.Соответствующие бактерии выращивали в триптон-соевом бульоне (TBS) при 37 ° C при непрерывном встряхивании. Затем культуральную среду центрифугировали при 4000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C. Затем осадок трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), и бактериальный лизис достигали путем суспендирования осадка в 10 мл холодного PBS и выполнения трех циклов замораживания в жидком азоте с последующим оттаиванием. Затем бактериальные клетки обрабатывали ультразвуком за 3 импульса по 15 с (Elma Transsonic 540 Sonicator, Singen, Германия), центрифугировали при 10000 об / мин в течение 30 минут при 4 ° C и супернатант отделяли для дальнейшего использования.Общее содержание белка оценивали методом BCA (Pierce Biotechnology, Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк, США), лизат разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° C до использования в качестве антигена для серологических анализов.

Обнаружение специфических антител с помощью иммуноферментного анализа (ELISA)

Специфические антитела в отдельных образцах сыворотки детектировали непрямым ИФА с использованием препарата антигена, описанного выше, в качестве покрывающего антигена. Вкратце, микротитрационные планшеты из полистирола (Nunc MaxiSorp, Rochester, New York) покрывали 1 мкг / лунку белкового экстракта в течение 1 ч при 37 ° C.После этого планшеты промывали PBS, содержащим 0,05% Tween 20 (PBS-T), а затем блокировали 300 мкл 3% обезжиренного сухого молока в PBS (PBS-M) в течение ночи при 4 ° C. Затем планшеты трижды промывали PBS-T и инкубировали с каждой сывороткой ламы, разведенной 1: 100 в PBS-M, в течение 1 ч при 37 ° C. После трехкратной промывки связанные антитела выявляли путем инкубации со 100 мкл меченной HRP козьей сыворотки против ламы (Bethyl, Montgomery, USA), разведенной в соотношении 1: 7000 в PBS-M, в течение 1 часа при 37 ° C. Лунки промывали, и реакцию проявляли 100 мкл субстрата-хромогена (3,3 ‘, 5,5’ тетраметилбензидин) (Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк, США).Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4 N H ₂ SO ₄ . Значения оптической плотности (O.D.) при 450 нм определяли в считывающем устройстве для микропланшетов (Original Multiskan Ex, Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк, США). Учитывая, что отсутствуют коммерческие и контрольные сыворотки собственного производства, анализ данных проводился, как указано в разделе «Статистический анализ».

Обнаружение специфических антител вестерн-блоттингом

Было выполнено

Вестерн-блоттинга, чтобы оценить, существует ли корреляция между картиной распознавания антигена и прямым культивированием мазков из носа.Образцы сыворотки были выбраны среди тех, которые обеспечивали высокий ОП. значения с помощью ELISA — чтобы гарантировать, что отсутствие сигнала не было связано с отсутствием специфических антител — отбирая некоторые из них, которые дали положительные посевы, а некоторые — отрицательные. Вкратце, белки разделяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле (SDS-PAGE), загружая до 30 мкг на дорожку. Затем белки переносили на мембрану из PVDF (PVDF, Plus Transfer мембрана, 0,22 микрон GE Water & Process Technologies, Little Chalfont, UK) с использованием устройства иммуноблоттинга (Bio Rad, Калифорния, США).Затем мембраны блокировали 3% БСА в PBS-T (PBS-T-B) в течение ночи при 4 ° C. Белки определяли с использованием сыворотки ламы, разведенной 1/100 в PBS-T-B в течение 1 ч при комнатной температуре. Специфические антитела выявляли с использованием меченного HRP конъюгата козьих антител против ламы (H + L) при разведении 1: 7000 в течение 1 ч при комнатной температуре при непрерывном встряхивании. После каждой стадии инкубации мембраны дважды промывали PBS-T. Фосфат и твин удаляли на заключительном этапе промывкой мембран солевым раствором с трис-буфером (TBS).Затем мембраны экспонировали на коммерческом субстрате с усиленной хемилюминесценцией (Pierce ECL WB Substrate, Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк, США) и раскрывали на фотопленке (Kodak, Рочестер, Нью-Йорк, США).

Статистический анализ

Значения оптической плотности

ELISA анализировали путем вычисления среднего, медианы, стандартного отклонения ( S.D .) и распределения с помощью теста нормальности Шапиро-Уилкса. Животные были классифицированы как положительные или отрицательные в соответствии с микробиологическим статусом каждого животного, а также различались в зависимости от региона происхождения.

Отсутствие референсных значений потребовало разработки особого подхода к определению положительной серологии. Для этого в каждой группе было обнаружено наличие выбросов с помощью «надежного теста». Было зарегистрировано количество выбросов, а также изменение распределения каждой группы до и после исключения выбросов. Процесс повторяли до тех пор, пока ни один образец не мог быть удален, что давало либо нормальный, либо ненормальный набор значений. Исключенные выбросы изначально считались положительными серологическим методом, а их О.Затем значения D. сравнивали с теми, которые не были исключены (считались отрицательными для серологического теста), используя тест Манна-Уитни U . Дальнейшее сравнение значений, полученных от животных, принадлежащих к разным регионам, было проведено с использованием теста Краскела-Уоллиса (непараметрический дисперсионный анализ) с последующим тестом множественных сравнений Данна.

Результаты

Микробиологический анализ и идентификация

Бактериальные мазки были успешно культивированы от 36 животных, и были выполнены выделения.Однако 13 изолятов не имели морфологической совместимости с респираторными бактериями и поэтому были отброшены. Два других изолята привели к очень сложной смеси бактерий и были сочтены непригодными для нашего исследования. Оставшийся 21 изолят, а также три дополнительных изолята, полученных из паренхимы легких, верхушки и основания, полученные от умерщвленного животного (три изолята считались отрицательными для Pasteurella / Mannheimia из-за морфологии колонии, но включены в качестве внутреннего отрицательного контроля), были подвергнуты анализу. для дальнейшей биохимической идентификации (таблица 1).Из них только 14 колоний имели биохимические свойства, совместимые с Acinetobacter / Pasteurella / Mannheimia . Хотя один из 14 оказался Arthrobacter oxydans (с оценкой 2,11) и 6 из 14 имели «ненадежные» баллы для Acinetobacter lwoffii , оставшиеся 7 были подтверждены как A. lwoffii с надежная оценка (4 из них с оценкой от 1,70 до 1,99 и 3 из них с оценкой от 2,00 до 3,00), как показано в таблице 1.Взятые вместе, эти результаты показывают, что по крайней мере 19,4% животных (7 из 36) носили A. lwoffii , что было определено с помощью надежной оценки с помощью метода MALDI / TOF-MS. Это значение можно использовать в качестве оценки степени колонизации A. lwoffii в стаде.

Таблица 1. Микробиологический анализ изолятов и идентификация бактерий с помощью MALDI / TOF-MS .

Обнаружение специфических антител с помощью ELISA

Согласно микробиологическому анализу, положительные и отрицательные популяции были определены на наличие Acinetobacter spp.Чтобы проверить, различаются ли эти популяции по уровню специфических антител, использовали ELISA, как описано выше. Нормальность данных оценивалась с помощью теста Шапиро-Уилка, в результате чего были получены два ненормальных распределения ( P <0,1; рис. 1A). Таким образом, разница была изучена с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, в результате чего значение P составило 0,0928 (односторонний критерий), что было сочтено несущественным. Был проведен тест на наличие выбросов, и выбросы были обнаружены в обеих популяциях (таблица 2).Исключение этих значений в конечном итоге привело к нормальному распределению для обеих популяций, хотя непарный тест Стьюдента t по-прежнему показал, что разница не была значимой (двустороннее значение P было 0,1692; Рисунок 1B).

Рисунок 1. Серологическое определение специфических антител против Acinetobacter lwoffii . (A) На рисунке показаны оптические плотности ELISA, соответствующие каждому образцу сыворотки при тестировании против препарата антигена Acinetobacter lwoffii .Животные были сгруппированы по результатам прямого культивирования мазков из носа. Выбросы можно определить простым наблюдением. Панель (B) показывает те же данные после отбрасывания выбросов; можно наблюдать нормальное распределение.

Таблица 2. Обнаружение выбросов с помощью робастного теста .

