Опн постренальная: Страница не найдена |

Страница не найдена |

Страница не найдена |

404. Страница не найдена

Архив за месяц

ПнВтСрЧтПтСбВс

      1

16171819202122

23242526272829

3031     

     12

     12

      1

3031     

     12

15161718192021

25262728293031

    123

45678910

     12

17181920212223

31      

2728293031  

      1

   1234

567891011

     12

891011121314

11121314151617

28293031   

   1234

     12

  12345

6789101112

567891011

12131415161718

19202122232425

3456789

17181920212223

24252627282930

  12345

13141516171819

20212223242526

2728293031  

15161718192021

22232425262728

2930     

Архивы

Метки

Настройки
для слабовидящих

Постренальная острая почечная недостаточность

Эта
форма ОПН обычно возникает вследствие
обструкции мочевыводящих путей (камнями,
сгустками крови, некротизированной
тканью сосочков) ниже устьев мочеточников,
наиболее часто — на уровне шейки мочевого
пузыря. Если обструкция локализована
выше, то выделительную функцию берёт
на себя непоражённая почка. Обструкция
на пути оттока мочи приводит к повышению
давления в мочеточниках и лоханках.
Острая обструкция первоначально приводит
к умеренному усилению почечного
кровотока, быстро сменяющемуся
вазоконстрикцией и снижением СКФ. ОПН
вследствие острого нарушения оттока
мочи из мочевого пузыря — самая частая
причина анурии в старческом возрасте,
у неврологических больных, а также у
больных сахарным диабетом (т.е. ОПН
возникает вследствие аденомы предстательной
железы, пузырно-мочеточникового рефлюкса,
вегетативной невропатии). Более редкие
причины постренальной ОПН — стриктуры
мочеиспускательного канала, лекарственный
ретроперитонеальный фиброз, шеечный
цистит.

Клиническая картина

Течение
ОПН традиционно делят на четыре стадии:
начальную, олигурическую, восстановления
диуреза (полиурическую) и полного
восстановления всех функций почек
(однако последняя возможна не всегда).

Начальная стадия

В
начальной стадии преобладают симптомы,
обусловленные этиологическим фактором:
шоком (болевым, анафилактическим,
инфекционно-токсическим и т.д.), гемолизом,
острым отравлением, инфекционным
заболеванием и т.д.

Олигурическая стадия

Олигурия
— выделение за сутки менее 400 мл мочи.
Совокупность гуморальных нарушений
приводит к нарастанию симптомов острой
уремии. Адинамию, потерю аппетита,
тошноту, рвоту наблюдают уже в первые
дни. По мере нарастания азотемии (обычно
концентрация мочевины в крови ежедневно
повышается на 0,5 г/л), ацидоза, гиперволемии
(особенно на фоне активных внутривенных
инфузий и обильного питья) и электролитных
нарушений появляются мышечные
подёргивания, сонливость, заторможенность,
усиливается одышка вследствие ацидоза
и отёка лёгких, раннюю стадию которого
определяют рентгенологически.

• Характерны
тахикардия, расширение границ сердца,
глухость тонов, систолический шум на
верхушке, иногда шум трения перикарда.
У части больных (20-30%) — АГ. Блокады сердца
или фибрилляция желудочков могут
привести к остановке сердца. Нарушения
ритма нередко связаны с гиперкалиемией.
При гиперкалиемии более 6,5 ммоль/л на
ЭКГ зубец Твысокий,
остроконечный, расширяется комплекс QRS,
может уменьшаться амплитуда зубца R.
Возможны инфаркт миокарда и ТЭЛА.

• Поражение
ЖКТ (боли в животе, увеличение печени)
часто отмечают при острой уремии. В
10-30% случаев регистрируют желудочно-кишечные
кровотечения из-за развития острых язв.

• Интеркуррентные
инфекции возникают в 50-90% случаев ОПН.
Высокая частота инфекций при ОПН связана
как с ослаблением иммунитета, так и
инвазивными вмешательствами (установление
артериовенозных шунтов, катетеризация
мочевого пузыря). Наиболее часто инфекция
при ОПН локализуются в мочевыводящих
путях, лёгких, брюшной полости. Острые
инфекции ухудшают прогноз больных с
ОПН, усугубляют избыточный катаболизм,
гиперкалиемию, метаболический ацидоз.
Генерализованные инфекции становятся
причиной смерти у 50% больных.

Продолжительность
олигурической стадии варьирует от 5 до
11 сут. У части больных с ОПН олигурия
может отсутствовать, например, при
воздействии нефротоксических агентов
развивается острое ухудшение почечной
функции, однако объём суточной мочи
обычно превышает 400 мл. Нарушения
азотистого обмена в этих случаях
развиваются вследствие усиленного
катаболизма.

Острая почечная недостаточность — Инновационный сосудистый центр

Острая почечная недостаточность –  потенциально обратимое, внезапно наступившее выраженное нарушение или прекращение функции почек. Характерно нарушение всех почечных функций (секреторной, выделительной и фильтрационной), выраженные изменения водно-электролитного баланса, быстро нарастающая азотемия. Почечная недостаточность ведет к выраженным нарушениям метаболических процессов в организме и без лечения приводит к смерти от остановки сердца.

Причины и факторы риска

Этиология преренальной ОПН

Преренальная ОПН может развиваться при состояниях, которые сопровождаются снижением сердечного выброса (при тромбоэмболии легочной артерии, сердечной недостаточности, аритмии, тампонаде сердца, кардиогенном шоке). Нередко причиной становится уменьшение количества внеклеточной жидкости (при диарее, дегидратации, острой кровопотери, ожогах, асците, вызванном циррозом печени). Может возникать вследствие выраженной вазодилатации, возникающей при бактериотоксическом или анафилактическом шоке.

Этиология ренальной ОПН

Возникает при токсическом воздействии на почечную паренхиму удобрений, ядовитых грибов, солей меди, кадмия, урана и ртути. Развивается при бесконтрольном приеме нефротоксичных медикаментов (противоопухолевые препараты, ряд антибиотиков и сульфаниламидов). Рентгенконстрастные вещества и перечисленные препараты, назначенные в обычной дозировке, могут стать причиной ренальной ОПН у больных с нарушением функции почек. Кроме того, данная форма ОПН возникает при циркуляции в крови большого количества миоглобина и гемоглобина (при выраженной макрогемаглобинурии, переливании несовместимой крови, длительном сдавлении тканей при травме, наркотической и алкогольной коме). Реже развитие ренальной ОПН обусловлено воспалительным заболеванием почек.

Этиология постренальной ОПН

Развивается при механическом нарушении пассажа мочи при двухсторонней обструкции мочевых путей камнями. Реже возникает при опухолях предстательной железы, мочевого пузыря и мочеточников, туберкулезных поражениях, уретритах и периуретритах, дистрофических поражениях забрюшинной клетчатки. При тяжелых сочетанных травмах и обширных хирургических вмешательствах острая почечная недостаточность вызывается несколькими факторами (шок, сепсис, переливание крови, лечение нефротоксичными препаратами).

Классификация

Выделяют следующие формы ОПН:

— Гемодинамическая (преренальная). Возникает вследствие острого нарушения гемодинамики.

— Паренхиматозная (ренальная). Причиной становится токсическое или ишемическое поражение почечной паренхимы, реже – острый воспалительный процесс в почках.

— Обструктивная (постренальная). Развивается вследствие остро возникшей обструкции мочевыводящих путей.

Симптомы и течение ОПН

Выделяют четыре фазы острой почечной недостаточности:

• Начальная фаза ОПН

Состояние пациента определяется основным заболеванием, вызывающим ОПН. Клинически начальная фаза обычно не выявляется из-за отсутствия характерных симптомов. Циркуляторный коллапс, возникающий в этой фазе, имеет очень малую продолжительность, поэтому проходит незамеченным. Неспецифичные симптомы ОПН (сонливость, тошнота, отсутствие аппетита, слабость) замаскированы проявлениями основного заболевания, травмы или отравления.

• Олигоанурическая фаза ОПН

Анурия возникает редко. Количество отделяемой мочи — менее 500 мл в сутки. Характерна выраженная протеинурия, азотемия, гиперфосфатемия, гиперкалиемия, гипернатиемия, метаболический ацидоз. Отмечается понос, тошнота, рвота. При отеке легкого вследствие гипергидратации появляется одышка и влажные хрипы. Больной заторможен, сонлив, может впасть в кому. Нередко развивается перикардит, уремический гастроэнтероколит, осложняющийся кровотечениями. Пациент подвержен инфекции вследствие снижения иммунитета. Возможен панкреатит, стоматит паротит, пневмония, сепсис.

Олигоанурическая фаза ОПН развивается в течение первых трех суток после воздействия. Позднее развитие олигоанурической фазы считается прогностически неблагоприятным признаком. Средняя продолжительность этой стадии 10-14 дней. Период олигурии может укорачиваться до нескольких часов или удлиняться до 6-8 недель. Продолжительная олигурия чаще возникает у пожилых пациентов с сопутствующей сосудистой патологией. При олигурической стадии ОПН, длящейся более месяца, необходимо провести дополнительную дифференциальную диагностику для исключения прогрессирующего гломерулонефрита, почечного васкулита, окклюзии почечной артерии, диффузного некроза коры почек.

• Диуретическая фаза ОПН

Длительность диуретической фазы – около двух недель. Суточный диурез постепенно увеличивается и достигает 2-5 литров. Отмечается постепенное восстановление водно-электролитного баланса. Возможна гипокалиемия вследствие значительных потерь калия с мочой.

• Фаза выздоровления

Происходит дальнейшее восстановление почечных функций, занимающее от 6 месяцев до 1 года.

Осложнения острой почечной недостаточности

Выраженность нарушений, характерных для почечной недостаточности (задержка жидкости, азотемия, нарушение водно-электролитного баланса) зависит от состояния катаболизма и наличия олигурии. При выраженной олигурии отмечается снижение уровня клубочковой фильтрации, существенно уменьшается выделение электролитов, воды и продуктов азотного обмена, что приводит к более выраженным изменениям состава крови.

• Нарушения водно-солевого обмена

При олигурии увеличивается риск развития водной и солевой сверхнагрузки. Гиперкалиемия при острой почечной недостаточности вызвана недостаточным выведением калия при сохраняющемся уровне его высвобождения из тканей. У больных, не страдающих олигурией, уровень калия составляет 0,3-0,5 ммоль/сут. Более выраженная гиперкалиемия у таких пациентов может говорить об экзогенной (переливание крови, лекарственные препараты, наличие в рационе продуктов, богатых калием) или энодгенной (гемолиз, деструкция тканей) калиевой нагрузке.

Первые симптомы гиперкалиемии появляются, когда уровень калия превышает 6,0-6,5 ммоль/л. Больные жалуются на мышечную слабость. В некоторых случаях развивается вялый тетрапарез. Отмечаются изменения ЭКГ. Снижается амплитуда зубцов P, увеличивается интервал P-R, развивается брадикардия. Значительное повышение концентрации калия может вызвать остановку сердца.

На первых двух стадиях ОПН наблюдаются гипокальциемия, гиперфосфатемия, слабо выраженная гипермагниемия.

• Изменения крови

Следствием выраженной азотемии является угнетение эритропоэза. Сокращается продолжительность жизни эритроцитов. Развивается нормоцитарная нормохромная анемия.

• Иммунные нарушения

Угнетение иммунитета способствует возникновению инфекционных заболеваний у 30-70% пациентов с острой почечной недостаточностью. Присоединение инфекции утяжеляет течение заболевания и нередко становится причиной смерти больного. Развивается воспаление в области послеоперационных ран, страдает полость рта, дыхательная система, мочевыводящие пути. Частым осложнением острой почечной недостаточности является сепсис, который может вызываться как грамположительной, так и грамотрицательной флорой.

• Неврологические нарушения

Отмечается сонливость, спутанность сознания, дезориентация, заторможенность, чередующаяся с периодами возбуждения. Периферическая нейропатия чаще возникает у пожилых пациентов.

• Осложнения со стороны сердечно-сосудистой системы

При ОПН может развиться застойная сердечная недостаточность, аритмия, перикардит, гипертензия.

• Нарушения деятельности ЖКТ

Больных беспокоит ощущение дискомфорта в брюшной полости, тошнота, рвота, потеря аппетита. В тяжелых случаях развивается уремический гастроэнтероколит, часто осложняющийся кровотечениями.

Прогноз

Летальность в первую очередь зависит от тяжести патологического состояния, ставшего причиной развития ОПН. На исход заболевания влияет возраст больного, степень нарушения функции почек, наличие осложнений. У выживших пациентов почечные функции восстанавливаются полностью в 35-40% случаев, частично – в 10-15% случаев. 1-3% больных необходим постоянный гемодиализ.

Диагностика почечной недостаточности у собак и кошек

Острая почечная недостаточность

ОПН (острая почечная недостаточность или острое почечное повреждение) – это клинический синдром, характеризующийся резким увеличением концентраций креатинина и мочевины в сыворотке крови выше нормы.

Важнейшим условием успешного лечения пациентов с острой почечной недостаточностью является ранняя диагностика. В ветеринарном центре «Астин» пациентов с подозрением на острую почечную недостаточность госпитализируют в ОРИТ. Внедренные в клиническую практику широкий спектр эффективных антибактериальных препаратов, новые подходы к гемодинамической, антиоксидантной терапии и респираторной поддержки привели к увеличению количества пациентов, которые с положительной динамикой преодолевают кризис острой почечной недостаточности.

Классификация

• Преренальная – снижение почечного кровотока;
• Ренальная – непосредственное повреждение паренхимы почек;
• Постренальная – закрытие просвета мочевыводящих путей.

Причины

1. Почечная недостаточность — синдром, возникающий на фоне сопутствующих заболеваний, уже поразивших мочеполовую систему (нефроз, пиелонефрит, мочекаменная болезнь и другие патологии) или вследствие стремительного развития патологического процесса (например, ОЗМ, отравление нефротоксинами, инфекционные заболевания — лептоспироза).
2. Почечная саморегуляция у животных, также, как и у людей, зависит от баланса расширения приносящих артериол, которую вызывают оксид азота и простагландины, и сужения выносящих артериол под воздействием ангиотензина-2. Если среднее давление держится ниже 70 мм рт.ст., то саморегуляция нарушается, и СКФ уменьшается пропорционально его снижению.
3. Лекарственные препараты, которые взаимодействуют с этими медиаторами (НПВС или селективные ингибиторы ЦОГ-2, ингибиторы АПФ или АРА), способны вызвать преренальную острую почечную недостаточность.
4. Наиболее частой ренальной причиной ОПН у животных является острый некроз канальцев. Он возникает в результате длительного течения одного и того же патофизиологического процесса, который приводит к преренальной гипоперфузии. Другой ренальной причиной острой почечной недостаточности является сепсис.
5. Обструктивная нефропатия начинается как острая почечная недостаточность относительно редко, поэтому её важно своевременно распознать, поскольку быстрая диагностика и своевременно начавшееся лечение помогут улучшить или даже полностью восстановить функционирование почки.

Симптомы острой почечной недостаточности могут быть разными:

• уменьшение объёма мочи (олигурия) или её полное отсутствие (анурия)
• острая сердечная недостаточность при преренальной ОПН
• острый гастроэнтерит (например, при отравлении солями тяжелых металлов)
• апатия и общая слабость животного
• понижение температуры тела животного
• диспепсические расстройства (рвота, диарея, снижение или отсутствие аппетита)
• появление отеков
• изменения цвета слизистых (бледность или покраснение)

Для ранней диагностики ОПН в ветеринарном центре «Астин» применяются лабораторные экспресс-методы: определение уровня креатинина, калия и мочевины в крови.

Жизнеугрожающие факторы ОПН

К олигурии и анурии могут быстро присоединяться симптомы внеклеточной (характерезуется полостными и периферическими отёками), а после и внутриклеточной гипергидратации (отёк мозга, лёгких, острая левожелудочковая недостаточность). Такие жизнеугрожающие состояния невозможно разрешить амбулаторно. Для оказания помощи данному пациенту требуется стационарное лечение и командная работа ветеринарных врачей разных специальностей.

Знаковым признаком ОПН является азотемия – повышение концентрации азота в крови. Чем быстрее при ОПН прогрессирует азотемия, тем тяжелее протекает ОПН.

При олигурической и анурической ОПН развивается гиперкалиемия – повышение содержания калия в сыворотке до уровня более 5,5 мэкв/л. Критическая (жизнеугрожающая) гиперкалиемия может развиться в течение первых суток болезни и определить темп нарастания уремии. В ветеринарном центре «Астин» в ОРИТ для выявления гиперкалиемии и последующего контроля уровня калия проводят биохимический мониторинг с забором сыворотки крови, а также регистрируют его изменения по ЭКГ.

