Метод инъекции: Ошибка выполнения

Инъекции для клеток, нанолифты и новые лекарства: в ЮУрГУ создан метод изучения наночастиц

Сегодня наночастицы используются при создании солнечных батарей, в наноэлектронике и биотехнологиях. Но наибольшего внимания заслуживает их применение в медицине, уверены в Южно-Уральском государственном университете.

Лабораторией компьютерного моделирования лекарственных средств ЮУрГУ создан новый метод анализа и прогноза физико-химической и биологической активности наночастиц. Его преимущество перед уже существующими способами — в быстроте расчетов: появляется возможность изучения моделей наночастиц, состоящих из десятков тысяч атомов, в то время как другие методы позволяют изучать наночастицы в 100—200 атомов. Кандидат химических наук, доцент Владимир Потемкин рассказал об исследованиях наночастиц, которые ведутся учеными в настоящее время.

Ученые смогут прогнозировать свойства новых лекарств

«Сейчас мы можем изучать не только наноразмерные частицы и их свойства, но и электронные характеристики молекул белка. Моделирование комплексов белков с каким-либо лекарственным средством позволит разобраться с механизмом терапевтического действия этого лекарства. Другими словами, мы сможем определить, на что оно действует в ферменте, чтобы блокировать или, наоборот, активизировать его. Фермент — это биокатализатор, который ускоряет некоторые химические процессы. Например, лекарство может блокировать какой-либо фермент в организме бактерии, и ее жизнедеятельность будет нарушена. Или же оно воздействует на иммуноглобулин в крови человека — его деятельность становится активнее, и мы уже силами собственного организма боремся с заболеванием».

Рассмотрев механизм биологического действия и определив, с чем именно в белке взаимодействует лекарство, ученые смогут прогнозировать биологическую активность новых лекарств. Они будут смоделированы путем внедрения в белок новой молекулы, неизвестной и несинтезированной.

Пролекарства и чуждые вещества

В изучении наночастиц используются следующие электронные характеристики: сродство с электроном, свойства приема-отдачи электродов наночастиц, сорбционная активность, значения электронной плотности в критических точках и др. Так, критические точки характеризуют силу связывания атомов, позволяют определять природу биологической активности или механизм проявления какого-либо физико-химического свойства. Одно из исследований Лаборатории компьютерного моделирования лекарственных средств — анализ критических точек в комплексах цитохрома Р450. Это комплексы белков в нашем организме, которые располагаются в печени и в легких и отвечают за детоксикацию организма.

Функции электронной плотности для расчета электронных дескрипторов в алгоритме AlteQ: а) Полная электронная плотность; b) Лапласиан электронной плотности

«Когда в организм человека попадет токсин, именно цитохромы Р450 отвечают за его окисление и выведение из организма. Поэтому изучение этих комплексов крайне важно. Мы пытаемся понять, как производится детоксикация, за счет каких взаимодействий идет окисление токсина. Это интересно также при создании лекарств. Печень воспринимает любое лекарство как чуждое вещество. При разработке лекарств важно не только рассматривать целевой эффект (например, противоопухолевый): необходимо определить, дойдет ли оно до больной клетки или окислится в печени и потеряет свои лечебные свойства. Кроме того, бывает и обратный эффект. Так, вещество, не являющееся лекарством, при взаимодействии с цитохромами становится им. Это пролекарство, и самым известным из них является аспирин».

Нанолифты и наношприцы

Учеными изучаются не только физико-химические свойства наночастиц, но и их биологическая активность. Так, двуокись титана определенных размеров способствует появлению рака. Прогноз канцерогенности, токсичности для организма наночастиц — одна из актуальных и острых задач.

«Мы ищем различные свойства наноразмерных частиц и пытаемся их смоделировать. Например, некоторые наночастицы могут использоваться как микрокапсулы для лекарственного средства. Лекарство помещается в нанотрубки, транспортируется и затем вводится в организм. Нанотрубки позволяют сохранить лекарственные свойства веществ и, в то же время, используются для точечной доставки. Такие наноразмерные капсулы называют нанолифтами. Кроме того, некоторые нанокапсулы прокалывают мембрану больной клетки, чтобы лекарство прошло через нее. Это так называемые наношприцы».

«К созданию новых лекарств»

В рамках данного исследования также рассматриваются молекулы белка со схожей структурой. Это необходимо по той причине, что во многих случаях белки, на которые действуют лекарственные средства, есть и в здоровых, и в больных клетках. Установив различия между ними, ученые смогут разработать лекарство, воздействующее на различающиеся участки. Таким образом, оно будет минимально токсично по отношению к организму человека и максимально токсично для опухолевых или бактериальных клеток.

Разработанный учеными ЮУрГУ метод анализа и прогноза физико-химической и биологической активности в настоящее время используется сайтом онлайн-вычислений www.chemosophia.com. Так, чтобы вычислить противоопухолевую активность, необходимо загрузить геометрию молекулы и дать соответствующую команду. Сейчас сайт насчитывает около 1800 пользователей, он существует с 2013 года. Наиболее популярные расчеты связаны с биологической активностью. Кроме того, он позволяет определить температуру кипения и плавления, кислотность, электронную плотность и др. Исследование физико-химической и биологической активности наночастиц — это путь к созданию новых лекарств, подчеркивает ученый ЮУрГУ. Ресурс является абсолютно бесплатным и обладает широким спектром возможностей.

Интравитреальные инъекции — новый эффективный метод лечения тяжелых воспалительных заболеваний переднего и заднего сегмента глаза. Первые результаты

Автор: А. Г. Шилкин

Лечение внутриглазных воспалительных заболеваний у собак и кошек: хориоретинитов, панувеитов, гемофтальмов, иридоциклитов является серьезной проблемой для ветеринарного офтальмолога вследствие трудной «адресной доставки» лекарственных препаратов к пораженным тканям. Основным препятствием на пути лекарственных препаратов при инстилляциях, субконъюнктивальных инъекциях или парабульбарных инъекциях к тканям-мишеням — сетчатке, сосудистой оболочке и цилиарному телу становится гематоофтальмический барьер. Гемато-офтальмологический барьер представлен эндотелием капилляров сосудистой оболочки глаза и служит  физиологическим заграждением между кровеносными сосудами и внутренними тканями глаза (схож с гемато-энцефалическим барьером). Его задачей является  препятствие прохождению внутрь глаза токсинов, бактерий и других нежелательных элементов, однако так же он препятствует прохождению лекарственных веществ. Таким образом большая часть препаратов вследствие этого барьера просто не доходит до проблемных зон. По этой причине и была разработана техника интравитреального введения лекарственных препаратов к сетчатке и стекловидному телу.

Интравитреальные инъекции — это введение препаратов непосредственно в полость стекловидного тела через прокол склеры. Преимуществами интравитреальных инъекций перед всеми другими методами лечения является прямая и быстрая доставка препаратов в обход гематоофтальмического барьера непосредственно к пораженным тканям-мишеням.

При интравитреальном введении лекарственное вещество попадает в ретроцилиарные цистерны стекловидного тела. В случае сохранной структуры стекловидного тела оно достигает задних его отделов, через 8 ч – 2 суток, а затем сосудистой оболочки и сетчатки. Это позволяет поддерживать концентрацию лекарственного препарата в течение более длительного времени по сравнению с другими путями доставки, а также снижает возможные побочные системные эффекты ввиду меньшей дозы и количества вещества, которое выводится из глаза и попадает в системный кровоток. В гуманитарной офтальмологии интравитреальные инъекции широко применяются для успешного лечения многих заболеваний заднего отрезка глаза: диабетической пролиферативной ретинопатии, гемофтальмов, эндофтальмитов, хориоретинитов, тромбозов центральной вены сетчатки и т.д. ( 2,3,5,18,19). В ветеринарной офтальмологии данная процедура так же периодически используется рядом врачей ( Лужецкий С.А, Гончаров Д.В). Однако сама методика техники интравитреальных инъекций для животных в отечественной ветеринарной литературе практически не описана. Отсутствуют данные о клинической эффективности метода, непоредственных и отдаленных клинических результатах лечения, осложнениях, показаниях и противопоказаниях к его применению (9).

Целью данной работы являлось:

• внедрение и применение в клинической практике нового метода лечения заболеваний заднего отрезка глаза — интравитреальных инъекций
• Проведение анализа эффективности методики
• Сравнение непосредственных и отдаленных результатов лечения
• Определение показаний и противопоказаний к применению интравитреальных инъекций.

Собственные исследования

Нами методом инравитреального введения препаратов было пролечено 13 глаз собак и кошек в возрасте от 1 до 10 лет. Девять глаз были с бесперспективными и проблемными глазами, которые на сленге офтальмологов называются «глазами, выброшенными на помойку», для которых другие методы лечения не работали и интравитреальные инъекции являлись единственной альтернативой энуклеации или эвисцерации. Из них было семь случаев тяжелых рецидивирующих иридоциклитов. Односторонние иридоциклиты наблюдались у 5 животных (3 кошек и 2 собак) . Двое кошек было с двусторонним панувеитом на фоне иммунодефицита и вирусного лейкоза.

Всем этим животным для купирования интраокулярного воспаления интравитреально вводили триамцинолон (кеналог 40) в дозе 0,2мл. Триамцинолон являлся базисным препаратом первого выбора при интравитреальных инъекциях вследствие того что: триамцинолон снижает экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), одновременно редуцирует отек, уменьшает воспаление внутриглазных структур и повышение проницаемости сосудов. (2,4,13,14,16). Интравитреальное введение кеналога позволяет добиться высокой внутриглазной концентрации стероидов, избежав системных побочных эффектов (11,12).

Двое животных было с односторонними рецидивирующими гемофтальмами в сочетании с гифемой сроком более 7 дней. Им в стекловидное тело для рассасывания внутриглазных кровоизлияний вводилось 0,4 мл АТР (актилизе) с разведенной в ней гемазой (4).

Чтобы ввести такое большое количество препарата внутрь глаза и не повысить резко внутриглазное давление осуществляли следующую процедуру. Перед проведением интравитреальной инъекции делали парацентез (прокол) передней камеры и выпускали шпателем или иглой несколько капель внутриглазной жидкости. Тем самым мы уменьшали внутренний объем жидкости в глазу и могли вводить большое количество лекарств в стекловидное тело, не боясь повышения внутриглазного давления и без истечения препаратов из стекловидного тела наружу глаза.

Интраоперационное сопровождение факоэмульсификации с имплантацией искусственного хрусталика для купирования фибринозной воспалительной реакции в передней камере после операции — 4 собаки.

Этим животным на завершающем этапе операции после имплантации интраокулярной линзы через роговичный разрез и отверстие в гаптической части ИОЛ в стекловидное тело вводили 0,05- 0,1 мл триамцинолона с целью снижения послеоперационного фибринозного воспаления.

Рисунок 1. Врожденная катаракта у хаски 1 года с мощным фиброзом задней капсулы хрусталика, который неизбежно приведет к вторичной катаракте и снижению зрения после операции.

Рисунок 2. Тяжелый двухсторонний кератоувеит у кота 3 лет в сочетании с множественными эрозиями роговицы и хориоретинитом на фоне вирусного лейкоза.

Рисунок 3. Тотальная гифема в сочетании с гемофтальмом у собаки чихуа хуа 6 лет.

Рисунок 4. Ультразвуковая факоэмульсификация катаракты у собаки 5 лет с набухающей катарактой.

Техника интравитреальных инъекций

Манипуляция у всех животных осуществлялась под операционным микроскопом и ингляционной анестезией. В конъюнктивальную полость до инъекции закапывали анестетик алкаин 2 раза в течение 2 минут, затем в глаз закапывали офтальмоантибиотик ципровет или тобрекс.

В верхне–наружном сегменте глаза на расстоянии 5 мм от лимба у собак и 6 мм от лимба у кошек, при помощи одноразового 1мл шприца с размером иглы в 30G производился сквозной прокол склеры. В месте прокола конъюнктива несколько смещалась в сторону для предотвращения развития эндофтальмита. Расстояние от лимба до места инъекции размечалось специальным офтальмологическим циркулем.

Это место анатомически соответствует плоской части цилиарного тела ( pars plana) и является наиболее безопасным для инъекцией. При проколе склеры дальше 6 мм от лимба возможна отслойка сетчатки. При проколе склеры дальше 6 мм от лимба возможна отслойка сетчатки. Игла вводилась на глубину до 0,3- 0,5 см под косым углом в направлении к центру стекловидного тела.

Правильная ориентация угла укола очень важна, при введении иглы под прямым углом возможна перфорация хрусталика и развитие травматической катаракты, особенно у кошек имеющих сферофакичный большой хрусталик.

Препараты в стекловидное тело вводили медленно. После извлечения иглы конъюнктива зажималась пинцетом в месте прокола на 1минуту для предотвращения вытекания препарата под конъюнктиву.

Рисунок 5. Интравитреальные инъекции проводились под операционным микроскопом и ингаляционной анестезией.

Рисунок 6. Разметка места интравитреальной инъекции с помощью офтальмологического циркуля

Рисунок 7. Техника интравитреальной инъекции.

Рисунок 8. В стекловидное тело игла вводится под косым углом в направлении к центру стекловидного тела.

Анализ результатов лечения

Интравитреальные инъекции показали себя полностью безопасной для глаза животного и достаточно простой манипуляцией. При их проведении у нас не отмечалось никаких осложнений и аллергических реакций. Перфорации хрусталика, развития токсической катаракты или тракционных отслоек сетчатки не было. Признаков воспаления после интравитреальной инъекции ни в передней камере, ни на глазном дне нами не выявлено. Влага передней камеры оставалась без изменений, радужная оболочка и цилиарное тело также не реагировали на введение препаратов. Токсические изменения со стороны сетчатки и зрительного нерва отсутствовали. У двух животных мы наблюдали единичные мелкие кровоизлияния на конъюнктиве в зоне инъекции, которые рассосались в течение 2-5 суток. Какие-либо другие изменения в тканях глаза не визуализировались. Небольшая офтальмогипертензия на фоне инъекций носила кратковременный транзиторный характер и на следующий день после инъекции цифры внутриглазного давления регистрировались в пределах нормы. Развития внутриглазных инфекций вследствие интравитреальных инъекций не было ни у одного животного. После интравиреальной инъекции триамцинолон у животных визуализировался как сгусток белого цвета в передней трети стекловидного тела. Через день-два дня после введения кристаллы стероида определялись, в основном, в нижнем сегменте стекловидного тела (вследствие большей силы тяжести и массы триамцинолона) в виде подвижного белого очага неправильной формы с четкими контурами. При биомикроскопии глаза на большом 16 кратном увеличении и максимальном освещении практически у всех животных четко визуализировалось уменьшающееся со временем диффузное осаждение кристаллов триамцинолона на волокнах стекловидного тела в виде белых несколько мутных образований или волокон. Стероидный сгусток имел медленную тенденцию к резорбции в течение нескольких месяцев с момента введения. У двух животных он так и не рассосался полностью при сроках наблюдения до 9 мес.

Терапевтическая эффективность данной методики составила чуть более 50%. У 7 из 13 животных произошло значительное улучшение клинической картины. Для таких изначально тяжелых и бесперспективных глаз данную эффективность мы считаем очень высокой. У 3 из 5 животных с односторонними иридоциклитами воспалительный процесс купировался полностью после однократной инъекции. Исчезли преципитаты с задней поверхности роговицы, отек и кровоизлияния на радужной оболочке. Резорбировался экссудат в передней камере, восстановилась прозрачность внутриглазной жидкости.

Клиническое состояние всех этих глаз является стабильным, эффективность не снижается при сроках наблюдения до 11мес.