Обнаружение специфических антител вестерн-блоттингом

Было проведено

Вестерн-блоттинга образцов сыворотки, которые дали более высокие значения с помощью ELISA, некоторые из них были положительными для микробиологического анализа, а некоторые — отрицательными.На рисунке 2 показан образец распознавания антигена для трех образцов сыворотки с отрицательным посевом и 5 образцов сыворотки с положительным посевом. На рисунке показано, что почти все образцы сыворотки распознали две полосы примерно 30 и 45 кДа и набор более мелких молекул примерно 21 кДа. Картина распознавания антигена существенно не различалась между образцами сыворотки с отрицательной и положительной культурой.

Рис. 2. Вестерн-блоттинг образцов сыворотки ламы . На рисунке показан вестерн-блот-анализ образцов сыворотки от животных с отрицательной и положительной культурой (как указано в таблице ниже).На рисунке также показана относительная интенсивность сигнала ELISA в условных единицах.

Серологическое исследование животных из других регионов Аргентины

Чтобы оценить, является ли высокая распространенность колонизации Acinetobacter и отсутствие различий в серологических тестах между колонизированными и неколонизированными животными исключительными для провинции Катамарка, мы изучили распространенность реактивных антител против A. lwoffii в образцы сыворотки крови из других провинций Аргентины.Результаты (обобщенные в таблице 3) показали различные уровни антител в различных проанализированных областях. Когда все образцы рассматривались как единая группа, независимо от прямого культурального анализа, О.Д. измерения каждой области вели себя как набор нормально распределенных значений. Тем не менее, непараметрический тест Краскала Уоллиса был проведен из-за различного количества значений в каждой группе, и результат показал, что среднее значение ОП. значения различались между регионами. Кроме того, с помощью пост-теста множественных сравнений Данна было обнаружено, что регион Буэнос-Айреса имеет значительно более высокое среднее значение по сравнению с другими регионами, за исключением Entre Ríos.Этот тест также показал, что регион Катамарка отличается от региона Энтре-Риос.

Таблица 3. Сравнение O.D. значения из разных регионов Аргентины .

Был проведен анализ выбросов с применением процедуры итеративным способом с пересчетом параметров до тех пор, пока выбросы не могли быть обнаружены. Эта стратегия привела к отсутствию выбросов, обнаруженных после двух итераций робастного теста (таблица 4).

Таблица 4.Анализ выбросов ELISA для каждого региона .

Вестерн-блоттинг был проведен с образцами, принадлежащими к разным регионам. Как показано на рисунке 3, характер распознавания антигена различается в зависимости от региона. За исключением Catamarca, полоса 30 кДа не появлялась ни в одной области, а дополнительный белок был распознан в одном образце с молекулярной массой ниже 21 кДа (образец из Джуджу). Тем не менее, ни к положительным, ни к отрицательным образцам нельзя было отнести какой-либо конкретный образец.

Рис. 3. Вестерн-блоттинг сывороток из разных регионов . Дорожки: 1, Буэнос-Айрес; 2, Энтре-Риос; 3, Жужуй; 4, Чубут; 5, Сан-Луис; 6, Катамарка (та же полоса, что и на рис. 2).

Обсуждение

Бактерии, принадлежащие к роду Acinetobacter , представляют собой короткие плеоморфные грамотрицательные бациллококки . Методы гибридизации ДНК позволили описать 20 видов в пределах рода. Идентификация на уровне видов затруднена, главным образом, из-за высокой степени сходства между особями.Большинство видов в пределах рода Acinetobacter являются условно-патогенными микроорганизмами, особенно Acinetobacter baumannii , что является одной из основных проблем в инфектологии из-за высокой частоты полирезистентности к лекарствам и ее широкого распространения в окружающей среде. A. baumanii является причиной серьезных внутрибольничных инфекций, особенно в отделениях интенсивной терапии. Acinetobacter Инфекция может быть эндемической или эпидемической с серьезными вспышками, которые трудно ограничить.Для грамотрицательных бактерий необычно жить в окружающей среде после высыхания, но этот вид не только выживает, но и остается жизнеспособным для заражения. Литература указывает на то, что исследователи Аллен и Грин были первыми, кто сообщил о том, что воздушное распространение может быть способом передачи при вспышках (Leardini, 2010).

Заболеваемость Acinetobacter , отличными от A. baumanii , изучалась другими (Turton et al., 2010) и с замечательной глубиной и точностью Al Atrouni et al.(2016). Хотя большинство клинических изолятов были идентифицированы как A. baumannii (78%), авторы указали, что было обнаружено значительное количество других видов, особенно A. lwoffii (8,8%), A. ursingii (4%), genospecies 3 (1,7%) и A. johnsonii (1,7%), часто связанные с бактериемией. Эти виды были связаны с серьезными инфекциями и могут считаться новыми патогенами. Действительно, A. lwoffii представляет 61% изолятов Acinetobacter spp.кроме A. baumannii , и имеющаяся информация указывает на то, что эти изоляты сочетаются с клиническими симптомами сепсиса, бактериемии, гипертермии, менингита, постгеморрагической гидроцефалии, озноба, пневмонии, целлюлита, сыпи, офтальмии новорожденных, инфекции мочевыводящих путей, и абсцесс. Более того, некоторые авторы (Tega et al., 2007) сообщили о выделении штаммов A. lwoffii с множественной лекарственной устойчивостью в случаях катетерной бактериемии, а бактериемия была связана с гастроэнтеритом (Regalado et al., 2009).

На сегодняшний день, Acinetobacter не baumanii были зарегистрированы в окружающей среде, продуктах питания и животных. Согласно литературным данным (Al Atrouni et al., 2016), эти бактерии были изолированы от коров, лошадей, домашних животных, некоторых водных животных и даже от вшей, собранных в приютах для бездомных или у руководителей начальной школы. В настоящей работе мы впервые сообщаем о колонизации L. glama бактериями из жанра Acinetobacter .Причина инфекции остается неизвестной, но открытие актуально, учитывая, что эти микроорганизмы могут быть причиной инфекции среди крупного рогатого скота и даже людей.

Серологический опрос, проведенный здесь, показывает, что наличие специфических антител не имеет четкой корреляции с присутствием бактерий, учитывая, что статистические анализы приводят к 76,9% ложноотрицательных результатов (10 животных с отрицательным результатом по ИФА из 13 животных с положительной культурой) и 15,4% ложноположительных результатов (2 ELISA-положительных животных из 13 отрицательных по культуре животных).Кроме того, О. средние значения положительной и отрицательной групп существенно не различаются. Кроме того, вестерн-блоттинг выявил отсутствие последовательной картины распознавания антигена, что также было продемонстрировано, когда в исследование были включены животные из других регионов, отличных от Катамарки. Хотя это отсутствие корреляции может быть связано с неправильной классификацией животных, мы полагаем, что это может быть следствием низкой распространенности специфических антител у долгоживущих колонизированных животных или даже присутствия встречающихся в природе специфических антител у животных, в отсутствие Acinetobacter .

Чтобы оценить использование серологии для клинической диагностики в контексте респираторных патогенов SAC, некоторые предположения могут быть получены из O.D. значения величин. Присутствие выбросов может указывать на истинно положительную колонизацию (положительную при ELISA и прямом культивировании), хотя в Catamarca этому противоречило наличие высокого O.D. ELISA. значения, соответствующие культуроотрицательным животным. Тем не менее, можно сделать предположение, что эти животные могли быть неправильно классифицированы (из-за неадекватного отбора носоглоточных проб), и поэтому наличие выбросов ELISA все же может указывать на истинно колонизированных животных.Если бы это было так, любое ненормальное распределение О. значения могут указывать на присутствие колонизированных животных, особенно если выбросы могут быть обнаружены и после их устранения достигается нормальное распределение.

Наконец, животные, принадлежащие Буэнос-Айресу и Энтре-Риосу, имели более высокий О.Д. значения, возможно, указывающие на присутствие других антител, перекрестно реагирующих с Acinetobacter , или, что менее вероятно, на широкую колонизацию этим микроорганизмом.

