Посев на чувствительность к антибиотикам что это такое: Посев на флору — Цены на процедуры в Москве

Содержание

Посев на флору — Цены на процедуры в Москве

Посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам – это микробиологический анализ высокой точности, проводящийся в условиях лаборатории. В благоприятную среду помещается биоматериал, в котором развиваются патогенные микроорганизмы. В настоящее время многие современные клиники предлагают такую услугу, в том числе и мы, «Доктор 2000».

Биоматериалом может быть не только микрофлора влагалища, но и мокрота, сперма, грудное молоко, желчь, секрет простаты. Этот анализ дает развернутую картину, имеет приемлемую стоимость и достаточно прост в выполнении. При помощи такого исследования специалист видит полную клиническую картину заболевания пациента, что дает ему возможность поставить правильный диагноз и определить, какую группу антибиотиков назначать для последующего лечения.

Фармакология не стоит на месте, и ассортимент антибиотиков велик, поэтому выделяют два основных способа определения чувствительности:

— к основному спектру антибиотиков;

— к развернутому спектру антибиотиков.

При помощи этой несложной процедуры происходит обнаружение таких микроорганизмов, как стафилококки, стрептококки, энтерококки, неферментирующие бактерии, энтеробактерии. Посев очень важен, так как лечащий врач должен непременно знать, какие именно антибиотики успешно справятся с течением болезни. Именно поэтому наличие аллергии на препарат не принесет должного результата.

Во время анализа просматривается, как биоматериал реагирует на тот или иной вид антибиотика, подавляются ли микроорганизмы предписанными дозами препарата или они остаются устойчивы к его воздействию. От этого во многом зависит правильный подход к локализации очага болезни.

Можно сделать вывод, что посев на флору необходим для установления возбудителя инфекции и подбора надлежащего препарата. Эта мера необходима для того, чтобы в случае нерезультативности предыдущего курса лечения выявить его причину.

Если в результатах вашего анализа вы видите латинскую букву R – это говорит о том, что биоматериал устойчив к действию антибиотика. Если же стоит буква S, значит, был проведен результативный курс лечения.

В заключении нужно отметить, что посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам – это лучшее исследование, которое можно провести для правильной постановки диагноза. Он является гарантом не только точной диагностики, но и определяет группу антибиотиков, которые хорошо воспринимает организм пациента.

Посев на флору с определением чувствительности к расширенному спектру антибиотиков и бактериофагам, в т.ч. Кандида

Выберите требуемый вид биоматериала

Соскобы из урогенитального тракта не берутся в течение суток после местной терапии (свечи, мази, спринцевания), после полового контакта и во время менструации у женщин. После кольпоскопии, интравагинального УЗИ должно пройти 48 часов. В случае наличия признаков острого воспаления необходимость взятия мазка определяется лечащим врачом. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней после окончания лечения.

Соскобы из урогенитального тракта не берутся в течение суток после местной терапии (свечи, мази, спринцевания), после полового контакта и во время менструации у женщин. После кольпоскопии, интравагинального УЗИ должно пройти 48 часов. В случае наличия признаков острого воспаления необходимость взятия мазка определяется лечащим врачом. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование методом ПЦР возможно не ранее, чем через 28 дней после окончания приема антибиотиков, на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней.

Соскобы из урогенитального тракта не берутся в течение суток после местной терапии (свечи, мази, спринцевания), после полового контакта и во время менструации у женщин. После кольпоскопии, интравагинального УЗИ должно пройти 48 часов. В случае наличия признаков острого воспаления необходимость взятия мазка определяется лечащим врачом. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование методом ПЦР возможно не ранее, чем через 28 дней после окончания приема антибиотиков, на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней.

Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.

Накануне исследования не применять местные лекарственные препараты и процедуры, исключить половой акт. При взятии соскоба из уретры не мочиться в течение 1,5-2 часов до процедуры. Если исследование назначается для контроля излеченности, то взятие материала на исследование методом ПЦР возможно не ранее, чем через 28 дней после окончания приема антибиотиков, на микробиологические исследования не ранее,чем через 14 дней.

Бак посев с определением чувствительности к антибиотикам в Москве

Мед Лайт

11 отзывов

многопрофильный медицинский центр

Посев на анаэробные бактерии с определением чувствительности к антибиотикам*

г. Москва, ул. Народного ополчения, д. 23 к.3

пн-пт
09:00 — 20:00
сб
09:00 — 20:00

8 (495) 185-01-01

Центр перинатальной профилактики

2 отзыва

многопрофильный медицинский центр

Бак. посев на флору с опред.чувст-ти к расширенному спектру а/б и бактериофагам

г. Москва, ул. Ленинская Слобода, д. 4

пн-пт
09:00 — 18:00

8 (495) 185-01-01

Мобилмед

0 отзывов

медицинский центр

Бактериологический посев на возбудителей кишечной инфекции (сальмонеллы, шигеллы) с определением чувствительности к антибиотикам.

