Norovirus 2 генотип рнк: Norovirus II, РНК [реал-тайм ПЦР]

Норовирус, или «желудочный грипп»: спасайся кто может!. Распространенность норовирусов резко активизировалась с середины 1990-х годов прошлого века

Норовирус, компьютерная реконструкция. Изображение: nobeastsofierce / shutterstock.com

По оценкам врачей, норовирус является сегодня основной причиной гастроэнтерита (воспалительных заболеваний желудка и кишечника). Около 90% случаев гастроэнтерита во всем мире вызывает именно норовирус. И многие жители крупных мегаполисов, работающие в большом коллективе в закрытых помещениях, испытали на себе все «прелести» действия этого вируса: рвоту, тошноту, головокружение и диарею. Норовирус является настоящим бичом людей, вынужденных долгое время проводить вместе: в лечебных, образовательных и исправительных учреждениях, общежитиях, пионерских лагерях и даже на круизных лайнерах. Причем, как утверждают специалисты, уберечься от норовируса практически нет шансов: если он попал в закрытый коллектив, то в скором времени подкосит практически всех.

Впервые этот коварный вирус был обнаружен в далеком 1968 году в США, в городе Норуолк. Там возникла вспышка острого гастроэнтерита среди школьников начальной школы. И только через четыре года, в 1972 году с помощью иммунной электронной микроскопии, которой подвергли законсервированные фекалии заболевших детей, был обнаружен новый, ранее неизвестный вирус. Новый вирус получил свое первоначальное название, Norwalk virus, в честь города, где впервые была зарегистрирована вспышка заражения. Свое нынешнее название, Norovirus, вирус получил в 2002 году после утверждения его Международным комитетом по таксономии вирусов. Его часто путают с ротавирусом — уж очень похожи симптомы, но ротавирус относится к семейству Reoviridae. В последнее время, в связи с удешевлением (и улучшением) средств диагностики, их стали различать.

Детальное изучение норовируса (в т.ч. клонирование и секвенирование его генома) показало, что норовирус имеет сходную геномную организацию с вирусами семейства Caliciviridae. Он относится к РНК-вирусам и генетический материал у них содержится в РНК, геном представлен однонитчатой РНК размером приблизительно 7,5 тыс. нуклеотидов. Форма норовирусов представляет собой икосаэдрический капсид, имеющий чашеобразные углубления. Диаметр вирусных частиц составляет 35—39 нм, а молекулярная масса вириона — 15 мегадальтон. Сегодня известно семи геногрупп норовирусов. Но большинство норовирусов, которые заражают людей, принадлежат к геногруппам GI и GII. Норовирусы из геногруппы II, генотип 4 (сокращенно GII.4) составляют подавляющее число вспышек гастроэнтерита по всему миру. Причем установлено, что люди с I группой крови заболевают чаще, в то время как с III и IV группой — менее восприимчивы к норовирусам.

Этот вирус очень жизнеустойчив и легко распространяется всеми возможными путями. Как показали наблюдения, влажная уборка с обычными моющими и спиртосодержащими средствами не убирает вирус из помещений. Он погибает только от хлорсодержащих дезинфицирующих средств. Вирус также устойчив к высыханию, замораживанию и нагреванию до 60 градусов. Поэтому для профилактики так важна правильная термическая обработка продуктов.

Подхвативший инфекцию человек выделяет норовирус в окружающую среду со своими естественными отправлениями и другими выделениями, например рвотой. Затем выделенный вирус через поверхности, с которыми контактировал носитель инфекции (дверные ручки, мышки компьютеров и др.) распространяется с молниеносной скоростью от человека к человеку. Причём, как показывает практика, часто заражение происходит аэрозольным путём из-за рвоты заражённого человека в помещении с другими людьми, когда в воздух выбрасывается множество вирусных частиц. Которых, кстати, нужно не так уж и много, чтобы отправить человека на больничный: всего от 5 до 18 вирионов. Описан случай, когда носительница норовируса, которую вырвало на пол в ресторане, моментально заразила несколько десятков других посетителей, которым не посчастливилось оказаться с ней в тот день в одном месте.

Инкубационный (непроявленный) период норовируса может длиться от нескольких часов до двух суток. В большой группе риска, кроме работников закрытых коллективов, находятся и любители морепродуктов: вирус часто обитает в устрицах и других продуктах моря. И их потребление без необходимой термической обработки имеет большие шансы привести к заражению. Как показали наблюдения, норовирусы активны в течение всего года, но подъем заболеваемости случается в осенне-зимний период. И если в тропических странах норовирусная инфекция регистрируется круглый год с увеличением дождливый сезон, то в РФ сезонный подъем заболеваемости — в январе—феврале.

Установлена ведущая роль норовирусов в возникновении вспышек острого гастроэнтерита и второе по значимости место, после ротавирусов, в инфекционной кишечной патологии. По имеющимся данным, которые могут быть занижены из-за трудности диагностики, во всём мире количество инфицированных норовирусом с каждым годом растёт. И если в 2013 году было заявлено о 267 млн. случаев заражения людей норовирусом, то в 2016 году таких случаев уже зарегистрировано у 685 млн. человек. Причём, по не установленным пока причинам распространённость норовирусов резко активизировалась с середины 1990-х годов прошлого века. Скажем, в Москве в 2016 г. показатель заболеваемости норовирусной инфекцией превысил уровень 2015 г. в два раза, за 1 кв. 2017 года заболело в 4,4 раза больше людей, чем в аналогичный период годом ранее. Норовирус особенно опасен для детей в возрасте до 5 лет: в 2016 году 50 000 детей умерло от этого вируса.

Достоверно определить, что человек заразился именно норовирусом, не так-то просто: для его точной диагностики нужно сделать полимеразную цепную реакцию. Как показала практика, обычные тесты с использованием антител обладают недостаточной точностью в диагностике норовируса. Считается, что из-за выраженной изменчивости норовируса стойкий иммунитет не формируется и человек не приобретает устойчивости к повторному заражению этим вирусом после выздоровления. Также пока не создано ни эффективных средств лечения, ни вакцин против него. И остается надеяться только на меры профилактики, которые включают в себя личную гигиену, обработку помещений хлорсодержащими средствами, правильное и безопасное приготовление пищи, дезинфекцию воды и избегание контактов с возможными носителями.

 Алексей Ржешевский

Сдать анализ РНК норовирусов (Norovirus) I и II типов в Москве платно, цена, сроки

Норовирусная инфекция (норовирусный гастроэнтерит) — это острая кишечная инфекция, вызываемая РНК-содержащим вирусом, который относится к семейству калицивирусов (Caliciviridae). В настоящее время выделяют 5 геногрупп норовируса, среди которых патогенными для человека являются только три: I, II, III группы. Норовирус II генотипа вызывает развитие острой кишечной инфекции в 90% случаев.

• Источником инфекции является больной человек;
• инкубационный период составляет 12–48 часов;
• продолжительность заболевания — 2–5 дней.

Инфицированный человек опасен для окружающих в период острой фазы гастроэнтерита и в следующие двое суток. Вирусные частицы могут выделяться не только во время болезни, но и в первые дни после выздоровления. Возможно скрытое носительство, длящееся несколько месяцев. Клинические проявления норовирусной инфекции — это тошнота, рвота, диарея, а также боли в области живота. Если болезнь не лечить, к симптомам может добавиться обезвоживание и нарушение электиролитного кислотно-щелочного баланса. ПЦР — современный и очень точный метод диагностики. Высокая чувствительность метода позволяет выявить заболевание на самой ранней стадии.

Подготовка к анализу крови на норовирус и к сдаче кала

За 3–4 дня до забора образца биоматериала необходимо:

• соблюдать диету: необходимо из рациона исключить копченую колбасу, орехи, грибы;
• прекратить прием ферментов, слабительных препаратов, ректальных суппозиториев;
• не проводить процедуру колоноскопии;
• избегать исследования слизистой кишечника и желудка.

Методика ПЦР на норовирус давно подтвердила свою эффективность. Она обеспечивает высокую точность результатов и оперативность их получения. Цена анализа на норовирус в сети наших центров доступна каждому, обращайтесь!

За 3–4 дня до проведения анализа придерживаться диеты, сбалансированной по содержанию белков, жиров и углеводов, желательно исключить из рациона орехи, грибы, копченую колбасу.

Рекомендуется отмена слабительных, препаратов висмута, железа, ректальных свеч на жировой основе, ферментов и других препаратов, влияющих на процессы переваривания и всасывания. После рентгенологического исследования желудка и кишечника проведение анализа кала показано не ранее чем через 2 суток. Стул должен быть получен без применения клизм и слабительных. Перед взятием биоматериала необходимо провести тщательный туалет наружных половых органов и области заднего прохода, промыв их под душем с мылом.

Допускается сбор биоматериала вечером, в этом случае полученный биоматериал хранить в холодильнике при температуре 2–8°С, не замораживая.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА ПО СБОРУ ОБРАЗЦОВ КАЛА

Биоматериал для исследования пациент отбирает самостоятельно, из средней части фекальной массы специальной ложечкой, вмонтированной в крышку универсального стерильного пластикового контейнера с ложкой (СКЛ). Количество биоматериала — 1 грамм (примерно с горошину). При заборе фикалий следует избегать попадания в образец мочи и отделяемого половых органов.

НОРОВИРУС (Norwalk virus) — диарейный синдром, выявление норовируса геногрупп I и II в кале, иммунохроматография (Norwalk virus GI , GII, One step rapid immunосhromotographic assay, antigen, stool)

Метод определения
Иммунохроматографический.

Исследуемый материал
Кал

Доступен выезд на дом

Выделяемые микроорганизмы и возбудители: даётся информация о наличии или отсутствии геногрупп I и II норовируса в кале.

Норовирусная инфекция — возбудитель относится к РНК-содержащим вирусам из семейства кальцивирусов, другое название возбудителя — вирус Норуолк или Норфолк, по месту первой крупной вспышки заболевания в штате Огайо (США). 

Норовирус является причиной серьезного инфекционного гастроэнтерита, который может развиваться у людей различного пола и возраста; Основные симптомы – рвота (чаще многократная), тошнота, диарея, умеренное повышение температуры, головная боль, боли в мышцах, слабость. Инкубационный период 12-48 часов, средняя длительность клинических проявлений 1-3 дня. Рвота и диарея приводят к быстрому обезвоживанию, что особенно опасно для детей дошкольного возраста. Пути передачи – контактно-бытовой, пищевой, водный. 

Вспышки заболевания часто возникают в учреждениях с большим скоплением людей: больницы, детские сады и школы, детские дома, круизные лайнеры, пансионаты, места заключения. Возбудитель может переноситься через овощные салаты, приготовленные с нарушением правил обработки овощей, нарезки готовой продукции (сыр, масло и др.), блюда, связанные с «ручным» приготовлением и не подвергающиеся повторной термической обработке (шаурма, суши), при пользовании общими столовыми приборами, недостаточно обработанными, а также фекально-оральным путем. 

Различают несколько геногрупп этого вируса, из которых представители 1, 2, 4 геногрупп могут быть причиной инфекции у человека. Из них более значимы геногруппы 1 и 2 с преобладанием при вспышках инфекции геногруппы 2 (генотипа GII.4). Показано, что восприимчивость человека к норовирусной инфекции имеет связь с антигенами групп крови (которые представлены в слюне, на слизистых оболочках кишечника и могут служить кофакторами или рецепторами инфекции). Так, лица с 3 группой крови более устойчивы к норовирусу геногруппы 1. 

Диагностика чаще основана на клинических проявлениях, но вирус может быть обнаружен методами ПЦР (см. тесты 33121 Острые кишечные инфекции, ПЦР-скрининг трёх вирусных возбудителей, кал; 33122 Острые кишечные инфекции, ПЦР-скрининг восьми бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций в кале), а также методами иммуноанализа, которые проявляют высокую специфичность, но менее чувствительны. Выделение вируса с калом максимально в течение первых 24-48 часов заболевания, в меньшей степени может продолжаться в течение недель, а у лиц с иммуносупрессией и более длительно. После перенесенной норовирусной инфекции иммунитет нестойкий, возможны повторные инфицирования.

ИДЦ — Иркутский диагностический центр

Острые кишечные инфекции в кале, скрининг-3 (ПЦР) (Rotavirus A, РНК; Norovirus 2 генотип, РНК; Astrovirus, РНК) (качественный)

Описание услуги

Код услуги:

2Ж3085

Готовность результатов:

через 8 рабочих дней

Назначается врачом любого профиля при подозрении на вирусные острые
кишечные инфекции.

Противопоказания

Противопоказания. После клизм, рентгенологического исследования желудка и
кишечника и колоноскопии, кал можно исследовать не ранее, чем через 2 дня.
ВНИМАНИЕ! Для детализации диагноза могут потребоваться дополнительные методы
исследований. Пожалуйста, обратитесь к лечащему врачу.

Для сдачи биоматериала обратиться в регистратуру клинико-диагностической лаборатории на 2 этаже. Правила сбора биоматериала (кал). Внимание! Для услуг 2Ж3083, 2Ж3084, 2Ж3085 (если Вы сдаете материал еще на другие услуги кроме этих) требуется отдельная емкость с биоматериалом. Биоматериал собирается утром, в день доставки в лабораторию. Объем необходимый для исследования 2-5 см3. Контейнер для сбора кала выдается в регистратуре 2 этажа по предъявлении маршрутного листа. Можно использовать одноразовую пластиковую емкость с плотно закрывающейся крышкой объемом 50-100 мл. При сдаче материала крышку с банки не снимать! Кал, доставленный в лабораторию в любых иных приспособленных емкостях исследованию не подлежит. Хранение. Если пациент не может собрать кал утром, можно сделать это раньше. При этом собранный образец нужно хранить в холодильнике в течение не более 8 часов при температуре +3+8С, не допуская замораживания. Противопоказания. После клизм, рентгенологического исследования желудка и кишечника и колоноскопии, кал можно исследовать не ранее, чем через 2 дня. Перед исследованием кала нужно отменить следующие препараты: слабительные, активированный уголь, препараты висмута, железа и препараты, вводимые в ректальных свечах, приготовленных на жировой основе. ВНИМАНИЕ! Для детализации диагноза могут потребоваться дополнительные методы исследований. Пожалуйста, обратитесь к лечащему врачу. 

Вирусные инфекции

В инфекционной патологии детского возраста все большую значимость приобретают вирусные диареи. Установлено, что вирусные кишечные инфекции являются одной из ведущих причин инфекционных гастроэнтеритов у детей первых трех лет жизни. Вирусные диареи наиболее тяжело протекают у ослабленных и часто болеющих детей. Пациентам первого года жизни свойственно быстрое развитие обезвоживания. Отсутствие специфической профилактики, легкость инфицирования создают предпосылки для роста заболеваемости.

Ротавирус, норовирус и астровирус являются РНК-содержащими и наиболее частыми возбудителями вирусных острых кишечных инфекций (ОВКИ). Основной причиной вирусных диарей являются ротавирусы. Ежегодно регистрируется значительное число эпизодов тяжелых форм ротавирусной инфекции, которые могут даже иметь фатальный исход. Распространенность других вирусных патогенов изучена мало, а клиническая картина сходна. Одним из сравнительно новых возбудителей ОВКИ вирусной этиологии являются норовирусы. Их распространенность при спорадической заболеваемости составляет 10–15 % от всех случаев ОКИ.

Ротавирусная инфекция имеет выраженную сезонность, подъем заболеваемости отмечается в зимний период и ранней весной. Несмотря на то, что она чаще регистрировалась в холодное время года, в спорадических случаях она выявлялась и летом. Подъем заболеваемости начинался в декабре и достигал максимального значения в марте. Ротавирусная инфекция характеризуется острым началом, лихорадкой, водянистой диареей, цикличностью течения. Катаральный синдром наблюдается у каждого второго ребенка. Пациентам в возрасте до 1 года свойственно развитие вододефицитного эксикоза. У детей первых 3 лет жизни ротавирусная инфекция  протекает в среднетяобезвоживанием, цикличностью течения.

Мониторинг норовирусной инфекции по сезонам года позволил выявить подъем заболеваемости данной инфекции с января по апрель. Спорадическая заболеваемость регистрируется в холодное время года. Норавирусная инфекция характеризуется острым началом, умеренной лихорадкой, водянистой диареей, цикличностью течения. Протекает чаще в среднетяжелой форме. Пациентам в возрасте до 1 года свойственно развитие обезвоживания.

Астровирусная инфекция регистрируется круглогодично, некоторое повышение числа случаев заболевания  отмечается в сентябре и октябре. Нередко астровирусная инфекция протекает бессимптомно. Выделение вируса с калом происходит в течение 3 недель с момента заражения, поэтому выявление возбудителя методом ПЦР рекомендуется проводить именно в это время. Астровирусная инфекция чаще поражает детей в возрасте от 1 года до 3 лет, посещающих детские дошкольные учреждения; в полной мере это относится и к другим организованным контингентам детей, редко в эпидемический процесс вовлекаются дети до 1 года. 

Для выявления и дифференциальной диагностики вирусных кишечных инфекций используются бактериологический и молекулярно-генетический методы исследования. ПЦР обладает преимуществом перед культуральными методами благодаря высокой специфичности и чувствительности исследования. Данный метод исследования входит в стандартные схемы диагностики вирусных кишечных инфекций и позволяет быстро и эффективно верифицировать диагноз. 

Показания к назначению: 

• 
  определение этиологического фактора острой кишечной инфекции;
• 
  дифференциальная диагностика причин острого гастроэнтерита;
• 
  дифференциальная диагностика причин острой диареи;
• 
  проведение обследование у контактных в очаге;
• 
  по эпидемиологическим показаниям.

Референсные значения: Отрицательный результат.

Взятие пробы необходимо проводить на ранних этапах, до приема противовирусных препаратов, пока патогенные микроорганизмы находятся в материале в больших количествах. Сбор кала проводится в соответствии с инструкцией по сбору.

Отрицательный результат — отсутствие инфекции.

Положительный результат — инфекция, вызванная вирусами Ротавирус группы А, Норовирус 2 генотипа, Астровирус, текущая (острая или недавно перенесенная).