Заключение

В данной работе заселение L.glama бактериями рода Acinetobacter продемонстрирована впервые. Об этих бактериях ранее сообщалось в окружающей среде, пище и животных, но никогда не было у верблюдов. Было продемонстрировано, что проведенные здесь серологические тесты бесполезны для прогнозирования колонизации, хотя можно сделать некоторые предположения относительно распределения O.D. ценности. Учитывая, что эти микроорганизмы могут быть причиной заражения крупного рогатого скота и даже людей, этот отчет способствует лучшему пониманию микробиоты, присутствующей у южноамериканских верблюдов.Хотя серология оказалась непригодной для клинической диагностики Acinetobacter у этих животных, использование мазков из носа привело к практическому и недорогому методу оценки идентичности бактерий, колонизирующих верхние дыхательные пути. Необходимо провести дальнейшие исследования для анализа происхождения перекрестно реагирующих антител.

Заявление об этике

Исследование проводилось под руководством Этического комитета Школы фармацевтики и биохимии Университета Буэнос-Айреса, Аргентина.Процедуры были одобрены владельцами животных в соответствии с письменным контрактом, в котором прямо указывалось, что ни одному из животных-участников не будет причинен вред, и что будет оказана соответствующая помощь, если какое-либо из них будет затронуто процедурами. Тем не менее ни одно животное не пострадало. Не были затронуты уязвимые группы населения.

Авторские взносы

Все авторы внесли свой вклад в работу во время планирования, проведения эксперимента и обсуждения результатов. ML выполнил большую часть экспериментов, а AF руководил проектом.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить семью Эскаланте из Санта-Мария, Катамарка, Карлоса Поплавского из Сан-Луиса и Пабло Ллавера из Буэнос-Айреса за предоставление нам животных для проведения представленных здесь экспериментов. Мы также хотели бы поблагодарить Dr.Гильермо Нуньесу за ценную переработку рукописи.

Список литературы

Алатум, А. А., Казанаве, К. Дж., Каннингем, С. А., Иде, С. М., и Патель, Р. (2012). Идентификация не дифтерийных Corynebacterium с использованием матричной лазерной десорбционной ионизации-времяпролетной масс-спектрометрии. J. Clin. Microbiol. 50, 160–163. DOI: 10.1128 / JCM.05889-11

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фасси-Фери, М.М. (1987). Les maladies des camelides [Болезни верблюдовых]. Rev. Sci. Technol. Выключенный. Int. Эпиз 6, 355–373.

Google Scholar

Лирдини, Н. А. (2010). «Acinetobacter», в Ветеринарная микробиология , под ред. Н. О. Станки (Буэнос-Айрес: Эдиториал Интермедика), 340–342.

МЭБ (2008). Отчет специальной группы по болезням верблюдовых. Париж.

Регаладо, Н. Г., Мартин, Г., и Энтони, С. Дж. (2009). Acinetobacter lwoffii : бактериемия, связанная с острым гастроэнтеритом. Travel Med. Заразить. Дис. 7, 316–317. DOI: 10.1016 / j.tmaid.2009.06.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Росадио, Р., Сирило, Э., Манчего, А., и Ривера, Х. (2011). Респираторно-синцитиальный вирус и вирус парагриппа 3 типа, сосуществующие с Pasteurella multocida и Mannheimia hemolytica при острой пневмонии неонатальных альпак. Маленький ром. Res. 97, 110–116. DOI: 10.1016 / j.smallrumres.2011.02.001

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тега, Л., Райета, К., Оттавиани, Д., Руссо, Г. Л., Бланко, Г., и Карратуро, А. (2007). Катетерная бактериемия и множественная лекарственная устойчивость A. lwoffii . Emerg. Заразить. Дис. 13, 355–356. DOI: 10.3201 / eid1302.060858

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Turton, J. F., Shah, J., Ozongwu, C., and Pike, R. (2010). Распространенность Acinetobacter видов, кроме A. baumannii среди клинических изолятов Acinetobacter : данные о новых видах. J. Clin. Microbiol. 48, 1445–1449. DOI: 10.1128 / JCM.02467-09

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Инфекция, вызванная Acinetobacter lwoffii с множественной лекарственной устойчивостью, у новорожденных в интенсивной терапии

Наронгсак Накван ^1,2 , Джераван Ваннаро ² , Наронгвит Накван ^3
1 Отделение интенсивной терапии новорожденных, ² Отделение педиатрии, ³ Центр медицинского образования, Хат Яй Госпиталь Яй, Сонгкхла, Таиланд

Цель: Описать клинические, бактериологические особенности и исход инфекции Acinetobacter lwoffii в популяции новорожденных.
Метод: Мы ретроспективно проанализировали медицинские карты четырех новорожденных с инфекцией A. lwoffii , поступивших в больницу Хат Яй с января 2005 года по декабрь 2009 года.
Результаты: Четыре случая (один в 2007 году и три в 2008) были идентифицированы как зараженные A. lwoffii . Из четырех случаев у трех было позднее начало инфекции (после 72 часов возраста), а в 1 — раннее начало (в течение первых 72 часов возраста). Во всех случаях были установлены пупочные катетеры, требовалась искусственная вентиляция легких с положительным давлением, и на момент постановки диагноза они лечились антибиотиками.Тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам семи изолятов (три в крови, три в мокроте и один в спинномозговой жидкости) было выполнено с использованием метода дисковой диффузии. Наиболее протестированные изоляты были чувствительны к нетилмицину, имипенему, цефоперазону / сульбактаму, в то время как большинство из них были одновременно устойчивы к амикацину, гентамицину, цефтазидиму, цефтриаксону, цефепиму, ципрофлоксацину и клиндамицину. Лечение инфекции A. lwoffii в четырех случаях варьировалось. Только один случай был успешно вылечен имипенемом, в то время как три случая умерли от тяжелой вентилятор-ассоциированной пневмонии и тяжелого сепсиса.
Заключение: Это исследование повышает осведомленность об инфекции A. lwoffii в популяции новорожденных, особенно у недоношенных детей с несколькими факторами риска нозокомиальной инфекции, включая центральные внутрисосудистые катетеры и длительную механическую вентиляцию легких.

Ключевые слова: Acinetobacter lwoffii , Инфекция Acinetobacter , новорожденный

Эта работа опубликована и лицензирована Dove Medical Press Limited.Полные условия этой лицензии доступны по адресу https://www.dovepress.com/terms.php и включают Некоммерческую лицензию Creative Commons Attribution (непортированная, v3.0).
Получая доступ к работе, вы тем самым принимаете Условия. Некоммерческое использование работы разрешено без какого-либо дополнительного разрешения Dove Medical Press Limited при условии надлежащей атрибуции работы. Для получения разрешения на коммерческое использование этой работы см. Параграфы 4.2 и 5 наших Условий.

Интерлейкин-6 важен для развития опосредованной Acinetobacter lwoffii защиты от астмы

Abstract

Предпосылки: Контакт с фермерскими бактериями в раннем возрасте, такими как Acinetobacter lwoffii , снижает риск последующей аллергии и / или развитие астмы.Интраназальное введение A. lwoffii вызывает у мышей местные и системные реакции врожденного иммунитета, о чем свидетельствует повышение уровней интерлейкина-6 (IL-6) в легких и сыворотке.

Цели и задачи: Мы предположили, что эти начальные реакции врожденного иммунитета модулируют развитие механизмов адаптивного иммунитета, способствующих снижению восприимчивости к астме и / или аллергии, и что IL-6 играет функциональную роль в этом процессе.

Методы: Для проверки этой гипотезы мыши BALB / c дикого типа или с нокаутом по IL-6 предварительно обрабатывали A.lwoffii подвергали индуцированной овальбумином (OVA) модели аллергического (Th3) воспаления дыхательных путей.

Результаты: Интересно, что эозинофилия легких, маркер аллергического воспаления дыхательных путей, была значительно сильнее у мышей с нокаутом IL-6. Кроме того, у мышей дикого типа, но не у мышей с нокаутом IL-6, предварительная обработка A. lwoffii приводила к значительно более слабому эозинофильному воспалению по сравнению с животными, не подвергавшимися предварительному воздействию этой бактерии.

Выводы: IL-6, центральный цитокин врожденного иммунитета, по-видимому, важен для общей способности организма модулировать свою адаптивную иммунную систему в неаллергическом (Th3) направлении.Кроме того, IL-6 играет особую роль в опосредовании развития защитных, противоаллергических механизмов, связанных с предшествующим воздействием A. lwoffii .

