Электрофорез методика по ратнеру: Электрофорез Клиника Прогноз

Электрофорез Клиника Прогноз

Эффективное сочетание лечебного воздействия на организм постоянного тока и лекарственных препаратов, которые вводятся с его помощью.

С какого возраста можно проводить?

Процедуры можно проводить младенцам с 3-х месяцев (при условии, что вес ребенка не менее 3-х кг), детям раннего, дошкольного и школьного возраста.

ри каких нарушениях назначаются эти процедуры и как они проводятся?

Электрофорез по Ратнеру (с эуфиллином и папаверином):

• Нарушения кровообращения в шейном отделе позвоночника
• Травмы и гипоксия во время беременности и родов
• Кривошея
• ДЦП
• ЗПР
• Специфические расстройства речевого развития (особенно эффективен в сочетании с логопедическим массажем и логопедическими занятиями)

Электроды накладываются сзади в районе шейно-воротниковой зоны, спереди на правую часть грудной клетки. Время воздействия 15-20 мин. Количество процедур 10-14.

Электрофорез с магнием:

• Повышенная возбудимость нервной системы
• СДВГ
• Нарушение сна
• Астено-невротический синдром
• Тики
• Заикания
• Вегетативная дисфункция
• Головные боли

Электроды накладываются сзади в районе шейно-воротниковой зоны. Время воздействия 15-20 мин. Количество процедур 10-14.

Электрофорез со спазмолитиком на нижние конечности:

• ДЦП спастическая форма
• «Цыпочки» (ребенок часто ходит, опирая только на переднюю часть стопы)
• Плоско-вальгусная стопа

Электроды накладываются на икроножные мышцы. Время воздействия 15-20 мин. Количество процедур 10-12.

акие плюсы данной схемы введения лекарственных средств?

• Минимальное количество побочных эффектов, т.к. препарат попадает в организм, минуя пищеварительный тракт
• Местное воздействие с высокой концентрацией вещества помогает доставить лекарство непосредственно в зону патологии, не насыщая весь организм
• Безболезненность и неинвазивность процедуры, во время процедуры пациент не испытывает болезненных ощущений, нет повреждений кожи и слизистых
• Пролонгирующее действие лекарственного вещества, создание в коже своеобразного «депо» с лекарством, которое обеспечивает продолжительный терапевтический эффект и позволяет снизить дозировку препарата
• Действие лекарственного препарата усиливается за счет постоянного электрического тока
• Увеличивается эффективность других методов немедикаментозного лечения, которые используются в клинике «Прогноз».

акие противопоказания?

• Индивидуальная непереносимость постоянного тока или вводимого вещества
• Острые воспалительные и гнойные процессы
• Заболевания кожи(экзема, дерматиты)
• Новообразования
• Эпилепсия
• Системные заболевания внутренних органов
• Нарушение целостности кожного покрова в месте наложения электродов
• Лихорадка
• Не рекомендуется сочетать с другими методами физиотерапии с использованием электротока

Кто составляет протокол проведения процедур?

Врач-физиотерапевт после проведения неврологической функциональной диагностики

Электрофорез для грудничков – одно решение для множества проблем

Электрофорез для грудничков – одно решение для множества проблем

Физиотерапевтические процедуры широко применяются в педиатрии, в том числе и при лечении грудных младенцев и детей до года.  Электрофорез для грудничков за десятилетия применения в медицинской практике стал одним из самых распространенных методов физиотерапии, хорошо зарекомендовавшим себя как средство против заболеваний опорно-двигательного аппарата – суставов, костей, позвоночника, нервной, дыхательной, эндокринной системы, болезней глаз и полости рта.

Список заболеваний, при которых назначают электрофорез детям до года, очень обширен.Электрофорез грудным детям чаще всего проводят для лечения гипо- и гипертонуса мышц, ДЦП, некоторых родовых травм, ОРЗ и других инфекций. Электрофорез ушей ребенку поможет справиться с хроническим отитом, от которого часто страдают ослабленные малыши, а назальный электрофорез – отличный способ лечения простудных заболеваний. Электрофорез с кальцием для ребенка по методике Вермеля – средство, которое назначают при первых признаках рахита.

Отдельно нужно обратить внимание на электрофорез с эуфиллином для грудничков – для чего его делают? В большинстве случаев электрофорез шейного отдела грудничку проводят при симптомах кривошеи, серьезного заболевания, которое лучше лечить в самом раннем возрасте. Почти всегдаэлектрофорез с эуфиллином грудничку на шейный отдел назначают именно по этой причине.Эуфиллин для электрофореза детям назначают и в качестве вспомогательного средства при введении чрескожно других медикаментов.

Электрофорез по Ратнеру также делают с применением эуфиллина и с наложением электродов на воротниковую зону. Это – отличный метод лечения врожденных или приобретенных нарушений мозгового кровообращения, повышенного внутричерепного давления.

Совместимость с другими видами физиотерапии, положительное воздействие гальванизации на организм обеспечивают самые доброжелательные на электрофорез отзывы. Дети хорошо реагируют на процедуру, так как при правильно подобранной силе тока она не доставляет никаких неприятных ощущений.

Если ребенку назначили электрофорез, следует задуматься над покупкой домашнего аппарата. Конечно, посещение физиотерапевтического кабинета может стать альтернативой покупке, но ежедневные визиты в больницу на протяжении 10-20 дней не всегда безопасны: риск заразиться от других пациентов или подхватить внутрибольничную инфекцию очень велик. Но и заниматься самолечением ни в коем случае нельзя, даже ознакомившись с тем, когда применяется электрофорез, что это такое, для детей какого возраста процедура разрешена и какие средства в каком случае применяются. В отличие от взрослого больного, ребенок не сможет сказать, что чувствует дискомфорт из-за неправильного положения накладок, вызванного неподходящим лекарством раздражения или слишком интенсивного воздействия электричества, поэтому оптимальный вариант – провести первые несколько процедур в условиях клиники под руководством врача, после чего продолжить курс лечения на дому.

Обычно электрофорез в педиатрии проводится при помощи аппаратов, обладающих плавной регуляцией силы тока и специальным детским режимом работы. Среди устройств, при помощи которых разрешено делать электрофорез для грудничков, отзывы специалистов и родителей выделяют аппарат Элфор-Проф. Простой в применении, компактный и надежный, он хорошо подходит для домашнего использования.

Еще одно популярное домашнее устройство, совпадающее с ним по большинству характеристик — аппарат ПоТок, также часто применяется для того, чтобы делать детский электрофорез. Но особого режима для самых маленьких пациентов в установках этого устройства нет – с его помощью можно проводить электрофорез на суставы, электрофорез воротниковой зоны ребенку от года и старше, а вот для того, чтобы делать электрофорез для грудничков на шею и другие зоны, ПоТок не подойдет.

Стоит заметить, что по умолчанию аппараты поставляются без необходимых для процедуры тканевых электродов. Поэтому, чтобы провести электрофорез шейного отдела ребенку, потребуется отдельно купить детские тканевые накладки или приобрести аппарат Элфор-Проф в специальной комплектации. Вместе с устройством идут три набора накладок: 30*60 мм, 50*70 мм, 60*80 мм. Самые маленькие из них идеально подходят для того, чтобы сделать электрофорез для грудничка – шейный, на область туловища, грудной клетки и суставов. А электроды большего размера можно оставить для применения в будущем.

Не только наружный могут назначить электрофорез детям. Методики лечения различных заболеваний включают в себя ванночковый и полостной электрофорез. Для лечения болезней верхних дыхательных путей и среднего уха понадобится приобрести одноразовые эндоназальные-эндонауральные электроды, которые, как и тканевые накладки, выпускаются в разных размерах и подходят для использования с аппаратом Элфор-Проф в его стандартной комплектации. Как и электрофорез на шею ребенку, полостной электрофорез нельзя проводить без рекомендации специалиста, выбора подходящих лекарств и нескольких обучающих процедур в условиях стационара. Электрофорез носовой полости очень полезен для грудничков, которые еще не могут высморкаться: после электрофореза ребенок быстро начинает нормально дышать, отек слизистых спадает после первых же двух-трех сеансов гальванизации.

Электрофорез для детей на воротниковой зоне, также проведения электрофорез для грудничков в Евромед

Проведение лечебных процедур электрофорезом в Омске. Электрофорез — метод введения лечебных препаратов через кожный покров, под действием электрического поля. При этом лекарство вводится в наиболее химически активной форме.

• Консультация
• Диагностика
• Лечение

Электрофорез — это метод введения лекарственного вещества под действием электрического поля в организм. Лечение электрофорезом проводится как через кожные покровы (в неврологии, травматологии и др.), так и через слизистые оболочки (в стоматологии, оториноларингологии, гинекологии и др.). Вещество вводится непосредственно в очаг воспаления в малых, но достаточно эффективных дозах, накапливаясь в тканях и действуя продолжительное время.

Поэтому особенно актуален электрофорез для детей, т.к. дает возможность местно использовать лекарства, которые в раннем детском возрасте нельзя применять другими способами. При этом лекарство вводится в наиболее химически активной форме — в виде ионов – и не разрушается, как например, при введении через рот. При проведении электрофореза электрический ток благоприятно влияет на реактивность и иммунобиологический статус тканей.

Этот метод применяется применяется с самого раннего возраста — например, электрофорез для грудничков используется уже спустя 3-6 недель после рождения. Для детей до года при этой процедуре в качестве лекарственного вещества часто используется эуфиллин как средство, снимающее тонус гладкой мускулатуры и улучшающее кровообращение (в основном, проводится электрофорез на воротниковую зону).

В целом выбор зоны проведения электрофорез зависит от заболевания: так, электрофорез воротниковой зоны проводится при заболеваниях нервной или сосудистой системы, электрофорез конечностей — при заболеваниях суставов, электрофорез поясничной зоны — при гинекологических заболеваниях и т.п.

Вернуться на страницу:

Остались вопросы?

Электрофорез по ратнеру – методика проведения

• Многие годы пытаетесь вылечить СУСТАВЫ?
• Читать далее »

Глава Института лечения суставов: «Вы будете поражены, насколько просто можно вылечить суставы принимая каждый день…

Содержание:

• Виды лечения
• Электрофорез и ультразвук
• Магнитотерапия и использование лучевого воздействия
• Лечение в период обострения

Основное лечение при этом – приём правильно подобранных медикаментов. Однако каждодневный приём таблеток сильно увеличивает риск развития побочных явлений. Но и здесь можно найти выход из создавшейся ситуации – это применение физиотерапии. Этот метод позволит в несколько раз усилить действие препаратов и снизить их дозировку, а значит — будет снижено количество побочных эффектов.

Виды лечения

При лечении артроза применяются самые разные виды физиотерапии. Это может быть электрофорез, ультразвук, магнитные поля, лучевое воздействие. Однако самостоятельно использовать их нельзя ни в коем случае. Только врач может точно определить, какое число сеансов должен пройти пациент и на каком аппарате ему стоит лечиться.

Чаще всего физиотерапия проводится в то время, когда человек находится в стационаре. Там для этого есть отдельные кабинеты со специально обученным персонажем. А правильно подобранные лекарства позволяют, к тому же, помочь пациенту справляться с болью, которая появляется при данном заболевании уже на самой ранней стадии.

Электрофорез и ультразвук

НАШИ ЧИТАТЕЛИ РЕКОМЕНДУЮТ!

Для лечения суставов наши читатели успешно используют СустаЛайф. Видя, такую популярность этого средства мы решили предложить его и вашему вниманию.
Подробнее здесь…

Ещё один не менее распространённый способ лечения артрозов – это ультразвук. Здесь терапевтический эффект основан на способности высокочастотного звука вызывать при воздействии на тело человека некоторые положительные эффекты.

При этом в самом повреждённом суставе улучшается обмен веществ, он становится более стойким к повреждениям. А так как хрящевая ткань не восстанавливается, основная задача лечения при этом непростом заболевании – это её сохранение.

Магнитотерапия и использование лучевого воздействия

Этот вид физиотерапии в последнее время становится всё более популярным. Почему же его рекомендуют врачи при самых разных артрозах, в том числе и при артрозе плечевого сустава?

1. Улучшаются реологические свойства крови.
2. Уменьшается воспаление.
3. Улучшается тонус сосудов.
4. Улучшается ток крови и лимфы.
5. Ускоряются процессы заживления.

При этом магнитотерапия может быть как местной, так и общей. Но применять данный вид лечения самостоятельно всё же не стоит, а перед тем, как начать лечиться таким способом, стоит обязательно проконсультироваться с врачом.

Лучевое воздействие на больной суставы может применяться как отдельно, так и совместно с другими методами. При этом данный вид лечения чаще всего имеет меньше всего противопоказаний и может использоваться там, где другие методы физиотерапии просто противопоказаны.

Но для всех методов подобного лечения есть и общие противопоказания. И с ними стоит обязательно ознакомиться прежде, чем начинать лечиться этими способами.

1. Злокачественные опухоли в любой части тела.
2. Туберкулёз в активной стадии.
3. Эпилепсия.
4. Гипертоническая болезнь в последних стадиях.
5. Сердечная недостаточность 3 степени.
6. Атеросклероз.
7. Беременность.
8. Повышенная температура тела.
9. Истощение организма
10. Сильная потеря в весе.
11. Склонность к развитию кровотечения.

Обострение болезни

Физиотерапия противопоказана при обострении любого артроза. При этом в коленном суставе может скапливаться жидкость или даже гной. В данном случае проводится лечение только лекарственными средствами, а физиотерапевтические методы могут принести только к ухудшению заболевания.

Об этом знает каждый специалист. И об этом должен знать каждый человек, который страдает этим неприятным недугом.

• Причины развития, симптомы и лечение серонегативного ревматоидного артрита
• Боли в спине в послеродовом периоде
• Причины появления и лечение боли в локтях
• Как вылечить гигрому без операции?
• Причины развития и терапия акропарэстезии

• Артроз и периартроз
• Боли
• Видео
• Грыжа позвоночника
• Дорсопатия
• Другие заболевания
• Заболевания спинного мозга
• Заболевания суставов
• Кифоз
• Миозит
• Невралгия
• Опухоли позвоночника
• Остеоартроз
• Остеопороз
• Остеохондроз
• Протрузия
• Радикулит
• Синдромы
• Сколиоз
• Спондилез
• Спондилолистез
• Товары для позвоночника
• Травмы позвоночника
• Упражнения для спины
• Это интересно

01 марта 2019
• Ощущение нехватки воздуха, боль в горле — это из-за остеохондроза?

01 марта 2019

• В чем причина боли в ягодице после падения на спину?

28 февраля 2019

• Перелом позвонка — можно ли поворачиваться и вставать в туалет?

28 февраля 2019

• Перелом поперечных отростков — можно ли поворачиваться на бок и как лечиться?

27 февраля 2019

• Поможет ли Алмаг при ревматоидном артрите?

Каталог клиник по лечению позвоночника

Список препаратов и лекарственных средств

© 2013 — 2019 Vashaspina.

ru | Карта сайта | Лечение в Израиле | Обратная связь | О сайте | Пользовательское соглашение | Политика конфиденциальности
Информация на сайте предоставлена исключительно в популярно-ознакомительных целях, не претендует на справочную и медицинскую точность, не является руководством к действию. Не занимайтесь самолечением. Проконсультируйтесь со своим лечащим врачом.

Использование материалов с сайта разрешается только при наличии гиперссылки на сайт VashaSpina.ru.

Электрофорез с Карипазимом является чудесным методом борьбы с межпозвоночной грыжей на ранних стадиях. Процедура помогает избежать ненужной в этом случае операции. Кроме того, метод показан при иных проблемах опорно-двигательной системы и других патологиях. Но процедура имеет противопоказания, поэтому её проведение лучше обсудить с врачом.

Электрофорез с Карипазимом соединяет в себе благотворное влияние гальванического магнитного напряжения и целебные свойства лекарственного препарата. Метод зачастую применяется для лечения межпозвонковой грыжи, помогая избежать оперативного вмешательства при незначительных ее размерах.

Однако неплохие результаты эта методика демонстрирует при запущенных хронических формах недуга. Вдобавок активные составляющие Карипазима оказывают позитивное действие на хрящи, поэтому к помощи метода прибегают и в случае таких заболеваний, как артрит и артроз.

Каковы же особенности электрофореза с Карипазимом?

Специфика электрофореза

Электрофорез является известной практически всем процедурой. Она весьма эффективна и отлично помогает устранить такие недуги, как простуда, гайморит, радикулит и прочее. Суть метода элементарна – незначительное гальваническое магнитное напряжение «транспортирует» лекарственное средство непосредственно к больному органу.

Следует отметить, что именно на базе метода электрофореза профессор В. Н. Найдин запатентовал оригинальную методику для лечения межпозвоночной грыжи с помощью препарата Карипазим. После популяризации этого метода сотни тысяч человек позабыло о грыже. Сейчас электрофорез с препаратом успешно применяется в терапии таких недугов опорно-двигательного аппарата:

• межпозвоночные грыжи, включая грыжу Шморля;
• артриты, артрозы разной природы.

Лечение грыж с помощью метода

Импонирующая многим методика профессора Найдина обрела любовь и популярность огромного числа людей. В основном это заслуга повышенной результативности и доступности процедуры.

Дело в том, что для её проведения не нужно обладать высокой медицинской квалификацией, а значит, с ней справится практически любой человек.

Медикамент для электрофореза также можно купить почти в любой аптеке, а также стоимость позволяет приобрести его при любом достатке пациента. К тому же нередко эта процедура помогает больным избежать операции по удалению грыжи.

Если попытаться объяснить высокую действенность этой процедуры, то это тоже не будет сложно.

Карипазим является высокоэффективным ферментным препаратом, что изготавливается на базе таких биоактивных компонентов, как папаин, лизоцин, протеиназ и химопапаин.

Все эти составляющие синтезируют из плодов папайи (дынное дерево). Их протеолитические и муколитические свойства обеспечивают следующий эффект:

• размягчение хрящей позвоночника;
• устранение воспалительных процессов;
• повышение продуцирования коллагена, что не только помогает рубцеванию повреждённых волокон, но и улучшает их упругость.

Лечение грыжи позвоночника электрофорезом с применением Карипазима способствует уменьшению грыж в размерах, вследствие чего высвобождается ущемлённый нерв, устраняется воспаление, а значит, пропадает болезненность.

Карипазим – это белый порошок, что перед процедурой разводится в 10 мл физраствора. Чтобы усилить эффект процедуры, по инструкции рекомендуется дополнить раствор несколькими каплями Димексида. К тому же важно обратить внимание и на температуру эмульсии: она должна составлять 37 градусов.

Чтобы провести сеанс электрофореза с применением Карипазима, нужно придерживаться такого алгоритма.

Вначале к прибору подсоединяются провода с электродами, которые и будут вырабатывать гальванический ток. Чёрные провода указывают на отрицательный, а красные – на положительный полюс.

На ранее подготовленную марлевую повязку выливают раствор Карипазима (в центр).

Далее, на 2 прокладки, ранее смоченные тёплой водой, выливают содержимое 2 ампул Эуфиллина. Этот препарат обладает сосудорасширяющим и улучшающим кровообращение свойством, что обеспечивает ускоренную доставку лекарства к проблемному участку.

1. Потом прокладки кладут на нужные области: когда повреждён межпозвоночный диск шейного или грудного отдела, то их укладывают по обе стороны от позвоночника в зоне поясницы, если же пострадал пояснично-крестцовый отдел – на внутреннюю поверхность бёдер.
2. Затем отрицательные электроды чёрного цвета подсоединяются к прокладкам.
3. Важно помнить, что напряжение нужно увеличивать постепенно, так, чтобы человек не испытывал повышенного дискомфорта.

Под действием незначительного электрического напряжения ионы медикамента получают положительный заряд и таким образом легко попадают в проблемную зону, обеспечивая целебный эффект.

Зачастую такие систематические процедуры обеспечивают полное выздоровление человека.

К тому же стоит отметить, что на фоне проникновения лекарства в проблемные участки межпозвоночного диска и в силу его накопления, отмечается положительное воздействие препарата как на ткани диска, так и на коллагеновые хрящей.

Карипазим устраняет воспаления даже тогда, когда иные противовоспалительные медикаменты не справляются. Естественно, что не следует рассчитывать на мгновенный результат после первой процедуры. Чтобы эффект был заметным и стойким, всё-таки необходимо время. Доктора советуют пройти 3 курса продолжительностью по 1 месяцу, с перерывами в 30 дней между ними.

Показания и противопоказания

Основанием для проведения электрофореза с препаратом Карипазим будет наличие межпозвоночных грыж, дискогенных радикулитов, а также грыжи Шморля.

Тем не менее есть ещё ряд патологий, при которых процедура будет уместна. К ним относят:

• келоидные рубцы;
• туннельный синдром;
• невриты лицевого нерва;
• посттравматические синдромы;
• плече — лопаточный переартрит;
• артриты, артрозы любых сочленений.

Хотя уникальность и результативность этого метода неоспорима, однако она всё же обладает рядом ограничений и противопоказаний. Так, его действенность будет снижена при большой запущенной грыже, а также в случае секвестрированной грыжи. Вдобавок процедуру электрофореза не стоит делать в таких случаях, если присутствуют:

• онкологические болезни;
• инфекционные процессы;
• сердечная, почечная недостаточность;
• повреждения кожи в области крепления прокладок;
• личная непереносимость лекарства, аллергия на него.

Естественно, успешность лечения с помощью этого метода во многом зависит от качества медикамента и именно поэтому, во избежание встречи с подделками, стоит приобретать лекарство в проверенных точках.

Если же говорить об отзывах в отношении препарата, то они существенно разнятся: одни пациенты пребывают в восторге, а иные – не скрывают разочарования.

Тем не менее не стоит опираться на чужие отзывы! Единственный способ узнать, насколько подходит человеку этот метод лечения, – это испытать его на себе.

2017-03-03

Источник: https://svargroup. ru/lechenie/elektroforez-metodika-ratnera/

Электрофорез по Ратнеру – методика проведения

Электрофорез относится к одной из самых популярных и назначаемых физиотерапевтических процедур. Посредством электрофореза с помощью электрического поля неинвазивно вводят фармпрепараты. В данной статье описываются преимущества данного типа введения лекарств. Особенно подробно разбирается электрофорез по Ратнеру, который используется у грудничков.

О том, как лекарство попадает в организм

Лекарство при процедуре электрофореза проникает в ткани через потовые и сальные железы кожного покрова или слизистые оболочки, в зависимости от места проведения процедуры. Это происходит под действием электрического поля небольшой силы, которое приводит заряженные частицы лекарства в движение.

Эффект от процедуры, количество попавшего лекарственного вещества в организм зависят от начальной концентрации препарата, параметров тока, особенностей кожи пациента, а также от продолжительности электрофореза.

• Все это определяет врач при назначении данного типа физиотерапии.
• Основными плюсами данной схемы введения лекарственных средств являются:

• минимальное количество побочных эффектов, так как препарат попадает в организм, минуя пищеварительный тракт,
• местное применение помогает доставить лекарство непосредственно в зону патологии,
• безболезненность и неинвазивность, во время процедуры пациент не испытывает никаких болезненных ощущений,
• создание в коже своеобразного «депо» с лекарством, которое обеспечивает продолжительный терапевтический эффект и позволяет снизить дозировку препарата,
• иммуномодулирующее действие тока определенных параметров.

Особенно важны все перечисленные свойства данного метода в лечении детей грудного возраста.

Процедура по методу Ратнера

Данная методика электрофореза была разработана выдающимся врачом и ученым А. Ю. Ратнером, занимавшимся детскими неврологическими заболеваниями. Он обнаружил, что электрофорез с эуфиллином и папаверином оказывает благотворное влияние на грудничков при:

• нарушениях кровотока в шейном отделе позвоночника,
• травмах во время родов,
• детском церебральном параличе (ДЦП).

Также данный вид электрофореза показан при:

• повышении ликворного давления,
• повышении или понижении тонуса скелетных мышц,
• кривошее,
• нарушениях развития тазобедренных суставов,
• некоторых воспалительных процессах мягких тканей.

Как проходит процедура?

Область проведения электрофореза определяется в зависимости от зоны поражения. Это может быть шейный отдел позвоночника, суставы, другие части тела. Концентрацию лекарственного вещества, параметры тока и продолжительность процедуры определяет только лечащий врач.

Пластины электродов, обернутые салфетками с лекарством, спереди могут накладываться на воротниковую область или правую часть грудины. Сзади ─ в районе лопаток, все зависит от заболевания, на которое направлено лечение. Чаще всего полный терапевтический курс состоит из 10-15 сеансов, проводимых ежедневно или через день.

Ребенок не будет испытывать никаких неприятных ощущений в течение всей процедуры. Самым «тяжелым» испытанием для него будет полежать спокойно без движения около четверти часа.

Производимый эффект

Лечебное действие электрофореза, проводимого по методике Ратнера, обусловлено используемыми лекарственными веществами.

Процедура с Эуфиллином:

• местно расширяет кровеносные сосуды, способствует расслаблению гладких мышц,
• увеличивает диурез,
• способствует нормальной работе сердца и легких,
• понижает агрегацию тромбоцитов, чем способствует разжижению крови.

Папаверин представляет собой спазмолитик, эффективно снимающий мышечные спазмы и связанную с ними боль.

Противопоказания

Несмотря на все свои преимущества, данный метод имеет и противопоказания, среди которых:

• острое воспаление,
• повышение температуры тела,
• пониженная свертываемость крови,
• заболевания кожи (экзема, дерматиты),
• раздражение, раны в предполагаемой области электрофореза,
• аллергические реакции, непереносимость лекарственного вещества,
• бронхиальная астма, особенно в фазу обострения,
• онкологические новообразования,
• сердечная, дыхательная, почечная недостаточность.

Комплексное лечение

При многих неврологических заболеваниях, например, ДЦП, лечение редко ограничивается только электрофорезом по Ратнеру.

Вместе с ним необходимо применять и другие типы физиотерапии, такие как ультразвук, магнитотерапия, бальнеолечение. Кроме того, эффективны в лечении ребенка массаж и лечебная физкультура.