ОКИ (острые кишечные инфекции) вирусной этиологии

Адреса клиник г. Казань

Адрес: ул. Гаврилова, 1, ост. «Гаврилова» (пр. Ямашева)

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобус: 10, 10а, 18, 33, 35, 35а, 36, 44, 45, 46, 49, 55, 60, 62, 76

Троллейбус: 2, 13

Трамвай: 5, 6

Адрес: ул. Т.Миннуллина, 8а, (Луковского) ост. «Театр кукол»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобус: 1, 2, 31, 37, 47, 74

Троллейбус: 6, 8, 12

Метро: Суконная слобода

Адрес: ул. Сыртлановой, 16, ст. метро Проспект Победы, ост. ул. Сыртлановой (проспект Победы)

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 5, 34, 37, 62 77

Трамвай: 5

Метро: Проспект Победы

Адрес: ул. Назарбаева, 10, ст. метро «Суконная Слобода», ост. «Метро Суконная Слобода»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 1, 4, 25, 43, 71

Метро: Суконная слобода

Адрес: ул. Декабристов, 180, ст. метро «Северный вокзал», ост. «Гагарина»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 6, 18, 29, 33, 37, 40, 43, 53, 62, 76, 78, 89

Троллейбус: 13

Трамвай: 1, 6

Метро: Северный вокзал

Адрес: пр. А.Камалеева, 28/9, (жилой комплекс «XXI век»), ост. «Новый ипподром»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Троллейбус: 3

Адрес: Дербышки, ул. Мира, 20, ост. «Магазин Комсомольский», «Гвоздика»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 1, 19, 25, 34, 44, 60, 84

Адрес: ул. Серова, 22/24, ост. «ул. Серова»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 10, 10а

Адрес: ул. Беломорская, 6, ст. метро «Авиастроительная», ост. «ул. Ленинградская»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 6, 18, 33, 37, 40, 42, 43, 53, 60, 78, 89, 93

Троллейбус: 13

Трамвай: 1

Метро: Авиастроительная

Адрес: ул. Закиева, 41а, ост. «Кабельное телевидение»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00 

Автобус: 5, 18, 30, 31, 34, 45, 46, 62, 63, 77, 89

Троллейбус: 3, 5, 9, 12

Адрес: ул. Кул Гали, 27, ост. «ул. Кул Гали» (ул. Габишева)

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: выходной

Автобус: 46, 90

Адрес: ул. Рихарда Зорге, 95, м. «Дубравная», ост. «ул. Юлиуса Фучика»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8.00-14.00

Автобусы: 5, 18, 30, 31, 33, 34, 45, 68, 74, 77

Троллейбусы: 5, 9, 12

Трамвай: 4

Метро: Дубравная

Адрес: ул. Фрунзе, 3а, ост. «Идель»

Пн-Пт: 7.00-20.00, Сб: 7.30-16.00, Вс: 8:00-14:00 

Автобусы: 10а, 36, 49, 53, 63, 72, 106

Троллейбус:1

Сдать анализ на сифилис — цены в Тамбове

Обновленная классификация геногрупп и генотипов норовирусов

Резюме

Норовирусы — это генетически разнообразные РНК-вирусы, ассоциированные с острым гастроэнтеритом у млекопитающих-хозяев. Филогенетически они могут быть разделены на разные геногруппы, а также на P (полимеразные) -группы и далее на генотипы и P-типы на основе аминокислотного разнообразия полного гена VP1 и нуклеотидного разнообразия области РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). ORF1 соответственно. В последние годы поступили сообщения о нескольких новых норовирусах, которые требуют обновления существующей схемы классификации.Используя ранее описанные критерии 2-кратного стандартного отклонения (sd) для группировки последовательностей в отдельные кластеры, мы увеличили количество геногрупп до 10 (GI-GX) и количество генотипов до 49 (9 GI, 27 GII, 3 GIII, 2 GIV , 2 GV, 2 GVI и по 1 генотипу для GVII, GVIII, GIX [ранее GII.15] и GX). Вирусы, для которых в настоящее время доступна только одна последовательность в общедоступных базах данных, были разделены на предварительные новые геногруппы (GNA1 и GNA2) и генотипы (GII.NA1, GII.NA2 и GIV.NA1) с их окончательным назначением, ожидающим дополнительных родственных последовательностей.Основываясь на нуклеотидном разнообразии в области RdRp, норовирусы можно разделить на 60 P-типов (14 GI, 37 GII, 2 GIII, 1 GIV, 2 GV, 2 GVI, 1 GVII и 1 GX), 2 предварительные P-группы и 14 ориентировочных P-типов. Будущие обновления классификации и номенклатуры будут основаны на полных последовательностях генома и будут координироваться и распространяться международной рабочей группой по классификации норовирусов.

Ключевые слова: Норовирус, острый гастроэнтерит, классификация, критерии 2xSD, геногруппа, генотип, P-группа, P-тип

Введение

Род Norovirus в семействе Caliciviridae состоит из генетически разнообразной группы вирусы, инфицирующие широкий спектр видов-хозяев млекопитающих, включая людей, собак, кошек, свиней, мышей, овец и крупный рогатый скот [1–8].Чтобы добавить разнообразия, недавно было идентифицировано несколько новых неклассифицированных норовирусов у летучих мышей, морских львов и морской свиньи [9–12], а также у нечеловеческих приматов (неопубликованные материалы GenBank). Норовирусы, обнаруженные у людей, отличаются генетически и антигенно и являются основной причиной острого гастроэнтерита у людей всех возрастов во всем мире, что, по оценкам, приводит к примерно 70 000–200 000 смертей ежегодно [13, 14].

Норовирусы — это вирусы без оболочки с геномом одноцепочечной РНК приблизительно 7.Длина 5 кб. На 5′-конце РНК ковалентно связана с вирусным белком (VPg), а 3′-конец генома полиаденилирован. Геном большинства норовирусов организован в три ORF, за исключением мышиных норовирусов, которые содержат четвертую ORF. ORF1 кодирует полипротеин, который генерирует шесть неструктурных белков (от NS1 / 2 до NS7) после посттрансляционного расщепления вирусной протеазой [2, 15]. ORF2 кодирует главный структурный белок (VP1), который имеет домены оболочки (S) и выступающие (P) домены. S-домен окружает вирусную РНК, а P-домен, состоящий из P2-домена, связан с S-доменом посредством гибкого шарнира [2, 14].Субдомен P2 очень вариабелен, содержит основные нейтрализующие эпитопы и взаимодействует с антигенами гистокрови (HBGA) [16]. ORF3 кодирует минорный структурный белок (VP2), который расположен внутри вирусной частицы и, как предполагалось, участвует в сборке капсида и инкапсидации генома [17] и, как недавно было описано для калицивируса кошек, проникновении вириона в клетку-хозяина. [18]. Полные аминокислотные последовательности VP1 и нуклеотидные последовательности области ORF1 NS7 (кодирующей РНК-зависимую РНК-полимеразу [RdRp]) составляют основу современной генетической классификации норовирусов [19].

Необходимость организации штаммов норовирусов в различные генетические группы или кластеры была признана в середине 1990-х годов, когда норовирусы были в первую очередь разделены на геногруппы и генотипы на основе частичных последовательностей RdRp [20–23]. Когда стало доступно больше последовательностей, классификация сместилась, чтобы обозначить геногруппы и генотипы на основе полной аминокислотной последовательности VP1 с 20% различием последовательностей, используемым в качестве порога отсечения для новых генотипов, который позже был скорректирован до 15% [24, 25].Из-за отсутствия международно признанных стандартов классификации норовирусов несколько исследовательских групп использовали небольшую нуклеотидную область на 5′-конце VP1 (названную областью C) для классификации генотипов, что, хотя и подходило для типирования норовирусов, привело к непоследовательной классификации некоторых штаммов. [25, 26].

Чтобы обеспечить эффективную передачу эпидемиологически важных клонов норовирусов, в 2013 г. исследователи из Рабочей группы по классификации норовирусов (NCWG) предложили универсальную стандартизированную систему номенклатуры и типирования для генотипирования норовирусов GI и GII с использованием филогенетической кластеризации полных аминокислотных последовательностей VP1 [ 19].Основываясь на анализе имеющихся на тот момент данных о последовательностях, норовирусы были классифицированы на шесть геногрупп (от GI до GVI) [19, 27] с предложенной седьмой геногруппой (GVII) [27]. В дальнейшем эти геногруппы были разделены на более чем 40 генотипов [28]. Вирусы GI, GII и GIV инфицируют людей, однако GII также включает три генотипа (GII.11, GII.18 и GII.19), обнаруженные в образцах фекалий свиней, а вирусы GIV включают генотип (GIV.2), который был только обнаружен. у хищников (кошек и собак) [2, 27, 29].Поскольку критерии номенклатуры не могли быть выполнены для различения вариантов GII.4, было решено, что подтипирование штаммов GII.4 на варианты будет основано на филогенетической кластеризации и что новые варианты GII.4 будут распознаваться только после того, как они станут эпидемическими в по крайней мере, два географически разных места [19]. За последние два десятилетия в обращении было восемь вариантов GII.4, каждый из которых заменял предыдущий доминирующий вариант, а с 2012 года GII.4 Sydney является наиболее современным вариантом GII.4 [19].

Кроме того, поскольку разнообразие норовирусов может быть дополнительно увеличено за счет рекомбинации, а циркулирующие рекомбинантные штаммы проявляются как отдельные эпидемиологические объекты, было предложено двойное типирование для включения разнообразия на уровне частичных последовательностей RdRp в обозначениях штаммов [19]. Хотя несколько контрольных точек рекомбинации было идентифицировано в геноме норовируса, они наиболее часто обнаруживаются в области соединения ORF1-ORF2 [29–36]. Двойное типирование (ORF1-RdRp = тип P, ORF2 = генотип) в настоящее время регулярно используется во многих лабораториях по всему миру, и было проведено по меньшей мере 14 GI P-типов и 27 GII P-типов, а также 9 генотипов GI капсида и 22 генотипа GII капсида. описано [2, 19, 27].Включение диагностического тестирования норовирусов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени в клиническую практику и общественное здравоохранение в последние годы [27, 37–39] подтвердило важность норовирусов GI и GII во всем мире [13, 31, 33, 35, 37, 40–44]. Все более широкое использование секвенирования генома патогенов для выяснения способов передачи, источников вспышек или изучения бремени инфекций привело к идентификации нескольких новых геногрупп и генотипов норовирусов-кандидатов с момента последнего обновления классификации норовирусов в 2013 г. [9, 12, 33 , 40, 41, 43, 45–49].В этой статье мы обновляем схему классификации норовирусов, предлагая новые геногруппы и генотипы на основе полных аминокислотных последовательностей капсида с использованием ранее согласованных критериев [19]. Чтобы обеспечить единообразную основу для классификации норовирусов перед лицом рекомбинации и потенциальных «сиротских» последовательностей, а также для устранения системы именования орфанных ORF1 (например, GI.Pa, GI.Pb, GII.Pa, GII.Pe и т. Д.), Мы сгруппировали нуклеотидные последовательности из частичной области RdRp в полимеразные (P) -группы и P-типы независимо от классификации их соответствующих геногрупп и генотипов капсида, соответственно.

Обсуждение

Мы обновили количество и классификацию геногрупп и генотипов норовирусов, статистически подтвержденных критериями 2 × sd (). До недавнего времени норовирусы были официально разделены на шесть геногрупп (GI – GVI) [2]. Наш обновленный анализ показывает, что на основе разнообразия аминокислотной последовательности VP1 количество геногрупп в роду Norovirus может быть увеличено до десяти (GI – GX), а также до двух предварительных геногрупп, которые необходимо будет подтвердить при дополнительных становится доступной полная или частичная последовательность VP1 или RdRp.Вирусы в этих десяти геногруппах можно далее разделить на 49 подтвержденных генотипов капсидов на основе аминокислот полного VP1 и 60 подтвержденных P-типов на основе частичных нуклеотидных последовательностей областей RdRp.

Обновленная схема классификации норовирусов с количеством геногрупп и генотипов на основе полных аминокислот VP1 и количеством P-групп и P-типов на основе частичного участка (762 нуклеотида) РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) на 5′-конец ORF1. P = P-группа, T = предварительный генотип / P-тип (когда доступна только одна последовательность или несколько неидентичных последовательностей из одного географического местоположения, они не присвоены (NA).

За последнее десятилетие было обнаружено несколько новых последовательностей норовирусов от новых хозяев. К ним относятся последовательности собачьих норовирусов, которые были идентифицированы в образцах фекальных мазков собак в Гонконге, Китай, в 2007 году [27, 49], а также в образцах сточных вод из Уругвая в 2012 году [47]. Наш анализ подтвердил отнесение этих вирусов к новой геногруппе GVII. Во время рутинного наблюдения за образцами стула у детей с острым гастроэнтеритом в Чибе, Япония, в 2004 г. был обнаружен предварительный новый генотип GII [50], а генетически подобный штамм из Юдзавы, Япония, в 2011 г. был представлен в GenBank.Мы подтвердили, что последовательности VP1 этих штаммов представляют новую геногруппу GVIII.

Среди вирусов GII вирусы GII.15 филогенетически всегда выделялись. С пятью последовательностями VP1, включая один полный геном, доступным в GenBank, мы подтвердили, что на основе критерия 2 × sd вирусы GII.15 должны быть переклассифицированы в отдельную геногруппу, обозначенную как GIX. Многолетний виромный анализ образцов мазков из глотки и анального канала из большой коллекции основных видов летучих мышей в Китае показал несколько новых последовательностей норовирусов, которые можно классифицировать в отдельную геногруппу (GX) [12].Предполагаемые новые геногруппы были также обнаружены у морских свиней [9] (GNA1) и морских львов (GNA2). Применение критерия 2 × sd к классификации филогенетических кластеров GIV и GVI предполагает, что каждый из трех генотипов GIV и двух генотипов GVI может представлять отдельные геногруппы, однако мы решили не переклассифицировать их, а подождать, пока не появятся дополнительные последовательности GIV и GVI. становятся доступными.

В последние годы было зарегистрировано несколько новых генотипов GII и GIV из разных географических регионов по всему миру [41, 43, 45, 46, 48].С добавлением пяти новых генотипов GII.23, GII.24, GII.25, GII.26 и GII.27 теперь мы распознаем 26 генотипов GII (GII.1 – GII.27) (исключая GII.15, который сейчас представляет новую геногруппу) вместе с двумя предполагаемыми новыми генотипами GII (GII.NA1 и GII.NA2). Новые генотипы GII были идентифицированы в образцах, собранных у людей в Перу, Гватемале, Эквадоре, Бангладеш, Германии, Аргентине и США [43, 45, 48]. Предварительный новый генотип GIV был недавно идентифицирован в сточных водах (Бразилия, Япония) и в образцах стула от вспышки острого гастроэнтерита в ресторане в США ([41, 46] J Vinjé, личное сообщение).Однако, поскольку в настоящее время доступна только одна полная последовательность генома GIV, ожидается отнесение дополнительных последовательностей к новому генотипу, и поэтому этот генотип временно обозначен как неназначенный (NA) (GIV.NA1 [PNA1]).

До сих пор классификация норовирусов на P-типы основывалась на системе именования, в которой использовалось обозначение P-типа, связанное с соответствующим генотипом VP1 штамма, и когда последовательность VP1 не была известна, орфанные P-типы и / или P-типы с были присвоены буквы алфавита [19].Поскольку в последние годы распознается все большее количество рекомбинантных штаммов [33, 37, 40, 51], мы предлагаем обновление системы классификации норовирусов, в которой генотипы P-типов и VP1 назначаются независимо. Мы также предлагаем обозначить двойные типы с генотипом капсида, указанным первым, за которым следует P-тип (например, GI.6 [P10], GII.4 Sydney [P16], GIX.1 [GII.P15], GIV.2 [GVI.P1] ]).

Пять P-типов, некоторые из которых включают штаммы 1970–1980-х годов, были сгруппированы в 12 P-типов, чтобы соответствовать критериям 2 × sd.Следует отметить, что P-типы (GII.P6 и GII.P7) имеют перекрывающиеся стандартные отклонения, а несколько типов GII.P4 также не удовлетворяли критерию 2 × sd из-за перекрытия стандартных отклонений с GII.P12, GII.P31 (бывший GII .Pe) и GII.P35 (бывший GII.Pj) (рис. S4 и S5). Поскольку все три P-типа являются историческими типами, особенно штаммы GII.P4, которые имеют эпидемиологическое значение во всем мире, а текущая классификация P-типирования основана на относительно коротких фрагментах нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида), мы решили, что мы повторно посетим эта проблема в нашем следующем обновлении классификации, которое, как ожидается, будет основано на полных последовательностях ORF1.

Последовательности RdRp вирусов GIV, GVI, GVIII, GIX разделяются независимо от соответствующих им геногрупп капсида. Например, последовательности RdRp вирусов GVIII, GIX объединяются с вирусами GII и были обозначены как GII.P28 и GII.P15 соответственно. Точно так же последовательности RdRp вирусов GIV и GVI сгруппированы в две отдельные группы с последовательностями вирусов GIV, которые инфицируют людей, сгруппированными вместе с другими штаммами GIV, тогда как последовательности вирусов GIV и GVI, которые инфицируют кошек, львов и собак, сгруппированы вместе как штаммы GVI.Таким образом, межгеногрупповая рекомбинация, которая считается редким явлением среди норовирусов [52, 53], могла произойти среди вирусов, инфицирующих людей (GVIII.1 [GII.P28]; GIX.1 [GII.P15]), и среди вирусов. заражение собак (GIV.2 [GVI.P1]). Кроме того, несколько недавно описанных последовательностей RdRp без ассоциированной последовательности VP1 были включены в нашу обновленную схему классификации [33, 40].

Одним из основных ограничений настоящей классификации является то, что текущее P-типирование основано на относительно коротком фрагменте нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида) на 3′-конце ORF1.Обнадеживает то, что филогенетическая кластеризация этих более коротких последовательностей RdRp была идентична сегрегации P-типов на основе полных последовательностей RdRp (~ 1500 нуклеотидов), которые были доступны для 85% последовательностей, используемых в нашем исследовании. Дополнительные полные последовательности RdRp или идеально полные последовательности генома для всех эталонных штаммов помогут повысить надежность существующей системы классификации, для которой недавно были описаны несколько протоколов [54–56].

С согласия NCWG мы предлагаем основывать будущие обновления номенклатуры и классификации на полных последовательностях ORF1 и VP1 новых генетических линий вирусов рода Norovirus .Обновленная номенклатура, включая новые геногруппы, генотипы и новые имена P-типа, доступна через общедоступные инструменты ввода https://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool и https: //norovirus.ng.philab.cdc. gov, оба из которых используют один и тот же набор эталонных последовательностей норовирусов, доступных в GenBank. Для высококачественных последовательностей, которые нельзя типизировать с помощью этих инструментов, исследователи имеют возможность связаться с членами NCWG для дополнительного анализа. Администраторы баз данных обоих инструментов набора текста будут координировать свои действия друг с другом для периодического мониторинга общедоступных баз данных на предмет новых генотипов и соответствующего обновления эталонных последовательностей.

Обновленная классификация геногрупп и генотипов норовирусов

Резюме

Норовирусы — это генетически разнообразные РНК-вирусы, ассоциированные с острым гастроэнтеритом у млекопитающих-хозяев. Филогенетически они могут быть разделены на разные геногруппы, а также на P (полимеразные) -группы и далее на генотипы и P-типы на основе аминокислотного разнообразия полного гена VP1 и нуклеотидного разнообразия области РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). ORF1 соответственно.В последние годы поступили сообщения о нескольких новых норовирусах, которые требуют обновления существующей схемы классификации. Используя ранее описанные критерии 2-кратного стандартного отклонения (sd) для группировки последовательностей в отдельные кластеры, мы увеличили количество геногрупп до 10 (GI-GX) и количество генотипов до 49 (9 GI, 27 GII, 3 GIII, 2 GIV , 2 GV, 2 GVI и по 1 генотипу для GVII, GVIII, GIX [ранее GII.15] и GX). Вирусы, для которых в настоящее время доступна только одна последовательность в общедоступных базах данных, были разделены на предварительные новые геногруппы (GNA1 и GNA2) и генотипы (GII.NA1, GII.NA2 и GIV.NA1) с их окончательным назначением в ожидании дополнительных родственных последовательностей. Основываясь на нуклеотидном разнообразии в области RdRp, норовирусы можно разделить на 60 P-типов (14 GI, 37 GII, 2 GIII, 1 GIV, 2 GV, 2 GVI, 1 GVII и 1 GX), 2 предварительные P-группы и 14 ориентировочных P-типов. Будущие обновления классификации и номенклатуры будут основаны на полных последовательностях генома и будут координироваться и распространяться международной рабочей группой по классификации норовирусов.

Ключевые слова: Норовирус, острый гастроэнтерит, классификация, критерии 2xSD, геногруппа, генотип, P-группа, P-тип

Введение

Род Norovirus в семействе Caliciviridae состоит из генетически разнообразной группы вирусы, инфицирующие широкий спектр видов-хозяев млекопитающих, включая людей, собак, кошек, свиней, мышей, овец и крупный рогатый скот [1–8].Чтобы добавить разнообразия, недавно было идентифицировано несколько новых неклассифицированных норовирусов у летучих мышей, морских львов и морской свиньи [9–12], а также у нечеловеческих приматов (неопубликованные материалы GenBank). Норовирусы, обнаруженные у людей, отличаются генетически и антигенно и являются основной причиной острого гастроэнтерита у людей всех возрастов во всем мире, что, по оценкам, приводит к примерно 70 000–200 000 смертей ежегодно [13, 14].

