Метод электрофореза: Методика проведения электрофореза в агарозном геле

Методика проведения электрофореза в агарозном геле

Электрофорез (от электро- и др.-греч. φορέω — «переношу») —метод разделения макромолекул, различающихся по размеру, молекулярной массе, пространственной конфигурацией, вторичной структурой или электрическому заряду. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.

Принцип метода

Молекулы в буферном растворе обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. При пропускании электрического тока через раствор в нем формируется направленное электрическое поле, напряженность которого измеряется разностью потенциалов по концам емкости, в которой производится электрофорез. Под действием поля молекулы начинают движение в направлении катода или анода. Скорость движения зависит от величины заряда, размеров и трения окружающей среды. С течением времени смесь разделяется на фракции, состоящие из молекул, движущихся с одинаковой скоростью. В современных экспериментах рабочий канал приборов для электрофореза заполняют гелем, имеющим структуру сетки. В этом случае основное влияние на подвижность молекул и их степень разделения оказывают их линейные размеры. В некоторых случаях может возникнуть ситуация, при которой особо крупные молекулы не проходят через поры геля.

Методика электрофореза в агарозном геле.

Электрофорез в агарозном геле в различных модификациях широко применяется для разделения молекул нуклеиновых кислот, белков и других макромолекул в биологии и медицине. На водяной бане или в лабораторной печи плавят смесь агарозы, буфера и воды. Затем ее охлаждают до 50-60 °C и заливают в форму. Лунки для нанесения делаются при помощи гребенки. Исследуемый образец наносят в лунку при помощи дозатора. Когда краситель, помещаемый в лунки в начале эксперимента, достигает конца геля, электрофорез останавливают. Затем гель окрашивают красителем, который связывается с исследуемыми молекулами. Интенсивность окраски полос красителя дает представление о концентрации молекул в образце. Кроме концентрации, метод электрофореза позволяет определить относительную молекулярную массу исследуемых молекул, для этого в крайнюю лунку помещают набор маркеров молекулярной массы,  который должен полностью покрывать диапазон молекулярных масс исследуемой системы.

Выбор карсителя и буфера

Бромфеноловый синий и ксиленцианол  — могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. Краситель Cresol red совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV. OrangeG наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне «рабочей зоны». Заметен под UV. Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле.

Самое широкое применение агарозные гели имеют в исследованиях, связанные с разделением нуклиновых кислот. Последние имеют довольно значительные отрицательный заряд, величина которого слабо зависиот от pH раствора, вследствие чего разделение на фракции происходит в основном за счет различия в линейных размеров молекул. В таких экспериментах используют 0.089М Трис-боратный, 0.05 Трсфосфатный и Трис-ацетатный буфер. Стоит отметить, что при обычном электрофорезе в геле можно разделять фрагменты нуклеиновых кислот, размер которых менее 50 тыс п.н. Также часто из эксперимента нужно получить оценку размеров молекул. Для этого используются наборы молекул известной длины. Например, для регистрации продуктов  амплификации ДНК применяется электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого эитидия, который образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением длиной волны 290-330 нм.

Анализ крови на белковые фракции методом электрофореза

Определение белковых фракций методом электрофореза назначается пациентам, у которых есть подозрение на острые и хронические воспалительные процессы, внутреннее кровотечение, для определения иммуносупрессии или иммунодефицита, опухолевой патологии или печеночной недостаточности. Чаще всего внимание акцентируется на определении альбумино-глобулинового коэффициента.

Подготовка к анализу крови на белковые фракции методом электрофореза

Для получения достоверных результатов анализа следует отказаться от приема пищи на 8 часов до проведения забора крови, а также, предварительно проконсультировавшись с врачом, отказаться от приема препаратов, которые могут исказить результаты обследования.

Как делают анализ крови на белковые фракций методом электрофореза?

После разделения фракций при помощи электрического тока, количество каждого белка определяется иммунологическим методом с использованием специфических антител.

Расшифровка результата. Нормы белковых фракций в крови

В норме количество различных типов белков сыворотки должно быть следующее:

• Альбумин от 35 до 50 г/л
• Альфа-1-глобулины от 2 до 4 г/л
• Альфа-2-глобулины от 4 до 8 г/л
• Бета-глобулины у детей до года 5–9 г/л, после года и у взрослых 5–11 г/л
• Гамма-глобулины — 6–13 г/л

Альбумино-глобулиновый индекс должен находится в пределах от 1,5 до 2,3.

Увеличение количества белковых фракций практически не существует, если оно есть — то это относительное увеличение при уменьшении количества плазмы вследствие обезвоживания.

Уменьшение количества белковых фракций свидетельствует о:

• Воспалительных процессах
• Онкопатологии
• Печеночной недостаточности
• Почечной недостаточности
• Синдроме мальабсорбции
• Активизации катаболических процессов в организме
• Панкреатите
• Иммунодефицитном состоянии

Где сделать анализ крови на белковые фракции методом электрофореза?

Доверьте проведение этого исследования специалистам сети медицинских МЦ «Здоровье» и уже через несколько дней вы получите достоверный результат обследования с грамотной расшифровкой результатов.

Белковые фракции в сыворотке

Определение количественных и качественных изменений основных фракций белка крови, используемое для диагностики и контроля лечения острых и хронических воспалений инфекционного и неинфекционного генеза, а также онкологических (моноклональных гаммапатий) и некоторых других заболеваний.

Синонимы русские

Протеинограмма.

Синонимы английские

Serum Protein Electrophoresis (SPE, SPEP).

Метод исследования

Электрофорез на пластинках с агарозным гелем.

Единицы измерения

Г/л (грамм на литр), % (процент).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Детям в возрасте до 1 года не принимать пищу в течение 30-40 минут до исследования.
• Детям в возрасте от 1 до 5 лет не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования.
• Не принимать пищу в течение 12 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.
• Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение в течение 30 минут до исследования.
• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Общий белок сыворотки крови включает в себя альбумин и глобулины, которые в норме находятся в определенном качественном и количественном соотношении. Оно может быть оценено с помощью нескольких лабораторных методов. Электрофорез белков в агарозном геле – это метод разделения белковых молекул, основанный на различной скорости их движения в электрическом поле в зависимости от размера, заряда и формы. При разделении общего белка сыворотки крови удается выявить 5 основных фракций. При проведении электрофореза белковые фракции определяются в виде полос различной ширины с характерным, специфичным для каждого типа белка местоположением в геле. Для определения доли каждой фракции в общем количестве белка оценивают интенсивность полос. Так, например, основная белковая фракция сыворотки – это альбумин. На его долю приходится около 2/3 всего белка крови. Альбумин соответствует самой интенсивной полосе, полученной при электрофорезе белков сыворотки крови здорового человека. К другим фракциям сыворотки, выявляемым с помощью метода электрофореза, относят: альфа-1 (преимущественно альфа-1-антитрипсин), альфа-2 (альфа-2-макроглобулин и гаптоглобин), бета (трансферрин и С3-компонент комплемента) и гамма-глобулины (иммуноглобулины). Различные острые и хронические воспалительные процессы и опухолевые заболевания сопровождаются изменением нормального соотношения белковых фракций. Отсутствие какой-либо полосы может указывать на дефицит белка, что наблюдается при иммунодефицитах или недостаточности альфа-1-антитрипсина. Избыток какого-либо белка сопровождается увеличением интенсивности соответствующей полосы, что наиболее часто наблюдается при различных гаммапатиях. Результат электрофоретического разделения белков может быть представлен графически, при этом каждая фракция характеризуется определенной высотой, отражающей ее долю в общем белке сыворотки. Патологическое увеличение доли какой-либо фракции носит название «пик», например «М-пик» при множественной миеломе.

