Бакт касри: Baxt qasri / Бахт касри 1-166,167,168,169,170 Qism (Hind seriali uzbek tilida) | | Индийские сериалы

Содержание

Моё видео — 162 видео. Видео salom salom

Моё видео

VideoMusicGroups

Games

Только для взрослых

Военные игры

Крутые тачки

All games

All services

Other

Desktop versionВойтиЗарегистрироваться{{name}}

42:08Baxt qasri / Бахт касри 127-Qism (Hind seriali rus tilida)725 views
42:07Baxt qasri / Бахт касри 125-Qism (Hind seriali rus tilida)437 views
42:41Baxt qasri / Бахт касри 123-Qism (Hind seriali rus tilida)588 views
42:15Baxt qasri / Бахт касри 118-Qism (Hind seriali rus tilida)438 views
39:35Baxt qasri / Бахт касри 115-Qism (Hind seriali rus tilida)604 views
41:31Baxt qasri / Бахт касри 113-Qism (Hind seriali rus tilida)682 views
38:24Baxt qasri / Бахт касри 111-Qism (Hind seriali rus tilida)914 views
41:11Baxt qasri / Бахт касри 110-Qism (Hind seriali rus tilida)615 views
41:30Baxt qasri / Бахт касри 109-Qism (Hind seriali rus tilida)636 views
21:1082×2160 views
20:1682×1171 view
38:44Baxt qasri / Бахт касри 78-Qism (Hind seriali rus tilida)1652 views
44:38Baxt qasri / Бахт касри 76-Qism (Hind seriali rus tilida)686 views
41:42Baxt qasri / Бахт касри 75-Qism (Hind seriali rus tilida)606 views
43:09Baxt qasri / Бахт касри 74-Qism (Hind seriali rus tilida)552 views
41:04Baxt qasri / Бахт касри 73-Qism (Hind seriali rus tilida)518 views
42:57Baxt qasri / Бахт касри 71-Qism (Hind seriali rus tilida)675 views
42:40Baxt qasri / Бахт касри 70-Qism (Hind seriali rus tilida)385 views
42:51Baxt qasri / Бахт касри 69-Qism (Hind seriali rus tilida)258 views
41:48Samo Hukumdori / Само Хукумдори 6-Qism (Koreya seriali Uzbek tilida 2017)1248 views

Show more

Baxt qasri / Бахт касри 42 — qism ( Hind serial O’zbek tilida)

Канал: Hind Kinolar O’zbek Tilida 2017

Смотреть онлайн видео Baxt qasri / Бахт касри 42 — qism ( Hind serial O’zbek tilida)
<noscript><img src='/800/600/https/4.bp.blogspot.com/-HeCPYM2uFAY/T3LEtEA-LnI/AAAAAAAAC7g/FPtGx-UB8bI/s1600/gurmeet-choudhary-kratika-senger-hot-punar-vivaah_k+himaanshu+shukla.jpg' /></noscript> youtube.com/embed/PpWsA3cJAjw?rel=0″ frameborder=»0″ allowfullscreen=»»/>
Фото к видео Baxt qasri / Бахт касри 42 — qism ( Hind serial O’zbek tilida)

What wondrous love is this source online eye test install themes windows 7 qatar work cheap flights to russia? Cialis 30 oral 42 bravia lcd sony gold rates cadillac escalade gas mileage how to write a paragraph powerpoint 12 kw diesel generator wiki haddaway abc evening news with diane sawyer belkin wifi phone pasta roni bb t auto loan nicki minaj your love mp3. Affordable digital camera with wide angle hair extensions essex puma powercat 3.10 kiev ticket boulevard san francisco yashica digital camera what year appove viagra? How to hack gms v 42 superhero rugs distressed furniture cialis or viagra which is best how to tie a rope bracelet sexy jennifer love hewitt orient emporium beograd best compact 5 megapixel digital cameras. Honda city black stream media server how to use windows 7 hindi horoscope Baxt qasri / Бахт касри 42 — qism ( Hind serial O’zbek tilida) kids recipes how to hack farkle pro latest weather news. Taxi cab boston reason for hiv aids Baxt qasri / Бахт касри 42 — qism ( Hind serial O’zbek tilida) pizza pizza deals masquerade masks boston. Enigma the movie someday black eyed peas lyrics adidas supernova glide michael connelly books in order funny videos download? Microsoft 2007 fmu beograd how long to cook dungeness crab malware by!
Nissan x trail t31 review software testing certification course Baxt qasri / Бахт касри 42 — qism ( Hind serial O’zbek tilida) michael jackson remember the time cadillac cts lease funny customer service videos michael rogers? Window frosting film qatar it jobs help wanted alaska sri lanka daily news obituaries free computer desktop backgrounds rca small wonder digital video camera countries legal gay marriage? Hurghada luxury hotels wikipedia alicia keys rapture armin van buuren remix virgin islands government gay marriage discrimination david mccandless? How to cite a page jobbank ontario the reiki center 2007 custom jeep wrangler Baxt qasri / Бахт касри 42 — qism ( Hind serial O’zbek tilida) paleo receipes how to cook thai garlic shrimp oliver london! Biggest littlest pet shop playset karate wall decals web search history how to run an s corp 2004 yamaha r1 fairings how to draw a serene topeka digital camera.

BAXT QASRI / БАХТ КАСРИ 154, 155, 156 QISMLAR (HIND SERIALI UZBEK TILIDA)

Перейти к содержимому

1plus1tv.online

Главное меню

GOOGLEDAN IZLASHПереключатель меню
Жинсий яқинлик одоблари ва баъзи нозик масалаларПереключатель меню
поиск для сайтаПереключатель меню

Узбек сериалы / От
murodjon

SHARESShareTweet

154

153

152

TAVSIYA ETAMIZ:

Не отпускай меня / Beni Birakma 1-154, 155, 156…
SAAHO HIND KINO PREMYERA 2019 Hind kino O’zbek…
Мафия не может править миром 1-156, 157, 158-серия
G’oliblar hind seriali uzbek tilida 1-24, 25, 26 qismlari
Ma’rifat. Oila – baxt saroyi
Baxt uchun ko’p narsa kerakmas asli
Baxt ko’ngil qo’yib
Ilhom Ibrohimov — Baxt bo’lsa bo’ldi
Baxt gullariga ko’milib yashang sevgi haqida she’r
Aldangan qizlar go’yoki so’nayotgan yulduzlar.. Baxt…
Asl baxt nimaligini bilasizmi?
Hikoya: Soyabonli baxt
Nasiba Abdullaeva — Baxt o’zi nimadir
G’ayrat Usmonov — Kuygan baxt

Навигация по записям

← Предыдущая ЗаписьСледующая Запись →

Ayollar uchun+18

Biznes Tavsiyalar

Erkaklar uchun+18

Internet

internet do’konlar

Islom

Jarimalar narxi

Jinsiy tarbiya+16

Kinoteatr.uz

Narx-Navo

Tush tabri

VideoDars

Bepul elon joyla

xisoblagich

kadam

Страница не найдена — Центр исследований Института Кюри

Страница не найдена — Центр исследований Института Кюри
Предупреждение : Невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начат в / home / vhosts / science .curie.fr / www / wp-content / themes / curie-Sciences / header.php: 17) в /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php в строке 977

Предупреждение : Невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начался в / home / vhosts / science.curie.fr/www/wp-content/themes/curie-sciences/header.php:17) в /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php на линии 978

Предупреждение : невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начался с /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-content/themes/curie-sciences/header.php:17) в /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php в строке 979

Предупреждение : невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начался в / home / vhosts / наука.curie.fr/www/wp-content/themes/curie-sciences/header.php:17) в /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php на линии 980

Предупреждение : невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начался с /home/vhosts/science. curie.fr/www/wp-content/themes/curie-sciences/header.php:17) в /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php в строке 985

Предупреждение : невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начался в / home / vhosts / наука. curie.fr/www/wp-content/themes/curie-sciences/header.php:17) в /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php на линии 994
ошибка

Страница не найдена — Центр исследований института Кюри

Страница не найдена — Центр исследований института Кюри
Предупреждение : Невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начат в / home / vhosts / science.curie.fr / www / wp-content / themes / curie-Sciences / header.php: 17) в / home / vhosts / science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php в строке 977

Предупреждение : невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начался с /home/vhosts/science.curie.fr/www/ wp-content / themes / curie-Sciences / header.php: 17) в /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php в строке 978

Предупреждение : невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начался с /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-content/themes/curie-sciences/header.php:17) в /home/vhosts/science. curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php в строке 982

Предупреждение : невозможно изменить информацию заголовка — заголовки уже отправлены (вывод начался в / home / vhosts / наука.curie.fr/www/wp-content/themes/curie-sciences/header. php:17) в /home/vhosts/science.curie.fr/www/wp-includes/pluggable.php на линии 993

C11ORF24 — новый мембранный белок типа I, который циклически перемещается между аппаратом Гольджи и плазматической мембраной в Rab6 -Положительные пузырьки

Образец цитирования: Fraisier V, Kasri A, Miserey-Lenkei S, Sibarita JB, Nair D, Mayeux A, et al.(2013) C11ORF24 — это новый мембранный белок типа I, который циркулирует между аппаратом Гольджи и плазматической мембраной в Rab6-положительных везикулах. PLoS ONE 8 (12):
e82223.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223

Редактор: Стив Каплан, Медицинский центр Университета Небраски, Соединенные Штаты Америки

Получено: 30 июня 2013 г .; Одобрена: 21 октября 2013 г .; Опубликовано: 2 декабря 2013 г.

Авторские права: © 2013 Fraisier et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Институтом Кюри и CNRS. IP и AAH поддерживаются Седьмой рамочной программой ЕС (FP7 / 2007-2013) в рамках грантового соглашения 241548 (проект MitoSys), AD была поддержана долгосрочной стипендией HFSP (LT000029 / 2010-L).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Комплекс Гольджи играет центральную роль во многих функциях, необходимых для роста, гомеостаза и деления клеток. Он обрабатывает и сортирует белки и липиды, синтезируемые в эндоплазматическом ретикулуме, и связывает антероградные и ретроградные пути переноса.Функция Гольджи связана с ее уникальными ультраструктурными характеристиками.

Аппарат Гольджи состоит из стопок плоских цистерн. В клетках млекопитающих большое количество стопок соединяется латерально, образуя лентообразную структуру, близкую к центру организации микротрубочек [1,2]. Каждая стопка демонстрирует внутреннюю полярность: часть цис обменивается материалом с эндоплазматическим ретикулумом через промежуточный отсек, тогда как на другом конце транс-Гольджи, отделенный от цис -Гольджи медиальными цистернами, находится в контакте с транс- Сеть Гольджи (TGN).TGN отвечает за заключительные этапы сортировки, которые нацелены на несколько разных мест назначения, и обменивается материалом с эндоцитарными компартментами.

Как и все органеллы, аппарат Гольджи разделяется между двумя дочерними клетками во время митоза. Однако для аппарата Гольджи деление происходит путем полной дисперсии в материнской клетке перед митозом [3]. Рассеивание начинается в G2, когда аппарат Гольджи фрагментируется из-за разрыва ленты [4,5]. Недавняя работа связала фрагментацию аппарата Гольджи с развитием клеточного цикла.Действительно, клетки не вступают в митоз, если лента не разорвана [6]. Этот контроль был описан как «митотическая контрольная точка Гольджи». Однако сигнальные пути и / или механизмы, с помощью которых связаны фрагментация аппарата Гольджи и прогрессирование клеточного цикла, все еще неясны. Дальнейшие исследования белков Гольджи показали потенциальную связь между аппаратом Гольджи и митотическим аппаратом [6]. Два белка, участвующие в укладке цистерн Гольджи, GRASP65 (белок Golgi Reassembly 65 кДа) и GM130 (белок матрицы Гольджи 130 кДа), по-видимому, играют роль в правильном формировании митотического веретена [7]. С другой стороны, было показано, что несколько белков Гольджи играют прямую роль в регуляции клеточного цикла. Например, после нокдауна малой GTPase RAB6A ’с помощью RNAi активируется контрольная точка Mad2, что приводит к метафазному блоку [8]. Подробное изучение роли этих белков в развитии клеточного цикла только начинается. Таким образом, у нас есть лишь смутное представление о том, как функция и организация аппарата Гольджи связаны с развитием клеточного цикла.