г. Москва, ул. Новослободская, д. 14/19 стр.1

пн-пт
08:00 — 20:00
сб
10:00 — 16:00

8 (495) 185-01-01

Мобил Мед на Таганке

0 отзывов

медицинская клиника

Бактериологический посев на возбудителей кишечной инфекции (сальмонеллы, шигеллы) с определением чувствительности к антибиотикам.

г. Москва, ул. Верхняя Радищевская, д. 15, стр. 3

пн-пт
08:00 — 20:00
сб
10:00 — 17:00

8 (495) 185-01-01

Мобил Мед на Б. Татарской

0 отзывов

медицинская клиника

Бактериологический посев на возбудителей кишечной инфекции (сальмонеллы, шигеллы) с определением чувствительности к антибиотикам.

г. Москва, ул. Большая Татарская, д.5, стр. 5

пн-пт
08:00 — 20:00
сб
10:00 — 17:00

8 (495) 185-01-01

Мобил Мед на Курской

0 отзывов

медицинская клиника

Бактериологический посев на возбудителей кишечной инфекции (сальмонеллы, шигеллы) с определением чувствительности к антибиотикам.

г. Москва, ул. Воронцово поле, д. 7

пн-пт
07:00 — 20:00
сб
08:00 — 17:00

8 (495) 185-01-01

Мобил Мед на Киевской

0 отзывов

медицинская клиника

Бактериологический посев на возбудителей кишечной инфекции (сальмонеллы, шигеллы) с определением чувствительности к антибиотикам.

г. Москва, ул. Резервный проезд, д.11А, стр. 1

пн-пт
08:00 — 20:00
сб
10:00 — 17:00

8 (495) 185-01-01

Евромед

1563 отзыва

многопрофильный медицинский центр

г. Москва, ул. Красина, д. 14, стр. 2

пн-пт
08:00 — 20:00
сб
08:00 — 20:00
вс
08:00 — 20:00

8 (499) 519-36-55

Евромедклиник

6642 отзыва

многопрофильный медицинский центр

г. Москва, ул. Сиреневый бульвар, д. 32а

пн-пт
00:00 — 24:00
сб
00:00 — 24:00
вс
00:00 — 24:00

8 (495) 185-01-01

Медико-стоматологическая клиника SHIFA (ШИФА) м. Университет

711 отзывов

многопрофильный медицинский центр

г. Москва, ул. Ломоносовский пр-т, д. 25, корп. 1

пн-пт
09:00 — 21:00
сб
09:00 — 21:00
вс
10:00 — 21:00

8 (499) 116-78-78

Анализ на чувствительность к бактериофагам

Бактериофаги – уникальные микроорганизмы. Их антибактериальная активность достигается внедрением в клетку возбудителя, последующим размножением и распадом бактерии. Для лечения бактериальных заболеваний могут применяться либо антибиотики, либо бактериофаги, либо проводят совместную терапию. В каких случаях необходимо назначать антибиотики, а когда – бактериофаги? Все ответы в нашей статье.

Зачем делать анализ

Одна из ключевых проблем, послужившая развитию антибиотикорезистентности бактерий, – неправильное применение антибиотиков или противомикробных препаратов.

Когда к врачу обращается пациент с острым течением заболевания, антибиотики в большинстве случаев назначают сразу, без предварительного определения чувствительности возбудителя.

Специалист назначает антибиотик исходя из собственного опыта, учитывая рекомендации по активности препарата в отношении бактерий, наиболее часто вызывающих данное заболевание. Выбор антибиотика зачастую продиктован клинической ситуацией: необходимо устранить острые симптомы воспаления, что возможно только при ликвидации микроорганизма как причины, его вызывающей. Одновременно с назначением антибиотика врач направляет на анализ по определению чувствительности возбудителя к антибактериальным препаратам и бактериофагам. Результаты анализа обычно готовы в течение 3–4-х дней.

Если врач по каким-либо причинам не назначил анализ на чувствительность к антибиотикам и бактериофагам, вы можете сделать его по своему желанию в клинической лаборатории, где проводят такие тесты.

Важные требования к подбору антибактериального препарата на первом этапе: правильная дозировка, узкий спектр активности. Корректное назначение антибиотика определяет возможность формирования к нему устойчивости у бактерий. К сожалению, часто случается наоборот: некорректно назначенный препарат катализирует процесс мутаций у бактерий и формирует устойчивость их к антибиотикам.

Резистентность к противомикробным средствам – серьезная проблема, представляющая угрозу для здоровья людей во всех регионах нашей планеты. Однако появление микроорганизмов, стойких к антибиотикам, послужило толчком к активному изучению бактериофагов.

Препараты бактериофагов рассматривают как альтернативу антибиотикам. В отличие от антибактериальных препаратов бактериофаги воздействуют только на возбудителя заболевания, не затрагивая нормальную флору человеческого организма. Препараты бактериофагов можно принимать в сочетании с другими антибактериальными средствами, что усиливает противобактериальный эффект и позволяет снизить дозу антибиотика.

Совместное назначение бактериофагов с противовирусными препаратами противопоказано.

