Мокрота на чувствительность к антибиотикам: Подготовка к исследованию мокроты и слюны

Содержание

Подготовка к исследованию мокроты и слюны

Правила сбора мокроты

Недопустимо направлять мокроту на исследование в емкостях, не предназначенных для этих целей, так как в них могут содержаться вещества, способные исказить результат анализов.

Нельзя разделять мокроту на две части для исследования в разных лабораториях, так как важные компоненты могут попасть только в один из контейнеров.

Мокрота собирается утром, натощак. Перед сбором мокроты почистите зубы и прополощите рот водой, чтобы удалить частицы пищи и бактериальный налет. Сделайте два глубоких вдоха, задерживая дыхание на несколько секунд, после каждого глубокого вдоха медленно выдыхайте. Затем вдохните в третий раз и с силой выдохните (вытолкните) воздух. Еще раз вдохните и хорошо откашляйтесь.
Поднесите контейнер как можно ближе ко рту и осторожно сплюньте в него мокроту после откашливания. Следите, чтобы мокрота не попала на край контейнера. Не касайтесь внутренней поверхности крышки и стенок стерильного контейнера пальцами. Плотно закройте контейнер крышкой.
Вымойте руки с мылом.
Собранную для исследования утреннюю мокроту доставьте в лабораторию не позднее, чем через 1–1,5 часа после сбора. При этом должны быть созданы условия, исключающие ее охлаждение при транспортировке. В противном случае в мокроте быстро произойдут изменения ее качеств, состава микробных колоний, что может исказить результаты исследования.

Внимание Нельзя собирать мокроту, выделяемую при отхаркивании, только при откашливании. Попадание слюны в образец может существенно влиять на результат исследования.

Общие правила сбора слюны

Внимание! Нецелесообразно проводить исследования слюны на фоне применения глюкокортикоидных препаратов (в т.ч. мазей).

За сутки до взятия слюны не употреблять алкоголь.

За час до сбора слюны не есть, не курить, не чистить зубы (если нет других указаний от лечащего врача).
За 10 минут до сбора слюны прополоскать рот водой.

Правила сбора слюны для исследований «Кортизол в слюне»

За сутки и в течение всего периода сбора слюны исключить физические нагрузки, не употреблять кофеин (чай, кофе, кофеиносодержащие энергетические напитки, продукты, жевательная резинка), алкоголь;
За один час до сбора слюны не курить;
За 30 минут до сбора слюны не употреблять пищу, не чистить зубы, в том числе не использовать зубную нить и ополаскиватель для полости рта, не жевать жевательную резинку;
За 10 минут до сбора слюны прополоскать рот водой;
Прием седативных препаратов, кортизона ацетата, эстрогенов, пероральных контрацептивов, глюкокортикоидных препаратов (в т. ч. мазей) может вызвать повышение уровня кортизола. Отмена лекарственных препаратов осуществляется строго по рекомендации лечащего врача.

Продробнее о правилах сбора слюны для исследований «Кортизол в слюне» смотрите по ссылке

Мокрота. Общая клиника

Мокрота собирается утром, натощак. Перед сбором мокроты почистите зубы и прополощите рот водой, чтобы удалить частицы пищи и бактериальный налет. Сделайте два глубоких вдоха, задерживая дыхание на несколько секунд, после каждого глубокого вдоха медленно выдыхайте. Затем вдохните в третий раз и с силой выдохните (вытолкните) воздух. Еще раз вдохните и хорошо откашляйтесь.
Поднесите контейнер как можно ближе ко рту и осторожно сплюньте в него мокроту после откашливания. Следите, чтобы мокрота не попала на край контейнера. Не касайтесь внутренней поверхности крышки и стенок стерильного контейнера пальцами. Плотно закройте контейнер крышкой.
Вымойте руки с мылом.
Собранную для исследования утреннюю мокроту доставьте в лабораторию не позднее, чем через 1–1,5 часа после сбора. При этом должны быть созданы условия, исключающие ее охлаждение при транспортировке. В противном случае в мокроте быстро произойдут изменения ее качеств, состава микробных колоний, что может исказить результаты исследования.

Внимание! Нельзя собирать мокроту, отделяющуюся при отхаркивании. Попадание слюны в образец может существенно влиять на результат исследования.

Мокрота. Туберкулез

Мокрота собирается утром, натощак. Перед сбором мокроты почистите зубы и прополощите рот водой, чтобы удалить частицы пищи и бактериальный налет. Сделайте два глубоких вдоха, задерживая дыхание на несколько секунд, после каждого глубокого вдоха медленно выдыхайте. Затем вдохните в третий раз и с силой выдохните (вытолкните) воздух. Еще раз вдохните и хорошо откашляйтесь.
Поднесите контейнер как можно ближе ко рту и осторожно сплюньте в него мокроту после откашливания. Следите, чтобы мокрота не попала на край контейнера. Не касайтесь внутренней поверхности крышки и стенок стерильного контейнера пальцами. Плотно закройте контейнер крышкой.
Вымойте руки с мылом.
Собранную для исследования утреннюю мокроту доставьте в лабораторию не позднее, чем через 1–1,5 часа после сбора. При этом должны быть созданы условия, исключающие ее охлаждение при транспортировке. В противном случае в мокроте быстро произойдут изменения ее качеств, состава микробных колоний, что может исказить результаты исследования.

Внимание! Нельзя собирать мокроту, выделяемую при отхаркивании, только при откашливании. Попадание слюны в образец может существенно влиять на результат исследования.

Посев мокроты на микрофлору и чувствительность к антибиотикам

Для бактериологического исследования мокроту собирают до начала антибактериальной терапии или через определенный промежуток времени после введения препарата.

Порядок сбора

Мокрота собирается утром, натощак. Перед сбором мокроты почистите зубы и прополощите рот водой, чтобы удалить частицы пищи и бактериальный налет. Сделайте два глубоких вдоха, задерживая дыхание на несколько секунд, после каждого глубокого вдоха медленно выдыхайте. Затем вдохните в третий раз и с силой выдохните (вытолкните) воздух. Еще раз вдохните и хорошо откашляйтесь.
Поднесите контейнер как можно ближе ко рту и осторожно сплюньте в него мокроту после откашливания. Следите, чтобы мокрота не попала на край контейнера. Не касайтесь внутренней поверхности крышки и стенок стерильного контейнера пальцами. Плотно закройте контейнер крышкой.
Вымойте руки с мылом.
Собранную для исследования утреннюю мокроту доставьте в лабораторию. При этом должны быть созданы условия, исключающие ее охлаждение при транспортировке. В противном случае в мокроте быстро произойдут изменения ее качеств, состава микробных колоний, что может исказить результаты исследования.

Мокрота. Анаэробы и чувствительность к антибиотикам

Внимание Мокрота собирается натощак.

Предварительно почистите зубы, десны и язык зубной щеткой и прополощите рот кипяченой водой комнатной температуры.

Порядок сбора

Сделайте два глубоких вдоха, задерживая дыхание на несколько секунд, после каждого глубокого вдоха медленно выдыхайте. Затем вдохните в третий раз и с силой выдохните (вытолкните) воздух. Еще раз вдохните и хорошо откашляйтесь.
Поднесите контейнер как можно ближе ко рту и осторожно сплюньте в него мокроту после откашливания. Следите, чтобы мокрота не попала на край контейнера. Не касайтесь внутренней поверхности крышки и стенок стерильного контейнера пальцами. Плотно закройте контейнер крышкой.
Вымойте руки с мылом.
Собранную для исследования утреннюю мокроту доставьте в лабораторию.

Мокрота. На грибы Candida

Внимание! Мокрота собирается до начала антибактериальной терапии.

Порядок сбора

Сделайте два глубоких вдоха, задерживая дыхание на несколько секунд, после каждого глубокого вдоха медленно выдыхайте. Затем вдохните в третий раз и с силой выдохните (вытолкните) воздух. Еще раз вдохните и хорошо откашляйтесь.
Поднесите контейнер как можно ближе ко рту и осторожно сплюньте в него мокроту после откашливания. Следите, чтобы мокрота не попала на край контейнера. Не касайтесь внутренней поверхности крышки и стенок стерильного контейнера пальцами. Плотно закройте контейнер крышкой.
Вымойте руки с мылом.
Собранную для исследования утреннюю мокроту доставьте в лабораторию.

Мокрота. Микроскопические грибы (комплекс)

Мокрота собирается до начала антибактериальной терапии. Предварительно почистите зубы, десны и язык зубной щеткой и прополощите рот кипяченой водой комнатной температуры.

Порядок сбора

Сделайте два глубоких вдоха, задерживая дыхание на несколько секунд, после каждого глубокого вдоха медленно выдыхайте. Затем вдохните в третий раз и с силой выдохните (вытолкните) воздух. Еще раз вдохните и хорошо откашляйтесь.
Поднесите контейнер как можно ближе ко рту и осторожно сплюньте в него мокроту после откашливания. Следите, чтобы мокрота не попала на край контейнера. Не касайтесь внутренней поверхности крышки и стенок стерильного контейнера пальцами. Плотно закройте контейнер крышкой.
Вымойте руки с мылом.
Собранную для исследования утреннюю мокроту доставьте в лабораторию.

Внимание! Качественным материалом для анализа считается мокрота, имеющая слизистый или слизисто-гнойный характер, а также содержащая плотные белесоватые включения.

Сбор мокроты у детей

У детей, не умеющих откашливать мокроту и заглатывающих ее, следует поступить следующим образом:

Вызвать рефлекторный кашель, раздражая ватным тампоном, накрученным на ручку чайной ложки область корня языка и задней стенки глотки.
Полученную мокроту собрать этим же тампоном и поместить в контейнер.

Так же следует поступать с очень слабыми больными, которые не могут откашляться самостоятельно.

<< Вернуться ко всем правилам подготовки

Анализ мокроты на чувствительность к антибиотикам

Дата: 25.09.2018

«Анализ мокроты на чувствительность к антибиотикам»

Анализ мокроты на чувствительность к антибиотикам позволит точно определить возбудителя болезни и подобрать эффективное лечение. Во время микроскопического исследования специалист определяет ДНК микроорганизмов в отделяемом, а также их концентрацию. Тест также включает проверку реакции бактерий на лекарственные препараты. По результатам анализа пациент получит рекомендации по лечению.

Анализ мокроты на чувствительность к антибиотикам требует специальной подготовки. Отделяемое сдают утром, натощак, методом отхаркивания. Перед этим необходимо тщательно почистить зубы и прополоскать рот. Для лучшего отделения слизи за день до теста рекомендуют пить больше жидкости. Исследование не проводят на фоне приема антибиотиков или противовоспалительных средств.

При сухом кашле для забора мокроты используют катетер или проводят биопсию. Манипуляции не входят в стоимость анализов на чувствительность к антибиотикам, оплачиваются отдельно.

Анализ мокроты на посев с определением чувствительности к антибиотикам

Анализ мокроты является одним из ключевых методов дифференциальной диагностики всевозможных бронхолегочных патологий: пневмоний, абсцесса, бронхоэктатической болезни и др. При этом такой метод лабораторного исследования, как посев мокроты, позволяет точноопределить качественный состав исследуемого биоматериала, выявить в нем патогенные микроорганизмы (или условно-патогенные микроорганизмы в высоком титре) и определить их чувствительность к конкретным группам антибиотиков и бактериофагов. Благодаря этому, данный анализ позволяет подобрать эффективное лечение даже в ситуации, когда наблюдается устойчивость патогенных микроорганизмов к многим антибактериальным препаратам.

Когда назначается анализ мокроты на посев с определением чувствительности к антибиотикам?

Проведение микробиологического исследования мокроты путем бактериологического посева с последующим определением чувствительности к антибиотикам выполняется:

при затяжных и тяжело протекающих заболеваниях дыхательных путей,

с целью установления возбудителя инфекционного заболевания,

для подбора рациональной антибактериальной терапии,

в случае неэффективности принимаемых антибиотиков.

Сбор биоматериала

Мокрота на посев собирается утром до первого приема пищи в специальный стерильный контейнер с плотно закрывающейся крышкой. Для того, чтобы в биоматериал не попали примеси слюны и слизи, перед сбором образца для исследования проводится тщательное очищение ротовой полости и носоглотки.

Анализу подлежит только свежая мокрота, выделенная в результате продолжительного откашливания.

Сбор мокроты на посев с определением чувствительности к антибиотикам проводят до начала лечения антибактериальными препаратами. В противном случае полученный результат может быть ложноотрицательным.

Результаты

Исследование мокроты больного с целью определения антибактериальной чувствительности включает в себя:

микроскопию мазка мокроты и предварительную идентификацию типа возбудителя;

посев материала на питательную среду;

культивацию микрооганизмов в индивидуально подобранных условиях;

повторную микроскопию с подробной идентификацией выращенных колоний и определением основных свойств микроорганизмов;

определение чувствительности к антибиотикам.

С помощью различных методов определения чувствительности возможно не только выделение спектра антибактериальных препаратов, обладающих губительным воздействием на выявленные микроорганизмы, но и установление минимально приемлемой для положительного терапевтического эффекта концентрации веществ.

В каких ситуациях посев мокроты необходим

Это исследование показано при всех заболеваниях средних и нижних дыхательных путей инфекционного происхождения: острые и хронические бронхиты, плевриты, пневмонии. Обязательно проводится при осложнениях этих патологий, например, при абсцессе легкого.

Неоднократно анализ должен осуществляться при малейшем подозрении на туберкулез или проводиться как контрольное исследование при его терапии. В ряде случаев посев мокроты назначается при онкологических заболеваниях легких, для уточнения диагноза при возможных их сочетаниях с инфекционной патологией.

Необходимо учитывать, что дыхательные пути содержат нормальную микрофлору, некоторые виды которой при ослабленном иммунитете могут стать патогенными. Наиболее частыми возбудителями воспалительных заболеваний дыхательных путей являются золотистый стафилококк, гемофильная палочка, клебсиелла, стрептококк, энтеробактерии, а также микроскопические грибки. При туберкулезе выявляется палочка Коха.

Как проводится исследование

Забор мокроты должен быть произведен до начала приема антибиотиков и осуществляется 3 способами: путем отхаркивания, аспирацией или с помощью бронхоскопии. Перед этим пациент должен почистить зубы и прополоскать рот. Полученный образец герметично упаковывают и отправляют в лабораторию, где в течение 2 часов он должен быть посеян в чашки Петри на питательную среду. Этот метод называют бактериологическим. При образовании колоний микроорганизмов производится их идентификация. Обнаружение поселений, созданных патогенными бактериями, является важным диагностическим критерием.

Следующий этап исследования-это определение чувствительности микробов к антибиотикам. Для этого чаще используется метод дисков: небольшие диски, пропитанные растворами различных антибактериальных препаратов, помещаются в колонии бактерий. Далее отслеживается скорость гибели колонии вокруг них. Чем быстрее это происходит, тем эффективнее антибиотик.

Расшифровка полученных данных

Бактериологический способ дает возможность не только определить тип возбудителя и его реакцию на антибиотики, но и подсчитать его количественно. Содержание 10/5 и более патогенных микроорганизмов на 1 мл мокроты считается этиологически значимым признаком.
Результат посева дает важнейшую информацию о причине заболевания, его тяжести и помогает выбрать правильный путь лечения.

Автор: Уразбахова Анар Жаксылыковна

Баклаборант бактериологического отделения

Областного медицинского центра

20.09.2018г

Посев на флору с определением чувствительности к основному спектру антибиотиков и бактериофагам,в т.ч.кандида

Выберите требуемый вид биоматериала

Сбор грудного молока желательно проводить до кормления ребенка или через два часа после кормления грудью. Грудное молоко собирается после тщательного мытья рук и молочных желез с обработкой околососкового пространства и кончиков пальцев спиртом. Первые 0,5 мл молока необходимо слить, следующие 5 мл молока из железы сцедить в стерильный пластиковый контейнер без ложки. При необходимости микробиологического исследования молока обеих молочных желез, сбор грудного молока из каждой железы производится в отдельный контейнер. Обращаем Ваше внимание, что 2 контейнера — это два исследования, каждое из которых оплачивается отдельно.

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Мокроту можно собрать только при наличии кашля! Перед сбором мокроты рекомендуется почистить зубы (не использовать зубную пасту с антибактериальными компонентами) и прополоскать рот кипяченой водой. Избегать попадания в мокроту слюны и носовой слизи. Мокрота по мере откашливания собирается в стерильный контейнер. Кашель можно вызвать с помощью нескольких глубоких вдохов.

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Сдать общий анализ мокроты в Одинцово и Звенигороде на грибы и антибиотики, цена

Сбор материала для исследования

Когда кашель с выделениями из органов дыхательных путей продолжается длительное время, а рентген выявил затемнения в груди, становится очевидной необходимость сдать мокроту на анализ.

Накануне сдачи анализа нужно пить много жидкости, так мокрота скопится за ночь. Сбор секрета стоит проводить утром до завтрака. Нужно почистить зубы, прополоскать рот, энергично покашлять или сделать несколько глубоких вдохов. Обильное выделение секрета провоцируют ингаляции с йодидом калия. Собранный материал в стерильном стаканчике отправляется в лабораторию, где общий анализ мокроты проводится в течение двух часов после взятия.

Что показывает анализ мокроты?

Общий анализ проводится в три этапа, включая визуальный осмотр жидкости, микроскопическое исследование, бактериоскопию и посев на питательные среды. Визуально лаборант оценивает следующие показатели:

цвет,

консистенция,

деление на слои,

запах,

наличие включений.

Под микроскопом материал исследуют на наличие клеточных элементов, паразитов, бактерий, волокон и кристаллов. Посев на флору позволяет определить бактерию-возбудителя и проверить её чувствительность к антибиотикам. Назначается анализ мокроты при пневмонии, бронхите, застое в легких, бронхиальной астме и других заболеваниях органов дыхания.

Цитологический анализ мокроты, или исследование на атипичные клетки делают при малейшем подозрении на онкологию. Он предполагает окрашивание мазков мокроты и изучение под микроскопом.

Анализ мокроты на грибы и антибиотики

Сдача мокроты на анализ – быстрый и простой способ диагностики патологии респираторной системы. Исследование позволяет определить вид патогенного микроорганизма, будь то грибы, бактерии, а также установить, какие антибиотики будут наиболее эффективны в лечении. При анализе выделяют три типа возбудителей по степени их приоритетности, оценивают их количество. Для наиболее значимых с точки зрения диагностики возбудителей проводится антибиотикограмма — тест на чувствительность возбудителя инфекционно-воспалительного заболевания к противомикробным препаратам.

Сдать анализ мокроты в Одинцово и Звенигороде

Медицинские центры «ВЕРАМЕД» предлагают пациентам услуги собственной лаборатории, где проводятся любые виды анализов.

Возможность прохождение полного обследования в одном месте, получение точных результатов исследований в самый короткий срок – вот что ценят наши пациенты. Более 10 лет вы доверяете нам свое здоровье, а мы заботимся о том, чтобы поход к врачу не был для вас проблемой. Позвоните в «ВЕРАМЕД» и узнайте, какая цена действует на анализы сегодня.

Бактериология: посев на микрофлору мокроты

Посев на микрофлору мокроты с определением чувствительности к расширенному спектру АБ

Посевом мокроты на микрофлору называют бактериологический анализ патологического отделяемого нижнего отдела дыхательного тракта (бронхов и легких). Исследование мокроты проводится с целью выявления воспалительных процессов в легких и бронхов, а также определения чувствительности микроорганизмов к расширенному спектру антибиотиков.

Подготовка к исследованию:

Исследование проводят до начала антибиотикотерапии
Процедура проводится после тщательного туалета ротовой полости

Тип биоматериала: мокрота (отхаркивание, аспирация, бронхоскопия легких)

Синонимы (rus): Бакпосев на флору мокроты и определение восприимчивости бацилл к антибиотикам расширенного спектра

Синонимы (eng): Bacterial culture on the flora of sputum and determination of the susceptibility of bacteria to antibiotics extended-spectrum

Методы исследования: микробиологическое исследование

Сроки выполнения: 3-5 дней

Микрофлора мокроты

В норме микрофлора мокроты, которая выводится из респираторных путей при откашливании, заселена условно-патогенными микробами:

стафило- и стрептококками;
корине-, фузо- и лакто-бактериями;
нейсерией;
бактероидами;
вейлонеллой;
дрожжеподобными грибками;
дифтероидами.

Посев на микрофлору мокроты имеет важное значение при диагностировании легочных заболеваний и определении вида возбудителя воспалительной реакции. Для выбора специфической терапии проводится анализ на восприимчивость выявленных микроорганизмов к расширенному спектру антимикробных средств (антибиотикограмма).

Когда назначают бактериальный анализ?

Опытные специалисты — терапевты, пульмонологи назначают бактериальный анализ мокроты при наличии у пациента признаков воспалительных процессов в органах дыхания:

пневмонии;
острых или хронических бронхитов;
абсцесса легкого;
эмпиемы плевры;
бронхоэктатической болезни;
туберкулеза.

Расшифровка анализа

В специальных условиях собранный секрет респираторного тракта (мокроту) помещают на подготовленные культуральные среды для роста колоний бактерий. Затем выросшие бациллы изучают, оценивают их тип и активность, определяют количество и чувствительность к широкому спектру антибиотиков.

Результаты анализа предоставляют микроскопическую картину образца мокроты:

наличие или отсутствие роста колоний бактерий;
количество выросших микробов, их вид;
восприимчивость возбудителей к АБ.

Диагностическое значение имеет титр >103 КОЕ/мл – «положительный результат» — указывает на легочную инфекцию. Основными микроорганизмами, которые приводят к патологическому процессу в дыхательных органах относят:

золотистый стафилококк;
гемофильную палочку инфлюэнце;
бета-гемолитический стрептококк;
пневмококк;
моракселлу;
грибы Candida;
нокардии;
плеоморфные грам-негативные палочки рода Acinetobacter;
хламидию пситаки;
микобактерии туберкулеза (палочки Коха).

Результаты посева на микрофлору мокроты интерпретируются только квалифицированным специалистом, который учитывает общее состояние пациента и клинические признаки воспалительной реакции.

Бакпосев на флору и чувствительность к антибиотикам — из МОКРОТЫ

Универсальное микробиологическое исследование, позволяющее определить наличие и основные культуральные свойства (титр, количество), чувствительность к основным группам антибактериальных препаратов) большинства аэробных микроорганизмов, растущих на обычных питательных средах. Для исследования подходит практически любой вид биологического материала. Анализ используют для микробиологической диагностики неспецифических инфекционных заболеваний, выявления возбудителей хронических инфекций, определения наиболее подходящего препарата для антибактериальной терапии. Чувствительность к антибиотикам для нормальной микрофлоры не определяется.

Список нормальной микрофлоры:

Зев и нос:- Streptococcus viridians — Staphylococcus epidermidis — Staphylococcus saprophyticus — Staphylococcus haemolyticus — Дифтероиды — Neisseria spp (кроме Neissria meningitidis)

Мазки урогенитальные (женские) – Lactobacillus — Сorynebacterium urealytica (дифтероиды) — Staphylococcus epidermidis (в титре ниже 1х10^4) — Staphylococcus saprophyticus(в титре ниже 1х10^4)

Указанные выше микроорганизмы относятся к постоянной нормальной микрофлоре и не требуют лечения антимикробными препаратами, т.к. при их отсутствии могут возникнуть проблемы «дисбактериоза» в указанных органах (снижение местного иммунитета, рецидивы хронических заболеваний) . Лечение этих микроорганизмов антибиотиками сравнимо, с лечением антибиотиками лакто- и бифидобактерий в кишечнике. При обнаружении микробиологическим методом микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору, или условно-патогенных микроорганизмов в титре менее диагностического не определяется чувствительность к антибиотикам и бактериофагам, так как это количество не является значимым и не требует лечения противомикробными препаратами.