При выраженных нарушениях кислотно-основного состояния с большим дефицитом бикарбонатов и снижением кислотности крови усугубляются нарушения сердечного ритма, вызванные гиперкалиемией, присоединяются шумное дыхание Куссмауля и другие признаки поражения центральной нервной системы. Для острой почечной недостаточности характерно тяжёлое угнетение функций иммунной системы.

К ОПН может присоединяться респираторный дистресс-синдром. Он проявляется острой дыхательной недостаточностью с ухудшением легочного газообмена и изменениями в лёгких (интерстициальным отёком, множественными ателектазами). Также может развиваться бактериальная пневмония. Такие пациенты категорируются как тяжелые и располагаются в стационаре ОРИТ с надлежащим круглосуточным аппаратным мониторингом.

Диагностика ОПН

Первым этапом диагностики является сбор анамнеза при поступлении пациента на прием к врачу. В ходе беседы врач предварительно на основании анамнеза дифференцирует анурию (отсутствие поступления мочи в мочевой пузырь) от острой задержки мочи. В отсутствии мочи в мочевом пузыре убеждаются с помощью ультразвукового исследования. Экспресс – диагностика биохимических показателей позволяет определить уровень креатинина, мочевины и калия сыворотки крови.

Последующим этапом диагностики устанавливают форму ОПН. В первую очередь исключают обструкцию мочевых путей с помощью ультразвуковых и рентгенологических методов диагностики. Также проводят лабораторное исследование мочи (если моча не содержит свободной крови в своем составе).

Когда врачи исключат преренальную острую почечную недостаточность, то устанавливают форму ренальной ОПН. Это возможно осуществить на основании анализа мочи по присутствию в ней эритроцитарных и белковых цилиндров (свидетельствует о поражении клубочков). Наличие эозинофилов и полиморфно-ядерных лейкоцитов характерно для острого тубулоинтерстициального нефрита.

На заключительных этапах диагностики рекомендуется проведение биопсии почки.

Лечение ОПН

При лечении постренальной острой почечной недостаточности устраняют обструкцию и восстанавливают нормальный отток мочи. После этого постренальная ОПН в большинстве случаев пропадает.

При диагностированной преренальной острой почечной недостаточности устраняются факторы, которые вызвали острую сосудистую недостаточность или гиповолемию, отменяют препараты, приведшие к преренальной ОПН. Для выведения из шока и восполнения объема циркулирующей крови внутривенно проводят инфузионную терапию кристаллоидными и коллоидными растворами, раствора альбумина. При кровопотере переливают цельную кровь или эритроцитарную массу.

Если ОПН является гипонатриемия и дегидратация, внутривенно вводят кристаллоидные растворы. Инфузионная терапия в ОРИТ проводится под контролем диуреза и мониторингом давления. Пациентам с некоторыми вариантами ренальной ОПН в терапию добавляют антибиотики, иммунодепрессанты.

Предупредить развитие почечной недостаточности у животного не всегда представляется возможным.

Однако при подозрении на нарушение работы органов мочевыделительной системы рекомендуется обратиться в ветеринарную клинику.

Острая почечная недостаточность у собаки

Если Вашей собаке ставят диагноз острая почечная недостаточность, то это совсем не значит, что питомец останется инвалидом на всю оставшуюся жизнь. Конечно, есть вероятность, что животное не вынесет характерное для этого состояния резкого повышения уровня креатинина, мочевины и калия. Но всегда стоит бороться! Благоприятных исходов гораздо больше, чем летальных. Но летальные, к сожалению, тоже есть.

Собака с острой почечной недостаточностью, как правило, хорошо выглядит: шерсть лоснится, отсутствует перхоть, отсутствует исхудание. Но чаще всего есть отказ от корма, угнетение,  повышенная жажда, рвота ( может быть кормом, желчью, слюной, белой пеной),  запах мочевины из ротовой  полости, может быть увеличение или наоборот прекращение выделения мочи, отёки.

Существует несколько типов острой почечной недостаточности:

1. преренальная

2. ренальная

3. постренальная.

При преренальной ( или допочечной) острой почечной недостаточности почки как таковые  не повреждены, но из-за общего нарушения кровообращения не могут выполнять свои функции полноценно.

Причины преренальной острой почечной недостаточности:

5. 
   гиповолемия (обезвоживание, кровотечение, прием мочегонных препаратов, рвота, жидкий стул, а возможно, и сочетание нескольких факторов в течение нескольких дней),
5. 
   низкий сердечный выброс ( патология сердца),
5. 
   вазодилатация ( расширение сосудов).

Ренальная (или истинная почечная)  острая почечная недостаточность связана с повреждением структуры почек ввиду, например, воспалительного характера:

• 
  интерстициальный нефрит,
• 
  гломерулонефрит
• 
  острый тубулярный некроз ( чаще происходит по причине отравления).

Причиной постренальной ( или послепочечной) острой почечной недостаточности является препятствие нормальному оттоку мочи ( может встать пробка из песка, конкремента, белка, клеточного детрита или смешанного происхождения) на любом уровне мочевыводящих путей ( уретра, мочевой пузырь, мочеточник, почка), двустороннее или одностороннее.

Лечение пациентов с острой почечной недостаточностью всегда зависит от того, как быстро владелец обратился в клинику и как быстро был поставлен правильный диагноз. Лечение должно быть комплексным, чаще всего удастся выявить и устранить причину острой почечной недостаточности.  Помимо устранения причины необходимо  откорректировать водно — электролитный дисбаланс, кислотно-щелочные нарушения путем инфузионной терапии ( капельницы внутривенные или подкожные, возможно совмещение тех и других). Чаще всего назначаются энтеросорбенты для выведение из организма накопившихся  токсинов. Данным пациентам чаще всего требуется проведение интенсивной терапии в условиях стационара.

Если у Вашей собаки диагносцирована острая задержка мочи и соответственно постренальная острая почечная недостаточность, то необходимо как можно быстрее устранить причину и обеспечить свободный отток мочи. Чаще всего в таких случаях производится установка уретрального катетера под общей седацией ( анестезией) для предотвращения  травматизации полового члена. Иногда требуются оперативные вмешательства.

Особенно Вам необходимо быть внимательными,  когда  собака болеет заболеваниями, передающимися с укусом клеща. Очень часто пироплазмоз у собак сопровождается серьезным течением острой почечной недостаточности, именно поэтому так необходимо проводить капельные инфузии в процессе лечения пироплазмоза.

Острая и хроническая почечная недостаточность — информация для владельцев и заводчиков

ОПН – острая почечная недостаточность – Это острое нарушение функции почек, которое развивается от нескольких часов до нескольких суток и характеризуется комплексом характерных симптомов.

Этиология прежде всего зависит от причины нарушения. Соответственно от того, где лежит причина возникновения проблемы ОПН делится на преренальную, ренальную и постренальную. Причиной преренальной ОПН является недостаточное кровоснабжение почек при: обезвоживании, различных видах шока, тромбозах, недостаточной оксигенации крови.

Причиной ренальной ОПН является непосредственное повреждение структур почек при воспалении , интоксикации, травме или закупорка канальцев почек – «засор фильтра».

Причиной постренальной ОПН является все возможные причины. Которые препятствуют оттоку мочи от почек: воспаление мочеточников, опухоли, уролитиаз.

Патогенез острой почечной недостаточности

Вне зависимости от причины, при ОПН нарушается главная функция почек – формирование и отведение мочи. При этом происходит повреждение всех структур почек и всего организма вследствие отравления продуктами белкового обмена и всем тем, что должно было быть выведенно из организма вместе с мочей. При этом симптомы нарастают постепенно в зависимости от тяжести процесса и собственно степени необходимости быстрого отведения мочи. Причем, чем дольше не отводится моча, тем сильней повреждение и больше продуктов. Которые нужно вывести из организма.

Клиника

Первым признаком ОПН является резкое снижение диуреза от четверти диуреза до полной анурии. Кроме этого присутствуют нарастающие признаки интоксикации: угнетение, апатия, рвота, нарушение дыхания и сердцебиения, а также присутствуют симптомы непосреедственной причины ОПН.

Диагнозставится комплексно на основании клинических признаков и возможно результатов УЗИ почек.

Лечение: Направлено прежде всего на устранение причины ОПН и восстановление диуреза и других функций почек, а также устранение последствий в виде интоксикации и других. Соответственно, лечение сильно разнится в соответствии с этиологией ОПН.

Опасными последствиями ОПН являются: интоксикация, которая может привести к серьезным повреждениям прежде всего нервной системы, гиперкалийэмия, которая нарушает мышечным и сердечный тонус. Также при длительной ОПН может произойти необратимое повреждение структур почек и ОПН перейдет в ХПН.

ХПН – хроническая почечная недостаточность

Стабильное длительное нарушение функции почек, характеризующееся нарушением фильтрационной, концентрационной, выделительной, кроветворной и других функций почек, возникшее вследствиие поражения значительной части почечной ткани. Часто это состояние уже необратимо, так как проявляется клинически у животных, когда более 2/3 почечной ткани уже не функционирует.

Этиология: Причиной служит стойкое повреждение или разрушение структурных единиц почек – нефронов и замещение их фиброзной тканью. Причиной также может быть атрофия нефронов при поликистозе, гидронефрозе и других причинах.

Патогенез: При полном разрушении нефронов они не восстанавливаются,так как в отличии от нефроэпителия, где есть бластные клетки, целый нефрон просто не из чего вырастить организму. Поэтому на место разрушенного нефрона замещается фиброзной тканью – «внутрипочечный рубец».

Клиника

К сожалению, клинически ХПН проявляется уже на поздних стадиях, когда почки уже не могут компенсировать потерю ткани усиленным диурезом, который для хозяев часто незаметен. К тому же клинические признаки ХПН не специфичны и могут проявляться при многих заболеваниях. Это: повышенная жажда и усиленный диурез, слабость, апатия, исхудание, снижение аппетита, неприятный запах, язвы во рту и многие другие.

Диагноз ставится на основании клинических симптомов, результатов анализов крови и результатов УЗИ почек.

Лечение: Как таковое к излечению чаще всего не ведет и служит для снижения силы проявления симптомов и продления жизни животного. Лечение сводится к антиитоксикационной терапии — инфузии внутривенные, подкожные, гемо- и перитонеальный диализ, а также препараты защищающие слизистую ЖКТ, антибиотики при необходимости, соответствующая диета.

Что вызывает постренальное острое повреждение почек (ОПП)?

Постпочечная недостаточность

2, 7163005

Послеоперационное острое повреждение почек при несердечной хирургии у взрослых: совместный консенсусный отчет Инициативы по качеству острых заболеваний и Инициативы по обеспечению качества периоперационных заболеваний

Почечная активация белка остеопонтина и мРНК при острой нефротоксичности у крыс | Нефрологическая диализная трансплантация

Аннотация

Справочная информация. Влияние сегмент-специфичного повреждения проксимальных канальцев на пространственно-временное распределение остеопонтина (OPN) было определено на двух разных нефротоксических моделях крыс, чтобы оценить его возможное влияние на возможную роль OPN в острой почечной недостаточности (ARF).Экспрессию гена OPN дополнительно определяли в клетках проксимальных и дистальных канальцев для исследования происхождения повышенного почечного OPN.

Методы. Почечный белок OPN и экспрессия мРНК сравнивали у крыс во время ртути-хлорида- и гентамицина-индуцированной ОПН с использованием иммуногистохимии и in situ гибридизации.

Результаты. Хлорид ртути в первую очередь вызывал повреждение канальцев и последующую пролиферацию клеток в проксимальных прямых канальцах (PST), тогда как гентамицин преимущественно поражал проксимальные извитые канальцы (PCT).В обеих моделях распределение белка OPN было связано с повышенными уровнями мРНК OPN как в проксимальных, так и в дистальных клетках канальцев. Тем не менее, позитивная регуляция была отложена в проксимальном канальцевом сегменте, который больше всего пострадал от повреждения, то есть ПКТ в гентамицине ARF по сравнению с PST в ARF с хлоридом ртути. Иммуноокрашивание OPN на апикальной клеточной мембране из дистальных канальцев контрастировало с перинуклеарным везикулярным окрашиванием в клетках проксимальных канальцев.

Выводы. Экспрессия гена и белка OPN индуцируется как в проксимальных, так и в дистальных канальцевых клетках во время токсической ОПН у крыс.Четкая субклеточная локализация в проксимальных клетках и дистальных канальцев указывает на различия в процессинге и / или обращении с OPN. Пространственно-временное распределение согласуется с возможной ролью в повреждении и регенерации почек.

Введение

Острая почечная недостаточность (ОПН), вызванная ишемическим реперфузионным повреждением или токсическим воздействием, по-прежнему имеет высокий уровень смертности, несмотря на значительные улучшения в диализном лечении и в клинической практике в целом.Обширные поражения канальцев, включая некроз и шелушение клеток, сопровождаются временным нарушением функции почек и накоплением интерстициальных лейкоцитов [1]. Пролиферация выживших канальцевых клеток знаменует начало последующей регенерации почек. Миграция, распространение и прочное прикрепление незрелых канальцевых клеток к обнаженной базальной мембране предшествуют поляризации и дифференцировке клеток [2]. В конце концов, функция почек и целостность тканей могут быть восстановлены за ограниченное время. Новые рациональные вмешательства могут ускорить этот процесс регенерации, повысить его эффективность и улучшить исход синдрома.

Экспериментальные и структурные данные показывают, что остеопонтин (OPN) может влиять на этот процесс ремоделирования. OPN представляет собой фосфорилированный гликопротеин, первоначально выделенный из кости, но продуцируемый различными типами клеток, включая эпителий почечных канальцев [3]. Значительные количества обнаруживаются в моче, где предположительно ингибирует образование кристаллов оксалата кальция [4]. Однако обильная экспрессия OPN после повреждения почек, а также в других органах и тканях в условиях высокого клеточного обмена, таких как стенка сосудов, сердце, кожа, легкие, скелетные мышцы и кости, предполагает, что этот белок может иметь важное значение в тканях. ремоделирование [5].

Защитная роль в почках предполагалась из-за сниженной толерантности мышей с нокаутом OPN к почечной ишемии, возможно, за счет ингибирования индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) [6]. Посредством своего взаимодействия с множеством интегринов последовательность аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) OPN может способствовать прикреплению клеток, опосредовать миграцию клеток [7] и уменьшать образование канальцевых повязок [8]. Кроме того, OPN снижает апоптотическую гибель клеток и его свойства аттрактанта макрофагов, а также его стимуляцию активности TGF- β и отложения коллагена I и IV предполагают, что он обладает профиброгенными свойствами [9].

В почках крысы повышенная экспрессия OPN была отмечена при гипертензии ангиотензина II [10], после односторонней обструкции мочеточника [11], в различных экспериментальных моделях гломерулонефрита и тубулоинтерстициального нефрита [12-15], а также после почечной ишемии [16-18]. [. Ранее мы продемонстрировали, что иммунореактивный ОПН появляется в клетках дистальных канальцев и регенерирующих клетках проксимальных канальцев во время ишемии-реперфузии почек, но не в сильно поврежденных клетках проксимальных канальцев [18]. Предполагая, что OPN участвует в процессе ремоделирования тканей после повреждения почек в целом, эта взаимосвязь также должна присутствовать в других, несвязанных моделях ARF, таких как токсическая ARF, где изменение гемодинамических параметров, по-видимому, не играет центральной роли в инициации почечной недостаточности. травма [19].Таким образом, в настоящем исследовании на двух разных моделях токсической ОПН мы исследовали, влияет ли сегмент-специфическое повреждение проксимальных канальцев на распределение ОПН в почках. Вторая важная проблема — происхождение иммунореактивного OPN в клетках проксимальных канальцев. Единственное описание мРНК OPN в клетках проксимальных канальцев крыс, позволяющее предположить, что клетки проксимальных канальцев способны продуцировать OPN [17], опровергается Мэдсеном и его коллегами [20], которые обнаружили OPN после индукции липополисахаридом (LPS) только в вакуолярно-лизосомной система клеток проксимальных канальцев крысы и пришла к выводу, что ОПН проксимальных канальцев реабсорбируется из жидкости канальцев.Чтобы определить в настоящем исследовании, является ли присутствие иммунореактивного OPN в клетках проксимальных канальцев следствием повышенной экспрессии гена OPN, а не эндоцитотического поглощения, распределение мРНК OPN сравнивали с локализацией белка OPN.

Были выбраны две модели нефротоксических крыс с сопоставимым течением времени, но с другой мишенью проксимальных канальцев. Гентамицин вызывает острое повреждение канальцев, в частности, проксимальных извитых канальцев коры головного мозга (ПКТ), в то время как основной мишенью нефротоксичности хлорида ртути (HgCl ₂ ) являются проксимальные прямые канальцы (PST) во внешней полосе наружного мозгового вещества (OSOM). ) и сердцевинные лучи.

