Как заживает пупочная ранка: обработка, сроки заживления, советы педиатров

Уход за пупочной ранкой – 10 простых правил

Когда молодые родители остаются один на один с новорожденным малышом, у них зачастую возникают вопросы, ответы на которые необходимо получить незамедлительно. Как ухаживать за младенцем? Каким правилам следует придерживаться молодым родителям с первых дней, чтобы малыш рос здоровым и счастливым? В последнее время для молодых мам и пап является актуальной проблема ухода за пупочной ранкой младенца. В этой статье Вы найдете простые, но такие нужные советы по уходу за пупочной ранкой ребенка.

У многих деток через некоторое время после заживления пупочная ранка начинает «мокнуть» вновь. Так было и у нас. Почему это происходит и как с этим бороться? Однако, такое часто бывает. И необходимо всего лишь придерживаться нескольких простых правил по уходу за пупочной ранкой:

1. Следить за животиком малыша, делать массаж и гимнастику. Да-да, не удивляйтесь! Основной причиной подобных проблем являются колики, повышенное газообразование в маленьком животике. Малыш испытывает дискомфорт и часто плачет, от этого большую нагрузку испытывают еще неокрепшие мышцы брюшного пресса – вот и страдает пупочная ранка.
2. Купать малыша в кипяченой воде до тех пор, пока ранка не заживет. Бактерии, содержащиеся в некипяченой воде, могут препятствовать быстрому заживлению пупочной ранки.
3. После купания следует просушить пупочную ранку, например, промокнув ее ватным тампоном.
4. Ежедневно после купания обрабатывать пупочную ранку перекисью водорода (3%). Для этого необходимо капнуть в пупочную ранку 2-3 капли перекиси водорода, затем аккуратно промокнуть сухой ватной палочкой и обработать «зеленкой».
5. Если пупочная ранка долго не заживает, пупочек постоянно «мокнет», обрабатывайте ранку перекисью водорода (3%) еще и по утрам. Также можно воспользоваться заживляющим кремом, например, Д-пантенолом.
6. Ни в коем случае не убирайте корочки с пупочной ранки специально. Корочки указывают на то, что идет заживление ранки, а при грубом их удалении процесс заживления может затянуться. При обрабатывании перекисью водорода лишние корочки отойдут сами.
7. Также не следует прижигать пупочную ранку спиртом, так как в данном случае может возникнуть ожог, а также алкоголь мгновенно проникает в кровь ребенка.
8. Регулярно делать массаж околопупочного кольца, укрепляя тем самым мышцы брюшного пресса и улучшая кровообращение: совершать поглаживания по часовой стрелке, не задевая пупка, а также слегка «пощипывать» кожу вокруг пупочной ранки.
9. Чаще выкладывать ребенка на живот. Это также поможет укрепить мышцы брюшного пресса.
10. Даже, если кажется, что пупочная ранка зажила полностью, не забывайте еще некоторое время внимательно осматривать ее ежедневно.

Соблюдение этих простых правил поможет вам избежать лишних переживаний, а пупочная ранка вашего малыша быстро превратится в аккуратный пупочек!

когда заживает, когда втянется и как выглядит

После выписки из роддома самое страшное для молодой мамы — это обработка пупочной ранки. Если у вас с малышом было совместное пребывание в роддоме, то вы скорее всего уже научились это делать, а если малыш лежал отдельно, то вам следует знать несколько моментов.

Виды пупков

Во время беременности маму и малыша связывает пуповина. После ее обрезания канатик связывают оcобым образом, а через несколько дней отсохший хвостик отмирает сам, а у человека остается напоминание — пупок. И он может быть разным:

1 наружный

2 внутренний

3 выпуклый (когда сам пупок втянут, но на дне шарик-узелок

Как обрабатывать пупок малыша в домашних условиях?

Основные правила

Совершенно не важно чем вы будете обрабатывать пупок новорожденного. Главное — делать это чистыми руками, вовремя менять одежду, проглаживать ее, купать малыша или обтирать чистой водой ежедневно.

Чем обрабатывать?

Обработка пупка проходит ежедневно. Обрабатывать отвалившийся хвостик можно специальными растворами — Хлоргексидином, перекисью водорода, Банеоцином. Или не обрабатывать ничем, но следует четко соблюдать гигиену и обеспечить доступ воздуха к ранке. Не нужно ничем заклеивать ранку или закрывать подгузником.

Как проводить обработку?

1. После купания промочите пупочную ранку чистым ватным диском

2. На место ранки капните 2-3 капельки перекиси водорода (подуйте)

3. После того, как ранка перестанет пенится, уберите сукровицу и частички кожицы чистым ватным тампоном или ватной палочкой.

4. Обработайте раствором, который НАЗНАЧИЛ ВРАЧ или МЕДСЕСТРА. 

Обработка ранки закончена. Все заняло не более пары минут.

Как купать ребенка, если пупок еще не зажил?

Купайте кроху только в отдельной ванне, предварительно ее помойте. Во время купания старайтесь не трогать пупочную ранку и не пользуйтесь моющими средствами. Только чистая вода. Можно добавить слабый раствор марганцовки, ромашки или череды.

Через какое время заживает пупок у новорожденного?

Нельзя четко сказать, когда отпадет пупок или когда заживет пупочная ранка. У некоторых малышей это происходит на 2 день после родов, а у кого-то за 7. Все индивидуально. 

Если вы видите, что пупочная ранка воспалилась, покраснела или из нее выделяется сукровица, кровь или гной — обратитесь к врачу.

Когда нужно волноваться?

В норме пупочная ранка не выглядит воспаленной, но в открытую рану легко может попасть инфекция. Чтобы обезопасить новорожденного, вам следует обрабатывать пупок только чистыми материалами и чистыми руками, не выкладывать малыша на живот слишком рано, тщательно следить за своим здоровьем, чтобы не передать инфекцию крохе.

На что еще обратить внимание

• Грыжа — уплотнение под широким пупочным кольцом




• Гранулема — разрастание ткани внутри и вокруг пупочного кольца




• Мокнущий пупок — признак воспаления




• Пупочный свищ — из пупка выделяется моча, желчь или содержимое кишечника




• Ранка не воспалена, но заживает долго — не хватает иммунитета

кровит пупок у новорожденного -Развитие грудничка по месяцам -Развитие детей

Новорожденные

Как правильно обрабатывать пупок новорожденного?

Перед обработкой пупка новорожденного, которую проводят два раза в день (утром и после вечернего купания), маме следует тщательно вымыть руки с мылом.

Затем нужно обработать пупочное кольцо 3%-ным раствором перекиси водорода с помощью ватного тампона или ватной палочки, выполняя движения от центра к периферии. При этом, чтобы удалить засохшие корочки, нужно раздвигать кожу пупка указательным и большим пальцами. Если при обработке перекисью появляется пена, значит, пупок новорожденного все еще кровит.

Как еще обрабатывают пупок? Комаровский пишет, что при наличии кровянистых выделений нужно обрабатывать ранку, прикладывая к ней на несколько минут ватный тампон, смоченный перекисью водорода, которую следует развести кипяченой водой до концентрации 1,5-2%. Затем на пупочную ранку нужно капнуть с помощью пипетки 1-2 капли зеленки.

Однако, — пишет Комаровский, – не стоит проводить такую обработку слишком часто, иначе ранка будет заживать медленнее. Пупок нужно обрабатывать перекисью водорода не чаще 3-4 раз в день, зеленкой – 1 раз. Можно также использовать пантенол в виде аэрозоля. А «лучшее лекарство для пупка – свежий воздух», — считает Комаровский.

Обратите внимание: не следует заклеивать пупочную ранку пластырем, закрывать подгузником и т. п., иначе она будет хуже заживать. После купания ребенка тщательно промокайте ее полотенцем, чтобы ранка не мокла.

Сколько заживает пупок у новорожденных?

Кровит пупок новорожденного первые 8 дней после рождения и это можно считать нормой. Постепенно, в течение 10-14 дней, она заживает, выделения прекращаются, и пупочное кольцо уменьшается в размерах. В норме через 3 недели оно должно быть сухим и чистым, а цвет кожи вокруг пупка – обычным. В некоторых случаях (у ослабленных детей) процесс заживления протекает дольше – в течение месяца.

Почему кровит пупок у новорожденного?

Пупок у новорожденного может кровить при травмировании, когда при купании, пеленании малыша, смене подгузника случайно отрывается подсохшая корочка. Причиной может быть и слишком частая или слишком грубая обработка пупочной ранки.

Кровянистые выделения также могут быть признаком гранулемы пупка. При этом на дне пупочной ранки появляется округлое красноватое образование от 1 до 2 см в диаметре. Лечение гранулемы заключается в обработке пупочной ранки перекисью водорода, марганцовкой или спиртовым раствором, а также прижигании нитратом серебра, которое выполняет врач.

Если пупок у новорожденного кровит сильно, кожа вокруг пупочного кольца приобрела красноватый цвет, возможно, у малыша развился омфалит – так называют воспаление тканей пупка (пупочного кольца, ранки, подкожной клетчатки и сосудов). Различают катаральный, гнойный, флегмонозный, некротический или гангренозный омфалит. Возбудителями этого заболевания являются бактерии – чаще всего кокки (а также стафилококки, стрептококки и другие виды).

В большинстве случаев омфалит развивается на 2-й – 4-й неделе жизни новорожденного. У ребенка мокнет пупок, затем из пупочной ранки начинает выделяться гной, пупочное кольцо отекает и набухает, покрывается корочкой, а кожа вокруг пупка становится красноватой и горячей. У малыша повышается температура (до 37-38º), он становится вялым, у него снижается аппетит. 

При появлении симптомов омфалита родителям нужно как можно быстрее показать малыша врачу, который назначит соответствующее лечение (обычно при этом заболевании пупочную ранку обрабатывают дезинфицирующими растворами). В более сложных случаях детей помещают в стационар.

=»text-align:>

Пупочная ранка — Вопрос педиатру

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 71 направлению: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 97.49% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

Почему не заживает пупок: 5 опасных причин и как помочь ребенк

19 сентября 2019 21:00

Почему не заживает пупок: 5 опасных причин и как помочь ребенку

istockphoto.com

Остаток пуповины обычно отпадает через неделю после рождения. На полное заживление ранки отводится примерно 10-14 дней. Но в некоторых случаях ранка продолжает мокнуть и краснеть даже после этого срока. Что делать?

Читайте также5 продуктов, которые убивают здоровье ребенка: не давайте это детям никогда

Напоминание о том, что мама и ребенок недавно были одним целым – пупочный остаток, заживает не сразу. А в некоторых случаях доставляет родителям немало хлопот!

Катаральный омфалит

В буквальном смысле этот диагноз переводится как «воспаление пупка». Признаки катарального омфалита – плохо заживающая пупочная ранка, из которой выделяется небольшое количество гноя. Иногда он засыхает и образует отпадающие корочки. Температура при этом может подскочить до 38 градусов, но чаще остается субфебрильной: 37,2-37,5 градусов.

• Малыш становится более вялым, плохо спит и ест. Запущенный катаральный омфалит может перейти в следующую – гнойную – стадию. Тогда пупок становится красным и воспаленным, отекает и за счет этого возвышается над животом. У ребенка к остальным симптомам добавляется высокая температура. В тяжелых случаях пупочную ранку покрывает плотная короста, под которой находится гной. Если болезнь перешла в эту стадию, лечение может провести только специалист.
• Распознать омфалит несложно. На анализ берут гной из пупочной ранки и кровь. Если в ней повышены уровень лейкоцитов (их норма для малышей первой недели жизни – от 7,2 до 18,5 единиц, в возрасте от недели до месяца – от 6,5 до 13,8 единиц) и скорость оседания эритроцитов (больше 4 мм/час), то диагноз, скорее всего, подтвердится. На раннем этапе омфалит можно вылечить дома, если 3-4 раза в сутки обрабатывать пупок 3% раствором перекиси водорода, а потом – антисептиком. Не бойтесь обжечь малыша: нервных окончаний в пуповине и ее остатке нет.

Гриб на теле

Иногда на месте отпадения пуповины образуется плотное утолщение, по форме напоминающее гриб, откуда и происходит его название — фунгус. Он чаще  встречается у новорожденных с большой массой тела (4 кг и более) и появляется при разрастании грануляционной ткани в области пупочной ранки. На самочувствие ребенка фунгус обычно не влияет, кровотечение при нем обычно не наблюдается либо очень слабое.

Лечится фунгус прижиганием раствора нитрата серебра вместе с обычной обработкой пупочной ранки. Хирургическое вмешательство нужно только в тяжелых случаях.

Почему не заживает пупок: 5 опасных причин и как помочь ребенку / istockphoto.com

Читайте такжеБруксизм: почему ребенок скрипит зубами во сне

Когда ждать опасно

В первые недели жизни эмбриона с пупочным канатиком соединяются 2 эмбриональных протока, желточный и мочевой,. Первый из них нужен для питания, поскольку соединяет между собой желточный мешок и кишечник, а по второму моча выводится в околоплодные воды. Обратное развитие протоков начинается примерно в три месяца внутриутробной жизни: мочевой атрофируется и становится связкой изнутри на брюшной стенке, а желточный исчезает. Но при патологии развития один из протоков может сохраниться – полностью или частично. Тогда образуется полный или неполный свищ.

В 8 раз чаще это происходит с желточным протоком. При полном свище после отпадения пуповины у малыша зияет широкий просвет на месте сообщения кишечника и пупка. Оттуда часто выделяется кишечное содержимое, а при незаращении мочевого протока – моча. К сожалению, единственное лечение, которое здесь можно назначить – это операция.

Если же свищ неполный, то ее можно избежать. Симптомы в этом случае менее пугающие: долго мокнущая ранка, иногда с гнойными выделениями и часто – с раздраженной кожей. Лечится такое состояние ежедневными ваннами с марганцовкой, которую добавляют до появления у воды слабого розового оттенка, а также обработкой пупочной ранки 3% перекисью водорода и потом – 5% раствором йода либо 2% раствором бриллиантового зеленого. Но если к 6 месяцам у малыша не закрылся неполный свищ, то хирургическое вмешательство всё-таки потребуется.

Как понять, что к пупочной ране присоединилась инфекция

Затянувшийся омфалит и долгое кровотечение из пупочной ранки могут говорить о начале сепсиса. Это заболевание вызывают бактерии, которые попадают из очага инфекции в кровяное русло, а оттуда – в другие органы. Заразиться инфекцией, которая приведет к сепсису, малыш может через плаценту, при прохождении по родовым путям или после рождения, если обстановка в роддоме недостаточно стерильна.

В организм бактерии проникают не только через пупочную ранку, но и через кожу и слизистые оболочки. На месте входных ворот инфекции образуется воспаление. Ранним считается сепсис, начавшийся до 4-го дня жизни, поздним – если малыш заболел на 5 день и позже.

• В первом случае причиной обычно становятся энтерококки, кишечная палочка, цитомегаловирус или кандида альбиканс, вызывающая кандидоз.
• Поздний сепсис чаще вызывают гемофильная палочка, золотистый стафилококк и синегнойная палочка – один из главных возбудителей внутрибольничных инфекций.
• Первые признаки сепсиса носят общий характер: вялость, плохие сон и аппетит. Но неустойчивая или повышенная температура тела, редкий пульс, бледная кожа, рвота и синюшный носогубный треугольник не должны оставлять сомнений: срочно вызывать врача! При сепсисе необходима госпитализация.

Сепсис: группа риска

• Вес: менее 2 кг (недоношенные дети)
• Пол: мужской
• Другие факторы: многоплодная беременность, раннее отхождение вод, инфекции у матери, искусственное вскармливание.

Правильный уход за пупочной ранкой

• обрабатывайте пупочную рану ежедневно после купания
• используйте раствор хлоргексидина, повидон-йод, раствор бриллиантового зеленого или 1% раствор хлорфиллипта
• если корочка с ранки готова отпасть, удалите ее, перед этим смочив перекисью водорода (3%)

Также вам интересно будет прочитать: как правильно обрабатывать пупок новорожденного

подгузники и средства гигиены для малышей и их мам

Первая гигиена новорожденного

25.06.2019

Первая гигиена неврожденного вызывает много вопросов у новоиспеченных родителей, что не удивительно – нежное, маленькое чудо зависит от вашего внимания, заботы, любви и ответственности. Проводить эту процедуру необходимо с первых дней жизни, аккуратно и регулярно. Малыш может реагировать на ваши действия плачем, но это не значит, что вы причиняете ему вред или делаете что-то неправильно – так он проявляет рефлекс защиты. Немного терпения и скоро ежедневные гигиенические процедуры не будут вызывать у вас и ребенка волнений.

Правила гигиены новорожденного

В первые дни жизни не следует купать малыша в ванночке. Пупочная ранка еще не зажила и нужно исключить попадание в нее воды. Ежедневная утренняя гигиена новорожденного, как и у взрослых, начинается с умывания. При этом личико и тело младенца протирается легкими, бережными движениями. Для этого используются специальные салфетки, мягкая губка или ватные диски, смоченные в теплой воде. Затем малыша обязательно насухо вытирают (лучше промокательными движениями). Эту процедуру необходимо проводить несколько раз в день, особенно в жаркий период. В ритуал ежедневной гигиены входят следующие процедуры:

• Уход за глазками. Мягкий тампон, ватный диск, салфетку смачиваем в теплой кипяченой воде и аккуратно протираем глазки, двигаясь от внешнего уголка к внутреннему на веках. Область под глазками, наоборот – от внутреннего к внешнему. Двигаемся по кругу, так нежная кожа малыша не растянется. Обязательно для каждого глаза использовать отдельное средство гигиены.
• Чистка носовых проходов. Носик малыша часто забивается слизью и его необходимо регулярно прочищать, особенно при грудном кормлении. Скопление сопелек вызывает дискомфорт. Скрученный ватный жгут или специальные ватные палочки с ограничителем смачивают в теплой воде. Аккуратно и не очень глубоко вводятся в пазухи и медленно прокручиваются, выводя загрязнения наружу. Появившиеся за ночь сухие корочки – явление обычное. Чтобы размягчить и удалить их, необходимо предварительно капнуть в носик по капле физиологического раствора (например, аквалор или аквамарис).
• Гигиена ушной раковины. Мягкими ватными палочками или дисками, смоченными в теплой кипяченное воде, нежными движениями промакиваем ушки. Ни в коем случае не пытайтесь прочищать канал, новорожденному можно причинить вред и боль.

Обязательной гигиенической процедурой является обработка пупочной ранки. Она заживает от 10 до 20 дней после родов, после чего малыша можно безопасно купать в ванночке. Для обработки используется 3% перекись водорода, зеленка. После смачивания перекисью необходимо легкими движениями убрать образовавшуюся корочку и обработать ранку зеленкой. Любые покраснения в этой области служат сигналом для срочного обращения к врачу. Если пупочная ранка сухая и чистая, то ее можно не обрабатывать.

Отдельное внимание уделим уходу за интимной зоной. Часто подмывание этой части тела малыша вызывает наибольший страх у новоиспеченных родителей, ведь зона интимная, нежная, требует постоянного ухода. Для мальчиков и девочек есть особенности в данной процедуре, учитывая физиологию, но общие правила не вызовут затруднений. Необходима чистая теплая вода, влажная салфетка и ваша забота.

Вначале подмываются половые органы, а затем ягодичная зона. У взрослых уже есть сформировавшийся микроклимат, малыши же в этом вопросе беззащитны. Важно регулярно, тщательно, но аккуратно ухаживать за половыми органами младенца – утром, перед отходом ко сну, после каждого испражнения, перед сменой подгузника. Необходимо промыть все складочки на ягодичках и насухо вытереть. Каждые 3-4 часа рекомендуется делать воздушные ванночки, давая коже малыша «подышать» без подгузника.

Таким образом, соблюдение простых правил сделает ритуал гигиены новорожденного простым и привычным.

Желаем здоровья вам и вашему малышу!

Детский врач Антон Клиншов

www.клиншов.рф

Назад к блогу
Распечатать

Гигиена новорожденных

Наступил долгожданный момент. Вас и вашего ребенка наконец-то выписывают из роддома домой. Пока вы находились в роддоме, вам в уходе за ребенком помогал персонал отделения, и все казалось ясным и понятным. Но когда вы остались дома, один на один со своим крохой все представляется гораздо сложнее. Чтобы вы не растерялись, еще раз поговорим о гигиене новорожденного.

Как ухаживать за пупочной ранкой

Зачем и почему? Пуповинный остаток отпадает обычно на 3-5 день жизни ребенка. На его месте остается так называемая «пупочная ранка», которая заживает к 10-14 дню жизни. Для того, чтобы ускорить процесс заживления и предотвратить попадание инфекции в ранку, за ней необходимо ежедневно ухаживать. Удобнее обрабатывать пупочную ранку после купания ребенка. Это совсем не сложно, Вы справитесь!

Итак, Вам понадобится: стерильные ватные палочки, 3% раствор перекиси водорода, спирт салициловый.

• Сначала нужно: снять с рук кольца, часы, тщательно вымыть руки.
• Распеленать малыша, при необходимости подмыть его и уложить на пеленальный стол.
• Большим и указательным пальцами левой руки развести края пупочного кольца (указательным пальцем потянуть кожу над пупком вверх по направлению к груди, а большим – кожу под пупком вниз).
• Теперь возьмите в правую руку флакон с перекисью и капните 1-2 капли прямо на пупочную ранку. Подождите секунд 20-30, пока перекись будет шипеть и пениться – она вымывает отмершие корочки, очищая ранку. Продолжая удерживать левой рукой кожу в области пупка, возьмите правой рукой стерильную ватную палочку и аккуратными промокательными движениями просушите пупочную ранку. Не нужно пытаться снять те корочки, которые не отделились самостоятельно – их время еще не наступило. Возможно, они отпадут завтра или через день.
• Возьмите другую ватную палочку, обмакните в салициловый спирт, снова разведите края пупочного кольца. Аккуратно, но тщательно промокните палочкой пупочную ранку, а затем протрите кожу вокруг пупка круговым движением.
• Пусть спирт подсохнет несколько секунд
• Вот и все. Можно надеть на малыша подгузник и запеленать его.

Как подмывать новорожденного ребенка

Зачем и почему? Кожа у малышей гораздо нежнее, чем у взрослых, раздражения и опрелости возникают очень легко, поэтому нужно подмывать ребенка каждый раз, после того, как у него был стул. Кроме того, содержание кожи в чистоте помогает вырабатывать Вашей крохе первые навыки опрятности.

Если вы находитесь вне дома, можно вместо подмывания воспользоваться специальными детскими салфетками, но не стоит совсем заменять мытье такой упрощенной обработкой кожи.

Маленькая хитрость. Младенцы, как правило, имеют привычку опорожнять кишечник после каждого кормления или во время него. Отсюда следует вывод, что подмывание перед едой – дело неблагодарное.

• Первым делом надо закатать рукава, снять с рук кольца, часы, отрегулировать температуру и напор проточной воды. Подготовьте тонкую пеленку, чтобы просушить кожу после подмывания. Очень удобно просто повесить ее себе на плечо всегда будет под рукой.
• Распеленайте малыша, снимите с него подгузник.
• Держать ребенка удобнее левой рукой, а правой подмывать.
• Мальчика при подмывании держат лицом вниз. Возьмите ребенка так, чтобы грудью он лежал поперек Вашего предплечья, при этом пальцами левой руки Вы будете держать его плечо. Как ни странно, но повиснув в такой позе, малыш не испытывает ни малейшего неудобства.
• Девочку нужно подмывать только спереди назад, чтобы не загрязнять половые органы. Положите ребенка спиной на предплечье своей руки, так, чтобы голова находилась на локтевом сгибе, а пальцами Вы будете держать ее за левое бедро. Такое положение позволяет надежно удерживать малышку, а Вам оставляет полную «свободу действий».
• Подмывайте ребенка, набирая воду в ладонь, аккуратными движениями сверху вниз, тщательно удаляя загрязнения с кожи. Особенно важно промыть все кожные складочки, где грязь может скапливаться, вызывая раздражение. Не используйте мыло без крайней необходимости, вполне достаточно мытья с мылом один раз в неделю.
• Подмывая девочку, не нужно «тереть» половые органы, так как слизистая оболочка очень нежная. Кроме того, чересчур усердное мытье удаляет защитную смазку, которая предохраняет половые органы от попадания болезнетворных микробов.
• После мытья подсушите кожу малыша. Сначала накиньте пеленку на нижнюю часть тела ребенка и перенесите его на пеленальный стол. Затем тщательно промокните половые органы, паховые, ягодичные и подколенные складки.
• При необходимости (наличие раздражений) обработайте кожные складки небольшим количеством детского масла.
• Ваша кроха снова довольна жизнью. Теперь хорошо бы «проветрить попу» минут 5-10, перед тем, как надеть новый подгузник.

Купание новорожденного

Зачем и почему? Купание новорожденного (гигиеническая ванна) проводится всем здоровым детям после отпадения пупочного остатка. До заживления пупочной ранки рекомендуется купать малыша в кипяченой воде или в проточной воде, но в нее нужно добавить раствор марганцовки (марганцовокислого калия).

Пока Вашему малышу не исполнилось шесть месяцев, желательно купать его ежедневно, во втором полугодии жизни можно делать это через день. Как правило, деткам очень нравится купаться, ведь до рождения вода была их родной стихией. В воде мышцы расслабляются, ребенку комфортно и спокойно. Продолжительность купания на первом году жизни 5-10 минут. Мытье с мылом проводится не чаще одного раза в неделю. Желательно купать ребенка не ранее, чем через час после кормления, лучше всего – за 10-15 минут перед вечерним кормлением.