Чтобы улучшить наши знания о роли аппарата Гольджи в регуляции клеточного цикла, мы объединили результаты двух недавних исследований.В первом сообщалось о скрининге РНК-опосредованной интерференции в масштабе генома в клетках HeLa, предназначенном для идентификации человеческих генов, важных для деления клеток [9]. Затем результаты этого скрининга были дополнительно изучены для идентификации белковых комплексов [10]. Используя генную маркировку зеленым флуоресцентным белком (GFP) на бактериальных искусственных хромосомах (BAC) в рамках проекта Mitocheck, все потенциальные попадания были локализованы в клетках HeLa. Интересно, что несколько белков, которые, как было установлено, играют роль в регуляции клеточного цикла, оказались локализованными на аппарате Гольджи.Среди них особенно привлекательным казался белок, функция которого была неизвестна, C11ORF24. Мы назвали этот белок C11ORF24. Мышь C11ORF24, помеченная GFP с помощью системы ВАС, была локализована на аппарате Гольджи [10].

Здесь мы охарактеризуем динамику и транспорт этого белка.

Результаты и обсуждение

C11ORF24 — трансмембранный белок типа I

Чтобы идентифицировать специфические домены C11ORF24, мы проанализировали последовательность белка.Ген C11ORF24 кодирует белок из 449 аминокислот. Поиски BLASTS, мотивов последовательности и гомологии привели нас к идентификации трех интересных доменов: сигнального пептида, трансмембранного домена и цитозольного хвоста. Предполагаемый сигнальный пептид был идентифицирован с помощью программного обеспечения для прогнозирования (http://bmbpcu36. leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html, рис. 1A, SP). Предполагаемый трансмембранный домен в C-концевой области был обнаружен с помощью программного обеспечения для прогнозирования HMMTOP [11,12] (рис. 1A, TM). Полная последовательность Homo Sapiens (Hs ) C11ORF24 была выровнена с его потенциальными гомологами в Mus musculus (Mm ) и Dano rerio ( Dr ) с использованием Clustal W2 [13,14] (Рисунок 1B).N-концевая часть белка мало похожа между разными видами. Однако область хвоста была высококонсервативной, что позволяет предположить, что она может играть важную роль в функции C11ORF24.

Рисунок 1. Последовательность C11ORF24.

(A) Предполагаемые домены C11ORF24. SP: сигнальный пептид, GFP: зеленый флуоресцентный белок, TM: трансмембранный домен, Tail: цитозольный хвост. Цифры указывают положение аминокислоты в нативном белке. Предполагаемый сигнальный пептид подчеркнут и окрашен в темно-красный цвет, а предполагаемый трансмембранный домен подчеркнут и окрашен в голубой цвет.Хвостовой домен имеет цветовую кодировку с использованием Clustal W2, чтобы подчеркнуть сходство между разными видами. Положение фрагмента, используемого для получения моноклонального антитела, обозначено черной полосой. (B) Homo sapiens (hs) C11ORF24 был сопоставлен с его предполагаемыми гомологами в Mus musculus (mm, NP_082353.1) и Dano rerio ( Dr , XP_690904.4) с использованием Clustal W2 [13,14] . Цитозольный хвостовой домен хорошо сохраняется в эволюции.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0082223.g001

C11ORF24 локализован на аппарате Гольджи и

trans -сети Гольджи

Чтобы исследовать локализацию человеческого C11ORF24, мы слили человеческую кДНК, кодирующую C11ORF24, с тегом GFP. Как и ожидалось из анализа последовательности, экспрессия слитого белка с GFP на N-конце была невозможна, и размещение GFP на C-конце значительно ухудшало экспрессию белка (данные не показаны). По этой причине мы вставили GFP после сигнального пептида (рис. 1А).C11ORF24, меченный GFP, экспрессировался в клетках HeLa в течение 18 часов. Клетки фиксировали и окрашивали иммунофлуоресценцией антителами против TGN-маркера TGN46 и цис--маркера Гольджи GM130. GFP-C11ORF24 явно локализован на аппарате Гольджи, близко расположен к двум маркерам Гольджи TGN46 и GM130 (Рисунок 2A). Чтобы оценить локализацию эндогенного белка, мы вывели моноклональные антитела у мышей. Специфичность этого антитела была подтверждена потерей иммунофлуоресцентного окрашивания после нокдауна C11ORF24 в клетках HeLa (фигура S1).Эксперименты по иммунофлуоресценции на клетках HeLa показали, что эндогенный белок был близко расположен к двум маркерам Гольджи Giantin и TGN46, что указывает на то, что нативный C11ORF24 локализован на аппарате Гольджи (рис. 2B, a). Кроме того, мы подтвердили, что C11ORF24 вел себя так же, как и другие белки Гольджи после обработки брефельдином А: после 5 минут обработки C11ORF24 присутствовал в пробирках, содержащих TGN46 (рис. S2, b), а при более длительной обработке белок присутствовал по всей клетке (рис. S2, в).C11ORF24 сильно локализован с маркером TGN TGN46, как показано на графике интенсивности флуоресценции вдоль линии, где C11ORF24 находится в зеленом цвете, а TGN46 — в красном (рис. 2B, a). С другой стороны, цис--маркер Гольджи Giantin был близко расположен, как показано синей линией на графике. Также интересно отметить, что окрашивание C11ORF24 было очень пунктированным.

Рисунок 2. C11ORF24 локализован в сети транс-Гольджи.

(A) Клетки HeLa трансфицировали конструкцией, кодирующей человеческий C11ORF24, меченный GFP, и фиксировали через 18 часов.Клетки были совместно окрашены TGN46 (средний, красный) и GM130 (правый, синий). Вторая линия представляет собой более близкий вид аппарата Гольджи, очерченного прямоугольником на объединенном изображении. (B) Клетки HeLa фиксировали и совместно окрашивали TGN46, C11ORF24 и Giantin. Колокализация очень сильна между TGN46 и C11ORF24 (столбец 4), тогда как у Giantin она ниже (столбец 5). Профили линий интенсивности флуоресценции C11ORF24 (зеленый), TGN46 (красный) и Giantin (синий) из линий на увеличенных изображениях показаны в столбце 7.Совместная локализация между TGN46 и C11ORF24 отчетливо видна на протяжении митоза (строки 2-5). (C) Клетки HeLa окрашивали на C11ORF24 и отображали с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения dSTORM. LUT огня использовался для облегчения визуализации. Увеличенный вид области левого изображения в рамке показан в середине, а увеличенный вид области в рамке среднего изображения показан справа.

Контур ячейки обведен красным.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0082223.g002

Поскольку было показано, что C11ORF24 участвует в развитии клеточного цикла [9], мы изучили локализацию эндогенного белка на протяжении митоза (рис. 2B, b-e). От профазы до анафазы (рис. 2B, bd), C11ORF24 присутствовал на небольших точечных структурах и хорошо локализовался с маркером TGN TGN46, тогда как он был тесно связан с маркером цис- Giantin (рис. 2B, bd и линейный график) . В телофазе, когда аппарат Гольджи формирует компактную структуру с обеих сторон ядра, C11ORF24 все еще обнаруживается на TGN, как показано совместной локализацией с TGN46 (Рис. 2B, e и линейный график).Чтобы более подробно охарактеризовать структуры, меченные антителом против C11ORF24, мы использовали метод оптической флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, микроскопию прямой стохастической оптической реконструкции (dSTORM) [15-17] (рис. 2C). Этот метод позволил нам визуализировать небольшие субдомены аппарата Гольджи, содержащие C11ORF24. Интересно, что TGN46 также присутствует на небольших точечных доменах (данные не показаны). Эти результаты предполагают, что C11ORF24 действительно присутствует в сети транс Гольджи и может быть отсортирован по конкретным субдоменам.

C11ORF24 имеет люминальный домен и небольшой цитозольный хвост

Анализ последовательности показал, что C11ORF24 имеет люминальный домен и короткий цитозольный хвост. Чтобы проверить правильность этой топологии, мы использовали модифицированную версию теста «Защита от флуоресцентной протеазы» [18]. Наша цель состояла в том, чтобы проверить, действительно ли домен C11ORF24 от N-конца до трансмембранного домена находится в просвете аппарата Гольджи. Мы воспользовались тем фактом, что и метка GFP, и эпитоп антитела против C11ORF24 были расположены в этой области (рис. 1A).Карикатура эксперимента показывает ожидаемые результаты (рис. 3А). В качестве контроля мы использовали GFP-меченную галактозилтрансферазу (GalT), поскольку известно, что GFP GalT находится в просвете аппарата Гольджи, и периферический белок аппарата Гольджи GM130. Иммунофлуоресценцию проводили либо без пермеабилизации (рис. 3А слева), либо после пермеабилизации сапонина (рис. 3А в середине) или после пермеабилизации дигитонина (рис. 3А справа). Чтобы гарантировать, что клетки не были проницаемыми в первом состоянии, мы выполнили иммунофлуоресцентное окрашивание перед фиксацией при 4 ° C.Без пермеабилизации ни одно из антител не должно быть в состоянии достичь своих мишеней на аппарате Гольджи (рис. 3A, слева: анти-GFP или анти-C11ORF24 зеленым, анти-GM130 красным). После сапониновой проницаемости все мембраны должны быть проницаемы, позволяя всем антителам связывать свои эпитопы (рис. 3A, в середине: GFP GalT или C11ORF24 и эпитоп против C11ORF24 показаны зеленой точкой внутри просвета аппарата Гольджи, эпитоп GM130 показан как красная точка вне аппарата Гольджи).После пермеабилизации дигитонина плазматическая мембрана должна стать проницаемой, чтобы антитела могли проникать в клетку, однако мембрана Гольджи не должна быть проницаемой, поэтому эпитопы, присутствующие в просвете, не должны быть доступны для антител (Рисунок 3A, справа: GFP GalT или C11ORF24 недоступны, тогда как GM130 доступен). Как и ожидалось, в контрольных клетках, экспрессирующих GFP-GalT, ни одно из антител не смогло достичь своих целей без пермеабилизации (рис. 3B, a), тогда как после пермеабилизации сапонина все антитела (анти-GFP и анти-GM130) нацелены на аппарат Гольджи ( Рисунок 3Б, б). После пермеабилизации дигитонина антитело против GFP не обнаруживало GFP GalT, поскольку оно было защищено интактной мембраной Гольджи. Однако антитело против GM130 обнаружило GM130, демонстрируя, что плазматическая мембрана была эффективно проницаема (фиг. 3B, c). В клетках, экспрессирующих GFP-C11ORF24, мы наблюдали такой же результат. Без пермеабилизации ни одно из антител не могло достичь аппарата Гольджи (Рисунок 3B, d), после пермеабилизации сапонина все антитела нацелены на аппарат Гольджи (Рисунок 3B, e), и после пермеабилизации дигитонина антитело против GFP не могло обнаружить GFP. C11ORF24, несмотря на то, что маркировка GM130 показывает, что плазматическая мембрана была правильно проницаема (фиг. 3B, f).Эти результаты продемонстрировали, что N-концевая часть GFP-C11ORF24 находилась в просвете аппарата Гольджи. Используя антитело против C11ORF24, мы получили тот же результат для эндогенного белка (рис. 3C). Мы пришли к выводу, что C11ORF24 имеет люминальный домен в аппарате Гольджи.