Комплекс необходимых процедур назначает врач после определения проблемы в каждом конкретном случае.

Где проводится?

Электрофорез обычно проводится в стенах лечебного медицинского учреждения ─ стационарного или амбулаторного. Если нет возможности ежедневно посещать больницу, то можно проводить данную процедуру на дому.

Можно купить себе нужный аппарат и все необходимые лекарственные препараты, получить подробные рекомендации по домашнему курсу лечения у врача-физиотерапевта или посетить один-два сеанса в больнице.

Специалиста лучше попросить показать, как делать процедуру самостоятельно. Также, для проведения первого обучающего сеанса физиотерапии можно пригласить медсестру физиотерапевтического отделения на дом.

Возможные альтернативы

В качестве альтернативы электрофорезу существует такой метод введения фармпрепаратов в тело человека как фонофорез. В основе данного типа физиотерапевтического лечения лежит использование ультразвуковых волн сходных с теми, что применяются в аппарате для УЗИ-исследования.

При фонофорезе вместо геля, который обеспечивает попадание ультразвуковых волн в организм, используют различные лекарственные препараты. Также существенным отличием является то, что при выключении аппарата тут же прекращается поступление лекарственных веществ в организм, никакого «депо» не создается.

Ограничено применение фонофореза тем, что ультразвук меняет структуру, а, следовательно, и свойства некоторых лекарственных препаратов: новокаина, витаминов, платифиллина и других. Соответственно, с такими веществами фонофорез не назначается.

В любом случае выбор нужного метода физиотерапии всегда остается за лечащим доктором и зависит от множества факторов. Электрофорез по методике Ратнера отличается от других видов физиолечения тем, что имеет свою определенную область применения, он наиболее востребован в терапии детей грудного возраста с неврологическими проблемами.

Источник: https://elesto.ru/fizioterapiya/elektroforez-po-metodike-ratnera

Электрофорез по ратнеру методика проведения

September 1, 2012

Электротерапия это способ лечения, который основан на применении электроэнергии. Электротерапия относится к патогенетическим способам терапии. Потому, что она воздействует на механизм развития болезни. При назначении данного способа лечения направляться учитывать общее состояние больного, особенности развития и течения патологического процесса, вероятные осложнения.

К способам электротерапии относятся: гальванизация, электрофорез и электростимуляция.

Гальванизация способ лечения постоянным током низкого напряжения и малой силы. Источником постоянного напряжения являются особые устройства. Механизм действия гальванизации пребывает в том, что под действием постоянного напряжения до катода направляются катионы, а до анода анионы.

Перемещение ионов провоцирует раздражение нервных рецепторов и происхождение рефлекторных реакций местного и характера. Местные реакции проявляются в виде трансформации кислотно-основного равновесия, усилением крово- и лимфообмена резорбционных процессов.

В местах действия тока образуются биоактивные соединения: серотонин, ацетилхолин, гистамин. Наряду с этим активируется метаболические процессы, секреция пищеварительных желез. Использование данного способа дает прекрасный результат при невралгиях, невритах, миозитах, артритах, тендинитах, гайморитах, асептических маститах.

Запрещается назначать гальванизацию при злокачественных опухолях, острых и гнойных процессах, геморрагическом диатезе.

Электростимуляция метод лечения с применением различных импульсных токов для трансформации функционального состояния мышечной и нервной тканей. Для этого применяют переменные синусоидные токи с частотой от 2-х до 5 тыс.

Гц, модулированные низкими частотами в диапазоне 10150 Гц. Данный способ активирует кровообращение и метаболические процессы в тканях, даёт предупреждение развитие атрофий и контрактур. Электростимуляцию назначают при парезах, параличах, атрофиях мышц.

Противопоказано применять при острых воспалительных и гнойных прорцессах.

Электрофорез с кальцием введения в организм через слизистые оболочки либо неповрежденную кожу растворов кальция. Введение препарата происходит благодаря гальваническому току. Ионы кальция попадают в эпидермис и депонируются в верхних слоях дермы. После этого они диффундируют интерстиций, эндотелий сосудов микроциркуляторного русла и лимфосусодов.

В следствии электрофореза ионы кальция попадают на глубину до полутора см, образуется необычное депо, из которого препарат попадает в клетки неспешно. Благодаря образованию для того чтобы депо обеспечивается пролонгированное воздействие препарата (от трех до 20 часов).

Конечно же, глубина проникновения и концентрация вещества зависит от длительности процедуры, силы тока и физиологического состояния кожи.

Аппаратура и методика медикаментозного электрофореза фактически не отличается от тех, что употребляются при проведении гальванизации, но при электрофорезе между прокладкой активного электрода и кожей размещается шар фильтровальной бумаги либо марли, которая намочена раствором лекарственного вещества.

Прокладку пасивного электрода пропитывают дистиллированной водой либо 0,9 % раствором натрия хлорида. Электрофорез с кальцием, другими словами катионы (кальций, натрий, цинк, калий, манган, гидроген), и антибиотики (не считая пенициллина) вводятся с позитивно заряженного электрода (катиона), а анионы с очень плохо заряженного.

В качестве растворителя лекарственных веществ довольно часто применяют дистиллированную воду, диметилсульфоксид либо 5-ти процентный раствор глюкозы.

Электрофорез с кальцием действен при спазмофилии и тетании, парезах и параличах, мышечной дистрофии; йод-электрофорез при эндемическом зобе.

Ионы лекарственных веществ, каковые вводятся при помощи гальванического тока, депонируются в коже, и подкожной клетчатке, с которых продолжительное время дифундируют и резорбируются организмом. Электрофорез с кальцием кроме этого достаточно действен при невритах, невралгиях, миозитах.

Его кроме этого назначают для стимуляции процессов рассасывания экссудата при подострых и хронических болезнях. Электрофорез с хлористым кальцием противопоказан при раковых болезнях, геморрагическом диатезе и при гнойных процессах.

Благодаря электрофорезу мы можем покрывать небольшими частицами поверхность, наряду с этим обеспечивается глубокое проникновение препаратов в разнообразные углубления и поры.

На сегодня в современной ортопедии при разнообразных болезнях опорно-двигательного аппарата медики назначают электрофорез с кальцием и фосфором. На протяжении проведения данной процедуры ионы кальция и фосфора легко попадают в эпидермис и верхние слои дермы.

Тут образуется необычное депо данных макроэлементов. Именно поэтому лечебный эффект имеет пролонгированное воздействие.

Источник: http://citytile.ru/medicine/jelektroforez-po-ratneru-metodika-provedenija.html

Электрофорез по ратнеру

Наталья11

Посещение невропатолога.

Были сегодня у невропатолога. Назначили нам электрофорез по Ратнеру №10 и кавинтон, при этом врач сказала, что у нас всё нормально. Странно… Может кому-то делали такие же назначения? Читать далее →

зиля

электрофорез

кто знает что значит электрофорез по Ратнеру Читать далее →

Татьяна

Ох уж эти диагнозы…

Вчера были на приеме у невролога в детской клинике при Медицинском центре в Коломенском. Очень приятная и приветливая доктор. все подробно объясняет, но что-то я сомневаюсь в правильности поставленного диагноза.

Она нам поставила Последствия сочетанного гипоксически-ишемического поражения ЦНС какой-то там локализации с задержкой моторных функций и вегетативной дисфункцией. Выписала лечение: 1. Гимнастика на мяче, 2. корригирующий массаж по 10-15 сеансов с акцентом на укрепление спины и конечностей. 3.

Электрофорез с эуфилином и дибазолом на …. отдел позвоночника по Ратнеру (поперечно).4… Читать далее →

Ranetka911

Что вам выписывали при кривошее?

Нам назначили Дибазол по одному порошку в день-20 шт,электрофорез по Ратнеру с никотиновой кислотой и суфиллином,и массаж с траумель-гелем.А я сегодня узнала,что первые два препарата понижают давление((Кто пил,как детки переносили? Читать далее →

Календарь развития ребенка

Мы расскажем вам реальные истории наших мамочек, которые прошли через это или проходят прямо сейчас!

Ranetka911

Будем лечить кривошею!

Ну вот наш злополучный перелом ключицы при родах и дал свои результаты-кривошея по левой стороне(( Сегодня ходили с сынулей к ортопеду,он нас научил надевать воротник Шанца,месяц надо носить не снимая.

Невролог выписала электрофорез по Ратнеру,лекарств для него в нашем районе нигде в аптеках не делают,обзвонила и еле нашла на другом конце города их,завтра будут готовы,также будем пить Дибазол в порошке,разбавляя водой.После этого снова курс массажей.

Короче,расстроенная я ужасно,начиталась в нете разных ужасов про этот диагноз-если до года не исправится,могут даже оперировать(( Читать далее →

Марина

Электрофорез или остеопат

Малышу 2 месяца. Были на приеме у невролога (врач, которому я доверяю из ЛДЦ).

Врач обратила наше внимание на то, что ребенок плохо подтягивает голову, когда его поднимаешь за ручки из положения лежа на спине, а также на то, что у него гипертонус по левой стороне (правда, не уточнила где именно).

Из назначений: электрофорез по Ратнеру с эуфиллином (что это и как?) сейчас, в 3 месяца массаж.И вот я задумалась, не стоит ли процедуру электрофореза заменить на приемы у остеопата… Читать далее →

Здоровье новорожденных

Обсудите вашу тему в сообществе, узнайте мнение активных пользователей Бэбиблога

Перейти в сообщество

Ranetka911

Топ-топ))

Из хорошего — наш Владунчик топает,уже несколько дней стал бесстрашно ходить сам дома!!!
У нас был гипертонус мышц,сделали курс массажиков на дому,пропили Дибазол,сделали курс — 20 хвойно — солевых ванн,сейчас ходим на электрофорез по Ратнеру,и вот они,положительные результаты)) Читать далее →

Ranetka911

О нас накануне годовасия))

Давно что-то не писала,а ведь пора уже подводить итоги этого месяца,а скоро и года) Мы прошли курс электрофорезов по Ратнеру,сыночек был умницей,вел себя отлично,лежал и не двигался,молодчинка наш! На неделе пойдем в поликлинику,хочу обойти невролога,ортопеда,окулиста,лора,ну и педиатра,Максюша несколько дней назад стал подкашливать,вроде бы балуется,он почему-то любит так делать,кашляет и смеется,смотрит за моей реакцией,даю Проспан,но послушать все равно нужно. Ходим пока за руки,причем за одну ходить не любит,хватается сразу же и другой,но на днях нес мячик и спокойно и уверенно топал… Читать далее →

ЯНА

Будем знакомы!

Привет девочки!!! Меня зовут Яна, 25 лет, я с Украины, есть сыночек Женечка.

Я вас читаю с телефона, но решила вот познакомиться уже и общаться, делиться новостями о нашем сыночке!)) Вот нам уже 2 месяца и 8 дней и у меня много вопросов к вам — мамочки! Родились мы 7 декабря, вес 3150 гр, рост 50 см.

Первый месяц +1500гр, + 6см. Второй месяц + 800 гр., + 1,5 см. Итого 5450гр. и 57,5 см. Что мы умеем:
1.Улыбаемся уже… Читать далее →

здоровье

Были мы в субботу у нашего дорогого доктора.-какать так и не началИтоги… Читать далее →

Источник: https://www.BabyBlog.ru/theme/elektroforez-po-ratneru

Электрофорез по ратнеру методика проведения

Электрофорез — физический метод анализа, позволяющий проводить разделение веществ, способных приобретать электрический заряд в проводящем электролите. величины электрофоретической подвижности Дает значимый результат только ,в том случае, когда экспериментальные условия точно определены. Эта подвижность зависит от характеристик вещества, его природы, размера, формы и электрического заряда.

Она также зависит от проводящей жидкости, ее природы, концентрации, pH, присутствия дополнительных растворителей и вязкости. Направление перемещения зависит от знака электрического заряда частицы, так как она движется к электроду с противоположным знаком.

• В соответствии с применяемыми методами электрофоретическая подвижность либо измеряется непосредственно, либо сравнивается с подвижностью стандартного образца.’
• Электрофорез с движущимся пограничным слоем (без носителя)
• Эта методика, используемая исключительно для определения подвижности, особенно подходит для веществ с высокой молекулярной массой и слабыми диффузионными свойствами.

Границы обычно измеряются до и после наложения электрического поля каким-нибудь физическим методом, таким, как рефрактометрия или кондуктометрия. Концентрация вещества в проводящей жидкости, характеристики последней и подробности методики, в том числе количественная оценка фракций, описаны в соответствующих частных статьях.

Зонный электрофорез

(электрофорез с использованием среды носителя)

При этом методе используют образцы только небольших размеров. Природа среды носителя (например, бумага, ацетат целлюлозы, гель крахмала, агаровый гель, полиметакриламид, смешанный гель) обусловливает дополнительные факторы, влияющие на подвижность.

Скорость перемещения зависит от подвижности частиц, а также от электро-эндосмо- тического тока (в случае носителей с полярными свойствами), от токов, обусловленных испарением (вызванным теплом, генерируемым за счет эффекта Джоуля), и от градиента электрического поля.

На практике подвижностью электрофоретических зон и их знаками пренебрегают; зоны обнаруживают эмпирически или путем сравнения с поведением стандартного образца в тех же условиях.

После разделения составных частей положение бесцветных веществ может быть определено путем обработки элек- трофореграмм реактивом, который переводит их в окрашенные или флуоресцирующие производные.

Для количественных целей пятно (зона) может быть тщательно выделено, вещество элюировано подходящим растворителем и затем определено непосредственно или после химической реакции достаточно чувствительным методом, таким, как спектрофотометрическое измерение.

По другой ‘количественной методике после превращения вещества в окрашенное производное интенсивность зоны можно измерить при помощи сканирующего денситометра.

Ниже перечислены составные части прибора для электрофореза на среде-носителе.

Источник постоянного тока, предпочтительно со стабилизированным напряжением.

Камера для электрофореза, обычно в форме параллелепипеда, выполненная из стекла или прочного пластического материала, с плотной воздухонепроницаемой крышкой, обеспечивающей поддержание атмосферы насыщенной влажности.

В противоположные стенки камеры запаяны два изолированных проводника, на конце ‘каждого из них ‘имеется внутренний соединитель, к которому присоединены электроды из платиновой проволоки. В целях безопасности камера должна быть снабжена приспособлением, обеспечивающим прерывание электропитания при снятии крышки.

В камере у двух противоположных сторон вставлены две двойные кюветы, разделенные вдоль на две равные половины. В другом варианте эти кюветы могут быть частью самой камеры. Вдоль основания каждого из внешних отделений кювет проложен один платиновый электрод.

Электроды соединены через наружный изолированный кабель с источником постоянного тока напряжением не менее 450 В при 150 мА. Источник энергии должен быть оборудован прибором, контролирующим и указывающим напряжение, а также потребление тока. Для стабилизации напряжения может быть встроена дополнительная цепь.

Держатель. Если используют бумагу или ацетат целлюлозы, полоски носителя, пропитанные проводящей жидкостью, укрепляют с помощью соответствующего приспособления в определенном положении, а их концы погружают в кюветы с электродами. При электрофорезе на геле ровный слой геля помещают клеющей стороной на стекло и и-каждому -концу слоя присоединяют электрические клеммы.

1. ‘ Приспособление для обнаружения и измерения пятен.
2. , ■ РЕКОМЕНДУЕМАЯ МЕТОДИКА
3. Электрофорез на бумаге

• Для определения .пригодна камера длиной около 50 см, шириной, 38 см и глубиной 4,5 см с кюветами, внутренняя длина которых составляет около 37 см, ширина 5 см и ‘внутренняя глубина 2 см. 7 •:

г » Бумага для электрофореза представляет собой., подходящую фильтровальную бумату (пригодна бумага .’Ватман 3 ММ ■нлиганалогичная ей), промытая хроматографически лгодходя- -ЩИМ растворителем, если в статье есть на это указание. Бумагу разрезают на полоски подходящего размера и.на расстояний около 13 см от одного конца карандашом прочерчивают базовую линию.

Заполняют кюветы прибора проводящей жидкостью, указанной в статье. Полоски бумаги для электрофореза (около 30X5 см) помещают в кюветы так, чтобы между наружным и внутренним отделениями образовался мостик; электроды должны быть полностью погружены в проводящую жидкость во внутренних отделениях.

Наносят отдельно в точки вдоль базовой линии на бумаге на расстоянии не менее 1 ом от края бумаги и не менее 2,5 см друг от друга объемы растворов, приготовленных, как указано в статье.

Дают пятнам высохнуть и затем помещают конец бумаги,, ближайший к ‘базовой линии, во внутреннее отделение кюветы, связанное с анодом, а другой конец бумаги — во внутреннее отделение кюветы, связанное с катодом. С помощью кисти смачивают бумагу проводящей жидкостью, начиная с концов бумаги в направлении базовой линии. Не смачивают полоску, на которой находится нанесенное вещество.

Закрывают крышку и дают жидкости диффундировать через базовую линию; если необходимо, закрывают прибор, чтобы защитить его от действия света, соединяют кабель с источником энергии и включают ток.

Доводят напряжение примерно до 20 В на 1 см бумаги между кюветами и дают процессу протекать в течение указанного времени или до тех пор, пока маркерное вещество не пройдет определенное расстояние. Выключают ток, вынимают бумагу, высушивают в токе воздуха, защищая, если необходимо, от действия света, и оценивают полученную элек- трофореграмму в условиях, описанных в статье.

Если статьей предписано применение маркерного вещества, результат испытания считается достоверным только в том случае, если это вещество продвинется от базовой линии на указанное расстояние.

Если интенсивность любого дополнительного пятна, полученного с испытуемым веществом, меньше, чем интенсивность пятна, полученного с раствором стандартного образца, вещество соответствует требованиям. Если указано в статье, опрыскивают бумагу равномерно с обеих сторон реактивом, проводят дальнейшую предписанную обработку для завершения реакции и применяют те же критерии для оценки полученных пятен.

• Электрофорез на полосках ацетата целлюлозы
• Предпочтительно использовать камеру меньших размеров, чем при электрофорезе на бумаге; удобна камера размером около 25X24 см с кюветами 10×23 см.
• Полоски полиацетата целлюлозы соответствующего качества размером 2,5х 17 см погружают в проводящую жидкость приблизительно за 1 ч до использования.

На полооки на расстоянии 8 см от их конца наносят растворы, приготовленные, как указано в статье, и в указанных объемах, затем проводят электрофорез, как описано в методике электрофореза на бумаге. Полосы окрашивают, промывают и, чтобы они стали прозрачными, обрабатывают методом, указанным в статье, где также описан метод оценки электрофореграмм.

Электрофорез на геле

Внутренний носитель представляет собой слой геля агара или крахмала подходящей консистенции толщиной 1—2 мм и имеет форму удлиненного прямоугольника.

Проводящую жидкость либо вводят в слой геля, либо после того, как гель сформировался, опрыскивают ею слой до полного смачивания. Раствор вещества помещают на поверхность слоя геля или внутрь отверстий, вырезанных в слое для этой цели.

Слой геля соединен своими узкими концами с двумя кюветами, содержащими проводящую жидкость; соединение осуществляется при помощи фитилей из двойного слоя марли, смоченной проводящей жидкостью.

Затем слой геля на его держателе и соединения помещают в камеру.

Электрофоретический процесс осуществляют с помощью постоянного электрического тока. Для устранения тепла, генерируемого за счет эффекта Джоуля, через пластинку держателя во время испытания должна циркулировать вода или другая подходящая охлаждающая жидкость.

После завершения процесса полученные пятна или площади миграции обнаруживают подходящим методом, указанным в частной статье; например, может быть определена зона угнетения после соответствующей инкубации, если испытуемое вещество является антибиотиком и соответствующий тест- организм был включен в слой геля, или применен какой-либо химический метод.

Источник: https://deti.medicalfirst.ru/jelektroforez-po-ratneru-metodika-provedenija/

описание процедуры, показания и противопоказания, действие, отзывы

Электрофорез – это метод безопасного и безболезненного введения медицинских препаратов к очагу повреждения. Под воздействием электрических импульсов лекарственные средства превращаются в мельчайшие частицы, называемые ионами, которые впоследствии доставляются в пораженные области. Препараты хранятся в слоях дермы и постепенно с током крови и лимфы расходятся по всему организму.

Как действует электрофорез

Для электрофореза используется гальванический ток – это электрический ток постоянного невысокого напряжения и небольшой силы. Под его воздействием в кожу и слизистые оболочки вводятся частицы лекарственного средства. Самой большой подвижностью обладают ионы тех лекарств, которые растворяется в воде. Оно попадает в эпидермис и накапливается в верхнем слое дермы. Под действием электрического тока медикаменты углубляются до полутора сантиметров, образуя своеобразное хранилище, из которого поступают в клетки и ткани органов.

Основные преимущества электрофореза

Электрофорез с никотиновой кислотой – это движение в электрическом поле заряженных ионов витамина PP. Проникая в ткани различных органов, лекарственное средство равномерно распределяется в межклеточной жидкости и клетках. При выполнении этой процедуры могут использоваться не только гальванические, но и диадинамические, синусоидальные модулированные, флюктуирующие и выпрямленные токи. Сущность процедуры от этого не меняется – никотиновая кислота доставляется в нужное место с помощью электрического тока. Благодаря этой процедуре под кожей создается и хранится запас лекарства, который постепенно расходуется.

Никотиновая кислота продолжительный период медленно поступает в кровоток, улучшая работу больного органа. Благодаря электрическому току ее действие усиливается, поэтому доза препарата вводится незначительная. Кроме этого, выведение лекарства также происходит медленно. Процедура совершенно не причиняет боли, поэтому очень часто врачи назначают грудничкам электрофорез с никотиновой кислотой.

Особенности применения «Эуфиллина»

«Эуфиллин» представляет собой сложный препарат, который используется для:

• снятия спазмов бронхов;
• расслабления гладкой мускулатуры;
• увеличения диуреза;
• уменьшения тромбообразования;
• снижения внутричерепного давления;
• обезболивания;
• улучшения кровотока.

Электрофорез с эуфиллином противопоказан при проблемах с печенью, почками, сердцем и непереносимостью препарата. Могут возникнуть побочные реакции в виде головной боли, снижения давления, нарушения сна. В процессе манипуляции наблюдаются небольшие покалывания.

Использование никотиновой кислоты для электрофореза

Никотиновая кислота или ниацин – это витамин PP, способствующий улучшению кровообращения. Он содержится в небольших количествах в рыбе, молоке, крупах и фруктах, дрожжах. Искусственные аналоги витамина выпускаются в таблетках. Раствор никотиновой кислоты для электрофореза способствует:

• Улучшению углеводного обмена. Его используют при заболеваниях сердца, органов пищеварения, печени и сахарном диабете.
• Заживлению ран на слизистых оболочках и коже.
• Расширению сосудов.
• Разжижению крови.
• Снижению уровня холестерина крови.

Кроме этого, никотиновая кислота оказывает положительное влияние на работу головного мозга и нормализует артериальное давление.

С эуфиллином и никотинкой

Электрофорез с эуфиллином и никотиновой кислотой нередко используется для лечения детей до года при:

• травмах малыша во время родов;
• гидроцефальном синдроме;
• гипо- или гипертонусе мышц.

Для взрослых электрофорез с этими двумя препаратами применяют при:

• болях в спине;
• восстановлении кровообращения головного мозга;
• болезнях шейного отдела позвоночника;
• нормализации кровотока в конечностях.

Следует помнить, что длительное введение больших доз никотиновой кислоты опасно возникновением жировой дистрофии печени.

Требования к лекарствам для электрофореза

При электрофорезе используют только те препараты, которые под воздействием электрического тока способны проникать в дерму. Они вводятся самостоятельно и в комплексе с использованием других средств для усиления эффекта. Электрофорез можно проводить, если:

• лекарственный препарат не содержит примесей;
• раствор приготовлен перед использованием;
• для приготовления применялась дистиллированная вода;
• в случае нерастворимости препарата в воде используется медицинский спирт или «Димексид»;
• готовится раствор ферментов, то растворителем служат буферы;
• во время всего курса полярность электродов остается неизменной.

Надо отметить, что использовать в качестве растворителя физиологический раствор нельзя. Количество медицинского препарата, который поступает в организм, зависит от:

• возраста больного;
• индивидуальных особенностей организма;
• состояния кожи;
• площади поверхности электрода;
• силы и плотности тока;
• используемого растворителя;
• продолжительности процедуры;
• количества препарата.

Электрофорез с никотиновой кислотой грудничку. Отзывы

Часто при различных родовых травмах, внутриутробных отклонениях или возникших заболеваниях грудничкам назначают процедуру электрофореза с никотиновой кислотой. Она расслабляет мышцы малыша, оказывает противовоспалительное и анальгезирующее действие. Ее назначают при следующих патологических состояниях:

• кривошея, дисплазия суставов;
• неврологические расстройства;
• диатез;
• переломы, вывихи;
• нарушение мышечного тонуса;
• болезни пищеварительной системы;
• воспаления дыхательной и мочевыделительной системы;
• стоматит;
• глазные заболевания;
• родовые травмы;
• реабилитация после операции.

Электрофорез с никотиновой кислотой для детей является безопасной процедурой и переносится лучше, чем инъекции, но ее нельзя проводить при:

• почечной и сердечной недостаточности;
• склонности к аллергии;
• плохой свертываемости крови;
• наличии новообразований;
• бронхиальной астме;
• гнойничковых высыпаниях;
• непереносимости электротока;
• повышенной температуре;
• повреждениях кожных покровов.

Для грудничков часто используют никотиновую кислоту совместно с эуфиллином. Это дает положительный эффект при нарушении тонуса мышц, родовых травмах и гидроцефалии. Перед процедурой доктор проводит обследование малыша и выявляет противопоказания.

Мнения родителей, детям которых был назначен электрофорез с никотиновой кислотой, неоднозначны. Одни из них считают, что процедуры имеют хороший эффект. Груднички быстрее восстанавливались после родовых травм, особенно если был поврежден шейный отдел. Малыши начали держать головку, переворачиваться и ползать. Другие отмечают, что после нескольких процедур электрофореза с никотиновой кислотой, дети становятся беспокойными, отказываются от груди, у них нарушается сон, появляется аллергическая реакция на коже. Малышам старше четырех месяцев тяжело пролежать без движения весь сеанс.