Объекты и методы

Лечение животных

Гентамицин или хлорид ртути вводили самкам крыс линии Вистар (200–220 г). Первая группа ( n = 28) получала 400 мг / кг гентамицина внутрибрюшинно (ip) (40 мг / мл в 0,9% NaCl), разделенная на три ежедневные инъекции в дни 1 и 2. Вторая группа ( n = 28). ) получил однократную подкожную (п / к) инъекцию 2,5 мг / кг хлорида ртути (1 мг / мл в 0,9% NaCl) в день 1.Контрольные крысы ( n = 7 и n = 14 для каждого лечения соответственно) получали носитель по той же схеме. В течение следующих 2 недель четыре животных, получавших гентамицин или хлорид ртути, и по крайней мере одно контрольное животное для каждой обработки были умерщвлены в разные промежутки времени. Все процедуры выполнялись в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных (85–23).

Креатинин сыворотки

Образцы сыворотки крови, взятой при умерщвлении, анализировали в двух экземплярах с использованием колориметрического теста Jaffé.

Иммуногистохимическое окрашивание

Окрашивание проводили на парафиновых срезах 4 мкм из фиксированной метакарном почечной ткани. Пролиферирующие клетки иммуноокрашивали кроличьим антимышиным моноклональным антителом (PC10 от Dako, Дания), направленным на ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA). После блокирования нормальной козьей сывороткой и инкубации с первичным антителом срезы инкубировали с биотинилированной козьей антикроличьей антисывороткой в ​​присутствии нормальной крысиной сыворотки и окрашивали авидин-биотинилированным комплексом пероксидазы хрена (Vectastain от Vector Laboratories, США). с использованием 3,3′-диаминобензидина в качестве хромогена.Срезы контрастировали метиловым зеленым и реагентом Шиффа периодной кислоты (PAS). Окрашивания не наблюдалось, когда первичное антитело было исключено или заменено нерелевантным мышиным антителом того же изотипа.

Двойное иммуноокрашивание на OPN и макрофаги проводили последовательно. После блокирования нормальной лошадиной сывороткой и инкубации с мышиным моноклональным антителом против макрофагов крысы ED-1 (Serotec, Великобритания) срезы инкубировали с биотинилированной лошадиной антимышиной антисывороткой в ​​присутствии нормальной крысиной сыворотки, а затем с авидин-биотинилированным щелочным раствором. фосфатазный комплекс (Вектастаин).Синий цвет был разработан с помощью нитросинего тетразолия (NBT) и 5-бром-4-хлор-3-индоксилфосфата (BCIP) в присутствии 1-бромтетрамизола. На следующем этапе срезы промывали и блокировали нормальной кроличьей сывороткой и инкубировали с очищенной аффинной козьей антисывороткой против OPN (OP199). Затем срезы инкубировали с биотинилированной кроличьей антикозьей антисывороткой в ​​присутствии нормальной крысиной сыворотки. Окрашивание пероксидазой проводили так же, как и для PCNA, за исключением проявления окраски, где в качестве хромогена использовали 3-амино-9-этилкарбазол.Ядра контрастировали метиловым зеленым. Окрашивания не наблюдалось, когда ED-1 или OP199 были исключены или заменены нерелевантными мышиными антителами того же изотипа или доиммунной козьей сывороткой соответственно.

Гибридизация in situ

Гибридизацию проводили на парафиновых срезах толщиной 4 мкм из почечной ткани, фиксированной Dubosq – Brasil. После обработки протеиназой К и постфиксации в 4% параформальдегиде срезы ткани гибридизовали либо с антисмысловым, либо с чувствительным флуоресцеин-меченым РНК-зондом (набор для окрашивания РНК, Amersham, UK), полученным путем текущей транскрипции Eco RI (антисмысловой) или Cla I (смысл) линеаризованная плазмида rOPN.Эта конструкция содержит фрагмент Eco RI – Cla I (563 п.н.) из клона кДНК крысиного OPN 2B7. Фон был уменьшен обработкой РНКазой А и промывками с высокой строгостью. Инкубацию с антителом против флуоресцеина, конъюгированным с щелочной фосфатазой, проводили в соответствии с инструкциями производителя. Темно-пурпурный цвет проявлялся во время инкубации в течение ночи в NBT и BCIP. При использовании сенсорного зонда OPN или при предварительной обработке срезов РНКазой A окрашивания не наблюдалось.

Методы анализа

Разрастание клеток и повреждение канальцев оценивали в одних и тех же срезах PCNA / PAS.Пролиферирующие клетки подсчитывали в 10 случайно выбранных микроскопических полях (общая площадь = 3,10 мм ² ) в коре и OSOM, соответственно, с различием между проксимальными и дистальными тубулярными клетками. В общей сложности 100 канальцев на почечный разрез оценивали на предмет повреждения канальцев: 25 проксимальных и 25 дистальных канальцев в коре головного мозга и в OSOM соответственно. Проксимальный каналец считался поврежденным, если его щеточная кайма была нарушена или потеряна, или если он содержал вакуолизированные клетки или некротические клетки. Дистальный каналец считался поврежденным, если он содержал разрушенные, вакуолизированные или некротические клетки.Даже когда травма была серьезной, проксимальные канальцы все же можно было отличить от дистальных канальцев по крайней мере по одному из следующих критериев: топографическая локализация, периметр канальцев, плотность цитоплазмы и положение ядра, отсутствие или наличие щеточной каймы, высота клетки и внешний вид базолатерального канала. OPN-положительные канальцы и ED-1-положительные макрофаги подсчитывали одновременно в 10 случайно выбранных полях микроскопа (общая площадь 0,78 мм ² ) в коре головного мозга и OSOM соответственно.

Статистика

Статистический анализ был выполнен с использованием статистического программного обеспечения SPSS.Средние значения и стандартные отклонения по меньшей мере четырех животных сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, а различия дополнительно выделяли с помощью апостериорного критерия Стьюдента – Ньюмана – Кеулса . Процент поврежденных канальцев сравнивали с тестом хи-квадрат Пирсона.

Результаты

Креатинин сыворотки

Кратковременное повышение уровня креатинина в сыворотке указывает на существенное снижение скорости клубочковой фильтрации и развитие ОПН в обеих моделях (рис. 1).

Органы управления

Нормальные значения креатинина сыворотки были обнаружены на протяжении всего периода наблюдения у контрольных животных обеих моделей.

Рис. 1.

Изменение значений креатинина сыворотки после введения гентамицина и хлорида ртути (* P <0,05 по сравнению с контрольными).

Рис. 1.

Изменение значений креатинина сыворотки после введения гентамицина и хлорида ртути (* P <0.05 против контрольных).

Гентамицин ARF

Показатели креатинина в сыворотке крови начали расти на 4-й день и были максимальными на 6-й день (5,8 ± 1,2 мг / дл), тогда как нормальные значения снова были достигнуты на 12-й день.

Ртуть-хлорид ARF

Показатели креатинина сыворотки повышались быстрее и достигли пика раньше, чем при гентамицине ARF. Максимальные значения были достигнуты на 2-й день (3,9 ± 1,4 мг / дл), тогда как значения снова были нормальными на 6-й день.

Повреждение канальцев и пролиферация клеток

Локализация повреждения канальцев и пролиферация клеток отражала сегмент-специфическую нефротоксичность гентамицина и хлорида ртути (Рисунки 2–4).

Органы управления

Морфология почек была нормальной у контрольных животных, в то время как пролиферирующих клеток было мало (рис. 2А и 2Е). Во всех сегментах канальцев было обнаружено менее 10 клеток с PCNA-положительными ядрами (рис. 4).

Рис. 2.

Повреждение проксимальных канальцев и пролиферация клеток в кортикомедуллярном соединении после введения гентамицина (левая колонка) и хлорида ртути (правая колонка). Окрашивание PAS / PCNA (увеличение 220 ×) ( A ) контрольной крысы, ( B ) крысы, обработанной гентамицином, на 4-й день, ( C ) на 8-й день и ( D ) на 12-й день.( E ) Контрольная крыса, ( F ) крыса, получавшая хлорид ртути на 2-й день, ( G ) на 6-й день и ( H ) на 14-й день. Гентамицин сильно повреждает кортикальную ПКТ (□) тогда как хлорид ртути в основном повреждает PST в OSOM и медуллярных лучах (*). Несколько PCNA-положительных клеток (стрелки) можно найти у контрольных животных и в конце наблюдений.

Рис. 2.

Повреждение проксимальных канальцев и пролиферация клеток кортикомедуллярного перехода после введения гентамицина (левая колонка) и хлорида ртути (правая колонка).Окрашивание PAS / PCNA (увеличение 220 ×) ( A ) контрольной крысы, ( B ) крысы, обработанной гентамицином, на 4-й день, ( C ) на 8-й день и ( D ) на 12-й день. ( E ) Контрольная крыса, ( F ) крыса, получавшая хлорид ртути на 2-й день, ( G ) на 6-й день и ( H ) на 14-й день. Гентамицин сильно повреждает кортикальную ПКТ (□) тогда как хлорид ртути в основном повреждает PST в OSOM и медуллярных лучах (*). Несколько PCNA-положительных клеток (стрелки) можно найти у контрольных животных и в конце наблюдений.

Рис. 3.

Развитие повреждения канальцев в коре почек и OSOM у крыс, получавших гентамицин или хлорид ртути (* P <0,05 по сравнению с контролем).

Рис. 3.

Развитие повреждения канальцев в коре почек и OSOM у крыс, получавших гентамицин или хлорид ртути (* P <0,05 по сравнению с контролем).

Рис.4.

Эволюция пролиферации клеток в коре головного мозга и OSOM у крыс, получавших гентамицин или хлорид ртути (* P <0.05 против контрольных).

Рис. 4.

Эволюция пролиферации клеток в коре почек и OSOM у крыс, получавших гентамицин или хлорид ртути (* P <0,05 по сравнению с контрольной группой).

Гентамицин ARF

Трубочное повреждение было наиболее выраженным при ПКТ коры ( P <0,001 по сравнению с PST). Первые признаки травмы наблюдались уже через 24 часа после первого введения гентамицина (день 1) и включали лизосомальный отек, потерю щеточной каймы и вакуолизацию клеток (рис. 2С).Это сопровождалось обширным некрозом клеток и их отслоением от базальной мембраны, что часто приводило к полностью слущившимся канальцам. Почти весь ПКТ (99%) был поврежден или некротизирован на 4-й день (рис. 3). Обнаженные трубчатые базальные мембраны постепенно заселялись регенерирующими уплощенными эпителиальными клетками, большинство из которых демонстрировали заметное иммуноокрашивание PCNA (рис. 2E). Следовательно, пролиферация клеток была максимальной в кортикальном PCT на 8 день (рис. 4). Это привело к восстановлению нормальной тканевой архитектуры на 12-й день (рис. 2G).

Хлорид ртути ARF

В отличие от гентамицина ARF, повреждение канальцев было наиболее выражено при PST OSOM и медуллярных лучей ( P <0,001 против PCT) (рис. 2D). В соответствии с быстрым увеличением значений креатинина в сыворотке, впечатляющее количество некротических PST можно было увидеть уже в день 1, достигнув максимума 93% от всех PST на 2 день (Рисунок 3). По аналогии с гентамицином ARF, пролиферирующие клетки начали покрывать обнаженные базальные мембраны после максимального повреждения (рис. 2F).В соответствии с локализацией наиболее тяжелого повреждения канальцев, пролиферация клеток была максимальной при PST и максимальной на 4-й день (рис. 4). Архитектура нормальной ткани была восстановлена ​​на 14 день (рис. 2H), за исключением некоторых фокальных областей в медуллярных лучах, которые все еще содержали регенерирующий PST.

ОПН иммуноокрашивание

Иммуноокрашивание

OPN в обеих моделях быстро увеличивалось в клетках проксимальных и дистальных канальцев, но задерживалось в проксимальном сегменте канальцев, который был наиболее серьезно поврежден (Фигуры 5 и 6).

Органы управления

OPN был почти исключительно локализован в мозговом веществе, где были окрашены самые тонкие конечности и папиллярный уроэпителий (рис. 6А). Только небольшое количество толстых восходящих конечностей и клеток проксимальных канальцев содержало OPN, тогда как иммуноокрашивание OPN отсутствовало в клубочках и интерстиции.

Рис. 5.

Эволюция иммунореактивности OPN в коре почек и OSOM у крыс, получавших гентамицин или хлорид ртути (* P <0.05 против контрольных).

Рис. 5.

Эволюция иммунореактивности OPN в коре почек и OSOM у крыс, получавших гентамицин или хлорид ртути (* P <0,05 по сравнению с контрольной группой).

Рис. 6.

Двойное иммуноокрашивание клеток ED-1 ⁺ (макрофаги; синий) и остеопонтин (красный). ( A ) ОПН в клетках папиллярного эпителия (стрелки) и тонком конце петли Генле (стрелки) в контрольной почке (400 ×).Клетки толстой восходящей конечности (TAL) чаще всего отрицательны (звездочки). ( B ) Сильное внутриклеточное окрашивание OPN в большинстве канальцев через 6 дней после обработки гентамицином (400 ×). Точечное окрашивание можно увидеть чуть ниже апикальной клеточной поверхности некоторых канальцев (стрелки) ( C ) Сильное иммуноокрашивание OPN через 1 день после обработки хлоридом ртути (260 ×). Некоторые канальцы имеют апикальное окрашивание, тогда как другие имеют только везикулярное внутриклеточное окрашивание. Отчетливое внутриклеточное окрашивание можно увидеть в гломерулярных париетальных эпителиальных клетках (стрелки) и в проксимальных канальцах, которые исходят из клубочков (наконечник стрелки).( D ) Обзор иммуноокрашивания OPN и накопления интерстициальных макрофагов в почечном OSOM (слева) и коре головного мозга (справа) при малом увеличении (32 ×) через 1 день после лечения хлоридом ртути. ( E ) Совместная локализация интерстициальных макрофагов и иммуноокрашивание OPN через 14 дней после лечения хлоридом ртути в очаговой области, где регенерация все еще продолжается (160 ×). ( F ) Типичный образец перинуклеарного окрашивания в клетках проксимальных канальцев (1000 ×). ( G ) Выраженное апикальное окрашивание в клетках дистальных канальцев (1000 ×).Перинуклеарное окрашивание также можно увидеть в некоторых клетках (стрелки). ( H ) Апикальное окрашивание незрелых регенерирующих клеток проксимальных канальцев (звездочки) через 6 дней после обработки хлоридом ртути (260 ×).

Рис. 6.

Двойное иммуноокрашивание клеток ED-1 ⁺ (макрофаги; синий) и остеопонтин (красный). ( A ) ОПН в клетках папиллярного эпителия (стрелки) и тонком конце петли Генле (стрелки) в контрольной почке (400 ×). Клетки толстой восходящей конечности (TAL) чаще всего отрицательны (звездочки).( B ) Сильное внутриклеточное окрашивание OPN в большинстве канальцев через 6 дней после обработки гентамицином (400 ×). Точечное окрашивание можно увидеть чуть ниже апикальной клеточной поверхности некоторых канальцев (стрелки) ( C ) Сильное иммуноокрашивание OPN через 1 день после обработки хлоридом ртути (260 ×). Некоторые канальцы имеют апикальное окрашивание, тогда как другие имеют только везикулярное внутриклеточное окрашивание. Отчетливое внутриклеточное окрашивание можно увидеть в гломерулярных париетальных эпителиальных клетках (стрелки) и в проксимальных канальцах, которые исходят из клубочков (наконечник стрелки).( D ) Обзор иммуноокрашивания OPN и накопления интерстициальных макрофагов в почечном OSOM (слева) и коре головного мозга (справа) при малом увеличении (32 ×) через 1 день после лечения хлоридом ртути. ( E ) Совместная локализация интерстициальных макрофагов и иммуноокрашивание OPN через 14 дней после лечения хлоридом ртути в очаговой области, где регенерация все еще продолжается (160 ×). ( F ) Типичный образец перинуклеарного окрашивания в клетках проксимальных канальцев (1000 ×). ( G ) Выраженное апикальное окрашивание в клетках дистальных канальцев (1000 ×).Перинуклеарное окрашивание также можно увидеть в некоторых клетках (стрелки). ( H ) Апикальное окрашивание незрелых регенерирующих клеток проксимальных канальцев (звездочки) через 6 дней после обработки хлоридом ртути (260 ×).

Гентамицин ARF

Иммуноокрашивание

OPN быстро индуцировалось в PST (фиг. 6B), но оставалось отсутствующим в сильно поврежденном PCT в течение первых 2 дней (фиг. 5). После этого количество OPN-положительных проксимальных канальцев постепенно увеличивалось в коре и OSOM.Иммуноокрашивание OPN в дистальных канальцах также начало увеличиваться рано и было сопоставимо в коре головного мозга и OSOM.