У двух кошек с двухсторонними панувеитами на фоне подтвержденных вирусных инфекций в начале произошла некоторая положительная динамика процесса: частично резорбировался экссудат в передней камере, произошло снижение дилятации и кровенаполненности сосудов радужки. Однако эффект оказался нестойкий и полностью исчез в течение 1.5 месяцев. В дальнейшем отрицательная динамика со стороны воспаления опять нарастала. Такой кратковременный эффект был по- видимому обусловлен прогрессирующим течением общего инфекционного заболевания и легко объясним.

При гемофтальмах и гифемах из двух животных кровь постепенно рассосалась у одной собаки в течение 10 дней. Стабилизация процесса произошла полностью и больше кровоизлияние не рецидивировало. У второй собаки на следующий день после инъекции произошло осложнение — свежее кровоизлияние в переднюю камеру высотой 5мм. Проведение дальнейших инъекций на фоне возникшего свежего кровоизлияния было признано нецелесообразным.

После факоэмульсификации катаракты с имплантацией искусственного хрусталика у 1 из 4 собак — 10 летней — овчарки через 21 день после операции факоэмульсификации с ИОЛ на фоне благополучного состояния глаза внезапно возникла вторичная глаукома. Насколько она связана с интравитреальной инъекцией кеналога сказать достаточно сложно. Уостальных 3 из 4 животных с интравитреальным введением триамцинолона фибринозное воспаление в передней камере было незначительным. Триамцинолон визуализировался за интраокулярной линзой в передней трети стекловидного тела в виде небольшого локального сгустка при длительном (до 8 месяцев ) периоде наблюдения и рассасывался достаточно медленно.

Хочется отметить, что введение триамцинолона в стекловидное тело при факоэмульсификации катаракты у животных несколько уменьшает фибринозную увеальную реакцию, но к сожалению полностью проблему фибрина в послеоперационном периоде не решает.

Рисунок 9. Глаз до лечения. Рецидивирующий вялотекущий односторонний увеит у кота сфинкса 5 лет невыясненной этиологии.

Рисунок 10. Глаз после проведения интравитреальной инъекции. Воспалительный процесс полностью исчез. Сроки наблюдения за животным 11 мес.

Рисунок 11. Глаз собаки хаски через1.5 мес. после факоэмулсификации катаракты с имплантацией хрусталика и интравитреальным введением триамцинолона. Триамцинолон четко визуализируется в виде белого небольшого сгустка за искуственным хрусталиком в нижней части.

Заключение

Интравитреальные инъекции являются совершенно новым интересным и перспективным способом лечения многих заболеваний заднего отрезка глаза: хориоретинитов, панувеитов, гемофтальмов, иридоциклитов. Преимуществом интравитреальных инъекций перед всеми другими методами лечения этих патологий является безопасность и быстрая «адресная» доставка лекарственных препаратов непосредственно к пораженным тканям в обход гематоофтальмического барьера. Метод показал высокие и длительные клинические результаты даже на самых сложных и бесперспективных глазах.

Сама техника интравитреальных инъекций достаточно проста в выполнении, не требует специальной аппаратуры или подготовки врача. При их проведении осложнений, воспалительных процессов, длительного повышения внутриглазного давления и аллергических реакций не наблюдалось.

Процедура экономически малозатратна для владельцев животных, что тоже немаловажно. Мы пока не знаем всех границ и возможностей интравитреальных инъекций, но будем их серьезно изучать в наших дальнейших исследованиях.

Субконъюнктивальные и парабульбарные инъекции в Троицке | «Андреевские больницы

Субконъюнктивальные, парабульбарные инъекции применяются при состояниях, угрожающих полной потерей зрения. Это намного более эффективная методика введения лекарственных средств по сравнению с закапыванием капель и закладыванием мазей в передний отдел глаза.

Область применения

Субконъюнктивальные и парабульбарные инъекции проводятся при поражениях глаз с целью улучшения обменных процессов в их тканях, увеличения остроты зрения, устранения воспалительных процессов, восполнения инсулиновой недостаточности, рассасывания глазных кровоизлияний.

Показания

Субконъюнктивальные и парабульбарные инъекции назначаются при следующих заболеваниях глаз:

• воспалительные процессы переднего и заднего отрезков глаза: склерит, увеит, кератит, иридоциклит, нейроретинит;




• аутоиммунные заболевания с поражением глаз: ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит;




• глаукома;




• отслоение сетчатки;




• миопия;




• травматические поражения глаз.

Противопоказания

Противопоказанием к проведению инъекций субконъюнктивальным и парабульбарным методами может стать индивидуальная непереносимость вводимого препарата.

Инъекции аскорбиновой кислоты противопоказаны при сахарном диабете и повышенной свертываемости крови. Препарат Эмоксипин не показан при пониженной свертываемости крови, так как может вызвать кровоизлияние в глаз. Введение Эхинохрома противопоказано больным с низким болевым порогом.

Методы проведения инъекций

Субконъюнктивальные инъекции сопровождаются сильными болевыми ощущениями, поэтому перед их выполнением проводят анестезию глазного яблока. Тонкой иглой прокалывают конъюнктиву и вводят 0,5–1 мл раствора лекарственного препарата.

Парабульбарные инъекции проводятся введением иглы на глубину 1–2 см параллельно нижней стенке орбиты под глазным яблоком.

Подготовка

Перед проведением инъекций пациент проходит обследование на выявление инфекционных и аллергических болезней.

Лечение суставов методом SVF(стромально-васкулярная фракция)

Стволовые клетки для лечения заболеваний суставов

За прошедшие 20 лет произошли больше перемены к лучшему, связанные с появлением новых еще более эффективных и безопасных методик лечения заболеваний суставов. Наука не стоит на месте, каждые 5 лет мы получаем новые технологии, помогающие нам лечить боль в суставе быстрее и эффективнее, чем раньше. Все уже дано знают про гиалуроновую кислоту, PRP (а если вы еще не знаете, советуем Вам ознакомиться со статьями). Сегодня мы поговорим про стволовые клетки для лечения суставов, получаемые из жировой ткани (стромально-васкулярную фракцию, SVF, ACA) обсудим суть, показания, противопоказания, эффективность и безопасность данного метода.

 Что же такое стволовые клетки?

Стволовая клетка — это биологический объект, который может превратиться в абсолютно любой тип ткани ( например кость, связка, хрящ). Это значит, что стволовая клетка при попадании в сустав может превращаться в клетки, которые были утрачены в результате заболевания или травмы (например некроз кости или дефект хряща)

Почему их получают из жировой ткани?

По данным многочисленных исследований стволовых клеток в жировой ткани в десятки раз больше, чем в других, например, в костном мозге или эпителии. 

В чем суть этой методики?

Стволовые клетки работают непосредственно в двух направлениях. Первое, и самое главное, они восстанавливают структуры, которые были утрачены в результате травмы или заболевания. Например при начальных стадиях остеонекроза кости мы видим значительные улучшения на МРТ уже через 3 месяца. При лечении локального размягчения хряща (хондромаляции) уже через 2 месяца можно не только почувствовать улучшение, но и увидеть его на МРТ.

Второе направление работы клеток — биологическое, они выделяют особые вещества (цитокины, морфогенетические белки и другие), которые помогают снять разрушительное воспаление, нормализовать микроциркуляцию крови, обезболить сустав. В целом оба направления работы клеток приводят к быстрому положительному эффекту.

При каких заболеваниях суставов показана эта методика?

Клеточная терапия будет эффективна при

— остеонекрозе (на ранних стадиях) до 3 ARCO

— при артрозе (остеоартрите) до 4 стадии по Kellgren-Lawrence

— при повреждении менисков

— при хондромаляции до 4 степени по Outerbridge

— при повреждении связок до 3 степени

— при остеохондрозе, спондилоартрозе

— при ревматоидном артрите

Каковы противопоказания для данной методики?

Ваша безопасность — это главное для нас, поэтому мы откажем Вам в проведении процедуры при:

— наличии активной инфекции

— при наличии онкологического заболевания в момент обращения и через 5 лет после удаления первичного

— при анорексии (нет источника жировой ткани)

— при беременности (нет научных данных о безопасности методики)

 Безопасна ли эта методика? Какие осложнения возможны?

Данная методика абсолютно безопасна потому, что при изготовлении клеточного концентрата используется собственный материал пациента — это гарантирует 100% биологическую совместимость. Осложнения возможны при любом инвазивном вмешательстве, поэтому у этой методики нет специфических осложнений, есть только общие, которые перечислены в порядке убывания: кратковременное (до 3 суток) усиление боли после инъекции (20%), хромота до 4 суток (7%), отек сустава (5%), инфекция области вмешательства при наличии факторов риска — синуситы, патология зубов, пиелонефрит, ИППП (0,01%).

Какие исследования, документы и анализы необходимы для проведения манипуляции?

Обязательным условием для проведение данной процедуры является дача Вами информированного согласия, для этого необходим паспорт. Обязательным анализом является сдача клинического анализа крови, скорости оседания эритроцитов и уровня С-реактивного белка количественным методом. Также Вы обязаны дать правдивую информацию о лекарственной аллергии, заверив ее письменно собственноручной подписью. Также при дефиците жировой ткани на животе Вам может быть показана ультразвуковая липометрия (УЗИ подкожной клетчатки с целью определения мест, богатых жиром). О каких-либо других необходимых анализах, являющихся специфическими расскажет Ваш хирург.

Эта методика официально зарегистрирована в России, кто ее придумал?

На 2019 год это единственная легальная, официально зарегистрированная методика получения стромально-васкулярной фракции в России. Метод разработан и внедрен компанией Arthrex – мировым лидером в области медицины спорта высоких достижений. Мы используем только 100% оригинальные одноразовые расходные материалы — набор для липоаспирации Tulip, двойные шприцы ACA-ACP, центрифугу Hettich Rotofix 32a, стерильное одноразовое белье. Все это для Вашей безопасности. Перед проведением подобных процедур поинтересуйтесь у Вашего врача, какой методикой он пользуется.

Как проводится процедура?

Вы прибываете в клинику. Анализы проверяются в день манипуляции. При отсутствии противопоказаний Ваш лечащий врач берет с Вас информированное согласие на манипуляцию, передает ассистенту. Вы перемещаетесь в процедурный кабинет. Манипуляция проходит в положении лежа на спине. Врач обрабатывает Ваш живот антисептиком, по бокам от пупка проводится анестезия (с 2-х сторон), далее через специальную иглу в жир живота вводится раствор Кляйна, который разрушает жир и делает процедуру более комфортной. Через 20 минут, разрушенный жир забирается в шприцы, центрифугируется дважды. При малом объеме полученного продукта (SVF, ACA) он разбавляется аутоплазмой. Разрезы на животе не ушивают, наклейки снимают через 3 дня. Принимать душ можно.

Как я пойму, что методика мне помогает?

К сожалению интернет пестрит заманчивой рекламой, кричащей что у Вас на следующий день все пройдет, вырастет новый хрящ, и сустав станет таким, каким был. Это не так. Данный метод медленно действующий. Ведь клеткам нужно в среднем 60-90 дней для того, чтобы осесть на поверхности и начать делиться, поэтому на МРТ результаты можно увидеть лишь спустя минимум 3 месяца с момента манипуляции. Клинические эффекты (то что Вы ощущаете, то есть уменьшение боли, увеличение подвижности, ускорение темпа шага) проявляются от 7 до 21 дня, они нарастают и первому месяцу Вы почувствуете выраженное улучшение.

 Какая реабилитация необходима?

В интернете много рекламных лозунгов, которые говорят что при использовании этой методики не требуется реабилитации. Реабилитация — это неотъемлемая часть любого комплексного лечения. Для Вас обязательно будет разработана индивидуальная программа реабилитации, потому что двух одинаковых пациентов не бывает. Реабилитация — это то, что поможет закрепить результат и значительно улучшить качество жизни. Под реабилитацией подразумеваются специальные упражнения.

Контурная пластика препаратами на основе ПОЛИМОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ (Скульптра, Эстефил) в Красноярске

Доказанный факт, что после 30 лет в коже снижается выработка не только гиалуроновой кислоты, но и коллагена – основного каркаса для нашей кожи.

В косметологии с целью стимуляции коллагена активно применяется ПолиМолочная Кислота (ПМК, PLA). Этот препарат уже более 20 лет используется для создания саморассасывающихся хирургических нитей и шовного материала.

ПолимолочнаяКислота подает нашему организму сигналы о повреждениях кожи, это, в свою очередь, способствует восстановлению тканей посредством непрерывного коллагенообразования и выработке зрелыми клетками кожи гиалуроновой кислоты.

Препарат корректирует не только отдельные морщинки, но также подтягивает контур лица и омолаживает кожу в течение длительного времени.

Этот эффект расширяет возможности контурной пластики: происходит естественному омоложению не только кожи лица и шеи, но и зоны декольте и кистей рук.

На сегодняшний день общепризнанными по эффективности и безопасности во всем мире считаются всего лишь 2 препарата, которые имеют регистрационные удостоверения на территории РФ и одобренные FDA (агентство Министерства здравоохранения и социальных служб США) на территории зарубежных стран: AestheFill (Эстефил) и Sculptra (Скульптра)

Препараты позволяют решить сразу несколько проблем, с которыми сталкиваются женщины с течением времени:

• Коррекция (заполнение) морщин.
• Омоложение и улучшение качества кожи (лицо, шея, декольте, руки).
• Коррекция рубцов, в том числе постакне.

Показания:

• Снижение тонуса кожи (лица, шеи, декольте, кистей рук).
• Обвисание кожи после резкого похудения.
• Липодистрофия.

Противопоказания

• кожные заболевания в местах проведения процедуры
• период беременности и лактации
• заболевания в острой стадии
• аллергические реакции (поливалентные проявления)
• аутоиммунные заболевания
• психические болезни
• склонность к образованию рубцов в местах уколов
• гемофилия

Ограничения и противопоказания:

• Во время месячных нежелательно назначать любые инъекционные процедуры, поскольку в этот период повышенная вероятность кровоточивости и образования гематом.
• Наличие герпетических высыпаний и повышенная температура тела — часто указывают на общее ослабление иммунитета в связи с другими заболеваниями.
• Склонность к отекам. При избыточном накоплении жидкости в тканях, биополимер создаст в месте укола сильную отечность, что может создать эффект одутловатости.
• Наличие новообразований – абсолютное противопоказание для процедуры.

AestheFill (Эстефил)

Aesthefill – инновационный препарат нового поколения, дермальный филлер (наполнитель) на основе ПМК. Страна производитель – Южная Корея. Попадая в кожу, Aesthefill активно заполняет пустоты, образовавшиеся в результате ее старения.

Aesthefill не мигрирует в близлежащие к месту ввода препарата ткани. К тому же, он полностью безопасен для организма: биодеградация (выведение препарат в течение времени) протекает естественным путем. Являясь коллагеностимулятором пролонгированного действия, Aesthefill способствует разглаживанию морщин, возвращению коже гладкости и упругости.

Aesthefill гарантирует прекрасный результат, обеспечивает поддержание кожи в хорошем состоянии на протяжении длительного периода.

Как проводится процедура AestheFill (Эстефил)

Проведение процедуры не требует какой-то особенной и длительной подготовки. Процедура проводится только по назначению врача, выполняется сертифицированным специалистом!!!

• препарат разводится непосредственно при клиенте перед процедурой, время приготовления суспензии для введения — около10 минут
• при разведении флакона получается 5 мл готового препарата, этого хватает на 2 зоны (например, лицо и шея, лицо и кисти рук)
• в работе используется канюля, что снижает болезненные ощущения
• не требует длительного процесса реабилитации. Сразу же после процедуры можно вести привычный образ жизни.

Sculptra (Скульптра)

Sculptra — это филлер длительного действия, который подходит для устранения мимических морщин, шрамов, недостатка объёма лицевых тканей. После процедур с использованием Sculptra кожа омолаживается, становится более мягкой и бархатистой. Эффективность процедуры сохраняется до 25 месяцев.

Применяется препарат для корректировки следующих зон: лицо, шея, декольте, живот, бедра, плечи, колени, локти.