Сноски

Цитируйте эту статью как: European Respiratory Journal 2018 52: Suppl. 62, PA1108.

Это тезисы Международного конгресса ERS. Полнотекстовая версия недоступна. Дополнительные материалы, сопровождающие этот тезис, могут быть доступны на сайте www.ers-education.org (только для членов ERS).

• Авторские права © авторы 2018

Acinetobacter lwoffii

Acinetobacter lwoffii

Свидетельство описывает источник аннотации, например эксперимент, опубликованный в научной литературе, ортологичный белок, запись из другой базы данных и т. д.

Еще …

Пропустить заголовок

Вы используете версию браузера, которая может не отображать все функции этого веб-сайта.Пожалуйста, подумайте об обновлении вашего браузера.

Формат

Acinetobacter lwoffii Новый патоген в отделении интенсивной терапии новорожденных

Название: Acinetobacter lwoffii Новый патоген в отделении интенсивной терапии новорожденных

ОБЪЕМ: 15 ВЫДАЧА: 3

Автор (ы): Сима Миттал, Мадху Шарма, Апарна Ядав, Киран Бала и Ума Чаудхари

Место работы: Кафедра микробиологии, Pt.B.D.S. PGIMS Rohtak-124001, Харьяна, Индия.

Ключевые слова: Acinetobacter lwoffii , ICU, множественная лекарственная устойчивость, неонатальный сепсис.

Реферат: Предыстория: виды Acinetobacter повсеместно распространены в окружающей среде.
важный возбудитель нозоскомиальной инфекции, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом.
Acinetobacter lwoffii с множественной лекарственной устойчивостью становится патогеном у новорожденных.
сепсис.Цели и задача: это исследование было направлено на оценку клинического профиля и профиля антибиотиков.
Acinetobacter lwoffii. Материалы и методы: исследование проводилось на образцах крови.
от новорожденных, поступивших в отделение интенсивной терапии новорожденных в течение одного года с
С января по декабрь 2012 г., у которого развилась инфекция Acinetobacter. Диагностика изолятов
и тестирование на чувствительность к антибиотикам проводилось как традиционными, так и автоматизированными методами.
система. Результаты: Из 13 133 образцов крови, полученных для посева, 1418 (10.8%) были из отделения интенсивной терапии.
Девяносто (6,3%) изолятов оказались положительными на рост видов Acinetobacter. Из этих изолятов
31,11% оказались Acinetobacter lwoffii, 68,9% — комплексом Acinetobacter baumannii calcaetius.
Изоляты Acinetobacter lwoffii были наиболее чувствительны к имепенему 16 (57%), котримоксазолу 9 (32%),
ципрофлоксацин 6 (21%), затем амоксиклавулановая кислота 2 (7%) и цефуроксим 1 (3,5%). Вывод: Мульти
Инфекция Acinetobacter lwoffii с лекарственной устойчивостью растет, особенно у недоношенных детей и детей с очень низкой массой тела при рождении.
новорожденные.Разумное и своевременное применение антибиотиков в отделениях интенсивной терапии и интенсивной терапии является одним из важных ключей в борьбе с множественными лекарственными препаратами.
резистентная инфекция Acinetobacter и улучшение клинического исхода.

Идентификация металло-β-лактамазы 1 Нью-Дели в Acinetobacter lwoffii пищевого происхождения животного происхождения

Аннотация

Фон

Для исследования присутствия генов металло-β-лактамаз (MBL) и генетической среды гена металло-β-лактамаз Нью-Дели bla _NDM-1 в бактериях пищевого животного происхождения.

Методология / основные выводы

Грамотрицательные бактерии с низкой чувствительностью к имипенему (МПК> 8 мкг / мл) были выделены из образцов мазков, собранных на 15 животноводческих фермах и одной бойне в восточном Китае. Эти бактерии были отобраны для фенотипического и молекулярного обнаружения известных генов MBL и тестирования чувствительности к противомикробным препаратам. Для положительного изолята bla _NDM-1 были проведены эксперименты по конъюгации и трансформации для оценки переноса плазмиды.Саузерн-блоттинг был проведен для локализации генов bla, , _{, NDM-1,} , и секвенирование ДНК было выполнено для определения последовательностей bla _NDM-1 и фланкирующих генов. Всего девять грамотрицательных бактерий четырех разных видов имели фенотип MBL. bla _NDM-1 был идентифицирован на мобильной плазмиде, названной pAL-01, в изоляте Acinetobacter lwoffii куриного происхождения. Перенос pAL-01 из этого изолята в E.coli J53 и JM109 приводили к устойчивости ко множеству β-лактамов. Анализ последовательности показал, что ген bla _NDM-1 присоединен к интактному вставляемому элементу IS Aba125 , чей правый инвертированный повтор (IR-R) перекрывается с промоторной последовательностью bla _NDM-1 . Таким образом, вставка IS Aba125 , вероятно, усиливает экспрессию bla _NDM-1 .

Заключение

Идентификация bla _NDM-1 — несущая нагрузка A.lwoffii у кур предполагает возможность зоонозной передачи bla _NDM-1 и имеет важное значение для безопасности пищевых продуктов.

Образец цитирования: Wang Y, Wu C, Zhang Q, Qi J, Liu H, Wang Y, et al. (2012) Идентификация металло-β-лактамазы 1 Нью-Дели в Acinetobacter lwoffii пищевого происхождения. PLoS ONE 7 (5):
e37152.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0037152

Редактор: Axel Cloeckaert, Institut National de la Recherche Agronomique, Франция

Поступила: 21 февраля 2012 г .; Принята к печати: 14 апреля 2012 г .; Опубликовано: 18 мая 2012 г.

Авторские права: © 2012 Wang et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Китайского национального фонда естественных наук (№ U0631006) и программы для ученых Чан Цзян и исследовательской группы инноваций Китайского университета (№ IRT0866). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Металло-β-лактамазы (МБЛ) в клинических грамотрицательных организмах представляют серьезную угрозу для здоровья населения. МБЛ, которым для ферментативной активности требуются двухвалентные катионы (обычно ионы цинка) в качестве кофакторов металлов, могут гидролизовать все β-лактамы, включая карбапенемы (кроме азтреонама) [1]. В 2009 году новый фермент MBL, названный металло-β-лактамаза Нью-Дели (NDM-1, кодируемый bla _NDM-1 ), был идентифицирован в плазмидах из изолятов Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli , выделенных из пациент из Швеции, ранее госпитализированный в Индии [2].Недавно во всем мире были идентифицированы штаммы bla _NDM-1 , несущие Enterobacteriaceae , при этом в большинстве сообщений указывается, что изоляты были получены из индийского субконтинента в больницах или сообществах [3] или из балканских стран [4] . Тем не менее, положительные штаммы NDM-1 также были зарегистрированы у пациентов, у которых не было известных контактов с этими областями [5]. Сосуществование bla _NDM-1 с геном карбапенемазы класса D bla _OXA-23 в клинических изолятах Acinetobacter baumannii было впервые обнаружено в Индии [6].Впоследствии в пяти различных провинциях Китая было зарегистрировано пять клинических штаммов bla _NDM-1 , несущих клинических штаммов A. baumannii [7], [8]. Штамм Acinetobacter lwoffii с множественной лекарственной устойчивостью, несущий плазмиду bla _NDM-1 , был также выделен из мочи пациентки в Китае [9]. Хотя Китай граничит с Индией и Пакистаном, нет никаких доказательств того, что инфицированные пациенты контактировали с Индийским субконтинентом.

Недавно, bla _NDM-1 был обнаружен у ряда видов бактерий, выделенных из воды и образцов просачивания в центральной части Нью-Дели, что позволяет предположить, что он широко распространен в местной среде [10].Кроме того, бактерии, несущие bla _NDM-1 , также были зарегистрированы как колонизаторы кишечника у пациентов без клинических симптомов, что указывает на возможную передачу bla _NDM-1 фекально-оральным путем и что фекальная флора может служить резервуаром для распространения bla _NDM-1 [3], [10], [11]. Эти данные свидетельствуют о том, что разброс детерминанты устойчивости к NDM-1 намного шире, чем предполагалось ранее. Однако информации о распределении NDM-1 у сельскохозяйственных животных нет.Здесь мы исследовали распространенность грамотрицательных бактерий с низкой чувствительностью к имипенему у животных, производящих пищу, и определили, присутствовали ли гены MBL, включая bla _NDM-1 , в этих животных изолятах.