Хлорид ртути ARF

Многие клетки ПКТ и гломерулярные париетальные эпителиальные клетки уже содержали ОПН в течение 24 часов после лечения (рис. 6С). По аналогии с гентамицином, иммуноокрашивание OPN отсутствовало до 2-го дня в проксимальном канальцевом сегменте, наиболее пострадавшем от повреждений, который теперь был PST в OSOM (рис. 5). Однако количество OPN-положительных ПКТ в коре постепенно увеличивалось, начиная с 1-го дня.Экспрессия OPN также индуцировалась на 1-й день в большинстве дистальных канальцев коры и OSOM (рис. 6D), постепенно снижаясь к 14-му дню. Ближе к концу периода наблюдения канальцы, все еще экспрессирующие OPN, были расположены в некоторых фокальных областях, где происходила регенерация. все еще продолжается (рис. 6E).

Паттерн субклеточного иммуноокрашивания OPN был очень своеобразным в обеих моделях. В большинстве проксимальных канальцевых клеток OPN присутствовал только в нескольких перинуклеарных пузырьках (Рисунок 6F), но в некоторых канальцах точечный рисунок можно было увидеть чуть ниже апикальной поверхности клетки (Рисунок 6B).Напротив, клетки дистальных канальцев показали заметное иммуноокрашивание OPN на апикальной клеточной поверхности, тогда как перинуклеарное окрашивание было заметно только в нескольких клетках (рис. 6G). Иммуноокрашивание также было наиболее интенсивным на поверхности апикальных клеток незрелых регенерирующих клеток проксимальных канальцев (рис. 6H).

OPN гибридизация in situ

Локализация мРНК OPN (фиг. 7) точно отражала картину иммуноокрашивания OPN (фиг. 6).

Органы управления

МРНК

OPN была обнаружена в большинстве тонких медуллярных конечностей Генле и в папиллярных уроэпителиальных клетках (фиг. 7A) и во всех аспектах соответствовала локализации иммунореактивного OPN.

Рис. 7.

In situ гибридизация мРНК OPN. ( A ) Сильный сигнал мРНК OPN в тонких конечностях Генле (стрелки) и уроэпителиальных клетках (наконечники стрелок) у контрольной крысы (350 ×). В толстых восходящих конечностях (звездочки) мРНК OPN не обнаруживается. ( B ) OSOM крысы, получавшей гентамицин, в день 1 (350 ×). Сильный сигнал мРНК OPN в дистальных канальцах и умеренная экспрессия в PST. ( C ) Кора головного мозга крысы, получавшей хлорид ртути, в день 1 (200 ×).Сильный сигнал мРНК OPN в дистальных канальцах (d) и умеренная экспрессия в PCT (p). Отчетливое окрашивание можно также увидеть в гломерулярных париетальных эпителиальных клетках (стрелки) и в проксимальных канальцах, которые исходят из клубочков (наконечник стрелки). ( D ) Обзор с малым увеличением (40 ×) локализации мРНК OPN в OSOM почек (слева) и коре головного мозга (справа) через 1 день после лечения хлоридом ртути. ( E ) мРНК OPN через 14 дней после обработки хлоридом ртути в очаговой области, где регенерация все еще продолжается (90 ×).( F ) Сигнал мРНК OPN в клетках проксимальных канальцев (350 ×) намного ниже или отсутствует при наличии щеточной каймы (стрелки). ( G ) Сильный сигнал мРНК OPN в клетках дистальных канальцев (200 ×). ( H ) Сильный сигнал мРНК OPN также можно обнаружить в незрелых регенерирующих клетках проксимальных канальцев (звездочки) (200 ×).

Рис. 7.

In situ гибридизация мРНК OPN. ( A ) Сильный сигнал мРНК OPN в тонких конечностях Генле (стрелки) и уроэпителиальных клетках (наконечники стрелок) у контрольной крысы (350 ×).В толстых восходящих конечностях (звездочки) мРНК OPN не обнаруживается. ( B ) OSOM крысы, получавшей гентамицин, в день 1 (350 ×). Сильный сигнал мРНК OPN в дистальных канальцах и умеренная экспрессия в PST. ( C ) Кора головного мозга крысы, получавшей хлорид ртути, в день 1 (200 ×). Сильный сигнал мРНК OPN в дистальных канальцах (d) и умеренная экспрессия в PCT (p). Отчетливое окрашивание можно также увидеть в гломерулярных париетальных эпителиальных клетках (стрелки) и в проксимальных канальцах, которые исходят из клубочков (наконечник стрелки).( D ) Обзор с малым увеличением (40 ×) локализации мРНК OPN в OSOM почек (слева) и коре головного мозга (справа) через 1 день после лечения хлоридом ртути. ( E ) мРНК OPN через 14 дней после обработки хлоридом ртути в очаговой области, где регенерация все еще продолжается (90 ×). ( F ) Сигнал мРНК OPN в клетках проксимальных канальцев (350 ×) намного ниже или отсутствует при наличии щеточной каймы (стрелки). ( G ) Сильный сигнал мРНК OPN в клетках дистальных канальцев (200 ×).( H ) Сильный сигнал мРНК OPN также можно обнаружить в незрелых регенерирующих клетках проксимальных канальцев (звездочки) (200 ×).

Гентамицин ARF

Экспрессия гена

OPN сильно повышалась в дистальных канальцах коры и OSOM. МРНК OPN не была обнаружена при тяжелом поражении ПКТ в коре головного мозга, но присутствовала в PST (рис. 7B).

Хлорид ртути ARF

По аналогии с гентамицином ARF, экспрессия мРНК OPN отражала усиление иммуноокрашивания OPN.МРНК OPN не была обнаружена в сильно поврежденном PST, но индуцировалась в PCT, в дистальных канальцах от коры и OSOM и в париетальных клетках клубочков (рис. 7C, D). МРНК OPN также была обнаружена в очаговых областях с незрелыми клетками проксимальных канальцев, которые присутствовали ближе к концу наблюдений (рис. 7E). Отсутствие проксимальной канальцевой щеточной каймы часто было связано с присутствием мРНК OPN (рис. 7F). В целом, клетки дистальных канальцев показали более сильный сигнал, чем клетки проксимальных канальцев (рис. 7G).Кроме того, с результатами иммуноокрашивания дополнительно согласуется сильная экспрессия мРНК OPN, обнаруженная в регенерирующих клетках проксимальных канальцев (фигура 7H).

Накопление интерстициальных макрофагов

Макрофаги накапливались в почечном интерстиции после обеих обработок (рис. 8), но не наблюдали устойчивой связи с экспрессией OPN.

Органы управления

Лишь несколько макрофагов были обнаружены в почечном интерстиции контрольных крыс.

Рис. 8.

Эволюция количества интерстициальных макрофагов в коре почек и OSOM у крыс, получавших гентамицин или хлорид ртути (* P <0,05 по сравнению с контрольной группой).

Рис. 8.

Эволюция количества интерстициальных макрофагов в коре почек и OSOM у крыс, получавших гентамицин или хлорид ртути (* P <0,05 по сравнению с контрольной группой).

Гентамицин ARF

Интерстициальные макрофаги диффузно накапливались как в коре, так и в OSOM и сохранялись до конца наблюдений (рис. 8).Четкой совместной локализации с тубулярной экспрессией OPN никогда не наблюдалось.

Хлорид ртути ARF

Количество интерстициальных макрофагов увеличилось до впечатляющих цифр на 4-й день в OSOM (рис. 8), тогда как в корковом интерстиции не наблюдалось значительного увеличения макрофагов. Совместная локализация с тубулярной экспрессией OPN наблюдалась только в фокусных областях в конце наблюдений, когда макрофаги окружали незрелые проксимальные канальцы с повышенной экспрессией OPN (рис. 5E).

Обсуждение

Мы исследовали экспрессию OPN в почках на двух моделях крыс с отчетливой локализацией острого повреждения канальцев. Мы подтвердили, что иммуноокрашивание OPN в нормальной почке крысы в ​​основном локализовано в почечном папиллярном эпителии и тонких конечностях петли Генле [11,18]. Кроме того, мы впервые продемонстрировали, что экспрессия почечного белка OPN и мРНК одновременно повышается в клетках проксимальных и дистальных канальцев во время токсической ОПН.

Иммуноокрашивание везикулярного OPN в клетках проксимальных канальцев по сравнению с апикальное окрашивание в клетках дистальных канальцев также согласуется с нашими данными при ишемической ARF [18] и с везикулярным паттерном, ранее наблюдавшимся в регенерирующих эндотелиальных клетках сосудов [21]. Идентичность этих пузырьков в почечных клетках до сих пор неизвестна. Они могут соответствовать аппарату Гольджи, где белок гликозилируется и фосфорилируется перед секрецией. Мэдсен и его коллеги [20] обнаружили ОПН в аппарате Гольджи из клеток дистальных канальцев с помощью иммуно-электронной микроскопии.Однако в клетках проксимальных канальцев авторы обнаружили OPN только в эндосомно-лизосомной системе. В проксимальных канальцах из эмбриональной куриной почки OPN локализуется в апикальной тубуло-везикулярной системе и в некоторых полиморфных лизосомоподобных структурах [22]. Эти места предполагают, что иммунореактивный OPN накапливается в клетках проксимальных канальцев после эндоцитотической интернализации. Однако теперь мы продемонстрировали на двух разных моделях сегмент-специфического нефротоксического повреждения, что усиление иммуноокрашивания OPN сопровождалось сопутствующей активацией мРНК OPN не только в дистальных, но и в проксимальных клетках канальцев.

Эти данные показывают, что присутствие иммунореактивного OPN в клетках проксимальных канальцев является вторичным по отношению к индукции гена OPN в этих клетках. Будучи направленным на апикальную клеточную поверхность после синтеза, OPN секретируется в просвет канальцев, но, как и в клетках дистальных канальцев, по крайней мере, его часть может также связываться с апикальной клеточной поверхностью. Также было продемонстрировано, что мембранные белки клеток проксимальных канальцев рециркулируют между плазматической мембраной и эндосомным компартментом [23].Такой механизм мог бы объяснить, почему OPN накапливается на клетках со слабо развитым эндоцитотическим механизмом, таких как клетки дистальных канальцев и регенерирующие клетки проксимальных канальцев, но становится интернализованным в более зрелых клетках проксимальных канальцев, имеющих хорошо развитый эндоцитотический механизм, и также согласовал бы наши настоящие результаты. с таковыми Мадсена и его коллег [20]. Альтернативное объяснение отсутствия OPN на апикальной клеточной поверхности зрелых проксимальных канальцевых клеток обеспечивается гетерогенным составом гликокаликса вдоль нефрона.Это также согласуется с окрашиванием апикального OPN в незрелых регенерирующих клетках проксимальных канальцев, которые демонстрируют потерю клеточной поляризации и изменения в составе клеточных мембран [2,24]. Наконец, клетки проксимальных канальцев могут продуцировать изоформы OPN с биологическими свойствами, отличными от OPN, продуцируемых клетками дистальных канальцев. И фосфорилированный, и нефосфорилированный OPN секретируются нормальными клетками почек крысы (NRK) in vitro ; фосфорилированная форма связывает фибронектин клеточной поверхности, тогда как нефосфорилированная форма связана с растворимым фибронектином [25].Для объяснения этого своеобразного паттерна субклеточного окрашивания необходимо провести дальнейшие исследования по изучению процессинга в почках и транспорта OPN.

Ранее описанные макрофаго-аттрактантные свойства OPN не были подтверждены в настоящем исследовании [9,11]. Пространственная связь между экспрессией OPN в канальцах и накоплением интерстициальных макрофагов была обнаружена только ближе к концу наблюдений в фокальных областях с регенерирующими проксимальными канальцами. Связь может быть более очевидной в экспериментальных моделях, где повреждение является главным образом очаговым.

Точная роль почечного OPN в ARF еще предстоит определить, но пространственно-временной паттерн активации OPN в поврежденных и регенерирующих канальцевых клетках согласуется с ролью в процессе ремоделирования ткани во время ARF. Liaw и др. . [21] предположили аналогичную роль OPN в процессе ремоделирования после сосудистого повреждения, способствуя прикреплению клеток и их распространению. Миграция и распространение регенерирующих канальцевых клеток после обработки гентамицином ранее предполагалась индукцией экспрессии виментина в клетках проксимальных канальцев крыс [26], в то время как частичная совместная локализация виментина и OPN наблюдалась при протеинурии с перегрузкой белком [14].Трубчатые клетки могут активировать OPN, чтобы уменьшить апоптотическую гибель клеток [9], ингибировать активность iNOS и уменьшить образование канальцевых повязок [6]. Следовательно, активация OPN после повреждения почек может представлять стратегию выживания как поврежденных, так и регенерирующих канальцевых клеток, причем первые вносят вклад в поддержание целостности канальцев, а вторые нацелены на репопуляцию базальной мембраны канальцев.

В заключение, экспрессия гена и белка OPN индуцируется как в проксимальных, так и в дистальных канальцевых клетках во время токсической ОПН.Субклеточная локализация предполагает различия в процессинге и / или транспортировке OPN в проксимальных и дистальных тубулярных клетках. Картина пространственно-временного распределения согласуется с возможной ролью защитного фактора при повреждении и регенерации канальцев.

В ходе этого исследования Верле П. Перси и Аня Верхюльст получили стипендию для аспирантов от FWO (Фонд научных исследований, Фландрия) и IWT (Фламандский институт содействия научно-технологическим исследованиям в промышленности) соответственно.Часть этой работы опубликована в абстрактной форме ( J Am Soc Nephrol 1996; 7: 2604). Авторы хотели бы выразить свою благодарность доктору Сесилии М. Джачелли за любезный подарок антисыворотки OP199 и клона кДНК 2B7. Благодарим Риту Мариниссен за ее техническую помощь, Эрика Снелдерса и Эдди Ван Хаута за их секретарскую помощь и Дирка Де Вердта за графический макет.

Список литературы

1

Toback FG. Регенерация после острого некроза канальцев [клиническая конференция].

Kidney Int

1992

;

41

:

226

–2462

Fish EM, Molitoris BA. Изменения полярности эпителия и патогенеза болезненных состояний.

N Engl J Med

1994

;

330

:

1580

–15883

Denhardt DT, Guo X: Остеопонтин: белок с разнообразными функциями.

FASEB J

1993

;

7

:

1475

–14824

Мин Вт, Ширага Х, Чалко С., Гольдфарб С., Кришна Г.Г., Хойер мл.Количественные исследования экскреции уропонтина с мочой.

Kidney Int

1998

;

53

:

189

–1935

Родан Г.А. Обзор остеопонтина.

Ann N Y Acad Sci

1995

;

760

:

1

–56

Нуари Э., Дикман К., Миллер Ф. и др. . Снижение толерантности к острой ишемии почек у мышей с целевым нарушением гена остеопонтина.

Kidney Int

1999

;

56

:

74

–827

Лиав Л., Скиннер М.П., ​​Рейнс Э.В. и др. .Адгезивные и миграционные эффекты остеопонтина опосредуются отдельными интегринами клеточной поверхности. Роль альфа по сравнению с бета 3 в миграции гладкомышечных клеток к остеопонтину in vitro .

Дж. Клин Инвест

1995

;

95

:

713

–7248

Голигорский М.С., Нури Э., Кесслер Х., Романов В. Терапевтический потенциал пептидов RGD при остром повреждении почек.

Kidney Int

1997

;

51

:

1487

–14929

Офашароенсук В., Джачелли С.М., Гордон К. и др. .Обструктивная уропатия у мышей: роль остеопонтина в интерстициальном фиброзе и апоптозе.

Kidney Int

1999

;

56

:

571

–58010

Джачелли С.М., Пихлер Р., Ломбарди Д. и др. . Экспрессия остеопонтина при тубулоинтерстициальном нефрите, индуцированном ангиотензином II.

Kidney Int

1994

;

45

:

515

–52411

Diamond JR, Kees ‐ Folts D, Ricardo SD, Pruznak A, Eufemio M. Ранняя и стойкая повышенная экспрессия почечного кортикального остеопонтина при экспериментальном гидронефрозе.

Am J Pathol

1995

;

146

:

1455

–146612

Pichler R, Giachelli CM, Lombardi D et al . Тубулоинтерстициальное заболевание при гломерулонефрите. Возможная роль остеопонтина (уропонтина).

Am J Pathol

1994

;

144

:

915

–

Couser WG, Johnson RJ. Механизмы прогрессирования почечной недостаточности при гломерулонефрите.

Am J Kidney Dis

1994

;

23

:

193

–19814

Эдди А.А., Джачелли С.М.Почечная экспрессия генов, которые способствуют интерстициальному воспалению и фиброзу у крыс с протеинурией, вызванной перегрузкой белков.

Kidney Int

1995

;

47

:

1546

–155715

Янг Б.А., Бурдманн Э.А., Джонсон Р.Дж. и др. . Клеточная пролиферация и приток макрофагов предшествуют интерстициальному фиброзу при нефротоксичности циклоспорина.

