Клетки шарко лейдена: Страница не найдена — Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова

Содержание

Лабораторная диагностика мокроты в СЗЦДМ


Патологическое отделяемое из дыхательных путей называется мокротой. Это секреторный продукт, который выделяется клетками эпителия и скапливается на стенках органов дыхания. В норме мокрота отсутствует, а секрет, который производит дыхательная система — проглатывается. Во время болезни его становится слишком много и он откашливается.


Исследование мокроты необходимо при наличии патологического процесса в легких и бронхах. Анализ позволит определить причины патологии, стадию процесса и характер болезни. Это исследование назначается в динамике, что позволяет оценить адекватность терапии и корректировать её, при необходимости.


Лечащий врач может назначить анализ мокроты, если есть длительный кашель, хронический патологический процесс в органах дыхательной системы, при неясности диагностической картины.

Виды исследования мокроты


Различают следующие виды исследования мокроты:


  • Макроскопическое


  • Микроскопическое


  • Микробиологическое


  • Химическое.



Перейти к анализам


Макроскопический анализ позволяет оценить общие свойства и характер мокроты. Оценивается количество мокроты, её консистенция, цвет, запах. Также, изучаются примеси, их характер и количество, различные волокна. Можно определить гной, слизистые частицы, серозную жидкость, элементы гнилостного процесса или распада тканей, кровь, волокна фибрина. Данные элементы могут отсутствовать, встречаться по одному или в комбинациях друг с другом.


Микроскопический анализ дает более точной представление о составе мокроты. Увеличение позволяет определить наличие клеток, элементов тканей. Это могут быть следы эпителия, лейкоциты, эозинофилы, эритроциты.


Бактериологическое исследование помогает подтвердить или исключить наличие микроорганизмов в мокроте. Это могут быть бактерии, грибок, паразиты. Проводится также анализ на чувствительность к антибактериальной терапии, что делает лечение более эффективным, сокращает его сроки и исключает неправильную тактику ведения пациента.


Химический анализ мокроты менее информативен. Проводится реакция на гемосидерин, что позволяет говорить о примеси крови. Также, оценивает кислотность биоматериала.

Виды мокроты


Мокроту можно классифицировать по нескольким признакам. Основным параметром является её характер. Различают такие виды мокроты:


Наблюдается при астме и воспалительных процессах. Имеет тягучую консистенцию, прозрачный цвет, стекловидный характер.


Сопровождает прорыв абсцесса или эмпиемы в просвет бронха. Имеет белый цвет с оттенком желтого или зеленого, непрозрачная, густая, имеет характерный запах.

  • слизисто-гнойная мокрота продуцируется при воспалительных процессах с бактериальным возбудителем. Представляет собой вязкую массу, мутную, неоднородную, с вкраплениями гноя и слизи.
  • кровянистая


Может содержать прожилки крови или сформированные сгустки. Это происходит при онкологическом процессе, туберкулезе. Кровь может быть алого или малинового цвета, в зависимости от вида и давности кровотечения.


Мокрота жидкой консистенции является результатом пропотевания воды из капилляров в легкие, наблюдается при задержке крови в малом кругу кровообращения, отеке легких. Может иметь розоватый цвет.


Как подготовиться к лабораторной диагностике мокроты?


Собирать материал для анализа необходимо в утренние часы, натощак. Подготовка к сбору мокроты включает в себя полоскание ротоглотки, отплевывание слюны. Задача правильного сбора — выделение лишь той мокроты, которая откашливается, без примесей изо рта или носа.


Пациенту рекомендуют набрать побольше воздуха в легкие и начать кашлять. После этого происходит забор материала.

Как собирается материал для анализа?


Материал для исследования собирается в стерильную посуду. После откашливания материала, контейнер закупоривается и отправляется в лабораторию. Важно, чтобы мокрота была свежей, иначе происходит изменение кислотности, а часть жидкости высыхает. Предусмотрены индивидуальные плевательницы с плотно прилегающей крышкой. До передачи в лабораторию, контейнер с собранным материалом хранится в холодильнике.



Как трактуются показатели анализа?


Оценка результатов всегда проводится в комплексе с анализом клинической картины, симптоматики и других исследований пациента. К примеру, на анализ сдается небольшое количество мокроты, но важно знать количество выделяемого вещества в сутки.




Наличие слизи наблюдается при остром бронхите, астме. Слизь и гной выделяются при бронхоэктазии, воспалении легких, абсцедировании, различных бронхитах. Кровь в мокроте наблюдается при тяжелом течении болезни, при инфаркте легкого, злокачественном росте, туберкулезе. Темный цвет и неприятный запах, наличие распадающихся тканей говорит о гангрене легкого.




Микроскопия мокроты позволяет исключить или подтвердить наличие паразитов. Это могут быть аскариды, эхинококк. Гнойные пробки формируются в мокроте при процессах гниения. Могут наблюдаться участки опухоли или легочных тканей, что говорит о распаде органа. Если в мокроте появилось большое количество плоского эпителия, скорее всего, материал смешан со слюной и требуется повторный анализ. Цилиндрические клетки эпителия в мокроте накапливается при остром воспалительном процессе в дыхательных путях, астме или онкологическом процессе. Лейкоциты входят в состав гнойной и слизистой мокроты и говорят о воспалении соответствующего характера. Наличие эозинофилов характерно для астмы или соответствующего вида пневмонии. Проводится исследование клеток на атипичность — если таковые обнаружены, возможно присутствует рост опухоли. Различные волокна говорят о распаде тканей. При астме также встречаются характерные спирали и кристаллы. Это слепки дыхательных путей, которые формируют элементы слизи.




Наличие грибка, мицелия, бактерий говорит о наличии соответствующей инфекции.

Какие болезни диагностируются с помощью анализа мокроты?




Анализ мокроты — ключевой этап диагностики целого ряда дыхательных патологий. Рассмотрим подробнее эти болезни.


Острый бронхит

Мокрота начинает выделяться на первых стадиях болезни. Вначале она слизистая и вязкая, но постепенно приобретает слизисто-гнойный характер. Постепенно растет и количество отделяемого материала. Под микроскопом можно обнаружить лейкоциты, много эпителиальных клеток, одиночные эритроциты.


Хронический бронхит

Пациенты с хроническим бронхитом отмечают регулярное отхаркивание большого количества мокроты слизисто-гнойного характера. Изредка встречаются прожилки крови, особенно после интенсивного кашля. В мокроте появляются альвеолярные макрофаги, фибринозные слепки дыхательных путей, а также представители флоры.


Астма

Мокрота при астме слизистая и вязкая, имеет стекловидный характер. Наблюдаются спиральные элементы Куршмана и кристаллические фрагменты Шарко-Лейдена, эозинофилы.


Бронхоэктазы

Для данной патологии характерно большое количество мокроты, которое может достигать 1 литра. Отделяемое имеет грязный, серо-зеленый оттенок. Если оставить мокроты в посуде на время, она расслоится на несколько видов: слизь, гной и серозная жидкость. Наблюдаются пробки Дитриха, значительное количество лейкоцитов, биохимические примеси.



Пневмония

Характерная мокрота продуцируется при крупозной пневмонии. Она имеет вязкую консистенцию, ржавый цвет, выделяется в небольшом количестве. С развитием болезни увеличивается её количество, приобретается слизисто-гнойный характер. Из примесей наблюдается фибрин, измененные эритроциты. Постепенно, эритроцитов становится меньше, повышается количество лейкоцитов.



Абсцесс легкого

Мокрота двухслойная, содержит большое количество гноя и примеси слизи. Микроскопическое исследование позволяет обнаружить лейкоциты, волокна тканей, элементы жирных кислот, гематоидин и холестерин. Бактериологический анализ позволяет оценить характер флоры.



Туберкулез

Мокрота продуцируется при кавернозной форме болезни. Это сопровождается гнойным отделяемым,  с примесями крови и слизи. Микроскопия позволяет определить наличие линз оха, волокон, кристаллов кислот. Если наблюдаются обызвествленные участки, это говорит о распаде старого туберкулезного очага.




Злокачественная опухоль


Появление мокроты наблюдается при распаде. Она содержит участки тканей, волокна, кровь, атипичные клетки. Характер — кровянистый, слизистый.

Как видим, многие болезни имеют общие показатели мокроты. Это еще раз напоминает о необходимости целостной оценки клинической картины, в комплексе с симптомами и результатами других исследований.

Копрограмма


Копрограмма позволяет оценить функциональную деятельность желудка, кишечника, печени и поджелудочной железы, выявить наличие воспалительных процессов и дисбактериоза. Этот анализ дает возможность изучить эффективность пищеварительных процессов организма, оценить скорость прохождения пищи по желудочно-кишечному тракту.


Химический анализ кала в рамках копрограммы включает определение содержания крови, билирубина, стеркобилина, реакции рН.


Реакция рН кала преимущественно зависит от жизнедеятельности микрофлоры кишечника. При преобладании белковой пищи и активации бактерий, расщепляющих белок, образуется много аммиака, придающего калу щелочную реакцию. При углеводной диете и активации бродильной микрофлоры усиливается образование СО2 и органических кислот, дающих кислую реакцию.


Наличие крови в кале свидетельствует о патологических процессах в желудочно-кишечном тракте, сопровождающихся изъязвлением слизистой или распадом опухоли.


Стеркобилин – основной пигмент кала, который придает ему определенную окраску. Отсутствие или резкое уменьшение количества стеркобилина в кале (ахоличный кал) чаще всего свидетельствует об обтурации общего желчного протока камнем, сдавлении его опухолью или резком снижении функции печени (например, при остром вирусном гепатите). Увеличение количества стеркобилина в кале возникает при массивном гемолизе эритроцитов (гемолитическая желтуха) или усиленном желчеотделении. Выявление в кале взрослого человека неизмененного билирубина указывает на нарушение процесса восстановления билирубина в кишечнике под действием микробной флоры. Наиболее частыми причинами этого нарушения являются: подавление жизнедеятельности бактерий кишечника под влиянием больших доз антибиотиков (дисбактериоз кишечника), резкое усиление перистальтики кишечника.


При микроскопическом исследовании в кале можно выявить детрит, остатки пищевых веществ, элементы слизистой оболочки кишечника, клеточные элементы: лейкоциты, эритроциты, макрофаги, опухолевые клетки, кристаллы, яйца гельминтов, паразитирующие в кишечнике простейшие, микроорганизмы. Данные микроскопического исследования могут дать представление о состоянии переваривающей способности кишечника, о состоянии слизистой оболочки (главным образом толстого кишечника).


Детрит составляет основной фон при микроскопии нормального кала, представляет собой остатки пищевых веществ, микроорганизмов, распавшихся клеточных элементов. Он имеет вид аморфных образований мелких размеров, преимущественно зернистой формы.


Слизь в нормальном кале может быть в виде тонкого, малозаметного блестящего налета. При воспалительных процессах обнаруживается в виде тяжей, клочков и плотных, лентовидной формы образований.


Мышечные волокна (остатки белковой пищи) – различают неизмененные и измененные (непереваренные, слабопереваренные, переваренные). Неизмененные (или непереваренные) волокна желтого цвета, цилиндрической формы с обрезанными концами, имеют поперечную, реже продольную исчерченность. По мере переваривания мышечные волокна теряют исчерченность, поверхность становится гладкой, форма округляется.


В нормальном кале немного переваренных мышечных волокон. Большое количество (креаторея) мышечных волокон, особенно непереваренных и слабопереваренных, находят при недостаточности поджелудочной железы, пониженной секреторной функции желудка, ускоренной перистальтике.


Соединительнотканные волокна имеют вид сероватых, преломляющих свет волокон, иногда похожих на тяжи слизи. В нормальном кале не обнаруживаются. Появление их указывает на недостаточность протеолитических ферментов желудка.


Растительная клетчатка и крахмал являются остатками углеводного компонента пищи. Различают два вида клетчатки: перевариваемую и неперевариваемую.


Неперевариваемая клетчатка является опорной клетчаткой (кожица овощей, фруктов, сосуды и волоски растений и т. п.), в кишечнике не расщепляется и полностью выделяется с калом. При микроскопии нативных неокрашенных препаратов она имеет разнообразные резкие очертания, правильный рисунок в виде толстых двухконтурных целлюлозных оболочек коричневой, желтой и серой окраски.


Перевариваемая клетчатка состоит из округлых больших клеток, имеющих тонкую оболочку и ячеистое строение. При микроскопии перевариваемая клетчатка отличается от неперевариваемой нежными контурами, наличием зерен крахмала или красящих пигментов. В нормальном кале не обнаруживается. Обнаруживается в кале при ускоренной эвакуации.


Крахмал при нормальном пищеварении отсутствует, так как амилолитические ферменты пищеварительного тракта и ферменты бактерий слепой кишки расщепляют крахмал полностью. Присутствие крахмала всегда указывает на недостаточность пищеварения, что бывает при заболеваниях тонкого кишечника и связанной с ними ускоренной эвакуации, при недостаточности поджелудочной железы.


Жир и продукты его расщепления, поступившие с пищей в умеренном количестве, в норме усваиваются почти полностью. Обнаружение значительного количества нейтрального жира и продуктов его расщепления свидетельствует о нарушении переваривания и всасывании жира. Нейтральный жир в нативных препаратах кала имеет вид бесцветных капель.


Жирные кислоты и мыла встречаются в виде глыбок, капель и кристаллов. Кристаллы имеют форму тонких игл, заостренных с двух концов. Часто складываются в небольшие пучки, иногда расположены радиально, окружая венчиком глыбки жирных киcлот. Обнаружение в нативном препарате бесцветных капель, глыбок и игольчатых кристаллов позволяет предположить стеаторею.


Клеточные элементы (кишечный эпителий, клетки крови, макрофаги, клетки опухолей) обнаруживаются в кале, содержащем слизь.


Единичные клетки кишечного эпителия можно встретить и в нормальном кале как следствие физиологического слущивания. Появление этих клеток большими группами, пластами отражает наличие воспаления слизистой оболочки толстого кишечника.


Лейкоциты, располагающиеся в слизи в значительном количестве (скопление), свидетельствуют о воспалительном процессе в толстом кишечнике. Лейкоциты в слизи, идущей из тонкого кишечника, успевают разрушиться.


Эритроциты неизмененные встречаются в кале при кровотечениях из толстого кишечника и прямой кишки. При кровотечении из более высоко лежащих отделов кишечника эритроциты либо совсем разрушаются, либо приобретают характер теней, и распознать их очень трудно.


Макрофаги встречаются при некоторых воспалительных процессах, особенно при бактериальной дизентерии.


Клетки злокачественных опухолей могут попасть в кал при расположении опухоли в прямой кишке. Диагностическое значение имеет нахождение не одиночных клеток, а обрывков ткани, групп клеток, отличающихся характерной атипией.


Кристаллические образования. Кристаллы трипельфосфатов встречаются в резко щелочном кале при усилении гнилостных процессов. Оксалаты кальция обнаруживаются при употреблении в пищу большого количества овощей или при снижении кислотности желудочного сока. Кристаллы Шарко-Лейдена в виде вытянутого ромба часто обнаруживаются в слизи в сочетании с эозинофилами, указывают на аллергическое воспаление кишечника, амебиаз, балантидиаз, глистную инвазию. Кристаллы гематоидина выявляются после кишечного кровотечения при язвенных колитах.

