Мутация v617f в гене jak2: Качественная оценка наличия соматической мутации V617F в 14 экзоне гена JAK2 (Qualitative assessment of presence of gene JAK2 617F somatic mutation)

Содержание

Качественная оценка наличия соматической мутации V617F в 14 экзоне гена JAK2 (Qualitative assessment of presence of gene JAK2 617F somatic mutation)

Метод определения
Real-Тime PCR.

Исследуемый материал
Цельная кровь (с ЭДТА)

Уважаемые пациенты. Дни приема биоматериала уточняйте, пожалуйста, по телефону.

Диагностический критерий Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) для ХМПЗ. Молекулярно-генетическая диагностика.

Миелопролиферативные заболевания (МПЗ) – заболевания, характеризующиеся избыточной пролиферацией (выработкой клеток) одного или нескольких ростков кроветворения. Нарушения возникают на уровне стволовых клеток. 

Классические Ph’-негативные ХМПЗ – группа болезней, включающая в себя эритремию (истинную полицитемию, ИП), эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ) и идиопатический миелофиброз (ИМФ). Это хронические лейкозы с поражением на уровне клетки-предшественницы гемопоэза с характерной для опухоли неограниченной пролиферацией этой клетки, потомки которой дифференцируются по всем росткам кроветворения. При этом для эритремии свойственно преобладание красного ростка, для эссенциальной тромбоцитемии – мегакариоцитов и тромбоцитов. Классические ХМПЗ и некоторые другие менее распространенные миелопролиферативные заболевания чаще всего являются приобретенными, спорадическими нарушениями гемопоэза. 

Молекулярные события, лежащие в основе патогенеза ХМПЗ, связаны с дефектами генов, которые кодируют белки, ответственные за нормальное поддержание миелопоэза. Для всех ХМПЗ характерна аномальная тирозинкиназная активность. 

Белок JAK2 принадлежит семейству нерецепторных тирозинкиназ (Janus-киназ), которое включает в себя четыре белка: JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. Для гемопоэза особое значение среди них имеет киназа JAK2, которая осуществляет передачу сигнала не только от эритропоэтина, но и от тромбопоэтина и колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF). Функция белков JAK заключается в том, что они служат промежуточным звеном между рецепторами на мембране клетки и сигнальными молекулами (цитокинами, факторами роста и пр.). Эти молекулы, связываясь с рецепторами JAK-киназ на поверхности клетки, активируют их, что приводит к активации сигнальных путей с участием ряда белков, которые передают сигналы для транскрипции, пролиферации и дифференцировки бластных предшественников. 

При появлении соматической мутации1 JAK2 (1849G/T (617V/F)) эти сигналы активируются автономно, независимо от связывания цитокина со своим рецептором, что приводит к избыточной пролиферации того или иного ростка клеток. Ген JAK2 расположен в локусе 9р24.1. Соматическая мутация 1849G/T (617V/F) выражается в замене нуклеотида G→T в позиции 1849 (четырнадцатый экзон), которая в свою очередь приводит к замене фенилаланина (F) на валин (V) в 617 позиции аминокислотной последовательности белка. 

JAK2 1849G/T (617V/F) является соматической мутацией, возникающей в гемопоэтических клетках-предшественницах. Она встречается у подавляющего большинства больных ХМПЗ, что делает эту мутацию очень удобным диагностическим маркером. Наличие точечной мутации JAK2 1849G/T (617V/F) – феномен, характерный исключительно для поражений миелоидного ростка, и не описан ни для солидных опухолей, ни для опухолей лимфоидного происхождения. 

______________________________________ 

1 Мутация 1849G/T (617V/F) является соматической, т. е.: 

  1. Возникает у человека спонтанно, а не передается по наследству от родителей.  
  2. Мутантный аллель выявляется в основном в виде гетерозиготного генотипа. 
  3. Возможно возникновение мутации через несколько лет после проведения данного анализа, следовательно, при необходимости целесообразно повторное проведение анализа.

Таблица 1. Молекулярные аномалии, связанные с «классическими» миелопролиферативными заболеваниями

Генетическая аномалия Нозология Частота, %
JAK2 1849G/T (617V/F) Истинная полицитемия > 95
Эссенциальная тромбоцитемия 50-70
Первичный миелофиброз 40-50

Мутация JAK2 1849G/T (617V/F) – диагностический маркер, при помощи которого можно проводить первичную и дифференциальную диагностику ХМПЗ, а также молекулярный мониторинг минимальной остаточной болезни (количественный тест).

Алгоритм проведения молекулярной диагностики МПЗ (рис. 1)

Определение химерного онкогена BCR/ABL позволяет провести дифференциальный анализ хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) и Ph’-негативных МПЗ. Если в случае Ph’-негативных МПЗ мутация JAK2 1849G/T (617V/F) не найдена, то в случае ИП следует осуществить поиск мутаций в двенадцатом экзоне гена JAK2, а в случае ЭТ и ИМФ – мутаций MPL W515L/K. В случае отрицательного результата следует исключить возможность наследственных дефектов генов VHL, EPO-R, PHD2, THPO, MPL и генов глобинов. При редких видах МПЗ, негативных по JAK2 V617F, целесообразно осуществить поиск химерных онкотирозинкиназ. 

Сейчас молекулярное исследование входит в диагностические критерии ВОЗ 2008 г., а тест на наличие мутации JAK2 стал стандартным методом диагностики ХМПЗ. Выявление мутации указывает на наличие клонального ХМПЗ и исключает возможность реактивного эритроцитоза, тромбоцитоза или миелофиброза.

Таблица 2. Диагностические критерии ВОЗ для ХМПЗ (2008)

В настоящее время исследование на наличие мутации JAK2 1849G/T (617V/F) – необходимое условие для установления правильного диагноза и определения дальнейшей тактики ведения пациента.

Литература

  1. Абдулкадыров К.М., Шуваев В.А., Мартынкевич И.С. Критерии диагностики и современные методы лечения первичного миелофиброза. Вестник гематологии. — М. 2013;3(9):44-78. 

  2. Мисюрин А.В. Молекулярный патогенез миелопролиферативных заболеваний. Клиническая онкогематология. — М. 2009;3(2):211-220. 

  3. Саврилова А.М., Костерина А.В., Ахмадеев А.Р. Выявление мутации JAK2 V617F при хронических Ph-негативных заболеваниях. Генетика, Практическая Медицина. Инновационные Технологии в Медицине. — М. 2014;4(14):100-102. 

  4. Материалы фирмы-производителя тест-системы.

Анализ мутаций в 12 экзоне JAK2 гена (ПЦР, кач.) Analysis of JAK2 Exon 12 mutations (PCR qualitative)

Метод определения
полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование

Исследуемый материал
Цельная кровь (с ЭДТА)

Доступен выезд на дом

Истинная полицитемия (ИП) – редкое заболевание, в основе патогенеза которого лежит дефект стволовой кроветворной клетки с последующей соматической мутацией в гене янускиназы 2 (JAK2), приводящий к пролиферации миелоидных ростков кроветворения, в большей степени эритроцитарного, с риском развития сосудистых тромбозов и тромбоэмболий. Длительная пролиферация гемопоэтических клеток приводит к фиброзу и замещению деятельного костного мозга волокнами коллагена, развитию вторичного постполицитемического миелофиброза. У части больных может происходить дальнейшее прогрессирование болезни в фазу бластной трансформации. Благодаря достигнутым в последние годы успехам в расшифровке молекулярно-генетических механизмов ИП значительно улучшилась диагностика и создан новый класс лекарственных препаратов, обладающих патогенетическим действием [1]. 

Все пациенты со стойкими изменениями в клиническом анализе крови в виде высоких показателей гемоглобина, гематокрита и эритроцитозом, сохраняющихся более 2 месяцев, должны быть обследованы для исключения миелопролиферативного заболевания. Диагноз ИП должен быть установлен в соответствии с критериями ВОЗ на основании комплексной оценки клинической картины и лабораторных показателей. Большими диагностическими критериями ИП являются:

  1. Гемоглобин более 185г/л для мужчин и 165 г/л для женщин или другие признаки повышения объема циркулирующих эритроцитов.
  2. Мутация гена JAK2 V617F или в 12 экзоне (4, 5).

Определяющим при ИП является обнаружение точечной мутации в 14 экзоне гена JAK2 V617F (встречается у около 95% больных). Если мутация JAK2V617F не найдена, то рекомендуется осуществить молекулярную диагностику мутаций в 12 экзоне гена JAK2 (около 4%) [2, 3].

Методы генетической диагностики онкогематологических заболеваний

Литература

  1. Абдулкадыров К. М., Шуваев В.А., Мартынкевич И.С. Современные представления о диагностике и лечении истинной полицитемии. Вестник гематологии, 2015; 11(1): 4-46. 

  2. Абдулкадыров К. М., Шуваев В. А., Мартынкевич И. С. Что нам известно об истинной полицитемии (обзор литературы и собственные данные). Онкогематология, 2015; 3(10): 28-42. 

  3. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016; 127(10): 2391-2405.

  4. Клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз). Национальное гематологическое общество. 2014. http://docplayer.ru/40035289-Rossiyskie-rekomendacii-po-diagnostike-i-terapii-ph-otricatelnyh-mieloproliferativnyh-zabolevaniy-istinnaya-policitemiya-essencialnaya.html  

  5. Ковригина А. М., Байков В.В. Истинная полицитемия: новая концепция диагностики и клинические формы. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. Том: 9, Номер: 2, Год: 2016 Страницы: 115-122. DOI:10.21320/2500-2139-2016-9-2-115-122. https://elibrary.ru/item.asp?id=26323243

ЧАСТОТА ОБНАРУЖЕНИЯ МУТАЦИИ ГЕНА JAK2 СРЕДИ ДОНОРОВ КРОВИ | Ольховский

1. Jelinek J, Oki Y, Gharibyan V et al. JAK2 mutation 1849G>T is rare in acute leukemias but can be found in CMML, Philadelphia chromosome-negative CML, and megakaryocytic leukemia. Blood 2005; 106:3370—3373.

2. Tefferi A, Vardiman JW. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2008; 22:14—22.

3. Xu X, Zhang Q, Luo J et al. JAK2V617F: prevalence in a large Chinese hospital population. Blood 2007; 109:339—342.

4. Orloff K, Tierney B. Community Health Screening Report, 2010. Доступно в интернете по адресу: http://www.atsdr.cdc.gov/HAC/pha/CommunityHealthScreeninginPA2010/CommunityHealthScreeningReport.pdf (по состоянию на25 июня2016 г.).

5. Nielsen C, Bojesen SE, Nordestgaard BG et al. JAK2 V617F somatic mutation in the general population: myeloproliferative neoplasm development and progression rate. Haematologica 2014; 99:1448—1455.

6. Titmarsh GJ, Duncombe AS, McMullin MF et al. How common are myeloproliferative neoplasms? A systematic review and meta-analysis. Am J Hematol 2014: 89:581—587.

7. Ольховский И. А., Столяр М. А. Особенности агрегационной активности тромбоцитов у пациентов с мутацией в генеJAK2: гендерные отличия и эффект аспирина. Гематология и трансфузиология2014; 59:11—14.

8. Schwarz J, International Hematology Expert Meeting 2014 Hermagor/ Austria. Доступно в интернете по адресу: http://xn-80aajeesum3a.xn-p1ai/pdf/Myeloproliferative.pdf (по состоянию на25 июня2016 г.).

9. Dentali F, Ageno W, Rumi E et al. Cerebral venous thrombosis and myeloproliferative neoplasms: results from two large databases. Thromb Res 2014; 134:41—43.

10. Passamonti SM, Biguzzi E, Cazzola M et al. The JAK2 V617F mutation in patients with cerebral venous thrombosis. J Thromb Haemost 2012; 10:998—1003.

11. Xavier SG, Gadelha T, Rezende SM et al. JAK2V617F mutation in patients with thrombosis: to screen or not to screen? Int J Lab Hematol 2011; 33:117—124.

12. Smalberg JH, Arends LR, Valla DC et al. Myeloproliferative neoplasms in Budd—Chiari syndrome and portal vein thrombosis: a meta-analysis. Blood 2012; 120:4921—4928.

13. Ольховский И. А., Карапетян Г. Э., Горбенко А. С. и др. Выявляемость пациентов с онкогенной соматической мутацией янускиназы-2 (V617F JAK2) в рамках программ диспансерного и профилактического осмотров. Клиническая лабораторная диагностика2016; 61:275—278.

14. Muendlein A, Gasser K, Kinz E et al. Evaluation of the prevalence and prospective clinical impact of the JAK2 V617F mutation in coronary patients. Am J Hematol 2014; 89:295—301.

15. Hinds DA, Barnholt KE, Mesa RA et al. Germ line variants predispose to both JAK2 V617F clonal hematopoiesis and myeloproliferative neoplasms. Blood 2016; 128:1121—1128.

16. Vassiliou GS. JAK2 V617F clonal disorders: fate or chance? Blood 2016; 128:1032—1033.

17. Sidon P, El Housni H, Dessars B et al. The JAK2V617F mutation is detectable at very low level in peripheral blood of healthy donors. Leukemia 2006; 20:1622.

18. Tagariello G, Di Gaetano R, Sartori R et al. The JAK2V617F tyrosine kinase mutation in blood donors with upper-limit haematocrit levels. Blood Transfusion 2009; 7:111—116.

19. Magnussen K, Hasselbalch H, Ullum H et al. Characterization of blood donors with high haemoglobin concentration. Vox Sang 2013; 104:110—114.

20. Edgren G, Reilly M, Hjalgrim H et al. Donation frequency, iron loss, and risk of cancer among blood donors. J Natl Cancer Inst 2008; 100:572—579.

21. Edgren G, Nyren O, Hultcrantz M et al. Blood donation and risk of polycythemia vera. Transfusion 2016; 56:1622—1627.

22. Khudhair MA. Detection of JAK2V617F mutation and estimation of serum erythropoietin among blood donors with high hematocrit. University of Baghdad, 2014. Доступно в интернете по адресуhttp://www.comed.uobaghdad.edu.iq/uploads/Thesis%202015/May%20Ahmed%20 Khudhair.pdf (по состоянию на25 мая2016 г.).

23. Горбенко А. С., Столяр М. А., Субботина Т. Н. и др. Разработка метода определения аллельной нагрузки соматической мутацииV617F в генеJAK2 (янускиназы2) в пулах проб венозной крови. Лабораторная служба2016; 1:19—25.

24. Krichevsky S, Prus E, Perlman R et al. The JAK2V617F mutation in normal individuals takes place in differentiating cells. Blood Cells Mol Dis 2017; 63:45—51.

25. Nemer W, De Grandis M, Brusson M. Abnormal adhesion of red blood cells in polycythemia vera: a prothrombotic effect? Thromb Res 2014; 133:S107—111.

26. Kubota Y, Tanaka T, Ohnishi H et al. Constitutively activated phosphatidylinositol 3-kinase primes platelets from patients with chronic myelogenous leukemia for thrombopoietin-induced aggregation. Leukemia 2004; 18:1127—1137.

27. Falanga A, Marchetti M, Vignoli A et al. Leukocyte-platelet interaction in patients with essential thrombocythemia and polycythemia vera. Exp Hematol 2005; 33:523—530.

28. Falanga A, Marchetti M. Thrombotic disease in the myeloproliferative neoplasms. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2012; 2012:571—581.

29. Hirsch P, Mamez AC, Belhocine R et al. Clonal history of a cord blood donor cell leukemia with prenatal somatic JAK2 V617F mutation. Leukemia 2016; 30:1756—1759.

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭССЕНЦИАЛЬНОГО ТРОМБОЦИТОЗА И ПЕРВИЧНОГО МИЕЛОФИБРОЗА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МУТАЦИОННОГО СТАТУСА ГЕНОВ JAK2 И CALR1 | Лисина

1. Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J. et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disor-ders. Lancet 2005;365:1054–1056. DOI: 10.1016/S0140-6736(05)71142-9. PMID: 15781101.

2. James C., Ugo V., Le Couedic J.P. et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera. Nature 2005;434(7037):1144–1148. DOI: 10.1038/nature03546. PMID: 15793561.

3. Levine R.L., Wadleigh M., Cools J. et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell 2005;7(4):387–397. DOI: 10.1016/j.ccr.2005.03.023. PMID: 15837627.

4. Kralovics R., Passamonti F., Buser A.S. et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med 2005;352(17):1779–1790. DOI: 10.1056/NEJMoa051113. PMID: 15858187.

5. Levine R.L., Belisle C., Wadleigh M. et al. X-inactivation-based clonality analysis and quantitative JAK2V617F assessment reveals a strong association between clonality and JAK2V617F in PV but not ET/MMM, and identifies a subset of JAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hema-topoiesis. Blood 2006;107(10):4139–4141. DOI: 10.1182/blood-2005-09-3900. PMID: 16434490.

6. Antonioli E., Guglielmelli P., Pancrazzi A. et al. Clinical implications of the JAK2 V617F mutation in essential thrombocythe-mia. Leukemia 2005;19:1847–1849. DOI: 10.1038/sj.leu.2403902. PMID: 16079890.

7. Campbell P.J., Scott L.M., Buck G. et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status:a prospective study. Lancet 2005;366:1945–1953. DOI: 10.1016/S0140-6736(05)67785-9. PMID: 16325696.

8. Jones A.V., Kreil S., Zoi K. et al. Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Blood 2005;106(6):2162–2168. DOI: 10.1182/blood-2005-03-1320. PMID: 15920007.

9. Wolanskyj A.P., Lasho T.L., Schwager S.M. et al. JAK2 mutation in essential thrombocythaemia: clinical associations and longterm prognostic relevance. Br J Haematol 2005;131(2):208–213. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2005.05764.x. PMID: 16197451.