Норовирусы — это вирусы без оболочки с геномом одноцепочечной РНК приблизительно 7.Длина 5 кб. На 5′-конце РНК ковалентно связана с вирусным белком (VPg), а 3′-конец генома полиаденилирован. Геном большинства норовирусов организован в три ORF, за исключением мышиных норовирусов, которые содержат четвертую ORF. ORF1 кодирует полипротеин, который генерирует шесть неструктурных белков (от NS1 / 2 до NS7) после посттрансляционного расщепления вирусной протеазой [2, 15]. ORF2 кодирует главный структурный белок (VP1), который имеет домены оболочки (S) и выступающие (P) домены. S-домен окружает вирусную РНК, а P-домен, состоящий из P2-домена, связан с S-доменом посредством гибкого шарнира [2, 14].Субдомен P2 очень вариабелен, содержит основные нейтрализующие эпитопы и взаимодействует с антигенами гистокрови (HBGA) [16]. ORF3 кодирует минорный структурный белок (VP2), который расположен внутри вирусной частицы и, как предполагалось, участвует в сборке капсида и инкапсидации генома [17] и, как недавно было описано для калицивируса кошек, проникновении вириона в клетку-хозяина. [18]. Полные аминокислотные последовательности VP1 и нуклеотидные последовательности области ORF1 NS7 (кодирующей РНК-зависимую РНК-полимеразу [RdRp]) составляют основу современной генетической классификации норовирусов [19].

Необходимость организации штаммов норовирусов в различные генетические группы или кластеры была признана в середине 1990-х годов, когда норовирусы были в первую очередь разделены на геногруппы и генотипы на основе частичных последовательностей RdRp [20–23]. Когда стало доступно больше последовательностей, классификация сместилась, чтобы обозначить геногруппы и генотипы на основе полной аминокислотной последовательности VP1 с 20% различием последовательностей, используемым в качестве порога отсечения для новых генотипов, который позже был скорректирован до 15% [24, 25].Из-за отсутствия международно признанных стандартов классификации норовирусов несколько исследовательских групп использовали небольшую нуклеотидную область на 5′-конце VP1 (названную областью C) для классификации генотипов, что, хотя и подходило для типирования норовирусов, привело к непоследовательной классификации некоторых штаммов. [25, 26].

Чтобы обеспечить эффективную передачу эпидемиологически важных клонов норовирусов, в 2013 г. исследователи из Рабочей группы по классификации норовирусов (NCWG) предложили универсальную стандартизированную систему номенклатуры и типирования для генотипирования норовирусов GI и GII с использованием филогенетической кластеризации полных аминокислотных последовательностей VP1 [ 19].Основываясь на анализе имеющихся на тот момент данных о последовательностях, норовирусы были классифицированы на шесть геногрупп (от GI до GVI) [19, 27] с предложенной седьмой геногруппой (GVII) [27]. В дальнейшем эти геногруппы были разделены на более чем 40 генотипов [28]. Вирусы GI, GII и GIV инфицируют людей, однако GII также включает три генотипа (GII.11, GII.18 и GII.19), обнаруженные в образцах фекалий свиней, а вирусы GIV включают генотип (GIV.2), который был только обнаружен. у хищников (кошек и собак) [2, 27, 29].Поскольку критерии номенклатуры не могли быть выполнены для различения вариантов GII.4, было решено, что подтипирование штаммов GII.4 на варианты будет основано на филогенетической кластеризации и что новые варианты GII.4 будут распознаваться только после того, как они станут эпидемическими в по крайней мере, два географически разных места [19]. За последние два десятилетия в обращении было восемь вариантов GII.4, каждый из которых заменял предыдущий доминирующий вариант, а с 2012 года GII.4 Sydney является наиболее современным вариантом GII.4 [19].

Кроме того, поскольку разнообразие норовирусов может быть дополнительно увеличено за счет рекомбинации, а циркулирующие рекомбинантные штаммы проявляются как отдельные эпидемиологические объекты, было предложено двойное типирование для включения разнообразия на уровне частичных последовательностей RdRp в обозначениях штаммов [19]. Хотя несколько контрольных точек рекомбинации было идентифицировано в геноме норовируса, они наиболее часто обнаруживаются в области соединения ORF1-ORF2 [29–36]. Двойное типирование (ORF1-RdRp = тип P, ORF2 = генотип) в настоящее время регулярно используется во многих лабораториях по всему миру, и было проведено по меньшей мере 14 GI P-типов и 27 GII P-типов, а также 9 генотипов GI капсида и 22 генотипа GII капсида. описано [2, 19, 27].Включение диагностического тестирования норовирусов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени в клиническую практику и общественное здравоохранение в последние годы [27, 37–39] подтвердило важность норовирусов GI и GII во всем мире [13, 31, 33, 35, 37, 40–44]. Все более широкое использование секвенирования генома патогенов для выяснения способов передачи, источников вспышек или изучения бремени инфекций привело к идентификации нескольких новых геногрупп и генотипов норовирусов-кандидатов с момента последнего обновления классификации норовирусов в 2013 г. [9, 12, 33 , 40, 41, 43, 45–49].В этой статье мы обновляем схему классификации норовирусов, предлагая новые геногруппы и генотипы на основе полных аминокислотных последовательностей капсида с использованием ранее согласованных критериев [19]. Чтобы обеспечить единообразную основу для классификации норовирусов перед лицом рекомбинации и потенциальных «сиротских» последовательностей, а также для устранения системы именования орфанных ORF1 (например, GI.Pa, GI.Pb, GII.Pa, GII.Pe и т. Д.), Мы сгруппировали нуклеотидные последовательности из частичной области RdRp в полимеразные (P) -группы и P-типы независимо от классификации их соответствующих геногрупп и генотипов капсида, соответственно.

Обсуждение

Мы обновили количество и классификацию геногрупп и генотипов норовирусов, статистически подтвержденных критериями 2 × sd (). До недавнего времени норовирусы были официально разделены на шесть геногрупп (GI – GVI) [2]. Наш обновленный анализ показывает, что на основе разнообразия аминокислотной последовательности VP1 количество геногрупп в роду Norovirus может быть увеличено до десяти (GI – GX), а также до двух предварительных геногрупп, которые необходимо будет подтвердить при дополнительных становится доступной полная или частичная последовательность VP1 или RdRp.Вирусы в этих десяти геногруппах можно далее разделить на 49 подтвержденных генотипов капсидов на основе аминокислот полного VP1 и 60 подтвержденных P-типов на основе частичных нуклеотидных последовательностей областей RdRp.

Обновленная схема классификации норовирусов с количеством геногрупп и генотипов на основе полных аминокислот VP1 и количеством P-групп и P-типов на основе частичного участка (762 нуклеотида) РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) на 5′-конец ORF1. P = P-группа, T = предварительный генотип / P-тип (когда доступна только одна последовательность или несколько неидентичных последовательностей из одного географического местоположения, они не присвоены (NA).

За последнее десятилетие было обнаружено несколько новых последовательностей норовирусов от новых хозяев. К ним относятся последовательности собачьих норовирусов, которые были идентифицированы в образцах фекальных мазков собак в Гонконге, Китай, в 2007 году [27, 49], а также в образцах сточных вод из Уругвая в 2012 году [47]. Наш анализ подтвердил отнесение этих вирусов к новой геногруппе GVII. Во время рутинного наблюдения за образцами стула у детей с острым гастроэнтеритом в Чибе, Япония, в 2004 г. был обнаружен предварительный новый генотип GII [50], а генетически подобный штамм из Юдзавы, Япония, в 2011 г. был представлен в GenBank.Мы подтвердили, что последовательности VP1 этих штаммов представляют новую геногруппу GVIII.

Среди вирусов GII вирусы GII.15 филогенетически всегда выделялись. С пятью последовательностями VP1, включая один полный геном, доступным в GenBank, мы подтвердили, что на основе критерия 2 × sd вирусы GII.15 должны быть переклассифицированы в отдельную геногруппу, обозначенную как GIX. Многолетний виромный анализ образцов мазков из глотки и анального канала из большой коллекции основных видов летучих мышей в Китае показал несколько новых последовательностей норовирусов, которые можно классифицировать в отдельную геногруппу (GX) [12].Предполагаемые новые геногруппы были также обнаружены у морских свиней [9] (GNA1) и морских львов (GNA2). Применение критерия 2 × sd к классификации филогенетических кластеров GIV и GVI предполагает, что каждый из трех генотипов GIV и двух генотипов GVI может представлять отдельные геногруппы, однако мы решили не переклассифицировать их, а подождать, пока не появятся дополнительные последовательности GIV и GVI. становятся доступными.

В последние годы было зарегистрировано несколько новых генотипов GII и GIV из разных географических регионов по всему миру [41, 43, 45, 46, 48].С добавлением пяти новых генотипов GII.23, GII.24, GII.25, GII.26 и GII.27 теперь мы распознаем 26 генотипов GII (GII.1 – GII.27) (исключая GII.15, который сейчас представляет новую геногруппу) вместе с двумя предполагаемыми новыми генотипами GII (GII.NA1 и GII.NA2). Новые генотипы GII были идентифицированы в образцах, собранных у людей в Перу, Гватемале, Эквадоре, Бангладеш, Германии, Аргентине и США [43, 45, 48]. Предварительный новый генотип GIV был недавно идентифицирован в сточных водах (Бразилия, Япония) и в образцах стула от вспышки острого гастроэнтерита в ресторане в США ([41, 46] J Vinjé, личное сообщение).Однако, поскольку в настоящее время доступна только одна полная последовательность генома GIV, ожидается отнесение дополнительных последовательностей к новому генотипу, и поэтому этот генотип временно обозначен как неназначенный (NA) (GIV.NA1 [PNA1]).

До сих пор классификация норовирусов на P-типы основывалась на системе именования, в которой использовалось обозначение P-типа, связанное с соответствующим генотипом VP1 штамма, и когда последовательность VP1 не была известна, орфанные P-типы и / или P-типы с были присвоены буквы алфавита [19].Поскольку в последние годы распознается все большее количество рекомбинантных штаммов [33, 37, 40, 51], мы предлагаем обновление системы классификации норовирусов, в которой генотипы P-типов и VP1 назначаются независимо. Мы также предлагаем обозначить двойные типы с генотипом капсида, указанным первым, за которым следует P-тип (например, GI.6 [P10], GII.4 Sydney [P16], GIX.1 [GII.P15], GIV.2 [GVI.P1] ]).

Пять P-типов, некоторые из которых включают штаммы 1970–1980-х годов, были сгруппированы в 12 P-типов, чтобы соответствовать критериям 2 × sd.Следует отметить, что P-типы (GII.P6 и GII.P7) имеют перекрывающиеся стандартные отклонения, а несколько типов GII.P4 также не удовлетворяли критерию 2 × sd из-за перекрытия стандартных отклонений с GII.P12, GII.P31 (бывший GII .Pe) и GII.P35 (бывший GII.Pj) (рис. S4 и S5). Поскольку все три P-типа являются историческими типами, особенно штаммы GII.P4, которые имеют эпидемиологическое значение во всем мире, а текущая классификация P-типирования основана на относительно коротких фрагментах нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида), мы решили, что мы повторно посетим эта проблема в нашем следующем обновлении классификации, которое, как ожидается, будет основано на полных последовательностях ORF1.

Последовательности RdRp вирусов GIV, GVI, GVIII, GIX разделяются независимо от соответствующих им геногрупп капсида. Например, последовательности RdRp вирусов GVIII, GIX объединяются с вирусами GII и были обозначены как GII.P28 и GII.P15 соответственно. Точно так же последовательности RdRp вирусов GIV и GVI сгруппированы в две отдельные группы с последовательностями вирусов GIV, которые инфицируют людей, сгруппированными вместе с другими штаммами GIV, тогда как последовательности вирусов GIV и GVI, которые инфицируют кошек, львов и собак, сгруппированы вместе как штаммы GVI.Таким образом, межгеногрупповая рекомбинация, которая считается редким явлением среди норовирусов [52, 53], могла произойти среди вирусов, инфицирующих людей (GVIII.1 [GII.P28]; GIX.1 [GII.P15]), и среди вирусов. заражение собак (GIV.2 [GVI.P1]). Кроме того, несколько недавно описанных последовательностей RdRp без ассоциированной последовательности VP1 были включены в нашу обновленную схему классификации [33, 40].

Одним из основных ограничений настоящей классификации является то, что текущее P-типирование основано на относительно коротком фрагменте нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида) на 3′-конце ORF1.Обнадеживает то, что филогенетическая кластеризация этих более коротких последовательностей RdRp была идентична сегрегации P-типов на основе полных последовательностей RdRp (~ 1500 нуклеотидов), которые были доступны для 85% последовательностей, используемых в нашем исследовании. Дополнительные полные последовательности RdRp или идеально полные последовательности генома для всех эталонных штаммов помогут повысить надежность существующей системы классификации, для которой недавно были описаны несколько протоколов [54–56].

С согласия NCWG мы предлагаем основывать будущие обновления номенклатуры и классификации на полных последовательностях ORF1 и VP1 новых генетических линий вирусов рода Norovirus .Обновленная номенклатура, включая новые геногруппы, генотипы и новые имена P-типа, доступна через общедоступные инструменты ввода https://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool и https: //norovirus.ng.philab.cdc. gov, оба из которых используют один и тот же набор эталонных последовательностей норовирусов, доступных в GenBank. Для высококачественных последовательностей, которые нельзя типизировать с помощью этих инструментов, исследователи имеют возможность связаться с членами NCWG для дополнительного анализа. Администраторы баз данных обоих инструментов набора текста будут координировать свои действия друг с другом для периодического мониторинга общедоступных баз данных на предмет новых генотипов и соответствующего обновления эталонных последовательностей.

Обновленная классификация геногрупп и генотипов норовирусов

Резюме

Норовирусы — это генетически разнообразные РНК-вирусы, ассоциированные с острым гастроэнтеритом у млекопитающих-хозяев. Филогенетически они могут быть разделены на разные геногруппы, а также на P (полимеразные) -группы и далее на генотипы и P-типы на основе аминокислотного разнообразия полного гена VP1 и нуклеотидного разнообразия области РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). ORF1 соответственно.В последние годы поступили сообщения о нескольких новых норовирусах, которые требуют обновления существующей схемы классификации. Используя ранее описанные критерии 2-кратного стандартного отклонения (sd) для группировки последовательностей в отдельные кластеры, мы увеличили количество геногрупп до 10 (GI-GX) и количество генотипов до 49 (9 GI, 27 GII, 3 GIII, 2 GIV , 2 GV, 2 GVI и по 1 генотипу для GVII, GVIII, GIX [ранее GII.15] и GX). Вирусы, для которых в настоящее время доступна только одна последовательность в общедоступных базах данных, были разделены на предварительные новые геногруппы (GNA1 и GNA2) и генотипы (GII.NA1, GII.NA2 и GIV.NA1) с их окончательным назначением в ожидании дополнительных родственных последовательностей. Основываясь на нуклеотидном разнообразии в области RdRp, норовирусы можно разделить на 60 P-типов (14 GI, 37 GII, 2 GIII, 1 GIV, 2 GV, 2 GVI, 1 GVII и 1 GX), 2 предварительные P-группы и 14 ориентировочных P-типов. Будущие обновления классификации и номенклатуры будут основаны на полных последовательностях генома и будут координироваться и распространяться международной рабочей группой по классификации норовирусов.

Ключевые слова: Норовирус, острый гастроэнтерит, классификация, критерии 2xSD, геногруппа, генотип, P-группа, P-тип

Введение

Род Norovirus в семействе Caliciviridae состоит из генетически разнообразной группы вирусы, инфицирующие широкий спектр видов-хозяев млекопитающих, включая людей, собак, кошек, свиней, мышей, овец и крупный рогатый скот [1–8].Чтобы добавить разнообразия, недавно было идентифицировано несколько новых неклассифицированных норовирусов у летучих мышей, морских львов и морской свиньи [9–12], а также у нечеловеческих приматов (неопубликованные материалы GenBank). Норовирусы, обнаруженные у людей, отличаются генетически и антигенно и являются основной причиной острого гастроэнтерита у людей всех возрастов во всем мире, что, по оценкам, приводит к примерно 70 000–200 000 смертей ежегодно [13, 14].

Норовирусы — это вирусы без оболочки с геномом одноцепочечной РНК приблизительно 7.Длина 5 кб. На 5′-конце РНК ковалентно связана с вирусным белком (VPg), а 3′-конец генома полиаденилирован. Геном большинства норовирусов организован в три ORF, за исключением мышиных норовирусов, которые содержат четвертую ORF. ORF1 кодирует полипротеин, который генерирует шесть неструктурных белков (от NS1 / 2 до NS7) после посттрансляционного расщепления вирусной протеазой [2, 15]. ORF2 кодирует главный структурный белок (VP1), который имеет домены оболочки (S) и выступающие (P) домены. S-домен окружает вирусную РНК, а P-домен, состоящий из P2-домена, связан с S-доменом посредством гибкого шарнира [2, 14].Субдомен P2 очень вариабелен, содержит основные нейтрализующие эпитопы и взаимодействует с антигенами гистокрови (HBGA) [16]. ORF3 кодирует минорный структурный белок (VP2), который расположен внутри вирусной частицы и, как предполагалось, участвует в сборке капсида и инкапсидации генома [17] и, как недавно было описано для калицивируса кошек, проникновении вириона в клетку-хозяина. [18]. Полные аминокислотные последовательности VP1 и нуклеотидные последовательности области ORF1 NS7 (кодирующей РНК-зависимую РНК-полимеразу [RdRp]) составляют основу современной генетической классификации норовирусов [19].

Необходимость организации штаммов норовирусов в различные генетические группы или кластеры была признана в середине 1990-х годов, когда норовирусы были в первую очередь разделены на геногруппы и генотипы на основе частичных последовательностей RdRp [20–23]. Когда стало доступно больше последовательностей, классификация сместилась, чтобы обозначить геногруппы и генотипы на основе полной аминокислотной последовательности VP1 с 20% различием последовательностей, используемым в качестве порога отсечения для новых генотипов, который позже был скорректирован до 15% [24, 25].Из-за отсутствия международно признанных стандартов классификации норовирусов несколько исследовательских групп использовали небольшую нуклеотидную область на 5′-конце VP1 (названную областью C) для классификации генотипов, что, хотя и подходило для типирования норовирусов, привело к непоследовательной классификации некоторых штаммов. [25, 26].

Чтобы обеспечить эффективную передачу эпидемиологически важных клонов норовирусов, в 2013 г. исследователи из Рабочей группы по классификации норовирусов (NCWG) предложили универсальную стандартизированную систему номенклатуры и типирования для генотипирования норовирусов GI и GII с использованием филогенетической кластеризации полных аминокислотных последовательностей VP1 [ 19].Основываясь на анализе имеющихся на тот момент данных о последовательностях, норовирусы были классифицированы на шесть геногрупп (от GI до GVI) [19, 27] с предложенной седьмой геногруппой (GVII) [27]. В дальнейшем эти геногруппы были разделены на более чем 40 генотипов [28]. Вирусы GI, GII и GIV инфицируют людей, однако GII также включает три генотипа (GII.11, GII.18 и GII.19), обнаруженные в образцах фекалий свиней, а вирусы GIV включают генотип (GIV.2), который был только обнаружен. у хищников (кошек и собак) [2, 27, 29].Поскольку критерии номенклатуры не могли быть выполнены для различения вариантов GII.4, было решено, что подтипирование штаммов GII.4 на варианты будет основано на филогенетической кластеризации и что новые варианты GII.4 будут распознаваться только после того, как они станут эпидемическими в по крайней мере, два географически разных места [19]. За последние два десятилетия в обращении было восемь вариантов GII.4, каждый из которых заменял предыдущий доминирующий вариант, а с 2012 года GII.4 Sydney является наиболее современным вариантом GII.4 [19].