Результаты

Распространенность грамотрицательных бактерий с низкой чувствительностью к имипенему у животных, производящих пищевые продукты

Всего девять изолятов с очень низкой чувствительностью к имипенему (MIC> 8 мкг / мл для имипенема), полученные из восьми из 396 образцов, были подтверждены как грамотрицательные бактерии.Изоляты были идентифицированы с помощью секвенирования рДНК ATB 32 GN, ATB 32E и 16 S как Stenotrophomonas maltophilia (n = 3), Chryseobacterium indologenes (n = 3), Myroides odoratimimus (n = 1), Myroides. odoratus (n = 1) и A. lwoffii (n = 1). Восемь из этих изолятов были получены из образцов свиней, а изолят A. lwoffii — из образцов курицы. В этом исследовании не было выявлено устойчивых к имипенему штаммов Enterobacteriaceae .Два изолята, M. odoratimimus LYP-BCYg6a и M. odoratus LYP-BCYg6b, были собраны из одного образца ректального мазка на свиноферме.

Характеристика девяти грамотрицательных бактерий с низкой чувствительностью к имипенему

Все девять грамотрицательных изолятов показали высокие значения МИК для трех протестированных карбапенемов, включая имипенем (в диапазоне 32–128 мкг / мл), меропенем (16–64 мкг / мл) и эртапенем (16–512 мкг / мл). Двухдисковые синергетические тесты имипенема-ЭДТА и тесты MBL-полосок E-test подтвердили, что все девять изолятов были MBL-положительными.Однако анализ ПЦР с использованием праймеров, специфичных для известных мобильных и хромосомных генов MBL, показал, что только штамм SGC-HZ9 A. lwoffii куриного происхождения был положительным на bla _NDM-1 . Этот штамм-носитель bla _NDM-1 был устойчив не только ко всем протестированным β-лактамам (кроме азтреонама, 8 мкг / мл), но также к ципрофлоксацину (8 мкг / мл), тетрациклину (32 мкг / мл), канамицин (64 мкг / мл) и хлорамфеникол (32 мкг / мл), оставаясь при этом чувствительными к гентамицину (0.5 мкг / мл) и полимиксин B (0,016 мкг / мл) (таблица 1). Кроме того, две повсеместно распространенные свободноживущие бактерии (одна Myroides odoratimimus LYP-BCYg6a и один изолят Myroides odoratus LYP-BCYg6b) несли хромосомный ген MBL, bla _MUS-1 . Шесть изолятов с фенотипом MBL не содержали ни одного из протестированных генов MBL.

Фенотипическая и плазмидная характеристика

A. lwoffii SGC-HZ9

Плазмиды A. lwoffii SGC-HZ9 экстрагировали и разделяли с помощью гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE).Последующий Саузерн-блоттинг-анализ геля PFGE выявил гибридизацию bla _NDM-1 -специфического зонда с плазмидой ~ 270 т.п.н., которая была обозначена как pAL-01 (фиг. 1). Плазмида pAL-01 была успешно перенесена из SGC-HZ9 в E. coli J53 с использованием фильтрования и в E. coli JM109 с помощью электропорации. Размер плазмиды, выделенной из трансформанта JM109-SGC-HZ9, соответствовал тому, который наблюдался с использованием PFGE, в то время как две плазмидные полосы были идентифицированы в трансконъюганте J53-SGC-HZ9 (приблизительно 260 т.п.н. и 270 т.п.н.) (рис. 1A).Саузерн-блоттинг с использованием зонда bla _NDM-1 дополнительно подтвердил присутствие pAL-01 в трансформанте JM109-SGC-HZ9, в то время как в трансконъюганте J53-SGC-HZ9 зонд гибридизировался с плазмидой размером 260 т.п.н., что указывает на неизвестные перегруппировки. встречались у трансконъюгантов по отношению к pAL-01 (рис. 1B). Тесты на чувствительность показали, что как трансконъюгант, так и трансформант проявляли устойчивость или пониженную чувствительность ко всем протестированным β-лактамам (кроме азтреонама) по сравнению с реципиентами E.coli J53 и JM109, но оставалась чувствительной к другим классам антибиотиков (канамицину, ципрофлоксацину, тетрациклину и хлорамфениколу) (таблица 1). После 14 пассажей в среде с 16 мкг / мл цефтазидима или без него, A. lwoffii SGC-HZ9 и трансформант JM109-SGC-HZ9 стабильно поддерживали плазмиду, содержащую bla _NDM-1 . Однако трансконъюгант J53-SGC-HZ9 потерял bla _NDM-1 в течение трех пассажей при выращивании в среде без антибиотиков, но сохранял bla _NDM-1 в присутствии цефтазидима.

Рисунок 1. Идентификация мобильного гена bla _NDM-1 .

(A) PFGE-анализ препаратов плазмид. (B) Саузерн-гибридизация геля PFGE и геля нуклеазы S1 PFGE с зондом bla _NDM-1 . Для обеих панелей дорожки 1-3 содержат плазмиды, полученные из A. lwoffii SGC-HZ9, трансформанта JM109-SGC-HZ9 и трансконъюганта J53-SGC-HZ9, соответственно. M: Маркер PFG Lambda Ladder (NEB, UK).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0037152.g001

Фланкирующая генетическая последовательность

bla _NDM-1 в pAL-01

После клонирования ДНК и анализа ходьбы модифицированной случайной последовательности праймеров была получена область 6,5 т.п.н., окружающая ген bla _NDM-1 (номер доступа в GenBank JN616388). Область гена включала в себя два гена устойчивости к противомикробным препаратам ( bla _NDM-1 и aphA6 ), три мобильных элемента (IS 911 , insB и IS Aba125 ) и ген фосфорибозилантранилазы триомепразилата. .Сравнение областей, окружающих bla _NDM-1 в плазмидах E. coli p271A, A. lwoffii pAL-01, K. pneumoniae pKpANDM-1 и E. coli pNDM -HK представлена ​​на Фигуре 2. Область, содержащая 2022 п.н. bla _NDM-1 в pAL-01, на 99% идентична последовательности с соответствующей областью в pKpANDM-1 из K. pneumoniae 05-506 (GenBank № FN396876), с дополнительными 24 п.н., вставленными в область между bla _NDM-1 и traF в pAL-01.Эти дополнительные 24 п.н. также были обнаружены в pA271A и pNDM-HK [12], [13].

Рис. 2. Схематическая карта, представляющая bla _NDM-1 и его фланкирующие генетические последовательности.

Сравнение плазмидных областей вокруг гена bla _NDM-1 в A. lwoffii SGC-HZ9 (JN616388), E. coli 271 (HQ162469) [12], K. pneumoniae 05- 506 (FN396876) [2] и E. coli HK-01 (HQ451074) [13]. Вертикальные пунктирные линии указывают места, в которых последовательности расходятся.X и E обозначают сайты Xba I и Eco RI соответственно. Промоторная область -35 bla _NDM-1 и перекрывающийся сайт Eco RI указаны в верхней части панели. Правый перевернутый повтор IS Aba125 заштрихован и частично перекрывается с блоком -35 из bla _NDM-1 .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0037152.g002

Неповрежденный элемент инсерционной последовательности (IS), IS Aba125 , фланкированный несовершенными концевыми повторами (IR-L AAACTTGAAGTGCGACA, IR-R TGTCGCACCTCATGTTT). идентифицирован непосредственно перед геном bla _NDM-1 .Этот IS элемент принадлежит к широко распространенному семейству IS 30 и ранее был идентифицирован у A. baumannii (GenBank № AY751533), где он связан с инсерционной инактивацией порина внешней мембраны [14]. Примечательно, что вышестоящие области bla _NDM-1 в pKpANDM-1, pA271A и pNDM-HK содержали только частичные последовательности IS Aba125 вместе с концевым повтором IR-R. В этих примерах элемент IS был усечен другими последовательностями вставки, включая IS Ec33 в pA271A и IS 26 в pKpANDM-1 и pNDM-HK (рисунок 2).Интересно, что ранее подтвержденная последовательность промотора -35 (TTGAAT) bla _NDM-1 [12] перекрывается с инвертированным повтором IR-R IS Aba125 , а нуклеотиды TGA в блоке -35 образуют концевой кодон. ИС Aba125 (рисунок 2).