10. Campbell P.J., Griesshammer M., Dohner K. et al. V617F mutation in JAK2 is associated with poorer survival in idiopathic myelofibrosis. Blood 2006;107:2098–2100. DOI: 10.1182/blood-2005-08-3395. PMID: 16293597.

11. Tefferi A., Lasho T.L., Schwager S.M. et al. The JAK2(V617F) tyrosine kinase mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia: lineage specificity and clinical correlates. Br J Haematol 2005;131(3):320–328. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2005.05776.x. PMID: 16225651.

12. Passamonti F., Elena C., Schnittger S. et al. Molecular and clinical features of the myeloproliferative neoplasm associated with JAK2 exon 12 mutations. Blood 2011;117(10):2813–6. DOI: 10.1182/blood-2010-11-316810. PMID: 21224469.

13. Kisseleva T., Bhattacharya S., Braunstein J., Schindler C.W. Signaling through the JAK/ STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 2002;285(1–2):124. PMID: 12039028.

14. Sandberg E.M., Wallace T.A., Godeny M.D. et al. Jak2 tyrosine kinase: a true jak of all trades? Cell Biochem Biophys 2004;41(2):207–232. PMID: 15475610.

15. Zhao R., Xing S., Li Z. et al. Identification of an acquired JAK2 mutation in polycythemia vera. J Biol Chem 2005;280(24):22788–22792. DOI: 10.1074/jbc.C500138200. PMID: 15863514.

16. Staerk J., Lacout C., Sato T. et al. An amphipathic motif at the transmembrane-cytoplasmic junction prevents autonomous activation of the thrombopoietin receptor. Blood 2006;107(5):1864–1871. DOI: 10.1182/blood-2005-06-2600. PMID: 16249382.

17. Pikman Y., Lee B.H., Mercher T. et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med 2006;3(7):e270. DOI: 10.1371/journal.pmed.0030270. PMID: 16834459.

18. Pardanani A.D., Levine R.L., Lasho T. et al. MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. Blood 2006;108(10):3472–6. DOI: 10.1182/blood-2006-04-018879. PMID: 16868251.

19. Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S. et al. Somatic Mutations of Calreticulin in Myeloproliferative Neoplasms. N Engl J Med 2013;369(25):2379–2390. DOI: 10.1056/NEJMoa1311347. PMID: 24325356.

20. Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. et al. Somatic CALR Mutations in Myeloproliferative Neoplasms with Nonmutated JAK2. N Engl J Med 2013;369(25):2391–2405. DOI: 10.1056/NEJMoa1312542. PMID: 24325359.

21. Rumi E., Pietra D., Ferretti V. et al. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro Gruppo Italiano Malattie Mieloproliferative Investigators. JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes. Blood 2014;123(10):1544–1551. DOI: 10.1182/blood-2013-11-539098. PMID: 24366362.

22. Cabagnols X., Defour J.P., Ugo V. et al. Differential association of calreticulin type 1 and type 2 mutations with myelofibrosis and essential thrombocytemia: relevance for disease evolution. Leukemia 2015;29:249–252. DOI: 10.1038/leu.2014.270. PMID: 25212275.

23. Chachoua I., Pecquet C., El-Khoury M. et al. Thrombopoietin receptor activation by myeloproliferative neoplasm associated calreticulin mutants. Blood 2016;127(10):1325–35. DOI: 10.1182/blood-2015-11-681932. PMID: 26668133.

24. Araki M., Yang Y., Masubuchi N. et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood 2016;127(10):1307–1316. DOI: 10.1182/blood-2015-09-671172. PMID: 26817954.

25. Abdel-Wahab O., Manshouri T., Patel J. et al. Genetic analysis of transforming events that convert chronic myeloproliferative neoplasms to leukemias. Cancer Res 2010;70(2):447–452. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-09-3783. PMID: 20068184.

26. Delhommeau F., Dupont S., Della Valle V. et al. Mutation in TET2 in myeloid cancers. N Engl J Med 2009;360(22):2289–2301. DOI: 10.1056/NEJMoa0810069. PMID: 19474426.

27. Zhang S.J., Rampal R., Manshouri T. et al. Genetic analysis of patients with leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms shows recurrent SRSF2 mutations that are associated with adverse outcome. Blood 2012;119(19):4480–4485. DOI: 10.1182/blood-2011-11-390252 PMID: 22431577.

28. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C.M. et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triplenegative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia 2014;28(7):1472–1477. DOI: 10.1038/leu.2014.3. PMID: 24402162.

29. Rampal R., Ahn J., Abdel-Wahab O. et al. Genomic and functional analysis of leukemic transformation of myeloproliferative neoplasms. Proc Natl Acad Sci USA 2014;111(50):E5401–E5410. DOI: 10.1073/pnas.1407792111. PMID: 25516983.

30. Skoda R.C., Duek A., Grisouard J. Pathogenesis of myeloproliferative neoplasms. Exp Hematol 2015;43(8):599–608. DOI: 10.1016/j.exphem.2015.06.007. PMID: 26209551.

31. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127(20):2391–2405. DOI: 10.1182/blood-2016-03-643544. PMID: 27069254.

32. Rumi E., Pietra D., Pascutto C. et al. Clinical effect of driver mutations of JAK2, CALR, or MPL in primary myelofibrosis. Blood 2014;124(7):1062–9. DOI: 10.1182/blood-2014-05-578435. PMID: 24986690.

33. Tefferi A., Wassie E.A., Lasho T.L. et al. Calreticulin mutations and longterm survival in essential thrombocythemia. Leukemia 2014;28(12):2300–3. DOI: 10.1038/leu.2014.148. PMID: 24791854.

34. Andrikovics H., Krahling T., Balassa K. et al. Distinct clinical characteristics of myeloproliferative neoplasms with calreticulin mutations. Haematologica 2014;99(7):1184–1190. DOI: 10.3324/haematol.2014.107482. PMID: 24895336.

35. Roques M., Park J.H., Minello A. et al. Detection of the CALR mutation in the diagnosis of splanchnic vein thrombosis. Br J Haematol 2015;169(4):601–603. DOI: 10.1111/bjh.13235. PMID: 25413838.

36. Turon F., Cervantes F., Colomer D. et al. Role of calreticulin mutations in the aetiological diagnosis of splanchnic vein thrombosis. J Hepatol 2015;62(1):72–74. DOI: 10.1016/j.jhep.2014.08.032. PMID: 25173966.

37. Sazawal S., Singh N., Mahapatra M. et al. Calreticulin mutation profile in Indian patients with primary myelofibrosis. Hematology 2015;20(10):567–570. DOI: 10.1179/1607845415Y.0000000018. PMID: 25959795.

38. Tefferi A., Lasho T.L., Finke C. et al. Type 1 vs type 2 calreticulin mutations in primary myelofibrosis: differences in phenotype and prognostic impact. Leukemia 2014;28(7):1568–1570. DOI: 10.1038/leu.2014.83. PMID: 24569778.

39. Tefferi A., Wassie E.A., Guglielmelli P. et al. Type 1 versus Type 2 calreticulin mutations in essential thrombocythemia: a collaborative study of 1027 patients. Am J Hematol 2014;89(8):E121–E124. DOI: 10.1002/ajh.23743. PMID: 24753125.

40. Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2008;22(1):14–22. DOI: 10.1038/sj.leu.24049550. PMID: 17882280.

41. Cervantes F., Dupriez B., Pereira A. et al. New prognostic scoring system for primary myelofibrosis based on a study of the International Working Group for Myelofibrosis Research and Treatment. Blood 2009;113(13):2895–901.

42. Passamonti F., Cervantes F., Vannucchi A.M. et al. A dynamic prognostic model to predict survival in primary myelofibrosis:a study by the IWG-MRT (International Working Group for Myeloproliferative Neoplasms Research and Treatment). Blood 2010;115(9):1703–8.

43. Al Assaf C., Van Obbergh F., Billiet J. et al. Analysis of phenotype and outcome in essential thrombocythemia with CALR or JAK2 mutations. Haematologica 2015;100(7):893–897. DOI: 10.3324/haematol.2014.118299. PMID: 25934766.

Количественное определение мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования

Перевод названия: The quantitative testing of V617F mutation in gen JAK2 using pyrosequencing technique

Тип публикации: статья из журнала

Год издания: 2014

Ключевые слова: Jak2, chronic myeloprolific diseases, pyrosequencing, хронические миелопролиферативные заболевания, пиросеквенирование

Аннотация: Соматическая мутация V617F в гене JAK2 является частой причиной хронических миелопролиферативных заболеваний, не обусловленных мутацией BCR/ABL. Количественное определение относительной доли мутантного аллеля может быть использовано для определения тяжести течения и прогноза заболевания, а также при назначении лекарств, ингибирующих активность JAK2. Для количественного определения мутации использован метод пиросеквенирования. Разработанная методика позволяет детектировать и количественно определять долю мутантной фракции начиная от 7%. “Серую зону» представляют образцы, имеющие долю мутантного аллеля от 4 до 7%. Зависимость ожидаемой доли мутантной фракции в анализируемом образце от наблюдаемого значения сигнала описывается уравнением прямой с коэффициентами регрессии: y=0,97x-1,32, при этом погрешность измерения составляет ± 0,7. Разработанная методика апробирована на клиническом материале от 192 пациентов с основными формами миелопролиферативных заболеваний, не обусловленных мутацией BCR/ABL. Обнаружено 64 образца, содержащих мутантную фракцию в количестве от 13 до 91%. Разработанная методика позволяет проводить мониторинг терапии миелопролиферативных заболеваний и помогает оптимизировать тактику лечения.
The somatic mutation V617F in gen JAK2 is a frequent cause of chronic myeloprolific diseases not conditioned by BCR/ABL mutation. The quantitative testing of relative percentage of mutant allele can be used in establishing severity of disease and its prognosis and in prescription of remedy inhibiting activity ofJAK2. To quantitatively test mutation the pyrosequencing technique was applied. The developed technique permits detecting and quantitatively testing percentage of mutation fraction since 7%. The “gray zone» is presented by samples with percentage of mutant allele from 4% to 7%. The dependence of expected percentage of mutant fraction in analyzed sample from observed value of signal is described by equation of line with regression coefficients y= — 0.97, x= -1.32 and at that measurement uncertainty consists ±0.7. The developed technique is approved officially on clinical material from 192 patients with main forms of myeloprolific diseases not conditioned by BCR/ABL mutation. It was detected 64 samples with mutant fraction percentage from 13% to 91%. The developed technique permits implementing monitoring of therapy of myeloprolific diseases and facilitates to optimize tactics of treatment.

Ссылки на полный текст

Определение мутации V617F в гене JAK2 у пациентов с неверифицированными хроническими миелопролиферативными заболеваниями

Сабурова И. Ю., Оникийчук Я. С., Зотова И. И., Сологуб Г. Н., Зарайский М. И.

doi 10.3205/ctt-2008-en-000018.01

Отправлено 30 Октября 2008
Одобрено 11 Декабря 2008
Опубликовано 17 Декабря 2008

Резюме

Миелопролиферативные заболевания (МПЗ) представляют собой гетерогенную группу нарушений гемопоэза, сопровождающихся множественной гиперплазией клеток костного мозга. Их диагностика сложна и часто основывается на критериях исключения. Одним из наиболее диагностически значимых критериев для МПЗ является наличие мутации V617F в гене JAK2. Основная цель данной статьи – описание скринингового метода детекции V617F в гене JAK2, пригодного для первичной диагностики. Геномная ДНК от 58 пациентов с неверифицированным миелопролиферативным заболеванием выделялась по стандартной технологии. Детекция наличия мутации V617F в гене JAK2 проводилась с использованием двух пар праймеров, специфичных для мутантного и дикого типов генов JAK2. Использовалась клеточная линия UKE1 (Б. Фезе, Германия). Установлено, что представляемая методика выявляет наличие мутации V617F в гене JAK2 с диагностически значимой чувствительностью и специфичностью. Частота мутации в общей группе составила 29,3%. Процент встречаемости мутации V617F в гене JAK2 в группе первичных пациентов с неверифицированным диагнозом МПЗ составил 25,7%. Таким образом, разработанный нами метод определения мутации V617F в гене JAK2 может быть использован в качестве скрининговой диагностики у пациентов с неверифицированными хроническими миелопролиферативными заболеваниями.

Ключевые слова

миелопролиферативные заболевания, мутация v617f в гене jak2, полимеразная цепная реакция (пцр)


doi 10.3205/ctt-2008-en-000018.01

Отправлено 30 Октября 2008
Одобрено 11 Декабря 2008
Опубликовано 17 Декабря 2008

Определение мутации V617F в 14 экзоне гене Jak 2 киназы (28.68) качественно


Определение мутации гена, контролирующего кроветворение (JAK 2), представляет собой генетический метод исследования. Анализ назначается для выявления риска развития тромбозов и формирования миелопролиферативных заболеваний. В результате изучения генома обнаруживают мутационные изменения, устанавливают повышенную активность свертывающей способности крови вследствие нарушения физиологической активности янус киназы 2. Основываясь на результатах обследования, проводят профилактические мероприятия, предупреждающие развитие патологии.


Показания для проведения анализа


Миелопролиферативные заболевания представляют собой патологический процесс, связанный с повышенной активностью того или иного ростка кроветворения. Изменения возникают на уровне стволовых клеток, вследствие чего развиваются такие болезни, как хронический миелолейкоз, сублейкемический миелоз, тромбоцитемия, эритремия, истинная полицитемия (болезнь Вакеза). Мутации гена, кодирующего янус киназу 2, приводят к усилению функциональной активности вещества и присоединению к нему молекул STAT-белков. Это вызывает повышение индукции транскрипции генов, расщеплению ядра, усиленному делению предшественников клеток крови.


Обследование назначается в следующих случаях:


  • выявление атипичных форм миелопролиферативных заболеваний;

  • подтверждение диагноза эссенциальной тромбоцитопении, истинной полицитемии, идиопатического миелофиброза;

  • дифференциальная диагностика первичного и вторичного эритроцитоза;

  • дополнительный метод исследования при цитологии и гистологии костного мозга;

  • определение риска появления тромбозов и тромбоэмболических осложнений.


Все миелопролиферативные заболевания обуславливают высокую вероятность развития тромбозов венечных аретрий, мезентериальных сосудов, вен головного мозга


Подготовка к исследованию


Необходимо воздержаться от приема пищи в течение 2-3 часов.

Соматическая мутация JAK2 V617F, смертность и риск рака в общей популяции

Резюме

JAK2 V617F присутствует у большинства пациентов с миелопролиферативным раком; однако его распространенность и клиническое значение среди населения в целом неизвестны. Мы проверили наличие мутации у 10 507 участников Копенгагенского городского исследования сердца с периодом наблюдения до 17,6 лет.

Распространенность мутации составила 0,2% (n = 18).Все 18 положительных мутаций погибли во время наблюдения, что соответствует многофакторному скорректированному отношению рисков ранней смерти 3,0 (95% ДИ: 1,9–4,9). Соответствующие коэффициенты риска для мужчин по сравнению с женщин и увеличение возраста за 1 год составили 1,4 (1,1–1,9) и 1,1 (1,1–1,1). Многофакторно скорректированные отношения рисков для любого рака, гематологического рака и миелопролиферативного рака составили 3,7 (1,7–8,0), 58 (13–261) и 161 (12–2,197) соответственно. Соответствующие коэффициенты опасности составили 1,2 (0,8–2,0), 2,3 (0,2–25), 1.3 (0,3–5,4) для мужчин по сравнению с женщин и 1,0 (1,0–1,1), 1,1 (0,9–1,2), 0,9 (0,8–1,1) для возрастных групп до 1 года. В общей популяции JAK2 V617F ассоциируется с повышенной заболеваемостью и смертностью, хотя присутствует только у 18 из 10 507 (0,2%).

Ключевые слова: JAK2 V617F, смертность, риск рака

Введение

Мутация JAK2 V617F является приобретенной соматической мутацией, присутствующей у большинства пациентов с миелопролиферативным раком (миелопролиферативными новообразованиями) i.е. почти у 100% пациентов с истинной полицитемией и примерно у 50% пациентов с эссенциальным тромбоцитозом и первичным миелофиброзом. 1 5 Мутация JAK2 V617F также может преобладать у людей без явных признаков миелопролиферативного рака. 6 9 Однако значение мутации в этой ситуации неизвестно, что заставляет нас исследовать, связано ли присутствие мутации JAK2 V617F у людей из общей популяции с плохим здоровьем.

Мы измерили распространенность мутации JAK2 V617F и проверили гипотезу о том, что наличие мутации связано с общей смертностью, риском любого рака, гематологического рака и миелопролиферативного рака у людей в общей популяции. С этой целью мы проверили ДНК, выделенную из образцов цельной крови 10 507 участников Копенгагенского городского исследования сердца, за которыми наблюдали в течение 17,6 лет после взятия образцов крови. После скрининга наличие мутации было подтверждено двумя независимыми анализами с использованием различных аналитических методов.

Дизайн и методы

Исследование было одобрено датским научно-этическим комитетом (KF V.100 2039/91, KF 01-144 / 01) и больницей Херлев университетской больницы Копенгагена. Популяция исследования включала 10 507 участников Копенгагенского городского исследования сердца. Это постоянное популяционное исследование, начатое в 1976 году, с участием людей в возрасте 20–95 лет. Более 99% были кавказцами датского происхождения. Даты смерти были получены из национальной системы регистрации актов гражданского состояния Дании. 10 Даты постановки диагноза и диагнозы любого рака были получены из Датского онкологического реестра. 11 , 12 Диагнозы были классифицированы в соответствии с Международной классификацией болезней (МКБ) Всемирной организации здравоохранения. 13 , 14

Мы количественно оценили мутацию JAK2 V617F с помощью анализа Taqman на основе ПЦР (ABI PRISM® 7900 Sequence Detection System) на ДНК, выделенной из периферической крови у всех 10 507 участников.Последовательности праймеров и зондов, а также условия реакции доступны по запросу. 1% участников (n = 107) с самым высоким сигналом от скринингового анализа также были протестированы с помощью аллель-специфической полуколичественной ПЦР, описанной Baxter et al. 1 и, кроме того, с помощью высокочувствительного количественного анализа ПЦР в реальном времени, основанного на ранее опубликованном анализе, 15 , последний количественно определяет бремя мутаций.