Купать новорожденного ребенка удобнее вдвоем, чаще всего в помощники призывают папу, а во многих семьях купание младенца – исключительно папина «почетная миссия». Большие и надежные мужские руки с поразительной нежностью держат крошечное тельце малыша, что способствует зарождению и развитию тесного контакта ребенка с отцом, который в эти минуты чувствует себя очень нужным. Но если Вам предстоит обходиться без помощника – не волнуйтесь, Вы прекрасно справитесь самостоятельно.

ВАЖНО! Если малыш нездоров, у него поднялась температура или появились признаки раздражения кожи лучше отложить купание до консультации с детским врачом-педиатром.

Вам понадобится: ванночка детская, кувшин с теплой водой для ополаскивания малыша, специальный водный термометр, детское мыло, махровая «рукавичка, большое махровое полотенце, пеленка, детское масло, пеленальный стол с подготовленной одеждой для ребенка, ватные палочки с ограничителями или ватные тампоны.

Если пупочная ранка еще не зажила, подготовьте две емкости с холодной и горячей кипяченой водой или раствор марганцовки для добавления в проточную воду. Раствор марганцовки нужно добавлять в воду «по каплям», пока вода не окрасится в слабо-розовый цвет. Перед использованием марганцовки убедитесь, что кристаллы полностью растворены, так как попадание кристалла марганцовки на кожу может вызвать ожог.

Температура воздуха в помещении во время купания ребенка должна быть 22-24 градуса. Купать малыша можно в ванной комнате, если она достаточно просторна, или в кухне.

• Прежде всего, нужно подготовить ванночку – вымыть щеткой с мылом и ополоснуть кипятком. Поставьте ванночку в устойчивое, удобное положение и наполните ее водой на ½ объема. В начале наливают холодную, а затем горячую воду во избежание образования пара. Теперь нужно погрузить термометр в воду. Температура воды в ванночке должна быть 37-37,5 градусов. Измерять температуру воды локтем можно только при наличии достаточного опыта, термометром всегда надежнее.
• На пеленальном столе разложите одежду для малыша, сверху постелите полотенце, на него положите пеленку для вытирания. Впрочем, пеленку можно положить около ванночки, чтобы Вам было удобнее взять ее.
• Разденьте ребенка, если нужно – подмойте. Возьмите малыша так, чтобы головка лежала на предплечье Вашей левой руки, а пальцами придерживайте левый плечевой сустав ребенка (большой палец обхватывает плечо сверху, другие пальцы расположить в подмышечной впадине). Правой рукой поддерживайте ягодицы и ножки ребенка.
• Медленно погрузите ребенка в ванночку: сначала ягодицы, затем ножки и туловище. Левой рукой продолжайте поддерживать головку ребенка, правая рука свободна для мытья. Уровень воды должен доходить малышу до подмышек.
• Покачивайте ребенка на воде вперед-назад, вправо-влево. Ваши движения должны быть плавными, неторопливыми. Улыбайтесь малышу, ласково разговаривайте с ним.
• Если предполагается мытье ребенка с мылом, то «рукавичку» надевают на правую руку. Намыливайте тело мягкими круговыми движениями и сразу ополаскивайте намыленные участки. Вначале мойте голову ото лба к затылку, затем шею, ручки, грудь, живо, ножки. Тщательно промойте складки кожи. В последнюю очередь мойте ягодицы и половые органы.
• Извлеките ребенка из воды спинкой кверху. Ополосните тело и вымойте лицо малыша водой из кувшина. Накиньте на ребенка пеленку, положите его на пеленальный стол, осушите кожу осторожными промокательными движениями.
• Просушите ушные раковины ватными палочками с ограничителями или тампонами из ваты.
• Смажьте складочки кожи детским маслом. При необходимости обработайте пупочную ранку.
• Запеленайте или оденьте ребенка.

Теперь Вашей крохе для ощущения полного счастья неплохо бы покушать и спать.

Утренний туалет новорожденного

Зачем и почему? Все мы знаем, что «чистота – залог здоровья», поэтому каждый день умываемся, чистим зубы, принимаем душ или ванну. Без этих привычных гигиенических процедур человек чувствует себя не комфортно. Для новорожденного ребенка ежедневный уход за кожей имеет гораздо большее значение, чем для взрослого человека, кроме того, первые навыки чистоты начинают формироваться неосознанно уже в столь раннем возрасте.

Ежедневный туалет малыша состоит из умывания, обработки глаз, носа, кожных складок. До заживления пупочной раки ее также необходимо обрабатывать ежедневно. Подмывать ребенка нужно после ночного сна и в течение дня всякий раз после того, как у ребенка был стул. Ушные раковины обрабатывают по необходимости в случае загрязнения и подсушивают после каждого купания. Ногти малышам подстригают по мере отрастания.

Вам понадобится: ватные диски (косметические подушечки), вата для изготовления жгутиков, масло детское или вазелиновое, емкость с теплой кипяченой водкой, емкость для использованных материалов, ножницы с закругленными концами, ватные палочки с ограничителями, набор для обработки пупочной ранки.

• Сначала нужно снять с рук кольца, часы и вымыть руки. Подготовьте все необходимое: откройте флакон с маслом,
• емкость для воды вымойте с мылом, ошпарьте кипятком, заполните теплой кипяченой водой,
• скрутите из небольших кусочков ваты жгутики для носа длиной около 3 см и диаметром 2-3 мм,
• подготовьте набор для обработки пупочной ранки.

Теперь, когда у Вас все под рукой, приступим к делу!

Умывание и уход за глазами

Умывание новорожденного ребенка проводится теплой кипяченой водой с помощью ватных дисков. Детей старше 3-х месяцев можно умывать проточной водой.

Возьмите ватный диск, смочите водой, слегка отожмите (чтобы не текло). Протрите личико малыша в следующей последовательности: лоб, щеки и, в последнюю очередь, область вокруг рта. Сбросьте этот диск в отходы.

Затем обработайте глаза отдельными для каждого глаза ватными дисками, смоченными теплой кипяченой водой, от наружного угла глаза к внутреннему.

Возьмите сухой ватный диск и просушите лицо ребенка в той же последовательности.

Уход за носовыми ходами

Носовые ходы новорожденного ребенка прочищают при наличии в них корочек мягкими жгутиками из ваты, смоченными вазелиновым или детским маслом. 

Не используйте ватные палочки на твердой основе. Правую и левую ноздрю очищают поочередно отдельными жгутиками. Жгутики вводят в нос осторожными вращательными движениями, не глубже, чем на 1-1,5 см.

Уход за складками кожи

Для обработки складок кожи используется детское или вазелиновое масло. Достаточно удобны готовые детские салфетки с масляной пропиткой. Маслом можно смочить ватный диск, а можно просто нанести его на свои ладони.

ВАЖНО! Нельзя пользоваться одновременно маслом и присыпкой, потому что присыпка в этом случае будет скатываться в комочки, которые могут вызывать раздражение кожи и опрелости.

Сначала смажьте складки верхней половины тела (сверху вниз) – заушные, шейные, подмышечные, локтевые, лучезапястные. Затем другим тампоном складки нижней половины тела (снизу вверх) – голеностопные, подколенные, паховые, ягодичные.

Теперь, чтоб малыш не был похож на масляный пончик, излишки масла с кожи нужно удалить сухим ватным диском.

Уход за ушными раковинами

Ушные раковины и наружные слуховые проходы после купания нужно просушить от воды. Очень удобно пользоваться готовыми «ушными» ватными палочками с ограничителями. Если их нет, можно сделать из ваты маленькие тампончики. Аккуратными промокательными движениями просушите ушки малыша, используя отдельные тампоны.

Если в наружном слуховом проходе скопились выделения (ушная сера), то нужно очистить их с помощью ватных палочек с ограничителями или ватных жгутиков, смоченных вазелиновыми или детским маслом. Вводите жгутик в наружный слуховой проход осторожными вращательными движениями на глубину не более 0,5 см. Для каждого слухового прохода используйте отдельный жгутик.

Подстригание ногтей

Ногти новорожденному ребенку нужно подстригать по мере их отрастания на руках и ногах для того, чтобы малыш не оцарапал сам себя. Удобны и безопасны специальные детские ножницы с закругленными концами.

Маленькая хитрость. Многих мам пугает одна только мыль, что придется подрезать ноготки на таких крошечных пальчиках, которые постоянно находятся в движении. Поэтому всем будет спокойнее, если делать эту «тонкую работу, когда малыш спит.

Возьмите ручку ребенка так, чтобы свободными оставался только один палец, на котором Вы собираетесь подрезать ноготь. Захватываете пальчик большим и указательными пальцами своей левой руки, придерживая с двух сторон, а остальными пальцами левой руки Вы можете придерживать другие пальчики ребенка.

Ногти на руках подстригают в форме полукруга, на ногах – по прямой линии, чтобы избежать в будущем такой неприятности, как врастание ногтя. Подрезать ногти нужно непрерывными движениями ножниц, а не «по кусочкам». Проверьте, пожалуйста, не осталось ли выступающих острых частей на ноготках.

Не забудьте тщательно собрать обрезанные ногти, чтобы они, затерявшись в складках одежды и белья, не травмировали кожу малыша.

Как врачи создали мне пупок?

Категория: Биология Опубликовано: 30 октября 2013 г.

Изображение из общественного достояния, источник: Кристофер С. Бэрд.

Доктора не создавали ваш пупок (или пупок). Пупок — это не шрам или узел, оставленный врачом, перерезавшим пуповину при рождении. Этот факт очевиден для любого, кто когда-либо имел детей или купал новорожденных, но иногда это неправильно понимают другие. Когда вы были в утробе матери, ваша пуповина одним концом прикреплялась к пупку, а другим — к плаценте.Плацента представляет собой массу кровеносных сосудов в форме блина, которая прикрепляется к стенке матки матери. Пища, которую ела ваша мать, и кислород, которым она дышала, попали в ее кровь, а затем попали в ее матку. Там, где ваша плацента и матка вашей матери соприкасались, пища и кислород переходили от материнской крови к вашей. Затем ваша кровь переносила питательные вещества из плаценты по пуповине через пупок в ваше тело.

Когда вы родились, вам больше не нужно было получать пищу и кислород через пупок, так как теперь вы могли получать их через рот.В результате пуповина больше не нужна, и у вашего тела появился естественный способ избавиться от нее. Само по себе ваше тело закрыло точку, где пуповина соединялась с вашим телом и образовывала пупок. Когда врач или акушерка, которые помогали вам во время родов, перерезали вашу пуповину, он или она перерезали ее в нескольких миллиметрах от конца пуповины, оставив кусок пуповины все еще свисающим с вашего живота. Он или она сделали это, чтобы позволить телу самостоятельно сформировать пупок правильной формы.Оставшийся кусок пуповины называется культей. Через несколько дней или недель после вашего рождения, когда ваше тело сформировало правильно закрытую кнопку звонка, культя отпала естественным образом, как струп, выпавший из зажившей раны (при условии, что у вас не было аномалий при рождении). В «Руководстве клиники Мэйо к первому году жизни вашего ребенка»,

После перерезания пуповины новорожденного остается лишь небольшая культя. В большинстве случаев оставшаяся пуповина высыхает и отпадает через одну-три недели после рождения.А до тех пор старайтесь, чтобы это место было как можно более чистым и сухим. Рекомендуется принимать ванну с губкой, а не полную, пока пуповина не отвалится и область пупка не заживет … Воздействие на пуповину воздуха и высыхание у основания ускорит ее отделение. Чтобы предотвратить раздражение и сохранить сухость в области пупка, сложите подгузник ребенка под культей. В теплую погоду оденьте новорожденного только в подгузник и футболку, чтобы воздух циркулировал и облегчал процесс высыхания.

Темы:
малыш, пупок, рождение, пупок, культя, пуповина

Оценка биологических свойств обезвоженной пуповины человека для ухода за ранами и заживления мягких тканей

J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2019 Май; 107 (4): 1035–1046.

,
^1
,
†
,
^1
,
†
,
¹
,
¹
,
¹
и
¹

Дженн Д. Буллард

¹
MiMedx Group, Inc.,
Мариетта,
Грузия 30062,

Дженнифер Лей

¹
MiMedx Group, Inc.,
Мариетта,
Грузия 30062,

Джереми Дж. Лим

¹
MiMedx Group, Inc.,
Мариетта,
Грузия 30062,

Мишель Масси

¹
MiMedx Group, Inc.,
Мариетта,
Грузия 30062,

Анна М. Фэллон

¹
MiMedx Group, Inc.,
Мариетта,
Грузия 30062,

Томас Дж. Кооб

¹
MiMedx Group, Inc.,
Мариетта,
Грузия 30062,

¹
MiMedx Group, Inc.,
Мариетта,
Грузия 30062,

Автор, ответственный за переписку.

^† Эти авторы внесли равный вклад в эту работу.

Поступило 19.01.2018 г .; Пересмотрено 16 мая 2018 г .; Принят в печать 27 июня 2018 г.

Авторские права © 2018 Авторы. Журнал исследований биомедицинских материалов, часть B: Applied Biomaterials, опубликованный Wiley Periodicals, Inc. Это статья в открытом доступе в соответствии с условиями http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ лицензии, которая разрешает использование и распространение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно процитирована, использование не является коммерческим и не производится никаких модификаций или адаптаций. Эта статья цитируется в других статьях PMC.

Дополнительные материалы

Таблица S1 .Список из 461 белка, разделенных на рецепторы адгезии, хемокины, модуляторы воспаления, факторы роста и цитокины, мембраносвязанные белки, другие растворимые регуляторы, протеазы и ингибиторы, а также сигнальные рецепторы, обнаруженные в ткани dHUC.

GUID: 16E3838F-2B50-4703-ACF2-5A2A84B1C959

Abstract

Хронические раны — серьезная проблема здравоохранения, имеющая серьезные последствия для качества жизни, поскольку они не заживают должным образом и часто требуют терапевтического вмешательства.Аллотрансплантаты амниотической мембраны успешно используются в качестве биологической терапии для ускорения заживления мягких тканей; однако пуповина, другая ткань плацентарного происхождения, также недавно вызвала интерес из-за ее уникального состава, но схожего происхождения плацентарной ткани. Целью этого исследования было охарактеризовать обезвоженную пуповину человека, обработанную PURION® PLUS (dHUC), и оценить биологические свойства этой ткани, которые способствуют заживлению. Это было выполнено посредством характеристики тканевого состава, оценки in vitro клеточного ответа на обработку dHUC и in vivo биорезорбции и тканевого ответа на модели крысы.Было замечено, что dHUC содержит коллаген I, гиалуроновую кислоту, ламинин и фибронектин. Кроме того, был обнаружен 461 белок, который состоит из факторов роста и цитокинов, модуляторов воспаления, хемокинов, протеаз и ингибиторов, молекул адгезии, сигнальных рецепторов, мембраносвязанных белков и других растворимых регуляторов. Клеточные анализы продемонстрировали увеличение пролиферации стволовых клеток из жировой ткани и мезенхимальных стволовых клеток, миграцию фибробластов и образование сосудов эндотелиальных клеток-предшественников дозозависимым образом после лечения dHUC.Наконец, подкожная имплантация крысам продемонстрировала биосовместимость, поскольку аллотрансплантаты dHUC резорбировались без фиброзной инкапсуляции. Эти результаты показывают, что dHUC обладает биологическими свойствами, которые стимулируют клеточные реакции, важные для заживления мягких тканей. © 2018 Авторы. Журнал исследований биомедицинских материалов, часть B: прикладные биоматериалы, опубликованные Wiley Periodicals, Inc. J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 107B: 1035-1046, 2019.

Ключевые слова: пуповина, заживление ран, хронические раны, обезвоживание пуповина человека, желе Уортона

ВВЕДЕНИЕ

Нормальное заживление ран представляет собой динамическую серию регулируемых взаимодействий и клеточных инфильтратов, которые можно суммировать как четыре высокоуровневых и последовательных, но перекрывающихся фазы: гемостаз, воспаление, клеточная пролиферация и ремоделирование тканей .1, 2 Фаза гемостаза происходит сразу после травмы, когда образуется сгусток крови, и тромбоциты высвобождают факторы свертывания и факторы роста в месте повреждения. 3, 4 Затем нейтрофилы и макрофаги попадают в ложе раны во время воспалительной фазы, чтобы фагоцитировать поврежденную ткань, чужеродные материалы и бактерии. 4 Во время клеточной пролиферации фибробласты откладывают новый внеклеточный матрикс (ВКМ), который в конечном итоге ремоделируется в организованный, сшитый коллагеновый матрикс, когда рана переходит в финальную фазу ремоделирования.

Более подробная перспектива каждой из этих фаз подчеркивает сложное взаимодействие между факторами роста, цитокинами, ECM и клетками, которые управляют прогрессированием через каскад заживления. Например, во время воспалительной фазы задействованные активированные макрофаги очищают раневое ложе и секретируют многочисленные факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), чтобы инициировать формирование сосудистой сети и стимулировать отложение коллагена фибробластами, 5 отмечая начало пролиферативной фазы. .Кроме того, связывание фактора роста фибробластов-2 (FGF-2) с гепарансульфатными протеогликанами, которые действуют как рецепторы митогена и фактора роста эпидермиса (EGF) с ламинином, усиливает миграцию фибробластов.6 Во время фазы ремоделирования интегрин-опосредованное связывание и рост клеток факторы могут регулировать ангиогенез, а также продукцию и деградацию ECM.7, 8 При успешном разрешении ткань раны становится похожей на ткань нормальной неповрежденной ткани, и передача клеточных сигналов возвращается к гомеостазу. В условиях хронической раны, обычно вызванной системными аномалиями, такими как диабет или венозная недостаточность, процесс заживления может быть остановлен из-за нарушения регуляции передачи сигналов цитокинов и повышенной активности протеаз.9, 10 В результате хронические раны не заживают должным образом, что приводит к необходимости терапевтического вмешательства, способствующего закрытию раны.

Хориоамниотические оболочки плода широко используются в качестве терапевтического средства для заживления кожных ран из-за их иммунологически привилегированного статуса и биоактивных свойств.11, 12, 13 Хотя эти плодные оболочки успешно используются для лечения хронических ран, 14, 15 пуповина привлекает все большее внимание как аллотрансплантат для заживления мягких тканей.16, 17, 18, 19 Пуповина транспортирует кислород и питательные вещества от плаценты к плоду во время беременности и состоит из амнионного эпителия, двух артерий, одной вены и желе Уортона.20 Желе Уортона представляет собой коллагеновый матрикс в пуповине. который защищает пуповинные сосуды и содержит большое количество гиалуроновой кислоты (ГК) .20 Многие исследования были сосредоточены на клетках, выделенных из пуповинной ткани, а также пуповинной крови; однако сам шнур не был хорошо охарактеризован.Например, сообщается, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из пуповинной крови и желе Уортона, обладают иммунологически привилегированными свойствами и обладают антифиброзными характеристиками, которые могут способствовать безрубцовому заживлению ран.21, 22, 23 Предварительные исследования показали, что криоконсервированный продукт из пуповины. был использован в качестве трансплантата для лечения сложных язв стопы и может способствовать реэпителизации на модели абразии роговицы у мышей, 24, 25, что указывает на то, что ткань пуповины обладает терапевтическим потенциалом для ускорения заживления мягких тканей.Однако еще предстоит определить, существуют ли эти свойства и биологические сигналы также в дегидратированной форме матрикса пуповины.

Целью этого исследования было охарактеризовать обезвоженную пуповину человека, обработанную PURION® PLUS (dHUC), и определить ее биологические свойства, имеющие отношение к заживлению ран. Это было выполнено путем характеристики состава ткани, оценки in vitro клеточных ответов , включая пролиферацию стволовых клеток, миграцию фибробластов и ангиогенный потенциал эндотелиальных клеток, и оценки in vivo биосовместимости и резорбции на модели подкожной имплантации крыс. .Обработанная PURION® PLUS ткань пуповины (dHUC, EpiCord, MiMedx Group, Inc.) обрабатывается с использованием технологии, аналогичной технологии PURION® Обработанная дегидратированная хорионная мембрана амниона человека (dHACM; EpiFix / AmnioFix, MiMedx Group, Inc.) 11, 12 , 13 Предыдущие исследования продемонстрировали, что этот запатентованный процесс приводит к амниотическому аллотрансплантату с сохраненной биологической активностью, что способствует ускоренному закрытию ран диабетической стопы и венозных язв ног по сравнению со стандартными методами лечения. 26, 27, 28 Новая ткань пуповины, dHUC также считается многообещающим вариантом лечения ран и повреждений мягких тканей.

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

Аллотрансплантаты пуповины

Человеческие плаценты были переданы на основе информированного согласия после родов с помощью кесарева сечения в соответствии со стандартами Надлежащей тканевой практики Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Американской ассоциации банков тканей (AATB). Все доноры прошли тестирование и подтвердили отсутствие инфекционных заболеваний, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), Т-лимфотрофный вирус человека (HTLV), гепатиты B и C и сифилис.

Пуповина была отделена от плаценты, а вена и артерии удалены.Полученная ткань была осторожно очищена с помощью запатентованного процесса PURION® PLUS, затем лиофилизирована и окончательно стерилизована электронно-лучевым облучением (17,5–30 кГр). Процесс PURION® PLUS принципиально похож на запатентованный процесс PURION®; однако небольшие модификации были оптимизированы для ткани пуповины. Подробное описание общих этапов очистки и обеззараживания, применяемых к продуктам MiMedx на основе плацентарной ткани, приведено в спецификации U.Патент № 8,709,494. Конфигурация листа dHUC (EpiCord®, MiMedx Group, Inc.) использовалась в качестве тестового материала для этого исследования.

Гистология

Ткань dHUC ( n = 1 донор) регидратировали в физиологическом растворе в течение 10 минут перед заделкой в ​​состав оптимальной температуры резки (OCT) TissueTek (Sakura Finetek). Вложенные ткани мгновенно замораживали и делали криосрезы толщиной 10 мкм. Срезы фиксировали инкубацией в ацетоне в течение 10 мин и сушили при комнатной температуре не менее 30 мин.Срезы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), блокировали ослиной сывороткой (Abcam) и окрашивали мышиными первичными антителами против человеческого коллагена типа I и овечьими первичными антителами против гиалуроновой кислоты человека (Abcam). Иммунореактивность определяли с помощью флуоресцентно конъюгированных вторичных антител осла против IgG мыши и ослиных вторичных антител против IgG овцы (Life Technologies). Ядра клеток контрастировали с DAPI, и срезы отображали под флуоресцентной микроскопией.

Состав внеклеточного матрикса

Для измерений HA образцы dHUC ( n = 6 доноров) получали путем извлечения измельченной ткани при концентрации 20 мг / мл в буфере RIPA (ThermoFisher) при осторожном перемешивании в течение ночи при 4 ° C.После 24-часовой экстракции образцы центрифугировали и пропускали через фильтр 0,22 мкм для удаления остаточных компонентов ткани. HA количественно определяли в каждом образце с использованием однофакторного иммуноферментного анализа (ELISA, TECO) и рассчитывали с использованием стандартов HA, предоставленных в наборе, в соответствии с протоколом производителя.

Для измерений ламинина и фибронектина образцы dHUC ( n = 6 доноров) экстрагировали 4 гуанидин гидрохлоридом M и 0,1 M ацетатом натрия, содержащим набор коктейлей III для ингибиторов протеазы (Calbiochem) в течение ночи при 4 ° C и pH. 6.0. Супернатанты собирали и замораживали при -20 ° C. Остаточную ткань ресуспендировали во втором объеме буфера для экстракции и обрабатывали идентичным образом. Супернатанты от обеих экстракций объединяли и диализовали с использованием диализной трубки MWCO 50 кДа (Spectrum) против деионизированной воды в течение 2 дней, а затем замораживали и лиофилизировали. Высушенные образцы восстанавливали в PBS, а содержание ламинина и фибронектина измеряли с помощью однофакторного ELISA (Abcam, R&D Systems). Ламинин и фибронектин определяли количественно с использованием стандартов, предоставленных наборами, в соответствии с протоколами производителя.

Общая характеристика растворимого белка

Образцы dHUC ( n = 5 доноров) измельчали, взвешивали и отправляли в RayBiotech (Norcross, GA) для анализа. После получения ткань инкубировали в буфере для лизиса (Raybiotech), содержащем ингибитор протеазы, при концентрации экстракции 100 мг / мл при осторожном встряхивании в течение ночи при 4 ° C. Лизаты центрифугировали, разбавляли аналитическим разбавителем и анализировали на множестве ELISA Quantibody® (Q600 Human Cytokine Antibody Array, RayBiotech).Набор Quantibody array позволяет анализировать в общей сложности 600 биомолекулярных аналитов, включая цитокины, хемокины, рецепторы, матричные белки, протеазы и ингибиторы протеаз. Положительные контроли пригодности системы состояли из образцов известной концентрации, а разбавитель для анализа Quantibody® использовали в качестве отрицательного контроля. Исходные данные флуоресценции для каждого аналита нормализовали относительно фоновой флуоресценции. Стандартные кривые известных концентраций для каждого аналита, предоставленные набором для анализа, были проанализированы и использованы для расчета количеств в каждом образце.Данные были просмотрены MiMedx, и содержание аналита было рассчитано как пикограмм аналита на миллиграмм сухой ткани. Классификации аналитов определялись с помощью использованных массивов RayBiotech, обзора литературы по отдельным аналитам и системы классификации PANTHER.29

Пролиферация стволовых клеток

in vitro

Чтобы приготовить растворимые экстракты dHUC для экспериментов с культурами клеток, стерилизованные трансплантаты от отдельных доноров измельчали ​​и экстрагировали при 20 мг / мл в течение ночи в основной среде (без сыворотки), подходящей для оцениваемого типа клеток ( n = 10 доноров).Остатки ткани удаляли центрифугированием и пропускали через фильтр 0,22 мкм. Затем экстракты разбавляли в основной среде до соответствующих тестовых концентраций. Отдельных доноров использовали в качестве отдельных обработок на лунку.

Нормальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC, Lonza PT-5006) и нормальные мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга человека (MSC, Lonza PT-2501), высевали на 96-луночные планшеты (Corning) по 2500 клеток / лунку в течение ночи. среда, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Lonza), 1% L-глутамин и гентамицин-амфотерицин B (Lonza).На следующий день среду отсасывали из лунок и промывали стерильным PBS. Среду заменяли следующими видами обработки: базальная среда без сыворотки (отрицательный контроль), полная среда с 10% FBS (положительный контроль) и экстракты dHUC при концентрациях 20, 10, 5 и 1 мг / мл в основной среде. После 3 дней культивирования клетки промывали PBS и проводили анализ CyQUANT (Invitrogen) для количественного определения содержания ДНК в качестве меры клеточной пролиферации в соответствии с инструкциями производителя.Содержание ДНК переводили в число клеток, используя стандартную кривую известных количеств ADSC или MSC, соответственно, как определено путем подсчета на гемоцитометре.

Миграция дермальных фибробластов человека

in vitro

Кожные фибробласты взрослого человека (HDF, Gibco) высевали при слиянии (10000 клеток / лунку) в 96-луночный планшет Image-Lock (Essen Bioscience) и лишали сыворотки в течение ночи в среде, содержащей 1% FBS. На следующий день с помощью инструмента WoundMaker (Essen Bioscience) в каждой лунке была создана стандартизированная полоса без клеток (царапина).Бесклеточные дорожки промывали базальной средой для удаления фрагментов клеток и оставшейся сыворотки, а затем обрабатывали одним из следующих: базальная среда без сыворотки (отрицательный контроль), полная среда с 10% FBS (положительный контроль) и экстракты dHUC при 20 мг / мл в основной среде ( n = 10 доноров). Растворимые экстракты dHUC получали, как описано ранее.

Планшеты были перенесены в систему визуализации IncuCyte ZOOM (версия программного обеспечения 2016B; Essen Bioscience) и визуализированы каждые 6 часов в общей сложности 72 часа.Процент слияния ран определяли с использованием алгоритма обработки изображений для дифференциации клеток HDF и клеточного мусора от фона, чтобы избежать влияния предвзятости пользователя во время анализа изображения.

Исследования образования сосудов с использованием стволовых клеток жирового происхождения и эндотелиальных колониеобразующих клеток

in vitro

ADSC и человеческие эндотелиальные колониеобразующие клетки (ECFCs, Essen Biosciences), предоставленные в комплекте Angiogenesis StemKit (Essen), использовали для создания совместной культуры в 96-луночном планшете в соответствии с инструкциями производителя.Вкратце, ECFC, которые помечены зеленым флуоресцентным белком, чтобы обеспечить флуоресцентную визуализацию образования канальцев, высевали из расчета 5750 клеток / лунку поверх монослоя ADSC, который засевали при 40000 клеток / лунку. После создания совместной культуры клетки обрабатывали следующим: среда для анализа + 20 нг / мл фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, положительный контроль), среда для анализа +20 нг / мл VEGF + 100 мкм сурамин (отрицательный контроль). , только аналитическая среда (контроль носителя) и экстракты dHUC при концентрациях 10, 5 и 1 мг / мл в аналитической среде.Положительный контроль был дополнен фактором роста VEGF из-за его известной способности индуцировать ангиогенез и образование канальцев, а отрицательный контроль включает сурамин, который представляет собой соединение с доказанными антиангиогенными свойствами. Экстракты dHUC ( n = 4 донора) получали, как описано ранее.

Планшет для культивирования помещали в систему IncuCyte (Essen Biosciences) и снимали изображения каждые 6 часов в течение 72 часов. Образование трубок с помощью ECFC количественно определяли как меру ангиогенного потенциала.Площадь сети (мм ² / мм ² ), определяемая как сумма площадей всех сетей в изображении, деленная на область изображения, и длины сети (мм / ² ), определяемой как сумма длин всех сетей на изображении, разделенная на площадь изображения, была определена с использованием модуля ангиогенеза в программном обеспечении IncuCyte, который дает количественную оценку образования трубок.

Биосовместимость и биорезорбция dHUC

in vivo

Для изучения биосовместимости и биорезорбции dHUC in vivo трансплантаты dHUC размером 5 мм × 5 мм были имплантированы подкожно 22 нормальным иммунокомпетентным крысам Sprague-Dawley (8 недель, 12 самцов и 12 самок) с помощью трансляционного тестирования. и учебные (Т3) лаборатории (Атланта, Джорджия) и отслеживаются до 97 дней.Перед процедурой крыс содержали по две на клетку одного пола, а после процедуры животных содержали поодиночке, чтобы предотвратить повреждение места имплантации. Животных анестезировали газом изофлураном и помещали в вентральное положение лежа. Перед установкой имплантатов спина была выбрита и вычищена с использованием стандартной асептической техники. Образец для испытаний размером 5 мм × 5 мм был обрезан непосредственно перед имплантацией в стерильном поле. Подняли кожу позвоночника и сделали разрез для создания подкожного кармана, и в карман поместили одно тестируемое изделие.Были приняты меры к тому, чтобы материал был плоским. После размещения карман закрывали швом и / или скобами. Место имплантата было отмечено нерассасывающимся швом. Имплантаты не были маркированы в ткани, поскольку их можно идентифицировать гистологически. Образцы ткани собирали единым блоком из места имплантации через 24 часа ( n = 2, один мужчина и одна женщина), 7, 14, 22, 42 и 97 дней ( n = 4, два мужчины и две женщины). после имплантации. Ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, заливали парафином, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и окрашивали пентахромом Мовата (Alizée Pathology).Образцы были проанализированы гистологически и оценены независимым сертифицированным гистопатологом на биосовместимость и биорезорбцию (Alizée Pathology, Thurmont, MD). Оценка общего воспаления и остаточного материала представлена ​​в таблицах и соответственно. Оценивающий патолог был ослеплен во время оценки и выставления баллов, а затем был открыт для составления отчета. Это исследование было выполнено в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC).

Таблица 1

Общая оценка воспаления

Таблица 2

Оценка остаточного материала

Статистический анализ

Для количественного анализа отдельных доноров запускали в двух экземплярах для следующих анализов: HA, фибронектин, ламинин ELISA; и трижды для следующих анализов: пролиферация ADSC и MSC, миграция HDF и совместное культивирование образования сосудов. Для анализа растворимого белка тестировали по одному образцу от каждого донора.Количественные данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Односторонний дисперсионный анализ ANOVA и апостериорный анализ Тьюки с p ≤ 0,05 выполняли для определения статистических различий между средними значениями каждой группы. Для миграции HDF был проведен односторонний дисперсионный анализ ANOVA и апостериорный анализ Тьюки с p ≤ 0,05 для среднего закрытия раны в конечный момент времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Гистологическая оценка и компоненты ECM dHUC

Гистологические изображения dHUC выявили губчатую ткань.Кроме того, ткань dHUC окрашивалась положительно как для коллагена типа I (рис. A), так и для гиалуроновой кислоты (рис. B), двух наиболее распространенных компонентов матрикса в ткани пуповины.20 Изображения продемонстрировали равномерное распределение этих компонентов внеклеточного матрикса по всей ткани. (Рисунок D). Положительное окрашивание DAPI также показывает, что неповрежденные клеточные компоненты сохраняются в dHUC (Рисунок C). В ткани dHUC анализ ELISA определил, что после экстракции гуанидина присутствовали 444,6 ± 176,8 нг / мг фибронектина, 183,0 ± 48,3 пг / мг ламинина и 676.5 ± 54,9 мкг / мг HA присутствовали после экстракции буфера RIPA (таблица).

Иммунофлуоресцентное окрашивание трансплантатов dHUC. (A) Наличие коллагена I типа показано зеленым цветом. (B) Распределение HA в ткани видно красным цветом. (C) Ядра клеток показаны синим цветом. (D) Наложение показывает совместную локализацию гиалуроновой кислоты (красный) и ядер клеток (синий) розовым цветом. Масштабная линейка = 400 мкм.

Таблица 3

Количественное определение компонентов внеклеточного матрикса в ткани dHUC

Общее содержание фактора роста тела Q60039 9000® Массив был использован для обнаружения факторов роста, цитокинов, рецепторов, протеаз и ингибиторов, трансмембранных белков и хемокинов, присутствующих в ткани dHUC. Анализ выявил в общей сложности 461 биомолекулу, удерживаемую в dHUC (рисунок, вспомогательная информационная таблица S1).Около 107 из 461 измеренного аналита были идентифицированы как факторы роста и цитокины, связанные с нормальными физиологическими механизмами, присущими ремоделированию и гомеостазу, и составляли 18% от общей концентрации растворимого белка. Модуляторы воспаления (55 из 461 аналита) составляли 4%, а хемокины (32 из 461 аналита) составляли 3% от общей концентрации. Рецепторы матричной и межклеточной адгезии (41 из 461 аналита) составляли 18%, в то время как рецепторы передачи сигналов (119 из 461 аналита) составляли 13% от всей обнаруженной концентрации белка.Связанные с мембраной и трансмембранные белки (60 из 461 аналита) составляли 11% от общего количества растворимых белков. Протеазы и ингибиторы (34 из 461 аналита), которые включали типы матрикса, серина и цистеина, составляли 5% от общего содержания растворимого белка. Наконец, другие растворимые регуляторы (13 из 461 аналита) составляли 28% от общего содержания белка. Полный список обнаруженных аналитов приведен в таблице вспомогательной информации S1.

Белковый состав обезвоженных лизатов пуповины человека.Для каждой категории указанные проценты представляют концентрацию белка (фактор пг / мг ткани), нормализованную к общему количеству обнаруженного белка.

Пролиферация стволовых клеток

Пролиферация клеток в ответ на положительный и отрицательный контроль и экстракты dHUC тестировали на двух релевантных типах клеток для заживления и восстановления, ADSC и MSC 22, 30 Положительный контроль представляет собой среду для каждого типа клеток с добавкой а отрицательный контроль представляет собой базальную среду. Для ADSC не было статистической разницы между положительным контролем (полная среда) и обработкой dHUC 20 мг / мл (Рисунок A).Аналогично с MSC, также не было статистической разницы между полными средами, обработками dHUC 20 и 10 мг / мл (Рисунок B). Концентрации экстрактов dHUC 20, 10 и 5 мг / мл способствовали значительно большей пролиферации как для ADSC, так и для MSC по сравнению с отрицательным контролем (базальная среда). Кроме того, концентрация dHUC 1 мг / мл не приводила к значительно большей пролиферации по сравнению с отрицательным контролем, что указывает на разбавление пролиферативных факторов, обнаруженных в экстрактах dHUC.Фазовые изображения показали, что морфология ADSC и MSC, обработанных dHUC, была похожа на морфологию положительных контрольных клеток, а тенденция слияния была аналогична результатам по количеству клеток (рисунок). В целом экстракты dHUC продемонстрировали дозозависимый пролиферативный эффект как на ADSC, так и на MSC.

Пролиферация (A) ADSC и (B) MSC через 72 часа в ответ на лечение dHUC. Столбцы представляют собой среднее количество клеток на лунку, нормализованное к отрицательному контролю (красная линия) ± стандартное отклонение, обнаруженное в каждой лунке для обработки и контрольной лунке.* указывает на статистически значимое отличие от отрицательного контроля; # указывает статистическое отличие от положительного контроля; p ≤ 0,05.

Фазовые изображения (A) ADSC и (B) MSC через 72 часа в ответ на контрольную обработку и обработку dHUC при 20, 10, 5 и 1 мг / мл. Масштабная линейка = 300 мкм.

Миграция фибробластов

Определяли миграцию HDF в рану с царапинами в ответ на 20 мг / мл экстрактов dHUC и контролей. Миграцию оценивали путем отслеживания слияния клеток в области царапины и сообщали как процент закрытия раны, таким образом, пролиферация клеток также могла способствовать закрытию раны.Положительный контроль представляет собой среду с добавлением фетальной бычьей сыворотки, а отрицательный контроль представляет собой базальную среду. Через 72 часа экстракты dHUC способствовали значительно большей миграции клеток со средним значением закрытия раны 78,5% ± 6,3% (рисунок) по сравнению с отрицательным контролем, который поддерживал жизнеспособность клеток, но стимулировал миграционную реакцию только на 43,9% ± 7,9% закрытия раны. Однако положительный контроль стимулировал значительно большую миграцию HDF с закрытием раны царапины на 97,2% ± 4,1% по сравнению как с отрицательным контролем, так и с тканевыми экстрактами dHUC с концентрацией 20 мг / мл.

Миграция HDF за 72 часа в ответ на обработку dHUC (20 мг / мл) и положительный и отрицательный контроль. Значения представлены как среднее относительное слияние ран (%) ± стандартное отклонение. * указывает на статистически значимое отличие от положительного и отрицательного контролей через 72 часа; p ≤ 0,05.

Формирование сосудов

Влияние экстрактов dHUC, а также положительных и отрицательных контролей на формирование сосудов в совместных культурах ECFC и ADSC исследовали как меру ангиогенного потенциала в течение 72 часов (рисунок).В течение первых 24 часов как длина сети, так и площадь увеличивались и выходили на плато примерно через 32 часа для положительных (среда для анализа +20 нг / мл VEGF) и контроля носителя (только среда для анализа), а также групп, обработанных dHUC. Для отрицательного контроля (VEGF + сурамин) длина и площадь сети начинают уменьшаться примерно через 24 часа после первоначального увеличения (Рисунок A, C). Через 72 часа длина сети и площадь клеток, обработанных самой высокой концентрацией dHUC (10 мг / мл), существенно не отличались от обработки положительного контроля (Рисунок B, D).Более низкая доза dHUC (1 мг / мл) привела к значительному увеличению площади и длины сети по сравнению с отрицательным контролем. Кроме того, лунки для обработки dHUC 10 и 5 мг / мл имели значительно более высокие площади и длину сети по сравнению как с отрицательным контролем, так и с контролем-носителем. Дозозависимый ангиогенный ответ очевиден при лечении dHUC 10, 5 и 1 мг / мл. Флуоресцентные изображения, полученные с помощью IncuCyte, показывают сформировавшиеся и уточненные сетчатые канальцы, стимулированные обработкой положительным контролем и экстрактом dHUC через 72 часа (рисунок).Обработка с добавлением сурамина (отрицательный контроль), известного ангиогенного ингибитора, содержит небольшую сеть или разветвление канальцев от ECFC через 72 часа, как и ожидалось. Эти результаты показывают, что экстракты dHUC содержат ангиогенные факторы, которые успешно способствуют образованию сосуда in vitro и в этой совместной культуре клеток ADSC и ECFC.

Ангиогенный ответ от ECFC после обработки dHUC. (A) Средняя длина сети (мм / мм ² ) и (C) средняя площадь сети (мм ² / мм ² ) в ответ на экстракты и контроль dHUC в течение 72 часов.(B) Длина сети и (D) площадь сети в 72-часовой момент времени. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от средних значений. * указывает на статистическое отличие от всех других групп; # указывает статистическое отличие от положительного контроля; Δ указывает только на статистические отличия от среды для анализа; p ≤ 0,05.

Флуоресцентные изображения меченых эндотелиальных клеток (зеленые) после обработки положительным, отрицательным носителем и обработкой dHUC при 10, 5 и 1 мг / мл через 72 часа.Масштабная линейка = 500 мкм.

Биосовместимость и биорезорбция dHUC

Биосовместимость и биорезорбция аллотрансплантатов dHUC были определены in vivo на подкожной модели крыс через 97 дней после имплантации по оценке независимого сертифицированного гистопатолога. Гистологические изображения показывают непрерывное врастание ткани в аллотрансплантаты dHUC, и dHUC претерпевает устойчивую биорезорбцию с уменьшением количества материала, присутствующего на участках имплантата, с течением времени (рисунок).DHUC также был биосовместимым с минимальной фиброзной инкапсуляцией, наблюдаемой через 97 дней. Умеренное воспаление наблюдалось в имплантатах dHUC через 42 дня, однако воспаление уменьшилось через 97 дней, поскольку имплантат разложился на in vivo на , как показывает гистологическая оценка (рисунок). В момент времени 97 дней dHUC был обнаружен только у одного из четырех животных, что указывает на существенную резорбцию у трех других животных.

Биосовместимость и биорезорбция аллотрансплантатов dHUC в модели подкожного имплантата крысы через (A) 24 часа, (B) 7 дней, (C) 14 дней, (D) 22 дня, (E) 42 дня и (F) 97 дней.указывает оценки, основанные только на одном образце, поскольку материал не может быть обнаружен у других животных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Это исследование охарактеризовало биологические свойства dHUC, оценило влияние in vitro на пролиферацию, миграцию и ангиогенез и определило его способность к резорбции на модели подкожной имплантации in vivo крысам. dHUC — это ткань, которую можно использовать в качестве покрытия раны для доставки таких компонентов, как НА, гликозаминогликан, который может удерживать воду31, и множество биоактивных факторов, управляющих клеточной активностью.

Гистологическая оценка показала, что первичные нативные компоненты ECM, обнаруженные в желе Уортона ткани пуповины, коллагене I и HA, 20, остаются в dHUC после обработки (рисунок). Поскольку аллотрансплантаты dHUC омертвели, ядра клеток остаются неповрежденными и все еще присутствуют в ткани, как показывает окрашивание DAPI. В то время как растет беспокойство по поводу нежелательного клеточного дебриса в каркасах на основе ECM, пуповина и другие фетальные плацентарные ткани являются иммунологически привилегированными тканями32, и не было сообщений о побочных реакциях, связанных с ДНК или остатками клеток в аллотрансплантатах плацентарной ткани, содержащих живые или сохранившиеся омертвевшие клетки.15, 27, 33, 34, 35 Количественная оценка других компонентов ВКМ, ламинина и фибронектина, показывает, что аллотрансплантаты dHUC содержат белки, которые являются неотъемлемыми биомолекулами ВКМ и участвуют в заживлении ран (таблица). Ламинин играет важную роль в гомеостазе тканей и может регулировать пролиферацию, дифференциацию, адгезию и миграцию клеток.36 Пептиды, производные от ламинина, также недавно были разработаны для улучшения регенерации тканей после травм из-за их роли в реэпителизации и ангиогенезе.36 Молекула адгезии, фибронектин, обнаруживается в базальной мембране внеклеточного матрикса и, как известно, способствует реэпителизации во время заживления ран.37 В целом, dHUC предлагается в качестве тканевого аллотрансплантата, который может обеспечить обильную матричную среду для ускорения заживления раны. разнообразие контекстов.

Около 461 белковой биомолекулы было обнаружено в dHUC, многие из которых являются факторами роста или цитокинами, которые играют роль в физиологических процессах, участвующих в ремоделировании тканей и гомеостазе (рисунок).Полный список измеренных аналитов можно найти в вспомогательной информационной таблице S1. К ним относятся такие факторы, как трансформирующий фактор роста-бета 1 (TGF-β1), фактор роста тромбоцитов-AA (PDFG-AA), VEGF и ангиогенин-4, которые, как известно, участвуют в пролиферации клеток и ангиогенезе. другие обнаруженные факторы включают воспалительные модуляторы и хемокины, а также протеазы и ингибиторы. Модуляторы воспаления, такие как интерлейкин-1 бета (IL-1β) и хемоаттрактантный белок моноцитов-1 (MCP-1), как известно, стимулируют макрофаги и привлекают нейтрофилы к месту повреждения.38 Обнаруженные протеазы и ингибиторы включают сериновые и цистеиновые протеазы, которые могут модифицировать белки до их активной формы, а также матричные протеазы и их ингибиторы, такие как матриксная металлопротеиназа-1 (MMP-1) и MMP-3, а также тканевый ингибитор металлопротеиназ ( TIMPs) -1 и -2, которые являются важными регуляторами оборота ECM во время фазы ремоделирования.6 Как отражено в анализе растворимых белков, dHUC является биологически активной тканью, которая содержит множество сигнальных факторов, способных стимулировать ответы, возникающие во время регенерации ткани.Подобные факторы также были выявлены в dHACM, другом трансплантате, полученном из плаценты, который показал клиническую эффективность при лечении венозных язв нижних конечностей и труднозаживающих ран.11, 26, 27, 28, 34, 39 Таким образом, считается, что dHUC трансплантаты обладают терапевтическим потенциалом, так как они также могут способствовать закрытию хронических ран.

Другой подгруппой идентифицированных факторов были молекулы адгезии, мембранные рецепторные белки клеток и сигнальные рецепторы. Молекулы адгезии, такие как белок адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1) и молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), играют важную роль в облегчении межклеточного взаимодействия нейтрофилов и макрофагов во время воспалительной фазы. .40 Рецепторы обычно присутствуют на поверхности мембраны клеток и МСК, обнаруженных в пуповине. 41, 42 Обнаружение этих молекул показывает, что процесс PURION® PLUS может помочь сохранить связанные с мембраной факторы, изначально присутствующие в пуповине, несмотря на отсутствие жизнеспособных клеток после обработки и лиофилизации. В целом известно, что dHUC содержит и сохраняет богатый состав факторов, которые участвуют в нескольких фазах заживления ран.

Во время фазы пролиферации при заживлении ран клетки пролиферируют, секретируют и откладывают ECM, чтобы сформировать новую ткань.3 В этих исследованиях ADSC и MSC стимулировались экстрактами dHUC дозозависимым образом для наблюдения за пролиферацией клеток (рисунки и). В недостаточной среде хронической раны увеличение присутствия и относительного количества этих клеток может потенциально дополнить каскад заживления. ADSC и MSC представляют собой два типа стволовых клеток, которые способны дифференцироваться в разные ткани30, 43, и было показано, что они участвуют в опосредовании гомеостаза и восстановления тканей, секретируя несколько факторов роста, которые включают, помимо прочего, фактор роста гепатоцитов ( HGF), VEGF, TGF-β1 и основной FGF (bFGF).44 Посредством паракринной передачи сигналов эти взрослые стволовые клетки способствуют секреции фибробластного коллагена I и миграции фибробластов, и было показано, что доставка только ADSC может привести к значительному уменьшению размера раны in vivo .45 Кроме того, МСК, полученные из желе Уортона и Пуповинная кровь приобрела интерес для трансплантации в качестве клеточной терапии для восстановления поврежденных тканей при инфекциях кожных ран за счет паракринных эффектов и уменьшения воспалительной реакции.

Точно так же миграция дермальных фибробластов в заживающие раны имеет решающее значение для создания новой грануляционной ткани и обеспечения матрицы для роста дополнительных клеток и кровеносных сосудов.4 Было замечено, что растворимые факторы в экстрактах dHUC способствовали закрытию кожных фибробластов раны человека, таким образом представляя значительную биологическую активность в аллотрансплантатах пуповины для стимуляции клеточных ответов (рисунок). В совокупности эти результаты in vitro подтверждают предложенный механизм dHUC в качестве регенеративной терапии путем стимулирования эндогенных клеток в месте доставки для восстановления поврежденной ткани и индукции мощной реакции заживления.

В ложе раны сначала появляется грануляционная ткань вместе с ветвящимися капиллярами и кровеносными сосудами.47 Формирование новых кровеносных сосудов, или ангиогенез, происходит в результате образования канальцев эндотелиальных колониеобразующих клеток и необходимо для переноса кислорода и питательных веществ во вновь образованную ткань. 47 Результаты модели совместного культивирования in vitro демонстрируют что экстракты dHUC увеличивают образование новых канальцев эндотелиальных колониеобразующих клеток с увеличением концентрации экстракта (рисунки и). После обработки ADSC и ECFC клетки дифференцировались в канальцы с образованием стабильных сетей в течение первых 48 часов, что демонстрируется начальным увеличением длины и площади сети.Эти сети сохраняются до 96 часов без дополнительной обработки, что видно по плато после первых 24 часов в культуре. Сурамин, известный ингибитор bFGF, 48 подавляет задержку сосудов, поэтому наблюдаемое первоначальное увеличение длины и площади трубки было связано с добавлением VEGF, а отсутствие устойчивости этих сосудов и, следовательно, уменьшение длины и площади было вызвано ингибитором.49, 50 Известно, что VEGF и bFGF играют важную роль в стимуляции, дифференцировке и установлении ангиогенных сетей эндотелиальными клетками.51 Эффект от лечения dHUC дополнительно подтверждается наличием этих ангиогенных факторов, а также других факторов, таких как ангиогенин-4 и ангиопоэтин, в ткани, что определяется анализом растворимого белка (вспомогательная информационная таблица S1) .47

Для успешного закрытия раны наложенный трансплантат резорбируется или разрушается, в то время как соседние клетки секретируют молекулы ЕСМ, такие как коллаген и фибронектин, с образованием новой ткани. Предварительные исследования in vivo показали, что в течение примерно 3 месяцев трансплантат dHUC резорбировался в подкожную окружающую ткань без фиброзной инкапсуляции и с умеренным воспалением, которое со временем уменьшалось (рисунки и).Это указывает на то, что dHUC в модели на крысах не подвергался фиброзной инкапсуляции или иммунному отторжению при имплантации, несмотря на то, что это ткань человеческого происхождения с интактными клетками в ксеногенном хозяине. Хотя эти результаты являются многообещающими, необходимы дальнейшие исследования, чтобы охарактеризовать способность трансплантатов dHUC к закрытию ран in vivo .