Перед IS Aba125 представляет собой открытую рамку считывания, кодирующую аминогликозид фосфотрансферазу, которая на 98,5% аналогична гену устойчивости к канамицину aphA6 в A. baumannii (GenBank No.P09885). Далее вверх по течению находятся два соседних мобильных гена, которые идентичны предполагаемой транспозазе OrfB (а именно insB ) в A. baumannii 1656-2 (номер GenBank CP001921) и транспозазе семейства IS 3 911 ранее. идентифицирован в A. baumannii (Номер GenBank CP001921). Ниже bla _NDM-1 ген фосфорибозилантранилат-изомеразы trpF (639 п.н.) демонстрирует 100% сходство с первыми 581 нуклеотидом trpF в pNDM-HK и pKpANDM-1 (рисунок 2).Белок TrpF имеет 65% аминокислотного сходства с фосфорибозилантранилат-изомеразой Erythrobacter sp. СД-21 (ZP_01863115).

Обсуждение

Девять грамотрицательных неферментативных бактерий (три C. indologenes , три S. maltophilia , два Myroides spp и один A. lwoffii ) с низкой чувствительностью к имипенему. учиться. Acinetobacter — распространенные свободноживущие сапрофиты, обнаруженные в почве, воде, сточных водах и продуктах животного происхождения.Сообщается, что видов Acinetobacter составляют до 22,7% от общей микрофлоры куриных туш [15]. A. lwoffii — один из наиболее распространенных видов Acinetobacter , участвующих в экономически важной порче пищевых продуктов, таких как бекон, курица, яйца и рыба, даже при хранении в холодильных условиях или после обработки облучением [15]. В прошлом Acinetobacter spp. считались сапрофитами, не имеющими клинической значимости.Однако с внедрением новых мощных антибиотиков в клиническую практику и сельское хозяйство, а также с использованием инвазивных процедур в больничных отделениях интенсивной терапии, все чаще возникают инфекции Acinetobacter , связанные с устойчивостью к антибиотикам, внутрибольничные и внутрибольничные инфекции Acinetobacter [16], [17].

Все девять грамотрицательных видов, выделенных в этом исследовании, были положительными по фенотипу MBL. Однако было обнаружено, что только четыре из них содержат известные гены, дающие MBL. Важно отметить, что недавно обнаруженный ген MBL bla _NDM-1 был идентифицирован в A.lwoffii SGC-HZ9, который не только обладал высокими значениями MIC почти для всех β-лактамов, но также был устойчив к четырем другим классам антибиотиков (канамицину, ципрофлоксацину, тетрациклину и хлорамфениколу). Этот изолят был получен из анального мазка цыпленка. Хотя информация об антимикробной терапии этого конкретного цыпленка отсутствовала, записи об использовании антибиотиков на птицеферме показали, что ряд противомикробных средств, включая пенициллин, цефотаксим, цефрадин, тилмикозин, доксициклин и неомицин, использовался для лечения или предотвращения бактериального заражения. инфекции.Насколько нам известно, это первое сообщение о гене bla _NDM-1 у A. lwoffii пищевого животного происхождения, что может иметь серьезные последствия для общественного здравоохранения, поскольку виды A. lwoffii — это повсеместная бактерия в пищевых продуктах, которая может передаваться человеку через пищевую цепочку. Кроме того, два Myroides spp. Изоляты, полученные из того же анального мазка на свиноферме, содержали bla _MUS-1 , хромосомный ген MBL, присущий M.odoratimimus , который кодирует металлофермент подгруппы 3a MUS-1 [18]. Несмотря на эти данные, шесть MBL-положительных изолятов (три C. indologenes и три S. maltophilia ) не содержали известных внутренних генов MBL bla _IND1–4 или bla _L1 [19], [20], как определено с помощью ПЦР-амплификации. Это может быть связано с молекулярной гетерогенностью генов MBL у этих видов и требует дальнейшего изучения.

Хотя использование антибиотиков карбепенема у животных, используемых для производства пищевых продуктов, запрещено в Китае и других странах, другие β-лактамные антибиотики, такие как пенициллин и цефалоспорины (цефрадин, цефтиофур и цефотаксим), широко используются в животноводстве для профилактики и контроля болезнь.Использование этих некарбепенемных β-лактамов в животноводстве может служить движущей силой для отбора генов MBL у бактерий. Однако из-за сосуществования генов MBL и других генов устойчивости к противомикробным препаратам, таких как aphA6 в pAL-01, идентифицированных в этом исследовании, нельзя игнорировать возможность перекрестного отбора генов MBL с использованием других противомикробных препаратов. Следует отметить, что некоторые карбапенемазо-положительные грамотрицательные бактерии, включая Enterobacteriaceae , со значениями MIC ниже 8 мкг / мл, могли быть пропущены в условиях, использованных в этом исследовании.

Плазмида

pAL-01 была успешно перенесена из SGC-HZ9 в E. coli J53 с использованием фильтрования и в E. coli JM109 с использованием электропорации, что позволяет предположить, что эта плазмида является подвижной. Трансформант и трансконъюгант были устойчивы или показали пониженную чувствительность почти ко всем протестированным β-лактамам, но оставались чувствительными к другим протестированным классам антибиотиков. Эти данные подтверждают функцию pAL-01 в обеспечении устойчивости к β-лактамам и предполагают, что устойчивость SGC-HZ9 к не-β-лактамным антибиотикам может быть связана с хромосомным геном или плазмидой, отличным от pAL-01.Интересно, что плазмида, несущая bla _NDM-1 , была высокостабильной в A. lwoffii SGC-HZ9 и трансформанте JM109-SGC-HZ9, но терялась в трансконъюганте J53-SGC-HZ9 в отсутствие отбора антибиотиков. давление. Это открытие аналогично тому, о котором сообщалось для плазмиды, несущей bla _NDM-1 , в изолятах A. baumannii человеческого происхождения [8]. Были предприняты попытки идентифицировать группу несовместимости pAL-01 путем типирования репликонов с использованием ранее описанных методов на основе ПЦР [21], [22], однако эксперимент по типированию репликонов дал отрицательные результаты и не идентифицировал pAL-01 в качестве члена. известных групп несовместимости как для A.baumannii и Enterobacteriaceae .

Местоположение промоторной последовательности для bla _NDM-1 было идентифицировано в предыдущем исследовании путем картирования сайта начала транскрипции [12]. Сайт транскрипции +1 гена был расположен на 7 п.н. ниже предполагаемой последовательности -10. Кроме того, последовательность -35 перекрывается с 3′-концом транспозазы и правым концевым повтором IS Aba125 . Эти результаты показали, что экспрессия bla _NDM-1 управляется промотором, частично обеспечиваемым IS Aba125 .Подобная структура была также обнаружена в исследованиях гена фермента, модифицирующего аминогликозиды, aphA6 , для которого правый инвертированный повтор IS Aba125 , соседний с aphA6 , обеспечивает последовательность -35 (TTGAAT), управляющую транскрипцией гена [23] , [24]. Поскольку все известные гены bla _NDM-1 связаны с частичным или интактным IS Aba125 (рис. 2), и учитывая, что интактный IS Aba125 не был обнаружен у других видов бактерий, кроме Acinetobacter , возможно, что ген bla _NDM-1 произошел от Acinetobacter , одного из самых распространенных видов бактерий в окружающей среде.Как и bla _NDM-1 , ген aphA6 был обнаружен непосредственно перед IS Aba125 (рис. 2). Однако перенос гена aphA6 (переносится на pAL-01) в E. coli не изменил его чувствительность к канамицину. Следовательно, вероятно, что aphA6 в pAL-01 не экспрессируется (или экспрессируется на незначительном уровне) в хозяине E. coli . В качестве альтернативы, высокое значение MIC канамицина в SGC-HZ9 (64 мкг / мл) может быть связано с другими детерминантами устойчивости.

