Пластина свинцовая для электрофореза: Свинцовые пластины толщиной 0,5 мм. (40×50, 60×100, 100×150 мм.) Цена за упаковку. Упаковка 10 шт. каждого размера.

Пластина свинцовая (200*500)

Пластина свинцовая (200*500)

MedicalStore

с 09:00 до 18:00 Пн. Пт.
онлайн заказ круглосуточно

1. Главная

2. Физиооборудование

3. Оборудование для электротерапии

4. Пластина свинцовая (200*500)

Оборудование для электротерапии

Пластина свинцовая — предназначена для проведения процедур гальванизации и электрофореза. Свинец играет роль токораспределительного элемента. Совместно с свинцовыми электродами необходимо использовать многоразовые гидрофильные прокладки. 

Артикул:

00000008729

Розничная цена:

11 000 ₸

Наличие:

В наличии.

—

+

Купить

Быстрый заказ

Описание

Пластина свинцовая — предназначена для проведения процедур гальванизации и электрофореза. Свинец играет роль токораспределительного элемента. Совместно с свинцовыми электродами необходимо использовать многоразовые гидрофильные прокладки. Свинец вставляется в технический разрез гидрофильной прокладки (карман) и служит для равномерного распределения тока по всей поверхности. Свинцовые электроды подойдут для аппарата Поток-1. либо для любого другого профессионального аппарата гальванизации электрофореза.

Характеристики:

• Размер, мм — 200*500

Другие товары из этой категории

Получить консультацию по товару Пластина свинцовая (200*500)

Отправить заявку

Оснащаем необходимой медицинской техникой, сэкономив для вас до 30% бюджета.

Не можете выбрать какое оборудование необходимо? Звоните, мы подберем все для полноценной работы
клиники.

8 (727) 221 91 10

О компании

Мы, ТОО «Medical Store», специализируемся на оптово-розничной продаже диагностического
оборудования для медицинской и ветеринарной промышленности. Являемся официальными
представителями большинства Немецких, Корейских, Российских и других
заводов-производителей.
Подробнее…

Регионы доставки: Алматы, Астана, Актау, Актобе, Атырау, Караганда, Кокшетау, Костанай,
Кызылорда, Павлодар, Петропавловск, Семипалатинск, Талдыкорган, Тараз, Уральск,
Усть-Каменогорск, Шымкент.
Подробнее..

Приведённые цены и характеристики товаров носят исключительно ознакомительный характер и
не являются публичной офертой.

Перезвоните мне

Введите ваши данные и мы свяжемся с вами в ближайшее время

Форма отправлена!

Мы свяжемся с вами в ближайшее время, спасибо за обращение!

Забыли пароль?

Укажите ваш e-mail и мы отправим вам инструкцию по восстановлению пароля.

Сброс пароля

На ваш E-mail была отправлена инструкция.

Для просмотра оптовой цены необходимо авторизоваться.

Войти на сайт

Для уточнения цены необходимо обратиться к менеджеру.

Обратиться к менеджеру

Для вашего профиля оптовая цена не отображается!

Закрыть

Аппарат для электрофореза Поток 1

Аппарат электротерапии Поток-1 предназначен для профилактического и лечебного воздействия постоянным током на организм человека, а также проведения лекарственного электрофореза.

Токи оказывают противоболевое, противовоспалительное, противоотечное, антиспастическое действие, улучшают циркуляцию крови, питание клеток. Электрофоретическое введение лекарств с помощью аппарата Поток-1 дает ряд преимуществ перед другими видами приема препаратов: локальное введение, доставка непосредственно к больному очагу, под действием тока увеличивается проникающая способность клетки и повышается концентрация препарата непосредственно в очаге воспаления, боли.

Особенности реализованных методов:

• большая лечебная эффективность;
• безболезненность процедур;
• возможность сочетания с другими методами лечебного воздействия

К аппарату Поток-1 прилагается комплект принадлежностей со свинцовыми электродами (провода пациента, пластина свинцовая). По дополнительной заявке поставляется комплект принадлежностей с углетканевыми электродами (набор прямоугольных электродов шести типоразмеров, двухлопастной, трехлопастной-полумаска Бергонье, воротниковый, провода пациента).

Аппарат Поток-1 применяется для лечения самых различных заболеваний в стационарных и домашних условиях.

Показания к применению

Заболевания и повреждения опорно-двигательного аппарата:

• Деформирующий артроз
• Инфекционно-аллергические артриты и полиартриты
• Ревматоидный артрит
• Бурситы, периартриты, пяточные шпоры
• Переломы костей
• Ушибы, растяжения, вывихи, контрактуры суставов

Заболевания периферической нервной системы

• Невралгии
• Остеохондроз позвоночника
• Радикулиты, люмбаго

Заболевания сердечно-сосудистой системы и периферических сосудов

• Гипертоническая болезнь I-II стадии
• Облитерирующие заболевания сосудов конечностей
• Вегето-сосудистая дистония
• Варикозное расширение вен

Заболевания органов пищеварения

• Хронический гастрит
• Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки

Заболевания органов дыхания

• Бронхиальная астма
• Хронический бронхит.

Паспорт (инструкция по эксплуатации) и схема аппарата для гальванизации Нион

1. Назначение

Аппарат для гальванизации «Нион» предназначен для воздействия постоянным электрическим током на организм человека с лечебными и профилактическими целями, а также для проверки процедуры лекарственного электрофореза. Может использоваться в медицинских (клиники и стационары), лечебно-профилактических и оздоровительных учреждениях.

2. Основные технические данные

2.1 Напряжение питающего переменного электрического тока от бытовой сети — 220 В

2.2 Частота питающего электротока — 50 Гц

2.3 Мощность, потребляемая от сети аппаратом, не более — 10 ВА

2.4 Максимальный ток в цепи пациента при нагрузке в 500 Ом — 50+-5мА

2.5 Поддиапазоны значений тока в цепи пациента — 0….5 мА

2.6 Коэффициент пульсации тока в цепи пациента при любом значении тока нагрузки, не превышает 0,3%

2.7 Интервал отсчета значения тока в цепи пациента
(с цифровой индикацией) — 0,1 мА

2.8 Электронная блокировка, исключающая появление тока в цепи пациента при включении аппарата при переключении поддиапозона работы, при положении ручки регулятора тока не в крайнем левом (нулевом) положении

2.9 Масса аппарат, не более 1,5 кг

2.10 Средний сок службы аппарата, не менее………………………….

2.11 Электробезопасность аппарата соответствует требованиям ГОСТ 12.2.025-76, класс защиты II типа BF.

3. Комплект поставки

Аппарат для гальванизации «Нион», комплект принадлежностей,
комплект запасных частей, паспорт

3.1 Комплект принадлежностей

3.1.1 Провод пациента одинарный с наконечником – 2 шт.

3.1.2 Пластинка свинцовая – 1 шт.

3.2 Комплект запасных частей

3.2.1 предохранитель ПМ 0,5 – 1шт.

3.2.2 Наконечник провода пациента – 1 шт.

4. Устройство и принцип работы

4.1 Электролечебный аппарат для гальванизации лечебного электрофореза позволяет плавно регулировать в цепи пациента силу постоянного тока, полученного при выпрямлении переменного тока от бытовой электросети.

Все детали и элементы электронной схемы смонтированы на вспомогательных бобышках, расположенных внутри корпуса. Собственно корпус аппарата выполнен из электроизоляционного полимерного материала и состоит из основного корпуса и съемного дна. Аппарат выполнен в настольном варианте, а также допускает установку на вертикальной поверхности.

На лицевой панели аппарата (рис. 1) расположены индикаторы цифрового миллиамперметра I (с интервалом отсчета в 0,1 мА), ручка плавного регулирования тока в цепи пациента 2, переключатель 3 поддиапазонов значений тока пациента «5мА» и «50 мА», тумблер 4 отключения аппарата от сети и прорези 5 в корпусе. На передней стенке установлены выходные клеммы 6, имеющие маркировку «+» и « — ». Аппарат включается в электросеть штепсельной вилкой 7.

В аппарате имеется электронное блокирующее устройство, исключающее появление тока в цепи пациента при включении аппарата и переключении поддиапазонов значения тока пациента установлена не в крайнем левом (нулевом) положении.

Рис. 1

4.2 Схема электрическая показана на рис. 2.

5. Указание мер безопасности

5.1 Для исключения несчастного случая пациента необходимо располагать вне пределов досягаемости заземленных металлических предметов, батарей отопления и т. д.

5.2 Размещение электродов на теле пациента и их смена должны производиться только при отключенном от сети аппарате и после установки ручки регулятора тока пациента в крайнее левое (нулевое) положение.

5.3 Замена предохранителей должна производиться только при отключенной штепсельной вилки от розетки электросети.

Запрещается пользование аппаратом лицам, не имеющим специальной подготовки.

6. Подготовка аппарата к работе

6.1 Подключить аппарат штепсельной вилкой в розетку электросети.

6.2 Установить ручку регулятора тока пациента в крайнее левое (нулевое) положение.

Таблица 1

6.3 Переключая тумблер, установить требуемый поддиапазон тока пациента: «5 мА» или «50 мА».
Аппарат готов к работе.

7. Порядок работы

7.1 продолжительность процедуры, величина тока и другие данные устанавливаются врачом.

7.2 Расположить электроды на теле пациента, после чего провода пациента подключить к выходным клеммам аппарата.

7.3 переключатель тумблера «Сеть» включить аппарат (загораются индикаторы цифрового миллиамперметра), плавным, медленным вращением рукоятки регулятора установить заданную величину тока пациента.

7.4 После окончания процедуры, вращая ручку регулятора против часовой стрелки, значение тока пациента плавно уменьшают до нуля и тумблером «Сеть» аппарат отключается от сети. После этого с тела пациента удаляют электроды.

7.5 В конце рабочего дня штепсельная вилка сетевого шнура отключается от розетки питающей электросети.

8. Техническое оборудование

8.1 До начала выполнения работ по техническому обслуживанию аппарат должен быть отключен от питающей электросети, штепсельная вилка сетевого шнура должна быть извлечена из розетки.

8.2 Через каждые 6 месяцев эксплуатации аппарата необходимо производить его профилактический осмотр. Проверяется состояние электрического монтажа на отсутствие видимых повреждений и удаляется пыль.

Осмотр должен проводить представитель «Медтехники», МП «Черномор» или другой квалифицированный специалист.

8.3 Разборка аппарата производится в следующей последовательности: вывернуть установленные на боковых стенках винты, снять крышку корпуса. Произвести осмотр или ремонт, произвести сборку в обратной последовательности.

8.4 Внешняя отделка корпуса аппарата допускает влажную санитарную обработку дезинфицирующими веществами: 3%-ым раствором перекиси водорода с добавлением 0,5 %–го раствора синтетического моющего средства типа «Лотос».