Рис. 3. C11ORF24 имеет длинный просветный домен и короткий цитозольный хвост.

(A) Рисунок клетки, экспрессирующей GFP-меченный GalT или C11ORF24 и окрашенный антителом против GFP и антителом против GM130.Когда клетки не проницаемы (слева), антитела не связываются со своими мишенями. После сапониновой проницаемости (в центре) все антитела способны достигать своих мишеней, поскольку все мембраны проницаемы. После пермеабилизации дигитонина (справа) метятся только цитозольные эпитопы (GM130), тогда как эпитопы просвета (GFP GalT или C11ORF24) защищены интактными мембранами Гольджи. Протокол модифицирован из [18] (B) Клетки HeLa, экспрессирующие GFP-GalT (ac) или GFP-C11ORF24 (df), были окрашены антителами GFP и GM130 до фиксации (a, d) или после фиксации и пермеабилизации сапонином (b, д) или после фиксации и пермеабилизации дигитонином (в, е).GFP C11ORF24 доступен для антитела против GFP только после пермеабилизации мембраны Гольджи. (C) Клетки HeLa, экспрессирующие GFP-GalT, окрашивали антителами GFP и C11ORF24 перед фиксацией (а) или после фиксации и пермеабилизации сапонином (б) или после фиксации и пермеабилизации дигитонином (в). Эпитоп антитела C11ORF24 доступен только после проницаемости мембраны Гольджи. (D) Клетки HeLa трансфицировали либо GFP-RAB6 (линия 1), либо GFP-C11ORF24 (линия 2) за 18 часов до инкубации с анти-GFP, и интернализацию проводили при 37 ° C в течение 90 минут.Затем клетки фиксировали и окрашивали вторичным антителом, и локализацию антитела против GFP сравнивали с сигналом GFP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.g003

Чтобы продолжить анализ динамики C11ORF24 в мембране Гольджи, мы выполнили восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) на клетках, экспрессирующих GFP-tagged C11ORF24 или GFP-GalT в качестве контроля (рис. 4A показывает один пример). Небольшая (3,5 мкм) область аппарата Гольджи (рис. 4А, красный кружок) была фотообесцвечена, и восстановление флуоресценции было зарегистрировано в течение 2 минут в той же области.Изображения были скорректированы на обесцвечивание фотографий из-за получения, и интенсивности были нормализованы.

Рисунок 4. C11ORF24 представляет собой трансмембранный белок.

(A) Клетки HeLa, экспрессирующие GFP-C11ORF24 (линия 1) или GFP-GalT (линия 2), отбеливали в круговой области 3,5 мкм аппарата Гольджи (красный кружок), а затем отображали в течение 2 минут с помощью микроскопии с вращающимся диском. . Восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания измеряли в 3 независимых экспериментах и наносили на график для GFP-GalT (красный, n = 18 клеток) и GFP-C11ORF24 (черный, n = 22 клетки).Планки погрешностей указывают стандартное отклонение. Восстановление было одинаковым для двух белков.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.g004

Результаты трех независимых экспериментов показаны на графике (Рисунок 4B, GFP-C11ORF24 черным цветом и GFP-GalT красным). Динамика C11ORF24 в мембране Гольджи была подобна той, что наблюдалась для трансмембранного белка GalT в этом исследовании и в предыдущих исследованиях с использованием других трансмембранных ферментов Гольджи [19,20]. Более того, эта динамика была медленной по сравнению с динамикой периферических белков аппарата Гольджи, также наблюдаемой при фотообесцвечивании [21-23]. Эти результаты согласуются с анализом последовательности и позволяют предположить, что C11ORF24 является трансмембранным белком аппарата Гольджи.

Пул C11ORF24 присутствует на плазматической мембране и в эндосомах

Чтобы понять механизм, контролирующий локализацию C11ORF24 на аппарате Гольджи, мы использовали анализ для нарушения градиента pH через мембраны органелл, как описано ранее [24].Этот анализ основан на том факте, что интегральный мембранный белок Гольджи GOLIM4 локализуется на аппарате Гольджи в устойчивом состоянии, но циклически перемещается к плазматической мембране и транспортируется обратно через эндосомы [24-26]. После обработки монензином GOLIM4 блокируется в эндосомах. Клетки обрабатывали монензином в присутствии циклогексимида в течение 1 часа и локализацию C11ORF24 сравнивали с маркером Гольджи GM130. Без обработки монензином C11ORF24 локализовался на аппарате Гольджи (фигура S2B, монензин 0 мин), тогда как после 1 часа обработки локализация Гольджи была потеряна, и C11ORF24 присутствовал на точечных структурах (фигура S2B, монензин 60 минут).Эти результаты предполагают, что C11ORF24 транспортируется к плазматической мембране и рециркулирует через эндосомы, как в случае GOLIM4 и TGN46 [24].

Поскольку пул C11ORF24 присутствует на плазматической мембране (рис. S2B), его N-концевой домен должен экспонироваться на поверхности клетки. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели анализ интернализации антител. Клетки, экспрессирующие либо GFP-RAB6 в качестве белка отрицательного контроля, который не присутствует на клеточной поверхности, либо GFP-C11ORF24, инкубировали с антителом против GFP и наблюдали интернализацию при 37 ° C в течение 0, 15, 90 и 240 минут (рис. 3D и рисунок S3).Как показано на фиг. 3 и, как и ожидалось, в случае GFP-RAB6 антитело против GFP не интернализовалось (фигура 3D и фигура S3, GFP-RAB6). Напротив, для GFP-C11ORF24 антитело против GFP было интернализовано. Действительно, антитело сначала было связано с плазматической мембраной (фиг. S3, 0 мин), затем интернализовалось в эндосомы (фиг. S3, 15 мин.) И, наконец, транспортировалось в аппарат Гольджи (фиг. 3, 90 мин. И фиг. S3, 240 мин.). Таким образом, эти результаты подтвердили, что C11ORF24 присутствует на плазматической мембране и что его N-концевой домен находится на поверхности клетки.

Интересно отметить, что интернализация эндогенного белка не была видна (данные не показаны). Это может быть связано с очень низким уровнем экспрессии белка: если на плазматической мембране присутствует только небольшая часть белка, антитело, зафиксированное на плазматической мембране, не будет обнаружено. Локализация C11ORF24 на плазматической мембране не была следствием присутствия GFP-метки, поскольку аналогичные результаты были получены с немеченой версией белка (данные не показаны), а также не из-за сверхэкспрессии белка, поскольку клетки, используемые в эти анализы показывают очень низкий уровень экспрессии.

C11ORF24 присутствует на положительных транспортных носителях RAB6

Для исследования динамики C11ORF24 мы отслеживали локализацию GFP-меченного C11ORF24 в клетках HeLa с помощью конфокальной микроскопии с вращающимся диском (рис. 5А). GFP-C11ORF24 присутствовал на аппарате Гольджи и на транспортных носителях, таких как тубуло-везикулярные структуры (рис. 5A, красная стрелка a и b) и трубках (рис. 5A, зеленая стрелка a и c). Эти структуры очень динамичны во времени (рис. 5A, время от 0 до 5 секунд и фильм S1).Локализация и динамика C11ORF24 отражают таковую GFP-tagged RAB6A [27]. RAB6, один из наиболее консервативных белков RAB в эволюции, локализуется на мембранах аппарата Гольджи и транс- сети Гольджи [28,29]. Несколько исследований из нашей лаборатории и других показали, что RAB6 регулирует различные пути переноса как в антероградном, так и в ретроградном путях на уровне аппарата Гольджи и TGN [30-34].

Рис. 5. C11ORF24 присутствует на положительных транспортных носителях RAB6.

(A) Клетки HeLa, экспрессирующие GFP-C11ORF24, отображали каждую секунду в течение 5 минут с помощью микроскопии с вращающимся диском. Красная стрелка указывает на небольшой транспортный носитель, а зеленая стрелка указывает на длинную трубку, подключенную к аппарату Гольджи. Увеличенное изображение этих структур показано в строках 2 и 3. (B) Клетки HeLa фиксировали и совместно окрашивали TGN46, C11ORF24 и GTP-RAB6. Совместная локализация очень сильна между TGN46, C11ORF24 и GTP-RAB6. Профиль линий интенсивности флуоресценции C11ORF24 (зеленый), TGN46 (красный) и GTP-RAB6 (синий) из линий на увеличенных изображениях показан в столбце 7.(C) Клетки HeLa, экспрессирующие GFP-C11ORF24 и mCherry-RAB6, отображали каждую секунду в течение 5 минут с помощью микроскопии с вращающимся диском. Стрелка указывает на транспортный носитель, положительный для GFP-C11ORF24 (зеленый) и mCherry-RAB6 (красный). Увеличенный вид этой структуры показан строками 4-6. (D) Транспортные носители были визуализированы с помощью кимографа, который был сделан вдоль линии, проведенной на объединенном изображении. Все динамические элементы, положительные для GFP-C11ORF24 (слева и объединенный зеленый), были положительными для mCherry-RAB6 (средний и объединенный красный).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.g005

Чтобы определить, присутствует ли C11ORF24 на RAB6-положительных структурах, мы пометили клетки HeLa антителами против C11ORF24, TGN46 и GTP-RAB6 (рис. 5B). . C11ORF24 совместно локализован с RAB6, как показано на увеличенном изображении аппарата Гольджи и на профиле линии интенсивности флуоресценции C11ORF24, TGN46 и RAB6. Поэтому мы проверили, локализуются ли два белка на одних и тех же транспортных носителях.Клетки HeLa, экспрессирующие как GFP-C11ORF24, так и mCherry-RAB6A, отслеживали с помощью микроскопии с вращающимся диском (фигура 5C, время от 0 до 6 секунд слева направо и фильм S2). Мы обнаружили, что RAB6 присутствует на всех динамических позитивных структурах C11ORF24. Один из примеров показан на увеличенном изображении транспортного носителя, обозначенного стрелкой (рис. 5C, линии e-f). Совместная локализация также была четко видна на кимографе (рис. 5D), соответствующем линии, проведенной на верхнем изображении. Все динамические структуры, положительные для C11ORF24 (слева), также были положительными для RAB6 (в центре).

Эти результаты предполагают, что C11ORF24 может либо участвовать в RAB6-зависимом транспорте, либо C11ORF24 может транспортироваться через RAB6-положительные носители.

C11ORF24 не требуется для перевозки классических грузов пути RAB6

Чтобы определить, играет ли C11ORF24 роль в RAB6-зависимом транспорте, мы проследили динамику RAB6 после нокдауна C11ORF24. Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие индуцибельный контроль или кшРНК C11ORF24, обрабатывали в течение 48 часов доксициклином для получения полного нокдауна C11ORF24.Затем клетки трансфицировали GFP-RAB6 и наблюдали с помощью микроскопии с вращающимся диском (фиг. 6A, фильм S3 для контрольной кшРНК и фильм S4 для кшРНК C11ORF24). Как в контрольных, так и в нокдаун клетках мы наблюдали RAB6-положительные транспортные носители, перемещающиеся по клетке. Затем количество и скорость транспортных носителей определяли количественно в контроле и в клетках с нокдауном C11ORF24 (рис. 6В). После обработки shRNA количество и распределение транспортных носителей RAB6 не изменилось. Мы наблюдали лишь небольшое увеличение скорости транспортных средств RAB6.Мы пришли к выводу, что C11ORF24 не играет никакой роли в формировании и перемещении транспортных носителей RAB6.

Рисунок 6. C11ORF24 не является необходимым для образования положительных транспортных носителей RAB6.