Результаты этого исследования подтверждают, что bla _NDM-1 и другие гены MBL ( bla _MUS-1 ) присутствуют в бактериях пищевого животного происхождения. Эти результаты имеют важное значение для распространения этого гена устойчивости, такого как Acinetobacter spp. широко распространены среди сельскохозяйственных животных (куры и свиньи) и в окружающей среде (почва, поверхностные воды и сточные воды). Было бы трудно сдержать распространение bla _NDM-1 , если бы он мог быть передан людям через пищевую цепочку.Однако неясно, представляет ли bla _NDM-1 штамм пищевого животного происхождения A. lwoffii , выявленный в этом исследовании, спорадическим случаем или ранней стадией тенденции к широкому распространению. Следовательно, необходимы усиленные и постоянные усилия для мониторинга распространенности bla _NDM-1 в Acinetobacter spp. и другие виды бактерий пищевого животного происхождения.

Материалы и методы

Сбор и идентификация бактерий с низкой чувствительностью к имипенему

Всего было взято 396 проб на восьми птицеводческих фермах (n = 146, клоакальные мазки), шести утиных хозяйствах (n = 50, клоакальные мазки), на одной свиноферме (n = 70, ректальные мазки) и на одной бойне свиней ( ректальные мазки n = 60 и назальные мазки n = 50 от туш до потрошения и мазки из лимфатических узлов n = 20 от туш после потрошения) в провинции Шаньдун, расположенной на востоке Китая, с октября по декабрь 2010 г.Каждый образец собирали у разных животных и инокулировали на чашку с агаром для инфузии мозга и сердца (BHI), содержащую 8 мкг / мл имипенема, и инкубировали при 30 ° C в течение 16–18 часов. Все колонии на культуральных планшетах были отобраны и идентифицированы с использованием окрашивания по Граму и анализа последовательности гена 16 s рДНК с использованием ранее описанных праймеров [25]. Грамотрицательные бактерии были дополнительно подтверждены системами идентификации ATB 32GN и 32E (bioMérieux, Крапон, Франция). Все собранные штаммы хранили при -70 ° C в BHI с добавлением 15% глицерина до тестирования.

Тест на чувствительность к антибиотикам

Чувствительность бактериальных изолятов к 15 антибиотикам была оценена с использованием метода микроразбавления в бульоне, как установлено в документе M100-S18 (2008) Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) [26].

Фенотипическое и молекулярное определение MBL у грамотрицательных бактерий

Двухдисковый синергетический тест имипенема-ЭДТА, а также полоски MBL E-test (bioMérieux, Craponne, France) были использованы для скрининга продукции MBL [27].Штаммы были проверены на известные мобильные гены MBL ( bla _NDM-1 , bla _SIM-1 , bla _SPM-1 , bla _VIM , bla

_{bla GIM-1 , bla AIM-1 и bla DIM-1 ) методом ПЦР с использованием ранее описанных праймеров [2], [27], [28]. Кроме того, хромосомные гены MBL ( bla IND1 / 2 и bla L1 ) также были проверены методом ПЦР [29], [30].Праймеры для мобильного гена MBL bla KHM и хромосомных генов MBL bla MUS-1 , bla TUS-1 и bla IND3 / 4 , разработанные в этом исследовании, перечислены в таблице. 2. Все ампликоны ПЦР секвенировали. Полная кодирующая последовательность bla NDM-1 была синтезирована Beijing Genomics Institution (BGI, Пекин, Китай) в соответствии с опубликованной последовательностью в плазмиде pKpANDM-1 (номер доступа FN396876) и использовалась в ПЦР-анализе в качестве положительный контроль на bla NDM-1 [2].}

Эксперименты по конъюгации и трансформации

Для конъюгации использовали A. lwoffii SGC-HZ9 и E. coli J53 (устойчивый к азидам) в качестве донора и реципиента, соответственно, с селекцией на среде МакКонки, содержащей азид натрия (100 мкг / мл) и цефтазидим ( 16 мкг / мл). Плазмидную ДНК экстрагировали из SGC-HZ9 с помощью набора QIAGEN Large-Construct Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Для трансформации препарат плазмиды использовали для трансформации электрокомпетентной E.coli JM109, и селекцию проводили на чашках с агаром Luria Bertani (LB), содержащим цефтазидим (16 мкг / мл). Трансформанты и трансконъюганты были дополнительно подтверждены с помощью специфической ПЦР и саузерн-блоттинга.

Саузерн-блоттинг-анализ

Трансформанты и трансконъюганты были дополнительно подтверждены с помощью специфической ПЦР и саузерн-блоттинга. Размеры плазмид, экстрагированных из исходного штамма A. lwoffii и из трансформантов, оценивали с помощью PFGE.Саузерн-блоттинг выполняли с использованием стартового набора для мечения и обнаружения ДНК DIG High Prime (Roche, Базель, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя. Меченный дигоксигенином bla _NDM-1 -специфический зонд был приготовлен с использованием праймеров (прямой 5′-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3 ‘; и обратный 5′-CGGAATGGCTCATCACGATC-3’), который амплифицировал область размером пар оснований bla из пар оснований. _NDM-1 ген. Плазмиды экстрагировали из A. lwoffii SGC-HZ9, трансконъюганта J53-SGC-HZ9 и трансформанта JM109-SGC-HZ9 с использованием набора QIAGEN Large-Construct Kit.Затем плазмидную ДНК разделяли с помощью PFGE в следующих условиях: 6,0 В / см с начальным / конечным временем переключения 5 с / 50 с под углом 120 ° при 14 ° C в течение 10 часов. Затем ДНК переносили на нейлоновую мембрану (Hybond N, Amersham, UK), которую гибридизовали с приготовленным зондом, специфичным для bla _NDM-1 . Детектирование проводили с использованием набора для определения цвета NBT / BCIP (Roche, Швейцария).

Тест стабильности плазмиды

Стабильность плазмиды оценивали путем серийного пассажа SGC-HZ9, трансконъюганта J53-SGC-HZ9 и трансформанта JM109-SGC-HZ9 на среде LB, не содержащей антибиотиков и содержащей цефтазидим (16 мкг / мл).Носительство bla _NDM-1 в этих штаммах оценивали путем инокуляции культур различных пассажей на чашки LB, содержащие 16 мкг / мл цефтазидима. Кроме того, присутствие плазмид, несущих bla _NDM-1 , в культурах различных пассажей подтверждали с помощью ПЦР-анализа. Плазмида считалась нестабильной, если она терялась после трех последовательных пассажей в среде без антибиотиков.

Клонирование, секвенирование и анализ ДНК

Клонирование выполняли с использованием вектора pHSG298 с маркером устойчивости к канамицину (Takara, Dalian, China).Эндонуклеазы рестрикции Eco RI, Xba I и Bam HI (NEB, UK) использовали для расщепления плазмидной ДНК, экстрагированной из A. lwoffii SGC-HZ9 и трансформанта JM109-SGC-HZ9. Затем фрагменты отдельно лигировали в pHSG298, который был предварительно расщеплен теми же ферментами. Трансформацию проводили с использованием электропорации в E. coli JM109. Трансформанты отбирали на чашках с агаром LB, содержащим цефтазидим (16 мкг / мл) и канамицин (50 мкг / мл).Рекомбинантные плазмиды, содержащие bla _NDM-1 -положительных вставок, подтверждали секвенированием. Фланкирующие области bla _NDM-1 , несущие рестрикционные фрагменты в плазмиде SGC-HZ9, были дополнительно секвенированы с использованием стратегии изменения последовательности случайных праймеров, как описано ранее [31]. Полученные последовательности аннотировали с помощью программы VectorNTI (Invitrogen, Carlsbad; CA, USA), а сравнение последовательностей проводили с помощью BLASTP и BLASTN.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: Ян Ван CW QZ JS. Проведены эксперименты: Yu Wang JQ HL TH LM JL. Проанализированы данные: CW ZS YL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: HL TH LM JL. Написал статью: Ян Ван QZ JS.