Препарат применяется в Европе с 2000 года. Изначально был разработан и предназначался для помощи ВИЧ-инфицированным. С помощью этого средства врачам удавалось восстановить таким пациентам объем тканей лица при липодистрофии.

Sculptra — синтетический препарат, который практически не вызывает отторжения и аллергических реакций, в отличие, от аналогов с ингредиентами животного происхождения. Кислота, которую используют в производстве филлера, изготавливается в лабораторных условиях, в ней не присутствуют ни продукты животного происхождения, ни ДНК человека. Под воздействием собственных ферментов организма полимолочная кислота разрушается и постепенно выводится.

Плюсы: Восполнение объёма происходит естественным путём, за счёт синтезирования волокон коллагена. Пролонгированное действие препарата.

Результат:

Работы врача косметолога Осколковой Л. И:

Пациент 1: 1 процедура контурной пластики препаратом AesthrFill.

Пациент 2: 1-ая процедура контурной пластики препаратом Sculptra, 2-ая процедура препаратом AestheFill.

Работы врача косметолога Чермаковой Н. А:

Пациент 1: 1 процедура контурной пластики препаратом AesthrFill.

В чем разница между IgG и IgM. Что и когда сдавать.

В условиях пандемии COVID-19 личная безопасность и своевременное обращение к медикам играет определяющую роль в вопросе выздоровления и течения болезни. Поэтому даже неспециалистам приходится разбираться в нюансах диагностики и выявление коронавирусной инфекции. Ниже мы разберемся, на чем основывается тестирование на антигены, а также в чем отличия антител к коронавирусу IgG и IgM.

Основные методы выявления болезни

Ключевыми методами диагностики COVID-19 сегодня являются ИФА (иммуноферментный анализ) и ПЦР (полимеразная цепная реакция). Их отличия:

• Суть ПЦР – в выявлении этиологии инфекции. Это высокочувствительный метод, который позволяет поставить точный диагноз даже на ранней стадии течения заболевания, когда его симптомы еще не проявились. Для этого берется мазок с носоглотки или ротоглотки. Делать достоверные прогнозы возможно, определяя концентрацию РНК вируса в материале для исследования. Тем не менее, достичь 100-процентной достоверности сложно;
• ИФА (иммуноферментный анализ) позволяет выявить не сам вирус, а ответную реакцию организма на вторжение инфекционных агентов.

Тестирование на антитела к COVID методом ИФА дает возможность определить болезнь в острой фазе или ее завершение. Подробнее о типах антител ниже.

Расшифровка IgG и IgM

Антитела к SARS CoV-2 IgM вырабатывает иммунная система, если организм поражается коронавирусной инфекцией. Они свидетельствуют о том, что заболевание протекает в острой фазе, и иммунитет ведет активную борьбу против возбудителя. Синтез белка начинается уже на 5-е сутки после первых клинических симптомов коронавируса, а самая высокая концентрация в организме – на 7-10-е сутки со дня появления симптоматики. Поэтому чтобы получить достоверный результат, врачи рекомендуют сдавать ИФА тест на IgM в промежутке между 7-ми и 10-ми сутками. Это позволит подтвердить или опровергнуть диагноз, а в случае инфицирования – обратиться за лечением и предпринять меры для самоизоляции.

Второй типа антител – IgG. Белковые соединения свидетельствуют о наличии иммунитета к коронавирусу, то есть, поздней фазе болезни или о том, что пациент уже перенес ее в прошлом. Выявить антитела IgG в организме сложнее, и появляются они не ранее 10-14 дней с первого дня симптомов. Наиболее информативно проведение тестирования не ранее, чем через 3 недели после начала инфекции: уровень антител с иммунной память в этот период достигает самых высоких значений.

Тестирование на COVID-19 в России возможно в таких вариантах:

• Антитела к SARS-CoV-2 (COVID-19) IgG. Метод ИФА;
• Антитела к SARS-CoV-2 (COVID-19) IgМ. Метод ИФА;
• Антитела к SARS-CoV-2 (COVID-19) IgМ+IgG. Метод ИФА.

Биоматериал берут натощак или не ранее, чем через 4 часа после последнего приема пищи. Нельзя пить чай, кофе в день проведения теста, курить за полчаса до исследования. При температуре 37,1 забор материала не выполняется.

Ботулинотерапия

Центральная городская клиническая больница №23

«Загадочная молекула века» – такой эпитет ботулинический токсин заслужил от мирового неврологического сообщества в 2000 году – ровно за тысячелетнюю историю с начала борьбы с ним, а в последние годы – в связи с эффективным его применением для лечения больных с самыми разными заболеваниями.
Особыми терапевтическими свойствами, выделяется возбудитель ботулизма типа А и именно он стал активно применятся в медицине и косметологии в качестве лечебного и профилактического препарата.

Механизм воздействия токсина на организм заключается в том, что он способен блокировать нервные импульсы к мышцам, что позволяет эффективно применять его при терапии разных заболеваний, проблем с состоянием кожи, чрезмерной потливостью.

В каких случаях возможно применение ботулотоксина:

1. Прекращает насильственные движения — тики, спастическая кривошея, писчий спазм, блефароспазм и др. Эти болезни не опасны для здоровья, но существенно снижают качество жизни. Препарат вводится в мышцы, вовлеченные в насильственные движения, передача импульса прекращается и насильственные движения исчезают.

2. Снимает головные боли — ботулотоксин крайне эффективен в лечении различных головных болей. Препарат широко применяется при лечении дисфункции височно-нижнечелюстного сустава, головных болях напряжения, мигрени и других, более редких видах головной боли. На сегодняшний день эффективность ботулотоксина при головных болях доказана множеством крупных исследований.

3. Восстанавливает двигательную способность — в некоторых случаях введение ботулотоксина — единственный эффективный метод лечения выраженного мышечного тонуса в конечностях (например, после инсульта, травмы, при детском церебральном параличе). Введение ботулотоксина в напряженные мышцы позволяет увеличить объем движений.

4. Устраняет избыточную потливость — еще одним показанием к введению ботулотоксина является гипергидроз. Существует несколько методов лекарственной и нелекарственной терапии этого состояния. Обычно ботулотоксин вводят, когда другие методы оказались неэффективными.

Особенности применения ботулотоксина.

— Инъекции ботулотоксина назначает только врач после установления диагноза.
— Эффект от лечения есть у всех пациентов, однако его выраженность и длительность индивидуальна.
Противопоказания к применению ботулотоксина.
Противопоказания к лечению ботулотоксином, должен знать Ваш лечащий врач. При сборе анамнеза он задаст Вам уточняющие вопросы и определит возможность проведения процедуры.

Терапия ботулотоксином — прекрасный метод лечения,
позволяющий значительно улучшить качество жизни.
Для получения консультации и проведения инъекций ботулотоксина Вы можете обратиться к специалистам Многопрофильного лечебно-консультативного центра «НейроЭксперт» созданного на базе ЦГКБ №23.

Гусев Вадим Венальевич, специалист по ботулинотерапии, кандидат медицинских наук, заведующий неврологическим отделением ЦГКБ №23

Балуева Татьяна Владимировна, специалист по ботулинотерапии, врач-невролог

Десять техник внедрения процессов: технический обзор распространенных и популярных методов внедрения процессов.

Внедрение процессов — широко распространенная техника обхода защиты, часто применяемая в рамках вредоносных программ и бесфайловых злоумышленников, и влечет за собой запуск специального кода в адресном пространстве другого процесса. Внедрение процесса улучшает скрытность, а некоторые методы также обеспечивают постоянство. Несмотря на то, что существует множество техник внедрения процессов, в этом блоге я представляю десять известных методов, которые запускают вредоносный код от имени другого процесса.Я дополнительно предоставляю снимки экрана для многих из этих методов, чтобы облегчить обратный инжиниринг и анализ вредоносных программ, помогая обнаруживать и защищать от этих распространенных методов.

1. КЛАССИЧЕСКОЕ ВНЕДРЕНИЕ DLL ЧЕРЕЗ СОЗДАНИЕ ЭЛЕКТРОННОЙ ПЕРЕДАЧИ И ЗАГРУЗКИ БИБЛИОТЕКИ

Этот метод является одним из наиболее распространенных методов, используемых для внедрения вредоносного ПО в другой процесс. Вредоносная программа записывает путь к своей вредоносной библиотеке динамической компоновки (DLL) в виртуальном адресном пространстве другого процесса и обеспечивает ее загрузку удаленным процессом, создавая удаленный поток в целевом процессе.

Вредоносной программе сначала необходимо атаковать процесс для внедрения (например, svchost.exe). Обычно это выполняется путем поиска в процессах путем вызова трех интерфейсов прикладных программ (API): CreateToolhelp32Snapshot, Process32First и Process32Next. CreateToolhelp32Snapshot — это API, используемый для перечисления состояний кучи или модуля указанного процесса или всех процессов, и он возвращает моментальный снимок. Process32First извлекает информацию о первом процессе в снимке, а затем Process32Next используется в цикле для итерации по ним.После обнаружения целевого процесса вредоносная программа получает дескриптор целевого процесса, вызывая OpenProcess.

Как показано на рисунке 1, вредоносная программа вызывает VirtualAllocEx, чтобы получить место для записи пути к своей DLL. Затем вредоносная программа вызывает WriteProcessMemory для записи пути в выделенной памяти. Наконец, чтобы выполнить код в другом процессе, вредоносная программа вызывает API, такие как CreateRemoteThread, NtCreateThreadEx или RtlCreateUserThread. Последние два не документированы. Однако общая идея состоит в том, чтобы передать адрес LoadLibrary одному из этих API, чтобы удаленный процесс выполнял DLL от имени вредоносной программы.

CreateRemoteThread отслеживается и помечается многими продуктами безопасности. Кроме того, требуется наличие вредоносной библиотеки DLL на диске, которую можно было бы обнаружить. Учитывая, что злоумышленники чаще всего вводят код для обхода защиты, опытные злоумышленники, вероятно, не будут использовать этот подход. На снимке экрана ниже показано вредоносное ПО под названием Rebhip, выполняющее эту технику.

Рисунок 1: Червь Rebhip, выполняющий типичное внедрение DLL
Sha256: 07b8f25e7b536f5b6f686c12d04edc37e11347c8acd5c53f98a174723078c365

2.ПОРТАТИВНОЕ ИСПОЛНИТЕЛЬНОЕ ВНЕДРЕНИЕ (PE INJECTION)

Вместо передачи адреса LoadLibrary вредоносная программа может скопировать свой вредоносный код в существующий открытый процесс и вызвать его выполнение (либо с помощью небольшого шеллкода, либо путем вызова CreateRemoteThread). Одно из преимуществ PE-инъекции по сравнению с методом LoadLibrary состоит в том, что вредоносной программе не нужно размещать вредоносную DLL на диске. Подобно первому способу, вредоносная программа выделяет память в хост-процессе (например, VirtualAllocEx) и вместо записи «пути к DLL» записывает свой вредоносный код, вызывая WriteProcessMemory.Однако препятствием для этого подхода является изменение базового адреса скопированного изображения. Когда вредоносная программа внедряет свой PE в другой процесс, у него будет новый базовый адрес, который непредсказуем, что потребует от него динамического пересчета фиксированных адресов своего PE. Чтобы преодолеть это, вредоносная программа должна найти адрес своей таблицы перемещения в хост-процессе и разрешить абсолютные адреса скопированного изображения, перебирая его дескрипторы перемещения.

Этот метод аналогичен другим методам, таким как рефлексивная инъекция DLL и модуль памяти, поскольку они не сбрасывают файлы на диск.Однако подходы к внедрению модулей памяти и рефлексивных DLL еще более незаметны. Они не полагаются на какие-либо дополнительные API Windows (например, CreateRemoteThread или LoadLibrary), потому что они загружаются и выполняются в памяти. Отражательная инъекция DLL работает путем создания библиотеки DLL, которая отображает себя в памяти при выполнении, вместо того, чтобы полагаться на загрузчик Windows. Модуль памяти аналогичен рефлексивному внедрению DLL, за исключением того, что инжектор или загрузчик отвечает за отображение целевой DLL в память, а не за отображение самой DLL.В предыдущем сообщении блога эти два подхода к работе с памятью подробно обсуждались.

При анализе внедрения PE очень часто можно увидеть циклы (обычно два цикла «for», один вложенный в другой) перед вызовом CreateRemoteThread. Этот метод довольно популярен среди криптовалют (программного обеспечения, шифрующего и скрывающего вредоносные программы). На рисунке 2 показан пример модульного теста, в котором используется преимущество этого метода. В коде есть два вложенных цикла для настройки своей таблицы перемещения, которую можно увидеть перед вызовами WriteProcessMemory и CreateRemoteThread.Команда «and 0x0fff» также является еще одним хорошим индикатором, показывающим, что первые 12 битов используются для получения смещения в виртуальном адресе содержащего блока перемещения. Теперь, когда вредоносная программа пересчитала все необходимые адреса, все, что ей нужно сделать, это передать свой начальный адрес CreateRemoteThread и запустить его.

Рисунок 2: Пример структуры циклов для PE-инъекции до вызовов CreateRemoteThread
Sha256: ce8d75

db2e51372a4a04d6a0927a65b2640739f9ec01cfd6c143b1110da

3.ВЫПОЛНЕНИЕ ПРОЦЕССА (также известное как ЗАМЕНА ПРОЦЕССА И ЗАПУСК)

Вместо внедрения кода в хост-программу (например, внедрение DLL) вредоносное ПО может выполнять метод, известный как «пустотелое». Загрязнение процесса происходит, когда вредоносная программа извлекает (удаляет) допустимый код из памяти целевого процесса и перезаписывает пространство памяти целевого процесса (например, svchost.exe) вредоносным исполняемым файлом.

Вредоносная программа сначала создает новый процесс для размещения вредоносного кода в приостановленном режиме.Как показано на рисунке 3, это делается путем вызова CreateProcess и установки флага создания процесса на CREATE_SUSPENDED (0x00000004). Основной поток нового процесса создается в приостановленном состоянии и не запускается, пока не будет вызвана функция ResumeThread. Затем вредоносной программе необходимо заменить содержимое легитимного файла вредоносной полезной нагрузкой. Это делается путем отмены отображения памяти целевого процесса путем вызова ZwUnmapViewOfSection или NtUnmapViewOfSection. Эти два API в основном освобождают всю память, на которую указывает раздел.Теперь, когда память не отображена, загрузчик выполняет VirtualAllocEx, чтобы выделить новую память для вредоносного ПО, и использует WriteProcessMemory для записи каждого раздела вредоносного ПО в пространство целевого процесса. Вредоносная программа вызывает SetThreadContext, чтобы указать точку входа на новый участок кода, который она написала. В конце вредоносная программа возобновляет приостановленный поток, вызывая ResumeThread, чтобы вывести процесс из приостановленного состояния.

Рисунок 3: Ransom.Cryak, выполняющий выдолбление
Sha256: eae72d803bf67df22526f50fc7ab84d838efb2865c27aef1a61592b1c520d144

4.ЗАЩИТА НИТИ (АНАЛИТИЧЕСКАЯ ПРИОСТАНОВКА, ВПРЫСКАНИЕ И ВОЗОБНОВЛЕНИЕ (SIR))

Этот метод имеет некоторые сходства с ранее обсуждавшейся техникой проделывания процесса. При перехвате выполнения потока вредоносная программа нацеливается на существующий поток процесса и избегает зашумленных операций процесса или создания потоков. Поэтому во время анализа вы, вероятно, увидите вызовы CreateToolhelp32Snapshot и Thread32First, за которыми следует OpenThread.

После получения дескриптора целевого потока вредоносная программа переводит поток в приостановленный режим, вызывая SuspendThread для выполнения инъекции.Вредоносная программа вызывает VirtualAllocEx и WriteProcessMemory для выделения памяти и выполнения внедрения кода. Код может содержать шелл-код, путь к вредоносной DLL и адрес LoadLibrary.