(A) После 48 часов нокдауна shRNA клетки HeLa трансфицировали GFP-RAB6, и на следующий день их визуализировали каждую секунду в течение 30 секунд с помощью микроскопии с вращающимся диском. Снимки из фильмов S1 и S2 представлены для контрольной кшРНК (верхние строки) по сравнению с кшРНК C11ORF24 (нижние строки).(B) Количество положительного транспортного носителя RAB6 на клетку и скорость этих носителей затем определяли количественно для обоих обработок из 3 независимых экспериментов и выражали как процент от контроля. Количество клеток указано для каждого лечения на графиках (n). Планки погрешностей представляют собой SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.g006

Затем мы проверили, нужен ли C11ORF24 для зависимой от RAB6 перевозки нескольких грузов. После 48-часового нокдауна C11ORF24 клетки инкубировали в течение 1 часа с фрагментом токсина B Shiga, связанным с Alexa488 (STxB), при 4 ° C.После смены среды клетки переносили на 37 ° C и фиксировали через 0, 15, 90 или 240 минут. Затем в каждый момент времени отслеживали локализацию STxB. Не наблюдали разницы между клетками, обработанными контролем или кшРНК C11ORF24 (фиг. S4A). Эти результаты предполагают, что C11ORF24 не участвует в интернализации токсина шига. Мы также протестировали влияние нокдауна C11ORF24 на секрецию ^tsO45 VSVG. Мы проследили секрецию GFP-^tsO45 VSVG в клетках, истощенных по C11ORF24, по сравнению с контрольной кшРНК.Клетки инкубировали в течение ночи при 40 ° C, чтобы сохранить ^tsO45 VSVG в эндоплазматическом ретикулуме, и секрецию оценивали через 0, 30, 120 минут при 32 ° C. Никаких дефектов секреции ^tsO45 VSVG не наблюдалось (рисунок S4B). Эти данные свидетельствуют о том, что C11ORF24 не требуется для функции RAB6 и вместо этого может транспортироваться через RAB6-положительные носители. Однако мы не можем исключить другую возможность, а именно, что C11ORF24 может быть задействован в другом маршруте трафика, который мы не тестировали.

C11ORF24 не участвует в регуляции клеточного цикла

Поскольку было высказано предположение, что C11ORF24 участвует в регуляции клеточного цикла [9], мы изучили влияние нокдауна C11ORF24 на митоз. Нокдаун был достигнут аналогично тому, что было описано в транспортном анализе. Затем клетки наблюдали в течение 3 дней с использованием фазового контраста на видеомикроскопе (рис. S5A). Представительные изображения показаны для контрольной кшРНК и для кшРНК C11ORF24 в первый момент времени (t = 0) и через 2 дня наблюдения (t = 48 ч).Пролиферацию количественно оценивали для двух клеточных линий (фигура S4B, 48h пролиферация). Количество клеток увеличивается примерно в 4 раза за 48 часов независимо от нокдауна C11ORF24. Чтобы определить, была ли задержка на конкретном этапе митоза, клетки фиксировали и окрашивали с использованием антител к фосфогистонам для визуализации ранних этапов митоза и DAPI для визуализации ДНК. Количество клеток, положительных по P-гистону (Рисунок S5B, P-гистон), клеток в метафазе (Рисунок S5B, Метафаза) или в анафазе (Рисунок S5B, Анафаза) было количественно определено в двух клеточных линиях.Мы наблюдали, что около 4% клеток были положительными по Р-гистону, около 2,5% находились в метафазе и около 0,5% находились в анафазе. Не наблюдалось существенной разницы между контрольными клетками и клетками, в которых был сбит C11ORF24. Нам не удалось воспроизвести митотический фенотип, описанный в полногеномном скрининге на основе esiRNA [9] (Рисунок S5). Этот фенотип может быть результатом нецелевого эффекта esiRNA, поскольку он не спасается экспрессией esiRNA-устойчивой конструкции C11ORF24.Другая возможность заключается в том, что наш нокдаун был недостаточно эффективным. Антитело против C11ORF24 не обнаружило каких-либо специфических полос с помощью вестерн-блоттинга, и поэтому мы не могли использовать этот метод для количественной оценки эффективности нашего нокдауна. Однако с помощью иммунофлуоресценции мы наблюдали полную потерю сигнала C11ORF24 на аппарате Гольджи. Следовательно, вероятно, что C11ORF24 не играет ключевой роли в митозе.

В заключение мы сообщаем, что человеческий C11ORF24 локализован на TGN и на транспортных носителях, положительных по RAB6, хотя C11ORF24 не участвует в RAB6-зависимом транспорте. Мы также показали, что C11ORF24 имеет сигнальный пептид и является трансмембранным белком типа I с люминальным доменом и коротким цитозольным хвостом, который хорошо сохраняется в эволюции, но что C11ORF24, по-видимому, не играет роли в митотической контрольной точке Гольджи.

Материалы и методы

Конструкция GFP-C11ORF24

кДНК C11ORF24 человека была получена от Origene (№: SC122931 Homo sapiens, хромосома 11, открытая рамка считывания 24 ДНК, NM_022338.2). Полноразмерную кДНК амплифицировали с использованием праймеров FL_for, 5’CGTATCGCTAGCATGTGGACAGCTCTTGTG и FL_rev, 5’GTGGCGACCGGTGGCATTTCTGAGTCCGCATA и C11ORF24 были вставлены в сайты clontech-вектора NEGFPI pEGFPI и C11ORF24 (NEGFPI24).Последовательность кДНК, лишенная сигнального пептида, затем была амплифицирована с использованием праймеров noSP_for, 5’TCAGTCTGTACAGCGCATCCAACGATCCACGC и noSP_rev, 5’GTCGAGGATCCTCACATTTCTGAGTCCGCATA, и этот фрагмент был вставлен в вектор клонтеха pEGOR-I-pEGFP-11-pEGFP-11-pEGFP-11-pEGFP-11-pEGFP-11-pEGFP-11-pEGFP-11. Сигнальный пептид был амплифицирован с помощью ПЦР из pEGFP-N1-C11ORF24 с использованием праймеров SP-for, 5’TGTATCATATGCCAAGTACGC и SP_rev, 5’TAGCTAACCGGTCCCGCATGGCTTTCAGATAAGG и вставлен перед GFP в сайтах pEGFP-C1ORI-no24 (pEGFP-C1-C11ORF24).Конструкции shRNA в индуцибельной лентивирусной системе pTRIPZ были получены от Openbiosystem для контрольной не подавляющей shRNA (# RHS4743) и C11ORF24 shRNA (# RHS4696-200755138, Mature Sense for V3THS_341691 TGGAAACAGTTGATAATAA).

Культура клеток, трансфекция и линии клеток

клеток HeLa выращивали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки при 37 ° C в инкубаторе с увлажнением с 5% CO2. Для экспрессии GFP-C11ORF24 клетки HeLa, выращенные в 6-луночных планшетах, трансфицировали с использованием Xtrem9 (Roche), следуя инструкциям производителя за 18 часов до наблюдения.Для нокдауна C11ORF24 лентивирусные векторы, кодирующие различные shРНК (контроль или C11ORF24), были получены путем котрансфекции плазмиды VSV-G и упаковывающей плазмиды psPax2 в клетках 293T [36], а клетки HeLa трансдуцировались супернатантом из этих клеток. Нокдаун был завершен после индукции экспрессии shРНК в течение 48 часов обработкой доксициклином (1 мкг / мл). Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие GFP-tagged GalT, были созданы в рамках проекта BAC TransgeneOmics и описаны ранее [37].

Иммунофлуоресценция

Клетки фиксировали либо 100% метанолом при -20 ° C в течение 4 минут, либо 3% параформальдегидом (PFA) при комнатной температуре в течение 30 минут, промывали PBS, инкубировали с PBS-0,1 M Nh5Cl в течение 5 минут, снова промывали PBS и проницаемость 0,05% сапонина в течение 20 мин. Первичные антитела: анти-Giantin hFc TA10 1/50, овечьи анти-TGN46 (AbD Serotec, 1/1000), мышиные анти-GFP (Roche, 1/400), мышиные анти-GM130 (Transduction Laboratories, 1/1000), DAPI 1/1000. Антитело против C11ORF24 было продуцировано у мышей.Длинный растворимый фрагмент белка (рис. 1А), помеченный глутатион-S-трансферазой (GST), был экспрессирован в бактериях и очищен. Затем этот фрагмент вводили мышам, и антитела, полученные из клеточных супернатантов, очищали против версии того же фрагмента белка, меченной мальтозосвязывающим белком (МВР). После выбора лучшей гибридомы ее отправляли на секвенирование в SydLabs (http://www.sydlabs.com/), и тяжелые и легкие цепи были субклонированы и слиты с человеческим Fc, как описано ранее [38].Вторичные антитела: против Cy3 человека, против Cy3 мыши, против Alexa488 мыши, Cy5 против овцы, против Alexa647 мыши (лаборатории Джексона, 1/400). Фиксированные клетки визуализировали с помощью вертикального микроскопа Nikon Eclipse 80i с камерой CoolSnapHQ2 (фотометрия, 100-кратный объектив CFI Plan Apo VC NA 1,4 WD 0,13 DIC Oil для получения 3D-изображений) или с помощью Leica DMRA и камеры CoolSnapHQ2, 100-кратный объектив NA 1,25, масло pH 3 CS (HCX PL APO) и Metamorph. Были получены 3D-стеки и деконволюция для построения проекции на одну плоскость Метаморфа.Профили линий интенсивности флуоресценции были сделаны с использованием Fiji (http://fiji.sc/), а кимографы были сделаны с использованием плагина Kymograph (http://www. embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html).

Микроскопия прямой стохастической оптической реконструкции (dSTORM)

Образцы

получали изображения при комнатной температуре в закрытой камере (Ludin Chamber, Life Imaging Services, Швейцария), установленной на инвертированном моторизованном микроскопе (Nikon Ti, Япония), оснащенном объективом 100X 1.45NA PL-APO и системой идеальной фокусировки, позволяющей длительное получение в режиме косого освещения (Roper, Франция).Визуализацию проводили во внеклеточном растворе, содержащем восстановительную и кислородопоглощающую системы, в соответствии с протоколом dSTORM [15-17]. В начале эксперимента ансамблевую флуоресценцию Alexa Fluor 647 сначала преобразовали в темное состояние с помощью лазера 640 нм (Coherent, США) с интенсивностью 30-50 кВт / см ². После того, как ансамблевая флуоресценция была преобразована в желаемую плотность одиночных молекул на кадр, мощность лазера была уменьшена до 7-15 кВт / см ² и изображение непрерывно отображалось со скоростью 20 кадров в секунду (время экспозиции 50 мс) в течение 20 000 кадров.Количество одиночных молекул, детектируемых на кадр, контролировали с помощью лазера с длиной волны 405 нм (Omicron, Германия). Мощность лазера была отрегулирована для поддержания определенного уровня стохастически активированных молекул, которые были хорошо разделены во время сбора данных. Флуоресценция как ансамбля, так и отдельной молекулы была собрана с помощью комбинации дихроичного и эмиссионного фильтра (D101-R561 и F39-617 соответственно, Chroma, США и четырехполосного дихроичного фильтра (Di01-R405 / 488/561/635, Semrock, США) .Флуоресценцию регистрировали с помощью чувствительной EM-CCD 512×512 (Evolve, Photometric, США).Для 3D-локализации использовался астигматический объектив N-STORM (Nikon), расположенный перед камерой CCD. Локализация и реконструкция одной молекулы выполнялись в режиме онлайн с использованием автоматического управления с обратной связью на лазерах, что обеспечивает оптимальную плотность молекул во время сбора данных [39,40]. Последовательность сбора данных управлялась программным обеспечением Metamorph (Molecular Devices, США) в потоковом режиме с использованием области, равной или менее 256×256 пикселей в качестве области интереса. Мы использовали многоцветные флуоресцентные микрошарики (Tetraspeck, Invitrogen) для регистрации долговременных снимков и корректировки боковых дрейфов и хроматических сдвигов.Пространственное разрешение 14 нм было измерено с использованием определения центроида на бусинах Tetraspeck 100 нм, полученных с таким же отношением сигнал / шум, как изображения одиночных молекул.