Чтобы уменьшить вероятность искажения результатов анализа риска из-за пола и возраста во время отбора проб крови, мы отобрали 30 участников с отрицательными мутациями, сопоставимых по полу и возрасту при заборе крови для каждого из 18 субъектов с положительными мутациями.Анализы были выполнены в подобранной подгруппе, а также во всех положительных мутациях по сравнению со всеми отрицательными. Более подробная информация о конструкции и методах описана в дополнительном онлайн-приложении .

Результаты и обсуждение

Среди 10 507 прошедших скрининг участников мы обнаружили 18 человек, которые были положительными на соматическую мутацию JAK2 V617F в 3 независимых анализах с использованием различных аналитических методов. Это соответствует распространенности 0,2% в данной выборке от общей популяции со средним возрастом 59 лет на момент забора крови.В настоящее время распространенность JAK2 V617F пациентов значительно ниже, чем предполагаемая распространенность в 1% в единственном другом крупном исследовании, в котором последовательно обследовали 3935 пациентов китайских больниц с различными диагнозами. 8

Среди всех участников наличие мутации было положительно связано с увеличением возраста ( P <0,0001), мужским полом ( P = 0,02) и совокупным курением ( P = 0,005) ( Дополнительная онлайн-таблица S1 ).В подобранной подгруппе факторы риска рака, то есть возраст, текущее и совокупное потребление табака, потребление алкоголя и индекс массы тела, были сходными у лиц с положительной и отрицательной мутациями ( Дополнительная онлайн-таблица S1 ).

Для общей выживаемости с периодом наблюдения до 17,6 лет 18 положительных мутаций по сравнению с отрицательными имели более низкую совокупную выживаемость (логарифмический ранг, P = 0,00003). Это соответствует многофакторному скорректированному соотношению рисков ранней смерти при положительных мутациях против отрицательных 3.0 (95% ДИ: 1,9–4,9) (). Соответствующие коэффициенты риска для мужчин против женщин и увеличение возраста за год составили 1,4 (1,1–1,9) и 1,1 (1,1–1,1).

Таблица 1.

Смертность и заболеваемость в общей популяции согласно JAK2 V617F статус соматической мутации, пол и возраст на момент забора крови.

Соматическая мутация JAK2 V617F, смертность и риск рака у населения Дании в целом. (A) Кумулятивная выживаемость как функция времени после забора крови.(B) Кумулятивная заболеваемость раком как функция времени после забора крови. (C) Кумулятивная заболеваемость гематологическим раком как функция времени после забора крови. (D) Кумулятивная заболеваемость миелопролиферативным раком как функция времени после забора крови. Число подверженных риску в момент времени = 0 варьируется из-за разного числа участников, заболевших до момента забора крови.

Для любого рака у 11 положительных мутаций без какого-либо рака до момента забора крови совокупная частота любого рака была выше, чем у сопоставленных отрицательных результатов (логарифмический ранг, P = 0.0001,), что соответствует многофакторному скорректированному коэффициенту опасности 3,7 (1,7–8,0). Соответствующие коэффициенты риска для мужчин против женщин и увеличение возраста за год составили 1,2 (0,8–2,0) и 1,0 (1,0–1,1).

Для гематологического рака 15 положительных мутаций без гематологического рака до момента забора крови имели более высокую совокупную частоту, чем совпадающие отрицательные мутации (логарифмический ранг, P = 2 * 10 −32 ,), что соответствует коэффициент риска, скорректированный на основе нескольких факторов, равный 58 (13–261).Соответствующие коэффициенты риска для мужчин против женщин и увеличение возраста за год составили 2,3 (0,2–25) и 1,1 (0,9–1,2).

Для миелопролиферативного рака (миелопролиферативные новообразования) 15 положительных мутаций без миелопролиферативного рака до момента взятия крови имели более высокую совокупную заболеваемость, чем соответствующие отрицательные мутации (логарифмический ранг, P = 7 * 10 −22 ,), что соответствует соотношению рисков, скорректированному по возрасту и полу, равному 161 (12–2,197). Соответствующие соотношения рисков для мужчин и женщин не могли быть рассчитаны в подобранной подгруппе, так как ни у одной женщины не развился миелопролиферативный рак после отбора проб крови; однако, когда были включены все участники, отношение рисков для мужчин против женщин составило 1.3 (0,3–5,4). Для увеличения возраста на год коэффициент опасности составил 0,9 (0,8–1,1). Оценки риска для всех четырех конечных точек оставались стабильными после включения в расчет всех отрицательных мутаций.

Мутантный белок JAK2 V617F проявляет свое действие в гематопоэтических стволовых клетках костного мозга и вызывает автономную экспансию нескольких гематологических линий. 16 Таким образом, в зависимости от природы положительных стволовых клеток JAK2 V617F, у пациента наблюдается истинная полицитемия, эссенциальный тромбоцитоз или первичный миелофиброз, 16 i.е. три заболевания, которые в этой рукописи называются миелопролиферативным раком.

Смертность и заболеваемость раком до и после взятия крови для каждого из 18 положительных мутаций показаны в. У четырнадцати развился какой-либо рак, у 7 развился гематологический рак, у 5 развился миелопролиферативный рак, и все 18 умерли во время наблюдения. Четверо из 18 не заболели раком за всю свою жизнь, хотя они были положительными по мутации в течение как минимум 2–12 лет.Для 2 участников бремя мутаций было даже очень высоким — 83% (Пациент 4) и 94% (Пациент 1). Ни один из подтипов негематологического рака, по-видимому, не имел более высокой частоты положительных мутаций по сравнению с отрицательными, чем ожидалось в исследовательских post hoc анализах . Эти результаты подтверждают, что в некоторых случаях наличие мутации предшествует клиническому диагнозу миелопролиферативного рака.

Таблица 2.

Характеристики положительных соматических мутаций JAK2 V617F из общей популяции (18 из 10 507 проверенных).

У нас не было достаточных статистических данных, чтобы определить единственную причину смерти как ответственную за наблюдаемую трехкратную смертность, но она, вероятно, в основном вызвана лежащим в основе, иногда скрытым, миелопролиферативным раком, а не общим эффектом JAK2 Мутация V617F и / или любая ассоциированная генетическая предрасположенность, связанная с локусом JAK2 .

Наше исследование имеет несколько ограничений: во-первых, небольшая статистическая мощность, обеспечиваемая 18 положительными мутациями из 10 507 участников.Это, однако, не ослабляет выводы о смертности и заболеваемости раком, поскольку увеличение мощности в этом случае, вероятно, будет способствовать только сужению доверительных интервалов наших результатов, но не к изменениям в точечных оценках. Во-вторых, наши конечные точки основаны на данных реестра, а не собираются с конкретной целью изучения миелопролиферативного рака. Кроме того, посещения терапевта, которые не привели к гистологическому диагнозу, не регистрируются в Датском реестре рака, используемом в настоящем исследовании.Неудивительно, что даже с учетом пожилого возраста многие из 18 положительных мутаций фактически не были диагностированы / неправильно диагностированы, учитывая, что многие миелопролиферативные формы рака могут иметь довольно плавное течение и различные проявления, связанные со многими другими причинами. Тем не менее, это возможное ошибочное отнесение пациентов к здоровым участникам, однако, будет иметь тенденцию только к снижению оценок риска и, следовательно, не может объяснить наблюдаемые оценки риска. В-третьих, к сожалению, гематологический фенотип 18 участников с положительной мутацией на момент забора крови неизвестен.Эта информация была бы очень интересной и могла бы выявить любые непосредственные клинические последствия этого исследования. В-четвертых, смещение выживаемости до забора крови может исказить оценки, особенно с учетом того, что мы обнаружили связь с повышенной смертностью во время последующего наблюдения. Такое смещение выживаемости привело бы к занижению наших оценок риска, потому что для большей доли положительных мутаций по сравнению с отрицательными не были бы взяты образцы крови. Соответственно, истинная смертность и заболеваемость раком могут быть даже выше, чем указанные здесь.Наконец, поскольку мы изучали только кавказцев, наши результаты не обязательно применимы к другим этническим группам.

Перспективы, основанные на огромном размере оценки риска при положительных мутациях по сравнению с отрицательными, эффективность нынешнего лечения миелопролиферативного рака, очевидный латентный период до девяти лет и относительно простая диагностика заставляют задуматься о том, действительно ли скрининг для этой мутации в общей популяции будет обеспечен разумный анализ эффективности затрат / выгод.Это было бы еще более актуально, если бы трехкратное увеличение смертности среди положительных мутаций по сравнению с отрицательными в этом исследовании было вызвано, главным образом, невыявленным / неправильно диагностированным миелопролиферативным раком. Однако есть несколько аргументов против такого скрининга: распространенность миелопролиферативного рака очень мала, и наши выводы о том, что не у всех людей с положительной мутацией JAK2 V617F разовьются миелопролиферативные или другие виды рака, не подтверждены другими исследованиями. В любом случае, будущие исследования клинической значимости скрининга мутации JAK2 V617F в общей популяции также должны включать измерение гематологического фенотипа.

В заключение, в этом исследовании с участием 10 507 человек, распространенность мутации JAK2 V617F в общей популяции была очень низкой, но положительные мутации по сравнению с отрицательными имели повышенную смертность и повышенный риск любого рака, гематологического рака, и миелопролиферативный рак.

Единичная мутация в группе миелопролиферативных заболеваний

Ulster Med J. 2006 May; 75 (2): 112–119.

Отделение гематологии, Королевский университет Белфаста, U Floor, Городская больница Белфаста, Лисберн-роуд, Белфаст, BT9 7AB, Великобритания

Авторские права © Ольстерское медицинское общество, 2006 Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Миелопролиферативные заболевания (MPD) представляют собой группу гематологических состояний, при которых имеется первичное нарушение на уровне мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток, приводящее к увеличению продукции одного или нескольких типов клеток крови. Три основных расстройства в этой группе — истинная полицитемия (PV), эссенциальная тромбоцитемия (ET) и идиопатический миелофиброз (IMF). PV характеризуется увеличением количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов и клинически полнокровием, зудом и спленомегалией.Заболевание может осложняться тромбоэмболическими явлениями и кровотечением, а в конечных стадиях прогрессировать до миелофиброза и острого лейкоза. ЕТ характеризуется повышенным количеством тромбоцитов. Клинически это часто протекает бессимптомно, но тромбоэмболические явления могут привести к выявлению заболевания. Существует небольшая склонность к прогрессированию миелофиброза и острого лейкоза, на которую могут повлиять используемые методы лечения. МВФ определяется лейкоэритробластической картиной крови, спленомегалией и фиброзом костного мозга.Картина крови включает анемию, тромбоцитемию или тромбоцитопению и изменчивое количество лейкоцитов. Заболевание часто неумолимо прогрессирует до трансфузионной анемии, симптоматической спленомегалии и трансформации в острый лейкоз.

Ряд различных биологических явлений был описан в гемопоэтических клетках пациентов с PV и других MPD, большинство из которых связано с нарушением регуляции ключевых медиаторов передачи сигналов. Ключевые молекулярные события в патогенезе этих заболеваний на сегодняшний день плохо определены, за исключением случая хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) с ассоциированной характерной хромосомной транслокацией «Филадельфийская хромосома» и ассоциированным реаранжированным геном BCR — ABL .

Клетки-предшественники

PV, как было показано, растут в отсутствие добавленного эритропоэтина, так называемого образования эндогенных эритроидных колоний (EEC) 1 , и обладают повышенной чувствительностью к множеству других цитокинов, включая инсулиноподобный фактор роста-1. 2 Формирование EEC, однако, не является специфическим для PV и также идентифицируется в других MPD. Другие свойства включают повышенную экспрессию ингибитора апоптоза Bcl-x L в отсутствие Epo в эритроидных клетках PV, что позволяет предположить, что дерегулированная экспрессия Bcl-xL может способствовать эритропоэтин-зависимой выживаемости клеток эритроидного происхождения в PV. 3 Экспрессия рецептора тромбопоэтина, Mpl, тромбоцитами и мегакариоцитами пациентов с PV была снижена по сравнению с нормальным контролем. 4 Это опять же не относится к PV, но может встречаться и в других MPD. Было обнаружено, что синтез РНК из гена polycythaemia rubra vera 1 (PRV-1) чрезмерно экспрессируется в гранулоцитах PV. 5 Эритроидные колонии от пациентов с ПВ содержат гиперактивную мембранно-ассоциированную тирозинфосфатазу PTP-MEG2, хотя точная роль в эритрогенезе требует дальнейшего изучения. 6

В нормальных условиях связывание рецептора Epo его лигандом вызывает быстрое фосфорилирование Akt и последующую стимуляцию путей выживания эритроидных колоний. Было показано, что эритроидные клетки, полученные от индивидуумов с PV, демонстрируют повышенное фосфорилирование Akt / PKb, а также киназы гликоген-синтазы 3. 7 Это способствует присущим эритроидным клеткам свойствам выживания. Анализ микроматрицы идентифицировал гены-кандидаты, участвующие в патофизиологии PV, включая фактор транскрипции NF-E2 (ядерный фактор (эритроидный 2)).Было показано, что это чрезмерно экспрессируется в мегакариоцитах, эритроидных и миелоидных предшественниках костного мозга субъектов PV. 8

Более 50 лет назад Dameshek 9 связал вместе известные расстройства PV, хронический миелоидный лейкоз и IMF и высказал предположение об общих миелостимулирующих факторах. В начале 1970-х годов хронический миелоидный лейкоз был выделен как отдельное клональное заболевание, определяемое перестройкой одной хромосомы, а позднее и гена ( BCR / ABL ). 10 До недавнего времени другие MPD продолжали разделяться и диагностироваться на основе их клинических и лабораторных данных (). Однако недавние молекулярные открытия в гене JAK2 являются общими для всех этих заболеваний.

Таблица I

Диагностические критерии распространенных миелопролиферативных расстройств

9024

. Причина реактивного тромбоцитоза неизвестна. Следует проявлять осторожность, чтобы исключить дефицит железа у женщин в пременопаузе.

Вера полицитемия Эссенциальная тромбоцитемия Идиопатический миелофиброз 25%
Миелофиброз
выше среднего (среднее значение массы клеток> 9024) 0.6 кобелей; ≥ 0,56 женщины A2 Отсутствие причины вторичного эритроцитоза 1. Количество тромбоцитов> 600 × 10 9 / л * НЕОБХОДИМЫЕ КРИТЕРИИ
9025 Фиброз костного мозга
B) Отсутствие филадельфийской хромосомы или транскрипта BCR-ABL в клетках периферической крови.
A3 Пальпируемая спленомегалия A4 Маркер клональности i.e приобретенный аномальный кариотип костного мозга 2. Нет доказательств явной полицитемии / полицитемии, замаскированной сопутствующим дефицитом железа ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КРИТЕРИИ
(i)
(ii) Анизопойкилоцитоз с эритроцитами слезной капли
B1 Тромбоцитоз (количество тромбоцитов> 400 × 10 9 / л) B2 курильщики;> 12.5 × 10 9 у курильщиков) 3. Отсутствие филадельфийской хромосомы (iii) Наличие циркулирующих незрелых миелоидных клеток
4. Отсутствие периферической крови и / или проявления миелодисплазии или миелофиброза в костном мозге (iv) Наличие циркулирующих эритробластов
B3 Спленомегалия (демонстрируется при изотопном / ультразвуковом сканировании) B4 Характерный рост BFUE или снижение уровня эритропоэтина в сыворотке (v) Наличие скоплений мегакариобластов и аномальных мегакариоцитов в срезах костного мозга.
(vi) Миелоидная метаплазия
Диагноз * У бессимптомных пациентов количество тромбоцитов следует контролировать в течение определенного периода. Диагностика IMF, если:
A1 + A2 + A3 или A4 устанавливает PV A1 + A2 + любые 2 B Критерии устанавливают PV Диагностика проводится при соблюдении всех вышеперечисленных критериев. Два необходимых критерия (обозначенные A и B) присутствуют с дополнительными критериями следующим образом:
(1) любые две другие характеристики, если присутствует спленомегалия
Адаптировано из Британского комитета по стандартам в Гематологические рекомендации по полицитемии 36 На основе диагностических критериев исследования PT-1, координируемого британской группой MPD 38 . (2) любые четыре дополнительных критерия при отсутствии спленомегалии.
Адаптировано из Итальянского консенсуса по диагностическим критериям миелофиброза 39 900 26.

JANUS KINASE 2

Ген JAK2 был впервые клонирован в 1989 г. 11 и является членом семейства четырех киназ Janus 1, 2 и 3 и тирозинкиназы 2.

Первоначально он был назван «просто еще одна киназа», но группа белков была переименована в киназы Януса в честь римского бога ворот и проходов.Эти нерецепторные киназы имеют два схожих «активного» и «неактивного» домена, и это напоминает Бога Януса, который имел способность смотреть одновременно в двух направлениях.