Исследование белковых фракций играет особую роль при диагностике моноклональных гаммапатий. В эту группу заболеваний входят множественная миелома, моноклональная гаммапатия неясного генеза, макроглобулинемия Вальденстрема и некоторые другие состояния. Эти заболевания характеризуются клональной пролиферацией В-лимфоцитов или плазматических клеток, при которой происходит бесконтрольная выработка одного вида (одного идиотипа) иммуноглобулинов. При разделении сывороточного белка пациентов с моноклональной гаммапатией с помощью электрофореза наблюдаются характерные изменения – появление узкой интенсивной полосы в зоне гамма-глобулинов, которая называется М-пик, или М-белок. М-пик может отражать гиперпродукцию любого иммуноглобулина (как IgG при множественной миеломе, так и IgM при макроглобулинемии Вальденстрема и IgA при моноклональной гаммапатии неясного генеза). Важно отметить, что метод электрофореза в агарозном геле не позволяет дифференцировать различные классы иммуноглобулинов между собой. Для этой цели используют иммуноэлектрофорез. Кроме того, данное исследование позволяет дать приблизительную оценку количества патологического иммуноглобулина. В связи с этим исследование не показано для дифференциальной диагностики множественной миеломы и моноклональной гаммапатии неясного генеза, так как она требует более точного измерения количества М-белка. С другой стороны, если диагноз «множественная миелома» был верифицирован, метод электрофореза в агарозном геле может быть использован для оценки динамики М-белка при контроле лечения. Следует отметить, что у 10 % пациентов с множественной миеломой нет никаких отклонений в протеинограмме. Таким образом, нормальная протеинограмма, полученная с помощью электрофореза в агарозном геле, не позволяет полностью исключить это заболевание.

Другим примером гаммапатии, выявляемой с помощью электрофореза, является ее поликлональная разновидность. Она характеризуется гиперпродукцией различных видов (различных идиотипов) иммуноглобулинов, что определяется как однородное увеличение интенсивности полосы гамма-глобулинов при отсутствии каких-либо пиков. Поликлональная гаммапатия наблюдается при многих хронических воспалительных заболеваниях (инфекционных и аутоиммунных), а также при патологии печени (вирусных гепатитах).

Исследование белковых фракций сыворотки крови используют для диагностики различных синдромов иммунодефицита. Примером может послужить агаммаглобулинемия Брутона, при которой снижается концентрация всех классов иммуноглобулинов. Электрофорез белков сыворотки пациента с болезнью Брутона характеризуется отсутствием или крайне низкой интенсивностью полосы гамма-глобулинов. Низкая интенсивность альфа-1-полосы – характерный диагностический признак недостаточности альфа-1-антитрипсина.

Широкий спектр состояний, при которых наблюдаются качественные и количественные изменения протеинограммы, включает самые разные заболевания (от хронической сердечной недостаточности до вирусных гепатитов). Несмотря на наличие некоторых типичных отклонений протеинограммы, позволяющих в ряде случаев с определенной уверенностью диагностировать заболевание, обычно результат электрофореза белков сыворотки не может служить однозначным критерием постановки диагноза. Поэтому интерпретацию исследования белковых фракций крови проводят с учетом дополнительных клинических, лабораторных и инструментальных данных.

Для чего используется исследование?

• Для оценки качественного и количественного соотношения основных белковых фракций у пациентов с острыми и хроническими инфекционными заболеваниями, аутоиммунными состояниями и некоторыми болезнями печени (хронические вирусные гепатиты) и почек (нефротический синдром).
• Для диагностики и контроля лечения моноклональных гаммапатий (множественной миеломы и моноклональной гаммапатии неясного генеза).
• Для диагностики синдромов иммунодефицита (агаммаглобулинемии Брутона).

Когда назначается исследование?

• При обследовании пациента с острыми или хроническими инфекционными заболеваниями, аутоиммунными состояниями и некоторыми болезнями печени (хронические вирусные гепатиты) и почек (нефротический синдром).
• При симптомах множественной миеломы: патологических переломах или болях в костях, немотивированной слабости, персистирующей лихорадки, рецидивирующих инфекционных заболеваниях.
• При отклонениях в других лабораторных анализах, позволяющих заподозрить множественную миелому: гиперкальциемии, гипоальбуминемии, лейкопении и анемии.
• При подозрении на недостаточность альфа-1-антитрипсина, болезнь Брутона и другие иммунодефициты.

Что означают результаты?

Референсные значения

Причины повышения фракции альбумина:

• беременность;
• дегидратация;
• алкоголизм.

Причины понижения фракции альбумина:

• острая ревматическая лихорадка;
• острый холецистит;
• сахарный диабет;
• воспалительные и опухолевые заболевания ЖКТ;
• нефротический синдром;
• нефритический синдром;
• лейкоз;
• лимфома;
• хроническая сердечная недостаточность;
• макроглобулинемия;
• множественная миелома;
• остеомиелит;
• язвенная болезнь;
• пневмония;
• саркоидоз;
• системная красная волчанка;
• неспецифический язвенный колит;
• прием глюкокортикоидов.

Причины повышения фракции альфа-1-глобулина:

• острые или хронические воспалительные заболевания;
• лимфогранулематоз;
• цирроз печени;
• язвенная болезнь;
• беременность;
• стресс;
• прием пероральных контрацептивов.

Причины понижения фракции альфа-1-глобулина:

• недостаточность альфа-1-антитрипсина;
• острый вирусный гепатит.

Причины повышения фракции альфа-2-глобулина:

• острая ревматическая лихорадка;
• хронический гломерулонефрит;
• цирроз печени;
• сахарный диабет;
• диспротеинемия;
• лимфогранулематоз;
• пожилой и младенческий возраст;
• нефротический синдром;
• остеомиелит;
• язвенная болезнь;
• пневмония;
• узловатый полиартериит;
• ревматоидный артрит;
• саркоидоз;
• стресс;
• системная красная волчанка;
• мальабсорбция;
• неспецифический язвенный колит.

Причины понижения фракции альфа-2-глобулина:

• острый вирусный гепатит;
• гипогаптоглобинемия;
• интраваскулярный гемолиз;
• гипертиреоз;
• мальабсорбция.

Причины повышения фракции бета-глобулина:

• острые воспалительные заболевания;
• сахарный диабет;
• диспротеинемия;
• гломерулонефрит;
• гиперхолестеринемия;
• железодефицитная анемия;
• подпеченочная желтуха;
• макроглобулинемия;
• нефротический синдром;
• беременность;
• ревматоидный артрит;
• саркоидоз;
• прием пероральных контрацептивов.

Причины понижения фракции бета-глобулина:

• аутоиммунные заболевания;
• лейкоз;
• лимфома;
• нефротический синдром;
• системная склеродермия;
• стеаторея;
• системная красная волчанка;
• цирроз печени;
• неспецифический язвенный колит.

Причины повышения фракции гамма-глобулина:

• амилоидоз;
• цирроз печени;
• хронический лимфолейкоз;
• криоглобулинемия;
• муковисцидоз;
• тиреоидит Хашимото;
• ювенильный ревматоидный артрит;
• множественная миелома;
• моноклональная гаммапатия неясного генеза;
• ревматоидный артрит;
• саркоидоз;
• системная склеродермия;
• синдром Шегрена;
• системная красная волчанка;
• макроглобулинемия Вальденстрема.

Причины понижения фракции гамма-глобулина:

• острый вирусный гепатит;
• агаммаглобулинемия;
• гломерулонефрит;
• лейкоз;
• лимфома;
• нефротический синдром;
• мальабсорбция;
• склеродермия;
• стеаторея;
• неспецифический язвенный колит.

Что может влиять на результат?

• Применение пенициллина может приводить к расщеплению полосы альбумина.
• Использование радиоконтрастных веществ, а также недавняя процедура гемодиализа препятствует интерпретации результата исследования.


Скачать пример результата

Важные замечания

• Исследование не позволяет дифференцировать различные классы иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG) между собой и не предназначено для дифференциальной диагностики множественной миеломы и моноклональной гаммапатии неясного генеза.
• У 10 % пациентов с множественной миеломой протеинограмма в норме.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Врач общей практики, онколог, гематолог.