Результаты этого исследования позволяют предположить, что dHUC является многообещающей терапией для лечения острых и хронических ран из-за большого количества факторов роста и содержания белка, компонентов ECM и способности стимулировать клеточные реакции, такие как пролиферация, миграция и ангиогенез.Кроме того, было охарактеризовано, что ткань dHUC не вызывает побочных эффектов и активно резорбируется при имплантации в модель на крысах. На сегодняшний день это первая опубликованная характеристика обезвоженной формы ткани пуповины. Эти данные демонстрируют, что dHUC обладает биологическими свойствами, которые могут способствовать основной клеточной активности, участвующей не только в закрытии раны, но также и в других общих реакциях заживления, которые могут быть обнаружены в мягких тканях.

Дополнительная информация

Таблица S1 .Список из 461 белка, разделенных на рецепторы адгезии, хемокины, модуляторы воспаления, факторы роста и цитокины, мембраносвязанные белки, другие растворимые регуляторы, протеазы и ингибиторы, а также сигнальные рецепторы, обнаруженные в ткани dHUC.

БЛАГОДАРНОСТИ

JL, JDB, JJL, MM, AMF, TJK являются сотрудниками MiMedx Group, Inc. Мультиплексные массивы ELISA факторов роста были выполнены независимым CRO, RayBiotech, Inc. (Норкросс, Джорджия). Исследование биорезорбции на крысах было выполнено независимой CRO, T3 Labs (Атланта, Джорджия), гистопатология — Alizée Pathology (Thurmont, MD).Авторы также благодарят доктора философии Хизер Бара за ценные комментарии к более ранней версии рукописи.

Банкноты

Как цитировать эту статью : Bullard JD, Lei J, Lim JJ, Massee M, Fallon AM, Koob TJ. 2019.
Оценка биологических свойств обезвоженной пуповины человека для лечения ран и заживления мягких тканей. J Biomed Mater Res B, часть B. 2019: 107B: 1035–1046. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

ССЫЛКИ

1.
Эминг С.А., Мартин П., Томич-Канич М.Ремонт и регенерация ран: механизмы, передача сигналов и трансляция. Sci Transl Med
2014; 2: 265. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3.
Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko MS, Brem H, Tomic-Canic M. Факторы роста и цитокины при заживлении ран. Регенерация заживления ран
2008; 16: 585–601. [PubMed] [Google Scholar] 4.
Diegelmann RF. Заживление ран: обзор острого, фиброзного и замедленного заживления. Передние биоски
2004; 9: 283. [PubMed] [Google Scholar] 5.
Wu WK, Llewellyn OPC, Bates DO, Nicholson LB, Dick AD.Регулирование IL-10 продукции макрофагами VEGF зависит от поляризации макрофагов и гипоксии. Иммунобиология
2010; 215: 796–803. [PubMed] [Google Scholar] 6.
Шульц Г.С., Высоцкий А. Взаимодействие между внеклеточным матриксом и факторами роста при заживлении ран. Регенерация заживления ран
2009. 17: 153–162. [PubMed] [Google Scholar] 7.
Робертс AB, Heine UI, Flanders KC, Sporn MB. Преобразование фактора роста-бета. Основная роль в регуляции внеклеточного матрикса. Ann N Y Acad Sci
1990; 580: 225–232. [PubMed] [Google Scholar] 8.Senger DR, Claffey KP, Benes JE, Perruzzi CA, Sergiou AP, Detmar M. Ангиогенез, стимулируемый фактором роста эндотелия сосудов: регуляция посредством интегринов alpha1beta1 и alpha2beta1. Proc Natl Acad Sci U S A
1997. 94: 13612–13617. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9.
Высоцкий А.Б., Гриннелл Ф. Профили фибронектина в нормальной и хронической раневой жидкости. Лаборатория Инвест
1990; 63: 825–831. [PubMed] [Google Scholar] 10.
Wysocki AB, Staiano ‐ Coico L, Grinnell F. Раневая жидкость из хронических язв ног содержит повышенные уровни металлопротеиназ MMP ‐ 2 и MMP ‐ 9.J Invest Dermatol
1993. 101: 64–68. [PubMed] [Google Scholar] 11.
Куб Т.Дж., Лим Дж.Дж., Масси М., Забек Н., Денозиер Г. Свойства обезвоженных композитных трансплантатов амниона / хориона человека: значение для заживления ран и регенерации мягких тканей. J Biomed Mater Res Часть B
2014. 102: 1353–1362. [PubMed] [Google Scholar] 12.
Месси М., Чинн К., Лей Дж, Лим Дж.Дж., Янг К.С., Куб Т.Дж. Обезвоженная мембрана амниона / хориона человека регулирует активность стволовых клеток in vitro
. J Biomed Mater Res Часть B
2015; 104: 1332–1342.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 13.
Мэсси М., Чинн К., Лим Дж. Дж., Годвин Л., Янг К. С., Куб Т. Дж.. Диабетические стволовые клетки, полученные из жировой ткани типа I и II, реагируют на лечение дегидратированным аллотрансплантатом амниона / хорионной мембраны человека увеличением пролиферации, миграции и изменением секреции цитокинов. Adv Уход за раной
2016; 5: 43–54. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14.
Forbes J, Fetterolf DE. Обезвоженные аллотрансплантаты амниотической мембраны для лечения хронических ран: серия случаев. J Уход за раной
2012; 21: 1–5.[PubMed] [Google Scholar] 15.
Mermet I, Pottier N, Sainthillier JM, Malugani C, Cairey-Remonnay S, Maddens S, Riethmuller D, Tiberghien P, Humbert P, Aubin F. Использование трансплантации амниотической мембраны при лечении венозных язв ног. Регенерация заживления ран
2007; 15: 459–464. [PubMed] [Google Scholar] 16.
Couture M. Одноцентровое ретроспективное исследование криоконсервированной пуповины для заживления ран у пациентов, страдающих хроническими ранами стопы и голеностопного сустава. Раны
2016; 28: 217–225. [PubMed] [Google Scholar] 17.Cheng AMS, Chua L, Casa V, Tseng SC. Морселизованная ткань амниотической мембраны при рефрактерных дефектах эпителия роговицы при рубцовых заболеваниях поверхности глаза. Переводчик Vis Sci Technol
2016; 5: 1–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 18.
Рейнс А.Л., Ши М.С., Чуа Л., Су К.В., Ценг С.К., О’Коннелл Дж. Эффективность твердых частиц амниотической мембраны и тканей пуповины в ослаблении разрушения хряща на модели остеоартрита. Ткань Eng Часть A
2017; 23: 12–19. [PubMed] [Google Scholar] 19.
Гансельман А.Е., Лалли ТАДЖ, Сантрок Р.Д.Тематический обзор: Использование тканей плода в хирургии стопы и голеностопного сустава. Спецификация голеностопного сустава стопы
2015; 8: 297–304. [PubMed] [Google Scholar] 20.
Спурвей Дж., Логан П., Пак С. Развитие, структура и кровоток в пуповине с особым упором на венозную систему. Aust J Ultrasound Med
2012; 15: 97–102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21.
Камолц Л.П., Кек М., Каспер К. Мезенхимальные стволовые клетки Уортона способствуют заживлению ран и регенерации тканей. Стволовые клетки Res Ther
2014; 4: 1-2.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 22.
Арно А.И., Амини-Ник С., Блит PH, Аль-Шехаб М., Белу С., Херер Э., Тьен С.Х., Йешке М.Г. Мезенхимальные стволовые клетки человеческого желе Wharton способствуют заживлению кожных ран посредством паракринной передачи сигналов. Стволовые клетки Res Ther
2014; 5: 1–13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23.
Дой Х, Китадзима Й, Луо Л., Ян Ц., Татейши С., Оно Й, Урата Й, Гото С., Мори Р., Масудзаки Х, Симокава И., Хирано А., Ли Т. С.. Эффективность пуповинной крови и мезенхимальных стволовых клеток Уортона, полученных из желе, для безрубцового заживления ран.Научный представитель
2016; 6: 18844. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24.
Капуто WJ, Vaquero C, Monterosa A, Monterosa P, Johnson E, Beggs D, Fahoury GJ. Ретроспективное исследование криоконсервированной пуповины в качестве дополнительной терапии для ускорения заживления хронических сложных язв стопы на фоне остеомиелита. Регенерация заживления ран
2016; 24: 885–893. [PubMed] [Google Scholar] 25.
Тиге С., Моейн Х.Р., Чуа Л., Ченг А., Хамрах П., Ценг СК. Актуальные криоконсервированные амниотические мембраны и глазные капли из пуповины способствуют реэпителизации на модели абразии роговицы у мышей.Инвестируйте офтальмол Vis Sci
2017; 58: 1586–1593. [PubMed] [Google Scholar] 26.
Серена Т.Е., Яаков Р., ДиМарко Д.Т., Ле Л.Т., Таффе Э., Дональдсон М., Миллер М. Лечение венозных язв нижних конечностей обезвоженным амнионом / хорионной мембраной человека: корреляция между 4-недельными и 24-недельными результатами. J Уход за раной
2015; 24: 530–534. [PubMed] [Google Scholar] 27.
Серена Т. Е., Картер MJ, Ле LT, Сабо MJ, DiMarco DT. Многоцентровое рандомизированное контролируемое клиническое исследование по оценке использования обезвоженных аллотрансплантатов с мембраной амниона / хориона человека и многослойной компрессионной терапии по сравнению столько многослойная компрессионная терапия при лечении венозных язв ног. Регенерация заживления ран
2014; 22: 688–693. [PubMed] [Google Scholar] 28.
Шейх Е.С., Феттерольф Д.Е. Использование обезвоженных аллотрансплантатов амниотической мембраны человека для ускорения заживления у пациентов с трудноизлечимыми незаживающими ранами. Внутри рана J
2014; 11: 711–717. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 29.
Ми Х, Анушья М., Касагранде Дж. Т., Томас П.Д. Широкомасштабный анализ функций генов с помощью системы классификации PANTHER. Нат Проток
2013; 8: 1551–1566.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 30.
Hassan WUI, Greiser U, Wang W. Роль стволовых клеток, полученных из жировой ткани, в заживлении ран. Регенерация заживления ран
2014; 22: 313–325. [PubMed] [Google Scholar] 31.
Сингх А., Ли П., Бичли В., МакДоннелл П., Элиссефф Дж. Х. Контактные линзы, связывающие гиалуроновую кислоту, с улучшенным удержанием воды. Контактные линзы переднего глаза
2015; 38: 79–84. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 32.
Uckan D, Steele A, Cherry, Wang BY, Chamizo W, Koutsonikolis A, Gilbert-Barness E, Good RA.Трофобласты экспрессируют лиганд Fas: предполагаемый механизм иммунной привилегии в плаценте и материнской инвазии. Мол Хум Репрод
1997; 3: 655–662. [PubMed] [Google Scholar] 33.
Азуара ‐ Бланко А, Пиллаи С., Дуа Х.С. Трансплантация амниотической мембраны для реконструкции поверхности глаза. Br J Opthalmol
1999; 83: 399–402. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 34.
Бьянки К., Каззелл С., Вайсер Д., Рейзельман А. М., Дослуоглу Х., Товмасян Г., Исследовательская группа EpiFix VLU
. Многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование, оценивающее эффективность обезвоженного аллотрансплантата амниона / хорионной мембраны человека (EpiFix®) для лечения венозных язв нижних конечностей.Внутри рана J
2017; 15: 114–122. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 35.
Мругала А., Суй А., Пламмер М., Альтман И., Папино Е., Франдсен Д., Хилл Д., Эннис В. Дж. Амниотическая мембрана — потенциальный вариант регенерации хронических незаживающих ран: отчет о пяти случаях получения обезвоженного аллотрансплантата амниона / хорионной мембраны человека. Внутри рана J
2016; 13: 485–492. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 38.
Koh TJ, DiPietro LA. Воспаление и заживление ран: роль макрофагов. Опыт Рев Мол Мед
2011; 13: 1–12.[Google Scholar] 39.
Куб Т.Дж., Лим Дж.Дж., Масси М., Забек Н., Реннерт Р., Гуртнер Г., Ли У. Ангиогенные свойства обезвоженных аллотрансплантатов амниона / хорина человека: терапевтический потенциал для восстановления и регенерации мягких тканей. Vasc Cell
2014; 6: 1–10. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 40.
Муцаерс С.Е., Епископ Дж. Э., Макгрутер Дж., Лоран Дж. Дж. Механизмы восстановления тканей: от заживления ран до фиброза. Int J Biochem Cell Biol.
1997; 29: 5–17. [PubMed] [Google Scholar] 41.
Акерман Ф., Лей З.М., Рао К.В. Пуповина человека и оболочки плода ко-экспрессируют лептин и его рецепторные гены.Гинекол Эндокринол
2002; 16: 299–306. [PubMed] [Google Scholar] 42.
Kim DS, Kim JH, Lee JK, Choi SJ, Kim JS, Jeun SS, Oh W, Yang YS, Chang JW. Избыточная экспрессия хемокиновых рецепторов CXC необходима для превосходного отслеживания глиомы мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповинной крови. Разработка стволовых клеток
2009; 18: 511–519. [PubMed] [Google Scholar] 43.
Ву Л., Чен Л., Скотт П. Г., Треджет Э. Мезенхимальные стволовые клетки ускоряют заживление ран за счет дифференцировки и ангиогенеза. Перевод Clin Res
2007. 25: 2648–2659.[PubMed] [Google Scholar] 44.
Цуджи В., Рубин П., Марра К.Г. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани: влияние на регенерацию тканей. Стволовые клетки World J
2014; 6: 312–321. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 45.
Ким В.С., Пак Б.С., Сун Дж. Х., Ян Дж. М., Пак С.Б., Квак С.Дж., Парк Дж. С.. Ранозаживляющий эффект стволовых клеток, полученных из жировой ткани: критическая роль секреторных факторов на дермальных фибробластах человека. J Dermatol Sci
2007; 48: 15–24. [PubMed] [Google Scholar] 46.
Malgieri A, Kantzari E, Patrizi MP, Gambardella S. Мезенхимальные стволовые клетки человека костного мозга и пуповинной крови: современное состояние.Int J Clin Exp Med
2010; 3: 248–269. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 47.
Тоннесен М.Г., Фэн Х, Кларк Р.А. Ангиогенез при заживлении ран. J Invest Dermatol Symp Proc
2000; 5: 40–46. [PubMed] [Google Scholar] 48.
Danesi R, Del Bioanchi S, Soldani RC, La Rocca RV, Myers CE, Paparelli A, Del Tacca M. Сурамин ингибирует bFGF-индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез в хориоаллантоидной мембране цыплят. Br J Рак
1993; 68: 932–938. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 49.
Томанек Р.Дж., Лотун К., Кларк Е.Б., Суварна П.Р., Ху Н.VEGF и bFGF стимулируют васкуляризацию миокарда у эмбриональных цыплят. Am J Physiol
1998; 274: h2620 – h2626. [PubMed] [Google Scholar] 50.
Томанек Р.Дж., Сандра А., Чжэн В., Брок Т., Бьерке Р.Дж., Холифилд Дж.С. Фактор роста эндотелия сосудов и основной фактор роста фибробластов по-разному модулируют ранний постнатальный коронарный ангиогенез. Circ Res
2001; 88: 1135–1141. [PubMed] [Google Scholar] 51.
Феррара Н, Кербель RS. Ангиогенез как терапевтическая мишень. Природа
2005; 438: 967–974. [PubMed] [Google Scholar] 52.Меткалф А.Д., Фергюсон М.В.Дж. Тканевая инженерия замещающей кожи: перекресток биоматериалов, заживления ран, эмбрионального развития, стволовых клеток и регенерации. Интерфейс J R Soc
2007; 4: 413–437. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток пуповинной крови человека, стимулируют регенеративное заживление ран через ингибирование рецептора трансформирующего фактора роста β | Исследования и терапия стволовыми клетками

Заживление ран у взрослых обычно включает заживление рубцов, которые могут быть результатом чрезмерного образования миофибробластов [1, 2].МСК — многообещающий метод для ускорения закрытия ран и ограничения рубцевания при заживлении ран [9, 14, 15, 16]. UCB-MSC использовались для ускорения заживления диабетических ран и, как сообщалось, способствовали экспрессии факторов, препятствующих рубцеванию [17,18,19,20,21]. Однако было сделано несколько попыток изучить влияние UCB-MSC на образование рубцов. Все больше и больше исследований показывают, что МСК играют роль в основном через иммунную регуляцию и паракринные процессы, а не напрямую дифференцируются [9, 10, 14, 29].UCB-MSC-exo являются основным источником паракринных факторов UCB-MSC; Остается неясным, являются ли они главными эффекторами функции UCB-MSC, тем более что роли «груза», происходящего из UCB-MSC экзо, неизвестны. Впервые настоящее исследование продемонстрировало, что UCB-MSC ускоряют закрытие раны и подавляют образование рубцов при заживлении ран, что частично может происходить через UCB-MSC-exo. Мы также идентифицировали две специфические miRNA, несущие UCB-MSC-exo, которые могут ингибировать сигнальную активность рецепторов TGF-β, тем самым ингибируя дифференцировку миофибробластов.В определенной степени наше исследование предлагает новую стратегию клинического применения UCB-MSC для предотвращения образования рубцов.

При заживлении ран терапия на основе МСК является многообещающей стратегией для усиления реэпителизации, подавления фиброзного ремоделирования, ускорения регенерации придатков кожи, усиления ангиогенеза, стимуляции рекрутирования эндогенных стволовых клеток и модуляции воспаления [9, 10, 14, 15 , 16, 29]. Кроме того, UCB-MSC могут представлять собой более многообещающий вариант, который может преодолеть несколько ограничений, включая большую способность к расширению с потенциалом дифференцировки, более низкую иммуногенность по сравнению с MSC взрослого происхождения и более легкое получение по сравнению с ESC из-за связанных этических проблем [ 22, 23].

UCB-MSC использовались для усиления реэпителизации и улучшения качества заживления ран. Jae-A Jung et al. [19] и N il et al. [20] соответственно сообщили, что UCB-MSC способствуют заживлению диабетических ран за счет увеличения синтеза коллагена и неоваскуляризации. Более того, Hanako Doi et al. [18] обнаружили, что UCB-MSC экспрессируют более низкие уровни провоспалительных цитокинов IL-1 и более высокие уровни ферментов деградации MMP1 и PLAU ECM, чем MSCs Wharton jelly, что позволяет предположить, что UCB-MSC с большей вероятностью способствуют заживлению без рубцов.Однако они не смогли значительно уменьшить образование рубцов после прямой инъекции UCB-MSCs в полнослойных голых мышей с кожными ранениями [18]. В настоящем исследовании мы оценили важную роль UCB-MSC в заживлении ран у крыс. Мы наблюдали явления более раннего закрытия раны, меньшего образования рубцов и большего количества кожных придатков, нервов и сосудов в заживающей коже в группе UCB-MSC по сравнению с таковыми в контрольной группе. Дифференциация миофибробластов и образование рубцов также ингибировались обработкой UCB-MSC, на что указывало снижение экспрессии α-SMA и коллагена I в заживающей коже крыс.Классически α-SMA считается маркером дифференцировки миофибробластов [30, 31], а коллаген I считается основным компонентом рубцовой ткани [2, 3]. Чрезмерная дифференцировка миофибробластов и постоянная экспрессия коллагена I является фундаментальной причиной образования рубцов [2, 3]; таким образом, требуется вмешательство во время заживления раны для предотвращения накопления миофибробластов, а не принятие лечебных мер после образования рубца. В этом исследовании наблюдались результаты экспериментов in vivo, отличающиеся от результатов, наблюдаемых Hanako Doi et al.[18]. Это может быть связано с различиями в методах лечения UCB-MSC (инъекция в хвостовую вену по сравнению с локальной инъекцией вокруг раны), что позволяет предположить, что пораженное микроокружение не способствует выживанию и сохранению МСК, что ограничивает эффективность лечения. Мы также наблюдали, что UCB-MSCs могут ингибировать отложение коллагена, что противоречит результатам Jae-A Jung et al. [19], возможно, из-за различных используемых моделей ран у животных (механические раны против диабетических ран), поскольку заживление диабетических ран отличается от механического заживления ран, оно может находиться на ранней стадии заживления в течение длительного времени.Известно, что МСК могут регулировать ремоделирование коллагена, подавляя гиперплазию рубца. На ранней стадии МСК способствуют ремоделированию коллагена за счет синтеза типов I и III, тогда как они уменьшают рубцевание на поздней стадии, ингибируя образование коллагена [32]. Это может указывать на то, что UCB-MSC обладают гибким целевым эффектом при различных патологиях, что может расширить область его применения.

В настоящее время считается, что МСК играют терапевтическую роль in vivo, главным образом посредством паракринной передачи сигналов [9, 10, 14, 29].МСК могут высвобождать биологически активные молекулы, влияющие на пролиферацию, миграцию и выживание рецепторных клеток. Наши недавние исследования показали, что EPSC [9] и стволовые клетки амниотической жидкости [10] способствуют регенерации кожи через секретируемые экзосомы. В этом исследовании мы также оценили важную роль UCB-MSC-exo в заживлении ран у крыс и обнаружили, что эффект UCB-MSC-exo был аналогичен эффекту UCB-MSC, предполагая, что регенеративное заживляющее действие UCB -MSC по заживлению ран может быть достигнута через секрецию экзосом.Мы отслеживали UCB-MSC in vivo и определяли, существуют ли они на участке ранения через 1 и 2 недели после трансплантации. Интересно, что мы обнаружили, что агрегация UCB-MSC была обнаружена на участке ранения через 1 неделю после имплантации клеток. Однако действительно существует очень мало UCB-MSC после клеточной имплантации через 2 недели (данные не показаны), что позволяет предположить, что несколько UCB-MSC навсегда приживаются в восстановленной ткани. Помимо регенеративного заживления кожных ран для достижения заживления без рубцов, быстрое закрытие раны также имеет решающее значение, потому что закрытие раны важно для блокирования внешнего воздействия окружающей среды.Хотя сократительная способность миофибробластов способствует закрытию ран на ранней стадии, ингибирование UCB-MSC-exo дифференцировки миофибробластов не обязательно приводит к замедлению заживления ран. Мы обнаружили, что UCB-MSC могут способствовать пролиферации и миграции клеток кожи, включая EPSC и HDF, что может иметь важное значение для ускорения закрытия ран; это похоже на результаты, сообщенные Ким Юн-Джин и др. [19]. UCB-MSC и UCB-MSC-exo обладают сходным репаративным действием на заживление ран; однако мы полагаем, что UCB-MSC-exo может иметь другие преимущества, такие как преодоление иммунных и онкогенных проблем, вызванных аллотрансплантацией.

Экзосомы обычно играют решающую роль в клеточной коммуникации, передавая информацию соседним клеткам через их «груз», включая белки, ДНК, мРНК и миРНК [26, 27, 33]. Терапевтический потенциал экзосом зависит от состава «груза», который они несут [33]. Сообщалось, что miRNAs обычно широко распространены в экзосомах [9, 10]; эти miRNA регулируют различные пути передачи сигналов в рецепторных клетках, включая перенос клеток, апоптоз, ангиогенез и протеолиз посредством нацеливания на факторы транскрипции и гены [33].Мы проанализировали miRNA в UCB-MSC, как сообщили Meng et al. [28] и обнаружили, что эти miRNAs положительно коррелировали с сигнальным путем TGF-β. Как правило, миРНК, происходящие из МСК, и миРНК, происходящие из их экзосом, сильно коррелированы, что подтверждается нашими результатами. Мы обнаружили, что эффект дифференцировки антимиофибробластов может быть результатом пары miRNA, нацеленных на рецептор TGF-β, miR-21-5p и miR-125b-5p. miR-125b-5p подавляет фиброз печени при неалкогольной жировой болезни печени путем ингибирования сигнального пути RhoA [34].В нашем исследовании miR-125b-5p также подавлял фиброзное рубцевание, подавляя экспрессию TGFBR1 . Кроме того, miR-21-5p может ингибировать экспрессию TGFBR2 в сигнальном пути TGF-β, тем самым подавляя дифференцировку миофибробластов, в отличие от других сообщений, в которых miR-21-5p способствовал развитию рака желудка и фиброза почек за счет активации Smad7 в Сигнальный путь TGF-β [35, 36]. Как правило, miRNA могут одновременно нацеливаться на разные мРНК. Следовательно, мы полагаем, что miR-21-5p может быть палкой о двух концах, регулирующей передачу сигналов TGF-β; его функция может варьироваться в зависимости от состояния клетки и конкретной задействованной молекулярной сети.Основываясь на приведенных выше результатах, мы предполагаем, что миРНК UCB-MSC-exo могут быть важными регуляторами сигнального пути TGF-β, ингибируя дифференцировку миофибробластов во время заживления ран на коже.

Границы | Бесклеточный желатиновый материал пуповины человека усиливает заживление ран: возможное средство для недостаточного заживления ран

Введение

Рана описывается как нарушение нормальной здоровой анатомической структуры и функциональной целостности кожи (Atiyeh et al., 2002). Процесс заживления ран включает четыре интегрированных и перекрывающихся этапа: гемостаз, воспаление, пролиферация и ремоделирование или рассасывание ткани (Gosain and DiPietro, 2004). Эти шаги позволяют реформировать и реваскуляризовать кожу, позволяя сформировать функциональную дерму и эпидермис. Около 1,5 миллиарда человек страдают кожными заболеваниями в результате как прогрессирующего старения, так и отсутствия надлежащего медицинского обслуживания (Valacchi et al., 2012). Среди них очень распространены поражения кожи, которые можно разделить на острые и хронические раны (Whitney, 2005).Сообщалось, что острые раны обычно возникают после травмы или воспаления и заживают в течение 6 недель (Valacchi et al., 2012). При определенных обстоятельствах возникают хронические раны, также известные как незаживающие раны, которые не проходят через обычные этапы заживления ран и не заживают в течение 6 недель; этот тип ран приводит к открытому рваному ранению различной степени тяжести (Branski et al. др., 2009). Такие раны часто переходят в состояние патологического воспаления из-за отложенного, неполного или нескоординированного процесса заживления.Лечение хронической раны, определяемой как барьерный дефект, который не зажил в течение 3 месяцев, стало серьезной терапевтической проблемой во всем западном мире, и эта проблема будет только усугубляться с появлением состояний, препятствующих заживлению ран, таких как так как диабет, ожирение, сосудистые заболевания растут в дополнение к ожоговым травмам (Nunan et al., 2014).