Каждый JAK имеет активный домен тирозинкиназы, гомологию JAK 1 (Jh2), каталитически неактивный домен псевдокиназы, гомологию JAK 2 (Jh3), домен гомологии 2 SRC (Sh3) и аминоконцевой FERM (4-точечный- 1, Erzin, Radixin, Moesin) домен гомологии, в котором происходит связывание с рецепторами цитокинов 1 типа. Взаимодействия домена JAK2 FERM также включают роль в транспортировке цитоплазматического домена рецептора EPO (EPOR) на поверхность клетки. 12 В нормальных физиологических условиях, когда лиганд (например, эритропоэтин) связывается с рецептором, происходит конформационное изменение ( см. ). Затем белок JAK2 вступает в контакт с цитоплазматическим доменом рецептора, где он катализирует фосфорилирование тирозина. Это в первую очередь приводит к привлечению молекул STAT (преобразователь сигнала и активатор транскрипции), которые затем фосфорилируются, гомодимеризуются и перемещаются в ядро, где они действуют как факторы транскрипции.Фосфорилирование тирозина также изменяет другие ключевые регуляторные события, участвующие в сигнальных путях цитокинов.

Диаграмма, иллюстрирующая функциональный путь JAK STAT

Этот путь «JAK STAT», по-видимому, широко распространен среди позвоночных. После связывания лиганда активированный белок JAK2 катализирует фосфорилирование тирозина в цитоплазматическом домене рецептора, а также приводит к фосфарилированию сигнальных преобразователей и активаторов транскрипции (STATS).

Фосфорилирование STAT приводит к димеризации через консервативные домены с гомологией Src 2 (Sh3).Транслокация этих димеров в ядро ​​затем происходит с помощью Nucleoprotein Interactor 1 (NPI-1). Последующая регуляция экспрессии генов происходит после взаимодействия с элементами ответа ДНК. Это приводит к транскрипционному ответу. Также существует взаимодействие с нисходящими путями RAS / MAPK, Pl-3 K и Akt.

В нормальных условиях усиленная экспрессия генов находится под действием сложных механизмов отрицательной обратной связи, включая, среди прочего, продукцию негативных регуляторов, подавляющих передачу сигналов цитокинов (SOCS).

Домен Jh3 является некаталитической псевдокиназой и выполняет несколько важных регуляторных функций. 13 Похоже, что в отсутствие связывания лиганда он обладает аутоингибирующими свойствами, что, скорее всего, проявляется взаимодействием Jh3 / Jh2, и если произойдет изменение в этой области, это приведет к нарушению регуляции этого аутоингибирования. Также кажется, что максимальная активность JAK2 в ответ на цитокины требует интактной области Jh3.

За короткий период в начале 2005 года четыре разные группы описали идентичную мутацию в JAK2 V617F у большого числа пациентов с MPD. 14 17 Хотя все группы пришли к одному результату, они подошли к нему разными методами. Группа Вайнченкеров, которые, как известно, сделали открытие первыми, подошли к нему с точки зрения биологии, лежащей в основе болезни. 14 Ранее они наблюдали, что ингибиторы JAK2 и других киназ вмешиваются в независимую от эритропоэтина дифференцировку в PV. 18 Поэтому они рассмотрели потенциальные механизмы, приводящие к образованию ЭЭК.

Идентифицируя JAK2 как потенциальный ген-кандидат и осознавая его роль в качестве сигнальной молекулы, расположенной выше по течению, непосредственно связанной с рецептором эритропоэтина, они сосредоточили внимание на этой тирозинкиназе. Они обнаружили, что подавление экспрессии JAK2 посредством введения короткой интерферирующей РНК приводит к заметному ингибированию образования EEC у людей с PV. Это, очевидно, предупредило исследователей о ключевой роли JAK2 в формировании EEC и побудило секвенировать кодирующие экзоны и интрон-экзонные соединения гена у трех пациентов с PV и у двух нормальных контролей.Два человека с ПВ продемонстрировали наличие мутации JAK2 V617F. () В более крупной группе пациентов с ПВ мутация присутствовала в 88% случаев. Во всех контрольных группах, помимо всех 35 образцов пациентов с диагнозом вторичный эритроцитоз, был обнаружен только JAK2 дикого типа.

Диаграмма доменов JAK2 с выделением основных ролей и указанием приблизительного местоположения мутации V617F.

Было показано, что мутация приобретена, поскольку она присутствует в миелоидном клоне, но отсутствует в Т-клетках.Эта группа также идентифицировала способность мутированного JAK2 спонтанно активировать нижестоящую транскрипцию, опосредованную STAT, в отсутствие лиганда эритропоэтина. Это контрастирует с неспособностью JAK2 дикого типа опосредовать такие события. Также наблюдалась активация путей ERK / MAP киназы и P13K / AKT в отсутствие стимуляции альтернативными цитокинами. В заключение следует отметить, что аутоингибиторная активность JAK2 была нарушена присутствием этой мутации V617F.

Группа Skoda 15 продолжила предыдущую работу, в которой они идентифицировали потерю гетерозиготности (LOH) на коротком плече хромосомы 9 у части пациентов с MPD с помощью полногеномного микросателлитного скрининга.Это предполагает, что 9p может нести патогенную мутацию. Первоначально они использовали 10 микросателлитных маркеров, покрывающих хромосму 9p, и обнаружили 9p LOH в гранулоцитах, полученных от пациентов с MPD, в 21% (51/244) случаев и ни в каких контрольных случаях, включая CML. У всех 51 пациента с 9p LOH была мутация JAK2 V617F. Дальнейшее исследование обнаружило мутацию у 65% пациентов с ПВ, из которых 27% имели приобретенную гомозиготную мутацию и 38% — гетерозиготную мутацию.

Нарушение регуляции ключевых тирозинкиназ имеет первостепенное значение в патогенезе многих видов рака, включая ХМЛ.Это побудило к дальнейшим углубленным поискам мутаций тирозинкиназ при обычных миелопролиферативных заболеваниях. Группа Гиллиланда 16 провела поиск мутаций тирозинкиназ с использованием высокопроизводительного анализа последовательностей и обнаружила мутацию JAK2 V61F . В рамках большого исследования генов протеинкиназ в MPD группа Грина 17 обнаружила мутацию у 57% людей с ET, 50% людей с IMF и 97% людей с PV. Он был обнаружен как в гранулоцит-макрофагальных, так и в эритроидных колониях и, что интересно, присутствовал во всех EEC, демонстрируя связь с гиперчувствительностью к факторам роста.

Мутация JAK2 V61F является причиной некоторых аномалий, описанных в PV, хотя молекулярные события, связывающие мутацию с биологическими параметрами, требуют дальнейшего описания. Домен Jh3 является псевдокиназой и обладает аутоингибиторными свойствами, предотвращающими фосфорилирование рецептора. Из исследований моделирования предсказано, что высококонсервативный валин в положении 617 будет располагаться на верхней поверхности N-концевой доли домена Jh3. Замена валина на большой фенлиланин дестабилизирует складку домена. 16 Следовательно, наличие мутации привело бы к JAK2, который является конститутивно активным. Интересно, что у гетерозигот, по-видимому, существует конкуренция между генами дикого типа и мутантными генами.

Гематопоэтические стволовые клетки пациентов с MPD гиперчувствительны к ряду факторов роста и используют JAK2 для передачи сигналов. Наблюдения предполагают нарушение передачи сигнала ниже JAK2, включая конститутивную активацию STAT3, повышающую регуляцию антиапоптотического белка Bcl-x L 3 и повышенную активность AKT. 7 Стимулируемые рецептором смерти пути апоптоза также оказываются нарушенными в эритробластах, происходящих от JAK2 V617F PV, с нарушенной регуляцией экспрессии короткой изоформы c-FLIP 21 , которая играет существенную роль в нормальном гомеостатическом каскаде апоптоза.

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ

Мутация JAK2 V617F в MPD может быть обнаружена различными методами. Самый простой метод — выделить ДНК из лейкоцитов цельной крови и использовать прямое ПЦР-секвенирование.Однако, поскольку мутация приобретена и ограничена миелоидным происхождением, этот метод имеет чувствительность от 20 до 30%. Подразумевается, что мутантный клон JAK2 V617F должен составлять значительную часть от общей популяции лейкоцитов, чтобы его можно было обнаружить этим методом.

Центрифугирование в градиенте фиколла можно использовать для выделения мононуклеарных клеток с последующим разделением на клоны гранулоцитов / макрофагов и лимфоциты. Следует использовать методы, гарантирующие отсутствие серьезного загрязнения фракций, например магнитную сортировку / проточную цитометрию.Затем можно выделить ДНК из фракций и применить методы прямого секвенирования. Это позволяет обнаруживать приобретенную мутацию JAK2 V617F в клетках миелоидного происхождения.

Amplification Refractory Mutation Screening (ARMS) ПЦР позволяет детектировать одно изменение основания в идеальных условиях ПЦР. Это идеально подходит для обнаружения трансверсии G → T по одному основанию, связанной с рассматриваемой мутацией JAK2 . В методе ARMS-PCR () используются 4 праймера следующим образом; прямой внешний праймер, обратный внешний праймер, прямой внутренний праймер, специфичный для дикого типа, и обратный внутренний праймер, специфичный для мутанта.Прямой праймер из одного набора и обратный из другого могут усиливать полосу положительного контроля. Два других праймера охватывают сайт мутации JAK2 V617F. Следовательно, в присутствии мутации JAK2 обратный внутренний мутантный специфический праймер и прямой внешний праймер связываются с образованием фрагмента размером 279 п.н. В присутствии JAK2 дикого типа обратный внешний праймер и прямой внутренний специфический праймер дикого типа продуцируют фрагмент размером 229 пар оснований.Выполнение серии разведений показывает, что уровень чувствительности ARMS-PCR составляет 1-2%. 22 Анализ позволяет различать гомозиготных и гетерозиготных индивидуумов с мутацией JAK2 V617F и играет ключевую роль в качестве надежного скринингового теста на наличие или отсутствие мутации у лиц с MPD.

Тетра праймер ARMS PCR

  • Tetra Primer Amplification Refractory Mutation Screening Полимеразная цепная реакция — ARMS-PCR — чрезвычайно эффективный метод обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNPS).

  • Состоит из двух пар праймеров — для амплификации дикого типа и мутанта соответственно.

  • Две аллель-специфические реакции амплификации происходят в противоположных направлениях одновременно.

  • Несоответствие находится в середине внутренних праймеров в отличие от традиционной ПЦР ARMS.

  • Существует внешний прямой праймер, прямой внутренний праймер дикого типа, обратный внешний праймер и обратный внутренний мутантный специфический праймер.

  • Требуются две температурные программы во время реакции ПЦР.

  • Из-за расположения внешних праймеров на разном расстоянии от сайта мутации в этом примере в гетерозиготе генерируются три фрагмента: два небольших аллель-специфичных фрагмента и большой контрольный продукт ПЦР.

  • Фрагменты ДНК можно различить с помощью электрофореза на агарозном геле.

Хотя ARMS-ПЦР может указать, является ли человек гомозиготным или гетерозиготным по мутации V617F JAK2 , она не дает количественной оценки соотношения аллелей дикого типа и мутантных аллелей.Это также относится к ПЦР-прямому секвенированию. Пиросеквенирование, в котором используется количественный метод, первоначально разработанный для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), был разработан для обнаружения мутации G1849T JAK2 , обеспечивая точные соотношения аллелей. 23 , 24 Этот метод уникален тем, что дает количественный результат для каждого аллеля. Пиросеквенирование включает амплификацию с помощью ПЦР экзона 12 из JAK2 с набором праймеров, один из которых помечен биотиновой меткой.Продукты одноцепочечной ПЦР получают после ПЦР. Любые меченые биотином одноцепочечные молекулы ДНК затем специфически выделяются путем захвата с помощью стрептавидиновых гранул, и генотипы определяются с использованием программного обеспечения SNP, которое позволяет количественно определять частоту аллелей и оценивать людей как гомозиготных, когда мутантный аллель превышает 50%.

КЛИНИЧЕСКИЕ СООТВЕТСТВИЯ

Другие группы приступили к изучению своей серии пациентов и определили аналогичные показатели наличия мутации в различных группах заболеваний (). 14 17 , 22 25 Интересно то, что мутация встречается крайне редко у тех, у кого не установлена ​​причина эритроцитоза, и поэтому скрининг полезен для выявления клональных болезнь. 26 Присутствие мутации JAK2 V617F коррелировало с другими описанными биологическими явлениями, такими как экспрессия PRV1 и образование ЕЕС. 27 Было показано, что пациенты, которые являются гетерозиготными или гомозиготными по мутации JAK2 V617F, экспрессируют более высокие уровни NF-E2 по сравнению с индивидуумами с отрицательной мутацией. 28

Таблица 2

Некоторые зарегистрированные случаи мутации JAK2 V61F при миелопролиферативных заболеваниях

Зеленый 17

9025 9025

9025

9024

Исследователи Vainchenker 14 Gilliland 16 Skoda 15 Tefferi 24 Cross 22 Zhao 25 9024 9024 9024 9024 9024 9025 Jelinek PV 97% 88% 74% 65% 81% 83% 4 86%

4 86%

ET 57% 9001 7 43% 32% 23% 41% 30%
IMF 4 50% 90% 4 50% 35% 57% 43% 95%
SM 0%
CNL 17% 33% 33% 33% 0% 2%
ООН 20%
MDS 1.5%
CMML 3% 13%

те, кто разные по мутации 9000 более запущенное заболевание по сравнению с гетерозиготными. Kravolics 15 показали, что те, кто был гомозиготным, имели более длительную продолжительность болезни и с большей вероятностью развивались вторичный миелофиброз.Tefferi 29 продемонстрировал, что при ПВ у тех, кто обладает гомозиготной мутацией JAK2 , как правило, наблюдается более высокий уровень гемоглобина, повышенная частота зуда и более высокая частота фиброзных осложнений.

Значение рассмотрения случаев с очень небольшим процентом JAK2 мутантных положительных клонов как «истинных» JAK2 V617F остается неясным. Очевидно, необходимо подумать о том, какое «отсеченное» значение мы используем, чтобы отличить тех, кто обладает мутацией, от тех, кто классифицируется как отрицательная по мутации.Это важно, если присутствие мутации JAK2 V61F должно стать первостепенным в системе классификации MPD. Семейные MPD, включая полицитемию, 30 , были хорошо задокументированы, и кажется, что даже в этих редких случаях мутация JAK2 оказывается соматической, а не зародышевой по своей природе.

Влияние мутации на IMF с клинической точки зрения кажется несколько менее четко определенным. В большом исследовании миелофиброза Campbell et al. 31 показали, что пациенты с мутацией JAK2 V617F имели более высокое количество нейтрофилов и лейкоцитов по сравнению с пациентами без мутации, и в целом имели более плохой прогноз.Tefferi et al. 32 искали мутацию у различных пациентов с миелофиброзом и обнаружили, что мутация с большей вероятностью присутствует у пациентов с предшествующей историей PV по сравнению с de novo MF. Наличие мутации JAK2 V617F в этой довольно большой когорте из 157 пациентов, по-видимому, не имело прогностического значения.

Проспективное исследование ЭТ MRC-PT-1 позволило сравнить пациентов с положительными и отрицательными мутациями. 33 Те, у кого была мутация, имели признаки, похожие на PV, более высокий гемоглобин, более высокое количество нейтрофилов, более высокий венозный тромбоз и более высокую скорость превращения в PV, но у них были более низкие уровни сывороточного эритропоэтина и ферритина. JAK2 V617F-положительные пациенты оказались более чувствительными к лечению гидроксикарбамидом, но не анагрелидом. Другая серия пациентов с ET показала, что те, у кого была мутация, с большей вероятностью трансформировались в PV. 34 Эти данные ставят под сомнение разделение болезней PV и ET.Может иметь место континуум заболевания с эффектами мутации JAK2 V617F на клинические проявления под влиянием других модификаторов, включая поступление железа, подавление эритропоэтина и другие генетические модификаторы ( см. ) .

Модель континуума болезни JAK2 V61F.

ДРУГИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Наличие мутации было исследовано при атипичных MPD, включая системный мастоцитоз, гиперэозинофильный синдром, хронический нейтрофильный лейкоз, неклассифицированные миелопролиферативные заболевания. 24 Интересно, что McLornan et al. 35 обнаружили мутацию у одного пациента с хроническим нейтрофильным лейкозом с необычно длительным течением, при котором мутация может каким-то образом влиять на течение болезни. Мутация была обнаружена у различных пропорций пациентов, как описано в. Он редко выявляется у пациентов с миелодиспластическими расстройствами. 22 Распространенность мутации выше у пациентов с острым миелоидным лейкозом (AML) с предшествующей PV или IMF, чем в общей когорте. 36 Редко сообщалось в других группах пациентов с AML и ни у одного пациента с лимфоидным лейкозом. 23 , 36

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

Захватывающее открытие единственной мутации в широком спектре MPD привело к быстрому прогрессу в исследовании MPD, но приводит к ряду дополнительных вопросов. Иерархическое положение этой мутации требует дальнейшего изучения. До сих пор не ясно, является ли мутация JAK2 V61F первичным инициирующим событием или вторичным событием с пока неизвестным первичным событием.Хотя наличие мутации было достаточным для индукции эритроцитоза у мышей, это экспериментальная ситуация, которой манипулируют, и ее может быть недостаточно для инициирования заболевания у человека.

Классификация МУРЗ требует пересмотра. Наличие мутации свидетельствует о клональном нарушении, но разделение болезней на основе клинических характеристик требует пересмотра. Остаются вопросы о лежащем в основе патогенезе пациентов с миелопролиферативными нарушениями, отрицательными по мутациям.Таким образом, открытие единственной мутации JAK2 V61F у большого числа пациентов с MPD привело к значительному прогрессу в понимании MPD, но приводит к множеству более интересных биологических вопросов.