Кроме того, поскольку разнообразие норовирусов может быть дополнительно увеличено за счет рекомбинации, а циркулирующие рекомбинантные штаммы проявляются как отдельные эпидемиологические объекты, было предложено двойное типирование для включения разнообразия на уровне частичных последовательностей RdRp в обозначениях штаммов [19]. Хотя несколько контрольных точек рекомбинации было идентифицировано в геноме норовируса, они наиболее часто обнаруживаются в области соединения ORF1-ORF2 [29–36]. Двойное типирование (ORF1-RdRp = тип P, ORF2 = генотип) в настоящее время регулярно используется во многих лабораториях по всему миру, и было проведено по меньшей мере 14 GI P-типов и 27 GII P-типов, а также 9 генотипов GI капсида и 22 генотипа GII капсида. описано [2, 19, 27].Включение диагностического тестирования норовирусов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени в клиническую практику и общественное здравоохранение в последние годы [27, 37–39] подтвердило важность норовирусов GI и GII во всем мире [13, 31, 33, 35, 37, 40–44]. Все более широкое использование секвенирования генома патогенов для выяснения способов передачи, источников вспышек или изучения бремени инфекций привело к идентификации нескольких новых геногрупп и генотипов норовирусов-кандидатов с момента последнего обновления классификации норовирусов в 2013 г. [9, 12, 33 , 40, 41, 43, 45–49].В этой статье мы обновляем схему классификации норовирусов, предлагая новые геногруппы и генотипы на основе полных аминокислотных последовательностей капсида с использованием ранее согласованных критериев [19]. Чтобы обеспечить единообразную основу для классификации норовирусов перед лицом рекомбинации и потенциальных «сиротских» последовательностей, а также для устранения системы именования орфанных ORF1 (например, GI.Pa, GI.Pb, GII.Pa, GII.Pe и т. Д.), Мы сгруппировали нуклеотидные последовательности из частичной области RdRp в полимеразные (P) -группы и P-типы независимо от классификации их соответствующих геногрупп и генотипов капсида, соответственно.

Обсуждение

Мы обновили количество и классификацию геногрупп и генотипов норовирусов, статистически подтвержденных критериями 2 × sd (). До недавнего времени норовирусы были официально разделены на шесть геногрупп (GI – GVI) [2]. Наш обновленный анализ показывает, что на основе разнообразия аминокислотной последовательности VP1 количество геногрупп в роду Norovirus может быть увеличено до десяти (GI – GX), а также до двух предварительных геногрупп, которые необходимо будет подтвердить при дополнительных становится доступной полная или частичная последовательность VP1 или RdRp.Вирусы в этих десяти геногруппах можно далее разделить на 49 подтвержденных генотипов капсидов на основе аминокислот полного VP1 и 60 подтвержденных P-типов на основе частичных нуклеотидных последовательностей областей RdRp.

Обновленная схема классификации норовирусов с количеством геногрупп и генотипов на основе полных аминокислот VP1 и количеством P-групп и P-типов на основе частичного участка (762 нуклеотида) РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) на 5′-конец ORF1. P = P-группа, T = предварительный генотип / P-тип (когда доступна только одна последовательность или несколько неидентичных последовательностей из одного географического местоположения, они не присвоены (NA).

За последнее десятилетие было обнаружено несколько новых последовательностей норовирусов от новых хозяев. К ним относятся последовательности собачьих норовирусов, которые были идентифицированы в образцах фекальных мазков собак в Гонконге, Китай, в 2007 году [27, 49], а также в образцах сточных вод из Уругвая в 2012 году [47]. Наш анализ подтвердил отнесение этих вирусов к новой геногруппе GVII. Во время рутинного наблюдения за образцами стула у детей с острым гастроэнтеритом в Чибе, Япония, в 2004 г. был обнаружен предварительный новый генотип GII [50], а генетически подобный штамм из Юдзавы, Япония, в 2011 г. был представлен в GenBank.Мы подтвердили, что последовательности VP1 этих штаммов представляют новую геногруппу GVIII.

Среди вирусов GII вирусы GII.15 филогенетически всегда выделялись. С пятью последовательностями VP1, включая один полный геном, доступным в GenBank, мы подтвердили, что на основе критерия 2 × sd вирусы GII.15 должны быть переклассифицированы в отдельную геногруппу, обозначенную как GIX. Многолетний виромный анализ образцов мазков из глотки и анального канала из большой коллекции основных видов летучих мышей в Китае показал несколько новых последовательностей норовирусов, которые можно классифицировать в отдельную геногруппу (GX) [12].Предполагаемые новые геногруппы были также обнаружены у морских свиней [9] (GNA1) и морских львов (GNA2). Применение критерия 2 × sd к классификации филогенетических кластеров GIV и GVI предполагает, что каждый из трех генотипов GIV и двух генотипов GVI может представлять отдельные геногруппы, однако мы решили не переклассифицировать их, а подождать, пока не появятся дополнительные последовательности GIV и GVI. становятся доступными.

В последние годы было зарегистрировано несколько новых генотипов GII и GIV из разных географических регионов по всему миру [41, 43, 45, 46, 48].С добавлением пяти новых генотипов GII.23, GII.24, GII.25, GII.26 и GII.27 теперь мы распознаем 26 генотипов GII (GII.1 – GII.27) (исключая GII.15, который сейчас представляет новую геногруппу) вместе с двумя предполагаемыми новыми генотипами GII (GII.NA1 и GII.NA2). Новые генотипы GII были идентифицированы в образцах, собранных у людей в Перу, Гватемале, Эквадоре, Бангладеш, Германии, Аргентине и США [43, 45, 48]. Предварительный новый генотип GIV был недавно идентифицирован в сточных водах (Бразилия, Япония) и в образцах стула от вспышки острого гастроэнтерита в ресторане в США ([41, 46] J Vinjé, личное сообщение).Однако, поскольку в настоящее время доступна только одна полная последовательность генома GIV, ожидается отнесение дополнительных последовательностей к новому генотипу, и поэтому этот генотип временно обозначен как неназначенный (NA) (GIV.NA1 [PNA1]).

До сих пор классификация норовирусов на P-типы основывалась на системе именования, в которой использовалось обозначение P-типа, связанное с соответствующим генотипом VP1 штамма, и когда последовательность VP1 не была известна, орфанные P-типы и / или P-типы с были присвоены буквы алфавита [19].Поскольку в последние годы распознается все большее количество рекомбинантных штаммов [33, 37, 40, 51], мы предлагаем обновление системы классификации норовирусов, в которой генотипы P-типов и VP1 назначаются независимо. Мы также предлагаем обозначить двойные типы с генотипом капсида, указанным первым, за которым следует P-тип (например, GI.6 [P10], GII.4 Sydney [P16], GIX.1 [GII.P15], GIV.2 [GVI.P1] ]).

Пять P-типов, некоторые из которых включают штаммы 1970–1980-х годов, были сгруппированы в 12 P-типов, чтобы соответствовать критериям 2 × sd.Следует отметить, что P-типы (GII.P6 и GII.P7) имеют перекрывающиеся стандартные отклонения, а несколько типов GII.P4 также не удовлетворяли критерию 2 × sd из-за перекрытия стандартных отклонений с GII.P12, GII.P31 (бывший GII .Pe) и GII.P35 (бывший GII.Pj) (рис. S4 и S5). Поскольку все три P-типа являются историческими типами, особенно штаммы GII.P4, которые имеют эпидемиологическое значение во всем мире, а текущая классификация P-типирования основана на относительно коротких фрагментах нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида), мы решили, что мы повторно посетим эта проблема в нашем следующем обновлении классификации, которое, как ожидается, будет основано на полных последовательностях ORF1.

Последовательности RdRp вирусов GIV, GVI, GVIII, GIX разделяются независимо от соответствующих им геногрупп капсида. Например, последовательности RdRp вирусов GVIII, GIX объединяются с вирусами GII и были обозначены как GII.P28 и GII.P15 соответственно. Точно так же последовательности RdRp вирусов GIV и GVI сгруппированы в две отдельные группы с последовательностями вирусов GIV, которые инфицируют людей, сгруппированными вместе с другими штаммами GIV, тогда как последовательности вирусов GIV и GVI, которые инфицируют кошек, львов и собак, сгруппированы вместе как штаммы GVI.Таким образом, межгеногрупповая рекомбинация, которая считается редким явлением среди норовирусов [52, 53], могла произойти среди вирусов, инфицирующих людей (GVIII.1 [GII.P28]; GIX.1 [GII.P15]), и среди вирусов. заражение собак (GIV.2 [GVI.P1]). Кроме того, несколько недавно описанных последовательностей RdRp без ассоциированной последовательности VP1 были включены в нашу обновленную схему классификации [33, 40].

Одним из основных ограничений настоящей классификации является то, что текущее P-типирование основано на относительно коротком фрагменте нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида) на 3′-конце ORF1.Обнадеживает то, что филогенетическая кластеризация этих более коротких последовательностей RdRp была идентична сегрегации P-типов на основе полных последовательностей RdRp (~ 1500 нуклеотидов), которые были доступны для 85% последовательностей, используемых в нашем исследовании. Дополнительные полные последовательности RdRp или идеально полные последовательности генома для всех эталонных штаммов помогут повысить надежность существующей системы классификации, для которой недавно были описаны несколько протоколов [54–56].

С согласия NCWG мы предлагаем основывать будущие обновления номенклатуры и классификации на полных последовательностях ORF1 и VP1 новых генетических линий вирусов рода Norovirus .Обновленная номенклатура, включая новые геногруппы, генотипы и новые имена P-типа, доступна через общедоступные инструменты ввода https://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool и https: //norovirus.ng.philab.cdc. gov, оба из которых используют один и тот же набор эталонных последовательностей норовирусов, доступных в GenBank. Для высококачественных последовательностей, которые нельзя типизировать с помощью этих инструментов, исследователи имеют возможность связаться с членами NCWG для дополнительного анализа. Администраторы баз данных обоих инструментов набора текста будут координировать свои действия друг с другом для периодического мониторинга общедоступных баз данных на предмет новых генотипов и соответствующего обновления эталонных последовательностей.

Обновленная классификация геногрупп и генотипов норовирусов

Резюме

Норовирусы — это генетически разнообразные РНК-вирусы, ассоциированные с острым гастроэнтеритом у млекопитающих-хозяев. Филогенетически они могут быть разделены на разные геногруппы, а также на P (полимеразные) -группы и далее на генотипы и P-типы на основе аминокислотного разнообразия полного гена VP1 и нуклеотидного разнообразия области РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). ORF1 соответственно.В последние годы поступили сообщения о нескольких новых норовирусах, которые требуют обновления существующей схемы классификации. Используя ранее описанные критерии 2-кратного стандартного отклонения (sd) для группировки последовательностей в отдельные кластеры, мы увеличили количество геногрупп до 10 (GI-GX) и количество генотипов до 49 (9 GI, 27 GII, 3 GIII, 2 GIV , 2 GV, 2 GVI и по 1 генотипу для GVII, GVIII, GIX [ранее GII.15] и GX). Вирусы, для которых в настоящее время доступна только одна последовательность в общедоступных базах данных, были разделены на предварительные новые геногруппы (GNA1 и GNA2) и генотипы (GII.NA1, GII.NA2 и GIV.NA1) с их окончательным назначением в ожидании дополнительных родственных последовательностей. Основываясь на нуклеотидном разнообразии в области RdRp, норовирусы можно разделить на 60 P-типов (14 GI, 37 GII, 2 GIII, 1 GIV, 2 GV, 2 GVI, 1 GVII и 1 GX), 2 предварительные P-группы и 14 ориентировочных P-типов. Будущие обновления классификации и номенклатуры будут основаны на полных последовательностях генома и будут координироваться и распространяться международной рабочей группой по классификации норовирусов.

Ключевые слова: Норовирус, острый гастроэнтерит, классификация, критерии 2xSD, геногруппа, генотип, P-группа, P-тип

Введение

Род Norovirus в семействе Caliciviridae состоит из генетически разнообразной группы вирусы, инфицирующие широкий спектр видов-хозяев млекопитающих, включая людей, собак, кошек, свиней, мышей, овец и крупный рогатый скот [1–8].Чтобы добавить разнообразия, недавно было идентифицировано несколько новых неклассифицированных норовирусов у летучих мышей, морских львов и морской свиньи [9–12], а также у нечеловеческих приматов (неопубликованные материалы GenBank). Норовирусы, обнаруженные у людей, отличаются генетически и антигенно и являются основной причиной острого гастроэнтерита у людей всех возрастов во всем мире, что, по оценкам, приводит к примерно 70 000–200 000 смертей ежегодно [13, 14].

Норовирусы — это вирусы без оболочки с геномом одноцепочечной РНК приблизительно 7.Длина 5 кб. На 5′-конце РНК ковалентно связана с вирусным белком (VPg), а 3′-конец генома полиаденилирован. Геном большинства норовирусов организован в три ORF, за исключением мышиных норовирусов, которые содержат четвертую ORF. ORF1 кодирует полипротеин, который генерирует шесть неструктурных белков (от NS1 / 2 до NS7) после посттрансляционного расщепления вирусной протеазой [2, 15]. ORF2 кодирует главный структурный белок (VP1), который имеет домены оболочки (S) и выступающие (P) домены. S-домен окружает вирусную РНК, а P-домен, состоящий из P2-домена, связан с S-доменом посредством гибкого шарнира [2, 14].Субдомен P2 очень вариабелен, содержит основные нейтрализующие эпитопы и взаимодействует с антигенами гистокрови (HBGA) [16]. ORF3 кодирует минорный структурный белок (VP2), который расположен внутри вирусной частицы и, как предполагалось, участвует в сборке капсида и инкапсидации генома [17] и, как недавно было описано для калицивируса кошек, проникновении вириона в клетку-хозяина. [18]. Полные аминокислотные последовательности VP1 и нуклеотидные последовательности области ORF1 NS7 (кодирующей РНК-зависимую РНК-полимеразу [RdRp]) составляют основу современной генетической классификации норовирусов [19].

Необходимость организации штаммов норовирусов в различные генетические группы или кластеры была признана в середине 1990-х годов, когда норовирусы были в первую очередь разделены на геногруппы и генотипы на основе частичных последовательностей RdRp [20–23]. Когда стало доступно больше последовательностей, классификация сместилась, чтобы обозначить геногруппы и генотипы на основе полной аминокислотной последовательности VP1 с 20% различием последовательностей, используемым в качестве порога отсечения для новых генотипов, который позже был скорректирован до 15% [24, 25].Из-за отсутствия международно признанных стандартов классификации норовирусов несколько исследовательских групп использовали небольшую нуклеотидную область на 5′-конце VP1 (названную областью C) для классификации генотипов, что, хотя и подходило для типирования норовирусов, привело к непоследовательной классификации некоторых штаммов. [25, 26].

Чтобы обеспечить эффективную передачу эпидемиологически важных клонов норовирусов, в 2013 г. исследователи из Рабочей группы по классификации норовирусов (NCWG) предложили универсальную стандартизированную систему номенклатуры и типирования для генотипирования норовирусов GI и GII с использованием филогенетической кластеризации полных аминокислотных последовательностей VP1 [ 19].Основываясь на анализе имеющихся на тот момент данных о последовательностях, норовирусы были классифицированы на шесть геногрупп (от GI до GVI) [19, 27] с предложенной седьмой геногруппой (GVII) [27]. В дальнейшем эти геногруппы были разделены на более чем 40 генотипов [28]. Вирусы GI, GII и GIV инфицируют людей, однако GII также включает три генотипа (GII.11, GII.18 и GII.19), обнаруженные в образцах фекалий свиней, а вирусы GIV включают генотип (GIV.2), который был только обнаружен. у хищников (кошек и собак) [2, 27, 29].Поскольку критерии номенклатуры не могли быть выполнены для различения вариантов GII.4, было решено, что подтипирование штаммов GII.4 на варианты будет основано на филогенетической кластеризации и что новые варианты GII.4 будут распознаваться только после того, как они станут эпидемическими в по крайней мере, два географически разных места [19]. За последние два десятилетия в обращении было восемь вариантов GII.4, каждый из которых заменял предыдущий доминирующий вариант, а с 2012 года GII.4 Sydney является наиболее современным вариантом GII.4 [19].

Кроме того, поскольку разнообразие норовирусов может быть дополнительно увеличено за счет рекомбинации, а циркулирующие рекомбинантные штаммы проявляются как отдельные эпидемиологические объекты, было предложено двойное типирование для включения разнообразия на уровне частичных последовательностей RdRp в обозначениях штаммов [19]. Хотя несколько контрольных точек рекомбинации было идентифицировано в геноме норовируса, они наиболее часто обнаруживаются в области соединения ORF1-ORF2 [29–36]. Двойное типирование (ORF1-RdRp = тип P, ORF2 = генотип) в настоящее время регулярно используется во многих лабораториях по всему миру, и было проведено по меньшей мере 14 GI P-типов и 27 GII P-типов, а также 9 генотипов GI капсида и 22 генотипа GII капсида. описано [2, 19, 27].Включение диагностического тестирования норовирусов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени в клиническую практику и общественное здравоохранение в последние годы [27, 37–39] подтвердило важность норовирусов GI и GII во всем мире [13, 31, 33, 35, 37, 40–44]. Все более широкое использование секвенирования генома патогенов для выяснения способов передачи, источников вспышек или изучения бремени инфекций привело к идентификации нескольких новых геногрупп и генотипов норовирусов-кандидатов с момента последнего обновления классификации норовирусов в 2013 г. [9, 12, 33 , 40, 41, 43, 45–49].В этой статье мы обновляем схему классификации норовирусов, предлагая новые геногруппы и генотипы на основе полных аминокислотных последовательностей капсида с использованием ранее согласованных критериев [19]. Чтобы обеспечить единообразную основу для классификации норовирусов перед лицом рекомбинации и потенциальных «сиротских» последовательностей, а также для устранения системы именования орфанных ORF1 (например, GI.Pa, GI.Pb, GII.Pa, GII.Pe и т. Д.), Мы сгруппировали нуклеотидные последовательности из частичной области RdRp в полимеразные (P) -группы и P-типы независимо от классификации их соответствующих геногрупп и генотипов капсида, соответственно.

Обсуждение

Мы обновили количество и классификацию геногрупп и генотипов норовирусов, статистически подтвержденных критериями 2 × sd (). До недавнего времени норовирусы были официально разделены на шесть геногрупп (GI – GVI) [2]. Наш обновленный анализ показывает, что на основе разнообразия аминокислотной последовательности VP1 количество геногрупп в роду Norovirus может быть увеличено до десяти (GI – GX), а также до двух предварительных геногрупп, которые необходимо будет подтвердить при дополнительных становится доступной полная или частичная последовательность VP1 или RdRp.Вирусы в этих десяти геногруппах можно далее разделить на 49 подтвержденных генотипов капсидов на основе аминокислот полного VP1 и 60 подтвержденных P-типов на основе частичных нуклеотидных последовательностей областей RdRp.

Обновленная схема классификации норовирусов с количеством геногрупп и генотипов на основе полных аминокислот VP1 и количеством P-групп и P-типов на основе частичного участка (762 нуклеотида) РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) на 5′-конец ORF1. P = P-группа, T = предварительный генотип / P-тип (когда доступна только одна последовательность или несколько неидентичных последовательностей из одного географического местоположения, они не присвоены (NA).

За последнее десятилетие было обнаружено несколько новых последовательностей норовирусов от новых хозяев. К ним относятся последовательности собачьих норовирусов, которые были идентифицированы в образцах фекальных мазков собак в Гонконге, Китай, в 2007 году [27, 49], а также в образцах сточных вод из Уругвая в 2012 году [47]. Наш анализ подтвердил отнесение этих вирусов к новой геногруппе GVII. Во время рутинного наблюдения за образцами стула у детей с острым гастроэнтеритом в Чибе, Япония, в 2004 г. был обнаружен предварительный новый генотип GII [50], а генетически подобный штамм из Юдзавы, Япония, в 2011 г. был представлен в GenBank.Мы подтвердили, что последовательности VP1 этих штаммов представляют новую геногруппу GVIII.

Среди вирусов GII вирусы GII.15 филогенетически всегда выделялись. С пятью последовательностями VP1, включая один полный геном, доступным в GenBank, мы подтвердили, что на основе критерия 2 × sd вирусы GII.15 должны быть переклассифицированы в отдельную геногруппу, обозначенную как GIX. Многолетний виромный анализ образцов мазков из глотки и анального канала из большой коллекции основных видов летучих мышей в Китае показал несколько новых последовательностей норовирусов, которые можно классифицировать в отдельную геногруппу (GX) [12].Предполагаемые новые геногруппы были также обнаружены у морских свиней [9] (GNA1) и морских львов (GNA2). Применение критерия 2 × sd к классификации филогенетических кластеров GIV и GVI предполагает, что каждый из трех генотипов GIV и двух генотипов GVI может представлять отдельные геногруппы, однако мы решили не переклассифицировать их, а подождать, пока не появятся дополнительные последовательности GIV и GVI. становятся доступными.