На самом деле, электрофорез является полезной и безопасной процедурой для грудничков. Лекарство доставляется прямо в пораженные зоны, и ребенок не получает нагрузки на внутренние органы, что очень важно для неокрепшего организма.

Как проводится процедура?

Электрофорез выполняется в физиотерапевтическом кабинете специально подготовленным медицинским персоналом. Для лечения детей раннего возраста, как правило, назначается десять сеансов, каждый из которых длится от 5 до 25 минут. Перед процедурой (за полчаса до нее) ребенок должен быть накормлен. Проводят манипуляцию следующим образом:

• Ребенок находится в горизонтальном положении. В исключительных случаях разрешают держать его на руках.
• Марлевую салфетку смачивают в составе лекарственного средства и накладывают на область поражения, фиксируя тканевой повязкой.
• Электроды помещают на салфетку, включают электрический ток и следят за реакцией малыша. Он испытывает легкие покалывания.
• После завершения сеанса кожу протирают чистой салфеткой и смазывают детским кремом.

В случае необходимости повторный курс лечения проводится не раньше, чем через месяц. А также существуют и другие методики электрофореза с никотиновой кислотой:

1. Полостная – в полость больного органа (влагалище или прямую кишку) вводят лекарство и один электрод, а второй оставляют на внутренней поверхности тела. Метод применяется при болезнях органов малого таза и толстого кишечника.
2. Ванночковая – емкость наполняют медикаментозным средством и погружают в нее поврежденную конечность.
3. Внутритканевая – при помощи инъекции вводят препарат и на эту же область накладывают электроды. Этот метод дает хороший эффект при заболеваниях дыхательной системы: бронхите и ларингите.

Электрофорез шейно-воротниковой зоны

Безопасность и высокая эффективность лечения токами приобрела большую популярность. Электрофорез с никотиновой кислотой на воротниковую зону используется при повреждении челюстно-лицевых мышц. Он нормализует поврежденные ткани и восстанавливает работу мышц.

Для проведения процедуры используют специальный прибор, генерирующий ток. На пациента надевают специальную прокладку, которая закрывает плечи, шею и лопатки. Под нее кладут фильтровальную бумагу, смоченную теплым раствором никотиновой кислоты. Температура раствора доводится до 38 градусов. Один электрод закрепляют на прокладке, а другой кладут между поясницей и крестцом. Расчет дозировки для проведения электрофореза с никотиновой кислотой на воротниковую зону делается индивидуально для каждого пациента. При этом учитывают:

• плотность тока;
• размер прокладки;
• время проведения процедуры;
• концентрацию кислоты;
• способность препарата распадаться на ионы;
• индивидуальные особенности организма к воздействию электрического тока.

Плотность тока зависит от величины прокладки и находится в обратно пропорциональной зависимости. Во время процедуры сила тока постепенно увеличивается. Курс лечения состоит из 15–20 процедур. При необходимости его можно повторить спустя месяц.

Техника электролечения

Для лечения электрофорезом применяют разные техники, имеющие большую эффективность для лечения определенных заболеваний. Вот несколько из них:

• По Бургиньону (глазнично-затылочный) – на глаз поверх закрытых век кладут маленькую прокладку, пропитанную лекарственным средством. Вторую – помещают на задней поверхности шеи. Манипуляция продолжается полчаса, сила тока 4 мА. Такое лечение действенно при неврите тройничного или лицевого нерва, при воспалениях и травмах сосудов головного мозга.
• По Ратнеру – применяют при сбое кровообращения в отделе шеи, ДЦП Особенно широко используется электрофорез по Ратнеру с никотиновой кислотой для лечения послеродовых травм у детей.
• Назальный – тампон с лекарством вставляют в обе ноздри и прикладывают электрод. Второй размещают на задней стороне шеи с прокладкой 8 х 10. При силе тока в 2 мА манипуляция длится от 10 до 20 минут. Этот электрофорез эффективен для лечения головного мозга с сосудистыми, воспалительными и травматическими патологиями, а также при сбое обменных процессов и язвенных поражениях желудка.

Использование электрофореза для лечения глазных заболеваний

В офтальмологической практике нередко применяют электрофорез на закрытые веки по Бургиньону. Этот щадящий метод лечения используется сразу после травм или операций, при изменениях эпителия роговицы, воспалительных процессах, кровоизлияниях в среде глазного яблока. Особенно часто дети в школьном возрасте страдают миопией. Большая зрительная нагрузка во время учебного процесса и постоянная работа на компьютере приводит к снижению кровотока, что провоцирует слабость аккомодации и дистрофию в диске зрительного нерва.

В профилактических целях для приостановки прогрессирования миопии используют препараты для улучшения гемодинамики глаза и усиления обменных процессов в сетчатой оболочке. Одним из таких лекарственных средств и является витамин PP. А электрофорез с никотиновой кислотой для глаз признан эффективной и безболезненной процедурой. Противопоказания к проведению – это повреждение кожи век, слизисто-гнойные выделения, повышенное внутриглазное давление, различные новообразования и индивидуальная непереносимость.

Электрофорез при остеохондрозе шейного отдела позвоночника

Недостаток движения и сидячий образ жизни часто приводит к деформации шейных позвонков, а это вызывает возникновение остеохондроза. Развитию болезни способствует:

• неправильная поза посадки за столом;
• несимметричная работа мышц позвоночника;
• ношение сумки на одном плече;
• выполнение физических нагрузок без разминки;
• использование мягких матрасов и подушек;
• избыточный вес.

Остеохондроз является хроническим заболеванием, излечить недуг полностью невозможно. Однако снять боль в период обострения и облегчить состояние пациента вполне возможно. Для этого врачи часто назначают электрофорез с никотиновой кислотой. Витамин PP положительно влияет на:

• метаболические процессы, стабилизируя их;
• улучшение липидного и углеводного обмена;
• расширяет кровеносные сосуды, в результате нормализуется кислородный обмен и питание тканей хряща.

Процедуры проводятся ежедневно, курс лечения – это десять манипуляций. Остеохондроз – тяжелое заболевание, причиняющие сильные боли. Иногда для облегчения состояния и усиления эффекта применяют электрофорез с эуфиллином и никотиновой кислотой. Такое лечение дает хороший результат, и больной быстро восстанавливается.

Электрофорез в гинекологии и при беременности

В гинекологии электрофорез широко используется для терапии воспалительных хронических процессов. Его используют для лечения эндометриоза и эрозии шейки матки. В этом случае используют метод тканевого электрофореза, когда лекарство проникает прямо в район повреждения. Без острой необходимости беременным женщинам витамин PP не выписывают, он может содержаться только в витаминных комплексах. Дополнительные дозировки препарата и электрофорез с никотиновой кислотой показан при:

• патологии плаценты;
• нарушении функционирования печени, спровоцированной беременностью;
• зависимости беременной женщины от алкоголя и наркотиков;
• склонности к тромбообразованию;
• многоплодной беременности.

В результате у рожениц происходит улучшение оттока лимфы и снабжение кислородом плода. Процедура должна проходить строго под наблюдением врача. При грудном вскармливании электрофорез с никотиновой кислотой делать не желательно.

Побочные эффекты

Электрофорез – это одна из самых безопасных процедур, которая не вызывает тяжелых осложнений. Хотя у грудничков отмечают появление следующих побочных эффектов:

• В месте наложения электродов происходит покраснение дермы.
• Возможны раздражения кожных покровов.
• Во время процедуры ребенок ощущает покалывание. Некоторые малыши начинают капризничать и срывать электроды.

У детей постарше и взрослых во время проведения электрофореза с никотиновой кислотой или через определенное время возможно:

• появление красных пятен, шелушения кожи или волдырей;
• учащенное сердцебиение;
• затрудненное дыхание, одышка, кашель;
• ухудшение общего состояния — появление вялости сонливости, отсутствие аппетита;
• повышение температуры тела.

При обнаружении вышеописанных симптомов во время сеанса процедура прекращается. Возникновение признаков недомогания дома требует немедленного обращения в больницу, где врач даст соответствующие рекомендации по устранению возникшей ситуации.

Электрофорез с никотиновой кислотой, отзывы о котором в большей степени положительны, очень широко применяется в медицине и косметологии. Хотя есть пациенты, которым пришлось отказаться от процедур из-за аллергических реакций на препарат или электрический ток. Несмотря на это, электрофорез положительно воздействует на организм как грудничков, так и взрослых людей.

Методика электрофорез по ратнеру :: Lesson study

МЕТОДИКИ КЛАССИЧЕСКОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. Данные методики взяты с сайта: «Физиотерапия и электролечение» по адресу.

Слово «электрофорез» включает в себя две части: «электро» — то есть подразумевается. Суть электрофореза и основные методики.

Электрофорез проводили по методике А. Ю. Ратнера: на область шейного отдела позвоночника (позвонки С2-С6) с анода вводили эуфиллин 2%, с катода на…

ВБШ на Учительской (Высшая Банковская Школа) » Свежие новости » электрофорез по ратнеру методика.

Возможно и назначение электрофореза ганглиоблокаторов или новокаина по методике А. Ю. Ратнера (анод — на шейный отдел позвоночника, катод — на грудную.

Электрофорез лекарственный (синоним: гальваноионотерапия, ионогальванизация, Электрофорез лекарственный по шейно-лицевой методике.

Гальванизация и лекарственный электрофорез(методика № 32 – 41). Гальванизация области кисти руки.

Электрофорез: суть процедуры, методики и техники проведения. Иногда врачи назначают нам лекарственные препараты. Каждый препарат.

Общая гальванизация и электрофорез по Вермелю. Гальванический воротник по Щербаку. Гальванизация продольная и электрофорез позвоночника. Гальванизация и электрофорез слизистой оболочки носа по…

При дизартриях (по методике Анашкина) накладывают грязевую лепешку на При явлениях гидроцефалии электрофорез по Ратнеру: прокладка с 0,5.

Электрофорез проводился по методике Ратнера: электрод, смоченный 1% раствором эуфиллина, устанавливается на уровне шейных позвонков С2-С6 электрод.

Методики лекарственного электрофореза. Процедура электрофореза по Ратнеру применяется для лечения нарушений.

Кто знает что значит электрофорез по Ратнеру. Повышенная активность ступней ног и кистей рук.

Электрофорез с прозерином

АНМО «Ставропольский краевой клинический консультативно-диагностический центр»:

355017, г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Посмотреть подробнее

Обособленное подразделение «Диагностический центр на Западном обходе»:

355029 г. Ставрополь, ул. Западный обход, 64

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-68-89 (факс)

Посмотреть подробнее

Клиника семейного врача:

355017 г. Ставрополь, пр. К. Маркса, 110 (за ЦУМом)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-50-60 (регистратура)

Посмотреть подробнее

Невинномысский филиал:

357107, г. Невинномысск, ул. Низяева 1

(86554) 95-777, 8-962-400-57-10 (регистратура)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Черкесске :

369000, г. Черкесск, ул. Умара Алиева 31

8(8782) 26-48-02, +7-988-700-81-06 (контактные телефоны)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Элисте :

358000, г. Элиста, ул. Республиканская, 47

8(989) 735-42-07 (контактные телефоны)

Посмотреть подробнее

ЗАО «Краевой клинический диагностический центр»:

355017 г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Савченко, 38 корп. 9:

355021, г. Ставрополь, ул. Савченко, 38, корп. 9

8 (8652) 316-847 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Чехова, 77 :

355000, г. Ставрополь, ул. Чехова, 77

8(8652) 951-943 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Михайловске:

358000, г. Михайловск, ул. Ленина, 201 (в новом жилом районе «Акварель»).

8(988) 099-15-55 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Додецилсульфат натрия — обзор

2 Анализ агрегатов по AUC

SDS PAGE обеспечил быстрое и чувствительное обнаружение в условиях, когда белок был развернут и, таким образом, использовался в основном для определения чистоты и молекулярной массы белков, продуцируемых рДНК. Этот метод также предоставил быстрый способ исследования сшивания дисульфидов с помощью SDS PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Хотя SDS PAGE является инструментом быстрого скрининга, он предоставил лишь ограниченную информацию о самоассоциации белков, поскольку метод включал связывание фиксированного количества SDS / г, что приводило к образованию развернутых препаратов белка.Развитие эксклюзионной хроматографии (SEC) как высокоэффективного и высокопроизводительного метода позволило определить распределение по размеру в условиях, когда белок был правильно свернут. Однако молекулярная масса была определена косвенно с использованием набора эталонных стандартов, поскольку SEC приводил к разделению молекул по гидродинамическому объему (Andrews, 1970; Whitaker, 1963). Таким образом, молекулярные массы нескольких белков были определены ошибочно из-за больших гидродинамических объемов, которые не были адекватно определены при использовании компактных простых стандартов глобулярных белков. Разработка линейных детекторов статического светорассеяния (SLS) позволила обойти эту проблему, поскольку средневесовую молекулярную массу белка в отдельных пиках, генерируемых и обнаруживаемых SEC, можно было определить без использования стандартов глобулярных белков (Wen, Arakawa, & Philo , 1996). Несмотря на эти улучшения, взаимодействие с матрицей столбцов и часто требования к использованию условий раствора, которые сильно отличались от окончательно сформулированных растворов белков, по-прежнему приводили к ошибочным результатам, например.ж., заниженная оценка агрегированного содержания или неправильное определение молекулярной массы (Carpenter et al., 2010; Philo, 2009). Кроме того, самоассоциация белков может сильно зависеть от концентрации, что приводит к обнаружению только мономера для слабого взаимодействия с помощью SEC из-за большого разбавления, которое часто происходит во время подготовки образца, а также во время хроматографии. Еще одна проблема, связанная с использованием SEC, — это возможная фильтрация очень крупных агрегированных частиц.

В общем, агрегация белков нежелательна, поскольку она может привести к снижению активности и изменению фармакокинетики (Klotz & Thomas, 1993; Maggio, 2010; Shao, Li, Krishnamoorthy, Chermak, & Mitra, 1993).Агрегаты также участвуют в усилении иммунного ответа (Moore & Leppert, 1980; Ratner, Phillips, & Steiner, 1990; Ring, Stephan & Brendel, 1979; Underwood, Voina, & Van Wyk, 1974) и побочных эффектах, связанных с в белковые агрегаты также сообщалось (Demeule, Gurny, & Arvinte, 2006; Ryan, Webster, & Statler, 1996; Seidl et al., 2012). По этим причинам регулирующие органы обеспокоены тем, что результатов SEC может быть недостаточно для оценки фактического распределения молекулярных размеров в белковых растворах.Часто регулирующие органы запрашивают альтернативные биофизические измерения, такие как SLS, фракционирование полевого потока, динамическое рассеяние света или AUC, чтобы продемонстрировать, что метод SEC в системе управления подходит для мониторинга белковых агрегатов. Пределы точности и точности измерений AUC были исследованы с использованием трех mAb неустановленного происхождения (Pekar & Sukumar, 2007). Это исследование показало точность ± 0,3% в измеренном диапазоне от 0,6 до 67% агрегата. Хорошая точность, подтвержденная экспериментами с совокупными пиками, может быть достигнута вплоть до совокупного уровня всего 1.5%. Габриельсон и Артур также обсудили дополнительные исследования с использованием AUC, которые исследуют точность, точность и факторы, влияющие на измерения при низких совокупных концентрациях (Gabrielson & Arthur, 2011), и большая часть этой работы рассмотрена и обновлена ​​в другой главе этого текущего выпуска. методов в энзимологии.

Примеры использования AUC для подтверждения результатов SEC для белков включают исследования двух гуманизированных mAb, хранящихся при -70 и 40 ° C (Liu, Andya, & Shire, 2006), и исследование агрегатов гуманизированного mAb (Andya, Liu, & Shire, 2010) и анализ агрегатов рекомбинантных гликопротеинов (Hughes et al., 2009). В исследовании Andya et al. SEC и AUC использовались для определения процента агрегатов в одном и том же образце mAb. Хотя SEC показал пик единственного мономера на 99,6% с небольшим количеством агрегированных частиц, анализ AUC показал значительный агрегированный пик (фиг. 1A). Это количество агрегата зависело от концентрации, как показал анализ скорости седиментации при различных концентрациях нагрузки (рис. 1В), а также определение средневзвешенной молекулярной массы по седиментационному равновесию (рис.1С). Это еще раз показывает, что значительная агрегация из-за обратимой самоассоциации белков может быть пропущена анализом SEC из-за диссоциации в среде с высокой ионной силой мобильной фазы SEC или разбавления во время хроматографии. Оба этих тематических исследования показывают, что для биофармацевтических применений AUC обеспечивает явное преимущество, заключающееся в проведении анализа распределения белков по размерам в буферных условиях, которые более важны для составления и доставки продукта.

Рисунок 1.Распределение размеров полноразмерных mAb, определяемое с помощью (A) SEC и (B) скорости оседания AUC. (C) Средневзвешенный коэффициент седиментации в зависимости от концентрации белка, наблюдаемый во время анализа скорости седиментации AUC mAb в PBS. (D) Средневзвешенная молекулярная масса, определенная с помощью седиментационного равновесия AUC mAb в PBS.

Воспроизведено Andya et al. (2010).

Agar — обзор | ScienceDirect Topics

2.2.6 Агаровые наноносители

Агар — это высушенный гидрофильный коллоидный полисахаридный комплекс, экстрагированный из агароцитов водорослей семейства Rhodophyceae .Агар представляет собой смесь двух компонентов: линейного полисахарида, известного как агароза, и гетерогенной смеси более мелких молекул, называемой агаропектином. Для агарозы выделяются три структурных крайности: нейтральная агароза; пируватированная агароза с низким содержанием сульфатирования; и сульфатированный галактан (рис. 2.2). Агароза содержит 1,3-связанные звенья d-галактозы и 1,4-связанные 3,6 ангидро-1-галактозы, при этом очень небольшое количество гидроксилов сульфатируется. Хотя агаропектин более сложен, чем агароза, он содержит, помимо звеньев d-галактозы и 3,6-ангидрогалактозы, d-глюконовую кислоту, пировиноградную кислоту и гораздо более высокую долю сложноэфирных групп сульфата (Lee et al., 2011).

Агар в качестве фармацевтического наполнителя использовался как эмульгирующий агент, загуститель, стабилизатор; мукоадгезив, основа для неплавящихся нерасщепляющихся суппозиториев, суспендирующий агент, разрыхлитель таблеток, связующее, агент, повышающий вязкость, и способствующий эффекту замедленного высвобождения (Varshosaz et al., 2015).

Для получения НЧ на основе агара использовались различные методы, например: эмульгирование, гелеобразование распылением, мембранное эмульгирование и нанопреципитация (рис.2.3). Было продемонстрировано, что условия производства, например концентрация агара и скорость гомогенизатора, сильно влияют на характеристики агаровых НЧ (Lee et al., 2011).

Сообщений об использовании НЧ агара для доставки лекарств немного (таблица 2. 3). Варшосаз и др. сообщили об успешной доставке в легкие бупропиона HCl, включенного в наносферы агара, с использованием хлорида кальция в качестве сшивающего агента в сочетании с агентом, повышающим проницаемость (HPβCD). При надлежащей оптимизации условий производства НЧ (скорость гомогенизации, процент агара и сшивающего агента) для этих НЧ были достигнуты оптимальное высвобождение (более 5 ч) и свойства мукоадгезии (Варшозаз и др., 2015).

Zaki et al. (2015) оценили использование генетического алгоритма, искусственной нейронной сети и методологии поверхности отклика для оптимизации процесса производства наносфер агара.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

ПРАЙМ PubMed | [Концентрация белков и белковых фракций сыворотки крови и мочи (по данным электрофореза в крахмальном геле) при различных морфологических типах гломерулонефрита]

Цитирование

Ратнер М. Я и соавт.«[Концентрация белков и белковых фракций сыворотки крови и мочи (по данным электрофореза в крахмальном геле) при различных морфологических типах гломерулонефрита]». Терапевтический архив, т. 46, нет. 7, 1974, стр. 45-54.

Ратнер М.Я., Чиж А.С., Лованова Э.Д. Концентрация белков и белковых фракций сыворотки крови и мочи (по данным электрофореза в крахмальном геле) при различных морфологических типах гломерулонефрита. Тер Арх .1974; 46 (7): 45-54.

Ратнер М.И.А., Чиж А.С., Лованова Е.Д. (1974). Концентрация белков и белковых фракций сыворотки крови и мочи (по данным электрофореза в крахмальном геле) при различных морфологических типах гломерулонефрита. Терапевтический Архив , 46 (7), 45-54.

Ратнер М. Я., Чиж А.С., Лованова Э.Д. Концентрация белков и белковых фракций сыворотки крови и мочи (по данным электрофореза в крахмальном геле) при различных морфологических типах гломерулонефрита. Тер Арх. 1974; 46 (7): 45-54. PubMed PMID: 4409012.

TY — JOUR
Т1 — [Концентрация белков и белковых фракций сыворотки крови и мочи (по данным электрофореза в крахмальном геле) при различных морфологических типах гломерулонефрита].
AU — Ратнер, М. Я.,
АС — Чиж, А С,
AU — Лованова Э. Д,
PY — 1974/1/1 / pubmed
PY — 1974/1/1 / medline
PY — 1974/1/1 / entrez
СП — 45
EP — 54
JF — Терапевтический архив
JO — Тер Арх
ВЛ — 46
ИС — 7
SN — 0040-3660
UR — https: // neuro.unboundmedicine.com/medline/citation/4409012/[concentration_of_proteins_and_protein_fractions_of_blood_serum_and_urine__according_to_the_data_of_electrophoresis_in_starch_gel__in_different_morphological_types_onephglobal
L2 — http://www.diseaseinfosearch.org/result/3081
БД — ПРЕМЬЕР
DP — Unbound Medicine
ER —

Методы микроочистки в анализе амилоидных белков

• AA, амилоидный белок A
• Aβ, амилоидный β-белок или пептид
• AβPP, предшественник β-амилоидного белка
• AD, болезнь Альцгеймера
• AL, амилоидные цепи
• AL, амилоидные цепи
• иммуноглобулин39
• апо, аполипротеин
• ATTR, амилоидный транстиретин
• ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография
• PVDF, поливинилдифторид
• SAA, сывороточный амилоид A протеин
• SDS, додецилсульфат натрия
• SDS-PAGE, натрийдодецилсульфат, натрийдодеакрилатный гель, полидоловый сульфат натрия электрофорез
• TFA, трифторуксусная кислота
• TTR, транстиретин

Развитие небольших методов очистки белков продиктовано необходимостью анализа биологических образцов, которые доступны только в очень малых количествах. Такие методы также необходимы для биохимического исследования амилоидных белков, содержащихся либо в образцах диагностической биопсии, либо в небольших количествах доступного посмертного материала, либо в тканях мелких животных с экспериментально индуцированным амилоидозом. ¹

«Описано не менее 20 различных белков амилоидных фибрилл, многие из которых связаны с различными клиническими формами амилоидоза»

Амилоидоз — это деструктивное патологическое состояние, которое возникает как первичное заболевание или связано с другими заболеваниями и характеризуется отложением амилоида в различных тканях и органах организма.Амилоидные отложения, обнаруживаемые при различных клинических формах амилоидоза, имеют общие морфологические и тинкториальные свойства. Амилоид состоит из параллельных массивов жестких фибрилл, которые имеют конфигурацию β-складчатого листа и демонстрируют типичное зеленое двойное лучепреломление на гистологических срезах, окрашенных конго красным и просматриваемых в поляризованном свете. Он состоит в основном из белковых фибрилл (амилоидных фибрилл) вместе с другими нефибриллярными белками, преимущественно гликозаминогликанами, протеогликанами и амилоидным P-компонентом сыворотки.Нефибриллярные белки — это второстепенные компоненты отложений, которые тесно связаны с фибриллами. Однако, несмотря на такие общие черты, амилоидные отложения разительно различаются по химической природе их основных фибриллярных белковых составляющих. На сегодняшний день описано не менее 20 различных белков амилоидных фибрилл, многие из которых связаны с различными клиническими формами амилоидоза. ^{2– 4} Белок AA, N-концевой фрагмент аполипопротеина и сывороточный амилоид A белка острой фазы (SAA), образует амилоидные фибриллы, которые обнаруживаются в связи с реактивным системным амилоидозом и семейной средиземноморской лихорадкой.Известно, что несколько изотипов SAA вовлечены в патогенез амилоидоза человеческого белка амилоида А (АК). В первичном амилоиде AL, связанном с миеломой и другими злокачественными дискразиями В-клеток и плазматических клеток, фибриллы происходят либо из цельных моноклональных фрагментов легкой цепи иммуноглобулина (подтип κ или λ), либо из их фрагментов. Нормальный транстиретин дикого типа (TTR) образует амилоидные фибриллы (ATTR) при сенильном системном амилоидозе, тогда как более 70 генетических вариантов TTR связаны с семейной амилоидной полинейропатией.Амилоидный β-пептид (Aβ), пептид от 39 до 42 аминокислотных остатков, высвобождаемый из внутримолекулярного сегмента трансмембранного белка-предшественника амилоидного β-белка клеточной поверхности (AβPP), является основным фибриллярным белком, обнаруженным в невритных и диффузных бляшках в головном мозге пациентов. с болезнью Альцгеймера (БА) и синдромом Дауна. За некоторыми исключениями, ^{5, 6} большинство белков амилоидных фибрилл представляют собой целые или N-концевые фрагменты интактных белков-предшественников.

Поскольку амилоидоз представляет собой очень разнородную группу заболеваний, связанных с отложением химически различных белков амилоидных фибрилл, точная химическая и иммунохимическая идентификация этих белков имеет диагностическое и терапевтическое значение. Это особенно верно в случаях с предполагаемым диагнозом амилоидоза AL: клинические проявления амилоидоза AL чрезвычайно разнородны, а некоторые характерные паттерны поражения органов неотличимы от таковых при семейной амилоидной полинейропатии и наследственном ненейропатическом системном амилоидозе. ⁷ Очистка и биохимический анализ амилоида вместе с его гистохимическими и иммуногистохимическими исследованиями также важны в исследованиях все еще плохо изученного патогенеза заболеваний, связанных с амилоидом.