Основными целями при лечении ран являются быстрое закрытие раны и формирование функционального и эстетически удовлетворительного рубца.Для этого закрытие раны является одним из краеугольных камней лечения ран (Singer and Clark, 1999). Клиницисты могут использовать различные материалы и методы, такие как терапия антибиотиками, хирургическая обработка раны, устройства отрицательного давления, перевязочные материалы, гипербарическая кислородная терапия, антимикробная терапия, биоинженерные эквиваленты кожи и факторы роста, но они имеют ограниченный успех, что иллюстрирует сложности заживления ран. Кожные трансплантаты из аллогенных или аутологичных источников, лоскутов реконструктивной ткани и искусственные заменители кожи также могут быть полезны при лечении более обширных или хронических ран (Valacchi et al., 2012). Хотя исследования продолжаются и кожные заменители становятся все более эффективными, заживление ран остается клинической проблемой, особенно в условиях старения населения (Jeschke et al., 2015, 2016). Клинические и доклинические исследования с использованием клеточной терапии постепенно вводятся в медицинскую помощь для лечения кожных ран, поскольку они могут восстанавливать / заменять поврежденную ткань здоровой тканью благодаря своей естественной способности производить цитокины и молекулы, необходимые для заживления ран (Марфия et al., 2015; Markeson et al., 2015; Николас и др., 2016а, б).

В 1991 г. McElreavey et al. впервые выделили мезенхимальные стромальные клетки из желейной части пуповины Уортона (McElreavey et al., 1991). Wharton’s Jelly — источник перинатальных мезенхимальных стволовых клеток (WJ-MSC) с уникальными свойствами как эмбриональных, так и взрослых стволовых клеток (Pirjali et al., 2013). MSCs Wharton, полученные из желе, обладают способностью поддерживать фенотипические атрибуты, кинетику роста клеток, структуру клеточного цикла, пластичность многолинейной дифференцировки in vitro , паттерн апоптоза, нормальные кариотипоподобные внутренние свойства MSC в долгосрочных культурах in vitro (Sabapathy и другие., 2014). В нескольких исследованиях изучалась клеточная терапия с помощью WJ-MSC, отдельно или внутри каркаса (Azari et al., 2011; Shohara et al., 2012; Fong et al., 2014; Ribeiro et al., 2014; Sabapathy et al., 2014). Исследования выяснили роль WJ-MSC для различных применений, таких как неврологические расстройства (Shalitin et al., 2003), повреждение почек (Du et al., 2013), повреждение легких (Moodley et al., 2009), печень. лечение травм и рака (Sabapathy et al., 2014). Недавно мы сообщили, что кондиционированная среда WJ-MSC с ее секретомом оказывает положительное влияние на заживление ран in vitro (Arno et al., 2014).

Мезенхимальные стволовые клетки в желе Уортона находятся в тесном взаимодействии со своим внеклеточным матриксом. Учитывая, что секретом WJ-MSC усиливает заживление ран in vitro , мы спросили, оказывает ли нативный внеклеточный матрикс этих клеток, который не обязательно секретируется WJ-MSC, какое-либо влияние на заживление кожи. Сам желе Wharton без клеток не исследовалось на предмет заживления ран. Желе Уортона содержит значительное количество компонентов внеклеточного матрикса, которые в основном состоят из коллагена, гиалуроновой кислоты и различных сульфатированных протеогликанов.Хорошо известно, что биосинтез компонентов внеклеточного матрикса усиливается несколькими пептидными факторами роста, в основном инсулиноподобным фактором роста (IGF) (Edmondson et al., 2003), фактором роста фибробластов (FGF) (Yu et al., 2003). ) и трансформирующий фактор роста b (TGF-b) (Шалитин и др., 2003). Эти факторы роста могут накапливаться в желе Уортона для поддержки клеток (например, МСК). Поэтому мы предположили, что бесклеточное студенистое желе Уортона (AGWJ) ускоряет заживление кожных ран. Здесь мы сообщаем об эффектах лечения AGWJ на фибробластные клетки дермы в экспериментах in vitro, .Затем мы провели эксперименты по заживлению ран на самцах мышей C57 / black 6 в возрасте 8 недель, чтобы установить эффект лечения AGWJ на раны in vivo . Полученные данные подтверждают исследования нового метода лечения ран с использованием AGWJ.

Материалы и методы

Культура клеток

Пластиковая посуда для тканевых культур была приобретена у BD Falcon ™ (Бедфорд, Массачусетс, США), и все среды для тканевых культур и добавки были приобретены у Wisent Inc. (Сен-Жан-Батист, Квебек, Канада), если не указано иное.Среда для культивирования клеток фибробластов представляла собой среду Игла, модифицированную Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствора антибиотик-антимикотика. Первичные фибробласты нормальной кожи человека получали из образцов кожной ткани. Кожу иссекали для удаления любого подлежащего жира из дермы, разрезали на небольшие кусочки эксплантата от 2 до 4 мм и культивировали в 10-сантиметровых чашках. Когда клетки фибробластов мигрировали из ткани на пластину, кусочки ткани удаляли.Когда фибробласты достигли 70% слияния, примерно в течение 1 недели, их трипсинизировали 0,05% трипсином для подготовки к субкультивированию. Фибробласты субкультивировали в колбах для тканевых культур размером 75 см ² при плотности 5000 клеток / см ² .

Ацеллюляризация желе Уортона

Стерильные пуповины были получены после кесарева сечения хирургами отделения гинекологии и акушерства Центра медицинских наук Саннибрук после получения согласия пациентов.Шнуры, длина которых составляла в среднем 20 см, разрезали пополам. Затем полукорды длиной 10 см разрезали продольно, чтобы обнажить желеобразное содержимое Wharton. Затем кусочки пуповины промывали, погружая их в 2% раствор антибиотика / антимикотика PBS с последующим погружением в 1% раствор антибиотика / антимикотика PBS. Затем пуповину полностью открыли и стерильным скальпелем соскребли желе с пуповины. Затем желе (приблизительно 5 мл) помещали в коническую пробирку на 50 мл с 20 мл полной среды 1 × DMEM и энергично ресуспендировали с помощью пипетки на 5 мл для разрушения желе.Затем ресуспендированный желе в среде центрифугировали при 1400 об / мин в течение 10 мин. Клетки и остатки пуповины осаждали. Супернатант с AGWJ собирали и замораживали при -80 ° C. Осадок клеток был отброшен (дополнительная фигура 1).

Исследование миграции клеток: анализ царапин

Нормальные фибробласты кожи человека высевали в планшеты с шестью лунками при плотности 20 000 клеток / лунку. Когда лунки достигли 100% слияния клеток, кончиком пипетки на 1000 мкл были сделаны две царапины.Затем среду отсасывали и клетки промывали PBS. PBS аспирировали. Одну лунку сразу же окрасили кристаллическим фиолетовым в качестве временной точки 0 ч. К клеткам добавляли среду для обработки AGWJ в DMEM или полную контрольную среду DMEM. Через 24 ч клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым. Изображения получали на микроскопе (Zeiss) с 4-кратным увеличением. На каждую царапину делалось восемь изображений. Количественную оценку выполняли с использованием программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США).Клетки в зоне царапины считали как клетки в зоне царапины.

In vivo Модель заживления ран

Восемь C57 / черный 6 (возраст 8 недель, самцы, масса тела от 25 до 30 г) были получены из лаборатории Джексона в соответствии с руководящими указаниями Исследовательского института Саннибрук и Комитета по политике и благополучию животных Саннибрук по политике и благополучию в области здравоохранения Университета Торонто. Процедуры для животных были рассмотрены и одобрены Исследовательским институтом Саннибрука и Центром медицинских наук Саннибрука Комитетом по уходу и использованию животных Университета Торонто.Животных анестезировали, и волосы на спине удаляли электрическим бритьем под анестезией, как указано в Протоколе для животных. На каждой стороне средней линии были образованы 4 раны диаметром 6 мм на всю толщину кожи. Животных случайным образом разделили на две группы: экспериментальную (AGWJ и Matrigel; матричный продукт высокой концентрации Corning Matrigel № 354262 Corning, Нью-Йорк, США) и контрольную (полная среда DMEM и матригель). Для 5-дневного временного исследования: 3 мыши получали контрольную обработку ран и 3 мыши получали лечение AGWJ.Для исследования с 7-дневными временными точками: 6 мышей получали контрольную терапию и 7 мышей получали лечение AGWJ. Каждую рану местно обрабатывали 100 мкл AGWJ или контрольной DMEM в смеси Matrigel. День ранения считали днем ​​0. Для 7-дневного временного исследования на 2 и 4 дни раны были восстановлены. На 6 день, за 24 ч до захвата мышей, животным внутрибрюшинно вводили бромдезоксиуридин (BrdU) (Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния, США). Для 5-дневной временной точки раны были восстановлены на 2-й день, BrdU вводили на 4-й день и мышей умерщвляли на 5-й день.

Этические правила исследования на животных

Эксперименты на животных были рассмотрены, одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Научно-исследовательским институтом Саннибрук и Комитетом по политике и благополучию животных Саннибрук по вопросам здоровья и благополучия Университета Торонто, Онтарио, Канада. Все процедуры с использованием животных были одобрены комитетом по уходу за животными Саннибрук, разрешение № 15-503 (M-1), выданное 20 ноября 2015 г. под эгидой Канадского совета по уходу за животными.

Человеческая пуповина была получена в результате кесарева сечения, выполненного хирургами отделения гинекологии и акушерства Центра медицинских наук Саннибрук, Университет Торонто, Торонто, Онтарио, Канада. Все субъекты дали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов. Протокол был одобрен Академической сетью медицинских наук Торонто (TAHSN) и Научно-исследовательским институтом Саннибрук и Университетом Торонто, утвержденным Советом по надзору институциональной этики Центра медицинских наук Саннибрук (номер REB: 017-2011, действителен до 1 марта 2017 г.), и после получения пациент подписал информированное согласие.

Анализ ран

На 5 и 7 день мышей умерщвляли. Затем раны иссекали с помощью скальпеля и хирургических ножниц. 3 из 4 ран были помещены в кассеты для гистологии и зафиксированы в 10% забуференном формалине в течение 24 часов при 4 °, затем были переведены на 70% раствор этанола и затем погружены в парафин. Образцы были разрезаны на срезы 5 мкм. Образцы ткани вырезали по центру или средней линии раны, обеспечивая поперечный разрез центра раны. Обе половины раны затем помещали на предметные стекла для анализа.Раны также включали нормальную неповрежденную кожу по обе стороны от раны. 4-я рана была заморожена сразу после удаления для будущих анализов. Для анализа ран под высоким увеличением поля (HPF) грануляционная ткань была выбрана из центра раны, который представлял собой зажившую область как контрольной, так и обработанной AGWJ ран.

Трихромное пятно

Реагенты для трихрома были от EMS (Hatfield, PA, USA), если не указано иное. Залитые в парафин предметные стекла нагревали 30 мин при 60 ° C.Затем предметные стекла депарафинизировали цитрозолом с последующей регидратацией через 100% × 2, 95%, 70% и промывали дистиллированной водой. Слайды помещали в раствор Буэна (26367–01; EMS, Hatfield, PA, USA) на ночь при комнатной температуре в течение ночи и промывали проточной водопроводной водой в течение 10 мин. Окрашивание гематоксилином (HHS16; Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) и раствор фуксина алой кислоты Бибриха наносили последовательно в течение 10 мин. Промывки выполнялись после добавления каждого красителя. Предметные стекла дифференцировали в фосфорно-вольфрамовой кислоте в течение 15 мин и переносили на анилиновый синий на 5 мин.Затем предметные стекла промывали и дифференцировали в 1% уксусной кислоте в течение 2 минут, затем промывали дистиллированной водой. Затем слайды обезвоживали 95% этанолом и абсолютным этанолом с последующей очисткой в ​​цитрозоле. Слайды закрепляли с помощью жидкой монтажной среды на основе ксилола SHUR / Mount (Triangle Biomedical Sciences, Дарем, Северная Каролина, США). Изображения были получены с использованием светового микроскопа Zeiss Axiovert 200 при 5-кратном, 10-кратном, 20-кратном и 40-кратном увеличении. Количественная оценка проводилась с использованием объединенных изображений для измерения всей длины раны.

Иммуногистохимия

Препараты из кожной ткани, залитые парафином, депарафинизировали нагреванием в течение 30 мин при 60 °. Затем предметные стекла помещали в цитрозол (2х), 100% этанол (2х), 95% этанол, 70% этанол на 3 мин каждое, а затем воду. Затем осуществляли извлечение антигена с использованием антигена для снятия блокировки (1 ×; Biocare Medical, Конкорд, Калифорния, США), который добавляли к предметным стеклам в предварительно нагретой камере для снятия блокировки в течение 4 минут при 110 ° C. Для окрашивания BrdU образцы денатурировали 1,5 н. HCl в течение 30 мин при 37 ° C и нейтрализовали 0.1 М борат забуферен дважды в течение 5 мин. Образцы блокировали 3% H ₂ O ₂ в течение 10 минут, а затем промывали промывочным буфером (0,05 М трис-HCl, 0,15 М NaCl, 0,05% Твин 20 в деионизированной воде). Первичные антитела (мышиные моноклональные анти-BrdU, 1: 200; Cell Signaling, Беверли, Массачусетс, США) разводили в PBS и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Для анализа α гладкомышечного актина (α SMA) другой срез зондировали αSMA (мышиные моноклональные анти-αSMA, 1: 200; клон 1A4; ebioscience, Sandiego CA, США), первичное антитело, разведенное в PBS, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч.Затем предметные стекла инкубировали в течение 15 мин с мышиным зондом MACh4 (Biocare Medical), а затем с полимером пероксидазы хрена кролика или мыши MACh4 с промежуточной промывкой. Набор хромогена для бетазоид диаминобензидина (Biocare Medical) смешивали и добавляли в течение 5 мин или до тех пор, пока не стало заметным коричневое пятно. Реакцию останавливали проточной водой. Окрашивание ядер проводили гематоксилином в течение 30 с с последующей дифференцировкой тремя погружениями в 1,5% кислый спирт и посинением в 0,1% бикарбонате натрия в течение 10 с.Срезы обезвоживали с помощью 95% и абсолютного этанола до цитрозола и закрепляли с помощью SHUR / Mount. Изображения были получены с использованием светового микроскопа Zeiss Axiovert 200 при 10-кратном увеличении для изображения всего сечения с последующим 40-кратным увеличением для дальнейшей фокусировки на краях и центре раны. Изображения с 40-кратным увеличением были количественно определены по положительным клеткам с использованием программного обеспечения ImageJ, а затем нормализованы к количеству общих клеток в 40-кратном поле.

Иммунофлуоресценция

Клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали в течение 15 мин в 4% параформальдегиде (Alfa Aesar, Карлсруэ, Германия).Фиксированные клетки промывали PBS и повышали проницаемость в течение 10 мин с помощью 0,5% раствора Triton X-100 в PBS. Клетки снова промывали и затем блокировали в течение 30 минут 1% бычьим сывороточным альбумином в 0,5% Triton X-100 в PBS. Добавляли первичное антитело моноклонального αSMA мыши (анти-αSMA, 1: 200; клон 1A4; ebioscience, Sandiego CA, США) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. После промывки PBS вторичные антитела добавляли в 1% бычий сывороточный альбумин в 0,5% Triton X-100 в PBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте (ослиная антимышь Alexa Fluor 488, 1: 500; Life Technologies, Юджин, штат Орегон, США).Затем клетки трижды промывали PBS, слайды помещали в монтажную среду Vectashield с 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Клетки исследовали и фотографировали с использованием системы флуоресцентной визуализации Apotome Axiovert при 10-кратном увеличении (Zeiss, Оберкохен, Германия). Были сделаны четыре изображения на лунку и две лунки, одна лунка была обработана клетками AGWJ, а одна была контрольной обработкой клеток.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток

определяли с использованием набора для анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-glo (G7571 Promega, Мэдисон, Висконсин, США).Вкратце, клетки высевали в 96-луночный планшет и позволяли расти в течение 24 часов при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2. Через 24 ч среду аспирировали и к клеткам добавляли среду для обработки AGWJ или контрольную среду. Планшет снова инкубировали 24 ч в инкубаторе. После инкубации с обработкой субстрат для титра клеток glo был добавлен к буферу, а затем добавлен в планшет. Раствор глобальных титров клеток добавляли в соотношении 1: 1 к объему среды в лунках. Планшет встряхивали для смешивания раствора со средой, а затем инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.После этого люминесценцию считывали с помощью гибридного многомодового микропланшетного ридера Synergy h5 (100 Tigan Street Winooski, VT, USA).

Приготовление клеточного лизата

Лизаты клеток были приготовлены на льду. Среду отсасывали из ячеек. Клетки промывали PBS, затем PBS отсасывали. Затем к клеткам добавляли буфер для лизиса (RIPA) с 5 мМ EDTA, 1 × ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы. 150 мкл буфера для лизиса добавляли в 10-сантиметровую пластину с клетками. Клетки соскребали с планшета скребком для клеток.Раствор помещали в пробирку Эппендорфа и инкубировали на льду в течение 30 мин с встряхиванием каждые 10 мин. Затем клеточный лизат центрифугировали при 4 ° C в течение 30 мин при 20000 × g. Супернатант собирали в пробирку Эппендорфа и хранили при -80 ° C.

Вестерн-блоттинг

Вкратце, лизаты клеток (15 мкг белка на лунку) разделяли 10% гелем SDS-PAGE, белки затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану, после чего блоты блокировали 5% обезжиренным молоком в буфере TBST.Блоты трижды промывали в буфере TBST, а затем блоты зондировали с использованием мышиного моноклонального αSMA (анти-αSMA, 1: 1000; клон 1A4; ebioscience, Sandiego CA, США), мышиного моноклонального виментина (анти-виментин, 1: 1000). ; Thermofisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). В качестве контроля загрузки использовали GAPDH (анти-GAPDH, 1: 5000, Cell Signaling, Danvers MA, США). Первичные антитела инкубируют в течение ночи при 4 ° C. Интенсивность полос детектируют, нормализуют и количественно определяют с помощью программного обеспечения Chemidoc и Image Lab 5.0 (Bio-Rad Laboratories).

Статистический анализ

Статистические сравнения между группами, получавшими AGWJ, и контрольными группами были выполнены с использованием двустороннего критерия Стьюдента t для анализа. Значение P <0,05 считалось статистически значимым. Данные были графически представлены как среднее значение целевой группы ± 95% доверительный интервал. Для анализа данных использовался Microsoft Excel.

Результаты

Лечение AGWJ улучшает заживление ран у мышей

Чтобы проверить, есть ли какие-либо положительные эффекты AGWJ на ускорение заживления ран in vivo , мы провели два исследования заживления ран на мышиной модели.Мы провели 5-дневное и 7-дневное точечное исследование. Длина раны и, следовательно, закрытие раны были проанализированы с использованием окрашивания трихомами на иссеченных ранах после окончания обоих исследований. Результаты показали, что через 5 дней, по сравнению с контрольным лечением (рис. 1A), лечение AGWJ привело к значительному уменьшению размера раны (рис. 1B). Длину раны измеряли от границы неповрежденной кожи на правой стороне через ложе раны до неповрежденной кожи на левой стороне раны. Были измерены все раны, и средняя длина ран для контрольных обработанных ран составила 4184.09 мкм ± 358,18, а для ран, обработанных AGWJ, средняя длина раны составляла 2673,53 мкм ± 379,02. * P <0,05 (рисунок 1C). Для 7-дневной временной точки лечения результаты также показывают резкое уменьшение длины раны при лечении AGWJ по сравнению с контролем, однако данные не показывают значимости (рисунки 1D – F). Эти результаты показывают, что лечение AGWJ способствует усиленному заживлению ран, наблюдаемому за счет более короткой длины раны и, следовательно, более быстрого закрытия раны на стадии пролиферации заживления кожи у молодых мышей.

Рисунок 1. Влияние лечения AGWJ на заживление ран in vivo через 5 дней и 7 дней . Длину раны оценивали с помощью окрашивания трихромом. (A) Репрезентативное изображение, показывающее длину контрольной раны после 5-дневного исследования заживления ран. (B) Типичная рана, обработанная AGWJ, показывает заживление в конце 5 дней. (C) Количественный анализ результатов окрашивания трихромом, сравнивающий длину раны между контрольной и обработанной AGWJ раной. (D) Типичное изображение, показывающее длину контрольной раны после 7-дневного исследования заживления ран. (E) Типичная рана, обработанная AGWJ, показывает заживление в конце 7 дней. (F) Количественный анализ результатов окрашивания трихромом, сравнивающий длину раны между контрольной и обработанной AGWJ раной. Представленные данные представляют собой среднее значение ± 95% доверительный интервал. P <0,05 по сравнению с контролем. N = 3 для AGWJ и N = 3 для контрольных мышей для 5-дневного исследования. N = 6 для контрольных мышей для 7-дневного исследования, N = 3 для обработанных мышей, каждый N представляет одно животное. Черная стрелка показывает границу раны и неповрежденной кожи. * Обозначает значимость p <0,05 по сравнению с контролем.

Обработка AGWJ не влияет на пролиферацию клеток или жизнеспособность фибробластов

В попытке установить механизм улучшения заживления ран, наблюдаемого у мышей после лечения ран с помощью AGWJ, мы стремились определить, влияет ли лечение AGWJ на пролиферацию клеток в ране.Чтобы исследовать это, мы количественно определили общее количество клеток в центре раневого ложа в поле высокой мощности (20-кратное увеличение). Результаты не показали значительной разницы в количестве клеток между контрольными обработанными (дополнительная фигура 2A) и обработанными AGWJ ранами (дополнительная фигура 2B) для 5-дневной временной точки (дополнительная фигура 2C). Для 7-дневной временной точки результаты, наблюдаемые для контрольных обработанных ран (дополнительная фигура 2D) и обработанных AGWJ ран (дополнительная фигура 2E), также не показали значительной разницы (дополнительная фигура 2F), предполагая, что AGWJ не влияет на клеточность ран.Несколько факторов влияют на клеточность тканей, включая скорость пролиферации. Сначала мы измерили жизнеспособность клеток in vitro в человеческих фибробластах, подвергая клетки воздействию AGWJ и контрольной среды. Результаты не показали значительной разницы в жизнеспособности между клетками, обработанными AGWJ и контрольными клетками (дополнительная фигура 3). Чтобы проверить состояние пролиферации клеток в грануляционной ткани in vivo , мы также проанализировали экспрессию BrdU с помощью анализа IHC. Положительная экспрессия белка BrdU количественно определялась как коричневое пятно в ядре фибробластов в ложе раны в 5 и 7 дневные моменты времени.Хотя количество BrdU-положительных клеток в группе, обработанной AGWJ (фиг. 2B), было немного ниже, чем в контрольной группе (фиг. 2A) через 5 дней после ранения (фиг. 2C), и было выше, чем в контроле через 7 дней после ранения (фиг. 2F). ), разница в результатах между AGWJ (Рисунки 2B, E) и контролем (Рисунки 2A, D) не была значительной. Таким образом, в совокупности наши результаты предполагают, что AGWJ не усиливает заживление ран за счет модуляции пролиферации клеток в раневом ложе.

Рисунок 2.BrdU-анализ пролиферации клеток в ложе раны после обработки AGWJ по сравнению с контролем. (A) Типичное изображение IHC, отображающее BrdU-положительные клетки в ложе раны контрольной обработанной раны через 5 дней. (B) BrdU-положительные клетки в ране, обработанной AGWJ, через 5 дней. (C) Количественное определение BrdU-положительных клеток в ложе раны после обработки AGWJ в течение 5 дней по сравнению с контрольной обработкой. График показывает процент BrdU-положительных клеток на поле с высоким увеличением (40 ×). (D) Репрезентативное изображение IHC, отображающее BrdU-положительные клетки в раневом ложе контрольной обработанной раны после 7-дневной временной точки. (E) BrdU-положительные клетки в ране, обработанной AGWJ, через 7 дней. (F) Количественное определение BrdU-положительных клеток в ложе раны после обработки AGWJ в течение 7 дней по сравнению с контрольной обработкой. График показывает процент BrdU-положительных клеток на поле с высоким увеличением (40 ×). Представленные данные представляют собой среднее значение ± 95% доверительный интервал. Для 7-дневного исследования N = 7 для мышей, получавших AGWJ, и N = 6 для контрольных мышей.Для 5-дневного исследования N = 3 для AGWJ и N = 3 для контрольных мышей. Каждый N представляет одно животное. Черные стрелки указывают на BrdU-положительные коричневые окрашенные ядра, а стрелки указывают на BrdU-отрицательные синие ядра.