Литература

• Chernecky C. C. Laboratory Tests and Diagnostic Procedures / С.С. Chernecky, В.J. Berger; 5th ed. – Saunder Elsevier, 2008.
• DeVita V.T. Principles and practice of Oncology / V.T. DeVita, Lawrence T.S., Rosenberg S.A; 8^th ed. – Lippincott Williams & Wilkins, 2008.
• Fauci et al. Harrison’s Principles of Internal Medicine/A. Fauci, D. Kasper, D. Longo, E. Braunwald, S. Hauser, J. L. Jameson, J. Loscalzo; 17 ed. – The McGraw-Hill Companies, 2008.

Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли растительного (соевого) белка методом электрофореза – РТС-тендер

ГОСТ 31475-2012

МКС 67.120.10

Дата введения 2013-07-01

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности им.В.М.Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им.В.М.Горбатова Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 24 мая 2012 г. N 41)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2012 г. N 714-ст введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 июля 2013 г.

5 Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53220-2008

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясные продукты (кроме консервов), полуфабрикаты и устанавливает метод электрофореза для определения в них массовой доли соевого белка.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 5962-67 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25011-81 Мясо и мясные продукты. Методы определения белка

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя, «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Метод основан на тепловой денатурации и экстракции белков из мясных фаршей, состоящих из смесей животных и растительных белков, с последующим электрофоретическим разделением экстрагированных белковых фракций в полиакриламидном геле. Массовая доля соевых белков в смеси определяется по сумме площадей пиков, соответствующих на денситограмме белковым зонам с молекулярными массами 65000-75000, которая пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.

4 Диапазоны измерений и метрологические характеристики метода

4.1 Диапазон измерения массовой доли соевого белка от 1% до 85%.

4.2 Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности 0,95 приведены в таблице 1.

Таблица 1

5 Отбор проб

5.1 Отбор проб — по [1].

5.2 От представительной пробы отбирают пробу массой не менее 200 г.

Пробу измельчают на микроизмельчителе тканей и сохраняют в холодильнике при температуре от 0 °С до 5 °С до полного завершения испытания в течение суток.

Допускается хранение проб при температуре от минус 20 °С до минус 10 °С в герметичной упаковке в течение одной недели с даты отбора проб на исследование.

6 Аппаратура, материалы и реактивы

Камера для проведения вертикального электрофореза с источником питания (стабилизация по току и напряжению, максимально 250 В и 500 мА; цифровая индикация; выход на одну электрофоретическую камеру).

Денситометрическое устройство для сканирования гелей или хроматограмм, позволяющее определять площадь одной электрофоретической полосы 0,1 мкг белка в полиакриламидном геле толщиной 1 мм.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,1 мг.

Микроизмельчитель тканей.

рН-метр, позволяющий производить измерения с допускаемой погрешностью ±0,05 единицы рН.

Дозатор пипеточный переменного объема.

Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.

Микрошприц вместимостью 100 мкл.

Пипетки 2-го класса точности вместимостью 1, 5 и 10 см по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169.

Воронки стеклянные ВД-1-100 ХС по ГОСТ 25336.

Бутыли стеклянные для растворов по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2, 2-2000-2 по ГОСТ 1770.

Пластиковые пробирки с крышкой типа «Эппендорф» вместимостью 1 или 2 см.

Стаканы химические В-1-50, В-1-100, В-1-250, В-1-1000 по ГОСТ 25336.

Цилиндры 2-25, 2-100, 2-1000 по ГОСТ 1770.

Баня водяная.

Кислота соляная, стандарт-титр 0,1 моль/дм.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., с массовой долей основного вещества 35%-38%.

Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Кислота трихлоруксусная, ч.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Глицерин по ГОСТ 6259.

N, N, N, N-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) для электрофореза с массовой долей основного вещества не менее 99%.

Акриламид для электрофореза с массовой долей основного вещества не менее 99%.

N, N’-метиленбисакриламид (МБА) для электрофореза.

2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (ТРИС) для электрофореза с массовой долей основного вещества 99,9%.

Натрия додецилсульфат (СДС) с массовой долей основного вещества не менее 99%.

Аммония персульфат (АПС) с массовой долей основного вещества 98%.

Краситель Кумасси R-250.

Глицин.

2-меркаптоэтанол с содержанием основного вещества не менее 99%.

Краситель бромфеноловый синий.

Набор маркерных белков с молекулярной массой 27000-180000.

Свинина, говядина или баранина с содержанием белка не менее 18%.

Соевый изолят, содержащий не менее 85% белка.

Допускается применять другие средства измерений, оборудование и материалы с метрологическими и техническими характеристиками не хуже указанных.

7 Подготовка к выполнению измерений

7.1 Приготовление растворов

7.1.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 1000 см количественно переносят содержимое вскрытой ампулы со стандарт-титром соляной кислоты 0,1 моль/дм, дополнительно ополаскивают ампулу дистиллированной водой, переносят в колбу и доводят дистиллированной водой объем раствора до метки.

7.1.2 Приготовление раствора ТРИС-буфера рН 6,8 для солюбилизации белков

7.1.2.1 Приготовление раствора 2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиола (ТРИС) молярной концентрации 0,1 моль/дм

Навеску 2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиола (ТРИС) массой 1,211 г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

7.1.2.2 В мерную колбу вместимостью 50 см помещают 25 см раствора ТРИС молярной концентрации 0,1 моль/дм, добавляют 22,5 см раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм и доводят дистиллированной водой до метки.

7.1.3 Приготовление растворов для электрофореза

7.1.3.1 Приготовление раствора

Навеску акриламида массой 30 г и навеску N, N’-метиленбисакриламида (МБА) массой 0,15 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

7.1.3.2 Приготовление раствора

Навеску ТРИС массой 18,2 г и навеску додецилсульфата натрия (СДС) массой 0,4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают рН=8,8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

7.1.3.3 Приготовление раствора

Навеску ТРИС массой 9,1 г и навеску СДС массой 0,4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают рН=6,8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.

7.1.3.4 Приготовление раствора

Навеску аммония персульфата (АПС) массой 0,125 г растворяют в 1,23 см дистиллированной воды.

7.1.3.5 Приготовление раствора

Навеску акриламида массой 30,0 г и навеску МБА массой 0,8 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в 50-60 см дистиллированной воды и доводят дистиллированной водой до метки.

7.1.4 Приготовление электродного буфера 1:4

7.1.4.1 Приготовление 20%-ного раствора СДС

Навеску СДС массой 20,0 г смешивают в химическом стакане с 80 см дистиллированной воды до полного растворения соли.

7.1.4.2 В мерную колбу вместимостью 2 дм помещают навеску 24,0 г ТРИС и навеску 115,0 г глицина, добавляют 40 см 20%-ного раствора СДС, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения компонентов.

7.1.5 Приготовление окрашивающего раствора для геля

К навеске красителя Кумасси R-250 массой 1,1 г приливают 200 см этилового спирта, 50 см уксусной кислоты, 200 см дистиллированной воды и перемешивают в химическом стакане до полного растворения.

7.1.6 Приготовление обесцвечивающего раствора

К 500 см этилового спирта приливают 350 см уксусной кислоты и 2 дм дистиллированной воды.

7.1.7 Приготовление буфера для растворения белковых проб

7.1.7.1 Приготовление 0,05%-ного раствора бромфенолового синего

Навеску 0,05 г бромфенолового синего смешивают в химическом стакане с 99,95 см дистиллированной воды.

7.1.7.2 К 0,4 см 2-меркаптоэтанола поочередно приливают 0,8 см 20%-ного раствора СДС, 0,4 см ТРИС-буфера, 0,8 см 0,05%-ного раствора бромфенолового синего, 5 см дистиллированной воды и 5 см глицерина.

Растворы используют свежеприготовленные, допускается их хранение при температуре 4 °С не более двух суток.

7.1.8 Приготовление раствора маркерных белков с молекулярной массой 27000-180000 с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл

В пластиковой пробирке типа «Эппендорф» растворяют навеску массой 50,0 мкг готовой смеси маркерных белков с молекулярной массой 27000-180000 в 50,0 мкл буфера для растворения белковых проб. Раствор сохраняют при минус 20 °С в течение одной недели.