Большая часть информации о структуре различных белков амилоидных фибрилл была получена с помощью методов макроочистки, подходящих для выделения этих белков из больших количеств ткани, полученной при вскрытии. ^{8– 10} Традиционно используемый метод солюбилизации в воде включает несколько стадий водной экстракции и центрифугирования с последующим осаждением амилоидных фибрилл солями. ⁸ Этот метод позволяет получать амилоидные фибриллы из 10–30 г посмертного материала, содержащего AA, AL, ATTR или другие белки, обнаруженные при системных амилоидозах. Классические методы выделения Aβ включают физическое разделение кортикальных бляшек / сосудов центрифугированием в градиенте плотности, что приводит к достаточному обогащению тканевого материала Aβ перед его экстракцией. ^{9, 10} Дальнейшая очистка амилоидных белков, полученных макропрепаративными методами, обычно осуществляется с помощью эксклюзионной хроматографии. Однако такие обширные манипуляции с тканью становятся непрактичными, если доступны только миллиграммы исходного тканевого материала. ¹ Кроме того, были разработаны классические методы экстракции и очистки для выделения амилоидных белков из свежих, но не из фиксированных формалином тканей. Поскольку фиксированные формалином ткани обычно используются в гистологических исследованиях, они более доступны, чем свежие ткани. Таким образом, новые методологические подходы, включая поиск подходящих растворителей для экстракции и стратегии разделения, необходимы для разработки эффективных процедур для выделения и очистки амилоидных белков в небольших масштабах.

Здесь мы описываем микротехники, разработанные и применяемые для экстракции и очистки различных амилоидных белков из небольших образцов свежих и фиксированных формалином тканей, и демонстрируем применимость этих методов для биохимического анализа амилоидных белков, обнаруженных в различных клинических формах. амилоидоза и в экспериментальных моделях мелких животных.

ОБЩЕЕ

Методологические подходы, используемые для микроэкстракции и очистки амилоидных белков, различаются в разных лабораториях, и иногда может быть неясно (особенно для исследователя, менее опытного в этой конкретной области), как выбрать подходящую методологию для изучаемого случая.Это контрастирует с классическими крупномасштабными методами, в которых есть четкие рекомендации по очистке амилоидного белка. Поэтому, чтобы преодолеть эту проблему, мы классифицировали существующие микротехники — во-первых, в соответствии с используемым экстракционным растворителем, а во-вторых, в соответствии с применяемой техникой очистки. Кроме того, преимущества и недостатки этих новых микротехник были очерчены с учетом типа ткани (фиксированный или нефиксированный формалин) и размера, типа амилоида и содержания амилоида в образце.

МИКРОЭКСТРАКЦИЯ

Свежие ткани

Было разработано и применено несколько процедур микроэкстракции для извлечения амилоидных белков из количества свежезамороженной ткани от миллиграмма до грамма. Ткани обычно гомогенизировали и промывали забуференным физиологическим раствором перед процедурой экстракции; в некоторых случаях гомогенаты тканей переваривали коллагеназой и ДНКазой ^{11, 12} или обезжиривали. ^{13– 16} Была описана процедура быстрой водной экстракции, которая использовалась для получения амилоидных фибрилл в их естественном состоянии. ¹⁷ Напротив, были разработаны другие микрометоды, в которых используются денатурирующие условия. Поскольку большинство амилоидных белков растворимо в 6М растворе гидрохлорида гуанидина, эти белки часто экстрагировали с использованием этого денатурирующего агента. ^{13– 16, 18, 19} В нескольких отчетах муравьиная кислота использовалась для выделения Aβ, AL и ATTR из небольших образцов свежей ткани. ^{11, 12, 20} Было обнаружено, что AA, AL, ATTR и некоторые более растворимые формы Aβ также могут быть экстрагированы более мягким растворителем, а именно: 20% ацетонитрила / 0.1% трифторуксусная кислота (TFA). ^{1, 12, 21– 34}

Ткань фиксированная формалином

Формалин, как и другие фиксаторы на основе альдегидов, образует межмолекулярные и внутримолекулярные сшивки, которые могут затруднить последующую экстракцию белков из фиксированных тканей. Однако было разработано несколько процедур экстракции, которые оказались полезными для преодоления трудностей, связанных с высокой нерастворимостью белков, присутствующих в фиксированных формалином тканях, залитых парафином.Инкубация депарафинированных, нагруженных амилоидом фиксированных тканей в стандартном 3% буфере для электрофореза додецилсульфата натрия (SDS) при 90 ° C в течение пяти минут приводила к солюбилизации АК, но не других амилоидных белков (таких как AL, ATTR и Aβ. ₂ микроглобулин). ^{35, 36} Экстракция с 2,5% SDS и 8M мочевиной, содержащим буфер для образцов для электрофореза при 90 ° C в течение 15 минут, позволила выделить белки AL, Aβ и ATTR. ^{37, 38} Поскольку при применении той же методики экстракции к тканям, фиксированным формалином, не содержащим амилоида, белки не были обнаружены, было высказано предположение, что амилоиды, в отличие от других тканевых белков, «выживают» при фиксации формалином.Устойчивость амилоидов к сшиванию может быть связана с отложением амилоидов в плотно упакованных агрегатах с конформацией β-складчатого листа, что может предотвратить проникновение формалина и сшивание. ^{37, 38} Однако другие исследования показали, что инкубация фиксированных формалином образцов с буферами, содержащими 2% SDS, при высоких температурах в течение более длительного периода времени приводила к экстракции «неамилоидных» белков, таких как E-кадгерин. , β-катенин и циклин D1. ³⁹ Фактически, извлечение этих белков значительно увеличивалось при повышении температуры: самые высокие извлечения были получены при инкубации образцов при 100 ° C в течение 20 минут с последующей инкубацией при 60 ° C в течение двух часов. Было высказано предположение, что длительное воздействие на фиксированный образец высокой температуры может привести к диссоциации сшивки. ³⁹ Таким образом, оказывается, что, хотя конфигурация β-складчатого листа может быть важным структурным фактором, сохраняющим химическую целостность амилоидов, экспериментальные условия экстракции имеют решающее значение для разрушения существующих поперечных связей.

«Устойчивость амилоидов к сшиванию может быть связана с отложением амилоидов в плотно упакованных агрегатах с конформацией β-складчатого листа, что может предотвратить проникновение формалина и сшивание»

В некоторых других исследованиях фиксированные формалином ткани экстрагировали с использованием солей муравьиной кислоты или гуанидина. Инкубация депарафинированных фиксированных тканей с муравьиной кислотой в течение ночи при комнатной температуре позволила солюбилизировать белки Aβ ⁴⁰ и AL ^{11, 41} .В недавнем исследовании, проведенном с большим количеством фиксированных образцов (n = 49), различные типы амилоидных белков были экстрагированы путем инкубации в 6М растворах гуанидина в течение 24–72 часов при 37 ° C. ⁴²

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ

Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) на основе вестерн-блоттинга и микросеквенирования представляет собой простой и очень часто используемый подход для разделения и анализа микроэкстрагированных амилоидных белков.Амилоидный материал, экстрагированный либо процедурой водной экстракции, либо буферами, содержащими SDS, можно непосредственно наносить на гели SDS; Экстракты тканей муравьиной кислоты и ацетонитрила / TFA необходимо высушить, повторно растворить в буфере для образцов, а затем провести электрофоретический анализ. Материал, экстрагированный гуанидином, необходимо подвергнуть тщательному диализу перед SDS-PAGE (поскольку SDS осаждается в присутствии солей гуанидина). Фактически очистка амилоидных белков, экстрагированных гуанидином, выполняется в основном с помощью хроматографических средств, как описано в следующем разделе.Наш опыт работы со свежими тканями показал, что для прямого электрофоретического исследования экстрактов сырых тканей предпочтительны летучие экстракционные растворители, особенно при манипуляциях с очень небольшими количествами доступной ткани. Такие растворители можно удалить лиофилизацией или сушкой Speed-Vac без необходимости диализа, и белки можно легко повторно экстрагировать, увеличивая, таким образом, извлечение амилоида.

Свежие ткани

В некоторых отчетах методы вестерн-блоттинга и микросеквенирования эффективно использовались для характеристики амилоида, выделенного из тканей путем экстракции муравьиной кислоты.Отложения ALλ-II были обнаружены в ткани мочеточника пациента с локализованным амилоидозом мочеточника. ¹¹ TTR-отложения человеческого происхождения обнаружены в почках мышей, трансгенных по транстиретину человека дикого типа. ¹²

Экстракция ацетонитрил / TFA с последующим вестерн-блоттингом использовалась для определения типа амилоидных белков, присутствующих в очень небольших количествах диагностических биоптатов, включая образцы селезенки, печени, сердца, щитовидной железы и кожи ²⁵ и жир тонкой иглы аспирирует. ³¹ Такие методы могут способствовать точной диагностике заболевания и особенно полезны в случаях, когда данные, полученные с помощью обычных иммуногистохимических методов, являются неожиданными или сомнительными. Вестерн-блоттинг экстрактов ацетонитрил / TFA, полученных из миллиграммовых количеств ткани головного мозга при AD, использовали для обнаружения Aβ ²⁶ ; этот анализ использовался, чтобы отличить AD от других деменций. ³⁰ Тот же метод микроэкстракции использовался при исследовании образцов биопсии кожи, взятых у пациентов с локализованным амилоидозом кожи, ²⁸ заболеванием, при котором химическая природа белка амилоидных фибрилл еще не была идентифицирована.Было обнаружено отложение полноразмерного аполипопротеина E (апоЕ) и его фрагмента, что указывает на важность этих минорных компонентов в образовании амилоида. Вестерн-блоттинг микроэкстрактов амилоидов с помощью ацетонитрила / ТФК использовали для изучения биоптатов, взятых у пациентов с амилоидозом сердца и гортани. ³² Это исследование выявило редкий случай, демонстрирующий совместную локализацию двух разных типов амилоида — ATTR и нового варианта апоА-I. В исследованиях, в которых экстракты ацетонитрил / TFA содержали достаточное количество амилоида, электрофорезированные белки были успешно секвенированы после того, как они были перенесены на мембраны из поливинилдифторида (PVDF). ^{12, 23, 27, 29} Такой метод был применен для изучения фибриллярных (амилоидных) и нефибриллярных (неамилоидных) отложений, сосуществующих у одного и того же пациента с пролиферативным заболеванием В-клеток. ²⁷ Было показано, что оба типа отложений имеют очень похожие молекулярные массы и идентичные N-концевые последовательности, принадлежащие вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина подгруппы κ-IV. Методика микроэкстракции ацетонитрил / TFA с последующим вестерн-блоттингом, аминокислотное секвенирование ^{12, 23} , ^{12, 23} и масс-спектральный анализ ¹² также использовались для изучения экспериментально индуцированного амилоидоза на животных на небольших животных. , ²³ сенильный системный амилоидоз, ¹² и невропатология синдрома Дауна (C Harris-Cerruti et al .Вредная ассоциация повышенной активности супероксиддисмутазы CuZn и белка-предшественника амилоида в модели нейропатологии синдрома Дауна у трансгенных мышей. IX Международный симпозиум по амилоидозу, Будапешт, 2001 г., аннотация 9.1.10). Данные, полученные в таких исследованиях, позволили сделать несколько предположений о механизмах образования амилоидных фибрилл. Так, при амилоидозе мышей, индуцированном казеином, было обнаружено ²³ отложение в ткани как АК, так и его предшественника, изомера SAA2: SAA2 обнаруживался только на ранних стадиях амилоидогенного процесса, тогда как значительные количества АК появлялись позже.Предполагалось, что при амилоидозе мышей отложение белков SAA2 является начальной стадией образования фибрилл, за которой следует процессинг SAA до AA. Подобно случаю комбинированного заболевания отложений легких цепей и амилоидоза AL, ²⁷ было обнаружено присутствие как фибриллярных, так и нефибриллярных TTR человека у мышей, трансгенных по TTR человека дикого типа. ¹² Оба типа отложения TTR содержали интактные мономеры TTR человека без признаков протеолиза или совместного отложения TTR мыши.Было обнаружено, что нефибриллярные белки откладывались до появления фибрилл, что позволяет предположить, что неамилоидные отложения представляют собой предшественник фибрилл.

Фиксированная ткань

Методы

вестерн-блоттинга и микросеквенирования были использованы для изучения амилоидных белков, микроэкстракированных из фиксированных тканей с SDS, содержащим буферы ^{36– 38} и муравьиную кислоту. ^{12, 40, 41} Анализ материала, экстрагированного муравьиной кислотой, позволил идентифицировать белки Aβ в головном мозге пациента с AD. ⁴⁰ Экстракция муравьиной кислоты была также полезна для выявления отложений амилоида, состоящих из фрагментов легкой цепи иммуноглобулина λ-III в ткани мочеточника ¹² и отложений легкой цепи иммуноглобулина типа λ в случае амилоидоза мочевого пузыря. ⁴¹ В других исследованиях, в которых фиксированные ткани экстрагировали буфером, содержащим 2% SDS / 8M мочевины, анализ аминокислотной последовательности выявил отложения ALλ в лептоменингиальных кровеносных сосудах пациента с церебральным амилоидозом, ³⁷ ATTR в сердце пациент с системным старческим амилоидозом, ³⁸ и AL-κ в селезенке пациента с системным амилоидозом. ³⁸

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА И АНАЛИЗ

Свежие ткани

Гель-фильтрация использовалась для очистки амилоидных белков, экстрагированных 6M гуанидином из относительно больших биоптатов. Амилоидные экстракты, полученные из образцов подкожной биопсии (около 1 см ³ ) ^{13, 16} и из интрацеребральной «амилоидомы» (2 г) ¹⁵ , были разделены на сефакриле S-200 ¹³ или сефарозе 6B. Столбец CL. ^{15, 16} Белки элюировали буфером, содержащим гуанидин, диализовали, лиофилизировали и подвергали анализу аминокислотной последовательности. Эти исследования позволили идентифицировать белки Alκ-I, ¹³ ALλ (подгруппа III или IV), ¹⁴ и Alκ-IV ¹⁶ .

«Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография не получила широкого применения при анализе AA, AL, ATTR и других белков, присутствующих в тканях пациентов с системным амилоидозом»

Хотя обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) эффективно используется для микроочистки белков в различных областях биологии и медицины, этот метод не получил широкого применения при анализе AA, AL, ATTR и других белков, присутствующих в ткани больных системным амилоидозом.Фактически, обращенно-фазовая ВЭЖХ на Lichrosorb RP-18 (размер частиц 10 мкм, внутренний диаметр 250 × 4,6 мм; Knauer, Берлин, Германия) и на Vydac 218 TP (размер частиц 5 мм, диаметр пор 300 Å, 250 × 4,6 мм внутренний диаметр; Alltech, Deerfield, Illinois, USA) были эффективны для очистки AA ^{43, 44} , но не для AL или ATTR. ^{43, 45} ВЭЖХ с обращенной фазой использовали для очистки белков Aβ, микроэкстрагированных муравьиной кислотой из ткани головного мозга при AD. ²⁰ В этом исследовании гомогенаты тканей промывали буферами, содержащими SDS, перед экстракцией Aβ, так что материал Aβ, очищенный с помощью ВЭЖХ, представлял нерастворимую в SDS фракцию Aβ. В нашем исследовании, целью которого было восстановление общего количества отложений Aβ, гомогенаты тканей AD были промыты в отсутствие этого детергента и экстрагированы с использованием ацетонитрила / TFA и муравьиной кислоты последовательно. ³⁴ Хотя экстрагированный материал содержал большие количества белков Aβ, применение только обращенно-фазовой ВЭЖХ было недостаточным для очистки этих белков (B Kaplan, 1999, неопубликованные данные).

ВЭЖХ с вытеснением по размеру в буфере, содержащем SDS (Bio-Sil TSK-125, 5 мкм; Bio-Rad, Ричмонд, Калифорния, США), применяли для исследования белков AA, AL и ATTR, микроэкстрагированных с помощью ацетонитрила / TFA. ²¹ Однако этот метод привел только к частичной очистке амилоидных белков, как было определено с помощью электрофоретического исследования полученных фракций ВЭЖХ. Эффективная очистка низкомолекулярного амилоида (<12 кДа), такого как AA и небольшие белки AL, была достигнута на колонке гель-фильтрации для ВЭЖХ в водном органическом растворителе. ⁴⁶ Используя этот метод, амилоидные протеины подвергали микроэкстракции смесью 20% ацетонитрила / 0,1% TFA из свежезамороженных образцов и дополнительно очищали на колонке Bio-Sil TSK, уравновешенной тем же растворителем. ²¹ К сожалению, этот метод оказался бесполезным для изучения амилоидных белков с более высокой молекулярной массой (> 12 кДа). Следует отметить, что элюирование смесью ацетонитрил / TFA приводило к аномальному поведению исключения размера на колонке Bio-Sil TSK, предположительно из-за взаимодействия белка с остаточными силанолами на колонках для ВЭЖХ на основе диоксида кремния.Это может объяснить, почему более крупные амилоидные белки плохо разделяются с помощью этой техники. ^{21, 46}

Фиксированная ткань

В большинстве исследований обращенно-фазовая ВЭЖХ использовалась для очистки фиксированных амилоидных белков, выделенных из тканей методом экстракции гуанидином. ^{1, 42} Вкратце, амилоидные белки, экстрагированные 6 М буфером, содержащим гидрохлорид гуанидина, восстанавливали и алкилировали, а затем прогоняли на Aquapore 300 C ₈ (30 × 4.0 мм) (колонка Brownlee; Perkin Elmer, Норуолк, Коннектикут, США). Материал, очищенный ВЭЖХ, был секвенирован, что позволило идентифицировать девять типов амилоидных белков (включая AA, AL, ATTR, Alys и ApoA-I), обнаруженных в различных образцах биопсии (например, селезенка, почки, печень, сердце, брюшной жир. , и двоеточие). Недавно этот метод был использован для изучения фиксированных формалином образцов ткани сердца пациента со старческим системным амилоидозом, где было обнаружено, что ATTR со-депонируется с второстепенным амилоидным компонентом, apoA-IV. ⁴⁷ В этом исследовании была продемонстрирована способность апоА-IV усиливать образование амилоида. Таким образом, экстракция гуанидина из тканей, фиксированных формалином, с последующим разделением на колонках для ВЭЖХ с обращенной фазой и химическим анализом очищенных амилоидных белков, является ценным методом для точной диагностики амилоид-ассоциированных заболеваний и может помочь в изучении механизмов образования амилоида в эти болезни.

КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ОЧИСТКИ

Хотя количество стадий разделения должно быть как можно меньшим при маломасштабной очистке, не всегда возможно очистить микроэкстрагированные амилоидные белки за одну стадию разделения.Мы столкнулись с такой ситуацией при анализе свежезамороженных (нефиксированных) экстрактов тканей, где содержание амилоидных белков было небольшим, а загрязнение другими совместно экстрагированными тканевыми белками было большим. ⁴⁵ Фактически, SDS-электрофорез на микропрепаративном пластинчатом геле позволяет эффективно разделить белки на основе их различий в молекулярной массе, но при использовании этого метода разделенные амилоидные белки могут быть загрязнены другими белками с такой же электрофоретической подвижностью.В случаях, когда количество доступного биопсийного материала было достаточным (например, биопсия подкожно-жировой клетчатки ^{13, 14} ), очистка была достигнута путем комбинирования гель-фильтрации на Sephacryl S-2000 HR с внутренним диаметром 800 × 9 мм (Pharmacia, Уппсала, Швеция) с обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке VYDAC 214 TPS 250 × 4,6 мм (Hesperia, Калифорния, США). Однако такие относительно большие колонки для гель-фильтрации менее практичны при анализе экстрактов, полученных из более мелких образцов тканей.Хотя использование колонок для гель-вытеснительной ВЭЖХ может быть более подходящим для небольших образцов, наш опыт показал, что во многих случаях разрешение амилоидных белков, полученное методом эксклюзионной ВЭЖХ, было менее эффективным, чем при использовании SDS-электрофореза в микропрепаративном пластинчатом геле. ⁴⁵

Мы разработали метод, сочетающий SDS-электрофорез в пластинчатом геле (SDS-PAGE) с последующей обращенно-фазовой ВЭЖХ, ^{44, 48, 49} и недавно адаптировали его для очистки белков AA, AL, ATTR и Aβ. микроэкстракция из нефиксированных тканей. ^{33, 34, 50} Используя этот метод, электрофорезированные белки переносили на PVDF-мембраны, затем элюировали с мембран и, наконец, применяли для обращенно-фазовой ВЭЖХ. Мы обнаружили, что элюирование из PVDF растворителем TFA / ацетонитрил / вода (3/4/3, об. / Об.) Позволяет эффективно извлекать белки AA, AL, ATTR и Aβ из мембран PVDF и совместимо с последующими обращенно-фазовое разделение методом ВЭЖХ. Последовательный SDS-PAGE и метод ВЭЖХ с обращенной фазой использовали для очистки Aβ из неочищенных экстрактов ткани головного мозга при AD. ^{34, 50} Это позволило отделить амилоидные белки электрофоретически от компонентов ткани с более высокой и низкой молекулярной массой, а затем очистить с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой от примесей, которые имели сходные молекулярные массы, но разное время удерживания на колонке.

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Стратегия мелкомасштабной очистки амилоидных белков в значительной степени зависит от типа образца ткани (свежий или фиксированный формалин), размера образца, содержания амилоида в ткани и его химической природы.Водный растворитель ацетонитрил / TFA эффективно использовали для микроэкстракции различных амилоидных белков из нефиксированных тканей, хотя он не подходил для экстракции амилоидных белков из фиксированных формалином тканей, где требовались более жесткие обработки для достижения солюбилизации амилоида. Обращенно-фазовая ВЭЖХ успешно использовалась для очистки и анализа различных типов амилоидных белков, выделенных из фиксированных формалином тканей. Однако при исследовании свежих тканей очистка с помощью ВЭЖХ была эффективной только для некоторых амилоидных белков, в зависимости от их химического типа и молекулярной массы.Вестерн-блоттинг на основе SDS-PAGE, по-видимому, является более универсальным подходом для первоначального анализа амилоидных белков, микроэкстрагированных из нефиксированных тканей. Он позволяет определить тип, молекулярную массу и количество амилоида. Если количество амилоида достаточно, метод микросеквенирования на основе SDS-PAGE может предоставить информацию о структуре первичного амилоидного белка. Когда количество амилоида невелико, а загрязнение другими соэкстрагированными белками ткани велико, совместное использование электрофоретических методов и методов ВЭЖХ кажется многообещающим.

Забрать домой сообщения

• Амилоидоз — это гетерогенная группа заболеваний, связанных с отложением химически различных белков амилоидных фибрилл, и точная химическая и иммунохимическая идентификация этих белков имеет диагностическое и терапевтическое значение

• Стратегия мелкомасштабной очистки амилоидных белков в значительной степени зависит от типа образца ткани (свежий или фиксированный формалин), размера образца, содержания амилоида в ткани и его химической природы

• Гидрохлорид гуанидина и водный раствор ацетонитрила / трифторуксусной кислоты были использованы для микроэкстракции различных амилоидных белков из свежих тканей

• Более жесткие методы обработки (например, додецилсульфат натрия (SDS) / SDS и мочевина при высоких температурах) необходимы для экстракции амилоидных белков из тканей, фиксированных формалином

• Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может использоваться для очистки и анализа различных типов амилоидных белков, экстрагированных из фиксированных формалином тканей

• Тем не менее, вестерн-блоттинг на основе электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), по-видимому, является лучшим подходом для первоначального анализа амилоидных белков, микроэкстрагированных из свежих тканей, поскольку он позволяет определить тип, молекулярную массу и количество амилоида

• Если количество амилоида достаточно, метод микросеквенирования на основе SDS-PAGE может предоставить информацию о структуре первичного амилоидного белка

• Если присутствуют только небольшие количества сильно загрязненного амилоида, может оказаться полезным комбинированное использование электрофоретических методов и методов ВЭЖХ

Благодарности

Благодарю г-жу Л. Ганс (Институт медицинских исследований Хеллера, Медицинский центр Шиба, Тель-Хашомер, Израиль) за полезную помощь в подготовке этой рукописи.

ССЫЛКИ

1. ↵

   Kaplan B , Hrncic R, Murphy CL, и др. . Методы микроэкстракции и очистки, применимые для характеристики амилоидных белков в незначительных количествах ткани. Методы Enzymol1999; 309: 67–81.

2. ↵

   Хан MS , Falk RH. Амилоидоз. Postgrad Med J2001; 77: 686–91.

3. Рокен С , Шекспир А.Патология, диагностика и патогенез амилоидоза АА. Вирхов Арка 3002; 440: 114–22.

4. ↵

   Герц MA , Rajkumar FV. Первичный системный амилоидоз. Варианты лечения Curr Oncol2002; 3: 261–71.

5. ↵

   Pras M , Prelli F, Franklin EC, и др. . Первичная структура варианта амилоида преальбумина при семейной полинейропатии еврейского происхождения. Proc Natl Acad Sci U S A1983; 80: 539–42.

6. ↵

   Prelli F , Pras M, Frangione B. Деградация и отложение амилоидных фибрилл AA зависит от ткани. Биохимия 1987; 26: 8251–6.

7. ↵

   Lachmann HJ , Chir B, Booth DR, и др. . Неправильный диагноз наследственного амилоидоза как AL (первичный) амилоидоз. N Engl J Med2002; 346: 1786–91.

8. ↵

   Прас М , Шуберт М., Цукер-Франклин Д., и др. .Характеристика растворимого амилоида, полученного в воде. Дж. Клин Инвест, 1968; 47: 924–33.