Ссылки

1. 1.
   Walsh TR, Toleman MA, Poirel L, Nordmann P (2005) Металло-бета-лактамазы: тишина перед бурей? Clin Microbiol Rev 18: 306–325.
2. 2.
   Yong D, Toleman MA, Giske CG, Cho HS, Sundman K, et al.(2009) Характеристика нового гена металло-бета-лактамазы, bla _NDM-1 , и нового гена эритромицинэстеразы, несущего уникальную генетическую структуру в последовательности типа 14 Klebsiella pneumoniae из Индии. Антимикробные агенты Chemother 53: 5046–5054.
3. 3.
   Кумарасами К.К., Толеман М.А., Уолш Т.Р., Багария Дж., Батт Ф. и др. (2010) Появление нового механизма устойчивости к антибиотикам в Индии, Пакистане и Великобритании: молекулярное, биологическое и эпидемиологическое исследование.Lancet Infect Dis 10: 597–602.
4. 4.
   Ливермор Д.М., Уолш Т.Р., Толеман М., Вудфорд Н. (2011) Балканский NDM-1: побег или пересадка? Lancet Infect Dis 11: 164.
5. 5.
   Poirel L, Benouda A, Hays C, Nordmann P (2011) Появление NDM-1-продуцирующего Klebsiella pneumoniae в Марокко. J Antimicrob Chemother 66: 2781–2783.
6. 6.
   Картикеян К., Тирунараян М.А., Кришнан П. (2010) Сосуществование bla _OXA-23 с bla _NDM-1 и armA в клинических изолятах Acinetobacter baumannii из Индии.J Antimicrob Chemother 65: 2253–2254.
7. 7.
   Chen Z, Qlu S, Wang Y, Liu S, Wang Z и др. (2011) Сосуществование bla NDM-1 с преобладающими bla _OXA23 и bla _IMP в изолятах Acinetobacter baumannii с общей лекарственной устойчивостью в Китае. Clin Infect Dis 52: 692–693.
8. 8.
   Chen Y, Zhou Z, Jiang Y, Yu Y (2011) Появление в Китае Acinetobacter baumannii , продуцирующего NDM-1.J Antimicrob Chemother 52: 692–693.
9. 9.
   Ху И, Чжан В., Лян Х, Лю Л., Пэн Г. и др. (2011) Полногеномная последовательность клинического изолята Acinetobacter lwoffii с множественной лекарственной устойчивостью. J Bacteriol 193: 5549–5550.
10. 10.
    Walsh TR, Weeks J, Livermore DM, Toleman MA (2011) Распространение NDM-1-положительных бактерий в окружающей среде Нью-Дели и его последствия для здоровья человека: исследование точечной распространенности в окружающей среде. Lancet Infect Dis 11: 355–362.
11. 11.
    D’Andrea MM, Venturelli C, Giani T, Arena F, Conte V и др. (2011) Постоянное носительство и инфекция полирезистентной Escherichia coli ST405, продуцирующей карбапенемазу NDM-1: отчет о первых случаях заболевания в Италии. J Clin Microbiol 49: 2755–2758.
12. 12.
    Poirel L, Lagrutta E, Taylor P, Pham J, Nordmann P (2010) Появление металло-бета-лактамазы NDM-1, продуцирующей множественную лекарственную устойчивость Escherichia coli в Австралии. Антимикробные агенты Chemother 54: 4914–6.
13. 13.
    Ho PL, Lo WU, Yeung MK, Lin CH, Chow KH и др. (2011) Полное секвенирование pNDM-HK, кодирующего карбапенемазу NDM-1, из штамма Escherichia coli с множественной лекарственной устойчивостью, выделенного в Гонконге. PLoS One 6: e17989.
14. 14.
    Мусси М.А., Лиманский А.С., Виале А.М. (2005) Приобретение устойчивости к карбапенемам в клинических штаммах Acinetobacter baumannii с множественной лекарственной устойчивостью: естественная инсерционная инактивация гена, кодирующего члена нового семейства белков внешней мембраны бета-ствола.Антимикробные агенты Chemother 49: 1432–1440.
15. 15.
    Towner KJ (1996) Биология Acinetobacter spp. В: Bergogne-Bérézin EJ-GM, Towner KJ, редакторы. Acinetobacter : микробиология, эпидемиология, инфекции, управление. С. 13–36. CRC Press. Бока-Ратон, Флорида.
16. 16.
    Бергонь-Березин Э., Таунер К.Дж. (1996) Acinetobacter spp. как внутрибольничные возбудители: микробиологические, клинико-эпидемиологические особенности. Clin Microbiol Rev 9: 148–165.
17. 17.
    Guardabassi L, Dalsgaard A, Olsen JE (1999) Фенотипическая характеристика и устойчивость к антибиотикам Acinetobacter spp. изолирован от водных источников. J Appl Microbiol 87: 659–67.
18. 18.
    Mammeri H, Bellais S, Nordmann P (2002) Кодируемые хромосомами бета-лактамазы TUS-1 и MUS-1 из Myroides odoratus и Myroides odoratimimus (ранее Flavobacterium odoratum ), новые представители молекулярного подкласса линии Металлоферменты B1.Антимикробные агенты Chemother 46: 3561–3567.
19. 19.
    Bellais S, Poirel L, Leotard S, Naas T, Nordmann P (2000) Генетическое разнообразие карбапенем-гидролизующих металло-бета-лактамаз из Chryseobacterium (Flavobacterium) индологенов . Антимикробные агенты Chemother 44: 3028–3034.
20. 20.
    Sanschagrin F, Dufresne J, Levesque RC (1998) Молекулярная гетерогенность семейства металло-бета-лактамаз L-1 из Stenotrophomonas maltophilia.Антимикробные агенты Chemother 42: 1245–1248.
21. 21.
    Бертини А., Пуарель Л., Мунье П., Вилла Л., Нордманн П. и др. (2010) Характеристика и типирование репликонов на основе ПЦР плазмид устойчивости в Acinetobacter baumannii . Антимикробные агенты Chemother 54: 4168–4177.
22. 22.
    Караттоли А., Бертини А., Вилла Л., Фалбо В., Хопкинс К. и др. (2005) Идентификация плазмид с помощью типирования репликонов на основе ПЦР. J Microbiol Methods 63: 219–228.
23. 23.Naas T, Aubert D, Lambert T, Nordmann P (2006) Сложные генетические структуры с повторяющимися элементами, интегроном класса 1 типа sul и ген бета-лактамазы расширенного спектра bla _VEB . Антимикробные агенты Chemother 50: 1745–1752.
24. 24.
    Adams MD, Chan ER, Molyneaux ND, Bonomo RA (2010) Полногеномный анализ дивергенции детерминант устойчивости к антибиотикам в близкородственных изолятах Acinetobacter baumannii .Антимикробные агенты Chemother 54: 3569–3577.
25. 25.
    Ким Т.В., Ким Й.Х., Ким С.Е., Ли Дж.Х., Пак С.С. и др. (2010) Идентификация и распределение видов Bacillus в doenjang по паттернам цельноклеточного белка и анализу последовательности гена 16 S рРНК. J Microbiol Biotechnol 20: 1210–1214.
26. 26.
    Институт клинических и лабораторных стандартов (2008) Стандарты эффективности тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам; восемнадцать информационных дополнений М100-С18.CLSI, Уэйн, Пенсильвания.
27. 27.
    Nordmann P, Poirel L, Carrer A, Toleman MA, Walsh TR (2011) Как обнаружить производителей NDM-1. J Clin Microbiol 49: 718–721.
28. 28.
    Poirel L, Rodriguez-Martinez JM, Al Naiemi N, Debets-Ossenkopp YJ, Nordmann P (2010) Характеристика DIM-1, металло-бета-лактамазы, кодируемой интегроном, из клинического изолята Pseudomonas stutzeri в Нидерландах. Антимикробные агенты Chemother 54: 2420–2424.
29. 29.
    Буш К. (2010) Тревожная опосредованная β-лактамазой резистентность у Enterobacteriaceae с множественной лекарственной устойчивостью.Curr Opin Microbiol 13: 558–564.
30. 30.
    Thomson KS (2010) Проблемы с бета-лактамазой расширенного спектра, AmpC и карбапенемазой. J Clin Microbiol 48: 1019–1025.
31. 31.
    Zhang K, McClure JA, Elsayed S, Conly JM (2009) Новая хромосома стафилококковой кассеты типа mec , предварительно обозначенная типом VIII, несущая комплексы генов класса A mec и типа 4 ccr в канадском эпидемическом штамме метициллина — устойчивый Staphylococcus aureus .