Примечания

У авторов нет конфликта интересов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Прчал Дж. Ф., Аксельрад А. А.. Реакции костного мозга при истинной полицитемии. N Engl J Med. 1974; 290 (24): 1382. [PubMed] [Google Scholar] 2. Корреа П.Н., Эскинази Д., Аксельрад А.А. Циркулирующие эритроидные предшественники при истинной полицитемии гиперчувствительны к инсулиноподобному фактору роста-1 in vitro: исследования в улучшенной бессывороточной среде.Кровь. 1994. 83 (1): 99–112. [PubMed] [Google Scholar] 3. Сильва М., Ричард С., Бенито А., Санс К., Олалла И., Фернандес-Луна Дж. Л.. Экспрессия Bcl-x в предшественниках эритроидов пациентов с истинной полицитемией. N Engl J Med. 1998. 338 (9): 564–71. [PubMed] [Google Scholar] 4. Молитерно А.Р., Ханкинс В.Д., Спивак Я.Л. Нарушение экспрессии рецептора тромбопоэтина тромбоцитами у пациентов с истинной полицитемией. N Engl J Med. 1998. 338 (9): 572–80. [PubMed] [Google Scholar] 5. Темеринак С., Клиппель С., Струнк Е., Родер С., Любберт М., Ланге М. и др.Клонирование PRV-1, нового члена суперсемейства рецепторов uPAR, которое сверхэкспрессируется при полицитемии вера. Кровь. 2000. 95 (8): 2569–76. [PubMed] [Google Scholar] 6. Сюй MJ, Суй X, Zhao R, Dai C, Krantz SB, Zhao ZJ. PTP-MEG2 активируется в клетках-предшественниках эритроидной полицитемии и требуется для роста и размножения эритроидных клеток. Кровь. 2003. 102 (13): 4354–60. [PubMed] [Google Scholar] 7. Дай Ц., Чунг И.Дж., Кранц С.Б. Повышенный эритропоэз при истинной полицитемии связан с повышенной пролиферацией эритроидов и повышенным фосфорилированием Akt / PKB.Exp Hematol. 2005. 33 (2): 152–8. [PubMed] [Google Scholar] 8. Goerttler PS, Kreutz C, Donauer J, Faller D, Maiwald T., Marz E, et al. Профили экспрессии генов при истинной полицитемии: сверхэкспрессия фактора транскрипции NF-E2. Br J Haematol. 2005. 129 (1): 138–50. [PubMed] [Google Scholar] 9. Дамешек В. Некоторые размышления о миелопролиферативных синдромах. Кровь. 1951; 6 (4): 372–5. [PubMed] [Google Scholar] 10. Роули Дж. Д. Новая стойкая хромосомная аномалия при хроническом миелолейкозе, идентифицированная с помощью флюоресценции хинакрина и окрашивания по Гимзе.Природа. 1973; 243 (5405): 290–3. [PubMed] [Google Scholar] 11. Уилкс А.Ф. Две предполагаемые протеин-тирозинкиназы, идентифицированные с помощью полимеразной цепной реакции. Proc Natl Acad Sci. 1989. 86 (5): 1603–7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Хуанг Л.Дж., Константинеску С.Н., Лодиш Х.Ф. N-концевой домен киназы Janus 2 необходим для процессинга Гольджи и экспрессии рецептора эритропоэтина на клеточной поверхности. Mol Cell. 2001. 8 (6): 1327–38. [PubMed] [Google Scholar] 13. Сахаринен П., Вихинин М., Сильвеннойнен О.Аутоингибирование тирозинкиназы Jak2 зависит от конкретных участков в ее псевдокиназном домене. Mol Biol Cell. 2003. 14 (4): 1448–59. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Джеймс С., Уго В., Ле Кудик Дж. П., Стерк Дж., Деломмо Ф., Лаку С. и др. Уникальная клональная мутация JAK2, приводящая к конститутивной передаче сигналов, вызывает истинную полицитемию. Природа. 2005. 434 (7037): 1144–8. [PubMed] [Google Scholar] 15. Кралович Р., Пассамонти Ф., Бузер А.С., Тео СС, Тидт Р., Пассвег Дж. Р. и др. Мутация JAK2 с усилением функции при миелопролиферативных заболеваниях.N Engl J Med. 2005. 352 (17): 779–90. [PubMed] [Google Scholar] 16. Левин Р.Л., Уодли М., Кулз Дж., Эберт Б.Л., Верниг Дж., Хантли Б.Дж. и др. Активирующая мутация тирозинкиназы JAK2 при истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии и миелоидной метаплазии с миелофиброзом. Раковая клетка. 2005. 7 (4): 387–97. [PubMed] [Google Scholar] 17. Бакстер Э.Дж., Скотт Л.М., Кэмпбелл П.Дж., Восточный Ц., Фуруклас Н., Суантон С. и др. Проект генома рака. Приобретенная мутация тирозинкиназы JAK2 при миелопролиферативных заболеваниях человека.Ланцет. 2005. 365 (9464): 1054–61. Ошибка в: Lancet 2005; 366 (9480) 122. [PubMed] [Google Scholar] 18. Уго В., Марзак К., Тейссандье И., Ларбе Ф., Леклюз И., Дебили Н. и др. Множественные сигнальные пути участвуют в эритропоэтин-независимой дифференцировке эритроидных предшественников при истинной полицитемии. Exp Hematol. 2004. 32 (2): 179–87. [PubMed] [Google Scholar] 19. Кралович Р., Гуань Ю., Прчал Дж. Т.. Приобретенная монородительская дисомия хромосомы 9p — частый дефект стволовых клеток при истинной полицитемии. Exp Hematol.2002. 30 (3): 229–36. [PubMed] [Google Scholar] 20. Родер С., Штаймле С., Майнхардт Г., Пал Х.Л. STAT3 постоянно активируется у некоторых пациентов с красной полицитемией. Exp Hematol. 2001. 29 (6): 694–702. [PubMed] [Google Scholar] 21. Zeuner A, Pedini F, Signore M, Ruscio G, Messina C, Tafuri A, et al. Повышенная устойчивость рецептора смерти и короткая экспрессия FLIP в клетках-предшественниках эритроидной полицитемии. Кровь. 2005 Dec 29; [Epub перед печатью] [PubMed] [Google Scholar] 22. Джонс А.В., Крейл С., Зои К., Вагхорн К., Кертис С., Чжан Л. и др.Широкое распространение мутации JAK2 V617F при хронических миелопролиферативных заболеваниях. Кровь. 2005. 106 (6): 2162–8. [PubMed] [Google Scholar] 23. Елинек Дж., Оки Ю., Гарибян В., Буэсо-Рамос С., Прчал Дж. Т., Верстовсек С. и др. Мутация JAK2 1849 G> T редко встречается при острых лейкозах, но может быть обнаружена при CMML, филадельфийской хромосомно-отрицательной CML и мегакариоцитарной лейкемии. Кровь. 2005. 106 (10): 3370–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Стинсма Д.П., Девальд Г.В., Лашо Т.Л., Пауэлл Х.Л., МакКлюр Р.Ф., Левин Р.Л. и др.Активирующая мутация тирозинкиназы JAK2 V617F является нечастым событием как при «атипичных» миелопролиферативных заболеваниях, так и при миелодиспластическом синдроме. Кровь. 2005. 106 (4): 1207–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Чжао Р., Син С., Ли З, Фу Х, Ли Кью, Кранц С.Б. и др. Выявление приобретенной мутации JAK2 при истинной полицитемии. J Biol Chem. 2005. 280 (24): 22788–92. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 26. Перси MJ, Джонс FG, Грин AR, Reilly JT, McMullin MF. Мутация V617F JAK2 редко встречается у пациентов с идиопатическим эритроцитозом.Haematologica. 2006. 91 (3): 413–4. [PubMed] [Google Scholar] 27. Goerttler PS, Steimle C, Marz E, Johansson PL, Andreasson B, Greisshammer M, et al. Мутация Jak2V617F, избыточная экспрессия PRV-1 и образование EEC определяют аналогичную когорту пациентов с MPD. Кровь. 2005. 106 (8): 2862–4. [PubMed] [Google Scholar] 28. Краволикс Р., Тео С.С., Бузер А.С., Брутше М., Тидт Р., Тичелли А. и др. Измененная экспрессия генов при миелопролиферативных заболеваниях коррелирует с активацией передачи сигналов мутацией V617F JAK2.Кровь. 2005. 106 (10): 3374–6. [PubMed] [Google Scholar] 29. Теффери А., Лашо Т.Л., Швагер С.М., Стрэнд Дж.С., Эллиотт М., Меса Р. и др. Клинический фенотип дикого типа, гетерозиготного и гомозиготного JAK2 (V617F) при истинной полицитемии. Рак. 2005. 106 (3): 631–5. [PubMed] [Google Scholar] 30. Карио Х., Герттлер П.С., Штаймле С., Левин Р.Л., Пал Х.Л. Мутация JAK2 V617F приобретается вторично по отношению к предрасполагающему изменению в семейной истинной полицитемии. Br J Haematol. 2005. 130 (5): 800–1. [PubMed] [Google Scholar] 31.Кэмпбелл П.Дж., Грисхаммер М., Донер К., Донер Х., Кузек Р., Хассельбалч Х.С. и др. Мутация V617F в JAK2 связана с худшей выживаемостью при идиопатическом миелофиброзе. Кровь. 2006. 107 (5): 2098–100. [PubMed] [Google Scholar] 32. Tefferi A, Lasho TL, Schwager SM, Steensma DP, Mesa RA, Li CY, et al. Мутация тирозинкиназы JAK2 (V617F) при миелофиброзе с миелоидной метаплазией: специфичность клонов и клинические корреляты. Br J Haematol. 2005. 131 (3): 320–8. [PubMed] [Google Scholar] 33. Кэмпбелл П.Дж., Скотт Л.М., Бак Дж., Уитли К., Восточный К.Л., Марсден Дж. Т. и др.Группа изучения миелопролиферативных заболеваний Соединенного Королевства; Рабочая группа Совета по медицинским исследованиям по лейкемии взрослых; Австралазийская группа лейкемии и лимфомы Определение подтипов эссенциальной тромбоцитемии и связь с истинной полицитемией на основе статуса мутации JAK2 V617F: проспективное исследование. Ланцет. 2005; 366 (9501): 1945–53. [PubMed] [Google Scholar] 34. Wolanskyj AP, Lasho TL, Schwager SM, McClure RF, Wadleigh M, Lee SJ, et al. Мутация JAK2V617F при эссенциальной тромбоцитемии: клинические ассоциации и долгосрочное прогностическое значение.Br J Haematol. 2005. 131 (2): 208–13. [PubMed] [Google Scholar] 35. МакЛорнан Д.П., Перси М.Дж., Джонс А.В., Кросс Северная Каролина. МакМуллин М.Ф. Хронический нейтрофильный лейкоз с ассоциированной мутацией тирозинкиназы V617F JAK2. Haematologica. 2005. 90 (12): 1696–7. [PubMed] [Google Scholar] 36. Левин Р.Л., Лорио М., Хантли Б.Дж., Ло М.Л., Беран М., Стоффреген Э. и др. Активирующая мутация JAK2V617F встречается при хроническом миеломоноцитарном лейкозе и остром миелоидном лейкозе, но не при остром лимфобластном лейкозе или хроническом лейкозе.Кровь. 2005. 106 (10): 3377–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Макмаллин М.Ф., Барефорд Д., Кэмпбелл П., Грин А.Р., Харрисон С., Хант Б. и др. Руководство по диагностике, исследованию и лечению полицитемии / эритроцитоза. Br J Haematol. 2005. 130 (2): 174–95. [PubMed] [Google Scholar] 38. Харрисон К.Н., Кэмпбелл П.Дж., Бак Дж., Уитли К., Ист-К.Л., Бэрфорд Д. и др. Гидроксимочевина в сравнении с анагрелидом при эссенциальной тромбоцитемии высокого риска. N Engl J Med. 2005. 353 (1): 33–45. [PubMed] [Google Scholar] 39.Барози Г., Амброзетти А., Финелли С., Гросси А., Леони П., Либерато Н. Л. и др. Итальянская консенсусная конференция по диагностическим критериям миелофиброза с миелоидной метаплазией. Br J Haematol. 1999. 104 (4): 730–7. [PubMed] [Google Scholar]

Единичная мутация в группе миелопролиферативных заболеваний

Ulster Med J. 2006 May; 75 (2): 112–119.

Отделение гематологии, Королевский университет Белфаста, U Floor, Городская больница Белфаста, Лисберн-роуд, Белфаст, BT9 7AB, Великобритания

Авторские права © Ольстерское медицинское общество, 2006 Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Миелопролиферативные заболевания (MPD) представляют собой группу гематологических состояний, при которых имеется первичное нарушение на уровне мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток, приводящее к увеличению продукции одного или нескольких типов клеток крови. Три основных расстройства в этой группе — истинная полицитемия (PV), эссенциальная тромбоцитемия (ET) и идиопатический миелофиброз (IMF). PV характеризуется увеличением количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов и клинически полнокровием, зудом и спленомегалией.Заболевание может осложняться тромбоэмболическими явлениями и кровотечением, а в конечных стадиях прогрессировать до миелофиброза и острого лейкоза. ЕТ характеризуется повышенным количеством тромбоцитов. Клинически это часто протекает бессимптомно, но тромбоэмболические явления могут привести к выявлению заболевания. Существует небольшая склонность к прогрессированию миелофиброза и острого лейкоза, на которую могут повлиять используемые методы лечения. МВФ определяется лейкоэритробластической картиной крови, спленомегалией и фиброзом костного мозга.Картина крови включает анемию, тромбоцитемию или тромбоцитопению и изменчивое количество лейкоцитов. Заболевание часто неумолимо прогрессирует до трансфузионной анемии, симптоматической спленомегалии и трансформации в острый лейкоз.

Ряд различных биологических явлений был описан в гемопоэтических клетках пациентов с PV и других MPD, большинство из которых связано с нарушением регуляции ключевых медиаторов передачи сигналов. Ключевые молекулярные события в патогенезе этих заболеваний на сегодняшний день плохо определены, за исключением случая хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) с ассоциированной характерной хромосомной транслокацией «Филадельфийская хромосома» и ассоциированным реаранжированным геном BCR — ABL .

Клетки-предшественники

PV, как было показано, растут в отсутствие добавленного эритропоэтина, так называемого образования эндогенных эритроидных колоний (EEC) 1 , и обладают повышенной чувствительностью к множеству других цитокинов, включая инсулиноподобный фактор роста-1. 2 Формирование EEC, однако, не является специфическим для PV и также идентифицируется в других MPD. Другие свойства включают повышенную экспрессию ингибитора апоптоза Bcl-x L в отсутствие Epo в эритроидных клетках PV, что позволяет предположить, что дерегулированная экспрессия Bcl-xL может способствовать эритропоэтин-зависимой выживаемости клеток эритроидного происхождения в PV. 3 Экспрессия рецептора тромбопоэтина, Mpl, тромбоцитами и мегакариоцитами пациентов с PV была снижена по сравнению с нормальным контролем. 4 Это опять же не относится к PV, но может встречаться и в других MPD. Было обнаружено, что синтез РНК из гена polycythaemia rubra vera 1 (PRV-1) чрезмерно экспрессируется в гранулоцитах PV. 5 Эритроидные колонии от пациентов с ПВ содержат гиперактивную мембранно-ассоциированную тирозинфосфатазу PTP-MEG2, хотя точная роль в эритрогенезе требует дальнейшего изучения. 6

В нормальных условиях связывание рецептора Epo его лигандом вызывает быстрое фосфорилирование Akt и последующую стимуляцию путей выживания эритроидных колоний. Было показано, что эритроидные клетки, полученные от индивидуумов с PV, демонстрируют повышенное фосфорилирование Akt / PKb, а также киназы гликоген-синтазы 3. 7 Это способствует присущим эритроидным клеткам свойствам выживания. Анализ микроматрицы идентифицировал гены-кандидаты, участвующие в патофизиологии PV, включая фактор транскрипции NF-E2 (ядерный фактор (эритроидный 2)).Было показано, что это чрезмерно экспрессируется в мегакариоцитах, эритроидных и миелоидных предшественниках костного мозга субъектов PV. 8

Более 50 лет назад Dameshek 9 связал вместе известные расстройства PV, хронический миелоидный лейкоз и IMF и высказал предположение об общих миелостимулирующих факторах. В начале 1970-х годов хронический миелоидный лейкоз был выделен как отдельное клональное заболевание, определяемое перестройкой одной хромосомы, а позднее и гена ( BCR / ABL ). 10 До недавнего времени другие MPD продолжали разделяться и диагностироваться на основе их клинических и лабораторных данных (). Однако недавние молекулярные открытия в гене JAK2 являются общими для всех этих заболеваний.

Таблица I

Диагностические критерии распространенных миелопролиферативных расстройств

9024

. Причина реактивного тромбоцитоза неизвестна. Следует проявлять осторожность, чтобы исключить дефицит железа у женщин в пременопаузе.