Kidney Int

1995

;

48

:

439

–44816

Клейнман Дж. Г., Вустер Е. М., Бешенский А. М., Шеридан А. М., Бонвентре СП, Браун Д.Повышение экспрессии остеопонтина при ишемии в почках крыс.

Ann N Y Acad Sci

1995

;

760

:

321

–32317

Паданилам Б.Дж., Мартин Д.Р., Хаммерман MR. Инсулиноподобный фактор роста I усиливает экспрессию остеопонтина в почках после острого ишемического повреждения у крыс.

Эндокринология

1996

;

137

:

2133

–214018

Persy VP, Verstrepen WA, Ysebaert DK, De Greef KE, De Broe ME. Различия в активации остеопонтина между проксимальными и дистальными канальцами после ишемии / реперфузии почек.

Kidney Int

1999

;

56

:

601

–61119

Ван Холдер Р., Прет М., Паттин П., Вакет Л., Рингуар С., Ламейр Н. Роль ранней вазоконстрикции в патофизиологии острой почечной недостаточности, вызванной хлоридом ртути. В: Элиаху Х.Э., изд.

Экспериментальная острая почечная недостаточность

. John Libbey, Лондон,

1982

;

206

–20920

Мадсен К.М., Чжан Л., Абу Шамат АР, Зигфрид С., Ча Дж. Х. Ультраструктурная локализация остеопонтина в почках: индукция липополисахаридом.

J Am Soc Nephrol

1997

;

8

:

1043

–105321

Лиав Л., Линднер В., Шварц С.М., Чемберс А.Ф., Джачелли С.М. Остеопонтин и бета 3 интегрин координированно экспрессируются в регенерирующем эндотелии in vivo и стимулируют Arg-Gly-Asp-зависимую миграцию эндотелия in vitro .

Circ Res

1995

;

77

:

665

–67222

Герстенфельд Л.С., Упорова Т., Ашкар С. и др. .Регуляция пре- и посттранскрипционной экспрессии остеопонтина птиц в скелетных тканях.

Ann N Y Acad Sci

1995

;

760

:

67

–8223

Коричневый D, Stow JL. Транспорт и полярность белков в эпителии почек: от клеточной биологии к физиологии.

Physiol Rev

1996

;

76

:

245

–29724

Walker PD. Изменения компонентов внеклеточного матрикса почечных канальцев после ишемического реперфузионного повреждения почки.

Lab Invest

1994

;

70

:

339

–34525

Сингх К., ДеВуж М.В., Мукерджи ББ. Физиологические свойства и дифференциальное гликозилирование фосфорилированных и нефосфорилированных форм остеопонтина, секретируемого нормальными клетками почек крысы.

J Biol Chem

1990

;

265

:

18696

–1870126

Ноувен Э.Дж., Верстрепен, Вашингтон, Байссенс Н, Чжу М.К., Де Бро, Мэн. Гиперплазия, гипертрофия и фенотипические изменения в дистальном отделе нефрона после острого повреждения проксимальных канальцев у крысы.

Lab Invest

1994

;

70

:

479

–493

Европейская почечная ассоциация — Европейская ассоциация диализа и трансплантологии

до-, интра- и послеоперационных факторов повреждения почек у пациентов, перенесших кардиохирургическое вмешательство: ретроспективное когортное исследование

Резюме

Предпосылки

Повреждение почек часто встречается у пациентов, перенесших кардиохирургическое вмешательство, и имеет высокую заболеваемость и смертность.Целью исследования было выявить до-, интра- и послеоперационные факторы риска, ответственные за повреждение почек у пациентов, перенесших кардиохирургические операции.

Материал / методы

Пациенты (n = 1468), перенесшие кардиохирургические операции, были разделены на пациентов с повреждением почек (n = 488) и пациентов без повреждения почек (n = 980) с использованием KDIGO (Заболевание почек: улучшение глобальных результатов) ) критерии. Были собраны и проанализированы данные о переменных до, во время и после операции.

Результаты

Острое повреждение почек произошло у 33,2% исследуемых пациентов. Пациенты с послеоперационным острым повреждением почек имели более пожилой возраст, сопутствующие заболевания, более высокий уровень креатинина в сыворотке до операции, аортокоронарное шунтирование, более длительное время операции, высокое сердечно-легочное шунтирование и время пережатия, низкое центральное венозное давление и более длительную искусственную вентиляцию легких по сравнению с пациентами. без повреждения почек ( P <0,05 для всех). Возраст> 65 лет (OR 1,4), предоперационная гипертензия (OR 2.0), предоперационная анемия (OR 2.3), предоперационная низкая фракция выброса (OR 3.7), индекс коморбидности Чарлсона> 2 (OR 2.5), более длительное время искусственного кровообращения (OR 4.0), переливание крови (OR 2.1), послеоперационная гипотензия (OR 5.2 ) и низкое центральное венозное давление (OR 8.1) были ответственны за повреждение почек. Смертность пациентов с повреждением почек была значительно выше, чем у пациентов без острого повреждения почек (52 против 1, P <0,001).

Выводы

Надлежащий и эффективный контроль пред-, интра- и послеоперационных переменных может снизить риск развития повреждения почек у пациентов, перенесших операции на сердце.

MeSH Ключевые слова: Острая почечная недостаточность, анемия, кардиохирургические процедуры, коронарное шунтирование, гипертония, инсультный объем

Общие сведения

Острое повреждение почек (ОПП) у госпитализированных пациентов вызывает серьезные осложнения, раннюю и позднюю смертность и увеличивает расходы на больницу [1]. ОПП после кардиохирургии (CSA-AKI) обычно встречается у взрослого населения и ассоциируется с высокими показателями заболеваемости и смертности. CSA-AKI — второй по распространенности тип AKI после септического AKI в отделениях интенсивной терапии [2].Несколько связанных факторов во время кардиохирургии, включая пережатие аорты, искусственное кровообращение (CPB), скорость и количество переливаний крови, а также высокие дозы вазопрессоров, которые изменяют перфузию почек, могут вызывать циклы ишемии и реперфузии, увеличивать окислительное повреждение и усиливают почечное и системное воспаление. Все эти механизмы в дальнейшем участвуют в развитии AKI [3]. Многие фармакологические и немедикаментозные методы лечения не смогли снизить CSA-AKI в клинических испытаниях.С другой стороны, периоперационные высокие дозы аторвастатина и отдаленное ишемическое прекондиционирование предоставили минимальные доказательства снижения CSA-AKI [4]. Таким образом, ранняя диагностика и оценка риска ОПП играют ключевую роль при лечении CSA-AKI.

Недавно 2 метаанализа показали, что частота возникновения CSA-AKI составляет 22%, при этом у большинства пациентов имеется легкая AKI [5,6]. Пациенты с CSA-AKI также предвещают более высокие показатели краткосрочной и долгосрочной смертности по сравнению с пациентами, перенесшими кардиохирургическое вмешательство без AKI.После внесения поправок на другие ковариаты, которые могли бы объяснить смертность, существует пропорционально повышенный риск смерти в зависимости от степени тяжести ОПП [7]. Помимо увеличения заболеваемости и смертности, CSA-AKI ассоциируется с увеличением затрат и использования ресурсов, на что указывает более длительное пребывание в больнице, что в дальнейшем пропорционально тяжести AKI [8]. Понимание индивидуальных факторов риска может помочь в профилактике ОПП, что в дальнейшем может привести к снижению заболеваемости, смертности и стоимости лечения.Это особенно полезно в условиях больницы, где предрасположенность пациента можно оценить до операции или введения потенциально нефротоксичных агентов [9]. Точное прогнозирование ОПП дает возможность клиницистам оптимизировать ведение пациентов с высоким риском, усилить мониторинг, включить пациентов в клинические испытания и начать профилактическое и терапевтическое лечение [10]. Хотя многие исследования выявили факторы риска CSA-AKI [5,11–16], данные о клинических факторах риска все еще ограничены [10], особенно в китайском населении.Существует очень мало исследований, оценивающих факторы риска CSA-AKI в популяции Китая [5,13–16]. Более того, большинство ранее проведенных исследований стратифицировали ОПП с использованием системы классификации AKNI (сеть острых травм почек) и системы классификации RIFLE (риск, травма, отказ, потеря функции, терминальная стадия почечной недостаточности). В то время как в нескольких исследованиях использовались проверенные критерии KDIGO (Заболевание почек: улучшение глобальных результатов) [17,18] в условиях кардиохирургии.

В рамках вышеупомянутого контекста, анализ нашего исследования был направлен на оценку пред-, интра- и послеоперационных факторов риска ОПП среди китайского населения, подвергающегося кардиохирургии, с использованием критериев KDIGO.

Материалы и методы

Этические соображения и согласие на участие

Протокол (CB / CR / ERBA / CHS-15/45781, от 1 января 2014 г.) исследования был одобрен комиссией по этике Центральной больницы г. Шанхайский район Цзядин. Исследование соответствовало закону Китая, заявлению STROBE (усиление отчетности наблюдательных исследований в эпидемиологии) и Хельсинкской декларации. Поскольку это исследование представляло собой ретроспективный обзор медицинских записей, требование об информированном согласии и регистрации в китайском реестре клинических испытаний было отменено.Все процедуры исследования были выполнены в соответствии с институциональными принципами, и личность участников исследования была анонимной перед анализом.

Критерии включения

Были проанализированы истории болезни пациентов, перенесших какие-либо хирургические вмешательства на сердце. Типы кардиохирургической процедуры были определены как аортокоронарное шунтирование (АКШ), хирургия клапана, комбинированная АКШ и клапанные процедуры, восстановление врожденных пороков сердца и аневризма аорты.

Критерии исключения

Критерии исключения включали: возраст пациентов моложе 18 лет и старше 90 лет, пациентов, получающих диализ перед операцией, пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности (ТПН) и пациентов с отсутствующими клиническими данными в медицинских картах институт.

Определение AKI

Классификация KDIGO использовалась для стратификации AKI среди кардиохирургических пациентов, где AKI определялся как: креатинин сыворотки (SCr) ≥0,3 мг / дл (≥26,5 мкМ / л) в течение 48 часов или увеличение SCr ≥1,5 раза от исходного значения, которое было известно или предположительно имело место в течение предшествующих 7 дней [19]. KDIGO также рекомендовал систему стадирования ОПП: на стадии 1 SCr ≥0,3 мг / дл (≥26,5 мкМ / л) в течение 48 часов или увеличение SCr ≥1,5 раза от исходного значения, на стадии 2 было увеличение SCr ≥ 2.0–2,9 раза от исходного значения), а на стадии 3 SCr увеличивался в ≥3 раза от исходного значения [17]. В настоящем анализе критерий мочи не использовался. Последнее значение SCr во время госпитализации и до операции было названо исходным SCr. Исходные значения SCr были жестко определены экспертным заключением нефрологов (минимум 3 года опыта) нашего института.

Сбор данных

Все пре-, внутри-. и послеоперационные данные были собраны в заранее определенной форме.Предоперационные переменные включали антропометрические и социальные характеристики, наличие сопутствующих заболеваний, уровень белка в моче, уровень SCr, расчетную скорость клубочковой фильтрации (eGFR), фракцию выброса левого желудочка (LVEF), индекс коморбидности Чарлсона (CCI) и появление хирургия. Интраоперационными переменными были тип хирургической процедуры, продолжительность операции, время искусственного кровообращения (CPB), время перекрестного зажима аорты (AXC) и необходимость переливания крови. Послеоперационными переменными были артериальное давление, центральное венозное давление (ЦВД), объем мочи, повторное обследование, необходимость и время искусственной вентиляции легких, использование ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (ИАПФ) / блокатора рецепторов ангиотензина (БРА) и замещение почек. терапия.

Пациенты, перенесшие операцию на сердце, были разделены на 2 группы: пациенты с ОПН и пациенты без ОПН. Все вышеупомянутые переменные сравнивались, чтобы определить значимые факторы риска ОПП. СКФ рассчитывали с использованием креатининового уравнения для эпидемиологии хронических заболеваний почек [20]. Отмечалась продолжительность пребывания в больнице и в отделении интенсивной терапии. Уровень белка более 15 мг / дл в точечных образцах мочи считался протеинурией.Уровень сывороточной мочевой кислоты более 6,6 мг / дл у женщин и более 7,0 мг / дл у мужчин считался гиперурикемией. Послеоперационное систолическое артериальное давление менее 90 мм рт. Ст. До постановки диагноза ОПП считалось гипотонией. Если общая продолжительность искусственной вентиляции легких составляла 48 часов или более в отделении интенсивной терапии интенсивной терапии, это считалось длительной механической вентиляцией легких. Если пациенту в таком состоянии было выполнено более 1 хирургического вмешательства, при анализе учитывались данные первого хирургического вмешательства.Диурез менее 400 мл / день считался олигурией.

Статистический анализ

Все данные были проанализированы с помощью SPSS версии 20.0. Непрерывные переменные были представлены как среднее значение со стандартным отклонением или медиана с 25–75% процентилями, тогда как категориальные переменные были выражены как частота (n) и пропорция (%). U-критерий Манна-Уитни использовался для сравнения непрерывных переменных, тогда как категориальные переменные сравнивались с точным критерием Фишера. Переменные, которые были статистически связаны с AKI или биологически правдоподобны с развитием AKI, независимо от статистической значимости, подвергались логистической регрессии.Переменные в одномерном анализе со значениями P <0,25 были включены в многомерный анализ, где переменные со значениями P <0,05 в многомерном анализе считались независимыми факторами риска ОПП [21,22]. Прогностическая точность окончательной модели CSA-AKI оценивалась по площади под кривой (AUC) анализа рабочих характеристик приемника (ROC).

Результаты

История болезни

В общей сложности 1761 пациент перенес кардиохирургическую операцию с 5 января 2014 г. по 31 декабря 2016 г. в Центральной больнице Шанхая, Китай.Из них у 214 пациентов отсутствовали клинические данные, 24 пациента были моложе 18 лет, 46 пациентов были старше 90 лет и у 9 пациентов была ТПН. Поэтому эти пациенты были исключены из окончательного анализа. В окончательный анализ были включены данные 1468 пациентов. Согласно определению KDIGO, популяция исследования была разделена на 2 когорты. Пациенты с ОПП были включены в когорту ОПП (n = 448), а пациенты, у которых не было ОПП, были включены в когорту без ОПП (n = 980).

Средний возраст участников исследования составил 57,8 ± 14,3 года с преобладанием мужчин (62,1%). Около 32% пациентов страдали гипертонией и 23,5% пациентов страдали анемией. Наиболее частым типом хирургического вмешательства была АКШ (39,9%), а вторым по частоте хирургическим вмешательством была операция на клапане (38,4%). Среднее время операции составило 3,4 ± 1,7 часа, время CPB — 116,2 ± 6,8 минут. Частота ОПП составила 33,2%: 1 стадия — 348 пациентов (23,7%), 2 стадия — 95 пациентов (6,5%) и 3 стадия — 45 пациентов (3.1%). Из 585 операций АКШ CSA-AKI произошла в 42,9%, в то время как это произошло в 26,1% всех операций на клапанах. Значительно большее количество пациентов в возрасте ( P <0,001), мужчин ( P = 0,041) и страдающих ожирением ( P = 0,01) было зарегистрировано в когорте пациентов с ОПП, чем в когорте без ОПП.

Клинико-лабораторные характеристики

Предоперационные переменные, которые различались между когортами с ОПП и без ОПП, были SCr ( P <0,001), рСКФ ( P <0,001), гипертензия ( P <0.001), сахарный диабет ( P = 0,002), анемия ( P <0,001), ФВЛЖ <45% ( P = 0,002), протеинурия ( P = 0,047), гиперурикемия ( P = 0,011. ) и CCI ( P <0,001). Другие предоперационные клинико-лабораторные характеристики включенных пациентов были одинаковыми в обеих когортах ().

Таблица 1

Антропометрические, социальные параметры и предоперационные клинико-лабораторные характеристики включенных пациентов.

926 926 926

35 90,1 ± 6,2 *

2726 141 (29)

(20)

1

Больше пациентов, перенесших АКШ 0,004 ) и аортальные ( P = 0,029) операции в когорте AKI, чем в когорте без AKI. Пациенты с ОПП имели значительно более продолжительное время операции ( P <0,001), время CPB ( P <0,001) и время AXC ( P <0.001) по сравнению с пациентами без AKI. Кроме того, количество и частота переливания крови ( P = 0,003) были выше среди когорт пациентов с ОПП, чем среди пациентов без ОПП ().

Таблица 2

Интраоперационная клинико-лабораторная характеристика включенных пациентов.