7.1.9 Приготовление фиксирующего раствора

Навеску 12,5 г трихлоруксусной кислоты растворяют в химическом стакане в 87,5 см дистиллированной воды и получают 12,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

7.1.10 Приготовление растворов для получения полимерного геля

7.1.10.1 Приготовление раствора для нижнего сепарирующего геля

18,0 см раствора , 7,5 см раствора , 4,3 см дистиллированной воды, 0,01 см ТЕМЕД, 0,2 см раствора смешивают в химическом стакане непосредственно перед использованием.

7.1.10.2 Приготовление раствора для верхнего формирующего геля

В химическом стакане смешивают 1,3 см раствора , 2,5 см раствора , 6,2 см дистиллированной воды, 0,01 см ТЕМЕД, 0,1 см раствора .

Растворы используют немедленно после приготовления.

7.2 Проведение экстракции

Навеску образца, содержащего около 0,2 г общего белка, определенного предварительно методом Кьельдаля по ГОСТ 25011 (для мясных продуктов при массовой доле общего белка 18% масса навески составляет 1,0 г), гомогенизируют в микроизмельчителе или путем растирания в ступке с 10 см ТРИС-буфера рН 6,8 или буфера для растворения белковых проб (в случае плохой растворимости). Затем нагревают смесь до 75 °С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Прозрачную надосадочную жидкость используют для проведения электрофореза.

7.3 Приготовление смесей для градуировочного графика

Навески по 100,0 г свинины (говядины или баранины, содержание животного белка не менее 18%) смешивают с навесками 1, 5, 10, 15, 20, 50 и 85 г соевого изолята, содержащего не менее 85% растительного белка.

Точное содержание растительного и животного белка предварительно устанавливают методом Кьельдаля по ГОСТ 25011. Каждую смесь перемешивают на микроизмельчителе тканей в течение 30 мин до образования гомогенной массы. Допускается использование уменьшенных навесок в случае приготовления смеси путем растирания в ступке. Получают двухкомпонентные модельные мясорастительные смеси, массовая доля растительного соевого белка в которых относительно массовой доли общего белка равна соответственно 4,5%; 19,1%; 32,1%; 41,5%; 48,6%; 70,2% и 80,0%.

7.4 Построение градуировочного графика

7.4.1 Проводят денситометрирование выявленных характеристических белковых полос, соответствующих молекулярным массам 65000-75000, и автоматически, используя показания денситометра, вычисляют сумму площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000-75000.

Сумма площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000-75000, пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.

Градуировочный график строят по результатам определения массовой доли соевых белков в двухкомпонентных модельных мясорастительных смесях, приведенным в таблице 2.

Таблица 2

График, построенный по данным таблицы 2, представлен в приложении А.

8 Проведение исследования

8.1 Проведение электрофореза

8.1.1 В соответствии с инструкцией по эксплуатации собирают камеру для проведения вертикального электрофореза.

8.1.2 Подготовка кассеты и заполнение ее нижним сепарирующим (рабочим) и верхним формирующим гелем

Два чистых стекла, входящих в комплект камеры для электрофореза, обезжиривают этиловым спиртом. Затем их закрепляют в кассету с заданным расстоянием между стеклами 1 мм, образуя пространство для заливки геля размером 115х115х1 мм. Затем осторожно по краю стекла через наконечник от пипеточного дозатора заливают состав для нижнего сепарирующего геля на три четверти высоты стекла. В кассету по стенке на поверхность залитого геля приливают дистиллированную воду для полимеризации геля и выравнивания верхнего края его поверхности. После полимеризации граница между гелем и водой должна быть четко видна. Процесс происходит при температуре 20 °С в течение 1 ч. Увеличение времени полимеризации приводит к получению более плотной сетки геля и возрастанию времени, необходимого для проведения электрофореза.

После полимеризации воду сливают и сверху через пластиковый наконечник от пипеточного дозатора заливают формирующий гель. Гель заливают в кассету на поверхность ранее полученного геля до верхних краев стеклянных пластинок, вставляют в раствор специальную пластмассовую гребенку для формирования в геле углублений, в которые будут вноситься анализируемые образцы, и проводят повторно полимеризацию в течение 20-30 мин. Для достижения лучшего разделения белковых полос кассету с гелем можно выдержать в течение 10 ч при 4 °С. После этого гребенку следует удалить.

8.1.3 В соответствии с инструкцией по эксплуатации кассету закрепляют в электрофорезной камере, туда же помещают электроды, спираль для охлаждения буфера и заливают в электродную камеру до краев электродный буфер так, чтобы буферный раствор покрывал верхний край кассеты с гелем.

После этого в каждое углубление микрошприцем вносят предварительно подготовленные по 7.2 растворы белковых проб в количестве 1-2 мкл, содержащих белок из расчета 10-20 мкг на одно углубление. Допускается максимально вносить в одно углубление 20 мкл раствора белка. Введение проб осуществляют медленно, так, чтобы вводимый раствор белка не всплывал со дна углублений.

В отдельное углубление рядом с анализируемой пробой вносят 5 мкл раствора маркерных белков с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл, приготовленного по 7.1.8.

Включают электрический ток и проводят процесс при плотности постоянного тока 2,5 мА/см в течение 1-2 ч.

Время процесса зависит от состояния геля (насколько свежими были использованные растворы), а также от расстояния, на которое необходимо продвинуть белки.

8.1.4 В ходе электрофореза окрашенные в фиолетовый цвет полосы белков собираются на дне углублений верхнего геля, затем продвигаются вниз. Происходит формирование молекул белка под воздействием тока (движение) и распрямление белковых глобул в присутствии СДС — реактива, способствующего разворачиванию молекул белка (добавление 1,5 г СДС на 1 г белка вызывает его полную денатурацию).

При закислении раствора окраска полос может измениться на желтую из-за наличия красителя бромфенолового синего.

После прохождения белков через верхний гель полосы собираются на границе двух гелей, входят в нижний сепарирующий гель, и происходит разделение белка на его составные части (фракции).

Путь, который проходит каждая полоса , прямо пропорционален молекулярной массе белковой фракции.

8.1.5 Процесс завершен, когда нижние низкомолекулярные белковые фракции оказываются примерно в 2 см от нижнего края геля. Камеру отключают от источника тока и электродный буфер сливают. Камеру разбирают и извлекают гель на поверхность стекла. Отделенный гель помещают в 12,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, выдерживают 15 мин, сливают кислоту и промывают дистиллированной водой. Гель переносят в окрашивающий раствор и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.

Затем опять промывают дистиллированной водой 2 раза. Обесцвечивание геля проводят в обесцвечивающем растворе в течение 3 ч.

В результате получают полиакриламидный гель, в котором видны окрашенные в синий цвет полосы фракций анализируемого белка и полосы, соответствующие маркерным белкам с известной молекулярной массой. Сравнение белковых полос анализируемого образца с полосами маркерных белков позволяет сделать заключение о фракционном составе определяемого белка и молекулярной массе каждой фракции, а также выявить характеристические полосы белка, соответствующие примесям растительного происхождения.

8.1.6 Повторяют анализ со второй параллельной пробой.

8.2 Определение массовой доли соевых белков

8.2.1 По градуировочному графику определяют массовую долю соевых белков в анализируемой пробе.

9 Обработка результатов

9.1 За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

, (1)

где и — результаты параллельных определений массовой доли соевых белков, определенные по градуировочному графику, %;

— предел повторяемости, приведенный в таблице 1.

Результат вычислений округляют до целого числа.

9.2 Массовую долю растительного соевого белка , %, относительно массовой доли общего белка, вычисляют по формуле

, (2)

где — среднеарифметическое значение массовой доли растительных белков в анализируемом образце, %;

— значение массовой доли общего белка в анализируемом образце, определенное методом Кьельдаля по ГОСТ 25011, %.

10 Требования безопасности

10.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

10.2 Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

10.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.

Приложение А (рекомендуемое). Градуировочный график определения массовой доли соевых белков в модельной мясорастительной смеси свиного и соевого белков

Приложение А
(рекомендуемое)

А.1. График определения массовой доли соевых белков в модельной смеси свиного и соевого белков приведен на рисунке А.1.