Микроскопическое исследование нативного и окрашенного препарата мокроты (общеклиническое исследование)

Повышенное выделение мокроты наблюдается при:
-отеке легких;
-абцессе легких;
-бронхоэктатической болезни.

Пониженное выделение мокроты наблюдается при:
— остром бронхите;
— пневмонии;
— застойных явлениях в легких;
— приступе бронхиальной астме
( в начале приступа)

Цвет:

1.Зеленоватый.
Наблюдается при :
-абцессе легких;
— бронхоэктатической болезни;
— гайморите;
— посттуберкулезных нарушениях.
2.Различного оттенка красного.
Наблюдается при:
— туберкулезе;
— раке легкого;
— отеке легких;
— сердечной астме.
3.Ржавый.
Наблюдается при:
— очаговой, крупозной и гриппозной пневмонии;
— туберкулезе легких;
— отеке легких;
— застойных явлениях в легких.
Иногда на цвет мокроты влияет прием некоторых лекарственных препаратов.
4.При аллергии мокрота может быть ярко-оранжевого цвета.
5.Желто-зеленый или грязно- зеленый
Наблюдается при различной патологии легких в сочетании с желтухой.
6.Черноватый или сероватый
Наблюдается у курящих людей ( примесь угольной пыли)

Характер и консистенция:
1.Густая слизистая.
Наблюдается при: -остром и хроническом бронхите;
— астматическом бронхите;
— трахеите.
2.Слизисто — гнойная
Наблюдается при:
— абсцессе легкого; — гангрене легкого;
— гнойном бронхите;
— стафилокковой пневмонии;
— актиномикозе легких;
— ганрене легких.
3.Серозная и серозно гнойная.
Наблюдается при:
— отеке легких;
— абсцессе легкого.
4.Кровянистая.
Наблюдается при:
— раке легкого;
— травме легкого;
— инфаркте легкого;
— сифилисе ;
— актиномикозе.

Примесь в мокроте.
— Мокрота с примесью крови- может наблюдаться при туберкулезе, раке легкого, системных заболеваниях соединительной ткани и т.д. Прожилки крови могут появляться в мокроте при тяжелом надсадном кашле ( трахеит, коклюш), когда при кашлевых движениях травмируется слизистая дыхательных путей;
— с примесью сгустка крови и отрывки ткани-рак легкого;
— белесоватые творожистые массы-туберкулез;
— серо-желтые песчинки -актиномикоз, черные — пневмокониоз;
— пленки — прорыв эхинококковой кисты.

Запах.
Гнилостный запах наблюдается при:
— гангрена легкого;
— гнилостный бронхит;
— броноэктатическая болезнь; — легкого, осложнившемся некрозом.

Клетки.
1.Альвеолярные макрофаги.
Наблюдаются при хронических патологических процессах в бронхолегочной системы.
2.Цилиндрический эпителий.
Наблюдается в мокроте при:
-бронхите;
— бронхиальной астме;
-трахеите;
— онкологических болезнях.
3.Плосикй эпителий.
-плоский эпителий попадает в мокроту из полости рта и не имеет диагностического значения. Наличие в мокроте более 25 клеток плоского эпителия указывает на то, что данный образец мокроты загрязнен отделяемым из ротовой полости.
4.Эритроциты.
— Эритроциты появляются в мокроте при разрушении ткани легкого,
-пневмонии,
-застои в малом круге кровообращения, -инфаркте легкого.
5.Лейкоциты.
— обнаружение в мокроте нейтрофильных лейкоцитов- более25 клеток в поле зрения- свидетельствует о инфекционном воспалении.
-Если определяется большое количество эозинофилов (боллее 50-90%), предполагают аллергический характер болезни или глистную инвазию.
— большое количество лимфоцитов в мокроте наблюдается при коклюше, туберкулезе легких.

Кристаллы Шарко-Лейдена
Наличие кристаллов Шарко — Лейдена в мокроте-продуктов распада эозинофилов-наблюдаются при:
— аллергии
— бронхиальной астме
-эозинофильных инфильтратах в легких;
— заражении легочной двуусткой.

Спирали Куршмана.
Наличие спиралей Куршмана в мокроте наблюдается при:
-бронхиальной астме;
— бронхите;
— опухоли легкого.

Волокна.
1.Эластические волокна.
Наличие эластических волокон в мокроте наблюдается при:
— распаде ткани легкого;
— туберкулезе;
— абсцессе легкого;
— эхинококкозе;
— раке легкого
2.Коралловидные волокна .
Коралловидные волокна наблюдается в мокроте при кавернозном туберкулезе.
3.Обызвествленные волокна.
Наблюдается при туберкулезе лекгких артритах.

Мокрота — Микроскопическое исследование | ClinLabs.com

Эпителиальные клетки.

Встречающиеся в мокроте клетки плоского эпителия диагностического значения не имеют. Клетки цилин­дрического эпителия (как единичные, так и в виде скоплений) могут быть обнаружены при бронхиальной астме, бронхите, бронхогенном раке легкого. Вместе с тем появление клеток цилиндрического эпителия в мокроте может быть обусловлено и примесью слизи из носоглотки.

Альвеолярные макрофаги

Альвеолярные макрофаги — клетки ретикулоэндотелия. Макрофаги, содержащие в протоплазме фагоцитированные частицы (так называемые пылевые клетки), встречаются в мокроте людей, находящихся в длительном контакте с пылью. Некоторое диагностическое значение имеют макрофаги, содержащие в протоплазме гемосидерин (продукт распада гемоглобина). Эти клетки называют «клетками сердечных пороков». Для подтверждения наличия в клетке гемосидерина проводят реакцию образования берлинской лазури, которая бывает положительной при наличии гемосидерина. «Клетки сердечных пороков» встречаются в мокроте при застое в легких (в частности при стенозе левого атриовентри­кулярного отверстия), при инфаркте легкого.

Лейкоциты

Лейкоциты в небольшом количестве встречаются в любой мокроте.

Большое количество нейтрофилов отмечается в слизисто-гнойной и особенно в гнойной мокроте.

Эозинофилы

Эозинофилами богата мокрота при бронхиальной астме, эозинофиль­ной пневмонии, гельминтозах легких, инфаркте легкого. Эозинофилы могут встречаться в мокроте при туберкулезе и раке легкого.

Лимфоциты

Лимфоциты встречаются в большом количестве при коклюше. Увели­чение содержания лимфоцитов в мокроте возможно при туберкулезе легких.

Эритроциты.

Обнаружение единичных эритроцитов в мокроте диагностического значения не имеет. Появление большого количества эритроцитов в мокроте отмечается при состояниях, сопровождающихся кровохарканьем и легочным кровотечением. При наличии свежей крови в мокроте определяются неизмененные эритроциты, если же с мокротой отходит кровь, задержавшаяся в дыхательных путях в течение длительного времени, то обнаруживают выщелоченные эритроциты.

Опухолевые клетки

Опухолевые клетки, обнаруживаемые в мокроте в виде групп, указывают на наличие опухоли легкого. При обнаружении только единичных клеток, подозрительных на опухоль, часто возникают затруд­нения в их оценке, в таких случаях делают несколько повторных исследований мокроты.

Эластические волокна

Эластические волокна появляются в результате распада легочной ткани при туберкулезе, абсцессе, гангрене легкого и других патологических состояниях, сопровождающихся распадом легочцой ткани. При гангрене легкого эластические волокна обнаруживают не всегда, так как под действием ферментов, находящихся в мокроте, они мргут растворяться.

Спирали Куршманна

Спирали Куршманна — особые трубчатые тела, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании, а иногда видимые невооруженным глазом. Обычно спирали Куршманна определяются при бронхиальной астме или астматическом бронхите. Единичные спирали Куршманна могут быть обнаружены при туберкулезе легких и пневмонии.

Кристаллы Шарко—Лейдена

Кристаллы Шарко—Лейдена обнаруживаются в мокроте, богатой эозинофилами (при бронхиальной астме, эозинофильной пневмонии и т. д.). Считают, что кристаллы Шарко — Лейдена образуются из эозинофилов. В мокроте, богатой эозинофилами, количество кристаллов Шарко — Лейдена увеличивается после того, как мокрота постоит 12—24 ч.

Коралловые волокна (волокна Колпена — Джонса)

Редко встречаются так называемые коралловые волокна (волокна Колпена — Джонса) — грубые, раздутые, с колбообразными утолщениями на концах, что является следствием отложения на эластических волокнах жирных кислот и мыл при длительно текущем деструктивном процессе (например, при вскрытии туберкулезных каверн).

Вскрытие петрифицированного туберкулезного очага в просвет бронха может сопровождаться одновременным обнаружением в мокроте обыз­вествленных эластических волокон, кристаллов XC, МБТ и аморфной извести (так называемая тетрада Эрлиха).

Общий анализ мокроты (стр. 2 из 2)

Спирали Куршмана

Спирали Куршмана (H. Curschmann, 1846-1910, немецкий врач) представляют собой беловато-прозрачные штопорообразно извитые трубчатые образования, сформировавшиеся из муцина в бронхиолах. Тяжи слизи состоят из центральной плотной осевой нити и спиралеобразно окутывающей её мантии, в которую бывают вкраплены лейкоциты (чаще эозинофилы) и кристаллы Шарко-Лейдена. Анализ мокроты, в котором обнаружены спирали Куршмана, характерен для спазма бронхов (чаще всего при бронхиальной астме, реже при пневмонии и раке лёгкого).

Кристаллы Шарко-Лейдена

Кристаллы Шарко-Лейдена (J. M. Charcot, 1825-1893, французский невропатолог; E. V. Leyden, 1832-1910, немецкий невропатолог) выглядят как гладкие бесцветные кристаллы в форме октаэдров. Кристаллы Шарко-Лейдена состоят из белка, освобождающего при распаде эозинофилов, поэтому они встречаются в мокроте, содержащей много эозинофилов (аллергические процессы, бронхиальная астма).

Форменные элементы крови

Небольшое количество лейкоцитов можно обнаружить в любой мокроте, при воспалительных (и особенно нагноительных) процессах их количество возрастает.

Нейтрофилы в мокроте.

Всегда содержатся в мокроте в большем или меньшем количестве в зависимости от ее характера. Обнаружение более 25 нейтрофилов в поле зрения свидетельствует об инфекции (пневмония, бронхит).

Эозинофилы в мокроте.

Распознаются по более темной окраске и наличию в цитоплазме четкой, одинаковой, обильной, преломляющей цвет зернистости. Распределяются они в препаратах неравномерно, часто в виде больших скоплений в отдельных участках. Единичные эозинофилы могут встречаться в любой мокроте; в большом количестве (до 50-90% всех лейкоцитов) они обнаруживаются при бронхиальной астме, эозинофильных инфильтратах, глистных инвазиях лёгких и т.п.

Эритроциты в мокроте.

Имеют вид дисков желтоватого цвета. Единичные эритроциты могут встречаться в любой мокроте. Эритроциты появляются в мокроте при разрушении ткани лёгкого, пневмонии, застое в малом круге кровообращения, инфаркте лёгкого и т.д.

Эпителиальные клетки

Плоский эпителий попадает в мокроту из полости рта и не имеет диагностического значения. Наличие в мокроте более 25 клеток плоского эпителия указывает на то, что данный образец мокроты загрязнён отделяемым из ротовой полости.

Цилиндрический мерцательный эпителий

Выстилает слизистую оболочку гортани, трахеи и бронхов. Клетки имеют удлиненную форму, расширенную у конца, обращенного в просвет бронха, и суженную у основания. В клетке иногда видно крупное, овальной формы ядро. На расширенном конце клетки нередко имеются реснички. Клетки цилиндрического эпителия располагаются почти всегда неравномерно, группами или большими скоплениями в отдельных участках препарата. В отдельных случаях цилиндрический эпителий имеет вид плотных клеточных комплексов округлой или овальной формы с четкими контурами, по краям которых иногда хорошо заметно активное движение ресничек, их ошибочно принимают за простейшие или за комплексы клеток злокачественного новообразования. В небольшом количестве присутствует в любой мокроте, в большом — при поражении дыхательных путей (бронхит, бронхиальная астма и астмоидных состояниях, новообразованиях легкого, пневмосклерозах).

Альвеолярные макрофаги

Относят к клеткам гистиоцитарной системы — большие клетки различной величины, чаще круглой формы с наличием в цитоплазме включений черно-бурого цвета. В препаратах располагаются в виде крупных скоплений, чаще в слизистой мокроте с небольшим количеством гноя. бнаруживается при разнообразных патологических процессах (пневмонии, бронхиты, профессиональные заболевания легких). При хронических воспалительных процессах часто подвергаются дегенеративным изменениям. Клетки с жировой дистрофией, липофаги, жировые шары имеют различную величину, чаще округлой или угловатой формы, цитоплазма заполнена капельками жира. Клетки располагаются, как правило, скоплениями. При добавлении к препарату судана III капли жира окрашиваются в оранжевый цвет. Альвеолярные макрофаги локализуется в основном в межальвеолярных перегородках. Поэтому анализ мокроты, где присутствует хотя бы 1 макрофаг, указывает на то, что поражены нижние отделы дыхательной системы.

Кристаллы гематоидина

Имеют форму ромбов и иголок (иногда паучков и звезд) золотисто-желтого цвета. Являются продуктом распада гемоглобина, образуются в глубине гематом и обширных кровоизлияний, в некротизированной ткани. В препаратах мокроты располагаются на фоне детрита, эластических волокон, в некротезированных тканевых клочках.

Друзы актиномицетов.

Микроскопически в нативном препарате — это сплетение тонкого мицелия, концы которого заканчиваются колбообразными вздутиями. Характерно при этом присутствие в мокроте ксантохромных клеток. Друзы актиномицетов находят в мокроте при актиномикозе легкого. Чаще друзы находят в гное, взятом из свищей, абсцессов, иногда в пунктатах, так как актиномикотический процесс может иметь различную локализацию: слепая кишка и брюшная полость, подчелюстная область.

Эластические волокна

Эластические волока имеют вид тонких двухконтурных волоконец одинаковой на всё протяжении толщины, дихотомически ветвящихся. Эластичные волокна исходят из лёгочной паренхимы. Выявление в мокроте эластичных волокон свидетельствует о разрушении лёгочной паренхимы (туберкулёз, рак, абсцесс). Иногда их присутствие в мокроте используют для подтверждения диагноза абсцедирующей пневмонии.

Компоненты мокроты Расшифровка анализа

Спирали Куршмана Бронхоспастический синдром, наиболее вероятен диагноз астмы.

Кристаллы Шарко-Лейдена Аллергические процессы, бронхиальная астма.

Эозинофилы, до 50-90% всех лейкоцитов аллергические процессы, бронхиальная астма, эозинофильные инфильтраты, глистная инвазия лёгких.

Нейтрофилы, более 25 в поле зрения Инфекционный процесс. Судить о локализации воспалительного процесса невозможно.

Плоский эпителий, более 25 клеток в поле зрения Примесь отделяемого из полости рта.

Альвеолярные макрофаги Образец мокроты исходит из нижних дыхательных путей.

Эластические волокна Деструкция лёгочной ткани, абсцедирующая пневмония.