Стоимость исследования

Результаты проспективного исследования чувствительности штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных из мокроты больных с прогрессирующими респираторными заболеваниями Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ОЗЫК МАКАЛА/ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ/ORIGINAL ARTICLE

Материал поступил в редакцию: 25-07-2014 Материал принят к печати: 29-07-2014 УДК 579.862.2.044:615.33

Results of Prospective Analysis of the Antibiotic Susceptibility of Streptococcus Pneumoniae Strains Isolated From Patients with Progressive Respiratory Infections

Bisenova N., Yergalieva A.

National Scientific Medical Research Center, Astana city, Kazakhstan

The aim of this study was to analyses the antibiotic susceptibility of Streptococcus pneumoniae strains isolated from patients with progressive respiratory infections.

Methods. Sputum of hospitalized patients diagnosed with progressive respiratory infection during 20092013 was included to the prospective bacteriological study. Initial seeding material conducted a quantitative method on nutrient medium according to guidelines. The identification of isolates and antibiotic susceptibility testing were performed by microbiological analyzer Microtax, MiniApi, Vitek 2-Compact. The etiological factor was defined at a concentration of 106 and above. The results were subjected to statistical analysis. We determined averages, an averages error (m), Students test, a confidence interval (p). The probability of null hypothesis did not exceed 0.05 (p<0.05).

Results. Streptococcus pneumoniae was the most frequently isolated from sputum with progressive respiratory infection. Antibiotic susceptibility testing showed that Streptococcus pneumoniae had 100% susceptibility to vancomycin. The susceptibility to beta-lactams ranged from 56.6% to penicillin up to 80.1% to cefuroxime. The most activity from quinolones was levofloxacin — 82.6% susceptibility strains of Streptococcus pneumoniae. Macrolides showed susceptibility rate below 50%.

Conclusions. 1) Streptococcus pneumoniae had 100% susceptibility to vancomycin. 2) The susceptibility of Streptococcus pneumoniae was above 80% to levofloxacin, cefuroxime, ceftriaxone.ргыда енделдь Ягни, сенімді ара кашыктыктын денгеш (р), Стьюденттщ t — елшемі, орташа кателік (m) жэне орташа аумактыгы аныкталды. Нэтиже тиянакты болып есептелді, егер нел-гипотезасы мYмкіндігі 0,05 тен аспаса (р<0,05).

Нэтижесь ЖYргізілген зерттеулер бойынша жедел респираторлы аурулардын негізгі коздыргышы болып Streptococcus pneumoniae табыл-ды. Осы себептен накты аймакта берілген патологиясы бар наукастардан белінген пневмококктардын антибиотиктерге сезімталдылык динами-касы байсалды тYPДе талкыга тYсті.

ЖYргізілген зерттеулер бойынша Streptococcus pneumoniae дакылынын ванкомицинге абсолютл 100% сезімталдылык керсетті. Пневмококктардын сезімталдылык денгеш бета-лактамды антибиотиктерге онын шшде; пенициллинге 56,6%, цефуроксимге 80,1% аралыгында ауыткыды. Фторхинолондардын онын ішінде левофлоксацин орташа есеппен 82,6% жана белшген Streptococcus pneumoniae дакылына айкын белсендшк керсеттіндегі аныкталды. Ал макролид антибиотиктерше пайыздык керсеткіш бойынша пневмококктардын белсендшп 50% темен екендігі аныкталды.

Цорытынды:

Streptococcus pneumoniae дакылынын ванкомицинге абсолютл 100% сезімталдылык керсетті.

Левофлоксацин, цефуроксим, цефтриаксон зерттелген Streptococcus pneumoniae дакылына 80% тен жогары антибактериалды белсендшк танытты.

Манызды сездер: дамыган респираторлы! аурулар, какырык, коздыргыштар, пневмококктар, антибиотиктерге сезімталдылык.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОСПЕКТИВНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОКРОТЫ БОЛЬНЫХ С ПРОГРЕССИРУЮЩИМИ РЕСПИРАТОРНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ Бисенова Н.М., Ергалиева А.С.

Национальный научный медицинский центр, Астана, Казахстан

Цель исследования. Анализ чувствительности к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у пациентов с прогрессирующими респираторными заболеваниями.

Методы. В течение с 2009 по 2013 годы проведено проспективное бактериологическое исследование больных с прогрессирующими респираторными заболеваниями, находившихся на стационарном лечении в отделениях терапевтического профиля. Бактериологическому исследованию подвергалась мокрота данных больных. Первичный посев клинического материала проводили количественным методом на питательные среды в соответствии с нормативными документами. Идентифицикацию и антибиотикочувствительность выделенных чистых культур микроорганизмов проводили на микробиологических компьютерных анализаторах «Microtax», «MiniAPI» и «Vitek 2 — Compact».

За этиологический фактор принимались только те виды микроорганизмов, которые выделялись из мокроты в количестве 106 КОЕ в 1 мл и выше.

Полученные результаты подвергали статистической обработке. Определяли средние величины, ошибку средней (m), t-критерий Стьюден-та, уровень доверительного интервала (р). Результаты считали достоверными, если вероятность нуль-гипотезы не превышала 0,05 (р<0,05).

Результаты. Проведенных исследований показали, что основным бактериальным возбудителем прогрессирующих респираторных заболеваний являлся Streptococcus pneumoniaе.

В связи с этим представлялось актуальным изучение динамики чувствительности к антибиотикам пневмококков, выделенных у пациентов с данной патологией в конкретном регионе.

Проведенное исследование показало, что абсолютную 100% чувствительность культуры Streptococcus pneumoniae имели к ванкомицину. Уровень чувствительности пневмококков к бета-лактамам колебался от 58,6% процентов к пенициллину до 81,1% к цефуроксиму Из фтор-хинолонов наибольшую активность в отношении свежевыделенных штаммов Streptococcus pneumoniae показал левофлоксацин — в среднем 84,2% чувствительных штаммов. Макролидные антибиотики имели процентный показатель активности в отношении пневмококков ниже 50%.

Выводы:

Абсолютную 100% чувствительность культуры Streptococcus pneumoniae имели к ванкомицину.

Левофлоксацин, цефуроксим, цефтриаксон проявляли антибактериальную активность более чем на 80% изученных штаммов Streptococcus pneumoniae.

Ключевые слова: прогрессирующие респираторные заболевания, мокрота, штаммы, пневмококки, антибиотикочувствительность.

ВВЕДЕНИЕ

Проблема прогрессирующих респираторных заболеваний остается актуальной и в настоящее время, несмотря на прогресс современной пульмонологии.

Антибактериальная терапия прогрессирующих респираторных заболеваний предусматривает выбор препаратов, активных в отношении наиболее вероятных возбудителей с учетом региональных и локальных данных по распространенности устойчивости микробов к различным классам антибиотиков [1-3].

В последнее время увеличивается резистентность штаммов пневмококка к пенициллину. Устойчивость возбудителя к р-лактамам связана с модификацией мишени действия антибиотиков. В тоже время, респираторные хинолоны, такие как левофлоксацин и моксифлоксацин, остаются активными против пени-циллин-резистентных пневмококков. Также указанные препараты сохраняют активность и против макролидус-

тойчивых пневмококков [4-7].

Устойчивость ключевых респираторных возбудителей существенно варьирует от страны к стране и отдельных регионах, поэтому при выборе препаратов наиболее целесообразно руководствоваться локальными данными по резистентности микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Например, в России среди штаммов пневмококка, включённых в исследование ПеГАС в 2006 — 2009 годах, резистентность к пенициллину составила 9,1%. Все выделенные штаммы Streptococcus pneumoniae были чувствительны к амоксициллину/клавуланату, левоф-локсацину. Частота резистентности к кларитромицину составила 5,7%, азитромицину 6,4%. Наиболее высокий уровень устойчивости был отмечен к тетрациклину (21,5%) и ко -тримоксазолу (16,6%). Данное исследование свидетельствует о сохранении высокой активности

Р-лактамов и макролидов в отношении пневмококков и диктует необходимость ограничения использования у пациентов с респираторными инфекциями в России тетрациклина и ко-тримоксазола [8].

Из-за особенностей фармакокинетических и фар-макодинамических параметров, а также хорошего профиля безопасности большой популярностью в клинической практике пользуются макролиды. Они являются альтернативой бета-лактамам при лечении нетяжелых пневмококковых инфекций и, в частности, у пациентов с аллергией на выше названные препараты. Но расту-

щий объем потребления макролидов вызвал широкое распространение штаммов с высоким уровнем резистентности к макролидам во всем мире [1,2].

Так, по данным исследования РЯОТБКТ и 8АиСБ-4, резистентность пневмококков к эритромицину в США составила 29,3% в Испании — 81,3% и в Японии — 81,9% [4-6].

Таким образом, эмпирическая антибактериальная должна базироваться на данных о факторах развития резистентности к антибиотикам в различных регионах.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ чувствительности к антибиотикам штам- с прогрессирующими респираторными инфекциями. мов Streptococcus pneumoniae, выделенных у пациентов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В течение с 2009 по 2013 годы проведено проспективное бактериологическое исследование больных с прогрессирующими респираторными заболеваниями, находившихся на стационарном лечении в отделениях терапевтического профиля. Бактериологическому исследованию подвергалась мокрота данных больных. Первичный посев клинического материала проводили количественным методом на питательные среды в соответствии с нормативными документами [9]. Идентифи-цикацию и антибиотикочувствительность выделенных чистых культур микроорганизмов проводили на микробиологических компьютерных анализаторах «Microtax», «MiniAPI» и «Vitek 2 — Compact».

Полученные результаты подвергали статисти-

ческой обработке. Определяли: средние величины, ошибку средней (m), t-критерий Стьюдента, уровень доверительного интервала (р). Результаты считали достоверными, если вероятность нуль-гипотезы не превышала 0,05 (р<0,05).

Результаты. Исследование этиологической структуры мокроты больных с прогрессирующими респираторными заболеваниями в течение пяти лет (2009-2013 годы) показало, что в нашем регионе основным возбудителем респираторных инфекций является Streptococcus pneumoniae — 40,2+1,6% [10,11].

В связи с этим представлялся интересным мониторинг антибиотикограмм основного бактериального возбудителя данной патологии. Динамика антибиоти-кочувствительности штаммов Streptococcus pneumoniae за наблюдаемый промежуток времени представлена в таблице 1.

Таблица 1 — Антибиотикочувствительность штаммов Б1гер1ососси8 рпеитошае, выделенных из мокроты больных с прогрессирующими респираторными заболеваниями за 2009-2013 годы

Годы

2009 2010 2011 2012 2013 Среднее

Вид антибиотика M±m% M±m% M±m% M±m% M±m% M±m%

Бета-лактамы

Ампициллин 80,2±4,5 72,4±8,3 84,6±7,0 64,0±6,7 50±3,3 81,4±2,8

Б ензилпенициллин 61,8±5,5 50±8,8 63,3±8,7 62,1±5,9 46,1±9,7 58,6±3,2

Цефалексин 73,6±5,0 58,6±9,1 63,6±14,5 52,1±7,3 43,4±10,3 61,6±3,5

Цефотаксим 89,4±3,5 62,5±8,5 80±7,3 90,6±3,6 55,5±9,5 80,7±2,6

Цефтриаксон 78,9±4,6 62,5±8,8 86,6±6,2 87,5±4,7 69,5±9,6 79,1±2,8

Цефтазидим 69,6±8,0 58,0±8,8 55,5±9,5 51,5±6,2 44±9,9 55,5±3,7

Цефуроксим 75,7±7,4 83,8±6,6 80±7,3 85,2±4,5 76±8,5 81,1±2,9

Хинолоны

Ципрофлоксацин 63,6±8,3 75±7,6 76,1±9,3 62,0±6,3 41,6±10 63,6±3,7

Офлоксацин 82,8±4,3 85,7±6,6 94,4±5,4 63,6±7,2 56,5±10,3 76,7±3,0

Левофлоксацин 91,7±3,2 86,2±6,4 92,3±7,3 79,1±8,2 64±9,6 84,7±2,8

Макролиды

Кларитром ицин 77,6±4,7 50±9,1 53,8±9,7 43,4±7,3 34,7±9,9 52,7±3,5

Азитромицин 72±5,1 39,2±9,2 51,8±9,6 35,4±6,0 26,9±8,6 49,5±3,3

Эритромицин 66,2±5,4 31,2±8,1 51,7±9,2 36,0±6,0 26,6±8,0 47,1±3,2

JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE OF KAZAKHSTAN 2014 VOLUME 2, NUMBER 32

Продолжение таблицы 1

Вид антибиотика 2009 M±m% Годы 2010 2011 2012 M±m% M±m% M±m% 2013 M±m% Среднее M±m%

Р окситромицин 52,0±5,8 51,8±9,6 65,3±9,3 Линкозамиды 41,6±7,1 34,7±9,9 49,2±3,5

Линкомицин 79,1±4,7 72,4±8,3 65,3±9,3 51,7±6,6 56,6±10,3 68,4±3,2

Клиндомицин 80,2±4,5 71,8±7,9 60,8±10,1 Гликопептиды 56,0±6,4 67,8±8,8 68,8±3,1

Ванкомицин 1 100 100 100 Другие препараты | 100 100 | 100

Рифампицин ]j>1,3±3,3 Г 92,8±4,8^ 100 |^97,2±2,7 95,6±4,2 [j>4,5±1,6

Из таблицы 1 видно, что абсолютную 100% чувствительность культуры Streptococcus pneumoniae имели к ванкомицину, что согласуется с данными российских и зарубежных исследователей.

Уровень чувствительности пневмококков к бета-лактамам колебался от 58,6% процентов к пенициллину до 81,1% к цефуроксиму. Высокую активность в отношении пневмококка демонстрировали цефалоспорины III поколения — цефуроксим — 81,1%, а также цефтри-аксон — 79,1%, чувствительность к которым колебалась в наблюдаемые годы соответственно от 75,7% до 85,2% и 62,5% до 87,5%. Наши данные по чувствительности Streptococcus pneumoniae .

К бензилпенициллину и ампициллину было чув-

ствительно соответственно 58,6% и 81,4% выделенных пневмококков.

Из фторхинолонов наибольшую активность в отношении свежевыделенных штаммов Streptococcus pneumoniae показал левофлоксацин — в среднем 84,7% чувствительных штаммов. Офлоксацин по результатам наших наблюдений оказывал антибактериальную активность на 76,7% изолятов пневмококка.

Макролидные антибиотики по нашим наблюдениям имели процентный показатель активности в отношении пневмококков ниже 50%. Наиболее низкий уровень чувствительности изолятов Streptococcus pneumoniae наблюдался к эритромицину — 47,1% и азитромицину -49,5%.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами данные о 100% чувствительности культуры Streptococcus pneumoniae к ванкомицину согласуются с данными российских и зарубежных исследователей [4,7,8].

По данным российского исследования ПеГАС в 2006 — 2009 годы чувствительные к цефтриаксону штаммы пневмококка составили 99% результаты наших исследований показывают 79,1% уровень чувствительности к цефтриаксону [8].

Наши данные по чувствительности Streptococcus pneumoniae к пенициллину (58,6% чувствительных штаммов) согласуются с данными исследования SOAR в странах Африки и Ближнего Востока, где было выявлено 61,5% пенициллинчувствительных штаммов [4-6]. По данным российского исследования ПеГАС в 2006 -2009 гг. чувствительные к пенициллину штаммы составили 88,8% [8]. Результаты надзора за антимикробной резистентностью в Европе в 2012 году показывают что, частота выделения Streptococcus pneumoniae, резистентных к пенициллину, колеблется от менее 1% в Эстонии; 1-5% в Бельгии, Нидерландах, Ирландии, Великобритании, Чехии; 5-10% в Германии, Австрии, Норвегия, Дании ; 10-25% в Франции, Италии, Венгрии до 10-25% в Испании, Румынии, Болгарии [12].

Из фторхинолонов наибольшую активность в отношении свежевыделенных штаммов Streptococcus

pneumoniae показал левофлоксацин — в среднем 84,7% чувствительных штаммов. По данным исследования ПеГАС в 2006 — 2009 гг. чувствительность пневмококков к левофлоксацину на территории России составила 100% [8]. Офлоксацин по результатам наших наблюдений оказывал антибактериальную активность на 76,7% изолятов пневмококка. По данным надзора за антимикробной резистентностью в Европе в 2012 году, частота выделения Streptococcus pneumoniae, резистентных к фторхинолонам составила 5,2% [12].

Наши данные показали низкий уровень чувствительности изолятов Streptococcus pneumoniae к эритромицину — 47,1% и азитромицину — 49,5%. По результатам российского исследования ПеГАС в 2006 — 2009 гг. чувствительные к эритромицину штаммы составили 95,4% , а к азитромицину — 92,7% [8].

Таким образом, наши динамичные наблюдения за антибиотикочувствительностью Streptococcus pneumoniae, выделенных из мокроты больных с прогрессирующими респираторными заболеваниями в течение пяти лет позволяют сделать следующие выводы:

Абсолютную 100% чувствительность культуры Streptococcus pneumoniae имели к ванкомицину.

ЛИТЕРАТУРА

1. Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких. // Пер. с англ. под ред. Чучалина А.Г. Атмосфера. Москва.2003. — 96с.

2. Авдеев С.Н. Антибактериальная терапия при обострении хронической обструктивной болезни легких // Пульмонология. — 2010. — №2. — С. 95-10.

3. Зубков М.Н. Современные проблемы резистентности пневмотропных патогенов // Пульмонология. — 2007. -№5. — С.5-13.

4. Данные первого Конгресса стран СНГ по рациональной антибиотикотерапии Inspiration // Антибиотикотерапия. — 2011.-№15-16. -С.268-269.

5. Jenkins S., Brown S., Farrell D. et al. Trends in antimicrobial resistance among Streptococcus pneumoniae isolated in the USA: update from PROTEKT US Years 1-4 // Ann Clin Microbiol Antimicob. — 2008. — N.11. -P.7-11.

6. Inoue M., Kaneko K., et.al. Antimicrobial susceptibility of respiratory tract pathogens in Japan during PROTEKT

years (1999-2004) // Microb Drug Resist. — 2008. -N.14. — P. 109-117.

7. Perez Trallero E., Martin Yerrero J., Mazon A., et al. Antimicrobial resistance among respiratory pathogens in Spain:

latest data and changes over 11 years (1996-1997 to 2006-2007) // Antimicrob Agents Chemother. — 2008. — N. 54. —

P.2953-2959.

8. Козлов Р.С. Динамика антибиотикорезистентности Streptococcus pneumoniae в России (по данным многоцентрового проспективного исследования ПЕГАС 2006-2009гг) // Клин микробиол антимикроб химиотер. — 2010. — №4. — С.329-341.

9. Кречикова О.И., Козлов Р.С., Богданович Т.М., Стецюк О.У, Суворов М.М. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae. Методические рекомендации для микробиологов. М, 2000.

10. Бисенова Н.М., Ергалиева А.С. Этиологическая структура мокроты больных с обострением ХОБЛ // Сборник трудов XXIII Национального конгресса по болезням органов дыхания. Казань. 2013. — С.198-199.

11. Бисенова Н.М., Ергалиева А.С. .Микробный пейзаж мокроты больных с респираторными инфекциями // Сборник трудов научно-практ. конференции «Микробиология: её роль в медицине, науке, медицинском образовании», посвященной 80 — летию проф. А.Л. Котовой. Алматы. 2012. — С.36-39.

12. Antimicrobial resistance surveillance in Europe. Surveillance report // Annual Report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network. Stockholm. 2012.- Р.51-59.

JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE OF KAZAKHSTAN 2014 VOLUME 2, NUMBER 32

Бактериология мокроты и паттерны чувствительности к антибиотикам внебольничной пневмонии у госпитализированных взрослых пациентов в Нигерии: 5-летнее многоцентровое ретроспективное исследование

Задний план:

Для оптимального лечения необходимо четкое знание патогенов, ответственных за внебольничную пневмонию (ВП) в данном регионе, и их характеристик чувствительности к антибиотикам. Мы определили общие бактериальные патогены, вызывающие ВП в Нигерии, и дополнительно проанализировали их паттерны чувствительности к антибиотикам с целью предоставления рекомендаций по улучшению лечения ВБП к антибиотикам.

Методы:

Были ретроспективно изучены истории болезни всех взрослых пациентов в возрасте 18 лет и старше, поступивших в четыре крупные больницы третичного уровня на юго-востоке Нигерии с диагнозом ВП в период с 2008 по 2012 год. Чтобы соответствовать критериям отбора, пациенты должны были иметь результаты посева мокроты и результатов анализа чувствительности. Также были получены социально-демографические, клинические данные, данные до госпитализации и лечения в стационаре.

Результаты:

Из 400 пациентов с рентгенологически подтвержденным диагнозом ВП 232 соответствовали критериям исследования; 122 (52,6%) были женщины, средний возраст составлял 50,6 ± 18,8 года. Этиологические возбудители выявлены в мокроте у 189 (81,5%) пациентов. Streptococcus pneumoniae (n = 90, 47,6%) был наиболее частым изолятом, за ним следовали Klebsiella pneumoniae (n = 62, 32,8%), Staphylococcus aureus (n = 24, 12.7%) и Streptococcus pyogenes (n = 13, 6,9%). Наиболее чувствительны возбудители к левофлоксацину (77%), цефтазидиму (75,5%) и офлоксацину (55,8%). Чувствительность изолятов к антибиотикам, наиболее часто назначаемым для эмпирической терапии, была низкой (коамоксиклав, 47,6%; ципрофлоксацин, 45,9% и цефтриаксон, 47,6%), и это было связано с более высокой смертностью и / или более длительным пребыванием в больнице у выживших. .

Вывод:

Strep.pneumoniae и K. pneumoniae были наиболее частыми причинами ВП. Наиболее чувствительны к левофлоксацину и цефтазидиму возбудители. Мы предлагаем все чаще рассматривать эти антибиотики как лучшие варианты эмпирического лечения ВП в Нигерии.

Ключевые слова:

Этиология; чувствительность к антибиотикам; бактериальный; внебольничная пневмония; мокрота.

Тестирование чувствительности к антибиотикам | Лабораторные тесты онлайн

Источники, использованные в текущем обзоре

улица, Т.(Обновлено 13 марта 2014 г.). Чувствительность к противомикробным препаратам. Medscape. Доступно в Интернете по адресу https://emedicine.medscape.com/article/2103786-overview?pa=rOBA1lN0uZhjg0bJO6bD2AgpF2o0ma5fK6AeuJMPuepOQ4%2B%2BoTWGQm%2Be5C543B%2BoTWGQm%2Be5C543B%2BoTWGQm%2Be5C543B%2BOTWGQm%2Be5c5z2mUj2. По состоянию на апрель 2018 г.

Arena, F. et al. (2015). Тестирование на чувствительность к антибиотикам: настоящее и будущее. Medscape. Доступно на сайте https://www.medscape.com/viewarticle/851528_1. По состоянию на апрель 2018 г.

Григоренко Э., Сталонс Д.Р. (5 октября 2016 г.). Устранение устойчивости к антибиотикам с помощью молекулярной диагностики. Клинические лабораторные продукты. Доступно на сайте http://www.clpmag.com/2016/10/addressing-antibiotic-resistance-molecular-diagnostics/. По состоянию на апрель 2018 г.

Syal, K. et al. (2017). Текущие и новые методы тестов на чувствительность к антибиотикам. Доступно на сайте https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5479269/. По состоянию на апрель 2018 г.

Форвик, Л. Дж. (От 26 января 2017 г.).Анализ чувствительности. MedlinePlus. Доступно на сайте https://medlineplus.gov/ency/article/003741.htm. По состоянию на апрель 2018 г.

Maurer, F. P. et al. (30 марта 2017 г.). Достижения в быстрой идентификации и тестировании на чувствительность бактерий в лаборатории клинкальной микробиологии: значение для ухода за пациентами и программы управления антимикробными препаратами. Сообщения об инфекционных заболеваниях. Доступно на сайте https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC53/. По состоянию на апрель 2018 г.

(обновлено 7 декабря 2017 г.).Вопросы и ответы о резистентности к антибиотикам. Центры по контролю и профилактике заболеваний. Доступно в Интернете по адресу https://www.cdc.gov/antibiotic-use/community/about/antibiotic-resistance-faqs.html. По состоянию на апрель 2018 г.