926

16,2 ± 626,8 ± 5,3 ^*

Послеоперационная гипотензия <0,001 P, P 6 см вод. часто встречается у пациентов, у которых развился ОПП, по сравнению с теми, у кого этого не было.Пациенты с ОПП также сообщили о плохих исходах с точки зрения увеличения продолжительности пребывания в стационаре ( P <0,001), пребывания в отделении интенсивной терапии ( P = 0,003) и потребности в диализе ( P <0,001). Летальность была выше среди пациентов с ОПП, чем без ОПП. Пациенты, соответствующие определению ОПП, которые умерли во время пребывания в больнице, были в 104 раза выше, чем пациенты без ОПП (). В течение периода наблюдения умерло сравнительно большее количество пациентов с ОПП 3 стадии (30 пациентов), чем со 2 стадией ОПП (17 пациентов) и 1 стадией (5 пациентов) ().Также было увеличено количество госпитализаций в связи с прогрессированием ОПП.

Летальность больных в зависимости от стадии острой почечной недостаточности в период наблюдения.

Таблица 3

Послеоперационная клинико-лабораторная характеристика включенных пациентов.

Значения

(2) )

Оценка факторов риска

Предоперационные, интра- и послеоперационные факторы клинической значимости при ОПП подвергались воздействию логистический регрессионный анализ. Независимые факторы риска CSA-AKI оценивались с помощью серии логистической регрессии. В текущем исследовании было идентифицировано в общей сложности 11 значимых детерминант CSA-AKI, включая пожилой возраст, предоперационную гипертензию, предоперационную анемию, LVEF <45%, CCI> 2, время CPB ≥110 минут, перелитые эритроциты, послеоперационная гипотензия, CVP <6 cmH ₂ O, ИВЛ ≥9 часов и использование ИАПФ / БРА.Послеоперационное ЦВД <6 см вод. Ст. ₂ O и гипотензия были самыми сильными предикторами CSA-AKI.

Анализ кривой ROC окончательной прогностической модели дал AUC 0,911 со стандартной ошибкой 0,013 и P -значение <0,001. Кроме того, анализ подгрупп показал, что АКШ [OR = 3,2 (2,2–4,8), P <0,001] и смешанная хирургия [OR = 1,8 (1,3–5,8), P = 0,037] были связаны с развитием ОПП у пациенты после кардиохирургии ().

Таблица 4

Оценка независимых факторов риска острого повреждения почек с помощью логистического регрессионного анализа.

лет ^*

1,540

2,0–4,6

,73

час

93–119 93–197

Обсуждение

При анализе 1468 пациентов, перенесших кардиохирургическое вмешательство, послеоперационные ОПП возникли у 33.2% случаев, когда у большинства пациентов была 1 стадия по критериям KDIGO. Частота ОПП в анализе соответствовала результатам других исследований, проведенных на азиатских популяциях [15,23]. Однако частота, о которой сообщалось в текущих результатах, была выше, чем в других исследованиях, проведенных с использованием критериев AKIN [24] и критериев RIFLE [25]. Разница в зарегистрированной заболеваемости может быть связана с несколькими причинами, включая различные определения, используемые для классификации ОПП, время оценки ОПП, диурез по сравнению с критериями SCr и популяционные характеристики.Использование нескольких критериев для стратификации ОПН приводит к большему расхождению в заболеваемости, а также к эпидемиологии ОПН [21]. Более того, в настоящем анализе большинство участников принадлежат к когорте старшего возраста с нарушенной функцией почек. Однако частота ОПП в настоящем исследовании была тесно связана с предыдущими исследованиями, проведенными в китайской популяции [15,23]. Тем не менее, наиболее важным аспектом текущего открытия было значительное количество пациентов, перенесших ОПП после различных видов кардиохирургических вмешательств.Следует использовать единообразные и согласованные определения для обобщения и сравнения результатов, полученных в опубликованной литературе.

Наиболее частыми операциями в настоящем исследовании были АКШ и клапанные процедуры, но распространенность ОПП была выше у пациентов, перенесших АКШ, по сравнению с теми, кто перенес клапанные и другие операции. Эти результаты согласуются с результатами ретроспективного анализа [7,14,26,27], но в отличие от результатов исследования, в котором распространенность CSA-AKI была значительно выше при хирургии клапанов [5], но это было мета -анализ и имел косвенные доказательства.В настоящем анализе пациенты, перенесшие АКШ, были старше, имели больше нарушений функции почек и сопутствующих заболеваний по сравнению с пациентами, перенесшими клапанные и другие операции. Это могло быть возможной причиной того, что распространенность ОПН была выше при АКШ по сравнению с другими операциями. ОПП у пациентов, перенесших операцию на клапане, отличается от таковой у пациентов, перенесших операцию АКШ.

Большинство случаев ОПН в настоящем анализе были легкими (стадия 1), однако исследование выявило случаи летальности в группе 1 стадии ОПП.Кроме того, результаты нашего исследования показали, что легкая ОПП также вызвала плохие исходы и смертность по сравнению со случаями без ОПП. Критерии KDIGO для AKI включают легкие случаи с преходящим повышением SCr [19]. Следовательно, выявление и лечение даже легкой ОПП является первоочередной задачей для снижения послеоперационной смертности у пациентов, перенесших операцию на сердце.

Пациенты с ОПН имели значительно более высокий уровень смертности по сравнению с пациентами без ОПН. Уровень смертности в нашем текущем исследовании (4%) соответствовал результатам ретроспективного анализа, в котором общий коэффициент госпитальной летальности составил 4.1% [14]. Более того, пациенты с CSA-AKI, нуждающиеся в диализе, показали более высокий уровень смертности; аналогичные результаты были представлены в ретроспективном исследовании [23]. Кроме того, в нашем исследовании пациенты с ОПП имели значительно более длительное пребывание в стационаре и в ОИТ, чем пациенты, которые не соответствовали критериям ОПП. Эти результаты согласуются с результатами других исследований, проведенных на китайской популяции [12,15,23]. В совокупности, настоящее исследование показало, что послеоперационная ОПП была частым осложнением после кардиохирургии и сопровождалась плохими исходами и высокой смертностью.

Наше исследование показало, что у большего числа умерших пациентов была стадия 3 ОПП, за которой следовала стадия 2 ОПП, а затем стадия 1 ОПП. Результаты нашего исследования соответствовали ретроспективным исследованиям [14,17,23,28] . Классификация KDIGO дает более точное представление о уровне смертности и повышает чувствительность диагностики ОПП [29]. Результаты нашего исследования подтвердили рекомендацию оценить факторы риска развития ОПН до операций на сердце.

Логистический регрессионный анализ показал, что ЦВД <6 см вод.Самым сильным фактором риска было ЦВД <6 см вод. Этот вывод согласуется с результатами предыдущих исследований в китайской популяции и подчеркивает важность послеоперационного замещения жидкости как эффективной меры профилактики ОПП [15]. Гипотония, определяемая систолическим артериальным давлением <90 мм рт.ст. после операции, но до развития ОПН, была еще одним сильным предиктором ОПН. Использование ИАПФ / БРА было связано с риском снижения СКФ [30].Наше исследование пришло к выводу, что пациенты, принимавшие гипотензивные препараты, имели в 2 раза больший риск развития ОПП.

Наш анализ показал, что мужской пол имел в 1,5 раза более высокую склонность к развитию ОПН по сравнению с женщинами, но пол не выявил какой-либо связи с CSA-AKI в нашем многомерном анализе. Влияние пола на оценку риска ОПП все еще обсуждается. Ретроспективные исследования показали, что мужчины подвержены высокому риску развития ОПН [14,20,23,26]. Другие ретроспективные исследования показали, что женщины подвержены высокому риску развития ОПП [18,27].Несколько исследований показали, что пол не является предиктором CSA-AKI [1,16]. Существует необходимость в дальнейших исследованиях влияния гендера на развитие CSA-AKI.

Дооперационная анемия была определена как один из важных изменяемых факторов риска в настоящем анализе. Анемия вызывает снижение доставки кислорода почками и нарушает гемостаз. CPB также вызывает нарушение гемостаза, что в дальнейшем приводит к увеличению риска кровотечения. В совокупности, дисфункция тромбоцитов, вызванная анемией, вызывает чрезмерное кровотечение во время операции на сердце, что требует более частого переливания крови, что еще больше увеличивает риск ОПП [11].Наше исследование подтвердило результаты предыдущей литературы [11,12]. Предоперационная анемия влияет на развитие ОПН.

Текущий анализ показал, что предоперационная гипертензия и сахарный диабет в значительной степени связаны с ОПП, но только гипертензия продемонстрировала независимую связь с ОПП в нашем многомерном анализе. Результаты анализа были аналогичны результатам другого когортного исследования [1]. Сопутствующие заболевания влияют на развитие ОПП.

Другими модифицируемыми во время операции параметрами риска распространенности ОПП в текущем анализе были операция, CPB и время AXC, которые ранее были описаны в литературе [12,14,23]. Еще одним важным интраоперационным фактором риска, выявленным в настоящем исследовании, было переливание крови. Опубликованные данные показали, что переливание крови во время CPB само по себе может способствовать риску AKI, усугубляя синдром системного воспалительного ответа, инициированного CPB, вторым воспалительным ответом, что дополнительно способствует ишемическому реперфузионному повреждению почек [12].Более того, хорошо задокументировано, что даже небольшое постепенное увеличение SCr может вызвать худшие краткосрочные и долгосрочные результаты, связанные со смертностью и заболеванием почек de-novo [20]. Результаты настоящего исследования подчеркивают внимание лечащих врачей к изменяемым во время операции факторам риска, способствующим развитию ОПН. Эти факторы следует тщательно контролировать и, если их невозможно избежать, следует учитывать при планировании наблюдения за пациентами после кардиохирургических операций.

Следует учитывать несколько ограничений текущего анализа. Поскольку настоящее исследование носило ретроспективный характер, нельзя игнорировать риск систематических ошибок при интерпретации результатов. Более того, анализ не давал точной предоперационной оценки СКФ, и возможно, что у некоторых пациентов на момент включения в исследование уже были почечные дисфункции. И последнее, но не менее важное: классификация ОПП в настоящем исследовании основывалась на SCr, а не на диурезе.Однако классификация ОПП на основе диуреза менее практична из-за удаления мочевых катетеров через 2 дня после операции. В будущем необходимы крупные популяционные исследования, чтобы подтвердить результаты текущего исследования и разработать модифицируемую шкалу риска, особенно среди китайского населения.

Блокада остеопонтина ослабляет повреждение почек после реперфузии ишемии путем ингибирования инфильтрации NK-клеток

Abstract

Ишемия-реперфузия почек (RIR) — обычное явление после обширных операций и шока, приводящее к острому повреждению почек (AKI).Остеопонтин (OPN) — это секретируемый гликопротеин, который действует как провоспалительный цитокин и активатор Т-лимфоцитов. Мы предположили, что блокада OPN снижает тяжесть воспаления и травмы в RIR. Ишемию почек индуцировали у взрослых мышей C57BL / 6 посредством двустороннего пережатия почечных ножек в течение 35 минут с последующей реперфузией в течение 24 часов. Антитело против OPN (Ab), неиммунизированный изотип IgG или физиологический раствор вводили внутривенно во время реперфузии. На анализ брали кровь и почки.Через 24 часа после RIR уровни мРНК и белка OPN были значительно увеличены в почечной ткани по сравнению с фиктивными мышами. В сыворотке у мышей, получавших анти-OPN Ab, повышенные уровни BUN и креатинина были снижены по сравнению с носителем. У мышей, получавших анти-OPN Ab, также были снижены уровни мРНК маркеров повреждения, липокалина, ассоциированного с нейтрофильной желатиназой, (NGAL) и молекулы повреждения почек-1 (KIM-1) по сравнению с носителем. Гистологическая архитектура и апоптоз почечной ткани были улучшены у мышей, получавших антитела против OPN.В почечной ткани уровни воспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α были снижены у мышей, получавших Ab. Инфильтрация NK-клеток уменьшалась после лечения анти-OPN Ab, как и инфильтрация нейтрофилов, о чем свидетельствует снижение экспрессии хемокинов и почечное иммуногистохимическое окрашивание Gr1. Эти данные демонстрируют положительную роль блокады OPN в RIR, связанной с опосредованным NK-клетками подавлением воспалительных цитокинов и хемокинов. Следовательно, введение анти-OPN Ab может служить иммуномодулирующим дополнением при лечении RIR-индуцированной AKI.

Ключевые слова: Острое повреждение почек, воспаление, апоптоз, нейтрофилы, NK-клетки

ВВЕДЕНИЕ

Почечная ишемия-реперфузия (RIR) часто возникает после серьезного хирургического вмешательства, такого как трансплантация почки, или после гиповолемического или септического шока. RIR может привести к острому повреждению почек (AKI) и связан с высокой заболеваемостью и смертностью. У тяжелобольных пациентов с ОПП оценочная смертность составляет 30–70%, что выше, когда они связаны со стадией 2 или 3 ОПП (1–5).Эти пациенты также в два раза чаще будут переведены в учреждение краткосрочной или долгосрочной медицинской помощи, а не на дому, что значительно увеличивает расходы на здравоохранение (1, 3). После первоначального инсульта у многих пациентов развивается хроническая болезнь почек и, в конечном итоге, терминальная стадия почечной недостаточности. Поскольку окончательного лечения ОПН не существует, варианты лечения сосредоточены исключительно на профилактике и поддерживающей терапии. Тем не менее, продолжающиеся исследования продолжают продвигать наше понимание патофизиологии ишемической ОПП, приводя к новым подходам к лечению.

При ишемии лишение кислорода и доставки питательных веществ к клеткам приводит к накоплению в ткани отходов метаболизма, что приводит к гибели клеток (1, 6). В почках повреждение аноксических клеток развивается в эпителиальных клетках почечных канальцев (ТЭК) (1). Врожденные иммунные клетки, такие как естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги, активируются и мигрируют в ткань, что вызывает дальнейшее клеточное повреждение ТЭК за счет высвобождения цитокинов и активных форм кислорода (7, 8).Из клеток врожденного иммунитета NK-клетки представляют собой цитотоксические лимфоциты, которые играют решающую роль в повреждении RIR (9–11). Эти клетки содержат перфорин и гранзимы, и при высвобождении в непосредственной близости от клеток-мишеней перфорин образует поры в клеточной мембране, через которые могут проникать гранзимы, вызывая апоптоз или осмотический лизис клеток (12). Также известно, что NK-клетки обеспечивают иммунитет против патогенов и опухолей благодаря своей способности секретировать цитокины (7). Эти клетки конститутивно экспрессируют рецепторы цитокинов и хемокинов, обеспечивая быстрый ответ провоспалительных молекул, которые усиливают накопление полиморфно-ядерных гранулоцитов, вызывая повреждение тканей (7).

Некоторые молекулы / факторы были идентифицированы как регуляторы активации и инфильтрации NK-клеток во время RIR. Остеопонтин (OPN) представляет собой секретируемый гликопротеин, который первоначально был идентифицирован как молекула костного матрикса, но позже было обнаружено, что он повсеместно экспрессируется в широком диапазоне тканей с множеством функций, включая миграцию клеток, адгезию и активацию лимфоцитов (13). После повреждения почек экспрессия OPN значительно повышается во всех сегментах канальцев и клубочках (13).Использование мышей с нокаутом OPN (KO) продемонстрировало роль OPN в стимулировании индуцированного NK-клетками почечного повреждения во время RIR, и что в условиях in vitro OPN может приводить к миграции и активации NK-клеток, вызывая гибель TEC (10). С другой стороны, у мышей OPN KO также было продемонстрировано повышенное повреждение после RIR, что свидетельствует о ренопротекторной роли OPN (14). Это несоответствие может быть связано с различиями в генетическом происхождении этих линий мышей KO. Кроме того, использование мышей KO не отражает нормальной физиологии.Чтобы устранить несоответствие между этими двумя исследованиями роли OPN во время RIR и выяснить, является ли OPN подходящей мишенью для терапевтического вмешательства, мы оценили эффект блокирования активности OPN на повреждение RIR у животных дикого типа (WT) с нормальной экспрессией OPN. .

В этом исследовании, используя модель RIR на мышах, мы показали, что уровни мРНК и белка OPN значительно повышаются в почечной ткани после ишемического повреждения. Повреждение почек, воспаление и апоптоз ослаблялись, когда анти-OPN антитело (Ab) вводили мышам RIR по сравнению с животными, которым вводили носитель.Этот улучшенный прогноз был связан со снижением инфильтрации NK-клеток в почках во время RIR. Эти данные подтверждают нашу гипотезу о том, что нейтрализация OPN может снизить тяжесть повреждения почек за счет уменьшения инфильтрации NK-клеток в RIR.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животная модель RIR

Взрослых самцов мышей C57BL / 6 (возраст 8–10 недель, 20–25 г; Charles River Laboratories; Уилмингтон, Массачусетс) индуцировали 2,5% ингаляционным изофлураном, а затем готовили. промывание живота 10% повидон-йодом.Был сделан разрез по средней линии, и кишечник был смещен, чтобы выявить двусторонние почечные хилы. Микроваскулярные зажимы накладывали на каждую почечную ножку на 35 мин; после удаления брюшная полость закрывалась непрерывным нейлоновым швом 6-0 и подкожно вводился болюс 500 мкл физиологического раствора. Реперфузия разрешена на 24 ч; Затем животных собирали на кровь и почечную ткань. Имитационным животным была выполнена лапаротомия без ишемии почек. Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами использования экспериментальных животных Национальными институтами здравоохранения (Bethesda, MD) и были одобрены Комитетом по уходу и использованию институциональных животных (IACUC) Института медицинских исследований Файнштейна.