В отличие от пролиферации, AGWJ усиливает миграцию фибробластов

Поскольку наш анализ раны in vivo продемонстрировал, что усиление заживления ран после лечения AGWJ не было связано с пролиферацией клеток в ложе раны, мы исследовали возможность усиленной миграции клеток, вызывающей более быстрое закрытие раны.Клеточная миграция является важным этапом при заживлении кожи (Amini-Nik et al., 2011, 2014). Чтобы проверить влияние обработки AGWJ на движение клеток при заживлении ран, миграцию клеток анализировали in vitro путем проведения анализа царапин. Использовались человеческие фибробласты, поскольку они являются основным клеточным компонентом дермы. Две горизонтальные царапины делали в лунке сливающихся фибробластов и добавляли либо контрольную среду, либо обработку AGWJ. Изображения были сделаны при t = 0 часов и t = 24 часа (рис. 3A).Через 24 часа мы количественно оценили инфильтрацию клеток в зоне царапин и наблюдали значительно большее количество клеток в зоне царапин для царапин, обработанных AGWJ, по сравнению с контролем. Для контрольных обработанных клеток в среднем 58,85 ± 22,95 фибробластов мигрировали в зону царапины, для AGWJ в среднем 117,33 ± 22,86 клеток мигрировали в царапину ( n = 3 контроля и n = 3 AGWJ, ** p <0,01) (Рисунок 3B). Следовательно, как показано на Фигуре 3A, обработанные AGWJ фибробластные клетки начали закрывать рану через 24 часа, тогда как контрольные клетки имели минимальную миграцию в зону царапины.Таким образом, обработка фибробластов AGWJ способствует их способности к миграции. Мы также наблюдали, что обработка AGWJ изменяет морфологию клеток фибробластов. Через 24 часа фибробласты, по-видимому, приобрели более удлиненный фенотип по сравнению с клетками, обработанными контрольной средой.

Фигура 3. Анализ миграции клеток in vitro для фибробластов. (A) На верхней панели показаны репрезентативные изображения царапины, обработанной контрольным образцом, в момент времени 0 ч по сравнению с царапиной, обработанной контрольной группой, через 24 ч.На нижней панели отображается анализ царапин фибробластов с обработкой AGWJ в момент времени 0 ч, а затем визуализируется зона царапин после инкубации с AGWJ в течение 24 ч. (B) На графике показано среднее количество клеток фибробластов, которые проникли в зону царапины через 24 часа для клеток, обработанных контрольной средой, по сравнению с клетками, обработанными AGWJ. ** Обозначает значимость p <0,01 по сравнению с контролем.

Лечение

AGWJ способствует развитию миофибробластного фенотипа

In vitro

Поскольку мы обнаружили меньший размер раны в ранах, обработанных AGWJ in vivo и наши результаты in vitro продемонстрировали усиленную миграцию клеток после обработки AGWJ, наши результаты подтверждают мнение о том, что AGWJ увеличивает миграцию клеток.И эта улучшенная миграция клеток является основным механизмом для более быстрого заживления ран. Более того, как уже упоминалось, мы наблюдали изменение фенотипа клеток, обработанных AGWJ in vitro , и меньший размер раны in vivo , оба из которых предполагают промио-фибробластный фенотип из-за лечения AGWJ, имевшего место ранее, что привело к к более быстрому сокращению, что характерно для ускоренного заживления ран. Чтобы оценить этот in vitro , мы обработали фибробласты AGWJ или контрольной средой и наблюдали с помощью иммунофлуоресцентного анализа, что белок αSMA резко увеличивается в фибробластах после обработки AGWJ (фигура 4B) по сравнению с контрольными обработанными клетками (фигура 4A).Этот результат был подтвержден вестерн-блоттингом, который обнаружил резко более высокий уровень экспрессии белка αSMA в обработанных AGWJ фибробластах для двух разных образцов фибробластов человека (фиг. 4C). Денситометрия полосы вестерн-блоттинга для αSMA была нормализована к GAPDH, и количественная оценка показывает почти 8-кратное увеличение уровней белка αSMA после обработки AGWJ по сравнению с контрольной средой DMEM (фиг. 4D). Кроме того, нормальные человеческие фибробласты демонстрируют высокие уровни виментина, которые снижаются после обработки AGWJ в течение 24 часов, наблюдаемые в двух разных образцах человеческих фибробластов с помощью вестерн-блоттинга (дополнительная фигура 4).

Рис. 4. Обработка AGWJ способствует развитию миофибробластного фенотипа in vitro , обнаруженного посредством экспрессии αSMA. (A) Иммунофлуоресцентное изображение фибробластов, обработанных контрольной средой, по сравнению с (B) AGWJ фибробластов после 24 часов обработки. Синяя флуоресценция DAPI представляет собой ядро, а родамин красный представляет αSMA. (C) Вестерн-блот-анализ двух нормальных клеток фибробластов человека (Hu-Fibro), обработанных либо контрольной средой DMEM, либо обработкой AGWJ в течение 24 часов для анализа экспрессии белка αSMA.Контролем загрузки был белок GAPDH. (D) Денситометрический анализ вестерн-блоттинга. Экспрессия белка αSMA была нормализована до GAPDH.

AGWJ увеличивает дифференциацию фибробластов до миофибробластов в ложе раны

Поскольку мы обнаружили повышенный уровень αSMA в фибробластах in vitro , что является характеристикой миофибробластов, мы хотели исследовать, транслируется ли этот результат in vivo . Иммуногистохимический анализ αSMA в ранах, вырезанных из временных точек 5-го и 7-го дня, демонстрирует, что для 5-дневной временной точки; раны, обработанные AGWJ, экспрессируют более высокие уровни αSMA (фиг. 5B), тогда как контрольные раны экспрессируют очень мало или не экспрессируют αSMA (фиг. 5A).Неожиданно, напротив, для 7-дневной временной точки мы обнаружили, что в ложе ран как для лечения AGWJ (фиг. 5D), так и для контрольного лечения (фиг. 5C) наблюдались высокие уровни αSMA. Следовательно, похоже, что AGWJ ускоряет процесс заживления ран за счет более ранней дифференцировки фибробластов в миофибробласты, как это видно на 5-й день, и, следовательно, сокращает фазу пролиферации при заживлении кожных ран.

Фигура 5. Влияние обработки AGWJ на экспрессию αSMA в ложе раны in vivo .(A) Экспрессия αSMA в грануляционной ткани контрольных обработанных ран через 5 дней. (B) Экспрессия αSMA в грануляционной ткани ран, обработанных AGWJ, через 5 дней. (C) Экспрессия αSMA в грануляционной ткани контрольных обработанных ран через 7 дней. (D) Экспрессия αSMA в грануляционной ткани ран, обработанных AGWJ, через 7 дней.

Обсуждение

Существует значительное количество литературы, в которой исследуются положительные эффекты клеточной терапии с помощью WJ-MSC, отдельно или внутри каркаса (Zebardast et al., 2010; Азари и др., 2011; Шохара и др., 2012; Арно и др., 2014; Фонг и др., 2014; Рибейро и др., 2014; Sabapathy et al., 2014). Новые отчеты показывают многообещающую роль децеллюляризованных биологических матриц для восстановления тканей (Boccafoschi et al., 2015). Наша группа сообщила, что кондиционированная среда WJ-MSC оказывает положительное влияние на заживление ран у человека in vivo в иссеченных ранах на всю толщину кожи на модели мыши посредством паракринной передачи сигналов через несколько механизмов: повышающая регуляция экспрессии генов факторов заживления ран, такие как TGF-β2, HIF-1α и PAI-1, в дополнение к усилению пролиферации и миграции фибробластов кожи человека (Arno et al., 2014). Известно, что ниша или микроокружение стволовых клеток имеет решающее значение для поддержки МСК и что между клетками и окружающей средой происходит значительный перекрестный обмен и передача сигналов (Boccafoschi et al., 2015; Khodadi et al., 2016). Кроме того, в желе Уортона есть секрет стволовых клеток. Сообщается, что помимо того, что он является резервуаром МСК, Wharton’s Jelly является отличным источником проангиогенных факторов и факторов, способствующих заживлению ран, таких как IGF-1, TGF-ß1, VEGF, PDGF, EGF, bFGF, HGF, IL. -6 и IL-8 (Sobolewski et al., 2005; Лю и др., 2012; Арно и др., 2014; Биазар, 2014; Эдвардс и др., 2014). Считается также, что эти факторы стимулируют клетки внутри Wharton’s Jelly производить большие количества компонентов ECM (Sobolewski et al., 2005). Поскольку AGWJ присутствует в нативной нише МСК и поддерживает эти стволовые клетки, помимо того, что он является источником факторов заживления ран, мы предположили, что AGWJ оказывает благотворное влияние на заживление кожных ран. Таким образом, мы выделили желе Wharton и нецеллюляризовали его (дополнительный рисунок 1).В пуповине неизвестно, способствует ли AGWJ поведению стволовых клеток и поддерживает эти МСК в их нише, или другие типы клеток вносят вклад в микроокружение и, следовательно, влияют на поведение стволовых клеток.

Результаты этого исследования установили, что AGWJ приводит к заживлению в более ранний момент времени на мышиной модели продемонстрировало значительное уменьшение длины раны после лечения AGWJ по сравнению с контрольным лечением через 5 дней. Мы выбрали 5 дней и 7 дней в качестве временных точек для этого исследования, потому что в модели на мышах 5-й день считается пиком фазы пролиферации, а 7-й день — началом фазы созревания раны при заживлении ран (Bielefeld et al., 2013). Несмотря на положительный эффект на заживление ран у молодых животных, о котором мы сообщаем здесь, еще предстоит определить, может ли этот эффект спасти недостаточное заживление, наблюдаемое у пожилых людей или пациентов с диабетом. Необходимы дополнительные исследования, чтобы изучить их влияние на несовершенную модель заживления кожи.

Мы также пытались понять механизм ускоренного заживления ран, исследуя несколько возможных механизмов, таких как жизнеспособность клеток, пролиферация и миграция клеток. Мы начали с исследования клеточности в ране, сделав подсчет клеток в грануляционной ткани в HPF, а также обнаружив пролиферацию клеток с помощью окрашивания ран BrdU.Результаты не показали какой-либо значимой разницы между AGWJ и контролями. Таким образом, наш анализ ран in vivo и предполагает, что усиление заживления ран после лечения AGWJ не было связано с увеличением количества клеток. Чтобы дополнительно охарактеризовать это наблюдение in vitro , мы выполнили анализ жизнеспособности с использованием AGWJ и обработки контрольной средой. Клеточная пролиферация может влиять на жизнеспособность клеток и, следовательно, на клеточность. Опять же, наши данные показали, что AGWJ не влияет на жизнеспособность фибробластов in vitro .Взятые вместе, этот набор данных устанавливает, что механизм действия AGWJ заключается не в увеличении пролиферации, жизнеспособности и клеточности клеток.

Затем мы исследовали возможность усиленной миграции клеток, вызывающей более быстрое закрытие раны. Подвижность и миграция клеток играют решающую роль во время заживления ран (Schneider et al., 2010; Amini-Nik et al., 2014). Действительно, наши результаты in vitro подтвердили, что AGWJ вызывает повышенную миграцию фибробластов. Более того, мы наблюдали изменение фенотипа клеток фибробластов, обработанных AGWJ, и меньший размер раны in vivo , оба из которых предполагают промио-фибробластный фенотип.ИГХ-анализ ран на αSMA показал повышенную экспрессию αSMA в грануляционной ткани через 5 дней по сравнению с контрольными обработанными ранами. Неожиданно для 7-дневной временной точки экспрессия αSMA в контрольных и обработанных AGWJ ранах оказалась одинаковой. Это предполагает, что AGWJ ускоряет фазу пролиферации при заживлении ран, вызывая более быструю дифференцировку фибробластов в миофибробласты, подтвержденную экспрессией αSMA. Контрольные раны проходят свой нормальный курс дифференциации и догоняют позже через 7 дней после ранения.Этот результат был подтвержден нашим анализом in vitro фибробластов после обработки AGWJ, который показал повышенную экспрессию белка αSMA по сравнению с контролем.

В этом отчете впервые показано, что AGWJ улучшает заживление ран, ускоряя фазу пролиферации заживления кожи, главным образом за счет увеличения миграции клеток и закрытия ран. Некоторые заболевания, в том числе раны у пациентов с диабетом и пожилых пациентов, связаны с замедленным заживлением ран, и AGWJ может быть лекарством для этой группы пациентов.Хотя мы обнаружили механизм через сигнальный путь TGF-бета для положительного эффекта AGWJ на заживление кожи, еще предстоит проверить, могут ли другие факторы способствовать этому наблюдению. Дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на дальнейшей характеристике AGWJ и поиске активных ингредиентов, особенно для компонентов сигнальных путей, которые играют важную роль во время заживления кожи, таких как Wnt / β-катенин, а также сигнальные пути TGF-β / Smad 2. (Amini Nik et al., 2007; Poon et al., 2009; Билефельд и др., 2011). Поскольку AGWJ усиливает заживление ран в основном за счет миграции клеток, а не за счет пролиферации клеток, он может быть идеальным средством для лечения недостаточного заживления кожи, связанного с недостаточной миграцией. Недавно мы сообщили, что у пожилых пациентов с ожогами наблюдается уменьшение пула стволовых клеток, недостаточная миграция МСК и измененная активация важных сигнальных путей для заживления кожи (Jeschke et al., 2015). Следовательно, поскольку наши данные предполагают, что AGWJ усиливает миграцию клеток, вызывает более раннюю дифференцировку фибробластов в миофибробласты и, следовательно, обеспечивает более раннее сокращение раны, это лечение может иметь значительные преимущества при заживлении ран, особенно для этой группы пациентов.

Экономия AGWJ

Результаты этого исследования демонстрируют открытие AGWJ, который является очень естественным и нишевым материалом стволовых клеток в пуповине с целью заживления кожных ран. Набираем примерно по 5 мл киселя с каждой пуповины. К этим 5 мл желе мы добавили 15 мл полной среды DMEM и повторно суспендировали желе так, чтобы у нас было всего 20 мл раствора. Для нашего исследования in vivo на мышах мы поместили 50 мкл раствора AGWJ, смешанного с 50 мкл матригеля (1: 1), на каждую рану, покрывая и усиливая 0.3 см. ² Площадь раны у животного. В совокупности каждая пуповина обеспечивает материал AGWJ приблизительно на 115 см ² области раны (дополнительный рисунок 5). В отличие от секретома МСК, для изоляции которого требуется оборудование, изоляция AGWJ требует минимального оборудования и может быть выполнена в любом учреждении в развивающихся странах.

В заключение, мы впервые демонстрируем, что AGWJ улучшает заживление ран, и устанавливаем механизм его роли в качестве потенциального терапевтического средства для недостаточного заживления кожных ран.Поскольку каждая пуповина обеспечивает приблизительно достаточное количество AGWJ, чтобы покрыть 115 см площади раны ² , ее легко изолировать, и она доступна во всем мире; пуповина AGWJ имеет далеко идущие преимущества для заживления ран не только в развитом мире, но и в развивающихся странах, где доступные и доступные средства для заживления ран являются критически необходимыми.

Взносы авторов

NB, MJ и SA внесли существенный вклад в концепцию и дизайн, сбор данных, анализ и интерпретацию данных для этого исследования.NB и SA отвечали за создание модели раны животного, и с помощью LM эти авторы отвечали за организацию, анализ и интерпретацию данных in vivo . NB выполнила экспериментов на культуре клеток и экспериментов in vitro. LM произвела слепой анализ данных. EH выполнила операции по получению пуповины для исследования. SA и NB участвовали в написании рукописи и внесении исправлений. Все авторы дали согласие на публикацию данной версии рукописи.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Г-жа Дженнифер Хе, г-жа Андреа Кайе Дату и финансирующие агентства Toronto Hydro and Medicine by Design-Seed грант (EMHSeed Award, 16 февраля 2016 г.).

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/article/10.3389/fphys.2017.00200/full#supplementary-material

Дополнительный рисунок 1. Децеллюляризация желе Уортона . Степень децеллюляризации желе Уортона оценивали с использованием ядер иммунофлуоресцентного окрашивания DAPI. На первой панели показан полный WJ до децеллюляризации с большим количеством клеток, на второй панели показан AGWJ без каких-либо клеток.

Дополнительный рисунок 2. Влияние лечения AGWJ на клеточность в ложе раны. (A) Анализ окраски трихома, используемый для количественного определения количества клеток в центре раны. (A) Репрезентативное изображение, показывающее клеточность в ложе раны после 5 дней контрольного лечения. (B) Изображение, показывающее клеточность ложа раны после обработки AGWJ через 5 дней. (C) Количественная оценка среднего числа клеток в раневом ложе, сравнивая контрольные обработанные раны с обработанными AGWJ ранами через 5 дней. (D) Типичное изображение, показывающее клеточность в ложе раны после 7 дней контрольного лечения. (E) Изображение, показывающее клеточность ложа раны после обработки AGWJ в течение 7 дней. (F) Количественная оценка среднего числа клеток в раневом ложе, сравнивая контрольные обработанные раны с обработанными AGWJ ранами после 7-дневного лечения. График показывает среднее количество клеток в ложе раны контроля по сравнению с мышами, обработанными AGWJ, при 20-кратном увеличении. Представленные данные представляют собой среднее значение ± 95% доверительный интервал. Для 7-дневного исследования N = 7 для мышей, получавших AGWJ, и N = 6 для контрольных мышей, каждое n представляет одно животное. Для 5-дневного исследования N = 3 для AGWJ и N = 3 для контрольных мышей.

Дополнительная фигура 3. AGWJ не влияет на жизнеспособность фибробластов in vitro . Количественный анализ жизнеспособности клеток после контроля и обработки AGWJ в течение 24 часов. Люминесценцию считывали с помощью гибридного многорежимного микропланшетного ридера Synergy h5.

Дополнительная фигура 4. Обработка AGWJ снижает экспрессию виментина в фибробластах . Вестерн-блоттинг двух нормальных клеток фибробластов человека (Hu-Fibro), обработанных либо контрольной средой DMEM, либо обработкой AGWJ в течение 24 часов.Контролем загрузки был белок GAPDH.

Дополнительный рисунок 5. Схема, иллюстрирующая процедуру изоляции AGWJ и последующее экономичное использование AGWJ в качестве средства для заживления ран .

Список литературы

Amini-Nik, S., Cambridge, E., Yu, W., Guo, A., Whetstone, H., Nadesan, P., et al. (2014). Адгезия и миграция миелоидных клеток, регулируемые β-катенином, определяют заживление ран. J. Clin. Инвестировать. 124, 2599–2610. DOI: 10.1172 / JCI62059

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Амини Ник, С., Эбрахим, Р. П., Ван Дам, К., Кассиман, Дж. Дж., И Теджпар, С. (2007). TGF-бета модулирует стабильность бета-катенина и передачу сигналов при мезенхимальной пролиферации. Exp. Cell Res. 313, 2887–2895. DOI: 10.1016 / j.yexcr.2007.05.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Амини-Ник, С., Глэнси, Д., Боймер, К., Ветстон, Х., Келлер, К., Алман, Б. и др. (2011). Клетки, экспрессирующие Pax7, способствуют заживлению кожных ран, регулируя размер рубца посредством процесса, опосредованного бета-катенином. Стволовые клетки 29, 1371–1379. DOI: 10.1002 / стержень.688

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Арно А. И., Амини-Ник С., Блит П. Х., Аль-Шехаб М., Белу К., Херер Э. и др. (2014). Влияние паракринной передачи сигналов мезенхимальных стволовых клеток человеческого желе Уортона на келоидные фибробласты. Stem Cells Пер. Med. 3, 299–307. DOI: 10.5966 / sctm.2013-0120

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Атье, Б.С., Иоаннович, Дж., Аль-Амм, К. А., и Эль-Муса, К. А. (2002). Ведение острых и хронических открытых ран: важность влажной среды для оптимального заживления ран. Curr. Pharm. Biotechnol. 3, 179–195. DOI: 10.2174 / 1389201023378283

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Азари О., Бабаи Х., Дерахшанфар А., Нематоллахи-Махани С. Н., Поурсахеби Р. и Мошрефи М. (2011). Влияние трансплантированных мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из желе Уортона пуповины коз, на заживление кожных ран; гистопатологическая оценка. Вет. Res. Commun. 35, 211–222. DOI: 10.1007 / s11259-011-9464-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Биазар, Э. (2014). Использование стволовых клеток пуповины и пуповинной крови для восстановления и регенерации тканей. Мнение эксперта. Биол. Ther. 14, 301–310. DOI: 10.1517 / 14712598.2014.867943

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Билефельд, К. А., Амини-Ник, С., и Алман, Б. А. (2013). Заживление кожных ран: задействование путей развития для регенерации. Cell. Мол. Life Sci. 70, 2059–2081. DOI: 10.1007 / s00018-012-1152-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Билефельд, К. А., Амини-Ник, С., Ветстон, Х., Пун, Р., Юн, А., Ван, Дж. И др. (2011). Фибронектин и бета-катенин действуют в регуляторной петле в дермальных фибробластах, модулируя заживление кожи. J. Biol. Chem. 286, 27687–27697. DOI: 10.1074 / jbc.M111.261677

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Боккафоски, Ф., Ботта, М., Фусаро, Л., Копес, Ф., Рамелла, М., и Каннас, М. (2015). Децеллюляризованные биологические матрицы: интересный подход к восстановлению и регенерации сердечно-сосудистой ткани. J. Tissue Eng. Regen. Med. DOI: 10.1002 / term.2103. [Epub перед печатью].

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брански, Л. К., Гауглиц, Г. Г., Херндон, Д. Н., и Йешке, М. Г. (2009). Обзор генной терапии и терапии стволовыми клетками при заживлении кожных ран. Бернс 35, 171–180.DOI: 10.1016 / j.burns.2008.03.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Du, T., Zou, X., Cheng, J., Wu, S., Zhong, L., Ju, G., et al. (2013). Желеобразные мезенхимальные стромальные клетки человека Wharton уменьшают почечный фиброз за счет индукции синтеза нативного и чужеродного фактора роста гепатоцитов в поврежденных эпителиальных клетках канальцев. Stem Cell Res. Ther 4:59. DOI: 10.1186 / scrt215

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эдмондсон, С.Р., Тумигер, С. П., Вертер, Г. А., и Райт, К. Дж. (2003). Эпидермальный гомеостаз: роль систем гормона роста и инсулиноподобных факторов роста. Endocr. Rev. 24, 737–764. DOI: 10.1210 / er.2002-0021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эдвардс, С.С., Завала, Г., Прието, К.П., Эллиотт, М., Мартинес, С., Эганья, Дж. Т. и др. (2014). Функциональный анализ показывает ангиогенный потенциал мезенхимальных стволовых клеток человека из желе Уортона в регенерации дермы. Ангиогенез 17, 851–866. DOI: 10.1007 / s10456-014-9432-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фонг, К. Ю., Там, К., Чейятрайвендран, С., Ган, С. У., Готаман, К., Армугам, А., и др. (2014). Стволовые клетки студня Human Wharton и его кондиционированная среда ускоряют заживление эксцизионных и диабетических ран. J. Cell. Biochem. 115, 290–302. DOI: 10.1002 / jcb.24661

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йешке, М.Г., Пацурис, Д., Станойчич, М., Абдуллахи, А., Реху, С., Пинто, Р. и др. (2015). Патофизиологический ответ на ожоги у пожилых людей. EBioMedicine 2, 1536–1548. DOI: 10.1016 / j.ebiom.2015.07.040

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йешке М. Г., Пинто Р., Костфорд С. Р. и Амини-Ник С. (2016). Пороговый возраст и размер ожога связаны с плохими исходами у пожилых людей после ожоговой травмы. Бернс 42, 276–281. DOI: 10.1016 / j.ожоги.2015.12.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ходади, Э., Шахраби, С., Шахджахани, М., Азанде, С., и Саки, Н. (2016). Роль фактора стволовых клеток в плацентарной нише. Cell Tissue Res. 366, 523–531. DOI: 10.1007 / s00441-016-2429-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лю С., Юань М., Хоу К., Чжан Л., Чжэн Х., Чжао Б. и др. (2012). Иммунная характеристика мезенхимальных стволовых клеток в желе Уортона пуповины человека и производных хрящевых клетках. Cell. Иммунол. 278, 35–44. DOI: 10.1016 / j.cellimm.2012.06.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Марфия Г., Навоне С. Э., Ди Вито К., Уги Н., Табано С., Миоццо М. и др. (2015). Мезенхимальные стволовые клетки: потенциал для терапии и лечения хронических незаживающих кожных ран. Органогенез 11, 183–206. DOI: 10.1080 / 15476278.2015.1126018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маркесон, Д., Плит, Дж. М., Шарп, Дж. Р., Харрис, А. Л., Сейфалиан, А. М., и Ватт, С. М. (2015). Рубцы, стволовые клетки, каркасы и восстановление кожи. J. Tissue Eng. Regen. Med. 9, 649–668. DOI: 10.1002 / срок.1841

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

МакЭлриви, К. Д., Ирвин, А. И., Эннис, К. Т., и Маклин, В. Х. (1991). Выделение, культивирование и характеристика фибробластоподобных клеток, полученных из желейной части Уортона пуповины человека. Biochem. Soc. Сделка. 19: 29с. DOI: 10.1042 / bst019029s

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Мудли, Ю., Атиенца, Д., Мануэльпиллаи, У., Самуэль, К. С., Чонге, Дж., Иланчеран, С., и др. (2009). Мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека уменьшают фиброз при повреждении легких, вызванном блеомицином. Am. J. Pathol. 175, 303–313. DOI: 10.2353 / ajpath.2009.080629

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Николай, М.Н., Йешке, М. Г., и Амини-Ник, С. (2016a). Клеточный двухслойный пуллулан-желатиновый гидрогель для регенерации кожи. Tissue Eng. Часть A 22, 754–764. DOI: 10.1089 / ten.tea.2015.0536

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нунан Р., Хардинг К. Г. и Мартин П. (2014). Клинические проблемы хронических ран: поиск оптимальной модели на животных, чтобы повторить их сложность. Dis. Модели Mechan. 7, 1205–1213. DOI: 10,1242 / дмм.016782

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пирджали Т., Азарпира Н., Аятоллахи М., Агдаи М. Х., Герамизаде Б. и Талаи Т. (2013). Выделение и характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, полученных из студня Уортона из пуповины человека и амниотической мембраны. Внутр. J. Трансплантация органов. Med. 4, 111–116.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Пун, Р., Ник, С. А., Ан, Дж., Слэйд, Л., и Алман, Б. А.(2009). Бета-катенин и трансформирующий фактор роста бета играют разные роли, регулируя подвижность фибробластных клеток и индуцируя сокращение коллагеновой решетки. BMC Cell Biol. 10:38. DOI: 10.1186 / 1471-2121-10-38

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рибейро, Дж., Перейра, Т., Аморим, И., Касейро, А. Р., Лопес, М. А., Лима, Дж. И др. (2014). Клеточная терапия человеческими МСК, выделенными из желе Уортона пуповины, связанного с ПВС-мембраной, при лечении хронических кожных ран. Внутр. J. Med. Sci. 11, 979–987. DOI: 10.7150 / ijms.9139

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сабапати, В., Сундарам, Б., В. М. С., Манкужи, П., и Кумар, С. (2014). Пластичность мезенхимальных стволовых клеток Human Wharton’s Jelly увеличивает заживление ран на коже без рубцов с ростом волос. PLoS ONE 9: E 93726. doi: 10.1371 / journal.pone.0093726

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шнайдер, Л., Каммер, М., Леман, Дж., Нильсен, С. К., Герра, К. Ф., Веланд, И. Р. и др. (2010). Направленная миграция клеток и хемотаксис в ответе заживления ран на PDGF-AA координируются первичными ресничками фибробластов. Cellular Physiol. Biochem. 25, 279–292. DOI: 10.1159 / 000276562

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шалитин Н., Шлезингер Х., Леви М. Дж., Кесслер Э. и Кесслер-Исексон Г. (2003). Экспрессия усилителя проколлагеновой С-протеиназы в культивируемых фибробластах сердца крысы: доказательства совместной регуляции с коллагеном I типа. J. Cell. Biochem. 90, 397–407. DOI: 10.1002 / jcb.10646

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шохара Р., Ямамото А., Такикава С., Ивасе А., Хиби Х., Киккава Ф. и др. (2012). Мезенхимные стромальные клетки пуповины человека Желе Уортона ускоряют заживление ран за счет паракринных механизмов. Цитотерапия 14, 1171–1181. DOI: 10.3109 / 14653249.2012.706705

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Соболевский, К., Малковски А., Банковски Э. и Яворски С. (2005). Желе Уортона как резервуар пептидных факторов роста. Плацента 26, 747–752. DOI: 10.1016 / j.placenta.2004.10.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Валаччи, Г., Занарди, И., Стикоцци, К., Боччи, В., и Травальи, В. (2012). Новые темы по заживлению кожных ран. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1259, 136–144. DOI: 10.1111 / j.1749-6632.2012.06636.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ю., С., Wang, F., Jin, C., Huang, X., Miller, D. L., Basilico, C., et al. (2003). Роль фактора роста фибробластов 1 и 2 типа в повреждении печени и фиброгенезе, вызванном тетрахлорметаном. Am. J. Pathol. 163, 1653–1662. DOI: 10.1016 / S0002-9440 (10) 63522-5

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зебардаст Н., Ликориш Д. и Дэвис Дж. Э. (2010). Периваскулярные клетки пуповины человека (HUCPVC): источник мезенхимальных клеток для заживления кожных ран. Органогенез 6, 197–203. DOI: 10.4161 / org.6.4.12393

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хронические раны, заживающие стволовыми клетками пуповины

Мы можем скоро изменить то, как мы думаем о ранах и способах их заживления, благодаря исследованиям с использованием стволовых клеток пуповины для лечения хронических ран.