(© 1995-2018). Чувствительность к противомикробным препаратам, анаэробные бактерии, МПК. Медицинские лаборатории Мэйо. Доступно на сайте https://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/56031. По состоянию на апрель 2018 г.

Rifai, N. et al. (© 2018). Учебник Тиц по клинической химии и молекулярной диагностике, шестое издание. Устойчивость к противомикробным препаратам и рекомендации по тестированию основных бактериальных патогенов, стр. 173700014–173700024. Доступно в Интернете по адресу https://expertconsult.inkling.com/read/rifai-tietz-textbook-clinical-chemistry-molecular-diagnost-6e/chapter-75/antimicrobial-resistance-and. По состоянию на апрель 2018 г.

(обновлено 2 апреля 2018 г.). О лабораторных испытаниях и ресурсах AR. Центры по контролю и профилактике заболеваний. Доступно в Интернете по адресу https://www.cdc.gov/drugresistance/laboratories.html. По состоянию на апрель 2018 г.

(3 апреля 2018 г.). Сдерживая необычное сопротивление. Центры по контролю и профилактике заболеваний. Доступно в Интернете по адресу https://www.cdc.gov/vitalsigns/contain-unusual-resistance/index.html. По состоянию на апрель 2018 г.

Устойчивость к противомикробным препаратам. Ассоциация лабораторий общественного здравоохранения.Доступно в Интернете по адресу https://www.aphl.org/programs/infectious_disease/Pages/Antimicrobial-Resistance.aspx. По состоянию на апрель 2018 г.

Источники, использованные в предыдущих обзорах

Томас, Клейтон Л., редактор (1997). Циклопедический медицинский словарь Табера. Компания F.A. Davis, Филадельфия, Пенсильвания [18-е издание].

Пагана, Кэтлин Д. и Пагана, Тимоти Дж. (2001). Справочник Мосби по диагностике и лабораторным испытаниям, 5-е издание: Mosby, Inc., Сент-Луис, Миссури.

(апрель 2004 г.).Проблема устойчивости к антибиотикам. Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.niaid.nih.gov/factsheets/antimicro.htm.

(4 апреля 2003 г.). Устойчивость к антибиотикам, растущая угроза. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США [он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.fda.gov/oc/opacom/hottopics/anti_resist.html.

(19 февраля 2004 г.). Разумное использование антибиотиков. Mayoclinic.com, Центр инфекционных заболеваний [Он-лайн информация].Доступно в Интернете по адресу http://www.mayoclinic.com/invoke.cfm?id=FL00075.

(ноябрь 2003 г.). Информационный бюллетень о туберкулезе с множественной лекарственной устойчивостью. Американская ассоциация легких [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.lungusa.org/site/pp.asp?c=dvLUK9O0E&b=35815.

Брен, Л. (сентябрь 2003 г., исправленная). Битва ошибок: борьба с устойчивостью к антибиотикам. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, журнал FDA Consumer [Электронная информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.fda.gov/fdac/features/2002/402_bugs.html.

Клиническая диагностика и лечение Генри с помощью лабораторных методов. 21-е изд. Макферсон Р.А. и Пинкус М.Р., ред. Филадельфия: 2007, стр. 1048-1057.

(14 марта 2009 г.) Медицинская энциклопедия MedlinePlus. Анализ чувствительности. Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003741.htm. По состоянию на май 2009 г.

(6 августа 2007 г.). Станьте умнее: знайте, когда антибиотики работают, часто задаваемые вопросы. CDC [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/getsmart/index.html. По состоянию на июнь 2009 г.

Sutphen, S (30 августа 2007 г.). Устойчивость к антибиотикам в отделении неотложной помощи: первая линия защиты. Medscape CME [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/562056. Дата обращения 24.08.08.

Барклай, Л. (3 июля 2008 г.). Использование антибактериальных средств Medscape в домашних условиях может способствовать повышению устойчивости к микробам.Medscape Medical News [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/577055. По состоянию на июнь 2009 г.

Nicasio, A. et. al. (13 мая 2008 г.). Текущее состояние грамотрицательных бацилл с множественной лекарственной устойчивостью в Северной Америке. Medscape from Фармакотерапия [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/572674. По состоянию на июнь 2009 г.

(27 августа 2009 г.). Лечение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и широкой лекарственной устойчивостью: текущее состояние и перспективы на будущее.Медицинская информация Medscape Reuters [Электронная информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/706826. По состоянию на июнь 2009 г.

(© 1995-2013). Чувствительность к противомикробным препаратам, аэробные бактерии, МПК. Клиника Мэйо Медицинские лаборатории Мэйо [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Overview/8073. По состоянию на август 2013 г.

Форвик, Л. (Обновлено 22 января 2013 г.). Анализ чувствительности. Медицинская энциклопедия MedlinePlus [Он-лайн информация].Доступно в Интернете по адресу http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003741.htm. По состоянию на август 2013 г.

Hazen, K. (отредактировано в феврале 2013 г.). Тестирование на восприимчивость. Пособие Merck для специалистов здравоохранения [Он-лайн информация]. Доступно на сайте http://www.merckmanuals.com. По состоянию на август 2013 г.

Street, T. и Schmidt, S. (Обновлено 18 октября 2012 г.) Чувствительность к противомикробным препаратам. Справочник по Medscape [Он-лайн информация]. Доступно на сайте http: //emedicine.medscape.com / article / 2103786-overview. По состоянию на август 2013 г.

Бактериология мокроты и паттерн чувствительности к антибиотикам при обострении ХОБЛ в Индии

Резюме

Цель

Определить бактериологию обострений ХОБЛ у госпитализированных пациентов нашего института, оценить антибиотикограмму и корреляцию клинических и исследовательских профилей пациентов.

Дизайн

160 госпитализированных и клинически диагностированных случаев AECOPD были оценены по клиническим характеристикам, бактериологическому анализу мокроты и антибиотикограмме.

Результаты

Положительный результат посева мокроты наблюдался в 78 случаях (48,7%). S. pneumoniae (13%) был наиболее частым изолированным организмом. Однако в совокупности грамотрицательные бактерии (ГНБ) были преобладающим этиологическим агентом (35,7%). Среди GNB наиболее частым изолированным организмом была E. coli (9,4%), за ней следовала Acinetobacter (8.1%), P. aeruginosa (7,5%) и Klebsiella (6,3%). Spo ₂ <80% (p = 0,002) и слизисто-гнойная / гнойная мокрота (p <0,05) имели значительную связь с положительным результатом мокроты. S. pneumoniae, H. influenzae и M. catarrhalis были чувствительны к антибиотикам, таким как фторхинолоны, цефалоспорины, аминогликозиды и пиперациллин-тазобактам. Однако GNB показал значительную устойчивость (p <0,05) к указанным выше группам антибиотиков. Колистин и полимиксин B были единственными эффективными антибиотиками против всех изолированных организмов.

Заключение

При постоянно меняющейся бактериальной флоре AECOPD выбор антибиотика должен основываться на местной структуре резистентности бактерий. Периодические исследования для определения вероятных агентов и характера их чувствительности к антибиотикам помогут сформулировать экономически эффективную стратегию применения антибиотиков, снижающую возникновение лекарственной устойчивости.

Сокращения

AECOPD

Острое обострение хронической обструктивной болезни легких

ХОБЛ

Хроническая обструктивная болезнь легких

GNB

Грамм-отрицательные бактерии

GOLD

Глобальная инициатива по обструктивной болезни легких

H.Influenzae

Haemophilus influenzae

K. pneumoniae

Klebsiella pneumoniae

K. oxytoca

Klebsiella oxytoca

M. catarrhalis

Moraxella catarrhalis

P. aeruginosa

Pseudomonas SpOxygen aspOxygen

Pseudomonas SpOxygen Saturation

pneumoniae

Streptococcus pneumoniae

Ключевые слова

ХОБЛ

Обострение

Бактериология

Антибиотикограмма

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Цитирующие статьи

Повышенная устойчивость к противомикробным препаратам среди патогенов мокроты пациента

Введение

Распространенность диабета увеличивается и становится ведущей причиной заболеваемости и смертности среди неинфекционных заболеваний во всем мире. ^1,2 В Китае распространенность диабета среди взрослых составляет 11,6%, а преддиабета — 50,1%. ³ Было признано, что диабет является фактором риска ишемической болезни сердца и инсульта, в результате которых погибло 12 человек.9 миллионов человек во всем мире в 2010 году. ⁴ Считающийся не только основным фактором риска неинфекционных заболеваний, диабет также является фактором риска инфекций и ухудшения исходов инфекционных заболеваний, ^5,6, как указано при внебольничной пневмонии. ⁵ Продолжительность пребывания в больнице и увеличение смертности среди диабетиков, особенно среди лиц с плохим гликемическим контролем, по сравнению с недиабетиками. ⁶ Контроль уровня глюкозы имеет большое значение в клинической практике.⁷ Гипергликемия при поступлении ухудшает исход госпитализированных пациентов и увеличивает риск смерти. ^6,7

Enterococcus faecium , Staphylococcus aureus , Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp. являются ведущими возбудителями госпитальных инфекций. ⁸ Устойчивость бактерий к антибиотикам стала неотложной глобальной угрозой, особенно с появлением множественной лекарственной устойчивости, широкой лекарственной устойчивости и даже устойчивости к пандлекарственным препаратам.⁹ Возникновение устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) повергло общественность в панику, поскольку доступные в настоящее время антибиотики могут оказаться неэффективными для лечения инфекций, вызванных этими микроорганизмами. ¹⁰ Сообщается о росте заболеваемости, смертности и продолжительности пребывания в больнице, связанных с УПП. ^11,12 По сравнению с инфекцией, вызванной чувствительными к антибиотикам организмами, более высокие медицинские расходы и продолжительность пребывания в больнице также связаны с устойчивостью к антибиотикам. ^12,13 Микроорганизмы, устойчивые к антибиотикам, в настоящее время представляют собой серьезную проблему для глобальной системы здравоохранения.¹⁴

Однако мнения предыдущих исследований о том, увеличивает ли диабет риск AMR среди госпитализированных пациентов, расходятся. ^14,15 Тиан и др. ¹⁴ обнаружили более высокую частоту УПП среди пациентов с диабетом, у которых был диагностирован абсцесс печени, в то время как другое исследование показало, что частота устойчивых к карбапенемам K. pneumoniae была ниже среди диабетиков, чем у тех, кто не страдает диабетом. пациенты. ¹⁵ Однако мало что известно о показателях устойчивости бактерий, выделенных от пациентов с нормогликемией или гипергликемией при поступлении.Здесь мы провели ретроспективное исследование с целью описания распределения бактерий у пациентов с нормогликемией, гипергликемией или диабетом и оценки чувствительности к противомикробным препаратам бактерий, выделенных из мокроты, что добавило прямых доказательств в эту область.

Методы

Дизайн исследования

Ретроспективное исследование было проведено среди взрослых пациентов из Китая хань, госпитализированных в больницу Жуйцзинь, третичную больницу в Шанхае, Китай. С января 2015 г. по март 2017 г. у всех пациентов были выявлены положительные результаты определения бактерий в мокроте.Была собрана информация о патогенах, выделенных из мокроты, и патогенах из других образцов, таких как кровь и гной. Дублированные изоляты из нестерильной жидкости организма одного и того же пациента были исключены. Клиническая информация, включая демографические данные и результаты клинической микробиологии, была собрана путем поиска в медицинских записях. Письменное информированное согласие было получено от пациентов или родственников первой степени родства. Исследование было одобрено Комитетом по этике больницы Жуйцзинь Медицинской школы Шанхайского университета Цзяо Тонг.

Сбор данных

Вся информация о включенных пациентах была найдена в таблицах. Заболевания легких относятся к хроническим легочным заболеваниям легких, легочному бронхиту и бронхоэктазам. Сердечно-сосудистые заболевания — это инфаркт мозга, инфаркт миокарда или другие ишемические заболевания сердца и головного мозга в анамнезе. Диагноз диабета: уровень глюкозы в плазме натощак ≥7 ммоль / л, глюкоза в плазме через 2 часа ≥11,1 ммоль / л во время перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT), случайный уровень глюкозы в плазме ≥11.1 ммоль / л при классических симптомах гипергликемии или HbA ₁ _c ≥6,5%. ¹⁶ Включенные пациенты были разделены на две группы в соответствии с историей диабета, а пациенты без диабета были затем разделены на две группы: нормальные (уровень глюкозы в плазме натощак <6,1 ммоль / л или 2-часовой уровень глюкозы в плазме <7,8 ммоль / л на OGTT без диагностированного диабета) или повышенного уровня глюкозы (глюкоза в плазме натощак ≥6,1 ммоль / л или 2-часовая глюкоза в плазме ≥7,8 ммоль / л на OGTT без диабета в анамнезе) при поступлении.Глюкозу в плазме крови тестировали с помощью автоматизированной системы (Advia 1650; Bayer) с использованием метода глюкозооксидазы.

Идентификация изолята и тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам

Все изоляты идентифицировали с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией и ионизацией с использованием матрицы (BioMérieux, Marcy-l’Etoile, Франция). Тест на чувствительность к противомикробным препаратам определялся с помощью дисковой диффузии Кирби-Бауэра и Е-тестов в соответствии с критериями Института клинических и лабораторных стандартов.Продукция β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) была идентифицирована по синергии с клавулановой кислотой. Escherichia coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 29213, Staphylococcus pneumoniae ATCC 49619, Enterococcus faecalis ATCC 29212 и Haemophilus influenzae были использованы для контроля качества Haemophilus influenzae .

Статистический анализ

Весь статистический анализ проводился с помощью SAS 9.4 (Институт SAS, США).Данные описываются как медианы (IQR) для непрерывных переменных и числа (в процентах) для категориальных переменных. ANOVA проводился для непрерывных переменных, когда вычисления были нормально распределенными и равными в дисперсионном анализе, а если нет, то меняли на непараметрическую статистику. Для категориальных переменных использовался точный критерий Фишера или χ ². Было проведено сравнение пациентов с диабетом и недиабетом или пациентов с нормогликемией или гипергликемией при поступлении.Двусторонний p <0,05 считался статистически значимым.

Результаты

Демографические характеристики

Всего было включено 1163 пациента: 582 с нормогликемией, 292 с гипергликемией и 289 с диабетом. Было 178 женщин в группе нормогликемии (30,6%), 83 в группе гипергликемии (28,4%) и 100 в группе диабета (34,6%), и никакой значимости по полу в трех группах обнаружено не было. Как показано в таблице 1, пациенты с диабетом были старше нормальных или страдали гипергликемией (68, IQR 60–78; 66, IQR 54.5–77; и 65, IQR 55–76 соответственно). Средний ИМТ составил 22 (IQR 19,4–24,2) кг / м ² в группе нормогликемии, 23,2 (IQR 20,2–25,7) кг / м ² в группе гипергликемии и 24 (IQR 21,2–26,8) кг / м2. ² у диабетиков 33,9% пациентов с нормогликемией имели артериальную гипертензию, в то время как это было 40,1% среди пациентов с гипергликемией и 58,5% среди диабетиков. Для сердечно-сосудистых заболеваний он составил 18,9% для пациентов с нормогликемией, 19,5% для пациентов с гипергликемией и 36.0% при диабете. Не было обнаружено значимости курения, употребления глюкокортикоидов, предшествующей госпитализации или воздействия антибиотиков среди трех групп.

Таблица 1 Демография пациентов в трех группах

С точки зрения лечения и прогноза инкубация центрального венозного катетера чаще выявлялась у пациентов с гипергликемией, чем у пациентов с нормогликемией или диабетом (22,3% против 11.9% против 8,0%), а у пациентов с гипергликемией частота искусственной вентиляции легких была выше, чем у пациентов с нормогликемией или диабетом. Для дальнейшего исследования также были проанализированы поступление в ОИТ и выживаемость. Мы обнаружили, что госпитализация в ОИТ гораздо чаще встречалась у диабетиков, чем у пациентов с гипергликемией или нормогликемией (17,7% против 15,4% против 10,7%), а самая низкая выживаемость наблюдалась среди пациентов с гипергликемией при поступлении (71,6%).

Распространение бактерий

Всего от пациентов было выделено 2167 патогенов: 1616 недубликатных бактерий, идентифицированных в образцах мокроты, и 551 бактерия в образцах, не являющихся образцами мокроты (Таблица 2).В образцах мокроты и непротеинов наиболее частыми изолированными патогенами были грамотрицательные палочки, включая Enterobacteriaceae, A. baumannii и P. aeruginosa , тогда как S. aureus имели наибольшую долю среди грамположительных кокков. Самый высокий уровень выявления Enterobacteriaceae (39,3%) был у диабетиков, в то время как самый высокий процент для A. baumannii (21,6%) и S. aureus (25,5%) был обнаружен у пациентов с гипергликемией, хотя значимость не была обнаружена. для последних двух видов между пациентами с диабетом или без него.Кроме того, K. pneumoniae был доминирующим патогеном среди Enterobacteriaceae для всех трех групп. Что касается количества бактерий, выделенных от каждого пациента, мы обнаружили, что 74,6% пациентов с повышенным уровнем глюкозы имели тенденцию нести более одного изолята, за которыми следовали пациенты с диабетом (68,3%).

Таблица 2 Распределение изолята между тремя группами

Для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам, уровень множественной лекарственной устойчивости K.pneumoniae (MDR-KP) была самой высокой среди пациентов с гипергликемией при поступлении и выше, чем в группе с нормальным уровнем глюкозы (62,1% против 35,1%, p <0,001). Процентное соотношение MDR A. baumannii (MDR-AB) и MDR P. aeruginosa (MDR-PA) было довольно высоким среди всех пациентов, независимо от уровня глюкозы при поступлении или диабетического статуса, хотя для MDR не было продемонстрировано статистической значимости. -AB или MDR-PA среди трех групп. Аналогично тенденции для MDR-KP, метициллин-устойчивый S.aureus (MRSA) была самой высокой долей среди пациентов с гипергликемией (73,8%), за ней следовали диабетики (71,2%).

Чувствительность бактерий мокроты к противомикробным препаратам

K. pneumoniae, S. aureus , A. baumannii и P. aeruginosa были наиболее частыми бактериями, выделенными в настоящем исследовании, и результаты определения чувствительности к противомикробным препаратам для этих видов, выделенных из мокроты, подробно описаны. Как показано в Таблице 2, K. pneumoniae был наиболее частым патогеном, обнаруженным среди Enterobacteriaceae.Мы провели дальнейшее исследование чувствительности K. pneumoniae из образцов мокроты, чтобы получить более глубокое понимание, как показано в таблице 3, и было обнаружено, что 20% K. pneumoniae вырабатывают БЛРС. По сравнению с K. pneumoniae от пациентов с нормальным уровнем глюкозы, устойчивость к цефемам, монобактамам, хинолонам, аминогликозидам и карбапенемам K. pneumoniae от пациентов с гипергликемией при поступлении была увеличена. 35,6% из K. pneumoniae от пациентов с повышенным уровнем глюкозы были устойчивы к имипенему и 35.9% не восприимчивы к меропенему, что значительно выше, чем у пациентов с нормальным уровнем глюкозы ( p = 0,002 и p = 0,003, соответственно). Общий уровень устойчивости K. pneumoniae к эртапенему был выше, чем к меропенему и имипенему, хотя статистической значимости между этими тремя группами не было достигнуто. Для тигециклина, последнего доступного препарата для лечения карбапенем-резистентного K. pneumoniae , не было обнаружено значимости между пациентами с диабетом или без него и пациентами с нормальным или повышенным уровнем глюкозы.Уровень резистентности K. pneumoniae у пациентов с повышенным уровнем глюкозы составлял 5,8%, что незначительно выше, чем у других пациентов. Что касается уровня резистентности всех протестированных агентов, не было продемонстрировано статистической значимости среди пациентов с различным статусом метаболизма глюкозы.

Таблица 3 Уровень устойчивости к антибиотикам K. pneumoniae , выделенный из мокроты

А.baumannii был вторым по распространенности патогеном в текущем исследовании, и уровень резистентности в целом был высоким для этих изолятов (Таблица 4). Для протестированных противомикробных препаратов, за исключением левофлоксацина, тигециклина и аминогликозидов, самый высокий уровень резистентности был отмечен среди пациентов с гипергликемией при поступлении, за которыми следовали пациенты с нормальным уровнем глюкозы и без диабета, а изоляты A. baumannii от пациентов с диабетом показали самый низкий уровень резистентности. (Таблица 4). А.baumannii , выделенный от пациентов с диабетом, показал статистически более низкую резистентность к ампициллину-сульбактаму, чем у недиабетиков ( p = 0,010).

Таблица 4 Уровень устойчивости к антибиотикам A . baumannii Выделено из мокроты

Для P. aeruginosa резистентность варьировала, поскольку пациенты имели разный статус глюкозы (таблица 5). Показатели нечувствительности к фосфомицину и карбапенемам были выше, чем к другим агентам.Самая высокая устойчивость к имипенему была обнаружена среди P. aeruginosa , выделенных от пациентов с диабетом (34,3%), в то время как для меропенема это было обнаружено среди изоляций P. aeruginosa от пациентов с нормальным уровнем глюкозы (32,1%). Никакой значимости не было продемонстрировано ни для одного из тестируемых агентов среди трех групп.

Таблица 5 Уровень устойчивости к антибиотикам P . aeruginosa Выделено из мокроты

С.aureus был преобладающим видом среди грамположительных кокков, среди которых MRSA занимал две трети, а чувствительный к метициллину S. aureus (MSSA) около трети (219 против 112, таблица 6). Для всех протестированных противомикробных препаратов уровень устойчивости к MRSA был намного выше, чем к MSSA. MSSA от пациентов с диабетом, как правило, проявлял более высокую устойчивость к левофлоксацину, чем от пациентов без диабета ( p = 0,006). Не было достигнуто значимости для MRSA среди лиц с различным статусом глюкозы с точки зрения лекарственной устойчивости.Ни один из этих изолятов не оказался устойчивым к ванкомицину, линезолиду или тейкопланину.

Таблица 6 Уровень устойчивости к антибиотикам S . aureus Изолировано из мокроты

Обсуждение

AMR представляет собой угрожающий кризис во всем мире и представляет собой серьезную проблему для людей во всем мире. Увеличение УПП требует глубоких знаний об эпидемиологии и потенциальных факторах риска в этой области, чтобы мы могли лучше контролировать ситуацию.Было признано, что предшествующее воздействие противомикробных препаратов, проживание в медицинских учреждениях и госпитализация в ОИТ являются факторами риска учащения случаев УПП.

При значительном увеличении заболеваемости за последние несколько десятилетий диабет затронул около 463 миллионов человек во всем мире в 2019 году. ¹⁷ Диабет всегда считается фактором риска во время инфекции. Контроль уровня глюкозы имеет большое значение в клинической практике. Гипергликемия связана с ухудшением исходов и является фактором риска внутрибольничной смертности.⁷ Это первое известное нам исследование, в котором основное внимание уделяется взаимосвязи между УПП и уровнем глюкозы при поступлении. Мы обнаружили, что AMR зависит от уровня глюкозы при поступлении. Пациенты с гипергликемией с большей вероятностью были носителями более одной бактерии, что намного выше, чем у пациентов с нормальным уровнем глюкозы, и такая же тенденция была обнаружена у пациентов с диабетом по сравнению с пациентами без диабета. Более того, MDR-KP был гораздо более распространен у пациентов с гипергликемией при поступлении, а самый высокий уровень MRSA был также обнаружен у пациентов с гипергликемией.