Топология C11ORF24

Для иммунофлуоресценции без пермеабилизации клетки инкубировали с антителом при 4 ° C, затем фиксировали добавлением 3% параформальдегида в среду и окрашивали вторичным антителом в PBS. Для обработки клеток сапонином применяли процессы, как описано ранее в разделе иммунофлуоресценции.Наконец, для обработки дигитонином клетки фиксировали и повышали проницаемость с использованием 0,8 мкМ дигитонина в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем иммунофлуоресценцию проводили в присутствии 0,8 мкМ дигитонина.

Интернализация антител

клеток HeLa трансфицировали GFP-RAB6 или GFP-C11ORF24 с использованием Xtrem9 (Roche), следуя инструкциям производителя за 18 часов до наблюдения. Затем клетки инкубировали при 4 ° C с анти-GFP (Roche, 1/400) в течение 1 часа. Через 0, 15, 90, 240 минут инкубации при 37 ° C клетки обрабатывали для иммунофлуоресценции.

Медикаментозное лечение

Лечение брефедлином А выполняли, как описано ранее [41]. Кратковременно клетки инкубировали с лекарством в течение 0, 5, 60 минут при 37 ° C и обрабатывали для иммунофлуоресценции.

Лечение монензином выполняли, как описано ранее [24]. Клетки обрабатывали циклогексимидом в течение 30 минут, а затем инкубировали с монензином в течение 0 или 60 минут, а затем обрабатывали для иммунофлуоресценции.

Ретроградный транспорт STxB

Ретроградный транспорт меченного Alexa488 STxB в эндоплазматический ретикулум выполняли, как описано ранее [42], через 48 часов индукции shRNA.Клетки HeLa инкубировали с Alexa488-STxB в течение 1 часа при 4 ° C. После смены среды клетки переносили при 37 ° C в течение 15, 90 или 240 минут. Затем клетки фиксировали и обрабатывали для иммунофлуоресценции.

Секреция

^цО45 ВСВГ

Секрецию GFP-^tsO45 VSVG из эндоплазматического ретикулума в плазматическую мембрану проводили, как описано ранее [43]. После 48 часов индукции shRNA клетки трансфицировали GFP-^tsO45 VSVG с использованием Xtrem9 (Roche), следуя инструкциям производителя за 24 часа до наблюдения.Клетки инкубировали в течение ночи при 40 ° C для удержания белка в эндопламатическом ретикулуме, а затем переключали на 32 ° C на 0, 30, 120 минут для отслеживания секреции.

Визуализация живых клеток

Для GFP-C11ORF24 или GFP-C11ORF24 с фильмами mCherry-RAB6A или GFP-RAB6 после 48-часовой индукции shRNA, клетки HeLa, культивированные в чашках для культивирования клеток Fluorodish со стеклянным дном (World Precision Instruments), трансфицировали с использованием Xtrem9 (Roche) после инструкции производителя за 18 часов до наблюдения.Изображения получены на вращающемся дисковом микроскопе. Микроскоп с вращающимся диском основан на головке CSU-X1 Yokogawa, установленной на перевернутом микроскопе Ti-E Nikon, оснащенном моторизованным предметным столиком XY. Изображения были получены с помощью объектива Plan-Apo x100 1,4NA с камерой Photometrics Coolsnap HQ2 CCD. Оптическое сечение производилось с помощью пьезоэлемента (Mad City Lab). Лазерная гостиная Roper / Errol оснащена лазерными диодами с длиной волны 491 и 561 нм, каждый мощностью 50 мВт, соединенными с головкой вращающегося диска через одно волокно.Многомерные записи выполняются в потоковом режиме с использованием программного обеспечения Metamorph 7.7.6. Изображения собираются каждую секунду (экспозиция 500 мсек). Данные, показанные в фильмах, получены с использованием ND-SAFIR (N-мерная адаптивная фильтрация структуры для восстановления изображения) # INRIA / INRA 2007, как описано ранее [44] [45]. Количество и скорость транспортных носителей RAB6 измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ.

Для анализа FRAP с использованием GFP-GalT, GFP-C11ORF24 клетки HeLa поддерживали в культуральной среде в чашках для культивирования клеток Fluorodish со стеклянным дном и отображали на аналогичном микроскопе с вращающимся диском, оборудованном головкой FRAP (Errol and Roper), через 18 часов после трансфекции.Изображения собирали перед обесцвечиванием области 3,5 мкм аппарата Гольджи, а после фотообесцвечивания изображения получали каждые 500 мс в течение 5 секунд и каждые 2 секунды в течение 2 минут. Изображения обрабатывались с помощью программы Metamorph. После коррекции обесцвечивания фото из-за получения фон был удален. Затем интенсивность флуоресценции нормализовали и наносили на график.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Специфичность антител и эффективность shРНК.
Клетки HeLa временно трансфицировали индуцибельным контролем или кшРНК C11ORF24 и обрабатывали доксициклином для индукции экспрессии кшРНК. После 48 часов индукции клетки фиксировали и окрашивали антителом против C11ORF24.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Локализация C11ORF24 после лечения Брефельдином А.
(A) Клетки HeLa были либо необработанными (контроль), обработанными брефельдином A в течение 5 минут или обработанными брефельдином A в течение 60 минут.Затем клетки фиксировали и окрашивали антителами против C11ORF24 (зеленый) и против TGN46 (красный). (B) Клетки HeLa обрабатывали циклогексимидом, а затем либо непосредственно (монензин 0 мин), либо обрабатывали монензином в течение 60 минут. Затем клетки фиксировали и окрашивали антителами против C11ORF24 (зеленый) и против GM130 (красный).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.s002

(TIF)

Рисунок S3.

C11ORF24 присутствует на плазматической мембране и интернализуется.
Клетки HeLa трансфицировали либо GFP-RAB6 (левая панель), либо GFP-C11ORF24 (правая панель) за 18 часов до инкубации с антителом против GFP, и интернализацию проводили при 37 ° C в течение 0, 15 и 240 минут. Затем клетки фиксировали и окрашивали вторичным антителом, и локализацию антитела против GFP (красный) сравнивали с сигналом GFP (зеленый).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.s003

(TIF)

Рисунок S4.

C11ORF24 не требуется для перевозки классических грузов пути RAB6.
(A) Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие либо индуцибельную контрольную shRNA, либо shRNA против C11ORF24, обрабатывали доксициклином в течение 48 часов для индукции экспрессии shRNA и RFP. Затем клетки инкубировали с STxB-488 в течение одного часа при 4 ° C. Затем проводили интернализацию при 37 ° C в течение указанного времени. Наконец, клетки фиксировали и окрашивали антителом против C11ORF24, и наблюдали локализацию STxB-488 с течением времени. (B) После 48 часов нокдауна клетки трансфицировали GFP-^tsO45 VSVG и инкубировали в течение ночи при 40 ° C для удержания белка в эндопламатическом ретикулуме, а затем переключали на 32 ° C на 0, 30, 120 минут, чтобы следить за секреция.Затем клетки фиксировали и окрашивали антителом против VSVG без пермеабилизации для специфического обнаружения прибытия белка на плазматическую мембрану.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.s004

(TIF)

Рисунок S5.

C11ORF24 не является необходимым для развития клеточного цикла.
Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие индуцибельную контрольную shRNA или shRNA против C11ORF24, обрабатывали доксициклином в течение 48 часов для индукции экспрессии shRNA и RFP.A) Затем клетки высевали на камеры для микроскопии в присутствии доксициклина и наблюдали каждые 10 минут в течение 3 дней по фазовому контрасту. Показан моментальный снимок поля одного представителя, а количественная оценка показана на B. B) Клетки фиксировали и окрашивали фосфогистоновыми антителами (график P-гистонов), DAPI для обнаружения ДНК (графики метафаз и анафаз) или подсчитано во время просмотра фильма, показанного на A (48-часовой график распространения).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.s005

(TIF)

Фильм S1.

GFP-C11ORF24 динамик.
Клетки HeLa, экспрессирующие GFP-C11ORF24, отображали каждую секунду в течение 5 минут с помощью микроскопии с вращающимся диском. Видны небольшой транспортный носитель и длинные трубки, подключенные к аппарату Гольджи или не подключенные по периферии клетки. Кадры из фильма представлены на рисунке 5A.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082223.s006

(MOV)

(PDF) Компактный и надежный генератор импульсов, использующий двойную ИС с таймером 555 для создания метода ШИМ

Компактный и надежный генератор импульсов, использующий ИС со сдвоенным 555-таймером

для создания метода ШИМ

1XU) DL] DO .DVUL

, QVWLWXW9ROWDQGDQ $ UXV7LQJJL, 9 $ 7

8QLYHUVLWL7HNQRORJL0DOD \ VLD

6NXGDL0DOD16 \ VLD XWPP \ 

0RKDPHG $ IHQGL0RKDPHG3LDK

, QVWLWXW9ROWDQGDQ $ UXV7LQJJL, 9 $ 7

8QLYHL9VLWL7 0DOD \ VLD

IHQGL # XWPP \



Резюме. Одним из отличительных нетепловых методов обработки пищевых продуктов. генератор импульсов, источник высокого напряжения, камера обработки

и система управления.Чтобы повысить скорость инактивации

микроорганизмов, генератор импульсов должен выдавать точный

и устойчивый импульсный сигнал. В связи с этим спросом, необходимо реализовать идею модернизации существующего генератора импульсов

. Таким образом,

в этой статье предлагает методику генерации точного и устойчивого прямоугольного импульсного сигнала

с использованием комбинации двух блоков 555-

таймера IC. Целью использования двойной ИС является получение метода широтно-импульсной модуляции

(ШИМ), рабочий цикл которого и частота

могут быть изменены независимо.Результат моделирования показывает параллельное понимание

с целью, где рабочий цикл составляет

, успешно скорректированный с 10% до 90% полного цикла без влияния

на его частоту. Изменение достигается настройкой значения

переменного резистора. Кроме того, частота изменяется

с выбранным значением в диапазоне от Гц до МГц, просто чтобы показать, что микросхема таймера 555-

может обеспечивать различные уровни частоты. Частота

может быть определена путем выбора правильного номинала резистора и конденсатора

в схемотехнической системе.Следовательно, этот генератор импульсов

может быть использован для управления переключающим устройством, таким как MOSFET и

IGBT, для получения точных и устойчивых высоковольтных импульсов

, которые создают импульсное электрическое поле высокой интенсивности, таким образом эффективно убивая бактерии

Ключевые слова: система очистки ПЭФ; нетепловой метод; пищевая

переработка; генератор импульсов; комбинация микросхемы таймера 555; квадратный

импульсный сигнал

, 



1752’8 и 7,21



1RZDGD \ V WKHUH DUH VH YHUDO ZD \ V WR WUHDWLXGGH  IRRG

WKDWKDVEHHQGLVFRYHUHGHLWKHUE \ XVLQJFRQYHQWLRQDOWKHUPDO

WHFKQLTXHRUQRQHWKHUPDO (

)