Банки пуповинной крови стали привычным вариантом для молодых родителей, желающих защитить свою семью от таких заболеваний, как лейкемия, серповидноклеточная анемия и лимфома.Однако пуповинная кровь — не единственный источник стволовых клеток новорожденных.

Biovault Family хранит ткань пуповины, а также стволовые клетки пуповинной крови, потому что пуповина сама по себе является богатым источником МСК: мезенхимальных стволовых клеток, ответственных за рост и восстановление тканей организма, таких как мышцы, кости и сухожилия.

Ученые теперь начинают использовать МСК для укрепления иммунной системы, регенерации поврежденных тканей и лечения или даже предотвращения болезней. Теперь группа ученых из Техаса использовала пуповинную ткань для улучшения заживления ран .

Что такое хроническая рана?

Хроническая рана — это рана, которая не заживает в течение примерно трех месяцев, но остается в одной из фаз заживления ран. ^{Хронические раны могут никогда не зажить, вызывая у пациентов эмоциональный и физический стресс и оказывая давление на наши медицинские услуги.}

Хронические раны имеют ряд причин, включая плохое кровообращение, системные заболевания, пожилой возраст и повторные травмы. До сих пор лечение, как правило, ограничивалось длительным использованием антибиотиков и, при необходимости, кожными трансплантатами.

Стволовые клетки и раны

Стволовые клетки в ткани пуповины молодые, здоровые и могут храниться в криогенных условиях в течение десятилетий. Сочетание этих свойств означает, что они очень ценны с терапевтической точки зрения.

Было показано, что стволовые клетки пуповинной крови приводят к меньшему количеству случаев реакции «трансплантат против хозяина», поскольку молодые клетки особенно податливы и адаптируются.

Важно отметить отсутствие отрицательного воздействия стволовых клеток пуповины на младенца-донора.Пуповинную ткань можно собирать и хранить после того, как будут удовлетворены потребности матери и ребенка, что является значительным преимуществом для сбора стволовых клеток из костного мозга.

Лечение

Врачи клиники в Темпле, штат Техас, обследовали 57 пациентов с 64 отдельными ранами. Само лечение простое: каждую рану очищают от мертвых, поврежденных или инфицированных тканей, прежде чем закрепить образец ткани пуповины влажной марлей.

Обнадеживающие результаты для пациентов и медицинских услуг

Для многих пациентов этот процесс повторялся еженедельно.После завершения цикла лечения команда из Техаса обнаружила впечатляющие результаты: 51 рана — почти 80 процентов от общего числа — зажила чуть менее чем за четыре недели. Этот общий показатель заживления ран в 79,7% намного выше, чем любой опубликованный стандарт лечения ран (примерно 24%), и подтвердил гипотезу ученых о том, что применение трансплантата ткани пуповины может улучшить заживление хронических ран. .

Лечение ткани пуповины, вероятно, будет менее затратным, чем традиционные методы лечения.В США лечение хронических ран оценивается более чем в 50 миллиардов долларов в год. Помимо затрат, связанных с медицинскими вмешательствами, такими как антибиотики и кожные трансплантаты, отсутствие заживления влияет на трудоспособность пациента, что в конечном итоге приводит как к увеличению медицинских, так и социально-экономических затрат.

Клиническое использование ткани пуповины для лечения хронических ран

Врачи уже начали использовать образцы ткани пуповины для лечения ран. Доктор Эндрю Райс из Foot Surgeons округа Фэрфилд объяснил, как он лечил язвы стопы пациента с диабетом с помощью пуповинной ткани.Используя эту богатую стволовыми клетками ткань, доктор Райс смогла сократить режим ухода за раной одного пациента с шести месяцев до пяти недель. Райс добавил, что, по его мнению, использование пуповинных клеток на ранах также может помочь гарантировать, что эти области не станут поврежденными или уязвимыми после первого заживления.

Источники

Раны: Официальный журнал, 2016; 28 (7): 217-225

Википедия: Хронические раны

Бакалавр (с отличием) по микробиологии

Главный исполнительный директор | Семья Biovault

Генеральный директор компании Biovault Кейт Снеддон присоединилась к Biovault в июле 2009 года и стала генеральным директором в 2016 году.Как специалист в области здравоохранения, она работала микробиологом и руководителем в GSK более 10 лет. Ее опыт в хранении пуповинной крови был отмечен наградами, публикациями в Parliamentary Review и Parents Guide to Cord Blood, а также вкладом в исследования с UCL и другими.

Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека способствует заживлению кожных ран у сильно обгоревших крыс

Абстрактные

Фон

Сильные ожоги — частая травма, приводящая к смертельному исходу.Ключевым этапом тяжелой ожоговой терапии является скорейшее заживление ран, и отчеты показывают, что терапия мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) способствует облегчению заживления ран. В этом исследовании мы исследовали влияние МСК пуповины человека (hUC-МСК) на заживление ран на крысиной модели тяжелого ожога и его потенциальный механизм.

Методы

взрослых крыс-самцов линии Wistar были случайным образом разделены на hUC-MSC с имитацией, ожогом и ожоговой трансплантацией. Меченные GFP hUC-MSC или PBS внутривенно вводили соответствующим группам.Скорость закрытия раны оценивалась Image Pro Plus. GFP-меченные hUC-MSC отслеживали с помощью in vivo, биолюминесцентной визуализации (BLI), а специфическую для человека экспрессию ДНК в ранах детектировали с помощью ПЦР. Воспалительные клетки, нейтрофилы, макрофаги, капилляры и коллаген I / III типов в ранах оценивали гистохимическим окрашиванием. Кровоток в ране оценивали с помощью лазерного доплеровского измерителя кровотока. Уровни провоспалительных и противовоспалительных факторов, VEGF, коллагена I / III типов в ранах анализировали с помощью ELISA.

Результаты

Мы обнаружили, что заживление ран было значительно ускорено в группе терапии hUC-MSC. HUC-MSC мигрировали в рану и заметно снижали количество инфильтрированных воспалительных клеток и уровни IL-1, IL-6, TNF-α и повышали уровни IL-10 и TSG-6 в ранах. Кроме того, неоваскуляризация и уровни VEGF в ранах в группе терапии hUC-MSC были заметно выше, чем в других контрольных группах. Соотношение типов коллагена I и III в группе терапии hUC-MSC было заметно выше, чем в группе ожогов в указанное время после трансплантации.

Заключение

Исследование предполагает, что трансплантация hUC-MSC может эффективно улучшить заживление ран на модели крыс с тяжелыми ожогами. Более того, эти данные могут стать теоретической основой для дальнейшего клинического применения hUC-MSC в ожоговых областях.

Образец цитирования: Liu L, Yu Y, Hou Y, Chai J, Duan H, Chu W, et al. (2014) Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека способствует заживлению кожных ран у сильно обожженных крыс. PLoS ONE 9 (2):
e88348.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088348

Редактор: Димас Тадеу Ковас, Университет Сан-Паулу — Фармакопея США, Бразилия

Поступила: 29 сентября 2013 г .; Одобрена: 6 января 2014 г .; Опубликован: 20 февраля 2014 г.

Авторские права: © 2014 Liu et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81372052), Общим финансовым грантом Китайского фонда постдокторантуры (2013M532200) и Первой дочерней больницей Китайского фонда научных исследований больниц общего профиля. (QN201207). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Тяжелые ожоги — одно из самых опасных хирургических вмешательств. Ключевым этапом спасения тяжелых ожоговых пациентов является как можно более раннее закрытие ран [1]. Однако аутогенные источники кожи серьезно дефицитны, а источники ксеногенной кожи были ограничены после выполнения Регламента трансплантации человеческих органов. Между тем, использование ксеногенной свиной кожи обычно подвержено реакциям отторжения антигена и риску инфицирования. Кроме того, биоинженерные заменители кожи все еще находятся на стадии экспериментов.Следовательно, необходимы новые и эффективные методы лечения для ускорения заживления ран у пациентов с тяжелыми ожогами.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) происходят из стромы, которую можно выделить из множества тканей человека, таких как костный мозг, жировая ткань, скелетные мышцы, синовиальная оболочка, десна, околоплодные воды, пуповинная кровь и пуповина [2], [2] 3]. МСК участвуют в регенерации многих поврежденных тканей, таких как легкие, почки и спинной мозг [4], [5], [6], [7], [8]. По сравнению с другими исходными МСК, преимущества МСК пуповины человека (hUC-МСК) заключаются в коротком времени амплификации, высокой скорости пролиферации, более низкой иммуногенности, более высокой безопасности, численности и удобстве [3], [9], [10].Сообщалось, что hUC-MSC способствуют функциональному восстановлению пациентов с лучевыми ожогами [11]. Однако мало что известно о hUC-MSC при лечении тяжелых термических ожогов.

Предыдущее исследование показывает, что МСК рекрутируются в раны и вносят вклад в заживление ран за счет трансдифференцировки во множественные типы кожных клеток [12]. Однако недавние исследования показали, что паракринная передача сигналов МСК является основным механизмом, определяющим положительные эффекты МСК в ответ на повреждение [13], [14].Таким образом, цель настоящего исследования — оценить влияние hUC-MSC на заживление ран при тяжелых ожогах и его возможные механизмы.

Материалы и методы

Уход за животными

Все исследования проводились в соответствии с процедурами, соответствующими Международным руководящим принципам биомедицинских исследований с участием животных, выпущенным Советом международных организаций медицинских наук (CIOMS.), И были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Первой больнице, аффилированной с PLA. Главная больница.Шестинедельных крыс-самцов линии Вистар (180–220 г) анестезировали внутрибрюшинным введением 300 мг / кг авертина (20 мг / мл) (2,2,2-трибромэтанол, Sigma, США) [15]. В конце эксперимента всех крыс умерщвляли передозировкой 10% хлоралгидрата.

Животная модель сильного ожога

126 взрослых крыс-самцов линии Wistar были случайным образом разделены на 3 группы (n = 42): имитация, ожоговая трансплантация и ожоговая трансплантация hUC-MSC. Каждая группа была разделена поровну на семь подгрупп по шесть крыс в соответствии с периодом эвтаназии через 0, 1, 2, 3, 6, 8, 11 недель после трансплантации клеток.Была подготовлена ​​модель 30% TBSA и ожога на всю толщину; после анестезии крыс внутрибрюшинной инъекцией авертина (300 мг / кг) волосы на спине были полностью удалены, сначала машинкой для стрижки, а затем нанесением депиляционного крема Veet. Затем заднюю часть этих крыс помещали в горячую воду (94 ° C) на 12 с, что вызывало 30% TBSA с ожогом на всю толщину [15]. Для предотвращения шока была произведена немедленная инъекция сбалансированного солевого раствора (40 мг / кг). Затем рану на спине обрабатывали 1% -ной настойкой йода и держали в сухом состоянии, чтобы предотвратить инфекцию.Крыс в имитационной группе помещали в воду при 37 ° C на 12 с, и другие процессы были такими же, как те, что применялись к обожженным крысам. Раны оставляли открытыми, и животных умерщвляли в определенные моменты времени после трансплантации.

Выделение, культивирование и маркировка hUC-MSC

hUC-МСК были выделены из 3 доношенных здоровых плодов, рожденных посредством кесарева сечения (срок беременности 39–40 недель), размноженных in vitro и охарактеризованных, как описано ранее [16].hUC-МСК из пассажей 3-8 использовали для всех экспериментов. За два дня до трансплантации hUC-MSC метили зеленым флуоресцентным белком (GFP) с использованием лентивирусной стратегии. Положительную долю GFP-меченных hUC-MSC оценивали с помощью проточной цитометрии [17].

Внутривенное введение меченных GFP hUC-MSC

Взрослых крыс-самцов случайным образом разделили на 3 группы. Крысам из группы hUC-MSC с трансплантированным ожогом были сделаны инъекции в хвостовую вену 5 × 10 ⁶ GFP-меченных hUC-MSC на 3 день после ожога.Крысы из других групп одновременно получали инъекцию PBS в хвостовую вену. Все крысы в ​​каждой группе прошли клиническую оценку.

Сбор и обнаружение образцов

На неделях 0, 1, 2, 3, 6, 8 и 11 после трансплантации hUC-MSC вся рана с краем 0,5 см была осторожно удалена, промыта в PBS. Затем каждый образец раны был разделен на две части по наименее заживающей части. Один кусок раны хранили в жидком азоте для будущего молекулярного детекции или анализа ELISA, а другой кусок фиксировали в 4% параформальдегиде для гистологического исследования.

Захват изображений и анализ

меченных GFP hUC-MSC применяли к сильно обожженным крысам для определения характера миграции hUC-MSC in vivo с использованием биолюминесцентной визуализации (BLI, Caliper Life Sciences Inc., MA, США). Для оценки развития тяжелых ожоговых ран были получены изображения ран, а время заживления и скорость заживления ран были оценены в определенные моменты времени после трансплантации. Остаточная площадь раны (<1%) считалась полным заживлением раны.Площадь раны измеряли фотографически каждую неделю после трансплантации hUC-MSC, и скорость закрытия раны рассчитывалась следующим образом: Скорость закрытия раны (%) = [(исходная площадь раны - площадь раны в определенные моменты времени) / исходная площадь раны] × 100%. Количественные измерения площади раны оценивали с помощью программного обеспечения для анализа изображений Image Pro Plus 5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Анализ ДНК человека

Кожные раны крыс в 3 группах в определенные моменты времени после инъекции hUC-MSC собирали, промывали PBS и переваривали с использованием протеиназы K.Затем ДНК каждого образца экстрагировали путем очистки фенол / хлороформ и осаждения изопропанолом. Присутствие специфической ДНК человека было обнаружено с помощью ПЦР-амплификации фрагмента длиной 479 п.н. очень повторяющейся последовательности α-сателлитной ДНК центромерной области хромосомы 17 человека с праймерами, модифицированными в соответствии с Беккером (5′-GGG ATA ATT TCA GCT GAC TAA ACA G-3 ‘; 5′-AAA CGT CCA CTT GCA GTT CTA G-3’) [18]. 40 циклов включали денатурацию в течение 30 с при 95 ° C, отжиг в течение 30 с при 58 ° C и удлинение в течение 40 с при 72 ° C.Продукт ПЦР детектировали с помощью агарозного геля.

Гистологические анализы

После фиксации 4% параформальдегидом в течение 24 часов при комнатной температуре образцы заливали парафином и делали срезы в плоскости, перпендикулярной разрезу. Были приготовлены срезы толщиной пять микрометров, депарафинизированы в диметилбензоле и регидратированы. Препаративные срезы окрашивали H&E в соответствии со стандартными процедурами. Другие срезы инкубировали со специфическими антителами (моноклональные мышиные антитела против крысиного c-ANCA, ED-1, CD31, vWF, коллагена типа I или коллагена типа III; Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния) с последующей инкубацией с соответствующими вторичными антитело и комплекс PAP (пероксидаза-антипероксидаза) и воздействие с использованием DAB (3,3′-диаминобензидина).Воспалительные клетки, c-ANCA + и ED-1 + клетки, капилляры и коллаген типов I и III в ранах подсчитывались в 5 случайно выбранных полях каждого слайда опытным и независимым ученым-клеточником слепым методом.

Лазерная допплерография кровотока (ЛДФ)

Изменения микроциркуляции в кожных ранах в определенные моменты времени после трансплантации оценивали с помощью LDF (Periflux 5000; зонд 404, Perimed, Швеция) [19]. LDF был измерен в соответствии с инструкциями в буклете со спецификациями продукта, предоставленными компанией.Вкратце, для скрепления зонда и кожи / раны крысы использовали специальную двустороннюю липкую ленту, и компьютер считывал значение BPU (единицы перфузии крови). Комнатную температуру поддерживали на уровне 23,6 ° C ± 1 ° C, а влажность составляла 46% ± 2%.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Уровни IL-1, IL-6, TNF-α, IL-10, TSG-6, VEGF, коллагена типов I и III в сильно обожженной ране определяли с помощью наборов ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота). Образцы ран были разрезаны на мелкие кусочки, и экстракция коллагена типов I и III из тканей раны была проведена с использованием стандартного метода, описанного ранее [20].Другие образцы гомогенизировали в ступке, лизировали в 500 мл буфера для экстракции и центрифугировали при 10 000 об / мин в течение 10 мин. Супернатанты всех образцов детектировали с помощью считывающего устройства для микропланшетов с множественным детектированием, используя сэндвич-набор для ELISA с двумя антителами в соответствии с протоколами производителя. Концентрации IL-1, IL-6, TNF-α, IL-10, TSG-6, VEGF, коллагена типов I и III были нормализованы к общему содержанию белка.

Статистический анализ

Все данные выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (± s) и были проанализированы с помощью SPSS 16.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Данные были проанализированы с использованием независимого t-критерия Стьюдента для сравнения между 2 группами и знакового рангового критерия Вилкоксона для денситометрических данных. Когда присутствовало более 2 групп, применяли тест ANOVA (факторный дизайн) с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Различия считались статистически значимыми при P <0,05.

Результаты

hUC-MSCs Инъекция в раны Восстановление после тяжелого ожога

Полное заживление кожных ран, т.е.е., с хорошей эпителизацией и остаточной площадью раны <1%, у крыс с тяжелым ожогом оценивали путем общего наблюдения. Время восстановления кожных ран в группе с трансплантированными ожогами hUC-MSC было значительно короче, чем в группе ожоговых. На 2-й неделе после трансплантации клеток струпы в группе hUC-MSC с трансплантированными ожогами были полностью десквамированы, а раны без тяжелой инфекции были чистыми. Однако струпы в ожоговой группе оставались плотно прилегающими к ранам, а гнойная секреция под струпами привела к частичному растворению струпов и серьезному инфицированию ран, что привело к замедленному заживлению ран у сильно обожженных крыс.На 11-й неделе после трансплантации hUC-MSC раневой эпителий 5 из 6 крыс восстановился в группе hUC-MSC, тогда как все 6 крыс в группе ожоговой группы показали отсутствие заживления в одно и то же время (рис. 1A). Время заживления ран в ожоговой трансплантированной hUC-MSC и ожоговой группах составило 74 ± 4 дня и 93 ± 3 дня соответственно. Время заживления ран в группе с пересаженными ожогами hUC-MSC было значительно короче, чем в группе ожоговых (** P <0,01; рис. 1B), а скорость заживления ран в группе с пересаженными ожогами hUC-MSC была значительно выше, чем в ожоговой группе на 2, 3, 6 и 8 неделях после трансплантации (* P <0.05, ** P <0,01; Рис. 1С).

Рис. 1. Инъекция hUC-MSC способствовала заживлению ран после тяжелого ожога.

(A) Типичные изображения кожных ран в разные моменты времени после трансплантации hUC-MSC. (B) Статистический анализ времени заживления ран был представлен на гистограмме. Время заживления ран в группе с пересаженными ожогами hUC-MSC было значительно короче, чем в группе ожоговых. (C) Статистический анализ скорости заживления ран через 2, 3, 6 и 8 недель после трансплантации был представлен на гистограмме.Скорость заживления ран в группе с пересаженными ожогами hUC-MSC была значительно выше, чем в группе ожоговой в то же время. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6), звездочка (*) и двойная звездочка (**) означают P <0,05 и p <0,01 по сравнению с ожоговой группой, соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088348.g001

Маркировка и миграция hUC-MSC

hUC-MSC из пассажей 3-8 имели однородную форму веретена и находились в своем логарифмическом цикле умножения.HUC-MSC метили зеленым флуоресцентным белком (GFP) с использованием стратегии лентивирусного вектора. Наши пилотные данные демонстрируют, что эта стратегия очень эффективна в производстве инфекционных вирусных частиц, экспрессирующих GFP (95,2% ± 3,5%) в привитых hUC-MSC (рис. 2А).

Рисунок 2. hUC-МСК культивировали, метили и отслеживали in vivo у крыс с тяжелыми ожогами.

(A) P3 hUC-MSC наблюдали с помощью светлопольной микроскопии с использованием инвертированного микроскопа. GFP-меченые hUC-MSC наблюдали с помощью инвертированной флуоресцентной микроскопии, а положительные уровни GFP-меченных клеток оценивали с помощью проточной цитометрии.Увеличение 100 раз. (B) GFP-меченные hUC-MSC мигрировали в кожные раны крыс с тяжелыми ожогами в разные моменты времени после трансплантации клеток. (C) ДНК человека в кожных ранах крыс с тяжелыми ожогами анализировали с помощью ОТ-ПЦР.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088348.g002

Для оценки динамического перемещения и самонаведения hUC-MSC в ответ на тяжелые ожоговые раны in vivo , 5 × 10 ⁶ GFP-меченый hUC-MSC трансплантировали крысам с тяжелыми ожогами, и последовательную визуализацию BLI выполняли через 1-3 недели после трансплантации hUC-MSC.На 1-й неделе после трансплантации мы наблюдали, что hUC-MSC мигрировали в тяжелые ожоговые раны, и эти GFP-меченные hUC-MSC в основном концентрировались на краю раны и в основании раны на 2-й и 3-й неделе после трансплантации hUC-MSC. (Рис. 2B).

Не было продукта ПЦР специфической ДНК человека в ранах группы с тяжелым ожогом, но сигналы ПЦР специфической ДНК человека были представлены в ранах группы hUC-MSC с трансплантированными тяжелыми ожогами на 1-й, 2-й, 3-й неделях ( Рис. 2C).

Противовоспалительный эффект hUC-МСК в ране

Окрашивание

H&E срезов кожной раны показало, что первичные инфильтрирующие клетки в сильно обожженной ране были воспалительными клетками.Общее количество воспалительных клеток в группе с трансплантированными ожогами hUC-MSC было заметно ниже, чем в группе ожоговых, и количество воспалительных клеток в группе с ожогом выше, чем в группе имитации, а в группе с ожогом наблюдался абсцесс. Количество инфильтрирующих нейтрофилов (c-ANCA ⁺ ) и макрофагов (ED-1 ⁺ ) в кожных ранах в группе подвергнутых ожоговой трансплантации hUC-MSC было значительно ниже, чем в группе ожоговых, и положительные показатели c- ANCA и ED-1 в ожоговой группе были заметно выше, чем в фиктивной (рис.3А). Результаты количественного анализа представлены на соответствующей гистограмме (рис. 3Б).