Введение нейтрализующего антитела OPN

Во время реперфузии мышам инъецировали одно из следующего: (1) очищенные сродством мыши поликлональные Ab, антитела против OPN (R&D Systems; Миннеаполис, Миннесота; Каталожный номер: AF808 ), (2) нормальный (неиммунизированный) козий иммуноглобулин G (IgG) (R&D Systems; каталожный номер: AB-108-C) или (3) PBS (носитель). Антитела вводили в дозе 1,5 мг / кг в объеме 100 мкл PBS. Инъекции производили в хвостовую вену у основания хвоста с использованием инсулинового шприца U-100 29G × 1/2 дюйма (Terumo Medical Corporation; Элктон, Мэриленд).Перед инъекцией кожа была обработана 70% -ным изопропиловым спиртом, а после этого на место было оказано давление, чтобы предотвратить кровотечение и способствовать гемостазу.

Анализ сывороточных маркеров почечной функции

Образцы крови центрифугировали при 2000 g в течение 15 минут для сбора сыворотки, а затем либо немедленно анализировали на параметры повреждения, либо хранили при -80 ° C. Азот мочевины крови (АМК) и креатинин измеряли с использованием коммерческих наборов для анализа в соответствии с инструкциями производителя (Pointe Scientific; Lincoln Park, MI).

Количественный анализ ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК экстрагировали из почечной ткани и гомогенизировали с использованием ультразвукового дисмембратора в TRIzol (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния). Затем РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей (Applied Biosystems; Foster City, CA). Реакцию ПЦР проводили в 20 мкл конечного объема, содержащего 1,25 пмоль прямого и обратного праймера, ~ 350 нг кДНК и 10 мкл основной смеси для ПЦР SYBR Green (Applied Biosystems). Температурный профиль, используемый машиной для ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7300, составлял: 50 ° C в течение 2 минут, 95 ° C в течение 10 минут, 45 циклов при 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 1 минуты.Для нормализации использовали β-актин мыши. Относительная экспрессия мРНК была представлена ​​как кратное изменение по сравнению с фиктивной группой. Последовательности праймеров были разработаны с использованием программного обеспечения Primer 3 (15), которое включает: OPN ({«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «NM_001204201», «term_id»: «323668332). «,» term_text «:» NM_001204201 «}} NM_001204201) Вперед: TCTGATGAGACCGTCACTGC, Назад: AGGTCCTCATCTGTGGCATCOPN; NGAL ({«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «NM_005564.4», «term_id»: «7465″, «term_text»: «NM_005564.4 «}} NM_005564.4): Вперед: CTCAGAACTTGATCCCTGCC, Обратное: TCCTTGAGGCCCAGAGACTT; KIM-1 ({» type «:» entrez-нуклеотид «,» attrs «: {» text «:» NM_134248.2 «,» term_id » : «262231820», «term_text»: «NM_134248.2»}} NM_134248.2): TGCTGCTACTGCTCCTTGTG, Reverse: GGGCCACTGGTACTCATTCT; KC ({«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: » NM_008176 «,» term_id «:» 229577225 «,» term_text «:» NM_008176 «}} NM_008176): Вперед: GCTGGATTCACCTCAAGAA, Обратное: ACAGGTGCCATCAGAGCAGT; β-actin ({» type «:» entders «, entrez- {«text»: «NM_007393», «term_id»: «

5786″, «term_text»: «NM_007393»}} NM_007393): Вперед: CGTGAAAAGATGACCCAGATCA, Назад: TGGTACGACCAGAGGCATACAG.

Измерение провоспалительных цитокинов и OPN

Провоспалительные цитокины, интерлейкин 6 (IL-6) и фактор некроза опухоли (TNF) -α в почечной ткани были определены количественно с использованием наборов для иммуноферментного анализа мыши (ELISA) (BD Biosciences). , Франклин Лейкс, Нью-Джерси). ОПН в почечной ткани измеряли с использованием набора ELISA для мышей (R&D Systems).

Гистологическая оценка повреждения почек и иммуногистохимия

Ткань почек фиксировали в 10% формалине и заливали парафином.Ткань разрезали на срезы 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). С помощью световой микроскопии степень повреждения оценивалась слепым методом по следующим категориям: повреждение канальцевых клеток, отслоение канальцевых клеток, потеря границы кисти, тубулярное упрощение и формирование гипсовой повязки. Гистологические изменения оценивали слепым методом в соответствии с модифицированной системой баллов, основанной на степени повреждения ткани (16). Вкратце, оценка 0 соответствует 0% травм, 1 (<10%), 2 (10-25%), 3 (25-50%), 4 (50-75%) и 5 ​​(> 75%), для максимального результата 25.Баллы были усреднены для каждой выборки по 10 случайно выбранным полям.

Для иммуногистохимии Gr-1 залитые в парафин почечные ткани депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в последовательных промывках этанолом. Срезы нагревали в 0,92% -ном буфере лимонной кислоты (Vector Laboratories; Burlingame, CA) при 95 ° C в течение 30 минут. После охлаждения слайды инкубировали с 2% H ₂ O ₂ /60% метанола и блокировали нормальной кроличьей сывороткой / трис-буферным физиологическим раствором. Наносили анти-Gr-1 Ab (Abcam; Cambridge, MA) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C.Реагент Vectastain ABC и набор DAB (Vector Laboratories) использовали для обнаружения иммуногистохимической реакции. Срезы контрастировали гематоксилином и исследовали под фазово-контрастным световым микроскопом Eclipse Ti-S (Nikon; Мелвилл, Нью-Йорк). Программное обеспечение для визуализации NIS-Elements BR (Nikon) использовали для количественного определения окрашенных в коричневый цвет клеток Gr-1 ⁺ .

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, dUTP, анализ ник-конца (TUNEL)

Присутствие апоптотических клеток измеряли с помощью in situ мечения фрагментации ДНК с использованием анализа TUNEL.Использовали набор для обнаружения клеточной смерти in situ (Roche Diagnostics; Индианаполис, Индиана). Слайды контрастировали с 4 ‘, 6-диамидино-2’-фенилиндол дигидрохлоридом (DAPI). Анализ проводился с использованием светового микроскопа Eclipse Ti-S (Nikon), а программное обеспечение для визуализации NIS-Elements BR (Nikon) использовалось для количественной оценки флуоресцентных клеток.

Измерение активности каспазы-3

Ткань почек гомогенизировали в буфере для лизиса (10 мМ HEPES, pH 7,4; 5 мМ MgCl ₂ ; 1 мМ DTT; 1% Triton X-100; 2 мМ EGTA; 2 мМ EDTA. ), содержащий ингибитор протеазы (Roche Diagnostics; Indianapolis, IN).Концентрации белка определяли с помощью реагента для анализа белков Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA). Пептид субстрата каспазы-3 (DEVD-AMC) добавляли к аналитическому буферу (20 мМ HEPES, pH 7,4; 5 мМ DTT, 2 мМ EDTA, 0,1% CHAPS). После 60–90 мин инкубации при 37 ° C в темноте флюорометрический ридер использовался для измерения возбуждения (365–380 нм) и эмиссии (430–460 нм). Результаты были разделены на концентрацию белка и выражены как кратное изменение.

Оценка NK-клеток с помощью проточной цитометрии

NK-клетки были очищены из почек мыши через 24 часа после RIR или фиктивной лапаротомии.Клетки выделяли с помощью панкреатина (Sigma-Aldrich; Сент-Луис, Миссури) и расщепления коллагеназой (Уортингтон; Лейквуд, Нью-Джерси), как описано ранее (17). Вкратце, почечные гидролизаты инкубировали при 37 ° C в течение 10 минут, а затем пропускали через фильтр с размером ячеек 70 мкм. Клетки окрашивали флуоресцентными антителами APC-CD3, PE-CD49b и PE-изотипом контроля (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния) в буфере для проточной цитометрии (PBS, 2% фетальной телячьей сыворотки, 0,1% азида натрия). Для каждого эксперимента по проточной цитометрии для обнаружения антигенов клеточной поверхности с использованием многоцветных флуоресцентных антител мы использовали неокрашенные контроли с одноцветной компенсацией, чтобы избавиться от любого возможного побочного эффекта индивидуальной флуоресценции.Данные были получены с использованием проточного цитометра BD LSRFortessa (BD Biosciences; Сан-Хосе, Калифорния) и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6.5 (FlowJo LLC; Ashland, OR).

Статистический анализ

Данные выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) и сравниваются с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и теста Стьюдента-Ньюмана-Кеулса (SNK) для множественных сравнений групп. Значимость считалась, если p <0,05 между экспериментальными группами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

RIR увеличивает экспрессию OPN в почках

Сначала мы определили, увеличилась ли экспрессия OPN в почках после RIR.Экспрессия OPN на уровне его мРНК была увеличена в 13 раз в почках RIR по сравнению с ложнооперированными животными (). Точно так же было обнаружено, что уровни белка OPN увеличиваются в 3 раза в почках RIR по сравнению с фиктивными мышами ().

Повышение экспрессии OPN в почках после RIR

Почечную ткань мышей, обработанных ложным, носителем, контрольным IgG и анти-OPN Ab, собирали через 24 часа после RIR. Уровни мРНК OPN (A) и белка (B) определяли с помощью qRT-PCR и ELISA, соответственно.Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 6–10 мышей / группа) и сравниваются с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA методом SNK. * p <0,05 по сравнению с фиктивным. RIR - ишемия-реперфузия почек; ОПН, остеопонтин; ИФА, иммуноферментный анализ.

Нейтрализация OPN улучшает функцию почек после RIR

Мы исследовали функцию почек, анализируя сывороточные уровни BUN и креатинина. И BUN, и креатинин были значительно увеличены в носителе после RIR по сравнению с фиктивными мышами. Мыши, обработанные неиммунизированным контрольным антителом IgG, не показали значительных различий по сравнению с мышами, обработанными носителем.У мышей, получавших анти-OPN Ab, хотя уровни BUN и креатинина все еще были значительно выше, чем у животных, подвергшихся ложной операции, мы заметили значительное снижение уровней BUN и креатинина на 25% и 22%, соответственно, по сравнению с мышами, получавшими носитель. ().

Нейтрализация OPN улучшает почечную функцию

Образцы сыворотки из групп имитации, носителя, контроля IgG и анти-OPN Ab были собраны для измерения (A) BUN и (B) креатинина. Данные выражены как среднее значение ± SEM (n = 7–9 мышей / группа) и сравниваются с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA методом SNK.* p <0,05 по сравнению с фиктивным; ^# p <0,05 по сравнению с носителем; ^ψ p <0,05 по сравнению с IgG. АМК - азот мочевины крови; ОПН, остеопонтин.

Нейтрализация OPN снижает уровни маркеров повреждения почек после RIR

Чтобы определить повреждение почек, мы проанализировали дополнительные маркеры, которые были выделены в недавно опубликованных исследованиях (18, 19). Во-первых, мы изучили липокалин, связанный с желатиназой нейтрофилов (NGAL), который служит ранним биомаркером ОПП (18).Он является частью липокалинового суперсемейства секретируемых белков, значительно активированных в стимулированных эпителиальных клетках (18). Уровень мРНК NGAL был снижен на 41% у мышей, получавших анти-OPN Ab, по сравнению с мышами, получавшими носитель (). Затем мы изучили экспрессию молекулы-1 повреждения почек (KIM-1), которая представляет собой трансмембранный белок, экспрессирующийся на низком уровне в нормальной почке, но резко повышенный в постишемической почке (19). Уровень мРНК KIM-1 был значительно снижен на 49% в почках мышей, получавших анти-OPN Ab, по сравнению с мышами, получавшими носитель ().

Нейтрализация OPN снижает новые маркеры почечного повреждения

Почечную ткань мышей, обработанных ложным, носителем, контрольным IgG и анти-OPN Ab, собирали для измерения мРНК (A) NGAL и (B) KIM-1 с помощью qRT-PCR. Уровни их экспрессии были нормализованы по β-актину, и для сравнения фиктивность была обозначена как 1. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 6-8 мышей / группа) и сравниваются с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA методом SNK. * p <0,05 по сравнению с фиктивным; ^# p <0.05 по сравнению с автомобилем; ^ψ p <0,05 по сравнению с IgG. ОПН, остеопонтин; NGAL, липокалин, связанный с желатиназой нейтрофилов; КИМ-1 почечная травма молекула-1.

Нейтрализация OPN защищает от повреждения почечной ткани после RIR

Чтобы определить, приводит ли ингибирование активности OPN с помощью Ab к уменьшению повреждения почек, мы оценили гистологию ткани с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Через 24 часа после RIR наблюдалась заметная разница в степени повреждения клеток канальцев и образования гипсов у животных, получавших анти-OPN Ab, по сравнению с контрольными мышами, получавшими носитель и IgG ().Используя полуколичественную гистологическую оценку, была рассчитана оценка травмы на основе критериев, описанных в разделе «Материалы и методы». Улучшение на 37% было отмечено у мышей, получавших анти-OPN Ab, по сравнению с группой носителя (). Помимо этого, при кратком исследовании срезов нашей почечной ткани после RIR мы наблюдали некоторые качественные различия в уровнях повреждения клубочков и подоцитов, при этом лечение анти-OPN Ab показало уменьшение повреждений (данные не показаны).

Нейтрализация OPN снижает гистологическое повреждение почек.

Срезы почечной ткани мышей, обработанных имитацией, носителем, контрольным IgG и анти-OPN Ab, собирали после RIR и окрашивали H&E. (A) Репрезентативные срезы показаны при 200-кратном увеличении. (B) Оценка гистологического повреждения, как описано в разделе «Материалы и методы». Оценка представляет собой процент морфологических изменений следующим образом: 1, <10%; 2, 10–25%; 3, 26–50%; 4, 51–75%; 5+,> 75%. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 10 микроскопических полей на группу) и сравниваются с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA методом SNK. * p <0,05 по сравнению с фиктивным; ^# p <0,05 по сравнению с носителем; ^ψ p <0.05 против IgG. H&E, гематоксилин и эозин; ОПН, остеопонтин.

Нейтрализация OPN подавляет почечный апоптоз после RIR

Клеточный апоптоз является отличительной чертой повреждения тканей во время RIR. Анализ TUNEL проводили на срезах почечной ткани, и он показал значительное увеличение TUNEL-положительного окрашивания в группе носителя и контрольной группе IgG по сравнению с фиктивными животными (). Напротив, у мышей RIR, получавших анти-OPN Ab, наблюдалось снижение TUNEL-положительного окрашивания на 79% по сравнению с мышами-носителем ().Каспаза-3 служит важным медиатором клеточного апоптоза, вызывая повреждение тканей во время воспаления (20). Мы провели анализ ферментативной активности каспазы-3, который показал значительное повышение регуляции в почечных тканях во время индукции RIR; однако его активность была значительно снижена в группе, получавшей анти-OPN Ab, на 59% по сравнению с животными-носителями ().

Нейтрализация OPN снижает почечный апоптоз

Срезы почечной ткани мышей, обработанных имитацией, носителем, контрольным IgG и анти-OPN Ab, собирали через 24 часа после RIR. (A) Репрезентативные микрофотографии показывают TUNEL-позитивное (зеленый) и DAPI (синий) ядерное контрастное окрашивание. (B) TUNEL-положительных клеток на 200 × поле. (C) Анализ активности фермента каспазы-3 проводили с тканью почек. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (анализ TUNEL, n = 20 микроскопических полей / группа; анализ Caspase n = 6–9 мышей / группа) и сравниваются с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA методом SNK. * p <0,05 по сравнению с фиктивным; ^# p <0,05 по сравнению с носителем; ^ψ p <0.05 против IgG. ОПН, остеопонтин; TUNEL, мечение ник-концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP; DAPI, 4 ', 6-диамидино-2'-фенилиндол дигидрохлорид.

Нейтрализация OPN снижает провоспалительные цитокины в почках после RIR

Воспаление — еще один важный путь, вызывающий повреждение после RIR. Мы измерили уровни провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α в почечной ткани. С помощью ELISA было обнаружено, что уровень IL-6 значительно увеличился у мышей с носителем и контрольным IgG, но значительно снизился на 30%, когда мышей RIR лечили антителами против OPN по сравнению с мышами с носителем ().Было также обнаружено, что TNF-α значительно увеличивался у мышей с носителем и контрольным IgG, но снижался на 51% в группе, получавшей анти-OPN Ab, по сравнению с мышами с носителем (). Таким образом, воспаление почек значительно уменьшается, когда OPN эффективно нацелен на его нейтрализующие Ab.

Нейтрализация OPN снижает воспаление почек

Почечную ткань мышей, обработанных имитацией, носителем, контрольным IgG и анти-OPN Ab, собирали для измерения уровней цитокинов (A) IL-6 и (B) TNF- α с помощью ELISA.Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 6–9 мышей / группа) и сравниваются с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA методом SNK. * p <0,05 по сравнению с фиктивным; ^# p <0,05 по сравнению с носителем; ^ψ p <0,05 по сравнению с IgG. ОПН, остеопонтин; ИЛ, интерлейкин; TNF, фактор некроза опухоли; ИФА, иммуноферментный анализ.

Нейтрализация OPN снижает инфильтрацию NK-клеток в почках после RIR

NK-клетки вносят важный вклад в повреждение почек после RIR (9).Используя флуоресцентно меченые антитела для маркеров, специфичных для NK-клеток, проточную цитометрию использовали для идентификации популяции NK-клеток из суспензии цельных клеток почек. CD3 ^— CD49b ⁺ NK-клетки отбирали через серию ворот; сначала регистрировали лейкоциты в общей популяции клеток почек, затем клетки CD3 ^— и, наконец, клетки CD49b ⁺ (). Было обнаружено, что популяция NK-клеток увеличивалась у мышей-носителей в 7 раз по сравнению с фиктивными мышами. С другой стороны, частота NK-клеток в почках мышей RIR, получавших анти-OPN Ab, была значительно снижена на 31% по сравнению с мышами, получавшими носитель ().

Нейтрализация OPN снижает инфильтрацию NK-клеток

Почечную ткань мышей, обработанных ложным, носителем, контрольным IgG и анти-OPN Ab, собирали через 24 часа после RIR. Клетки выделяли и окрашивали на CD3 ^— CD49b ⁺ NK-клеток. (A) Показаны типичные изображения потоков со стратегиями стробирования. (B) Частоты NK-клеток, выраженные в процентах от CD3 ^— лейкоцитов. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM (n = 8–10 животных / группа) и сравниваются с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA методом SNK.* p <0,05 по сравнению с фиктивным; ^# p <0,05 по сравнению с носителем; ^ψ p <0,05 по сравнению с IgG. Н.К., естественный убийца; ОПН, остеопонтин.

Нейтрализация OPN снижает инфильтрацию нейтрофилов в почках после того, как было показано, что NK-клетки RIR

способствуют инфильтрации нейтрофилов в ткани при воспалении (21). Для оценки нейтрофилов на срезах почечной ткани проводили иммуногистохимию для Gr-1, антител, специфичных для нейтрофилов. Было обнаружено, что Gr-1 увеличивался в почках мышей контрольной группы носителя и IgG, но уменьшался на 85% у мышей, получавших анти-OPN Ab ().Также известно, что NK-клетки экспрессируют провоспалительные хемокины во время воспаления (12). Чтобы определить рекрутирование нейтрофилов, мы выполнили количественную ПЦР для хемокинового (мотив C-X-C) лиганда-1 (CXCL-1), также известного как хемоаттрактант кератиноцитов (KC). Уровни мРНК хемокина KC увеличились в 13 и 15 раз у мышей, использующих носитель, и контрольных мышей IgG, соответственно; однако мыши RIR, получавшие анти-OPN Ab, снижали уровень KC на 39% по сравнению с животными, получавшими носитель ().

Нейтрализация OPN снижает инфильтрацию нейтрофилов

Срезы почечной ткани мышей, обработанных имитацией, носителем, контрольным IgG и анти-OPN Ab, собирали через 24 часа после RIR. (A) Репрезентативные иммуногистохимические изображения срезов почек показаны при 200 × с 400 × вставками. Коричневые точки указывают на положительное окрашивание Gr1, тогда как ядра контрастируют с синим цветом. (B) Определяют Gr1-положительных клеток на 200-кратное поле. (C) Почечную ткань мышей, обработанных ложным, носителем, контрольным IgG и антителом против OPN Ab, собирали для измерения мРНК KC с помощью кПЦР. Уровни их экспрессии были нормализованы по β-актину, и для сравнения фиктивность была обозначена как 1.Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (IHC n = 20 полей / группа; qRT-PCR n = 7-10 мышей / группа) и сравниваются с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA методом SNK. * p <0,05 по сравнению с фиктивным; ^# p <0,05 по сравнению с носителем; ^ψ p <0,05 по сравнению с IgG. ИГХ, иммуногистохимия; ОПН, остеопонтин; KC, хемоаттрактант кератиноцитов.

ОБСУЖДЕНИЕ

ОПП, вызванная травмой RIR, является дорогостоящим и обременительным событием, осложняющим болезнь для многих пациентов. Здесь мы провели исследование с использованием антител против OPN для смягчения опосредованного RIR AKI.Мы обнаружили, что ингибирование OPN его нейтрализующим Ab способно улучшить функцию почек на мышиной модели RIR. Почки мышей проявляли защиту от повреждений, как показал гистологический анализ, и снижали апоптоз, как видно из тестов TUNEL и каспазы-3. Блокада OPN также привела к уменьшению воспаления почечной ткани. Проточная цитометрия NK-клеток в почках показала уменьшение популяции мышей, получавших лечение анти-OPN Ab. Кроме того, снижение экспрессии хемокинов KC и уменьшение инфильтрации нейтрофилов Gr-1 по данным иммуногистохимии подтверждают гипотезу о том, что ингибирование инфильтрации NK-клеток было механизмом, с помощью которого было обнаружено, что блокада OPN эффективна при RIR.

Блокада ОПН привела к сохранению функции почек и уменьшению их повреждения. Это было продемонстрировано снижением уровней азота мочевины, креатинина, NGAL и KIM-1 у мышей, получавших анти-OPN Ab, что коррелировало с гистологическими данными. АМК и креатинин являются наиболее широко оцениваемыми диагностическими и прогностическими маркерами почечных заболеваний, но новые маркеры повреждений, такие как NGAL и KIM-1, стали многообещающими биомаркерами следующего поколения в клинической нефрологии (18, 19). NGAL был впервые очищен от нейтрофилов человека из-за его ассоциации с желатиназой, и он сильно повышен в почках мышей с ранней постишемией (22).KIM-1 представляет собой трансмембранный гликопротеин, который способствует обструкции просвета канальцев, что характеризует ОПП (23). В клинических исследованиях и NGAL, и KIM-1 являются биомаркерами, которые показали способность прогнозировать ОПП за несколько дней до повышения уровня креатинина в сыворотке (24). В нашем исследовании нацеливание на OPN привело к значительному снижению как NGAL, так и KIM-1, что подчеркивает значение блокады OPN в уменьшении травм RIR.

Апоптоз — основная патофизиологическая причина повреждения тканей во время RIR. Наш анализ TUNEL выявил значительно меньше TUNEL-положительных клеток в почках, обработанных антителами против OPN, а также меньшую ферментативную активность каспазы-3 по сравнению с почками-носителем и контрольными IgG.Многообещающая область исследований RIR, в частности, включает антиапоптотическое лечение. Стратегия с использованием короткой шпилечной РНК (shRNA), которая нацелена на Fas и каспазу-8 и подавляет их, оказалась защитной в RIR (25). В более позднем исследовании было показано, что ингибитор апоптоза макрофагального белка (AIM) способствует восстановлению после AKI (26). В другой степени, защищая целостность митохондрий, основная органелла участвовала в индукции апоптоза с помощью 5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеозида (AICAR) и карнитина, который также улучшал функцию почек после RIR (27).В соответствии с этими исследованиями, ослабление апоптоза с помощью лечения анти-OPN Ab также приводит к улучшению результатов после RIR.

Острое воспаление, вызванное RIR, считается еще одним важным путем повреждения. Мы обнаружили усиление экспрессии OPN после RIR в почках, а также в кровообращении (данные не показаны). Сообщалось об индукции экспрессии OPN во время острых и хронических воспалительных заболеваний, как и других провоспалительных цитокинов и хемокинов (28, 29). OPN действует как хемотаксический агент, который способствует миграции воспалительных клеток к месту повреждения, и действует как адгезивный белок, удерживающий клетки (29, 30).В этом исследовании нейтрализация анти-OPN Ab значительно подавляла экспрессию провоспалительных цитокинов IL-6 и TNF-α в почках по сравнению с носителем. В сыворотке также было показано, что уровни TNF-α и IL-1β снижаются при лечении анти-OPN Ab у животных с RIR (данные не показаны). Аналогичным образом Hirano et al. использовал анти-OPN Ab в мышиной модели сепсиса для подавления воспаления, что привело к положительным результатам (28). Нацелив OPN с помощью нейтрализующего Ab, мы смогли снизить чрезмерную продукцию цитокинов и уменьшить повреждение TEC, что привело к общему улучшению после RIR.

Ранее было показано, что NK-клетки важны для повреждения RIR (9–11). NK-клетки производят токсичные молекулы, такие как перфорин и гранзимы, которые вызывают гибель клеток (12). Мы обнаружили, что инфильтрация NK-клеток уменьшилась после лечения анти-OPN Ab в почках после RIR. Zhang et al. впервые описал взаимодействия между ТЕС и NK-клетками, которые приводят к апоптотической гибели ТЕС (9). Кроме того, используя мышей OPN KO, они обнаружили, что мыши KO имели меньшую инфильтрацию NK-клеток и меньшее повреждение тканей во время RIR по сравнению с мышами WT (10).Мы также показали, что инфильтрация нейтрофилов была ослаблена у мышей, получавших анти-OPN Ab, что коррелировало со сниженной экспрессией хемокина KC. Ранее Kim et al. показали, что передача сигналов через костимулирующий лиганд CD137L в TECs важна для опосредованного NK-клетками рекрутирования нейтрофилов (21). Обратная передача сигналов через CD137L привела к продукции хемокинов CXCL1 / KC и CXCL2 (21). Помимо опосредованной NK-клетками инфильтрации нейтрофилов, нельзя исключить прямую роль OPN в индукции инфильтрации нейтрофилов, основываясь на предыдущем отчете, показывающем, что OPN служил хемоаттрактантом для миграции нейтрофилов in vitro (31).Тем не менее, NK-клетки являются важной частью патогенеза OPN-опосредованного повреждения посредством рекрутирования нейтрофилов после RIR.

Хотя OPN был исследован другими группами в контексте травмы RIR (10), его результаты в литературе противоречивы. Как упоминалось ранее, Zhang et al. обнаружили, что у мышей OPN KO улучшилась функция почек с меньшим повреждением тканей после RIR по сравнению с мышами WT. Другое исследование с использованием мышей OPN KO обнаружило ухудшение функции почек, связанное с более сильным структурным повреждением, чем у мышей WT, после RIR (14).Поскольку OPN выполняет множество важных функций, связанных с формированием / ремоделированием кости (13), его отсутствие может привести к затруднениям в нормальном формировании кости и к развитию заболеваний, связанных с костной тканью. В почках OPN также продуцируется эпителием просвета нефронов в гомеостатических условиях (13). Он секретируется в жидкость канальцев, но его функция точно не известна (13). В этом исследовании мы разработали терапевтический подход с использованием анти-OPN Ab для лечения RIR-животных, который более точно отражает нормальную физиологию, сохраняя базальные гомеостатические функции OPN нетронутыми.

Сохранение функции трансплантата почек имеет решающее значение для эффективной трансплантации. Современные экспериментальные стратегии с участием белков, которые подавляют воспаление, окислительный стресс и апоптоз, улучшают выживаемость и функцию трансплантата на животных моделях трансплантации (32). Хотя нет такой литературы, демонстрирующей роль OPN в сохранении трансплантата почки, недавнее исследование было сосредоточено на роли OPN в повреждении аллотрансплантата почки (33). Отторжение трансплантата — это процесс, при котором иммунная система реципиента трансплантата атакует пересаженный орган или ткань, рассматривая их как чужеродное вещество.Недавние исследования показали, что естественные клетки-киллеры (NK) цитотоксичны по отношению к эпителиальным клеткам канальцев и способствуют острому ишемическому реперфузионному повреждению почек (9, 10). Было показано, что OPN, который может активировать NK-клетки для опосредования гибели эпителиальных клеток канальцев, сильно экспрессируется в трансплантатах почек (33). Почечные трансплантаты, не содержащие OPN, имели меньшее повреждение после трансплантации мышам, что указывает на то, что OPN играет пагубную роль в повреждении почечного аллотрансплантата (33). Поскольку наше текущее исследование продемонстрировало положительный результат после лечения анти-OPN Ab с точки зрения ослабления повреждения и воспаления почечной ткани за счет ингибирования инфильтрации NK-клеток в почке, дальнейшие исследования с использованием анти-OPN Ab могут предоставить дополнительную информацию для защиты от повреждения аллотрансплантата почки во время трансплантации. .

В нашем исследовании мы получили умеренный эффект на функциональные маркеры почек при лечении анти-OPN Ab у мышей с повреждениями, вызванными RIR. Здесь мы приняли модель RIR, которая фокусировалась только на острой фазе, собирая образцы после 24 часов реперфузии. Однако мы предполагаем, что эксперименты, проведенные в более поздние периоды времени, дадут ценную информацию о степени эффективности лечения анти-OPN Ab для значительного снижения параметров заболевания. Дальнейшие исследования по более длительным временным точкам RIR, отличным от 24 часов, будут представлять большой интерес.Одна из ловушек нашего исследования заключается в том, что мы не смогли установить сильную экспериментальную связь между лечением анти-OPN у мышей RIR и модуляцией инфильтрации NK-клеток. Тем не менее, на основании текущих литературных данных мы делаем вывод об их причинно-следственной связи, поскольку Zhang et al и Victorino et al показали, что патология AKI напрямую связана с NK-клетками (9, 11), а OPN напрямую связана с NK-клетки (10).

Таким образом, мы продемонстрировали, что нейтрализация OPN может уменьшить почечную дисфункцию, вызванную чрезмерным воспалением, повреждением клеток, апоптозом и инфильтрацией нейтрофилов после RIR.Эти эффекты, вероятно, связаны с уменьшением набора NK-клеток в почки. Хотя роль OPN широко изучалась в области RIR, выводы сильно разошлись. Наша цель исследовать OPN посредством нейтрализации антител дает дополнительные доказательства того, что OPN является вредным агентом при ишемии почек. Следовательно, нацеливание на OPN после RIR может быть многообещающим терапевтическим вариантом для пациентов с высоким риском ишемического повреждения почек.

Экспрессия, роли, рецепторы и регуляция остеопонтина в почках

Экспрессия, роли, рецепторы и регуляция остеопонтина в почках. Остеопонтин (OPN) представляет собой секретируемый гликопротеин как в фосфорилированной, так и в нефосфорилированной формах. Он содержит последовательность связывания клеток Arg-Gly-Asp и сайт расщепления тромбином. ОПН в основном присутствует в петле Генле и дистальных отделах нефронов нормальных почек у животных и человека. После повреждения почек экспрессия OPN может значительно повышаться во всех сегментах канальцев и клубочках. Исследования с использованием мышей с дефицитом гена OPN, животных, получавших антисмысловую или анти-OPN, продемонстрировали, что OPN способствует накоплению макрофагов и может играть роль в опосредованном макрофагами повреждении почек, но эффект может быть слабым и непродолжительным. .С другой стороны, OPN обладает некоторым ренопротекторным действием при повреждении почек, например, повышает толерантность к острой ишемии, ингибирует индуцибельную синтазу оксида азота и подавляет синтез оксида азота, снижает уровень перекиси в клетках и способствует выживанию клеток, подвергшихся гипоксии, уменьшая апоптоз клеток. и участие в регенерации клеток. Кроме того, OPN связан с почечными камнями, но вопрос о том, действует ли он в качестве промотора или ингибитора образования камней, является спорным. Было продемонстрировано, что рецепторы OPN включают два семейства: интегрин и CD44.Рецепторы интегрина OPN включают α _v β ₃ , α _v β ₁ , α _{v 5} и α ₉ β ₁ и α ₄ β ₁ . В нормальных почках человека стандартный CD44 экспрессируется наиболее доминирующим образом. Различные функции OPN опосредуются разными рецепторами. Гормон паращитовидной железы, витамин D ₃ , кальций, фосфат и некоторые цитокины увеличивают экспрессию OPN in vitro или in vivo, тогда как женские половые гормоны и ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента или антагонисты рецепторов ангиотензина II снижают экспрессию OPN при некоторых состояниях повреждения почек.