WHFKQLTXHRUQRQHWKHUPDO >   @ : KHQ FR PSDULQJ ERWK WHFKQLTXHV 3 ()  LV PRUH

VXSHULRUWKDQ WKHWUDGLWLRQDO SUDFWLFH DV LW LV QRWM  NLOOVWKH

SDWKRJHQ DQG VSRLODJH EDFWHULD EXW LQWURGXFH PLQLPDO

GHWULPHQWDOHIIHFWWRZDUGVSK 7KXVWKHWUHDWHGIRRGLVFRQVLGHUHGIUHVKDQGKLJKTXDOLW \ WKDW

EHQHILW RXU KHDOWK% \  UHIHUUULQJWHIHUFWLWHQWHQWHQWHQWHQWHWHRWHWHWHWHQWHWHQWHWHQWHWWHQWHWHWHQWHWHWHWHWHWHWHWHWHWHVV

PDLQIDFWRUWRGULYHWKHLQQRYDWLRQRIWKHSXOVHJHQHUDWRUVRLW

FDQ FRSH ZLWK WRGD \ ¶V GHPDQHLD QGQD J

LWV HIILFLHQF \  WR LQDFWLYDWH PLFURRUJDQLVP WKDW MHRSDUGLVH RXU

KHDOWK 3 ()  WUHDWPHQW WHFKQRORJ \  LV EDVLFDOO \  DQ DSSOLFDWLRQ RI

VKRUW SXOVHV RI HOHFWULFLW \  WR D SURGXFW KRXVHG RU IORZLQJ

EHWZHHQWZRHOHFWURGHV>  @ 7 \ SLFDOFWURGHV  LQ DVLQJOH V \ VWHPDUHSXOVH JHQHUDWRU KLJKYROWDJH

VXSSO \ WUHDWPHQWFKDPEHUDQGPRQLWRULQJGHYLFH16 9XYLFH16 JHQHUDWRU SURYLGHV SXOVH YROWDJH HLWKHU LQ WKH IRUP RI

H [SRQHQWLDO GHFD \ LQJ RU VTXDUH ZKLFK XVXHDOOV 9000 EHWFK XVXHDOOV 9 EHWFK 9000 EHWF 9000 EHWFK >  @ , WFDQEHHLWKHULQPRQRSRODURUELSRODU

IDVKLRQ 7KH GXUDWLRQ IRU HDFK SXOVH WKDW KDV EHHQ WHVWHG 9 W \ SLFDOO \  IURP PLOOLVHFRQG WR PLFURVHFRQG EXW WKHUH LV DQ

LPSOHPHQWDWLRQ RI QDQRVHFRQG SXOVH ZLGWH9K UVWKD

RUWHGUHFHQWO \ >  @ 

7KH DGYDQFHPHQW LQ VHPLFRQGXFWRU WHFKQRORJ \  KDV

LPSURYHG WKH SHUIRUDI WRDFWIDVWHUZKLOHSURGXFLQJDQDFFXUDWHUHVXOW, WDOVR

UHGXFHV WKH SULFH DQG EHFRQLPH PRUHZDIIRJDE LWVVL] HLWLVVPDOOHQRXJK WREHFRPSDFWHGDQG

PLOG LQ LWV ZHLJKW 7KHVH IHDWXUHV WXUQ PDWL WR E 

VSHFLILFDWLRQVWKDWVKRXOGEHHTXLSSHGDVSDUWRIWKHLQQRYDWLRQ

7KXVLWDOVRRSWLPL] HVWKHQSHWHWKHQSH

WRSURYLGHKLJKTXDOLW \ DQGSUHFLVHRXWFRPH7KLVSDSHUUHYHDOV

WKHFRQVWUXFWLRQRIDFRPSDORWJQOVRQRIDFRPSDORJDQ  W \ SLFDO FRPSRQHQWV VXFK DV WLPHU, &  UHVLVWRU DQG

FDSDFLWRU, WDOVR LQWURGXFHV D 3: 0 PHWKRGWR SURY 

UDQJHRISXOVHZLGWKDQGIU HTXHQF \ VHOHFWLRQV

,,  &

20%, 1 $ 7,212) 

7

, 0 (5

, & 

 WLPHU, & ZDVVHOHFWHGLQWKLVUHVHDUFKDVDPDLQGHYLFH

RIVTXDUHSXOVHJHQHUDWLRQ, WRZQVFDSD

DQGDFFXUDWHUHVXOWRIVTXDUHSXOVHYROWDJH: LWKLWVVPDOOVL] H

WKH FLUFXLW FDQ EH FRPSDFWHKG WDF 

VSDFH DQG HDV \  WR EH PRELOL] HG + RZHYHU WKH PDLQ SUREOHP

ZKHQ GHDOLQJ ZLWK WLPHU, &  LVDHWLHUPL RI LWV GXW \ 

F \ FOH DQG IUHTXHQF \  LQGHSHQGHQWO \  $  VLQJOH WLPHU, &  LV

QRW DEOH WR IXOILO WKUH  RI FKDQJLQJ WKH GXW \  F \ FOH

ZLWKRXW FKDQJLQJ LWV IUHTXHQF \  (YHQ WKRXJK WKHUH LV DQ

HQ LQWURY LQWURY 16

LQWURY LQWURY FLUFXLW WKDW DLP WR LPSURYH LWV

SHUIRUPDQFH LQ DGMXVWLQJ WKH GXW \  F \ FOH EXW VWLOO  FDXVLQJ

PLQLPDOHIIHFW RQIUHTXHQF \ ) XUWKHUPRUHWKHGXW \ F \ FOHFDQ

RQO \ EHDGMXVHWHHPLGQOL WRRI WKH

IXOOF \ FOH>  @ 

7KH SURJUDPPDEOH GHYLFHV  IRU SXOVH JHQHUDWLRQ KDV VRPH

GZEDFNV LWLVFRVWO \ WRRZQ0RUHRYHULWQHHGVWREH

SURJUDPPHG LQRUGHU WR PDNHLW ZRUN 7KXV FUHDWHV DQ H [ 

MRE EHIRUH LW FDQ EH LPSOHPHQWHG% HVLGHV WKDW WKH RSHUDWRU

QHHGVWRGHVLJQDQH [WUDFLUHUFLW 3: 0

RWKHUZLVH QHHG WR EH FRQVWDQWO \  SURJUDPPHG) RU EDVLF

 , (((

Профили фитохимии и биоактивности дикой Asparagus albus L.растение

Основные характеристики

•: Листья и околоплодник богаты флавоноидами.
•: В корневище не было обнаружено флавоноидов, в то время как его концентрация сапонинов была очень высокой.
•: Этанольный экстракт околоплодника обладает более высокой антиоксидантной активностью, чем экстракты корневищ и листьев.
•: Корневище обладало более выраженной цитотоксической активностью в отношении клеток HCT-116.
•: Все экстракты демонстрируют разную степень антимикробной активности в отношении большинства патогенных изолятов человека.

Реферат

Этанольные экстракты листьев, околоплодников и корневищ Asparagus albus L. были исследованы на их фитохимический состав, антиоксидант (анализы DPPH и FRAP), антимикробные средства против патогенных изолятов человека (человеческие цитотоксические изоляты). клетки карциномы толстой кишки HCT-116). Наибольшее содержание флавоноидов было получено в экстракте листьев, за которым следовали околоплодники, но в корневище флавоноидов обнаружено не было.Однако в корневище была высокая концентрация сапонинов. Профили флавоноидов и сапонинов были аналогичны профилям, описанным ранее для старомодного сорта спаржи triguero Huetor Tajar asparagus. Было обнаружено, что этанольный экстракт околоплодника проявляет более высокую антиоксидантную активность, чем экстракты корневища и листьев. Более того, корневище обладало более выраженной цитотоксической активностью в отношении клеток HCT-116 по сравнению с листом и околоплодником. Все экстракты показали разную степень антимикробной активности против большинства патогенных изолятов человека.Кроме того, листья показали более сильную ингибирующую активность против максимального числа бактерий и всех выделенных грибов, а самая высокая активность была в экстракте околоплодника против множественной лекарственной устойчивости Pseudomonas aeruginosa (MDR) и устойчивости к эритромицину Streptococcus agalactiae (ER) с зоной ингибирования 21 мм и 19 мм соответственно. Результаты показывают, что A. albus может быть новой культурой, представляющей фармацевтический интерес, поскольку ее богатство биологически активными соединениями обеспечивает значительную пользу для здоровья человека.

Аббревиатуры

TFC

общее содержание флавоноидов

triguero HT

triguero Huetor Tajar asparagus landrace

HTSAP

Huétor-Tájar saponin

90 -258 Ключевые слова

6 albidus L.

Цитотоксичность

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

Полный текст

Ссылки на статьи

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Гестационные факторы на всех этапах развития нервной системы плода: связь серотонина

4.1. Гестационные факторы влияют на содержание 5-HT, производное плацентой и ядрами рафа