На рис. 4 показан типовой троян, использующий эту технику. Чтобы перехватить выполнение потока, вредоносная программа изменяет регистр EIP (регистр, содержащий адрес следующей инструкции) целевого потока, вызывая SetThreadContext. После этого вредоносная программа возобновляет поток для выполнения шелл-кода, записанного в хост-процесс.С точки зрения злоумышленника, подход SIR может быть проблематичным, потому что приостановка и возобновление потока в середине системного вызова может вызвать сбой системы. Чтобы избежать этого, более сложная вредоносная программа возобновит работу и попытается повторить попытку позже, если регистр EIP находится в диапазоне NTDLL.dll.

Рисунок 4: Общий троян выполняет захват выполнения потока
Sha256: 787cbc8a6d1bc58ea169e51e1ad029a637f22560660cc129ab8a099a745bd50e

5.HOOK INJECTION ЧЕРЕЗ SETWINDOWSHOOKEX

Перехват — это метод, используемый для перехвата вызовов функций. Вредоносное ПО может использовать функцию перехвата для загрузки своей вредоносной библиотеки DLL при запуске события в определенном потоке. Обычно это делается путем вызова SetWindowsHookEx для установки подпрограммы ловушки в цепочку ловушек. Функция SetWindowsHookEx принимает четыре аргумента. Первый аргумент — это тип события. События отражают диапазон типов ловушек и варьируются от нажатия клавиш на клавиатуре (WH_KEYBOARD) до ввода в мышь (WH_MOUSE), CBT и т. Д.Второй аргумент — это указатель на функцию, которую вредоносная программа хочет вызвать при выполнении события. Третий аргумент — это модуль, содержащий функцию. Таким образом, очень часто можно увидеть вызовы LoadLibrary и GetProcAddress перед вызовом SetWindowsHookEx. Последний аргумент этой функции — поток, с которым должна быть связана подключаемая процедура. Если это значение установлено равным нулю, все потоки выполняют действие при срабатывании события. Однако вредоносное ПО обычно нацелено на один поток для уменьшения шума, поэтому также можно увидеть вызовы CreateToolhelp32Snapshot и Thread32Next перед SetWindowsHookEx для поиска и нацеливания на один поток.После внедрения DLL вредоносная программа выполняет свой вредоносный код от имени процесса, идентификатор потока которого был передан функции SetWindowsHookEx. На рисунке 5 эта техника реализована в Locky Ransomware.

Рисунок 5: Locky Ransomware, использующее внедрение крючка
Sha256: 5d6ddb8458ee5ab99f3e7d9a21490ff4e5bc9808e18b9e20b6dc2c5b27927ba1

6. ВНЕДРЕНИЕ И УСТОЙЧИВОСТЬ ЧЕРЕЗ МОДИФИКАЦИЮ РЕЕСТРА (например, APPINIT_DLLS, APPCERTDLLS, IFEO)

Appinit_DLL, AppCertDlls и IFEO (параметры выполнения файла изображения) — все ключи реестра, которые используются вредоносными программами для сохранения.Записи расположены в следующих местах:

HKLM \ Software \ Microsoft \ Windows NT \ CurrentVersion \ Windows \ Appinit_Dlls HKLM \ Software \ Wow6432Node \ Microsoft \ Windows NT \ CurrentVersion \ Windows \ Appinit_Dlls HKLM \ System \ CurrentControlSet \ Control \ Session Manager \ AppCertDlls HKLM \ Software Параметры выполнения файла Windows NT \ currentversion \ image

AppInit_DLLs

Вредоносные программы могут вставить расположение своей вредоносной библиотеки в раздел реестра Appinit_Dlls, чтобы другой процесс загрузил их библиотеку.Каждая библиотека в этом разделе реестра загружается в каждый процесс, загружающий User32.dll. User32.dll — очень распространенная библиотека, используемая для хранения графических элементов, таких как диалоговые окна. Таким образом, когда вредоносная программа изменяет этот подраздел, большинство процессов загружают вредоносную библиотеку. На рисунке 6 показан троян Ginwui, использующий этот подход для внедрения и сохранения. Он просто открывает раздел реестра Appinit_Dlls, вызывая RegCreateKeyEx, и изменяет его значения, вызывая RegSetValueEx.

Рисунок 6: Ginwui изменяет ключ реестра AppIniti_DLLs
Sha256: 9f10ec2786a10971eddc919a5e87a927c652e1655ddbbae72d376856d30fa27c

AppCertDlls

Этот подход очень похож на подход AppInit_DLLs, за исключением того, что библиотеки DLL в этом разделе реестра загружаются в каждый процесс, который вызывает функции Win32 API CreateProcess, CreateProcessAsUser, CreateProcessWithLogonW, CreateProcessWithTokenW и WinExec.

Параметры выполнения файла изображения (IFEO)

IFEO обычно используется для целей отладки.Разработчики могут установить «Значение отладчика» в этом разделе реестра, чтобы прикрепить программу к другому исполняемому файлу для отладки. Следовательно, всякий раз, когда запускается исполняемый файл, будет запускаться присоединенная к нему программа. Чтобы использовать эту функцию, вы можете просто указать путь к отладчику и прикрепить его к исполняемому файлу, который вы хотите проанализировать. Вредоносное ПО может изменить этот раздел реестра, чтобы внедрить себя в целевой исполняемый файл. На рисунке 7 троян Diztakun реализует эту технику, изменяя значение отладчика диспетчера задач.

Рисунок 7: Троян Diztakun, изменяющий ключ реестра IFEO
Sha256: f0089056fc6a314713077273c5910f878813fa750f801dfca4ae7e9d7578a148

7. ВНЕДРЕНИЕ APC И АТОМБОМБИРОВАНИЕ

Вредоносное ПО может воспользоваться преимуществами асинхронных вызовов процедур (APC), чтобы заставить другой поток выполнить свой собственный код, прикрепив его к очереди APC целевого потока. У каждого потока есть очередь APC, которые ожидают выполнения после того, как целевой поток перейдет в изменяемое состояние.Поток переходит в состояние предупреждения, если он вызывает функции SleepEx, SignalObjectAndWait, MsgWaitForMultipleObjectsEx, WaitForMultipleObjectsEx или WaitForSingleObjectEx. Вредоносная программа обычно ищет любой поток, который находится в изменяемом состоянии, а затем вызывает OpenThread и QueueUserAPC, чтобы поставить APC в очередь для потока. QueueUserAPC принимает три аргумента: 1) дескриптор целевого потока; 2) указатель на функцию, которую вредоносная программа хочет запустить; 3) и параметр, который передается в указатель функции.На рисунке 8 вредоносная программа Amanahe сначала вызывает OpenThread для получения дескриптора другого потока, а затем вызывает QueueUserAPC с LoadLibraryA в качестве указателя на функцию, чтобы внедрить свою вредоносную DLL в другой поток.

Атомная бомбардировка — это метод, который был впервые представлен исследованием enSilo, а затем использован в Dridex V4. Как мы подробно обсуждали в предыдущем посте, этот метод также основан на инъекции APC. Однако он использует таблицы атомов для записи в память другого процесса.

Рисунок 8: Almanahe выполняет впрыск APC
Sha256: f74399cc0be275376dad23151e3d0c2e2a1c966e6db6a695a05ec1a30551c0ad

8.ВНЕДРЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ПАМЯТИ ОКНА (EWMI) ЧЕРЕЗ SETWINDOWLONG

EWMI полагается на внедрение в дополнительную память окна панели задач проводника и несколько раз использовалось среди вредоносных программ, таких как Gapz и PowerLoader. При регистрации класса окна приложение может указать количество дополнительных байтов памяти, называемых дополнительной памятью окна (EWM). Однако в EWM не так много места. Чтобы обойти это ограничение, вредоносная программа записывает код в общий раздел explorer.exe и использует SetWindowLong и SendNotifyMessage, чтобы указатель функции указывал на шелл-код, а затем выполнял его.

У вредоносной программы есть два варианта записи в общий раздел. Он может либо создать общий раздел и сопоставить его как с собой, так и с другим процессом (например, explorer.exe), либо просто открыть уже существующий общий раздел. У первого есть накладные расходы на выделение пространства кучи и вызов NTMapViewOfSection в дополнение к нескольким другим вызовам API, поэтому второй подход используется чаще. После того, как вредоносная программа записывает свой шелл-код в общий раздел, она использует GetWindowLong и SetWindowLong для доступа и изменения дополнительной оконной памяти Shell_TrayWnd.GetWindowLong — это API, используемый для извлечения 32-битного значения с указанным смещением в дополнительную память окна объекта класса окна, а SetWindowLong используется для изменения значений с указанным смещением. Таким образом вредоносная программа может просто изменить смещение указателя функции в классе окна и указать его на шеллкод, записанный в разделяемую секцию.

Как и большинство других методов, упомянутых выше, вредоносная программа должна запускать написанный ею код. В ранее описанных методах вредоносное ПО достигало этого, вызывая API, такие как CreateRemoteThread, QueueUserAPC или SetThreadContext.При таком подходе вредоносная программа вместо этого запускает внедренный код, вызывая SendNotifyMessage. После выполнения SendNotifyMessage Shell_TrayWnd получает и передает управление по адресу, на который указывает значение, ранее установленное SetWindowLong. На рисунке 9 вредоносная программа с именем PowerLoader использует эту технику.

Рисунок 9: PowerLoader, внедряющий в дополнительную память окна лотка оболочки
Sha256: 5e56a3c4d4c304ee6278df0b32afb62bd0dd01e2a9894ad007f4cc5f873ab5cf

9.ИНЪЕКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОКЛАДКИ

Microsoft предоставляет разработчикам прокладки в основном для обратной совместимости. Оболочки позволяют разработчикам применять исправления к своим программам без необходимости переписывать код. Используя прокладки, разработчики могут указать операционной системе, как работать с их приложением. По сути, прокладки — это способ подключения к API и нацеливания на определенные исполняемые файлы. Вредоносное ПО может использовать прокладки для нацеливания на исполняемый файл как для сохранения, так и для внедрения. Windows запускает Shim Engine, когда загружает двоичный файл, чтобы проверить наличие совместимости с базами данных, чтобы применить соответствующие исправления.

Есть много исправлений, которые можно применить, но самыми любимыми вредоносными программами являются те, которые в некоторой степени связаны с безопасностью (например, DisableNX, DisableSEH, InjectDLL и т. Д.). Чтобы установить базу данных shimming, вредоносное ПО может использовать различные подходы. Например, один из распространенных подходов — просто запустить sdbinst.exe и указать его на вредоносный файл sdb. На рисунке 10 рекламное ПО «Search Protect by Conduit» использует прокладку для сохранения и внедрения. Он выполняет прокладку «InjectDLL» в Google Chrome для загрузки vc32loader.dll. Существует несколько инструментов для анализа файлов sdb, но для анализа файлов sdb, перечисленных ниже, я использовал python-sdb.

Рисунок 10: SDB, используемый Search Protect для инъекций
Sha256: 6d5048baf2c3bba85adc9ac5ffd96b21c9a27d76003c4aa657157978d7437a20

10. Перехват IAT и встроенный перехват (также известные как USERLAND ROOTKITS)

Перехват IAT и встроенный перехват обычно известны как руткиты пользовательского уровня. Перехват IAT — это метод, который вредоносное ПО использует для изменения таблицы адресов импорта.Когда легитимное приложение вызывает API, расположенный в DLL, замененная функция выполняется вместо исходной. Напротив, при встроенном подключении вредоносная программа изменяет саму функцию API. На рисунке 11 вредоносная программа FinFisher выполняет перехват IAT, изменяя точку CreateWindowEx.

Рисунок 11: FinFisher выполняет перехват IAT, изменяя точку CreateWindowEx на
Sha256: f827c92fbe832db3f09f47fe0dcaafd89b40c7064aba1f418f2d1e75e8e

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этом посте я рассмотрел десять различных методов, которые вредоносное ПО использует для сокрытия своей активности в другом процессе.Как правило, вредоносная программа либо напрямую внедряет свой шелл-код в другой процесс, либо заставляет другой процесс загрузить свою вредоносную библиотеку. В Таблице 1 я классифицировал различные методы и предоставил образцы, которые могут служить ориентиром для наблюдения за каждой техникой инъекции, описанной в этом посте. Цифры, приведенные в сообщении, помогут исследователю распознать различные методы устранения вредоносных программ.

Таблица 1: Внедрение процесса может быть выполнено путем непосредственного внедрения кода в другой процесс или путем принудительной загрузки библиотеки DLL в другой процесс.

Злоумышленники и исследователи регулярно открывают новые методы внедрения и скрытности.В этом посте подробно описаны десять распространенных и новых техник, но есть и другие, например, угон COM. Защитники никогда не завершат свою миссию по обнаружению и предотвращению скрытого внедрения процессов, потому что злоумышленники никогда не перестанут вводить новшества.

В Endgame мы постоянно исследуем передовые методы скрытности и внедряем средства защиты в наш продукт. Мы накладываем на уровни возможности, которые обнаруживают вредоносные библиотеки DLL, которые загружаются с некоторой персистентностью (например, AppInit DLL, COM Hijacks и т. Д.), Предотвращают многие формы внедрения кода в режиме реального времени с помощью нашей запатентованной защиты от инъекций шелл-кода и обнаруживают вредоносные внедренные полезные нагрузки, работающие в доставленной памяти. с помощью любого из вышеперечисленных методов с помощью наших методов обнаружения бесфайловых атак, на которые подана заявка на патент.Такой подход позволяет нашей платформе быть более эффективной, чем любой другой продукт на рынке, в защите от внедрения кода, а также максимизировать отказоустойчивость от обхода благодаря новым методам внедрения кода.

Метод закачки газа — обзор

2.4 Закачка газа в металлический расплав

Для метода вспенивания из расплава необходим точный контроль диапазона температуры вспенивания и времени обработки, в то время как метод закачки газа, представленный в этом разделе, проще в реализации и также имеет невысокую стоимость [8,33].Металлические пены, используемые для нагнетания газа, имеют широкий диапазон размеров пор и очень высокую пористость (до> 90%). Газ извне вводится в нижнюю часть расплавленного металла, в результате чего образуются пузырьки, и используемые газы могут быть воздухом, паром, кислородом, CO ₂ и инертным газом. Ключевыми техническими моментами этой процедуры являются правильная вязкость расплава и широкий диапазон температур для вспенивания. Образующиеся пены должны быть стабильными и не должны ломаться во время процесса [8]. Смесь, состоящая из металла и твердых частиц стабилизатора, нагревается до температуры, превышающей температуру ликвидуса металла, а затем вводится газ для создания пузырьков с закрытыми ячейками.После охлаждения до температуры ниже солидуса получается металлическая пена с большим количеством закрытых ячеек [33]. Стабилизирующие материалы могут быть оксидом алюминия, Ti, ZrO ₂ , SiC и нитридом кремния, а металлические газы, которые можно вводить, — это Al, сталь, Zn, Pb, Ni, Mg, Cu и их сплавы. Размер частиц и объемное соотношение стабилизирующих материалов следует тщательно выбирать. Небольшой размер частиц вызывает проблему смешивания, а высокий объемный коэффициент приводит к низкой стабильности пены, в то время как низкий объемный коэффициент приводит к избыточной вязкости.Размер пор можно регулировать с помощью расхода газа.