Рисунок 3. Обнаружен противовоспалительный эффект hUC-MSC на кожные раны крыс с тяжелыми ожогами (A) Инфильтрацию воспалительных клеток в ранах оценивали по окрашиванию H&E.

Положительное окрашивание на нейтрофилы (c-ANCA) и макрофаги (ED-1) исследовали с помощью иммуногистохимии. (B) Количественный анализ положительного окрашивания нейтрофилов (c-ANCA) и макрофагов (ED-1) показан на соответствующей гистограмме.(C, D, E) Провоспалительные цитокины IL-1, IL-6 и TNF-α в ранах оценивали с помощью набора для ELISA. Уровни IL-1, IL-6 и TNF-α в группе с трансплантированными ожогами hUC-MSC были значительно ниже, чем в группе ожоговых, а их уровни в группе ожогов были значительно выше, чем в группе фиктивных. (F, G) Противовоспалительные цитокины IL-10 и TSG-6 в ранах оценивали с помощью набора для ELISA. Уровни IL-10 и TSG-6 в группе hUC-MSC с трансплантированными ожогами были значительно выше, чем в других контрольных группах.Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6), двойная звездочка (**) означает p <0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088348.g003

Кроме того, мы оценили уровни основных провоспалительных факторов (IL-1, IL-6 и TNF-α) и противовоспалительных цитокинов ( IL-10 и TSG-6) в кожных ранах в 3 группах на 2 неделе после трансплантации. Мы обнаружили, что уровни IL-1, IL-6 и TNF-α в группе с трансплантированными ожогами hUC-MSC были значительно ниже, чем в группе ожоговых, а уровни этих цитокинов в группе ожоговых были значительно выше, чем в группе с ожоговыми клетками. в фиктивной группе (рис.3C, 3D, 3E). Однако уровни противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10 и TSG-6, были значительно выше, чем в двух других группах (фиг. 3F, 3G).

Влияние hUC-MSC на неоваскуляризацию раны

На 3-й неделе после трансплантации hUC-MSC неоваскуляризация раны произошла как в ожоговой, так и в ожоговой трансплантированной группе hUC-MSC. Неоваскуляризацию количественно оценивали путем подсчета микрососудов. По сравнению с ожоговой группой, группа hUC-MSC с пересаженной ожогом содержала больше микрососудов (рис.4А). Результаты количественного анализа представлены на соответствующей гистограмме (рис. 4Б).

Рис. 4. Влияние hUC-MSC на неоваскуляризацию раны на 3-й неделе после трансплантации клеток.

(A) Образцы ран в группах hUC-MSC с имитацией, ожогом и ожогом были окрашены на маркеры эндотелиальных клеток сосудов CD31 и vWF с использованием иммуногистохимии. (B) Количественный анализ микрососудов показан на соответствующей гистограмме. (C) Уровень VEGF в ранах оценивали с помощью набора для ELISA.Уровень VEGF в группе hUC-MSC с трансплантированными ожогами был значительно выше, чем в других контрольных группах. (D) Микроциркуляцию кожной раны оценивали с помощью лазерного допплеровского измерителя кровотока. Микроциркуляция кожной раны в группе ожоговой трансплантации hUC-MSC была заметно выше, чем в группе ожоговой на 1, 2, 3, 6 и 8 неделях после трансплантации. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6), звездочка (*) и двойная звездочка (**) означают P <0,05 и p <0,01 соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088348.g004

Мы дополнительно исследовали уровень VEGF в кожных ранах, чтобы определить возможное влияние hUC-MSC на ангиогенез раны. Уровни VEGF в группах hUC-MSC с трансплантированными ожогами были значительно выше, чем в других контрольных группах (фиг. 4C), что указывает на то, что hUC-MSC приводили к усилению ангиогенеза раны.

Микроциркуляцию кожной раны оценивали с помощью лазерного допплеровского измерителя кровотока (ЛДФ).Микроциркуляция кожной раны в группе с трансплантированными ожогами hUC-MSC была заметно выше, чем в группе ожоговых, через 1, 2, 3, 6 и 8 недель после трансплантации (рис. 4D).

Все результаты предполагают, что hUC-MSC способствовали неоваскуляризации тяжелых ожоговых ран.

Модификация накопления коллагена I и III типов в ране

Типы коллагена I и III являются основными типами коллагена здоровой кожи, и соотношение коллагена типов I и III определяет ход заживления ран.Обработка сильно обожженных ран с помощью hUC-МСК изменила накопление коллагена типов I и III на 3-й неделе после трансплантации (рис. 5А). Результаты количественного анализа представлены на соответствующей гистограмме (рис. 5Б). Результат elisa также показал аналогичный результат. По сравнению с ранами в группе с сильным ожогом соотношение типов коллагена I и III в группе с трансплантированными ожоговыми клетками hUC-MSC значительно увеличивалось на 1, 2, 3, 6, 8 и 11 неделях после трансплантации (фиг. 5C).

Рисунок 5.Модификация накопления коллагена I и III типов в ране.

(A) Лечение сильно обожженных ран с помощью hUC-MSC, изменяющих накопление коллагена типов I и III на 3-й неделе после трансплантации. (B) Количественный анализ соотношения типов коллагена I и III показан на соответствующей гистограмме. (C) Уровни коллагена типов I и III в ранах в различные моменты времени после трансплантации оценивали с помощью набора для ELISA. По сравнению с ранами в группе с тяжелым ожогом, hUC-MSC значительно повышали соотношение коллагена типов I и III в ране на 1, 2, 3, 6, 8 и 11 неделях после трансплантации.Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 6), звездочка (*) и двойная звездочка (**) означают P <0,05 и p <0,01 соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088348.g005

Обсуждение

Необходимо быстрое и соответствующее лечение тяжелых ожогов, особенно в острой фазе. В последнее время МСК стали перспективным методом лечения радиационно-индуцированных ожогов [1]. Учитывая терапевтическую эффективность МСК при лучевых ожогах, существует большой интерес к потенциальному использованию МСК для лечения термических ожогов и тяжелых ожогов.В этом исследовании мы обнаружили, что большое количество GFP-меченных hUC-MSC мигрировало в рану через кровообращение. Раны, обработанные hUC-MSC, показали более быстрое закрытие ран, предположительно из-за того, что hUC-MSC снижали воспалительную реакцию, способствовали ангиогенезу и модифицировали накопление коллагена в локально обожженной коже в различные моменты времени после трансплантации паракринными цитокинами.

В настоящем исследовании hUC-MSC мигрировали в рану и располагались на краю раны и в основании раны.Но механизм, ответственный за нахождение hUC-MSC в раны, не совсем понятен, он, вероятно, включает сложное взаимодействие молекул адгезии, хемокинов и протеаз внеклеточного матрикса [21]. Одно исследование продемонстрировало, что внутрикожная инъекция хемокина SLC / CCL21 на краю раны увеличивает набор внутривенно введенных МСК и значительно ускоряет закрытие раны [22].

Некоторые исследования подтвердили, что процесс заживления ран может быть нарушен инфекцией, некрозом и повышенным уровнем воспалительных факторов.Даже постоянное воспаление в ране создает каскад, который поддерживает длительное состояние [23], [24], [25]. Наши результаты показали, что hUC-МСК заметно ослабляли воспаление на локально обожженной коже за счет уменьшения инфильтрации нейтрофилов и макрофагов, а также продукции провоспалительных цитокинов. Между тем, введение hUC-MSC явно увеличивало продукцию противовоспалительных цитокинов, стимулированных IL-10 и TNF-α, гена / белка 6 (TSG-6), которые были основными участниками противовоспалительного цитокинового профиля hUC-MSC.

Кровоснабжение — ключ к заживлению ран. Несколько исследований продемонстрировали, что некоторые паракринные факторы питания, секретируемые МСК, такие как VEGF, основной фактор роста фибробластов (FGF2) и фактор роста гепатоцитов (HGF), способствовали неоваскуляризации поврежденных тканей [26], [27]. Несколько исследований также выявили способность МСК улучшать кровоснабжение тканей, способствуя разрастанию эндотелиальных клеток за счет секреции растворимого фактора [28]. Наше исследование также показало, что hUC-MSC повышают уровень VEGF в тяжелых ожоговых ранах и способствуют ангиогенезу раны.Кроме того, мы предположили, что hUC-MSC ускоряют заживление сильно обгоревшей раны паракринным VEGF, увеличивая ангиогенез раны.

Коллаген как структурно и функционально важная молекула, которая создает каркас в соединительной ткани, также участвует на каждой стадии заживления ран [29]. Коллаген I и III типов — это основные типы коллагена для здоровой кожи. Кроме того, соотношение коллагена I и III типов в ранах, в основном, определяет процесс заживления ран [29].Наши результаты показали, что hUC-МСК могут изменять накопление коллагена I и III типов и повышать соотношение коллагена I и III типов в сильно обожженной ране. Предыдущее исследование также показало, что МСК способствуют заживлению ран за счет секреции коллагена I типа и изменения экспрессии генов в дермальных фибробластах [30].

Трансплантация

hUC-MSC ускорила закрытие ран после тяжелых ожогов, стимулируя миграцию hUC-MSC, модулируя воспалительную среду, способствуя формированию хорошо васкуляризованного грануляционного матрикса и коллагенового каркаса.Таким образом, эти данные могут обеспечить теоретическую основу для дальнейшего клинического применения hUC-MSC у пациентов с тяжелыми ожогами.

Вклад авторов

Задумал и разработал эксперименты: LYL YHY YSH JKC. Проведены эксперименты: LYL YHY YSH. Проанализированы данные: LYL YHY YSH. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: HJD WLC HJZ QH JDD. Написал статью: LYL YHY YSH JKC.

Список литературы

1. 1.
   Леклерк Т., Тепеньер С., Джалт П., Бей Э., Пельтцер Дж. И др.(2011) Клеточная терапия ожогов. Cell Prolif 44: 48–54.
2. 2.
   Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В., Чеглаков И.Б., Ярыгин К.Н. (2008) Сравнение иммунологических свойств культивированных мезенхимальных клеток человека из различных источников in vitro. Булл Эксп Биол Мед 145: 228–231.
3. 3.
   Troyer DL, Weiss ML (2008) Клетки, полученные из студня Wharton, представляют собой примитивную популяцию стромальных клеток. Стволовые клетки 26: 591–599.
4. 4.
   Li J, Li D, Liu X, Tang S, Wei F (2012) Мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека уменьшают системное воспаление и ослабляют LPS-индуцированное острое повреждение легких у крыс.Дж. Инфламм (Лондон) 9:33
5. 5.
   Бернардо М.Э., Пальяра Д., Локателли Ф. (2012) Терапия мезенхимальными стромальными клетками: революция в регенеративной медицине? Пересадка костного мозга 47: 164–171.
6. 6.
   Салем HK, Thiemermann C (2010) Мезенхимальные стромальные клетки: текущее понимание и клинический статус. Стволовые клетки 28: 585–596.
7. 7.
   Oh JY, Kim MK, Shin MS, Lee HJ, Ko JH и др. (2008) Противовоспалительная и антиангиогенная роль мезенхимальных стволовых клеток в заживлении ран роговицы после химического повреждения.Стволовые клетки 26: 1047–1055.
8. 8.
   Lau K, Paus R, Tiede S, Day P, Bayat A (2009) Изучение роли стволовых клеток в заживлении кожных ран. Exp Dermatol 18: 921–933.
9. 9.
   Фонг С.Ю., Ричардс М., Манаси Н., Бисвас А., Бонгсо А. (2007) Сравнительное поведение роста и характеристика стволовых клеток из человеческого студня Вартона. Reprod Biomed Online 15: 708–718.
10. 10.
    Бакш Д., Яо Р., Туан Р.С. (2007) Сравнение потенциала пролиферативной и многолинейной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток человека, полученных из пуповины и костного мозга.Стволовые клетки 25: 1384–1392.
11. 11.
    Maxson S, Lopez EA, Yoo D, Danilkovitch-Miagkova A, Leroux MA (2012) Краткий обзор: роль мезенхимальных стволовых клеток в заживлении ран. Стволовые клетки Transl Med 1: 142–149.
12. 12.
    Сасаки М., Абэ Р., Фудзита Ю., Андо С., Инокума Д. и др. (2008) Мезенхимальные стволовые клетки привлекаются к поврежденной коже и вносят свой вклад в заживление ран путем трансдифференцировки в несколько типов клеток кожи. J Immunol 180: 2581–2587.
13. 13.
    Hocking AM, Gibran NS (2010) Мезенхимальные стволовые клетки: паракринная передача сигналов и дифференцировка во время заживления кожных ран.Exp Cell Res 316: 2213–2219.
14. 14.
    Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ (2008) Паракринные механизмы в передаче сигналов и терапии взрослых стволовых клеток. Circ Res 103: 1204–1219.
15. 15.
    Чу В.Л., Чай Дж.К., Фэн Ю.К., Ма Л., Чжу Г.Й. и др. (2012) [Экспрессия белков, ассоциированных со стрессом эндоплазматического ретикулума, в печени сильно обожженных крыс]. Чжунхуа И Сюэ За Чжи 92: 853–856.
16. 16.
    Han Y, Chai J, Sun T, Li D, Tao R (2011) Дифференциация мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека в дермальные фибробласты in vitro.Biochem Biophys Res Commun 413: 561–565.
17. 17.
    Бай З.М., Дэн XD, Ли Дж.Д., Ли Д.Х., Цао Х. и др. (2013) Артериально трансплантированные мезенхимальные стволовые клетки в модели обратимой односторонней обструкции мочеточника у мышей: визуализация биолюминесценции in vivo и влияние на фиброз почек. Чин Мед Ж. (англ.) 126: 1890–1894.
18. 18.
    Ли Дж., Мяо С., Го В., Цзя Л., Чжоу Дж. И др. (2008) Обогащение предполагаемых эпидермальных стволовых клеток человека на основе размера клеток и адгезии коллагена IV типа.Cell Res 18: 360–371.
19. 19.
    Yuhua S, Ligen L, Jiake C, Tongzhu S (2012) Влияние полоксамера 188 на углубление глубоких ожоговых ран второй степени на ранней стадии. Бернс 38: 95–101.
20. 20.
    Ян Х., Пэн К.Дж., Ван К.Л., Гу З.Й., Лу Й.К. и др. (2013) Влияние геля полифенола кожуры граната на заживление кожных ран у крыс с аллоксан-индуцированным диабетом. Чин Мед Ж. (англ.) 126: 1700–1706.
21. 21.
    Карп Дж. М., Ленг Тео Г. С. (2009) Направление мезенхимальных стволовых клеток: дьявол кроется в деталях.Стволовая клетка клетки 4: 206–216.
22. 22.
    Чжоу Ю.Л., Чжан Х.Ф., Ли XL, Ди Р.М., Яо В.М. и др. (2010) Повышенный уровень фактора 1, полученного из стромальных клеток, усиливает возвращение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при дилатационной кардиомиопатии у крыс. Chin Med J (англ.) 123: 3282–3287.
23. 23.
    Choi H, Lee RH, Bazhanov N, Oh JY, Prockop DJ (2011) Противовоспалительный белок TSG-6, секретируемый активированными МСК, ослабляет вызванный зимозаном перитонит мышей за счет уменьшения передачи сигналов TLR2 / NF-kappaB в резидентных макрофагах.Кровь 118: 330–338.
24. 24.
    Chen K, Wang D, Du WT, Han ZB, Ren H и др. (2010) hUC-МСК мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека проявляют иммуносупрессивную активность посредством PGE2-зависимого механизма. Clin Immunol 135: 448–458.
25. 25.
    Краснодембская А, Сонг Й, Фанг Х, Гупта Н, Сериков В и др. (2010) Антибактериальный эффект мезенхимальных стволовых клеток человека частично опосредован секрецией антимикробного пептида LL-37. Стволовые клетки 28: 2229–2238.
26. 26.
    Wang M, Crisostomo PR, Herring C, Meldrum KK, Meldrum DR (2006) Клетки-предшественники человека из костного мозга или жировой ткани продуцируют VEGF, HGF и IGF-I в ответ на TNF с помощью p38 MAPK-зависимого механизма. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 291: R880–884.
27. 27.
    Ван И, Ван М., Абарбанелл А.М., Вейл Б.Р., Херрманн Дж. Л. и др. (2009) MEK опосредует новый перекрестный обмен между TNFR2 и TGF-EGFR в усилении секреции фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) мезенхимальными стволовыми клетками человека.Хирургия 146: 198–205.
28. 28.
    Йоханссон Ю., Расмуссон И., Никлоу С.П., Форслунд Н., Густавссон Л. и др. (2008) Формирование сложных островков эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток: новый подход к реваскуляризации островков. Диабет 57: 2393–2401.
29. 29.
    Iyyam Pillai S, Palsamy P, Subramanian S, Kandaswamy M (2010) Ранозаживляющие свойства индийского прополиса изучались на крысах, вызванных иссеченными ранами. Фарм Биол 48: 1198–1206.
30. 30.
    Tondreau T, Meuleman N, Stamatopoulos B, De Bruyn C, Delforge A и др.(2009) Исследование in vitro матриксной металлопротеиназы / тканевого ингибитора продукции металлопротеиназы мезенхимальными стромальными клетками в ответ на воспалительные цитокины: роль их миграции в поврежденных тканях. Цитотерапия 11: 559–569.

Эффективность мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповинной крови и желе Уортона, для безрубцового заживления ран

Этика

Это исследование было одобрено комитетом по этике клинических исследований Высшей школы биомедицинских наук Университета Нагасаки (12053003).Ткани плаценты и пуповины были взяты у здоровых доноров, перенесших плановое кесарево сечение после доношенной беременности; все доноры дали информированное согласие.

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных (1206070993-2) Университета Нагасаки (Нагасаки, Япония). Эксперименты проводились в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями.

Ex vivo размножение UCB-MSC

Пуповинную кровь собирали из доставленных плацент с использованием стерильных игл 18G и шприцев на 50 мл, содержащих 1000 единиц гепарина.Собранные образцы крови хранили на льду и разбавляли фосфатно-солевым буфером Дульбекко (D-PBS), содержащим 2 мМ EDTA. Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте плотности с использованием раствора Ficoll-Hypaque-Plus (GE Healthcare). Свежевыделенные мононуклеарные клетки суспендировали в модифицированной по Дульбекко средне-низкой глюкозе Игла (DMEM-LG) (Wako), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone Laboratories, Inc.) и 1% пенициллин / стрептомицин (Life Technologies), а затем засевали в Т75. — или флаконы для культивирования клеток Т25 плотностью 8.0–10 × 10 ⁵ клеток / см ² . Клетки инкубировали при 37 ° C в 5% CO ₂ и среду меняли каждые 3-4 дня. Мы продолжали культивирование в течение приблизительно 1 недели после того, как фибробластоподобные клетки появились на дне колб. Затем эти фибробластоподобные клетки собирали, используя 0,25% трипсин-ЭДТА, и повторно высевали для дальнейшего размножения ex vivo . Клетки пассажа 2 ^nd или 3 ^rd использовали для экспериментов, за исключением анализа роста клеток.

Ex vivo размножение WJ-MSC

Ткань пуповины собирали и хранили в сбалансированном солевом растворе Хэнка (Life Technologies) при 4 ° C. После удаления пупочной артерии и вен желеобразную ткань Уортона разрезали на мелкие кусочки (1-2 мм) и поместили в чашки для культивирования диаметром 6 или 10 см, покрытые 10 мкг / мл человеческого фибронектина. В чашки добавляли небольшое количество среды DMEM-LG, содержащей 10% FBS и пенициллин / стрептомицин, и клетки инкубировали в 5% CO ₂ при 37 ° C.После инкубации в течение ночи в чашки добавляли еще среду. Фибробластоподобные клетки выросли из тканей примерно через 5 дней инкубации со сменой среды каждые 3-4 дня. Клетки собирали, используя 0,25% трипсин-ЭДТА, и повторно высевали для дальнейшего размножения ex vivo . Для экспериментов мы использовали 2 клетки ^и пассажа, исключая анализ роста клеток.

Анализ роста клеток

UCB-MSC и WJ-MSC первого пассажа высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 3.0 × 10 ³ клеток / см ² и культивировали в течение 1 недели. Клетки собирали в виде суспензии отдельных клеток, и общее количество клеток подсчитывали с помощью NucleoCounter ^® NC-100 ^TM .

Проточная цитометрия

Для характеристики UCB-MSC и WJ-MSC, 2 клетки пассажа ^и были подвергнуты трипсинизации для получения суспензии единичных клеток, а затем окрашены моноклональными антителами мыши против CD34-FITC (4h21), CD44-PE ( IM7), CD45-PE (HI30), CD73-FITC (AD2), CD90-FITC (eBio5E10) и CD105-PE (SN6) (eBioscience).Соответствующие изотипические контроли использовали в качестве отрицательных контролей. После двукратной промывки PBS был проведен количественный анализ проточной цитометрии с использованием прибора LSRFortessa ^TM (Becton Dickinson). Мы проанализировали полученные данные с помощью программы Cell Quest (Becton Dickinson).

RT

² Profiler PCR array

Суммарную РНК выделяли из UCB-MSC и WJ-MSC с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). После генерации кДНК с использованием набора RT ² First Strand Kit (SABiosciences) был проведен ПЦР-массив RT ² Profiler для определения фиброза человека в соответствии с инструкциями производителя (SABiosciences).Всего в массив было включено 84 ключевых гена, участвующих в ремоделировании тканей во время восстановления и заживления ран. Было проведено три отдельных эксперимента, и данные были проанализированы с помощью программы анализа в сети (SABiosciences, http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php).

Мышиная модель заживления ран и имплантация клеток

Шестинедельных мышей BALB / cSlc (nu-nu) были приобретены у Japan SLC. Четыре дефекта кожи на всю толщину были созданы в дорсальной коже с помощью биопсийных штампов диаметром 5 мм (Kai Industries).Затем мышей случайным образом разделили на 3 группы и получили подкожные инъекции в 4 точки вокруг каждой раны: общее количество 1,0 × 10 ⁵ UCB-MSC в 50 мкл среды (группа UCB-MSC), 1,0 × 10 ⁵ WJ-MSC (группа WJ-MSC) или только 50 мкл среды (контрольная группа). Раны регистрировали с помощью цифровой камеры (Lumix DMC-GF3, Panasonic) через 0, 1, 3, 5, 7, 10 и 14 дней после лечения, а площади ран измеряли с помощью программного обеспечения Photoshop CS6 Extended (системы Adobe).Ткани раны собирали с нормальными краями кожи 1 мм в разные моменты времени для следующих анализов.

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (ОТ-ПЦР)

Для измерения уровней экспрессии мРНК нескольких генов, связанных с заживлением ран, мы собирали ткани кожной раны для анализа с помощью ОТ-ПЦР через 3 или 7 дней после лечения. Вкратце, раневые ткани гомогенизировали с использованием Multi-beads shocker ^® (Yasui Kikai), а очистку РНК проводили с использованием ISOGEN2 (Nippon Gene) в соответствии с протоколом производителя.Набор ReverTra Ace ^® q-PRC RT с устройством для удаления геномной ДНК (TOYOBO) использовали для получения кДНК из очищенной тотальной РНК. ОТ-ПЦР выполняли с использованием смеси для кПЦР THUNDERBIRD SYBR (TOYOBO) и системы обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 Touch (Bio Rad). Последовательности праймеров, используемые для количественной оценки уровней экспрессии генов, перечислены в дополнительной таблице 1.

Гистологическая оценка

Для гистологического анализа мышей умерщвляли через 3, 7 и 14 дней после обработки. Собранные раневые ткани фиксировали в 4% параформальдегиде для заливки парафином.Срезы (толщиной 6 мкм) использовали для различных методов окрашивания: окрашивания гематоксилин-эозином (HE), окрашивания трихромом Массона, окрашивания пикросириусом красным ²⁶ и иммуногистохимического (IHC) окрашивания на CD31 (ab28364, Abcam) и F4 / 80 (CI : A3-1, Abcam). Для ИГХ срезы депарафинизировали, инкубировали в течение 20 минут с 3% перекисью водорода для блокирования активности эндогенной пероксидазы, инкубировали с Blocking One Histo (Nacalai Tesque) при комнатной температуре, а затем инкубировали с первичными антителами при 4 ° C в течение ночи.Все срезы визуализировали с использованием Histofine Simplestaining mouseMAX-PO (кролик или крыса) (Nichirei Biosciences, Inc.) и таблеток 3,3′-диаминобензидина (Sigma-Aldrich). Окрашенные срезы просматривали под микроскопом (Olympus IX83, Olympus), а цифровые изображения получали с помощью камеры DP80 с использованием программного обеспечения cellSens (Olympus). Срезы, окрашенные пикросириусом красным, наблюдали с помощью поляризованного микроскопа. Окрашенные НЕ срезы использовали для оценки реэпителизации и грануляции ран. Изображения были оптимизированы глобально и собраны в фигуры с помощью Adobe Photoshop.

Вестерн-блоттинг

Для измерения уровней белков CD31 и F4 / 80 мышей умерщвляли и через 7 дней после обработки собирали ткани раны. Вкратце, собранные раневые ткани гомогенизировали с использованием Multi-beads shocker ^® и добавляли к реагенту T-PER (Thermo Fisher Scientific), состоящему из ингибиторов протеиназы и дефосфорилирования (Thermo Fisher Scientific). Полные лизаты белка получали после удаления дебриса фильтрованием через фильтры 0,22 мкм (Millipore).Общий белок (10 мкг) отделяли с использованием геля mini-Protean TGX Stain-Free ^TM (BioRad) и затем переносили на мембраны PVDF с использованием системы переноса Trans-Blot ^® Turbo ^TM (BioRad).