В последние годы было зарегистрировано несколько новых генотипов GII и GIV из разных географических регионов по всему миру [41, 43, 45, 46, 48].С добавлением пяти новых генотипов GII.23, GII.24, GII.25, GII.26 и GII.27 теперь мы распознаем 26 генотипов GII (GII.1 – GII.27) (исключая GII.15, который сейчас представляет новую геногруппу) вместе с двумя предполагаемыми новыми генотипами GII (GII.NA1 и GII.NA2). Новые генотипы GII были идентифицированы в образцах, собранных у людей в Перу, Гватемале, Эквадоре, Бангладеш, Германии, Аргентине и США [43, 45, 48]. Предварительный новый генотип GIV был недавно идентифицирован в сточных водах (Бразилия, Япония) и в образцах стула от вспышки острого гастроэнтерита в ресторане в США ([41, 46] J Vinjé, личное сообщение).Однако, поскольку в настоящее время доступна только одна полная последовательность генома GIV, ожидается отнесение дополнительных последовательностей к новому генотипу, и поэтому этот генотип временно обозначен как неназначенный (NA) (GIV.NA1 [PNA1]).

До сих пор классификация норовирусов на P-типы основывалась на системе именования, в которой использовалось обозначение P-типа, связанное с соответствующим генотипом VP1 штамма, и когда последовательность VP1 не была известна, орфанные P-типы и / или P-типы с были присвоены буквы алфавита [19].Поскольку в последние годы распознается все большее количество рекомбинантных штаммов [33, 37, 40, 51], мы предлагаем обновление системы классификации норовирусов, в которой генотипы P-типов и VP1 назначаются независимо. Мы также предлагаем обозначить двойные типы с генотипом капсида, указанным первым, за которым следует P-тип (например, GI.6 [P10], GII.4 Sydney [P16], GIX.1 [GII.P15], GIV.2 [GVI.P1] ]).

Пять P-типов, некоторые из которых включают штаммы 1970–1980-х годов, были сгруппированы в 12 P-типов, чтобы соответствовать критериям 2 × sd.Следует отметить, что P-типы (GII.P6 и GII.P7) имеют перекрывающиеся стандартные отклонения, а несколько типов GII.P4 также не удовлетворяли критерию 2 × sd из-за перекрытия стандартных отклонений с GII.P12, GII.P31 (бывший GII .Pe) и GII.P35 (бывший GII.Pj) (рис. S4 и S5). Поскольку все три P-типа являются историческими типами, особенно штаммы GII.P4, которые имеют эпидемиологическое значение во всем мире, а текущая классификация P-типирования основана на относительно коротких фрагментах нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида), мы решили, что мы повторно посетим эта проблема в нашем следующем обновлении классификации, которое, как ожидается, будет основано на полных последовательностях ORF1.

Последовательности RdRp вирусов GIV, GVI, GVIII, GIX разделяются независимо от соответствующих им геногрупп капсида. Например, последовательности RdRp вирусов GVIII, GIX объединяются с вирусами GII и были обозначены как GII.P28 и GII.P15 соответственно. Точно так же последовательности RdRp вирусов GIV и GVI сгруппированы в две отдельные группы с последовательностями вирусов GIV, которые инфицируют людей, сгруппированными вместе с другими штаммами GIV, тогда как последовательности вирусов GIV и GVI, которые инфицируют кошек, львов и собак, сгруппированы вместе как штаммы GVI.Таким образом, межгеногрупповая рекомбинация, которая считается редким явлением среди норовирусов [52, 53], могла произойти среди вирусов, инфицирующих людей (GVIII.1 [GII.P28]; GIX.1 [GII.P15]), и среди вирусов. заражение собак (GIV.2 [GVI.P1]). Кроме того, несколько недавно описанных последовательностей RdRp без ассоциированной последовательности VP1 были включены в нашу обновленную схему классификации [33, 40].

Одним из основных ограничений настоящей классификации является то, что текущее P-типирование основано на относительно коротком фрагменте нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида) на 3′-конце ORF1.Обнадеживает то, что филогенетическая кластеризация этих более коротких последовательностей RdRp была идентична сегрегации P-типов на основе полных последовательностей RdRp (~ 1500 нуклеотидов), которые были доступны для 85% последовательностей, используемых в нашем исследовании. Дополнительные полные последовательности RdRp или идеально полные последовательности генома для всех эталонных штаммов помогут повысить надежность существующей системы классификации, для которой недавно были описаны несколько протоколов [54–56].

С согласия NCWG мы предлагаем основывать будущие обновления номенклатуры и классификации на полных последовательностях ORF1 и VP1 новых генетических линий вирусов рода Norovirus .Обновленная номенклатура, включая новые геногруппы, генотипы и новые имена P-типа, доступна через общедоступные инструменты ввода https://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool и https: //norovirus.ng.philab.cdc. gov, оба из которых используют один и тот же набор эталонных последовательностей норовирусов, доступных в GenBank. Для высококачественных последовательностей, которые нельзя типизировать с помощью этих инструментов, исследователи имеют возможность связаться с членами NCWG для дополнительного анализа. Администраторы баз данных обоих инструментов набора текста будут координировать свои действия друг с другом для периодического мониторинга общедоступных баз данных на предмет новых генотипов и соответствующего обновления эталонных последовательностей.

Обновленная классификация геногрупп и генотипов норовирусов

Резюме

Норовирусы — это генетически разнообразные РНК-вирусы, ассоциированные с острым гастроэнтеритом у млекопитающих-хозяев. Филогенетически они могут быть разделены на разные геногруппы, а также на P (полимеразные) -группы и далее на генотипы и P-типы на основе аминокислотного разнообразия полного гена VP1 и нуклеотидного разнообразия области РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). ORF1 соответственно.В последние годы поступили сообщения о нескольких новых норовирусах, которые требуют обновления существующей схемы классификации. Используя ранее описанные критерии 2-кратного стандартного отклонения (sd) для группировки последовательностей в отдельные кластеры, мы увеличили количество геногрупп до 10 (GI-GX) и количество генотипов до 49 (9 GI, 27 GII, 3 GIII, 2 GIV , 2 GV, 2 GVI и по 1 генотипу для GVII, GVIII, GIX [ранее GII.15] и GX). Вирусы, для которых в настоящее время доступна только одна последовательность в общедоступных базах данных, были разделены на предварительные новые геногруппы (GNA1 и GNA2) и генотипы (GII.NA1, GII.NA2 и GIV.NA1) с их окончательным назначением в ожидании дополнительных родственных последовательностей. Основываясь на нуклеотидном разнообразии в области RdRp, норовирусы можно разделить на 60 P-типов (14 GI, 37 GII, 2 GIII, 1 GIV, 2 GV, 2 GVI, 1 GVII и 1 GX), 2 предварительные P-группы и 14 ориентировочных P-типов. Будущие обновления классификации и номенклатуры будут основаны на полных последовательностях генома и будут координироваться и распространяться международной рабочей группой по классификации норовирусов.

Ключевые слова: Норовирус, острый гастроэнтерит, классификация, критерии 2xSD, геногруппа, генотип, P-группа, P-тип

Введение

Род Norovirus в семействе Caliciviridae состоит из генетически разнообразной группы вирусы, инфицирующие широкий спектр видов-хозяев млекопитающих, включая людей, собак, кошек, свиней, мышей, овец и крупный рогатый скот [1–8].Чтобы добавить разнообразия, недавно было идентифицировано несколько новых неклассифицированных норовирусов у летучих мышей, морских львов и морской свиньи [9–12], а также у нечеловеческих приматов (неопубликованные материалы GenBank). Норовирусы, обнаруженные у людей, отличаются генетически и антигенно и являются основной причиной острого гастроэнтерита у людей всех возрастов во всем мире, что, по оценкам, приводит к примерно 70 000–200 000 смертей ежегодно [13, 14].

Норовирусы — это вирусы без оболочки с геномом одноцепочечной РНК приблизительно 7.Длина 5 кб. На 5′-конце РНК ковалентно связана с вирусным белком (VPg), а 3′-конец генома полиаденилирован. Геном большинства норовирусов организован в три ORF, за исключением мышиных норовирусов, которые содержат четвертую ORF. ORF1 кодирует полипротеин, который генерирует шесть неструктурных белков (от NS1 / 2 до NS7) после посттрансляционного расщепления вирусной протеазой [2, 15]. ORF2 кодирует главный структурный белок (VP1), который имеет домены оболочки (S) и выступающие (P) домены. S-домен окружает вирусную РНК, а P-домен, состоящий из P2-домена, связан с S-доменом посредством гибкого шарнира [2, 14].Субдомен P2 очень вариабелен, содержит основные нейтрализующие эпитопы и взаимодействует с антигенами гистокрови (HBGA) [16]. ORF3 кодирует минорный структурный белок (VP2), который расположен внутри вирусной частицы и, как предполагалось, участвует в сборке капсида и инкапсидации генома [17] и, как недавно было описано для калицивируса кошек, проникновении вириона в клетку-хозяина. [18]. Полные аминокислотные последовательности VP1 и нуклеотидные последовательности области ORF1 NS7 (кодирующей РНК-зависимую РНК-полимеразу [RdRp]) составляют основу современной генетической классификации норовирусов [19].

Необходимость организации штаммов норовирусов в различные генетические группы или кластеры была признана в середине 1990-х годов, когда норовирусы были в первую очередь разделены на геногруппы и генотипы на основе частичных последовательностей RdRp [20–23]. Когда стало доступно больше последовательностей, классификация сместилась, чтобы обозначить геногруппы и генотипы на основе полной аминокислотной последовательности VP1 с 20% различием последовательностей, используемым в качестве порога отсечения для новых генотипов, который позже был скорректирован до 15% [24, 25].Из-за отсутствия международно признанных стандартов классификации норовирусов несколько исследовательских групп использовали небольшую нуклеотидную область на 5′-конце VP1 (названную областью C) для классификации генотипов, что, хотя и подходило для типирования норовирусов, привело к непоследовательной классификации некоторых штаммов. [25, 26].

Чтобы обеспечить эффективную передачу эпидемиологически важных клонов норовирусов, в 2013 г. исследователи из Рабочей группы по классификации норовирусов (NCWG) предложили универсальную стандартизированную систему номенклатуры и типирования для генотипирования норовирусов GI и GII с использованием филогенетической кластеризации полных аминокислотных последовательностей VP1 [ 19].Основываясь на анализе имеющихся на тот момент данных о последовательностях, норовирусы были классифицированы на шесть геногрупп (от GI до GVI) [19, 27] с предложенной седьмой геногруппой (GVII) [27]. В дальнейшем эти геногруппы были разделены на более чем 40 генотипов [28]. Вирусы GI, GII и GIV инфицируют людей, однако GII также включает три генотипа (GII.11, GII.18 и GII.19), обнаруженные в образцах фекалий свиней, а вирусы GIV включают генотип (GIV.2), который был только обнаружен. у хищников (кошек и собак) [2, 27, 29].Поскольку критерии номенклатуры не могли быть выполнены для различения вариантов GII.4, было решено, что подтипирование штаммов GII.4 на варианты будет основано на филогенетической кластеризации и что новые варианты GII.4 будут распознаваться только после того, как они станут эпидемическими в по крайней мере, два географически разных места [19]. За последние два десятилетия в обращении было восемь вариантов GII.4, каждый из которых заменял предыдущий доминирующий вариант, а с 2012 года GII.4 Sydney является наиболее современным вариантом GII.4 [19].

Кроме того, поскольку разнообразие норовирусов может быть дополнительно увеличено за счет рекомбинации, а циркулирующие рекомбинантные штаммы проявляются как отдельные эпидемиологические объекты, было предложено двойное типирование для включения разнообразия на уровне частичных последовательностей RdRp в обозначениях штаммов [19]. Хотя несколько контрольных точек рекомбинации было идентифицировано в геноме норовируса, они наиболее часто обнаруживаются в области соединения ORF1-ORF2 [29–36]. Двойное типирование (ORF1-RdRp = тип P, ORF2 = генотип) в настоящее время регулярно используется во многих лабораториях по всему миру, и было проведено по меньшей мере 14 GI P-типов и 27 GII P-типов, а также 9 генотипов GI капсида и 22 генотипа GII капсида. описано [2, 19, 27].Включение диагностического тестирования норовирусов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени в клиническую практику и общественное здравоохранение в последние годы [27, 37–39] подтвердило важность норовирусов GI и GII во всем мире [13, 31, 33, 35, 37, 40–44]. Все более широкое использование секвенирования генома патогенов для выяснения способов передачи, источников вспышек или изучения бремени инфекций привело к идентификации нескольких новых геногрупп и генотипов норовирусов-кандидатов с момента последнего обновления классификации норовирусов в 2013 г. [9, 12, 33 , 40, 41, 43, 45–49].В этой статье мы обновляем схему классификации норовирусов, предлагая новые геногруппы и генотипы на основе полных аминокислотных последовательностей капсида с использованием ранее согласованных критериев [19]. Чтобы обеспечить единообразную основу для классификации норовирусов перед лицом рекомбинации и потенциальных «сиротских» последовательностей, а также для устранения системы именования орфанных ORF1 (например, GI.Pa, GI.Pb, GII.Pa, GII.Pe и т. Д.), Мы сгруппировали нуклеотидные последовательности из частичной области RdRp в полимеразные (P) -группы и P-типы независимо от классификации их соответствующих геногрупп и генотипов капсида, соответственно.

Обсуждение

Мы обновили количество и классификацию геногрупп и генотипов норовирусов, статистически подтвержденных критериями 2 × sd (). До недавнего времени норовирусы были официально разделены на шесть геногрупп (GI – GVI) [2]. Наш обновленный анализ показывает, что на основе разнообразия аминокислотной последовательности VP1 количество геногрупп в роду Norovirus может быть увеличено до десяти (GI – GX), а также до двух предварительных геногрупп, которые необходимо будет подтвердить при дополнительных становится доступной полная или частичная последовательность VP1 или RdRp.Вирусы в этих десяти геногруппах можно далее разделить на 49 подтвержденных генотипов капсидов на основе аминокислот полного VP1 и 60 подтвержденных P-типов на основе частичных нуклеотидных последовательностей областей RdRp.

Обновленная схема классификации норовирусов с количеством геногрупп и генотипов на основе полных аминокислот VP1 и количеством P-групп и P-типов на основе частичного участка (762 нуклеотида) РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) на 5′-конец ORF1. P = P-группа, T = предварительный генотип / P-тип (когда доступна только одна последовательность или несколько неидентичных последовательностей из одного географического местоположения, они не присвоены (NA).

За последнее десятилетие было обнаружено несколько новых последовательностей норовирусов от новых хозяев. К ним относятся последовательности собачьих норовирусов, которые были идентифицированы в образцах фекальных мазков собак в Гонконге, Китай, в 2007 году [27, 49], а также в образцах сточных вод из Уругвая в 2012 году [47]. Наш анализ подтвердил отнесение этих вирусов к новой геногруппе GVII. Во время рутинного наблюдения за образцами стула у детей с острым гастроэнтеритом в Чибе, Япония, в 2004 г. был обнаружен предварительный новый генотип GII [50], а генетически подобный штамм из Юдзавы, Япония, в 2011 г. был представлен в GenBank.Мы подтвердили, что последовательности VP1 этих штаммов представляют новую геногруппу GVIII.

Среди вирусов GII вирусы GII.15 филогенетически всегда выделялись. С пятью последовательностями VP1, включая один полный геном, доступным в GenBank, мы подтвердили, что на основе критерия 2 × sd вирусы GII.15 должны быть переклассифицированы в отдельную геногруппу, обозначенную как GIX. Многолетний виромный анализ образцов мазков из глотки и анального канала из большой коллекции основных видов летучих мышей в Китае показал несколько новых последовательностей норовирусов, которые можно классифицировать в отдельную геногруппу (GX) [12].Предполагаемые новые геногруппы были также обнаружены у морских свиней [9] (GNA1) и морских львов (GNA2). Применение критерия 2 × sd к классификации филогенетических кластеров GIV и GVI предполагает, что каждый из трех генотипов GIV и двух генотипов GVI может представлять отдельные геногруппы, однако мы решили не переклассифицировать их, а подождать, пока не появятся дополнительные последовательности GIV и GVI. становятся доступными.

В последние годы было зарегистрировано несколько новых генотипов GII и GIV из разных географических регионов по всему миру [41, 43, 45, 46, 48].С добавлением пяти новых генотипов GII.23, GII.24, GII.25, GII.26 и GII.27 теперь мы распознаем 26 генотипов GII (GII.1 – GII.27) (исключая GII.15, который сейчас представляет новую геногруппу) вместе с двумя предполагаемыми новыми генотипами GII (GII.NA1 и GII.NA2). Новые генотипы GII были идентифицированы в образцах, собранных у людей в Перу, Гватемале, Эквадоре, Бангладеш, Германии, Аргентине и США [43, 45, 48]. Предварительный новый генотип GIV был недавно идентифицирован в сточных водах (Бразилия, Япония) и в образцах стула от вспышки острого гастроэнтерита в ресторане в США ([41, 46] J Vinjé, личное сообщение).Однако, поскольку в настоящее время доступна только одна полная последовательность генома GIV, ожидается отнесение дополнительных последовательностей к новому генотипу, и поэтому этот генотип временно обозначен как неназначенный (NA) (GIV.NA1 [PNA1]).

До сих пор классификация норовирусов на P-типы основывалась на системе именования, в которой использовалось обозначение P-типа, связанное с соответствующим генотипом VP1 штамма, и когда последовательность VP1 не была известна, орфанные P-типы и / или P-типы с были присвоены буквы алфавита [19].Поскольку в последние годы распознается все большее количество рекомбинантных штаммов [33, 37, 40, 51], мы предлагаем обновление системы классификации норовирусов, в которой генотипы P-типов и VP1 назначаются независимо. Мы также предлагаем обозначить двойные типы с генотипом капсида, указанным первым, за которым следует P-тип (например, GI.6 [P10], GII.4 Sydney [P16], GIX.1 [GII.P15], GIV.2 [GVI.P1] ]).

Пять P-типов, некоторые из которых включают штаммы 1970–1980-х годов, были сгруппированы в 12 P-типов, чтобы соответствовать критериям 2 × sd.Следует отметить, что P-типы (GII.P6 и GII.P7) имеют перекрывающиеся стандартные отклонения, а несколько типов GII.P4 также не удовлетворяли критерию 2 × sd из-за перекрытия стандартных отклонений с GII.P12, GII.P31 (бывший GII .Pe) и GII.P35 (бывший GII.Pj) (рис. S4 и S5). Поскольку все три P-типа являются историческими типами, особенно штаммы GII.P4, которые имеют эпидемиологическое значение во всем мире, а текущая классификация P-типирования основана на относительно коротких фрагментах нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида), мы решили, что мы повторно посетим эта проблема в нашем следующем обновлении классификации, которое, как ожидается, будет основано на полных последовательностях ORF1.

Последовательности RdRp вирусов GIV, GVI, GVIII, GIX разделяются независимо от соответствующих им геногрупп капсида. Например, последовательности RdRp вирусов GVIII, GIX объединяются с вирусами GII и были обозначены как GII.P28 и GII.P15 соответственно. Точно так же последовательности RdRp вирусов GIV и GVI сгруппированы в две отдельные группы с последовательностями вирусов GIV, которые инфицируют людей, сгруппированными вместе с другими штаммами GIV, тогда как последовательности вирусов GIV и GVI, которые инфицируют кошек, львов и собак, сгруппированы вместе как штаммы GVI.Таким образом, межгеногрупповая рекомбинация, которая считается редким явлением среди норовирусов [52, 53], могла произойти среди вирусов, инфицирующих людей (GVIII.1 [GII.P28]; GIX.1 [GII.P15]), и среди вирусов. заражение собак (GIV.2 [GVI.P1]). Кроме того, несколько недавно описанных последовательностей RdRp без ассоциированной последовательности VP1 были включены в нашу обновленную схему классификации [33, 40].