Что касается обычных видов бактерий, Enterobacteriaceae, A . baumannii , P. aeruginosa и S. aureus — распространенные патогены, вызывающие инфекции в клинической практике, — также были наиболее распространенными патогенами, обнаруженными в текущем исследовании. Кроме того, распределение этих бактерий значительно различалось между бактериями, изолированными от пациентов с гипергликемией или без нее при поступлении. Enterobacteriaceae составляли самую высокую долю среди всех изолятов, а K.pneumoniae была основным патогеном среди энтеробактерий для всех пациентов, независимо от статуса метаболизма глюкозы. Не было обнаружено значимости ни для распределения бактерий, выделенных от пациентов с диабетом или без него, ни для количества пациентов, несущих более одного изолята между двумя группами. Все это указывает на то, что гипергликемия при поступлении играет гораздо более важную роль в распространении бактерий и УПП, и это первое исследование, которое предоставило доказательства связи между УПП и метаболизмом глюкозы.

K. pneumoniae был наиболее часто обнаруживаемым видом среди Enterobacteriaceae. В то же время устойчивость к большинству противомикробных препаратов, включая имипенем и меропенем, была самой высокой в группе гипергликемии. Карбапенемы служат антибиотиками последней линии для лечения бактерий, не чувствительных к антибиотикам широкого спектра действия. ¹⁸ В континентальном Китае устойчивость K. pneumoniae к меропенему и имипенему увеличилась с 2,6% до 13,4% и с 2,4% до 10,5% соответственно.¹⁹ В этом исследовании мы обнаружили, что уровень устойчивости K. pneumoniae к карбапенемам, обнаруженный среди гипергликемии, был выше, чем общий уровень, зарегистрированный в материковом Китае с 2005 по 2014 год, ¹⁹, что подчеркивает важность оценки уровня глюкозы в крови. прием и проверка перевозки K. pneumoniae . Обнадеживает тот факт, что устойчивость к тигециклину в изолятах K. pneumoniae была низкой, и не было достигнуто никакого значения для трех групп в нашем исследовании, поэтому тигециклин может быть альтернативой для борьбы с инфекцией, вызванной устойчивым к карбапенемам K.Пневмония . ²⁰ Меньшее воздействие тигециклина может быть потенциальным объяснением, но это должно быть дополнительно изучено в рамках хорошо спланированного исследования.

Для A. baumannii и P. aeruginosa , двух других распространенных видов патогенов, выделенных из мокроты в текущем исследовании, МЛУ для всех групп был высоким, а для большинства лекарств не было обнаружено статистической значимости. Самый высокий уровень устойчивости к карбапенемам A. baumanni был обнаружен среди A.baumanni , изолированного от пациентов с гипергликемией, и он был намного выше, чем у P. aeruginosa и K. pneumoniae , что также представляло огромную угрозу для стационарных пациентов. ²¹ Высокий уровень устойчивости у A. baumannii соответствовал зарегистрированному среднему уровню по стране, ¹⁹, что указывает на появление устойчивости широкого спектра у A. baumannii , как и в предыдущем исследовании. ²² Мокрота P. aeruginosa в нашем исследовании продемонстрировала более высокий уровень резистентности, чем сообщалось в эпидемиологии, ¹⁹, и самый высокий уровень всегда наблюдался среди пациентов с гипергликемией.Структурные заболевания легких, такие как хронические обструктивные заболевания легких или бронхоэктазы, представляют собой риск для колонизации P. aeruginosa , ²³, и почти у 20% пациентов в настоящем исследовании наблюдались сопутствующие хронические заболевания легких.

В нашем исследовании MRSA имел более высокий процент среди пациентов с гипергликемией или диабетом, чем у людей с нормогликемией. Устойчивость к метициллину в текущем исследовании также была выше, чем в нашей стране. ¹⁹ Было обнаружено, что носовое носительство S.aureus выше у диабетиков. ²⁴ Сообщалось о повышенном риске внебольничной бактериемии S. aureus среди пациентов с диабетом, особенно среди пациентов с длительной продолжительностью, плохим гликемическим контролем и осложнениями диабета. ²⁴ Более того, гипергликемия увеличивает риск респираторных инфекций, вызываемых S. aureus , ^6,25, а индуцированный гипергликемией рост бактерий может быть подавлен путем модификации потока глюкозы в эпителий дыхательных путей, изменяемого метформином.²⁶

Феномен того, что уровни резистентности для K. pneumoniae и S. aureus выше среднего уровня по нашей стране, могут быть объяснены тем, что среди первоклассных больниц условия пациентов у нас всегда тяжелые. Общее количество чувствительных к противомикробным препаратам изолятов для каждого препарата варьировалось в этом ретроспективном клиническом исследовании, но наши результаты являются важным показателем того, что пациенты подвергаются высокому риску переноса устойчивых к антибиотикам бактерий, особенно с гипергликемией при поступлении, что требует особого внимания. и первоначальный скрининг среди них микроорганизмов.Кроме того, у пациентов с гипергликемией была более высокая частота искусственной вентиляции легких и инкубации центрального венозного катетера наряду с повышенным AMR. Пациенты с гипергликемией или диабетом имели более высокий уровень госпитализации и госпитальной смертности. Причинно-следственная связь, связывающая высокую устойчивость к антибиотикам и худшие исходы у пациентов с гипергликемией или диабетом, должна быть дополнительно изучена в проспективных исследованиях.

В текущем исследовании есть несколько ограничений. Во-первых, это было ретроспективное исследование, посвященное устойчивости микроорганизмов в нозокомиальном контексте, при котором колонизация не отличалась от инфекции.Бактерии были идентифицированы автоматизированной системой Vitek 2, как указано в разделе «Методы». Было бы полезно, если бы бактериальные изоляты были идентифицированы с помощью 16sРНК, а минимальная ингибирующая концентрация определялась разведением в агаре или микроразбавлением бульона. Кроме того, ESBL не обсуждалась глубоко. Наконец, это было одноцентровое исследование, которое проводилось только в нашей больнице. Хорошо спланированные многоцентровые исследования необходимы для определения распространенности УПП среди пациентов с гипергликемией или диабетом и потенциальной связи между УПП бактериальной и внутрибольничной смертностью.

В заключение, настоящее исследование предоставляет исчерпывающую информацию о распределении бактерий и степени резистентности среди изолятов мокроты, включая K. pneumoniae и S. aureus , для пациентов с гипергликемией или ранее диагностированным диабетом. Полученные данные имеют первостепенное значение для клинических призывов к целенаправленным усилиям по дифференцированию пациентов с гипергликемией при поступлении или с предыдущим диагнозом диабета от пациентов с нормогликемией, поскольку они предрасположены к переносчикам резистентных бактерий.

Благодарности

Аннотация этой статьи — «Повышенная устойчивость к противомикробным препаратам среди возбудителей мокроты у пациентов с гипергликемией: ретроспективное исследование, проведенное в больнице в Шанхае» — была представлена на конференции Американского общества торакса (2019) в качестве постерной презентации с промежуточными результатами.

Взносы авторов

Все авторы участвовали в анализе данных, составлении или редактировании статьи, окончательно одобрили версию, которая будет опубликована, и согласны нести ответственность за все аспекты работы.

Финансирование

Исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFC1309701 и 2017YFC1309700), Национальным фондом естественных наук Китая (81570029), Шанхайской ключевой дисциплиной респираторных заболеваний (2017ZZ02014) и инновационными исследовательскими группами местных университетов высокого уровня. Шанхай.

Раскрытие

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в данной работе.

Список литературы

1. Лозано Р., Нагави М., Форман К. и др.Глобальная и региональная смертность от 235 причин смерти для 20 возрастных групп в 1990 и 2010 годах: систематический анализ для исследования Global Burden of Disease Study 2010. Lancet . 2012. 380 (9859): 2095–2128. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (12) 61728-0

2. Группа IDFDA. Обновление данных о смертности от диабета для Атласа диабета IDF: оценки за 2013 год. Diabetes Res Clin Pract . 2015; 109 (3): 461–465. DOI: 10.1016 / j.diabres.2015.05.037

3. Xu Y, Wang L, He J, et al.Распространенность и контроль диабета у взрослых китайцев. ЯМА . 2013; 310 (9): 948–959. DOI: 10.1001 / jama.2013.168118

4. Мюррей С.Дж., Вос Т., Лозано Р. и др. Годы жизни с поправкой на инвалидность (DALY) для 291 заболевания и травмы в 21 регионе, 1990–2010 гг., Систематический анализ для исследования глобального бремени болезней 2010 г. Lancet . 2012; 380 (9859): 27. DOI: 10.1016 / S0140-6736 (12) 61689-4

5. Lepper PM, Ott S, Nuesch E, et al. Уровни глюкозы в сыворотке для прогнозирования смерти у пациентов, госпитализированных по поводу внебольничной пневмонии: проспективное когортное исследование. BMJ . 2012; 344: e3397. DOI: 10.1136 / bmj.e3397

6. Baker EH, Janaway CH, Philips BJ, et al. Гипергликемия связана с плохими исходами у пациентов, госпитализированных с обострениями хронической обструктивной болезни легких. Грудь . 2006. 61 (4): 284–289. DOI: 10.1136 / thx.2005.051029

7. Umpierrez GE, Isaacs SD, Bazargan N, You X, Thaler LM, AE K. Гипергликемия — независимый маркер внутрибольничной смертности у пациентов с недиагностированным диабетом. Дж Клин Эндокринол Метаб . 2002; 87 (3): 5. DOI: 10.1210 / jcem.87.3.8341

8. Сантаджит С., Индраваттана Н. Механизмы устойчивости к противомикробным препаратам у возбудителей ESKAPE. Биомед Рес Инт . 2016; 2016: 2475067. DOI: 10.1155 / 2016/2475067

9. Гайдач М. Концепция идеального антибиотика: значение для разработки лекарств. Молекулы . 2019; 24: 5. DOI: 10.3390 / молекулы24050892

10. Магиоракос А.П., Сринивасан А., Кэри Р.Б. и др. Бактерии с множественной лекарственной устойчивостью, широкой лекарственной устойчивостью и устойчивостью к пандемиям: предложение международного эксперта по временным стандартным определениям приобретенной устойчивости. Clin Microbiol Инфекция . 2012. 18 (3): 268–281. DOI: 10.1111 / j.1469-0691.2011.03570.x

11. Barrasa-Villar JI, Aibar-Remón C, Prieto-Andrés P, et al. Влияние устойчивых микроорганизмов на заболеваемость, смертность и продолжительность госпитальных инфекций. Клиническая инфекция . 2017; 65 (4): 644–652. DOI: 10.1093 / cid / cix411

12. Neidell MJ, Cohen B., Furuya Y, et al. Стоимость инфекций, связанных с здравоохранением и населением, с устойчивыми к противомикробным препаратам и чувствительными к противомикробным препаратам. Клиническая инфекция . 2012. 55 (6): 807–815. DOI: 10.1093 / cid / cis552

13. Маулдин П.Д., Сальгадо С.Д., Хансен И.С. и др. Связанные с больничными расходами и продолжительностью пребывания, связанные с инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи, вызванными устойчивыми к антибиотикам грамотрицательными бактериями. Противомикробные агенты Chemother . 2010. 54 (1): 109–115. DOI: 10.1128 / AAC.01041-09

14. Tian LT, Yao K, Zhang XY, et al. Абсцессы печени у взрослых пациентов с сахарным диабетом и без него: анализ клинических характеристик, характеристик возбудителей, исходов и предикторов летальности: отчет, основанный на ретроспективном исследовании большой популяции в Китае. Clin Microbiol Инфекция . 2012; 18 (9): E314–30. DOI: 10.1111 / j.1469-0691.2012.03912.x

15. Тиан Л., Тан Р., Чен Ю. и др. Эпидемиология Klebsiella pneumoniae инфекций кровотока в учебной больнице: факторы, связанные с устойчивостью к карбапенемам и смертностью пациентов. Противомикробная защита от инфекций . 2016; 5: 48. DOI: 10.1186 / s13756-016-0145-0

16. Американский диабет A2. Классификация и диагностика диабета: стандарты оказания медицинской помощи при диабете-2018. Уход за диабетом . 2018; 41 (Приложение 1): S13 – S27.

17. http://www.diabetesatlas.org.

18. Gupta N, Limbago BM, Patel JB, et al. Карбапенем-устойчивые Enterobacteriaceae: эпидемиология и профилактика. Клиническая инфекция . 2011; 53 (1): 60–67. DOI: 10.1093 / cid / cir202

19. Hu FP, Guo Y, Zhu DM, et al. Тенденции развития резистентности среди клинических изолятов в Китае, полученные в результате эпиднадзора за бактериальной резистентностью CHINET, 2005–2014 гг. Clin Microbiol Инфекция .2016; 22 (Приложение 1): S9–14. DOI: 10.1016 / j.cmi.2016.01.001

20. Tzouvelekis LS, Markogiannakis A, Psichogiou M, et al. Карбапенемазы в Klebsiella pneumoniae и других Enterobacteriaceae: развивающийся кризис глобального масштаба. Clin Microbiol Ред. . 2012. 25 (4): 682–707. DOI: 10.1128 / CMR.05035-11

21. Погу Дж. М., Манн Т., Барбер К. Э., Устойчивый к карбапенемам KSK. Acinetobacter baumannii Эпидемиология, надзор и лечение. Expert Rev Anti Infect Ther .2013; 11 ((4: 383–393. Doi: 10.1586 / eri.13.14

22. Потрон А., Пойрел Л., Нордманн П. Возникающая устойчивость широкого спектра действия у Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii : механизмы и эпидемиология. Int J Антимикробные агенты . 2015; 45 (6): 568–585. DOI: 10.1016 / j.ijantimicag.2015.03.001

23. Манделл Л.А., Вундеринк Р.Г., Анзуэто А. и др. Общество инфекционных болезней Америки / Американское торакальное общество согласовали руководящие принципы ведения внебольничной пневмонии у взрослых. Клиническая инфекция . 2007; 44 (Приложение 2): S27–72.

24. Смит Дж., Согаард М., Шёнхейдер Х. С., Нильсен Х., Фрёслев Т., Р. В. Т. Диабет и риск внебольничной бактериемии Staphylococcus aureus. Популяционное исследование методом случай-контроль. Eur J Эндокринол . 2016; 174 (5): 9. DOI: 10.1530 / EJE-16-0023

25. Филипс Б.Дж., Редман Дж., Бреннан А. и др. Глюкоза в бронхиальном аспирате увеличивает риск респираторного MRSA у интубированных пациентов. Грудь . 2005. 60 (9): 761–764.DOI: 10.1136 / thx.2004.035766

26. Garnett JP, Baker EH, Naik S, et al. Метформин снижает проницаемость дыхательных путей для глюкозы и снижает нагрузку на Staphylococcus aureus , вызванную гипергликемией, независимо от воздействия на уровень глюкозы в крови. Грудь . 2013. 68 (9): 835–845. DOI: 10.1136 / thoraxjnl-2012-203178

Бактериальная этиология мокроты от больных с подозрением на туберкулез и антибиотикограмма изолятов | BMC Research Notes

Thomas M, Bomar P, Koutsothanasis GA.Инфекция верхних дыхательных путей. Остров сокровищ: StatPearls Publishing; 2019. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK532961/.

Акан О.А., Ахмед К., Нагатаке Т., Озилмаз Э., Гулхан М. Основные бактерии внебольничных инфекций дыхательных путей в Турции. Jpn J Infect Dis. 2005; 58: 50–2.

PubMed

Google Scholar

Уокер П., Уайт Д. Болезнь легких. Med Clin North Am. 1996; 80: 1337–62.

CAS
Статья

Google Scholar

Attia EF, Pho Y, Nhem S, Sok C, By B, Phann D и др. Туберкулез и другие бактериальные сочетанные инфекции в Камбодже: ретроспективное перекрестное исследование в едином центре. BMC Pulm Med. 2019; 19: 1–7.

Артикул

Google Scholar

Лангбанг А., Дека Н., Рахман Х., Калита Д. Исследование бактериальных патогенов, вызывающих вторичные инфекции у пациентов, страдающих туберкулезом, и их характера чувствительности к антибиотикам. Int J Curr Microbiol Appl Sci.2016; 5: 197–203.

CAS
Статья

Google Scholar

Ngekeng S, Pokam B, Meriki H, Njunda A, Assob J, Ane-Anyangwe I. Высокая распространенность бактериальных патогенов в мокроте пациентов с подозрением на туберкулез в Буэа. Br Microbiol Res J. 2015; 11: 1–8.

Артикул

Google Scholar

Илиясу Г., Мохаммад А.Б., Якасай А.М., Дайяб FM, Одух Дж., Хабиб АГ. Грамотрицательные бациллы являются основной причиной вторичной пневмонии у пациентов с туберкулезом легких: данные перекрестного исследования в больнице третичного уровня в Нигерии.Trans R Soc Trop Med Hyg. 2018; 112: 252–4.

Артикул

Google Scholar

Davis CP. Нормальная флора. В кн .: Медицинская микробиология. Эдинбург: Эльзевир; 1996.

Google Scholar

Adhikari S, Khadka S, Rana JC, Baniya S, Poudel S, Chapagain A, et al. Распространенность β-лактамаз, продуцирующих устойчивые к карбапенему энтеробактерии, среди пациентов, посещающих больницу Бхаратпура.Biosci Discov. 2019; 10: 64–71.

Google Scholar

10.

Бертран X, Хоке Д. Устойчивость к антибиотикам: причины и решения. EJHP Pract. 2011; 17: 58–9.

Google Scholar

11.

Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Диагностическая микробиология. Сент-Луис: Мосби; 2007.

Google Scholar

12.

Институт клинических лабораторных стандартов (CLSI).Стандарты эффективности тестирования чувствительности к противомикробным препаратам. В: 24-е информационное приложение (M100-S28) Wayne. 2016.

13.

Hana J, Chena D, Lic S, Lia X, Zhoud WW, Zhangb B, et al. Чувствительность к антибиотикам потенциально пробиотических штаммов Lactobacillus . Ital J Food Sci. 2015; 27: 282–9.

Google Scholar

14.

Параджули Н.П., Махарджан П., Джоши Г., Ханал ПР. Возникающие опасности клинических изолятов Enterobacteriaceae, продуцирующих β-лактамазу расширенного спектра, в учебной больнице Непала.Biomed Res Int. 2016. https://doi.org/10.1155/2016/1782835.

Артикул
PubMed
PubMed Central

Google Scholar

15.

Samaha-Kfoury JN, Araj GF. Последние разработки в области лактамаз и лактамаз расширенного спектра действия. BMJ. 2003. 327: 1209–13.

CAS
Статья

Google Scholar

16.

Nazi SA, Campus G. Распространенность и антибиотикограмма видов pseudomonas, вызывающих вторичные инфекции среди пациентов с туберкулезом легких.IntI Chem Pharm Med J. 2005; 2: 231–7.

Google Scholar

17.

Chevalier S, Bouffartigues E, Bodilis J, Maillot O, Lesouhaitier O, Feuilloley MGJ, et al. Структура, функция и регуляция поринов Pseudomonas aeruginosa . FEMS Microbiol Rev.2017; 41: 698–722.

CAS
Статья

Google Scholar

18.

Akingbade OA, Ogiogwa JI, Okerentugba PO, Innocent-Adiele H, Nwanze J, Okonko I., et al.Распространенность и чувствительность к антибиотикам бактериальных агентов, вызывающих инфекции нижних дыхательных путей, в Абеокуте, штат Огун, Нигерия. Rep Opin. 2012; 4: 25–30.

Google Scholar

19.

Эгбагбе Э., Морди Р. Этиология инфекции нижних дыхательных путей в Бенин-Сити, Нигерия. J Med Biomed Res. 2009; 5: 22–7.

Артикул

Google Scholar

20.

Hasan AZ, Al-sulami A, Al-taee A.Грамположительные и грамотрицательные бактерии из мокроты пациентов с клиническим подозрением на туберкулез. Int J Curr Res. 2015; 7: 14289–91.

CAS

Google Scholar

21.

Egbe CA, Ndiokwere C, Omoregie R. Микробиология инфекций нижних дыхательных путей в городе Бенин, Нигерия. Malays J Med Sci. 2011; 18: 27–31.

PubMed
PubMed Central

Google Scholar

22.

Sia JK, Rengarajan J. Иммунология инфекций Mycobacterium tuberculosis Джонатан. Microbiol Spectr. 2019; 176: 139–48.

Google Scholar

23.

Покхрел Б.М., Койрала Дж., Мишра С.К., Дахал РК, Хадга П., Туладхар Н.Р. Штаммы, продуцирующие бета-лактамазу с множественной лекарственной устойчивостью и расширенным спектром действия, вызывают инфекции нижних дыхательных путей и мочевыводящих путей. J Inst Med. 2006; 28: 19–27.

Google Scholar

24.

Thapa P, Bhandari D, Shrestha D., Parajuli H, Chaudhary P, Amatya J, et al. Больничное наблюдение за грамотрицательными бактериями, продуцирующими металло-бета-лактамазу, в Непале с помощью метода диска имипенема-ЭДТА. BMC Res Notes. 2017; 10: 1–6.

CAS
Статья

Google Scholar

25.

Ehondor TO, Ogefere HO, Ibadin EE. Обнаружение изолятов грамотрицательных бактерий, продуцирующих металло-β-лактамазу, у пациентов с инфекциями нижних дыхательных путей в больнице третичного уровня в Бенин-Сити, Нигерия.J Med Lab Sci. 2019; 29: 21–8.

Google Scholar

Сравнение мокроты и бронхоскопии для диагностики биопленок синегнойной палочки при муковисцидозе

Реферат

Авторы выдвинули гипотезу, что при бронхоскопии с защищенной щеткой для образцов можно выявить образующие биопленку бактерии, прикрепленные к стенке дыхательных путей, в то время как традиционный сбор мокроты — нет.

Pseudomonas aeruginosa , полученная из мокроты, бронхоальвеолярного лаважа и защищенной щетки, взятых из правого верхнего бронха легкого 12 взрослых пациентов с муковисцидозом.Извлеченные бактерии были генотипированы и выращены в планктонных культурах и в виде биопленок, и была определена восприимчивость к отдельным антибиотикам и к комбинациям антибиотиков.

Бактериальные культуры, полученные с помощью бронхоскопии, не дали новых штаммов бактерий, которые также не были обнаружены в мокроте. Всего у 10 пациентов (83%) был обнаружен единственный штамм P. aeruginosa с использованием мокроты, бронхоальвеолярного лаважа и методов защищенной щетки, а у двух пациентов (17%) два штамма были выделены в мокроте, но только один штамм был восстановлен. с помощью бронхоскопических методик.Чувствительность к отдельным антибиотикам и к комбинациям антибиотиков не различалась между бактериями, выращенными на планктоне или биопленке, полученными из мокроты, по сравнению с бактериями, полученными при бронхоальвеолярном лаваже и защищенной щетке.

В заключение, сбор мокроты дает такую же информацию, как и бронхоскопия, для характеристики генотипа и чувствительности к антибиотикам хронической инфекции Pseudomonas aeruginosa у пациентов со стабильным муковисцидозом.

Это исследование было поддержано грантами Physician Services Inc.и Торакальное общество Онтарио, Онтарио, Канада.

Pseudomonas aeruginosa является наиболее распространенным патогеном, который хронически инфицирует пациентов с муковисцидозом (МВ) 1. Недавние данные свидетельствуют о том, что P. aeruginosa на самом деле может расти в виде плотных сообществ инкапсулированных экзополисахаридом биопленок, прикрепленных к дыхательным путям пациентов с МВ 2– 4.

У пациентов с МВ регулярно берут посев мокроты в течение клинически стабильных периодов, и результаты этих посевов на чувствительность используются для определения начальной антибактериальной терапии во время обострений.Одна из проблем, связанных с использованием образцов мокроты для руководства терапией, заключается в том, что образцы биопленочных бактерий могут быть неадекватно взяты из мокроты , поскольку мокрота откашливается только для образцов P. aeruginosa , которые отделились и рассеялись из биопленки дыхательных путей 5, 6. In vitro Исследования показали, что образующие биопленку P. aeruginosa значительно менее чувствительны к антибиотикам по сравнению с неприлипающимися формами 3, 7. Однако ранее не проводились исследования, чтобы определить, являются ли бактерии, извлеченные из мокроты, более восприимчивыми к антибиотикам по сравнению с извлеченными бактериями. непосредственно из биопленки дыхательных путей.