Метод закачки газа для вспенивания алюминия и алюминиевых сплавов был разработан в HYDRO в Норвегии и Cymat Technologies в Торонто, Канада [5]. SiC, Al ₂ O ₃ и частицы MgO используются для повышения вязкости расплава, как показано на рисунке 2.14. На первом этапе должен быть приготовлен расплав Al, например литой AlSi10Mg (A359) или прецизионные литые сплавы 1060, 3003, 6016, 6061 с этими частицами, и смачивание расплава до частиц и равномерное распределение частиц должны быть решены.Второй этап — это нагнетание газа в расплав через специально сконструированный вращающийся пропеллер или вибрирующее сопло, которое создает пену. Функция пропеллера или сопла заключается в создании более мелких, равномерно распределенных пузырьков в расплаве. Благодаря наличию этих более мелких пузырьков образуется высококачественная пена. Во время стекания расплава густая смесь пузырьков и расплава будет плавать над расплавом, а затем превратиться в жидкую металлическую пену. Из-за наличия керамических частиц этот вид жидкой металлической пены является довольно стабильной и может вытягиваться из жидкости, охлаждаться и затвердевать.Перед тем, как произойдет полное затвердевание, полутвердую пену можно расплющить роликами или лентой. В принципе, длина ленты из пеноматериала может быть сколь угодно большой, однако ширина зависит от допустимой ширины контейнера для жидкого металла с нормальной толщиной около 10 см. На рис. 2.15 показаны два изделия из металлической пены.

Рисунок 2.14. Схематическое изображение изготовления металлической пены путем нагнетания газа: (а) режим 1 [5]; (б) режим 2 [34].

Рисунок 2.15. Металлическая пена, полученная путем нагнетания газа: (а) две вспененные пластины с разной плотностью и размером пор [5]; (б) колонна из вспененного алюминия [34].

Объемная доля частиц составляет около 10–20%, средний размер 5–20 мкм [5,33]. Размер и содержание частиц выбираются на основе прошлого опыта. Частицы на стенке поры играют ключевую роль в процессе стабилизации. Сначала частицы увеличивают поверхностную вязкость, а затем задерживают выхлоп. Во-вторых, частицы частично смачиваются расплавом, и контактный угол должен находиться в заданном диапазоне, чтобы гарантировать стабильность границы раздела пузырь / частица и снижение энергии частиц на границе раздела по сравнению с общей энергией пузырька и частиц.Очень хорошее (с гораздо меньшим углом контакта) или плохое (с большим углом контакта) смачивание не обеспечивает эффективной стабилизации.

Пена Al, полученная таким способом, имеет пористость 80–98%, плотность 0,069–0,54 г / см ³ со средним размером пор 3–25 мм и толщиной стенки 50–85 мкм [ 5]. Средний размер пор имеет обратную зависимость от толщины и плотности стенки, и на него влияют поток газа, скорость пропеллера, частота вибрации и другие параметры [5,35].Плотность, размер пор и градиенты расширения пор присутствуют во вспененной панели, что является результатом вытяжки под действием силы тяжести [35]. Кроме того, сдвигающее усилие конвейерной ленты вызывает диагональные искаженные поры в конечном продукте и оказывает заметное влияние на его механические свойства. Этот эффект можно улучшить за счет вертикального нанесения пены.

Достоинствами этого метода являются возможность крупносерийного производства вспененных материалов, а также низкая плотность.Следовательно, композитные пенопласты на основе металлов дешевле, чем пористые металлы. Однако одним из недостатков является наличие открытых пор после окончательного разрезания пены. Кроме того, присутствие частиц для армирования приведет к тому, что композитные пенопласты на основе металлов станут хрупкими, что является неожиданным побочным эффектом процесса вспенивания.

Этот процесс также можно проводить в условиях невесомости [20]. Проблемы всплытия пузырьков и повышенной вязкости, необходимость во вспенивающих агентах не могут возникнуть в условиях невесомости.Пена может быть получена путем введения аргона в жидкий металл.

Пенопласт может иметь одну из двух форм: сфера или многогранник [36]. Полиэдрические поры обычно образуются в процессе закачки газа, в то время как сферические поры образуются на ранней стадии газообразования в расплаве, а смесь сфер и многогранников представлена ​​на поздней стадии. Отношение сфер к многогранникам связано со временем вспенивания. Сферические поры в некоторых условиях могут переходить в многогранные.Чтобы получить металлическую пену с высокой пористостью, ключевыми параметрами обработки в дополнение к размеру и дисперсии пенообразователя являются состав, время охлаждения и скорость охлаждения. Эффект стенки контейнера влияет на стабильность многогранной пены, в то время как он не влияет на стабильность сферической пены. Эффект стенки на образование и стабильность многогранных пен отражает скорость образования диспергированных пузырьков и свободную поверхность, образующуюся при разрыве пены.Скорость разрушения пузырьков в слое пены зависит от свободной поверхности и высоты слоя пены, поскольку скорость стекания изолированных пузырьков зависит от высоты слоев пены.

Электрогидродинамический метод впрыска капель в модельную нефть: AIP Advances: Vol 9, № 10

Для впрыска капель воды сначала следует определить относительную высоту мениска. На рис. 6 высота мениска равна h, а его радиус равен R _cap . Тогда относительная высота мениска определяется как H = h / R _cap , что и используется в дальнейшем.

A. Требуется новая форма импульса

Ранее использовавшийся многоступенчатый импульс (MSP) называется MSP6, и он использовался в (Raisin, Atten, and Reboud 201321. Raisin, J., Atten, P., and Reboud, J .-Л., «Новая техника срабатывания для инжекции по требованию беззарядных проводящих капель в вязкую диэлектрическую жидкость», Experiments in Fluids 54 (3), 1473 (2013). Https: // doi. org / 10.1007 / s00348-013-1473-у). Сообщалось, что MSP6 была лучшей формой MSP для закачки одиночных капель воды, потому что она давала самое широкое распределение капель по размеру.Этот MSP6 имеет форму двух плато с длительностью 1750 мкс, и закачка капли воды выполнялась в полибутеновом масле. Во-первых, мы используем этот MSP6 для впрыскивания капель воды в Marcol52. В отличие от ожидаемого, впрыскивание капель не приносит успеха, потому что отсутствуют капли диаметром от микрон до сотен микрон. Эти недостающие диаметры связаны с тем, что в конце процесса впрыска капли не прекращается сужение воды. Следовательно, для успешного однокапельного впрыска необходимо определить новую форму MSP.

Основное различие между полибутеновым маслом и Marcol52 заключается в межфазном натяжении вода-масло. Для полибутена межфазное натяжение σ _{полибутена} = 21 мН / м, а для Marcol52 σ _Marcol52 = 36 мН / м. Это более высокое значение межфазного натяжения в Marcol52 означает, что более сильная электрическая сила необходима для деформации водяного мениска и извлечения капли. Таким образом, мы нашли новую форму импульса под названием MSP с длительностью 1490 мкс.

На рис. 7 MSP имеет длительность 1490 мкс, что хорошо соответствует расчетному капиллярному времени и вязкому времени.MSP короче MSP6 по длительности импульса, а отношение t _MSP / t _MSP6 ≈ 0,85. Для первой впрыснутой капли напряжение, используемое в полибутеновом масле, составляет 3000 В для капель диаметром 30 мкм (Raisin 201120. Raisin, J., «Электрокоалесценция в эмульсиях вода-в-масле: к критерию эффективности», апрель 2011 г.) , в то время как напряжение, используемое в Marcol52, составляет 3650 В для капель диаметром 19,5 мкм, как показано на рис. 8. На рис. 8 показано введение одиночных капель в Marcol 52 с помощью MSP. Он представляет собой две серии капельных инъекций.Серия «Инжекция 1» — это инжекция падения напряжения с шагом 100 В, а «Инжекция 2» — инжекция падения с шагом 50 В. Можно видеть, что впрыскивание капель с использованием MSP может иметь большое распределение размеров капель (от 19,5 мкм до 360 мкм) без каких-либо недостающих диаметров капель внутри серии впрысков. Это означает, что используемый MSP может обеспечить стабильную серию капельного впрыска. Диаметр капель отображается с помощью ImageJ, а вертикальные неопределенности добавляются к двум рядам в виде столбцов ошибок. Они не больше размера точек отметки.Кроме того, наблюдение за процессом впрыска капель позволяет выявить проблемы производства спутников, которые возникают во многих процессах впрыска капель, таких как (Dong, Carr, and Morris 20066. Dong, H., Carr, WW, and Morris, JF, «Экспериментальное исследование капель- формирование капель по запросу, Physics of Fluids 18 (7), 072102 (2006). https://doi.org/10.1063/1.2217929) (AU Chen and Basaran 20012. Chen, AU и Basaran, OA, » Новый метод значительного уменьшения радиуса капли без уменьшения радиуса сопла при производстве капель по запросу, Physics of Fluids 14 (1), L1 – L4 (2001).https://doi.org/10.1063/1.1427441) (Raisin, Atten, and Reboud 201321. Raisin, J., Atten, P., and Reboud, J.-L., «Новая техника срабатывания для устройств по требованию инжекция беззарядных проводящих капель в вязкую диэлектрическую жидкость », Experiments in Fluids 54 (3), 1473 (2013). https://doi.org/10.1007/s00348-013-1473-y) устранены принятие нового MSP. Это является преимуществом для метода впрыска капель, поскольку наличие спутников вокруг основных капель в экспериментах по электрокоалесценции изменяет окружающие электрические поля и влияет на результаты слияния капель.

B. Метод нахождения правильной формы MSP для данных жидкостей

Методика поиска подходящего MSP для капельного впрыска в данные жидкости не описана ни в каких документах. Эксперименты очень деликатны, и бывают случаи, когда в одних и тех же экспериментальных условиях в течение 5 минут две последовательные инъекции капель могут дать два разных результата: один с введенной каплей, а другой — нет. Из-за этой высокой нестабильности невозможно дать фиксированное пороговое значение на основе одного успешного впрыска капли и обобщить его для всех случаев.Например, углы форм менисков при их динамических деформациях не одинаковы от случая к случаю, так же как и время отсечки сужения жидкости. Таким образом, опыт капельной инъекции извлекается из количества успешных инъекций. Ниже представлена ​​динамика водяного мениска во время впрыска капель, в сочетании с важными моментами, которые нужно обрабатывать шаг за шагом, как основное правило для поиска хорошего MSP для данной жидкости.

Во-первых, чтобы найти подходящее MSP для данной жидкости, необходимо определить продолжительность MSP.Ссылаясь на таблицу II, для низкого числа Oh, как у Marcol52 и полибутенового масла, продолжительность MSP находится между теоретически рассчитанным капиллярным временем и временем вязкости. В этих условиях для более высокого межфазного натяжения продолжительность MSP приближается к пределу времени для капилляров. Для большого числа Oh, такого как Primol352, продолжительность MSP должна быть увеличена намного дольше, за пределами диапазона, определяемого капиллярным временем и вязкостным временем.

ТАБЛИЦА II. Полученные параметры, с цоколем R = 0.42 мм для Marcol52 и 0,23 мм для Primol 352 во время экспериментов.

Во-вторых, для хорошего впрыска капель первое плато MSP всегда должно деформироваться, как показано на Рис. как можно больше форма мениска без нарушения предела струи, как показано на рис. 9, от 0 до 600 мкс (первое плато MSP начинается со 142 мкс и заканчивается на 497 мкс). Это помогает передать максимальную кинетическую энергию водяному мениску для следующих деформаций.

В-третьих, впадины формы MSP позволяют мениску сокращать свою форму. Когда самая большая кривизна вне оси убрана, второе плато (начинается на 1017 мкс и заканчивается на 1230 мкс) направлено на перетаскивание головки мениска по оси.

Далее, продолжительное волочение головки мениска из-за второго плато всегда приводит к длинной шейке, которая формирует большие сателлиты после введения основной капли. Таким образом образуется короткая впадина, которая помогает уменьшить эту тяговую силу. Для поддержания эффективности импульса MSP добавляется третье плато, которое начинается на 1348 мкс и заканчивается на 1466 мкс.Это нацелено на более слабое сопротивление головке мениска, чтобы способствовать извлечению капель, не вызывая удлинения шейки.

В-пятых, после окончания импульса при 1490 мкс капля воды отделилась под действием силы инерции.

Следует отметить, что плато MSP не ограничивается двумя или тремя плато, оно может быть добавлено в соответствии с потребностями экспериментов. Конструкция MSP достаточно гибкая. В этом эксперименте третье плато MSP помогает уменьшить силу сопротивления, оказываемую вторым плато, и поддерживать эффективность импульса MSP.Таким образом устраняются сателлиты, обычно рассматриваемые как второй эффект впрыска капель.

Влияние техники инъекции, лекарственной формы и микросреды опухоли на доставку и эффективность внутриопухолевой иммунотерапии

Предпосылки

Системная иммунотерапия представляет собой сдвиг парадигмы в лечении рака. Однако у большинства пациентов не наблюдается стойкого ответа на системные методы лечения, такие как ингибиторы иммунных контрольных точек.1 Исследования паттернов устойчивости к иммунотерапии выявили множественные механизмы, включая дисфункцию Т-клеток, тактику уклонения опухолевых клеток от иммунитета и иммуносупрессивные клетки в иммунном микроокружении опухоли.2 Хотя некоторые из этих барьеров можно преодолеть с помощью комбинированной системной терапии, такой как двойное ингибирование контрольной точки, токсичность, связанная с такими схемами с несколькими лекарствами, может быть значительной.3

Внутриопухолевая доставка иммунотерапевтических средств представляет собой убедительное решение для непосредственного устранения местных препятствий для иммунитета к опухоли. Прямая доставка в целевые опухолевые поражения дает несколько преимуществ по сравнению с системной доставкой, включая повышенные локальные концентрации и потенциально сниженную системную токсичность.Более того, для пациентов с поликлональными метастазами возможность инъекции в несколько сайтов потенциально может привести к более устойчивому адаптивному иммунному ответу.

В настоящее время проходят клинические испытания бесчисленное множество внутриопухолевых иммунотерапевтических препаратов. По нашему клиническому опыту, мы пришли к выводу, что внутриопухолевые процедуры иммунотерапии с визуальным контролем в целом безопасны.4 Однако мы также обнаружили, что введение иглы с визуализацией в целевое поражение часто бывает простым, гарантируя, что введенная терапия распределяется по всему участку. целевого поражения без проникновения в окружающие ткани нет.Существенные различия в точности нанесения лекарственного средства могут происходить в пределах одной и той же гистологии рака, одного и того же органа и даже одного и того же пациента. Эти недостатки в доставке лекарственного средства могут привести к неэффективной иммунной активации в поражении-мишени из-за недостаточного отложения на мишени, и они могут привести к повреждению органов и системной иммунной токсичности из-за утечки за пределы цели. В самом деле, вполне вероятно, что отсутствие клинического ответа в клиническом исследовании внутриопухолевой иммунотерапии может быть отражением неэффективности лекарственного средства, а не доставки.4

Таким образом, есть существенные последствия для определения клинически переводимых методов для оптимизации доставки и эффективности внутриопухолевой иммунотерапии. Основываясь на наших клинических наблюдениях, мы приняли эвристическую модель внутриопухолевой доставки лекарств, в которой выделяются три важные переменные: техника инъекции, состав лекарственного средства и микросреда опухоли (рис. 1). Цель этого исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать влияние изменений каждой переменной на внутриопухолевую доставку лекарств и эффективность иммунотерапии.

Рисунок 1

Переменные, влияющие на внутриопухолевую иммунотерапию. Основываясь на наших клинических наблюдениях, мы создали эвристическую модель факторов, влияющих на внутриопухолевую иммунотерапию, включающую эти три переменных. Для каждой переменной мы перечислили возможные модификации, которые могут привести к улучшению доставки и эффективности внутриопухолевой иммунотерапии.