Одним из основных ограничений настоящей классификации является то, что текущее P-типирование основано на относительно коротком фрагменте нуклеотидной последовательности (762 нуклеотида) на 3′-конце ORF1.Обнадеживает то, что филогенетическая кластеризация этих более коротких последовательностей RdRp была идентична сегрегации P-типов на основе полных последовательностей RdRp (~ 1500 нуклеотидов), которые были доступны для 85% последовательностей, используемых в нашем исследовании. Дополнительные полные последовательности RdRp или идеально полные последовательности генома для всех эталонных штаммов помогут повысить надежность существующей системы классификации, для которой недавно были описаны несколько протоколов [54–56].

С согласия NCWG мы предлагаем основывать будущие обновления номенклатуры и классификации на полных последовательностях ORF1 и VP1 новых генетических линий вирусов рода Norovirus .Обновленная номенклатура, включая новые геногруппы, генотипы и новые имена P-типа, доступна через общедоступные инструменты ввода https://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool и https: //norovirus.ng.philab.cdc. gov, оба из которых используют один и тот же набор эталонных последовательностей норовирусов, доступных в GenBank. Для высококачественных последовательностей, которые нельзя типизировать с помощью этих инструментов, исследователи имеют возможность связаться с членами NCWG для дополнительного анализа. Администраторы баз данных обоих инструментов набора текста будут координировать свои действия друг с другом для периодического мониторинга общедоступных баз данных на предмет новых генотипов и соответствующего обновления эталонных последовательностей.

Обнаружение, количественная оценка и молекулярный анализ

Abstract

Во всем мире норовирус (NoV) является основной причиной острого гастроэнтерита (AGE), вызывающей пандемии каждые ~ 3 года и более 200 000 случаев смерти в год, в основном у детей из развивающихся стран. Мы исследуем заболеваемость NoV у детей, госпитализированных с AGE из Белен, Пара, Бразилия, а также коррелировали уровни вирусной РНК в их крови и стуле с клинической тяжестью.С этой целью у 445 педиатрических пациентов были взяты парные образцы стула и сыворотки крови в возрасте ≤9 лет в период с марта 2012 г. по июнь 2015 г. Иммуноферментный анализ (ИФА) был использован для обнаружения NoV в кале и количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR). ), используемого для количественного определения уровней РНК NoV в сыворотке (РНКемия) и в стуле с положительным результатом. Положительные образцы характеризовались частичной последовательностью области ORF1 / 2 вирусного генома. Антиген NoV был обнаружен в 24,3% (108/445) образцов стула, при этом РНКемия также присутствовала в 20.4% (22/108). РНКемия и высокая вирусная нагрузка в кале (> 10 ⁷ копий генома на грамм фекалий) были связаны с более длительной госпитализацией. Преобладающими генотипами были варианты GII.4 Sydney_2012 (71,6% -58 / 81) и New Orleans_2009 (6,2% -5 / 81). Было обнаружено восемь других генотипов, принадлежащих к GII, и четыре из них были рекомбинантными штаммами. Все сыворотки были охарактеризованы как GII.4 и имели 100% сходство со стулом. Результаты показывают, что распространение NoV в кровоток не является редкостью и может быть связано с увеличением вирусной нагрузки в фекалиях и тяжестью заболевания.

Образец цитирования: Reymão TKA, Fumian TM, Justino MCA, Hernandez JM, Bandeira RS, Lucena MSS, et al. (2018) РНК норовируса в сыворотке, связанная с повышенной вирусной нагрузкой в ​​кале у детей: обнаружение, количественная оценка и молекулярный анализ. PLoS ONE 13 (7):
e0199763.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763

Редактор: Кристиан Э. Вобус, Мичиганский университет, США, США

Поступила: 31 января 2018 г .; Принята к печати: 13 июня 2018 г .; Опубликовано: 2 июля 2018 г.

Авторские права: © 2018 Reymão et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Это исследование было поддержано Институтом Эвандро Шагаса Министерства здравоохранения Бразилии. Основной проект исследования ротавирусов, координатором которого является д-р.MCAJ, предполагалось в 2014 году с финансированием в размере 35 000 реалов по универсальному призыву Национального совета по научному и технологическому развитию №14 / 2013 (www.cnpq.br). На эту сумму были закуплены реагенты и материалы, необходимые для исследования ротавируса. Настоящее исследование является подпроектом основного проекта и не предполагалось получить какое-либо финансирование. Первый автор этого исследования, TKAR, получил степень магистра от Фонда исследований и исследований Амазонии (www.fapespa.pa.gov.br) в течение 24 месяцев с 2014 по 2016 год, ежемесячная сумма которого составляла 1500,00 бразильских реалов на личные расходы во время магистерской программы. Плата за публикацию автора не взимается. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Острый гастроэнтерит (AGE) остается важной причиной детской заболеваемости и смертности в развивающихся странах [1].Следуя рекомендации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), несколько стран ввели ротавирусные вакцины в национальные программы иммунизации, включая внедрение в государственный сектор, что привело к снижению числа случаев, вызываемых ротавирусом (RoV). В настоящее время норовирус (NoV) признан ведущим вирусным этиологическим агентом острого гастроэнтерита во всех возрастных группах [2–4]. На долю NoV приходится более 90% вспышек гастроэнтерита во всем мире и значительная часть спорадических эпизодов среди детей и пожилых людей [5].В этом контексте было подсчитано, что новая инфекция связана с 200 000 смертей в год, в основном среди детей раннего возраста, живущих в странах с низким или средним уровнем дохода [5].

NoV является членом семейства Caliciviridae и содержит одноцепочечный геном РНК с положительной полярностью приблизительно 7,5 т.п.н., состоящий из трех открытых рамок считывания (ORF 1-3). ORF1 кодирует шесть неструктурных белков, включая вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), тогда как ORF2 и ORF3 кодируют основные белки капсида VP1 и VP2, соответственно.На основе полной аминокислотной последовательности (аа) VP1 штаммы NoV классифицируются на семь геногрупп (GI – GVII) и более 40 генотипов; среди них известно, что генотипы GI, GII и GIV инфицируют людей [6, 7].

Инфекция

NoV обычно бывает острой и проходит самостоятельно с основными симптомами, включая рвоту, диарею и тошноту. Инфекция у госпитализированных пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом может привести к длительному выделению вируса и клиническим осложнениям [8, 9]. Кроме того, описаны необычные внекишечные проявления, такие как судороги, диссеминированное внутрисосудистое свертывание и некротический энтероколит у новорожденных, что указывает на распространение вируса на системные органы [10–12].Было проведено несколько исследований, посвященных виремии NoV среди пациентов с AGE, как правило, с небольшим количеством субъектов [8, 13]. В Японии NoV был обнаружен в образцах сыворотки шести детей с сопутствующими NoV-положительными образцами стула [13]. В другом исследовании Frange et al. [8] продемонстрировали, что около 25% педиатрических пациентов с ослабленным иммунитетом и стулом, положительным по отношению к NoV, также имели одновременно положительную реакцию на РНК NoV в своей сыворотке.

В Бразилии NoV в основном исследовали в контексте исследований в больницах с основной целью оценки роли ротавирусов как причины тяжелого детского гастроэнтерита.На сегодняшний день только два из этих исследований сообщили о возникновении либо антигенемии NoV (наличие вирусных антигенов в крови), либо РНКемии NoV. Первое включает первые семь месяцев результатов, полученные в ходе настоящего исследования [14], а второе исследование включало пациентов с аллогенной трансплантацией стволовых клеток (ASCT) из Гояса, центрально-западный регион Бразилии, где пролонгированная экскреция NoV и стойкая РНК NoV. в крови были обнаружены у шести из десяти пациентов, находившихся под наблюдением в течение года [9].

В настоящем исследовании мы в первую очередь стремились оценить молекулярную эпидемиологию инфекции NoV в Белене, Бразилия, в исследовании наблюдения с участием детей, госпитализированных с гастроэнтеритом в течение трех лет. Это позволило нам найти РНКемию NoV и проверить ее корреляцию с клинической тяжестью.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Это было перекрестное проспективное обсервационное исследование на базе больниц, проведенное в двух педиатрических больницах в Белене, штат Пара, северная Бразилия.С марта 2012 г. по июнь 2015 г. парные пробы кала и крови собирались сразу после госпитализации детей по поводу возраста, определяемого как три или более жидких или полужидких стула в течение 24 часов, вплоть до 48 часов после поступления в больницу. Клинические особенности, такие как количество эпизодов рвоты / диареи в день и продолжительность рвоты и диареи, регистрировались с помощью структурированного вопросника педиатрами или помощниками медсестры. Данные о продолжительности госпитализации и времени болезни были получены из медицинских карт.В дополнение к вышеупомянутым клиническим критериям для включения в исследование дети должны были родиться после даты введения вакцины против RoV в Бразилии (март / 2006 г.), и, следовательно, им было не более 9 лет. возраст. Все собранные образцы фекалий и сыворотки также были проверены на наличие RoV (данные не показаны). Все собранные образцы хранили при -20 ° C до обработки.

Вся информация и образцы были получены после того, как родители или законные опекуны каждого ребенка предоставили подписанную форму информированного согласия.Настоящее исследование было одобрено Комитетом по этике исследований на людях Института Эвандро Шагаса Министерства здравоохранения Бразилии (IEC-CEPH, протокол № 0039/2011).

Обнаружение норовируса

Иммуноферментный анализ (EIA).

Скрининг

NoV в образцах фекалий проводился с использованием коммерческого набора RIDASCREEN ^® Norovirus 3 ^rd Generation (R-Biopharm) для ИФА, который выявляет вирусные антигены из геногрупп GI и GII в соответствии с рекомендациями производителя.

Экстракция нуклеиновой кислоты.

Нуклеиновая кислота из всех образцов фекалий была получена с использованием собственного метода экстракции кремнеземом, как описано Boom et al. [15] с модификациями, сделанными das Dôres de Paula и др. [16]. Все сыворотки экстрагировали с использованием коммерческого набора (QIAamp ^® Viral RNA Mini kit, Qiagen, Freigburg, Germany), следуя инструкциям производителя.

Количественная ОТ-ПЦР (RT-qPCR).

NoV GII Количественная оценка всех образцов сыворотки и образцов, положительных по EIA NoV, была проведена в системе ABI 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) с использованием праймеров и зондов, как описано ранее [17], и Система одностадийной количественной ОТ-ПЦР SuperScript III Platinum (Invitrogen, CA, USA).Мы использовали реакционную смесь, содержащую 5 мкл очищенной РНК с конечными концентрациями праймеров и зондов 600 и 300 нМ соответственно. 10-кратное серийное разведение плазмиды, содержащей соединение ORF1 / 2 NV GII, использовали для построения стандартных кривых для количественной оценки вирусной нагрузки. В реакции использовали 40 циклов, и образцы с порогом цикла <40 считались положительными. К сожалению, невозможно было количественно определить образцы с GI-положительным статусом NoV из-за того, что на момент исследования стандартная кривая для этой геногруппы не была доступна.

Молекулярные характеристики.

Для синтеза кДНК проводили обратную транскрипцию (RT) с использованием случайного праймера [pd (N) 6] (Amersham Bioscience, Hilden, Германия) с набором обратной транскриптазы SuperScript ™ II (Invitrogen). Образцы с положительными результатами либо RT-qPCR, либо EIA были подвергнуты полугнездовой ПЦР для получения продукта для дальнейшего нуклеотидного секвенирования с использованием праймеров Mon 431 и G2SKR, которые нацелены на соединение ORF1-2 в первом раунде (~ 557 п.н.).Во втором раунде использовали праймеры COG2F и G2SKR, которые нацелены на C-область капсида NoV (~ 390 п.н.). Образцы, положительные по EIA NoV, также подвергали скринингу на GI с использованием полугнездовой ПЦР с праймерами Mon432 / G1SKR (первый цикл) и COG1F / G1SKR (второй цикл), генерируя ампликон размером ~ 543 п.н. и ~ 376 п.н. соответственно. Очищенные ампликоны секвенировали в обоих направлениях с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ^® (v. 3.1) и секвенатора модели ДНК ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems).

Филогенетический и рекомбинационный анализ.

Полученные последовательности сравнивали с другими доступными в базе данных GenBank с помощью инструмента Blast (NCBI) и затем отправляли в Genbank. Выравнивание последовательностей проводили с использованием программы AliView [18] с прототипами / эталонными штаммами. Выбор модели замещения и построение филогенетических дендрограмм были выполнены с помощью программного обеспечения IQtree [19, 20] с использованием вывода максимального правдоподобия и режима сверхбыстрой начальной загрузки с 1000 повторениями.В качестве моделей замещения использовали: K2P + G4 (дендрограммы парных образцов с соединением и областью капсида) и HKY + G4 (дендрограмма области C капсид-фекальных образцов). Редактирование дендрограмм производилось с помощью программы FigTree v.1.4.3 [21].

Чтобы оценить возможное событие рекомбинации, последовательности эталонных штаммов, полученные из GenBank, и последовательности из области соединения ORF1-ORF2 были проанализированы в программе SimPlot (v.3.5.1) [22]. В анализе использовались настройки программы по умолчанию с эволюционным расстоянием двух параметров Кимуры.

Статистический анализ конкретных симптомов и возрастной группы.

Статистический анализ выполнен с помощью программы BioEstat v.5.3 [23]. Тест Манна-Уитни (U-тест) использовался для оценки разницы вирусной нагрузки в обеих группах пациентов (с и без NoV в сыворотке), а также вариаций, представленных одними и теми же группами для каждого из шести клинических симптомов: продолжительность госпитализации и время болезни (количество дней), продолжительность диареи и рвоты (количество дней), количество эпизодов диареи и рвоты (в день).Связь между инфекцией NoV и возрастной группой анализировалась с помощью теста хи-квадрат. Чтобы оценить взаимосвязь между увеличением возрастной группы и уменьшением случаев AGE к NoV в обеих группах, использовался критерий хи-квадрат.

Результаты

Всего было получено 445 парных образцов (сыворотка и стул от одного и того же пациента). В целом положительный результат ИФА 24,3% (108/445) наблюдался в образцах стула у детей. Кроме того, NoV-РНК была обнаружена в сыворотке 22 (20.4%) из 108 детей, стул которых был положительным по данным EIA.

Анализ по возрастным группам

Гастроэнтерит, связанный с норовирусом, наблюдался во всех возрастных группах с более высокой положительной реакцией у младенцев от 0 до 36 месяцев (рис. 1). Вирусная РНК была обнаружена в сыворотке крови пациентов в возрасте от 0 до 48 месяцев, с наибольшей долей среди детей в возрасте от 6 до 24 месяцев (72,7% — 16/22). Кроме того, с возрастом снижалось количество гастроэнтеритов, связанных с NoV (p = 0.0059). Тот же анализ был проведен с использованием только группы РНКемии, и он также показал обратно пропорциональную зависимость между возрастом и возникновением РНКемии (p = 0,0211). Несмотря на более высокую положительность, зарегистрированную среди детей в возрасте от 6 до 12 месяцев, статистической значимости не наблюдалось (раздел критерия хи-квадрат, p = 0,0840) (рис. 1).

Рис. 1. Распределение по возрастным группам пациентов с положительной реакцией на норовирус в образцах сыворотки / стула, взятых у детей, госпитализированных по поводу острого гастроэнтерита в городе Белен, Пара, Бразилия, с марта 2012 г. по июнь 2015 г.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763.g001

Клинические проявления и вирусная нагрузка

Было проанализировано шесть различных клинических параметров. Статистически значимая взаимосвязь наблюдалась между временем госпитализации и наличием РНК в сыворотке пациентов ( p = 0,0252) и вирусной нагрузкой с возникновением РНКемии ( p <0,0001). По остальным параметрам статистической значимости не было (таблица 1).

Таблица 1. Клинические симптомы и параметры вирусной нагрузки у норовирус-положительных пациентов с РНКемией и без нее от детей, госпитализированных по поводу острого гастроэнтерита в Белене, Бразилия, с марта 2012 г. по июнь 2015 г.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763.t001

Временное распределение случаев и генотипов

В апреле и мае 2012 г. NoV-положительность составляла 100%, а в феврале 2013 г., мае, сентябре и октябре 2014 г. и марте 2015 г. — около 50% (рис. 2).На протяжении всего периода наблюдения наблюдалось широкое разнообразие генотипов NoV с циркуляцией 11 различных генотипов, большинство из которых принадлежало к генотипу GII (9/11) и только два — к GI. Кроме того, преобладание генотипа GII.4 было очевидным в течение периода исследования, особенно варианта Sydney 2012, обнаруженного с апреля 2012 г.

Рис. 2. Ежемесячная частота положительности норовируса и временное распределение генотипов в образцах стула от детей, госпитализированных по поводу острого гастроэнтерита в городе Белен, Бразилия, с марта 2012 г. по июнь 2015 г.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763.g002

Значения RT-qPCR

Количественная оценка генома NoV с помощью RT-qPCR показала значения в диапазоне от 1,8×10 ² до 7,2×10 ⁵ геномных копий на мл сыворотки, тогда как в стуле самая низкая вирусная нагрузка составляла 6,6×10 ³ , а самая высокая была 5,4х10 ¹¹ копий на грамм (рис 3). Было замечено, что количество вирусного генома, определенное количественно в стуле пациентов, у которых не было РНК в сыворотке, было в среднем меньше, чем в группе, которая имела обнаруживаемые вирусные геномы в сыворотке ( p <0.0001).

Рис. 3. Количественная оценка вирусной нагрузки с помощью RT-qPCR в образцах сыворотки и стула от случаев норовирусной инфекции у детей, госпитализированных по поводу острого гастроэнтерита в городе Белен, Пара, Бразилия, с марта 2012 г. по июнь 2015 г.

Красные точки обозначают положительные образцы сыворотки, синие точки обозначают положительные образцы стула без РНКемии, а зеленые точки обозначают положительные образцы стула с присутствием РНК в сыворотке.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763.g003

Филогенетическая характеристика

Семьдесят пять процентов (81/108) образцов кала, положительных по вирусу, и 45,4% (10/22) положительных образцов сыворотки были секвенированы. Преобладающим генотипом был GII.4 (77,8% 63/81), включая наличие двух вариантов (New Orleans_2009 и Sydney_2012) (рис. 4). Кроме того, были обнаружены восемь других генотипов, принадлежащих к геногруппе GII, четыре из которых оказались рекомбинантными штаммами (GII.P7 / GII.6, GII.P13 / GII.17, GII.P22 / GII.5 и GI.Pb / GI.6). Все последовательности, полученные из сывороток, были охарактеризованы как GII.4 и имели 100% нуклеотидную идентичность с парными образцами фекалий (рис. 5). Все последовательности, полученные в этом исследовании, были отправлены в Genbank (номера доступа: KC165031-KC165052; MG023175 -MG023246). Для получения дополнительной информации см. Таблицу S1.

Рис. 4. Филогенетическая кладограмма, полученная с помощью теста максимального правдоподобия с использованием частичных нуклеотидных последовательностей (360 п.н.) области C капсида штаммов норовируса, полученных из стула 47 детей, госпитализированных по поводу острого гастроэнтерита в двух клиниках города Белен, Бразилия. , с марта 2012 г. по июнь 2015 г.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763.g004

Рис. 5. Филогенетическая кладограмма, полученная с помощью теста максимального правдоподобия с использованием частичных нуклеотидных последовательностей (360 п.н.) из области C штаммов норовируса из 10 парных образцов сыворотки и фекалии детей, госпитализированных по поводу острого гастроэнтерита в двух клиниках города Белен, Бразилия, с марта 2012 г. по июнь 2015 г.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763.g005

Рекомбинационный анализ

Анализ потенциальной рекомбинации с помощью Simplot (v.3.5.1) программа выявила наличие точек разрыва в области соединения между полимеразой и областями вирусного капсида в шести образцах: GII.P7 / GII.6 (n = 3), GII.P22 / GII.5 (n = 2 ) и GII.P13 / GII.17 (n = 1) (рис. 6). Образец, принадлежащий к геногруппе GI (GI.Pb / GI.6), также показал подозрение на рекомбинацию, подтвержденное с помощью теста BootScan, выполненного в программе Simplot [22].

Рис. 6.