В основной части этого обзора, в разделе 3, мы описали, как пять гестационных факторов влияют на систему 5-HT, развитие мозга и поведение в потомстве. Короче говоря, все рассмотренные гестационные факторы влияют на системы 5-HT, увеличивая или уменьшая уровни 5-HT у матери, плаценты и плода, что приводит к риску нейропсихиатрических расстройств у потомства. В этом разделе 4.1 мы суммируем основные результаты, касающиеся влияния гестационного фактора на систему 5-HT у потомства, и обсуждаем возможные основные механизмы (таблица 4). Далее, в разделе 4.2, мы обсудим, как взаимодействие между гестационными факторами может усиливать или противодействовать влиянию друг друга на серотонинергическую систему плода. Затем мы суммируем и обсуждаем в Разделе 4.3 основные результаты, связанные с индуцированными гестационным фактором 5-HT-ергическими изменениями структуры и функции таламокортикальных областей, префронтально-лимбических областей и оси HPA.Наконец, в Разделе 4.4 мы сообщаем об основных результатах, связанных с риском нейропсихиатрических расстройств, индуцированным гестационными факторами, и обсуждаем эффективность 5-HT-ергических зависимых изменений как основных механизмов в упомянутых цепях. -HT-ергический генотип зависит от исследуемого гена и от того, связана ли вариация гена с мутацией потери или увеличения функции. Генотип матери может влиять на систему 5-HT плода посредством различных механизмов, изменяя содержание 5-HT, полученного из плаценты.Генотип матери может влиять на функцию желудочно-кишечного тракта матери [266] или ее реакцию на кишечные бактерии (т.е. микробиом [267]). Важно отметить, что желудочно-кишечный тракт и микробиом, в свою очередь, влияют на уровни триптофана в крови матери и 5-HT тромбоцитов [267, 268]. Следовательно, изменения уровня триптофана или 5-HT у матери потенциально изменяют поглощение 5-HT и передачу через плаценту. Генотип матери может влиять на синтез 5-HT в плаценте (в случае полиморфизма TPh2 и / или TPh3) и на активацию плацентарного иммунитета и метаболизма (в случае доступности 5-HTT у матери [6]).В свою очередь, влияет на гомеостаз плаценты 5-HT. Поскольку аллели материнского риска могут передаваться потомству, материнский генотип также может напрямую влиять на систему 5-HT потомства (т.е. производство, доступность и активность рецепторов 5-HT). Что касается рациона матери, связанного с 5-HT, триптофан- обедненные диеты, диеты с высоким содержанием жиров и употребление алкоголя, по-видимому, в основном снижают уровень 5-HT у потомства. Вместо этого, высокое потребление триптофана и диета с ограниченным содержанием углеводов, по-видимому, связаны с повышенным уровнем 5-HT у потомства.Важно отметить, что для некоторых диет направление изменений, по-видимому, различается в зависимости от измеренного времени (эмбриональный или на протяжении всей жизни). Для изучения этого вопроса настоятельно рекомендуется проводить лонгитюдные исследования. Потенциальными механизмами, лежащими в основе материнского рациона, которые специфичны для изменений триптофана и ограниченного белком увеличения углеводов, являются изменения материнских уровней триптофана и 5-HT и их поглощения плацентой и, следовательно, передача плоду. Снижение уровня 5-HT в мозге плода, вызванное употреблением алкоголя матерью, может быть следствием изменений в составе кишечной микробиоты и ее функции [269, 270].В свою очередь, как показано для материнского генотипа, эти изменения могут влиять на уровни триптофана и 5-HT тромбоцитов в крови матери [267, 268]. Похожий механизм можно предположить для вызванных материнской диетой изменений уровней 5-HT в головном мозге потомства [271, 272]. Материнский стресс увеличивал уровни 5-HT в мозге плода в нескольких исследованиях, изучающих уровни 5-HT в эмбриональном периоде. После рождения сообщалось о повышении и понижении уровней 5-HT после материнского стресса. Хотя есть много различий между моделями материнского стресса, даже исследования с похожими моделями, временными окнами, полом или возрастом обнаруживают противоположные эффекты материнского стресса на систему 5-HT потомства (например,g. относительно уровней 5-HT и экспрессии TPh3 и 5-HTT; Таблица S2). Это предполагает, что эти противоречивые результаты в уровнях 5-HT после рождения связаны со сложными основными механизмами. Мы хотели бы выделить вызванное материнским стрессом снижение экспрессии Lmx1b, фактора транскрипции, необходимого для дифференцировки и поддержания центральных 5-HT нейронов в заднем мозге плода и ядрах шва взрослых [164]. Снижение этого фактора транскрипции может потенциально привести к замедлению развития системы 5-HT и, как следствие, к снижению выработки 5-HT мозгом.Предполагается, что повышение уровней 5-HT в мозгу потомства связано с изменениями 5-HT, полученного из плаценты. Повышенный уровень материнского триптофана может быть либо доставлен непосредственно к плоду, либо может повышать материнский или плацентарный уровни 5-HT [142]. Изменения в развивающейся системе ядер шва и временная экспрессия 5-HTT могут быть компенсаторным механизмом повышенного содержания 5-HT, полученного из плаценты. Обычно считается, что прием СИОЗС матерью увеличивает уровни 5-HT у плода (см. Обзор [273]). .Многие из поведенческих и механических эффектов нейроразвития гестационного воздействия СИОЗС напоминают эффекты, наблюдаемые у грызунов, лишенных 5-HTT [29 239 240 274 275 276]. Поскольку нокаут 5-HTT у грызунов связан с повышенными внеклеточными уровнями 5-HT [277], можно предположить, что гестационное воздействие SSRI также увеличивает уровни 5-HT у плода. Однако несколько исследований, в которых изучались фактические уровни 5-HT у потомства, противоречивы и не могут быть объяснены использованием разных типов СИОЗС или различиями в периодах воздействия.Интересно, что исследования, посвященные как гестационному стрессу, так и воздействию СИОЗС, в основном показывают, что воздействие СИОЗС нормализует вызванные пренатальным стрессом эффекты на уровни 5-HT у потомства, независимо от того, увеличивает или снижает пренатальный стресс уровни 5-HT у потомства (Таблица S2). Прием материнских 5-HT-ергических препаратов может влиять на 5-HT систему плода через несколько механизмов. Во-первых, лекарства снижают уровень 5-HT тромбоцитов у матери [278, 279], что потенциально снижает передачу 5-HT через плаценту.Кроме того, поскольку тромбоциты материнской крови и плацента экспрессируют 5-HTT [280,281], такие лекарства, как СИОЗС, могут влиять на функцию плаценты, а также на перенос 5-HT. Более того, большинство 5-HT-ергических препаратов способны проходить через плаценту, тем самым создавая возможность связываться с 5-HTT плода и влиять на экспрессию 5-HT рецепторов в мозге потомства [282,283]. Активация материнского иммунитета снижает уровни 5-HT у потомства после рождения, независимо от используемого метода и индуцированного срока гестации.Однако измерения во время развития плода неоднозначны и могут указывать на временное повышение уровней 5-HT. Цитокины, полученные из плаценты, способны активировать воспаление плода, что может повлиять на выживаемость 5-HT-положительных клеток в ядрах шва. Было высказано предположение, что высокий уровень материнского IL-6 увеличивает транспорт аминокислот A / L системы плаценты [284] и, таким образом, потенциально увеличивает плацентарный перенос триптофана и, таким образом, также уровни 5-HT в мозге плода. Напротив, снижение уровней 5-HT, полученного из плаценты, может быть связано с тем, что провоспалительные цитокины в материнской крови активируют IDO и TDO, которые, в свою очередь, запускают выработку кинуренина.Таким образом, материнское воспаление может шунтировать плацентарный метаболизм триптофана с 5-HT на кинурениновый путь. В подтверждение, активация материнского иммунитета увеличивает экспрессию IDO в плаценте и перивентрикулярной области плода вместе с интенсивной активацией микроглии в перивентрикулярной области плода [254, 258].

4.2. Синергетическое воздействие на 5-HT-ергические системы и нейроразвитие плода

Как показано на рисунке 2, обсуждаемые гестационные факторы не только независимо влияют на систему 5-HT и, следовательно, на развитие мозга потомства, но также во взаимодействии.Как обсуждалось в Разделе 3.2.2, диета с высоким содержанием жиров, приводящая к ожирению во время беременности, увеличивает риск материнской и плацентарной иммунной активации за счет увеличения высвобождения провоспалительных цитокинов [117, 120], но также и риск преэклампсии из-за снижения васкуляризации плаценты и кровоток, ведущий к ограничению доставки питательных веществ через плаценту [284,285]. Точно так же материнский стресс провоцирует усиление материнской иммунной активации, о чем свидетельствуют приросты IL-6 в плазме человека и мышей [286,287].Таким образом, хотя некоторые взаимодействия между материнскими факторами могут привести к логическим последствиям для развивающейся системы 5-HT, другие эффекты взаимодействия материнских факторов не столь естественны и требуют дополнительных исследований в будущих исследованиях. Как описано в Разделе 3.3, Разделе 3.4 и Разделе 3.5, три гестационных фактора: материнская депрессия, прием СИОЗС матерью и преэклампсия могут изменять уровни 5-HT в плаценте и плодах и увеличивать риск РАС. Эти факторы могут взаимодействовать, учитывая, что у людей пренатальный прием антидепрессантов беременными женщинами с депрессией увеличивает риск преэклампсии [288, 289, 290].Интересно, что этот риск увеличивается, когда лечение СИОЗС продолжается во втором триместре [288, 291]. Следует отметить, что другое исследование не смогло воспроизвести эти результаты [292]. Важно отметить, что комбинированное воздействие этих трех гестационных факторов может усилить их действие на систему 5-HT матери и плода и может увеличить риск развития РАС у потомства. Синергетический эффект пренатального приема СИОЗС и преэклампсии можно объяснить вызванным СИОЗС повышением активности плацентарного рецептора 5-HT _2A [26].Поскольку рецептор 5-HT _2A является ключевым регулятором плаценты (влияющим на рост и функцию плаценты), предполагается, что он играет роль в патофизиологии преэклампсии [293, 294], тем самым влияя на активность материнской иммунной системы. Однако связь между преэклампсией и функцией рецептора 5-HT _2A не была подтверждена в другом исследовании [295]. Более того, предполагается, что факторы, включая питание матери и генетику, могут влиять на промотор рецептора 5-HT _2A [296].Следовательно, питание и генетика матери могут влиять на синергетический эффект пренатального приема антидепрессантов и преэклампсии. Предыдущие исследования показали, что СИОЗС снижают эффективность у людей с низкой экспрессией 5-HTT из-за унаследованного S-аллеля 5-HTTLPR [297]. Таким образом, наличие S-аллельного варианта 5-HTTLPR может быть фактором, обеспечивающим некоторую защиту от нежелательного воздействия СИОЗС на развитие нервной системы потомства. Если это так, то лечение может одновременно принести меньше пользы матери, что увеличивает влияние материнского стресса и депрессии на развитие плода.Также предполагалось, что 5-HTTLPR влияет на устойчивость к стрессу. В частности, матери 5-HTTLPR-SS детей с РАС сообщили о большем количестве стрессоров и повышенной реактивности на эти стрессоры по сравнению с матерями с 5-HTTLPR-LL. Это говорит о том, что этот специфический материнский генотип вместе с пренатальным стрессом увеличивает риск развития РАС у потомства [298]. В подтверждение этого, исследования на мышах показали, что сочетание материнского стресса и материнского генотипа 5-HTT влияет на эпигенетические механизмы в эмбрионе, приводя к социальному дефициту, но не к поведению, подобному тревоге [299,300].Более того, материнские функциональные гаплотипы TPh3 влияют на материнскую депрессию во время и после беременности [301].

Материнский 5-HT-ергический генотип может влиять на количество триптофана и 5-HT, которые высвобождаются в материнское и плацентарное кровообращение (т. Е. На изменение функции желудочно-кишечного тракта или чувствительность к микробиому кишечника). Таким образом, материнский генотип может влиять на влияние других гестационных факторов. Описанные примеры взаимодействия между материнскими факторами могут быть изменены из-за способности состава материнского рациона влиять на потенциальное негативное влияние других материнских факторов.Богатая белками диета с низким содержанием углеводов потенциально снижает транспорт триптофана, в то время как диета с низким содержанием белков и высоким содержанием углеводов, по-видимому, увеличивает этот транспорт. В результате диета с ограничением белков, обогащенная углеводами или диета с высоким содержанием триптофана, может увеличить сниженные уровни 5-HT в мозге, очевидные у потомков, подвергшихся материнскому употреблению алкоголя (3.2.3) и активации материнского иммунитета (3.5). Требуется дальнейшее изучение этого потенциального подхода. Крайне важно помнить, что как слишком низкий, так и слишком высокий уровень 5-HT отрицательно влияет на развитие нервной системы плода.

4.3. Гестационные факторы влияют на мозговые цепи потомства

Кажется, существует взаимосвязь между материнскими, плацентарными и фетальными изменениями системы 5-HT во время событий нервного развития и формированием и функцией трех рассмотренных нами мозговых цепей. Таламокортикальный контур обычно является мишенью для (1) материнского 5-HT-ергического генотипа, (2) потребления алкоголя, (3) стресса, приводящего к увеличению уровней 5-HT в головном мозге потомства, (4) приема СИОЗС и 5) позднего заражения. активация иммунитета при беременности.В то время как снижение уровней 5-HT у плода (генотип 5-HTT у матери, потребление алкоголя, пренатальное воздействие СИОЗС и активация иммунной системы) привело к потере или расширению таламокортикальных афферентов, повышению уровня 5-HT у плода (стресс матери и потенциально неонатальный прием СИОЗС здоровыми самками) приводил к увеличению 5-HT-содержащих таламокортикальных афферентов или меньшему количеству ответвлений. Интересно, что эти результаты могут указывать на то, что эмбриональные изменения 5-HT (пренатальное воздействие SSRI) приводят к противоположным эффектам на таламокортикальное развитие по сравнению с прямыми эффектами на систему 5-HT потомства, наблюдаемыми после неонатального воздействия SSRI.