Методы

Животные модели

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию онкологического центра им. М. Д. Андерсона Техасского университета.Использовали сингенные модели крыс и мышей; Первая модель позволила оценить внутриопухолевые инъекции в опухоли клинически значимых размеров, а последние модели позволили изучить влияние стромы опухоли на эффективность инъекции. Для модели на крысах животные были приобретены из колонии крыс-буйволов, содержащейся в Онкологическом центре им. М. Д. Андерсона Техасского университета. Если иное не указано как повторное измерение, данные были взяты из разных образцов. Модель гепатоцеллюлярной карциномы (HCC) была создана путем подкожной имплантации 5 × 10 ⁶ клеток гепатомы McArdle RH-7777 (ATCC) крысам Buffalo.Рост опухоли контролировали дважды в неделю штангенциркулем в течение 1-2 недель до тех пор, пока опухоли не достигли объема примерно 1 см3, используя формулу (длина × ширина ² /2). Это сингенная модель животных с ГЦК у иммунокомпетентных крыс.

Клеточные линии меланомы и колоректального рака мыши B16 и MC38 / gp100 культивировали в RPMI 1640 с добавлением 1X HEPES, 1X глутамакса, 1X инсулин-трансферрин-селен, 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (FBS), 55 мкМ β -меркаптоэтанол и 0,2% нормоцин (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США).Эти две клеточные линии были выбраны из-за их несопоставимых стромальных характеристик опухоли, при этом опухоли меланомы B16 представляют «мягкие» опухоли, а опухоли MC38 представляют «твердые» опухоли. Предыдущие исследования показали, что значения интерстициального давления в опухолях меланомы B16 (~ 10 мм рт. Ст.) 5 намного ниже, чем у опухолей MC38 (~ 150 мм рт. Ст.) 6, подчеркивая различия в жесткости опухоли между этими двумя моделями; 3 × 10 ^{5 клеток} имплантировали подкожно в дорсальную и вентральную подкожную ткань самок мышей C57BL / 6NC в возрасте 6–12 недель, и опухоли позволяли расти в течение 10–14 дней или до тех пор, пока они не достигли 6–8 мм в длину. длина, измеренная штангенциркулем.Использовали только опухоли без признаков изъязвления на момент лечения.

Техника внутриопухолевых инъекций, получение изображений и анализ данных

Внутриопухолевые инъекции были выполнены в гибридном наборе вмешательств под визуальным контролем. Установка инъекционной иглы проводилась интервенционным радиологом под контролем ультразвука в реальном времени (Acuson, Siemens). Ультразвуковое изображение использовалось для подтверждения того, что кончик иглы находится в центре целевого поражения. Введение йодсодержащих контрастных агентов и / или иммунотерапевтических агентов выполняли под живым флюороскопическим изображением со скоростью 15 кадров в секунду (Artis Q, Siemens).Затем животных сканировали с помощью компьютерной томографии на рельсах (Miyabi, Siemens) сразу после инъекции; это позволяло животным оставаться в неподвижном состоянии, не переводя их в другой комплект визуализации или портал. Толщина CT-среза по оси z составляла 0,6 мм. Объемный анализ КТ-изображений был выполнен для количественной оценки процента опухоли, заполненной введенным лекарственным средством, с использованием стандартного программного обеспечения для анализа трехмерных (3D) изображений (iNtuition; TeraRecon, Foster City, California, USA).

Влияние конструкции инъекционной иглы на доставку и удержание инъекционного лекарства оценивалось следующим образом.Инъекции выполняли с использованием либо обычной иглы с концевым отверстием калибра 21 (EHN; Becton Dickinson), либо иглы с многосторонним отверстием без концевого отверстия (ProFusion, Cook Regentec). Игла ProFusion, используемая в этом исследовании, имеет закрытый ромбовидный наконечник для облегчения позиционирования под контролем изображения в целевом поражении. Дистальный 1 см иглы имеет 22 вытравленных лазером отверстия, распределенных по спирали с характерным эхогенным узором. Множественные параллельные каналы позволяют улучшить внутриопухолевое распределение и идут рука об руку с уменьшением давления во время инъекции.Установка иглы производилась под контролем ультразвука, чтобы гарантировать, что все боковые отверстия были расположены внутри опухоли, поскольку проксимальное боковое отверстие, расположенное за пределами опухоли, привело бы к утечке жидкости не в цель.

Иглы соединяли со шприцами, и инъекции йодированного контрастного вещества (Omnipaque 240) выполняли одновременно в двусторонние боковые опухоли на модели опухоли крысы (n = 10). Впрыски выполнялись с равным объемом (1 см3) и с постоянной скоростью впрыска с использованием нагнетательного насоса с двойной головкой (Harvard Apparatus).Непрерывные измерения давления на линии были получены во время инъекций с использованием пьезоэлектрического датчика давления (CompassCT, Cook Regentec). Периодически использовалась ультразвуковая визуализация, чтобы убедиться, что игла остается хорошо позиционированной в целевом поражении.

Влияние состава стромы опухоли на доставку инъекционного лекарства проводили следующим образом. Внутриопухолевые инъекции йодированного контраста (Omnipaque 240) были выполнены на моделях мышей меланомы B16 и колоректального рака MC38, описанных ранее.Перед инъекцией объем опухоли измеряли штангенциркулем по формуле длина × ширина ² /2. Объем внутриопухолевого инъекционного раствора для каждой опухоли был рассчитан таким образом, чтобы он был равен объему опухоли, рассчитанному с использованием этого метода. Инъекции выполнялись под ультразвуковым контролем через одиночный EHN 27 калибра; В отличие от больших опухолей у крыс, которые могут быть приспособлены для клинически значимой иглы 21G, для инъекций в меньшие опухоли мышей требовалось иглы более высокого калибра. Затем животных сразу же визуализировали с помощью системы микроКТ (Skyscan, Bruker).Объемный анализ КТ-изображений был выполнен для количественной оценки процента опухоли, заполненной введенным лекарственным средством, с использованием полуавтоматического алгоритма объемного измерения на основе пороговых значений с помощью стандартного пакета программного обеспечения для анализа трехмерных изображений (iNtuition; TeraRecon).

Иммунологический профиль после внутриопухолевой доставки иммунотерапии

Клетки сингенной гепатомы McArdle RH-7777 (ATCC) имплантировали в бок самок крыс Buffalo (n = 10). Как только опухоли достигли размера 15-20 мм, агонист STING (50 мкг ML RR-S2 CDA, Sigma-Aldrich) по сравнению с физиологическим раствором (контроль, n = 2) вводили под ультразвуковой визуализацией с использованием либо EHN 21 калибра (Becton Dickinson; n = 4) или игла с многосторонним отверстием 21G (ProFusion; n = 4).Ткань опухоли собирали через 24 часа после инъекции и получали суспензии единичных клеток следующим образом. Опухоли рассекали и разрезали на мелкие кусочки скальпелем. Фрагменты ткани подвергали ферментативному расщеплению в 3 объемах фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 1 мг / мл ДНКазы I (номер по каталогу Roche 11284932001), коллагеназу D 1 мг / мл (номер по каталогу Roche 11088882001) и Dispase II 2,4 ед. / мл (№ по каталогу Roche 4942078001). После инкубации при 37 ° C в течение 30 минут при осторожном перемешивании лизат промывали PBS + 2% FBS и процеживали через нейлоновую сетку 40 мкМ.Затем эритроциты лизировали хлоридным аммонийным буфером (Miltenyi cat # 130-094-183). Суспензию клеток промывали и ресуспендировали в PBS + 2% FBS перед определением общего количества полученных клеток, а также их жизнеспособности с использованием трипанового синего. Затем лейкоциты (т.е. клетки CD45 +) очищали с использованием микробусин CD45 (Miltenyi cat # 130-109-682) в соответствии с указаниями производителя. Очищенные клетки ресуспендировали в ледяном PBS + 2% FBS, и общее количество и жизнеспособность определяли с помощью автоматического счетчика клеток (Countess II, Thermo Fisher).

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNAseq) внутриопухолевых лейкоцитов CD45 + выполняли следующим образом. Библиотеки scRNAseq были приготовлены с помощью 10X Genomics Chromium Single Cell Immune Profiling Solution на основе рекомендаций производителя с использованием 10 000 очищенных лейкоцитов на образец. Образцы не объединяли, а запускали независимо в качестве повторов (n = 2 для контроля, n = 4 для каждой из двух групп обработки). Затем была секвенирована комплементарная ДНК транскриптомов одиночных клеток с использованием платформы Illumina (NextSeq 500).Затем данные были проанализированы с использованием пакета Seurat V.3.07 в R (R V.4.0.2, The R Foundation). Сначала мы построили атлас клеток CD45 +, подвергшихся scRNAseq (n = 25 399 клеток). После определения основных типов иммунных клеток, кластеры были аннотированы на основе установленных транскрипционных профилей.8 Затем мы отобрали кластеры, представляющие миелоидные популяции (макрофаги и моноциты), и охарактеризовали их фенотипическое состояние, используя ранее опубликованные наборы генов для «воспалительных» дендритных клеток и гены, стимулированные интерфероном I типа.8 9

Синтез и оценка гидрогелей

Многодоменные пептиды (MDP) спонтанно самоорганизуются в бета-листовые нановолокна, в результате чего получаются мягкие гидрогели, идеально подходящие для инъекции шприцом в любое место, до которого может добраться игла. Было показано, что МДП являются биосовместимыми и биоразлагаемыми как in vitro, так и in vivo, и могут быть легко загружены небольшими молекулами, биологическими препаратами или клетками для различных применений. Мультидоменный пептид на основе катионного лизина K ₂ (SL) ₆ K ₂ (или K2-MDP) использовали для загрузки и улучшения биораспределения контрастного агента иогексола, а также агониста STING.Йогексол был приобретен в исходной концентрации 240 мгI / мл (Omnipaque 240), и была приготовлена ​​серия разведений для образования различных составов гидрогеля K2-MDP, загруженных различными концентрациями иогексола, для определения его совместимости с гидрогелированием. Йогексол получали при 120, 48 и 24 мгI / мл путем разбавления в 1X PBS при pH 7,2, и лиофилизированный исходный пептид K2-MDP получали в концентрации 2 мас.% (20 мг / мл или 11,2 мМ) в 298 мМ растворе сахарозы. . Все испытанные составы были полностью гомогенными и успешно образовывали гидрогели.Также была построена кривая интенсивности количественного разведения с использованием компьютерной томографии, которая позволила выбрать оптимальную концентрацию для экспериментов in vivo (60 мгI / мл в пределах 1 мас.% Гидрогеля). Чтобы оценить улучшение внутриопухолевого отложения лекарственного средства, соединение MDP-йогексол или свободный йогексол (100 мкл каждого) вводили с помощью иглы 29G со скоростью 50 мкл / с под рентгеноскопией с последующей немедленной постинъекционной компьютерной томографией в тот же бок крысы. модель опухоли (n = 10), как описано ранее.

Затем, чтобы определить влияние доставки иммунотерапии на основе гидрогеля, готовили гелевый состав агониста MDP-STING, как описано ранее.10 Состав геля агониста MDP-STING в сравнении со свободным агонистом STING (50 мкг ML RR-S2 CDA, Sigma-Aldrich в обеих руках) по сравнению с контролем солевого раствора вводили в ту же модель опухоли на боках крысы и проводили проточную цитометрию CD45 + иммунных клеток из сбор опухолей проводили через 48 часов после инъекции. Анализ проточной цитометрии выполняли следующим образом. Экспрессию поверхностных антигенов клетки оценивали с использованием следующих антител: CD45-PE / Dazzle594 (BioLegend cat # 202223), CD3-VioBlue (Miltenyi cat # 130-102-677), CD8-FITC (BD Pharmingen cat # 554856) и CD4. -PE / Cy7 (№ по каталогу BD Pharmingen 561578).Вкратце, неспецифическое связывание сначала блокировали обработкой образцов антителом к ​​CD32 (BD Pharmingen, каталожный № 550270) при 1: 200 при 4 ° C в течение 5 мин. Разведения антител готовили в PBS + 2% FBS, содержащем фиксируемый краситель жизнеспособности eFluor 780 (eBioscience cat # 65-0865-14) в соотношении 1: 1000. Клетки инкубировали с антителами в рекомендованных производителем разведениях в течение 30 мин при 4 ° C в темноте. Клетки дважды промывали, ресуспендировали в PBS + 2% FBS и анализировали проточной цитометрией с помощью проточного цитометра Gallios 561 (Beckman Coulter, Калифорния, США).Количественную оценку некроза опухоли проводили на срезах, окрашенных H и E, с использованием QuPath.11

Results

Доставка в зависимости от конструкции инъекционной иглы

Существует большое разнообразие клинически доступных конструкций инъекционных игл. Хотя одиночные EHN являются наиболее распространенными, мы предположили, что игла без концевых отверстий, а скорее с несколькими боковыми отверстиями (MSHN), приведет к улучшенному внутриопухолевому отложению лекарственного средства. Была проведена одновременная инъекция 1 см3 йодированного контрастного вещества через EHN 21 калибра и MSHN 21 калибра под живой рентгеноскопией в модели двусторонней боковой опухоли крысы (рисунок 2, онлайн-дополнительное видео 1).Интравазация (непреднамеренная системная доставка из-за утечки введенного лекарства в сосудистую сеть опухоли) была заметно больше при инъекции EHN, чем при использовании иглы с многосторонним отверстием. Сразу после инъекции, подтвержденное КТ, улучшенное удерживание в опухоли с помощью иглы с многосторонним отверстием. Эти результаты хорошо коррелировали с клиническими наблюдениями за йодированными внутриопухолевыми иммунотерапевтическими агентами, которые выявили, что интравазация и перитуморальная утечка являются обычными для EHNs (онлайн-дополнительный рисунок 1).4 Параллельные измерения межклеточного давления во время закачки показали ожидаемое относительное снижение давления во время закачки с помощью MSHN по сравнению с EHN.

Рисунок 2

Игла с торцевым отверстием (EHN) и игла с многосторонним отверстием (MSHN). На двусторонней модели гепатоцеллюлярной карциномы на крысах выполняли одновременную инъекцию через MSHN по сравнению с EHN. Иглы были помещены под ультразвуковой контроль (А). При рентгеноскопии в реальном времени вводили йодированный контраст с помощью инжектора контраста с двумя головками (B).Цифровая ангиография с вычитанием (C) во время инъекции показывает увеличение интравазации с EHN по сравнению с MSHN. Изображение через 5 минут после инъекции показывает улучшенное удерживание в опухоли при MSHN по сравнению с EHN (D). Этот результат был подтвержден компьютерной томографией (E) с примерно трехкратным улучшением при использовании MSHN по сравнению с EHN (F). Поточные измерения межклеточного давления продемонстрировали меньшее увеличение пикового давления во время закачки с MSHN по сравнению с EHN (G).

Влияние доставки лекарств для иммунотерапии на функцию лекарств

Затем мы проверили нашу гипотезу о том, что улучшение доставки лекарств для внутриопухолевой иммунотерапии приведет к повышению эффективности лекарств.Для этого мы выполнили инъекции агониста STING под контролем изображения с использованием EHN по сравнению с иглами с многосторонним отверстием в модели ГЦК на крысах. Внутриопухолевые иммунные клетки CD45 + выделяли через 24 часа после инъекции и выполняли scRNAseq (фиг. 3). Неконтролируемый кластерный анализ выявил несколько отдельных иммунных популяций. Кластерная характеристика была выполнена с использованием индивидуальных графиков экспрессии генов и тепловых карт. Учитывая прямой механизм действия агонистов STING на дендритные клетки, 12 мы сосредоточили наш анализ на этой субпопуляции.В группе лечения MSHN наблюдалась значительно повышенная экспрессия генов, связанных с интерфероном I типа, и сигнатуры «воспалительных» генов дендритных клеток по сравнению с ENH и контрольной группой.