9. Возможные неисправности и способы их устранения

Неисправность, внешнее проявление и дополнительные признаки Вероятная причина Метод устранения
При включении в сеть аппарат не работает Перегорел предохранитель Заменить предохранитель
При включении в сеть аппарат работает, но один или несколько индикаторов не горят Вышел из строя индикатор Заменить индикатор

Индикаторы горят, ток в цепи пациента отсутствует, но при вращении ручки регулятора в одном из положений возникает ток Обрыв обмотки проволочного потенциометра Контрольным прибором проверить наличие обрыва и заменить потенциометр

Не работает блокировка Вышел из строя один из элементов электронной схемы Вызвать специалиста

Для замены индикатора необходимо снять крышку, демонтировать платы и заменить индикатор.

Для замены предохранителя слегка нажать головку держателя предохранителя на боковой стенке аппарата и поворотом против часовой стрелки вынуть ее вместе с предохранителем из гнезда. Заменить предохранитель и установить головку.

10. Свидетельство о приемке

Аппарат для гальванизации «Нион», заводской номер ____ соответствует техническим условиям ТУ ______ и признан годным для эксплуатации.

Дата выпуска ___________________________.

Аппарат следует хранить в закрытом помещении при температуре от 278? К до 313?К (+5…+40?С). Относительная влажность воздуха не должна превышать 80% при температуре 298?С (+25?С). Воздух в помещении не должен не должен содержать примесей, вызывающих коррозию.

11. Гарантия изготовителя

11.1 Изготовитель гарантирует соответствие аппарата требованиям технических условий при соблюдении потребителем условий эксплуатации, транспортирования и хранения.

11.2 Гарантийный срок эксплуатации – 2 года со дня ввода изделия в эксплуатацию, но не более 2,5 лет со дня отгрузки его изготовителем.

11.3 В течение гарантийного срока малое предприятие «Черномор» безвозмездно ремонтирует или заменяет изделие и его части по предъявлении гарантийного талона.

11.4 Предельный срок защиты без переконсервации – 5 лет.

12. Сведения о рекламациях

В случае отказа аппарата или неисправности его в период действия гарантийных обязательств, а также обнаружения некомплектности при его первичной приемке владелец аппарата должен направлять в адрес МП «Черномор» следующие документы:
-заявку на ремонт (замену) с указанием адреса и номера телефона, дефектную ведомость, гарантийный талон.



Рис. 2. Схема электрическая принципиальная (к сожалению другой пока нет)

Аппарат Поток-1 ЭМА профессионального электрофореза

Аппарат Поток-1 ЭМА профессионального электрофореза

Аппарат Поток-1 ЭМА профессионального электрофореза в наличии в нашем магазине

Данный аппарат подходит для лечебного электрофореза на дому и в профессиональном применении в клиниках.

Отличительные особенности:

Современный дизайн

Небольшие размеры, которые не требуют большого места для размещения прибора

Цифровой дисплей для индикации текущих настроек прибора

Мощность выходного тока регулируется с помощью кнопок на приборной панели устройства

Звуковая сигнализация окончания процедуры

Гарантия 1 год

Электрофорез для генотипирования: диагональный гель-электрофорез с микротитровальной матрицей на горизонтальных полиакриламидных гелях, гидролинке или агарозе

Электрофорез ДНК традиционно проводят в матрице либо агарозного, либо акриламидного геля. Значительные усилия были направлены на улучшение качества агароз, способных к высокому разрешению, но для небольших фрагментов, таких как фрагменты полимеразной цепной реакции (ПЦР) и пост-ПЦР-гидролиза, акриламид по-прежнему обеспечивает самое высокое разрешение.Хотя агарозные гели можно легко приготовить в открытом формате для получения удобства горизонтального электрофореза, акриламид не полимеризуется в присутствии воздуха, и обычные конфигурации для приготовления геля приводят к электрофорезу в вертикальном измерении. Мы описываем здесь очень простое устройство и метод приготовления и обработки горизонтальных полиакриламидных гелей (H-PAGE). Кроме того, открытое горизонтальное расположение позволяет загружать группы скважин. Поскольку многие процедуры выполняются в стандартных 96-луночных микротитровальных планшетах, мы также разработали устройство, которое сохраняет точную конфигурацию массива 8 x 12 и позволяет проводить электрофорез на треках после 71.6 градусов по диагонали между лунками (MADGE, диагональный гель-электрофорез микротитровальной матрицы) с использованием акриламида или агарозы. Это устраняет почти все время, затрачиваемое персоналом на настройку, загрузку и ведение записей, и обеспечивает высокое разрешение для распознавания образов генотипа. Природа и размер гелей позволяют напрямую складывать гели в один резервуар, так что резервуар, обычно используемый для анализа 30-60 образцов, может быть легко использован для анализа 1000-2000 образцов. Гели также позволят роботизированную загрузку. Электрофорез позволяет анализировать размер и заряд, параметры, недоступные для жидкофазных методов: таким образом, возможны модели размера генотипа, повторы переменной длины и гаплотипы, а также возможность адаптации к типированию точечных вариаций с использованием протоколов, которые создают разницу, обнаруживаемую электрофорезом.

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот в температурном градиенте: анализ конформационных переходов, вариаций последовательностей и взаимодействий белок-нуклеиновая кислота

Гель-электрофорез в температурном градиенте (TGGE) применяется для анализа конформационных переходов и вариаций последовательности нуклеиновых кислот и взаимодействий белок-нуклеиновая кислота. Линейный и хорошо воспроизводимый температурный градиент устанавливается перпендикулярно или параллельно направлению электрофореза.Прибор состоит из электрически изолированной металлической пластины, которая нагревается с одной стороны и охлаждается с другой стороны двумя термостатирующими ваннами и используется в качестве вспомогательного устройства для коммерческих горизонтальных инструментов для гель-электрофореза. Биополимеры разделяются в TGGE по размеру, форме и термостабильности их конформационных переходов. Если температурный градиент устанавливается перпендикулярно электрофорезу, мономолекулярные конформационные переходы нуклеиновых кислот проявляются в виде непрерывных кривых перехода; разделение нитей приводит к прерывистым переходам.В исследованиях РНК вироидов было показано, что естественная кольцевая РНК вироидов претерпевает один высоко кооперативный переход, обнаруженный TGGE как резкое замедление подвижности. Олигомерные промежуточные продукты репликации вироидов обнаруживают сосуществующие структуры, которые не могут быть обнаружены никакими другими методами. Двухцепочечная сателлитная РНК вируса мозаики огурца представляет собой смесь вариантов последовательностей, каждая из которых имеет одинаковую длину в 335 нуклеотидов. В TGGE было выделено шесть различных штаммов. Варианты последовательностей вироидов анализировали путем гибридизации РНК вироида с (-) нитевыми транскриптами РНК вироида из клонов кДНК вироида.Вариации последовательности приводят к несовпадению двойных нитей и, следовательно, к сдвигу кривой перехода в сторону более низкой температуры. Мутации в плазмидах, особенно в клонированных вставках, были обнаружены путем смешивания плазмид двух разных клонов, линеаризации, денатурирования, ренатурирования и поиска сдвигов в кривых перехода, которые возникают в результате образования несовпадений во время ренатурации (+) — и (-) нити от разных клонов. Приведены примеры для разных клонов вироидов и ВИЧ-клонов от одного и того же пациента.В другом примере клоны с точечными мутациями в результате сайт-направленного мутагенеза анализируются и отбираются с помощью TGGE. TGGE также применяется для изучения влияния аминокислотных обменов в репрессоре Tet из E. coli на термостабильность репрессора и на способ связывания репрессора с операторной ДНК. Результаты обсуждаются с учетом того, что TGGE может применяться в качестве рутинной аналитической лабораторной процедуры.

Gel Electrophoresis — обзор

2.31.2.2.1 1D SDS-PAGE и 2D-GE

Гель-электрофорез разделяет молекулы на основе физических характеристик, таких как размер, форма или p I внутри гелевой матрицы. Во время SDS-PAGE белки разделяются в соответствии с их электрофоретической подвижностью в зависимости от длины полипептидной цепи или MW [5]. Гель изготовлен с различными концентрациями акриламида и сшивающего агента, что дает полиакриламидные сетки разного размера. Белки денатурируют с помощью SDS, который покрывает белки отрицательным зарядом, прямо пропорциональным его массе, так что отношение массы к заряду ( m / z ) остается постоянным.Денатурированные белки превращаются в длинные стержни вместо сложной третичной формы; следовательно, скорость, с которой белки, покрытые SDS, мигрируют в геле, зависит от его размера, а не от его заряда или формы [5]. Затем разделенные белки переваривают в геле для разделения пептидов и анализа ВЭЖХ-МС / МС.

В 2D-GE два свойства, которые используются для разделения белков, — это p I (pH, при котором молекула не несет чистого электрического заряда — с использованием IEF) и MW (с использованием 1D SDS-PAGE; см. Рисунок 2) ).IEF разделяет белки на основе их относительного содержания кислотных и основных остатков. Белки вводятся в гель, который имеет установленный градиент pH (иммобилизованный градиент pH или полоски IPG). IEF может разделять белки, которые различаются по значениям p I всего на 0,01, с превосходной воспроизводимостью и высокой емкостью белковой нагрузки, особенно с полосками IPG. ИЭФ широко используется не только в первом измерении разделения в 2D-GE, но также для препаративного фракционирования белков в жидком и гелевом форматах.

Рис. 2. Двумерный гель-электрофорез (2D-GE) изоэлектрического фокусирования (IEF) в диапазоне pH 3,0–10,0. Белки психрофила Pedobacter cryoconitis , растворенные в 12,5% акриламидном геле.

2D-GE по-прежнему считается «рабочей лошадкой» для протеомики, поскольку он хорошо зарекомендовал себя и надежен, а его преимущество состоит в том, что он позволяет одновременно визуализировать тысячи белковых пятен, количественно определять их уровни и обнаруживать ПТМ. Однако он имеет хорошо изученные ограничения, такие как значительная рабочая нагрузка, низкое разрешение для высокогидрофобных белков и чрезвычайно кислые или основные, большие или маленькие белки.Использование автоматизированных систем точечного удаления и оборудования для разложения в геле, а также программного обеспечения для анализа изображений повысило его возможности и производительность. Была разработана альтернатива протоколу 2D-GE для разделения и обнаружения наиболее гидрофобных белков тилакоидной мембраны с использованием электрофореза в 2D голубом нативном (BN) геле, где солюбилизированные тилакоидные мембраны загружаются красителем для зарядки комплексов для разделения. с последующим SDS-PAGE во втором измерении (2D: BN / SDS-PAGE).Этот протокол сводит к минимуму потери за счет эффективности переноса белка. Другой метод, метод дифференциального электрофореза в геле (DIGE), позволяет проводить анализ нескольких образцов в одном геле. Это достигается за счет использования нескольких флуоресцентных красителей для маркировки образцов белка перед 2D-GE, при этом образцы одновременно разделяются и визуализируются в одном и том же геле, а также уменьшаются технические вариации от геля к гелю.

96-мультиплексная платформа для скрининга капиллярного электрофореза для эволюции P450 BM3 на основе продукта

Все использованные химические вещества были приобретены у Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия), Roth (Карлсруэ, Германия) или Merck (Дармштадт, Германия), если не указано иное. иначе.Рестрикционный фермент Dpn I и dNTP были приобретены в New England Biolabs (Франкфурт А. М., Германия). Бессолевые олигонуклеотиды (чистота HPSF) были получены от Eurofins Genomics (Эберсберг, Германия). Глюкозодегидрогеназа (GDH) из Pseudomonas sp . был получен от Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия). ДНК-полимераза PfuS была произведена на собственном производстве. Химический 4-гидроксиизофорон был синтезирован и предоставлен InnoSyn B.V. (Geelen, Нидерланды).

Мутагенез с насыщением сайта в положениях F87 и A328 P450 BM3

Библиотеки мутагенеза с насыщением на P450. BM3 WT (скелет вектора pALXtreme-1a) в положениях F87 и A328 были созданы с использованием модифицированного протокола QuikChange для амплификации ДНК.SSM328 был создан Müller et. al . ⁵⁰ . Олигонуклеотиды со следующими последовательностями использовали в качестве прямых праймеров для положения F87 5′-CAGGAGACGGGTTANNKACAAGCTGGACGCATG-3 ‘и положения A328 5′-GCTGCGCTTATGGCCAACTNNNKCCTGCGTTTTCCCTATATG-3’ и обратных праймеров для праймеров при температуре 60 ° C для комплементарных последовательностей при температуре 60 ° C (смещение комплементарных последовательностей 60 °) 30 с) соответственно. ДНК-матрицу удаляли расщеплением 20 ед. DpnI в течение ночи и последующей очисткой с помощью набора NucleoSpin® Gel и PCR Clean-up (Macherey-Nagel, Düren, Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.Трансформацию библиотек проводили с использованием химически компетентных клеток Escherichia coli BL21-Gold (DE3) lacI ^{Q1 51} , которые высевали на чашки с агаром LB с добавлением 50 мкг мл ^-1 канамицина. Набор плазмид NucleoSpin® (Macherey-Nagel) использовали для очистки плазмид 3 мл ночных культур от единичных клонов, а секвенирование гена P450 BM3 выполняли в GATC Biotec (Констанц, Германия).

Культивирование P450 BM3 в 96-луночных планшетах с глубокими лунками

Готовили мастер-планшеты (150 мкл среды LB с 50 мкг мл ^-1 канамицина на лунку) в 96-луночных планшетах с плоским дном для микротитрования (MTP) путем инокуляции либо клеточная культура из запасов глицерина (5 мкл), либо отдельные колонии из чашек с агаром LB.Инкубацию проводили в шейкере Multitron II (Infors GmbH, Einsbach, Германия) в течение 16 ч при 37 ° C (900 об / мин, влажность воздуха 70%). Каждый мастер-планшет дополнительно содержал 3-4 повтора отрицательного (пустой вектор) и положительного контроля (P450 BM3 дикого типа). Для длительного хранения бактериальных клеток к культурам клеток добавляли глицерин в конечной концентрации 25% (об. / Об.). Полученные криогенные культуры хранили при -80 ° C. Для экспрессии белка 6 мкл криокультуры переносили в 96-луночные планшеты (круглое дно, 2.2 мл, Brand GmbH, Вертхайм, Германия), содержащий 600 мкл среды с ужасающим бульоном (TB) с добавлением 1: 1000 канамицина (50 мг / мл ^-1 ), аминолевулиновой кислоты (0,5 M), IPTG (0,1 M), тиамина ( 100 г л ⁻¹ ) и раствора микроэлементов (0,5 г л ⁻¹ CaCl ₂ × 2 H ₂ O, 0,18 г л ⁻¹ ZnSO ₄ × 7 H ₂ O , 0,1 г л ⁻¹ MnSO ₄ × H ₂ O, 20,1 г л ⁻¹ ЭДТА-Na ₂ × 2 H ₂ O, 16.7 г л ⁻¹ FeCl × 6 H ₂ O, 0,16 г л ⁻¹ CuSO ₄ × 5 H ₂ O, 0,18 г л ⁻¹ CoCl ₂ × 6 H ₂ O). Клетки культивировали в течение 20 ч при 30 ° C (900 об / мин, влажность воздуха 70%) на шейкере Multitron II MTP. Пластины для экспрессии собирали центрифугированием (3220 × g, 15 мин, 4 ° C) и клеточные осадки хранили при -20 ° C до дальнейшего использования.

Скрининг библиотек мутагенеза P450 BM3 в 96-луночном формате

Замороженные гранулы микротитровальных культур клеток размораживали (10 мин, температура окружающей среды) и 150 мкл калий-фосфатного (KPi) буфера (50 мМ, pH 7.5) добавляли на лунку. Образцы инкубировали (5 мин, температура окружающей среды), встряхивали до тех пор, пока все осадки не ресуспендировались, и добавляли 150 мкл раствора лизоцима (5 мг / мл ^-1 лизоцима в 50 мМ KPi, pH 7,5) на лунку и инкубировали 1 час при 37 °. C (900 об / мин, влажность воздуха 70%) в шейкере MTP. 250 мкл разрушенных культур клеток на лунку переносили в 96-луночные планшеты для микротитрования с V-образным дном и центрифугировали (3220 × g, 15 мин, 4 ° C). Полученные лизаты использовали для скрининговых экспериментов.

Измерения истощения НАДФН

Скрининг на повышенную скорость окисления НАДФН проводили с помощью считывающего устройства Sunrise ™ (Tecan Group Ltd., Männedorf, Швейцария), как описано Glieder and Meinhold (2003) ²⁰ . MTP (96-луночные с плоским дном) содержали 30 мкл лизата, 20 мМ субстрата, 2% (об. / Об.) ДМСО, 50 мкл НАДФН (конечная концентрация 240 мкМ) и KPi (50 мМ, pH 7,5) в общем объеме 250 мкл. Были приготовлены две идентичные установки, одна из которых содержала субстрат (альфа-изофорон), а другая служила эталоном без субстрата (ДМСО).MTP инкубировали в течение 5 минут и измеряли фоновое поглощение при 340 нм перед тем, как начать реакцию добавлением NADPH с последующим встряхиванием в течение 2 секунд. Уменьшение оптической плотности измеряли при 340 нм каждые 10 с в течение 30 циклов.

Скрининг мультиплексированного капиллярного электрофореза

Для прямого анализа профиля продукта библиотеки скринировали с помощью мультиплексного капиллярного электрофореза (MP-CE). Каждая лунка MTP содержала 40 мкл лизата, 20 мМ субстрата, 2% (об. / Об.) ДМСО, 50 мкл смеси для регенерации НАДФН (480 мкМ НАДФН, 4 ед. Мл ^-1 GDH, 60 мМ глюкозы; конечные концентрации) и KPi ( 50 мМ, pH 7.5) общим объемом 250 мкл. MTP закрывали крышкой и инкубировали (900 об / мин, влажность воздуха 70%; 18 ч при 25 ° C) в шейкере MTP. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл смеси STOP (42 мМ SDS в 15 мМ фосфате натрия (NaPi), pH 7,45) с добавлением 0,78% (об. / Об.) Бензилового спирта в качестве внутреннего стандарта. MTP встряхивали (400 об / мин, 10 мин), затем центрифугировали (3220 × g, 20 мин, 4 ° C) и 100 мкл супернатанта каждой лунки переносили в 96-луночный ПЦР-планшет с юбкой. Готовые ПЦР-планшеты закрывали липкой пленкой и хранили при 4 ° C до использования в тот же день.

Измерения капиллярного электрофореза проводили с использованием мультиплексной системы cePRO 9600 ™, работающей с программным обеспечением pK _a -Analyzer (оба поставляются Advanced Analytical Technologies, Ames, IA, USA). Все эксперименты проводились в 96-капиллярной матрице с внутренним диаметром 50 мкм, эффективной длиной капилляра 55 см (общая длина 80 см). Воздух охлаждали до 15 ° C с помощью элемента Пельтье и направляли через входное отверстие капиллярной решетки. Напряжение 4,5 кВ было приложено с анодом на входе и катодом на выходе, создавая электрическое поле 56.25 В см ⁻¹ . Образцы вводили гидродинамически, создавая вакуум -0,7 фунт / кв. Дюйм в течение десяти секунд, и УФ-детектирование образцов проводили при 214 нм. Массив промывали между прогонами (70 фунтов на квадратный дюйм, 5 мин) 0,1 М NaOH и деионизированной водой, соответственно, а затем уравновешивали буфером для электрофореза (30 мМ SDS в 15 мМ буфере NaPi, pH 7,45). Для количественной оценки калибровочные кривые стандартов были построены по площадям пиков каждого компонента.

Экспрессия и очистка вариантов P450 BM3

Экспрессию проводили во встряхиваемых колбах, содержащих 20% (об. / Об.) Среды TB, дополненной 1: 1000 (об. / Об.) Канамицином (50 мг / мл ^-1 ) и раствор микроэлементов (0.5 г л ⁻¹ CaCl ₂ × 2 H ₂ O, 0,18 г л ⁻¹ ZnSO ₄ × 7 H ₂ O, 0,1 г л ⁻¹ MnSO ₄ × H ₂ O, 20,1 г л ⁻¹ EDTA-Na ₂ × 2 H ₂ O, 16,7 г л ⁻¹ FeCl × 6 H ₂ O, 0,16 г л ⁻¹ CuSO ₄ × 5 H ₂ O, 0,18 г л ⁻¹ CoCl ₂ × 6 H ₂ O). После инокуляции 1% (об. / Об.) Ночной культуры LB _kan ( E.coli BL21-Gold (DE3) lacI ^{Q 1} клеток), клетки культивировали (37 ° C, 250 об / мин) до OD ₆₀₀ 0,8–1. Добавляли аминолевулиновую кислоту (500 мкМ, конечная концентрация) и тиамин (0,1 г л ^-1 , конечная концентрация), и экспрессию индуцировали добавлением IPTG (100 мкМ, конечная концентрация). Экспрессию продолжали при 30 ° C в течение 20 часов, и клетки собирали центрифугированием (3220 × g, 20 мин, 4 ° C).

Для экспериментов с бесклеточными лизатами клеточные осадки 30 мл культуры ресуспендировали в 3 мл 50 мМ KPi, pH 7.5, гомогенизировали обработкой ультразвуком в течение 4 минут (30 секунд включили + 30 секунд выключили, амплитуда 40%, Vibra-cell VCX-130, SONICS, Франкфурт, Германия) и центрифугировали (13000 × g, 30 минут, 4 ° C). Супернатант переносили в свежие пробирки и хранили при 4 ° C до дальнейшего использования.

Для очистки белка замороженные клеточные осадки из 200 мл культуры ресуспендировали в 15 мл 0,1 М буфера Tris / HCl (pH 7,8). Клетки гомогенизировали обработкой ультразвуком в течение 4 минут (30 секунд включения + 30 секунд отключения, 40% амплитуда, Vibra-cell VCX-130, SONICS) и затем разрушали в гомогенизаторе высокого давления Avestin EmulsiFlex-C3 (Оттава, Онтарио, Канада). путем применения трех циклов под давлением 1500 бар.После центрифугирования (16 000 × g, 30 мин, 4 ° C) супернатант фильтровали через фильтрующую мембрану 0,22 мкм. Очистку вариантов P450 BM3 проводили, как описано в другом месте, с использованием анионообменной матрицы Toyopearl DEAE 650 S (Tosoh Bioscience, Штутгарт, Германия) и хроматографической системы ÄKTAprime Plus с УФ-детектированием (GE Healthcare, München, Германия) ⁵² . Элюцию вариантов P450 BM3 инициировали с использованием солевого градиента (1 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8) и собирали фракции, содержащие фермент P450 BM3.Фракции концентрировали в пробирке для центрифугирования Amicon Ultra-4 (отсечка 50 кДа; Millipore, Schwalbach, Германия) и обессоливали с использованием гель-фильтрационной колонки PD-10 (GE Healthcare, München, Германия), уравновешенной KPi (50 мМ, pH 7,5). Для длительного хранения ферменты подвергали шоковой заморозке в жидком азоте и лиофилизировали в сублимационной сушилке (48 ч, -54 ° C, <0,01 мбар). Образцы лиофилизированного фермента хранили при -20 ° C.

Характеристика вариантов P450 BM3

Концентрации вариантов P450 BM3 определяли путем записи разностной спектроскопии CO в соответствии с протоколом Omura and Sato (1964) ⁵³ .

Конверсия субстрата с бесклеточными экстрактами скрининговых вариантов

Выходы продукта были получены после конверсии альфа-изофорона с помощью системы регенерации кофактора НАДФН на основе GDH-глюкозы. Каждый образец содержал: 1 мкМ вариант P450 BM3, 2,0 ед. Мл ^-1 GDH, 360 мМ глюкозы, 50 мМ субстрата, 2% ДМСО (об. / Об.), 500 мкМ НАДФН в 1 мл KPi (50 мМ, pH 7,5). . Реакции перемешивали во флаконах на 3,5 мл с завинчивающейся крышкой при 400 об / мин на многоточечных магнитных мешалках (Variomag или Cimarec Poly 15, Thermo Scientific, Dreieich, Германия), гасили через 22 часа 100 мкл 37% (об. / Об.) HCl и использовали далее для GC-FID анализ.

Характеристика вариантов P450 BM3 WT, F87V и A328N

Очищенные варианты охарактеризованы профилями их продуктов и определением эффективности связывания и начальной активности окисления НАДФН. Профили продуктов, включая региоселективность, выходы и общие числа оборота, были получены после преобразования альфа-изофорона с помощью системы регенерации кофактора НАДФН на основе GDH-глюкозы. Каждый образец содержал: 1 мкМ вариант P450 BM3, 3 ед. Мл ^-1 GDH, 240 мМ глюкозы, 20 мМ субстрата, 2% ДМСО (об. / Об.), 500 мкМ НАДФН в 1 мл KPi (50 мМ, pH 7.5). Реакции останавливали через 22 часа перемешивания (400 об / мин, Variomag или Cimarec Poly 15, Thermo Scientific, Dreieich, Германия) со 100 мкл 37% (об. / Об.) HCl. Эффективность связывания определяли после полного истощения НАДФН с использованием 2 мкМ P450 BM3, 10 мМ субстрата, 2% ДМСО (об. / Об.) И 1 мМ НАДФН в 1 мл KPi (50 мМ, pH 7,5), инкубированных при 30 ° C. Затем образцы из экспериментов по преобразованию и определения эффективности связывания анализировали с помощью GC-FID. Концентрации P450 BM3: 1 мкМ WT, 1 мкМ F87V, 0,2 мкМ A328N использовали для определения активности окисления НАДФН при 30 ° C.Реакции содержали 10 мМ субстрата, 2% ДМСО (об. / Об.) В KPi (50 мМ; pH 7,5) в конечном объеме 1 мл с использованием полумикрокювет. После 3 мин инкубации добавляли 0,5 мМ НАДФН и проводили окисление кофактора при 340 нм в спектрофотометре (Varian Cary 50 UV, Agilent, Ratingen, Германия). Скорости были рассчитаны с использованием коэффициента экстинкции 6 220 м ^–1 см ^–1 для НАДФН.

Анализ продукта с помощью газовой хроматографии

Образцы, полученные в результате определения конверсии субстрата и эффективности связывания, анализировали и количественно оценивали с помощью газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором (GC-FID).Экстракцию проводили этилацетатом (1: 1) в качестве растворителя с добавлением 2,6 мкл бензилового спирта ^-1 в качестве внутреннего стандарта, полученную смесь переносили в 2 мл пробирки с безопасным замком и встряхивали (максимальное усилие 60-70%, 20%). мин; Vortex Genie 2, Scientific Industries, Богемия, Нью-Йорк, США). После центрифугирования (11000 × g, 5 мин) верхнюю органическую фазу переносили в новые пробирки объемом 2 мл, содержащие 50 мг безводного сульфата натрия, для сушки. Образцы встряхивали (максимальная сила 60–70%, 5 мин), центрифугировали (11 000 × g, 5 мин), и высушенную органическую фазу использовали для измерений GC-FID.100 мкл каждого образца помещали в 1,5 мл стеклянные флаконы с завинчивающимся горлышком, снабженные стеклянными впускными отверстиями на 250 мкл. Анализ проводился на газовом хроматографе GC-2010 с автоматическим пробоотборником, управляемым программным обеспечением GCsolution версии 2.3 (Shimadzu Corp., Киото, Япония). Усеченная 30 см колонка Optima ^® 17-MS от Macherey-Nagel (Düren, Германия) служила для разделения и использовались следующие параметры: объем впрыска: 1 мкл, температура впрыска: 300 ° C, режим впрыска: разделение, контроль потока режим: линейная скорость, давление: 114.9 кПа, общий поток: 58,6 мл мин. ^-1 , поток колонки: 2,65 мл мин. ^-1 , линейная скорость: 69,1 см с ^-1 , продувочный поток: 3,0 мл с ^-1 , разделенное соотношение: 20, температурный градиент: 100 ° C, 5 ° C мин. ^-1 до 175 ° C, 20 ° C мин. ^-1 до 250 ° C, температура обнаружения: 300 ° C, частота дискретизации: 40 мсек, H ₂ поток: 40 мл мин. ⁻¹ , подпиточный газ N ₂ / воздух: мин. 30 мл ⁻¹ /400 мл мин. ⁻¹ . Концентрации производных изофорона рассчитывали по соответствующим калибровочным кривым стандартов.

Настройка и запуск гелей SDS

Настройка и запуск гелей SDS

Электрофорез в полиакриламидном геле SDS

CHP — обновлено: 29 октября 1998 г.

1. Установите гелевые пластины.

Квадратная задняя пластина l-15 см X w-16 см и 1 пластина с надрезом.

проставки 0,75 мм: 2 более коротких проставки длиной ~ 14 см и 1 длиннее
распорка ~ 18 см длиной.

Поместите две короткие распорки по бокам и длинную распорку вдоль
дно одной стеклянной тарелки.

(Эти распорки были вырезаны для большего куска стекла, поэтому убедитесь, что
плоский (необрезанный) конец совмещается с другой проставкой.

• Зажмите с помощью 1- или 2-дюймовых зажимов.

Используйте два зажима внизу (на прокладке, а не на геле
площадь)

Используйте один из 2-дюймовых зажимов или два из 1-дюймовых зажимов на каждом
боковая сторона; убедитесь, что соединение нижней и боковой прокладок зажато.

2. Закройте гель 2% агаром (бактоагар не дорого).
агароза).

Растопить в микроволновой печи 1 мин. на средней (или до плавления).

Капните агар (с помощью пипетки Пастера) по швам двух
стеклянные тарелки (кроме верхних).

Скорее всего протекает «стык» боковой и нижней распорки;
его нужно хорошо запечатать.

• Оставьте одну сторону на несколько секунд. затвердеть; заклейте другую сторону, пусть
он затвердевает на несколько секунд.

• Закройте дно, добавив дополнительную каплю агара на дно сбоку.
проставочный интерфейс. Запечатанный гель можно перевернуть вверх ногами в
белые стойки.

3. Смешайте нижний или разделяющий гель; посмотреть рецепты (обратите внимание, что они
сделать ровно два нижних геля).

• Смешайте буфер, воду и акриламид (лучше всего
worlds, дегазировать, поскольку акриламидная полимераза ингибируется O2).

• Добавьте 10% персульфат аммония (APS) [содержится в
эксикатор в тренажерном зале] (изготовлен в течение одной недели) и ТЕМЕД.
Водоворот.

• Залейте так, чтобы уровень был примерно на 1 см ниже гребня. Используйте 10 мл
пипетка.

Старайтесь не задерживать пузырьки.

• Колба-подставка, содержащая избыток раствора геля под углом; это
помогает определить, когда гель полимеризовался.

4. Осторожно смазать верх водой или н-бутанолом.

Полимеризация акриламида ингибируется O2; это наслоение
обеспечивает плоский интерфейс.

• Полимеризация должна произойти в течение 30 мин.

Это можно наблюдать по «загустеванию» гелевого раствора в
колбу или когда наблюдается четкая линия между водой и нижним
гель.

5. Подготовьтесь к заливке верхнего геля / укладывающего геля.

• Слить слой воды: протереть пространство между стеклом.
тарелки с фильтровальной бумагой.

Постарайтесь не трогать гель.

6. Смешайте гель для верха / укладки.

• Смешайте воду, буфер и акриламид, затем добавьте 10% APS и
ТЕМЕД, водоворот.

• Либо поместите гребешок, затем накачайте гель и медленно влейте гель.
чтобы избежать захвата пузырьков. (Выбор Кэмми),

• Или залейте гель для укладки и положите в гребешок.

• Закрепите колбу под углом, чтобы помочь определить, когда гель
полимеризованный

• Полимеризация должна произойти за 30 мин,

Ищите четкую линию вокруг колодцев.

7. Настройка геля

• Снимите зажимы.

• Выньте нижнюю прокладку, достаньте столько агара, сколько вы
может, так как это может вызвать проблемы с захваченными пузырьками.

• Прежде чем вынимать гребень, вы можете пометить
хорошие позиции.

• Выньте гребень, осторожно потянув его наружу. Чтобы выйти
любой неполимеризованный акриламид, промойте лунки проточным буфером, используя
шприц с иглой 38 калибра.

• Прикрепите гель к коробкам с гелем с помощью больших зажимов.

На «ушках» стеклянных пластин, чтобы он был плотно прижат к
прокладки.

8. Залейте рабочий буфер.

• Для удаления пузырьков из нижней части между стеклами.
пластин используйте шприц на 10 мл с изогнутой иглой 16 или 18.Наполнять
шприц с буфером, протолкните дно геля острием
иглы между пластинами при выталкивании буфера. Это будет
«прогнать» пузыри.

Эти пузырьки мешают прохождению электрического тока

Некоторым удается заполнить нижний резервуар и
нанесение геля под углом, чтобы уменьшить количество захваченного
пузыри.

9. Загрузочные гели

• Мы используем шприц Hamilton на 100 или 50 мкл, хорошо промывая
между образцами (6х в нижнем резервуаре).20 гребней
между 30-50 мкл, зависит от того, насколько глубоко вы их вставите. Советы по загрузке геля
может быть использован.

• Вставьте острие иглы около дна лунки,
медленно загружайте образец, вытягивая иглу.

10. Гели для бега

• Присоедините выводы: белок, покрытый SDS (отрицательно заряженный).
перейдет к положительному красному проводу

— красный снизу черный сверху.

11. Настройки

• Гели SDS работают при 20 мА / гель (эти гели 15×16 см)

• Тепло, выделяемое комбинацией тока и
напряжение меньше при штабелировании; если ваш белок чувствителен к
это, используйте эти настройки.Мы используем это с хвостовиком, он уменьшается
тепловое разворачивание N -конца в присутствии SDS,
уменьшение полосы ниже родного хвостовика. (Вид Бао-Лу)

• Для других приложений можно использовать всего 150 вольт, но не
зависит от количества гелей (сила тока изменится соответствующим образом).

12. Доведите до тех пор, пока краска не отойдет.

13. Пятно — метод King Lab (от Myoung Hee Yu).

30 мин в морилке # 2:

10% изопропанол

10% уксусная кислота

0.003% Кумасси Синий

1 час или дольше в пятне № 3:

10% уксусная кислота

0,003% Кумасси синий

Дестейн при необходимости:

10% уксусная кислота

1 кимвип для впитывания пятен

Высокопроизводительный генетический анализ с использованием микропланшетов для электрофореза с капиллярной матрицей на 96 образцов

Реферат

Микропланшеты для капиллярного матричного электрофореза (CAE), которые могут анализировать 96 образцов менее чем за 8 минут, были изготовлены путем соединения микромашинных стеклянных пластин диаметром 10 см с образованием стеклянной многослойной структуры.Микропланшет имеет 96 лунок для образцов и 48 каналов разделения с блоком ввода, который позволяет проводить последовательный анализ двух различных образцов на каждом капилляре. Лист эластомера с набором отверстий 8 на 12 помещается поверх стеклянной многослойной структуры для определения лунок для образцов. К образцам обращаются с помощью электродной решетки, которая составляет третий слой сборки. Обнаружение всех дорожек с высоким временным разрешением было достигнуто с помощью конфокального флуоресцентного сканера с лазерным возбуждением.Чтобы продемонстрировать функциональность этих микропланшетов, были выполнены электрофоретическое разделение и флуоресцентное обнаружение маркера рестрикционных фрагментов для диагностики наследственного гемохроматоза. Микропланшеты CAE облегчат проведение всех типов высокопроизводительного генетического анализа, поскольку их высокая скорость анализа обеспечивает производительность в 50-100 раз больше, чем у обычных гелей для пластин.

Чтобы облегчить завершение проекта «Геном человека» и использовать богатство производимой им генетической информации, необходимо будет значительно увеличить скорость, пропускную способность и рентабельность анализа ДНК.В течение многих лет пластинчатые гелевые системы использовались в качестве рабочей лошадки для картирования генов, секвенирования ДНК и диагностики заболеваний. В последнее время такие достижения, как тонкие пластинчатые гели (1), капиллярный электрофорез (CE) (2–5) и электрофорез капиллярной матрицы (CAE) (6–12), значительно повысили эффективность гель-электрофореза. Однако для удовлетворения растущего спроса на увеличенную скорость и пропускную способность образцов необходимы более революционные подходы.

Применение технологий микротехнологии для разработки устройств для электрофоретического анализа может на порядки повысить производительность анализа ДНК.Микросхемы CE были разработаны в 1992 г. (13) и использовались для разделения флуоресцентных красителей (14, 15) и флуоресцентно меченых аминокислот (15-17). Совсем недавно было показано, что рестрикционные фрагменты ДНК (18–20), продукты ПЦР (18), короткие олигонуклеотиды (21) и даже фрагменты секвенирования ДНК (22) могут быть быстро и эффективно разделены с помощью чипов CE. Кроме того, были разработаны интегрированные микроустройства, которые могут выполнять ПЦР-амплификацию сразу с последующим определением размера ампликона (23), рестрикционным расщеплением ДНК и последующим разделением по размеру (19), а также сортировкой и лизисом мембран выбранных клеток (24).Расширение этих индивидуальных устройств анализа до формата массива высокой плотности поможет удовлетворить потребности проекта «Геном человека».

Разработка микропланшета для электрофореза с капиллярной решеткой высокой плотности представляет собой уникальные и сложные задачи. Конструкция и компоновка должны позволять анализ большого количества (≥96) образцов на небольшом устройстве, обеспечивать легкую загрузку без загрязнения, обеспечивать легкую электрическую адресацию и обеспечивать высокое качество разделения и обнаружения. Мы представляем здесь разработку сборки микропланшетов CAE, состоящей из склеенного сэндвича из микрообработанного стекла, эластомерного верхнего слоя и массива электродов, который выполняет эти задачи.Обнаружение обеспечивается гальвосканером конфокальной флуоресценции. Мы используем обнаружение вариантов HFE , гена, вариация которого коррелирует с наследственным гемохроматозом (HHC) (25), чтобы проиллюстрировать полезность микропланшетов CAE для популяционного скрининга генетических заболеваний. HHC — это генетическое заболевание, идеально подходящее для крупномасштабного популяционного скрининга, поскольку оно идентифицируется с помощью простого рестрикционного анализа на основе ПЦР и поддается лечению, если обнаружено на ранней стадии прогрессирования заболевания.Эта работа демонстрирует полезность высокопроизводительных микропланшетов CAE для генотипирования и дополнительно демонстрирует возможности микротехнологии в производстве устройств для мультиплексного анализа ДНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Микрофабрикация.

Пластины из стекла Borofloat (Schott, Yonkers, NY) были предварительно протравлены в 49% HF в течение 15 секунд и очищены перед осаждением временного слоя аморфного кремния (1500 Å) в системе химического осаждения из паровой фазы (PECVD) (PEII- A, Technics West, Сан-Хосе, Калифорния).Пластины загрунтовали гексаметилдисилазаном, покрыли центрифугированием фоторезистом (Shipley 1818, Мальборо, Массачусетс) при 5000 об / мин, а затем подвергали мягкому обжигу при 90 ° C в течение 30 минут. Рисунок маски переносили на подложку, подвергая фоторезист УФ-излучению в выравнивателе контактных масок Quintel. Фоторезист проявляли в смеси 1: 1 концентрата проявителя Microposit (Shipley) и H ₂ O. Рисунок маски был перенесен на аморфный кремний с помощью плазменного травления CF ₄ , выполненного в реакторе PECVD.Пластины травились в 49% HF в течение 3 минут со скоростью травления 7 мкм / мин, что дало конечную глубину травления 21 мкм и ширину канала ≈60 мкм на склеиваемой поверхности. Фоторезист был удален, а оставшийся аморфный кремний был удален с помощью плазменного травления CF ₄ . В протравленной пластине просверливали отверстия алмазным сверлом диаметром 1,25 мм (Crystalite, Вестервилль, Огайо). Протравленная и просверленная пластина была термически прикреплена к плоской пластине аналогичного размера в программируемой вакуумной печи (Centurion VPM, J.М. Ней, Юкайпа, Калифорния). Высокое качество склеивания обычно достигается по всей подложке. После склеивания поверхности каналов были покрыты с использованием модифицированной версии протокола покрытия Hjerten (26, 27). Более подробное обсуждение методов микротехнологии представлено в другом месте (28).

Рис. 1 Верхний представляет дизайн маски, используемый для изготовления микропланшетов CAE. Нижние изображения представляют собой микрофотографии, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, которые демонстрируют качество травления по всему массиву.Сорок восемь отдельных разделительных каналов были вытравлены в периодической решетке 150 мкм в области обнаружения (A). Каналы разветвляются на ряд резервуаров для образцов размером 8 на 12, которые расположены на расстоянии 9 мм друг от друга, чтобы облегчить загрузку с помощью пипетки с восемью наконечниками. Каналы разделения простираются на 10 см от области инжекции до анода и примерно на 1,75 см от области инжекции до катода. Два резервуара для нагнетания (B и C) соединены с каждым разделительным каналом, что позволяет производить последовательную закачку двух проб.Чтобы уменьшить количество отверстий для доступа, необходимых для этой конструкции, резервуары для отходов закачки (D) сгруппированы таким образом, что для четырех резервуаров для закачки требуется только один. Катодные резервуары (E) также подключены к нескольким (6 или 12) капиллярам. Компоновка была разработана таким образом, чтобы расстояние от анода до катода было одинаковым для всех разделительных каналов. Анод (F) размещен не по центру, чтобы избежать конфликта со сканирующим объективом. Количество отверстий резервуара для этого шаблона составляет N + 7, где N — количество образцов, поэтому для анализа 96 образцов требуется 127 отверстий.Это количество отверстий близко к теоретическому минимуму ( N + 3), полученному путем группирования всех резервуаров для анодных, катодных и закачиваемых отходов.

Рисунок 1

( Верхний ) Шаблон маски для микропланшета для капиллярного электрофореза с 96 образцами. A — область обнаружения, B и C — резервуары для нагнетания, D — резервуары для отходов, E — катодные резервуары, а F — анод. Диаметр кружка указывает на размер подложки 10 см. ( Нижний ) Микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа на Left , показывает все 48 каналов, расположенных на расстоянии 150 мкм друг от друга с шагом 200 мкм через каждые 12 каналов.Микрофотография, сделанная с помощью сканирующего электронного микроскопа Right , представляет собой крупный план части массива, показывающий протравленные каналы глубиной 21 мкм.

Метод впрыска.

Рис. 2 A представляет собой конструкцию инжектора для образцов, который содержит четыре резервуара для образцов, два канала разделения и один резервуар для отходов закачки. Метод инъекции показан на рис. 2 B – E с использованием флуоресцеина. На рис. 2 B между резервуаром 1 для пробы и отходами нагнетания прикладывается напряжение инжекции (300 В) для забора пробы в межканальную область.Во время инжекции напряжение смещения (250 В) используется для уменьшения уширения свечи инжекции из-за диффузии в катодный и анодный каналы. На рис. 2 C между катодом и анодом прикладывается разделительное напряжение (3700 В), а образец 1 и резервуары для отходов нагнетания имеют обратное смещение (720 В), чтобы удалить избыток пробы из поперечного канала впрыска. Вводится пробка для образца длиной 100 мкм, и любой остаточный образец удаляется из области ввода, чтобы избежать образования хвостов.На рис. 2 D и E представлены аналогичные инъекции образца 2. Этот метод инъекции успешно использовался для введения до четырех образцов в один капилляр без признаков перекрестного загрязнения (28).

Рисунок 2

( A ) Схема инжектора пробы. Инжектор для образцов включает четыре резервуара для образцов, две разделительные колонны и один общий резервуар для отходов, обозначенный как на рис. 1. ( B – E ) Флуоресцентные изображения, иллюстрирующие работу инжектора с флуоресцеином.

Подготовка проб.

Образцы получали с использованием ПЦР-амплификации и расщепления для анализа мутации C282Y в гене HFE . Эта мутация G → A в нуклеотиде 845 создает сайт рестрикции Rsa I в гене HFE (29). ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови стандартными методами (30). Сегмент экзона HFE , содержащий вариантный сайт, амплифицировали со следующими праймерами: HH-E4B, 5′-GACCTCTTCAGTGACCACTC-3 ‘; HC282R, 5’-CTCAGGCACTCCTCTCAACC-3 ‘.Праймер HC282R следует за Feder et al. (25), тогда как праймер HH-E4B является нашей собственной разработкой и содержит 5′-биотиновую метку. Реакционная смесь амплификации объемом 25 мкл содержала 10 мМ Tris⋅HCl (pH = 8,8), 50 мМ KCl, 0,75 мМ MgCl ₂ , 0,2 мМ dNTP, 7,5 пмоль каждого праймера и 1,5 единицы ДНК-полимеразы AmpliTaq (Perkin– Элмер). ПЦР проводили в трех последовательных условиях: 5 циклов: 95 ° C в течение 1 минуты, 64 ° C в течение 1 минуты и 72 ° C в течение 1 минуты; 5 циклов 95 ° C в течение 1 минуты, 60 ° C в течение 1 минуты и 72 ° C в течение 1 минуты; и 25 циклов 95 ° C в течение 1 минуты, 56 ° C в течение 1 минуты и 72 ° C в течение 1 минуты.Рестрикционное расщепление амплифицированного продукта проводили путем добавления 4 мкл каждого амплифицированного образца к 6 мкл буфера, содержащего 2 единицы Rsa I (Sigma), и переваривания в течение 90 мин при 37 ° C. Образцы диализовали против деионизированного H ₂ O на диализной пластине для 96 образцов (Millipore). Типы образцов первоначально были установлены путем разделения рестрикционных фрагментов на геле 1% агарозы / 3% SeaPlaque (FMC Bioproducts) в 0,5 × TBE (1 × TBE = 9 мМ Трис / 64,6 мМ борная кислота / 2,5 мМ EDTA, pH 8.3). Гели окрашивали в 0,5 мкг / мл бромистого этидия в течение 30 мин и визуализировали на УФ-трансиллюминаторе (Spectroline, модель TR-302) вместе с лестницей из 123 п.о. (Life Technologies, Gaithersburg, MD) для определения размеров фрагментов.

Электрофоретические методы.

В предыдущих экспериментах с чипами CE (13–15, 18) и чипами CAE (20) использовались пластиковые наконечники пипеток, вставленные в отверстия для образцов, или трубки, приклеенные к субстрату, для формирования резервуаров вместе с ручным электрическим контактом.Однако со 127 скважинами и коллекторами эти подходы нецелесообразны. Для упрощения работы с образцом и введения электродов, а также для увеличения объема буфера в катодном и анодном резервуарах были разработаны резервуарный массив из эластомера (Sylgard 184; Dow Corning) и электродный массив (рис. 3). Массив эластомерных резервуаров помещали на пластину перед заполнением каналов разделяющей средой, 0,75% (масс. / Об.) Гидроксиэтилцеллюлозы (HEC) в буфере 1 × TBE с 1 мкМ бромистого этидия.Бромид этидия был использован для флуоресцентной метки ДНК, потому что он лучше подходит для доступного возбуждения 532 нм, чем другие красители и метки, которые мы разработали для возбуждения 488 нм (31). Лист эластомера толщиной 1 мм обеспечивает водонепроницаемость при контакте со стеклом и полностью изолирует резервуары друг от друга. Капилляры заполнялись под давлением ситовой матрицей от анода до тех пор, пока не были заполнены все каналы. Резервуары анода и катода были заполнены буфером 10 × TBE для уменьшения ионного истощения во время электрофореза.Резервуары для образцов промывали деионизированной водой, а затем образцы (3,5 мкл) загружали из микротитрационного планшета с помощью пипетки с восемью наконечниками. Массив электродов был изготовлен путем пропускания массива платиновых проводов через печатную плату. Каждый провод соответствовал резервуару на пластине, а провода соединялись металлическими полосками на печатной плате. Печатная плата была размещена на массиве эластомеров и использовалась для обращения к отдельным резервуарам и уменьшения испарения. Массив электродов был подключен к четырем источникам питания с компьютерным управлением (Stanford Research Systems, серия PS300, Саннивейл, Калифорния), и компьютерная программа, написанная в LabVIEW (National Instruments, Остин, Техас), использовалась для автоматического измерения времени и переключения соответствующих напряжений. .

Рисунок 3

Схема сборки резервуара эластомера и узла загрузки электродной матрицы. Массив загрузки эластомера помещается наверху микропланшета так, чтобы отверстия в эластомере совпадали с просверленными отверстиями в микропланшете CAE. Затем электродную решетку помещают поверх эластомера для работы с резервуарами.

Приборы.

Микропланшет CAE исследовали с помощью гальвосканера (рис. 4), оснащенного двойным лазером на Nd: YAG (иттрий / алюминиевый гранат) (Uniphase, San Jose, CA).Луч 30 мВт 532 нм фокусировался в пятно размером 5 мкм и сканировался по каналам с частотой 40 Гц. Луч фокусировался с помощью сканирующей линзовой системы с числовой апертурой 0.33, предназначенной для количественного анализа поля (32). Система обнаружения состояла из эмиссионного фильтра (545–620 нм), за которым следовало точечное отверстие 400 мкм, и продемонстрировала предел обнаружения флуоресценции 1 молекула красителя Cy3 на 100 мкм ² . Данные, соответствующие пространственно различному флуоресцентному излучению, были получены на частоте 77 кГц с помощью 16-битного аналого-цифрового преобразователя (Burr – Brown, Tucson, AZ).Было использовано логарифмическое сжатие данных, что дало 5 линейных порядков динамического диапазона измерений. Данные были получены в виде 16-битного изображения TIFF, а электрофореграммы были созданы в IPLab (Signal Analytics, Вена, Вирджиния) путем суммирования точек данных по каждому каналу.

Рисунок 4

Схема гальвосканера с лазерным возбуждением и микропланшета CAE. ФЭУ, фотоэлектронный умножитель.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Маркер рестрикционного фрагмента для HHC, полученный из гена HFE , был выбран для демонстрации высокопроизводительного анализа биологически релевантных образцов с помощью микропланшетов CAE.HHC — это генетическое заболевание, которое вызывает накопление железа в тканях, что со временем приводит к заболеванию, в первую очередь поражающему печень (33). От 0,1% до 0,5% населения европеоидной расы гомозиготны по варианту HFE C282Y (34). Если это состояние обнаружено на ранней стадии, можно начать лечение и избежать долгосрочных последствий; поэтому необходимы высокопроизводительные методы скрининга.

На рис. 5 представлено изображение разделения 96 HFE ампликонов на CAE-микропланшете. 96 проб были разделены на две серии по 48 проб, что соответствует двум нагнетательным коллекторам на канал.Ширина представленного электрофоретического изображения составляет 7,4 мм для 48 дорожек, а полный анализ 96 образцов был выполнен менее чем за 8 мин. Увеличенные изображения показывают, что полосы имеют высокую интенсивность и разрешение. В этом эксперименте 19 различных образцов были распределены по 96 лункам, что обеспечило 5-кратную избыточность анализа образцов. Нормальный аллель (845G) имеет два фрагмента, один на 167 пар оснований и один на 140 пар оснований; вариант (845A) показывает три полосы на 167, 111 и 29 п.н. Типы гетерозигот содержат все четыре фрагмента.После учета изменения времени миграции по изображению, вызванного асимметричным размещением резервуара анода, время миграции, как было установлено, согласовано от полосы к полосе с диапазоном 199–204 с (SD = 0,65%, 48 измерений). для первого впрыска и 205–215 с (SD = 0,98%, 48 измерений) для второго впрыска. Время миграции для второй закачки медленнее и менее согласовано из-за истощения запасов ионов в резервуарах. Изменение времени миграции сравнимо с таковым в других чипах CAE (20) и обычных капиллярных решетках (6–12).Общее время анализа для двух разделений составляло 7,6 мин, что соответствует времени анализа менее 5 секунд на образец.

Рисунок 5

( A ) Изображение 96 Rsa I-переваренных ампликонов HFE, проанализированных в двух последовательных разделениях на 48 образцов. ( B и C ) Расширенные виды разделительного изображения от первой и второй инъекции, соответственно. Общее время для двух разделений было менее 7,6 мин. Образцы разделяли на 0,75% (вес / объем) гидроксиэтилцеллюлозы в буфере 1 × TBE с 1 мкМ бромистого этидия в рабочем буфере.Длина каналов от инжекции до области детектирования составляла 10 см. Инъекция выполнялась, как описано в тексте, а применяемые поля для инъекции и разделения составляли 300 В / см.

Изображение на рис. 5 показывает, что есть вариации во времени миграции, когда правые полосы движутся на ≈20 секунд медленнее, чем левые. Это вызвано градиентом напряжения электрофореза в результате размещения анода сбоку от области обнаружения.Такое размещение анода было необходимо для обеспечения достаточного расстояния от объектива; это искажение может быть легко устранено в системе второго поколения сканированием снизу или соответствующей регулировкой длины капилляров.

На рис. 6 представлены 96 электрофореграмм, полученных из изображения на рис. 5. Все электрофореграммы были сдвинуты, чтобы выровнять дублет из 167 пар оснований для сравнения разделений. Фрагмент длиной 167 п.н. выглядит как дублет из-за частичного биотинилирования праймера HH-E4B; биотинилированная форма составляет более крупный фрагмент в дублете.‖ Хотя биотинилированный материал можно было бы очистить с помощью стандартных процедур, мы обнаружили, что дублет из 167 п.н. обеспечивает полезный ориентир для выравнивания электрофореграммы. Среднее расстояние между полосами 111 и 140 п.н. составляет 7,3 с при стандартном отклонении 0,8 и 0,6 с соответственно для первой инъекции и 6,6 с при стандартном отклонении 1,1 и 0,5 с, соответственно, для второй инъекции. По тесту Стьюдента t типизация для обеих инъекций определена как> 99.Уровень достоверности 9%. Все 96 образцов были типизированы точно, и их можно было легко генотипировать либо по электрофореграмме, либо по изображению.

Рисунок 6

Электрофореграммы, полученные из изображения 96 разделений HFE , представленных на рис. 5. Электрофореграммы были сдвинуты до 10%, чтобы выровнять постоянный дублетный пик на 167 п.н. Три генотипа характеризуются ( i ) одиночным пиком на 140 п.н., соответствующим типу 845G, ( ii ) одиночным пиком на 111 п.н., соответствующим типу 845A, и ( iii ) гетерозиготным типом, который имеет пики как 140 п.н., так и 111 п.н.Поскольку интенсивность маркировки интеркаляционным красителем пропорциональна размеру фрагмента ДНК, фрагмент длиной 29 п.н. не наблюдается на этих дисплеях.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мы разработали, изготовили и эксплуатировали микропланшеты CAE, которые могут быстро анализировать 96 образцов на одном устройстве. Эта работа показывает, что методы микротехнологии могут быть использованы для создания массивов капилляров высокой плотности на всей 10-сантиметровой пластине без значительных дефектов. Резервуары для отходов катода, анода и закачки объединены, чтобы уменьшить количество отверстий до ≈ N .В шаблоне массива резервуары для образцов размещаются по центрам 9 мм в одном измерении, чтобы облегчить параллельную загрузку нескольких образцов. Мы также продемонстрировали обнаружение гальванометрическим сканированием, которое обеспечивает частоту дискретизации> 10 Гц с достаточным отношением сигнал / шум для высокочувствительного анализа ДНК. С помощью этих CAE-микропланшетов анализ 96 образцов продуктов ПЦР или двухцепочечных фрагментов ДНК может быть выполнен менее чем за 8 минут (<5 секунд на образец). Это в 50–100 раз больше по сравнению с обычными автоматическими гелевыми системами для пластин, где для заливки геля, загрузки и прогона 24–48 образцов требуется несколько часов.Высокая производительность этих микропланшетов CAE будет способствовать быстрому и недорогому скринингу двухцепочечных рестрикционных фрагментов на предмет генетических заболеваний, таких как HHC. CAE-микропланшеты также будут полезны для анализа одноцепочечных коротких тандемных повторов в денатурирующих условиях в соответствии с методами, недавно разработанными Ван и его коллегами для судебно-медицинской идентификации и диагностики рака (35, 36).

Несколько простых модификаций дизайна могут способствовать дальнейшему расширению применения микропланшетов CAE для генетического анализа.Хотя время разделения невелико, загрузка пробы вручную остается трудоемкой задачей. В настоящее время мы работаем над методами автоматизации заполнения каналов и загрузки образцов. Последовательные инъекции — эффективный метод увеличения пропускной способности пробы при ограниченном количестве капилляров. Возможен ввод четырех образцов на канал, и его можно использовать для анализа 192 образцов на планшет. В качестве альтернативы изготовление 96 отдельных капилляров на микропланшете CAE увеличит производительность в 2 раза и гарантирует отсутствие загрязнения образцов.Система обнаружения при сканировании может быть улучшена путем переворота объектива и сканирования снизу. Размещение оптики под пластиной позволит легко манипулировать и вводить образцы. Перевернутое сканирование также позволило бы избежать пространственного конфликта с резервуаром анода, позволяя размещать анод по центру. С помощью этих вариаций легко представить себе микропланшеты в широком диапазоне форматов, которые могут обеспечить разделение с более высоким разрешением, более быстрое разделение или разделение большего количества образцов.

По мере увеличения производительности микропланшетов, таких как CAE-микропланшеты с высокой плотностью и матрицы олигонуклеотидов (37), удобная и недорогая подготовка образцов становится все более важной и серьезной проблемой. Интеграция массива из 96 ПЦР-камер с 96 капиллярами на чипе в соответствии с концепциями дизайна, которые мы представили ранее (23), повысила бы полезность микропланшетов CAE, исключив отслеживание образцов и этапы ручного переноса. Эта интеграция также должна привести к уменьшению объемов проб для амплификации, что снизит затраты на анализ.Интеграция электронных нагревателей, термопар и систем обнаружения вместе с массивом микрожидкостных капилляров в одном устройстве еще больше повысит возможности и простоту эксплуатации этих ДНК-микропроцессоров.

Благодарности

Мы благодарим Боба Лодера и Тома Армстронга за помощь с компьютерным программным обеспечением и оптикой, а также доктора Дэвида М. Бэра из больницы Kaiser Permanente в Окленде, Калифорния, за предоставление образцов пациентов для тестирования HHC. Работа по генотипированию HFE была частично поддержана грантом Исследовательского института Фонда Кайзера Дэвиду М.Баер и Г.Ф.С. Изготовление микропланшетов CAE было выполнено в лаборатории микротехнологии Калифорнийского университета в Беркли. Это исследование было частично поддержано директором отдела энергетических исследований Управления здравоохранения и экологических исследований Министерства энергетики США по контракту DEFG-91ER61125 и Национальными институтами здравоохранения в рамках гранта HG01399, предоставленного R.A.M. Работа в Molecular Dynamics была поддержана грантом R01 HG01775-01 Национального института здравоохранения и грантом 70 NANB5h2031 Национального института стандартов и технологий.

Сноски

• ↵§ Кому запросы на перепечатку следует направлять по адресу: Department of Chemistry, 312 Hildebrand Hall, University of California, Berkeley, CA 94720. Электронная почта: rich {at} zinc.cchem.berkeley.edu.

• ↵¶ Считается, что острые пики в начале электрофореграммы второй инъекции вызваны ложными продуктами амплификации, связанными с генотипами A / A и A / G. Количество ложной амплификации эквивалентно аналогичным типам ДНК при первой и второй инъекции.Пики из-за ложного усиления более резкие при второй инжекции из-за повышенных эффектов суммирования из-за электромиграции 10 × TBE от катода к инжектору.

• ↵‖ Два пика при ≈167 п.н. также наблюдались в анализах полиакриламидного пластинчатого геля. Биотинилированная форма праймера составляет более крупный фрагмент в дублете. Это было показано амплификацией с небиотинилированным праймером E4B, которая дала единственную полосу, соответствующую меньшему фрагменту из двух полос в дублете; кроме того, адсорбция биотинилированного продукта ПЦР E4B на иммобилизованном авидине удаляла большую полосу (данные не показаны).

СОКРАЩЕНИЯ

CE,

капиллярный электрофорез;

CAE,

капиллярный решетчатый электрофорез;

HHC,

наследственный гемохроматоз

• Получено 15 ноября 1997 года.
• Принято 23 декабря 1997 года.

  Электрофорез с ацетатом целлюлозы — это тип зонного электрофореза, при котором молекулы в жидкой форме, такие как белки, разделяются на мембране или полоске из ацетата целлюлозы.Электрофорез с ацетатом целлюлозы, разработанный немецким химиком Иоахимом Коном (1912–1987) в 1957 году, был второй формой зонного электрофореза после электрофореза на фильтровальной бумаге. Это также был один из первых электрофоретических методов, принятых в клинических лабораториях для рутинной диагностики, который используется до сих пор (Rocco, 2005). При электрофорезе с ацетатом целлюлозы мембрана или полоска из ацетата целлюлозы используются в качестве поддерживающей матрицы для разделения компоненты в образце. Как и в случае обычного зонного электрофореза, электрофоретическое разделение происходит в гомогенной буферной системе.Матрицу-носитель или среду погружают в рабочий буфер для электрофореза , поддерживаемый при определенном значении pH, и проводят электрофоретическое разделение в течение определенного времени (Westermeier, et al., , 2005).

  Он может обеспечить эффект молекулярного сита на электрофоретическое разделение образца в зависимости от размера пор между молекулами матрицы-носителя. Он также может уменьшить конвекционные токи, возникающие из-за чрезмерного тепла, возникающего во время электрофореза.Когда разделение завершено, компоненты образца выделяются на отдельные полосы или зоны . Каждая полоса представляет компоненты в образцах, которые обладают схожими или идентичными характеристиками (Jorgenson, 1986; Walker, 2010). Рисунок 1: Схематическое изображение установки электрофореза ацетата целлюлозы В случае электрофореза ацетата целлюлозы мембраны в виде листов или полосок, изготовленных из ацетата целлюлозы, насыщаются рабочим буфером.Каждый конец насыщенных буфером полосок перекрывается фитилем из фильтровальной бумаги, который проникает в буфер в резервуаре для электрофореза (рис. 1). Представляющие интерес образцы нанесены на поверхность примерно на половину или одну треть длины мембраны из ацетата целлюлозы (Kohn, 1969; Walker, 2010). Разделение начинается, когда электрический ток подается на каждый конец полосы, которая действует как анод , и катод . В конце электрофореза разделенные компоненты могут быть окрашены и неокрашены для визуализации и для дальнейших количественных анализов (Kohn, 1962).

  Электрофорез с ацетатом целлюлозы подходит для целей быстрого скрининга путем сравнения картины разделения, полученной для исследуемого образца, с образцом разделения известного эталона. Этот метод применим к различным типам образцов, таким как нуклеиновые кислоты, белки, полипептиды, красители и смеси красителей и полисахаридов (Kohn, 1962; Dudman & Bishop, 1968).

  Ацетат целлюлозы в качестве поддерживающей электрофоретической матрицы

  Ацетат целлюлозы получают в результате ацетилирования фильтровальной бумаги, изготовленной из чистой целлюлозы.Ацетилирование обычно происходит в положениях C-3 и C-6 глюкозного кольца (Rochetti & Gelfi, 2001). Ацетат целлюлозы имеет более крупные поры, чем другие популярные электрофоретические матрицы, такие как агароза и полиакриламид (Walker, 2010). Просеивание влияет на то, что ацетат целлюлозы накладывает на разделяющие компоненты, поэтому очень мало или совсем нет. Фактически, можно сделать вывод, что подвижность компонентов в образце во время электрофореза с ацетатом целлюлозы в значительной степени основана на общем заряде, а не на размере рассматриваемого компонента (Kohn, 1957; Westermeier, et al ., 2005).

  По этой причине способность различать разные компоненты, которые очень похожи по размеру, или разрешение электрофореза ацетата целлюлозы, довольно ограничено по сравнению с гель-электрофорезом или капиллярным электрофорезом. Точно так же электрофорез с ацетатом целлюлозы, в отличие от других матриц, применим для разделения пептидов или белков на основе их изоэлектрической точки (pI), где общий заряд пептидов или белков равен нулю.Электрофорез белков или пептидов на ацетате целлюлозы дает результаты, аналогичные результатам, полученным при изоэлектрическом фокусировании (IEF), хотя электрофорез ацетата целлюлозы не проводится в градиенте pH. Электрофорез ацетата целлюлозы был впервые представлен, когда Кон продемонстрировал его способность разделять гемоглобин, a белка в красных кровяных тельцах и для выявления аномального гемоглобина в сыворотке крови (Kohn, 1957, цит. по Rocco, 2005). Этот метод был очень хорошо принят клиническими биохимиками, потому что ацетат целлюлозы имеет несколько преимуществ по сравнению с фильтровальной бумагой.Ниже приведены некоторые преимущества этой техники:

  1. Электрофоретическое разделение требует меньшего времени, чем электрофорез на фильтровальной бумаге.

  Электрофорез на фильтровальной бумаге, предшественник электрофореза с ацетатом целлюлозы, обычно требует 12-14 часов для электрофоретического разделения белков сыворотки, что было основной причиной того, что электрофорез не был полностью принят для клинического анализа (Durrum, 1950 & Rosenfeld, 1981, as цитируется по Rocco, 2005).При электрофорезе с ацетатом целлюлозы время разделения было сокращено с менее чем до 6 часов, в зависимости от разделяемых образцов (Rocco, 2005). Это позволяет проводить быстрый скрининг, который лучше подходит для рутинных анализов в клинических лабораториях, чем электрофорез на фильтровальной бумаге.

  2. Разделение на ацетате целлюлозы приводит к резкой зоне разделения

  Модификация фильтровальной бумаги ацильными группами заменяет гидроксильные (-ОН) группы в гексозных кольцах ацильными группами (CH ₃ CO), что приводит к нескольким изменениям свойств, которые отражаются в ацетате целлюлозы.Одно очевидное изменение в характеристиках ацетата целлюлозы заключается в том, что он стал более гидрофобным (Mashkour et al., 2015), в результате чего ацетат целлюлозы стал менее абсорбирующим белок и воду, чем обычная фильтровальная бумага. Другой определяющей характеристикой ацетата целлюлозы является его однородный размер пор. Следовательно, полосы зон изолированных компонентов, полученных при электрофорезе с ацетатом целлюлозы, более резкие, с гораздо меньшим после (Walker, 2010), и картина разделения как таковая более воспроизводима, чем полученная при электрофорезе на фильтровальной бумаге ( Рокко, 2005).

  3. Ацетат целлюлозы можно сделать прозрачным для последующего анализа

  Одним из основных недостатков электрофореза на фильтре является невозможность количественного определения полученных разделенных компонентов. Возможна только оценка относительного количества или концентрации разделенных компонентов. Однако ацетат целлюлозы может быть очищен от до после электрофоретического разделения и окрашивания, если это необходимо. Это достигается либо за счет прозрачности ацетата целлюлозы, либо за счет его растворения в совместимых растворителях.Например, полоски целлюлозы с разделенными белковыми фракциями можно окрасить Acid Black 2 (нигрозин) или Ponceau S и сделать прозрачными с помощью микроскопического иммерсионного масла, смеси уксусно-этаноловой кислоты или раствора трихлоруксусной кислоты. Когда фон станет полностью прозрачным, очищенную полосу можно сканировать на оптическом денситометре для количественной оценки. В качестве альтернативы, каждую полосу можно отрезать от мембраны, растворить в смеси этанола и хлороформа, а комплекс белок-краситель, который отражает количество каждой белковой фракции, можно измерить с помощью спектрофотометра (Rocco, 2005).

  4. Ацетат целлюлозы — это готовая опорная матрица

  В отличие от других более новых матриц, ацетат целлюлозы представляет собой готовую матрицу, которая, кроме уравновешивания в рабочем буфере, не требует дальнейшей модификации или подготовки перед использованием. Это особенно полезно при высокопроизводительном анализе, когда один или два типа образцов повторно анализируются в больших количествах. Готовая матрица снижает вероятность непреднамеренного внесения непредвиденных изменений в схему электрофореза (Walker, 2010), а также обеспечивает универсальность метода.Электрофорез с ацетатом целлюлозы можно применять к широкому спектру образцов при условии, что имеется подходящий рабочий буфер. Например, более понятная картина разделения гемоглобинов может быть достигнута путем изменения рабочего буфера на два рабочих буфера, по одному на каждом электроде, создавая прерывистую буферную систему (Kohn, 1969). Использование готовой матрицы также позволяет интегрировать робототехнику для анализа, что позволяет преобразовать электрофорез с ацетатом целлюлозы в полностью автоматическую систему (Rochetti & Gelfi, 2001).Электрофорез с ацетатом целлюлозы — это универсальный метод разделения, который применим для многих анализов, особенно в клинических лабораториях. Некоторые примеры применения электрофореза ацетата целлюлозы:

  1. Анализ сыворотки: профилирование гемоглобина

  Анализ сыворотки, в частности разделение нормального и аномального гемоглобинов в сыворотке крови, был первым применением электрофореза ацетата целлюлозы в клинической патологии. Гемоглобины — это железосодержащие белки, переносящие кислород в красных кровяных тельцах.Мутации в генах, кодирующих любую из субъединиц гемоглобина, приведут к изменению некоторых характеристик гоблина, что приведет к наследственным заболеваниям крови, таким как серповидно-клеточная анемия, альфа- и бета-талассемия (Forgot & Bunn, 2013).

  В 1957 году Кон представил использование ацетата целлюлозы в качестве поддерживающей матрицы в зонном электрофорезе (Rocco, 2005), используя в качестве примера разделение сыворотки крови, включая гемоглобины. И снова в 1969 году он продемонстрировал разделение и идентификацию аномальных форм гемоглобина с помощью электрофореза с ацетатом целлюлозы, проведенного в прерывистой буферной системе (Kohn, 1969).С тех пор было разработано множество протоколов, основанных на электрофорезе с ацетатом целлюлозы для быстрого определения профиля гемоглобина, который может идентифицировать пациентов, страдающих серповидно-клеточной анемией и талассемией. Профилирование требует разделения и количественной оценки различных форм гемоглобина (Marengo-Rowe, 1965). В настоящее время быстрое профилирование гемоглобина выполняется путем нанесения гемолизатов на пластину из ацетата целлюлозы, полоску из ацетата целлюлозы на пластиковую пластину и подвергания ее электрофорезу (Wild & Bain, 2004).

  2. Метод иммуноэлектрофореза с переносом (ИЭП)

  Метод иммуноэлектрофореза с переносом — это адаптация иммуноэлектрофореза (ИЭП), выполняемого с использованием агарового блока, разработанного Грабаром и Уильямсом в 1955 г. (Rocco, 2005). В IEP сыворотку, содержащую антигенов, , которые представляют собой белки или пептиды, специфически реагирующие с антителами , разделяют с помощью гель-электрофореза. После разделения антисывороточные антитела диффундируют, чтобы обеспечить связывание антигена с его соответствующим антителом , , что приведет к преципитации комплекса антиген-антитело (Nowotny, 1979).

  В 1957 году Кон модифицировал метод ИЭП Грабара и Вильямса, разделив сывороточные антигены с помощью электрофореза с ацетатом целлюлозы. После электрофореза мембрану из ацетата целлюлозы помещают рядом с фильтровальной бумагой, пропитанной антисывороткой, чтобы обеспечить диффузию на мембрану из ацетата целлюлозы. Диффузия антисыворотки на мембрану из ацетата целлюлозы приводит к образованию комплекса антиген-антитело. Наконец, мембрану можно окрасить, очистить, высушить и сразу сохранить для записи анализа (Kohn, 1957; Rocco, 2005).

  3. Противоиммуноэлектрофорез на ацетате целлюлозы

  Противоиммуноэлектрофорез (CIE) — это метод электрофореза, который проверяет совместимость взаимодействия антиген-антитело. В CIE сыворотка наносится на одну сторону среды, а образец — на другую. После приложения электрического поля сыворотка и образцы перемещаются к середине, и, если в сыворотке присутствуют антитела, образуется полоса, представляющая комплекс антиген-антитело или преципитин , .Кон продемонстрировал применение электрофореза ацетата целлюлозы для CIE. Подобно методу переноса IEP, образование комплекса антиген-антитело в CIE может быть окрашено, очищено, высушено и непосредственно сохранено в качестве записи анализа (Rocco, 2005). Ацетат целлюлозы составляет одну из самых первых использованных поддерживающих матриц. для зонного электрофореза. С момента создания появились новые формы зонного электрофореза, которые предлагают более высокую разрешающую способность без ущерба для времени или результатов разделения.Такие методы, как гель и капиллярный электрофорез, по большей части заменили электрофорез с ацетатом целлюлозы в большинстве исследовательских лабораторий. Тем не менее, электрофорез с ацетатом целлюлозы по-прежнему сохраняет свое место в рутинной клинической диагностике благодаря простоте использования и адаптируемости.

  1. Забудьте, Б.Г., и Банн, Х.Ф. (2013). Классификация нарушений гемоглобина. Перспективы Колд-Спринг-Харбор в медицине, 3 (2), a011684 – a011684. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a011684
  2. Йоргенсон, Дж.W. (1986). Электрофорез. Аналитическая химия, 58 (7), 743A-760A. https://doi.org/10.1021/ac00298a001
  3. Кон, Дж. (1969). Разделение гемоглобинов на ацетате целлюлозы. Журнал клинической патологии, 22 (1), 109–111. https://doi.org/10.1136/jcp.22.1.109
  4. Кон, Дж. (1962). Электрофорез ацетата целлюлозы. Труды ассоциации клинических биохимиков, 2 (1), 19–20. https://doi.org/10.1177/036985646200200114
  5. Кон, Дж. (1957). Иммуно-электрофоретическая техника.Природа, 180 (4593), 986–987. https://doi.org/10.1038/180986a0
  6. Маренго-Роу, А. Дж. (1965). Быстрый электрофорез и количественное определение гемоглобинов на ацетате целлюлозы. Журнал клинической патологии, 18 (6), 790–792. https://doi.org/10.1136/jcp.18.6.790
  7. Машкур, М., Афра, Э., Ресалати, Х., и Машкур, М. (2015). Умеренное ацетилирование поверхности нанофибриллированной целлюлозы для улучшения прочности бумаги и барьерных свойств. RSC Advances, 5 (74), 60179–60187. https: // doi.org / 10.1039 / C5RA08161K
  8. Новотны, А. (1979). Иммуноэлектрофорез. В основных упражнениях по иммунохимии (стр. 235–237). https://doi.org/10.1007/978-3-642-67356-6_72
  9. Ригетти П. Г. и Гельфи К. (2001). 14. Электрофорез. В книге Helmut Guenzler & A. Williams (Eds.), Handbook of Analytical Techniques (стр. 346–347). WILEY-VCH Verlag GmbH.
  10. Рокко Р. М. (2005). Иоахим Кон (1912–1987) и происхождение электрофореза ацетата целлюлозы. Клиническая химия, 51 (10), 1896–1901.https://doi.org/10.1373/clinchem.2005.056572
  11. Уокер, Дж. М. (2010). 10 Электрофоретические техники. В К. Уилсон и Дж. М. Уокер (ред.), Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии (7-е изд.). Кембридж: Издательство Кембриджского университета.
  12. Вестермайер, Р.