Библиография

________________
* Доступ к международным и зарубежным документам можно получить, перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru. — Примечание изготовителя базы данных.

_______________________________________________________________________________
УДК 637.5.045:633.34:537.3:006.354 МКС 67.120.10

Ключевые слова: стандарт, мясо, мясные продукты, метод электрофореза, растительный белок, соевый белок
_______________________________________________________________________________

Электронный текст документа
подготовлен ЗАО «Кодекс» и сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2014

Центр лечения детей методом магнитная стимуляции в Ростове-на-Дону

Записей не найдено.

«Счастье — это продукт здоровья». С. Смайлс.

КОГДА ЭЛЕКТРИЧЕСТВО ЛУЧШИЙ ЛЕКАРЬ

Слово «электрофорез» будто током прошибает беспокойных мамочек, которые видят его в списке назначений доктора-невролога или ортопеда. Однако именно электрическое воздействие в данном случае дарит исцеление, ведь это помогает лекарственному веществу лучше проникать в ткани организма.

На самом деле эта процедура безобидна для ребенка, малыш может ощутить небольшое покалывание, однако боли это не вызывает. Кто сам сталкивался с этим, знает, что «электрофорез» только звучит угрожающе, но не вызывает дискомфорта. Подробнее о методике рассказывает детский невролог медицинского центре «Авиценна» Ирина Александровна Волошкина.

Ирина Александровна, каковы плюсы и минусы электрофореза?

Слово «электрофорез» в переводе с греческого языка означает «перенос электричеством». Лекарственные препараты в жидкой форме доставляют к больному органу через минимальный разряд тока, подаваемый через железные пластины. Данный способ имеет ряд преимуществ по сравнению с внутривенным, внутримышечным, пероральным (то есть через рот) и другими способами введения лекарств. Во-первых, поступление происходит непосредственно в очаг патологического процесса. Во-вторых, препарат практически не проникает в системный кровоток, что минимизирует риск токсических эффектов. Электрофорез не вредит печени и желудочно-кишечному тракту, в отличие, например, от приема таблеток.

В каких случаях детский невролог или ортопед может рекомендовать эту процедуру?

В неврологии методика электрофореза используется при самых разных состояниях: параличах и парезах, повышенном и пониженном тонусе мышц, миастении, невритах периферических нервов, перинатальном поражении центральной нервной системы, минимальной мозговой дисфункции. В ортопедии электрофорез применяют при лечении последствий травм и переломов, при дегенеративных заболеваниях костей и мышц, артритах и артрозах. Обычно электрофорез лекарственных препаратов применяется в комплексной терапии (в сочетании с такими методами лечения, как массаж, ЛФК, медикаментозная и мануальная терапия).

Всем ли детям можно назначать электрофорез?

Как и у каждой процедуры, есмь ряд противопоказаний. Опытный доктор никогда не направит на электрофорез ребенка с острыми инфекционными заболеваниями, гнойничковыми поражениями кожи, онкологией, туберкулезом, тяжелыми психическими отклонениями.

У врачей «Авиценны» есть соответствующая специализация для проведения данных процедур?

Наши доктора имеют большой опыт работы с пациентами с различными диагнозами, в том числе заболеваниями центральной нервной системы, ограниченными возможностями движения, детским церебральным параличом. Все наши специалисты прошли профессиональное обучение и регулярно посещают курсы повышения квалификации, перенимая опыт ведущих докторов Москвы, Санкт-Петербурга, Казани.

Вниманию родителей: при наличии направления из детской поликлиники по месту жительства на консультацию невролога или ортопеда для реобилитации, а также полиса обязательного медицинского страхования и свидетельства о рождении ребенка (либо паспорта при достижении им возраста 14 лет) лечение проводится бесплатно!

По желанию родителей в детском центре «Авиценна» получить все виды медицинской помощи, в том числе процедуры электрофореза, можно на платной основе без направления.

Процедура электрофорез для детей в клинике «Авиценна» в Ростове-на-Дону проводится опытными специалистами с использованием современного оборудования. Это безболезненная процедура, которую мы проводим в комфортных условиях.

Оптимизация способов математической обработки калибровочных кривых при оценке молекулярной массы биологических лекарственных средств методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS | Томилин

1. ОФС. 1.2.1.0023.15. Электрофорез в полиакриламидном геле. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII изд. Т. 1. М.; 2015. С. 638-57. Available from: http://www.femb.ru/feml.

2. Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая. М.: Гриф и К; 2013. С. 80-4.

3. Shapiro AL, Viuela E, Maizel JV Jr. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 1967; 28(5): 815-20.

4. Weber K, Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J Biol Chem. 1969; 244(16): 4406-12.

5. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227(5259): 680-5.

6. Sadeghi M, Hajivandi M, Bogoev R, Amshey J. Molecular weight estimation of proteins by gel electrophoresis revisited. Focus 2003; 25: 35-39.

7. ОФС. 1.1.0012.15. Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII изд. Т. 1. М.; 2015. С. 222-34. Available from: http://www.femb.ru/feml.

8. Авдеева ЖИ, Волкова РА, Алпатова НА, Солдатов АА, Медуницын НВ, Меркулов ВА. Методические приемы и принципы оценки сопоставимости биотехнологических продуктов, полученных до и после внесения изменений в процесс производства. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2013; (2): 18-21.

9. Бондарев ВП, Борисевич ИВ, Волкова РА, Фадейкина ОВ. Проблемы аттестации отраслевых стандартных образцов для контроля качества иммунобиологических лекарственных препаратов. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения 2013; (2): 28-32.

Возможности использования метода капиллярного электрофореза при анализе водных вытяжек из засоленных почв | Черноусенко

1. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1970, 487 с.

2. Борисочкина Т.И., Черноусенко Г.И., Никитина Н.С. Сравнение методов определения анионов и катионов в природных водах юга средней Сибири // Современные методы исследований почв и почвенного покрова. Мат-лы Всерос. конф. М.: Почв. ин-т им. В.В. Докучаева, 2015. C. 170-172.

3. Комарова Н.В., Каменцев Я.С. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза “Капель”. СПб.: ООО “Веда”, 2006. 212 с.

4. ПНД Ф 14.1:2:4.157-99. Количественный химический анализ вод. Методика измерения массовых концентраций хлорид-ионов, нитрит-ионов, сульфат-ионов, нитрат-ионов, фторид-ионов и фосфат-ионов в пробах природной, питьевой и сточной вод с применением системы капиллярного электрофореза “Капель”. СПб.: Люмекс, 1999.

5. ПНД Ф 16.1:2:4. 167-2000. Количественный химический анализ вод. Методика измерения массовых концентраций катионов цезия, аммония, калия, натрия, лития, магния, кальция, стронция, бария в пробах питьевых, природных и сточных вод с использованием системы капиллярного электрофореза “Капель”. СПб.: Люмекс, 2000.

6. Теория и практика химического анализа почв / Под ред. Воробьевой Л.А. М.: ГЕОС, 2006. 400 с.

7. Engelhardt H., Beck W., Schmitt T. Capillarelektroforese, Metoden und Moglichkeiten. Wiesbaden, Vieveg Velag, 1994. 218 p.

8. Kuhn R., Hofstetter-Kuhn S. Capillary Electroforesis, principle and practice. Springer Verlag, Berlin Heidelberg. 1993. 386 p.

9. Landers J.P. Handbook of Capillary Electroforesis. Boca Raton, CRC Press, 1994. 486 р.

Addgene: Protocol — How to Run an Agarose Gel

Примечание: Загрузочный буфер служит двум целям: 1) он обеспечивает видимый краситель, который помогает с загрузкой геля и позволяет вам оценить, насколько далеко переместилась ДНК; 2) он содержит высокий процент глицерина, который увеличивает плотность вашего образца ДНК, заставляя его оседать на дно лунки геля вместо того, чтобы диффундировать в буфер.