Префронтально-лимбическая схема включает функции мозга, на которые также часто влияют гестационные факторы. На эту схему нацелены (1) модели стресса, приводящие к снижению уровней 5-HT в мозгу потомства, (2) потребление СИОЗС, (3) активация иммунной системы и (4) потенциально все обсуждаемые материнские диеты. Питание матери связано с изменениями системы 5-HT потомства в префронтально-лимбической подобласти, прежде всего. Сосредоточившись на нейрогенезе гиппокампа, было показано, что материнский стресс снижает этот процесс, в то время как материнское воздействие СИОЗС, как часто сообщается, увеличивает нейрогенез в гиппокампе.Таким образом, воздействие СИОЗС на мать может потенциально регулировать вызванные стрессом эффекты у матери. Однако изменения нейрогенеза гиппокампа, вызванные СИОЗС, по-видимому, различаются в зависимости от пола и возраста. Следовательно, в некоторых случаях перинатальное воздействие СИОЗС отрицательно влияет на нейрогенез гиппокампа. Более того, структурная пластичность была снижена у потомства при воздействии диет без триптофана, материнского стресса или приема СИОЗС здоровыми самками. Интересно, что стрессы, связанные как с лишением триптофана, так и со стороны матери, были связаны со снижением уровней 5-HT в префронтально-лимбических областях потомства.

На ось HPA влияют изменения 5-HT плода под влиянием (1) материнского стресса, приводящего к увеличению или снижению уровней 5-HT в головном мозге потомства, (2) потреблению СИОЗС и (3) потенциально материнскому 5-HT -ергический генотип, диета с ограниченным содержанием белков и повышенным содержанием углеводов и потребление алкоголя. Генотип матери и диета могут влиять на ось HPA, влияя на экспрессию 5-HT-ергических рецепторов. Материнский стресс и прием СИОЗС имеют более распространенный эффект, изменяя не только экспрессию рецепторов, но также изменяя петлю отрицательной обратной связи, в том числе, через уровни кортикостерона / кортизола и рецепторы глюкокортикоидов в гиппокампе.Материнский стресс, независимо от направления изменения уровней 5-HT в головном мозге, по-видимому, вызывает гиперреактивную ось HPA. С другой стороны, большинство исследований, касающихся перинатального воздействия СИОЗС (исследования на людях, здоровых и животных, подвергшихся перинатальному стрессу), указывают на снижение реактивности оси HPA, тем самым нормализуя вызванные стрессом эффекты у матери. Важно отметить, что перинатальное воздействие СИОЗС также влияет на ось HPA без нормализации материнского стресса (например, снижения плотности рецепторов глюкокортикоидов в различных областях мозга).

4.4. Гестационные факторы могут влиять на риск развития нейропсихиатрических расстройств

Вызванные гестационными факторами изменения в системе 5-HT головного мозга потомства, по-видимому, коррелируют с повышенным риском возникновения определенных психоневрологических расстройств (рис. 3). Например, материнские мутации потери функции TPh2 были связаны с повышенным риском развития СДВГ. Поскольку материнские мутации TPh2 изменяют скорость пролиферации эмбриональных клеток и вызывают аномалии развития корковых областей эмбриона, эти изменения могут лежать в основе повышенного риска СДВГ.Можно предположить, что эти эффекты вызваны снижением уровней 5-HT в мозге плода, поскольку мутации TPh2, вероятно, приводят к снижению уровней 5-HT тромбоцитов и плаценты у матери и, таким образом, к снижению содержания экзогенного 5-HT. Кроме того, наблюдались проблемы с вниманием при воздействии триптана, агониста рецептора 5-HT _{1B / 1D}. Действительно, генетические мутации в этих рецепторах связаны с риском СДВГ [302,303].

Что касается РАС, сообщалось о повышенном риске у детей от матерей, носящих 5-HTTLPR-LL, и у животных, подвергшихся материнскому стрессу или активации материнского иммунитета.Интересно, что усиленная экспрессия 5-HTT, по-видимому, приводит к снижению уровней 5-HT в переднем мозге плода и изменениям в таламокортикальной цепи (мутация увеличения функции 5-HTT и пренатальное воздействие SSRI). Эти данные могут указывать на потенциальный механизм, посредством которого материнский генотип 5-HTT влияет на начало РАС. Гиперреактивная ось HPA и пониженная структурная пластичность в префронтально-лимбической цепи предполагаются в качестве основных механизмов после воздействия материнского стресса и приема СИОЗС.Важно отметить, что есть несколько индикаторов, позволяющих предположить, что прием СИОЗС матерью после стресса у матери восстанавливает вызванные стрессом изменения в оси HPA. Настоятельно рекомендуется провести более подробные исследования для дальнейшего изучения этого потенциала. Тем не менее, исследования людей и животных в отношении воздействия СИОЗС очень непоследовательны, но в целом предполагают риск РАС, независимо от последствий пренатального стресса. Эта связь, однако, может меняться в зависимости от окружающей среды (например, материнская 5-HT-ергическая генетическая изменчивость влияет на уровни 5-HT у плода, материнскую предрасположенность к нейропсихиатрическим расстройствам и эффективность СИОЗС).Было бы важно принять во внимание такие среды как потенциальные взаимодействующие факторы.

Сообщается об усилении тревожного поведения у потомства после гестационного воздействия материнского генотипа, диеты с высоким содержанием жиров, потребления алкоголя, стресса, приема СИОЗС и активации иммунной системы. Результаты исследований могут означать, что поведение, вызванное воздействием СИОЗС, больше связано с депрессивным, а не с тревожным поведением. Интересно, что диеты с высоким содержанием жиров, употребление алкоголя, а также активация материнского иммунитета, как предполагается, приводят к снижению уровней 5-HT у потомства, что может означать связь между высоким уровнем тревожности и вызванным гестационным фактором снижением 5-HT у потомства. уровни.Интересно, что эти факторы (включая модели стресса, приводящие к снижению уровней 5-HT в мозгу потомства) связаны с нарушенной структурой и функцией префронтально-лимбической схемы. Гиперреактивная ось HPA также была предложена в качестве основного механизма.

Активация материнского иммунитета, стресс, а также прием СИОЗС во время беременности связаны с усилением депрессивно-подобного поведения у потомства. Интересно, что до сих пор только в одном исследовании на животных изучали пренатальное воздействие СИОЗС, а не перинатальное или неонатальное воздействие, и не обнаружили никаких изменений в депрессивно-подобном поведении [304].Это согласуется с результатами исследования на людях, показывающего, что только воздействие СИОЗС на поздних сроках беременности было связано с повышенным риском депрессии [187]. Эти данные свидетельствуют о том, что индуцированные СИОЗС эффекты на 5-HT-ергическую систему потомства более важны, чем содержание 5-HT из плаценты.

Влияние кислородно-глюкозной депривации (OGD) на барьерные свойства и уровни транскриптов мРНК выбранных маркерных белков в совместных культурах эндотелиальных клеток головного мозга / астроцитов, PLOS ONE

Было показано, что ишемический инсульт вызывает нарушение гематоэнцефалического барьера, хотя эти изменения полностью не охарактеризованы.Кислородно-глюкозная депривация (OGD) использовалась для исследования эффектов ишемии в культивируемых эндотелиальных клетках капилляров головного мозга, однако это включает изменение среды, которая сама по себе может повлиять на клетки. Целью настоящего исследования было изучить влияние OGD и простой замены среды с последующими 48 часами реперфузии на барьерные свойства первичных эндотелиальных клеток крупного рогатого скота, совместно культивируемых с астроцитами крысы. Барьерные свойства оценивали с помощью измерений трансэндотелиального электрического сопротивления, пассивной проницаемости маркеров потока, RT-qPCR и иммуноцитохимии.И OGD, и простая замена среды вызывали увеличение проницаемости эндотелиального монослоя. Это коррелировало со снижением уровня транскрипта ряда белков, связанных с плотным соединением и связанных с плотным соединением (клаудин-1, клаудин-5, окклюдин, ZO-1, трицеллулин, marveld3 и PECAM-1), а также с измененным уровнем транскрипта несколько переносчиков и рецепторов (GLUT-1, HB-EGF, InsR, TfR, два члена семейства рецепторов липопротеинов низкой плотности, LDLR и LRP-1, а также переносчик оттока BCRP).Напротив, эффекты, специфически индуцированные OGD, включали временную де-локализацию клаудина-5 из зоны соединения, повышенную локализацию InsR на плазматической мембране и временное подавление уровней транскриптов MRP-1 и P-gp. В заключение, OGD вызывал изменения в локализации клаудина-5 и InsR, а также в уровнях транскриптов MRP-1 и P-gp. Однако наши результаты также показали, что замена среды сама по себе вызывает изменения функциональных барьерных свойств и уровней экспрессии широкого спектра белков.

中文翻译：

葡萄糖剥夺（OGD）对脑内皮细胞 / 星形胶质细胞共培养物中屏障特性的的影响

性中风已被证明可导致血脑屏障的破坏，尽管这些变化尚未得到充分。氧葡萄糖剥夺（OGD）已用于研究对培养的脑内皮影响，但是涉及培养基的改变，而培养基本身可能会细胞。研究的目的是研究 OGD 和简单的培养基交换，然后再灌注的大鼠星形细胞内皮-特性的影响。跨内皮测量，标记物的被动渗透性， RT-qPCR 和免疫细胞化学来评估屏障性质 OGD 的介质交换都会与许多紧密连接和连接相关蛋白（claudin-1 claudin-5 occludin ， ZO-1 tricellulin ， marveld3 PECAM-1）的降低有关几个。受体（GLUT-1 HB-EGF ， InsR ， TfR ，脂蛋白受体家族的两个成员， LDLR 和 LRP-1 外转运 BCRP）。相比之下， OGD 特异诱导的作用 claudin-5 连接区的瞬时去定位，质膜上 InsR 定位的增加 MRP-1 P-gp 转录水平的瞬时。总之 OGD 导致 claudin-5 和 InsR 定位以及 MRP- 1 和 P-gp 转录水平发生变化。

Моё видео — 162 видео. Видео salom salom

Baxt qasri / Бахт касри 42 — qism ( Hind serial O’zbek tilida)

BAXT QASRI / БАХТ КАСРИ 154, 155, 156 QISMLAR (HIND SERIALI UZBEK TILIDA)

TAVSIYA ETAMIZ:

Навигация по записям

Свежие записи

xisoblagich

kadam

Страница не найдена — Центр исследований Института Кюри

Страница не найдена — Центр исследований института Кюри

C11ORF24 — новый мембранный белок типа I, который циклически перемещается между аппаратом Гольджи и плазматической мембраной в Rab6 -Положительные пузырьки

Введение

Результаты и обсуждение

C11ORF24 — трансмембранный белок типа I

C11ORF24 локализован на аппарате Гольджи и

C11ORF24 имеет люминальный домен и небольшой цитозольный хвост

Пул C11ORF24 присутствует на плазматической мембране и в эндосомах

C11ORF24 присутствует на положительных транспортных носителях RAB6

C11ORF24 не требуется для перевозки классических грузов пути RAB6

C11ORF24 не участвует в регуляции клеточного цикла

Материалы и методы

Конструкция GFP-C11ORF24

Культура клеток, трансфекция и линии клеток

Иммунофлуоресценция

Микроскопия прямой стохастической оптической реконструкции (dSTORM)

Топология C11ORF24

Интернализация антител

Медикаментозное лечение

Ретроградный транспорт STxB

Секреция

Визуализация живых клеток

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Рисунок S2.

Рисунок S3.

Рисунок S4.

Рисунок S5.

Фильм S1.

(PDF) Компактный и надежный генератор импульсов, использующий двойную ИС с таймером 555 для создания метода ШИМ

Профили фитохимии и биоактивности дикой Asparagus albus L.растение

Основные характеристики

Реферат

Аббревиатуры

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Гестационные факторы на всех этапах развития нервной системы плода: связь серотонина

4.1. Гестационные факторы влияют на содержание 5-HT, производное плацентой и ядрами рафа

4.2. Синергетическое воздействие на 5-HT-ергические системы и нейроразвитие плода

4.3. Гестационные факторы влияют на мозговые цепи потомства

4.4. Гестационные факторы могут влиять на риск развития нейропсихиатрических расстройств

Добавить комментарий Отменить ответ