Атипичные клетки

Мокрота может содержать клетки злокачественных опухолей, особенно если опухоль растёт эндоброхиально или распадается. Определять клетки как опухолевые можно только в случае нахождения комплекса атипичных полиморфных клеток, особенно если они располагаются вместе с эластическими волокнами.

Паразиты и яйца гельминтов

Мокрота в норме не содержит паразитов и яйца гельминтов. Выявление паразитов позволяет установить природу легочной инвазии, а также диагностировать кишечную инвазию и её стадию:

Трофозоиты E. histolytica — легочный амёбиаз.

Личинки и взрослые особи Ascaris lumbricoides — пневмонит.

Кисты и личинки E. granulosus — гидатидный эхинококкоз.

Яйца P. westermani — парагонимоз.

Личинки Strongyloides stercoralis — стронгилоидоз.

Личинки N. americanus — анкилостомидоз.

Для бактериоскопического исследования предварительно готовят препарат. Вначале растирают комок мокроты между двумя предметными стёклами; затем высохший мазок фиксируют над пламенем горелки и окрашивают: для поисков микобактерий туберкулёза по Цилю-Нильсену, в других случаях — по Грамму.

Чувствительность бактериоскопического метода напрямую зависит от кратности обследования пациента. Например, согласно исследованиям, однократный анализ мокроты на микобактерии туберкулёза имеет чувствительность 80-83%, двукратный анализ мокроты (в течение двух дней) — на 90-93% больше и при исследовании трёх проб мокроты (в течение трёх дней) — 95-98%. Таким образом, при подозрении на туберкулез органов дыхания необходимо исследовать не менее трёх проб мокроты.

Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноз той или иной инфекции, так как мокрота пациента может содержать меньше микробов, чем может выявить микроскопическое исследование.

Когда бактериоскопическое исследование не обнаруживает предполагаемого возбудителя, прибегают к посеву мокроты на питательные среды. Посев мокроты производят не позднее 2-х часов после сбора. Если подозревается туберкулёз, то сбор мокроты осуществляют в течение 3-х последовательных дней.

Бактериологическое исследование позволяет идентифицировать вид микробов и определять их антибиотикочувствительность.

Обычно у здоровых лиц в мокроте при посеве выявляются альфа-гемолитический стрептококк, Neisseria spp., дифтероиды. Обнаружение лишь нормальной микрофлоры ещё не означает отсутствие инфекции. Результат посева следует интерпретировать с учётом клинической картины и общего состояния пациента.

Критерием этиологической значимости возбудителя будет выявления микроба в концентрации 106 в 1 мл и выше. Но к выявлению микобактерий туберкулёза в любом количестве следует отнестись со всей серьёзностью.

1. Лабораторные и инструментальные исследования в диагностике: Справочник / Пер. с англ. В.Ю. Халатова; под. ред. В.Н. Титова. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. — 960 с.

2. Kincaid-Smith P., Larkins R., Whelan G. Problems in clinical medicine. — Sydney: MacLennan and Petty, 1990, 105-108.

3. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Под ред. проф. Меньшикова В.В. — М.: «Медицина», 1987. — 368 с.

4. Пропедевтика внутренних болезней. Под ред. В.Х. Василенко, А.Л. Гребнёва. — М.: «Медицина», 1982. — 640 с.

5. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е.А. Кост. — «Медицина», 1975 — 383 с.

Раскрыта вековая тайна астматических кристаллов

Светлана Маслова

При астме и воспалении дыхательных путей в мокроте образуются кристаллы Шарко-Лейдена. О них известно с 19 века, однако их роль в развитии заболеваний прояснилась лишь сейчас.

10

Кристаллы Шарко-Лейдена состоят из белка Galectin-10 (Gal10) и впервые были обнаружены в дыхательных путях астматиков в 1853 году. Долгое время их присутствие в мокроте и других биологических материалах не изучалось, однако теперь бельгийские ученые определили роль кристаллов в заболеваниях дыхательных путей. Работа опубликована на сайте Фламандского института биотехнологий.

Команда установила, что кристаллы Шарко-Лейдена очень распространены в слизи дыхательных путей, стимулируют иммунную систему и способствуют воспалению и изменению вырабатываемой слизи.

Чтобы прийти к этому выводу, ученые определили трехмерную структуру белка Galectin-10 вплоть до атомного масштаба, а также провели исследования в моделях мышей и культуре клеток.

Выяснилось, что белок Galectin-10 подавлял иммунитет только при образовании в структуры кристаллов. Именно кристаллический Galectin-10 индуцировал ключевые признаки астмы, включая изменение мокроты, подчеркивают авторы.

Исследователи уже разработали антитела, которые могут растворять кристаллы Шарко-Лейдена. В мышиной модели это приводило к значительному снижению симптомов воспаления в легких, восстановлению функций в легких и выработке слизи.

В чашке Петри в лаборатории антитела растворяли кристаллы в образцах мокроты человека в течение нескольких часов.

Ученые считают, что терапия обладает потенциалом стать эффективным инструментом для снижения тяжелых воспалительных симптомов у человека при астме, а также поможет сократить накопление слизи в легких. Исследования будут продолжены.

Недавно в Бразилии эксперименты на животных помогли предотвратить развитие аллергической астмы. Для этого ученые просто внесли изменения в один из этапов развития болезни.

FacebookВконтакте10WhatsAppTelegram


Кристаллы Шарко-Лейдена фото

Клетка Пирогова u2014 Лангханса в мокроте больного туберкулезом легких; окраска гематоксилином и эозиномu0026quot;u0026gt;

17- Слоистые слизистые пробки в бронхах (спирали Куршмана), много эозинофилов и кристаллов Шарко- Лейдена характерны для: А- бронхоэктазов Б- бронхиальной …

Кристаллы Шарко-Лейдена — Wikiwand

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Кристаллы Шарко Лейдена встречаются в мокроте вместе с эозинофилами. Образование кристаллов Шарко Лейдена

Рис. 3. Микропрепарат мокроты. Альвеолярные макрофаги, содержащие в цитоплазме включения гемосидерина темно-синего цвета; реакция Перльса.

Дизентерийная амеба быстро передвигается; характерными для нее являются стекловидные ложноножки, ясно отграниченные от мелкозернистой эндоплазмы.

Рис. 5б). Микропрепарат мокроты. Опухолевые клетки u2014 клетки аденокарциномы (указаны стрелками

Микобактерии туберкулеза

При астме образуется густая, вязкая слизь, содержащая слущенный эпителий бронхов, эозинофилы, кристаллы Шарко-Лейдена. Слизь может частично или полностью …

… эритроцитами свободно лежащие эритроциты в массе кала, Б u2013 при хроническом амебиазе: мелкие дизентерийные амебы, цисты их, кристаллы Шарко-Лейдена.

Кристалл Шарко-Лейдена. Кристаллы гематоидина. Клетки цилиндрического эпителия. Слизь. Нормальный кал

Клиническая картина Мокрота скудная, вязкая, стекловидная, содержит эозинофиллы, спирали Куршмана, кристаллы Шарко-Лейдена, выделяется в конце приступа; …

В патогенезе заболевания основную роль играет снижение защитных сил организма, позволяющее активизироваться банальной микрофлоре, всегда существующей в …

Лейкоцитоз со сдвигом влево, повышение СОЭ, при аллергическом колите — кристаллы Шарко-Лейдена в кале. При бактериологическом исследовании обнаруживают …

При перкуссии отмечается высокий коробочный звук с нек-рым укорочением в паравертебральных отделах; аускультативно дыхание ослабленное, сухие свистящие …

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Кристаллы Шарко Лейдена встречаются в мокроте вместе с эозинофилами. Образование их связывают с

Лейкоцитоз со сдвигом влево, повышение СОЭ, при аллергическом колите — кристаллы Шарко-Лейдена в кале. При бактериологическом исследовании обнаруживают …

Оценка клинической эффективности молочной адаптированной смеси и анализ состояния здоровья детей, находящихся на различных видах

Дата публикации: 2015-08-11
Просмотров: 6470

Еще интересные материалы:

кристаллов Шарко-Лейдена: разгадка загадки | Кровь

В этом выпуске Blood Ueki и др. Элегантно демонстрируют активное образование кристаллов Шарко-Лейдена (CLC) во время цитолиза эозинофилов. 1 Подтвердив связь отложения ХЛК с эозинофильным воспалением и разрушением плазматической мембраны эозинофилов в срезах ткани с помощью световой и электронной микроскопии, Уэки и др. Использовали комбинацию сложных методов визуализации, включая иммунофлуоресцентную покадровую фотографию, чтобы проследить за ходом Образование CLC in vitro в ответ на различные стимулы, которые вызывают гибель эозинофилов внеклеточной ловушки (EETosis).Связь CLC с распадом эозинофилов была предложена еще в 1940-х годах 2 , и впоследствии было показано, что такие агенты, как Aerosol MA, которые нарушают целостность эозинофилов, способствуют образованию CLC in vitro в окружающей среде. 3 Ueki et al. Предоставляют первые убедительные доказательства того, что образование CLC зависит от энергии и тесно связано с процессом EETosis (см. Рисунок).

Хотя присутствие CLC в тканях было впервые описано в конце 1800-х годов, механизм образования и функции этих кристаллов только начинают понимать.Белок Шарко-Лейдена (галектин-10) составляет до 10% от общего белка в эозинофилах, и хотя галектин-10 был продемонстрирован в Т-клетках, 4 образование CLC, по-видимому, ограничивается эозинофилами и базофилами человека. 5 Более того, отложение CLC в тканях описано исключительно в тканях и жидкостях организма в местах эозинофильного воспаления. Недавние исследования начали проливать свет на функциональную роль белка Шарко-Лейдена в эозинофильном воспалении.Первоначально предполагалось, что это лизофосфолипаза на основании исследований с помощью гель-хроматографии, но впоследствии было показано, что наблюдаемое повышение активности лизофосфолипазы связано со связыванием галектина-10 с ингибитором лизофосфолипазы. 6 Галектин-10 также участвует в развитии клонов эозинофилов 7 и, совсем недавно, в регуляции пролиферации Т-клеток эозинофилами. 8 Однако роль кристаллообразования в этих сценариях неизвестна.

Внеклеточные кристаллы, включая кристаллы оксалата кальция и мононатрия урата, могут откладываться в тканях и вызывать воспалительную реакцию, приводящую к повреждению тканей. Также было показано, что они индуцируют регулируемую гибель клеток (некроптоз) независимым от каспаз образом, который включает взаимодействующую с рецептором серин-треонинкиназу 3 и псевдокиназу, подобную домену киназы смешанного происхождения, in vitro и in vivo. 9 Эти данные предполагают, что кристаллы Шарко-Лейдена могут вносить вклад в вызванное эозинофилами повреждение тканей способом, отличным от такового для вторичных гранул эозинофилов, которые ранее показали Ueki et al., Как связанные с ловушками внеклеточной ДНК эозинофилов. 10

Таким образом, работа Ueki et al ясно демонстрирует, что образование CLC является активным, энергозависимым процессом, который связан с цитолизом эозинофилов. Более того, энергетическая зависимость этого процесса поддерживает гипотезу о том, что образование CLC не является просто побочным продуктом разрушения эозинофилов, и обеспечивает первый и важный шаг в понимании функции CLC при эозинофильном воспалении.Остается выяснить, является ли основная роль CLC цитотоксической или более сложным образом участвует в иммунорегуляторных процессах.

Раскрытие информации о конфликте интересов: автор заявляет об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

кристаллов Шарко-Лейдена активируют инфламмасому NLRP3 и вызывают воспаление IL-1β.

РЕФЕРАТ

Кристаллы Шарко-Лейдена (CLC) представляют собой кристаллы белка галектина-10, которые могут образовываться после дегранулы эозинофилов.ХЛК могут появляться и сохраняться в тканях пациентов с эозинофильными расстройствами, такими как астма, аллергические реакции, грибковые и глистные инфекции. Несмотря на многочисленные сообщения об их возникновении при заболеваниях человека, воспалительный потенциал CLC остается неизвестным. Здесь мы показываем, что CLC индуцируют высвобождение IL-1β при их поглощении первичными человеческими макрофагами in vitro, и что они вызывают воспаление in vivo на мышиных моделях острого перитонита и бронхита. CLC-индуцированный IL-1β зависел от NLRP3 и каспазы-1, и их закапывание в мышей-репортерных инфламмасом способствовало сборке комплексов ASC и секреции IL-1β в легких.Наши результаты показывают, что CLC распознаются инфламмасомой NLRP3, которая может поддерживать воспаление, которое следует за эозинофильными воспалительными процессами.

ВВЕДЕНИЕ

Модификации физико-химических свойств определенных белков, липидов или метаболитов могут привести к фазовому переходу, ведущему к образованию кристаллов или нефизиологической агрегации (Franklin et al., 2016; Mulay and Anders, 2016). Кристаллы могут образовываться в тканях при отложении эндогенного материала, такого как минералы, холестерин и мочевая кислота.Они также могут поступать из экзогенных источников путем ингаляции (диоксид кремния, асбест, взвешенные в воздухе твердые частицы) или путем инъекций (медицинские наноматериалы, адъюванты вакцин) (Franklin et al., 2016). Кристаллические или агрегированные материалы воспринимаются клетками врожденного иммунитета, которые оснащены сигнальными рецепторами распознавания образов (PRR), кодируемыми зародышевой линией. Врожденные иммунные клетки исследуют ткани и удаляют накопленный внеклеточный материал, патогены и остатки гибели клеток. Чувствительность кристаллов вызывает сильные воспалительные реакции, свойство, которое использовалось для адъювантности вакцинных композиций.В то время как несколько мембраносвязанных PRR участвуют в распознавании и поглощении кристаллов (Tsugita et al., 2017; Sheedy et al., 2013), цитозольный PRR NLRP3 воспринимает чрезмерно фагоцитированные кристаллы. Активация NLRP3 вызывает образование инфламмасомы, которая приводит к активации и высвобождению провоспалительного цитокина интерлейкина-1 бета (IL-1β) (Hornung et al., 2008; Duewell et al., 2010; Masters et al., 2010; Halle et al., 2008; Martinon et al., 2006b; Dostert et al., 2008). IL-1β играет важную роль в воспалительных заболеваниях, вызванных кристаллами, и вместе с NLRP3 представляет собой многообещающую терапевтическую мишень для ряда заболеваний, опосредованных кристаллами (Franklin et al., 2016; Мулай и Андерс, 2016).