Рисунок 3

Анализ секвенирования РНК одной клетки методом инъекции. В модели гепатоцеллюлярной карциномы на крысах агонист STING (50 мкг ML RR-S2 CDA) вводили с помощью иглы с торцевым или многосторонним отверстием. Образцы тканей собирали через 24 часа, и секвенирование РНК отдельных клеток выполняли на внутриопухолевой популяции CD45 +.Неконтролируемый кластерный анализ (tSNE) выявил несколько дискретных иммунных популяций (A). Затем были проанализированы миелоидные ТАМ и плазмацитоидные дендритные клетки (mDC и pDC) (B), и характеристика кластера была выполнена с использованием индивидуальных графиков признаков экспрессии генов (C). Анализ обогащения набора генов выявил значительное увеличение экспрессии гена интерферона типа I и сигнатур «воспалительных» генов DC в опухолях, подвергшихся инъекции STING, по сравнению с контролем (D, E). Графики Z-значений для скрипки для образцов инъекции STING показали, что они были значительно больше по сравнению с контролем (D).Более того, по сравнению с иглами с торцевыми отверстиями, наблюдался кластер ДК со значительным увеличением сигнатур обоих этих генов, когда инъекции STING выполнялись с помощью иглы с многосторонним отверстием на основе графика Z-язв (F) на скрипке и диаграмм разброса Z-баллов. (ГРАММ). *** P <0,001; **** p <0,0001. ТАМ, опухолевые макрофаги.

Доставка лекарственного средства в зависимости от лекарственного состава

Затем мы оценили, могут ли модификации в инъекционной композиции влиять на внутриопухолевую доставку и последующий иммунный ответ (рис. 4).Растворимые лекарства в жидкостях с низкой вязкостью плохо локализуются в метастазах твердых органов. Мы предположили, что лекарства, встроенные в гидрогель на основе MDP, будут демонстрировать значительно улучшенную доставку и удерживание в опухолях после чрескожной доставки. Флюороскопическая визуализация во время инъекции свободного иогексола in vivo продемонстрировала утечку лекарственного средства вдоль капсулы опухоли, а также венозную интравазацию, как и ожидалось; по сравнению с этим наблюдается существенно улучшенная локализация соединения MDP-иогексол в опухоли без интравазации.Это было подтверждено последующей компьютерной томографией, которая продемонстрировала примерно пятикратное улучшение процента объема опухоли, содержащего введенное лекарство (38% против 8%, p <0,001).

Рисунок 4

Внутриопухолевая доставка на основе гидрогеля на основе многодоменного пептида (MDP). В модели гепатоцеллюлярной карциномы на крысах внутриопухолевый гидрогель MDP, содержащий иогексол, демонстрирует превосходное удерживание в целевой опухоли при рентгеноскопии в реальном времени (A) и компьютерной томографии (B, синяя звездочка) по сравнению со свободным иогексолом (B, красная звездочка), с более чем четырехкратным улучшением внутриопухолевой доставки (C).Гистологическая оценка через 48 часов после внутриопухолевой инъекции физиологического раствора (D), агониста STING в свободной водной фазе (E), только гидрогеля MDP (F) и агониста MDP-STING (G) демонстрирует географические области некроза, соответствующие участкам отложения MDP. Некроз опухоли наблюдался при использовании одного гидрогеля MDP в дополнение к инъекциям свободного STING и MDP-STING (H). Проточная цитометрия внутриопухолевых клеток CD45 + через 48 часов (I) и 96 часов (J) после лечения демонстрирует увеличение количества CD8 + Т-клеток во всех трех группах лечения в оба момента времени.Подмножества CD3 были привязаны к клеткам CD45 +, а подмножества CD4 / CD8 были привязаны к клеткам CD3 +. После внутриопухолевой доставки свободного STING и MDP-STING было аналогичное увеличение как CD4 +, так и CD8 + T-клеток (K). * P <0,05; ** p <0,01. нс, не имеет значения.

Сравнение инфильтрирующих опухоль лейкоцитов из подкожных крысиного HCC и колоректальных опухолей мышей, обработанных агонистом MDP-STING, и опухолей, обработанных одним свободным агонистом STING и одним гидрогелем MDP, показало несколько значительных различий.Мы обнаружили, что через 48 часов после внутриопухолевой доставки лекарственного средства гистологический анализ показал наличие обширных географических областей некроза, соответствующих внутриопухолевому отложению гидрогеля MDP как для одного гидрогеля, так и для агониста MDP-STING. Проточная цитометрия показала, что как на моделях крыс (рисунок 4), так и на моделях мышей (онлайн-дополнительный рисунок 2) опухоли, которые получили свободный агонист STING, имели в среднем более чем в два раза больше CD3 + -клеток по сравнению с составом гидрогеля (13,03% против 5.41%, p = 0,050, двусторонний t-критерий Стьюдента; данные из модели мыши). Однако в модели опухоли мыши MC38 именно опухоли, обработанные агонистом MDP-STING, продемонстрировали самый высокий процент клеток CD3 +, которые были CD8 +. Через 96 часов после лечения все опухоли, кроме обработанных физиологическим раствором, показали увеличение процентного содержания CD3 + клеток по сравнению с 48 часами. Примечательно, что опухоли, которые получали гидрогель, имели очень значительное увеличение процента клеток CD8 +, что указывает на то, что сам MDP вызывает иммунный ответ, который может скрывать ответ терапевтического агента, который он несет.

Влияние микросреды опухоли на доставку лекарств

Мы предположили, что строма опухоли и характеристики микросреды оказывают значительное влияние на внутриопухолевую доставку лекарств. Чтобы проверить эту гипотезу, мы оценили эффективность внутриопухолевых инъекций на двух моделях рака на мышах с различным внутренним составом, а именно на меланоме B16 и колоректальном раке MC38. В подкожные опухоли вводили объем йодированного контраста, равный объему опухоли, а затем сразу же визуализировали с помощью микроКТ (рис. 5).Объемный анализ введенных опухолей показал более чем двукратное улучшение внутриопухолевого распределения в опухолях меланомы B16 по сравнению с MC38 (46,2% ± 13,5% против 19,5% ± 10,7%, p <0,001).

Рисунок 5

Влияние микросреды опухоли на внутриопухолевую доставку лекарств. Внутриопухолевые инъекции йодсодержащего контрастного вещества выполняли в подкожных опухолях меланомы B16 и колоректального рака MC38 у мышей (опухоли, очерченные красными овалами). Мгновенная постинъекционная микроКТ-визуализация (A – C) выявила значительно улучшенное удерживание в опухолях B16 по сравнению с опухолями MC38, при этом в последних отмечена значительная экстракапсулярная утечка.

Обсуждение

С 2016 года мы выполнили более 1500 инъекций внутриопухолевой иммунотерапии под визуальным контролем как в клинических испытаниях, так и в стандартных условиях лечения в нашем учреждении. Наш клинический опыт выявил тот факт, что, хотя внутриопухолевая доставка иммунотерапевтических средств является безопасной процедурой, вариабельность внутриопухолевой дисперсии с неконтролируемым распределением вводимого лекарства по объему опухоли и утечкой в ​​окружающие ткани является серьезной проблемой.Негативные последствия доставки вне мишени включают снижение эффективности лекарственного средства и потенциально повышенную системную токсичность. В обзоре наших первых 500 внутриопухолевых инъекций мы обнаружили общую частоту нежелательных явлений 5,0%, связанных с введенным лекарственным средством в течение 24 часов после процедуры инъекции.4 Этот результат неудивителен, учитывая степень интравазации, наблюдаемую в этом исследовании. Пациенты могут испытывать симптомы, похожие на «цитокиновый шторм», уже через несколько минут после инъекции.У пациентов нередко развивается озноб, дрожащий озноб, тахикардия и гипотензия в процедурном кабинете или зоне восстановления. Серьезные осложнения (общие терминологические критерии нежелательных явлений Национального института рака (NCI CTC AE) ≥3) возникли у небольшого числа пациентов (2% пациентов, получавших исследуемые препараты, и 4% пациентов, получавших стандартную терапию талимогеном лахерпарепвек), и включали симптомы. достаточной степени тяжести, чтобы потребовать госпитализации с тщательным гемодинамическим мониторингом.

Наш клинический опыт выявил несколько переменных, которые влияют на внутриопухолевую доставку лекарств. К ним относятся стромальный состав опухоли и орган, в котором она находится, а также конструкция инъекционной иглы и скорость, с которой вводится лекарство. Эти проблемы хорошо известны интервенционным радиологам, имеющим опыт традиционных процедур инъекций под визуальным контролем, таких как чрескожная инъекция этанола, для которых часто используются специально разработанные MSHN.

Как указано в этом исследовании, изменения в конструкции иглы могут дать существенные преимущества. Эти модификации особенно полезны для пациентов с твердыми опухолями, предполагая, что современный универсальный подход к инъекциям требует переоценки. Более того, современные методы, использующие обычные EHN, несовершенны по нескольким причинам. Особая точка выхода жидкости из EHN приводит к тому, что лекарство выбрасывается при давлении жидкости, которое на два порядка превышает физиологическое давление жидкости.Причем жидкость выбрасывается одним вектором. Эти факторы приводят к тому, что лекарство доставляется струей под высоким давлением, которая разрушает опухолевые ткани и врывается в окружающую паренхиму. Эти доклинические исследования подтверждаются нашим клиническим опытом, в котором мы стали свидетелями плохой локализации опухоли (дополнительное онлайн-изображение 1). Более подходящей иглой является игла, в которой полностью отсутствует торцевое отверстие, а вместо этого имеется несколько боковых отверстий. Таким образом, давление нагнетания распределяется по множеству точек выхода жидкости и по разным векторам.Игла MSHN, использованная в этом исследовании, имеет несколько параллельных каналов, которые позволяют улучшить внутриопухолевое распределение и идут рука об руку с уменьшением давления во время инъекции.

Улучшения во внутриопухолевом распределении лекарств имеют значение только в том случае, если они приводят к повышению эффективности лекарств. Предыдущие исследования, основанные на моделировании, показали, что даже для репликации онколитических вирусов существует минимальное распространение вируса за пределы области внутриопухолевого отложения, и поэтому следует использовать стратегии, которые широко распространяют вирусные векторы по всей опухоли.13 Мы попытались экспериментально оценить эту гипотезу, используя агонист STING. Агонисты STING оказались многообещающими в доклинических условиях12 и проходят оценку в многочисленных клинических испытаниях (например, NCT03172936). STING — это внутрицитозольный двухцепочечный датчик ДНК, который при активации запускает транскрипцию интерферона-β.12 Помимо своей роли в иммунном ответе на вирусы, STING является центральным компонентом иммунного ответа на опухоли. Когда агонисты STING вводятся в опухоли, их механизм действия заключается в изменении фенотипа внутриопухолевых дендритных клеток.Чтобы агонисты STING активировали дендритные клетки и инициировали реакцию интерферона I типа, эти клетки должны подвергаться действию препарата. Поскольку эти клетки составляют редкую меньшинство внутриопухолевой клеточной среды, разумно предположить, что агонист STING должен быть распределен по всей опухоли таким образом, чтобы наибольший объем опухолевой ткани подвергался воздействию лекарственного средства. Такой подход должен максимизировать вероятность того, что соответствующие иммунные клетки столкнутся с агонистом STING и станут активными.Наши данные scRNAseq подтвердили эту гипотезу. Мы решили применить эту технологию на ранней стадии постинъекции, так как она обеспечит самую высокую разрешающую оценку прямых транскрипционных изменений из-за активации STING. Различия в последующих побочных эффектах, таких как внутриопухолевые концентрации интерферона, инфильтрация иммунных клеток и системные разветвления, потенциально могут быть затуплены нелинейным ответом дендритных клеток на активацию STING. То есть, количество активированных STING дендритных клеток может быть сложно предсказать на основе дальнейших нисходящих сигналов из-за петель положительной обратной связи после высвобождения интерферона.Более того, агонисты СТИНГА являются одновременно чрезвычайно сильнодействующими и не зависящими от тканей, и доставка этих препаратов не в цель может привести к очень болезненному синдрому цитокинового шторма. Следовательно, методика инъекции, помимо улучшения внутриопухолевого объема распределения, также должна уделять приоритетное внимание подавлению системной утечки.

В последнее время наблюдается распространение биоматериалов с улучшенной локализацией и устойчивым высвобождением, которые поддаются минимально инвазивным вмешательствам с визуальным контролем, таким как внутриопухолевые инъекции.14 Разжижающие напряжение сдвига гидрогели представляют собой класс биоматериалов с регулируемой вязкостью, которые хорошо подходят для таких применений. Когда их проталкивают через иглу, их вязкость уменьшается, что позволяет вводить инъекции; как только они попадают в организм, они подвергаются процессу гелеобразования и вновь приобретают свое сопротивление потоку до инъекции. Кроме того, гидрогели могут быть функционализированы, чтобы служить в качестве депо с замедленным высвобождением для различных лекарств, включая иммунотерапевтические. Ранее мы продемонстрировали, что гидрогели MDP, нагруженные STING, могут иметь драматические эффекты на уменьшение размера опухоли и выживаемость на мышиных моделях рака полости рта.10 Мы аналогичным образом обнаружили в этом исследовании, что гидрогель MDP очень эффективен при задержке внутри опухоли и некрозе опухоли, хотя последующий иммунный ответ может быть нацелен на сам гидрогель, а не на опухолевые антигены, поскольку MDP в основном состоит из катионных аминокислот. Однако изменения в составе гидрогеля потенциально могут преодолеть это ограничение, чтобы объединить преимущества внутриопухолевого осаждения на основе гидрогеля с фармакокинетическими преимуществами длительного высвобождения лекарственного средства.16 17

В то время как вариации конструкции инъекционной иглы и платформы доставки лекарств являются благодатной почвой для инноваций и экспериментов, манипуляции со стромой иммунодепрессивной опухоли, в которую должна быть введена иммунотерапия, предоставляет меньше возможностей. Было показано, что несколько неинвазивных и минимально инвазивных вмешательств снижают интерстициальное давление опухоли и, следовательно, потенциально могут быть использованы для изменения механических свойств опухоли, чтобы сделать ее более податливой для внутриопухолевой доставки лекарств.Например, давно известно, что внешнее лучевое излучение снижает интерстициальное давление опухоли18; это также верно и для гипертермии19. Таким образом, помимо потенциального иммуностимулирующего эффекта этих адъювантных вмешательств, их влияние на биомеханику опухоли может принести дополнительную пользу.

Внутриопухолевая иммунотерапия — это развивающаяся парадигма в иммуноонкологии, способная существенно усилить влияние иммунотерапии на весь спектр рака. Несмотря на то, что при разработке новых внутриопухолевых иммунотерапевтических агентов был применен огромный творческий потенциал, также важно гарантировать, что эти методы лечения точно воздействуют на целевые поражения.Инновации в технике инъекций, составах лекарств и модификации микросреды опухоли будут способствовать достижению этой цели.

c # — Разница между внедрением интерфейса и внедрением метода

Существует три основных шаблона DI, которые описывают , как внедрять зависимость:

• Внедрение конструктора — это статическое определение списка необходимых зависимостей путем их указания в качестве параметров для конструктора класса.
• Внедрение свойств (также известное как Setter Injection), статически определяет необязательную зависимость с использованием свойства, когда уже есть хороший Local Default .
• Внедрение метода , позволяет предоставить потребителю зависимость, передав ее в качестве параметра метода, где этот метод вызывается вне корня композиции

Мартин Фаулер, однако, также определил внедрение интерфейса. Это может показаться другой формой DI, но на самом деле это просто форма Property Injection или Method Injection , где свойство или метод является частью Abstraction класса.Насколько мне известно, внедрение интерфейса — это не широко используемая терминология.

Принципы, практики и шаблоны внедрения зависимостей описывает, что методы внедрения должны всегда размещаться на абстракции . Когда такой метод внедрения реализован исключительно в реализации, это означает, что только Composition Root может получить к ним доступ, но в книге указано:

Метод впрыска не подходит для использования внутри корня композиции .Внутри корня композиции можно использовать внедрение метода для инициализации ранее созданного класса с его зависимостями . Однако это приводит к Temporal Coupling и по этой причине крайне не рекомендуется (§ 4.3.2).