Методы получения образцов из дыхательных путей, которые являются более инвазивными и потенциально более точными, чем мокрота, были исследованы для определения их способности обнаруживать бактериальную флору, присутствующую в легких пациентов. Например, полуколичественный бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) ранее оценивался для выявления инфекций в нижних дыхательных путях 8–11. Бронхоскопия с защищенной щеткой для образцов (PSB) также использовалась для сбора незагрязненных образцов из дыхательных путей для посева 12–14.В отличие от БАЛ, где солевой раствор бронхиального секрета аспирируется для отбора проб, при бронхоскопии PSB просвет дыхательных путей очищается непосредственно щеткой для удаления бактерий, а затем PSB втягивается в его стерильную оболочку для минимизации загрязнения другими секретами дыхательных путей. Таким образом, возможно, что PSB может напрямую восстанавливать бактерий P. aeruginosa , которые собрались в виде биопленок и прилипли к поверхности дыхательных путей.

Целью настоящего исследования было определить, может ли PSB брать пробы непосредственно из биопленки дыхательных путей и, таким образом, более точно представлять состояние P.aeruginosa в легких больных МВ. Авторы хотели определить, отличаются ли бактерии, прикрепленные к дыхательным путям, с помощью защищенных образцов щеток, генотипически или фенотипически от бактерий, которые традиционно извлекаются из культур мокроты. Если бы это было так, то это могло бы означать, что образцы бронхоскопии предпочтительнее мокроты для точного диагноза легочных инфекций МВ.

Материалы и методы

Субъекты

Пациенты имели право на участие в этом исследовании, если они были в возрасте> 16 лет, имели подтвержденный диагноз МВ с хроническим P.aeruginosa , были способны спонтанно выделять мокроту, имели объем форсированного выдоха за одну секунду (FEV ₁) ≥40% от прогнозируемого, были клинически стабильными и не принимали перорально или в / в. антибиотиков в течение> 4 недель до включения в исследование. Исследование было одобрено Советом по этике исследований больницы Оттавы, и все субъекты предоставили информированное письменное согласие.

Сбор образцов

Пациенты должны были спонтанно выделять мокроту непосредственно перед проведением бронхоскопии.Один и тот же исследователь выполнил бронхоскопию всем 12 пациентам. После отхаркивания мокроты верхние дыхательные пути анестезировали 2% спреем лидокаина. Затем пациентам вводили седативные препараты фентанилом и диазепамом внутривенно, используя среднюю дозу 50 мкг и 5 мг соответственно. Местная анестезия голосовых связок и трахеи была достигнута с использованием 2% лидокаина, вводимого через бронхоскоп над связками. Затем через голосовые связки вводили бронхоскоп (IT-160 и BF-200; Olympus Corporation, Hinode, Japan), а его наконечник вклинивали в передний сегмент правого верхнедолевого бронха.Перед заклиниванием избегали использования всасывания, чтобы не допустить загрязнения всасывающего канала. БАЛ выполняли путем закапывания и аспирации пяти аликвот по 20 мл стерильного 0,9% NaCl (Chastre et al. 12). Жидкость BAL была объединена и немедленно помещена на лед. После процедуры BAL PSB (8115; Primed Instrument Incorp., Mississauga, ON, Canada) был введен через рабочий канал бронхоскопа и продвинут в передний сегмент правого верхнедолевого бронха.После удаления пробки дистального катетера кисть прикладывалась к стенке субсегментарного дыхательного пути и встряхивалась против стенки дыхательного пути для получения секреции нижних дыхательных путей (Chastre et al. 13). Затем щетку разрезали, помещали в 1 мл стерильного физиологического раствора и помещали на лед.

Культура образцов

Образцы мокроты промывали равным объемом стерильного физиологического раствора, а промывочную жидкость удаляли. Затем соответствующее количество мокроты добавляли к равному количеству триптиказо-соевого бульона (TSB; Becton-Dickinson Company, Cockysville, MD, USA) и измельчали в измельчителе тканей (Radnoti Glass, Монровия, Калифорния, США).Затем образцы разбавляли TSB в соотношении 1:10, 1: 1000 и 1: 100000, и 10 мкл каждого разведения инокулировали на триптиказо-соевый агар с 5% агаром с овечьей кровью (BA) и чашки с агаром МакКонки (PML Microbiologicals, Mississauga, США, США). ON, Канада).

Жидкость

BAL разбавляли 1: 100 и 1: 100 000 TSB и 10 мкл неразбавленного образца, и каждое из двух разведений вносили в среду, как описано для мокроты. Образцы PSB интенсивно встряхивали в 1 мл стерильного физиологического раствора, чтобы обеспечить полное высвобождение всего материала из щеток.Разведения и посев микробиологических сред выполняли, как описано для жидкостей БАЛ.

Планшеты BA и McConkey инкубировали 48–72 ч при 35 ° C на воздухе. Колонии, похожие на Pseudomonas spp. были выбраны из планшетов BA или McConkey для идентификации и тестирования чувствительности. В общей сложности пять различных колоний были случайным образом отобраны из каждого типа образца независимо от того, представляют ли они одинаковые или разные морфологические типы.Таким образом, культуры преднамеренно подвергались избыточному отбору образцов, чтобы максимизировать извлечение как можно большего количества различных типов штаммов. Все изоляты, отобранные для исследования, были идентифицированы как P. aeruginosa обычными микробиологическими методами, как описано в других статьях 15, 16. Все изоляты хранили замороженными при -70 ° C в TSB, содержащем 15% глицерина (Sigma-Aldrich, St. Луис, Миссури, США) до тех пор, пока не потребуются дальнейшие испытания.

Типирование изолятов для гель-электрофореза в импульсном поле

Молекулярное генотипирование P.aeruginosa проводили гель-электрофорезом в импульсном поле (PFGE), как описано Aaron et al. 17. Профили рестрикционных фрагментов визуально сравнивали и интерпретировали на основании рекомендаций, рекомендованных Tenover et al. 18. Изоляты с идентичными профилями рестрикционных фрагментов считались представляющими один штамм. Изоляты с профилями рестрикции, различающимися 1–3 фрагментами (полосами), считались близкородственными штаммами и считались произошедшими от одного клона.Изоляты с профилями рестрикции, различающимися четырьмя или более полосами, считались разными штаммами.

Определение минимальной ингибирующей концентрации (рост планктона)

Минимальные ингибирующие концентрации (МПК) были определены для шести антипсевдомонадных антибиотиков: меропенема (AstraZeneca Pharmaceuticals, Уилмингтон, Делавэр, США), тобрамицина (Sabex, Бушервиль, Квебек, Канада), амикацина (лаборатории Бристоля, Монреаль, Квебек, Канада). , пиперациллин (Wyeth-Ayerst, Монреаль, Квебек, Канада), ципрофлоксацин (MilesInc., West Haven, CT, USA) и цефтазидим (GlaxoSmithKline, Mississauga, ON, Canada) для каждого изолята P. aeruginosa . МИК были выполнены путем микроразбавления бульона и интерпретированы в соответствии с рекомендациями 19 Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам.

Множественный комбинированный бактерицидный тест (рост планктона)

Множественный комбинированный бактерицидный тест (MCBT) был проведен для оценки чувствительности каждого изолята к множественным комбинациям антибиотиков, как описано ранее 20.Десять антибиотиков были протестированы против каждого P. aeruginosa в 94 различных комбинациях. Комбинации состояли из двух или трех из следующих групп: азитромицин (Pfizer, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США), меропенем, тикарциллин-клавулановая кислота (GlaxoSmithKline, Миссиссауга, Онтарио, Канада), пиперациллин-тазобактам (Wyeth-Ayerst), триметоприм-сульфаметоксазол (GlaxoSmithKline), амикацин, цефтазидим, ципрофлоксацин, хлорамфеникол (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и тобрамицин.

Тестирование биопленок

Все из P.aeruginosa , выделенные из образцов мокроты, БАЛ и PSB у 12 пациентов, выращивали в виде биопленок с использованием модифицированного устройства Calgary Biofilm 21. Тесты на чувствительность к антибиотикам P. aeruginosa , выращенных в виде биопленок, на индивидуальную и комбинированную антибиотики, были ранее подтверждены и показали, что быть воспроизводимым 7, 21.

Вкратце, для роста биопленки изоляты выращивали в течение 24 часов, прикрепленных к полистироловым штырям, которые находились в стандартных 96-луночных планшетах (Nalge Nunc International, Роскилле, Дания) при 35 ° C в окружающем воздухе.Качающийся стол использовался для создания поперечных сил на каждом стержне, что приводило к образованию эквивалентных биопленок на каждом участке стержня. Авторы ранее показали с помощью электронной микроскопии, что этот метод приводит к росту биопленки на стержнях 7. Затем культуру биопленки переносили в стандартный 96-луночный планшет, в котором были приготовлены разведения антибиотиков, и затем инкубировали в течение ночи при 35 ° C. в окружающем воздухе. МИК для биопленки определяли как концентрацию антибиотика, при которой рост биопленки (отсутствие помутнения в лунке) подавлялся.Затем биопленку удалили с колышков обработкой ультразвуком, и жизнеспособность бактериальной биопленки (минимальная концентрация уничтожения биопленки) оценили с помощью подсчета на чашках 7.

Статистический анализ

Модель обобщенных оценочных уравнений (GEE) использовалась для сравнения изолятов мокроты с изолятами BAL и PSB, чтобы определить, были ли какие-либо существенные различия в их значениях MIC. Модель GEE является расширением обобщенной линейной модели и допускает корреляцию между людьми и не требует нормального распределения данных.Результаты были проанализированы, моделируя антибиотики индивидуально, а также рассматривая тип антибиотика в качестве ковариаты для сравнения чувствительности мокроты, изолятов БАЛ и PSB ко всем шести антибиотикам. Результаты MCBT были проанализированы с помощью парных t-критериев, чтобы определить, были ли существенные различия между мокротой и BAL, а также мокротой и результатами PSB. Статистически значимым считалось значение p <0,05.

Результаты

Исследуемая популяция

Исследуемая популяция состояла из девяти мужчин и трех женщин с МВ, средний возраст которых составлял 29 лет.Все пациенты были хронически инфицированы мукоидными изолятами P. aeruginosa в течение средней продолжительности 8 ± 5 лет (диапазон: 3–19 лет). Соответствующие характеристики пациентов приведены в таблице 1⇓. Все 12 исследуемых пациентов хорошо перенесли бронхоскопию без осложнений.

Таблица 1—

Исходные характеристики пациентов с муковисцидозом (МВ)

Количественные культуры

Количественный анализ культур 15 изолятов, выращенных на планктоне (пять мокроты, пять BAL и пять PSB), полученных от каждого из 12 пациентов с МВ, показал, что все они имели ≥1000000 КОЕ · мл ^-1 из P.aeruginosa , присутствующих в их образцах. Это количество бактерий значительно превышает пороговое значение в 10 000 КОЕ · мл ^-1, которое в настоящее время предписано для точной диагностики легочных инфекций с помощью PSB и BAL 11,12.

Бактериальное генотипирование

Бактериальные культуры, полученные с помощью бронхоскопии, не дали новых штаммов бактерий, которые также не были обнаружены в мокроте. PFGE выявил, что у 10 пациентов (83%) был обнаружен единственный штамм P. aeruginosa во всех культурах мокроты, ЖБАЛ и PBS (рис.1⇓). У двух пациентов (17%) были выделены два штамма P. aeruginosa из мокроты, но только один штамм был выделен из БАЛ и ПСБ (рис. 2).

Рис. 1.—

Гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE) изолятов Pseudomonas aeruginosa от пациента 4. Геномная ДНК 15 изолятов P. aeruginosa от каждого пациента (по пять для каждого из трех методов отбора проб) анализировали с помощью PFGE после рестрикционного переваривания с SpeI (эндонуклеазой рестрикции).Все изоляты от этого пациента были получены либо от одного штамма, либо от близкородственного штамма P. aeruginosa , поскольку ни один из изолятов не отличался более чем тремя полосами рестрикции. S: мокрота; БАЛ: бронхоальвеолярный лаваж; PSB: кисть для защищенных образцов. ^#: лестница ДНК размером 48,5 т.п.н.

Рис. 2.—

Гель-электрофорез в импульсном поле (PFGE) изолятов Pseudomonas aeruginosa от пациента 2. Геномная ДНК 15 изолятов P. aeruginosa от каждого пациента (по пять для каждого из трех методов отбора проб) анализировали с помощью PFGE после рестрикционного переваривания с SpeI (эндонуклеазой рестрикции).Профили изолята на дорожках 5–16 получены из того же штамма P. aeruginosa . Однако изоляты 1, 2 и 3 из мокроты представляют собой штамм P. aeruginosa , отличный от других изолятов (см. Белые стрелки для иллюстративных примеров различных полос). S: мокрота; БАЛ: бронхоальвеолярный лаваж; PSB: кисть для защищенных образцов. ^#: лестница ДНК размером 48,5 т.п.н.

В таблице 2 приведены генотипы изолятов пациентов. Всего у пяти пациентов (пациенты 1, 3, 5, 7 и 11) был обнаружен общий штамм «А» P.aeruginosa из мокроты.

Таблица 2–

Сводка по Pseudomonas aeruginosa штаммов

Чувствительность к одному антибиотику

Таблица 3⇓ суммирует данные MIC для одного антибиотика в виде значений log ₂ для изолятов, выращенных на планктоне. Чувствительность к антибиотикам не зависела от источника изолята P. aeruginosa (p = 0,76 и p = 0,65 для сравнения МПК мокроты и БАЛ, а также МПК мокроты и ПСБ, соответственно).Не было значительных различий в чувствительности к антибиотикам между тремя методами отбора проб для всех шести протестированных антибиотиков. Единственным исключением был цефтазидим, где изоляты, полученные с помощью BAL, были менее чувствительны к цефтазидиму, чем изоляты, полученные из мокроты (p = 0,04).

Таблица 3–

Результаты по чувствительности к отдельным антибиотикам, представленные в виде минимальной ингибирующей концентрации (MIC) log ₂ значений для планктонно выращенных изолятов, полученных от пациентов с муковисцидозом

Таблица 4⇓ суммирует данные МИК одного антибиотика в виде значений log ₂ для изолятов, выращенных в виде биопленок.Для всех этих изолятов не было значительных различий в чувствительности между образцами, полученными BAL и PSB, по сравнению с изолятами из мокроты. Минимальные концентрации антибиотиков для уничтожения биопленки были даже выше, чем МИК биопленок, и они аналогичным образом не показали различий между изолятами, выделенными из мокроты, БАЛ или PSB (данные не показаны).

Таблица 4–

Результаты по индивидуальной чувствительности к антибиотикам, представленные в виде минимальной ингибирующей концентрации (MIC) log ₂ значений для изолятов, выращенных на биопленке, полученных от пациентов с муковисцидозом

Чувствительность к комбинированным антибиотикам

Таблица 5⇓ обобщает данные MCBT.В общей сложности 94 двойных и тройных комбинаций антибиотиков оценивали на бактерицидную активность против каждого изолята. Не наблюдалось значительных различий между количеством чувствительных комбинаций антибиотиков для изолятов мокроты, выращенных на планктоне (среднее: 75,9 ± 7,5), по сравнению с изолятами БАЛ (среднее: 76,2 ± 8,6, p = 0,80) или изолятами PSB (среднее: 76,1 ± 11,0). , p = 0,89).

Таблица 5–

Результаты бактерицидного тестирования множественных комбинаций

Аналогичные результаты были получены для изолятов, выращенных на биопленках.Изоляты, выращенные на биопленке, были менее чувствительны к комбинациям антибиотиков, чем изоляты, выращенные на планктоне. Однако при сравнении количества чувствительных комбинаций антибиотиков для изолятов мокроты, выращенных на биопленке (среднее значение: 31,0 ± 9,0), по сравнению с изолятами BAL (среднее значение: 27,5 ± 11,4, p = 0,34) или изолятами PSB (среднее значение: : 28,1 ± 10,4, p = 0,29).

Обсуждение

До этого исследования ранее не проводилось исследований, чтобы выяснить, может ли бронхоскопия получить культуры бактерий непосредственно из биопленок in vivo и являются ли эти бактерии генетически отличными или более устойчивыми к антибиотикам, чем бактерии, полученные из культур мокроты.В этой группе из 12 стабильных пациентов с МВ ни ПСБ, ни изоляты БАЛ не предоставили никакой дополнительной информации относительно типа штамма и чувствительности бактерий P. aeruginosa к антибиотикам по сравнению с образцами, выделенными из мокроты.

При бронхоскопии не было обнаружено штаммов P. aeruginosa , которые не были обнаружены в мокроте. Возможное объяснение этого заключается в том, что в данном исследовании отбор проб при бронхоскопии был ограничен только правой верхней долей, чтобы избежать загрязнения порта для пробы из-за всасывания нескольких участков.Отхаркиваемые образцы мокроты проходят через большую часть дыхательных путей с обеих сторон и потенциально могут дать более точную картину присутствующей флоры. В качестве альтернативы возможно, что дополнительные штаммы P. aeruginosa , выделенные в мокроте у двух пациентов, но не извлеченные из их правых верхних долей с помощью бронхоскопии, могли происходить из верхних дыхательных путей или пазух этих пациентов.

В общей сложности у 10 из 12 пациентов был отдельный штамм P.aeruginosa во всех изолятах, а посев мокроты только от двух пациентов дает два различных штамма. Представленные результаты согласуются с результатами, полученными в результате предыдущих исследований P. aeruginosa у хронически инфицированных пациентов с МВ 17, 22, 23. Во всех этих исследованиях сообщалось, что с течением времени у большинства взрослых пациентов с МВ обычно имеется один клон или субклон. из P. aeruginosa в периоды клинической стабильности, и тот же бактериальный клон, извлеченный в периоды клинической стабильности, также извлекается во время обострений легких 17.

В текущем исследовании использовались стандартные микробиологические методы серийных разведений для выделения, идентификации и количественного определения организмов. Методы серийного разбавления могут не идентифицировать организмы, которые присутствуют только в очень небольшом количестве. Однако изолятов намеренно брали избыточный образец из планшетов для культивирования, чтобы максимизировать извлечение как можно большего количества различных типов штаммов.

В общей сложности пять из 12 пациентов имели один и тот же штамм P. aeruginosa во всех типах образцов.Это указывает на то, что в клинике нашего центра может циркулировать штамм P. aeruginosa , вызывающий инфекцию у части наших пациентов с МВ. Это наблюдение согласуется с результатами нескольких других исследований 24–28. Все эти исследования предоставили убедительные доказательства того, что перекрестная инфекция у пациентов с МВ может существовать, и предполагают, что ограниченного общего контакта в условиях клиники может быть достаточно для передачи типов штаммов между пациентами с МВ. Армстронг и др. 28 и Jones et al. 29 предположили, что наиболее вероятным способом распространения был прямой контакт пациента с пациентом.

Когда индивидуальная чувствительность к антибиотикам для P. aeruginosa , полученная из мокроты, сравнивалась с чувствительностью, полученной при бронхоскопии, значительных различий в значениях МИК не наблюдалось. Аналогичные результаты были получены при сравнении чувствительности изолятов к комбинациям антибиотиков. Основываясь на этих наблюдениях, изоляты, полученные с помощью методов бронхоскопии, не дадут никаких дополнительных преимуществ по сравнению с изолятами мокроты для оценки чувствительности к антибиотикам P.aeruginosa у пациентов с МВ.

Baughman et al. 11 опубликовали исследование, в котором результаты посева мокроты сравнивались с результатами полуколичественного посева БАЛ из 28 бронхоскопий, сделанных у 11 взрослых пациентов с МВ. Они показали, что в 11 случаях БАЛ смог либо обнаружить новый патоген, либо обнаружить дополнительный патоген, которого не было при посеве мокроты. Это привело к изменению терапии у 48% обследованных пациентов. Основное различие в исследовании Baughman et al. 11, по сравнению с текущим отчетом, было обнаружено, что посев мокроты не соответствовал требованиям для сравнения в 11 из 28 процедур БАЛ. Поскольку многие из их пациентов не могли получить мокроту, бронхоскопия выявила патогены, не идентифицированные иным образом.

Настоящее исследование было ограничено клинически стабильными пациентами. Авторы решили провести это исследование на клинически стабильных пациентах из соображений безопасности, а также для имитации клинической практики. У пациентов с МВ регулярно берут посев мокроты в течение клинически стабильных периодов, и результаты этих посевов на чувствительность используются для определения начальной антибактериальной терапии во время обострений.Предыдущее исследование 17 подтвердило, что подавляющее большинство изолятов P. aeruginosa , извлеченных во время обострений, идентичны изолятам, извлеченным во время клинической стабильности. Таким образом, представленные здесь пациенты являются репрезентативными для тех, кто получит наибольшую пользу от альтернативной и потенциально более точной техники взятия проб из дыхательных путей во время клинически стабильных периодов, чтобы направить терапию в случае болезни.

Тестирование чувствительности к антибиотикам Pseudomonas aeruginosa , выделенных из мокроты, остается обязательным условием для направления терапии у пациентов с хроническим муковисцидозом.Однако прием антибиотиков почти никогда не устраняет носительство этой бактерии, а скорее уменьшает симптомы легочных обострений. Учитывая текущие результаты, авторы считают, что неспособность антибактериальной терапии стерилизовать дыхательные пути от муковисцидоза взрослых не является следствием какого-либо врожденного ограничения способности мокроты адекватно анализировать флору дыхательных путей. В заключение, два бронхоскопических метода (бронхоальвеолярный лаваж и защищенная кисточка для образцов) не показали каких-либо преимуществ по сравнению с мокротой при отборе образцов типа Pseudomonas aeruginosa , инфицирующих легкие у пациентов со стабильным муковисцидозом.

Получено 26 апреля 2004 г.
Принято 11 июня 2004 г.