* Pro-Tip * Помните, если вы добавили EtBr в свой гель, добавьте также немного в буфер. EtBr заряжен положительно и будет двигаться в противоположном направлении от ДНК. Таким образом, если вы запустите гель без EtBr в буфере, вы достигнете точки, в которой ДНК будет находиться в нижней части геля, но весь EtBr будет в верхней части, и ваши полосы будут различно интенсивными.Если это произойдет, вы можете просто замочить гель в растворе EtBr и промыть его водой, чтобы выровнять окрашивание после нанесения геля, как если бы вы не добавляли EtBr в гель с самого начала.

Примечание: При загрузке образца в лунку поддерживайте положительное давление на образец, чтобы предотвратить попадание пузырьков или буфера в наконечник.Поместите самый верхний конец наконечника пипетки в буфер прямо над лункой. Очень медленно и равномерно вытолкните образец наружу и наблюдайте, как образец заполняет лунку. После выгрузки всего образца нажмите пипетку до второго упора и осторожно поднимите пипетку прямо из буфера.

Примечание: Черный — отрицательный, красный — положительный. ДНК заряжена отрицательно и будет двигаться к положительному электроду. Всегда бегать к красному.

* Pro-Tip * Если вы собираетесь очищать ДНК для дальнейшего использования, используйте длинноволновое УФ-излучение и экспонируйте как можно меньше времени, чтобы минимизировать повреждение ДНК.

Примечание: При использовании УФ-излучения защищайте кожу, надев защитные очки или маску для лица, перчатки и лабораторный халат.

Используя лестницу ДНК на первой полосе в качестве ориентира (в инструкции производителя указан размер каждой полосы), вы можете сделать вывод о размере ДНК на дорожках для образцов. Для получения дополнительных сведений о составлении диагностических обзоров и о том, как их интерпретировать, см.
Страница диагностического дайджеста.

Если вы проводите определенные процедуры, такие как молекулярное клонирование, вам необходимо очистить ДНК от агарозного геля. Чтобы узнать, как это сделать, посетите
Страница «Очистка геля».

Методы электрофореза белков | Bio-Rad Laboratories

Blue Native PAGE (BN-PAGE)
BN-PAGE используется для разделения и характеристики больших белковых комплексов в их природных и активных формах. Первоначально описанный Schagger и von Jagow (1987), этот метод основан на солюбилизации белковых комплексов мягкими нейтральными детергентами и связывании отрицательно заряженного красителя Coomassie (Brilliant) Blue G-250 с их поверхностями.Это обеспечивает высокое отношение заряда к массе, которое позволяет белковым комплексам мигрировать к аноду, как это происходит в SDS-PAGE. Кумасси синий, однако, не денатурирует и не диссоциирует белковые комплексы, как это делает SDS.

Zymogram PAGE
Zymogram PAGE используется для обнаружения и характеристики коллагеназ и других протеаз в геле. Гели отливают из желатина или казеина, который действует как субстрат для ферментов, которые выделяются в геле в невосстанавливающих условиях.Белки обрабатывают денатурирующим SDS для разделения по молекулярной массе. После ренатурирования ферментов и последующего расщепления субстрата гели зимограммы окрашивают красителем Кумасси (бриллиантовый) синий R-250, который окрашивает субстрат, оставляя прозрачные области вокруг активных протеаз.

Изоэлектрическое фокусирование (IEF)
IEF сочетает использование электрического поля с градиентом pH для разделения белков в соответствии с их изоэлектрической точкой (pI).Когда белок движется через градиент pH, его чистый заряд изменяется в зависимости от pH, с которым он сталкивается. Под воздействием электрического поля белок в градиенте pH перемещается в позицию, пока его общий заряд не станет нулевым (более подробную информацию см. В разделе «Двумерный электрофорез»).

Двумерный электрофорез
Последовательное применение различных методов электрофореза дает многомерное разделение. Наиболее распространенный двухмерный метод (O’Farrell, 1975) включает образцы белков сначала для денатурирования IEF на геле для пробирок или гелевой полоски IPG (для разделения по pI), а затем — для SDS-PAGE для дальнейшего разделения по молекулярной массе.Двухмерные методы с высоким разрешением позволяют разделить тысячи полипептидов в одном пластинчатом геле. Полученные пятна можно визуализировать путем окрашивания геля, или они могут быть перенесены на мембранную подложку для окрашивания общего белка или анализа с определением специфических антител. (См. Подробности в разделе «Двумерный электрофорез»).

Применение

к компонентам системы регуляции лактозного оперона Escherichia coli.

Nucleic Acids Res. 1981 10 июля; 9 (13): 3047–3060.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Описано использование гель-электрофореза для количественного исследования ДНК-белковых взаимодействий. Этот быстрый и простой метод включает отделение свободной ДНК от комплексов ДНК-белок на основе различий в их электрофоретической подвижности в полиакриламидных гелях. При благоприятных условиях можно количественно определить как несвязанную ДНК, так и ДНК, связанную с белком. Этот гелевый метод применяется для изучения системы регуляции лактозного оперона E. coli. Показано, что при ионной силе в физиологическом диапазоне белок-активатор катаболита (CAP) образует долгоживущий комплекс с промотором lac дикого типа, но не с мутантом, нечувствительным к CAP.Образование стабильного «открытого» или «расплавленного» комплекса РНК-полимеразы с промотором дикого типа требует участия CAP и циклического AMP. Кроме того, показано, что даже при предварительном образовании в присутствии CAP-cAMP открытый комплекс полимераза-промотор становится нестабильным, если CAP затем селективно удаляется.

Полный текст

Полный текст доступен в виде отсканированной копии оригинальной печатной версии. Получите копию для печати (файл PDF) полной статьи (1.3M) или щелкните изображение страницы ниже, чтобы просмотреть страницу за страницей. Ссылки на PubMed также доступны для Избранные ссылки .

Изображения в этой статье

Щелкните изображение, чтобы увидеть его в увеличенном виде.

Избранные ссылки

Эти ссылки находятся в PubMed. Это может быть не полный список ссылок из этой статьи.