9. ↵

   Гленнер ГГ , Вонг Ч. Болезнь Альцгеймера: первоначальный отчет об очистке и описании нового цереброваскулярного амилоидного белка. Biochem Biophys Res Commun.1984; 120: 885–90.

10. ↵

    Roher AE , Kuo YM. Выделение отложений амилоида из мозга. Методы Enzymol1999; 309: 58–69.

11. ↵

    Castano M , Prelli F, Morelli L, и др. . Лямбда-легкие цепи иммуноглобулина являются предшественниками локализованного амилоидоза мочеточника: микрометод для экстракции амилоида. Amyloid1997; 4: 253–8.

12. ↵

    Teng M , Yin J, Vidal R, et al . Амилоидные и нефибриллярные отложения у мышей, трансгенных по транстиретину человека дикого типа: возможная модель старческого системного амилоидоза.Лаборатория Инвест2001; 81: 385–96.

13. ↵

    Вестермарк П , Бенсон Л., Юул Дж., и др. . Использование образца биопсии подкожного абдоминального жира для детального типирования белка амилоидных фибрилл AL с помощью анализа аминокислотной последовательности. Дж. Клин Патол, 1989; 42: 817–19.

14. ↵

    Форсберг AH , Слеттен К., Бенсон Л., и др. . Биопсия брюшного жира для характеристики основных белков амилоидных фибрилл по аминокислотной последовательности.В: Natvig JB, Forre O, Husby G, и др. , ред. Амилоид и амилоидоз 1990 . Норвелл, Массачусетс: Kluver Academic, Dordrecht, 1990: 797–800.

15. ↵

    Эрикссон Л. , Слеттен К., Бенсон Л., и др. . Опухолевый локализованный амилоид головного мозга происходит из легкой цепи иммуноглобулина. Scand J Immunol1993; 37: 623-6.

16. ↵

    Olsen KE , Sletten K, Westermark P.Расширенный анализ AL-амилоидного белка из биопсии подкожно-жировой клетчатки брюшной стенки: легкая цепь иммуноглобулина каппа IV. Biochem Biophys Res Commun1998; 245: 713–16.

17. ↵

    Теннент GA . Выделение и характеристика амилоидных фибрилл из ткани. Методы Enzymol1999; 309: 26–47.

18. ↵

    Olsen KE , Sletten K, Westermark P. Использование подкожной жировой ткани для определения амилоидного типа методом иммуноферментного анализа.Am J Clin Pathol, 1999; 111: 355–62.

19. ↵

    Hazenberg BPC , Limburg PC, Bijzet J, и др. . Количественный метод определения отложений белка амилоида А в аспирированной жировой ткани пациентов с артритом. Энн Рум Дис, 1999; 58: 96–102.

20. ↵

    Мори Х. , Такио К., Огавара М., и др. . Масс-спектроскопия очищенного белка амилоида β при болезни Альцгеймера.J Biol Chem 1992; 267: 17082–6.

21. ↵

    Kaplan B , German G, Pras M. Выделение и характеристика амилоидных белков из миллиграммовых количеств амилоидсодержащей ткани. J Liq Chromatogr 1993; 16: 2249–68.

22. Kaplan B , German G, Ravid M, et al . Определение типа амилоида с помощью ELISA с использованием количества ткани в миллиграммах. Clin Chim Acta 1994; 229: 174–9.

23. ↵

    Якар С , Каплан Б, Ливне А, и др. . Прямые доказательства отложения SAA в тканях во время амилоидогенеза у мышей. Scand J Immunol1994; 40: 653–8.

24. Якар S , Каплан Б, Герман Г, и др. . Количественная оценка содержания амилоида в тканях при амилоидозе АК с помощью ингибирующего ИФА. Amyloid1995; 2: 167–72.

25. ↵

    Каплан Б , Якар С., Кумар А, и др. .Иммунохимическая характеристика амилоида в диагностической биопсии тканей. Amyloid1997; 4: 80–6.

26. ↵

    Каплан Б. , Мартин Б., Якар С., и др. . Простая процедура иммунохимического определения белков амилоида β с использованием миллиграммовых количеств тканей мозга пациентов с болезнью Альцгеймера. В: Фишер А., Йошида М., Ханин И., ред. Прогресс в лечении болезней Альцгеймера и Паркинсона . Нью-Йорк: Plenum Press, 1998: 823–8.

27. ↵

    Каплан Б. , Видал Р., Кумар А., и др. . Амино-терминальная идентичность сосуществующих отложений легких цепей амилоида и неамилоида иммуноглобулина. Clin Exp Immunol1997; 110: 427–78.

28. ↵

    Фурумото Х. , Симидзу Т., Асагами С., и др. . Аполипопротеин E присутствует при первичном локализованном кожном амилоидозе. J Invest Dermatol 1998; 111: 417–21.

29. ↵

    Ростанго А , Видал Р., Каплан Б., и др. .pH-зависимый фибриллогенез белка Бенс-Джонса V каппа III. Br J Haematol1999; 107: 835–43.

30. ↵

    Каплан Б , Арутюнян В., Кудинов А, и др. . Биохимический анализ отложений β-амилоида, чтобы отличить болезнь Альцгеймера от других деменций. Clin Chim Acta 1999; 280: 147–59.

31. ↵

    Каплан Б. , Видал Р., Гисо Дж., и др. . Иммунохимический микроанализ амилоидных белков в диагностических аспиратах тонкоигольного жира.Am J Clin Pathol, 1999; 112: 403–7.

32. ↵

    де Соуза MM , Vital C, Ostler D, и др. . Аполипопротеин AI и транстиретин как компоненты амилоидных фибрилл в родстве с амилоидозом apoAIleu 178His. Am J Pathol 2000; 156: 1911–17.

33. ↵

    Каплан В , Мерфи К.Л., Ратнер В., и др. . Микрометод выделения и очистки амилоидных белков для химической характеристики.Амилоид 2001; 8: 22–9.

34. ↵

    Kaplan B , Pras M. Комбинированное использование микропрепаративного гель-электрофореза и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для очистки белков амилоида β. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2002; 769: 363–70.

35. ↵

    Штрасбург S , Прас М, Лангевич П, и др. . Демонстрация AA-белка в фиксированных формалином и залитых парафином тканях.Am J Pathol1982; 106: 141–4.

36. ↵

    Штрасбург С , Ливне А, Прас М, и др. . Обнаружение сывороточных белков, производных амилоида А, в фиксированных формалином тканях, залитых парафином. Надежность метода и расширение его спектра. Am J Clin Pathol 1997; 108: 289–94.

37. ↵

    Layfield R , Бейли К., Лоу Дж., и др. . Экстракция и секвенирование белков легкой цепи иммуноглобулина из фиксированных формалином цереброваскулярных амилоидных отложений.Дж. Патол, 1996; 180: 455–9.

38. ↵

    Layfield R , Bailey K, Dineen R, и др. . Применение формалиновой фиксации для очистки амилоидных белков. Анальная биохимия, 1997; 253: 142–4.

39. ↵

    Икеда К , Монден Т, Кано Т, и др. . Извлечение и анализ диагностически полезных белков из фиксированных формалином и залитых парафином срезов тканей.J. Histochem Cytochem1998; 46: 397-403.

40. ↵

    Coria F , Prelli F, Castano EM, и др. . β Отложение белка: патогенетическая связь между болезнью Альцгеймера и церебральными амилоидными ангиопатиями. Brain Res 1988; 463: 187–91.

41. ↵

    Ливних А , Штрасбург С, Мартин Б., и др. . Амилоидоз легких цепей мочевого пузыря. Ограниченное по сайту отложение иммуноглобулина, продуцируемого извне.Дж. Клин Патол, 2001; 54: 920–3.

42. ↵

    Murphy CL , Eulitz M, Hrncic R, и др. . Химическое типирование амилоидных белков, содержащихся в фиксированных формалином образцах биопсии, залитых парафином. Am J Clin Pathol, 2001; 116: 135–42.

43. ↵

    Каплан В , Прас М. Препаративное фракционирование амилоидных белков в масштабе микрограммов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.Clin Chim Acta 1987; 163: 199–205.

44. ↵

    Каплан В , Прас М., Рэвид М. Выделение и очистка амилоидного белка А электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой. J Chromatogr, 1992; 573: 17–22.

45. ↵

    Каплан Б . Применение электрофореза в полиакриламидных пластинах в геле для очистки амилоидных белков в малых масштабах.Анальный Чим Acta1998; 372: 161–72.

46. ↵

    Каплан В , Прас М. Разделение амилоидных белков методом эксклюзионной хроматографии в водной органической подвижной фазе. J Liq Chromatogr 1992; 15: 2467–86.

47. ↵

    Бергстром Дж. , Мерфи С., Юлитц М., и др. . Совместное расположение аполипопротеина A-IV и транстиретина при сенильном системном амилоидозе. Biochem Biophys Res Commun2001; 285: 903–8.

48. ↵

    Каплан В , Прас М. Разделение белков с использованием последовательного электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Биомедицинская хроматография, 1991; 5: 86–9.

49. ↵

    Каплан Б , Якар С, Балта У, и др. . Выделение и характеристика двух основных изотипов амилоида A SAA1 и SAA2 из плазмы острой фазы мышей.J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 1997; 704: 69–76.

50. ↵

    Каплан Б . Последовательный электрофорез в геле с додецилсульфатом натрия и высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой. Приложения для микроочистки и анализа белков, пептидов и родственных соединений. Текущие темы аналитической химии, 2001; 2: 160–9.

Сравнение с гель-электрофорезом в импульсном поле и спа-типированием

Абстрактные

Фон

Молекулярное типирование метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus (MRSA) необходимо для изучения путей и скорости передачи этого патогена.Доступные в настоящее время методы набора текста либо ресурсозатратны, либо обладают ограниченной дискриминационной способностью. Анализ тандемных повторов (MLVA) с множеством локусов переменных может предоставить альтернативный высокопроизводительный инструмент молекулярного типирования с высоким эпидемиологическим разрешением.

Методология / основные выводы

Новая схема MLVA для S. aureus была утверждена с использованием 1681 изолятов S. aureus , собранных от голландских пациентов, и 100 изолятов от свиней. MLVA с использованием 8 локусов тандемных повторов выполняли в 2 мультиплексных ПЦР, и флуоресцентно меченые продукты ПЦР точно определяли размер на автоматическом секвенаторе ДНК.Оцененное количество повторов было использовано для создания профилей MLVA, состоящих из строк из 8 целых чисел, которые использовались для категориальной кластеризации. MLVA дало 511 типов, которые сгруппировались в 11 различных комплексов MLVA, которые, по-видимому, совпадали с клональными комплексами MLST. MLVA была по крайней мере такой же дискриминационной, как PFGE, и вдвое более дискриминационной, чем spa -последовательное типирование. Наблюдалось значительное совпадение между MLVA, spa -типированием последовательности и PFGE на уровне комплекса MLVA со значениями разделения групп 95.1% и 89,2%. MLVA не смог провести различие между связанными со свиньями штаммами MRSA, выделенными от людей и свиней, что подтверждает высокую степень родства. MLVA также превосходил группу изолятов MRSA, ранее отнесенных к временно-пространственным кластерам с неотличимыми SpaTypes, демонстрируя его повышенную эпидемиологическую полезность.

Выводы

MLVA, описанный в этом исследовании, представляет собой высокопроизводительный и относительно недорогой метод генотипирования для S. aureus , который дает дискретные и однозначные данные, которые могут использоваться для определения биологических значимых генотипов и комплексов и могут использоваться для межлабораторных сравнений в доступной сети. базы данных.Результаты показывают, что MLVA компенсирует недостатки других подходов к высокодискриминационной типизации и представляет собой многообещающий инструмент для больничной, национальной и международной молекулярной эпидемиологии.

Образец цитирования: Schouls LM, Spalburg EC, van Luit M, Huijsdens XW, Pluister GN, van Santen-Verheuvel MG, et al. (2009) Тандемный повторный анализ числа переменных с множественными локусами для Staphylococcus Aureus : сравнение с гель-электрофорезом в импульсном поле и типом spa .PLoS ONE 4 (4):
e5082.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005082

Редактор: Адам Дж. Ратнер, Колумбийский университет, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 7 января 2009 г .; Одобрена: 3 марта 2009 г .; Опубликован: 3 апреля 2009 г.

Авторские права: © 2009 Schouls et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Финансирование этого исследования было предоставлено правительством Нидерландов (Министерством здравоохранения, социального обеспечения и спорта). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Staphylococcus aureus — важный бактериальный патоген, связанный с серьезными внебольничными и внутрибольничными заболеваниями [1], [2].Хотя он может вызывать различные клинические синдромы, такие как бактериемия, пневмония, эндокардит и образование глубоких абсцессов, S. aureus , по-видимому, присутствует повсеместно и чаще всего переносится без каких-либо клинических симптомов. Носители могут распространять патоген, заражая людей, у которых может развиться болезнь. Внедрение метициллина привело к быстрому появлению устойчивых к метициллину S. aureus (MRSA) и представляет собой серьезную клиническую проблему в больницах по всему миру [3] — [5].В Нидерландах заболеваемость инфекциями MRSA все еще довольно низка, вероятно, в результате «политики поиска и уничтожения» и ограниченного использования антибиотиков [6], [7]. В последнее время количество инфекций MRSA в Нидерландах постепенно увеличивается, что является серьезной причиной для беспокойства [8], [9].

Чтобы понять популяционную биологию S. aureus и изучить влияние мер по борьбе с инфекциями MRSA, необходимо дать однозначную характеристику S.aureus . Для анализа S. aureus использовались многие методы типирования. В течение многих лет использовалось фаговое типирование [10], но с появлением молекулярного типирования фаговое типирование было заменено более новыми методами. Было использовано множество методов, таких как риботипирование [11], [12], случайный амплифицированный полиморфный анализ ДНК [12], [13], анализ последовательности 16S – 23S рДНК spa cer областей [14], [15] , полиморфизм длины амплифицированного фрагмента [16], [17] и типирование SSC mec [18], [19].Однако наиболее широко используемыми методами молекулярного типирования для S. aureus являются PFGE [20], [21], MLST [21], [22] и spa -типирование последовательностей [23], [24]. В PFGE фрагменты, полученные после макрорестрикции Sma I, разделяют на специальном агарозном геле. Это было чрезвычайно полезно для выяснения популяционных структур и идентификации вспышек S. aureus . MLST, основанный на анализе последовательности ДНК 7 генов домашнего хозяйства, дает однозначные результаты типирования, которые подходят для межлабораторных сравнений.В результате появилась база данных, доступная в Интернете, которая используется во всем мире (http://saureus.mlst.net/). Spa — последовательное типирование стало широко распространенной техникой типирования для S. aureus за очень короткое время. В spa — последовательность, типизирующая вариацию в области тандемного повтора белка А, кодирующего ген spa , используется для выполнения генотипирования S. aureus . Повторы в гене spa различаются как по количеству, так и по последовательности.Путем определения последовательности повторов создается профиль, который можно использовать для кластеризации. Это привело к быстрорастущей базе данных, доступной в Интернете, по которой можно делать запросы (http://www.spaserver.ridom.de/).

Как и большинство других методов генотипирования на основе полос, PFGE постепенно устаревает. Этот метод не является портативным, размеры полос неточны, что приводит к неоднозначным результатам, а создание профилей является трудоемким и сложным в исполнении. MLST очень дорогой, трудоемкий и поэтому недоступен для большинства лабораторий. Spa -последовательная типизация — это портативная техника, которая относительно проста в исполнении. Однако он основан только на одном локусе в геноме, и кластеризация изолятов S. aureus на основе данных spa является сложной. По этим причинам мы разработали и проверили метод типирования, основанный на составе геномных локусов, содержащих тандемные повторы. Этот метод, называемый анализом тандемных повторов с переменным числом множественных локусов (MLVA), был введен в качестве метода типирования для большого числа бактериальных патогенов [25] — [37].В MLVA вариабельность количества коротких последовательностей тандемных повторов используется для создания профилей ДНК для эпидемиологических исследований. Несколько схем MLVA для S. aureus были разработаны и использованы для определения типа этого патогена. Однако эти схемы MLVA основаны на анализе в агарозных гелях, что делает их неточными и непереносимыми. В этом отчете мы описываем разработку надежного и портативного MLVA и демонстрируем полезность этого метода, идентифицируя типы и комплексы в большой коллекции метициллин-устойчивых и метициллин-чувствительных S.aureus .

Материалы и методы

Штаммы бактерий

В это исследование мы включили коллекцию из 2525 штаммов, состоящую из i) тестового набора из 86 изолятов S. aureus +10 S. epidermidis , ii) набора из 1681 человека и 100 свиней S. aureus. изолятов, используемых для обширной валидации; iii) 658 изолятов S. aureus , используемых для оценки потенциала MLVA для выявления вспышек. Набор для испытаний включал эталонные штаммы и использовался для первоначальной настройки MLVA.Изоляты, использованные для обширной проверки, были собраны для национального надзора за S. aureus отделом бактериального типирования Лаборатории инфекционных заболеваний и перинатального скрининга Национального института общественного здравоохранения и окружающей среды. Из этого набора штаммов с 2005 по 2007 год было собрано 1781 штамм, из которых 1681 штамм был выделен от людей и 100 — от свиней. Для этого исследования мы использовали 393 изолята, собранные в 2005 г., 617 — в 2006 г. и 671 изолят — в 2007 г.Изоляты собирали в течение первых 3 месяцев каждого из 3 лет и составляли примерно 20% от общего числа изолятов, собранных для национального надзора за этот период времени. Из 1681 штамма от людей 135 были выделены из крови, 831 — из мазков из носа, горла или промежности, а оставшаяся часть была выделена преимущественно из раневых инфекций. Приблизительно 87% штаммов, выделенных от человека, и все штаммы, выделенные от свиней, были устойчивыми к метициллину S.aureus (MRSA). Коллекция из 1681 штамма, выделенного от человека, также включала 163 штамма, которые были частью голландских штаммов, собранных для проекта EARSS (http://www.rivm.nl/earss/), 156 из которых были чувствительными к метициллину S. aureus ( MSSA). Все 100 штаммов MRSA, выделенных от свиней, были собраны в 2007 году. Кроме того, для предварительной оценки эпидемиологического потенциала MLVA был использован набор из 658 изолятов MRSA, собранных для национального эпиднадзора за S. aureus в 2008 году.

Рост бактерий и подготовка лизатов

Культуры, хранящиеся при -80 ° C, наносили штрихами на чашки с колумбийским агаром с 5% овечьей кровью, культивировали в течение ночи при 37 ° C и визуально проверяли на чистоту. Две колонии суспендировали в 50 мкл смеси для лизиса в ТЕ (10 мМ Трис. HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) с добавлением 100 мкг / мл лизостафина, инкубировали в течение 35 минут при 37 ° C и нагревали в течение 10 минут при 95 ° C. . После стадии инактивации добавляли 450 мкл ТЕ и лизат использовали либо напрямую, либо хранили при -20 ° C до использования в ПЦР.

Гель-электрофорез в импульсном поле и

Spa -последовательное типирование

Гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE) выполняли, как описано ранее [38]. Spa Типирование -последовательностей в основном выполнялось в соответствии с протоколом RIDOM [24], (http://www.ridom.de) с небольшими изменениями. Первой модификацией было использование нового прямого праймера (TAAAGACGATCCTTCAGTGAGC) для замены праймера spa -1113f, используемого для ПЦР spa , и секвенирования, которое имеет несоответствие последовательности в положении 16 со всеми известными spa генные последовательности.Используемый обратный праймер был spa -1514r, как описано в протоколе RIDOM. Кроме того, мы уменьшили количество праймера, используемого в spa -PCR, чтобы минимизировать количество неиспользованного праймера после ПЦР. В результате не требовалось очистки продукта ПЦР для анализа последовательности. Вкратце, 1 мкл стафилококкового лизата использовали в 25 мкл ПЦР с использованием мастер-микса HotStar (Qiagen, Hilden, Германия) и 2,5 пмоль праймеров. Ген spa амплифицировали с использованием следующей программы: 15 мин при 95 ° C, 30 циклов амплификации, состоящих из 45 секунд при 95 ° C, 45 секунд при 60 ° C и 1.5 мин при 72 ° C и последний этап 7 мин при 72 ° C. Два мкл неочищенного продукта ПЦР использовали для секвенирования обеих цепей продукта.

Идентификация и выбор локусов VNTR в

S. aureus

В начале этого исследования последовательности генома 9 различных штаммов S. aureus были доступны в открытом доступе. Эти геномные последовательности были проверены на наличие последовательностей тандемных повторов с помощью программы Tandem Repeats Finder, версия 4.00 [39] и самодельный сценарий для программного обеспечения Kodon 3.5 (Applied Maths, Синт-Мартенс-Латем, Бельгия). Анализ in silico имеющихся геномов S. aureus выявил наличие локусов с переменной количество тандемных повторяющихся последовательностей в этих секвенированных геномах. Примечательно, что большинство идентифицированных локусов VNTR несут несовершенные тандемные повторы. Праймеры, фланкирующие области VNTR, были разработаны и использованы на случайно выбранной генетически разнообразной тестовой панели штаммов, которые ранее были проанализированы PFGE в нашей лаборатории.Локусы VNTR считались подходящими, если они давали продукты ПЦР со всеми штаммами в тестовой панели и в тестовой выборке было не менее 3, но не более 10 различных аллелей. Повторяющиеся локусы, не дающие ни одного продукта ПЦР, считались неподходящими. Кроме того, предпочтение отдавалось локусам VNTR, которые располагались в некодирующих областях генома, но это не было критерием исключения. Из более чем 20 локусов VNTR, которые первоначально были идентифицированы с помощью анализа in silico , были отобраны 10 на основе их характеристик (размер повтора, количество повторов, уникальный локус).Из этих 10 мы выбрали 8 локусов VNTR, которые соответствовали указанным выше критериям. Только 3 из 8 локусов располагались в кодирующих областях в геноме S. aureus (Таблица 1 и Рис. 1). Обоснование выбора 8 локусов VNTR было прагматичным. Во-первых, необходимо включить достаточное количество локусов, чтобы получить достаточную дискриминационную силу. Во-вторых, автоматический секвенатор ДНК, используемый для MLVA, может различать 5 различных флуоресцентных меток в одном канале. Это означает, что мультиплексная ПЦР с 4 разными мишенями с использованием разных флуоресцентных меток для каждой ПЦР может быть проанализирована вместе с внутренним маркером с пятой флуоресцентной меткой для получения точного определения размера.Таким образом, 2 мультиплексных ПЦР позволили провести одновременный анализ 8 различных локусов VNTR S. aureus .

Анализ тандемных повторов числа переменных с множественными локусами

ПЦР VNTR проводили в объемах 25 мкл на машинах для ПЦР Applied Biosystems 9700 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, США). Восемь локусов VNTR были амплифицированы в 2 мультиплексных ПЦР. Для каждой мультиплексной ПЦР 2 мкл 1-10 разведенного лизата S. aureus добавляли к смеси, содержащей 10 пмоль каждого из 4 различных 5′-флуоресцентно меченных прямых праймеров, 10 пмоль каждого из 4 немеченых обратных праймеров и 12 пмоль каждого.5 мкл мультиплексной мастермикса HotStarTaq (Qiagen, Hilden, Германия). Исключением была вторая мультиплексная ПЦР, в которой 5 пмоль меченого праймера VNTR61_02FV, а также 5 пмоль немеченого праймера VNTR61_02F использовали для уменьшения сигнала для этого VNTR в мультиплексной ПЦР. Все последовательности праймеров показаны в таблице 2. Локусы VNTR амплифицировали с использованием следующей программы ПЦР: 15 мин при 95 ° C, затем 20 циклов амплификации, которые включали 45 секунд при 95 ° C, 45 секунд при 54 ° C и 90 секунд при 72 ° C и заключительный этап 30 минут при 68 ° C, чтобы гарантировать полную активность терминальной трансферазы ДНК-полимеразы Taq.После ПЦР образцы разбавляли 1 × 100 в воде и 1 мкл разбавленных образцов смешивали с 10 мкл 1 × 100 в воде, разбавленной флуоресцентно меченным маркером GeneScan 1200 LIZ (Applied Biosystems). После тепловой денатурации в течение 5 мин при 95 ° C фрагменты разделяли на секвенаторе ДНК ABI 3730 с использованием стандартного модуля анализа фрагментов. Полученные файлы .fsa были импортированы и проанализированы в программе GeneMarker (Softgenetics, State College, США) для расчета количества повторов каждого локуса VNTR.Локусам VNTR, которые не дали продукта ПЦР после повторного анализа, был присвоен номер 99. Однако все 1681 изолят проверочного набора дали продукт ПЦР для всех локусов VNTR. Оцененные количества повторов 8 локусов VNTR были объединены в строку, состоящую из 8 целых чисел, например. 14-0-2-4-1-7-1-6. Эта строка, называемая профилем MLVA, использовалась для кластеризации.

Расчет количества повторов в каждом из локусов VNTR был простым. Размер продукта ПЦР минус размер фланкирующих областей давал повторяющуюся область.Разделив размер этой области на размер повторяющейся единицы, мы получили количество повторов в каждом локусе. Это было верно для всех локусов VNTR, за исключением VNTR61_01. Вышестоящая фланкирующая область этого локуса оказалась неоднородной по составу, в результате чего фрагменты были немного больше или меньше. Некоторые размеры бинов, используемых в программном обеспечении GeneMarker, были сдвинуты, чтобы соответствовать фактическим размерам различных аллелей, что обеспечило точный расчет количества повторов в локусе VNTR61_01.Представители всех аллельных вариантов были секвенированы, чтобы гарантировать правильность определения количества повторов.