Список литературы

↵
Фик Р. Б. Мл. Патогенез поражения легких псевдомонадой при муковисцидозе. Сундук 1989; 96: 158–164.
↵
Singh PK, Parsek MR, Greenberg EP, Welsh MJ. Компонент врожденного иммунитета предотвращает развитие бактериальной биопленки. Природа 2002; 417: 552–555.
↵
Drenkard E, Ausubel FM. Pseudomonas Образование биопленок и устойчивость к антибиотикам связаны с фенотипической изменчивостью. Природа 2002; 416: 740–743.
↵
Singh PK, Schaefer AL, Parsek MR, Moninger TO, Welsh MJ, Greenberg EP. Сигналы кворума указывают на то, что легкие с муковисцидозом инфицированы бактериальными биопленками. Природа 2000; 407: 762–764.
↵
Costerton JW. Введение в биопленку. Int J Antimicrob Agents 1999; 11: 217–221.
↵
Костертон Дж. У., Стюарт П. С., Гринберг Е. П.. Бактериальные биопленки: частая причина хронических инфекций. Наука 1999; 284: 1318–1322.
↵
Аарон С.Д., Феррис В., Рамотар К., Вандемхин К., Чан Ф., Сагинур Р. Индивидуальная и комбинированная чувствительность к антибиотикам планктонных, адгезивных и биопленочных растений Pseudomonas aeruginosa , культивированных из мокроты CF. J Clin Microbiology 2002; 40: 4172–4179.
↵
Кан Ф.В., Джонс Дж. М.. Диагностика бактериальной респираторной инфекции с помощью бронхоальвеолярного лаважа. J. Infect Dis 1987; 155: 862–869.
Thorpe JE, Baughman RP, Frame PT, Wesseler TA, Staneck JL. Бронхоальвеолярный лаваж для диагностики острой бактериальной пневмонии. J. Infect Dis 1987; 155: 855–861.
Konstan MW, Hilliard KA, Norvell TM, Berger M.Результаты бронхоальвеолярного лаважа у пациентов с муковисцидозом со стабильным, клинически легким заболеванием легких предполагают продолжающуюся инфекцию и воспаление. Am J Respir Crit Care Med 1994; 150: 448–454.
↵
Баумэн Р.П., Китон Д.А., Перес К., Уилмотт Р.В. Использование полуколичественных культур бронхоальвеолярного лаважа при муковисцидозе. Am J Respir Crit Care Med 1997; 156: 286–291.
↵
Chastre J, Fagon J-Y, Bornet-Lesco M, et al. Оценка бронхоскопических методов диагностики внутрибольничной пневмонии. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152: 231–240.
↵
Chastre J, Viau F, Brun P, et al. Проспективная оценка защищенной щетки для образцов для диагностики легочных инфекций у пациентов, находящихся на ИВЛ. Am Rev Respir Dis 1984; 130: 924–929.
↵
Хигучи Дж. Х., Коулсон Дж. Дж., Йохансон В. Г. Мл.Бактериологическая диагностика нозоциальной пневмонии у приматов. Полезность защищенной щетки для образцов. Am Rev Respir Dis 1982; 125: 53–57.
↵
Гиллиган PH. Микробиология заболеваний дыхательных путей у больных муковисцидозом. Clin Microbiology Rev 1991; 4: 35–51.
↵
Миллер МБ, Гиллиган РН. Лабораторные аспекты ведения хронических легочных инфекций у больных муковисцидозом.J Clin Microbiol 2003; 41: 4009-4015.
↵
Аарон С.Д., Рамотар К., Феррис В., и др. Обострения муковисцидоза у взрослых и новые штаммы Pseudomonas aeruginosa . Am J Respir Crit Care Med 2004; 169: 811–815.
↵
Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV. Интерпретация паттернов рестрикции хромосомной ДНК, полученных с помощью гель-электрофореза в импульсном поле: критерии типирования бактериального окрашивания.J Clin Microbiol 1995; 33: 2233–2239.
↵
Методы разбавления тестов на чувствительность к противомикробным препаратам для бактерий, которые растут в аэробных условиях; утвержденные стандарты. Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS). Уэйн PA, NCCLS, 2003.
↵
Аарон С.Д., Феррис В., Генри Д.А., Спирт Д.П., Макдональд, штат Нью-Йорк. Тестирование нескольких комбинаций бактерицидных антибиотиков для пациентов с муковисцидозом, инфицированных Burkholderia cepacia .Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 1206–1212.
↵
Ceri H, Olson ME, Stremick C, Read RR, Morck D, Buret A. Биопленочное устройство Калгари: новая технология для быстрого определения чувствительности бактериальных биопленок к антибиотикам. J Clin Microbiol 1999; 37: 1771–1776.
↵
Breitenstein S, Walter S, Bobhammer J, Romling U, Tummler B. Прямой анализ мокроты генотипов макрорестрикционных фрагментов Pseudomonas aeruginosa у пациентов с муковисцидозом.Med Microbiol Immunol 1997; 186: 93–99.
↵
Struelens MJ, Schwam V, Delpano A, Baran D. Анализ макрорестрикции генома разнообразия и изменчивости штаммов Pseudomonas aeruginosa , инфицирующих пациентов с муковисцидозом. J Clin Microbiol 1993; 31: 2320–2326.
↵
Cheng K, Smyth RL, Govan JRW, et al. Распространение β-лактам-устойчивого Pseudomonas aeruginosa в клинике муковисцидоза.Ланцет 1996; 348: 639–642.
Jones AM, Govan JRW, Doherty CJ, et al. Распространение мультирезистентного штамма Pseudomonas aeruginosa в клинике муковисцидоза у взрослых. Ланцет 2001; 358: 557–558.
McCullum SJ, Corkill J, Gallagher M, Ledson MJ, Hart CA, Walshaw MJ. Суперинфекция трансмиссивным штаммом Pseudomonas aeruginosa у взрослых с муковисцидозом, хронически колонизированных P aeruginosa .Ланцет 2001; 358: 558–560.
Энтони М., Роуз Б., Борода-Пеглер М., и др. Генетический анализ изолятов Pseudomonas aeruginosa из мокроты взрослых пациентов с муковисцидозом в Австралии. J Clin Microbiol 2002; 40: 2772–2778.
↵
Armstrong DS, Nixon GM, Carzino R, et al. Обнаружение широко распространенного клона Pseudomonas aeruginosa в детской клинике муковисцидоза.Am J Resp Crit Care Med 2002; 166: 983–987.
↵
Jones AM, Webb AK, Govan JR, Hart CA, Walshaw MJ. Pseudomonas aeruginosa Перекрестное заражение при муковисцидозе. Ланцет 2002; 359: 527–528.

Быстрый фенотипический тест на лекарственную чувствительность к микобактериям непосредственно из мокроты

Аннотация

Фон

Распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) является ведущей глобальной проблемой общественного здравоохранения.Поскольку не все биологические механизмы устойчивости известны, посевы (фенотипические) исследования лекарственной чувствительности (ТЛЧ) предоставляют важную информацию, которая влияет на принятие клинических решений. Текущие фенотипические тесты обычно требуют предварительного культивирования, чтобы убедиться, что бактериальная нагрузка находится на тестируемом уровне (занимает 2–4 недели), а затем 10–14 дней для подтверждения роста или его отсутствия.

Методы и выводы

Мы представляем двухэтапный метод получения результатов ТЛЧ в течение 3 дней после сбора образцов.Первый включает выборочную концентрацию живых микобактериальных клеток, присутствующих в относительно больших объемах мокроты (~ 2-10 мл), с использованием коммерчески доступных магнитных наночастиц (МНЧ) в меньшие объемы, тем самым обходя необходимость предварительного культивирования. Второй включает использование микроканальной спектроскопии электрического импеданса (m-EIS) для мониторинга нескольких аликвот небольших объемов (~ 10 мкл) суспензии, содержащей микобактериальные клетки, МНЧ и лекарственные препараты-кандидаты, чтобы определить, растут ли клетки, умирают или остаются статичными в данных условиях. проверено.m-EIS дает оценку «объемной емкости» раствора (Cb), параметра, который пропорционален количеству живых бактерий в суспензии. Таким образом, мы можем обнаруживать гибель клеток (бактерицидное действие препарата) в дополнение к их росту. Мы демонстрируем доказательство принципа, используя M . bovis BCG и M . smegmatis во взвешенном состоянии в искусственной мокроте. В процессе обеззараживания из ~ 5 мл искусственной мокроты было извлечено около 2000–10 000 КОЕ микобактерий с эффективностью 84–100%.Впоследствии суспензии, содержащие ~ 105 КОЕ / мл микобактерий с 10 мг / мл МНЧ, контролировались в присутствии бактериостатических и бактерицидных препаратов при концентрациях ниже, равной и выше известных значений МИК (минимальная ингибирующая концентрация). Данные m-EIS (ΔCb) показали данные, согласующиеся с ожидаемым ростом, смертью или застоем и / или зарегистрированными с использованием подсчета на планшете. Электрические сигналы смерти были видны уже через 3 часа, а рост наблюдался менее чем через 3 дня для всех образцов, что позволяет нам проводить ТЛЧ менее чем за 3 дня.

Заключение

Мы продемонстрировали «принципиальное доказательство» того, что (а) живые микобактерии могут быть выделены из мокроты с помощью MNP с высокой эффективностью (почти все бактерии, которые выживают после дезактивации), и (b) эффективность лекарств-кандидатов на выделенные таким образом микобактерии (в суспензии, содержащие MNP) могут быть протестированы в режиме реального времени с помощью m-EIS.

Образец цитирования: Батлер Т.Э., Ли А.Дж., Ян Й., Ньютон М.Д., Каргупта Р., Путтасвами С. и др. (2020) Быстрый фенотипический тест на лекарственную чувствительность к микобактериям прямо из мокроты.PLoS ONE 15 (8):
e0238298.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298

Редактор: Hasnain Seyed Ehtesham, Jamia Hamdard, INDIA

Поступила: 14 января 2020 г .; Принята к печати: 13 августа 2020 г .; Опубликовано: 28 августа 2020 г.

Авторские права: © 2020 Butler et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные, обсуждаемые в статье, находятся в рукописи.

Финансирование: Автор Шрамик Сенгупта имеет коммерческую связь с ImpeDx Diagnostics и имеет долю в компании ImpeDx Diagnostics, получившей грант NSF SBIR. Университет Миссури выступил субподрядчиком по гранту и провел дизайн исследования, сбор и анализ данных. Фонд предоставил поддержку в виде заработной платы авторам SP и стипендий авторам TEB, AJL и YY.MDN, научный сотрудник ImpeDx, обучил студентов Университета Миссури протоколам экстракции с использованием магнитных наночастиц (MNP) и помог в проведении эксперимента по экстракции. Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «Авторский вклад». Диагностика ImpeDx не играла никакой роли в планировании экспериментов или анализе данных. Они также не наложили никаких ограничений на распространение результатов.

Конкурирующие доли: Шрамик Сенгупта владеет долей в ImpeDx Diagnostics.ImpeDx имеет лицензию на технологию от Университета Миссури. Шрамик Сенгупта, Сачидеви Путтасвами и Роли Каргупта являются соавторами этой технологии. Это не влияет на нашу приверженность политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

2. Введение

2.1. Мотивация

Туберкулез (ТБ) — одна из серьезных проблем общественного здравоохранения в мире. В 2017 г. от туберкулеза умерло 1,6 млн человек, было зарегистрировано 10 млн новых случаев инфицирования [1]. Поскольку туберкулез является одновременно смертельным и заразным заболеванием, своевременная диагностика и лечение являются ключом к сдерживанию распространения туберкулеза.

Одной из основных проблем, связанных с простым и эффективным лечением, является появление устойчивых к лекарствам штаммов Mycobacterium tuberculosis (Mtb), организма, вызывающего туберкулез. Существует набор из 4 препаратов, которые считаются «первой линией» лечения туберкулеза: рифампицин (он же рифампицин) (RIF), пиразинамид (PZA), этамбутол (EMB) и изониазид [2, 3] (иногда стрептомицин). (STR) также включен в этот список [3]). Из них RIF и INH являются первым и вторым наиболее часто назначаемыми препаратами, а штаммы Mtb, проявляющие устойчивость к ним по отдельности, обозначаются RIF-устойчивыми и INH-устойчивыми, соответственно.

Штамм Mtb считается мультирезистентным (МЛУ), если он устойчив к обоим [3]. Кроме того, существуют другие препараты «второго ряда», которые могут лечить туберкулез, но не являются предпочтительными по целому ряду причин, начиная от стоимости и заканчивая побочными эффектами. К ним относятся фторхинолоны, а также другие препараты, некоторые из которых необходимо вводить инъекционно. Штамм Mtb, устойчивый не только к INH и RIF, но и к фторхинолонам, и, по крайней мере, к одному из 3 наиболее распространенных инъекционных препаратов второго ряда (т.е., амикацин, канамицин или капреомицин) обозначен как штамм с высокой лекарственной устойчивостью (XDR).

В 2015 году годовой отчет по ТБ, выпущенный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), включал приложение, посвященное возникновению и распространению лекарственной устойчивости [4], а в 2017 году ВОЗ выпустила обновления к ранее выпущенному дополнению по лекарственным средствам. сопротивление [5]. Согласно этим отчетам, 4,1% новых и 19% ранее пролеченных случаев ТБ имели RR (устойчивость к рифампицину) или МЛУ ТБ.Кроме того, 6,2% случаев МЛУ-ТБ имели дополнительную лекарственную устойчивость и считались ТБ с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ). Только 54% пациентов с МЛУ-ТБ, начавших лечение в 2014 г., прошли успешное лечение, в то время как 16% пациентов умерли, а лечение 8% пациентов оказалось безуспешным (21% были потеряны для последующего наблюдения или не прошли оценку). Это означает, что в 2016 г. возникло около 600 000 новых случаев МЛУ / РУ-ТБ, и 240 000 случаев смерти от МЛУ / РУ-ТБ.

Основным методом диагностики туберкулеза в условиях ограниченных ресурсов является микроскопия мазка мокроты.Этот метод включает в себя воздействие на собранную мокроту пятен, которые прилипают к M . tuberculosis (Mtb) и поиск окрашенных клеток под микроскопом. Хотя этот метод недорогой, он имеет относительно высокий предел обнаружения, около 105 КОЕ / мл Mtb [6], и, следовательно, имеет высокий уровень ложноотрицательных результатов. Это особенно верно для пациентов с бессимптомными или слабо выраженными симптомами, у которых нагрузка Mtb может составлять всего 1000 КОЕ в 2-5 мл мокроты [2]. Еще одним ограничением этого метода является то, что его нельзя использовать для тестирования лекарственной чувствительности (ТЛЧ).Как для обнаружения клеток Mtb, так и для анализа лекарственной устойчивости доступны два широких класса методов: генотипический (молекулярный) и фенотипический (на основе культуры).

2.2. Генотипические (молекулярные) системы

Генотипические системы обнаруживают виды / группы микроорганизмов в биологическом образце путем обнаружения присутствия ДНК с характерной последовательностью. Устойчивость к лекарствам выявляется на основе обнаружения ДНК, кодирующих гены / мутации, известные ранее, которые ответственны за устойчивость к одному или нескольким лекарствам.

Примеры этой системы включают Xpert MTB / RIFTM от Cepheid и Line Probe Assays (LPA) от таких компаний, как Hain Biosciences. XpertTM дает информацию о наличии ДНК Mtb и гена, кодирующего устойчивость к RIF. LPA доступны от Hain Bioscience в Германии [7, 8] и обнаруживают мутации в гене rpoB , который связан с устойчивостью к RIF, а также мутации в гене katG и промоторной области inhA , которые являются связано с резистентностью к INH.Другой анализ, называемый MTBDRslTM, также от Hain, выявляет определенные генетические мутации, которые делают Mtb устойчивым к фторхинолонам.

У этих систем есть несколько преимуществ, благодаря которым они были недавно приняты в различных условиях, в том числе в средах с низким уровнем ресурсов. Самая главная их черта в том, что они быстрые. Например, XpertTM может дать ответ в течение 2–6 часов [9], а LPA от Hain имеют время обработки 24–48 часов [8]. Другой важной особенностью этих систем является то, что они автоматизированы и, следовательно, имеют низкий уровень ошибок пользователя и, при необходимости, могут обрабатывать большое количество образцов.

У этих систем есть два основных недостатка. Во-первых, это относительно высокая стоимость, которая требует значительных субсидий для охвата пользователей в условиях ограниченных ресурсов. В США и Западной Европе прибор Xpert MTB / RIF продается по цене около 60 000 долларов, а отдельные тестовые картриджи — около 65 долларов [10]. Фонд инновационной диагностики (FIND) координирует оптовые скидки от производителя и субсидии от ООН (ВОЗ), правительств и различных частных благотворительных организаций, таких как Фонд Гейтса, делает инструменты доступными по цене около 17000 долларов США, а картриджи по цене около 10 долларов США каждый. пользователи в малоресурсных средах [11].Точно так же полосы LPA доступны по цене примерно 10 долларов. Однако, как отмечает ВОЗ [7, 8], для проведения теста LPA требуются другие лабораторные расходные материалы и материалы, что может привести к увеличению стоимости теста до 20–30 долларов даже после субсидии.

Другой главный недостаток заключается в том, что генетические тесты дают лишь ограниченную картину профиля лекарственной чувствительности организма, особенно с точки зрения эффективного лечения. Например, Xpert выявляет устойчивость только к рифампицину, генетическая основа которого хорошо изучена, а LPA выявляют некоторые, но не все, случаи устойчивости к изониазиду, поскольку существует несколько путей устойчивости к устойчивости к INH [12].Еще больше усложняет картину мутация гена katG (S315T), обнаруживаемая LPA, которая, как известно, приводит к повышенным значениям минимальных ингибирующих концентраций (MIC) до INH, но степень повышения MIC значительно варьируется. среди изолятов [7]. Это означает, что некоторые изоляты, несущие мутацию, все еще можно лечить с помощью INH, а другие — нет. Более того, отсутствие известных мутаций не означает, что выбранный препарат будет эффективным. CDC заявляет в своих рекомендациях для клиницистов [13]: «Кроме того, не все биологические механизмы устойчивости известны.В результате, если молекулярным анализом не обнаружено никаких мутаций, нельзя исключать резистентность. Следовательно, важно, чтобы обычные тесты на лекарственную чувствительность, основанные на росте, проводились и использовались вместе с молекулярными результатами ».

2.3. Фенотипические системы

Фенотипические системы — это системы, в которых Mtb обнаружен и / или охарактеризован в отношении его лекарственной чувствительности на основании прямых или косвенных наблюдений за клеточным ростом и / или бактериальным метаболизмом в выбранной среде.

Самый распространенный матрикс, проверяемый на наличие Mtb, — это мокрота. Поскольку в мокроте всех пациентов присутствует большое количество микроорганизмов различных типов, протокол обеззараживания обычно выполняется перед любым фенотипическим тестом. Протокол включает использование противоотечного средства (такого как NALC – N-ацетил-L-цистеин), чтобы сделать мокроту менее вязкой, и смертоносного агента (такого как гидроксид натрия), который убивает все микроорганизмы, кроме чрезвычайно выносливых микобактерий, таких как Mtb.После обеззараживания образец (обеззараженная мокрота) добавляется в питательную среду и вводится в автоматизированную диагностическую систему на основе культур, такую как MGIT (пробирка с индикатором роста микобактерий) от Becton Dickinson (BD) или система Trek ESP от Thermo-Fisher.

Благодаря низким эксплуатационным расходам и высокой производительности, автоматизированные диагностические системы на основе культур остаются рабочими лошадками для множества приложений, включая обнаружение туберкулеза (MGIT и Trek ESP) и последующее фенотипическое ТЛЧ.Эти автоматизированные системы культивирования полагаются на обнаружение живых бактерий путем поиска изменений, вызванных бактериальным метаболизмом, в свойствах суспензии, таких как уровни O2 / CO2, pH, электрическая проводимость, температура и т. Д. Их главный недостаток заключается в том, что количество метаболитов, выделяемых бактериями, мало, у них высокий «порог» обнаружения. Другими словами, эти системы требуют, чтобы концентрация бактерий в суспензии повысилась примерно до 108 КОЕ / мл, прежде чем можно будет идентифицировать положительную культуру [14].Это может занять много времени, поскольку бактерии, такие как Mtb, имеют длительное время удвоения и могут присутствовать в мокроте в небольших количествах, около 1000 КОЕ в 2-5 мл [2]. Таким образом, иногда может пройти много дней (недель), прежде чем уровень культуры достигнет достаточно высокого уровня для обнаружения.

Тестирование на устойчивость к лекарствам обычно проводится после обнаружения Mtb в автоматизированной системе посева крови. Аликвоты из положительной пробирки MGIT переносятся в другие пробирки, где среда была дополнена антибиотиками, и наблюдаются в течение 1-2 недель для обнаружения роста (или его отсутствия) в присутствии антибиотиков.Это, в сочетании с тем фактом, что ТЛЧ начинается через много дней после сбора образца мокроты, приводит к тому, что время получения результатов для фенотипического ТЛЧ составляет ~ 1 месяц или больше.

Чтобы преодолеть потребность в «предварительном культивировании» перед ТЛЧ, был разработан метод, называемый микроскопическим наблюдением лекарственной чувствительности (MODS) [15]. В тесте используются 24-луночные планшеты с четырьмя лунками для одного образца пациента: две лунки не содержат лекарств, а две другие содержат рифампицин [16] и изониазид [2].После посева планшеты запечатывают в пакеты с застежкой-молнией, а затем инкубируют. Если патоген в мокроте присутствует, их рост в жидкой среде наблюдают под инвертированным световым микроскопом и морфологически исследуют для выявления паттернов, специфичных для Mtb. Обычно это занимает 7–14 дней, чтобы наблюдать рост в лунках без лекарств и подтвердить отсутствие роста в лунках с лекарствами [17], а стоимость одного теста оценивается примерно в 5 долларов в условиях ограниченных ресурсов Перу [18] . Таким образом, ВОЗ рекомендовала анализ лекарственной чувствительности (MODS) под микроскопом как доступный метод для относительно быстрого обнаружения и ТЛЧ.

Несмотря на свои преимущества, MODS не так широко используется в условиях ограниченных ресурсов, как предполагалось изначально, из-за опасений по поводу биобезопасности, зависимости от навыков лабораторного персонала в интерпретации результатов и эффективности работы с большим количеством образцов. Хотя опасения по поводу биобезопасности можно уменьшить, используя коммерчески производимые наборы с закрытыми лунками, например, производимые компанией Hardy Diagnostics [18], и можно ввести определенную степень автоматизации при захвате изображений [19], этот метод по-прежнему требует, чтобы каждый хорошо пройти визуальный осмотр хорошо обученным лабораторным специалистом.Это требует как времени, так и человеческих ресурсов, что часто делает невозможным обработку большого количества образцов мокроты, которые могут потребоваться для тестирования в условиях высокого бремени ТБ и ограниченных ресурсов.

Фенотипический подход, представленный здесь, направлен на (а) преодоление необходимости предварительного культивирования с использованием метода на основе магнитных наночастиц (MNP) для сбора практически всех клеток микобактерий, присутствующих в относительно большом объеме мокроты (2–5 мл). в относительно небольшой объем (~ 200 мкл) буфера / ростовой среды в течение короткого периода времени (~ 20 минут) (б) преодолеть проблемы биобезопасности за счет использования микрожидкостной технологии для разделения 200 мкл среды, содержащей клетки микобактерий, на шестнадцать индивидуально изолированных микробактерий. — резервуар (лунки) объемом 10 мкл, каждая из которых содержит разное количество лекарств-кандидатов, и (c) устраняет необходимость субъективного суждения квалифицированного клинического работника с помощью чрезвычайно чувствительного электрического метода (m-EIS), который контролирует суспензии в лунки непрерывно и может сообщать не только о росте, но и о гибели клеток в режиме реального времени.

Поскольку этот метод предварительно концентрирует микобактерии перед культивированием и позволяет отслеживать гибель клеток в режиме реального времени из-за действия антибиотиков, он потенциально позволяет проводить тесты фенотипической чувствительности в масштабе времени, сравнимом с «молекулярной », И с автоматизацией и масштабируемостью последнего, но за небольшую часть стоимости. На рис. 1 показаны временные рамки каждого метода.

Рис. 1. Хронология доступных подходов к получению информации о лекарственной чувствительности к туберкулезу.

(A) Генотипический подход GeneXpert, который идентифицирует только чувствительные к рифампицину патогены. Если RIF-устойчивый, образец направляется в путь B. (B) Традиционный фенотипический подход, основанный на культуре (MGIT и т. Д.) (C) Микроскопическое наблюдение за лекарственной чувствительностью (MODS). (D) Предлагаемый подход (выделение с использованием MNP + анализ роста / смерти / стаза с использованием EIS).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.g001

2.4. m-EIS

Наша лаборатория ранее разработала и запатентовала [20, 21] новый метод мониторинга распространения или гибели микроорганизмов в суспензии, который мы называем микроканальной спектроскопией электрического импеданса (m-EIS).Он основан на том факте, что в присутствии электрического поля высокочастотного переменного тока (AC) мембраны клеток становятся поляризованными и накапливают заряд; тем самым действуя как электрические конденсаторы [22]. Эти емкости в отдельных ячейках вносят вклад в общую «объемную емкость» подвески или чистый заряд, хранящийся внутри. Количество заряда, накопленного бактериями, примерно в 100 раз больше, чем у равного объема водного раствора [23]. Следовательно, даже при низких концентрациях (объемных долях) бактерии в суспензии вносят значительный вклад в ее объемную емкость.Также следует отметить, что только живые клетки с неповрежденными мембранами вносят вклад в объемную емкость. Гибель клеток сопровождается потерей мембранного потенциала и электрической поляризации [24].