Анализ Simplot перекрывающейся последовательности ORF1-ORF2 (530 п.н.) штаммов VIR613F (MG023180) / VIR699F (MG023186) / VIR715F (MG023183) (a), VIR554F (MG023184) (MG023184) (MG023188) (MG69188) (MG023188) б), VIR 138F (MG023190) (в), VIR 560 (MG023187) (г).Анализ проводили с использованием стандартных параметров программы с размером окна 200 п.н., размером шага 20 п.н. и с моделью Кимуры (2-параметрическая). Инвентарные номера прототипов, использованных в анализах, были следующими: GII.P13 / GII.13 (EU921354.2), GII.17 / GII.17 (AY502009.1), GII.P22 / GII.22 (AB233471). , GII.P5 / GII.5 (AF397156), GII.P7 / GII.7 (JQ751043), GII.P6 / GII.6 (AB039778), GI.Pb / GI.6 (AB081723), GI.6 / GI .6 (AF093797), GI.Pb / GI.6 (AB354289). Ось y указывает сходство нуклеотидной последовательности между рекомбинантной последовательностью и эталонными штаммами.Ось ординат указывает положение нуклеотида.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763.g006

Обсуждение

Общая положительная реакция на NoV в нашем исследовании (24,3%) была аналогична показателю в китайском исследовании (26,9%) с образцами, взятыми у детей с диареей, собранными в период с 2010 по 2013 год [24]. Более того, в исследовании, проведенном в Квебеке, Канада, во время постротавирусного периода внедрения вакцины, образцы фекалий были собраны в период с февраля 2012 года по май 2014 года, в период, аналогичный тому, что было в нашем исследовании, в результате чего уровень позитивности к NoV составил 25.5%, также как и у нас [25].

Эпиднадзорные исследования на базе больниц, проведенные ранее в Порту-Велью, Рондония, Северная Бразилия, в период с февраля 2010 г. по февраль 2012 г., показали, что у детей младше шести лет, госпитализированных, положительная реакция на NoV составила лишь 7,8% [26]. Напротив, в период с 2008 по 2011 год в Белене, штат Пара, был зарегистрирован более высокий уровень позитивности к новообразованию (35,4%), а также в когорте детей в возрасте до пяти лет, госпитализированных по поводу острого гастроэнтерита [27].

Нам удалось обнаружить РНК NoV у 20.4% (22/108) сывороток наших исследуемых детей, что выше, чем в предыдущих исследованиях в США и Японии, где показатели РНКемии составляли 6,3% (11/176) и 15,4% (6/39). найдено соответственно [13, 28]. Кроме того, во Франции среди педиатрических пациентов, страдающих синдромами иммунодефицита, был обнаружен более высокий уровень РНКемии NoV — 25% [8].

Следует отметить, что в недавнем исследовании Lemes et al. [9] в Бразилии с участием пациентов, перенесших трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток, было обнаружено, что у шести из десяти пациентов развилась инфекция NoV, у одного из которых была сопутствующая РНКемия.В этом исследовании было обнаружено, что все штаммы NoV принадлежат к геногруппе GI, в отличие от результатов нашего исследования в Белене и других исследований в других местах, где все положительные образцы сыворотки были GII [13, 28]. При сравнении последовательностей штаммов NoV в парных (от одного пациента) образцах фекалий и сыворотки в настоящем исследовании наблюдали 100% нуклеотидное сходство, что подтверждает гипотезу о том, что внекишечное кровообращение происходит только после первичной инфекции в кишечнике. Стоит отметить, что настоящее исследование является первым проведенным в Бразилии исследованием виремии NoV у детей с диареей без других сопутствующих заболеваний с использованием большого количества образцов в исследовании.

Было замечено, что вирусная нагрузка, обнаруженная в сыворотке крови пациентов, была значительно ниже, чем вирусная нагрузка в стуле. Интересно, что наблюдалась положительная корреляция между вирусной нагрузкой в ​​кале и вероятностью развития у пациента РНКемии (p <0,0001), хотя это не наблюдалось в исследованиях, проведенных в других местах [13]. Вероятно, это связано с тем, что большее повреждение тканей приводит к большей вероятности экстравазации вирусных частиц в кровеносные сосуды.

Мы стремились оценить тяжесть клинических симптомов у пациентов с NoV-положительным стулом, с РНКемией или без нее. Было замечено, что пациенты с NoV-РНКемией имели более длительное пребывание в больнице, что считалось показателем большей клинической тяжести заболевания, что контрастирует с данными Huhti et al. [28], которые не обнаружили значительных клинических различий при сравнении пациентов с РНК NoV в сыворотке или без нее. Примечательно, что в нашем исследовании более серьезная клиническая тяжесть наблюдалась у пациентов с более высокой вирусной нагрузкой в ​​стуле (таблица 1).

Результаты нашего исследования, показывающие, что наибольшая доля РНКемии наблюдалась среди детей в возрасте от шести до двенадцати месяцев, соответствуют результатам исследования Huhti et al. [28]. В связи с этим данные обоих исследований предполагают, что распространение NoV в кровоток может быть связано с более тяжелой первой инфекцией NoV в этой возрастной группе, возможно, в результате отлучения от груди и, следовательно, отсутствия естественной защиты, обеспечиваемой материнским молоком. и антитела. В подтверждение этого Huhti et al.[28] также продемонстрировали тенденцию к снижению частоты РНКемии с увеличением возраста. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы сделать какой-либо твердый вывод об этой возможной связи между РНКемией при инфекции NoV и возрастной группой. Принимая во внимание положительные результаты только по стулу, самый высокий уровень выявления наблюдался среди детей в возрасте от шести до двенадцати месяцев (25,6%), несмотря на то, что NoV циркулировал во всех оцениваемых возрастных группах (от 0 до> 60 месяцев). Эти данные отличались от данных, описанных Chen et al.[29], где наибольшее количество случаев было среди пациентов в возрасте от 13 до 24 месяцев (16,7%).

В нашем исследовании было обнаружено, что инфекции NoV возникают круглый год, а пик заболеваемости приходится на сезон дождей в нашем регионе. Однако два пика позитива наблюдались в недождливые месяцы (сентябрь и октябрь 2014 г.). В Рио-де-Жанейро, Бразилия, в 2004 г. Виктория и др. Наблюдали совершенно иную картину. [30], где инфекции NoV происходили относительно высокими темпами в засушливые и влажные сезоны, включая февраль, май, сентябрь и октябрь.Как сообщили Raboni et al., В настоящем исследовании не удалось определить сезонную закономерность. [31] в исследовании, проведенном в юго-восточном регионе Бразилии, сезоны которого определены лучше, чем на севере страны, и где этот вирус был обнаружен в основном в июне, августе и сентябре.

Как наблюдалось в других исследованиях, включая образцы стула, собранные в период, аналогичный нашему, частичное генотипирование положительных образцов продемонстрировало высокий уровень обнаружения NoV GII.4 [32, 33].Вторым наиболее распространенным циркулирующим генотипом оказался GII.6, который регистрировался с низкой частотой в других странах [34, 35], но, по-видимому, часто встречается в Манаусе-Амазонасе, как описано Hernandez et al., 2018 [ 36].

Особый интерес в нашем исследовании вызвало обнаружение очень необычного рекомбинантного штамма GII.P13 / GII.17 в образце стула от двухлетнего ребенка, взятом в январе 2013 года. В литературе мало данных об этой линии. Этот рекомбинантный штамм имел высокую гомологию последовательностей (> 97%) с восемью другими GII.Штаммы P13 / GII.17 обнаружены в других странах, включая Республику Камерун (JF802507), Францию ​​(EF529741 / 42), Китай в 2007 г. (JQ751044) и Россию в 2005 г. (FJ383845-98,2%). Кроме того, рекомбинантный штамм, возникший в нашем исследовании в Белене, на 98,6% идентичен единственному штамму GII.P13 / GII.17 (KR074153), ранее обнаруженному в Бразилии в 2006 г. [37]. В нашем исследовании второй рекомбинантный штамм со специфичностью к линии GI.Pb / GI.6 был обнаружен в 2004 году в стуле 4-летнего ребенка. Этот штамм имел 99% нуклеотидного сходства с другим GI.Pb / GI.6 извлекается из кишечного содержимого крыс, отловленных в сточных водах в Дании [38]. При отправке наших последовательностей (VIR560F) в GenBank мы также обнаружили, что наш штамм GI.Pb / GI.6 имел 99,4% попарную идентичность с двумя образцами (KP963774 и 75), обнаруженными в 2014 году в Рио-де-Жанейро, Бразилия.

Мы считаем, что одним из ограничений настоящего исследования было то, чтобы анализировать только пациентов с симптомами. Кроме того, мы использовали в качестве критерия включения, что у пациента был по крайней мере три жидкого или жидкого стула в день для характеристики диареи, как рекомендовано ВОЗ [39], критерий, который, возможно, подразумевал выявление менее тяжелых случаев.Другой способ — использование EIA для скрининга кала на NoV вместо количественной ПЦР (qPCR), которая использовалась только для количественного определения образцов, положительных по вирусу. Однако предыдущие исследования, проведенные с образцами, собранными в регионе Амазонки, продемонстрировали хорошую эффективность метода EIA, получение более высоких показателей положительности, а также обнаружение необычных рекомбинантных штаммов и возникающих вариантов [36, 40–45].

Выводы

Настоящее исследование расширило наши знания о роли инфекции NoV как причины детского гастроэнтерита в Белене, Бразилия, особенно в отношении особенностей молекулярной эпидемиологии.Высокая (~ 25%) доля инфекций NoV среди детей, госпитализированных по поводу гастроэнтерита в Белене, Бразилия, подчеркивает его роль в качестве основного энтеропатогена при внедрении постротавирусной вакцины. Относительно высокая доля (~ 20%) РНКемии среди детей с NoV-положительным стулом предполагает, что распространение NoV за пределы кишечника может быть обычным явлением, даже несмотря на то, что никаких явных внекишечных клинических проявлений не наблюдалось. Наши результаты подтверждают мнение о том, что РНКемия может быть связана с более длительным пребыванием в больнице (p = 0.0252), а также предположили, что РНКемия может коррелировать с более высокой вирусной нагрузкой в ​​стуле. Все эти данные подтверждают необходимость получения вакцины против этого вируса.

Хотя среди циркулирующих штаммов NoV в Белене, Бразилия, можно было выявить широкое генетическое разнообразие, штамм GII.4 Sydney 2012 явно доминировал. Наконец, обнаружение штаммов со специфичностью к линии GII.P13 / GII.17 и GI.Pb / GI.6 предполагает, что события рекомбинации могут в конечном итоге происходить при инфекциях человека NoV.

Вспомогательная информация

S1 Таблица. Последовательности образцов кала и сыворотки крови детей с острым гастроэнтеритом из Белен, Пара, Бразилия (2012–2015 гг.), С соответствующими номерами доступа, генотипами и секвенированными участками генома.

Приведенные ниже последовательности были использованы при построении рисунков 4, 5 и 6 настоящего исследования.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199763.s001

(DOCX)

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Яна Лима, Джермано Нето, Таяра Мораис, Джонса Сикейра за ценную техническую поддержку, сотрудников Лаборатории вирусного гастроэнтерита Института Эвандро Шагаса.Благодарим Мирлейде Сантос и Родриго Баррос за их техническую поддержку при проведении анализа RT-qPCR. Особая благодарность всем младенцам, их семьям и медицинским работникам (врачам и студентам), которые добровольно согласились принять участие в этом исследовании. Мы также благодарны Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas do Pará (FAPESPA) за стипендию, предоставленную автору Тэмми Реймау во время ее получения степени магистра по программе последипломного образования в области вирусологии Института Эвандро Шагаса. Особая благодарность CNPq — Министерству науки, технологий, инноваций и коммуникаций и Институту Эвандро Шагаса, секретарю по надзору за здоровьем Министерства здравоохранения, которые поддержали это исследование.

Ссылки

1. 1.
   Walker CL, Rudan I, Liu L, Nair H, Theodoratou E, Bhutta ZA и др. Глобальное бремя детской пневмонии и диареи. Ланцет. 2013. 381 (9875): 1405–16. pmid: 23582727
2. 2.
   Чжэн Д.П., Виддоусон М.А., Гласс Р.И., Винже Дж. Молекулярная эпидемиология норовирусов геногруппы II-генотип 4 в Соединенных Штатах в период с 1994 по 2006 год. J Clin Microbiol. 2010. 48 (1): 168–77. pmid: 19864482
3. 3.
   Payne DC, Vinjé J, Szilagyi PG, Edwards KM, Staat MA, Weinberg GA и др.Норовирус и медицинский гастроэнтерит у детей в США. N Engl J Med. 2013. 368 (12): 1121–30. pmid: 23514289
4. 4.
   Лопман Б.А., Стил Д., Кирквуд К.Д., Парашар Ю.Д. Обширное и разнообразное глобальное бремя норовируса: перспективы профилактики и контроля. PLoS Med. 2016; 13 (4): e1001999. pmid: 27115709
5. 5.
   Патель М.М., Уиддоусон М.А., Гласс Р.И., Акадзава К., Виндже Дж., Парашар Ю.Д. Систематический обзор литературы о роли норовирусов в спорадическом гастроэнтерите.Emerg Infect Dis. 2008. 14 (8): 1224–31. pmid: 18680645
6. 6.
   KY G. Caliciviridae : Норовирусы. В: Knipe DM HP, Cohen JL, Griffin DE, Lamb RA, Martin MA, Racaniello VR, редактор. Области вирусологии. Шестое изд. Филадельфия, Пенсильвания: Липпинкотт Уильямс и Уилкинс; 2013. с. 582–608.
7. 7.
   Кронеман А., Вега Е., Веннема Х, Винже Дж., Уайт П.А., Хансман Г. и др. Предложение по единой номенклатуре и генотипированию норовирусов. Arch Virol. 2013. 158 (10): 2059–68.pmid: 23615870
8. 8.
   Френдж П., Тузо Ф., Дебре М., Эритье С., Леруэс-Вилль М., Крос Дж. И др. Распространенность и клиническое влияние фекального выделения норовируса у детей с наследственной иммунной недостаточностью. J Infect Dis. 2012. 206 (8): 1269–74. pmid: 22872736
9. 9.
   Lemes LG, Corrêa TS, Fiaccadori FS, Cardoso D, Arantes AeM, Souza KM и др. Проспективное исследование норовирусной инфекции среди реципиентов аллогенных стволовых клеток: пролонгированная вирусная экскреция и вирусная РНК в крови.J Clin Virol. 2014. 61 (3): 329–33. pmid: 25171964
10. 10.
    (CDC) CfDCaP. Вспышка острого гастроэнтерита, связанного с норволк-подобными вирусами, среди британских военнослужащих — Афганистан, май 2002 г. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2002; 51 (22): 477–9. pmid: 12064451
11. 11.
    Ито С., Такешита С., Нэдзу А., Айхара Й., Усуку С., Ногучи Ю. и др. Энцефалопатия, связанная с норовирусом. Pediatr Infect Dis J. 2006; 25 (7): 651–2. pmid: 16804441
12. 12.
    Стюарт Р.Л., Тан К., Махар Дж. Э., Кирквуд С.Д., Эндрю Рамсден С., Андрианопулос Н. и др.Вспышка некротического энтероколита, связанного с генотипом норовируса GII.3. Pediatr Infect Dis J. 2010; 29 (7): 644–7. pmid: 20589982
13. 13.
    Таканаши С., Хашира С., Мацунага Т., Ёсида А., Сиота Т., Тунг П.Г. и др. Обнаружение, генетическая характеристика и количественная оценка РНК норовируса в сыворотке крови детей с гастроэнтеритом. J Clin Virol. 2009. 44 (2): 161–3. pmid: 19131272
14. 14.
    Fumian TM, Justino MC, D’Arc Pereira Mascarenhas J, Reymão TK, Abreu E, Soares L, et al.Количественный и молекулярный анализ РНК норовирусов в крови детей, госпитализированных по поводу острого гастроэнтерита в Белене, Бразилия. J Clin Virol. 2013; 58 (1): 31–5. pmid: 23886502
15. 15.
    Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Быстрый и простой метод очистки нуклеиновых кислот. J Clin Microbiol. 1990. 28 (3): 495–503. pmid: 1691208
16. 16.
    das Dôres de Paula Cardoso D, Fiaccadori FS, Borges de Lima Dias e Souza M, Bringel Martins RM, Gagliardi Leite JP.Обнаружение и генотипирование астровирусов у детей с острым гастроэнтеритом из Гоянии, Гояс, Бразилия. Med Sci Monit. 2002; 8 (9): CR624–8. pmid: 12218943
17. 17.
    Кагеяма Т., Кодзима С., Шинохара М., Учида К., Фукуши С., Хосино Ф. Б. и др. Широкореактивный и высокочувствительный анализ на норволк-подобные вирусы, основанный на количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. J Clin Microbiol. 2003. 41 (4): 1548–57. pmid: 12682144
18. 18.
    Larsson A. AliView: быстрый и легкий просмотрщик и редактор выравнивания для больших наборов данных.Биоинформатика. 2014. 30 (22): 3276–8. pmid: 25095880
19. 19.
    Minh BQ, Nguyen MA, von Haeseler A. Сверхбыстрая аппроксимация для филогенетического бутстрапа. Mol Biol Evol. 2013; 30 (5): 1188–95. pmid: 23418397
20. 20.
    Нгуен LT, Шмидт HA, фон Хезелер A, Minh BQ. IQ-TREE: быстрый и эффективный стохастический алгоритм для оценки филогении максимального правдоподобия. Mol Biol Evol. 2015; 32 (1): 268–74. pmid: 25371430
21. 21.
    Р. ФигТри. Инструмент рисования древовидных фигур версии 1.4.2. Эдинбургский университет: Институт эволюционной биологии; 2006–2014 [http://tree.bio.ed.ac.uk/].
22. 22.
    Лоле К.С., Боллинджер Р.С., Паранджапе Р.С., Гадкари Д., Кулькарни С.С., Новак Н.Г. и др. Полноразмерные геномы вируса иммунодефицита человека типа 1 из сероконвертеров, инфицированных подтипом С, в Индии, с доказательствами межподтипной рекомбинации. J Virol. 1999. 73 (1): 152–60. pmid: 9847317
23. 23.
    Эйрес М.М., Эйрес Д.Л., Сантос ААС. BioEstat: Aplicações estatísticas nas áreas de ciências biomédicas.Белен, Пара, Бразилия: Sociedade Civil Mamirauá MCT – CNPQ; 2007.
24. 24.
    Fu JG, Ai J, Zhang J, Wu QB, Qi X, Ji H и др. Молекулярная эпидемиология норовирусной инфекции геногруппы II среди госпитализированных детей с острым гастроэнтеритом в Сучжоу (Цзянсу, Китай) с 2010 по 2013 год. J Med Virol. 2016; 88 (6): 954–60. pmid: 26547266
25. 25.
    Doll MK, Gagneur A, Tapiéro B, Charest H, Gonzales M, Buckeridge DL, et al. Временные изменения при детском гастроэнтерите после вакцинации против ротавируса в Квебеке.Pediatr Infect Dis J. 2016; 35 (5): 555–60. pmid: 26855410
26. 26.
    Amaral MS, Estevam GK, Penatti M, Lafontaine R, Lima IC, Spada PK и др. Распространенность норовируса, астровируса и аденовирусной инфекции среди госпитализированных детей с острым гастроэнтеритом в Порту-Велью, штат Рондония, западная бразильская Амазонка. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2015; 110 (2): 215–21. pmid: 25946245
27. 27.
    Siqueira JA, Linhares AaC, Gonçalves MoS, Carvalho TC, Justino MC, Mascarenhas JD, et al.Ротавирус и норовирус группы А демонстрируют резко разные сезонные профили в Белене, северная Бразилия. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2013; 108 (5): 661–4. pmid: 235
28. 28.
    Хухти Л., Хемминг-Харло М., Весикари Т. Обнаружение норовируса из сывороток маленьких детей с острым норовирусным гастроэнтеритом. J Clin Virol. 2016; 79: 6–9. pmid: 27043968
29. 29.
    Chen CJ, Wu FT, Huang YC, Chang WC, Wu HS, Wu CY и др. Клинические и эпидемиологические особенности тяжелого вирусного гастроэнтерита у детей: трехлетнее наблюдение, многоцентровое исследование на Тайване с частичной иммунизацией против ротавируса.Медицина (Балтимор). 2015; 94 (33): e1372.
30. 30.
    Виктория М., Карвалью-Коста Ф.А., Хайнеманн М.Б., Лейте Дж. П., Мягостович М. Распространенность и молекулярная эпидемиология норовирусов у госпитализированных детей с острым гастроэнтеритом в Рио-де-Жанейро, Бразилия, 2004 г. Pediatr Infect Dis J. 2007; 26 (7): 602–6. pmid: 17596802
31. 31.
    Raboni SM, Damasio GA, Ferreira CE, Pereira LA, Nogueira MB, Vidal LR, et al. Острый гастроэнтерит и кишечные вирусы у госпитализированных детей на юге Бразилии: этиология, сезонность и клинические исходы.Mem Inst Oswaldo Cruz. 2014. 109 (4): 428–35. pmid: 25075782
32. 32.
    Кумадзаки М., Усуку С. Генетический анализ штаммов вариантов норовируса GII.4, выявленных во время вспышек гастроэнтерита в Иокогаме, Япония, с сезонов 2006–2007 гг. По 2013–2014 гг. PLoS One. 2015; 10 (11): e0142568. pmid: 26544040
33. 33.
    Чжан Дж., Шен З., Чжу З., Чжан В., Чен Х, Цянь Ф и др. Распределение генотипов норовируса вокруг появления Sydney_2012 и антигенный дрейф современного GII.4 эпидемических штамма. J Clin Virol. 2015; 72: 95–101. pmid: 26476326
34. 34.
    Рахман М., Рахман Р., Нахар С., Хоссейн С., Ахмед С., Голам Фарук А.С. и др. Норовирусная диарея в Бангладеш, 2010–2014 гг .: распространенность, клинические особенности и генотипы. J Med Virol. 2016; 88 (10): 1742–50. pmid: 27003679
35. 35.
    Манс Дж., Мюррей Т.Ю., Надан С., Нетшиквета Р., Пейдж Н.А., Тейлор МБ. Разнообразие норовирусов у детей с гастроэнтеритом в Южной Африке с 2009 по 2013 г .: преобладают варианты GII.4 и рекомбинантные штаммы.Epidemiol Infect. 2016; 144 (5): 907–16. pmid: 26374265
36. 36.
    Эрнандес Дж. М., Силва Л. Д., Джуниор ЭКС, Бандейра Р.С., Родригес ЕАМ, Лусена М.С. Молекулярная эпидемиология и временная эволюция норовируса, связанного с острым гастроэнтеритом в штате Амазонас, Бразилия. BMC Infect Dis. 2018; 18 (1): 147. pmid: 29606095
37. 37.
    Fumian TM, da Silva Ribeiro de Andrade J, Leite JP, Miagostovich MP. Рекомбинантные штаммы норовируса, выделенные в результате вспышек гастроэнтерита в южной части Бразилии, 2004–2011 гг.PLoS One. 2016; 11 (4): e0145391. pmid: 27116353
38. 38.
    Вольф С., Ритц Дж., Джон Р., Хейберг А.С., Петри С., Каниг Х. и др. Одновременное появление норовируса человека и вируса гепатита Е у норвежской крысы (Rattus norvegicus). Arch Virol. 2013. 158 (7): 1575–8. pmid: 23443935
39. 39.
    Всемирная организация здравоохранения [http://www.who.int]. Информационный бюллетень — Диарейное заболевание, 2017 г. [Дата обращения: 05 июня 2018 г.] Доступно по адресу: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/diarrhoeal-disease.
40. 40.
    Aragão GC, Mascarenhas JD, Kaiano JH, de Lucena MS, Siqueira JA, Fumian TM, et al. Разнообразие норовирусов у детей с диареей из поселения потомков африканцев в Белене, Северная Бразилия. PLoS One. 2013; 8 (2): e56608. pmid: 23457593
41. 41.
    Costa STPD Fumian TM, Lima ICG Siqueira JAM, Silva LDD Hernández JDM, et al. Высокая распространенность норовируса у детей со спорадическим острым гастроэнтеритом в Манаусе, регион Амазонки, северная Бразилия. Mem Inst Oswaldo Cruz.2017; 112 (6): 391–5. pmid: 28591398
42. 42.
    Portal TM, Siqueira JA, Costa LC, Lima IC, Lucena MS, Bandeira RaS и др. Калицивирусы у госпитализированных детей, Сан-Луис, Мараньян, 1997–1999: обнаружение норовируса GII.12. Braz J Microbiol. 2016; 47 (3): 724–30. pmid: 27161199
43. 43.
    Siqueira JA, Linhares AaC, Oliveira DeS, Soares LaS, Lucena MS, Wanzeller AL, et al. Оценка иммуноферментного анализа третьего поколения RIDASCREEN для обнаружения антигенов норовируса в образцах стула госпитализированных детей в Белене, Пара, Бразилия.Диагностика Microbiol Infect Dis. 2011. 71 (4): 391–5. pmid: 22001621
44. 44.
    Siqueira JAM, Bandeira RDS, Oliveira DS, Dos Santos LFP, Gabbay YB. Разнообразие генотипов и молекулярная эволюция норовирусов: 30-летнее (1982–2011 гг.) Всестороннее исследование с участием детей из Северной Бразилии. PLoS One. 2017; 12 (6): e0178909. pmid: 28604828
45. 45.
    Сильва Л.Д., Родригес Е.Л., Лусена М.С., Лима И.К., Оливейра ДеС, Соарес Л.С. и др. Обнаружение пандемического варианта норовируса GII.4 Сидней 2012 г. в Рио-Бранко, штат Акко, северная Бразилия.Mem Inst Oswaldo Cruz. 2013; 108 (8): 1068–70. pmid: 24141954