Воспаление возникает не только в результате скопления кристаллов, но и само по себе может способствовать кристаллизации. Во время воспаления иммунные клетки привлекаются к пораженной ткани. Среди них эозинофилы и базофилы играют важную роль в аллергических реакциях, грибковых и глистных инфекциях, а также в регуляции различных аутоиммунных заболеваний. Эти клетки могут вытеснять высоко цитотоксические белки из своих секреторных гранул, которые опосредуют заметные физиологические изменения, связанные с воспалением эозинофилов и базофилов.Преобладающим белком, присутствующим в эозинофильных и базофильных гранулах, является галектин-10 (LGASL10), также известный как белок Шарко-лейдена (Golightly et al., 1992; Archer and Blackwood, 1965). Галектин-10 может образовывать кластеры и образовывать кристаллы Шарко-Лейдена (ХЖК), которые представляют собой бесцветные удлиненные гексагональные бипирамидальные структуры, длина которых может достигать 50 мкм. Со времени их первого сообщения, более 160 лет назад, было показано, что CLC спонтанно образуют in vitro из лизатов эозинофилов (Weller et al., 1980) и базофилов (Ackerman et al., 1982), и было обнаружено, что они накапливаются в тканях пациентов с астмой (Dor et al., 1984), грибковыми аллергическими реакциями (el-Hashimi, 1971; Katzenstein et al., 1983; DeShazo et al., 1997), глистные инфекции (Kaplan et al., 2001) и миелоидный лейкоз (Nashiro et al., 2016; van de Kerkhof et al., 2015; Manny and Ellis, 2012). Несмотря на многочисленные сообщения о появлении ХЛК в тканях пациентов с эозинофильными расстройствами, эти кристаллы по-прежнему рассматриваются как инертные остатки активности эозинофилов с нераспознанной иммунной функцией.Достижениям в этой области препятствует отсутствие подходящей модели на животных для изучения образования CLC in vivo . У мышей отсутствует ген LGASL10 , который кодирует галектин-10. Следовательно, еще предстоит продемонстрировать, являются ли ХЛК воспалительными in vitro и in vivo .

Здесь мы показываем, что CLCs in vitro быстро фагоцитируются макрофагами человека, и это приводит к высвобождению провоспалительного цитокина IL-1β. CLC-индуцированный IL-1β в макрофагах происходил за счет активации каспазы-1 после сборки инфламмасомы NLRP3.Кроме того, мы показываем, что CLCs способствовали воспалению in vivo , характеризующемуся инфильтрацией нейтрофилов, фагоцитозом кристаллов и высвобождением IL-1β. Кроме того, CLC индуцировали сборку инфламмасом (пятнышек ASC) in vivo после их инстилляции в легкие мышей-трансгенных репортеров ASC-mCitrine.

Наши результаты раскрывают иммуностимулирующие свойства CLC и проливают новый свет на вероятные последствия, вызванные воспалительными последствиями, которые следуют за инфильтрацией эозинофилов в тканях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и характеристика кристаллов Шарко-Лейдена

Чтобы исследовать воспалительный потенциал CLC, мы сначала получили CLC из цельноклеточных лизатов клеток AML14.3D10, субклона линии клеток AML14, созданной из 68-летний пациент с острым миелоидным лейкозом FAB M2 (Baumann and Paul, 1998). И родительская клеточная линия AML14, и субклон AML14.3D10 являются признанными инструментами для изучения биологии эозинофилов (Paul et al., 1994). Мы получили CLC in vitro путем инкубации предварительно очищенных лизатов клеток AML14.3D10 при 4 ° C в течение 16 часов (фиг. 1a и фиг. S1a), как описано ранее (Ackerman et al., 1980). Полученные кристаллы имели гексагональную бипирамидальную морфологию, характерную для ХЖК (рис. 1б). Окрашивание кумасси бриллиантовым синим геля, нагруженного кристаллами, денатурированными SDS, показало, что препараты CLC содержали в основном один белок (рис. 1c и рис. S1a), а иммуноблоттинг со специфическими mAb против галецина-10 показал, что препараты CLC состояли из Галектин-10 (рис.1d и рис. S1a).

Рис. 1. Получение и характеристика ХЖК.

( a ) Схема генерации CLC из ячеек AML14.3D10. ( b ) Получение изображения репрезентативной чистой фракции ХЖК в широком поле, как показано в a . Масштабные линейки: 400 мкм. Вставка — это 20-кратное увеличение области, обведенной сверху. ( c ) Белковый гель, окрашенный Кумасси, и ( d ) иммуноблоттинг для галектина-10 репрезентативных фракций лизатов клеток AML14.3D10, неочищенных CLC и чистых CLC, которые были получены, как показано в a .Данные представляют два независимых эксперимента.

Фагоцитоз CLC ведет к секреции IL-1β макрофагами человека

Затем мы создали первичные макрофаги, происходящие из моноцитов человека (hMDM), дифференцированные от моноцитов CD14 + , выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) из лейкоцитов здоровых людей. доноры. Эти клетки были примированы LPS и подвергнуты воздействию CLC, и их фагоцитарный потенциал против CLC оценивали с помощью микроскопии. Мы заметили, что hMDM быстро поглощали ХЖК различного размера (рис.2а и фильм S1).

Рис. 2 Фагоцитоз кристаллов Шарко-Лейдена (CLC) вызывает секрецию IL-1β макрофагами человека in vitro .

( a ) Конфокальная визуализация LPS-примированных (2 нг / мл, в течение 3 часов) первичных макрофагов человека (hMDM), стимулированных очищенными CLC в течение 6 часов. Плазменная мембрана (красный, WGA-AF555), ядра (синий, DRAQ5) и ХЖК (зеленый, отражение лазера). Масштабные линейки (левая панель 4 мкм и правая панель 8 мкм). Данные взяты из одного представителя из трех независимых экспериментов.( b ) Измерение HTRF IL-1β и TNFα из супернатантов hMDM, которые были либо оставлены без обработки, примированы LPS, либо примированы LPS и стимулированы в течение 6 часов с указанными соотношениями CLC / макрофаги или указанными концентрациями кристаллов кремнезема, кристаллов холестерина или в течение 1,5 часов с нигерицином (Nig). Каждый символ представляет значения из hMDM, сгенерированных от разных доноров. Столбцы представляют собой среднее значение и SEM объединенных данных из четырех независимых экспериментов с различными препаратами CLC.( c ) Измерение HTRF IL-1β в hMDM, праймированных, как в a , и стимулированных CLC (2 на ячейку) или кристаллами кремнезема (100 мкг / мл) в указанные моменты времени. Столбцы представляют собой среднее и стандартное отклонение объединенных данных двух независимых экспериментов. Каждый символ представляет значения от разных доноров. ( d ) Конфокальная визуализация hMDM, примированных LPS, которые были предварительно обработаны или не обработаны 5 мкл цитохалазина D, за 30 минут до инкубации с CLC (2 на клетку). ( e ) Измерение HTRF IL-1β из супернатантов LPS-примированных hMDM, которые были предварительно обработаны возрастающими концентрациями цитохалазина D (0, 0.3, 0,6, 1,25, 2,5 или 5 мкМ). Столбцы представляют собой среднее значение и SEM объединенных данных трех независимых экспериментов. Каждый символ представляет значения от разных доноров. ( f ) Измерение HTRF IL-1β из супернатантов LPS-примированных hMDM, которые были предварительно обработаны возрастающими концентрациями ингибитора катепсина-B CA-074 Me (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 15 мкМ ). Столбцы представляют собой среднее значение и SEM объединенных данных трех независимых экспериментов. Каждый символ представляет значения от разных доноров.

Провоспалительный цитокин IL-1β является ключевым фактором индуцированного кристаллами воспаления при нескольких хронических воспалительных заболеваниях (Hornung et al., 2008; Duewell et al., 2010; Masters et al., 2010; Halle et al. , 2008; Martinon et al., 2006b; Dostert et al., 2008). Таким образом, мы исследовали, приводит ли фагоцитоз CLC к высвобождению IL-1β hMDM. Мы обнаружили, что, как и в случае хорошо известных активаторов инфламмасом, кремнезема и кристаллов холестерина, воздействие на LPS-примированные hMDMs с CLC приводит к дозозависимому и зависящему от времени высвобождению IL-1β из этих клеток (рис.2б-в). Подобно сообщениям с использованием других кристаллов, примирование ЛПС требовалось для высвобождения IL-1β с помощью in vitro стимулированных CLC hMDM (таблица S1). Важно отметить, что фагоцитоз был необходим для индуцированного CLCs высвобождения IL-1β с помощью hMDM in vitro , поскольку обработка клеток ингибитором полимеризации актина цитохалазином D нарушала их фагоцитарную активность и уменьшала их способность высвобождать IL-1β в ответ на стимуляцию CLC ( Рис. 2d-e). Как и ожидалось, цитохалазин D ингибировал высвобождение IL-1β, опосредованное кристаллами кремнезема, в то время как реакция на нигерицин, растворимый активатор инфламмасом, который действует как антипортер H + и K + , осталась неизменной.

CLCs-индуцированное высвобождение IL-1β

in vitro зависит от активации NLRP3

Фагоцитоз кристаллического материала и нерастворимых белковых агрегатов может в конечном итоге привести к повреждению лизосом и высвобождению лизосомального содержимого в цитозоль клетки. Лизосомное повреждение может активировать NLRP3, который затем рекрутирует адаптерный белок ASC и каспазу-1, белковый комплекс, который делает возможным созревание про-ИЛ-1β за счет протеолиза, опосредованного каспазой-1 (Hornung et al., 2008). Чтобы выяснить, участвует ли лизосомное повреждение в индуцированной CLC активации инфламмасом, мы предварительно обработали hMDM CA-074 Me, соединением, которое ингибирует активацию NLRP3, опосредованную лизосомным повреждением (Hornung et al., 2008). Действительно, ингибирование CA-074 Me блокировало индуцированное CLC высвобождение IL-1β дозозависимым образом (рис. 2f), предполагая, что лизосомное повреждение является вероятным механизмом, с помощью которого CLC могут индуцировать секрецию IL-1β макрофагами. Сборка инфламмасом может быть визуализирована с помощью перехода ASC из диффузной цитозольной локализации в точечную структуру, называемую пятнышком ASC (Stutz et al., 2013; Hoss et al., 2017). Поэтому мы выполнили иммунофлуоресцентное окрашивание ASC в LPS-примированных hMDM, стимулированных CLC.Используя конъюгированные с флуорохромом антитела против ASC или соответствующие изотипу конъюгированные с флуорохромом IgG, мы выявили образование пятен ASC в hMDM, которые фагоцитируют CLC in vitro (рис. 3a).

Рис. 3 CLCs активируют инфламмасому NLRP3 в макрофагах человека.

( a ) Конфокальная визуализация LPS-примированных (2 нг / мл, в течение 3 часов) hMDM, стимулированных CLC (2 на макрофаг) в течение 6 часов. Клетки фиксировали и окрашивали непосредственно меченными Alexa Fluor 647 (AF647) антителами против ASC или равными количествами контрольных mAb изотипа AF647-IgG.Плазменная мембрана (красный, WGA-AF555), ядро ​​(темно-синий, Hoechst 34580), ASC (зеленый, AF647) и ХЖК (голубой, отражение лазера). Данные представляют два независимых эксперимента. ( b ) Измерение HTRF IL-1β в LPS-примированных (2 нг / мл, 3 часа) макрофагах человека, которые не подвергались лечению или дополнительно стимулировались CLC (2 на макрофаг, 6 часов), кристаллами кремнезема (100 мкг / мл, 6 часов), кристаллы холестерина (250 мкг / мл, 6 часов), нигерицин (10 мкМ, 1,5 часа) или PrgI (2 мкг / мл, 3 часа) вместе с LFn-PA (0.5 мкг / мл) в присутствии возрастающих концентраций ингибитора NLRP3 CRID3 (0, 2,5, 5 или 10 мкМ) или ингибитора каспазы-1 VX-765 (0, 5, 10 или 30 мкМ). Столбцы представляют собой среднее значение и SEM объединенных данных из пяти независимых экспериментов. Каждый символ представляет значения от разных доноров. Те же самые точки данных для IL-1β для hMDM, обработанных CLC, в отсутствие ингибиторов представлены в b и c .

В соответствии с ролью инфламмасомы NLRP3 во внутриклеточном восприятии CLC, специфическое ингибирование NLRP3 и каспазы-1 с помощью соединений CRID3 (Coll et al., 2015) и VX-765, соответственно, устраняли вызванное CLC высвобождение IL-1β с помощью hMDMs (рис. 3b-c). Напротив, ответ на активацию инфламмасомы NAIP-NLRC4, тестируемый посредством доставки игольчатого белка системы секреции острова 1 патогенности 1 типа III (PrgI) Salmonella в цитозоль, не подвергался влиянию ингибитора NLRP3 CRID3, демонстрируя специфичность. . Эти данные показывают, что, подобно кремнезему (Hornung et al., 2008), мочевой кислоте (Martinon et al., 2006a) и кристаллам холестерина (Duewell et al., 2010), CLC индуцируют активацию и высвобождение IL-1β из hMDMs путем активации инфламмасомы NLRP3.

CLCs индуцируют активацию инфламмасом

in vivo

Одна из основных функций цитокинов семейства IL-1 — стимулировать рекрутирование иммунных клеток, таких как нейтрофилы и моноциты, что ограничивает распространение инфекции и инициирует восстановление тканей (Dinarello , 2009). Активация инфламмасомы in vivo характеризуется сильной инфильтрацией нейтрофилов в ткани (Satoh et al., 2013), а тканевая нейтрофилия — отличительный признак аутовоспалительных заболеваний, вызванных IL-1 (Bonar et al., 2012; Broderick et al., 2015). Поэтому мы использовали хорошо зарекомендовавшую себя модель перитонита у мышей (Yanagida et al., 2013; Duewell et al., 2010; Hornung et al., 2008), чтобы оценить, способствуют ли также ХЛК инфильтрации нейтрофилов, что может указывать на активацию инфламмасом в vivo . Мы вводили мышам C57BL / 6 дикого типа внутрибрюшинно PBS или CLC. Кристаллы кремнезема использовали в качестве положительного контроля, поскольку сообщалось, что эти кристаллы вызывают IL-1R-зависимую нейтрофильную инфильтрацию in vivo (Hornung et al., 2008; Курода и др., 2011). ХЛК вызывают перитонит, характеризующийся массивной инфильтрацией нейтрофилов (CD11b + , Ly6G + , Ly6C int ) и воспалительных моноцитов (CD11b + , Ly6G , Ly6C + -b) (Рис. 4a ) в полость брюшины. Следует отметить, что визуализация клеток, извлеченных из PELF, выявила присутствие нейтрофилов и моноцитов, которые имели фагоцитированные CLC (фиг. 4c и фиг. S2), подтверждая, что CLC также фагоцитируются in vivo .

Рис. 4 CLC вызывают рекрутирование нейтрофилов in vivo .

( a ) Проточно-цитометрический анализ, показывающий стратегию гейтирования и точечные диаграммы, используемые для количественного определения клеток в жидкостях перитонеального лаважа (PELF) мышей C57BL / 6 через 6 часов после внутрибрюшинной инъекции 100 мкл только PBS или PBS, содержащего 100 мкг кристаллов кремнезема или 1⨯10 6 ХЖК. Цифры в регионах показывают процентное соотношение ячеек. ( b ) Количественное определение живых (7AAD ) нейтрофилов (CD11b + Ly6G + ) и воспалительных моноцитов (CD11b + Ly6C + Ly6G ) у мышей с помощью проточной цитометрии вводил я.п. с PBS или кристаллами. Каждый символ представляет отдельную мышь; маленькие горизонтальные линии указывают среднее значение и стандартное отклонение. ( c ) Конфокальная микроскопия клеток в PELF мышей, которым инъецировали CLC, как описано в b . Моноциты (красный, Ly6C-AF647), нейтрофилы (зеленый, Ly6G-FITC), ХЛК (синий, отражение лазера). Стрелки указывают на CLC с их характерной морфологией, которые были фагоцитированы нейтрофилами и моноцитами. Масштабные линейки: левая панель 42 мкм, средняя и правая панели 9 мкм.