• Джонс О.В., Берг П. Исследования связывания РНК-полимеразы с полинуклеотидами. J Mol Biol. 1966, 28 декабря; 22 (2): 199–209.[PubMed] [Google Scholar]
• Riggs AD, Bourgeois S, Newby RF, Cohn M. Связывание ДНК репрессора lac. J Mol Biol. 1968, 14 июля; 34 (2): 365–368. [PubMed] [Google Scholar]
• Hinkle DC, Chamberlin MJ. Исследования связывания РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК. I. Роль сигма-субъединицы в выборе сайта. J Mol Biol. 1972, 28 сентября; 70 (2): 157–185. [PubMed] [Google Scholar]
• Hinkle DC, Chamberlin MJ. Исследования связывания РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК.II. Кинетика реакции связывания. J Mol Biol. 1972, 28 сентября; 70 (2): 187–195. [PubMed] [Google Scholar]
• Риггс А.Д., Сузуки Х., Буржуа С. Лак Взаимодействие репрессора и оператора. I. Исследования равновесия. J Mol Biol. 1970 28 февраля; 48 (1): 67–83. [PubMed] [Google Scholar]
• Риггс А.Д., Буржуа С., Кон М. Взаимодействие lac-репрессора с оператором. 3. Кинетические исследования. J Mol Biol. 1970, 14 ноября; 53 (3): 401–417. [PubMed] [Google Scholar]
• Пастан I, Адхья С. Циклический аденозин-5′-монофосфат в Escherichia coli.Bacteriol Rev.1976, сентябрь; 40 (3): 527–551. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Риггс А.Д., Рейнесс Дж., Зубай Г. Очистка и ДНК-связывающие свойства белка-активатора гена катаболита. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1971 июн; 68 (6): 1222–1225. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Majors J. Специфическое связывание фактора CAP с ДНК промотора lac. Природа. 1975, 21 августа; 256 (5519): 672–674. [PubMed] [Google Scholar]
• McClure WR. Ограничивающие скорость шаги в инициации цепи РНК.Proc Natl Acad Sci U S. A. 1980, октябрь; 77 (10): 5634–5638. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хоули, Д. К., МакКлюр, В. Р.. Сравнение in vitro свойств инициации PR бактериофага дикого типа и мутантных промоторов x3. Proc Natl Acad Sci U S. A., ноябрь 1980 г., 77 (11): 6381–6385. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Уолтер Дж., Зиллиг В., Палм П., Фукс Э. Инициирование ДНК-зависимого синтеза РНК и влияние гепарина на РНК-полимеразу. Eur J Biochem. 1967 декабрь; 3 (2): 194–201.[PubMed] [Google Scholar]
• Burgess RR, Jendrisak JJ. Процедура быстрой крупномасштабной очистки ДНК-зависимой РНК-полимеразы Escherichia coli с использованием преципитации Polymin P и ДНК-целлюлозной хроматографии. Биохимия. 1975 21 октября; 14 (21): 4634–4638. [PubMed] [Google Scholar]
• Lowe PA, Hager DA, Burgess RR. Очистка и свойства сигма-субъединицы ДНК-зависимой РНК-полимеразы Escherichia coli. Биохимия. 1979 г., 3 апреля; 18 (7): 1344–1352. [PubMed] [Google Scholar]
• Ревзин А., Войчик Р.П.Количественное определение взаимодействия холофермента РНК-полимеразы EScherichia coli с двойной спиральной ДНК с использованием термодинамически строгого метода центрифугирования. Биохимия. 1981, 20 января; 20 (2): 250–256. [PubMed] [Google Scholar]
• Чемберлин MJ, Nierman WC, Wiggs J, Neff N. Количественный анализ бактериальных РНК-полимераз. J Biol Chem. 1979, 25 октября; 254 (20): 10061–10069. [PubMed] [Google Scholar]
• Бун Т., Уилкокс Г. Быстрая высокопроизводительная процедура очистки белка циклического аденозин-3 ‘, 5’-монофосфатного рецептора из Escherichia coli.Biochim Biophys Acta. 17 июля 1978 г .; 541 (4): 528–534. [PubMed] [Google Scholar]
• Clewell DB. Природа репликации плазмиды Col E 1 в Escherichia coli в присутствии хлорамфеникола. J Bacteriol. 1972 Май; 110 (2): 667–676. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Hardies SC, Wells RD. Получение и характеристика больших количеств рестрикционных фрагментов, содержащих контрольные элементы E. coli lac. Ген. 1979 Сен; 7 (1): 1–14. [PubMed] [Google Scholar]
• Felsenfeld G, Hirschman SZ.Анализ взаимодействия соседей гипохромности и спектров ДНК. J Mol Biol. 1965 Сен; 13 (2): 407–427. [PubMed] [Google Scholar]
• Иппен К., Миллер Дж. Х., Скайф Дж., Беквит Дж. Новый контролирующий элемент в опероне Lac E. coli. Природа. 2 марта 1968 г., 217 (5131): 825–827. [PubMed] [Google Scholar]
• Сильверстоун А.Е., Ардитти Р.Р., Магасаник Б. Нечувствительные к катаболиту ревертанты мутантов промотора lac. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1970 июл; 66 (3): 773–779. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Чех CL, McClure WR.Характеристика бинарных комплексов полимераза рибонуклеиновой кислоты-промотор Т7. Биохимия. 1980, 27 мая; 19 (11): 2440–2447. [PubMed] [Google Scholar]
• Майзелс Н.М. Нуклеотидная последовательность рибонуклеиновой кислоты-мессенджера лактозы, транскрибируемая с мутантного промотора UV5 Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1973 Dec; 70 (12): 3585–3589. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Majors J. Инициирование синтеза мРНК in vitro с промотора lac дикого типа. Proc Natl Acad Sci U S A.1975 ноя; 72 (11): 4394–4398. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Энтони Д.Д., Голдтуэйт Д.А. Исследования с РНК-полимеразой. 3. Ферментативная активность мономерной формы. Biochim Biophys Acta. 19 марта 1970 г .; 204 (1): 156–167. [PubMed] [Google Scholar]
• Saxe SA, Revzin A. Совместное связывание с ДНК белка-активатора катаболита Escherichia coli. Биохимия. 1979, 23 января; 18 (2): 255–263. [PubMed] [Google Scholar]
• Takahashi M, Blazy B, Baudras A. Неспецифические взаимодействия CRP из E.coli с нативной и денатурированной ДНК: контроль связывания цАМФ и цГМФ и концентрацией катионов. Nucleic Acids Res. 1979, 24 ноября; 7 (6): 1699–1712. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Maquat LE, Reznikoff WS. Анализ in vitro взаимодействия РНК-полимеразы Escherichia coli с промоторами лактозы дикого типа и мутантными. J Mol Biol. 1978, 15 ноября; 125 (4): 467–490. [PubMed] [Google Scholar]
• Seeburg PH, Nüsslein C, Schaller H. Взаимодействие РНК-полимеразы с промоторами из бактериофага fd.Eur J Biochem. 1977 15 марта; 74 (1): 107–113. [PubMed] [Google Scholar]

Здесь представлены статьи из Nucleic Acids Research, любезно предоставленные Oxford University Press

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Метод быстрого капиллярного электрофореза с детектированием нативной флуоресценции на светодиодах для анализа каннабиноидов в ротовой жидкости

В настоящем исследовании описан метод капиллярного электрофореза с детекцией нативной флуоресценции для количественного определения двух основных каннабиноидов марихуаны, тетрагидроканнабинола (THC) и каннабидиола (CBD) в ротовой жидкости.Сообщенный метод CE позволяет оценить незаконное употребление каннабиса примерно за 10 минут, включая сбор образцов слюны, процедуры предварительной обработки и анализ капиллярного электрофореза (CE). Доказательство принципа, продемонстрированное на самодельном лабораторном приборе, может быть легко преобразовано в действительно портативный прибор для измерений на месте. Процедуру сбора / подготовки / предварительного концентрирования пробы слюны объединяли в один этап с использованием устройства для отбора проб Salivette®.Отдельного осаждения белков и / или дериватизации не требовалось. Базовое разделение CE двух каннабиноидов было достигнуто менее чем за 7 минут путем применения неводного фонового электролита (BGE), состоящего из 2,5 мМ гидроксида натрия в смеси метанол-ацетонитрил (1: 1). Каннабиноиды были обнаружены при их втором λ _ex / λ _em максимум (280/307 нм) со значениями LOD 0,19 и 0,17 мкг · мл ^-1 для THC и CBD, соответственно.Извлечение каннабиноидов из вкладыша для сбора было более 80% для обоих протестированных каннабиноидов при 2,5 мкг мл ^-1 , а межсуточная точность была менее 6% для всех аналитов. Процедура была применена к образцам ротовой жидкости после контролируемого выкуривания ad libitum одной сигареты с каннабисом.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент…

Что-то пошло не так. Попробуйте снова?

Новая техника гель-электрофореза для рэпа

изображение: Растворимые сшитые гели ВАС позволяют быстро и без потерь восстанавливать белковые биомаркеры, разделенные электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле, и облегчают анализ с помощью масс-спектрометрии
посмотреть еще

Предоставлено: перепечатано с разрешения Journal of Proteome Research © 2020 Американское химическое общество (ACS)

Масс-спектрометрия (МС) — мощный метод анализа биомаркеров, поскольку он обеспечивает высокочувствительное и точное измерение целевых молекул в клинических образцах.Применение рассеянного склероза для клинической диагностики, такой как неонатальный метаболический скрининг, развивается с упором на маркеры метаболитов. Измерение белков с помощью МС в настоящее время в основном используется для исследований по обнаружению новых маркеров, но растет интерес к его применению в диагностике клинических маркеров в качестве альтернативы иммуноанализу.

Количественная оценка белковых биомаркеров на основе MS

в основном выполняется восходящим методом с использованием пептидных фрагментов, полученных ферментативным расщеплением белка трипсином.Стандартные протоколы разложения требуют времени реакции более 20 часов, что является фактором, ограничивающим скорость в рабочих процессах подготовки проб.