Департамент здравоохранения | Глава 2: Предпосылки

2.1 Характеристики норовируса

2.1.1 История болезни

Гастроэнтерит, который, вероятно, был вызван норовирусом, был впервые описан Загорским в 1929 году как «зимняя рвота». Однако агент не был идентифицирован до 1972 года, когда вирусные частицы были впервые визуализированы с помощью электронной микроскопии (ЭМ) в фекалиях, полученных во время вспышки.Вспышка произошла в 1968 году в школе в Норуолке, штат Огайо, США, с высоким уровнем заболеваемости среди учащихся и учителей. Заболевание характеризовалось тошнотой, рвотой и диареей с продолжительностью болезни 12–24 часа [12].

В Австралии первая подтвержденная вспышка норовируса произошла в 1978 г. и была связана с употреблением устриц [13]. Вспышка затронула людей по всей Австралии, и норовирус был подтвержден как причина при визуализации вирусных частиц в фекалиях пациентов с помощью ЭМ и иммуно-ЭМ [13, 14].Эта вспышка была одной из первых зарегистрированных вспышек норовируса пищевого происхождения [13].

Открытие вируса с помощью ЭМ было важно, потому что это был первый обнаруженный вирус, который был специфически связан со случаями острого гастроэнтерита. На протяжении десятилетий роль вируса как возбудителя болезни сдерживалась нечувствительностью микробиологической диагностики. Его нельзя выращивать в культуре клеток, и нет модели на мелких животных. Единственная альтернатива — тестирование на добровольцах [12].С 1970-х годов вирусы были известны как «Norwalk-подобные вирусы» (NLV) и «Small Round Structured Viruses» (SRSV). Ранние названия этих вирусов определялись местом обнаружения каждого штамма (например, Гавайи, Норуолк) или их физическим внешним видом, визуализированным с помощью ЭМ [15, 16].

В 2002 году норовирус стал официальным названием рода после дальнейшего исследования вирусной систематики с помощью чувствительных молекулярных методов. Улучшение диагностических методов позволило быстро распознать возбудителя вспышек и изменило понимание клинического значения и эпидемиологии этого вируса [17].

2.1.2 Вирусология

Норовирусы (семейство Caliciviridae, род Norovirus ) представляют собой генетически разнообразную группу одноцепочечных рибонуклеиновых кислот (РНК), вирусов без оболочки. Геном РНК вируса состоит примерно из 7700 нуклеотидов (без учета полиаденилированного хвоста) и включает три открытые рамки считывания. Вирус при визуализации с помощью ЭМ имеет диаметр от 26 до 34 нм; маленькие, круглые, с аморфной поверхностью и рваным внешним краем (рис. 1). Открытая рамка считывания (ORF) 1 кодирует неструктурные полипротеины, включая геликазу, протеазу и РНК-зависимую РНК-полимеразу.ORF 2 кодирует вирусный капсидный белок, а ORF 3 — небольшой структурный белок [18].

К началу страницы

Рис. 1: Изображение частиц норовируса, полученное с помощью электронного микроскопа

Изображение любезно предоставлено Джоном Маршаллом

2.1.3 Таксономия

Норовирус — один из четырех родов Caliciviridae. Остальные три рода — это Lagovirus, Vesivirus и Sapovirus . Саповирус и норовирус — единственные два рода, вызывающие гастроэнтерит у человека. Норовирусы в настоящее время подразделяются на пять геногрупп, обозначенных GI-GV.Штаммы GI, GII и GIV инфицируют людей, тогда как GIII и GV обнаруживаются у свиней, крупного рогатого скота и мышей. Чаще всего известно, что геногруппы I и II инфицируют людей и вызывают вспышки острого гастроэнтерита [19]. Геногруппы включают ряд генетически и антигенно разнообразных штаммов, которые можно далее разделить на генотипы или генетические кластеры на основе анализа последовательностей. В настоящее время есть:

• восемь генотипов геногруппы I (GI): GI включает вирус Norwalk, вирус Desert Shield и вирус Southampton.
• 19 генотипов геногруппы II (GII): GII включает вирус Бристоль, вирус Лордсдейла, вирус Торонто, вирус Мексики, вирус Гавайев и вирус Снежной горы.
• два генотипа геногруппы III (GIII).

Примером GIV является Ft. Вирус Лодердейла [17].

Начало страницы

2.1.4 Молекулярная эпидемиология

Хотя большое количество штаммов норовируса одновременно циркулирует в сообществе, отдельные штаммы доминируют во всем мире в последние годы [20]. Штамм геногруппы II чаще вызывает вспышки гастроэнтерита, а штамм геногруппы II, генотип 4 (GII.4) преобладающий штамм, циркулирующий во всем мире в последние годы. О вспышках в 2006–2007 годах, вызванных новыми вариантами GII.4, сообщали агентства здравоохранения во всем мире [7]. Недавнее повышение активности было зарегистрировано в Венгрии, Германии, Японии и США [21]. Новые варианты в GII.4 совпали с высокими уровнями сообщений о вспышках во всем мире в 1996, 2002 и 2004 годах [11, 22, 23].

Обзор вспышек норовируса в США в период с 2000 по 2004 год показал, что штаммы GII.4 чаще встречаются в полузакрытых средах (например, в автобусах или самолетах), чем другие штаммы [22].Эти штаммы чаще обнаруживались в медицинских учреждениях, школах, детских садах и круизных лайнерах. Передача от человека к человеку происходила чаще, чем вспышки, связанные с пищевыми продуктами [22].

2.1.5 Симптомы

Норовирусы вызывают инфекцию пищеварительного тракта, которая проявляется острым началом диареи, спазмами в животе, тошнотой и рвотой. Рвота чаще встречается у детей, тогда как большая часть взрослых страдает диареей.Также могут возникать системные симптомы, такие как лихорадка, головная боль, миалгия, недомогание и боль в животе [24].

Средний инкубационный период обычно составляет 32 часа с диапазоном 24–48 часов, но может выходить за пределы этого диапазона (12–50 часов). Симптомы обычно проходят в течение 24–48 часов, но могут длиться от 12 до 72 часов [25]. Однако у некоторых людей симптомы могут длиться дольше, чем считалось ранее, особенно у пожилых людей и детей младшего возраста, а также у реципиентов трансплантата и людей с ослабленным иммунитетом, например, у людей, получающих иммунодепрессивную терапию, или больных иммуномодулирующими заболеваниями (например,грамм. ВИЧ) [17, 26].

Болезнь обычно проходит самостоятельно (проходит без лечения), и выздоровление проходит без каких-либо серьезных долгосрочных последствий. Однако более тяжелое клиническое заболевание наблюдается у пожилых людей и людей с другими основными заболеваниями, такими как сердечно-сосудистые заболевания, реципиенты почечного трансплантата и пациенты, получающие иммуносупрессивную терапию [17]. В этих условиях могут наблюдаться тяжелые осложнения с пониженным уровнем калия, повышенным содержанием С-реактивного белка и креатинфосфокиназы [26].Смерть у жителей АКФ может наступить в результате аспирации или обострения других хронических заболеваний [4, 27].

2.2 Эпидемиология

По оценкам, ежегодно в Австралии регистрируется 1,8 миллиона (95% достоверный интервал 1,4–2,3 миллиона) случаев норовирусной инфекции, что делает его наиболее частой причиной гастроэнтерита [28]. Норовирус встречается круглый год, но чаще встречается с конца зимы до начала лета [29, 30]. Исследование, проведенное в Мельбурне, обнаружило сезонную тенденцию, наблюдаемую в отношении случаев норовируса.Распространенность была максимальной весной (сентябрь – ноябрь) и летом (декабрь – февраль) [31]. Однако эпидемические штаммы норовируса могут приводить к вспышкам, не имеющим обычного сезонного характера [32].

Норовирус эндемичен для Австралии и поражает все возрастные группы. Анализ сывороток, собранных у пациентов, поступивших в больницу Алис-Спрингс в 1977, 1984 и 1986 годах, показал, что 96% сывороток пациентов старше двух лет и 70% сывороток пациентов до двух лет показали присутствие норовируса. антитела, предполагающие, что воздействие происходит в молодом возрасте [33].

Хотя норовирусные инфекции встречаются во всех возрастных группах, они могут быть более тяжелыми у очень молодых и пожилых людей, что приводит к госпитализации. Исследование, проведенное в Нидерландах, выявило несколько факторов риска, связанных с норовирусной инфекцией [34]. МакИвер описывает аналогичные факторы риска норовирусной инфекции [18]. К ним относятся:

• контакт с людьми или членами семьи, больными гастроэнтеритом
• пребывание в полузакрытых помещениях, таких как автобусы или самолеты, с людьми, больными гастроэнтеритом
• посещение или работа в медицинском учреждении во время вспышки
• контакт с участками, загрязненными рвотой и / или фекалиями
• потребление зараженных пищевых продуктов в результате несоблюдения правил гигиены при обращении с пищевыми продуктами или выращивания моллюсков с фильтром в загрязненной окружающей среде.

Начало страницы

2.2.1 Передача

Передача норовируса происходит различными путями, но в основном от человека к человеку передается фекально-оральным путем, при контакте с загрязненными поверхностями и через рвотные массы в виде аэрозоля. Аэрозолизация рвотных масс может привести к загрязнению таких поверхностей, как мебель и ковры, так что вспышки болезни распространяются через загрязнение окружающей среды. Рвотные массы в аэрозольной форме, содержащие норовирус, также можно вдохнуть и проглотить. Маловероятно, что инфекция происходит через дыхательные пути, поскольку нет доказательств того, что вирус реплицируется в клетках слизистой оболочки дыхательных путей [35, 36].Передача также может происходить через употребление зараженной пищи, особенно устриц и моллюсков, или воды [24, 37].

Распространению инфекции во время вспышек способствуют специфические характеристики вируса. Низкая инфекционная доза в сочетании со способностью вируса передаваться из загрязненной среды или инфицированных людей позволяет затронуть множество людей, о чем свидетельствует распространение среди контактов и членов семьи [2]. Точно так же вирус стабилен в окружающей среде и выдерживает высокие уровни хлора, замораживание и нагревание до 600 ° C, что затрудняет его удаление из загрязненной воды, продуктов питания и поверхностей [38].Длительное выделение вируса у бессимптомных людей увеличивает риск вторичной передачи и вызывает беспокойство среди медицинских работников и лиц, занимающихся обработкой пищевых продуктов, даже после исчезновения симптомов [24]. Разнообразие штаммов и отсутствие долгосрочного иммунитета способствуют облегчению передачи и возможности возникновения вспышек [17, 39].

Вспышки возникают в различных условиях, но чаще встречаются в местах, где люди находятся в непосредственной близости, например, в учреждениях общественного питания, больницах, школах, на кораблях и в ресторанах.В этих условиях люди могут подвергаться большему риску передачи инфекции от человека к человеку. Зараженные лица, работающие с пищевыми продуктами, часто подозреваются в качестве источника вспышек болезней пищевого происхождения и могут заражать пищу до употребления в пищу [40]. Готовые к употреблению продукты, требующие обработки, но не готовые, такие как салаты, сэндвичи и выпечка, подвергаются наибольшему риску заражения [24, 41-43]. Пищевые продукты также могут быть инфицированы норовирусом перед приготовлением через фекальное загрязнение. Моллюски, в частности устрицы, являются фильтраторами, которые концентрируют микроорганизмы из загрязненной воды.Вспышки норовирусной инфекции, связанной с устрицами, случались даже тогда, когда устрицы были приготовлены на гриле [44] или приготовлены на пару, вероятно, из-за неправильного приготовления [45, 46]. Зараженная малина также была причастна к вспышкам, как и другие фрукты, глазурь для кондитерских изделий и глазурь [47, 48]

Также сообщалось о вспышках норовируса, передаваемых через воду, включая зараженную колодезную воду, лед, воду из озера, питьевую воду и воду в плавательных бассейнах. [49-54]. Вспышки передаваемых через воду норовирусов происходят, когда сточные воды загрязняют воду, которая либо используется в качестве питьевого водоснабжения, либо непреднамеренно потребляется во время рекреационных мероприятий.Норовирус устойчив к хлору в присутствии органических веществ [55], и для загрязненной воды могут потребоваться более высокие уровни хлора [56].

2.2.2 Иммунитет

Контакт с норовирусом обычно происходит в детстве, при этом распространенность антител увеличивается до более чем 50% к пятому десятилетию жизни человека. Похоже, что у людей развивается кратковременный иммунитет после инфекции, а иммунитет является штаммоспецифическим. Генетическая изменчивость циркулирующего норовируса указывает на то, что люди, вероятно, будут повторно инфицированы в течение своей жизни [57].Кратковременный иммунитет может частично объяснить высокий уровень атак во всех возрастных группах вспышки. Имеются данные, свидетельствующие о том, что предрасположенность к норовирусной инфекции основывается на антигенах гистокрови [58].

2.2.3 Период выделения и инфекционность

Предыдущие исследования на людях-добровольцах показали, что выделение вируса в стуле совпало с началом болезни и не длилось более 72 часов после появления первого симптома. Однако вирусная РНК была обнаружена с помощью молекулярных методов в течение трех недель после начала заболевания [59, 60].Исследования показали длительное выделение вируса и продолжительность заболевания из-за норовирусной инфекции, а также продемонстрировали, что выведение вируса происходит после прекращения симптомов и у инфицированных лиц без клинических симптомов [24, 61, 62]. В исследовании, проведенном в Виктории, изучали клинические симптомы и выделение норовируса среди пожилых людей во время вспышки гастроэнтерита в ACF. Исследование показало, что острые симптомы длились 3-4 дня, а среднее время выведения норовируса составляло 8,6 дня [60].Выделение вирусов не было связано с клиническими симптомами или появлением стула [60]. Аналогичным образом, исследование естественной истории калицивируса в Нидерландах показало, что норовирус встречается во всех возрастных группах, клинические симптомы сохраняются в среднем 5 дней, а образцы стула были положительными с помощью ПЦР на норовирус в течение трех недель после начала заболевания [ 25].

Продолжительное выделение вируса, симптоматическое или бессимптомное, имеет значение для передачи. Хотя бессимптомные приемы пищи могут играть важную роль в распространении болезни, значение выделения вируса при отсутствии симптомов неясно [24].Marshall et al. предполагают, что выведение норовируса бессимптомными людьми может выступать в качестве значительного потенциального инфекционного резервуара в сообществе [61].