Хотя перитонеальная инъекция CLC полезна для оценки индуцированного кристаллами воспаления in vivo , она не представляет собой физиологически релевантный сайт для образования CLC. ХЛК часто обнаруживались в дыхательных путях и мокроте пациентов с различными широко распространенными респираторными заболеваниями, такими как астма (Dor et al., 1984). Чтобы подтвердить, индуцируют ли ХЛК активацию инфламмасом in vivo в легких и локально связать поглощение ХЛК с активацией инфламмасом, мы выполнили интратрахеальную инстилляцию ХЛК в легкие мышей с трансгенным репортером ASC-mCitrine (Tzeng et al., 2016). Мышам ASC-mCitrine закапывали либо PBS, либо CLC, либо кристаллы кремнезема. Через шесть часов после инстилляции мы оценивали инфильтрацию нейтрофилов, образование mCitrine-флуоресцентных пятен ASC и продукцию провоспалительных цитокинов в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа (BALF). У мышей, которым вводили CLC, обнаруживалось большое количество нейтрофилов в ЖБАЛ (рис. 5а). Очень мало или совсем не нейтрофилов (CD11b + , Ly6G + , Ly6C int ) было обнаружено в ЖБАЛ мышей, которым вводили PBS.В соответствии с наблюдениями на модели перитонита мы обнаружили, что клетки, выделенные в ЖБАЛ, содержали фагоцитированные CLC. Это сопровождалось образованием пятен ASC-mCitrine, что было дополнительно подтверждено окрашиванием пятен ASC-mCitrine непосредственно конъюгированным с Alexa-647 антителом против ASC (рис. 5b и S3). Измерения IL1-β, присутствующего в BALF, показали заметное увеличение этого провоспалительного цитокина через шесть часов после инъекции кристаллов кремнезема или CLC по сравнению с животными, которым инъецировали PBS.Уровни TNF, независимого от инфламмасомы провоспалительного цитокина, также были повышены в BALF мышей, получавших CLC (фиг. 5c).

Рис. 5 CLC вызывают активацию инфламмасом в легких.

( a ) Количественное определение живых (7AAD ) нейтрофилов (CD11b + Ly6G + ) в жидкости бронхиального лаважа (ЖБАЛ) трансгенных мышей ASC-mCitrine через 6 часов после интратрахеального введения 60 мкл одного PBS, или 60 мкл PBS, содержащего 1 мг кристаллов диоксида кремния, или 3.5 × 10 6 CLC. Каждый символ представляет отдельную мышь; маленькие горизонтальные линии указывают среднее значение и стандартное отклонение. ( b ) Конфокальная визуализация клеток, присутствующих в ЖБАЛ трансгенных мышей ASC-mCitrine, интратрахеально инстиллированных CLC, показывающая образование агрегатов ASC в их цитозоле. Уровни цитокинов ASC (зеленый, mCitrine), нейтрофилов (пурпурный, Ly6G-A647), anti-ASC (красный, Anti-ASC A555. ( c ) IL-1β и TNF-α в ЖБАЛ трансгенных мышей ASC-mCitrine обрабатывается как описано в a .Каждый символ представляет отдельную мышь; маленькие горизонтальные линии указывают среднее значение и стандартное отклонение.

В целом, наши данные показывают, что ХЛК вызывают активацию воспаления in vivo и предполагают, что их накопление в тканях может быть важным фактором хронического воспаления тканей после инфильтрации эозинофилов.

Заключительные замечания

Наше исследование выявляет ранее недооцененную воспалительную способность CLC и открывает новые возможности для рассмотрения иммуногенности и потенциальной значимости этих кристаллов для лечения распространенных хронических иммунологических заболеваний, таких как астма.

ХЛК обнаружены в мокроте больных астмой с эозинофилией (Dor et al., 1984; Sakula, 1986). Хотя пациенты с астмой могут демонстрировать гетерогенные фенотипы, важным молекулярным механизмом астмы является воспаление 2 типа, которое характеризуется увеличением титров IgE, привлечением эозинофилов и преобладанием клеток T H 2, которые секретируют IL-4. , Ил-5 и Ил-13 (Fahy, 2015). Иммунитет 2 типа также может влиять на экспрессию классических провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, которые могут способствовать развитию хронического воспаления.В соответствии с этими наблюдениями, эндогенные молекулярные структуры, связанные с опасностью (DAMP), включая кристаллы мочевой кислоты, традиционно известные как причина воспаления при подагре, являются сильными адъювантами для иммунитета Th3 (Kool et al., 2008; 2011).

Действительно, было показано, что уровни IL-1β повышаются при астме, а количество макрофагов, экспрессирующих IL-1β, в бронхиальном эпителии пациентов с астмой выше по сравнению с контрольными субъектами (Sousa et al., 1996). Наши результаты показывают, что CLC, которые обычно обнаруживаются в жидкостях и тканях пациентов с эозинофилией, вызывают сильное высвобождение сильно провоспалительного цитокина IL-1β.Этот результат вместе с сообщением о ХЛК, обнаруженных в фагосомах макрофагов in vivo (Lao et al., 1998; Dvorak et al., 1990), предполагает, что поглощение CLC макрофагами и последующее высвобождение IL- 1β может быть одним из сигналов, которые сохраняют и усугубляют воспаление в тканях пациентов с эозинофильными расстройствами. В этой связи сообщалось, что IL-1β является критическим цитокином для развития подтипа с преобладанием Th3 / Th27 у пациентов с астмой (Liu et al., 2017). У пациентов с астмой с преобладанием Th3 / Th27 присутствуют двойные положительные клетки Th3 / Th27 в ЖБАЛ и проявляется тяжелая форма астмы. Более того, у этих пациентов наблюдается повышенное количество эозинофилов в ЖБАЛ. Присутствуют ли ХЛК, являющиеся признаком эозинофильных заболеваний, в ЖБАЛ пациентов с астмой с преобладанием Th3 / Th27 и является ли их распознавание альвеолярными макрофагами причиной повышенных уровней IL-1β у этих пациентов — это вопрос дальнейшие исследования. В этом сценарии ингибирование образования, поглощения CLC или эффектов высвобождения IL-1β — потенциально за счет блокирования активности NLRP3 — может принести пользу пациентам с астмой.

Результаты, представленные в этом исследовании, расширяют наше текущее понимание того, как кристаллизация белка способствует иммуногенности, и подчеркивают необходимость рассмотрения новых терапевтических стратегий, которые нейтрализуют кристаллизацию белка, затянувшуюся из-за активности гранулоцитов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

Реагенты

Сверхчистый липополисахарид (LPS) из E. Coli 0111: B4 и нигерицин были от Invitrogen, DRAQ5 от eBiosciences. Цитохалазин D был приобретен у Sigma и CA-074 Me у Enzo.Ингибитор каспазы-1 Belnacasan (VX-765) был от Selleckchem. Специфический ингибитор NLRP3 CRID3 (также известный как лекарственное средство 3, ингибирующее высвобождение цитокинов, или MCC950) был приобретен у Sigma-Aldrich. Наборы HTRF для человеческого IL-1β и TNF-α были получены от Cisbio Bioassays и использовались в соответствии с инструкциями производителя. Кристаллы холестерина получали, как описано ранее (Zimmer et al., 2016). Вкратце кристаллы получали из раствора холестерина с концентрацией 2 мг / мл в 1-пропаноле. Кристаллизацию вызывали добавлением 1.5 объемов воды без эндотоксинов. Кристаллы сушили и ресуспендировали в стерильном PBS.

Мыши

Мыши C57BL / 6 были приобретены из лаборатории Джексона (инвентарный номер 000664). Трансгенные мыши C57BL / 6 ASC-mCtrine (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm1.1 (CAG-Pycard / mCitrine * , -CD2 * ) Dtg / J) были приобретены из лаборатории Джексона ( Инвентарный № 030744). Мышей содержали в условиях, свободных от патогенов, и с ними обращались в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здравоохранения США и Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Медицинской школы Массачусетского университета.Трансгенные мыши C57BL / 6 ASC-mCtrine (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm1.1 (CAG-Pycard / mCitrine * , -CD2 * ) Dtg / J) были приобретены из лаборатории Джексона ( Инвентарный № 030744).

Клеточные линии

Клеточная линия AML 14.3D10 была любезно подарена Меган Шихан, Кассандрой С. Пол и Майклом А. Бауманом из Государственного университета Райта (WSU) Государственный университет Райта 3640 Полковник Гленн Хайвей, 304 Университетский холл, Dayton, OH 45435. Клетки AML14.3D10 культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen), 1% пенициллин / стрептомицин, 1x GlutaMAX и 1x пируват натрия (оба от Life Technologies) ( полная среда).

Первичные клетки человека

Бледно-желтая пленка от здоровых доноров была получена в соответствии с протоколами, принятыми наблюдательным советом учреждения Боннского университета (местное голосование по этике Lfd. Nr. 075/14). Первичные макрофаги человека получали путем дифференцировки моноцитов CD14 + в среде, дополненной 500 ед / мл rhGM-CSF (Immunotools) в течение 3 дней. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) получали из лейкоцитов здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности в Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare).PBMC инкубировали при 4 ° C с магнитными микрошариками, конъюгированными с моноклональными антителами против CD14 человека (Miltenyi Biotec). Таким образом, моноциты CD14 + были магнитно помечены и изолированы с использованием колонки MACS, помещенной в магнитное поле, как указано производителем (Miltenyi Biotec). Макрофаги, происходящие из моноцитов, культивировали в полной среде во время всех экспериментов.

Приготовление CLC

CLC выделяли в соответствии с адаптированной версией протокола, опубликованной в другом месте (Ackerman JI 1980).Все этапы выполнялись при 4 ° C, чтобы избежать деградации белка, и в стерильных условиях с использованием шкафа биобезопасности класса II и стерильных реагентов. По крайней мере, 600 × 10 6 клеток AML14.3D10 дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) (Life Technologies) и ресуспендировали в гипотоническом (0,15% NaCl) PBS, дополненном коктейлем комплексных ингибиторов протеазы (Roche) (буфер для лизиса). На каждый мл осадка клеток использовали 1 мл буфера для лизиса для ресуспендирования клеток. Затем ресуспендированные клетки лизировали при 4 ° C с использованием измельчителя тканей Dounce.В соответствии с включением красителя трипанового синего для лизиса> 90% клеток потребовалось 30 штрихов. ДНК и большие мембраны удаляли центрифугированием лизатов при 1000 × g в течение 10 минут при 4 ° C. Осадки ресуспендировали в 500 мкл буфера для лизиса, и суспензию снова центрифугировали при 1000 × g в течение 10 минут при 4 ° C для извлечения любого растворимого белка, который мог быть захвачен осадком мембран. Супернатанты от обеих стадий центрифугирования объединяли и дополнительно центрифугировали при 40000 × g в течение 20 минут при 4 ° C для удаления мембран органелл и клеточного мусора.Осадки отбрасывали, а супернатанты снова центрифугировали при 40000 × g в течение 30 минут при 4 ° C. Супернатанты объединяли, и их объем уменьшали до ~ 1 мл центрифугированием при 3200 × g на центробежном фильтре Amicon Ultra-15 с мембраной с NMWL 10 кДа (EMD Millipore). Этот очищенный и концентрированный белковый лизат уже содержал CLC в суспензии с остальными мембранами и белковые преципитаты, когда его наблюдали под микроскопом. CLC разделяли центрифугированием при 750 × g в течение 5 минут при 4 ° C.Супернатанты выдерживали в течение 16 часов при 4 ° C, а позже их исследовали на наличие дополнительных CLC. Этот второй набор CLC был разделен центрифугированием при 750 × g в течение 5 минут при 4 ° C и смешан с предыдущим набором. Комбинированные CLC ресуспендировали в холодном PBS и тщательно промывали (минимум 6 раз) до тех пор, пока CLC не были в основном свободны от загрязнений при наблюдении под микроскопом. После всех стадий промывки подсчитывали CLC и разбавляли полной средой, использованной для стимуляции макрофагов.

Белковые гели и вестерн-блоттинг

Образцы, обогащенные белком, в процессе генерации ХЖК смешивали с буфером для образцов NuPAGE® LDS (4X) и с восстанавливающим агентом NuPAGE® (10X) (оба от ThermoFischer Scientific) после нагревания при температуре 85 ° C в течение 10 минут, чтобы денатурализовать и уменьшить количество всех белков, присутствующих в образцах.

Денатурализованные и восстановленные белки разделяли в геле NuPAGE 12% Bis-Tris (ThermoFischer Scientific) в электрофоретических условиях в буфере MES.После электрофореза белки в геле окрашивали красителем Кумасси бриллиантовый синий R-250 (ThermoFischer Scientific) в течение десяти минут. Гели обесцвечивали в обесцвечивающем растворе (15% изопропанол + 10% ацетон в воде) в течение 16 часов. В качестве альтернативы белки в геле переносили на PVDF-мембрану Immobilon-FL (Millipore). Неспецифическое связывание блокировали 3% BSA в трис-буферном солевом растворе (TBS) в течение 1 ч с последующей инкубацией в течение ночи с кроличьим моноклональным антителом против галектина-10 человека (EPR11197Abcam, разведение 1: 10000) в 3% BSA в TBS с 0.1% Твин-20 (TBS-T). Мембраны трижды промывали TBS-T и инкубировали в течение 2 часов с ослиным антителом против кролика IRDye 680RD (Licor) в TBS-T. Мембраны промывали два раза TBS-T и последний раз TBS перед измерением флуоресцентного сигнала в инфракрасном сканере Odissey модели 9120.

Immunocytochemistry

Клетки фиксировали в PBS, содержащем 4% метанола без формальдегида (Thermo Scientific), в течение 15 минут. при комнатной температуре. После фиксации мембраны окрашивали агглютинином зародышей пшеницы (WGA) -Alexa Fluor 555 (Invitrogen) в концентрации 5 мкг / мл в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.Фиксированные клетки инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с PBS, содержащим 10% козьей сыворотки, 1% FBS, 0,5% Triton X-100 (блокирующий / проницаемый буфер), а затем инкубировали в течение ночи при 4 ° C с 0,1 мкг / мл мыши. моноклональное антитело против ASC (клон HASC-71, Biolegend), непосредственно меченное AF647 или его соответствующий контроль изотипа, также меченное AF647. Клетки промывали трижды блокирующим / проницаемым буфером. Ядра окрашивали DRAQ5 (1: 5 000, Thermo Fischer).

Микроскопия

Конфокальная микроскопия была объединена с флуоресцентной микроскопией с использованием конфокальной системы Leica TCS SP5 SMD (Leica Microsystems, Вецлар, Германия).Изображения были получены с использованием объектива 63X с числовой апертурой 1,2 и проанализированы с помощью программного обеспечения Volocity 6.01 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Для лучшей видимости в некоторых случаях были отрегулированы яркость и контраст, и все изображения в рамках одного эксперимента были применены в равной степени к контролю изотипа и условиям окрашивания.