Вера полицитемия Эссенциальная тромбоцитемия Идиопатический миелофиброз 25%
Миелофиброз
выше среднего (среднее значение массы клеток> 9024) 0.6 кобелей; ≥ 0,56 женщины A2 Отсутствие причины вторичного эритроцитоза 1. Количество тромбоцитов> 600 × 10 9 / л * НЕОБХОДИМЫЕ КРИТЕРИИ
9025 Фиброз костного мозга
B) Отсутствие филадельфийской хромосомы или транскрипта BCR-ABL в клетках периферической крови.
A3 Пальпируемая спленомегалия A4 Маркер клональности i.e приобретенный аномальный кариотип костного мозга 2. Нет доказательств явной полицитемии / полицитемии, замаскированной сопутствующим дефицитом железа ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КРИТЕРИИ
(i)
(ii) Анизопойкилоцитоз с эритроцитами слезной капли
B1 Тромбоцитоз (количество тромбоцитов> 400 × 10 9 / л) B2 курильщики;> 12.5 × 10 9 у курильщиков) 3. Отсутствие филадельфийской хромосомы (iii) Наличие циркулирующих незрелых миелоидных клеток
4. Отсутствие периферической крови и / или проявления миелодисплазии или миелофиброза в костном мозге (iv) Наличие циркулирующих эритробластов
B3 Спленомегалия (демонстрируется при изотопном / ультразвуковом сканировании) B4 Характерный рост BFUE или снижение уровня эритропоэтина в сыворотке (v) Наличие скоплений мегакариобластов и аномальных мегакариоцитов в срезах костного мозга.
(vi) Миелоидная метаплазия
Диагноз * У бессимптомных пациентов количество тромбоцитов следует контролировать в течение определенного периода. Диагностика IMF, если:
A1 + A2 + A3 или A4 устанавливает PV A1 + A2 + любые 2 B Критерии устанавливают PV Диагностика проводится при соблюдении всех вышеперечисленных критериев. Два необходимых критерия (обозначенные A и B) присутствуют с дополнительными критериями следующим образом:
(1) любые две другие характеристики, если присутствует спленомегалия
Адаптировано из Британского комитета по стандартам в Гематологические рекомендации по полицитемии 36 На основе диагностических критериев исследования PT-1, координируемого британской группой MPD 38 . (2) любые четыре дополнительных критерия при отсутствии спленомегалии.
Адаптировано из Итальянского консенсуса по диагностическим критериям миелофиброза 39 900 26.

JANUS KINASE 2

Ген JAK2 был впервые клонирован в 1989 г. 11 и является членом семейства четырех киназ Janus 1, 2 и 3 и тирозинкиназы 2.

Первоначально он был назван «просто еще одна киназа», но группа белков была переименована в киназы Януса в честь римского бога ворот и проходов.Эти нерецепторные киназы имеют два схожих «активного» и «неактивного» домена, и это напоминает Бога Януса, который имел способность смотреть одновременно в двух направлениях.

Каждый JAK имеет активный домен тирозинкиназы, гомологию JAK 1 (Jh2), каталитически неактивный домен псевдокиназы, гомологию JAK 2 (Jh3), домен гомологии 2 SRC (Sh3) и аминоконцевой FERM (4-точечный- 1, Erzin, Radixin, Moesin) домен гомологии, в котором происходит связывание с рецепторами цитокинов 1 типа. Взаимодействия домена JAK2 FERM также включают роль в транспортировке цитоплазматического домена рецептора EPO (EPOR) на поверхность клетки. 12 В нормальных физиологических условиях, когда лиганд (например, эритропоэтин) связывается с рецептором, происходит конформационное изменение ( см. ). Затем белок JAK2 вступает в контакт с цитоплазматическим доменом рецептора, где он катализирует фосфорилирование тирозина. Это в первую очередь приводит к привлечению молекул STAT (преобразователь сигнала и активатор транскрипции), которые затем фосфорилируются, гомодимеризуются и перемещаются в ядро, где они действуют как факторы транскрипции.Фосфорилирование тирозина также изменяет другие ключевые регуляторные события, участвующие в сигнальных путях цитокинов.

Диаграмма, иллюстрирующая функциональный путь JAK STAT

Этот путь «JAK STAT», по-видимому, широко распространен среди позвоночных. После связывания лиганда активированный белок JAK2 катализирует фосфорилирование тирозина в цитоплазматическом домене рецептора, а также приводит к фосфарилированию сигнальных преобразователей и активаторов транскрипции (STATS).

Фосфорилирование STAT приводит к димеризации через консервативные домены с гомологией Src 2 (Sh3).Транслокация этих димеров в ядро ​​затем происходит с помощью Nucleoprotein Interactor 1 (NPI-1). Последующая регуляция экспрессии генов происходит после взаимодействия с элементами ответа ДНК. Это приводит к транскрипционному ответу. Также существует взаимодействие с нисходящими путями RAS / MAPK, Pl-3 K и Akt.

В нормальных условиях усиленная экспрессия генов находится под действием сложных механизмов отрицательной обратной связи, включая, среди прочего, продукцию негативных регуляторов, подавляющих передачу сигналов цитокинов (SOCS).

Домен Jh3 является некаталитической псевдокиназой и выполняет несколько важных регуляторных функций. 13 Похоже, что в отсутствие связывания лиганда он обладает аутоингибирующими свойствами, что, скорее всего, проявляется взаимодействием Jh3 / Jh2, и если произойдет изменение в этой области, это приведет к нарушению регуляции этого аутоингибирования. Также кажется, что максимальная активность JAK2 в ответ на цитокины требует интактной области Jh3.

За короткий период в начале 2005 года четыре разные группы описали идентичную мутацию в JAK2 V617F у большого числа пациентов с MPD. 14 17 Хотя все группы пришли к одному результату, они подошли к нему разными методами. Группа Вайнченкеров, которые, как известно, сделали открытие первыми, подошли к нему с точки зрения биологии, лежащей в основе болезни. 14 Ранее они наблюдали, что ингибиторы JAK2 и других киназ вмешиваются в независимую от эритропоэтина дифференцировку в PV. 18 Поэтому они рассмотрели потенциальные механизмы, приводящие к образованию ЭЭК.

Идентифицируя JAK2 как потенциальный ген-кандидат и осознавая его роль в качестве сигнальной молекулы, расположенной выше по течению, непосредственно связанной с рецептором эритропоэтина, они сосредоточили внимание на этой тирозинкиназе. Они обнаружили, что подавление экспрессии JAK2 посредством введения короткой интерферирующей РНК приводит к заметному ингибированию образования EEC у людей с PV. Это, очевидно, предупредило исследователей о ключевой роли JAK2 в формировании EEC и побудило секвенировать кодирующие экзоны и интрон-экзонные соединения гена у трех пациентов с PV и у двух нормальных контролей.Два человека с ПВ продемонстрировали наличие мутации JAK2 V617F. () В более крупной группе пациентов с ПВ мутация присутствовала в 88% случаев. Во всех контрольных группах, помимо всех 35 образцов пациентов с диагнозом вторичный эритроцитоз, был обнаружен только JAK2 дикого типа.

Диаграмма доменов JAK2 с выделением основных ролей и указанием приблизительного местоположения мутации V617F.

Было показано, что мутация приобретена, поскольку она присутствует в миелоидном клоне, но отсутствует в Т-клетках.Эта группа также идентифицировала способность мутированного JAK2 спонтанно активировать нижестоящую транскрипцию, опосредованную STAT, в отсутствие лиганда эритропоэтина. Это контрастирует с неспособностью JAK2 дикого типа опосредовать такие события. Также наблюдалась активация путей ERK / MAP киназы и P13K / AKT в отсутствие стимуляции альтернативными цитокинами. В заключение следует отметить, что аутоингибиторная активность JAK2 была нарушена присутствием этой мутации V617F.

Группа Skoda 15 продолжила предыдущую работу, в которой они идентифицировали потерю гетерозиготности (LOH) на коротком плече хромосомы 9 у части пациентов с MPD с помощью полногеномного микросателлитного скрининга.Это предполагает, что 9p может нести патогенную мутацию. Первоначально они использовали 10 микросателлитных маркеров, покрывающих хромосму 9p, и обнаружили 9p LOH в гранулоцитах, полученных от пациентов с MPD, в 21% (51/244) случаев и ни в каких контрольных случаях, включая CML. У всех 51 пациента с 9p LOH была мутация JAK2 V617F. Дальнейшее исследование обнаружило мутацию у 65% пациентов с ПВ, из которых 27% имели приобретенную гомозиготную мутацию и 38% — гетерозиготную мутацию.

Нарушение регуляции ключевых тирозинкиназ имеет первостепенное значение в патогенезе многих видов рака, включая ХМЛ.Это побудило к дальнейшим углубленным поискам мутаций тирозинкиназ при обычных миелопролиферативных заболеваниях. Группа Гиллиланда 16 провела поиск мутаций тирозинкиназ с использованием высокопроизводительного анализа последовательностей и обнаружила мутацию JAK2 V61F . В рамках большого исследования генов протеинкиназ в MPD группа Грина 17 обнаружила мутацию у 57% людей с ET, 50% людей с IMF и 97% людей с PV. Он был обнаружен как в гранулоцит-макрофагальных, так и в эритроидных колониях и, что интересно, присутствовал во всех EEC, демонстрируя связь с гиперчувствительностью к факторам роста.

Мутация JAK2 V61F является причиной некоторых аномалий, описанных в PV, хотя молекулярные события, связывающие мутацию с биологическими параметрами, требуют дальнейшего описания. Домен Jh3 является псевдокиназой и обладает аутоингибиторными свойствами, предотвращающими фосфорилирование рецептора. Из исследований моделирования предсказано, что высококонсервативный валин в положении 617 будет располагаться на верхней поверхности N-концевой доли домена Jh3. Замена валина на большой фенлиланин дестабилизирует складку домена. 16 Следовательно, наличие мутации привело бы к JAK2, который является конститутивно активным. Интересно, что у гетерозигот, по-видимому, существует конкуренция между генами дикого типа и мутантными генами.

Гематопоэтические стволовые клетки пациентов с MPD гиперчувствительны к ряду факторов роста и используют JAK2 для передачи сигналов. Наблюдения предполагают нарушение передачи сигнала ниже JAK2, включая конститутивную активацию STAT3, повышающую регуляцию антиапоптотического белка Bcl-x L 3 и повышенную активность AKT. 7 Стимулируемые рецептором смерти пути апоптоза также оказываются нарушенными в эритробластах, происходящих от JAK2 V617F PV, с нарушенной регуляцией экспрессии короткой изоформы c-FLIP 21 , которая играет существенную роль в нормальном гомеостатическом каскаде апоптоза.

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ

Мутация JAK2 V617F в MPD может быть обнаружена различными методами. Самый простой метод — выделить ДНК из лейкоцитов цельной крови и использовать прямое ПЦР-секвенирование.Однако, поскольку мутация приобретена и ограничена миелоидным происхождением, этот метод имеет чувствительность от 20 до 30%. Подразумевается, что мутантный клон JAK2 V617F должен составлять значительную часть от общей популяции лейкоцитов, чтобы его можно было обнаружить этим методом.

Центрифугирование в градиенте фиколла можно использовать для выделения мононуклеарных клеток с последующим разделением на клоны гранулоцитов / макрофагов и лимфоциты. Следует использовать методы, гарантирующие отсутствие серьезного загрязнения фракций, например магнитную сортировку / проточную цитометрию.Затем можно выделить ДНК из фракций и применить методы прямого секвенирования. Это позволяет обнаруживать приобретенную мутацию JAK2 V617F в клетках миелоидного происхождения.

Amplification Refractory Mutation Screening (ARMS) ПЦР позволяет детектировать одно изменение основания в идеальных условиях ПЦР. Это идеально подходит для обнаружения трансверсии G → T по одному основанию, связанной с рассматриваемой мутацией JAK2 . В методе ARMS-PCR () используются 4 праймера следующим образом; прямой внешний праймер, обратный внешний праймер, прямой внутренний праймер, специфичный для дикого типа, и обратный внутренний праймер, специфичный для мутанта.Прямой праймер из одного набора и обратный из другого могут усиливать полосу положительного контроля. Два других праймера охватывают сайт мутации JAK2 V617F. Следовательно, в присутствии мутации JAK2 обратный внутренний мутантный специфический праймер и прямой внешний праймер связываются с образованием фрагмента размером 279 п.н. В присутствии JAK2 дикого типа обратный внешний праймер и прямой внутренний специфический праймер дикого типа продуцируют фрагмент размером 229 пар оснований.Выполнение серии разведений показывает, что уровень чувствительности ARMS-PCR составляет 1-2%. 22 Анализ позволяет различать гомозиготных и гетерозиготных индивидуумов с мутацией JAK2 V617F и играет ключевую роль в качестве надежного скринингового теста на наличие или отсутствие мутации у лиц с MPD.

Тетра праймер ARMS PCR

  • Tetra Primer Amplification Refractory Mutation Screening Полимеразная цепная реакция — ARMS-PCR — чрезвычайно эффективный метод обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNPS).

  • Состоит из двух пар праймеров — для амплификации дикого типа и мутанта соответственно.

  • Две аллель-специфические реакции амплификации происходят в противоположных направлениях одновременно.

  • Несоответствие находится в середине внутренних праймеров в отличие от традиционной ПЦР ARMS.

  • Существует внешний прямой праймер, прямой внутренний праймер дикого типа, обратный внешний праймер и обратный внутренний мутантный специфический праймер.

  • Требуются две температурные программы во время реакции ПЦР.

  • Из-за расположения внешних праймеров на разном расстоянии от сайта мутации в этом примере в гетерозиготе генерируются три фрагмента: два небольших аллель-специфичных фрагмента и большой контрольный продукт ПЦР.

  • Фрагменты ДНК можно различить с помощью электрофореза на агарозном геле.

Хотя ARMS-ПЦР может указать, является ли человек гомозиготным или гетерозиготным по мутации V617F JAK2 , она не дает количественной оценки соотношения аллелей дикого типа и мутантных аллелей.Это также относится к ПЦР-прямому секвенированию. Пиросеквенирование, в котором используется количественный метод, первоначально разработанный для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), был разработан для обнаружения мутации G1849T JAK2 , обеспечивая точные соотношения аллелей. 23 , 24 Этот метод уникален тем, что дает количественный результат для каждого аллеля. Пиросеквенирование включает амплификацию с помощью ПЦР экзона 12 из JAK2 с набором праймеров, один из которых помечен биотиновой меткой.Продукты одноцепочечной ПЦР получают после ПЦР. Любые меченые биотином одноцепочечные молекулы ДНК затем специфически выделяются путем захвата с помощью стрептавидиновых гранул, и генотипы определяются с использованием программного обеспечения SNP, которое позволяет количественно определять частоту аллелей и оценивать людей как гомозиготных, когда мутантный аллель превышает 50%.

КЛИНИЧЕСКИЕ СООТВЕТСТВИЯ

Другие группы приступили к изучению своей серии пациентов и определили аналогичные показатели наличия мутации в различных группах заболеваний (). 14 17 , 22 25 Интересно то, что мутация встречается крайне редко у тех, у кого не установлена ​​причина эритроцитоза, и поэтому скрининг полезен для выявления клональных болезнь. 26 Присутствие мутации JAK2 V617F коррелировало с другими описанными биологическими явлениями, такими как экспрессия PRV1 и образование ЕЕС. 27 Было показано, что пациенты, которые являются гетерозиготными или гомозиготными по мутации JAK2 V617F, экспрессируют более высокие уровни NF-E2 по сравнению с индивидуумами с отрицательной мутацией. 28

Таблица 2

Некоторые зарегистрированные случаи мутации JAK2 V61F при миелопролиферативных заболеваниях

Зеленый 17

9025 9025

9025

9024

Исследователи Vainchenker 14 Gilliland 16 Skoda 15 Tefferi 24 Cross 22 Zhao 25 9024 9024 9024 9024 9024 9025 Jelinek PV 97% 88% 74% 65% 81% 83% 4 86%

4 86%

ET 57% 9001 7 43% 32% 23% 41% 30%
IMF 4 50% 90% 4 50% 35% 57% 43% 95%
SM 0%
CNL 17% 33% 33% 33% 0% 2%
ООН 20%
MDS 1.5%
CMML 3% 13%

те, кто разные по мутации 9000 более запущенное заболевание по сравнению с гетерозиготными. Kravolics 15 показали, что те, кто был гомозиготным, имели более длительную продолжительность болезни и с большей вероятностью развивались вторичный миелофиброз.Tefferi 29 продемонстрировал, что при ПВ у тех, кто обладает гомозиготной мутацией JAK2 , как правило, наблюдается более высокий уровень гемоглобина, повышенная частота зуда и более высокая частота фиброзных осложнений.

Значение рассмотрения случаев с очень небольшим процентом JAK2 мутантных положительных клонов как «истинных» JAK2 V617F остается неясным. Очевидно, необходимо подумать о том, какое «отсеченное» значение мы используем, чтобы отличить тех, кто обладает мутацией, от тех, кто классифицируется как отрицательная по мутации.Это важно, если присутствие мутации JAK2 V61F должно стать первостепенным в системе классификации MPD. Семейные MPD, включая полицитемию, 30 , были хорошо задокументированы, и кажется, что даже в этих редких случаях мутация JAK2 оказывается соматической, а не зародышевой по своей природе.

Влияние мутации на IMF с клинической точки зрения кажется несколько менее четко определенным. В большом исследовании миелофиброза Campbell et al. 31 показали, что пациенты с мутацией JAK2 V617F имели более высокое количество нейтрофилов и лейкоцитов по сравнению с пациентами без мутации, и в целом имели более плохой прогноз.Tefferi et al. 32 искали мутацию у различных пациентов с миелофиброзом и обнаружили, что мутация с большей вероятностью присутствует у пациентов с предшествующей историей PV по сравнению с de novo MF. Наличие мутации JAK2 V617F в этой довольно большой когорте из 157 пациентов, по-видимому, не имело прогностического значения.

Проспективное исследование ЭТ MRC-PT-1 позволило сравнить пациентов с положительными и отрицательными мутациями. 33 Те, у кого была мутация, имели признаки, похожие на PV, более высокий гемоглобин, более высокое количество нейтрофилов, более высокий венозный тромбоз и более высокую скорость превращения в PV, но у них были более низкие уровни сывороточного эритропоэтина и ферритина. JAK2 V617F-положительные пациенты оказались более чувствительными к лечению гидроксикарбамидом, но не анагрелидом. Другая серия пациентов с ET показала, что те, у кого была мутация, с большей вероятностью трансформировались в PV. 34 Эти данные ставят под сомнение разделение болезней PV и ET.Может иметь место континуум заболевания с эффектами мутации JAK2 V617F на клинические проявления под влиянием других модификаторов, включая поступление железа, подавление эритропоэтина и другие генетические модификаторы ( см. ) .