Анализ данных

Все данные набора были импортированы в программное обеспечение Bionumerics (прикладная математика), сгруппированы с использованием соответствующих настроек и взаимосвязей, отображаемых с использованием метода построения графиков, называемого минимальным остовным деревом, как описано ранее [34]. В минимальном связующем дереве было выбрано правило приоритета для первых типов ссылок, которые имеют наибольшее количество вариантов одного локуса.В дереве типы представлены кружками. В наших предпочтительных настройках размер круга указывает количество штаммов этого конкретного типа. Жирные короткие линии, соединяющие два типа, обозначают типы, отличающиеся одним локусом, тонкие более длинные линии соединяют варианты с двойным локусом. Комплексы MLVA создавались, если расстояние между соседними типами не превышало 1 и по крайней мере 5 типов удовлетворяли этому критерию. Для расчета генетического разнообразия и дискриминирующей способности типирования использовался индекс разнообразия Симпсона, где n _i — количество штаммов, принадлежащих к типу i ^th , а N — общее количество штаммов в выборочной популяции [34 ], [40].

Статистический анализ проводился либо в Bionumerics, либо в StatsDirect v2.6.6 (StatsDirect Ltd., Чешир, Великобритания). В Bionumerics стабильность определенных групп рассчитывается с использованием статистического метода, называемого разделением групп. В этом методе используется метод складного ножа, при котором каждая запись берется из списка и идентифицируется по каждой группе. В этом исследовании это было сделано с использованием для идентификации среднего сходства каждой группы.

Секвенирование ДНК

Для реакций секвенирования ДНК использовали технологии BigDye Terminator и BigDye XTerminator (Applied Biosystems).Последовательности реакционных смесей анализировали на автоматическом секвенаторе ДНК ABI 3730.

Результаты

Проектирование и разработка MLVA для

S. aureus

На основе имеющихся последовательностей генома S. aureus были отобраны локусы VNTR и оценены для использования в MLVA. Были отобраны восемь локусов VNTR и проанализированы в 2 мультиплексных ПЦР. Пригодность была проверена с использованием набора из 96 штаммов, который включал 4 изолятов S. aureus , для которых был секвенирован геном (MW2, COL, N315, NCTC8325), 10 штаммов MRSA (5 пар), рассматриваемых как изоляты вспышек на основании их идентичных Профили PFGE, дата выделения и тот факт, что они были получены из одной и той же больницы, 72 случайно выбранных изолята MRSA, 5 изолятов MSSA и 5 изолятов метициллин-резистентных Staphylococcus epidermidis (MRSE) и 5 ​​чувствительных к метициллину S.epidermidis (MSSE). Все изоляты S. aureus дали продукты ПЦР, которые различались по размеру. Штаммы, из которых был секвенирован геном, дали ожидаемое количество повторов в различных локусах VNTR. Штаммы, принадлежащие к одной и той же вспышке, имели идентичные профили MLVA. Ни один из изолятов S. epidermidis не дал продуктов ПЦР ни с одним из ПЦР VNTR.

Для определения стабильности локусов VNTR 5 изолятов S. aureus субкультивировали в течение 20 последовательных дней, высевая одну колонию из каждого штамма на чашки с агаром.Из каждой субкультуры готовили суспензии и подвергали MLVA. Ни один из 8 локусов VNTR не был изменен во время серийного пассажа, что показывает, что по крайней мере в лабораторных условиях локусы VNTR были стабильными.

MLVA

изолятов S. aureus

MLVA было выполнено на 1681 изолятах S. aureus , полученных от пациентов-людей. Все изоляты этого набора для проверки дали продукт ПЦР для всех локусов VNTR. Анализ состава 8 локусов VNTR белка S.Коллекция штаммов aureus показала, что разнообразие в количестве повторов варьировало среди различных локусов VNTR. Некоторые локусы несут большое количество повторов, например до 25 повторов в локусе VNTR09_01, в то время как другие локусы несут только ограниченное количество повторов, например VNTR61_02 с максимум 5 повторами (Таблица 1). Индексы разнообразия (DI) 8 различных локусов VNTR также значительно различались. Самый низкий DI (34,2%) был обнаружен для VNTR21_01, а самый высокий — для VNTR24_01 (83%), который представляет собой ген spa (Таблица 1).Всего среди 1681 изолятов S. aureus было обнаружено 511 различных типов MLVA. Профили MLVA были сгруппированы с использованием категориального коэффициента кластеризации, и было построено минимальное остовное дерево для отображения взаимосвязей между различными типами MLVA (рис. 2). Это выявило присутствие 11 различных комплексов MLVA, которым были присвоены сложные названия, например MC8 представляет собой комплекс MLVA 8. Из 1681 изолятов, использованных для исследования, 1473 (87,6%) входили в состав комплекса MLVA. Остальные 208 изолятов (12.4%) не были частью этих комплексов и им был присвоен код ближайшего комплекса MLVA (NMC), например NMC8 или 8, что указывает на наиболее близкий комплекс MLVA.

Рис. 2. Минимальное остовное дерево из 1681 изолятов S. aureus , типизированных методом MLVA.

Кластеризация профилей MLVA производилась с использованием категориального коэффициента. В минимальном остовном дереве типы MLVA отображаются кружками. Размер каждого кружка указывает количество изолятов этого конкретного типа. Толстые сплошные линии соединяют типы, которые различаются одним локусом VNTR, а тонкая сплошная линия соединяет типы, которые различаются 2 локусами VNTR.Цвет ореола, окружающий типы MLVA, обозначает типы, принадлежащие к одному и тому же комплексу. Комплексы MLVA назначались, если 2 соседних типа не различались более чем в 1 локусе VNTR и если этому критерию удовлетворяли не менее 5 типов. Комплексы MLVA также обозначаются буквами, например, MC8 обозначает комплекс MLVA 8.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005082.g002

Большинство изолятов, включенных в это исследование, были MRSA (78,1%). Изоляты MSSA были обнаружены практически во всех комплексах MLVA.Однако комплексы MC100, MC15 и все 19 изолятов, которые были тесно связаны с MC15 (NMC15), полностью состояли из чувствительного к метициллину S. aureus . Кроме того, только 7,7% изолятов в комплексе MC7 MLVA были MRSA. Напротив, только 2 изолята (0,9%) в комплексе MC398 были MSSA (таблица 3). Для 1185 изолятов также было определено присутствие генов лейкоцидинов Пантон-Валентайн (PVL) [41], и это показало, что 94,2% изолятов в MC80 были PVL-положительными (таблица 3). Два других комплекса MLVA, которые содержали значительное количество PVL-положительных изолятов, были MC30 (34.4%) и MC8 (17,8%).

Сравнение MLVA с

spa -последовательностью типирования и PFGE

Большое количество изолятов, ранее охарактеризованных с использованием типирования последовательности spa и / или PFGE, было использовано для оценки значения MLVA в качестве метода типирования для S. aureus . Spa — типирование последовательности было выполнено для 882 из 1681 изолята. Типы SpaTypes были сгруппированы с помощью подключаемого модуля spa в программном обеспечении Bionumerics, и результаты отображались в виде минимального связующего дерева.Минимальное остовное дерево (рис. 3) показало, что группировка по типу spa -последовательности была аналогична группировке, найденной MLVA. Одним из наиболее примечательных результатов было то, что изоляты, принадлежащие к MC7 и MC15, находились в одном кластере spa . Анализ PFGE был проведен на 1304 из 1681 изолята. Снова кластеризация на основе PFGE дала группировку, аналогичную группировке MLVA (рис. 4). Однако из-за небольших неточностей, присущих экспериментальным вариациям PFGE, группировка не была такой четкой, как при MLVA или spa -последовательности типирования.

Рисунок 3. Минимальное остовное дерево 882 изолятов S. aureus , типизированных с помощью spa -последовательного типирования.

SpaTypes отображаются в виде кружков. Описание символов, линий и т. Д. См. В легенде на рисунке 2. Кластеризация была выполнена с использованием спа-плагина Bionumerics с консервативной настройкой выравнивания 100% и максимальной длиной дублирования 0%. Ореолы, окружающие SpaTypes, указывают на связанные SpaTypes.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005082.g003

Рис. 4. Минимальное остовное дерево из 1304 изолятов S. aureus , типизированное методом PFGE.

Типы PFGE отображаются в виде кружков. Кластеризация проводилась с использованием коэффициента корреляции Пирсона и параметра оптимизации 2%. Полученная в результате матрица подобия использовалась для построения минимального остовного дерева с размером ячейки подобия 10%. Связанные ПФГЭ сгруппированы, и это обозначено двойным кружком (уплотненные комплексы). Комплекс MLVA обозначается цветом кружков (см. Рисунок 2), а также обозначается буквами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005082.g004

Для количественной оценки степени сходства в группировке, полученной тремя методами, с помощью программного обеспечения Bionumerics определяли как соответствие между методами типизации, так и разделение групп. Соответствие методов типизации выводится из матриц сходства, которые создаются при анализе методов. Анализ с использованием коэффициента корреляции Пирсона показал, что соответствие между типированием последовательности spa и MLVA составило 62.7% для набора из 882 изолятов, типизированных обоими методами. Соответствие между PFGE и MLVA, выполненным на 1304 изолятах, было значительно ниже и составило 48,0%. Разделение групп рассчитывали по алгоритму Jackknife. В данном случае группы представлены 11 комплексами MLVA. Анализ показал, что 95,1% изолятов принадлежали к этим 11 группам, если для идентификации использовалось spa -последовательное типирование. Разделение групп составляло 89,2%, если для характеристики изолятов использовался PFGE.Это указывает на то, что существует значительная степень сходства в группировке с использованием трех методов набора текста.

Индексы разнообразия MLVA, PFGE и

spa — типирование последовательности

Индексы разнообразия могут использоваться для оценки разнообразия бактериальной популяции. Однако индекс разнообразия также часто используется для обозначения дискриминирующей способности методов набора текста. Индекс разнообразия Симпсона был определен для всех изолятов, типизированных любым из 3 методов, и для 529 изолятов, для которых были выполнены все 3 метода типирования (таблица 4).Это показало, что MLVA и PFGE дали одинаковые DI 98,5% и 97,7% соответственно. DI spa -последовательности типирования составил 96,2% и, таким образом, несколько ниже, чем у MLVA и PFGE. Это предполагает относительно небольшую разницу между тремя методами набора текста. Однако, если число типов наносить на график в зависимости от кумулятивной доли изолятов в отобранной популяции, выявляется более выраженная разница между типами последовательностей MLVA, PFGE и spa (рис. 5). График выявил значительную разницу в дискриминирующей способности MLVA и PFGE в отличие от spa -последовательного типирования.В коллекции, отсортированной по частоте типов, 70% всех изолятов представляют 44 типа MLVA и 44 типа PFGE. Напротив, 70% всех изолятов представляют только 19 SpaTypes, что составляет менее половины от числа типов, полученных с помощью MLVA и PFGE. Более высокая дискриминирующая сила MLVA также очевидна из того факта, что для типирования spa -sequence существует значительно больше изолятов одного типа, чем для MLVA (таблица 4).

Рисунок 5. Дискриминационная сила MLVA, spa -последовательности типирования и PFGE для S.aureus.

Разнообразие отображается как количество типов в зависимости от процента изолятов. Для получения графика список результатов типирования сначала был отсортирован по частоте, и было определено процентное соотношение изолятов по отношению к количеству типов. На графике показаны результаты только для 529 изолятов S. aureus , которые были проанализированы всеми тремя методами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005082.g005

Связь между MLVA и MLST

Четыре линии наблюдений подтверждают идею сильного согласия между группировками, созданными MLST и MLVA.(1) Прямое сравнение между MLST и MLVA на основе 40 изолятов, (2) косвенное сравнение MLVA с MLST на основе данных, полученных из базы данных Ridom, (3) косвенные доказательства того, что гены pvl присутствовали только в MC8, MC30 и MC80, (4) in silico анализ конгруэнтности с использованием 14 полностью секвенированных геномов.

Согласие между MLVA и MLST стало очевидным из сравнения результатов MLVA с результатами MLST, полученными для небольшого набора из 40 изолятов, для которых у нас также были данные MLST, которые были ранее получены в нашем отделе.Это показало, что MLVA был более разборчивым, чем MLST, но, что более важно, только ST, принадлежащие к одному и тому же клональному комплексу MLST, были сгруппированы по MLVA (рис. 6)

Рисунок 6. Соответствие группировки, полученной MLVA и MLST.

Минимальное остовное дерево было построено на основе данных MLVA для 40 изолятов, для которых MLST уже был выполнен. Кружки представляют типы MLVA, а числа в кружках представляют ЗБ. Числа, отображаемые между типами, обозначают количество локусов VNTR, которые различаются между этими типами.Цвета представляют клональные комплексы MLST. Белые кружки — это ST, которые не были отнесены к конкретному клональному комплексу. Только варианты MLVA с одним или двумя локусами соединены линиями. Размер каждого кружка указывает количество изолятов с этим конкретным типом MLVA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005082.g006

Дополнительные доказательства соглашения между MLVA и MLST были получены косвенным образом. Была произведена инвентаризация моделей spa , которые присутствовали в различных комплексах MLVA.После этого Ridom Spa -Server (http://spaserver2.ridom.de/mlst.shtml) был опрошен, чтобы выявить взаимосвязь между spa-типом и типом последовательности (ST). Это выявило замечательное согласие между комплексами MLVA и клональными комплексами MLST. За исключением одного, каждый комплекс MLVA соответствовал определенному клональному комплексу MLST. По этой причине комплексы MLVA были названы по аналогии с клональными комплексами MLST, например. Комплекс MLVA MC8 состоит из изолятов, которые имеют spa -типы, принадлежащие клональному комплексу CC8 MLST.Был большой комплекс MLVA, MC398, который не мог быть идентифицирован как соответствующий известному клональному комплексу MLST. Этот комплекс MLVA содержал все изоляты MRSA свиньи и поэтому был назван в честь доминантного типа последовательности MRSA свиньи ST398.

Строгое согласие между MLVA и MLST было дополнительно подтверждено наблюдением, что практически все PVL-положительные изоляты были обнаружены в MC80, MC30 и MC8. Это согласуется с выводом о том, что большинство PVL-положительных изолятов S. aureus принадлежат к клональным комплексам MLST CC80, CC30 и CC8 [42].

В качестве дополнительных усилий для подтверждения возможной тесной взаимосвязи между MLVA и MLST был проведен анализ in silico 14 секвенированных геномов S. aureus . Типы последовательностей, профили MLVA и spa -типы были получены из последовательностей геномов, сгруппированы и впоследствии рассчитано соответствие (рис. 7). Это показало, что совпадение между MLST и MLVA составляет 86,5%. Соответствие 66,7% между типированием последовательностей MLST и spa было значительно ниже, чем между MLST и MLVA.Для этого набора данных соответствие между MLVA и spa — типирование последовательности составило 71,9%. Набор данных, полученных от этих 14 изолятов, слишком мал, чтобы делать однозначные выводы. Однако высокая согласованность между MLST и MLVA этого набора данных in silico предполагает высокую степень сходства между кластеризацией на основе MLST и MLVA.

Рис. 7. Анализ In silico 14 штаммов S. aureus , для которых была определена последовательность генома.

Штаммы

были сгруппированы на основе их полногеномной последовательности, профиля MLST, профиля MLVA и типа последовательности spa соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005082.g007

MLVA изолятов MRSA свиньи

Приблизительно 12% штаммов, выделенных от людей, которые использовались для этого исследования, были скрининговыми культурами местного происхождения, то есть без госпитализации ни за границей, ни в Нидерландах, которые были взяты из-за контакта со свиньями. Эти так называемые свиньи MRSA принадлежали к одному комплексу MLVA, MC398. Вариабельность внутри этого комплекса очень низкая, индекс разнообразия составляет всего 72.1%. Используя MLVA, этот набор из 195 изолятов сравнивали с набором из 100 свиней MRSA, выделенных от свиней (фиг. 8). Как и ожидалось, MLVA не может отличить штаммы, выделенные от людей, от штаммов, выделенных от свиней. Было 2 доминирующих типа MLVA, которые представляли 2 доминирующих spa -типа t011 и t108. Изоляты с SpaType t1254 были того же типа MLVA, что и изоляты с SpaType t011. Учитывая, что между t011 и t1254 существует только одна разница в паре оснований, такое сходство неудивительно.Различие между доминирующими типами MLVA, представляющими изоляты с SpaTypes t011 и t108, вызвано исключительно наличием дополнительного spa повтора (r34) в t011. Этот дополнительный повтор приводит к единственному различию локусов между двумя основными типами MLVA.

Рисунок 8. Минимальное остовное дерево из 295 изолятов MRSA свиней, типизированных с помощью MLVA.

Каждый кружок представляет тип MLVA. Оранжевые кружки или секторы кружков обозначают типы, полученные из 195 штаммов MRSA свиней, выделенных от человека.Профили MLVA 100 штаммов MRSA свиней, выделенных от свиней, показаны голубым цветом. Цифры в кружках обозначают типы SpaTypes и их частоту в пределах двух доминирующих типов MLVA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005082.g008

Потенциал MLVA для выявления вспышек

После проверки технических характеристик MLVA в нашей лаборатории, все изоляты, представленные в рамках национального надзора за MRSA в 2008 г., были охарактеризованы последовательностью spa и MLVA.Это позволило нам сделать предварительную оценку эпидемиологического соответствия MLVA среди изолятов от пациентов с проксимальными временными и пространственными отношениями. Была включена выборка из 658 изолятов из больничных лабораторий, которые представили 30 или более изолятов в период с января по октябрь. Пространственно-временные кластеры были определены как изоляция 3 или более первичных изолятов от отдельных пациентов, пролеченных в одной больнице, в течение двухмесячного окна, отображающего один и тот же SpaType. Это выявило появление 38 пространственно-временных кластеров SpaType в 15 больничных лабораториях (Таблица 5).В 29 из 38 кластеров (76%) только один тип MLVA был обнаружен внутри кластера. Однако в 9 из 38 кластеров (24%) каждый кластер содержал 2 или 3 типа MLVA. В некоторых кластерах отклоняющийся тип MLVA представлял вариант MLVA с одним локусом (например, кластер 1 ^st в мае-июне, больница B). Это может означать изменение профиля MLVA в пределах одного и того же штамма. Однако в нескольких других Spa-кластерах были получены изоляты с профилями MLVA, которые различались по 3 локусам (например, 2 кластера ^st в мае-июне, больница B).Представляется весьма маловероятным, что изоляты, которые не соответствуют трем несвязанным генетическим локусам, могут считаться эпидемиологически связанными. Гораздо более вероятно, что типирование последовательности spa не позволило дифференцировать эти изоляты и, таким образом, неверно предположить эпидемиологическое родство. Это предварительное исследование показывает, что MLVA может быть более надежным средством выявления кластеров эпидемиологически связанных изолятов, которые могут представлять собой вспышку MRSA. Однако для оценки окончательной валидности MLVA как молекулярного эпидемиологического инструмента требуется тщательно спланированное исследование с подробными данными о перемещениях пациентов.

Обсуждение

В этом исследовании мы проверили недавно разработанный MLVA, используя коллекцию из 1681 штаммов S. aureus , выделенных от голландских пациентов. MLVA сравнивали с ранее полученными данными типирования последовательностей PFGE и spa , и это показало, что MLVA была по крайней мере такой же дискриминационной, как и PFGE, давая 511 различных типов MLVA, что в два раза больше типов, чем при типировании последовательности spa . MLVA дала однозначные числовые профили, представляющие количество повторов, присутствующих в 8 различных локусах VNTR в S.aureus геном. Профили MLVA, строки из 8 целых чисел, использовались для категориальной кластеризации изолятов, проанализированных в этом исследовании. Кластеризация дала 11 различных групп, которые мы обозначили как комплексы MLVA. Некоторые из этих комплексов состояли преимущественно только из MSSA, тогда как другие группы почти полностью состояли из MRSA. На уровне типирования наблюдалось умеренное соответствие между MLVA, spa, -последовательным типированием и PFGE. Совпадение между этими методами было намного выше на уровне групп со значениями разделения групп 95% для взаимосвязи между MLVA и spa -группировка по типу последовательности и 89% для MLVA и PFGE.Анализ набора из 40 изолятов, которые ранее были типизированы с помощью MLST, поддерживает высокую степень соответствия между MLVA и MLST. Кроме того, используя доступные данные типирования spa -sequence, мы смогли показать, что было высокое согласие комплексов MLVA с клональными комплексами MLST. Однако необходимо будет проводить систематическое сравнение между MLVA и MLST, чтобы подтвердить установленную высокую степень согласия. Подготовка к такому сравнению в настоящее время продолжается.

В последние годы возможный новый резервуар для MRSA появился в Нидерландах.Поступали сообщения о том, что носительство MRSA через нос увеличилось у свиноводов, и что эти линии S. aureus являются общими для фермеров и их животных [43] — [45]. Этот родственный свинье MRSA, по-видимому, является клональным и идентифицирован MLST как последовательность типа 398 [8], [46]. MLVA этих штаммов ST-398, выделенных от людей и свиней, использовали для оценки возможных различий между изолятами человека и животных. Однако таких различий не обнаружено, и MLVA выявила ту же степень дифференциации, что и типирование последовательности spa и .Было 2 основных типа MLVA, которые представляли 2 доминирующих spa -типа t011 и t108, которые отличаются одним повтором.

Чтобы оценить потенциал MLVA как молекулярного эпидемиологического инструмента, MRSA, представленные в рамках национальной стратегии эпиднадзора в 2008 г., были просканированы на предмет пространственно-временных кластеров с неразличимыми SpaTypes. В этом наборе из 658 изолятов было идентифицировано тридцать восемь изолятов, 76% из которых были подтверждены идентичными кластерами MLVA-профилей. Более того, в 24% кластеров MLVA улучшило разрешение и еще больше различает SpaTypes.Это может быть связано с микроэволюцией локусов VNTR, но в случаях, когда 2 или 3 локуса VNTR различались, более вероятно, что spa -последовательность, типизирующая неправильно сгруппированные штаммы, которые были различны в разных хромосомных положениях. Эти данные свидетельствуют о том, что MLVA может повысить микроэпидемиологическую точность, имеющую решающее значение для понимания распространения MRSA в определенных условиях больницы. Однако необходимы дополнительные исследования, подкрепленные подробными исследованиями контактов с пациентами, чтобы оценить весь потенциал этого метода как инструмента микроэпидемиологического типирования.

Для изучения эпидемиологии S. aureus использовалось множество различных методов генотипирования, и в течение многих лет PFGE был методом выбора из-за его дискриминирующей способности и относительно простого оборудования, необходимого для создания профилей PFGE [20], [21]. ]. Однако основным недостатком PFGE является его низкая портативность, что делает его непригодным для межлабораторных сравнений. Разработка схемы MLST для S. aureus оказалась значительным улучшением [22].Его портативность и однозначность результатов, вероятно, делают MLST лучшим выбором для популяционного анализа эпидемиологических исследований. Однако высокие затраты, связанные с секвенированием 7 генов домашнего хозяйства для MLST, ограничивают его использование. Внедрение spa -последовательного типирования было весьма успешным [24]. При типировании последовательности spa требуется секвенирование только одного гена. Это делает его портативным методом с однозначными результатами, который является гораздо более экономичным методом, чем MLST.Главный недостаток типирования spa -sequence заключается в том, что изучается только один локус в геноме, и небольшое изменение, даже одна мутация, уже дает другой тип. Трудно интерпретировать значение такого изменения в его эволюционном контексте и в отсутствие более глобального взгляда на остальную часть генома. Изоляты S. aureus , которые различаются по одному или нескольким основаниям в локусе spa или даже по количеству повторяющихся единиц spa , могут представлять собой близкородственные штаммы или очень далекие.Использование нескольких геномных локусов, таких как MLST, обеспечивает более надежный подход. Гораздо более очевидна взаимосвязь между двумя изолятами, которые различаются только по одному из семи локусов. В то же время увеличение количества локусов также улучшает дискриминационную способность любой системы типирования. Как и MLST, MLVA использует несколько геномных локусов для генотипирования.

Представленная здесь схема MLVA — не первая зарегистрированная MLVA для S. aureus . Sabat et al. были первыми, кто описал MLVA на основе 5 различных локусов VNTR [47].Они проанализировали 34 изолята и обнаружили 26 различных типов и пришли к выводу, что их MLVA был таким же различающим и воспроизводимым, как PFGE. Однако их MLVA содержали VNTR с размером повтора всего 9 п.н., что делает невозможным точное определение размера полос на агарозных гелях. Кроме того, ПЦР на некоторых локусах, включенных в их MLVA, например, локус sdr давал множественные анонимные продукты ПЦР, что усугубляло то, что продукты ПЦР не могли быть отнесены к отдельным локусам VNTR.Таким образом, эта схема MLVA не могла решить генетические отношения. Результаты набора на основе анонимного рисунка полос, разрешенного в гелях агрозы, — как и PFGE — непереносимы и не дают однозначных результатов. Другие группы использовали схему типирования Sabat et al. или немного измененная схема [48] — [52]. Харди и др. [53], [54] описали использование VNTR, которые они, по не совсем понятным причинам, назвали стафилококковыми вкрапленными повторяющимися единицами (SIRU). Снова размер продуктов ПЦР определяли на агарозных гелях для расчета количества повторов на локус и в первом исследовании анализа 16 S.Изоляты aureus дали 11 различных типов. Во втором исследовании 116 изолятов дали 18 различных профилей SIRU. Недавно Ikawaty et al. [55] сообщили о применении слегка адаптированной версии MLVA Харди. Исследовали полиморфизм в 5 локусах VNTR с использованием коллекции из 150 изолятов и обнаружили 76 различных МТ. Часть их исследования была проведена с использованием изолятов от 6 вспышек. Однако эти вспышки были просто идентифицированы на основе идентичного фаготипирования и профилей PFGE, но не имели какого-либо эпидемиологического подтверждения.Примечательно, что профили MLVA показали неоднородность в 4 из 6 зарегистрированных вспышек.