In vivo перитонеальная инъекция CLC

Мышей C57BL / 6 подвергали воздействию кристаллов путем перитонеальной инъекции 100 мкл PBS, содержащего либо 1 × 10 6 CLC, либо 100 мкг кристаллов кремнезема, либо ничего.Через 6 часов мышей умерщвляли и 6 мл раствора для лаважа (RPMI + 3 мМ ЭДТА) вводили в брюшину мышей, как описано в другом месте (Yanagida et al., 2013). После массирования растянутой брюшной полости жидкость перитонеального лаважа (PELF) извлекали и разделяли на клеточную фракцию и жидкую фракцию центрифугированием при 350 × g при 4 ° C в течение 5 минут. Эти клетки анализировали с помощью проточной цитометрии для определения рекрутирования нейтрофилов, а также наблюдали под микроскопом (Leica SP5) для идентификации клеток, которые фагоцитировали CLC.

Интратрахеальная инстилляция кристаллов

Мышам C57BL / 6 ASC-mCitrine вводили дозу 1 мг кристаллов кремнезема или 3,5 × 10 6 ХЛК в 60 мкл PBS. Суспензию образца однократно вводили интратрахеально анестезированным изофлураном животным с помощью шприца через катетер, введенный в дыхательные пути. Контрольной группе вводили только PBS. Мышей умерщвляли через 6 часов после закапывания и собирали 3 мл жидкости бронхоальвеолярного лаважа для определения общего количества клеток, нейтрофилов (7AAD , CD11b + , Ly6G + ) и уровней цитокинов с помощью HTRF.

Анализы набора нейтрофилов

Клетки, выделенные в PELF или BALF, ресуспендировали в 2 мл окрашивающего раствора (PBS + 2% FCS) и подсчитывали с помощью гемоцитометра. Для идентификации нейтрофилов и моноцитов 250 мкл клеток окрашивали меченными флуорохромом антителами против CD11b (клон M1 / ​​70, Biolegend), Ly-6G (клон 1A8, BD Biosciences) и Ly-6C (клон ER-MP20, Bio- Rad) или их соответствующий меченный флуорохромом изотип Ig. После окрашивания 7AAD (BD Biosciences) для исключения мертвых клеток клетки анализировали в проточном цитометре MACSQuant Analyzer 10.

Измерение уровней цитокинов в BALF

Жидкую фракцию BALF концентрировали с использованием центробежных фильтров Amicon Ultra-2 мл 10K. Количества мышиного IL-1β и мышиного TNF-α в концентрированном BALF были количественно определены с использованием набора для анализа HTRF (Cisbio Bioassays) и нормализованы по объему концентрированного лаважа.

Статистический анализ

Если не указано иное, все данные объединены как минимум из 3 независимых экспериментов, проведенных на макрофагах от разных доноров.Для очистки отдельные эксперименты обозначены символами на графиках. Каждый символ представляет средние значения из трех технических повторений от отдельного донора. Данные представлены в виде среднего значения, планки ошибок показывают стандартное отклонение (стандартное отклонение при объединении из двух независимых экспериментов) или ошибку среднего значения (стандартное отклонение среднего значения (стандартное отклонение при объединении из трех или более независимых экспериментов). Достоверность различий между группами оценивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с повторными измерениями с помощью постсравнительного теста Холма-Сидака и поправки Гейссера-Гринхауса.Статистический анализ проводился с помощью Graphpad Prism (версия 6.0). Данные считались значимыми при p <0,05 (*), 0,01 (**), 0,001 (***) или 0,0001 (****).

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Меган Шихан, Кассандру С. Пол и Майкла А. Баумана из Государственного университета Райта (WSU) за линию клеток AML 14.3D10. Благодарим Максимилиана Рота за техническую помощь. Мы благодарим Фэн Шао (Национальный институт биологических наук, Пекин 102206, Китай) за плазмиду, кодирующую белок-конъюгат с защитным антигеном PrgI, а также Маттиаса Гейера и Дэвида Фусхёллера за очищенный белок PrgI, используемый здесь для активации воспаления NLRC4.B.S.F. поддерживается грантом Европейского исследовательского совета (PLAT-IL-1) и Немецкого исследовательского фонда (DFG, SFBTRR57). B.S.F, E.L. и Н.Г. являются членами кластера передового опыта ImmunoSensation. Н.Г. поддерживается грантами DFG (SFB704 и GRK2168). E.L. поддерживается грантами DFG (SFB645, 704, 670, 1123, TRR57, 83) и Европейского исследовательского совета (InflammAct).

(PDF) Значение кристаллов Шарко-Лейдена в аспирате печени

79

Journal of Cytology / April 2009 / Volume 26 / Issue 2

дал хороший ответ.Другой возможностью такой презентации

может быть заражение Capillaria hepatica, но обычно

поражает маленьких детей, живущих в антисанитарных условиях

, зараженных крысами; здесь такой истории не было.

У взрослых с аналогичными клиническими признаками заболевания печени

рентгенологически очевидное одиночное поражение печени

вместе с периферической эозинофилией может представлять собой диагностическую проблему

.Дифференциальный диагноз в этих случаях может включать

заражение фасциолами, воспалительную псевдоопухоль и

неопластическое поражение. В азиатских странах Fasciola gigantic встречается более

, чем Fasciola hepatica. [4] Какой бы ни была причина, заражение Fasciola

проявляется острым заболеванием с симптомами лихорадки,

боли в животе, головной боли, сыпи или крапивницы. [6] Двухфазный паттерн периферической эозинофилии

очень распространен [6], а результаты функционального теста печени

либо нормальны, либо слегка повышены.[6]

Одиночные или множественные мигрирующие абсцессы, которые меняются по форме, размеру и положению

со временем и очевидны радиологически

, особенно при компьютерной томографии, являются очень характерной чертой

заражения фасциолами [6]. В хронической стадии у пациента

могут отсутствовать симптомы или могут быть эпизоды некоторых неспецифических симптомов

[6]. В данном случае, хотя признаки

весьма наводили на мысль о заражении фасциолами, это было

, которое не считалось диагнозом из-за его редкости в Индии

и невозможности обнаружить каких-либо паразитов.

Воспалительная псевдоопухоль печени — это редкое доброкачественное образование

, которое имеет признаки лихорадки, боли и образования в печени.

Этиология и патогенез неизвестны, но возможными причинами могут быть инфекция

или паразитарное заражение. Три случая

, описанные в литературе, включают один случай, вызванный кишечной палочкой,

другой — грамположительными кокками, а в третьем случае в поражении печени были обнаружены личинки аскарид

.[9] Мазки аспирации тонкой иглой

, а также биопсия, в основном показывают интенсивную воспалительную реакцию

(нейтрофилы, эозинофилы, гистиоциты,

и лимфоциты) вместе с кристаллами Шарко-Лейдена. [9] В

настоящей серии в случае 2 воспалительная реакция не была достаточно серьезной

, чтобы рассматривать случай как воспалительную псевдоопухоль

.

У взрослых возможность неопластических и метастатических поражений

также должна быть исключена на основании наличия преобладающего воспалительного инфильтрата эозинофилов

и отсутствия гиперхроматических плеоморфных клеток

.[6,12] Наконец, принимая во внимание

результаты аспирации тонкой иглой из поражения печени

женщины (обильные гексагональные игольчатые кристаллы Шарко-Лейдена

на фоне дегенерированных гепатоцитов, некротический материал

и смешанный воспалительный инфильтрат преимущественно

, состоящий из эозинофилов с плохо сформированными эпителиоидными (

гранулемами) вместе с периферической эозинофилией, поскольку

косвенное свидетельство паразитарной инвазии, пациент

лечился антигельминтными средствами и показал заметное улучшение.

Возможность «эозинофильной гранулемы» (гистиоцитоз клеток Лангерганса

), которая также может содержать многочисленные кристаллы Шарко-Лейдена

на фоне эозинофилов [11], была исключена из-за

из-за отсутствия характерных гистиоцитов со складчатыми или сложенными формами.

ядра с бороздками (клетки Лангерганса).

Кристаллы Шарко-Лейдена с эозинофилами — обычная находка

в образцах стула пациентов с амебным энтеритом

.Однако они редко встречаются в гное из амебного абсцесса печени

, который в основном состоит из некрозированных воспалительных клеток

и паренхиматозных клеток, эритроцитов и трофозоитов

E. histolytica. [11]

Оба случая подчеркивают, что наличие большого количества кристаллов Шарко-Лейдена

на фоне эозинофилов

или эозинофильной гранулемы в мазках из тонкоигольной аспирации

из поражений печени может быть косвенным свидетельством паразитарного заражения

в отсутствие явного паразита.Эти

пациентов должны получить противогельминтное лечение до

с учетом других диагнозов даже у взрослых, особенно в развивающейся стране

, такой как Индия, где частота заражения паразитами

высока.

Ссылки

1. Генри Дж. Б.. Клиническая диагностика и ведение лабораторными методами.

21 изд. Филадельфия: Сондерс; 2001. с. 484-503.

2. Арчер Г.Т., Блэквуд А. Образование кристаллов шарко-лейдена в эозинофилах и базофилах человека

и изучение состава выделенных кристаллов

.J Exp Med 1965; 122: 173-80.

3. Каплан К.Дж., Гудман З.Д., Исхак К.Г. Эозинофильная гранулема печени

: характерное поражение, связанное с висцеральной мигрирующей личинкой.

Am J Surg Pathol 2001; 25: 1316-21.

4. Деннис Л.К., Юджин Б., Энтони С.Ф. Принципы внутренней медицины Харрисона

. Том 1, 16 изд. США: Макгроу-Хилл; 2005. с. 1271-2.

5. Pereira FE, Musso C, Castelo JS. Патология гнойного абсцесса печени

у детей.Педиатр Дев Патол 1999; 2: 537-43.

6. Маклин Дж. Д., Грэм-Кук FM. Случай 12-2002. Мужчина, 50 лет,

, с эозинофилией и пульсирующими поражениями печени. N Engl J Med

2002; 346: 1232-9.

7. Леоне Н., Баронио М., Тодрос Л., Дэвид Е., Брунелло Ф, Артиоли С. и др.

Поражение печени в мигрирующих личинках Toxocara canis: отчет о случае

с патологическими и рентгенологическими данными. Dig Liver Dis 2006; 38: 511-4.

8.Хартлеб М., Янушевский К. Тяжелое поражение печени висцеральной личинкой

migrans. Eur J Gastroenterol Hepatol 2001; 13: 1245-9.

9. Цзи XL, Шэнь М.С., Инь Т. Воспалительная псевдоопухоль печени или паразитарная гранулема

. Всемирный журнал J Gastroenterol 2000; 6: 458-60.

10. Бхатия В., Сарин С.К. Мигрирующая висцеральная личинка печени: эволюция поражения

, диагностика и роль терапии высокими дозами альбендазола. Am J

Gastroenterol 1994; 89: 624-7.

11. Арора В.К., Сингх Н., Бхатиа А. Кристаллы Шарко-Лейдена в игле Эне

аспирационная цитология. Acta Cytol 1997; 41: 409-12.

12. Райан Р.С., Аль-Хашими Х., Ли М.Дж. Абсцессы печени у пожилых пациентов

, имитирующие метастатическое заболевание. Ir J Med Sci 2001; 170: 251-3.

Источник поддержки: нет, конфликт интересов: не объявлен.

Мисра и др .: Кристаллы Шарко-Лейдена в аспирате печени

[Загружается бесплатно с http: // www.jcytol.org в субботу, 31 марта 2018 г., IP: 181.49.64.233]

Введение, обнаружение и его клиническое значение

Введение кристалла Charcot Leyden

Кристалл

Charcot Leyden происходит от фамилий описателей Жан-Мартена Шарко и Эрнста Виктора фон Лейдена. Он состоит из эозинофильного связывающего лизофосфолипазу белка, называемого галектином-10. Это микроскопический кристалл, который можно наблюдать под микроскопом в таких образцах, как стул, мокрота и плевральная жидкость людей, страдающих аллергическими и паразитарными заболеваниями.

Внешний вид кристалла Шарко – Лейдена

Он различается по размеру и может достигать 50 мкм. Он тонкий и заострен с обоих концов, как показано на рисунке выше.

Обнаружение кристалла Шарко-Лейдена

Может появляться в таких образцах, как моча, мокрота, стул и даже некоторые биологические жидкости пациента, страдающего паразитарной инфекцией.

Клиническое значение внедрения кристалла Charcot Leyden

Кристалл Шарко-Лейдена указывает на заболевание, сопровождающееся эозинофильным воспалением или пролиферацией.Аллергические реакции, такие как астма, бронхит, аллергический ринит и риносинусит, а также паразитарные инфекции, такие как амебиаз и анкилостомоз. патологически часто наблюдаются у пациентов с бронхиальной астмой.

Примечания: Гнойные клетки, эритроциты и кристаллы C L в плевральной жидкости под микроскопом

Кристалл Charcoat Leyden (CL) в микроскопии кала —

Дополнительная литература

  1. Медицинская паразитология Меркель и Фоге
    9-е издание.
  2. Паразитология: 12-е издание
    К. Д. Чаттерджи
  3. Районная лабораторная практика в тропических странах — Часть I.
    Моника Чизбро.
  4. Справочник по клиническим микробиологическим процедурам Isenberg
    2-е издание. Vol. 2
  5. Атлас медицинской гельминтологии и птозоологии -4 изд. -П.Л. Чиодини, А.Х. Муди, Д.В. Мансер
  6. Медицинская паразитология Абхая Р. Сатоскара, Гэри Л. Саймона, Питера Дж. Хотеза и Мории Цуджи
  7. Атлас паразитологии человека, Лоуренс Р. Эш, Томас К.Орихель, 3-е изд. Издательство ASCP Press, Чикаго.
  8. Молекулярная медицинская паразитология. Редакторы: Дж. Джозеф Марр, Тимоти В. Нильсен и Ричард В. Комунецки, издательство Academic Press, отпечаток Elsevier Science.
  9. Принцип паразитологии Топли и Уилсона. Редакторы: М. Parker & amp; Л. Х. Коллиер, 8-е изд 1990 г., издание издателя Эдварда Арнольда, Лондон.

Abstract A83: Опосредованный лентивирусами shRNA нокдаун эозинофильных кристаллов галектина-10 / Шарко-Лейдена: новый подход к иммунотерапии рака

Аннотация: Седьмая конференция AACR по науке о различиях в состоянии здоровья у расовых / этнических меньшинств и лиц с недостаточным медицинским обслуживанием; 9-12 ноября 2014 г .; San Antonio, TX

Abstract

Введение: Несмотря на открытие многообещающих противораковых иммунотерапевтических стратегий, таких как противораковые вакцины, цитокины и терапия на основе Т-клеток, лечебные результаты остаются неуловимыми.Мы исследовали эозинофил как потенциальную противораковую эффекторную клетку и ранее сообщили о способности эозинофилов и их изолированных гранулированных белков ингибировать рост клеток рака предстательной железы и молочной железы in vitro. В некоторых опухолях эозинофилия, связанная с опухолью, характеризуется отложением заметного эозинофильного белка, кристаллов галектина-10 / Шарко-Лейдена. Мы предположили, что галектин-10, как и другие аналоги лектина, играет ключевую роль в противораковом иммунном ответе.В большом количестве исследований была установлена ​​связь галектина и рака, и были определены важные роли в качестве промоторов или ингибиторов опухолей. Также было показано, что некоторые опухоли используют галектины в своих механизмах уклонения от опухолевого иммунитета. Кроме того, исследования siRNA-опосредованного нокдауна продемонстрировали экспрессию галектина-10 в регуляторных Т-клетках (Treg) — клетках, которые, как было показано, играют важную роль в регуляции противораковых иммунных ответов, — и его механическую необходимость в поддержании анергии Treg и подавляющей функции на CD4 + T-лимфоцитарная пролиферация.Несмотря на то, что галектин-10 был задокументирован на многочисленных участках опухоли, прогностическое значение галектина-10 в разрешении опухоли требует дальнейшего изучения. Роль белка в подавлении Treg Т-лимфоцитов и участие других галектинов в иммунном ответе опухоли, однако, подтвердила его клиническое значение в отношении опухоли и вероятность того, что галектин-10 модулирует опосредованные эозинофилом эффекты на Т-лимфоциты могут влиять на иммунологическую защиту от рака. В настоящем исследовании мы решили создать сублинию нокдауна эозинофилов галектина-10 путем трансфекции GRC.014.24 (линия эозинофильных клеток, созданная в нашей лаборатории), с shRNA лентивирусными частицами трансдукции и, после этого, провести дальнейшие исследования, чтобы изучить потенциал эозинофильного галектина-10 по увеличению возвращения Т-клеток к опухолям.

Экспериментальная процедура. Вкратце, GRC.014.24 (2 × 104 клеток / мл) трансфицировали галектин-10-специфичными лентивирусными векторами трансдукции. Пуромицин использовали для отбора стабильных трансдуктантов; Методы ПЦР и иммунофлюоресценции для определения эффективности трансдукции.

Результаты: мы показали, что лентивирусная частица кшРНК, специфичная для галектина-10, оказывала 100% -ное влияние на молчание гена; этот клон эозинофилов лишен экспрессии как гранулярных, так и цитоплазматических белков.

Заключение: создание нокдаун-эозинофилов галектина-10 представляет собой полезную модель для исследования способности эозинофильного галектина-10 модулировать доступ к Т-клеткам и самонаведение к опухолям, а также предполагаемую роль, аналогичную Treg-галектину-10, в регуляции опухолевых Т-лимфоцитов. распространение, конечно, можно предвидеть.Рассмотрение нокдаун-эозинофилов галектина-10 в качестве единственного подхода к иммунотерапии рака или в сочетании с другими противораковыми методами лечения, такими как адоптивная терапия Т-клетками или терапевтические противораковые вакцины, является интригующим.

Примечание: Данный тезис не был представлен на конференции.

Формат цитирования: Кристин А. Кларк, Кларенс М. Ли, Ибрагим Ланиян, Полетт Ферберт-Харрис. Лентивирусный shRNA-опосредованный нокдаун эозинофильных кристаллов Галектина-10 / Шарко-Лейдена: новый подход к иммунотерапии рака.[Аннотация]. В: Материалы седьмой конференции AACR по науке о неравенстве в отношении здоровья расовых / этнических меньшинств и лиц с недостаточным медицинским обслуживанием; 9-12 ноября 2014 г .; Сан-Антонио, Техас. Филадельфия (Пенсильвания): AACR; Биомаркеры эпидемиологии рака Prev 2015; 24 (10 Suppl): Abstract nr A83.

  • © Американская ассоциация исследований рака, 2015 г.

Молекулы | Бесплатный полнотекстовый | Краткая история исследований кристаллического белка Шарко-Лейдена / галектина-10

1. Кристаллы Шарко-Лейдена

Кристаллы Шарко-Лейдена (ХЖК), имеющие как гексагональную, так и бипирамидную формы, впервые были обнаружены в 1853 году Жаном-Мартином Шарко, который обнаружил крошечные кристаллы в сердечной крови и селезенке пациента, умершего от лейкемии [1].В 1872 году Эрнст Виктор фон Лейден также описал бесцветные кристаллы, обнаруженные в мокроте больных астмой [2]. После открытия ХЖК появилось много противоречивых сообщений о химической природе и значении этих кристаллов [3,4,5,6]. В то время было неизвестно, является ли CLC кристаллизованным белком. ХЛК даже ошибочно считали тем же, что и кристаллы секрета предстательной железы или ионные кристаллы [7,8]. В 1895 году Кон правильно пришел к выводу, что ХЛК, обнаруженные в лейкозной крови, в астматической мокроте, в полипах носа и в костном мозге, были одинаковыми и отличались от таковых, обнаруженных в секрете простаты [9].В 1914 г. о взаимосвязи CLCs и эозинофилов сообщил Schwarz [6], предложение, которое облегчило изучение CLC. Ранние работы показали, что CLCs могут быть обнаружены только у людей и приматов [5,10]. ХЛК не могли образовываться в эозинофилах морских свинок [11], а исследование крови лошади и кролика при различных стимулах также не дало кристаллов [5]. Однако один тип четырехгранных кристаллов наблюдался в эозинофилах мышей с пневмонией [12] и в макрофагах модели астмы у мышей [13].Однако эти кристаллы состоят из хитиназоподобного белка Ym1, но не из белка CLC [14]. Первичные структуры белка CLC человека и приматов больше похожи друг на друга, чем на другие виды [15]. Несмотря на то, что кажется, что ХЛК образуются только у людей и обезьян, любопытно, что они не встречаются у других видов, тем более что никаких надежных методов, таких как масс-спектроскопия, не использовалось для определения фактического состава кристаллов белка, обнаруженных у этих видов.

2.Неоднозначная история белка CLC / галецина-10

До того, как ген белка CLC был секвенирован, его неправильно считали лизофосфолипазой [16,17]. Хотя было обнаружено, что фермент 74 кДа представляет собой настоящую лизофосфолипазу [18], анализ методом pull-down показал, что белок CLC может взаимодействовать с этой лизофосфолипазой [19]. Это указывает на то, что первоначальный ферментный анализ на белок CLC был фактически загрязнен лизофосфолипазой. Ген белка CLC был картирован на хромосоме 19 человека [20], а позже более точно сопоставлен с хромосомой 19q13.2 Проектом «Геном человека» (http://www.genecards.org). Интрон-экзонная архитектура гена белка CLC сходна с таковой у галектинов, с углеводсвязывающим доменом (CRD), кодируемым одним экзоном [21]. Выравнивание первичной структуры аминокислотной последовательности белка CLC с другими галектинами показало, что белок CLC гомологичен углеводсвязывающему домену (CRD) (рис. 1) [22]. Более того, кристаллическая структура белка CLC показала, что он имеет очень похожую складку на CRD галектина [23].Из-за этого белок CLC был переименован в галектин-10 (Gal-10) [24]. В асимметричной единице кристалла Gal-10 есть только один мономер Gal-10, псевдоморф, который неточно отображал глобальную форму Gal10. Фактически, Gal-10 представляет собой гомодимерный белок в растворе [25]. До сих пор естественные лиганды Gal-10, включая белки и углеводы, полностью не идентифицированы. Однако есть несколько противоречивых результатов относительно специфичности связывания лиганда Gal-10. Твердофазный анализ показал, что Gal-10 может слабо связываться с лактозой и н-ацетил-d-глюкозамином, конъюгированным с агарозой [23,26].Однако три противоречивых результата показали, что слабая активность связывания углеводов может быть приписана связыванию Gal-10 дикого типа с матриксом сшитой агарозы (или сефарозы), а не с лактозой [19,25,27], а также кристаллической структурой Gal-10 показал, что он может связывать маннозу [23]. Недавно мы создали вариант Gal-10 (W127A), который существует в виде мономера и может слабо связываться с модифицированной лактозой сефарозой [28]. ХЛК, выделенные из эозинофилов человека, содержат 1,2% углеводов [29]. Масс-спектроскопия Gal-10, полученного из носовой жидкости, показала, что Gal-10 не гликозилирован, но может быть ацетилирован по Ser2 [30].Кристаллическая структура высокого разрешения Gal-10, которая была очищена из линии миелоидных лейкозных клеток человека, также показала отсутствие гликозилирования [23]. В целом, Gal-10 не гликозилирован и может слабо связываться с углеводом в нескольких условиях, например в его мономерном состоянии.

4. Структурные сравнения Gal-10 и других прототипов галектинов

С момента открытия Gal-1 в геноме человека были обнаружены четырнадцать генов галектинов [35,36,37,38]. Хотя у галектинов человека отсутствует последовательность сигнального пептида, они могут транспортироваться из цитоплазмы неизвестным путем.Недавнее сообщение показало, что Gal-3 секретируется из цитоплазмы посредством экструзии микросом [39]. При апоптозе или некрозе галектины также высвобождаются и регулируют функции соседних клеток [38]. Во внеклеточном матриксе галектины связываются с β-галактозидными единицами в полисахаридах, гликозилированных внеклеточных белках и гликозилированных липидах. Галектины также участвуют во многих физиологических функциях, таких как воспаление, иммунные ответы, миграция клеток, аутофагия и передача сигналов. Они также связаны со многими заболеваниями, такими как фиброз, рак и болезни сердца [38].Основываясь на структурных различиях, галектины подразделяются на три типа: тандемно-повторяющиеся, химерные и прототипные [37,40,41,42,43]. Каждый из этих типов имеет отличительную глобальную структуру. Галектины типа тандемных повторов, включая галектин-4, -8, -9 и -12, имеют два CRD, соединенных коротким линкерным пептидом [43]. До сих пор структура любого галектина тандемно-повторяющегося типа полной длины еще не решена в первую очередь из-за присущей ему гибкости структуры. Однако варианты Gal-8 и -9 с укороченными подобными пептидами могли быть кристаллизованы, и их структуры были решены [44,45].Gal-3, единственный галектин химерного типа, имеет длинный, богатый пролином повтор, коллагеноподобный N-концевой хвост [46]. Несмотря на то, что сообщалось о многих кристаллических структурах Gal-3 CRD [47,48,49,50], его N-концевой хвост очень гибкий и временно взаимодействует с F-гранью CRD [51], динамическая ситуация что исключает кристаллизацию лектина полной длины. Недавно была опубликована интересная кристаллическая структура Gal-3, показывающая, что короткий пептид из N-концевого хвоста Gal-3 может расширять β-лист F-стороны CRD [52].Хотя структуры некоторых прототипов галектинов (например, галектина-14, -16 и -17) еще не сообщены, большинство структур прототипа галектина известно [34,53,54,55,56]. Кристаллографические и биохимические анализы показывают, что Gal-1, -2, -7 и -10 образуют димеры посредством нековалентных взаимодействий [34,53,54,55]. Глобальные конформации Gal-1 и Gal-2 очень похожи с β-сэндвич-структура с таким же количеством бета-тяжей [53,54]. Сайты связывания углеводов этих галектинов расположены в противоположных сайтах в каждом CRD.Кристаллическая структура Gal-1 показывает, что каждый CRD связывает одну молекулу лактозы, что указывает на ее функциональную роль. Поскольку время кристаллизации относительно велико, связывание лактозы с двумя CRD не может происходить независимо. Фактически, результаты ЯМР продемонстрировали, что связывание одной молекулы лактозы с Gal-1 CRD может негативно регулировать связывание другой [57]. В кристаллической структуре Gal-2 одна молекула лактозы связывается с одним CRD, а другой сайт, как было обнаружено, занят остатком аспартата (Asp29) [54].Это похоже на то, как Gal-1 связывает лактозу в растворе. Однако из-за этого специфичность связывания лиганда Gal-1 отличается от специфичности связывания Gal-2, подразумевая, что эти два галектина выполняют разные функции in vivo. Gal-1, очищенный из эукариотических клеток, имеет более высокую молекулярную массу, чем Gal-1, очищенный из E. coli [58]. Это означает, что Gal-1 химически модифицирован in vivo. Более того, при низкой концентрации (7 мкМ) димеры Gal-1 могут диссоциировать, при этом его специфичность связывания лиганда отличается от димеров Gal-1 [59].Напротив, сообщалось, что Gal-1, даже при 2 мкМ, поддерживает димерное состояние [60,61], как показали структурные исследования ЯМР Gal-1 в растворе [57]. Было показано, что вариант Gal-1 с двойными мутациями (C2S / V5A) существует в виде мономера [62], причем его способность связывать сахар ниже, чем у лектина дикого типа [59]. Gal-1 имеет шесть остатков цистеина, которые могут окисляться [53]. Окисленная форма Gal-1 имеет более низкую специфичность связывания сахара по сравнению с полностью восстановленным состоянием [59]. Было высказано предположение, что основная функция окисленного Gal-1 — регулировать передачу сигнала в клетках [63,64].Более того, восстановленный Gal-1 может связываться с остатками галактозы гликанов внутри внеклеточного матрикса и, таким образом, может запускать пути передачи сигнала извне внутрь клетки [59]. Gal-7 образует димеры через свою F-грань, при этом несколько остатков образуют водород. и ионные связи, а также ван-дер-ваальсовы взаимодействия, которые способствуют его димерной структуре. Два мономера Gal-7 могут связываться с двумя молекулами галактозы [55]. Gal-10 высоко экспрессируется в эозинофилах [29]. Первая структура Gal-10, решенная с использованием Gal-10, очищенного из линии миелоидных лейкозных клеток человека [23], показала, что в каждой асимметричной единице присутствует только один мономер Gal-10.Недавно мы и Kamitori использовали PISA для предсказания взаимодействий между двумя CRD Gal-10 в двух отдельных асимметричных единицах, расположенных близко друг к другу, и предположили, что Gal-10 может димеризоваться [25,40]. Эта модель Gal-10 имеет структуру от S-граней до S-граней и значительно отличается от других прототипов галектинов (Рисунок 2). Гель-фильтрация подтвердила образование димеров Gal-10 в растворе [25]. Кроме того, ключевой остаток (Trp127) помогает опосредовать димеризацию Gal-10 [28]. Фактически, мутация Trp127 в аланин отменяет образование димера Gal-10.Gal-13 является необычным прототипом галектина в том смысле, что он образует димеры за счет дисульфидных связей, образованных между двумя остатками цистеина (Cys136 и Cys138) на С-конце его CRD [56]. Вариант с двумя мутациями (C136S / C138S) существует в виде мономера в растворе [56]. Анализы гемагглютинации показали, что DTT может ингибировать этот вариант, вызывающий агглютинацию эритроцитов, указывая на то, что структура димера Gal-13 имеет решающее значение для его функции. Конструктивное устройство Гал-7, -10 и -13 отличается от Гал-1 и Гал-2 (Рисунок 2).Хотя существует консенсус, что все галектины произошли от одного белка-предка, глобальная структура этих лектинов изменилась в ходе эволюции вместе с их соответствующими функциями. Взятые вместе, это указывает на то, что все галектины имеют разные глобальные формы и функции, хотя нет четкого ответа относительно того, почему и как эти прототипы галектинов получили разные структуры.