Измерение объемной емкости непросто, поскольку электрические характеристики водных растворов, содержащих поляризуемые частицы, такие как клетки и белки, чрезвычайно сложны. Такие системы можно смоделировать электрически с помощью схемы, показанной на рис. 3A [25]. В этом уравнении заряд, накопленный на границах раздела электрод-раствор, учитывается емкостью интерфейса двух электродов (Ce), а заряд, накопленный элементами, рассредоточенными внутри, — «объемной емкостью» (Cb).Измерение изменений в Cb является сложной задачей, поскольку Ce примерно в 1000 раз больше. Ключевым нововведением [26] является метод, который позволяет обнаруживать изменения в Cb, несмотря на «экранирующий эффект» зарядов на границе раздела электродов, за счет того, что микрофлюидные каналы становятся длинными и узкими, а электроды размещаются по длине канала. , что увеличивает эффективное объемное сопротивление (Rb) суспензии. Это увеличивает импеданс объема (RbCb), чтобы быть сравнимым с импедансом границы раздела на реализуемых частотах, позволяя заметное падение напряжения на объемном подвесе.Следовательно, накопление заряда в бактериях значительно влияет на измеряемый импеданс. Длинный узкий канал заставляет большее количество электрических «силовых линий» взаимодействовать с взвешенными бактериями. Измеренный импеданс (Z) на 500 частотах (ω) между 1 кГц и 100 МГц соответствует уравнению, и оценивается Cb (вместе с Rb, Re и Ce). Применение этой технологии было продемонстрировано для оценки качества пищевых продуктов [26] и посева крови [27]. Для посева крови «время до обнаружения» (TTD) часто было на несколько дней короче, чем у нынешнего лидера рынка.Пороговые концентрации обнаружения составляют 103–104 КОЕ / мл, тогда как по сравнению с современными технологиями 108 КОЕ / мл [14].

Кроме того, поскольку отдельные клетки теряют свой мембранный потенциал, когда они умирают, и при отсутствии потенциала на мембране не накапливается заряд, m-EIS может наблюдать гибель клеток в режиме реального времени. Это понимание ранее использовалось для определения минимальных ингибирующих концентраций (МПК) для нескольких пар бактерия-антибиотик [28]. Помимо быстрой скорости, для E требуется 4 часа. coli , S . Обнаружение aureus и Pseudomonas , и точные, правильные значения MIC были получены для хорошо охарактеризованных пятен; он способен отличать бактериостатические эффекты, при которых бактерии больше не могут размножаться, от бактерицидных, которые убивают клетки бактерий. Более того, гибель клеток можно наблюдать с помощью m-EIS для начальных нагрузок на уровне или выше «пороговых» концентраций около 103 КОЕ / мл. Это было показано для E . coli и Pseudomonas aeruginosa [29]. Метод m-EIS не только требует более низкой пороговой концентрации, но также работает с небольшими объемами образца (~ 10 мкл). Таким образом, для работы требуется очень небольшое количество клеток (<100 КОЕ). Кроме того (как будет продемонстрировано в этой работе), на него не влияет присутствие инертных материалов, таких как MNP, даже если они оказываются заряженными или поляризуемыми. Присутствие инертных частиц просто вносит свой вклад в фон, и поскольку m-EIS ищет изменение на объемной емкости на нм от исходного значения (время t = 0), вызванное пролиферацией или гибелью клеток, для определения эффекта кандидатный препарат на микобактериальных клетках, они не влияют на интерпретацию данных, пока их количество остается постоянным.Благодаря сочетанию необходимости небольшого количества клеток для работы и способности работать в присутствии MNP, m-EIS идеально подходит для мониторинга роста / гибели клеток после того, как клетки, присутствующие во всем образце мокроты, были сконцентрированы в небольшой объем с использованием MNP.

3. Материалы и методы

3.1. Обоснование и обзор

Целью разработки этого метода является получение быстрых и точных фенотипических результатов ТЛЧ. Основными препятствиями на пути к этим результатам являются (а) относительно низкая нагрузка микобактерий, которая может присутствовать в мокроте, что приводит к необходимости предварительного культивирования, и (б) относительно низкая скорость метаболизма (время удвоения) микобактерий. , из-за чего сложно отличить суспензию, содержащую клетки, которые растут, несмотря на присутствие лекарств, от суспензии, в которой клетки перестают расти или погибают.Мы преодолеваем первое, изолируя и концентрируя клетки в небольшом объеме с помощью MNP, а второе — с помощью чувствительного электрического метода, который может отслеживать рост / гибель / застой клеток в небольших объемах в режиме реального времени.

Начиная с M . tuberculosis — организм с уровнем биобезопасности 3 (BSL-3), и наша лаборатория сертифицирована только для BSL-2, мы решили использовать аналоги BSL-1 и BSL-2. М . smegmatis — это организм BSL-1, мембрана которого очень похожа на мембрану M . tuberculosis [30, 31] и M . bovis BCG — это организм BSL-2, время удвоения которого составляет ~ 20 часов [32], что сопоставимо с ~ 24-часовым временем удвоения M . туберкулез [30, 31]. Чтобы смоделировать образец пациента из клинических лабораторий, вместо реальной мокроты пациента была создана искусственная мокрота. Поскольку естественная мокрота также содержит немикобактериальные микроорганизмы (грамположительные и грамотрицательные бактерии), мы также добавили в нашу мокроту S . aureus и P . aeruginosa , чтобы представить эффекты присутствия других комменсальных / патогенных бактерий в мокроте.

Обзор применяемого экспериментального протокола изображен на рис. 2. После создания синтетической «инфицированной» мокроты грамположительными, грамотрицательными и микобактериями ее подвергают протоколу деконтаминации и деконтаминации, аналогичному протоколу пациента. претерпит. После деконтаминации и деконтаминации MNP используются для сбора микобактерий.Эффективность процесса дезактивации и эффективность сбора микобактерий, выживших после дезактивации, оценивают с помощью подсчета на чашках. Суспензии микобактерий, содержащие множество микроорганизмов и МНЧ, подобные тем, которые были получены в конце процесса выделения, затем подвергаются воздействию антибиотиков-кандидатов в известной концентрации, после чего оценивается эффективность метода m-EIS для наблюдения за пролиферацией / гибелью клеток в режиме реального времени. . Чтобы установить тот факт, что измерения m-EIS можно проводить, несмотря на наличие MNP, мы также проводим аналогичные тесты без присутствия MNP.Более подробная информация, содержащая отдельные шаги, представлена ниже (включая сбор данных, анализ и статистический анализ).

Рис. 2. Протокол эксперимента.

(A) приготовление искусственной мокроты с микобактериями + грамположительными и грамотрицательными бактериями (B) переваривание / обеззараживание (C) добавление MNP и их связывание с микобактериями (D) выделение микобактерий в осадок и его ресуспендирование (E) Периодический электрический анализ с использованием m-EIS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.g002

3.2. Бактериальный препарат

Все культуры, использованные в эксперименте, были приобретены через АТСС и пересеяны в лаборатории. Для экспериментов in vitro в качестве суррогатов были выбраны два разных типа микобактерий вместо M . туберкулез , а именно. Mycobacterium smegmatis (ATCC 700084) и Mycobacterium bovis BCG (ATCC 3574). Для имитации бактерий, обнаруживаемых в мокроте в образцах пациентов, Staphylococcus aureus (ATCC 29213) и Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) были выбраны как репрезентативные грамположительные и грамотрицательные бактерии соответственно. М . smegmatis культивировали в Миддлбруке 7H9 (Fluka Analytical, Сент-Луис, штат Миссури) и M . bovis BCG культивировали в добавках Middlebrook Albumin Dextrose Catalase (ADC) (HIMEDIA, Mumbai, India). Оба S . aureus и P . aeruginosa культивировали в среде с триптическим соевым бульоном (TSB) ( Sigma Aldrich , St , Louis , Missouri) . Все культуры инкубировали при 37 ° C.Чтобы получить подходящие концентрации для экспериментов, спектрофотометр UV-VIS (Azzota S M 1000) использовался для определения оптической плотности (OD) образцов при 600 нм или 570 нм. Из литературы известно, что значения OD600 0,1 и 0,05 соответствуют концентрациям 1 x 107 КОЕ / мл для M . smegmatis и M . bovis BCG соответственно [33, 34]. Аналогичным образом значение OD570 для 1 x 107 КОЕ / мл S . Сообщается, что aureus равно 0.15 [35], а ~ 1х 108 КОЕ / мл P . aeruginosa составляет 0,1 [36]. Все бактерии выращивали до указанных выше целевых концентраций, а затем последовательно разбавляли для получения концентраций, желательных для введения в искусственный матрикс мокроты.

3.3. Препараты искусственной мокроты

Чтобы точно представить образец пациента, мы создали искусственную мокроту для экспериментов по экстракции. Искусственную мокроту готовили в соответствии с протоколами, доступными в литературе [37–39].Этот образец представлял собой 1% (мас. / Об.) Водный раствор метилцеллюлозы с начальным объемом 1 л. Затем этот образец стерилизовали в автоклаве и к смеси добавляли 1 эмульгированное яйцо для использования в качестве искусственной мокроты в наших экспериментах. Для правильного моделирования бактериального сбора из мокроты до бактериальной концентрации S . aureus и P . aeruginosa составляла 10000 КОЕ / мл. Модель M . smegmatis и M . Концентрация bovis BCG составляла 10 000 КОЕ / мл.Для эксперимента использовали 5 мл мокроты и бактерий для имитации образца. Дальнейшее представление этого шага можно увидеть на рис. 2А.

3.4. Обеззараживание и пищеварение

Этот процесс проводится для обеспечения того, чтобы (а) все немикобактериальные виды были уничтожены из собранных образцов и (б) живые микобактерии высвобождались из матрицы (водный буфер) и могли свободно расти в суспензии. Наиболее часто используемый реагент для переваривания / обеззараживания состоит из смеси N-ацетил-L-цистеина (NALC) и гидроксида натрия, где NALC действует как переваривающий агент, а NaOH действует как обеззараживающий агент.

Для представленных здесь экспериментов был использован стандартный процесс дезактивации NaOH-NALC, предложенный в литературе [40], с небольшими изменениями, а именно. мы использовали немного более низкую концентрацию NaOH, равную 1%, по сравнению с 2%, обычно используемыми в [2], наряду с более короткой продолжительностью воздействия (10 минут для M , smegmatis и M . bovis BCG против 15 минут для M (). tuberculosis ). Это было связано с тем, что M . smegmatis и M . bovis BCG менее выносливы, чем M . tuberculosis , что делает их более восприимчивыми к процессу дезактивации.

Эффективность процесса (как с точки зрения уничтожения немикобактериальных видов, так и с точки зрения выживания микобактерий) оценивалась путем посева аликвот, полученных в начале и в конце процесса дезактивации и экстракции. В начале процесса 5 мл искусственной мокроты, содержащей S . aureus , P . aeruginosa и M . смегматис / M . bovis BCG при ~ 104 КОЕ / мл. Чтобы убедиться в этом, аликвоты 100 мкл «инфицированной» искусственной мокроты помещали на чашки с триптическим соевым агаром (TSA) и 7h20 (для образцов, содержащих M , smegmatis и другие немикобактериальные виды) или TSA и Lowenstein-Jensen. (LJ) чашки (для образцов, содержащих M , bovis BCG и другие немикобактериальные виды) после соответствующих разведений.Подсчет колоний на чашках TSA показывает количество присутствующих немикобактериальных видов, а на чашках 7h20 / LJ указано количество присутствующих микобактерий.

К искусственно приготовленной «инфицированной мокроте» добавляли равный объем (5 мл) 2% NaLC-NaOH, хорошо перемешивали и оставляли на 10 минут. По истечении 10 минут образец нейтрализовали добавлением 450 мкл ~ 12 М HCl. Еще раз аликвоты по 100 мкл из суспензии помещали на чашки с агаром TSA, 7h20 и / или LJ для оценки количества выживших микобактерий и немикобактериальных видов.

3,5. Экстракция с использованием МНЧ

МНЧ, использованные в описанных здесь экспериментах, представляли собой коммерчески доступные гранулы RapiPrep-TBTM (Microsens Biotechnologies, Лондон, Великобритания), которые уже были оптимизированы для связывания с M . tuberculosis В мокроте присутствуют клеток [41–43].

Эти шарики поставляются в виде суспензии, в которой концентрация шариков составляет 2,5 мг / мл. 4 мл этой суспензии добавляют к ~ 10 мл нейтрализованной обеззараженной мокроты, осторожно перемешивают, переворачивая вручную ~ 10 раз, и оставляют на 10 минут.По истечении этого времени смесь снова перемешивали путем переворачивания и помещали трубку на постоянный магнит на 1 минуту. Это притягивает практически все МНЧ к стенке пробирки, образуя осадок, который также содержит микобактерии, прикрепленные к МНЧ. Супернатант отбрасывают, а осадок повторно суспендируют в 1 мл буфера. Аликвоты по 100 мкл этой ресуспензии высевают на планшеты TSA / 7h20 / LJ для оценки количества собранных живых клеток. Можно отметить, что если практически все МНЧ собраны в осадок, ресуспензия будет иметь концентрацию МНЧ ~ 10 мг / мл, которая является концентрацией, используемой во время исследований m-EIS.

Образцы мокроты реальных клинических пациентов (которые содержат микобактерии наряду с другими комменсальными микроорганизмами) могут обрабатываться аналогичным образом для обеззараживания и экстракции с использованием магнитных наночастиц. Обзор протокола обработки образца мокроты пациента перед использованием в m-EIS для определения чувствительности к антибиотикам можно увидеть на рис. 3.

Рис. 3. Реальный протокол обработки образцов мокроты клинических пациентов.

Схема предлагаемого подхода, включающего изоляцию микобактерий с использованием MNPs для обхода прекультуры, что позволяет быстро завершить анализ роста / гибели с использованием измерений m-EIS.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.g003

3,6. Выбор препаратов и проверенных концентраций

Лекарства, испытанные в этом исследовании, представляли собой подгруппу препаратов общего / первого ряда, которые обычно использовались против M . tuberculosis и чьи эффекты на M . smegmatis и / или M . bovis BCG в различных концентрациях ранее исследовались другими исследователями. Как показано в Таблице 1, лекарства были выбраны так, чтобы они отражали различные эффекты, которые они могут иметь в отношении выживаемости микробов: а именно.cidal (когда лекарство убивает микроорганизм), статическим (когда чистое количество живых микроорганизмов не меняется) и неэффективным (когда микроорганизм продолжает размножаться, несмотря на присутствие лекарства). Для каждого цидального / статического лекарственного средства были выбраны три концентрации: одна значительно ниже известного диапазона минимальной ингибирующей концентрации (МИК), одна в пределах известного диапазона МИК и одна намного выше этого же диапазона.

Для M . smegmatis , были выбраны следующие препараты: амикацин (берицидный, с известной МИК 0.5 мг / л [44]), рифампицин (известный как неэффективный [45]) и этамбутол (известный как бактериостатический, с МПК 1 мг / л [44]). Для M . bovis BCG выбраны следующие препараты: амикацин (бактерицидный, с известной МИК 0,125 мг / л [46], пиразинамид (известный как неэффективный [47]) и этамбутол (известный как бактериостатический, с диапазоном МИК). от 2 мг / л до 4 мг / л) [48]).

В реальной ситуации мы ожидаем, что микобактерии, выделенные из мокроты человека с использованием MNP, будут диспергированы в питательной среде и параллельно протестированы против нескольких лекарственных препаратов-кандидатов.Таким образом, мы приготовили суспензии с микобактериями и МНЧ в питательной среде, где как начальная нагрузка микобактерий (~ 105 КОЕ / мл), так и концентрация присутствующих МНЧ (10 мг / мл) были аналогичны той, которую можно было бы получить в конце. описанного выше процесса дезактивации и изоляции. Поскольку априори было неизвестно / не подтверждено, будут ли (а) МНЧ влиять на метаболизм клеток таким образом, который изменяет их реакцию на лекарства, и (б) МНЧ отрицательно влияют на электрические измерения, параллельные эксперименты, там, где MNP не добавлялись, также проводились в качестве основы при попытке оценить эффект MNP.Для любого данного эксперимента готовили ~ 20 мл суспензии (содержащей микобактерии, питательную среду, лекарственные препараты-кандидаты в выбранных концентрациях и / или МНЧ) и инкубировали при 37 ° C. Периодически из этих жидких культур отбирали аликвоты по 50 мкл и измеряли электрические параметры.

3,7. Электрические показания

Аликвоты (~ 50 мкл) были взяты из жидкой культуры и помещены в микрожидкостную кассету, содержащую каналы с поперечным сечением 1 мм x 1 мм. Эти кассеты состоят из стеклянной направляющей и верхней части, напечатанной на 3D-принтере, с выгравированными каналами, прикрепленными с помощью клея (Epo-Tek 301TM).Деталь, напечатанная на 3D-принтере, была изготовлена в лаборатории 3D-печати Mizzou и имела электроды, асимметрично расположенные на расстоянии 10 мм друг от друга, как показано на рис. 4. Таким образом, это позволяет пользователю анализировать объем жидкости ~ 10 мкл (~ 10 мм x 1 мм x 1 мм).

Рис. 4. Принципиальная электрическая схема и модельное представление микроканала.

(а) Электрическая модель водной суспензии, контактирующей с металлическими электродами. Уравнение связывает реальную (синфазную) и мнимую (не синфазную) составляющие измеренного импеданса (Z) и то, как они меняются в зависимости от частоты и параметров модели (Re, Ce, Rb и Cb) (b ) схематическое, и (c) изображение микрожидкостной кассеты.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.g004

Показанные электроды были подключены к анализатору импеданса (Agilent / Keysight 4294A), и были выполнены измерения импеданса [Сопротивление (R) и Реактивность (X)]. записано на 128 частотах (ω) от 1 кГц до 100 МГц. Эти необработанные данные [R (ω) и X (ω)] были проанализированы в автономном режиме с использованием программного обеспечения ZView TM для получения оценки объемной емкости подвески (Cb). Чтобы изучить влияние лекарственных препаратов-кандидатов на клетки микобактерий, такое сканирование одного и того же образца проводилось несколько раз на протяжении всего исследования.Временной интервал между снятием показаний для M составлял от ½ до ¾ часа. smegmatis и 12 часов для M . bovis BCG (кроме случая изучения действия цидального препарата амикацин на M . bovis BCG , где измерения снимали каждый час). В каждый момент времени из жидкой суспензии культуры отбирали 5 независимых аликвот. После загрузки каждой аликвоты (~ 50 мкл) в кассету были проведены электрические измерения. Затем канал дважды очищали стерильной базовой средой (7H9 для M . smegmatis , MGIT для M . bovis BCG ). После очистки канала в канал снова загружали следующую аликвоту ~ 50 мкл до тех пор, пока не будут выполнены 5 измерений.

Хотя разные суспензии имели разные начальные значения Cb (предположительно из-за незначительных различий в начальной загрузке живых микроорганизмов и / или MNP), мы заинтересованы в отслеживании изменений Cb из-за роста / гибели клеток. Следовательно, все показания были масштабированы относительно среднего значения Cb в момент времени t = 0.

3.8. Анализ электрических данных

Данные, собранные анализатором импеданса, представлены в виде значений сопротивления (R) и реактивного сопротивления (X) бактериальной суспензии на 128 логарифмически равных частотах (w) между 1 кГц и 100 МГц. Как описано нами ранее [49], данные R и X в зависимости от ω соответствуют эквивалентной электрической схеме, показанной на рис. 5, с использованием имеющегося в продаже пакета программного обеспечения (ZView ™). Программное обеспечение принимает в качестве входных данных данные Z в зависимости от ω и предоставляет оценку для всех параметров схемы, включая «объемную емкость» (наш интересующий параметр, который обеспечивает измерение зарядов, хранящихся внутри подвески (вдали от электроды)).Можно отметить, что здесь (а) емкости и сопротивления на обоих электродах объединены в одну емкость и сопротивление, соответственно, и (б) как объемная, так и межфазная емкости представлены как элемент постоянной фазы (СРЕ) для учета из-за неидеального характера емкости на клеточных мембранах, где заряды, переносимые ионами, накапливаются за конечное время, в отличие от идеального конденсатора, где накопление происходит мгновенно. Таким образом, величина общего CPE отражает количество заряда, накопленного на мембранах живых микроорганизмов в суспензии.Увеличение количества живых микроорганизмов (вызванное пролиферацией клеток) должно отражаться как увеличение этого значения (величины CPE). С другой стороны, уменьшение количества живых микроорганизмов в суспензии (из-за действия присутствующего лекарства) должно приводить к более низкой объемной емкости (CPEb — T).

Рис 5. Анализ данных с помощью программы ZView®.

Левая сторона показывает графическую линию для сопротивления (Z ’) и реактивного сопротивления (Z”), которые подходят для выбранной схемы (вверху справа).Подгонка дает оценку объемной емкости (в кружке, внизу справа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.g005

При попытке оценить эффективность лекарственного препарата-кандидата (способны ли микобактерии расти в присутствии лекарственного средства, препятствуют ли их росту или убит), наша проблема сводится к установлению, можно ли объективным образом установить, увеличивается ли, уменьшается или остается неизменным значение объемных емкостей в течение наблюдаемого периода времени.Для этого мы подгоняем линейное уравнение к данным (среднего) Cb от времени с помощью Microsoft Excel и исследуем наклон. Excel также предоставляет 95% доверительный интервал для рассчитанного наклона. Верхняя и нижняя границы этого доверительного интервала также регистрируются, чтобы интерпретировать, увеличивается ли Cb, уменьшается или остается неизменным. Если доверительный интервал равен нулю (т.е. верхняя граница этого доверительного интервала положительна, а нижняя граница отрицательна), то нельзя с уверенностью утверждать, что Cb либо увеличивается, либо уменьшается, и выборка считается статической.С другой стороны, если и верхняя, и нижняя границы положительны, то можно утверждать, что Cb увеличивается (и, следовательно, микроорганизмы размножаются), а если и верхняя, и нижняя границы отрицательны, то можно утверждать, что Cb уменьшается. , предположительно потому, что это лекарство убивает микроорганизмы.

4. Результаты

4.1. Пробоподготовка (дезактивация + экстракция)

Как обсуждалось ранее и проиллюстрировано на рис. 1, наш метод требует, чтобы большая часть микобактерий, присутствующих в образце пациента (мокрота), выжила в процессе деконтаминации и впоследствии была собрана MNP в «осадок» для ресуспендирования в небольшом объеме среды DST.Протоколы, принятые для дезактивации и выделения на основе MNP, также были описаны ранее, наряду с протоколами, принятыми для оценки количества живых бактерий различных типов, присутствующих в исследуемой пробе. Результаты (n = 3 для M . smegmatis , n = 2 для M . bovis BCG ) представлены в таблице 2 и на рисунке 6.

Рис. 6. Результаты дезактивации и экстракции.

Данные, показывающие обеззараживание и извлечение жизнеспособных микобактерий из синтетической мокроты с использованием гранул RapiPREP-TB TM для (A) M.smegmatis (n = 3) и (B) M. bovis BCG (n = 2) (> 95% жизнеспособных клеток после обеззараживания собирают в осадок).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.g006

4.2. m-EIS анализ роста / гибели микобактерий

Как объяснялось ранее, были проведены эксперименты с m-EIS, в которых лекарственные препараты-кандидаты в различных концентрациях позволяли воздействовать на образцы, имитирующие те, которые мы ожидаем получить после процесса подготовки образцов (с точки зрения количества живых микобактерий и присутствующих MNP), и измеренная объемная емкость, отслеживаемая в течение определенного периода времени (от 3 до 5 часов для M . smegmatis и до 3 дней для M . bovis BCG ). Чтобы убедиться, что MNP не влияют ни на поведение микобактериальных клеток (в отношении их восприимчивости к тестируемым лекарственным средствам), ни на метод m-EIS для мониторинга указанного роста или гибели, другие эксперименты проводятся параллельно при определенных условиях. аналогично первой серии экспериментов, но без MNP. Результаты (значения объемной емкости, масштабированные до «базового» значения времени t = 0) показаны на рисунках 7 и 8 для M . smegmatis и M . bovis BCG соответственно. В таблицах 3 и 4 показаны выводы, которые можно сделать относительно роста / гибели / застоя микобактерий на основании того, как эти измеренные значения объемной емкости изменяются с течением времени. В таблицах показаны оценки наклона прямой, аппроксимирующие среднее значение измеренной объемной емкости в зависимости от данных времени с 95% доверительным интервалом (ДИ). Если верхняя и нижняя границы доверительного интервала полностью лежат в положительном диапазоне, микобактерии в образце считаются размножающимися; если ДИ полностью находится в пределах отрицательного диапазона, микобактерии считаются умирающими, а если ДИ перекрывает ноль, микобактерии считаются статичными в тестируемых условиях.