Используя 2 мультиплексных ПЦР, MLVA 96 изолятов можно легко провести в течение одного дня при условии доступности оборудования для секвенирования. В нашей лаборатории стоимость расходных материалов для MLST-анализа одного штамма составляет примерно 70 евро. Стоимость последовательного типирования spa намного ниже — 9 евро за изолят, а затраты на MLVA еще ниже и составляют евро. 8. Это делает MLVA почти в 9 раз дешевле, чем MLST.Основным преимуществом MLVA над spa -последовательностью является простая кластеризация профилей MLVA по сравнению с SpaTypes. В кластеризации MLVA, которую мы использовали в этом исследовании, расстояние между типами выражается как количество различающихся локусов, а разница в количестве повторов не принимается во внимание. Сложный алгоритм, используемый для кластеризации SpaTypes, называется «основанный на повторяющемся шаблоне» (BURP) [56], [57]. Он использует множество различных параметров, таких как повтор-дупликация, повтор-вырезание и повтор-замена, но также события базовой вставки и удаления основания использовались для расчета родства различных SpaTypes.Кроме того, он исключает SpaTypes, длина которых меньше 5 повторов. Достоверность использования этих параметров сомнительна, поскольку неизвестен механизм, управляющий изменением этого локуса, и часы эволюции. Кластеризация MLVA намного проще и похожа на метод, используемый для кластеризации профилей MLST. В MLVA локусы либо идентичны, либо разные, и не учитывается количество потерянных или полученных повторов.

Представленное здесь исследование было выполнено для проверки MLVA как нового метода типизации для S.aureus и, в частности, MRSA. Ван Белкум и др. [58] недавно опубликовали обзор, в котором они предоставили критерии для валидации метода типизации. В нашем исследовании мы продемонстрировали, что MLVA соответствует всем критериям эффективности, описанным в публикации Ван Белкума. Стабильность маркера в лабораторных условиях; среди 2515 S. aureus , включенных в исследование, не было нетипируемых изолятов. Тестовая группа, выбранная для этого исследования, четко определена и, вероятно, составляет самую большую коллекцию, когда-либо использовавшуюся для такого анализа.Кроме того, было показано, что MLVA обладает высокой степенью дискриминации, а типирование — воспроизводимым и точным, что было подтверждено анализом последовательности всех аллельных вариантов. Эпидемиологическая достоверность была рассмотрена в предварительной оценке путем анализа изолятов с четкими пространственно-временными отношениями. MLVA был очень согласован и может даже превзойти spa -типирование последовательности, хотя для подтверждения этого вывода потребуется более подробное исследование. Помимо критериев эффективности, MLVA, описанный в этом исследовании, также соответствует практически всем критериям удобства.Хотя праймеры для этого MLVA предназначены только для использования с S. aureus и не могут использоваться для других видов, сам метод является гибким и может использоваться для любых видов бактерий, несущих локусы VNTR. MLVA быстр, прост в использовании и отлично подходит для высокопроизводительного набора текста при относительно низких затратах. Он не требует экзотических реагентов или оборудования и поэтому доступен для любой лаборатории, оснащенной ПЦР-машинами и автоматическим секвенатором ДНК. Благодаря прямому компьютеризированному анализу, который приводит к однозначным числовым профилям, данные очень подходят для использования в электронных базах данных.

В заключение, MLVA, описанный в этом исследовании, представляет собой высокопроизводительный и относительно недорогой метод генотипирования, который дает однозначные данные, которые можно использовать для межлабораторных сравнений и для баз данных, доступных в Интернете. В настоящее время мы разрабатываем веб-платформу, на которой можно будет запрашивать базу данных со всеми известными профилями MLVA, обеспечивая единую номенклатуру для пользователей метода. Этот веб-сайт будет иметь функциональные возможности, аналогичные функциям веб-сайта MLST (www.mlst.net). Высокая пропускная способность и наблюдаемое сходство с группировкой MLST делают MLVA ценным методом типирования, который может позволить изучить эпидемиологию S. aureus на различных географических уровнях, и мы уверены, что его истинная ценность станет очевидной в подробных эпидемиологических исследованиях.

Благодарности

Мы благодарим голландские лаборатории медицинской микробиологии и больницы за отправку изолятов S. aureus для молекулярного типирования.Без их вклада это исследование было бы невозможно.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: LMS. Проведены эксперименты: ЭКС МВЛ ВНП МГВСВ. Проанализированы данные: LMS HG AJDN. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: XWH HGJVdH MEOCH. Написал статью: LMS.

Список литературы

1. 1.
   Эмори Т.Г., Гейнес Р.П. (1993) Обзор внутрибольничных инфекций, включая роль микробиологической лаборатории.Clin Microbiol Rev 6: 428–442.
2. 2.
   Steinberg JP, Clark CC, Hackman BO (1996) Нозокомиальные и внебольничные бактериемии Staphylococcus aureus с 1980 по 1993 год: влияние внутрисосудистых устройств и резистентность к метициллину. Clin Infect Dis 23: 255–259.
3. 3.
   Tiemersma EW, Bronzwaer SL, Lyytikainen O, Degener JE, Schrijnemakers P, et al. (2004) Метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus в Европе, 1999–2002 гг. Emerg Infect Dis 10: 1627–1634.
4. 4.
   Панлилио А.Л., Калвер Д.Х., Гейнес Р.П., Банерджи С., Хендерсон Т.С. и др. (1992) Метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus в больницах США, 1975–1991. Инфекционный контроль Hosp Epidemiol 13: 582–586.
5. 5.
   Спеллер Д.К., Джонсон А.П., Джеймс Д., Марплс Р.Р., Чарлетт А. и др. (1997) Устойчивость к метициллину и другим антибиотикам в изолятах Staphylococcus aureus из крови и спинномозговой жидкости, Англия и Уэльс, 1989–95.Ланцет 350: 323–325.
6. 6.
   Wertheim HF, Vos MC, Boelens HA, Voss A, Vandenbroucke-Grauls CM и др. (2004) Низкая распространенность метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus (MRSA) при госпитализации в Нидерландах: значение поиска и уничтожения и ограничительного использования антибиотиков. J Hosp Infect 56: 321–325.
7. 7.
   ван Трайп М.Дж., Меллес Д.К., Хендрикс В.Д., Парлевлит Г.А., Гомманс М. и др. (2007) Успешный контроль широко распространенной колонизации и инфекции метициллин-резистентного стафилококка золотистого стафилококка в большой клинической больнице в Нидерландах.Инфекционный контроль Hosp Epidemiol 28: 970–975.
8. 8.
   де Нилинг AJ, ван ден Брук MJ, Spalburg EC, van Santen-Verheuvel MG, Dam-Deisz WD, et al. (2007) Высокая распространенность метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus у свиней. Vet Microbiol 122: 366–372.
9. 9.
   де Нилинг AJ, ван Лиувен WJ, Schouls LM, Schot CS, van Veen-Rutgers A, et al. (1998) Устойчивость стафилококков в Нидерландах: наблюдение с помощью электронной сети в 1989–1995 гг.J Antimicrob Chemother 41: 93–101.
10. 10.
    Williams RERJ, Dowsett LM (1953) Типирование бактериофагом штаммов Staphylococcus aureus из различных источников. Ланцет 14: 510–514.
11. 11.
    Hadorn K, Lenz W, Kayser FH, Shalit I., Krasemann C (1990) Использование зонда гена рибосомной РНК для эпидемиологического исследования метициллина и ципрофлоксацина, устойчивого к Staphylococcus aureus . Eur J Clin Microbiol Infect Dis 9: 649–653.
12. 12.van Belkum A, Bax R, Prevost G (1994) Сравнение четырех анализов генотипирования для эпидемиологического исследования метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus . Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13: 420–424.
13. 13.
    Дамиани Г., Телекко С., Коминчини С., Сирони М., Карретто Е. и др. (1996) Сравнение улучшенного снятия отпечатков пальцев RAPD с различными методами типирования для различения клинических изолятов Staphylococcus spp. Eur J Epidemiol 12: 163–169.
14. 14.
    Gurtler V, Barrie HD (1995) Типирование штаммов Staphylococcus aureus с помощью ПЦР-амплификации спейсерных областей 16S-23S рДНК переменной длины: характеристика спейсерных последовательностей. Microbiology 141 (Pt 5): 1255–1265.
15. 15.
    Deplano A, Vaneechoutte M, Verschraegen G, Struelens MJ (1997) Типирование штаммов Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis с помощью ПЦР-анализа полиморфизмов длины спейсера интер-IS256.J Clin Microbiol 35: 2580–2587.
16. 16.
    Grady R, Desai M, O’Neill G, Cookson B, Stanley J (1999) Генотипирование эпидемических метициллин-устойчивых изолятов Staphylococcus aureus фага типа 15 с помощью флуоресцентного анализа полиморфизма длины амплифицированных фрагментов. J Clin Microbiol 37: 3198–3203.
17. 17.
    Меллес Д.К., ван Леувен В.Б., Снайдерс С.В., Хорст-Крефт Д., Петерс Дж.К. и др. (2007) Сравнение мультилокусного типирования последовательностей (MLST), гель-электрофореза в импульсном поле (PFGE) и полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (AFLP) для генетического типирования Staphylococcus aureus .J Microbiol Methods 69: 371–375.
18. 18.
    Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K (2000) Новый класс генетического элемента, кассетная хромосома стафилококка mec, кодирует устойчивость к метициллину в Staphylococcus aureus . Антимикробные агенты Chemother 44: 1549–1555.
19. 19.
    Стивенс AJ, Huygens F, Giffard PM (2007) Систематическое получение наборов маркеров для механического типирования хромосом стафилококковой кассеты. Антимикробные агенты Chemother 51: 2954–2964.
20. 20.Ichiyama S, Ohta M, Shimokata K, Kato N, Takeuchi J (1991) Фингерпринт геномной ДНК с помощью гель-электрофореза в импульсном поле как эпидемиологический маркер для изучения внутрибольничных инфекций, вызванных метициллин-устойчивым стафилококком Staphylococcus aureus . J Clin Microbiol 29: 2690–2695.
21. 21.
    Куксон Б.Д., Робинсон Д.А., Монк А.Б., Мурчан С., Деплано А. и др. (2007) Оценка методов молекулярного типирования для характеристики европейской коллекции эпидемических метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus : коллекция HARMONY.J Clin Microbiol 45: 1830–1837.
22. 22.
    Enright MC, Day NP, Davies CE, Peacock SJ, Spratt BG (2000) Мультилокусное типирование последовательностей для характеристики метициллин-устойчивых и метициллин-чувствительных клонов Staphylococcus aureus . J Clin Microbiol 38: 1008–1015.
23. 23.
    Frenay HM, Theelen JP, Schouls LM, Vandenbroucke-Grauls CM, Verhoef J, et al. (1994) Различение эпидемических и неэпидемических метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus на основе полиморфизма гена протеина А.J Clin Microbiol 32: 846–847.
24. 24.
    Хармсен Д., Клаус Н., Витте В., Ротгангер Дж., Тернвальд Д. и др. (2003) Типирование метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus в условиях университетской больницы с использованием нового программного обеспечения для определения повторения СПА и управления базой данных. J Clin Microbiol 41: 5442–5448.
25. 25.
    Coletta-Filho HD, Takita MA, de Souza AA, Aguilar-Vildoso CI, Machado MA (2001) Дифференциация штаммов Xylella fastidiosa с помощью анализа переменного количества тандемных повторов.Appl Environ Microbiol 67: 4091–4095.
26. 26.
    Фарлоу Дж., Постик Д., Смит К.Л., Джей З., Барантон Дж. И др. (2002) Типирование штаммов Borrelia burgdorferi , Borrelia afzelii и Borrelia garinii с использованием анализа тандемных повторов с несколькими локусами с переменным числом переменных. J Clin Microbiol 40: 4612–4618.
27. 27.
    Фарлоу Дж., Смит К.Л., Вонг Дж., Абрамс М., Литл М. и др. (2001) Типирование штамма Francisella tularensis с использованием тандемного анализа множественных локусов с переменным числом повторов.J Clin Microbiol 39: 3186–3192.
28. 28.
    Frothingham R, Meeker-O’Connell WA (1998) Генетическое разнообразие в комплексе Mycobacterium tuberculosis на основе переменного количества тандемных повторов ДНК. Microbiology 144 (Pt 5): 1189–1196.
29. 29.
    Кейм П., Клевицкая А.М., Прайс Л. Б., Шупп Дж. М., Зинзер Г. и др. (1999) Молекулярное разнообразие в Bacillus anthracis . J Appl Microbiol 87: 215–217.
30. 30.
    Клевицкая А.М., Прайс Л.Б., Шупп Дж.М., Уоршам П.Л., Вонг Дж. И др.(2001) Идентификация и характеристика тандемных повторов с переменным числом в геноме Yersinia pestis . J Clin Microbiol 39: 3179–3185.
31. 31.
    Лю Й., Ли М.А., Оои Е.Е., Мавис Й., Тан А.Л. и др. (2003) Молекулярное типирование изолятов серовара typhi Salmonella enterica из разных стран Азии с помощью мультиплексной ПЦР на тандемных повторах с переменным числом. J Clin Microbiol 41: 4388–4394.
32. 32.
    Pourcel C, Vidgop Y, Ramisse F, Vergnaud G, Tram C (2003) Характеристика полиморфизма тандемных повторов в Legionella pneumophila и его использование для генотипирования.J Clin Microbiol 41: 1819–1826.
33. 33.
    Schouls LM, van der Ende A, Damen M, van de Pol I (2006) Анализ тандемных повторов с переменным числом множественных локусов у Neisseria meningitidis дает группировки, аналогичные группировкам, полученным с помощью мультилокусного типирования последовательностей. J Clin Microbiol 44: 1509–1518.
34. 34.
    Schouls LM, van der Ende A, van de Pol I, Schot C, Spanjaard L, et al. (2005) Увеличение генетического разнообразия штаммов Haemophilus influenzae серотипа b (Hib) после внедрения вакцинации против Hib в Нидерландах.J Clin Microbiol 43: 2741–2749.
35. 35.
    Schouls LM, van der Heide HG, Vauterin L, Vauterin P, Mooi FR (2004) Анализ тандемных повторов с несколькими локусами и переменным числом голландских штаммов Bordetella pertussis показывает быстрые генетические изменения с клональной экспансией в конце 1990-х годов. J Bacteriol 186: 5496–5505.
36. 36.
    Top J, Schouls LM, Bonten MJ, Willems RJ (2004) Анализ тандемных повторов с переменным числом множественных локусов, новая схема типирования для изучения генетического родства и эпидемиологии изолятов Enterococcus faecium .J Clin Microbiol 42: 4503–4511.
37. 37.
    ван Белкум А., Шерер С., ван Леувен В., Виллемсе Д., ван Альфен Л. и др. (1997) Переменное количество тандемных повторов в клинических штаммах Haemophilus influenzae . Инфекция иммунной 65: 5017–5027.
38. 38.
    Малви М.Р., Чуй Л., Исмаил Дж., Луи Л., Мерфи С. и др. (2001) Разработка канадского стандартизированного протокола для определения подтипов метициллин-устойчивого Staphylococcus aureus с использованием гель-электрофореза в импульсном поле.J Clin Microbiol 39: 3481–3485.
39. 39.
    Benson G (1999) Поиск тандемных повторов: программа для анализа последовательностей ДНК. Nucleic Acids Res 27: 573–580.
40. 40.
    Симпсон Э. (1949) Измерение разнообразия. Природа 163: 688.
41. 41.
    Lina G, Piemont Y, Godail-Gamot F, Bes M, Peter MO, et al. (1999) Участие продуцирующего лейкоцидин Panton-Valentine Staphylococcus aureus в первичных кожных инфекциях и пневмонии. Clin Infect Dis 29: 1128–1132.
42. 42.
    Ванденеш Ф., Наими Т., Энрайт М.С., Лина Дж., Ниммо Г.Р. и др. (2003) Внебольничный устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus , несущий гены лейкоцидина Пантона-Валентайна: появление во всем мире. Emerg Infect Dis 9: 978–984.
43. 43.
    Armand-Lefevre L, Ruimy R, Andremont A (2005) Клональное сравнение изолятов Staphylococcus aureus от здоровых свиноводов, контрольных людей и свиней. Emerg Infect Dis 11: 711–714.
44. 44.Витте В., Стромменгер Б., Станек С., Куни С. (2007) Метициллин-устойчивый Staphylococcus aureus ST398 у людей и животных, Центральная Европа. Emerg Infect Dis 13: 255–258.
45. 45.
    Huijsdens XW, van Dijke BJ, Spalburg E, van Santen-Verheuvel MG, Heck ME и др. (2006) Приобретенный сообществом MRSA и свиноводство. Энн Клин Микробиол Антимикроб 5: 26
46. 46.
    ван Белкум А., Меллес Д.К., Петерс Дж.К., ван Леувен В.Б., ван Дуйкерен Э. и др.(2008) Метициллин-устойчивый и чувствительный Staphylococcus aureus Sequence Type 398 у свиней и людей. Emerg Infect Dis 14: 479–483.
47. 47.
    Сабат А., Кшиштон-Руссьян Дж., Стшалка В., Филипек Р., Косовска К. и др. (2003) Новый метод типирования штаммов Staphylococcus aureus : тандемный анализ полиморфизма и генетических связей клинических изолятов по множеству локусов с переменным числом тандемных повторов. J Clin Microbiol 41: 1801–1804.
48. 48.
    Gilbert FB, Fromageau A, Gelineau L, Poutrel B (2006) Дифференциация изолятов крупного рогатого скота Staphylococcus aureus с использованием полиморфного тандемного повторного типирования.Vet Microbiol 117: 297–303.
49. 49.
    Francois P, Huyghe A, Charbonnier Y, Bento M, Herzig S, et al. (2005) Использование автоматизированного метода множественных локусов и тандемных повторов с переменным числом для быстрого и высокопроизводительного генотипирования изолятов Staphylococcus aureus . J Clin Microbiol 43: 3346–3355.
50. 50.
    Tenover FC, Vaughn RR, McDougal LK, Fosheim GE, McGowan JE Jr (2007) Анализ тандемных повторов с множественными локусами и переменным числом метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus .J Clin Microbiol 45: 2215–2219.
51. 51.
    Collery MM, Smyth DS, Twohig JM, Shore AC, Coleman DC и др. (2008) Молекулярное типирование изолятов носительства из носа Staphylococcus aureus из популяции студентов ирландского университета на основе ПЦР токсинового гена, типов и множественных локусов agr, анализа тандемных повторов с переменным числом тандемных повторов. J Med Microbiol 57: 348–358.
52. 52.
    Малахова Н., Сабат А., Гнядковски М., Кшиштон-Руссьян Дж., Эмпель Дж. И др. (2005) Сравнение анализа тандемных повторов с переменным числом множественных локусов с гель-электрофорезом в импульсном поле, спа-типированием и мультилокусным типированием последовательностей для клональной характеристики изолятов Staphylococcus aureus .J Clin Microbiol 43: 3095–3100.
53. 53.
    Hardy KJ, Ussery DW, Oppenheim BA, Hawkey PM (2004) Распределение и характеристика стафилококковых вкрапленных повторяющихся единиц (SIRU) и потенциальное использование для дифференциации штаммов. Микробиология 150: 4045–4052.
54. 54.
    Hardy KJ, Oppenheim BA, Gossain S, Gao F, Hawkey PM (2006) Использование вариаций в стафилококковых вкрапленных повторяющихся единицах для молекулярного типирования метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus.J Clin Microbiol 44: 271–273.
55. 55.
    Ikawaty R, Willems RJ, Box AT, Verhoef J, Fluit AC (2008) Новый метод анализа тандемных повторов с переменным числом множественных локусов для быстрого молекулярного типирования золотистого стафилококка человека. J Clin Microbiol 46: 3147–3151.
56. 56.
    Меллманн А., Венигер Т., Берсенбрюгге С., Ротгангер Дж., Саммет М. и др. (2007) На основе повторяющегося паттерна (BURP): алгоритм для характеристики долгосрочной эволюции популяций Staphylococcus aureus на основе спа-полиморфизма.BMC Microbiol 7: 98
57. 57.
    Стромменгер Б., Кеттлитц С., Венигер Т., Хармсен Д., Фридрих А.В. и др. (2006) Распределение изолятов Staphylococcus по группам с помощью спа-типирования, макрорестрикционного анализа SmaI и мультилокусного типирования последовательностей. J Clin Microbiol 44: 2533–2540.
58. 58.
    ван Белкум А., Тассиос П.Т., Дейксхорн Л., Хеггман С., Куксон Б. и др. (2007) Руководство по валидации и применению методов типирования для использования в бактериальной эпидемиологии.Clin Microbiol Infect 13: Suppl 31–46.

Акриловые микроканалы и их использование в электрофоретических приложениях

ВВЕДЕНИЕ

1. Область изобретения

Область изобретения — электрофорез.

2. Предпосылки изобретения

Электрофорез стал незаменимым инструментом в биотехнологической промышленности, поскольку он широко используется для разделения, идентификации и подготовки чистых образцов нуклеиновых кислот, белков и углеводов.Например, электрофорез имеет решающее значение для таких приложений секвенирования ДНК, как дидезокси-методы Максама-Гилберта и Сенгера, где основным этапом этих методов является электрофоретическое разделение меченых фрагментов ДНК.

Все больший интерес в области электрофореза вызывает использование устройств с размерами микропереечения, таких как капилляры микроканалов и микроканалы. Использование устройств, в которых электрофоретическая среда размещена в контейнере, имеющем размеры микроперечного сечения, может обеспечить ряд различных преимуществ по сравнению с традиционными конфигурациями электрофоретического пластинчатого геля.Например, при капиллярном электрофорезе (КЭ), когда электрофорез проводится в капиллярах микрокапилляров, можно достичь разделения и разделения компонентов пробы намного быстрее, чем при использовании традиционных конфигураций пластинчатого геля. Микроканальный электрофорез (МКЭ), при котором электрофорез проводится в микроканалах на плоской подложке, также обеспечивает более короткое время анализа, чем это достигается с помощью обычных плоских гелей. Кроме того, с помощью микроканалов существует возможность получения приложений с высокой пропускной способностью, в которых общее количество проб, выполняемых в минуту, значительно увеличивается.Поскольку в CE и MCE требуется гораздо более короткое время выполнения, CE и MCE являются особенно привлекательными методами для проектов, требующих разделения и разрешения сложных смесей большого количества нуклеиновых кислот разного размера, таких как проект «Геном человека».

Традиционно предпочтительным материалом для использования в таких областях, как CE и MCE, был плавленый кварц. Несмотря на популярность плавленого кварца в качестве материала для использования в электрофоретических применениях, плавленый кварц имеет много недостатков.Внутренняя поверхность микроканала из плавленого кварца, например капиллярный, в условиях электрофореза заряжен отрицательно. Этот отрицательный заряд вызывает явление, известное как электроосмотический поток (EOF), которое модулирует характеристики потока и, следовательно, влияет на разделение отдельных компонентов образца в разделительной среде, присутствующей в микрососуде. Кроме того, компоненты пробы, такие как белки и другие аналиты, могут адсорбироваться на отрицательно заряженной поверхности плавленого кварца и тем самым непредсказуемо нарушать однородность EOF, тем самым способствуя невоспроизводимости результатов, полученных при электрофоретическом применении.

Для преодоления вышеуказанных проблем были разработаны различные способы обработки, включая динамическую и ковалентную модификацию внутренней поверхности микрососудов из плавленого кварца. См. Патент США. US 5,221,447, где приведены примеры модификации поверхности капилляров из плавленого кварца. Хотя в идеальных условиях эти обработки могут уменьшить или даже устранить проблемы, связанные с EOF и адсорбцией растворенных веществ, на практике эти обработки могут не полностью замаскировать отрицательно заряженную поверхность диоксида кремния.Кроме того, модифицированный слой на поверхности, полученный в результате такой обработки, может быть не полностью стабильным в условиях электрофореза. Наконец, микрососуды из плавленого кварца с модифицированной поверхностью, такие как капилляры, трудно изготовить, так как процесс изготовления может быть трудоемким и требовать много времени.

Соответственно, существует интерес к идентификации материалов, альтернативных плавленому кварцу, из которых могут быть изготовлены средства удержания среды, то есть микроканалы, подходящие для использования в электрофорезе, где хорошее разделение и разрешение компонентов образца могут быть достигнуты без модификации поверхности материал.В идеале такие материалы должны приводить к существенному снижению адсорбции EOF и / или компонентов пробы по сравнению с необработанным плавленым кварцем в электрофоретических условиях. Кроме того, такие материалы должны быть формованными, оптически прозрачными для оперативного обнаружения и стабильными в условиях электрофореза.

Соответствующая литература

Капиллярный электрофорез рассматривается в Barron & Blanch, Separation and Purification Methods, (1995) 24: 1-118;

Сообщалось о различных методах управления электроосмотическим потоком в капиллярах из плавленого кварца, включая: (1) манипулирование радиальными электрическими полями, см. Lee et al., Анал. Chem. (1990) 62: 1550-1552; Ли и др., Anal. Chem. (1991) 63: 1519-1528; Lee et al., J. Chromatogr. (1991) 559: 133-140; (2) химическая модификация поверхности плавленого кварца, см. Belder & Schomburg, J. High Res. Chromatogr. (1992) 15: 686: 693; Vanderhoff et al., Separation and Purification Meth. (1977) 6: 61-87; Hjerten, J. Chromatogr. (1985) 347: 191–198; Lux et al., J. High Res. Chromatogr. (1990) 13: 145-148; и (3) регулировка характеристик электрофоретической среды, см. Lukacs & Jorgenson, J.Высокое разрешение. Chromatogr. Comm. (1985) 8: 407-411; Швер и Кендлер, Анал. Chem. (1991) 63: 1801-1807.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаются микроканалы, содержащие по меньшей мере акриловую внутреннюю поверхность, и их использование в электрофоретических применениях. Микроканалы по настоящему изобретению имеют множество различных конфигураций и имеют микромасштабные внутренние размеры поперечного сечения. Акриловая внутренняя поверхность рассматриваемых микроканалов приводит к существенному снижению EOF и / или адсорбции в условиях электрофореза по сравнению с природным плавленым кварцем, что делает указанные микроканалы особенно подходящими для использования в ряде различных электрофоретических применений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 представлены результаты электрофоретического разделения лестницы ДНК из 10 пар оснований в необработанном полиметакрилатном капилляре и капилляре из плавленого кварца с покрытием.

РИС. 2 представляет собой частичный вид в разрезе устройства для электрофоретического разделения по настоящему изобретению.

ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Предлагаются микроканалы, имеющие по меньшей мере акриловую внутреннюю поверхность, и их использование в электрофоретических применениях.Микроканалы имеют различные конфигурации поперечного сечения, при этом каналы имеют микромасштабные внутренние размеры поперечного сечения. Рассматриваемые микроканалы приводят к существенному снижению адсорбции EOF и / или компонентов образца в условиях электрофореза по сравнению с природным или необработанным плавленым кварцем, и поэтому подходят для множества различных электрофоретических применений.

Микроканалы по настоящему изобретению могут быть открытыми или закрытыми, где «открытый» означает, что внутренний объем микроканала не полностью отделен, по крайней мере, с одной продольной стороны от внешней среды, в то время как под «закрытым» подразумевается что внутренний объем канала полностью отделен в продольном направлении от внешней среды.Примеры открытых микроканалов включают желоба, желоба и т.п., в то время как закрытые каналы представлены цилиндрами, трубками, капиллярами и т.п. Рассматриваемые микроканалы будут иметь микромасштабные внутренние размеры поперечного сечения, так что внутренние размеры поперечного сечения микроканалов будут больше чем 1 мкм и меньше чем 1000 мкм. Как правило, внутренний размер (а) поперечного сечения микроканала, то есть ширина, глубина или диаметр в зависимости от конкретной природы канала, обычно находится в диапазоне от примерно 1 до 200 мкм, обычно от примерно 10 до 150 мкм, чаще от примерно 20 до 100 мкм, с общей площадью внутреннего поперечного сечения микроканала в диапазоне примерно от 100 до 40000 мкм ² , обычно от примерно 400 до 25000 мкм ² .Форма внутреннего поперечного сечения микроканала может варьироваться среди множества различных конфигураций, включая прямоугольную, квадратную, ромбическую, треугольную или V-образную, круглую, полукруглую, эллипсоидную и т.п. Длина микроканала обязательно будет зависеть от конкретной природы сосуда, а также от электрофоретического устройства, в котором он будет использоваться. Например, если микроканал представляет собой желоб или желоб в подложке, длина микроканала может находиться в диапазоне от примерно 0.От 1 до 100 см, и обычно будет составлять от примерно 1 до 20 см, обычно от примерно 1 до 10 см, и более обычно от примерно 5 до 10 см, в то время как для капилляров длина обычно находится в диапазоне примерно от 10 до 100 см, обычно примерно от 10 до 75 см, чаще примерно от 20 до 50 см. Если рассматриваемый микрососуд содержится внутри капилляра, толщина стенки капилляра может находиться в диапазоне от примерно 50 до 1000 мкм, обычно от примерно 100 до 500 мкм, чаще от 100 до 150 мкм, чтобы обеспечить капилляр с внешним диаметр составляет от 100 до 2000 мкм, обычно примерно от 150 до 400 мкм.

В зоне движения объекта или микроканалах, по крайней мере, внутренняя поверхность, определяющая микроканал, будет из акрилового полимерного материала. Под «по меньшей мере внутренней поверхностью» подразумевается, что где угодно от части до всей стенки (стенок) микроканала может быть акриловый полимерный материал, где, когда только часть микроканала представляет собой акриловый полимерный материал, эта часть будет внутренняя часть стенки канала, которая непосредственно примыкает к электрофоретической среде, присутствующей в канале во время электрофореза.Таким образом, весь микроканал может быть изготовлен из акрилового полимерного материала, или внутренняя поверхность микроканала может быть покрыта тонким слоем акрилового полимера. Как правило, толщина акриловой части микроканала будет составлять, по меньшей мере, около 1 мкм, обычно, по меньшей мере, около 10 мкм, чаще, по меньшей мере, около 25 мкм, и может составлять несколько мм или выше, но обычно не превышает 10 мм. и более обычно не превышает 5 мм.

Если только внутренняя часть, определяющая микроканал, представляет собой акриловый полимерный материал, остальная часть стенки канала может быть любым подходящим материалом, включая теплоотводящий материал, который служит для поглощения тепла, выделяемого в электрофоретической среде во время электрофореза.Таким образом, если микроканал находится на поверхности акриловой подложки, например траншеи или желоба, подложка может быть композитной подложкой, содержащей слой акрилового полимера поверх теплоотводящего материала. Для капилляров акриловая внутренняя поверхность, то есть внутренняя трубчатая секция капилляра может быть окружена или покрыта слоем или внешней трубчатой ​​секцией теплоотводящего материала, где внешний слой или покрытие абсорбирующего материала может быть частично удалено по мере необходимости для обнажения внутренняя акриловая часть стенки капилляра, когда требуется обнаружение в реальном времени.Конкретные материалы, которые обеспечивают отвод тепла и могут составлять, по меньшей мере, часть микроканалов, включают стекло, керамику, металлы и тому подобное. Представляющие интерес материалы, поглощающие удельную теплоту, в зависимости от природы микроканала, включают алюминий, медь, стекло и тому подобное. При использовании металлы должны быть удалены или изолированы от контакта с любыми проводящими средами, чтобы предотвратить короткое замыкание.

Как упоминалось выше, микроканалы в соответствии с настоящим изобретением имеют множество различных конфигураций, включая углубления или углубления на или на поверхности подложки, капилляры и другие микромасштабные конфигурации, подходящие для удержания или содержания электрофоретической среды во время электрофореза.Если микроканал в устройстве 9 представляет собой желоб или желоб, проходящий вниз от поверхности подложки, то удобно использовать канавку 11 в корпусе или подложке 12 из акрилового материала описанного здесь типа, как показано на фиг. 2, подложка может быть квадратной, прямоугольной, круглой и т.п. и будет иметь размеры, которые будут значительно варьироваться в зависимости от предполагаемого использования микроканала, при этом особый интерес представляет подложка в виде карты или по существу правильного параллелепипеда.Если подложка имеет размеры в виде карты или, по существу, правильного параллелепипеда, длина подложки обычно будет находиться в диапазоне от примерно 2 до 200 мм, ширина подложки обычно будет в диапазоне примерно от 2 до 200 мм, а толщина подложки будет обычно составляют от 0,1 до 10 мм. Один или несколько, обычно по меньшей мере 2 и до 100 или более, микроканалов могут присутствовать на или на поверхности подложки, где, когда множество микроканалов присутствует на поверхности подложки, существует возможность иметь несколько различных электрофоретические аппликации, выполняемые одновременно на одной подложке.Микроканал (ы), присутствующий на поверхности подложки, может быть линейным, разветвленным или иметь другую удобную конфигурацию. В случае разветвленных микроканалов или желобов существует возможность иметь первую траншею или канал, пересекаемый одним или несколькими боковыми каналами, где боковые каналы могут пересекать основной канал под любым удобным углом.

Поскольку микроканал (ы), присутствующий на поверхности подложки, может быть открытым, может быть желательно отделить внутренний объем канала и, таким образом, среду, размещенную в канале, от внешней среды.В таких случаях может использоваться закрывающая пластина 13, которая опирается на поверхность подложки и тем самым отделяет внутренний объем канала от окружающей среды. Покрывающая пластина может быть изготовлена ​​из ряда различных материалов, включая плавленый кварц, акриловые полимерные материалы и тому подобное. При необходимости одна или несколько поверхностей покрывающей пластины могут быть обработаны для уменьшения любого EOF, который может возникнуть во время электрофореза. Необходимость обработки, а также конкретный тип обработки обязательно будут зависеть от конкретного материала, используемого в качестве накладки.Например, если крышка изготовлена ​​из акрилового полимерного материала, где материал может быть таким же или отличаться от акрилового полимерного материала, присутствующего, по крайней мере, на внутренней поверхности канала, обычно нет необходимости обрабатывать поверхность плита. Однако, если крышка изготовлена ​​из материала, имеющего заряженные поверхности в условиях электрофореза, такого как плавленый кварц, обычно необходимо обрабатывать по крайней мере поверхность, контактирующую со средой в канале, чтобы уменьшить присутствие EOF. во время электрофореза.Известен ряд различных методов, которые уменьшают или устраняют EOF. См. Ссылки, обсуждающие модификацию поверхности материалов из плавленого кварца, перечисленные в соответствующей литературе выше. Как и в случае с подложкой, крышка может быть изготовлена ​​из одного типа материала или быть композитом из одного или нескольких, обычно двух материалов. Если закрывающая пластина представляет собой композит из двух или более материалов, первый материал или слой, то есть слой, контактирующий со средой в канале, обычно представляет собой акриловый полимерный материал, обработанный плавленый кварц и т.п., в то время как второй материал или слой, а также любые последующие слои могут быть любым удобным материалом, таким как теплоотводящие материалы, описанные выше.

Толщина накладки обычно составляет от 0,01 до 10 мм, чаще от 0,1 до 1,0 мм, при этом длина и ширина накладной пластины могут быть такими же, как длина и ширина, или отличаться от них. субстрат, но обычно будет по существу таким же, как у субстрата. Покровная пластина может иметь по существу гладкие, плоские, плоские поверхности или, необязательно, может быть зеркальным отображением подложки. Хотя это и не обязательно, закрывающая пластина обычно плотно прилегает к подложке.Покрывающую пластину и подложку можно герметизировать с использованием любых удобных средств, таких как ультразвуковая сварка, давление, термообработка, клеи, герметики, физическое соответствие и тому подобное (не показано на фиг. 2).

Акриловый полимерный материал, присутствующий, по крайней мере, на внутренней поверхности микроканалов, будет нерастворимым в воде, твердым, непористым и электрически непроводящим, то есть он будет иметь высокое электрическое сопротивление. Поскольку акриловый полимерный материал непористый, материал будет непроницаемым как для малых, так и для больших молекул, таких как вода, заряженные ионы и т.п.Акриловый полимерный материал будет стабильным в условиях капиллярного электрофореза, то есть в водных условиях с высокими концентрациями солей, при которых pH может находиться в диапазоне от 2 до 12. Если акриловый материал представляет собой блочный материал или капилляр, он будет пригоден для прецизионного формования. или формования с использованием процессов формования и экструзии и обладают достаточной механической прочностью и жесткостью, чтобы сохранять свою форму в условиях электрофореза. Важно отметить, что акриловый полимерный материал будет оптически прозрачным, обычно позволяя свету с длинами волн от 180 до 1500 нм, обычно от 220 до 800 нм, чаще от 250 до 800 нм, чтобы иметь низкие потери на пропускание.Акриловый полимерный материал должен быть в достаточной степени свободным от добавок или примесей, которые могут мешать электрофорезу и желаемым оптическим характеристикам микроканала, полученного из него, таким как прозрачность в определенном диапазоне длин волн.

Акриловый полимерный материал может содержать один или несколько, обычно не более четырех, чаще не более трех отдельных акриловых полимеров, где полимеры могут быть полимеризованы из множества одного или нескольких акриловых мономеров, где термин «акрил» включает как метакрил, так и акрил.Акриловые гомо- и сополимеры, из которых получают микроканалы, будут несшитыми или сшитыми.

Если в полимерном материале присутствуют акриловые сополимеры, существует возможность полимеризовать сополимеры из двух или более различных мономеров, где каждый мономер придает различные характеристики полученному материалу сополимера. В этой ситуации будут рассмотрены следующие критерии: (а) желаемые поверхностные свойства полимера, например его склонность вызывать EOF и / или адсорбировать растворенные вещества в электрофоретических условиях; (b) желаемые механические свойства полимерного материала, содержащего сополимер, такие как прочность и жесткость; (c) желаемые оптические свойства полимерного материала, такие как прозрачность в определенном диапазоне длин волн; и (d) желаемая смачиваемость полимерного материала.Например, для получения полимерного материала, который можно экструдировать в капилляр, пригодный для электрофореза, гидрофобные мономеры, которые придают материалу механическую жесткость, могут быть сополимеризованы с гидрофильными мономерами, которые придают материалу смачиваемость. Гидрофобные мономеры, представляющие интерес для сополимеризации, включают те акриловые гидрофобные мономеры, которые имеют нейтральные сложноэфирные заместители, обычно алкильные заместители, содержащие от 1 до 18 атомов углерода, чаще от 1 до 10 атомов углерода.Гидрофильные мономеры, которые могут быть сополимеризованы с гидрофильными мономерами, включают акриловые кислоты и сложные эфиры, в которых сложноэфирный заместитель обычно имеет длину от 1 до 5 атомов углерода, чаще от 2 до 4 атомов углерода, обычно по меньшей мере с одним атомом кислорода. Для таких сополимеров соотношение гидрофильных и гидрофобных мономерных звеньев в составе сополимера обычно составляет от 0,01 до 1,00: 1, обычно от 0,01 до 0,50: 1, чаще от 0,01 до 0,30: 1. Акриловые сополимеры, из которых получают микроканалы, могут быть статистическими или блок-сополимерами.

По большей части полимерные материалы, из которых изготовлены рассматриваемые микроканалы, будут полимеризоваться из одного или нескольких различных мономеров, при этом отдельные мономерные звенья вдоль цепи могут варьироваться в зависимости от того, является ли полимер гомо- или сополимером, поскольку а также является ли полимер статистическим или блочным, где мономеры по большей части будут иметь формулу: где R ₁ представляет собой H или CH ₃ ;

и R ₂ является таким же или отличным от R ₁ , являясь H, CH ₃ или неароматической алкильной группой, содержащей от 2 до 18 атомов углерода, обычно от 2 до 10 атомов углерода, где алкильная группа может быть линейной, разветвленной или циклической, может иметь один или несколько гетероатомов, обычно не более 2, и может иметь один или несколько участков ненасыщенности, обычно не более 2, где алкильная группа может быть галогенуглеродом, содержащим один или больше атомов галогена, обычно атомов фтора, вплоть до пергалогена;

, где общее количество мономерных звеньев в полимере достаточно для получения полимера с молекулярной массой в диапазоне от примерно 10 ² до 10 ⁴ кДал, обычно от примерно 10 ³ до 5 × 10 ³ кДал.

Интерес представляют акриловые полимеры, полимеризованные из одного или нескольких из следующих мономеров: метилакрилат, метилметакрилат, этилакрилат, этилметакрилат, изопропилакрилат, изопропилметакрилат, трет-бутилакрилат, трет-бутилметакрилат, трет-бутилметакрилат. , изоборнилакрилат, изоборнилметакрилат, адамантил акрилат, адамантил метакрилат, акриловая кислота, метакриловая кислота, глицерин акрилат, метакрилат глицерин, гидроксиэтилметакрилат, этоксиэтилметакрилат, циклогексил акрилат, циклогексилметакрилат, tetradyrofurfuryl акрилат, метакрилат tetradyrofurfuryl, 2-этоксиэтил акрилат, 2- этоксиэтилметакрилат, 2-метоксиэтилакрилат, 2-метоксиэтилметакрилат и т.п.

Если микроканал изготовлен из сшитого акрилового полимера, полимер может быть полимеризован из одного или нескольких из вышеупомянутых монофункциональных мономеров и одного или нескольких бифункциональных или многофункциональных акриловых мономеров, которые обеспечивают сшивание. Би- или многофункциональные акриловые мономеры, которые обеспечивают сшивание, по большей части описываются формулой: где R ₁ такой же, как указано выше;

R ₃ представляет собой неароматическую, линейную, разветвленную или циклическую насыщенную алкильную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, которая может содержать 1 или несколько гетероатомов, обычно не более 3, обычно кислород; и

x — целое число от 2 до 4.

Конкретные представляющие интерес акриловые мономеры, которые являются по меньшей мере бифункциональными, включают диметакрилат этиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диметакрилат неопентилгликоля, акрилат неопентилгликоля, диэтоксилированный триметилолпропантриакрилат и т.п.

Особый интерес представляют микроканалы, в которых акриловая часть представляет собой гомополимер, полимеризованный из акриловых или метакриловых сложных эфиров, где сложноэфирный заместитель содержит от 1 до 10 атомов углерода, обычно от 1 до 2 атомов углерода, причем предпочтительным является полиметилметакрилат (ПММА).

Рассматриваемые полимеры можно получить коммерчески или легко получить известными методами.

Рассматриваемые микроканалы могут быть получены с использованием обычных методов, известных в данной области техники, таких как термоформование, экструзия, литье и т.п.

Рассматриваемые микроканалы находят применение в различных электрофоретических приложениях, где под «электрофоретическими приложениями» подразумевается приложение, в котором заряженные объекты, например молекулы, частицы и т.п. средний.При использовании рассматриваемых микроканалов в электрофоретических применениях конкретный применяемый метод будет зависеть, по меньшей мере, частично от природы электрофоретического устройства, в котором используются рассматриваемые микроканалы, а также от характера выполняемого применения. Как правило, первым шагом будет заполнение внутреннего объема микроканала подходящей электрофоретической средой. В зависимости от конкретного проводимого электрофоретического применения, электрофоретические среды, которые находят применение, включают водные и неводные растворы, дисперсии и гели, где в среде могут присутствовать различные буферы, органические и неорганические модификаторы и т.п.

Следующим шагом обычно будет введение заряженных объектов, которые будут перемещаться во время электрофоретического воздействия в среду. Введение может быть достигнуто с использованием любых удобных средств, включая электрокинетический ввод, гидродинамический ввод и т.п., где конкретные используемые средства будут, по большей части, зависеть от конфигурации канала, а также от необходимости введения точного объема пробы. . Например, с каналами в капилляре средства ввода пробы могут включать электрокинетический ввод, гидродинамический ввод, самопроизвольное вытеснение жидкости и т.п., как описано в Barron & Blach, выше, в §§ 6.5.2-6.5.4. Для приложений MCE, в которых электрофоретическое нанесение выполняется в микроканале на подложке, где используемая конфигурация микроканала включает второй канал, пересекающий первый или основной канал, второй канал может быть заполнен образцом с последующим перемещением объема или пробки. образца в пересечении второго и основного каналов в основной канал путем приложения соответствующего электрического поля. Введенные заряженные объекты могут быть компонентами сложной смеси или образца, реагентов и т.п., в зависимости от конкретного выполняемого приложения.

После введения заряженных объектов, которыми можно манипулировать, к среде будет приложено электрическое поле или поля. В зависимости от конкретного применения, градиент напряжения, приложенный к среде, может находиться в диапазоне от 10 до 1000 В / см, обычно от 50 до 500 В / см. Посредством модуляции приложенного электрического поля или полей движением заряженных объектов через среду можно управлять по желанию, в зависимости от конкретного применения.

Для применений электрофоретического разделения электрофоретическая среда, введенная во внутренний объем микроканала, будет разделительной матрицей.Разделительные среды или матрицы, которые находят применение в применениях для электрофоретического разделения, могут включать буферы и другие добавки, а также полимерные агенты, где могут найти применение как сшитые, так и несшитые линейные полимеры как синтетического, так и природного происхождения и т.д. Матрицы разделения, которые находят особое применение при разделении нуклеиновых кислот, рассмотрены в Barron & Blanch, Separation and Purification Methods (1995) 24: 1-105, § 6.8, специально включенных в настоящее описание в качестве ссылки. При необходимости разделительная матрица может быть загружена во внутренний объем канала под перепадом давления.

Для применений электрофоретического разделения, после того, как микроканал помещен в устройство и готов для электрофореза, образец для электрофореза будет введен в микроканал. Особый интерес представляют методы ввода пробы, которые обеспечивают точную и эффективную доставку объема пробы в электрофоретическую среду. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы избежать уширения полосы во время электрофореза. Чтобы избежать значительного уширения полосы, объем образца обычно составляет от 1 пиколитра до 1 микролитра.Методы, которые обеспечивают введение точных объемов пробы, особенно в CE, включают электрокинетический ввод, гидродинамический ввод, самопроизвольное вытеснение жидкости и т.п., как описано в Barron & Blach, выше, в §§ 6.5.2-6.5.4. Для MCE особый интерес представляет использование пересекающихся каналов, когда объем образца или пробка на пересечении вторичного и основного каналов перемещается в основной канал в результате приложенного электрического поля, как описано выше.

После введения пробы к разделяющей среде будет приложен градиент напряжения, в результате чего различные компоненты пробы будут перемещаться через среду со скоростью, пропорциональной их определенному заряду и / или массе. Можно использовать любые удобные средства для приложения градиента напряжения в среде.

Разделенные и разделенные компоненты затем обнаруживаются с использованием любых удобных средств обнаружения. Используемая система обнаружения будет зависеть от конкретного сигнала, используемого в качестве индикации выделенного компонента, например.g Детекторы УФ-поглощения, где УФ-поглощение является сигналом, детекторы флуоресценции, где лазерно-индуцированная флуоресценция (LIF) является сигналом, и т.п.

Рассматриваемые микроканалы подходят для использования при электрофоретическом разделении компонентов различных образцов, включая сложные смеси белков, углеводов и нуклеиновых кислот. Особый интерес представляет использование рассматриваемых микроканалов в электрофоретическом разделении сложных смесей большого количества нуклеиновых кислот разного размера, таких как фрагменты ДНК, генерируемые в приложениях для секвенирования большого генома.Особый интерес представляет разделение фрагментов ДНК размером примерно от 10 до 10 000 000 п.н., обычно от примерно 10 до 10 000 п.н., чаще примерно от 10 до 5 000 п.н. Методы обнаружения и секвенирования ДНК с использованием микроканалов, таких как капилляры, подробно описаны в Barron & Blach, выше, § 6.6 и Lipshutz & Fodor, Curr. Мнение в Struct. Биол. (1994) 4: 376-380. Рассматриваемые микроканалы особенно подходят для таких применений, поскольку они приводят к значительному снижению EOF и адсорбции компонентов пробы по сравнению с природным или необработанным плавленым кварцем.Под существенно сниженным EOF подразумевается, что EOF, возникающий в рассматриваемых микроканалах в электрофоретических условиях, обычно составляет менее примерно 50%, обычно менее примерно 40%, более обычно менее примерно 30% EOF, присутствующего в микроканалах из природного или необработанного плавленого кварца. в аналогичных условиях. В рассматриваемых микроканалах обычно менее 20%, обычно менее 15%, чаще менее 10% от общей электрофоретической подвижности заряженных объектов, движущихся через канал под действием приложенного градиента напряжения, будет относиться к EOF.

В дополнение к рассматриваемым микроканалам и способам их использования в электрофорезе предоставляются наборы, включающие исследуемые микроканалы с электрофоретической средой, например разделительная матрица, в которой среда может быть предварительно загружена в канал или отделена от канала. Наборы могут дополнительно содержать различные детектируемые метки, способные обеспечивать сигнал, обычно флуоресценцию, который может быть объединен с образцом и обеспечивать детектируемый сигнал во время или после электрофореза, например меченые нуклеиновые кислоты, например меченые нуклеиновые кислоты, например.грамм. флуоресцентно меченные олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентно меченные ddNTP и т.п.

Следующий пример предлагается в качестве иллюстрации, а не ограничения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пример 1

КЭ дцДНК в полиметилметакрилатных капиллярах

Капилляр из полиметилметакрилата (ПММА) диаметром 34 см, имеющий внутренний диаметр 75 мкм и внешний диаметр 375 мкм, был нагружен под давлением разделительной средой, приготовленной из 0,4 г гидроксиэтилцеллюлозы (HEC) (молекулярная масса 90 000-105 000) и 1.5 г гидроксипропилцеллюлозы (HPC) (молекулярная масса 300 000) растворяли в 98,1 г 0,5 X TBE при 400 фунт / кв. Дюйм. Лэддер ДНК из 10 пар оснований, состоящий примерно из 30 повторов длиной 10 пар оснований (GibcoBRL), загружали электрокинетически в течение пяти секунд при 5 кВ. Электрофорез выполняли при 5 кВ с использованием прототипа прибора для электрофореза с детектором конфокальной флуоресценции, имеющим оптические компоненты Spindler & Hoyer (Медфорд, Массачусетс) и омнихромным аргоновым ионным лазером, работающим при приблизительно 12 мВт и 488 нм.

Результаты представлены на фиг.1. Кривая A представляет собой разделение лестницы из 10 пар оснований в полиметакрилатном капилляре, а кривая B представляет собой разделение идентичного образца в капилляре из плавленого кварца с покрытием аналогичных размеров. Кривая «A» имеет положительное смещение базовой линии только для целей сравнения. Введение нейтрального маркера не было обнаружено в течение одного часа после инъекции, что указывает на незначительный электроосмотический поток как в полиметакрилате, так и в капиллярах из плавленого кварца с покрытием. Самый высокий пик в каждом разделе соответствует фрагменту из 100 пар оснований.Поскольку любая электроосмотическая подвижность будет препятствовать миграции образцов пробы к детектору во время эксперимента, на небольшой электроосмос указывало как сходство, так и короткое время анализа двух опытов. Разделение аналогичного образца в непокрытом капилляре из плавленого кварца в аналогичных условиях было значительно плохого качества и демонстрировало обратный порядок элюирования.

Из приведенных выше результатов и обсуждения очевидно, что акриловые микроканалы согласно настоящему изобретению представляют собой жизнеспособную альтернативу микроканалам, полученным из плавленого кварца в электрофоретических применениях.Немодифицированные акриловые микроканалы согласно настоящему изобретению вызывают EOF достаточно малой величины, чтобы обеспечить хорошее разрешение электрофоретически разделенных компонентов, подобное разделению и разрешению, достигаемому с каналами из плавленого кварца с покрытием. Поскольку рассматриваемые микроканалы не требуют модификации поверхности, их легче приготовить и использовать, чем каналы с модифицированной поверхностью. Кроме того, оптическая прозрачность акрилового полимерного материала исследуемых каналов делает их пригодными для использования в методах онлайн-обнаружения.Рассматриваемые микроканалы особенно подходят для разделения сложных смесей большого количества нуклеиновых кислот разного размера, таких как меченые фрагменты ДНК, полученные в приложениях для секвенирования генома.

Все публикации и заявки на патенты, упомянутые в данном описании, включены сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была специально и индивидуально указана для включения посредством ссылки.

Теперь, когда изобретение полностью описано, специалисту в данной области будет очевидно, что в него можно внести множество изменений и модификаций, не выходя за рамки сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.