Модель континуума болезни JAK2 V61F.

ДРУГИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Наличие мутации было исследовано при атипичных MPD, включая системный мастоцитоз, гиперэозинофильный синдром, хронический нейтрофильный лейкоз, неклассифицированные миелопролиферативные заболевания. 24 Интересно, что McLornan et al. 35 обнаружили мутацию у одного пациента с хроническим нейтрофильным лейкозом с необычно длительным течением, при котором мутация может каким-то образом влиять на течение болезни. Мутация была обнаружена у различных пропорций пациентов, как описано в. Он редко выявляется у пациентов с миелодиспластическими расстройствами. 22 Распространенность мутации выше у пациентов с острым миелоидным лейкозом (AML) с предшествующей PV или IMF, чем в общей когорте. 36 Редко сообщалось в других группах пациентов с AML и ни у одного пациента с лимфоидным лейкозом. 23 , 36

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

Захватывающее открытие единственной мутации в широком спектре MPD привело к быстрому прогрессу в исследовании MPD, но приводит к ряду дополнительных вопросов. Иерархическое положение этой мутации требует дальнейшего изучения. До сих пор не ясно, является ли мутация JAK2 V61F первичным инициирующим событием или вторичным событием с пока неизвестным первичным событием.Хотя наличие мутации было достаточным для индукции эритроцитоза у мышей, это экспериментальная ситуация, которой манипулируют, и ее может быть недостаточно для инициирования заболевания у человека.

Классификация МУРЗ требует пересмотра. Наличие мутации свидетельствует о клональном нарушении, но разделение болезней на основе клинических характеристик требует пересмотра. Остаются вопросы о лежащем в основе патогенезе пациентов с миелопролиферативными нарушениями, отрицательными по мутациям.Таким образом, открытие единственной мутации JAK2 V61F у большого числа пациентов с MPD привело к значительному прогрессу в понимании MPD, но приводит к множеству более интересных биологических вопросов.

Примечания

У авторов нет конфликта интересов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Прчал Дж. Ф., Аксельрад А. А.. Реакции костного мозга при истинной полицитемии. N Engl J Med. 1974; 290 (24): 1382. [PubMed] [Google Scholar] 2. Корреа П.Н., Эскинази Д., Аксельрад А.А. Циркулирующие эритроидные предшественники при истинной полицитемии гиперчувствительны к инсулиноподобному фактору роста-1 in vitro: исследования в улучшенной бессывороточной среде.Кровь. 1994. 83 (1): 99–112. [PubMed] [Google Scholar] 3. Сильва М., Ричард С., Бенито А., Санс К., Олалла И., Фернандес-Луна Дж. Л.. Экспрессия Bcl-x в предшественниках эритроидов пациентов с истинной полицитемией. N Engl J Med. 1998. 338 (9): 564–71. [PubMed] [Google Scholar] 4. Молитерно А.Р., Ханкинс В.Д., Спивак Я.Л. Нарушение экспрессии рецептора тромбопоэтина тромбоцитами у пациентов с истинной полицитемией. N Engl J Med. 1998. 338 (9): 572–80. [PubMed] [Google Scholar] 5. Темеринак С., Клиппель С., Струнк Е., Родер С., Любберт М., Ланге М. и др.Клонирование PRV-1, нового члена суперсемейства рецепторов uPAR, которое сверхэкспрессируется при полицитемии вера. Кровь. 2000. 95 (8): 2569–76. [PubMed] [Google Scholar] 6. Сюй MJ, Суй X, Zhao R, Dai C, Krantz SB, Zhao ZJ. PTP-MEG2 активируется в клетках-предшественниках эритроидной полицитемии и требуется для роста и размножения эритроидных клеток. Кровь. 2003. 102 (13): 4354–60. [PubMed] [Google Scholar] 7. Дай Ц., Чунг И.Дж., Кранц С.Б. Повышенный эритропоэз при истинной полицитемии связан с повышенной пролиферацией эритроидов и повышенным фосфорилированием Akt / PKB.Exp Hematol. 2005. 33 (2): 152–8. [PubMed] [Google Scholar] 8. Goerttler PS, Kreutz C, Donauer J, Faller D, Maiwald T., Marz E, et al. Профили экспрессии генов при истинной полицитемии: сверхэкспрессия фактора транскрипции NF-E2. Br J Haematol. 2005. 129 (1): 138–50. [PubMed] [Google Scholar] 9. Дамешек В. Некоторые размышления о миелопролиферативных синдромах. Кровь. 1951; 6 (4): 372–5. [PubMed] [Google Scholar] 10. Роули Дж. Д. Новая стойкая хромосомная аномалия при хроническом миелолейкозе, идентифицированная с помощью флюоресценции хинакрина и окрашивания по Гимзе.Природа. 1973; 243 (5405): 290–3. [PubMed] [Google Scholar] 11. Уилкс А.Ф. Две предполагаемые протеин-тирозинкиназы, идентифицированные с помощью полимеразной цепной реакции. Proc Natl Acad Sci. 1989. 86 (5): 1603–7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Хуанг Л.Дж., Константинеску С.Н., Лодиш Х.Ф. N-концевой домен киназы Janus 2 необходим для процессинга Гольджи и экспрессии рецептора эритропоэтина на клеточной поверхности. Mol Cell. 2001. 8 (6): 1327–38. [PubMed] [Google Scholar] 13. Сахаринен П., Вихинин М., Сильвеннойнен О.Аутоингибирование тирозинкиназы Jak2 зависит от конкретных участков в ее псевдокиназном домене. Mol Biol Cell. 2003. 14 (4): 1448–59. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Джеймс С., Уго В., Ле Кудик Дж. П., Стерк Дж., Деломмо Ф., Лаку С. и др. Уникальная клональная мутация JAK2, приводящая к конститутивной передаче сигналов, вызывает истинную полицитемию. Природа. 2005. 434 (7037): 1144–8. [PubMed] [Google Scholar] 15. Кралович Р., Пассамонти Ф., Бузер А.С., Тео СС, Тидт Р., Пассвег Дж. Р. и др. Мутация JAK2 с усилением функции при миелопролиферативных заболеваниях.N Engl J Med. 2005. 352 (17): 779–90. [PubMed] [Google Scholar] 16. Левин Р.Л., Уодли М., Кулз Дж., Эберт Б.Л., Верниг Дж., Хантли Б.Дж. и др. Активирующая мутация тирозинкиназы JAK2 при истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии и миелоидной метаплазии с миелофиброзом. Раковая клетка. 2005. 7 (4): 387–97. [PubMed] [Google Scholar] 17. Бакстер Э.Дж., Скотт Л.М., Кэмпбелл П.Дж., Восточный Ц., Фуруклас Н., Суантон С. и др. Проект генома рака. Приобретенная мутация тирозинкиназы JAK2 при миелопролиферативных заболеваниях человека.Ланцет. 2005. 365 (9464): 1054–61. Ошибка в: Lancet 2005; 366 (9480) 122. [PubMed] [Google Scholar] 18. Уго В., Марзак К., Тейссандье И., Ларбе Ф., Леклюз И., Дебили Н. и др. Множественные сигнальные пути участвуют в эритропоэтин-независимой дифференцировке эритроидных предшественников при истинной полицитемии. Exp Hematol. 2004. 32 (2): 179–87. [PubMed] [Google Scholar] 19. Кралович Р., Гуань Ю., Прчал Дж. Т.. Приобретенная монородительская дисомия хромосомы 9p — частый дефект стволовых клеток при истинной полицитемии. Exp Hematol.2002. 30 (3): 229–36. [PubMed] [Google Scholar] 20. Родер С., Штаймле С., Майнхардт Г., Пал Х.Л. STAT3 постоянно активируется у некоторых пациентов с красной полицитемией. Exp Hematol. 2001. 29 (6): 694–702. [PubMed] [Google Scholar] 21. Zeuner A, Pedini F, Signore M, Ruscio G, Messina C, Tafuri A, et al. Повышенная устойчивость рецептора смерти и короткая экспрессия FLIP в клетках-предшественниках эритроидной полицитемии. Кровь. 2005 Dec 29; [Epub перед печатью] [PubMed] [Google Scholar] 22. Джонс А.В., Крейл С., Зои К., Вагхорн К., Кертис С., Чжан Л. и др.Широкое распространение мутации JAK2 V617F при хронических миелопролиферативных заболеваниях. Кровь. 2005. 106 (6): 2162–8. [PubMed] [Google Scholar] 23. Елинек Дж., Оки Ю., Гарибян В., Буэсо-Рамос С., Прчал Дж. Т., Верстовсек С. и др. Мутация JAK2 1849 G> T редко встречается при острых лейкозах, но может быть обнаружена при CMML, филадельфийской хромосомно-отрицательной CML и мегакариоцитарной лейкемии. Кровь. 2005. 106 (10): 3370–3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Стинсма Д.П., Девальд Г.В., Лашо Т.Л., Пауэлл Х.Л., МакКлюр Р.Ф., Левин Р.Л. и др.Активирующая мутация тирозинкиназы JAK2 V617F является нечастым событием как при «атипичных» миелопролиферативных заболеваниях, так и при миелодиспластическом синдроме. Кровь. 2005. 106 (4): 1207–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Чжао Р., Син С., Ли З, Фу Х, Ли Кью, Кранц С.Б. и др. Выявление приобретенной мутации JAK2 при истинной полицитемии. J Biol Chem. 2005. 280 (24): 22788–92. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 26. Перси MJ, Джонс FG, Грин AR, Reilly JT, McMullin MF. Мутация V617F JAK2 редко встречается у пациентов с идиопатическим эритроцитозом.Haematologica. 2006. 91 (3): 413–4. [PubMed] [Google Scholar] 27. Goerttler PS, Steimle C, Marz E, Johansson PL, Andreasson B, Greisshammer M, et al. Мутация Jak2V617F, избыточная экспрессия PRV-1 и образование EEC определяют аналогичную когорту пациентов с MPD. Кровь. 2005. 106 (8): 2862–4. [PubMed] [Google Scholar] 28. Краволикс Р., Тео С.С., Бузер А.С., Брутше М., Тидт Р., Тичелли А. и др. Измененная экспрессия генов при миелопролиферативных заболеваниях коррелирует с активацией передачи сигналов мутацией V617F JAK2.Кровь. 2005. 106 (10): 3374–6. [PubMed] [Google Scholar] 29. Теффери А., Лашо Т.Л., Швагер С.М., Стрэнд Дж.С., Эллиотт М., Меса Р. и др. Клинический фенотип дикого типа, гетерозиготного и гомозиготного JAK2 (V617F) при истинной полицитемии. Рак. 2005. 106 (3): 631–5. [PubMed] [Google Scholar] 30. Карио Х., Герттлер П.С., Штаймле С., Левин Р.Л., Пал Х.Л. Мутация JAK2 V617F приобретается вторично по отношению к предрасполагающему изменению в семейной истинной полицитемии. Br J Haematol. 2005. 130 (5): 800–1. [PubMed] [Google Scholar] 31.Кэмпбелл П.Дж., Грисхаммер М., Донер К., Донер Х., Кузек Р., Хассельбалч Х.С. и др. Мутация V617F в JAK2 связана с худшей выживаемостью при идиопатическом миелофиброзе. Кровь. 2006. 107 (5): 2098–100. [PubMed] [Google Scholar] 32. Tefferi A, Lasho TL, Schwager SM, Steensma DP, Mesa RA, Li CY, et al. Мутация тирозинкиназы JAK2 (V617F) при миелофиброзе с миелоидной метаплазией: специфичность клонов и клинические корреляты. Br J Haematol. 2005. 131 (3): 320–8. [PubMed] [Google Scholar] 33. Кэмпбелл П.Дж., Скотт Л.М., Бак Дж., Уитли К., Восточный К.Л., Марсден Дж. Т. и др.Группа изучения миелопролиферативных заболеваний Соединенного Королевства; Рабочая группа Совета по медицинским исследованиям по лейкемии взрослых; Австралазийская группа лейкемии и лимфомы Определение подтипов эссенциальной тромбоцитемии и связь с истинной полицитемией на основе статуса мутации JAK2 V617F: проспективное исследование. Ланцет. 2005; 366 (9501): 1945–53. [PubMed] [Google Scholar] 34. Wolanskyj AP, Lasho TL, Schwager SM, McClure RF, Wadleigh M, Lee SJ, et al. Мутация JAK2V617F при эссенциальной тромбоцитемии: клинические ассоциации и долгосрочное прогностическое значение.Br J Haematol. 2005. 131 (2): 208–13. [PubMed] [Google Scholar] 35. МакЛорнан Д.П., Перси М.Дж., Джонс А.В., Кросс Северная Каролина. МакМуллин М.Ф. Хронический нейтрофильный лейкоз с ассоциированной мутацией тирозинкиназы V617F JAK2. Haematologica. 2005. 90 (12): 1696–7. [PubMed] [Google Scholar] 36. Левин Р.Л., Лорио М., Хантли Б.Дж., Ло М.Л., Беран М., Стоффреген Э. и др. Активирующая мутация JAK2V617F встречается при хроническом миеломоноцитарном лейкозе и остром миелоидном лейкозе, но не при остром лимфобластном лейкозе или хроническом лейкозе.Кровь. 2005. 106 (10): 3377–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 37. Макмаллин М.Ф., Барефорд Д., Кэмпбелл П., Грин А.Р., Харрисон С., Хант Б. и др. Руководство по диагностике, исследованию и лечению полицитемии / эритроцитоза. Br J Haematol. 2005. 130 (2): 174–95. [PubMed] [Google Scholar] 38. Харрисон К.Н., Кэмпбелл П.Дж., Бак Дж., Уитли К., Ист-К.Л., Бэрфорд Д. и др. Гидроксимочевина в сравнении с анагрелидом при эссенциальной тромбоцитемии высокого риска. N Engl J Med. 2005. 353 (1): 33–45. [PubMed] [Google Scholar] 39.Барози Г., Амброзетти А., Финелли С., Гросси А., Леони П., Либерато Н. Л. и др. Итальянская консенсусная конференция по диагностическим критериям миелофиброза с миелоидной метаплазией. Br J Haematol. 1999. 104 (4): 730–7. [PubMed] [Google Scholar]

мутации JAK2 | Лабораторные тесты онлайн

Источники, использованные в текущем обзоре

Нагалла С. и Беса Э. (обновлено 2 декабря 2016 г.). Вера полицитемия. Спасательные препараты и болезни. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/205114-workup#c5.Доступно 22.01.17.

Лал, А. (Обновлено 10 ноября 2016 г.). Эссенциальное обследование тромбоцитоза. Спасательные препараты и болезни. Доступно в Интернете по адресу http://emedicine.medscape.com/article/206697-workup#showall. Доступно 22.01.17.

(© 1995–2017). JAK2 V617F Обнаружение мутаций, кровь. Клиника Мэйо Медицинские лаборатории Мэйо. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/88715. Доступно 22.01.17.

(© 1995–2017). Обнаружение 12 экзона JAK2 и других мутаций, не относящихся к V617F, кровь.Клиника Мэйо Медицинские лаборатории Мэйо. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/89189. Доступно 22.01.17.

(сентябрь 2014 г., обзор). Ген Jak2. Домашний справочник по генетике. Доступно в Интернете по адресу https://ghr.nlm.nih.gov/gene/JAK2. Доступно 22.01.17.

Келли Т. и Салама М. (обновлено за октябрь 2016 г.). Миелопролиферативные новообразования — МПН. ARUP Consult. Доступно на сайте https://arupconsult.com/content/myeloproliferative-neoplasms.Доступно 22.01.17.

Арбер Д.А., Орази А., Хассерджян Р. и др. Пересмотр 2016 г. классификации миелоидных новообразований и острого лейкоза Всемирной организации здравоохранения. Кровь . 2016; 127: 2391-2405. Доступно в Интернете по адресу http://www.bloodjournal.org/content/127/20/2391?sso-checked=true. По состоянию на февраль 2017 г.

Хофманн И. Миелопролиферативные новообразования у детей. J Гематопатол . 2015; 8: 143-157.

Вайнченкер В., Кралович Р. Генетические основы и молекулярная патофизиология классических миелопролиферативных новообразований. Кровь . 2017; 129: 667-679.

Rumi E, Cazzola M. Диагностика, стратификация риска и оценка ответа при классических миелопролиферативных новообразованиях. Кровь . 2017; 129: 680-692.

DeLario MR, Sheehan AM, Ataya R и др. Клинические, гистопатологические и генетические особенности первичного миелофиброза у детей — сущность, отличная от взрослых. Ам Дж. Гематол . 2012; 87: 461-464.

An W, Wan Y, Guo Y, et al. Скрининг мутаций CALR при первичном миелофиброзе у детей. Рак крови у детей. 2014; 61: 2256-2262.

Источники, использованные в предыдущих обзорах

(2007 май). Эссенциальная или первичная тромбоцитемия. Общество лейкемии и лимфомы [он-лайн информация]. PDF-файл доступен для загрузки по адресу http://www.leukemia-lymphoma.org/attachments/National/br_1178803674.pdf. По состоянию на июль 2009 г.

(февраль 2009 г.). Что такое истинная полицитемия? Национальный институт сердца, легких и крови [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http: // www.nhlbi.nih.gov/health/dci/Diseases/poly/poly_whatis.html. По состоянию на июль 2009 г.