Рис. 7. Объемная емкость для M. smegmatis изменяется с течением времени.

Изменение значения измеренной объемной емкости (Cb) как функции времени для культур M. smegmatis с магнитными наночастицами (MNP) и без них при воздействии цидных, статических и неэффективных антибиотиков. Все изменения нормализованы к базовому (время t = 0) значению. (n = 5 в каждой точке данных).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.g007

Рис.8.Объемная емкость для M. bovis BCG со временем изменяется.

Изменение значения измеренной объемной емкости (Cb) как функции времени для культур M. bovis BCG с магнитными наночастицами (MNP) и без них при воздействии цидных, статических и неэффективных антибиотиков. Все изменения нормализованы к базовому (время t = 0) значению. (n = 5 в каждой точке данных).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.g008

Таблица 3.Оценки наклона прямой, аппроксимирующие данные, состоящие из измеренного значения объемной емкости (Cb) (зависимая переменная) как функции времени (t) (независимая переменная) для различных условий, а также нижняя и верхняя границы 95% доверительный интервал для M. smegmatis .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.t003

Таблица 4. Оценки наклона прямой, аппроксимируемые данными, состоящими из измеренного значения объемной емкости (Cb) (зависимая переменная) в зависимости от time (t) (независимая переменная) для различных условий, а также нижняя и верхняя границы 95% доверительного интервала для M.bovis BCG .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0238298.t004

5. Обсуждение

В этой работе мы пытаемся продемонстрировать «доказательство принципа» того, что (а) живые микобактерии могут быть изолированы из мокроты с использованием МНЧ с высокой эффективностью (почти все бактерии, которые выживают при дезактивации) и (б) что Эффективность лекарств-кандидатов на выделенные таким образом микобактерии (в суспензиях, содержащих MNP) можно было проверить в реальном времени с помощью m-EIS.

Как видно из наших экспериментов по изоляции (Таблица 2 и Рис.6), использованный протокол обеззараживания оказался в значительной степени успешным в устранении «контаминантных» грамположительных и грамотрицательных видов (менее 0.6% выживаемость для обоих M . smegmatis и M . bovis BCG ). Однако это сопровождалось значительной потерей количества микобактерий (выживаемость только ~ 70% для M , smegmatis и ~ 56% выживаемости для M . bovis BCG ). Однако следует отметить, что широко используемый протокол [50], из которого были получены наши протоколы путем корректировки силы химикатов и времени воздействия, был сформулирован для M . tuberculosis , микобактерии, более выносливые, чем протестированные нами. Полное (> 5 логарифмов) уничтожение бактерий-контаминантов и выживаемость> 90% (<1 логарифм) M . tuberculosis были зарегистрированы для этого протокола [51].

Что еще более интересно, практически все бактерии (как микобактерии, так и другие бактерии), которые выживают при дезактивации, по-видимому, собираются MNP, практически без разницы в нагрузках, оцененных после дезактивации и после сбора с использованием MNP.Можно отметить, что эти бусы были предназначены для сбора M . tuberculosis клеток и почти 100% сбор других микобактерий — результат лучше, чем ожидалось. Таким образом, в реальной ситуации (когда процесс дезактивации, вероятно, приведет к полному устранению контаминантов и высокой выживаемости микобактерий), весьма вероятно, что наш процесс позволит нам изначально собрать практически все живые микобактерии. присутствует в образце в виде «гранулы», которую затем можно повторно суспендировать в небольшом объеме буфера DST.

Искусственная мокрота, созданная для этого протокола, включала комменсальные бактерии, обычно обнаруживаемые в образцах мокроты человека. Мы понимаем, что включение человеческих клеток, таких как эпителиальные клетки и слизистые вещества (которые могут присутствовать в образцах «реального мира»), будет способствовать лучшему приближению образцов «реального мира». Основываясь на нашем предыдущем опыте использования метода m-EIS [28], когда человеческая кровь (содержащая эритроциты, лейкоциты, некоторые белки и химические вещества) в культуральной среде использовалась для обнаружения бактерий в образце, результаты, полученные с помощью m-EIS, продемонстрировали, что на обнаружение не влияло присутствие этих непролиферирующих клеток / материалов.Мы полагаем, что то же самое верно и в отношении наличия эпителиальных клеток и слизистого материала. Однако будущая работа будет включать в себя реальные образцы мокроты человека с M клеток tuberculosis с присутствием этих нераспространяющихся человеческих клеток и материалов, чтобы определить их влияние на наши методы обнаружения, если таковые имеются.

Поскольку основная цель этого исследования «доказательства принципа» заключалась в том, чтобы убедиться, что (а) результаты МИК могут быть получены путем обхода трудоемкой предварительной культуры микобактерий в пользу быстрого этапа предварительного концентрирования с использованием МНЧ, и что (б) присутствие МНЧ не влияло на точность полученных результатов, в исследовании использовались стандартные штаммы ATCC M bovis и M smegmatis .«Золотой стандарт» фенотипических значений ТЛЧ для этих штаммов АТСС хорошо известен и доступен в литературе. Таким образом, результаты MIC, полученные с помощью метода m-EIS, сравнивались с доступными значениями MIC из литературы, чтобы гарантировать достоверность результатов. M smegmatis и M bovis BCG имеют известные значения МИК 0,5 мг / л [44] и 0,125 мг / л [46] против бактерицидного амикацина соответственно, в то время как бактериостатический этамбутол составляет 1 мг / л [44] и 2 — 4 мг / л [48] соответственно.Рифампицин неэффективен [45] против M smegmatis , а пиразинамид неэффективен против M bovis BCG [47]. Как видно из наших результатов m-EIS (рисунки 7 и 8, а также таблицы 3 и 4), все результаты (как с MNP, так и без них) соответствуют нашим ожиданиям в том смысле, что (а) электрические признаки роста ( увеличение объемной емкости) наблюдаются для контролей (без лекарств), для лекарств, заведомо неэффективных, а также для бактериостатических и бактерицидных препаратов, присутствующих в концентрациях ниже МПК, (б) электрические признаки смерти (снижение объемной емкости) наблюдаются для цидных препараты в концентрации при МИК и / или выше, и (c) электрические сигнатуры, соответствующие бактериальному застою (отсутствие значительного изменения объемной емкости с течением времени), можно увидеть для бактериостатических препаратов с МИК и выше (и для бактерицидного препарата с МИК в дело M bovis BCG ).Более того, аналогичные образцы с МНЧ и без них демонстрируют аналогичное поведение, тем самым развеивая наши опасения относительно потенциального вмешательства в поведение бактерий или электрические показатели.

Одним из основных ограничений текущего исследования является то, что, хотя две части исследования (выделение с использованием MNPs и m-EIS) были проведены независимо, хотя были приняты меры для обеспечения того, чтобы состав суспензий, подвергнутых m-EIS, был аналогичен составу суспензий, подвергнутых m-EIS. те, которые получены в конце протокола изоляции.

Будущая работа будет включать (а) образец из реального мира (человеческая мокрота с M , туберкулезных клеток ), (b) автономные герметичные микрожидкостные кассеты с несколькими лунками, каждая из которых содержит предварительно загруженные выбранные количества лекарств-кандидатов. в 10 мкл «лунки», в которые могут быть загружены суспензии, содержащие питательную среду, микобактерии и MNP, и (c) встроенная электроника для отслеживания нескольких лунок параллельно. Ранее мы продемонстрировали использование m-EIS для обнаружения микобактерий в очищенных образцах мокроты: как на основе обнаружения их пролиферации (процесс, занимающий ~ 36 часов для M . bovis BCG ) [49], а также новый подход «обнаружение по смерти» [52]. Микролунки, предназначенные для реализации этих подходов, могут быть включены в одну и ту же микрожидкостную кассету, чтобы собрать портативное, чувствительное и доступное устройство для обнаружения M . tuberculosis в образцах мокроты и одновременно определяют профиль множественной лекарственной устойчивости возбудителя в течение 3 дней после сбора мокроты.

Можно отметить, что представленные ранее данные m-EIS были получены с использованием суспензий, содержащих микобактерии в концентрациях ~ 105 КОЕ / мл, загруженных в микроканалы, в которых объем области между электродами составлял ~ 10 мкл.Таким образом, это означает, что 1 условие (лекарство-кандидат в выбранной концентрации) может быть протестировано только с 1000 КОЕ микобактерий. Фенотипическое летнее время для M . tuberculosis часто выполняется путем тестирования аналогичных концентраций микобактерий (~ 10 5 КОЕ / мл) по сравнению с определенными «пороговыми» концентрациями препаратов-кандидатов [53]. Таким образом, используя только 5000–10 000 клеток, выделенных из одного (или небольшого количества) образца мокроты, можно потенциально провести тесты на фенотипическую лекарственную чувствительность по отношению к ряду лекарств в течение 3 дней (по сравнению с 4–6 неделями при использовании современных технологий).

Важным аспектом исследовательских усилий было достижение времени оборота тестирования ТЛЧ, сравнимого с молекулярными методами, такими как GeneXpert и Line probe Assays (которые занимают 1-2 дня [8], при сохранении затрат, сопоставимых с дешевизной традиционного фенотипического ТЛЧ. платформы, такие как системы MGIT ^TM и TREK-ESP ^TM. Последние обычно состоят из платформ, стоимость которых составляет ~ 20 000–50 000 долларов США (в зависимости от количества обработанных образцов), а стоимость одного теста составляет менее 10 долларов США за тест.Мы полагаем, что при масштабной реализации нашего подхода стоимость фиксированного оборудования может быть сохранена на уровне около 50 000 долларов, а стоимость продаваемых одноразовых товаров (MNP и микрофлюидные кассеты, предварительно заполненные лекарствами) может быть ограничена примерно 20 долларами за тест. Настоящая работа является первым шагом на пути к демонстрации нашей способности достигать быстрых результатов при тестировании DST. Более того, учитывая, что в конечном продукте показания будут получены электронным способом из запечатанной микрожидкостной кассеты, а оценка микобактериального поведения (рост / смерть / застой) может быть проведена без оценки пользователя, этот продукт должен быть в состоянии преодолеть недостаток методики MODS и представляют собой быструю, надежную и относительно недорогую альтернативу существующим инструментам / методам, доступным для фенотипического ТЛЧ.

Благодарности

Финансовая поддержка была получена от Национального научного фонда в рамках гранта № 1647216 (Фаза I SBIR: недорогая портативная система для быстрого выявления и профилирования лекарственной устойчивости туберкулеза). Мы также хотели бы поблагодарить профессора Эвангелина Алоцилиа из Университета штата Мичиган за полезные обсуждения и советы по культивированию микобактерий. Мы хотели бы поблагодарить Гарольда Бургесона и доктора Джареда Коберли из Лаборатории клинической микробиологии, MU Health Care, Dr.Патрику Л. Смиту из отделения патологии Университета Миссури за их руководство в понимании работы клинических лабораторий и микробиологической практики.

Список литературы

1.
Всемирная организация здоровья. Глобальный отчет о туберкулезе. 2018.
2.
Palaci M, Dietze R, Hadad DJ, Ribeiro FKCa, Peres RL, Vinhas SA и др. Заболевания полости рта и количественная бациллярная нагрузка мокроты при туберкулезе легких. Журнал клинической микробиологии.600 2007. 45 (12): 4064–6. pmid: 17928422
3.
Контроль UCfD, Профилактика. Основная учебная программа по туберкулезу: что должен знать врач. Центры по контролю и профилактике заболеваний Атланта, Джорджия; 2013.
4.
Организация WH. Глобальный доклад о туберкулезе, 2015 г .: Всемирная организация здравоохранения; 2015.
5.
Всемирная организация здоровья. Глобальная ситуация с МЛУ-ТБ; обновление 2017 (слайды). 2017.
6.
Падмаприядаршини Ч., Нарендран Дж., Сваминатан С.Диагностика и лечение туберкулеза у пациентов с коинфекцией ВИЧ. Индийский журнал медицинских исследований. 2011. 134 (6): 850–65. pmid: 22310818
7.
Использование молекулярных зондов для определения устойчивости к изониазиду и рифампицину. Всемирная организация здоровья; 2016.
8.
Использование молекулярных зондов для определения устойчивости к противотуберкулезным препаратам второго ряда. Руководство по политике: Всемирная организация здравоохранения; 2016. Отчет №: 978 92 151056 1.
9.
Часто задаваемые вопросы об анализе Xpert MTB / RIF [Доступно по адресу: http://www.who.int/tb/laboratory/xpert_faqs.pdf.
10.
Roscigno G. Xpert MTB / RIF: обновленная информация о льготных ценах, затратах на установку и запуск, а также постмаркетинговом надзоре. Фонд инновационных новых диагностических средств; 2011.
11.
О’Брайен С.М., Гупта С.К., Виатор Дж. А., Сенгупта С., Мосли Дж., Руд К. Система с многофазным потоком для обнаружения и изоляции веществ.Патенты Google; 2015.
12.
Cade CE, Dlouhy AC, Medzihradszky KF, Salas-Castillo SP, Ghiladi RA. Устойчивость к изониазиду, вызывающая мутации в Mycobacterium tuberculosis KatG: активность образования аддуктов каталазы, пероксидазы и INH-NADH. Белковая наука. 2010. 19 (3): 458–74. pmid: 20054829
13.
Центры по контролю и профилактике заболеваний. Основная учебная программа по туберкулезу: что должен знать врач. 2013.
14.
Смит Дж. М., Серебренникова Ю. М., Хаффман Д. Е., Лепарк Г. Ф., Гарсия-Рубио Л. Х.Новый метод обнаружения микроорганизмов в культурах крови: Часть I. Теоретический анализ и моделирование процессов посева крови. Канадский журнал химической инженерии. 2008. 86 (5): 947–59.
15.
Мур Д.А., Эванс КА, Гилман Р.Х., Кэвидес Л., Коронель Дж., Вивар А. и др. Анализ лекарственной чувствительности под микроскопом для диагностики туберкулеза. Медицинский журнал Новой Англии. 2006. 355 (15): 1539–50. pmid: 17035648
16.
Мид П.С., Слуцкер Л., Дитц В., Маккейг Л.Ф., Брези Дж. С., Шапиро С. и др.Заболевания и смерть, связанные с пищевыми продуктами в США. Возникающие инфекционные заболевания. 1999; 5 (5): 607. pmid: 10511517
17.
Бванга Ф., Хоффнер С., Хайле М, Йолоба МЛ. Тестирование прямой чувствительности к туберкулезу с множественной лекарственной устойчивостью: метаанализ. BMC Инфекционные болезни. 2009; 9 (67).
18.
Мартин Л., Коронель Дж., Фолкс Д., Вальдес М., Мецлер М., Круддер С. и др. Полевая оценка набора Hardy TB MODS Kit ™ для быстрой фенотипической диагностики туберкулеза и туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью.PLoS ONE. 2014; 9 (9): e107258. pmid: 25225802
19.
Ван Л., Мохаммад С.Х., Чайясиринродже Б., Ли К., Риентонг С., Риентонг Д. и др. Оценка теста Auto-MODS, нового инструмента для диагностики туберкулеза для использования в условиях ограниченных ресурсов. Журнал клинической микробиологии. 2015; 53: 172–8. pmid: 25378569
20.
Сенгупта С., Путтасвами С., Чанг Х.С., изобретатели: система и метод быстрого обнаружения жизнеспособных бактерий. Патент США 8,635,028 B2. 2014 г. 1 октября 2010 г.
21.
Сенгупта С., Путтасвами, Сачидеви и Каргупта, Роли, изобретатель; Университет Миссури, правопреемник. Обнаружение живых клеток. USA2018.
22.
Асами К. Характеристика биологических клеток методом диэлектрической спектроскопии. Журнал некристаллических твердых тел. 2002. 305 (1–3): 268–77.
23.
Поортинга А., Бос Р., Бюшер Х. Измерение переноса заряда во время адгезии бактерий к поверхности оксида индия и олова в проточной камере с параллельными пластинами.Журнал микробиологических методов. 1999. 38 (3): 183–9. pmid: 10541431
24.
Del Giorgio PA, Gasol JM. Физиологическая структура и одноклеточная активность морского бактериопланктона. Микробная экология океанов. 2008; 2: 243–85.
25.
Александр П, Лундгрен HP. Лабораторное руководство по аналитическим методам химии белков: Elsevier; 2014.
26.
Путтасвами С., Сенгупта С. Быстрое обнаружение размножения бактерий в образцах пищевых продуктов с использованием измерений импеданса микроканалов на нескольких частотах.Датчики и приборы для пищевых продуктов 653 Качество и безопасность. 2010. 4 (3): 108–18.
27.
Путтасвами С., Ли Б.Д., Сенгупта С. Новый электрический метод раннего обнаружения жизнеспособных бактерий в культурах крови. Журнал клинической микробиологии. 2011; 49 (6): 2286–9. pmid: 21471337
28.
Путтасвами С., Ли, Бьюнг Ду и Сенгупта, Шрамик. Новый электрический метод раннего обнаружения жизнеспособных бактерий в культурах крови. Журнал клинической микробиологии. 2011; 49 (6): 2286–9.pmid: 21471337
29.
Колона NC. Быстрая оценка эффективности антибиотиков для посевов бактерий с низким содержанием бактерий с использованием многочастотных измерений импеданса Колумбия, Миссури: Университет Миссури; 2015.
30.
Смит И. Патогенез микобактерий туберкулеза и молекулярные детерминанты вирулентности. Обзоры клинической микробиологии. 2003. 16 (3): 463–96. pmid: 12857778
31.
Nakedi KC, Nel AJ, Garnett S, Blackburn JM, Soares NC. Сравнительная фосфопротеомика Ser / Thr / Tyr между двумя видами микобактерий: быстрорастущей Mycobacterium smegmatis и медленно растущей Mycobacterium bovis BCG.Границы микробиологии. 2015; 6: 237. pmid: 256
32.
Moriwaki Y, Begum NA, Kobayashi M, Matsumoto M, Toyoshima K, Seya T. Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin и его комплекс клеточной стенки индуцируют новый белок лизосомальной мембраны SIMPLE, который соединяет недостающее звено между липополисахаридом и индуцируемым p53 геном. , LITAF (PIG7), 668 и ген, индуцируемый эстрогеном, EET-1. Журнал биологической химии. 2001. 276 (25): 23065–76. pmid: 11274176
33.
Муругасу-Оэй Б., Дик Т.Бактерицидная активность нитрофуранов в отношении растущих и покоящихся Mycobacterium bovis BCG. Журнал антимикробной химиотерапии. 2000. 46 (6): 917–9. pmid: 11102410
34.
Беттанкур П., Пирес Д., Кармо Н., Анес Э. Применение конфокальной микроскопии для количественной оценки внутриклеточных микобактерий в макрофагах. Микроскопия: наука, технологии, приложения и образование. 2010; 614.
35.
Гриффет Г.К., Каллори Н., Ранкин СК, Бостон Р.К., Моррис Д.О. Оптимизация анализа адгезии Staphylococcus aureus для корнеоцитов лошади.Ветеринарная дерматология. 2012; 23 (1): 57 – e13. pmid: 21992593
36.
Кулотти А., Пакман А.И. Pseudomonas aeruginosa способствует образованию биопленок Escherichia coli в среде с ограниченным содержанием питательных веществ. PLoS One. 2014; 9 (9): e107186. pmid: 25198725
37.
де Кантор И.Н. Лабораторные услуги по борьбе с туберкулезом. Организация и управление Часть I. 1998: 42–3.
38.
Демерс А., Булль А., Уоррен Р., Вервер С., Ван Хелден П., Бер М. и др. Использование смоделированных образцов мокроты для оценки специфичности лабораторно диагностированного туберкулеза.Международный журнал туберкулеза и болезней легких. 2010. 14 (8): 1016–23. pmid: 20626947
39.
Роджерс Дж., Чой Ю. Предварительная оценка обнаружения микобактерий туберкулеза в культуре и искусственной мокроте с использованием мембраны BioNanoPore и ПЦР в реальном времени. J Microb Biochem Technol. 2012; 4: 147–51.
40.
Кубица Г., Краситель В., Кон М., Миддлбрук Г. Переваривание и обеззараживание мокроты N-ацетил-L-цистеином — гидроксидом натрия для культивирования микобактерий.Американский обзор респираторных заболеваний. 1963. 87 (5): 775–9.
41.
Годбейн Р., Дранкур М. Протокол с использованием магнитных шариков для культивирования Mycobacterium tuberculosis из образцов мокроты. Журнал клинической микробиологии. 2013: JCM. 03428–12.
42.
DiNardo AR, Hahn A, Leyden J, Stager C, Baron EJ, Graviss EA и др. Использование струнного теста и образцов кала для диагностики туберкулеза легких. Международный журнал инфекционных болезней. 2015; 41: 50–2. pmid: 26523638
43.Ван Х, Чжао Л., Ю Икс, Ли И, Ма И, Донг Л. и др. Захват шариков повышает чувствительность микроскопии мокроты для диагностики туберкулеза в Пекине, Китай. Труды Королевского общества тропической медицины и гигиены. 2013; 107 (11): 741–3. pmid: 24052595
44.
Родригес Л., Рамос Дж., Коуту И., Амарал Л., Вивейрос М. Транспорт бромида этидия через клеточную стенку Mycobacterium smegmatis: корреляция с устойчивостью к антибиотикам. BMC микробиология. 2011; 11 (1): 35.
45.
Байсарович Дж., Котева К., Хьюз Д.В., Эджим Л., Гриффитс Э., Чжан К. и др. Устойчивость к антибиотикам рифамицина по АДФ-рибозилированию: структура и разнообразие Arr. Труды Национальной академии наук. 2008. 105 (12): 4886–91.
46.
Ритц Н., Тебрюгге М., Коннелл Т.Г., Сиверс А., Робинс-Браун Р., Кертис Н. Чувствительность вакцинных штаммов Mycobacterium bovis BCG к противотуберкулезным антибиотикам. Противомикробные средства и химиотерапия. 2009. 53 (1): 316–8.pmid: 18955515
47.
Сомоскови А., Парсонс Л. М., Салфингер М. Молекулярные основы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду. Респираторные исследования. 2001; 2 (3): 164. pmid: 11686881
48.
Шишидо Ю., Митараи С., Отомо К., Секи М., Сато А., Яно И. и др. Тестирование чувствительности к противотуберкулезным препаратам штамма Mycobacterium bovis BCG Tokyo. Международный журнал туберкулеза и болезней легких. 2007. 11 (12): 1334–8.pmid: 18034955
49.
Каргупта Р., Путтасвами С., Ли А. Дж., Батлер Т. Е., Ли З., Чакраборти С. и др. Быстрое обнаружение живых микобактерий на основе культур с помощью микроканальной спектроскопии электрического импеданса (m-EIS). Биологические исследования. 2017; 50 (1): 21. pmid: 28601089
50.
Ратнам С., Стед Ф.А., Хоус М. Упрощенная процедура ацетилцистеин-щелочного переваривания-деконтаминации для выделения микобактерий из клинических образцов. Журнал клинической микробиологии. 1987. 25 (8): 1428–32.pmid: 3305557
51.
Бурдз Т.В., Вулф Дж., Кабани А. Оценка методов обеззараживания мокроты на Mycobacterium tuberculosis с использованием подсчета жизнеспособных колоний и проточной цитометрии. Диагностическая микробиология и инфекционные болезни. 2003. 47 (3): 503–9. pmid: 14596969
52.
Каргупта Р., Ян Й., Путтасвами С., Ли А. Дж., Падилья Н. А., Футч А. П. и др. Обнаружение по смерти: быстрый способ обнаружения жизнеспособных медленнорастущих микроорганизмов, достигаемый с помощью микроканальной спектроскопии электрического импеданса (m-EIS).