5. Специфичность связывания лиганда Gal-10

Сразу после завершения последовательности кДНК Gal-10 [22] Dyer et al., обнаружили, что первичная структура Gal-10 очень похожа на Gal-1 и Gal-3 [26]. Таким образом, было сделано предположение, что Gal-10 является членом семейства галектинов [21]. Твердый анализ можно использовать для проверки способности связывания Gal-10 с агарозой, модифицированной лактозой. Результаты показали, что Gal-10 может только слабо связываться с этими гранулами [23,26]. Однако три других отчета опровергают этот вывод [19,25,27]. Кроме того, кристаллическая структура показала, что Gal-10 может сокристаллизоваться с маннозой, но не с лактозой [23].Однако вариант (W127A), который существует в виде мономера, может связываться с гранулами агарозы, модифицированной лактозой [28]. Изучая гомодимерную структуру Gal-10, мы обнаружили, что остаток глутамата (Glu33) с S-стороны одного мономера непосредственно занимает сайт связывания углеводов другого мономера. Этот остаток глутамата может ингибировать связывание лактозы с Gal-10. Был создан вариант с мутацией Glu33 на аланин, и его кристаллическая структура показала, что этот вариант может совместно кристаллизоваться с лактозой.В целом поведение мутантов E33A и W127A указывает на то, что Gal-10 имеет функциональный сайт связывания углеводов, тогда как димерная структура влияет на связывание Gal-10 с β-галактозидами. Gal-1 может диссоциировать на мономеры [65]. Таким образом, димеры Gal-10 также могут диссоциировать таким же образом и могут связывать углеводы. Однако это предложение требует дальнейших экспериментов для проверки.

6. Методы окрашивания для CLC

Если размеры клеточных CLC достаточно велики, кристаллы можно непосредственно наблюдать с помощью световой микроскопии [66,67], фазово-контрастной микроскопии [68].Кроме того, поскольку Gal-10 в ХЖК содержит ароматические остатки, их можно непосредственно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии [69]. Однако, поскольку ХЖК обычно маленькие и бесцветные, их трудно непосредственно наблюдать с помощью световой микроскопии, если они не окрашены в цвет. Первая кроличья антисыворотка к человеческому Gal-10 была разработана в 1980 г. [70]; это антитело использовали для иммунофлуоресцентного окрашивания [71] и мечения иммунозолотой ТЕМ [72]. Иммунофлуоресцентное окрашивание CLCs обеспечило четкое наблюдение CLCs в базофилах человека [71].Кроме того, окрашивание по Маю-Грюнвальду-Гимзе и окрашивание по папаниколау может придавать ХЛК синий и оранжевый цвет соответственно [73,74,75]. CLCs можно было четко отличить от других клеточных органелл по окрашиванию гематоксилин-основным фуксин-пикриновой кислотой [76,77]. Окрашивание гематоксилином и эозином пурпурным было использовано для идентификации ХЛК в гранулоцитарной саркоме и в костном мозге [78,79]. Окрашивание по Райту-Гимзе позволяет отличать CLC от макрофагов от других клеток [79,80,81]. Кислотоустойчивое положительное окрашивание — это новый метод, который может эффективно окрашивать ХЛК и делать их отличимыми от других клеток [69].

7. Исследования промотора гена Gal-10

Некоторые соединения могут регулировать транскрипцию Gal-10 в клетках. Бутират может активировать свою транскрипцию в клетках промиелоцитарного лейкоза HL-60 [82]. Другое исследование показало, что GC-бокс перед сайтом начала транскрипции (от -44 до -50) фактически контролирует индукцию экспрессии гена бутиратом [83]. Напротив, диметилсульфоксид ингибирует транскрипцию Gal-10 в клетках крови [84], хотя механизм этого ингибирования остается неизвестным. Сайт инициации транскрипции Gal-10 был идентифицирован на 43 п.н. выше 5′-конца последовательности кДНК.Последовательность вышестоящей кДНК (от -1 до -411) содержит консенсусные сайты связывания для нескольких факторов транскрипции, включая GATA-1, PU.1, Oct и Sp.1 [82]. Еще одно исследование показало, что область от -1 до -1504 содержит несколько других сайтов связывания факторов транскрипции, таких как EoTF, NF-1, AP-2, AML1, которые могут повышать или понижать экспрессию Gal-10. Было обнаружено, что сайты связывания GATA-1 и EoTF необходимы для полной активности промотора [85]. Более того, нарушение GC-бокса (от -44 до -50) или сайта Orc (от -255 до -261) снижает активность промотора Gal-10.Кроме того, анализ супер-сдвига продемонстрировал, что факторы транскрипции Sp1 и Oct1 могут связываться с консенсусным GC box и Oct сайтом, соответственно [83]. Биоинформатическое исследование показало, что гомозиготы по минорному аллелю однонуклеотидных полиморфизмов в промоторной области CLC могут регулировать экспрессию Gal-10 и, таким образом, могут вызывать аллергический ринит [86].

9. Исследования ХЖК с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

В 1980-х годах просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) использовалась для определения распределения Gal-10 / CLC в лимфоцитах [72].Разрешение этих изображений было достаточным для анализа распределения Gal-10 / CLC в клеточных органеллах. Первая ПЭМ Gal-10 показала, что он был преимущественно локализован в незначительной (около 5%) субпопуляции первичных гранул эозинофилов. Эти мембраносвязанные цитоплазматические гранулы не содержат включений кристаллоидов [72]. Однако противоречивое сообщение показало, что первичные гранулы также содержат пероксидазу эозинофилов, белок, образующий кристаллоидные включения [90]. ПЭМ показала, что Gal-10 присутствует в ядерном матриксе и внеорганелларной цитоплазме зрелых эозинофилов, стимулированных интерлейкином-5 [91].Обширные количества Gal-10 также присутствовали в бедных гранулами и субплазматических мембранах цитоплазмы зрелых эозинофилов [91,92]. Другие анализы продемонстрировали, что высвобождение белков гранул эозинофилов, включая Gal-10, может быть селективным и запускается стимуляцией одного или нескольких мембранных рецепторов [93,94]. Используя TEM, Arne Egesten et al. Обнаружили, что Gal-10 присутствует в редком гранулярном компартменте как незрелых, так и зрелых эозинофилов [95]. ПЭМ также показала, что Gal-10 присутствует в фагосомах макрофагов [77,91] и поздних эндосомах [90].Gal-10 может храниться в гранулах нестимулированных базофилов человека [66]. И положительные, и отрицательные гранулы Gal-10 указывают на одну и ту же характерную подобную частицам структуру гранулярного матрикса, причем обе имеют один и тот же мембранный маркер CD63 [90]. После того, как пептид N-формилметионин (fMet) стимулировал базофилы человека, Gal-10 высвобождался через везикулы к плазматической мембране, проявляя частичную дегрануляцию (PMD). В начале PMD Gal-10 все еще может быть связан с плазматическими мембранами каналов дегрануляции [66].Во время дегрануляции поглощение базофилами высвобождает Gal-10, который быстро рециркулируется в клетки после провокации пептидом fMet [66,96]. После первых секунд дегрануляции белок CLC секретировался в виде кристаллов, которые непосредственно вытеснялись из внутригранулярных участков с морфологическими фенотипами, связанными с анафилактической дегрануляцией (AND) [66]. Помимо гранул, Gal-10 также распределяется в ядре (в эухроматине) [90], цитоплазме, плазматической мембране [97] и связанных с Гольджи гладких мембраносвязанных пузырьках [98].В целом, ПЭМ, пожалуй, лучший доступный метод для анализа распределения клеточного Gal-10. Хороший протокол использования ТЕА для базофилов и тучных клеток был обобщен Дворжаком [99].

10. Клеточное распределение CLC и Gal-10.

CLC присутствуют в ядерном хроматине, остатках клеточных мембран и многочисленных пустых и частично пустых гранулах из лизированных эозинофилов и интактных фагосом [77]. Это указывает на то, что образование CLC зависит только от концентрации Gal-10.Когда локальная концентрация Gal-10 выше, чем концентрация для кристаллизации, Gal-10 кристаллизуется. Кроме того, распределение CLC в гранулах, ядрах и фагосомах указывает на то, что должны быть некоторые ключевые транспортные системы для переноса белка в эти органеллы. Иммунофлуоресцентная микроскопия периферических эозинофилов человека показала, что в ядре сконцентрировано значительное количество Gal-10 [66]. Это исследование согласуется с исследованием Calafat et al., Которое показало, что Gal-10 в основном распределяется в ядрах эозинофилов [90].Наше недавнее исследование Gal-10 показывает, что лектин, меченный EGFP, в первую очередь распределяется в ядре клеток HeLa [25], указывая на то, что Gal-10 может активно транспортироваться в ядро. Это также означает, что Gal-10 может играть роль в регуляции транскрипции или трансляции посредством взаимодействий с неизвестными лигандами. Многие сообщения показали, что Gal-10 может распределяться в цитоплазме [91,92,97]. Однако функция Gal-10 в цитоплазме остается неизвестной. Кроме того, Gal-10 распределяется в областях внешней и внутренней клеточной мембраны.Gal-10 связывается с внешней мембраной Т-клеток и подавляет функцию Т-клеток [87]. Высвобождение Gal-10 из эозинофилов предполагает, что он стимулируется триггерами на внешней мембране [93,94]. При стимуляции Gal-10 секретируется путем дегрануляции или непосредственно вытесняется из цитоплазмы [66,96]. Более того, апоптоз и некроз эозинофилов также могут способствовать высвобождению Gal-10.

В целом распределение Gal-10 в клетках кажется ясным. Однако молекулярный механизм того, как действует Gal-10, до сих пор практически неизвестен, и остается много открытых вопросов относительно того, с какими партнерами in vivo может связываться Gal-10, как транспортируется Gal-10, имеет ли Gal-10 роль в передаче сигнала и так далее.Чтобы ответить на эти вопросы, крайне важно идентифицировать лиганды Gal-10 in vivo с помощью различных методов, таких как pull down, co-IP и дрожжевой двугибридный.

12. Выводы и перспективы

Прошло более 160 лет с тех пор, как сообщалось о CLC. Изначально ХЛК были идентифицированы in vivo как кристаллы белка, которые могут спонтанно образовываться в организме человека. С момента их открытия ХЖК широко исследовались. Эозинофилы могут сверхэкспрессировать огромные количества Gal-10, а Gal-10 может иногда образовывать CLC в эозинофилах, и, образуя CLC, способность Gal-10 связывать лиганд может быть изменена.Таким образом эозинофилы могут защитить себя от чрезмерной стимуляции. При заражении эозинофилы могут реагировать на болезнетворные микроорганизмы и паразиты. Сигналы стимуляции от человеческого тела или посторонних веществ могут вызвать массовое высвобождение эозинофилов Gal-10. Более того, токсичные вещества, выделяемые патогенами и паразитами, также могут вызывать апоптоз или некроз эозинофилов. Когда взаимодействуют большие количества Gal-10, они могут образовывать ХЖК за очень короткое время. Следовательно, образование CLC связано с нарушением работы эозинофилов, что указывает на то, что CLC могут использоваться в качестве потенциального маркера этих заболеваний.

CLC могут быстро образовываться in vivo и in vitro. Это значительно облегчает кристаллографические исследования Гал-10. Кристаллографические и биохимические исследования показывают, что Gal-10 образует димерные структуры, которые значительно отличаются от других галектинов прототипа. Gal-10 образует свой димер через S-грани двух CRD, тогда как другие прототипы галектинов димеризуются, обнажая свои связывающие сахар S-грани. Эта уникальная димерная структура Gal-10 с S-гранью на S-грань может влиять на его специфичность связывания лиганда, хотя это мало изучено.

С развитием ПЭМ, иммунологических методов и различных методов окрашивания выяснилось распределение Gal-10 в лимфоцитах, тканях и жидкостях организма. Gal-10 может существовать в ядре, цитоплазме, гранулах и внеклеточном матриксе. Однако молекулярные механизмы действия Gal-10 in vivo остаются плохо изученными. Только недавно было обнаружено подавляющее действие Gal-10 на Т-клетки. Gal-10 может связываться с неизвестными гликанами на Т-клеточной мембране, подавляя функцию Т-клеток.Лиганды для Gal-10 в ядре, цитоплазме и гранулах неизвестны. Молекулярная масса Gal-10 составляет 16,5 кДа, что ниже порогового значения для ограничений транспортировки ядерной дыры. Это означает, что цитоплазматический Gal-10 может пассивно диффундировать в ядро. Интересно, что Гал-10, по-видимому, сконцентрирован в ядре. Накопление Gal-10 в ядре предполагает, что этот лектин может контролировать экспрессию и функцию некоторых неизвестных генов. Лиганды для Gal-10 в цитоплазме также неизвестны.В эозинофилах Gal-10 может транспортироваться в первичные гранулы. Однако пути транспортировки неясны. В целом, клеточные лиганды, включая углеводы и белки, для Gal-10 неизвестны, и идентификация этих лигандов может помочь нам понять нарушение эозинофилов и даже помочь облегчить различные болезненные состояния.

«Кристаллы Шарко-Лейдена активируют инфламмасому NLRP3 и вызывают IL-1» Хуан Франсиско Родригес-Алькасар, Марко Антонио Атаиде и др.

Название

Кристаллы Шарко-Лейдена активируют инфламмасому NLRP3 и вызывают воспаление IL-1beta в макрофагах человека

Принадлежность UMMS

Кафедра медицины, Отделение инфекционных болезней и иммунологии

Дата публикации

2019-01-15

Дисциплины

Иммунология и инфекционные болезни | Инфекционная болезнь

Абстрактные

Кристаллы Шарко-Лейдена (ХЖК) представляют собой кристаллы белка галектина-10, которые могут образовываться после дегрануляции эозинофилов.ХЛК могут появляться и сохраняться в тканях пациентов с эозинофильными расстройствами, такими как астма, аллергические реакции, грибковые и глистные инфекции. Несмотря на многочисленные сообщения об их возникновении при заболеваниях человека, воспалительный потенциал CLC остается неизвестным. В этой статье мы показываем, что ХЛК индуцируют высвобождение провоспалительного цитокина IL-1beta при их фагоцитозе первичными макрофагами человека in vitro. Химическое ингибирование и нокдаун малой интерферирующей РНК NLRP3 в первичных макрофагах человека отменяли их ответ IL-1beta на CLC.Используя C57BL / 6 ASC-mCitrine репортерных мышей с трансгенной инфламмасомой, мы показали, что инстилляция CLC в легкие способствует сборке комплексов ASC в инфильтрирующих иммунных клетках (нейтрофилах и воспалительных моноцитах) и приводит к накоплению IL-1beta в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. . Наши результаты показывают, что CLC распознаются инфламмасомой NLRP3, которая может поддерживать воспаление, которое следует за эозинофильными воспалительными процессами.

DOI опубликованной версии

10.4049 / jimmunol.1800107

Источник

Родригес-Алькасар Дж. Ф., Атаиде М. А., Энгельс Г., Шмитт-Мабмуньо С., Гарби Н., Кастенмюллер В., Латц Е., Франклин Б. С.. Кристаллы Шарко-Лейдена активируют инфламмасому NLRP3 и вызывают воспаление IL-1β в макрофагах человека. J Immunol. 2019 15 января; 202 (2): 550-558. DOI: 10.4049 / jimmunol.1800107. Epub 2018 17 декабря. PMID: 30559319. Ссылка на статью на сайте издателя

Название журнала / книги / конференции

Журнал иммунологии (Балтимор, штат Мэриленд.: 1950)

Ссылка из репозитория

Родригес-Алькасар JF,

Атаида М.А.,

Энгельс Г,

Шмитт-Мабмуньо C,

Гарби Н,

Кастенмюллер В,

Латц Э,

Франклин Б.С.

(2019).
Кристаллы Шарко-Лейдена активируют инфламмасому NLRP3 и вызывают воспаление IL-1beta в макрофагах человека.Публикации по инфекционным болезням и иммунологии.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.