Билс, Дж. (16 марта 2009 г.) Гаплотипы JAK2 влияют на восприимчивость к миелопролиферативным новообразованиям. Medscape Medical News [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/589655. По состоянию на июль 2009 г.

McMahon, C. et. al. (2007 25 мая). Мутация JAK2 V617F у пациентов с катастрофическими внутрибрюшными тромбозами. Medscape из Американский журнал клинической патологии [Он-лайн информация].Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/556664. По состоянию на июль 2009 г.

Tan, A. et. al. (23 июля 2007 г.). Простой, быстрый и чувствительный метод обнаружения мутации JAK2 V617F. Medscape из Американский журнал клинической патологии [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/558906. По состоянию на июль 2009 г.

Vannucchi, A. et. al. (23 марта 2009 г.). Варианты лечения эссенциальной тромбоцитемии и истинной полицитемии.Medscape от Гематологический экспертный обзор [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.medscape.com/viewarticle/589735. По состоянию на июль 2009 г.

(март 2007 г.). JAK2 c.1849G> T (V617F) Количественная оценка мутации с помощью ПЦР в реальном времени. Технический бюллетень ARUP [Он-лайн информация]. PDF-файл доступен для загрузки на сайте http://www.aruplab.com. По состоянию на июль 2009 г.

(март 2007 г.). JAK2 (V617F) Мутация с помощью ПЦР. Технический бюллетень ARUP [Он-лайн информация]. PDF-файл доступен для скачивания по адресу http: // www.aruplab.com. По состоянию на июль 2009 г.

Чек, W. (сентябрь 2008 г.). Групповой иск по миелопролиферативным заболеваниям. CAP Today [Он-лайн информация]. Доступно в Интернете по адресу http://www.cap.org. По состоянию на июль 2009 г.

(13 февраля 2012 г.). Теффери, Аялев. Истинная полицитемия и эссенциальная тромбоцитемия: обновленная информация о диагностике, стратификации риска и лечении за 2012 год. Американский журнал гематологии Серия непрерывного образования. Доступно в Интернете по адресу http: // onlinelibrary.wiley.com. По состоянию на июнь 2013 г.

(апрель 2013 г.). Классические BCR-ABL1-отрицательные миелопролиферативные новообразования. Лаборатории Аруп. PDF-файл доступен для загрузки по адресу http://www.aruplab.com/guides/ug/tests/iconpdf_383.pdf. По состоянию на июнь 2013 г.

(8 декабря 2012 г.). Киладжян, Жан-Жак. Спектр JAK2-положительных миелопролиферативных новообразований. Образовательная книга Американского общества гематологии. Доступно в Интернете по адресу http://asheducationbook.hemologylibrary.org/content/2012/1/561.full. По состоянию на июнь 2013 г.

(обновлено в мае 2013 г.). Миелопролиферативные новообразования. Аруп Консалт. Доступно в Интернете по адресу http://www.arupconsult.com/Topics/MyeloproliferativeNeoplasms.html. По состоянию на июнь 2013 г.

(проверено в декабре 2011 г.). JAK2 . Национальная медицинская библиотека. Домашний справочник по генетике. Доступно в Интернете по адресу http://ghr.nlm.nih.gov/gene/JAK2. По состоянию на июнь 2013 г.

(проверено в декабре 2011 г.). Эссенциальная тромбоцитемия. Национальная медицинская библиотека. Домашний справочник по генетике. Доступно в Интернете по адресу http: // ghr.nlm.nih.gov/condition/essential-thrombocythemia. По состоянию на июнь 2013 г.

Вайнченкер, Уильям и др. (7 июня 2011 г.). Новые мутации и патогенез миелопролиферативных новообразований. Кровь. Американское общество гематологии. PDF-файл доступен для загрузки на http://bloodjournal.hemologylibrary.org/content/118/7/1723.full.pdf. По состоянию на июнь 2013 г.

(обновлено в марте 2013 г.). Янус Киназа 2 . Интернет-Менделирующее наследование в человеке (OMIM). Доступно в Интернете по адресу http://omim.org/entry/147796.По состоянию на июнь 2013 г.

(сентябрь 2012 г.) Эссенциальная тромбоцитемия. Клиника Майо. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayoclinic.com/health/thrombocythemia/DS01087/DSECTION=symptoms. По состоянию на июнь 2013 г.

(декабрь 2011 г.) Миелофиброз. Клиника Майо. Доступно в Интернете по адресу http://www.mayoclinic.com/health/myelofibrosis/DS00886/DSECTION=symptoms. По состоянию на июнь 2013 г.

JAK2 (V617F), Saint Francis Health System, Tulsa, Oklahoma

JAK2 (V617F)

Символ гена: JAK2

Хромосомный локус: 9p24.1

Белок: Тирозин-протеинкиназа JAK2

Псевдонимы: Janus kinase 2

ВРЕМЯ ОБРАТНОГО ДНЯ: 8 дней

2012 Код AMA: 81270

МЕТОДИКА ТЕСТИРОВАНИЯ: V617F Мутационно-специфическая полимеразная цепная реакция (ПЦР) и флуоресцентный капиллярный электрофорез

ТРЕБОВАНИЯ К ОБРАЗЦАМ:

  • Собрать: Предпочитайте одну пробирку на 3 мл костного мозга или 3 мл цельной крови с ЭДТА (верхняя часть лаванды).
  • Мин. Сбор: 0,7 мл костного мозга или цельной крови.
  • Транспортировка: Комнатная температура отправляется обычным воздухом на следующий день (доставка в субботу не производится; образцы хранятся при 4 ° C, отправляются в понедельник).
  • Стабильность: Окружающая среда: до 7 дней; В холодильнике: 2 недели. Замороженные: неприемлемо
  • Неприемлемые условия: Сыворотка. Замороженная или сильно гемолизированная кровь. Свернувшаяся кровь.

Образец должен сопровождать заявка на лабораторное исследование молекулярной генетики.Свяжитесь с молекулярной лабораторией по телефону 918-502-1721 для получения дополнительной информации.

Примечание: Для генетического тестирования рекомендуется консультирование и информированное согласие. Форма согласия доступна в качестве ресурса, но не обязательна.

ИНТЕРПРЕТАТИВНЫЕ ДАННЫЕ:

Наследование: Приобретено соматически.

Характеристики заболевания: Мутация V617F в гене JAK2 обычно обнаруживается при приобретенных клональных миелопролиферативных заболеваниях.Обнаружение мутации подтверждает наличие миелопролиферативного заболевания, которое имеет значительные преимущества в отношении пролиферации и выживаемости. Пациенты с мутацией V617F имеют значительно более длительную продолжительность заболевания с более высоким уровнем осложнений (фиброз, кровотечение и тромбоз).

Молекулярно-генетический механизм: Мутация Val617Phe (V617F) находится в экзоне 14 по адресу c.1849G> T. Мутация может иметь вид гетерозиготного или гомозиготного изменения.

Клиническая чувствительность: Мутация V617F обнаруживается примерно в 90% случаев истинной полицитемии (PV), 50% эссенциальной тромбоцитопении (ET) и 50% первичного миелофиброза (PMF).

Аналитическая чувствительность: 99%

Ограничения теста: Этот тест обнаруживает только мутацию V617F в экзоне 14 гена JAK2. Этот тест не обнаружит мутации экзона 12. Редкие диагностические ошибки могут возникать из-за мутаций сайта праймера / зонда или редких полиморфизмов.

ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ:

  • Для выявления подгруппы миелопролиферативных заболеваний не хронического миелолейкоза.
  • Наличие мутации JAK2 V617F коррелирует с риском тромбоза, фиброза костного мозга и выживаемостью пациента.
  • Выявить пациентов, которые могут реагировать на ингибиторы тирозинкиназы Jak2

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ССЫЛКИ:

JAK2 V617F мутация, множественные гематологические и негематологические процессы: ассоциация? | Biomarker Research

MPN (ранее хронические миелопролиферативные заболевания) характеризуются эффективной клональной миелопролиферацией (например, гранулоцитозом периферической крови, тромбоцитозом или эритроцитозом) при отсутствии дизеритропоэза, гранулоцитарной дисплазии.Основываясь на Схеме классификации Всемирной организации здравоохранения 2008 г., MPN подразделяются на «классические» (которые включают хронический миелогенный лейкоз (CML), истинную полицитемию (PV), эссенциальную тромбоцитемию (ET), первичный миелофиброз (PMF)) и «атипичные». подгруппы. Представленный здесь пациент соответствовал критериям ЭТ, которое характеризуется пролиферацией мегакариоцитов с крупной и зрелой морфологией, связанной с тромбоцитозом, в отсутствие реактивного тромбоцитоза. Демонстрация мутации JAK2 V617F или другого клонального маркера часто помогает при постановке диагноза [4, 5].

В целом, MPN были связаны с трансформацией заболевания в миелодисплазию (MDS) и / или острый миелоидный лейкоз (AML). Сообщаемая частота AML у пациентов с MPN обычно колеблется в пределах 5-10% в зависимости от конкретного типа MPN после 10 лет наблюдения [6, 7]. Этот риск, по-видимому, связан с самим механизмом основного заболевания, но также может быть связан с терапией для лечения заболевания. Данные по населению из Швеции показали, что пациенты с MPN, получавшие радиоактивный фосфор (P (32)) более 1000 МБк и алкилирующие агенты более 1 грамма, имели 4.В 6 раз (95% ДИ, 2,1–9,8; P = 0,002) и в 3,4 раза (95% ДИ, 1,1–10,6; P = 0,015) повышен риск ОМЛ / МДС, соответственно. Следует отметить, что 41 (25%) из 162 пациентов с МПН с развитием ОМЛ / МДС никогда не подвергались воздействию алкилирующих агентов, P32 или гидроксимочевины, что указывает на важную роль факторов, не связанных с лечением [8].

Недавние исследования также продемонстрировали связь между MPN и LPN. Итальянское исследование показало, что пациенты с MPN имели в 3,44 раза повышенный риск развития LPN по сравнению с общей популяцией, начиная от 2.86 для заболеваний плазматических клеток, 3,44 для неходжкинской лимфомы и 12,42 для хронического лимфолейкоза. Риск развития неходжкинской лимфомы существенно увеличивался до 5,71 раза при наличии мутации JAK2 V617F [9].

У пациента изначально был диагностирован JAK2-положительный MPN, но впоследствии у него развился моноцитоз, а тромбоцитоз улучшился. Он соответствовал критериям Всемирной организации здравоохранения для CMML, который определяется как наличие> 10% полной дифференциации лейкоцитов, абсолютное количество моноцитов> 1000 / мкл, отсутствие гена слияния BCR-ABL1, <20% миелобластов, монобластов и промоноцитов. и дисплазия одной или нескольких миелоидных линий [3].CMML имеет как миелопролиферативные, так и миелодиспластические особенности и поэтому классифицируется как миелодиспластический синдром / миелопролиферативное новообразование (MDS / MPN) [10]. Средний возраст при постановке диагноза составляет около 70 лет с преобладанием мужчин 2: 1 [11]. Патогенез CMML также не совсем ясен. Современные подходы предполагают, что может быть предпочтительный порядок соматических генетических мутаций: сначала TET2 или ASXL1, затем SRSF2 или альтернативный ген сплайсинга, затем мутация сигнального гена, вызывающая гиперчувствительность к GM-CSF и миелопролиферацию в 35-40% случаев [12].

У пациента впоследствии развился AML-M5. Цитогенетические исследования продемонстрировали транслокацию (4; 11) (q21; q24), моносомию 9 и трисомию 11. Перестройка гена MLL, которая затрагивает полосу хромосомы 11q23, была отмечена в 57,5% аномальных миелоидных клеток. В целом хромосомные аномалии тех же типов, что и при первичном ОМЛ, также наблюдаются при ОМЛ / МДС, связанных с терапией [13]. В литературе описано, что делеции или потеря плеча хромосомы 5q или 7q или потеря всей хромосомы (5q — / — 5 и 7q — / — 7) могут наблюдаться при ОМЛ / МДС после лечения алкилирующими агентами, тогда как сбалансированные аберрации с перестройкой характерны для аберраций, связанных с ингибиторами топоизомеразы II.Эти сбалансированные хромосомные аберрации включают гены MLL, AML1 / CBFB, RARA или NUP98 [14]. Ген MLL высоко консервативен среди видов и связан с лейкемией «смешанного происхождения», когда бластные клетки проявляют как миелоидные, так и лимфоидные характеристики. В то время как миелоидные и лимфоидные фенотипы равномерно распределены среди случаев лейкемии de novo с этими аномалиями, подавляющее большинство (> 90%) связанных с терапией AML связаны с миелоидным фенотипом. Ингибиторы топоизомеразы II, такие как антрациклины (например,g., доксорубицин), митоксантрон и дактиномицин были связаны с перестройкой гена MLL, которая обычно имеет латентный период в среднем 30-34 месяца [15]. Следует отметить, что реаранжировка гена MLL сама по себе не может окончательно исключить AML de novo. В одном исследовании частота ОМЛ с перестройкой гена MLL составила 9,4% при ОМЛ, связанном с терапией, против 2,6% при ОМЛ de novo (P <0,001) [16]. Учитывая длительный анамнез MPN / CMML у нашего пациента и его AML, развивающийся в течение 8 месяцев после использования доксорубицина с отчетливым цитогенетическим профилем и реаранжировкой гена MLL, это больше наводит на мысль о AML, связанном с MPN / CMML, хотя предыдущее использование антрациклина может сыграть свою роль. роль тоже.

Как уже отмечалось, у нашего пациента была обнаружена мутация JAK2 V617F во время прохождения обследования на MPN / CMML. Мутация JAK2 V617F долгое время описывалась как доминантная мутация увеличения функции, которая способствует размножению клонов MPN. Это не только важно для диагностики МПН, но также связано со значительно большей продолжительностью заболевания и более высокой частотой осложнений [17]. Хотя эта мутация присутствует у большинства пациентов с MPN, она также наблюдалась в периферической крови здоровых доноров, причем процентное соотношение колеблется от 1 до 10% в зависимости от используемого анализа [18, 19].Значение мутации в этой ситуации неясно. Однако в датском исследовании из 10 507 участников был проведен скрининг на наличие JAK2 V617F, и они наблюдались в течение 17,6 лет после забора крови. Распространенность мутации в этой преимущественно европеоидной популяции составляла 0,2% ( n = 18). Участники с мутацией были связаны с повышенной смертностью, что соответствует многофакторному скорректированному отношению рисков 3,0 (95% ДИ, 1,9–4,9). Многофакторно скорректированные отношения рисков для любого рака и гематологического рака составили 3.7 (95% ДИ, 1,7–8,0) и 58 (95% ДИ, 13–261), соответственно [2]. Таким образом, результаты этого исследования позволяют предположить, что наличие мутации JAK2 V617F может быть маркером повышенного риска развития злокачественных новообразований в будущем и повышенной смертности.

031658 — B6N.129S6 (SJL) -Jak2 / AmlyJ

Jak2 + / VF Мыши имеют инвертированный экзон 14, несущий мутацию от валина к фенилаланину (V617F), ниже эндогенного экзона 14 гена киназы Янус 2 ( Jak2 ).Оба экзона окружены сайтами loxP и loxP511 , что делает возможным Cre-опосредованное удаление эндогенного экзона 14 и инверсию мутированного экзона 14. Мутация V617F обычно обнаруживается у пациентов с миелопролиферативным новообразованием (MPN) и присутствует. примерно у 95% пациентов с истинной полицитемией (PV) и примерно у 50% пациентов с эссенциальной тромбоцитемией (ET) и первичным миелофиброзом (PMF).

JAK2 представляет собой протеинтирозинкиназу, участвующую в специфической подгруппе сигнальных путей цитокиновых рецепторов, и она неправильно регулируется или мутирует при некоторых миелопролиферативных заболеваниях и раках.Мутация V617F приводит к конститутивной активации передачи сигналов киназы JAK2. При активации JAK2 фосфорилирует факторы транскрипции STAT и инициирует сигнальный путь JAK-STAT. Это наиболее распространенная мутация JAK2.

Мыши, гетерозиготные по этому аллелю, жизнеспособны и фертильны, в то время как гомозиготные мыши, подвергшиеся флоксированию, нежизнеспособны. Летальность может быть результатом целевой конструкции, создающей нулевой аллель до удаления cre . При скрещивании с мышами, экспрессирующими тканеспецифическую рекомбиназу Cre, полученное потомство будет иметь удаленный эндогенный экзон 14, а мутантный экзон 14 V617F помещается в транскрипционную ориентацию.

Когда мышей скрещивают с зародышевой линией или штаммом, специфичным для гемопоэза, экспрессирующим Cre-рекомбиназу, таким как B6.FVB-Tg (EIIa-cre), C5379Lmgd / J (инвентарный номер 003724), B6.Cg-Tg (Mx1-cre) Мыши 1Cgn / J (инвентарный номер 003556) или VavCre представляют собой модель MPN, характеризующуюся повышенным гематокритом (HCT), спленомегалией и выраженным экстрамедуллярным эритропоэзом селезенки. Среднее время выживания мышей составляет 146 дней. У них развиваются смертельные 100% пенетрантные миелопролиферативные новообразования, но не острый лейкоз. Компартмент миелоидного предшественника костного мозга смещен в сторону эритроидного происхождения, который не может передавать болезнь.Компартмент долговременных HSC (CD150 + CD48 + LSK) может трансплантировать болезнь смертельно облученным мышам-реципиентам дикого типа. Когда мышей обрабатывают интерфероном-α, клетки Jak2 VF , размножающиеся MPN, истощаются, и болезнь не может передаваться.

Следует отметить, что скрещивание первичных флоксованных мышей с MxCre приводит к спонтанной рекомбинации в отсутствие pIpC.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *