Пцр днк диагностика что это: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции

Что такое ПЦР-анализ?

Что такое ПЦР-анализ?

ПЦР — это метод лабораторной диагностики, направленный на выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Трёхбуквенный вариант — это аббревиатура названия «полимеразная цепная реакция». Собственно, в этом названии и отражается суть метода, но для того, чтобы разобраться, придётся основательно вспомнить школьный курс биологии.

Но сначала – немного истории. Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии. Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.

В литературе очень часто встречается такое образное описание ПЦР: это метод, с помощью которого учёные могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. В принципе, очень точное описание. Если продолжать сравнение, то игла – это небольшой участок генетического материала микроорганизма, а стог сена – это организм человека, в котором данный микроорганизм поселился.

Что показывает анализ ПЦР

Анализ позволяет обнаружить присутствие генетического материала инфекционных возбудителей. ПЦР в гинекологии и в урологии широко применяется для выявления скрытых и труднодиагностируемых инфекций. В том числе выполняется ПЦР и на ВИЧ.

Принцип работы

За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК — двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики – правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе.

У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) – своя ДНК, причём для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК, но и её фрагменты можно находить с помощью ПЦР.

Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий.

Один цикл ПЦР длится около трёх минут, количество копий растёт в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.

Достоинства

Теория – это, безусловно, замечательно, но что мы имеем на выходе? Какую практическую выгоду получает человек, когда отправляется на поиски вредоносных микроорганизмов, вооруженный ПЦР?

• Безусловно, одно из главных достоинств — это универсальностьметода. ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем.
• Следующий плюс — высокая специфичность. В материале, направленном на исследование, определяется уникальная последовательность нуклеотидов, характерная только для конкретного возбудителя. Таким образом, можно говорить, что специфичность метода достигает 100%. Кроме того, это позволяет одновременно, в одном и том же материале, проводить поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба для качества ответа.
• Метод обладает высочайшей чувствительностью – мы уже говорили о том, что возможно найти всего один фрагмент генетического материала возбудителя.
• Несомненное преимущество метода – оперативность. Постановка реакции занимает несколько часов, таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет всего один день.
• При помощи ПЦР определяют возбудителя , а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.

тестирование — что это такое, как работает метод ПЦР, показания, подготовка к проведению ПЦР-теста, как проводится ПЦР-анализ, результаты теста

Опубликовано: 10.02.2021 13:07:00    Обновлено: 18.02.2021   Просмотров: 149778

ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.

Суть метода ПЦР

ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.

Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.

Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.

Преимущества метода ПЦР

1. Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Таким образом, специфичность теста стремится к 100%. Исключен риск ложноположительных результатов.
2. Чувствительность. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена (или даже уже неактивных – разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве), чтобы он был обнаружен в ходе исследования.
3. Скорость проведения. Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент – уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки.
4. Универсальность. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны.
5. Диагностика латентных инфекций. ПЦР-диагностика определяет возбудителя инфекции даже в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания.

Какие есть недостатки

Единственный серьезный недостаток, связанный с методом полимеразной цепной реакции, — его высокая технологичность. Исследования ПЦР требуют строжайших соблюдений правил и серьезной оснащенности лабораторного комплекса. Не каждая лаборатория может позволить себе все необходимое оборудование.

Показания к проведению ПЦР-анализа

ПЦР – один из наиболее востребованных способов диагностики в медицине, и применяется он в самых разных областях:

• Диагностика инфекционных заболеваний (гепатит, ВИЧ, TORCH-инфекции и огромное множество других видов патогенов).
• Урогинекология (диагностика инфекций, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазма, микоплазма, кандиды, гарднерелла, герпесвирусы). Важное значение для женского и мужского здоровья играет ВПЧ – вирус папилломы человека. Доказано, что у женщин онкогенные штаммы этого вируса способны вызывать рак шейки матки.
• Неонатология. Существует целый ряд инфекций, способных поражать плод еще в материнской утробе. Среди них вирусы герпеса, токсоплазмы, краснухи. ПЦР-диагностика позволяет правильно определить тактику ведения и риски внутриутробной инфекции.
• Респираторные заболевания. Диагностика методом ПЦР стала в 2020 году актуальной как никогда и продемонстрировала свою незаменимость и эффективность. ПЦР-анализ – главный тест и «золотой стандарт» диагностики коронавирусной инфекции Sars-Cov-2 (COVID-19), ставшей причиной самой масштабной пандемии последних десятилетий.
• Генетика. Наследственные заболевания и отцовство также диагностируются при помощи метода ПЦР.

ПЦР-тесты применяются везде, где нужен быстрый, точный и надежный результат.

Подготовка к проведению ПЦР-теста

Еще одно немаловажное преимущество ПЦР-анализов – это отсутствие специфической подготовки к проведению тестов. Достаточно следовать стандартным рекомендациям специалиста:

• Анализ сдается утром натощак. При этом ряд генетических исследований проводится в произвольное время, удобное пациенту.
• 
  При сдаче анализа по мазку из ротоглотки необходимо выдержать интервал с приемом пищи и воды в 3-4 часа перед тестом.
• 
  Перед анализом на венерические инфекции необходимо воздержаться от половой активности в течение суток.
• 
  Перед анализом нельзя использовать никакие противовирусные препараты.

Подробную инструкцию по правилам подготовки к каждому анализу вы всегда можете получить у лечащего врача или у консультантов на нашей горячей линии.

Как проводится ПЦР-анализ

С 1983 года, когда был изобретен данный метод, прошло много времени, и технологии не стоят на месте. Сегодня существует несколько различных методик для проведения ПЦР-теста:

1. С обратной транскрипцией. Самый распространенный способ идентификации известной последовательности РНК, включающий амплификацию, определение патогена и его идентификации среди образцов, хранящихся в научной картотеке.
2. Вложенная ПЦР (или «гнездовая») — используется для снижения количества неспецифичных продуктов реакции и имеет две стадии с использованием двух видов праймеров.
3. Изотермические методы – не требуют повторяющихся температурных циклов, менее энергозатратны.
4. Инвертированная ПЦР — применяется, если имеется только короткий фрагмент известной последовательности, но необходимо определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
5. ПЦР в реальном времени — метод, позволяющий определить не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество ее копий после каждого цикла амплификации, что дает возможность для проведения тестов с количественным результатом

Это далеко не все существующие на сегодняшний день разновидности ПЦР-технологий. Ученые активно развивают эту важную и перспективную область лабораторной диагностики, совершенствуют методы ПЦР, оттачивают техники и изобретают новые подходы.

Результаты ПЦР-теста

Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.

Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.

когда нужно сдавать, как проводится исследование, методы диагностики заболеваний

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики[1]. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию[2]. Высокотехнологичный лабораторный метод диагностики дает возможность выявлять множество заболеваний на самых ранних стадиях. Как проводится ПЦР-диагностика, когда назначают исследование с помощью этого метода и как подготовиться к анализу. Ответы на эти и другие вопросы — в статье.

ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, находящихся в пробах биоматериала, например в крови.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Сферы применения метода

Для чего же нужен ПЦР? Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции.

Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики[3,4]:

• ВИЧ;
• герпеса;
• различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
• кандидоза;
• гепатитов;
• мононуклеоза;
• листериоза;
• цитомегаловируса;
• туберкулеза;
• вируса папилломы человека;
• клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины. В условиях нынешней сложной эпидемиологической обстановки ПЦР-метод используют для диагностики вирусных заболеваний, в том числе коронавирусной инфекции COVID-19[5].

Кстати

Метод ПЦР применяется не только в медицинских целях. В наши дни он используется и в иных сферах, например в криминалистике — в тех случаях, когда требуется определить, кому принадлежит найденный на месте преступления биоматериал[6]. ПЦР иногда используется также при установлении отцовства[7].

Преимущества и недостатки подхода

Какие плюсы у диагностики методом ПЦР?

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а также в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекает латентно.

Универсальность. Для проведения ПЦР-анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.

Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.

Оперативность. Результат, как правило, готов через пять–семь часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.

Точность. Метод ПЦР практически не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа[8].

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в проверенных лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала[9]. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы. Для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты. Для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала[10]. Кровь сдается натощак утром. Мочу также следует собрать утром в стерильный контейнер и сдать в лабораторию в ближайшие два часа. Перед взятием мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации. Пациент, принимающий какие-либо лекарственные препараты или БАД, должен сообщить об этом врачу: возможно придется остановить курс приема, так как действующие вещества средства могут исказить результаты лабораторного анализа.

Методы ПЦР-диагностики заболеваний

Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.

Как расшифровать результаты ПЦР-исследования

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным[11]. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Значит, заболевание находится на очень ранней стадии развития. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь раннем этапе, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна: она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК[12]. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

Вся информация, касающаяся здоровья и медицины, представлена исключительно в ознакомительных целях и не является поводом для самодиагностики или самолечения.

ПЦР-диагностика

ПЦР ( Полимеразная цепная реакция )  Если попытаться описать ПЦР-диагностику в трёх словах, то это, совершенно определённо, будут слова ТОЧНО, НАДЁЖНО, БЫСТРО. На сегодняшний день, ПЦР-диагностика является самым точным и чувствительным методом выявления инфекционных  и генетических заболеваний. За 30 лет, с момента своего появления в 1983 году, этот уникальный метод уверенно завоевал весь мир, принеся своему изобретателю Кэрри Мюллису, Нобелевскую премию в области химии за 1993 год. Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую, но абсолютно заслуженную популярность.

Диагностика инфекционных заболеваний, в том числе вызванных трудно культивируемыми микроорганизмами, их генотипирование, оценка вирулентности (степень болезнетворности), определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, пренатальная диагностика генетических заболеваний, биоконтроль препаратов крови — вот неполный перечень направлений, где с успехом применяется ПЦР.

Достоинства ПЦР-диагностики:

• Высочайшая специфичность – В процессе анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный (присущий) только конкретному возбудителю —  бактерии или вирусу. Этот участок ДНК уникален и не характерен ни для одной другой инфекции на Земле. Можно говорить, что специфичность метода достигает 100% или близка к этому. Это позволяет в одном и том же материале, проводить одновременный поиск нескольких возбудителей без какого-либо ущерба качеству.
• Высочайшая чувствительность –  Метод ПЦР позволяет выявить одну-единственную болезнетворную бактерию среди миллиардов других, предоставив через несколько часов, 50 миллиардов ее копий! Он работает там, где другие методы: микроскопический, бактериологический, иммуноферментный, бессильны. Достоверный диагноз при помощи ПЦР можно ставить по 10 — 100 возбудителям в пробе, в то время как для других тестов эта цифра составляет 1000 — 1000 000.
• Оперативность —  Постановка реакции занимает всего несколько часов, т.к. не требуется искусственное выращивание возбудителя. Процесс максимально автоматизирован. Таким образом, вся диагностика, от момента сдачи материала на анализ до получения результата, отнимет один день.
• Прямое определение возбудителей инфекционных заболеваний – методом  ПЦР определяют возбудителя, а не реакцию на его внедрение со стороны организма. Таким образом, появилась возможность точно диагностировать заболевание еще в инкубационном периоде, когда нет никаких клинических или лабораторных признаков болезни.
• Абсолютная универсальность — ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Оборудование, используемое для ПЦР, стандартно, оно не зависит от того, что именно и где именно мы ищем. Для ПЦР-исследования может применяться практически любые материалы, в том числе недоступные для исследования другими методами: слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток, почва и т.д.

Описание метода

Думается, пришло время, перейти от восторженных эпитетов и хвалебных речей к описанию, собственно ПЦР метода. И постараться сделать это так, чтобы даже максимально далёкий от молекулярной биологии читатель, смог оценить красоту и изящество метода, а заодно уяснить за что же, собственно, дают Нобелевскую премию…. 

Для начала, нужно понять сущность решаемой задачи и основную проблему, мешающую нам всё устроить легко и просто….

Уже задолго до начала 80-х годов учёным биологам было ясно, что анализ генетической информации содержащеёся в хромосомах любой живой (да и не вполне живой, тоже) клетки, позволяет однозначно определить хозяина этих клеток. Это относится, как к человеку и животным, так и к мельчайшим бактериям и вирусам – без исключений. Вся генетическая  информация записана внутри ДНК.   Так вот, решаемая в ту пору  задача формулировалась весьма просто — хорошо бы найти метод, который позволил бы извлекать из клетки  ДНК, и идентифицировать ее по принципу: «Это ДНК вируса гриппа, это — стафилококка, а это — хламидии». Тогда, взяв у человека каплю крови, мокроту, мочу и т.д., можно было бы легко установить, не содержатся ли в этих биологических пробах возбудители инфекций.  Но… Во-первых, выделить ДНК из клеток неповрежденной практически невозможно — она рвется в произвольных местах, и даже  выделяя её 100 раз из 100 одинаковых клеток, мы получим  тысячи кусков генов во фрагментах разной длины. Ясно, что ни сравнивать, ни анализировать тут будет нечего. Во-вторых, даже если каким-то чудом удастся выделить и безошибочно определять ДНК возбудителя инфекции, сложности остаются. Ведь ДНК, например, вируса, содержится в пробе, среди миллиардов других клеток,  в таких ничтожных количествах, что её запросто можно не заметить, и получить отрицательный результат вместо положительного. Можно, конечно, искусственно вырастить культуру для увеличения объема вирусной ДНК, но, во-первых, не все возбудители болезней хорошо культивируются в искусственных условиях, и, во-вторых, на это требуется значительное время…

Теперь нам пора разобраться с мироустройством, и начать называть вещи своими именами.  Итак, что же это такое ДНК и РНК,  как это всё устроено и из чего состоит ?

Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа, его геном.  Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. Это весьма напоминает винтовую лестницу, «перила» которой удерживаются вместе за счёт «ступенек». 

ДНК (ДезоксирибоНуклеиновая Кислота) имея чрезвычайно сложную структуру, тем не менее,  строится из достаточно простых структурных компонентов, тех самых «ступенек»  – нуклеотидов.

Нуклеотиды бывают 5-и видов :

• Тимин (Thymine)      ( T )
• Аденин (Adenine)    ( A )
• Гуанин (Guaninne)   ( G )
• Цитозин (Citosine)   ( C )
• Урацил (Uracil)         ( U )

Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, наш  ген, определяющий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов.

«Ступеньки» в нашей «лестнице», на самом деле не целые, а состоят из 2-х половинок – 2-х разных нуклеотидов.  Но всё дело в том, что половинки не могут соединяться, как попало, а только особыми «комплементарными» парами. Комплементарность – это точное взаимное соответствие и взаимное дополнение. Если хотите — единство противоположностей!  Нуклеотиды обладают свойством комплементарности,  т.е. сцепляться друг с другом могут только нуклеотиды, входящие в одну комплементарную пару. Никакие другие связи в природе не возможны. Это весьма напоминает поведение магнитов, когда южный полюс легко сцепляется с северным, а попытки соединить юг с югом и север с севером обречены на провал… Здесь тоже самое, только полюсов не два, а четыре (попробуйте это себе представить). Свойство комплементарности — ключевое в методе ПЦР.

Комплементарными являются пары Тимин — Аденин  и Гуанин – Цитозин.

Практически это означает, что напротив аденина (A) в одной цепочке ДНК, в другой цепочке обязательно стоит тимин (T), а напротив гуанина (G) – цитозин (C). Схематически  всё это выглядит следующим образом:

Кроме ДНК, точно такую же структуру имеет РНК ( рибонуклеиновая кислота ), отличающаяся от ДНК тем, что вместо тимина в ней используется урацил и комплементарная пара имеет вид A — U.

РНК – является хранителем генетической информации у некоторых вирусов, которые называются ретровирусами. Наиболее известный и активно изучаемый представитель этого поганого семейства  —  ВИЧ.

Чтобы представить сложность структуры ДНК и РНК, вдумайтесь в следующий факт: если развернуть спираль ДНК, её длина окажется около ста восьмидесяти сантиметров. Не смотря на то, что размеры клетки исчисляются микронами, из-за очень специфической плотной упаковки спирали, ядро клетки свободно вмещает десятки хромосом.

Итак, пора переходить к решению задачи. 

Рассматривая поставленную выше задачу, мы уже увидели две основных проблемы на пути к её решению. Понятно, что с одной стороны, выискивать клетку возбудителя инфекции среди миллионов клеток крови – занятие достаточно бесперспективное, если не сказать бестолковое, а с другой стороны,  выделять ДНК из клеток » в рукопашную» – тоже не вариант, из-за опасности  порвать на кусочки, всё что мы с таким трудом отыскали… Поэтому, нам очень помог бы какой-нибудь метод, позволяющий активно размножать ДНК, но делающий это только с определёнными, «избранными» экземплярами. Это позволит увеличивать концентрацию интересующей культуры до уровней, безошибочно определяемых и не требующих длительного поиска. 

Вот этим чудо-методом и стал метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).  В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.  Так это звучит сухим академическим языком. Но мы задались целью, объяснить Вам всё, буквально, «на пальцах», а потому продолжим свой рассказ о том, как всё происходит.

На первом этапе реакции надо разъединить двойную нить ДНК. Этот процесс называется денатурацией и проходит при температуре 93 — 95 градусов Цельсия. Уже через 30 — 40 секунд связи нуклеотидов разрываются и вместо двойной цепи получаются две одиночные.

Надо заметить, что если после этого, снова, просто понизить температуру, то разделившиеся половинки достаточно быстро находят друг друга и всё возвращается, практически, к исходному состоянию. Следовательно, нам надо не дать соединиться половинкам интересующей нас ДНК. Как этому помешать? – приставить на её место (хотя бы временно) что-то, что точно соответствует небольшому фрагменту ДНК и в точности повторяет комплементарную последовательность небольшой цепочки нуклеотидов. Тогда, место на половинке-основании окажется занято, при попытке присоединения, свойство комплементарности окажется нарушено, и вторая половинка не сможет прицепиться на своё «законное» место. Это «что-то» названное праймером,  синтезируется в научной или промышленной лаборатории и представляет собой цепочку синтетических нуклеотидов (олигонуклеотидов), расположенных в таком же порядке, как и у того вируса (бактерии и так далее), на который делается анализ. Например, если делают анализ на хламидии, то праймер соответствует специфическому участку гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis.

Итак, вторая стадия — присоединение праймеров к ДНК (также называется отжигом)  длится от 20 до 60 секунд. Температура отжига равна 50 — 65 градусам (для каждого вида возбудителей, т.е. для каждого праймера, она своя).

На этом этапе мы уже разделили ДНК на две половинки и не даём им соединиться. Теперь самое время достроить каждую половинку до полноценной ДНК. Но температура, при которой это должно произойти, очень высока, по меркам молекулярной биологии  – более 70 градусов (выше температуры отжига). Проблема была решена благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этого фермента заключается в его исключительной термостойкости (период полужизни при 95 градусах составляет 40 минут) и высокой рабочей температуре — оптимум работы 72градуса. В клетках, фермент ДНК-полимеразы отвечает за копирование и «ремонт» ДНК и способен удлинять короткие нуклеотидные цепочки праймеров, последовательно присоединяя к одному из концов праймера дополнительные нуклеотиды, таким образом, достраивая цепь до конца. Так ДНК копирует саму себя.

Третий этап — достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от конца к концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор «кирпичики» — все те же производные аденина, гуанина, цитозина и тимина. Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70 — 72 градуса. Время протекания синтеза зависит от длины достраиваемого фрагмента и обычно принимается равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

Теперь мы имеем две двойные цепочки ДНК вместо одной, исходной.

Ну а дальше процесс повторяется. Опять температура повышается до 93 — 95 градусов, цепочки разъединяются… и так далее. Обычно за 1 — 2 часа при наличии вирусной ДНК ее становится столько, что не заметить ее, даже при стандартном методе обнаружения становится просто нереально.

Схематично, это выглядит так:

Подведём итог: каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию (денатурация) происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую (отжиг) — происходит присоединение праймера к участку нити ДНК. И, наконец, в заключительной третьей стадии, «фермент-строитель»  достраивает нити, восстанавливая ДНК.   В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения (амплификаций) определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни тысяч или миллионы копий.

Детекция и Real-Time PCR

Полимеразная цепная реакция требует быстрой смены температур, ведь идет она в три этапа. Поначалу для каждой стадии использовали отдельную водяную баню, что сильно увеличивало время получения результата. Поставить «на поток» метод помогли специальные автоматические термостаты — амплификаторы, в которых изменение температуры происходит по заданной программе. Современный амплификатор – сложный электронный прибор, не только управляющий циклами амплификации и поддерживающий необходимые температуры, но и делающий количественные замеры после каждого цикла.

Эта технология называется «Real-Time PCR», или ПЦР в реальном времени. В её основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

Для этого в состав реакционной смеси, наряду с праймерами  и другими компонентами реакции, добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд выполнен по той же технологии, что и праймер и отличается он него тем, что на одном его конце прикреплена флуоресцентная молекула (флуорофор), а на другом конце расположена специальная молекула-гаситель флуоресценции. За счёт близости гасителя, энергия поглощаемая флуорофором не вызывает флуоресцентного свечения, а целиком передаётся гасителю. При этом, при облучении смеси ультрафиолетом, флуоресцентный отклик полностью отсутствует.

Дальше всё происходит, так же, как было описано выше:

• В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК с распадом на две половинки.
• Зонд вместе с праймерами присоединяется к комплементарному участку ДНК.
• В процессе восстановления и синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимеразы расщепляет этот зонд и разрушает его. При этом флуорофор и гаситель освобождаются, расстояние между ними увеличивается и эффект гашения перестаёт работать. Теперь при облучении смеси ультрафиолетом, мы получим устойчивый флуоресцентный сигнал-отклик от флуорофора.

Изготавливая молекулы флуорофора с разным цветом свечения можно проводить  одновременный поиск разных возбудителей в одной пробирке.

Большинство используемых сегодня, для ПЦР диагностики, амплификаторов , относится к классу автоматических, высокоскоростных многофункциональных Real Time аппаратов. Они позволяют проводить множественный ПЦР анализ  до 5 мишеней (цветных флуоресцентных красителей) в 96 пробирках одновременно. Это полностью автоматические термоциклеры со встроенным оптическим блоком и возможностью детекции накопления продуктов амплификации непосредственно в пробирке во время протекания реакции. Весь процесс амплификации протекает в закрытых одноразовых пробирках, считывание происходит через прозрачные стенки пробирок, без их открытия. Например, на фото CFX96 Touch, производства американской компании  Bio-Rad

Особенности и недостатки метода

Безусловно, ПЦР не идеальный метод, и у него имеются свои недостатки. Но они напрямую связаны с его достоинствами и с тем, что называется «человеческим фактором».

• ПЦР – высокотехнологичный метод, требующий соблюдения строжайших правил устройства и оснащения  лаборатории. Достаточно сказать, что на рабочем месте, где происходит приготовление и раскапывание смесей по пробиркам, должен быть установлен фильтр биологической очистки со степенью более 99%.  Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов. И если в процессе подготовки к проведению реакции, образец будет загрязнен — возможно «ложное срабатывание».
• С другой стороны, далеко не всегда положительный результат ПЦР означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель (фактически его останки) будет еще некоторое время находиться среди клеток крови и «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР – результат окажется положительным.
• Другой вариант – это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин – материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория.
• При создании праймеров используют специфичный для данного микроорганизма фрагмент ДНК, наименее подверженный изменениям. Он выбирается из так называемой высоко консервативной области ДНК. Но изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать и накапливать мутации в амплифицируемом (клонируемом) участке генома, и становиться неуловимыми для данного праймера, и тест-системы, в целом. Таким образом, различные тест-системы — одна из причин, почему анализы, сделанные в разных лабораториях и в разных клиниках «одним и тем же» методом ПЦР могут показывать разные результаты. Чтобы максимально избежать ошибок по вине мутаций, современные стандарты качества, регламентируют объем испытаний тест-системы, прежде чем она попадет на рынок и будет использована для диагностики. Эти испытания включают проверку на перекрестные реакции, а также тестирование всех известных штаммов определяемого возбудителя.

Полный список исследований методом ПЦР и цену на них  можно посмотреть в разделе «Прейскурант»
 

ПЦР метод сдачи анализа на инфекции, полимеразная цепная реакция

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Основа метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Эффективность диагностики инфекций 

ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Для выявления каких инфекций используется метод ПЦР?

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.).

В урологической и гинекологической практике —

• для выявления хламидиоза,
• уреаплазмоза,
• гонореи,
• герпеса,
• гарднереллёза,
• микоплазменной инфекции,
• ВПЧ — вирусов папилломы человека;

В пульмонологии —

• для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний,
• туберкулёза;

В гастроэнтерологии —

• для выявления хеликобактериоза;

В клинике инфекционных заболеваний —

• в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза,
• дифтерии,
• вирусных гепатитов В, С и G;

В гематологии —

• для выявления цитомегаловирусной инфекции,
• онковирусов.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции.

При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу.

Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь.

При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева.

Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала.

Кровь сдается натощак утром.

Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер.

Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

ПЦР — диагностика инфекций

ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний

ПЦР — диагностика (полимеразная цепная реакция) — высокоточный метод диагностики многочисленных инфекций, который основывается на исследовании генетического материала человека (ДНК и РНК). В зависимости от цели исследования используются кровь, слюна, мокрота, выделения половых органов и прочее биологические материалы.

ПЦР — анализ

Часто бывает, что различные по своей природе вирусы могу вызывать одинаковые симптомы заболевания. ПЦР анализ позволяет определить наличие возбудителя, даже при минимальном содержании его штаммов в биологическом материале, а в отдельных случаях, выявляет даже единичные клетки вирусов или бактерий. Определяется вирус, природа его появления, устанавливается сила его воздействия на организм и количество имеющихся микробов в организме. Эта информация важна для лечащего врача при выборе лекарственных препаратов и назначении методов лечения.

В настоящее время ПЦР тест позволяет выявлять все известные современной медицине вирусные заболевания. В том числе даже те, которые могут годами «жить» в организме человека и не проявлять себя, ожидая наиболее комфортных условий для своей «работы». Диагностика «растущих» длительное время возбудителей особенно актуальна в гинекологии и урологии.

В медицинской лаборатории «Синэво» можно пройти ПЦР — диагностику по следующим заболеваниям:

Гепатит B и C

Проведение ПЦР — диагностики необходимо здесь в силу того, что вирус гепатитов имеет продолжительный инкубационный период (до 180 дней) и достаточно серьезные последствия, вплоть до летального исхода.

ИППП

Заболевания, передающиеся половым путем: уреплазмол половых органов, хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз. Коварство заключается в том, что симптомы данных заболеваний зачастую на ранних стадиях «стерты». Эта группа заболеваний опасна тем, что может вызвать у женщин бесплодие, оказывает серьезное влияние на течение беременности, увеличивает риск развития рака шейки матки. У мужчин снижается подвижность и жизнеспособность сперматозоидов, вызывая мужское бесплодие, поражается мочеиспускательный канал и развивается простатит. Увеличиваются риски заболевания генитальным герпесом, а так же ВИЧ/СПИД. Пакет 18.1 «Обследование на ИППП».

Сдать анализ рекомендуется и супругам, желающим родить здорового ребенка. Ведь только ПЦР — диагностика позволяет выявить скрытые инфекции в организме и предотвратить их проникновение в организм плода.

Герпес

Опасное и устойчивое заболевание. Зачастую болезнь не системна и протекает долгие годы в неактивном режиме. При этом возможны проявления, похожие на симптомы герпеса. Но истекают они так быстро, что не возможно точно поставить диагноз традиционным способом. Опасность герпеса в том, что он может поражать центральную нервную систему и стать причиной развития менингита и энцефалита. См. услуги ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (соскоб) и ДНК вируса простого герпеса 1-го и 2-го типа (кровь, качественное определение).

Тест на отцовство

Благодаря ПЦР — диагностике инфекции выявляются на начальном этапе их развития, что способствует скорейшему выздоровлению и предотвращению серьезных осложнений.

Что такое ПЦР и почему это «золотой стандарт» в молекулярной диагностике?

Что такое ПЦР-тестирование?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ¹ , признанная одним из важнейших научных достижений 20-го века, представляет собой быстрый и простой способ создания неограниченных копий ДНК из одной исходной цепи. Эти миллионы копий участка ДНК создаются всего за несколько часов с целью воссоздать достаточно ДНК для различных целей тестирования, таких как секвенирование или идентификация инфекции.Он также используется для безопасности пищевых продуктов, судебной медицины, эпидемиологии и многих других дисциплин, помимо диагностических тестов.

В ПЦР-тестировании есть два важных компонента — праймеры и зонды.

• Праймеры — это короткие последовательности нуклеотидов, из которых состоит наша ДНК, которые связываются вместе уникальным образом. «Праймер» — это начальная точка или участок ДНК, который идентифицируется для копирования. Используются два праймера, которые связаны с каждым концом нашей матричной ДНК.Затем область между этими праймерными областями реплицируется полимеразой. Подобно копировальному аппарату, он печатает последовательность снова и снова, создавая значительное количество генетического материала.
• Зонды очень специфично связываются с амплифицированным материалом после репликации и излучают световой сигнал, который можно обнаружить. Чем больше присутствует последовательность (от репликации), тем больше света она будет давать, обеспечивая более четкую картину для более точного теста. Очень специфическая природа связывания праймеров и зондов производит этот свет, и генерируемое количество дает нам уверенность в определении положительных или отрицательных результатов.

ПЦР — золотой стандарт диагностического тестирования

«Золотой стандарт» относится к высочайшему качеству или эталону конкретной практики, продукта или технологии. Понимая это определение, технология ПЦР считается эталоном во многих аспектах диагностического тестирования, поскольку теоретически может идентифицировать и обнаруживать цель с помощью единственной копии, присутствующей в образце. Идеальная диагностика является одновременно специфической и чувствительной, что означает, что цели, даже при очень низкой концентрации, положительные и ложноотрицательные результаты не проскальзывают сквозь трещины.Например, один ген, обнаруживающий хламидиоз, может быть не так хорош, как два гена, специфичных для хламидиоза.

Несколько целей в дизайне теста, если они положительные, дают больше уверенности в правильности диагноза. Технология ПЦР также является быстрой и может выполняться от часов до минут по сравнению с традиционными методами, такими как культивирование, которые являются трудозатратными и могут занять несколько дней для получения результата

Другие методы диагностического тестирования, такие как посев или серология, могут не обеспечивать такой же уровень чувствительности, как ПЦР.Следовательно, риск ложноотрицательных результатов возрастает в критических сценариях тестирования, когда организмы или вирусы могут быть трудными для роста или обнаружения иммунного ответа. Вот почему многие специалисты диагностического сообщества считают ПЦР золотым стандартом. Компания Roche Diagnostics имеет долгую историю создания высококачественных молекулярных тестов на основе ПЦР для широкого спектра заболеваний и использовала эту технологию для быстрой разработки теста SARS-CoV-2 в ответ на развивающуюся пандемию.

Доказательства ДНК

: основы анализа

На этой странице вы найдете общую информацию о:

Обзор шагов по анализу доказательств ДНК

Независимо от типа теста ДНК выполняется несколько основных этапов.Общая процедура включает: 1) выделение ДНК из образца доказательства, содержащего ДНК неизвестного происхождения, и, как правило, в более позднее время выделение ДНК из образца (например, крови) известного человека; 2) обработка ДНК для получения результатов тестирования; 3) определение вариаций в результатах (или типах) ДНК-тестов по конкретным участкам ДНК; и 4) сравнение и интерпретация результатов испытаний неизвестных и известных образцов, чтобы определить, является ли известный человек источником ДНК или включен в качестве возможного источника ДНК.

Любой доказательный биологический образец, который хранился сухим или замороженным, независимо от возраста, может быть рассмотрен для анализа ДНК.

Каждый дополнительный тест в ранее непроверенном локусе (месте или участке) в ДНК предоставляет другую возможность для результата «исключения», если известный человек, используемый для сравнения, не является источником ДНК из доказательного образца неизвестного происхождения. Однако, если известный человек является источником ДНК в образце доказательства, дополнительное тестирование будет продолжено только для включения этого человека в качестве возможного источника ДНК.Когда было проведено достаточное количество тестов, в которых человек не может быть исключен как источник ДНК ни одним из тестов, наступает момент, когда тесты практически исключают население мира и уникальную идентификацию этого человека как источник ДНК был достигнут.

Этапы обработки образцов ДНК

Ниже приводится обзор этапов обработки судебно-медицинских образцов ДНК с помощью STR-маркеров. STR — это уменьшенная версия последовательностей VNTR, впервые описанных доктором Дж.Джеффрис. Образцы, полученные с мест преступлений или расследований отцовства, подвергаются определенным процессам, связанным с биологией, технологиями и генетикой.

Биология

После сбора биологического материала с места преступления или расследования установления отцовства ДНК сначала извлекается из исходного биологического материала, а затем измеряется для оценки количества извлеченной ДНК. После выделения ДНК из ее клеток определенные области копируются с помощью метода, известного как полимеразная цепная реакция или ПЦР.ПЦР производит миллионы копий для каждого интересующего сегмента ДНК и, таким образом, позволяет исследовать очень незначительные количества ДНК. Одновременно можно исследовать несколько STR-областей, чтобы повысить информативность ДНК-теста.

Технологии

Затем полученные продукты ПЦР разделяют и детектируют, чтобы охарактеризовать исследуемую область STR. Методы разделения, используемые сегодня, включают пластинчатый гель и капиллярный электрофорез (КЭ). Методы обнаружения флуоресценции значительно повысили чувствительность и легкость измерения STR-аллелей, усиленных ПЦР.После обнаружения аллелей STR определяется количество повторов в последовательности ДНК. Этот процесс известен как генотипирование образца.

Конкретные методы, используемые для типирования ДНК, проверяются отдельными лабораториями, чтобы гарантировать получение надежных результатов до внедрения новых технологий. Базы данных ДНК, такие как описанная ранее в этой главе для сопоставления Монтарэ Дэвиса с местом его преступления, являются ценными инструментами и будут продолжать играть важную роль в усилиях правоохранительных органов.

Генетика

Полученный профиль ДНК для образца, который представляет собой комбинацию отдельных генотипов STR, сравнивается с другими образцами. В случае судебно-медицинской экспертизы эти другие образцы будут включать известные эталонные образцы, такие как жертва или подозреваемые, которые сравниваются с доказательствами с места преступления. При расследовании отцовства генотип ребенка будет сравниваться с генотипом его или ее матери и предполагаемого отца (ов), в отношении которого проводится расследование. Если нет совпадения между подвергнутой сомнению выборкой и известной выборкой, то можно считать, что эти образцы были получены из разных источников.Термин, используемый для несоответствия между двумя профилями ДНК, — «исключение».

Если результаты совпадают или «включение», то выполняется сравнение профиля ДНК с базой данных населения, которая представляет собой набор профилей ДНК, полученных от неродственных лиц определенной этнической группы. Например, из-за генетических различий между группами афроамериканцы и кавказцы имеют разные базы данных о населении для целей сравнения.

Наконец, создается отчет о болезни или результат теста на отцовство.Этот отчет обычно включает вероятность случайного совпадения для рассматриваемого совпадения. Эта вероятность случайного совпадения — это вероятность того, что случайно выбранный человек из популяции будет иметь идентичный STR-профиль или комбинацию генотипов на тестируемых маркерах ДНК.

Анализ свидетельств ДНК типов

Типирование ДНК — полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Эволюция тестирования ДНК значительно продвинулась, когда доктор Кэри Маллис обнаружила, что ДНК можно копировать в лаборатории так же, как в естественном мире.

Процесс копирования, известный как полимеразная цепная реакция (ПЦР), использует фермент (полимеразу) для репликации участков ДНК в пробирке. Повторяя процесс копирования, небольшое количество молекул ДНК может быть надежно увеличено до миллиардов в течение нескольких часов.

Для анализа

RFLP требуется биологический образец размером примерно с четверть, но с помощью ПЦР можно воспроизвести миллионы копий ДНК, содержащихся в нескольких клетках кожи. Поскольку для ПЦР-анализа требуется лишь незначительное количество ДНК, он может позволить лаборатории проанализировать сильно деградировавшие доказательства ДНК.С другой стороны, поскольку метод чувствительной ПЦР воспроизводит любую ДНК, содержащуюся в образце доказательств, необходимо уделять больше внимания вопросам контаминации при идентификации, сборе и сохранении доказательств ДНК. Эти факторы могут быть особенно важны при оценке нераскрытых дел, в которых доказательства могли быть неправильно собраны или сохранены.

Типирование ДНК — Анализ коротких тандемных повторов (STR)

Технология коротких тандемных повторов (STR) — это судебно-медицинский анализ, который оценивает определенные области (локусы), обнаруженные на ядерной ДНК.Вариабельная (полиморфная) природа STR-регионов, которые анализируются для судебно-медицинской экспертизы, усиливает различение между одним профилем ДНК и другим. Например, вероятность того, что любые два человека (кроме однояйцевых близнецов) будут иметь одинаковый профиль ДНК из 13 локусов, может достигать 1 на 1 миллиард или больше.

Федеральное бюро расследований (ФБР) выбрало 13 конкретных STR-локусов в качестве стандарта для CODIS. Целью создания основного набора STR-локусов является обеспечение того, чтобы все лаборатории судебной экспертизы могли создавать единые базы данных ДНК и, что более важно, обмениваться ценной криминалистической информацией.Если индекс CODIS судебно-медицинских экспертов или осужденных преступников будет использоваться на этапах расследования нераскрытых дел, профили ДНК должны быть созданы с использованием технологии STR и определенных 13 основных локусов STR, выбранных ФБР.

Подробнее об анализе STR:

Типирование ДНК — анализ Y-хромосомы

На Y-хромосоме было идентифицировано несколько генетических маркеров, которые можно использовать в судебной медицине. Маркеры Y-хромосомы нацелены только на мужскую фракцию биологического образца.Следовательно, этот метод может быть очень ценным, если лаборатория обнаруживает сложные смеси (несколько мужчин-участников) в образце биологических доказательств. Поскольку Y-хромосома передается напрямую от отца всем его сыновьям, ее также можно использовать для отслеживания семейных отношений между мужчинами. Достижения в области тестирования Y-хромосомы могут в конечном итоге устранить необходимость в лабораториях для извлечения и отделения спермы и вагинальных клеток (например, из вагинального мазка из набора для изнасилования) перед анализом.

Типирование ДНК — митохондриальный анализ

Анализ митохондриальной ДНК (мтДНК) позволяет лабораториям судебной экспертизы разрабатывать профили ДНК на основе доказательств, которые могут не подходить для анализа RFLP или STR. В то время как методы ПДРФ и ПЦР анализируют ДНК, выделенную из ядра клетки, технология мтДНК анализирует ДНК, обнаруженную в другой части клетки, митохондрии (см. Рисунок 1). Старые останки и доказательства отсутствия ядерных клеток, таких как стержни волос, костей и зубов, которые не поддаются тестированию STR и RFLP, могут дать результаты, если будет проведен анализ мтДНК.По этой причине тестирование мтДНК может быть очень ценным для расследования нераскрытого дела. Например, журнал «холодного» случая может показать, что биологические доказательства в виде крови, спермы и волос были собраны в конкретном случае, но все они хранились ненадлежащим образом в течение длительного периода времени.

Хотя ПЦР-анализ иногда позволяет криминалистической лаборатории создать профиль ДНК из очень испорченных доказательств, возможно, что кровь и сперма будут настолько сильно разложены, что ядерный анализ ДНК не даст профиля ДНК.Однако стержень волоса может быть подвергнут анализу мтДНК и, таким образом, станет ключом к раскрытию дела. Наконец, важно отметить, что все родственники по материнской линии (например, мать человека или бабушка по материнской линии) имеют идентичную мтДНК. Это позволяет анализировать неопознанные останки и сравнивать их с профилем мтДНК любого родственника по матери с целью оказания помощи в расследовании пропавших без вести или неопознанных останков. 40)). Это то, что делает ПЦР такой удивительно чувствительной. Кроме того, если при разработке теста, специфичного для патогена, проявить должную осторожность, то этот тест редко — если вообще когда-либо — дает ложноположительный результат. Это называется специфичностью.

Поскольку чувствительность и специфичность ПЦР настолько высоки, ПЦР широко считается «золотым стандартом». С точки зрения непрофессионала, это очень точно.

SARS-CoV-2 (возбудитель, вызывающий COVID-19) является возбудителем РНК. Чтобы успешно обнаружить этот патоген с помощью ПЦР, сначала необходимо преобразовать РНК в ДНК, и это делается путем обратной транскрипции РНК в ДНК.Когда ученые комбинируют обратную транскрипцию (ОТ) и ПЦР для амплификации мишеней РНК, это сокращенно называют ОТ-ПЦР. Шаг RT занимает 5-15 минут. Благодаря своей точности ОТ-ПЦР является основным методом, используемым справочными лабораториями для выявления присутствия SARS-CoV-2 (COVID-19) и многих других патогенов.

Несмотря на надежность ПЦР, существует множество конкурирующих химикатов, которые можно использовать для обнаружения патогенов. Два примера — изотермическая амплификация и тесты на основе антигенов. Эти химические процессы обычно выполняются быстрее и требуют меньше технических средств.Однако считается, что эти технологии уступают по чувствительности ОТ-ПЦР. Из-за этого они не являются выбором большинства референс-лабораторий, так как большинство референс-лабораторий предпочли бы потратить немного больше времени и получить правильный ответ, чем спешить с низкокачественной технологией и подвергнуться более высокому риску ошибочного диагноза.

ПЦР-тесты занимают около часа и дают очень точные результаты. Существуют и другие химические методы (изотермическая амплификация и тесты на антиген), которые могут предложить более быстрые результаты тестов, но они упускают из виду процент случаев, которые могут быть обнаружены с помощью ПЦР.

ПЦР традиционно проводится в справочной лаборатории, которая обычно возвращает результаты в течение 24 часов после получения образца. Доставка образцов в референс-лаборатории может значительно увеличить задержку с получением результатов. LexaGene помогает решить проблему «времени», автоматизируя ПЦР в момент необходимости и возвращая результаты через ~ 2 часа после начала обработки образца.

Подробнее о кПЦР читайте в блоге компании.

Объяснение науки о ДНК: что делает ДНК и как работают тесты ДНК

Биология ДНК: структура и репликация

Строительные блоки ДНК известны как нуклеотиды (сокращенно A, T, C и G) и появляются в ДНК как пары букв.В нашем коде ДНК около 3 миллиардов пар букв.

У людей большая часть ДНК находится в форме плотно скрученных цепей, называемых хромосомами, которые находятся внутри ядра клетки. В человеческой клетке 46 хромосом, расположенных в 22 аутосомных (неполовые хромосомы) пары и две половые хромосомы (XY для мужчин и XX для женщин). Если развернуть каждую хромосому и разместить их встык, то получится длинная двухцепочечная спираль ДНК длиной около 3 метров — и все это из одной микроскопической клетки человека.

Спираль ДНК выглядит как витая лестница или винтовая лестница. «Ступени» состоят из четырех оснований: аденина (A), тимина (T), гуанина (G) и цитозина (C) и удерживаются вместе водородными связями, которые соединяют вместе определенные пары этих молекул: A– Т и G – C. Расположение этих молекул, называемое последовательностью ДНК, описывает инструкции для наших физических характеристик и функций организма. Эти инструкции находятся в единицах, называемых генами.

Специфическое спаривание молекул ДНК представляет собой простой механизм их репликации.Репликация происходит всякий раз, когда клетка делится на две части во время роста и развития. Во время репликации спираль раскручивается, и фермент разделяет две нити. Другой фермент, ДНК-полимераза, добавляет четыре молекулы A, T, C и G к каждой цепи в соответствии с последовательностью цепи: A добавляется напротив T на цепи, а C добавляется напротив G. ”Позволяет производить репликацию быстро и надежно.

Продукты репликации представляют собой два набора двухцепочечных молекул ДНК, которые имеют точно такую ​​же последовательность, что и оригинал.Во время деления клетки каждая клетка получает один набор ДНК. Таким образом, все клетки тела имеют одинаковые молекулы ДНК.

Что такое ПЦР-тестирование? | Norgen Biotek Corp.

В прошлом диагнозы ограничивались тем, что лечащий врач мог наблюдать своими собственными чувствами. Как и следовало ожидать, это привело к сильно различающимся уровням ухода за пациентами и нетрадиционным тестам и методам лечения, многие из которых, к сожалению, были связаны с домашним скотом. К счастью, в современную эпоху произошли огромные успехи в области молекулярной биологии и, как следствие, медицинской диагностики.Сегодня у нас есть окончательные тесты для многих состояний и заболеваний, от бесплодия до рака. В последнее время мир столкнулся с острой необходимостью в быстром способе определения наличия у пациента COVID-19. В настоящее время золотым стандартом диагностики COVID-19 являются тесты на антигены и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Тестирование антигенов

Самый распространенный тест на антиген, вероятно, знаком почти каждому, поскольку он похож на тест на беременность. Тесты на антиген COVID-19 действуют таким же образом и основываются на специфическом связывании антигена (белка, отображаемого на поверхности вируса) в образце с антителами (еще больше белков, обычно животного происхождения), иммобилизованных в местах, где появятся индикаторные линии. ¹ Для облегчения обнаружения вторичные антитела также связываются с антигеном и в ответ либо флуоресцируют, либо меняют цвет. ¹ Уровень изменения цвета или флуоресценции также можно использовать для количественной оценки уровня антигена, присутствующего в образце. В случае теста на антиген COVID-19 образец берется из верхних дыхательных путей пациента, обычно через ротоглоточный или носоглоточный мазок, как показано на рисунке справа.

ПЦР-тестирование

При тестировании с помощью ПЦР

создаются миллионы копий определенной последовательности или последовательностей в генетическом материале, присутствующем в образце, что позволяет выявить гораздо более низкую исходную вирусную нагрузку.Эти скопированные последовательности затем можно использовать для диагностики пациента либо по их наличию (положительный результат), либо отсутствию (отрицательный результат). В случае COVID-19 генетический материал состоит из рибонуклеиновой кислоты (РНК), которая является относительно хрупкой, в отличие от дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая гораздо более стабильна. ³ Для проведения теста, который может выполняться только на ДНК, необходимо выполнить преобразование первого во вторую. ³ Это достигается с помощью фермента, называемого обратной транскриптазой, который делает копию РНК из ДНК.После получения комплементарной ДНК или кДНК можно продолжить ПЦР. Основные компоненты состоят из ДНК-полимеразы Taq, матрицы, праймеров и свободных нуклеотидов в форме дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP). ³ Полимеразу лучше всего представить как часть механизма, чья работа заключается в сборке новых сегментов ДНК. Подобно механическому устройству, полимераза требует таких инструкций, как с чего начать и последовательность новой цепи. Матрица представляет собой кусок кДНК, созданный из образца, и обеспечивает последовательность новой цепи.Всем известен знакомый профиль двойной спирали ДНК, который дает хорошее представление о ее структуре. ДНК состоит из двух комплементарных цепей связанных нуклеотидов в согласованных парах A / T и C / G. Таким образом, если присутствует одна цепь, полимераза может продуцировать противоположную цепь. Праймеры дают начальные точки и представляют собой короткие сегменты ДНК с противоположной последовательностью пар оснований на цепи матрицы в начале интересующего сегмента. Наконец, топливом можно считать дНТФ. Это отдельные нуклеотиды, которые полимераза связывает вместе в конечный продукт.Фактический процесс ПЦР включает нагревание и охлаждение смеси для последовательного разделения комплементарных цепей, прикрепления праймеров и, наконец, позволяет полимеразе реплицировать интересующий сегмент. ³ Повторяя этот процесс, исходная цепь экспоненциально амплифицируется. ³

Изначально эти циклы выполнялись вручную, при перемещении образцов из одной водяной бани в другую, хотя, к счастью, этот процесс был автоматизирован. ² В среднем, тесты ПЦР проходят 40 таких петель, создавая более одного триллиона копий исходной цепи. ³ С точки зрения масштаба, один триллион секунд эквивалентен 30 000 годам или всему периоду времен Верхнего Каменного века. Такое огромное количество амплификации позволяет обнаруживать вирус в чрезвычайно низких концентрациях, что приводит как к уменьшению требований к размеру образца, так и к высокой степени точности обнаружения. Это обнаружение осуществляется с помощью флуоресцентных маркеров, прикрепленных к зонду в процессе, известном как количественная ПЦР или qPCR.Этот зонд представляет собой еще один короткий сегмент комплементарной ДНК, который прилипает к матрице и разрушается при создании копии. Когда он разрушен, маркер флуоресцирует. Когда уровень флуоресценции достигает точки, которую можно обнаружить, порог цикла (Ct) был достигнут, и его можно использовать для расчета концентрации исходного шаблона в образце.

Почему стоит предпочесть ПЦР тестированию на антигены?

Теоретически для обнаружения требуется только одна копия исследуемой ДНК, поскольку она амплифицируется в миллионы раз.Чтобы получить положительный результат, в образце должны присутствовать тысячи вирионов. ¹ Это вредно для раннего обнаружения, особенно в бессимптомных случаях, поскольку часто вирусная нагрузка в образце слишком мала для правильной регистрации, что приводит к ложноотрицательному результату. И наоборот, ложноположительные тесты также более вероятны при тестах на основе антигенов. ⁴ Это связано с тем, что родственные виды вируса могут связываться вместо вируса SARS-CoV-2, вызывая изменение цвета или флуоресценции. ⁴ Ложноположительный результат теста может быть травмирующим, что может привести к финансовому, психологическому и даже физическому ущербу. ⁴ Следует приложить все возможные усилия, чтобы все положительные результаты тестов были точными, чтобы избежать ненужных мучений.

Прощальные мысли

Текущая политика Онтарио гласит, что любой положительный экспресс-тест на антиген должен подтверждаться с помощью последующего ПЦР-теста. Хотя получение результатов может занять немного больше времени, повышенная безопасность более высокой чувствительности обеспечивает душевное спокойствие, которого не дает тест на антиген.Тест qPCR на основе слюны Norgen обеспечивает доступное, быстрое и точное тестирование COVID-19 как для предприятий, так и для частных лиц. Это просто требует, чтобы человек плюнул в пробирку, добавил предоставленный консервант и отправил его в Norgen для обработки и анализа нашими опытными учеными. В течение 24–48 часов вы получите результат, а вместе с ним и ваше душевное спокойствие.

Чтобы увидеть, как весь процесс ПЦР работает в лаборатории, ознакомьтесь с руководством Norgen по обнаружению COVID-19 RT-PCR!

Просмотреть ссылки

Список литературы

1. Prinzi, A.(2020). Как работают тесты на антиген SARS-CoV-2 EUA. Американское общество микробиологии.

2. Сайки, Р. К. и др. Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. Наука 239, 487–491 (1988)

3. Тинер, С. (30 июля 2020 г.). Наука, лежащая в основе теста для обнаружения вируса COVID-19. https://discoverysedge.mayo.edu/. https://discoverysedge.mayo.edu/2020/03/27/the-science-behind-the-test-for-the-covid-19-virus/

4. Суркова, Е., Николаевский, В., и Дробневский, Ф. (2020). Ложноположительные результаты COVID-19: скрытые проблемы и затраты. Ланцет респираторной медицины, 8 (12), 1167–1168. https://doi.org/10.1016/s2213-2600(20)30453-7

Стандартный тест на коронавирус, если он доступен, работает хорошо, но могут ли новые методы диагностики помочь в этой пандемии? | Наука

Врач в Германии готовит мазок для анализа на коронавирусную инфекцию.

Дэниел Рейнхардт / фото альянс через Getty Images

Автор Роберт Ф. Сервис 22 марта 2020 г. 12:15

По мере того, как Соединенные Штаты стремятся активизировать тестирование на пандемический коронавирус с использованием технологии, основанной на проверенной временем полимеразной цепной реакции (ПЦР), начинают разворачиваться альтернативные подходы, которые могут упростить и ускорить изучение людьми того, нужно ли они были инфицированы.Некоторые методы модифицируют стандартный тест ПЦР, который усиливает крошечные кусочки генетического материала для обнаружения, тогда как другие секвенируют вирус напрямую или используют редактор генома CRISPR.

Грядут более быстрые и дешевые тесты, — говорит Эван Джонс, генеральный директор OpGen, компании по быстрой диагностике. Однако, добавляет он, разработка новых видов тестов «займет время». Некоторые из новых тестов уже поступают в онлайн, но для проверки других, вероятно, потребуются месяцы, и они будут готовы к широкому распространению.

«Тестирование, тестирование, тестирование» — это мантра, которую снова и снова повторяет Генеральный директор Всемирной организации здравоохранения Тедрос Адханом Гебрейесус. Диагностические тесты, выявляющие активные инфекции у людей, жизненно важны для усилий общественного здравоохранения, а не только для здоровья людей. Широко распространенное диагностическое тестирование, наряду с изоляцией инфицированных, отслеживанием контактов и помещением в карантин этих контактов, похоже, сыграло ключевую роль в работе Южной Кореи по подавлению распространения вируса.

Связанные

В Соединенных Штатах медленное развертывание ПЦР-тестов на коронавирус широко объясняется сочетанием строгих правил, направленных на обеспечение их надежности, и сложной сети компаний и систем здравоохранения, ответственных за разработку, проведение и оплату тестов. Администрация Трампа заявляет, что тестирование ускоряется. 16 марта на пресс-конференции в Белом доме У.Помощник секретаря по вопросам здравоохранения Бретт Гироар (S. Health and Human Services) сказал, что страна сможет обработать 1 миллион тестов к концу недели и 2 миллиона на следующей неделе. Но реальные цифры еще не близки к этому. Согласно данным, собранным в рамках проекта отслеживания COVID, некоммерческого сотрудничества представителей общественного здравоохранения и журналистов по подсчету тестов, проведенных в Соединенных Штатах, по состоянию на 22 марта была проведена 191 541 ПЦР-диагностика, 24 345 из которых оказались положительными на вирус.

29 февраля Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) опубликовало новые правила, разрешающие выдачу разрешений на использование тестов на коронавирус в чрезвычайных ситуациях помимо тех, которые производятся и распространяются Центрами США по контролю и профилактике заболеваний. Академические вирусологические лаборатории, департаменты здравоохранения и компании начали создавать свои собственные тесты ПЦР. Сегодня около четырех десятков организаций получили одобрение FDA на свои тесты. Среди крупнейших — диагностические компании, такие как Roche Molecular Systems, получившая на этой неделе зеленый свет на проведение испытаний FDA.По словам Александра Валсамакис, главного медицинского директора компании, на начальном этапе она будет предоставлять около 400 000 тестов в неделю в США и 3 миллиона во всем мире. Другие крупные компании также недавно получили одобрение на свои тесты, в том числе Thermo Fisher Scientific и Abbott Laboratories.

университетских вирусологических лабораторий также вмешались, чтобы помочь диагностировать случаи заболевания поблизости от них. Например, на прошлой неделе врачи Медицинского центра Университета Питтсбурга (UPMC) начали использовать самодельный ПЦР-тест для проверки на наличие инфекции в округе Аллегейни.На данный момент количество тестов остается небольшим, около 100 в неделю. «Нам определенно хотелось, чтобы мы начали это раньше, — говорит Алан Уэллс, возглавляющий клинические лаборатории UPMC.

ПЦР — это наиболее часто используемый тест для диагностики коронавируса, поскольку он очень точен. (См. Как работает самый распространенный тест на коронавирус?) Но его ограничивают другие проблемы. «Нам не удалось добиться необходимого улучшения», — говорит Стивен Волински, врач-инфекционист Северо-Западного университета. Каждый тест занимает около 4 часов после того, как образец поступает в централизованную лабораторию тестирования, с разделением времени между подготовкой образца и фактическим тестом ПЦР.С транспортом и очередями получение результата может занять от 2 до 4 дней. За это время инфицированные люди могут передать вирус многим другим.

Самостоятельная тампона

В диагностический ландшафт коронавируса добавляется еще одно новое измерение: «домашние» тесты, которые включают отправку образца, взятого дома, в лабораторию. Например, завтра Everlywell планирует начать поставки комплектов на дом и в розничные аптеки. Эти тесты начнутся со скрининговых вопросов в Интернете или в магазине, чтобы определить, вероятно ли, что человек подвергся воздействию вируса.Если да, они могут получить набор для отбора проб из носоглотки по почте или купить его у местного продавца. Человеку будут даны подробные инструкции по введению его собственного тампона, помещению его в защитный флакон и в ночное время по почте в одну из десятков диагностических лабораторий (которые сотрудничают с Everlywell и уже имеют одобрение FDA) для анализа ПЦР.

Фрэнк Онг, главный медицинский и научный директор Everlywell, говорит, что компания рассчитывает быстро вырасти с тысячи таких тестов в день до десятков тысяч.Хотя каждый тест, вероятно, потребует 4-дневного ожидания результатов, говорит Онг, эта стратегия домашнего отбора проб имеет серьезные преимущества: она защитит медицинских работников от воздействия потенциальной инфекции и высвободит их время. «Нам нужно убедиться, что мы даем им возможность позаботиться о пациентах», — говорит Онг. Другие компании, в том числе Nurx и Carbon Health, заявляют, что теперь они поставляют ограниченные запасы собственных наборов для взятия проб в домашних условиях.

Большинство тестов ПЦР на новый вирус проводится на больших дорогих автоматизированных машинах, которые выполняют множество тестов одновременно.Они есть в крупных больницах или диагностических учреждениях, но сейчас начинает разворачиваться еще один вариант — это небольшие и менее дорогие устройства, которые также выполняют амплификацию нуклеиновых кислот. Они могут использоваться небольшими больницами и даже отдельными врачебными кабинетами.

В пятницу, например, компания Cepheid, которая продает небольшие системы ПЦР для быстрого обнаружения вирусов гриппа, бактерий туберкулеза и других микробов, получила одобрение FDA на экстренное использование тестового картриджа на коронавирус 2 (SARS-CoV-2), который может экстренно использовать острый респираторный синдром. в систему GenXpert компании, устройство размером с кофемашину, которое может выдать диагностический результат всего за 45 минут.Официальные лица Cepheid говорят, что во всем мире установлено 23 000 таких систем, из них 5000 — в Соединенных Штатах. 19 марта GenMark получил одобрение FDA на экстренное использование собственных тестов на коронавирус, которые проводятся на машинах аналогичного размера, которые используют запатентованный электрохимический подход для обнаружения целевого генетического материала менее чем за 2 часа. Другие компании, спешащие поставить диагностические аппараты для пунктов оказания медицинской помощи, включают Mesa Biotech, HiberGene, Mobidiag и QuantuMDx.

То же самое и с такими компаниями, как Oxford Nanopore и Fulgent Genetics, которые вместо использования ПЦР напрямую секвенируют любой генетический материал в образце, а затем ищут совпадения, скажем, с новым коронавирусом.Этот подход к высокоскоростному секвенированию генов может помочь охарактеризовать геном коронавируса, чтобы лучше понять, как вирус развивается, но он также может быть диагностическим в определенных ситуациях, таких как удаленные сайты без доступа к ПЦР. Портативные устройства Oxford Nanopore использовались во время вспышек лихорадки Эбола, и компания отправила их в Китай на раннем этапе пандемии.

CRISPR для тестирования

Самый быстрый способ тестирования на коронавирус в конечном итоге может быть предложен компаниями, использующими редактор генома CRISPR, более известный тем, что он добавляет или удаляет ДНК в клетках.Две американские компании, Mammoth Biosciences и Sherlock Biosciences, заявляют, что они создали тесты на основе CRISPR и в настоящее время проверяют их на образцах пациентов, прежде чем обращаться за разрешением на экстренное использование в FDA. Метод начинается с образца пациента, извлекается вирусная РНК и используется тест быстрой амплификации нуклеиновых кислот, называемый петлевой амплификацией, чтобы получить ровно столько РНК, чтобы тест мог ее обнаружить. Затем исследователи добавляют два компонента редактора генома CRISPR: белок под названием CAS12, который разрезает ДНК или РНК, и «направляющую» РНК, которая вставляется в CAS12 и помогает ему найти последовательность, соответствующую части генома коронавируса.Если CAS12 и его руководство находят совпадение в РНК, CAS12 связывается с этой совпадающей РНК, которая активирует CAS12, чтобы разрезать ее и продолжить разрезать любые другие короткие цепи РНК или ДНК поблизости, включая копии цепи, предназначенные для высвобождения цвета. — изменение молекул, когда CAS12 отсекает их. Результатом может быть простое изменение цвета тест-полоски.

Этот метод отлично подходит для поиска небольших фрагментов генетического материала, говорит Дженнифер Дудна, биохимик из Калифорнийского университета (UC), Беркли, пионер CRISPR, председатель научного консультативного совета Mammoth Biosciences.

В препринте, опубликованном 10 марта на medRxiv, исследователи из Mammoth Biosciences и Калифорнийского университета в Сан-Франциско сообщают, что тесты на клинических образцах дали результаты с точностью, сравнимой с ПЦР, всего за 30 минут. Он использует простую бумажную полоску с цветной линией, которая появляется с положительным результатом. По словам Тревора Мартина, генерального директора Mammoth, компания обсуждает с партнерами производство наборов для тестирования, которые позволят быстро и дешево диагностировать инфекцию SARS-CoV-2 в домашних условиях, не требуя медицинских знаний.

Для завершения теста и получения одобрения регулирующих органов могут потребоваться месяцы, поэтому, скорее всего, он не будет готов в ближайшие критические недели. Но он может быть готов, если распространение коронавируса продолжится. Некоторые предсказывают, что вирус тоже исчезнет, ​​но осенью снова появятся инфекции. Мартин говорит, что для получения результатов не потребуются машины для ПЦР, управляемые обученными специалистами. «Это изменит правила игры в нашей реакции» на возникающие болезни, — говорит Мартин.

Проблемы со снабжением

Несмотря на то, что компании и академические лаборатории расширяют свои диагностические усилия на основе ПЦР, больницы и центры тестирования по всей стране сообщают, что они сталкиваются с более серьезным кризисом: у многих заканчиваются химические вещества и другие материалы, которые позволяют проводить тесты, такие как тампоны для сбора образцов у пациентов и реагенты, необходимые для ПЦР.Бенджамин Пински, патолог Стэнфордского университета, который разработал диагностический тест на основе ПЦР, используемый в Северной Калифорнии, говорит, что его лаборатория сталкивается с постоянной нехваткой различных материалов, в первую очередь наборов, используемых для извлечения РНК из вирусных образцов, прежде чем ее можно будет загрузить в ПЦР-машины.

«Это был большой вызов», — говорит Пинский. «Мы должны были быть очень ловкими, чтобы справиться с этим», постоянно меняя поставщиков или даже химические процедуры, которые необходимо проверять, прежде чем их можно будет использовать на образцах пациентов.Его команда даже разослала в Твиттере просьбы к сообществу Стэнфорда и региональным биотехнологическим компаниям с просьбой пожертвовать наборы реагентов, такие как наборы от Zymo и Qiagen. По словам Пинского, даже несмотря на то, что поступают пожертвования, запасов по-прежнему не хватает.

Реагентные компании пытаются ответить. Например, Qiagen, крупный поставщик наборов для экстракции РНК, объявил во вторник, что его сотрудники работают круглосуточно, чтобы увеличить производство с 1,5 миллиона наборов в месяц до 6.5 миллионов в месяц к концу апреля и далее увеличится.

Пинский, например, говорит, что он готов к тому, чтобы компании полностью взяли на себя тестирование на коронавирус у таких ученых, как он сам. «Я надеюсь, что эти компании смогут провести обещанное тестирование», — говорит Пинский. «Это еще предстоит выяснить.»

Ультрапортативная и универсальная платформа для тестирования ДНК на месте

ВВЕДЕНИЕ

Лабораторные методы обнаружения, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), обычно недоступны в условиях ограниченных ресурсов, где сложная инфраструктура, надежное электроснабжение и обучение операторы отсутствуют.С другой стороны, тестирование в местах оказания медицинской помощи (POCT) позволяет быстро обнаруживать в этих местах на месте. Следовательно, любая форма молекулярного обнаружения, включая анализ ДНК, требует POCT ( 1 — 2 ).

За последние 5 лет исследования анализа ДНК POC быстро продвинулись не только в клинической практике, но и в сельском хозяйстве, охране окружающей среды и безопасности пищевых продуктов ( 3 — 6 ). Два ключа к успеху практических приложений — это портативность и универсальность POCT.Что касается вопроса переносимости, одной из самых больших проблем было обеспечение переносимости на протяжении всего процесса, от подготовки образца до усиления сигнала и считывания без дополнительных инструментов. В последнее время много усилий было направлено на улучшение переносимости ступени усиления сигнала ( 7 — 8 ). Например, методы обнаружения ДНК на бумажной основе, такие как анализ бокового потока, обеспечивали переносимость связывания и фиксации ДНК (на тонких полосках бумаги), но по-прежнему требовали дополнительных инструментов, таких как центрифуга для подготовки образцов и термоинкубатор или термоинкубатор. циклер для ферментативных реакций.Кроме того, для большинства приборов требуется источник питания переменного тока. Потребность в приборах на стадии подготовки проб и / или источниках питания переменного тока серьезно ограничивает портативность всего POCT. Хотя для достижения изотермического усиления были разработаны различные методы без использования источника переменного тока, такие как использование экзотермических химических реакций или нагревателей с положительным температурным коэффициентом ( 9 — 12 ), эти методы все еще весили от сотен до тысяч граммов, что слишком тяжело для быть ультрапортативным.

Универсальность — еще одна серьезная проблема для POCT. Идеальная система ДНК-POCT должна не только быть способной обрабатывать различные типы образцов (таких как слюна, моча и кровь), но также иметь возможность обнаруживать множественные формы ДНК-мишеней, включая патоген-специфические последовательности ДНК, генные мутации, однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и аллельные гены ( 13 — 14 ). До сих пор по-прежнему трудно обнаружить патоген-специфичную ДНК непосредственно из сырых образцов (например, слюны) методом «образец-вход-результат» ( 15 ).Учитывая потребность в более точном обнаружении других форм-мишеней ДНК и совместимости с другими биологическими образцами (цельная кровь и т. различные типы выборок по принципу «от образца к ответу».

В этом исследовании мы создали набор для обслуживания на месте для всего теста, POCKET, как ультрапортативную и универсальную платформу POCT. Платформа POCKET была ультрапортативной: вес менее 100 г и длина менее 25 см, помещалась в пластиковый пакет размером с кварту или конверт обычного размера (размер B5, 17 см × 25 см).POCKET был ультрапортативным для всего процесса тестирования, от подготовки образца до усиления сигнала и окончательного считывания без использования каких-либо инструментов. POCKET также был универсальным, обнаруживая различные типы ДНК из различных источников образцов, от клиник (кровь, щёк и моча) до продуктов питания (молоко), окружающей среды (речная вода) и сельского хозяйства (листья растений).

POCKET состоял всего из двух компонентов: интегрированного чипа (i-chip), как для подготовки образцов, так и для усиления сигнала, и складного блока обнаружения (f-box), использующего смартфон в качестве нагревателя, инкубатора и детектор и считыватель результатов.I-chip был меньше кончика пальца и был изготовлен с использованием трехмерной (3D) печати и микротехнологии. F-бокс складывался для уменьшения размера. Вся платформа POCKET помещается в пластиковый пакет размером с кварту или конверт обычного размера (рис. 1A). Более того, ранее неизвестный способ генерирования тепла был создан с использованием только смартфона; В сочетании с f-box изотермический инкубатор на базе смартфона был реализован без каких-либо обычных нагревателей, инкубаторов и источников питания переменного тока (рис.1Б, справа). Для усиления сигнала мы разработали ранее не идентифицированный метод тройной амплификации, который объединил амплификацию изотермической рекомбиназной полимеразы (iRP) вместе с дополнительными комплексами Au-серебро для всего тройных амплификаций (называемых iRPAS) (рис. 1B, слева вверху). Окончательные усиленные сигналы были колориметрическими и были обнаружены смартфоном с помощью f-box (рис. 1C). Таким образом, мы достигли сверхпортативности от подготовки образцов до усиления сигнала и окончательного считывания без использования каких-либо инструментов.

Рис. 1 Платформа POCKET была ультрапортативной и универсальной.

( A ) Платформа POCKET состояла из i-chip и f-box, который был ультрапортативным (60 г) и хранился в кармане размером B5. ( B ) Во время усиления сигнала i-chip нагревался смартфоном без дополнительного нагревательного прибора (справа). Визуальный сигнал генерировался тройным усилением сигнала iRPAS (вверху). Размер i-chip был меньше кончика пальца (внизу слева).( C ) Схема и фотография f-box на базе смартфона. ( D ) Платформа POCKET позволяла анализировать делеции длинных и коротких фрагментов, замену одного основания, вставку одного основания и аллельные гены, в дополнение к патоген-специфическим последовательностям ДНК из широкого диапазона источников, включая кровь, извлеченную ДНК, буккальный, моча, молоко, речная вода или листья растений. Фотография (A, B и C): Хуан Сюй, Армейский медицинский университет.

Помимо сверхпортативности, платформа POCKET была универсальной, способной анализировать несколько типов ДНК из широкого диапазона источников.Во-первых, i-chip имел разъемы типа Lego, напечатанные на 3D-принтере, что делало платформу POCKET легко расширяемой для параллельного обнаружения нескольких образцов. Во-вторых, вся платформа POCKET была разработана для использования с различными типами ДНК с использованием образцов из разных источников. Другими словами, КАРМАН был разработан и сконструирован независимо от того, какие типы ДНК использовались. Мы успешно обнаружили различные типы ДНК в клинических образцах крови и буккальных пробах, включая генные мутации (делеции длинных или коротких фрагментов), SNP (одноосновная замена или вставка) и аллельные гены.Мы также успешно обнаружили патоген-специфические последовательности ДНК в образцах мочи (рис. 1D). Чувствительность и специфичность обнаружений были проверены с помощью обычных клинических методов, которые в настоящее время выполняются в централизованной лаборатории. В дополнение к реальным клиническим образцам с помощью платформы POCKET мы успешно обнаружили следующую специфическую ДНК: бактерии в молоке, речной воде и на листьях растений, что еще раз продемонстрировало универсальность платформы POCKET в источниках образцов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стратегия разработки платформы POCKET

Платформа POCKET состояла из двух основных компонентов: i-chip и f-box.В i-chip весом всего 4 г интегрированы два блока: блок подготовки образцов, напечатанный на 3D-принтере, и блок усиления микрофлюидного сигнала (рис. 2А). Для блока подготовки образцов, напечатанного на 3D-принтере, мы включили три модуля: корзину, поворотный клапан и блочный модуль. Мы разработали диск извлечения в нижней части модуля корзины для связывания ДНК из широкого диапазона источников (рис. 2A, пунктирная рамка). Корзина была соединена с политетрафторэтиленом (PTFE) для ввода реагентов в корзину с помощью шприца.Чтобы упростить доставку реагентов и избежать использования дорогостоящих инструментов для дозирования, мы разработали тандемную пробирку для реагентов для предварительной загрузки и автоматической доставки реагентов. Каждый реагент был разделен воздушным зазором, так что несколько реагентов были предварительно загружены в трубку из ПТФЭ (рис. S1). Блок-модуль содержал промывочную камеру, которая была оснащена модулем корзины для очистки ДНК, и реакционную камеру, которая была снабжена поворотным клапаном для амплификации целевой ДНК посредством амплификации рекомбиназной полимеразы (RPA).Поворотный клапан выполнен в виде полого цилиндра с отверстием в нижней части модуля для соединения с блоком усиления микрожидкостного сигнала. На реакционной камере блочного модуля была еще одна пора, соединяющаяся с блоком усиления микрофлюидного сигнала через трубку из ПТФЭ. Открытое и закрытое состояния соединения блока микрофлюидного усиления контролировались вращением поворотного клапана.

Рис. 2 Конструкция и конструкция КАРМАННОЙ платформы.

( A ) Схема i-chip (слева). I-chip состоял из блока подготовки образцов, напечатанного на 3D-принтере, и блока микрофлюидного усиления. Блок подготовки образцов был разработан для выполнения всего процесса предварительной обработки ДНК POC с использованием модуля корзины, поворотного клапана и блочного модуля. Модуль корзины имел диск для экстракции ДНК на дне (пунктирная рамка). ( B ) Схема блока микрофлюидного усиления. Блок микрофлюидного усиления состоял из слоя микрофлюидного канала и функционализированного альдегидом стеклянного чипа.Слой канала зонда (отмечен красным) был использован для модификации зондов захвата на функционализированном альдегидом чипе. Слой микрожидкостных каналов (отмечен розовым) затем был собран на чипе для завершения блока усиления. Поперечное сечение жидкостного и микрофлюидного каналов зонда составляет зону реакции (пунктирная рамка). Цифры 1, 2, 3 и 4 на слое канала зонда обозначают разные каналы зонда разными цветами. ( C ) Процедура обнаружения КАРМАННОЙ системы.ДНК абсорбировали и экстрагировали с помощью экстракционного диска на дне корзины. ДНК-мишень очищали с использованием промывочного буфера и амплифицировали с помощью RPA для получения ампликонов, модифицированных биотином. Ампликоны были связаны с SA-AuNP и захвачены предварительно модифицированными зондами захвата для достижения вторичного усиления сигнала. Третичное усиление инициировалось нанесением ионов серебра на AuNP. ( D ) Платформа POCKET была масштабируемой для параллельного обнаружения образцов с помощью сборки i-chip. ( E ) Схема f-бокса, который был разработан для отображения результатов.Сюда входили складная подставка, смартфон, оптический блок с макрообъективом и светодиодная лампа. Фотография (D): Хуан Сюй, Армейский медицинский университет.

Блок микрофлюидного усиления состоял из слоя микрожидкостного канала и функционализированного альдегидом стеклянного чипа, предназначенного для визуального считывания через смартфон (рис. 2B). Стеклянный чип был модифицирован множеством зондов для захвата ДНК, которые дополняли свои мишени. Чтобы зафиксировать зонды захвата на стеклянном чипе, мы сначала связали слой канала зонда, изготовленный из полидиметилсилоксана (PDMS), который содержал несколько каналов, на стекло, функционализированное альдегидом.Затем мы вливали в каждый канал один тип амино-функционализированного зонда захвата. Зонды закреплялись на поверхности стекла за счет альдиминовой конденсации. Затем мы сняли слой канала зонда и собрали слой микрофлюидного канала поверх стеклянного чипа, чтобы завершить блок усиления (рис. 2B, внизу и рис. S2). Поверхностная плотность зонда захвата была критической для функции чувствительного слоя ( 16 ). Мы оптимизировали концентрации улавливающих зондов и обнаружили, что 6 мкМ были идеальными для получения надежного результата с примерно 10-кратным увеличением сигнала (рис.S3A).

Чтобы усилить сигналы до такой степени, чтобы их можно было визуализировать невооруженным глазом или смартфоном, мы разработали ранее не идентифицированный метод тройного усиления сигнала iRPAS (рис. 2C). Вкратце, ДНК сначала амплифицировали через RPA с помощью праймеров с прямым хвостом и биотинилированных обратных праймеров в течение 20 мин, в результате чего получали модифицированные биотином хвостатые ампликоны. Реакция была перенесена в канал микрофлюидного элемента, и модифицированные биотином ампликоны были захвачены упомянутыми ранее зондами захвата.Вторая амплификация осуществлялась посредством аффинного связывания биотина с конъюгированными со стрептавидином золотыми наночастицами (SA-AuNP), и время гибридизации было оптимизировано до 15 минут (рис. S3B). Третье усиление было завершено через каталитический каскад ионов серебра, в результате чего все больше и больше ионов серебра осаждались на AuNP. После этого тройного усиления сигнала iRPAS сигнал визуализировался невооруженным глазом или полуколичественно определялся с помощью смартфона. Вся процедура работы для пользователя была простой, включала пять шагов, а время операции было коротким, менее 80 мин (рис.S4).

Примечательно, что весь i-chip был разработан с пазовыми и шиповыми соединениями типа Lego для простой сборки и обеспечения возможности одновременного анализа нескольких образцов (рис. 2D). Таким образом, платформу POCKET можно легко масштабировать для множественных анализов ДНК.

Для большинства методов обнаружения ДНК на основе ферментов, таких как ПЦР и петлевой изотермической амплификации (LAMP), требуется громоздкий термоциклер или инкубатор. Не удивительно, что современные системы POC все еще требуют дополнительного источника тепла, такого как инкубатор или экзотермический химический пакет ( 11 , 17 , 18 ).Чтобы сделать наш POCKET ультрапортативным без каких-либо дополнительных инструментов, мы воспользовались теплом, выделяемым смартфоном, и намеренно использовали это тепло для поддержания изотермической инкубации при 37 ° C, оптимальной температуре для RPA. Более подробно, мы запрограммировали приложение для смартфона (так называемое приложение «разогрева»), алгоритм которого требовал интенсивных операций центрального процессора, что приводило к быстрому повышению температуры смартфона. Контролируя как количество, так и время работы алгоритмов, мы точно контролировали температуру смартфона (рис.S5A). Передача тепла от смартфона к чипу происходила практически мгновенно из-за чрезвычайно малого нанолитрового объема. Чтобы предотвратить рассеивание тепла в холодных условиях, мы создали термос с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить потери тепла в холодных условиях (4 ° C). Мы также включили панель отображения температуры (от 30 ° до 40 ° C с интервалом 2 ° C), которая отображает внутреннюю температуру в режиме реального времени. Также были включены два дополнительных диска индикации температуры для записи того, была ли температура слишком низкой (<37 ° C) или слишком высокой (> 42 ° C) (рис.S5B). Чтобы защитить смартфон от биологической опасности, мы помещаем смартфон в одноразовый пластиковый пакет, чтобы изолировать его от клинических образцов, при этом смартфон все еще может нагревать чип вне пакета. После обнаружения мешок может быть переработан или утилизирован. Мы сравнили эффекты нагрева смартфона с одноразовым пластиковым пакетом и без него и обнаружили, что закрывающий пакет мало влияет на нагрев смартфона после 20-минутного нагрева смартфона (рис. S6).

Для считывания сигналов мы разработали f-box, в который интегрированы смартфон, подставка для смартфона и оптический блок с макрообъективом и светодиодом (LED) (рис.2E). Подставка для смартфона была спроектирована складной и изготовлена ​​из легкого картона (рис. S7). Стоимость изготовления одноразовой части нашей платформы составляет менее 4,1 доллара США, а многоразовой части менее 2,5 долларов США (таблица S1). По сравнению с коммерческими устройствами, такими как GeneXpert IV (17 000 долларов США), наша платформа очень рентабельна.

Анализ нескольких типов ДНК

Чтобы превратить POCKET в универсальную платформу, мы протестировали различные виды ДНК, включая генные мутации (делеции длинных и коротких фрагментов), SNP (одноосновные замены и вставки), аллельные гены и патогены. -специфические последовательности ДНК.Чтобы проверить ложноотрицательный результат, вызванный плохой подготовкой ДНК, мы добавили собственный ген (ген гемоглобина человека, hbb ) в образцы крови в качестве внутреннего контроля. Теперь мы можем различать отрицательный результат между плохой подготовкой ДНК и отсутствием мишени: если и внутренний контроль, и мишень отрицательны, то это указывает на плохую подготовку ДНК. Если внутренний контроль положительный, но цель отрицательная, то это означает отсутствие цели. Мы показали результаты положительного, отрицательного и плохого приготовления ДНК на рис.S8. Для обнаружения делеций длинных фрагментов мы протестировали делецию 19 т.п.н. гена α-талассемии Юго-Восточной Азии (SEA). Обратите внимание, что RPA был типичен только для амплификации последовательностей менее 500 пар оснований, а не для длинных фрагментов ( 19 ). Тем не менее, с помощью системы POCKET и разработанных парных праймеров (рис. S9A) мы обнаружили значительные различия между мутантным образцом и здоровым контролем; результаты были дополнительно подтверждены секвенированием ДНК (рис. 3А).

Инжир.3 Анализ ДНК с использованием платформы POCKET.

( A ) Результаты обнаружения в образце крови с мутацией α-талассемии SEA (делеция ~ 19 т.п.н.), представляющей делецию длинного фрагмента. -α ^3,7 мутацию α-талассемии использовали в качестве отрицательного контроля. ( B ) Результаты обнаружения в образце крови с мутацией β-талассемии CD41 (делеция TCTT, отмечена красной линией), представляющие делецию короткого фрагмента. ( C ) Результаты обнаружения в образце крови с мутацией CD17 β-талассемии (аденин, замещенный тимином, отмечен красным), представляющие собой замену на одно основание.( D ) Результаты обнаружения в образце крови с мутацией β-талассемии CD71 (вставлен аденин, отмечен красным), представляющие вставку одного основания. (От E до G ) Результаты обнаружения образцов трансбуккального свопа с аллельными генами ALDh3. Слева (E), посередине (F) и справа (G) представлены гомозиготный мутант дикого типа (ALDh3 * GG), гетерозиготный (ALDh3 * GA) и гомозиготный мутант (ALDh3 * AA) соответственно. ( H ) Результаты обнаружения в образце мочи инфицированного пациента K. pn .( I ) Результаты обнаружения в образце мочи инфицированного E. coli пациента. ( J ) Результаты обнаружения в образце молока, зараженного E. coli– , с добавлением добавок. ( K ) Результаты обнаружения в пробе речной воды, зараженной E. coli– . ( L ) Результаты обнаружения для листьев киви, инфицированных P. sa . C. gl использовали в качестве отрицательного контроля. Каждый отображаемый сигнал имел размер 200 мкм × 200 мкм (от A до L, вверху слева), полуколичественно определялся значением шкалы серого (от A до L, вверху справа) и дополнительно подтверждался секвенированием ДНК (от A до G, внизу).Зеленый прямоугольник представляет тип образца. Синие и красные прямоугольники представляют группу мутантов и здоровых людей (CTL). Оранжевые и голубые прямоугольники обозначают датчики, используемые при обнаружении КАРМАНА. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (три повтора). *** P <0,001, ** P <0,01, тест Стьюдента t . Н.С., не имеет значения.

Для обнаружения мутаций других генов, SNP и аллельных генов мы использовали концевые праймеры для ошибочного спаривания с использованием особого вида нуклеиновых кислот, заблокированных нуклеиновых кислот (LNA).LNA представляет собой нуклеиновую кислоту, химически модифицированную добавлением 20-O, 40-C метиленового мостика. LNA показала повышенную специфичность в обнаружении SNP, о котором ранее сообщалось ( 20 ). Кроме того, введение несовпадений в праймер, особенно на концевых концах, заметно ингибировало удлинение полимеразы и, таким образом, различало дикий тип и мутантные типы (фиг. S9B) ( 21 ). Мы выбрали следующие заболевания для генных мутаций и тестов SNP с помощью системы POCKET: (i) β-талассемия, всемирная наследственная анемия, содержащая различные типы генных мутаций [мы обнаружили мутацию CD41 (делеция четырех оснований) (рис.3B), мутации CD17 (замена одного основания) (рис. 3C) и мутации CD71 (вставка одного основания) (рис. 3D)] и (i) гены аллелей (ген ALDh3 человека), которые сильно коррелировали при склонности к алкогольному опьянению. В каждом случае (рис. 3, от E до G) мы получили сильные сигналы в мутантных образцах и слабые или нулевые сигналы в контрольных образцах. Результаты были дополнительно подтверждены секвенированием ДНК (рис. 3, от A до G, внизу).

Кроме того, для выявления последовательностей ДНК, специфичных для патогенов, образцы мочи пациентов были успешно протестированы и диагностированы на две распространенные бактериальные инфекции мочевыводящих путей: Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae ( K.pn ) через парные праймеры против областей консервативной последовательности (фиг. 3, H и I).

Подводя итог, система POCKET продемонстрировала универсальность в обнаружении всех типов ДНК с одноосновной специфичностью, включая, помимо прочего, генные мутации. Кроме того, весь тест по существу оставался одинаковым для разных типов ДНК; единственное серьезное изменение заключалось в разработке различных праймеров (таблица S2).

Обнаружение ДНК в других областях, помимо клинической медицины

В клинической медицине платформа POCKET оказалась очень успешной для обнаружения α-талассемии и β-талассемии в образцах крови, ALDh3 в буккальных мазках и патогенных микроорганизмов в образцах мочи.Чтобы еще больше расширить возможности системы POCKET в других областях, мы исследовали ее полезность в области безопасности пищевых продуктов, защиты сельского хозяйства и мониторинга окружающей среды (рис. 3, J – L).

Для обеспечения безопасности пищевых продуктов мы имитировали загрязнение пищевых продуктов, добавив 10 ⁴ копий E. coli в 1 мл стерильного молока. Система POCKET успешно обнаружила загрязнение (рис. 3J) без особых изменений в течение всего теста. Для защиты окружающей среды мы выбрали речную воду с содержанием E.coli в качестве нашей модели. Опять же, даже с огромным количеством примесей окружающей среды, таких как песок и микроорганизмы, мы успешно обнаружили 10 ⁴ копий E. coli с шипами в 1 мл пробы речной воды (рис. 3K). Для защиты сельского хозяйства подготовка образцов растений в устройстве POC была чрезвычайно сложной из-за присутствия в образце сильных ингибирующих соединений, таких как лигнин, полисахариды и фенолы ( 22 ). Чтобы более эффективно подготовить образцы растений, мы напечатали на 3D-принтере миниатюрные пестик и ступку для измельчения (рис.S10). Мы успешно обнаружили Pseudomonas syringae pv. actinidiae ( P. sa ), распространенный патоген фруктовых деревьев, в листьях киви с использованием нашей системы POCKET (рис. 3L).

Эти результаты подтвердили, что платформа POCKET была универсальной в отношении ресурсов образцов не только для клинических применений, но и для безопасности пищевых продуктов, защиты сельского хозяйства и мониторинга окружающей среды.

Производительность системы POCKET в полевых условиях

Была оценена производительность системы POCKET, от контроля температуры до сравнения методов золотого стандарта.Для контроля температуры (например, зимой или летом) мы запрограммировали и протестировали наше приложение для нагрева на смартфоне, чтобы достичь оптимальной температуры 37 ° C при различных температурах окружающей среды (4 °, 15 °, 25 ° или 37 °. C). В каждом случае для достижения и поддержания 37 ° C требовалось не более 20 минут (рис. 4A). Сильные сигналы были получены при всех испытанных температурах (рис. 4B). Мы также измерили производительность аккумулятора смартфона при каждой температуре окружающей среды. Как минимум четыре полных теста были выполнены без зарядки (аккумулятор 3400 мАч) (рис.S11A).

Рис. 4 Производительность обнаружения КАРМАННОЙ платформы.

( A ) Температурные профили с использованием нагрева смартфона в полевых условиях 4 °, 15 °, 25 ° и 37 ° C. Зеленая полоса указывает рекомендуемый диапазон температур реакции для RPA. ( B ) Эффективность обнаружения КАРМАННОЙ платформы при температуре окружающей среды 4 °, 15 °, 25 ° и 37 ° C. Н.С., не имеет значения. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA). ( C ) LOD платформы определяли 10-кратным разведением плазмидной ДНК и измерением их визуальных сигналов.Все тесты были выполнены в трех экземплярах. ( D ) Калибровочная кривая платформы обнаружения. Красная пунктирная линия указывает LOD: 113 копий / мл. ( E ) Мутации талассемии SEA, CD41, CD17 и CD71 измеряли в клинических образцах периферической венозной крови и образцах ДНК, очищенных из крови ( n = 118, среднее значение трех повторов для каждого). *** P <0,001, тест Стьюдента t . ( F ) E. coli и K. pn измеряли в образцах мочи пациента ( n = 34, среднее из трех повторов для каждого).*** P <0,001, тест Стьюдента t . ( G ) Образцы гомозиготных образцов дикого типа (ALDh3 * GG), гетерозиготных (ALDh3 * GA) и гомозиготных мутантов (ALDh3 * AA) были измерены из клинических буккальных мазков ( n = 20, в среднем по три повтора каждый) . *** P <0,001, тест Стьюдента t . ( H ) Кривые ROC мутантов SEA, CD41, CD17 и CD71 анализировали в образцах мутантного и здорового контроля (CTL). Значения площади под кривой (AUC) рассчитывались следующим образом: SEA, 1.000; CD41, 0,994; CD17, 0,981; CD71, 1.000. ( I ) Сравнивали кривые ROC E. coli и K. pn инфицированных образцов и образцов CTL. Значения AUC были рассчитаны как 1.000 ( E. coli ) и 1.000 ( K. pn ). ( J ) Кривые ROC для ALDh3 * G и ALDh3 * A анализировали в трех группах. Рассчитанные значения AUC составили 0,978 (ALDh3 * G) и 1000 (ALDh3 * A).

Были оценены рабочие параметры POCKET. Для определения предела обнаружения (LOD) системы мы использовали серийное 10-кратное разведение плазмидной ДНК (от 1 × 10 ¹⁰ до 10 копий / мл) в качестве стандартных образцов.Как и ожидалось, сигнал обнаружения уменьшался по сигмоидальной функции по мере уменьшения логарифма целевой концентрации (фиг. 4C). LOD, определенный как «холостой пробы с использованием дистиллированной воды плюс трехкратное стандартное отклонение» ( 23 ), был рассчитан и составил 113 копий / мл (рис. 4D).

Мы также исследовали срок годности i-chip без холодного хранения, выдерживая партию i-chip в инкубаторе при 25 ° C до 10 недель. Затем мы использовали их для обнаружения один раз в неделю. Никаких значительных изменений результатов через 10 недель не наблюдалось ( P <0.05), что указывает на то, что i-chip оставался стабильным в течение не менее 10 недель без хранения в холодильнике (рис. S11B).

Для удобства пользователя мы сравнили эффективность обнаружения группы обученных пользователей (ранее уже выполнявших КАРМАН как минимум три раза) с группой неподготовленных пользователей (впервые использовавших КАРМАН). Никаких существенных различий между двумя группами не наблюдалось, что говорит о том, что система POCKET была очень простой в использовании и очень удобной для пользователя (рис. S11C). Кроме того, поскольку смартфон был единственным одноразовым и дорогим инструментом, используемым в нашей системе, мы протестировали производительность нашего POCKET на смартфонах разных производителей.Результаты не показали значительных различий между какими-либо из трех протестированных брендов (рис. S11D).

Производительность системы POCKET сравнивалась с традиционными методами золотого стандарта, которые в настоящее время используются в централизованной лаборатории. С этой целью мы собрали в общей сложности 172 образца, включая 63 образца периферической венозной крови, 55 образцов ДНК, очищенных из крови участников, 20 буккальных мазков и 34 образца мочи. Чтобы продемонстрировать надежность нашего тестирования ДНК с использованием платформы POCKET на клинических образцах, мы протестировали клинические образцы с общими отклонениями.Мы суммировали аномальные характеристики клинических образцов, включая некоторые сильные помехи (например, фоновые клетки, гемоглобин и тромбоциты) в таблице S3. В образцах крови образцы включали широкий диапазон концентраций интерференции RPA (12 образцов с аномальными эритроцитами от 3,3 × 10 ¹² до 6,9 × 10 ¹² клеток / л, 46 образцов с аномальным гемоглобином от 52 до 159 г. / литр, 13 образцов с аномальными тромбоцитами от 101 × 10 ⁹ до 555 × 10 ⁹ отсчетов / литр).В образцах мочи образцы также включали широкий спектр фоновых клеток (19 образцов с аномальными эритроцитами: от 1 до 48 948 клеток / мкл, 24 образца с аномальными лейкоцитами: от 1 до 47 577 клеток / мкл, 8 образцов с аномальным эпителием). клетки: от 1 до 295 клеток / мкл) (таблица S4). Все образцы были успешно проанализированы с помощью системы POCKET. Они также были проанализированы с использованием стандартных методов, включая набор для обнаружения талассемии (коммерческий клинический набор) для образцов ДНК и крови, секвенирование ДНК для буккальных образцов и бактериальный посев для образцов мочи (рис.4, с E по G). Система POCKET показала успешные детекции. Общая точность нашего устройства для клинических образцов составляет 97,1%, что подтверждено стандартными лабораторными методами: секвенирование ДНК для образцов крови, буккального и ДНК, бактериальные культуры и масс-спектрометрия для образцов мочи. (таблица S5). Далее были построены кривые рабочих характеристик приемника (ROC) для определения площади под кривой (AUC) (рис. 4, H – J). Высокое значение AUC, превышающее 0,9, считалось отличной точностью ( 24 ). Каждый AUC в наших обнаружениях POCKET был больше 0.950. Здесь платформа POCKET достигла более высокой точности обнаружения, сравнимой с методами золотого стандарта, применяемыми в централизованных лабораториях.

Мы установили значение максимальной чувствительности в качестве порогового значения, которое привело к снижению специфичности и положительной прогностической ценности (PPV). Платформа POCKET по-прежнему обеспечивает 100% специфичность и PPV для обнаружения SEA, CD71, E. coli , K. pn и ALDh3 * A. Все остальные особенности были больше 77.8%, а PPV было больше 88,2% (таблица 1). Эти результаты продемонстрировали, что наша система POCKET обнаруживает несколько целей с отличными характеристиками.

Таблица 1 Обнаружение производительности платформы POCKET.

Пороговые значения были определены как максимальная чувствительность скринингового теста. N , количество проб, включенных для анализа ROC; 95% ДИ, 95% доверительный интервал; NPV, отрицательная прогностическая ценность.

ОБСУЖДЕНИЕ

Здесь мы создали ультрапортативную и универсальную КАРМАННУЮ платформу для обнаружения ДНК вне лаборатории и в условиях ограниченных ресурсов.Чтобы преодолеть проблемы, связанные с подготовкой образцов и усилением сигнала до считывания в рабочем процессе POCT, мы объединили 3D-печать, микрофлюидику, усиление сигнала iRPAS и смартфон. С помощью трехмерной печати можно свободно изготавливать миниатюрные прототипы устройств со сложной трехмерной структурой, обеспечивая высокую гибкость при подготовке образцов и манипуляциях с жидкостью ( 25 ). Таким образом, на нашей платформе POCKET можно использовать самые разные образцы сырой нефти. Во многих современных устройствах POCT, включая бумажные методы, клинические образцы (например,g., кровь) по-прежнему полагаются на предварительную лабораторную обработку. В настройках POC ( 26 ) сложно выполнить прямое определение типа «образец-ответ». Мы также внедрили микрофлюидику и усиление сигнала iRPAS, что позволяет проводить чувствительное, селективное и мультиплексное тестирование на кристалле. В дополнение к этому, создавая колориметрические сигналы, наш POCKET устраняет необходимость в каких-либо оптических фильтрах, делая всю платформу не только ультрапортативной и универсальной, но и более экономичной по сравнению с системами на основе флуоресценции ( 17 ).Мы используем смартфон не только в качестве считывающего устройства для количественного анализа, но и в качестве обогревателя, что позволяет быстро и надежно амплифицировать ДНК даже в холодных условиях. В POCT существует несколько методов нагрева с использованием химикатов, Пельтье и солнечного света ( 9 , 11 , 17 , 18 ). Все они требуют дополнительных нагревательных модулей, что приводит к увеличению веса и объема системы. Используя смартфон в качестве обогревателя и считывающего устройства, мы значительно уменьшили вес и объем всей платформы до 60 г и карманного размера.Насколько нам известно, POCKET — единственная платформа, которая использует сам смартфон в качестве источника тепла. Благодаря нашему комбинированному и комплексному подходу, система POCKET была чрезвычайно легкой и маленькой, что сделало систему POCKET, насколько нам известно, одним из самых маленьких и самых портативных устройств для тестирования ДНК POC. По сравнению с другими микросхемами, напечатанными на 3D-принтере или микрожидкостными микросхемами, наша система POCKET была более универсальной для более широкого диапазона возможных источников проб и обеспечивала мультиплексное обнаружение с уменьшенными затратами на реагенты (таблица S6) ( 6 , 9 , 11 , 14 , 17 , 27 — 31 ).

Помимо тестирования ДНК, мы уверены, что наша платформа может обнаруживать больше типов нуклеиновых кислот, включая, помимо прочего, двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК или РНК, учитывая, что и ДНК, и РНК могут быть амплифицированы с помощью рекомбиназная полимераза ( 14 , 19 , 32 ). Более того, нашу систему POCKET можно расширить для обнаружения нуклеиновых кислот в других областях, помимо клинической медицины, включая, помимо прочего, безопасность пищевых продуктов, защиту сельского хозяйства и мониторинг окружающей среды.Источниками проб могут быть кровь, моча, мазки со слизистой оболочки рта, молоко, речная вода, листья и т. Д.

При наличии двух миллиардов смартфонов (2016 г.) и даже больше к 2020 г. (охват более 70% населения мира), Смартфоны являются одними из самых удобных, удобных и мощных интерфейсов для обнаружения POC в условиях ограниченных ресурсов ( 33 , 34 ). Смартфоны также наиболее подходят для обработки и считывания сигналов в режиме POC. На основе встроенных в смартфоны возможностей беспроводной связи и геолокации наша платформа POCKET позволяет в реальном времени определять местонахождение распространения болезни.Кроме того, платформа POCKET может служить Интернетом медицинских вещей (IoMT) в анализе ДНК для передачи результатов тестирования на месте в централизованную больницу или в органы здравоохранения, обеспечивая пространственно-временное картирование заболеваний для дальнейшего исследования. Кроме того, конечные пользователи, включая пациентов, могут быстро получать отзывы о контроле и профилактике заболеваний.

POCT в этой статье — наша первая версия. В будущих усовершенствованиях мы расширим типы образцов до тех, которые, как известно, трудно приготовить, таких как мокрота и фекалии ( 35 , 36 ).Мы также будем и дальше предотвращать перекрестное заражение от положительных образцов. Способ загрузки реагента также можно лучше контролировать, используя метод без питания ( 11 , 37 ).

Мы предполагаем, что, предварительно изготовив часто выделяемые цели на наших чипах, мы предоставим серию комплексных панелей обнаружения ДНК для каждого отдельного приложения, от клиник до сельского хозяйства, окружающей среды, продуктов питания и питьевой воды. По мере дальнейшего развития мы твердо уверены, что платформа POCKET станет широко используемым устройством POCT для большого количества реальных приложений в различных областях.Мы также надеемся, что наша система POCKET станет одним из золотых стандартов для будущего развития POCT.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изготовление i-chip

Мы разработали i-chip в программе SolidWorks (SolidWorks, США). За исключением блока микрофлюидного усиления, i-chip напечатали на 3D-принтере ProJet MJP 3600 с использованием смолы VisiJet M3 Crystal (3D Systems, США). Все свежеотпечатанные чипы i-chip нагревали в печи при 60 ° C для удаления воска-носителя, а затем промывали в кукурузном масле в течение 15 минут.Наконец, напечатанные i-чипы промывали водой и сушили в потоке азота. В блоке пробоподготовки небольшой бумажный диск диаметром 2 мм вырубался из большого куска бумаги для экстракции ДНК (GE Lifescience, США) с помощью микроперфоратора Харриса. Бумажный диск был помещен в модуль корзины, который затем был запечатан в пластиковый пакет до тех пор, пока он не потребовался. Блок микрофлюидного усиления, содержащий микрофлюидные каналы шириной 200 мкм и глубиной 30 мкм, был изготовлен с использованием стандартной мягкой литографии, как описано ранее ( 38 ).Сначала мы изготовили форму чипа на предметном стекле методом стандартной фотолитографии с фоторезистом AZ4620 (AZ Electronic Materials, США). Форполимер PDMS (Dow Corning, США) заливали в форму для стружки и отверждали при 90 ° C в течение 30 мин. Затем отвержденный ПДМС снимали с формы, чтобы получить узорчатые каналы. Затем слой PDMS обрабатывали в соответствии с предыдущим отчетом (рис. S2): сначала пропитывали 20 мл промывочного буфера (1% H ₂ O ₂ , 3 M HCl) в течение 10 минут, а затем обрабатывали 30 мл. 30% (3-аминопропил) триметоксисилана (APTMS; Adamas, Китай) в воде ( 39 ).После этого слой ПДМС дважды промывали водой, а затем сушили продувкой азота. Слой PDMS прикрепляли к функционализированному альдегидом стеклянному чипу (Baio, Китай) на 1 час, а затем вакуумировали в течение 30 минут. Мы разработали два слоя, изготовленных из PDMS: слой канала зонда и слой микрофлюидного канала. Слой канала зонда сначала приклеивался к стеклянной микросхеме. Затем в каждый канал вводили 5 мкМ аминофункциональных ДНК-зондов (Tsingke, Китай) в растворе для выявления пятен ДНК (CapitalBio, Китай) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре для модификации зондов на поверхности стеклянного чипа посредством конденсации альдимина. .Затем слой канала зонда отделяли от чипа, который затем тщательно промывали водой и сушили в токе азота. Свежеприготовленный слой микрожидкостного канала затем связывали со стеклянным чипом, модифицированным зондом, с образованием модуля микрожидкостной амплификации. Блок усиления крепился к i-chip и соединялся с блоком подготовки с помощью трубки из ПТФЭ (внутренний диаметр 0,35 мм; Titan, Китай). Изготовленный i-chip хранили при 4 ° C до использования.

Конструкция f-box

Мы сделали f-box со складной подставкой, оптический блок со светодиодом белого света (Supernatural Light, Китай) и макрообъективом 60 × (Baisite, Китай), а также смартфон (Lenovo ZUK Z2, Китай).Подставка разработана в программе SolidWorks и изготовлена ​​из белого картона (толщиной 0,4 мм). Затем картон был вырезан по разработанному шаблону на лазерном гравировальном станке (Shenhui, Китай). После этого мы сложили картон в подставку, так как восемь этапов складывания процесса сборки, показанные на рис. S7, а затем зафиксировал кредл в предназначенном для этого слоте. На верхней стенке люльки было открытое окно для вставки блока детектирования в люльку. Белый светодиод мощностью 0,3 Вт с питанием от двух 1.Над блоком детектирования для подсветки устанавливались 5-вольтовые батарейки. Макрообъектив вставлялся в верхнее окно подставки и совмещался с блоком детектирования. Макрообъектив плотно фиксировался на задней камере смартфона зажимом.

Нагрев чипа смартфоном

Мы контролировали нагрев чипа с помощью приложения разогрева с функциями считывания показаний внутреннего датчика температуры и нагрева смартфона. Температура контролировалась как количеством, так и временем работы алгоритмов.После того, как температура достигла 37 ° C, i-chip поместили на заднюю часть смартфона для инкубации. Чтобы избежать тепловых потерь и сэкономить электроэнергию, смартфон с i-chip помещали в термос с индикатором температуры (Jieyada, Китай). Затем тепловые эффекты смартфона в термосе были протестированы в инкубаторе (Bluepard, Китай) при 4 °, 15 °, 25 ° и 37 ° C. При тестировании производительности нагрева смартфона в холодной среде (4 ° C) смартфон с i-chip помещали в термос и заклеивали зажимами перед помещением в инкубатор.Температура i-chip контролировалась в реальном времени с помощью внешнего регистратора температуры (Elitech, Китай).

Сбор образцов

Исследование было одобрено комитетами по этике больниц Дапин и Юго-Запад, Чунцин, Китай. Очищенные образцы ДНК, буккальные образцы и образцы мочи были собраны у 55, 20 и 34 участников соответственно из больницы Дапин, Чунцин, Китай. Образцы периферической венозной крови 63 участников были собраны в Юго-западной больнице, Чунцин, Китай.Образцы с добавками молока были воспроизведены путем смешивания 1 мл стерильного молока с E. coli [10 ⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл]. Пробы речной воды с добавками были приготовлены путем смешивания 1 мл природной речной воды с 10 ⁴ КОЕ / мл E. coli . инфицированных P. sa листьев и инфицированных Colletotrichum gloeosporioide ( C. gl ) листьев были получены от X. Sun в Сычуаньском сельскохозяйственном университете, Чэнду, Китай.

Подготовка образца ДНК

Мы погрузили модуль корзины в жидкость для образца.Около 2 мкл образца было поглощено бумажным диском для экстракции внизу. Мы подготовили образцы листьев путем дополнительного измельчения в соответствии со следующими этапами. Пять миллиграммов листьев со 100 мкл буфера для лизиса (Tiangen, Китай) добавляли в ступку, напечатанную на 3D-принтере, и измельчали ​​пестиком, напечатанным на 3D-принтере, в течение 5 мин, а затем добавляли 100 мкл нейтрализующего буфера (Tiangen, Китай) и тщательно перемешать. Бумажный диск для экстракции с жидкостью образца сушили при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого модуль корзины был вставлен в моечную камеру (внутренний диаметр 5,5 мм).0 мм; высота 6,5 мм) блока пробоподготовки и промывают 200 мкл реагента для очистки (GE Lifescience, США) в течение 5 мин и 200 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl и 0,1 мМ ЭДТА, pH 8,0) в течение 5 мин. . После промывки корзиночный модуль с очищенным образцом ДНК на бумажном диске вынимали из промывочной камеры и сушили при комнатной температуре в течение 15 мин.

Амплификация RPA

Мы выполнили амплификацию RPA в соответствии с инструкциями производителя (TwistDx, Великобритания). Для каждой реакции 25 мкл реакционного буфера TwistDx 2 × смешивали с 5 мкл 10 × основной E-mix, 3.6 мкл 25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфата, 6,6 мкл воды, свободной от нуклеаз, и 2,5 мкл смеси ядер. Затем 4,8 мкл смеси праймеров, содержащей биотинилированный обратный праймер и хвостатый прямой праймер, добавляли к реактиву RPA. Предварительно смешанный реакционный реагент RPA (47,5 мкл) и 2,5 мкл ацетата магния последовательно вливали в пробирку из ПТФЭ (внутренний диаметр 1,0 мм и длина 65 см, Titan, Китай). Каждый реагент разделяли воздушным зазором (более 5 см в длину), чтобы сформировать изолированную тандемную пробирку для реагентов, и хранили при 4 ° C до тех пор, пока не потребовалось.В начале амплификации реагенты в изолированной тандемной пробирке с реагентами вводились в реакционную камеру (внутренний диаметр 6,9 мм и глубина 6,5 мм) в блоке пробоподготовки путем нагнетания воздуха с помощью шприца объемом 1 мл, подключенного к тандему. трубка. Смартфон, работающий с приложением для разогрева, выдерживал реакцию при 37 ° C в течение 20 мин. Все праймеры, аминофункциональные ДНК-зонды и LNA-модифицированные зонды (Zhanshan, Китай) описаны в таблице S2. Плазмида (Цингке, Китай) описана на рис.S12.

Амплификация AuNP-серебро

После амплификации RPA вводили 50 мкл гибридизационного буфера (5 × раствор Денхардта, 3 × физиологический раствор цитрата натрия и 0,1% бычьего сывороточного альбумина), содержащего 1% AuNP, конъюгированные со стрептавидином (Nanoprobes, США). в реакционную камеру для смешивания с прореагировавшим раствором RPA. Затем мы открывали поворотный клапан и вводили смешанный раствор в блок микрофлюидного усиления через соединительную трубку из ПТФЭ, нагнетая воздух с помощью шприца объемом 1 мл.После этого чип инкубировали 15 мин при нагревании на смартфоне. Затем слой PDMS отделяли от блока амплификации, промывали водой и затем окрашивали 20 мкл буфера для усиления серебра (Sigma, США) в течение 7 мин. Наконец, после тройного усиления сигнала iRPAS, устройство микрофлюидного усиления было отображено с помощью смартфона, на котором было установлено программное приложение POCKET для считывания сигнала.

ПО POCKET

Приложение для смартфона «POCKET версия 1.0 ”был разработан для захвата изображения и обработки изображения, ввода основной информации об образце, включая штрих-код образца, местоположение и загрузку результатов в облачную базу данных. Вкратце, изображение было захвачено и преобразовано в 8-битный формат шкалы серого и вычислено его значение шкалы серого (черный как 0 и белый как 255) в областях, представляющих интерес для образца, эталона и фона (рис. S13). Во-первых, среднее значение в градациях серого образца и эталона было получено путем вычитания фонового значения.Затем относительное кратное изменение было получено путем деления среднего значения шкалы серого образца и эталона. Наконец, относительные кратные изменения образцов записывались и сравнивались с пороговым значением для определения положительного или отрицательного результата. Здесь порог был обозначен как значение отсечки для каждой цели.

Подтверждение обнаружения

Все очищенные образцы ДНК и образцы периферической венозной крови были первоначально диагностированы с помощью набора для диагностики талассемии (Hybribio, Китай) методом обратного дот-блоттинга и затем проверены путем секвенирования ДНК (Invitrogen, Китай).Для проверки аллельных генов ген ALDh3 из буккальных мазков был обнаружен с помощью секвенирования ДНК (Invitrogen, Китай). Бактерии в образцах мочи культивировали на чашке со средой с кровяным агаром (Pangtong, Китай), а затем диагностировали с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации-времяпролетной масс-спектрометрии (bioMérieux, Франция).

Анализ данных и статистика

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, США) и SPSS версии 19.0 (SPSS, США). Данные были нормализованы и выражены как среднее ± стандартное отклонение. Независимые выборочные двусторонние тесты Стьюдента t были выполнены для сравнения между группами. Многогрупповой статистический анализ выполняли с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA), при этом наименьшая значимая разница использовалась для апостериорного тестирования. P значения <0,05 считались статистически значимыми. Эффективность обнаружения платформы POCKET рассчитывалась с использованием площади под кривыми ROC.В качестве скринингового теста значения отсечения были выбраны на основе минимизированных ложноотрицательных результатов, определяемых как максимальная чувствительность во всех точках кривой ROC.

Благодарности: Мы благодарим W. Jiang, H. Huang, T. Sun и L. Liao из отделения клинической лаборатории больницы Daping, Чунцин, Китай. Мы также благодарны X. Sun из Сычуаньского сельскохозяйственного университета, Чэнду, Китай, за помощь с образцами растений. Финансирование: Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 81430053, 81430054, 81972027, 31400087 и 21778071), крупными научными исследовательскими проектами Народно-освободительной армии Китая (грант №AWS14C003-2), военный научно-исследовательский проект Армейского медицинского университета (2018XYY04) и Институт нанотехнологий и нанобионики Сучжоу (Y5AAS11001). М.Г. выражает признательность за поддержку Молодежной ассоциации содействия инновациям CAS (2015257). Вклад авторов: H.X., J.C., M.G., D.L. и M.C. разработал исследование. Ю.З. распечатали 3D-единицы. H.X., A.X., L.Z., F.Z., W.Z., Y.W., C.Y. и K.C. собрал образцы. H.X., A.X. и D.W. проводил эксперименты. W.L., S.D., J.L., Q.Z. и W.F. проанализировали данные.