Хотя количественная оценка белка с помощью МС очень чувствительна, протеомы плазмы и сыворотки очень сложны, и вмешательство других компонентов представляет собой серьезную проблему. Для высокоточного обнаружения маркеров-мишеней сообщалось о подходах к предварительному удалению основных белковых компонентов сыворотки, таких как альбумин, или селективному обогащению маркеров-мишеней с использованием колонок с антителами, но нецелевое влияние на количественные результаты и сложность обработки нескольких образцы остаются препятствиями.

В этом исследовании мы сосредоточились на растворимых полиакриламидных гелях с использованием N, N ‘-бис (акрилоил) цистамина (ВАС) в качестве сшивающего агента для решения этих проблем. Сшитые ВАС полиакриламидные гели легко растворяются при восстановительной обработке, что позволяет извлекать белки, которые вышли в раствор. Мы обнаружили, что восстановленные белки подходят для быстрого переваривания трипсина в условиях высоких температур, и нам удалось разработать высокопроизводительный метод подготовки проб для количественного определения биомаркеров на основе МС, который мы назвали ВАС-DROP (ВАС-гель растворения для переваривания ПААГ). -Разрешенные объективные белки).

Фракционирование протеома с высоким разрешением с помощью BAC-DROP особенно эффективно для количественной оценки целевых белков-маркеров, полученных из клинических образцов, методом МС. Введя BAC-DROP в рабочий процесс количественной оценки воспалительного биомаркера C-реактивного белка (CRP), мы смогли завершить предварительную обработку образца всего за 5 часов и успешно определить количество CRP из 0,5 мкл образца сыворотки крови человека. Нам также удалось провести серологический диагноз инфекции вируса гепатита B (HBV) с помощью количественного определения HBsAg в сочетании с BAC-DROP и MS.В последнее время интерес к диагностике вирусных инфекций с рассеянным склерозом быстро растет, о чем свидетельствует диагностика COVID-19. Подход BAC-DROP к высокопроизводительной пробоподготовке, показанный в этом исследовании, будет применим не только к HBV, но и к образцам других инфекционных вирусных заболеваний.

###

Это исследование было проведено совместной исследовательской группой Университета Эхимэ, Медицинского факультета Университета Хамамацу и Университета Китасато, и результаты исследования были опубликованы в Интернете в журнале Journal of Proteome Research Американского химического общества 24 декабря 2020 года.

Журнал

Журнал протеомных исследований

Заявление об ограничении ответственности: AAAS и EurekAlert! не несут ответственности за точность выпусков новостей, размещенных на EurekAlert! участвующими учреждениями или для использования любой информации через систему EurekAlert.

Гель-электрофорез

— определение, цель и шаги

Гель-электрофорез Определение

Гель-электрофорез — это процедура, используемая для разделения биологических молекул по размеру. Разделение этих молекул достигается помещением их в гель с небольшими порами и созданием электрического поля поперек геля. Молекулы будут двигаться быстрее или медленнее в зависимости от их размера и электрического заряда.

Обзор гель-электрофореза

Процесс гель-электрофореза работает, потому что отрицательно заряженные молекулы удаляются от отрицательного полюса электрического тока, а молекулы меньшего размера будут двигаться быстрее, чем молекулы большего размера.Таким образом, разделение по размерам достигается в пуле молекул, проходящих через гель. Гель работает аналогично сите, разделяя частицы по размеру. Электрофорез перемещает частицы, используя свой собственный электрический заряд, через сито.

Когда исследователи пытаются различить разные сегменты ДНК, например, процесс прост. Образцы загружаются в каналы в начале геля. Каждая молекула ДНК имеет одинаковый заряд (-1), потому что ДНК образована одними и теми же 4 нуклеотидами и всегда несет слегка отрицательный заряд независимо от ее размера. Следовательно, каждая молекула ДНК будет иметь одинаковую силу, протягивая ее через гель.

Однако размер каждой молекулы препятствует ее прохождению через гель. Большие молекулы ударяются о части гелевой матрицы и замедляются. Небольшие молекулы ДНК могут скользить между различными компонентами гелевой матрицы и быстро переходить на другую сторону геля. По прошествии определенного времени можно увидеть агрегацию окрашенных молекул ДНК в различных областях геля в зависимости от того, как далеко они переместились во время гель-электрофореза. Это позволяет исследователям идентифицировать сегменты и сравнивать ДНК разных организмов.

Для чего используется гель-электрофорез?

Цель гель-электрофореза — визуализировать, идентифицировать и различать молекулы , которые были обработаны с помощью предыдущего метода, такого как ПЦР, ферментативное расщепление или экспериментальные условия. Часто смеси нуклеиновых кислот или белков, собранные в предыдущем эксперименте / методе, подвергаются гель-электрофорезу для определения идентичности или различения молекул.

Этапы гель-электрофореза

Общие этапы, включенные в общий протокол гель-электрофореза ДНК:

1. Подготовка образцов для запуска

ДНК выделяется и предварительно обрабатывается (например, ПЦР, ферментативное расщепление) и готовится в растворе с некоторым основным синим красителем, чтобы помочь визуализировать движение образца через гель.

2. Готовят раствор агарозного геля TAE.

Буфер TAE обеспечивает источник ионов для создания электрического поля во время электрофореза.Отношение веса к объему агарозы в буфере TAE используется для приготовления раствора. Например, если требуется 1% гель агарозы, 1 г агарозы добавляют к 100 мл TAE. Используемый процент агарозы определяется ожидаемым размером ДНК. Если кто-то хочет разделить пул полос ДНК меньшего размера (<500 п.н.), готовится гель с более высоким процентным содержанием агарозы (> 1%). Более высокий процент агарозы создает более плотное сито для увеличения разделения небольших различий в длине ДНК.Раствор агароза-ТАЕ нагревают до растворения агарозы.

3. Отливка геля

Раствор TAE агарозы наливают в лоток для отливки , который после охлаждения и затвердевания раствора геля образует пластину геля с рядом лунок наверху.

4. Установка камеры для электрофореза

Твердый гель помещают в камеру, заполненную буфером TAE. Гель располагают так, чтобы лунки камеры были ближе всего к отрицательному электроду камеры.

5. Загрузка геля

Лунки гелевой камеры загружаются образцами ДНК, и обычно лестница ДНК также загружается в качестве эталона для размеров.

6. Электрофорез

Отрицательный и положительный выводы подключены к камере и к источнику питания, на котором устанавливается напряжение. При включении источника питания создается электрическое поле. , и отрицательно заряженные образцы ДНК начинают мигрировать через гель от отрицательного электрода к положительному.

7. Остановка электрофореза и визуализация ДНК

После того, как синий краситель в образцах ДНК прошел через гель достаточно далеко, питание отключают, гель удаляют и помещают в раствор бромистого этидия. Бромид этидия внедряется между ДНК и виден в ультрафиолетовом свете. Иногда бромид этидия добавляют непосредственно в раствор агарозного геля на этапе 2. Гель, окрашенный бромидом этидия, затем подвергается воздействию УФ-излучения и делается снимок. полос ДНК визуализируются на каждой дорожке, соответствующей лунке камеры. Также визуализируется загруженная лестница ДНК и можно оценить длину полос ДНК. Пример приведен на рисунке ниже.

Гель-электрофорез

Типы гель-электрофореза

Существует два типа гель-электрофореза: нативный и денатурирующий. Электрофорез в нативном геле обычно пытается сохранить РНК или белок в его нативной структуре при прохождении через гель.Денатурирующий гель-электрофорез пытается восстановить РНК или белок до его наиболее линейной структуры до или во время гель-электрофореза.

Денатурация РНК или белка достигается добавлением восстанавливающего агента к образцу, гелю и / или буферу. Восстанавливающий агент разделяет связи в молекуле РНК или белка и тем самым уменьшает ее вторичную структуру. Вторичная структура белка или РНК будет нелинейным образом влиять на скорость его миграции через гель. Однако денатурированная линейная форма РНК или белка будет мигрировать пропорционально своему линейному размеру (парам оснований или килодальтонам). Денатурирующий гель-электрофорез часто более точен для определения размера, тогда как нативный гель-электрофорез обычно используется для идентификации более крупных белковых комплексов.

Примеры гель-электрофореза

• TAE-агарозный гель-электрофорез наиболее часто используется для ДНК.