Property Injection , с другой стороны, обычно используется исключительно в реализации, а не Abstraction . Это потому, что в случае Property Injection это — это Composition Root , который установит эту зависимость.

Внедрение интерфейса , как описывает его Фаулер, кажется, в основном используется для инициализации компонента, но, как указано выше, это приводит к Temporal Couping и, следовательно, должно быть предотвращено. Либо используйте Constructor Injection , либо используйте Method Injection без сохранения зависимости.

Чтобы лучше понять DI, вам следует прочитать 1-ю главу этой книги в свободном доступе.

Process Injection Techniques — Cynet

Юваль Фишер — CyOps Analyst

Cynet всегда находится в поиске новых методов вредоносного ПО, и это стремление приводит нас к множеству вариаций аналогичных методологий.Мы постоянно сталкиваемся с проблемой внедрения процесса, для которой у Cynet есть специальная стратегия обнаружения и исправления в реальном времени.

Внедрение процесса — это широко распространенный метод обхода защиты, обычно применяемый при атаках вредоносных программ и бесфайловых атак. Это влечет за собой запуск пользовательского кода в адресном пространстве другого процесса. Внедрение процесса улучшает скрытность, а некоторые различные методы также обеспечивают постоянство.

Запуск кода в контексте другого процесса может разрешить доступ к памяти процесса, системным / сетевым ресурсам и, возможно, к повышенным привилегиям.Выполнение посредством внедрения процесса также может избежать обнаружения продуктами безопасности, поскольку выполнение маскируется под законным процессом.

Этот метод включает в себя множество суб-методов — в структуре MITER ATT & CK каталогизировано 11 суб-методов. В этой статье мы рассмотрим три основных метода внедрения процесса и проанализируем этот метод на практике:

Внедрение DLL

Классическое внедрение DLL

Классическое внедрение DLL — один из наиболее популярных методов.Во-первых, вредоносный процесс внедряет путь к вредоносной DLL в адресное пространство законного процесса. Затем процесс Injector вызывает DLL через выполнение удаленного потока. Это довольно простой метод, но с некоторыми недостатками:

• Вредоносную DLL необходимо сохранить на диске.
• Вредоносная DLL будет видна в таблице импорта.

Шаги для предварительного формирования атаки:

1. Найдите целевой процесс и создайте его дескриптор.
2. Выделите место для вставки пути к файлу DLL.
3. Запишите путь к DLL в отведенное место.
4. Выполнить DLL, создав удаленный поток.

Поток атаки (с использованием базового вызова API):

Отражательное внедрение DLL

Отражательное внедрение DLL, в отличие от предыдущего метода, упомянутого выше, относится к загрузке DLL из памяти, а не с диска. В Windows нет функции LoadLibrary , которая поддерживает это.Для достижения этой функциональности злоумышленники должны написать свою собственную функцию, опуская некоторые из вещей, которые обычно делает Windows, например, регистрацию DLL в качестве загруженного модуля в процессе, потенциально обходя мониторинг загрузки DLL.

Поток внедрения отражающей DLL:

1. Откройте целевой процесс и выделите достаточно большой памяти для DLL.
2. Скопируйте DLL в выделенное пространство памяти.
3. Вычислите смещение памяти в DLL для экспорта, используемого для выполнения отражающей загрузки.
4. Вызов CreateRemoteThread (или эквивалентную недокументированную функцию API, такую ​​как RtlCreateUserThread), чтобы начать выполнение в удаленном процессе, используя адрес смещения функции отражающего загрузчика в качестве точки входа.
5. Функция отражающего загрузчика находит блок среды процесса целевого процесса, используя соответствующий регистр ЦП, и использует его для поиска адреса в памяти kernel32.dll и любых других необходимых библиотек.
6. Проанализируйте каталог экспорта ядра 32, чтобы найти адреса памяти необходимых функций API, таких как LoadLibraryA, GetProcAddress и VirtualAlloc.
7. Используйте эти функции, чтобы затем правильно загрузить DLL (саму) в память и вызвать ее точку входа, DllMain.

Основной поток атаки:

Отражающий поток функций загрузчика:

Перехват выполнения потока

Перехват потока — это операция, при которой вредоносный шелл-код внедряется в законный поток. Как и Process Hollowing, перед впрыскиванием нить необходимо приостановить.

Поток атаки:

Этот метод можно использовать для внедрения вредоносных исполняемых файлов или в тандеме с функцией отражающей загрузки.

PE-инъекция

Как и рефлексивная DLL-инъекция, PE-инъекция не требует, чтобы исполняемый файл находился на диске. Это наиболее часто используемый прием в дикой природе. PE-инъекция работает, копируя свой вредоносный код в существующий открытый процесс и заставляя его выполняться. Чтобы понять, как работает PE-инъекция, мы должны сначала понять шеллкод.

Шелл-код — это последовательность машинного кода или исполняемых инструкций, которая вводится в память компьютера с целью получения контроля над выполняющейся программой.Большинство шелл-кодов написано на ассемблере.

Основной поток (упрощенный):

1. Получите текущий базовый адрес и размер изображения из заголовка PE.
2. Выделите достаточно памяти для изображения внутри собственного адресного пространства процесса, используя VirtualAlloc .
3. Попросите процесс скопировать собственный образ в локально выделенную память с помощью функции Memcpy .
4. Вызовите VirtualAllocEx , чтобы выделить память, достаточно большую, чтобы уместить изображение в целевом процессе.
5. Скопируйте локальный образ в область памяти, выделенную в целевом процессе, с помощью функции WriteProcessMemory .
6. Вычислить удаленный адрес функции, которая будет выполняться в удаленном процессе, вычтя адрес функции в текущем процессе из базового адреса текущего процесса, а затем прибавив его к адресу выделенной памяти в целевом процессе. .
7. Наконец, создайте новый поток с начальным адресом, установленным на удаленный адрес функции, используя CreateRemoteThread .

Анализ внедрения процесса во вредоносное ПО

Если мы подозреваем, что вредоносное ПО внедряет код в законный процесс, мы можем проверить наши выводы, отслеживая вызовы API вредоносного ПО. Нас можно предупредить, проанализировав подозрительную сетевую активность законного процесса или законного процесса, создающего вредоносные файлы. Мы начнем с использования инструмента мониторинга API и его настройки для мониторинга всех вызовов API, связанных с внедрением процессов. (Выше мы писали о наиболее распространенных вызовах API, хотя есть также вызовы API из DLL NTDLM.dll, которые выполняют ту же работу, но реже обнаруживаются продуктами для защиты от вредоносных программ)

Этот инструмент доступен для загрузки по адресу: http://www.rohitab.com/apimonitor
(хотя имейте в виду, что этот инструмент все еще находится в альфа и имеет некоторые ошибки).

Сначала мы настраиваем все подозрительные вызовы API в программу монитора. Мы проверим вредоносную программу-кражу информации, которая выполняет внедрение процесса.

Подозрительный API:

• VirtualAlloc / VirtualAllocX / NtAllocateVirtualMemory
• WriteProcessMemory / NtWriteVirtualMemory
• CreateRemoteThread / CreateRemoteThreadEX

можно настроить в строке поиска

, выбрав

в строке поиска

.

После того, как мы все настроили, мы можем запустить файл под контролем, который выдаст следующий результат:

Очевидно, что процесс преформ вводит процесс.Теперь мы можем проверить содержимое инъекции:

В третьем вызове функции мы видим буфер, который четко показывает введенный шелл-код. Единственная проблема в том, что мы не можем отбросить всю буферную страницу, поэтому мы будем проверять дальше в отладчике. В этом примере мы будем использовать отладчик IDA. После загрузки вредоносной программы мы будем искать другие API-интерфейсы, которые API Monitor не обнаружил (вы можете выполнять поиск по комбинации клавиш, используя CTRL + G):

CreateRemoteThread :

WriteProcessMemory :

Мы специально искали эти два API до отмеченной точки разрыва.

Когда мы дойдем до критической точки WriteProcessMemory , мы рассмотрим следующие разделы (изображенные ниже):

Теперь давайте сделаем шаг назад. Функция WriteProcessMemory в MSDN описывается как:

Итак, нас интересует третий параметр этой функции, поскольку это указатель на буфер с кодом, который скоро будет внедрен. Если мы проследим за третьим параметром до буфера, мы снова найдем внедренный код:

Теперь мы знаем точное местоположение внедренного кода в буфере.Мы можем открыть HxD, чтобы посмотреть в память процесса вредоносного ПО в месте внедрения. Теперь мы можем выгрузить введенный шелл-код и проанализировать его (этот шелл-код загружает файл .PNG, который является исполняемым файлом).

Cynet против инъекции

Используя Cynet360, мы смогли обнаружить технику внедрения вредоносного процесса, используемую в Cobalt Strike Beacon.

Cobalt Strike — это приложение для моделирования противников и операций Red Team.Он использует эти оценки безопасности для имитации проникновения в сеть продвинутых злоумышленников. В то время как тесты на проникновение фокусируются на незащищенных уязвимостях и неправильных конфигурациях, эти оценки приносят пользу операциям безопасности и реагированию на инциденты.

Одной из функций Cobalt Strike Beacon является использование неуправляемой библиотеки DLL PowerShell для выполнения команды PowerShell без использования powershell.exe.

Используя простую команду powerpick / psinject , злоумышленник может внедрить DLL, которая выполнит команду PowerShell и уклонится от большинства обнаружений PowerShell.

Чтобы обнаружить это, мы настроили прослушиватель:

И как только мы выполнили его с использованием PowerPick / Powerinject :

Cynet заблокировал внедрение неуправляемого исполняемого файла PowerShell. Команда, которую злоумышленник использовал для команды PowerShell, заблокирована. Это может быть шаг в полезной нагрузке злоумышленника, который идентифицирует этот процесс как вредоносный и потенциально может выявить скрытый бэкдор / скрытый вредоносный файл.

В пользовательском интерфейсе Cynet:

Обзор протоколов смертельных инъекций

До 2009 года в большинстве штатов для смертельных инъекций использовалась комбинация из трех препаратов: анестетика (обычно тиопентал натрия, до введения пентобарбитала в конце 2010 года), панкурония бромид (паралитическое средство, также называемое Павулон) и хлорид калия ( останавливает сердце и вызывает смерть).Из-за нехватки лекарств штаты приняли новые методы смертельной инъекции, в том числе:

ОДИН НАРКОТИК: В восьми штатах казнили с применением единственного лекарства — смертельной дозы анестетика (Аризона, Джорджия, Айдахо, Миссури, Огайо, Южная Дакота, Техас и Вашингтон). Шесть других штатов в тот или иной момент объявили о планах использовать протокол с одним лекарством, но не проводили такую ​​казнь (Арканзас, Калифорния, Кентукки, Луизиана, Северная Каролина и Теннесси).

ПЕНТОБАРБИТАЛ: В четырнадцати штатах использовалось пентобарбитала при казнях: Алабама, Аризона, Делавэр, Флорида, Джорджия, Айдахо, Миссисипи, Миссури, Огайо, Оклахома, Южная Каролина, Южная Дакота, Техас и Вирджиния. Еще пять штатов планируют использовать пентобарбитал: Кентукки, Луизиана, Монтана, Северная Каролина и Теннесси. Колорадо включает пентобарбитал в качестве резервного препарата в процедуру смертельной инъекции.

МИДАЗОЛАМ: В семи штатах использовался мидазолам в качестве первого препарата в протоколе трех препаратов: Флорида, Огайо, Оклахома, Алабама, Вирджиния, Арканзас и Теннесси.Оклахома использовала мидазолам при неудачной казни Клейтона Локетта в апреле 2014 года, и Локетт умер после того, как процедура была остановлена. Использование мидазолама в Алабаме при казни Рональда Смита в декабре 2016 года привело к тому, что Смит тяжело дышал и тяжело дышал в течение почти пятнадцати минут. Использование Арканзасом мидазолама в четырех казнях в апреле 2017 года вызвало обеспокоенность, а при казни Кеннета Уильямса свидетели сообщали о кашле, конвульсиях, покачивании и подергивании. В январе 2017 года Флорида отказалась от использования мидазолама в качестве первого препарата в протоколе из трех препаратов и заменила его на этомидат.Два штата использовали мидазолам в протоколе с двумя лекарствами, состоящим из мидазолама и гидроморфона: Огайо (Деннис МакГуайр) и Аризона (Джозеф Вуд). Обе казни, проведенные в 2014 году, были продолжительными и сопровождались затрудненным дыханием заключенных. После неудачного исполнения Макгуайра штат Огайо отказался от использования мидазолама в протоколе с двумя препаратами, но затем в октябре 2016 года решил сохранить мидазолам в протоколе с тремя препаратами. В декабре 2016 года Аризона отказалась от использования мидазолама в протоколе с двумя или тремя препаратами.Три штата в какой-то момент предложили использовать мидазолам в протоколе с двумя препаратами (Луизиана, Кентукки и Оклахома), но ни один из этих штатов не выполнил эту формулу. Некоторые штаты предложили несколько протоколов. Миссури вводил заключенным мидазолам в качестве успокаивающего средства до начала официального протокола казни.

ФЕНТАНИЛ: Небраска впервые применила фентанил при казни Кэри Дина Мура 14 августа 2018 года. Невада также объявила, что будет использовать фентанил в сочетании с другими наркотиками для проведения казней.

КОМПАКТНЫЕ АПТЕКИ : По крайней мере, десять штатов использовали или намереваются использовать аптеки для приготовления лекарств для смертельных инъекций. Южная Дакота провели 2 казни в октябре 2012 года, получив наркотики от производителей смесей. Миссури впервые применил пентобарбитал из аптеки при казни 20 ноября 2013 года Джозефа Франклина. Texas впервые применил пентобарбитал из аптеки при казни Майкла Йоуэлла 9 октября 2013 года. Джорджия использовала наркотики из безымянной аптеки для казни 17 июня 2014 года. Оклахома использовала наркотики из аптек-компаундов при казнях, в том числе в неудачной казни Локетта. Вирджиния впервые применила составной пентобарбитал, полученный через Департамент уголовного правосудия Техаса при казни Альфредо Прието 1 октября 2015 года. Огайо объявил о планах получения лекарств в аптеках-компаундах в октябре 2013 года.В марте 2014 года компания Mississippi объявила о планах использования пентобарбитала из аптеки, производящей рецептуры. Документы, опубликованные в январе 2014 года, показывают, что Луизиана связалась с аптекой, производящей рецептуры, по поводу лекарств для казни, но неясно, были ли эти лекарства там получены. Пенсильвания , возможно, получал лекарства от производителя смесей, но не употреблял их. Колорадо разослала запросы в аптеки по производству смертельных инъекционных наркотиков, но все казни приостановлены.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ: В нескольких штатах есть законы, разрешающие альтернативные методы казни, если смертельные инъекции недоступны. Алабама (действует с июля 2018 года), Миссисипи ( действует с апреля 2017 года) и Оклахома (действует с ноября 2015 года) — все они имеют законы, разрешающие использование азотной гипоксии. Закон штата Теннесси разрешает использование электрического стула. Закон Utah разрешает использование расстрельной команды, если штат не может получить смертельные инъекции за 30 дней до казни. Нью-Гэмпшир допускает повешение, «если по какой-либо причине комиссар [исправительных учреждений] сочтет нецелесообразным применять смертную казнь путем введения необходимого смертоносного вещества или веществ». Для получения подробной информации о методах выполнения состояний, см. Методы выполнения.

В казнях на федеральном уровне используется метод смертельной инъекции, который использовался во всех трех федеральных казнях в современную эпоху путем смертельной инъекции, проводимой в федеральном учреждении в Индиане.Федеральное правительство использовало пентобарбитал. Военный США не приводил никаких казней с момента восстановления. Планируется использовать смертельную инъекцию.