Чтобы достичь нужного эффекта при лечении любым антибактериальным препаратом и препаратом бактериофага, необходимо пройти тест на чувствительность возбудителя.

Метод серийных разведений

Антибиотик в различных разведениях помещают в жидкую питательную среду (бульон) или агар, куда добавляют бактериальную суспензию. По наличию или отсутствию роста микроорганизмов в питательной среде оценивают эффективность антибиотика, определяют его минимальную подавляющую концентрацию.

Диско-диффузионный метод

В питательную среду с ранее внесенной бактериальной суспензией помещают бумажные диски с антибиотиками. Вследствие диффузии антибиотика происходит подавление роста микроорганизмов, и по диаметру зон задержки роста судят о чувствительности культуры.

Е-тест

Это полоска, на которую нанесен градиент концентрации антибиотика. Исследование проводят аналогично диско-диффузионному методу.

Метод слепого пятна

Классический тест на определение чувствительности к бактериофагам. В клинических лабораториях и на производстве применяют метод титрования. Выделенные из патологического содержимого бактерии засевают в питательную среду вместе с бактериофагом.

Появление стерильных округлых пятен говорит о лизисе (растворении клеток) бактерий с образованием колоний бактериофагов. Просветление среды (формирование прозрачных зон) подтверждает чувствительность бактерий к бактериофагу.

По спектру действия выделяют моновалентные бактериофаги, которые лизируют бактерии одного вида, и поливалентные – разрушающие бактерии нескольких видов.

Расшифровка результатов анализа

На бланке теста будут обозначения в виде букв R или S. R (Resistant) – резистентность бактерий к данному бактериофагу или антибиотику, S (Sensitive) – чувствительность возбудителя к препарату.

Если результат теста R, лечение данным фаговым препаратом неэффективно, S говорит о том, что бактериофаг или антибиотик можно назначать. Если возбудитель чувствителен к определенной группе антибиотиков и резистентен к бактериофагу, назначают антибактериальные препараты, и наоборот.

Тест на антибиотико- и фагочувствительность помогает определить, справится препарат с возбудителем инфекции или нет. Это важный показатель, на который ориентируются специалисты при выборе схемы лечения.

АО «НПО «Микроген» выпускает широкий спектр бактериофагов, что расширяет возможности фаготерапии и позволяет корректно подобрать препарат, к которому чувствительны патогенные бактерии.

Посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам: исследования в лаборатории KDLmed

Это микробиологическое исследование, позволяющее определить качественный и количественный состав микрофлоры исследуемого биоматериала, в том числе выявить условно-патогенные микроорганизмы в высоком титре и патогенные микроорганизмы, определить их чувствительность к антибиотикам.

При обнаружении микробиологическим методом микроорганизмов, составляющих нормальную микрофлору, или условно-патогенных микроорганизмов в титре менее диагностического не определяется чувствительность к антибиотикам и бактериофагам, так как это количество не является значимым и не требует лечения противомикробными препаратами.

Исследуется аэробная микрофлора.

Синонимы русские

Бактериологический посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам.

Синонимы английские

Culture, routine. Bacteria identification and antibiotic susceptibility testing.

Метод исследования

Микробиологический метод.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Разовую порцию мочи, урогенитальный мазок (с секретом предстательной железы), мокроту, мазок из ротоглотки, грудное молоко, мазок из носоглотки, эякулят, отделяемое уха, мазок с конъюнктивы, мазок из носа, синовиальную жидкость, мазок из цервикального канала, мазок из уретры, отделяемое абсцесса полости рта, плевральную жидкость, ликвор, смыв из бронхов, желчь, экссудат, биоптат, содержимое желчного пузыря.

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Рекомендуется употребить большой объём воды за 8-12 часов до сбора мокроты.
  • Исключить приём мочегонных препаратов в течение 48 часов до сбора мочи (по согласованию с врачом).
  • Женщинам рекомендуется сдавать урогенитальный мазок или мочу до менструации или через 2 дня после её окончания.
  • Мужчинам не следует мочиться в течение 3 часов до сдачи урогенитального мазка или мочи.
  • Не чистить зубы в день взятия биоматериала на исследование.

Общая информация об исследовании

Нормальная микрофлора человека представляет собой совокупность микроорганизмов, населяющих кожу и слизистые оболочки. Наибольшее их количество (около 40 %) обитает в желудочно-кишечном тракте, остальная часть – на кожных покровах, зеве, глотке, в мочеполовой системе и др. Нормальная микрофлора подразделяется на постоянную (составляет до 90 % присутствующих в организме микробов), факультативную (менее 10 %) и случайную (не более 0,5 %).

По способности вызывать инфекционные заболевания микроорганизмы классифицируют на непатогенные (не вызывающие заболевания), условно-патогенные (в норме могут выделяться в небольших количествах и при определённых условиях активно размножаются, приводя к воспалению) и патогенные (являются возбудителями инфекционных заболеваний и в составе нормальной микрофлоры не обнаруживаются).

Бактериологическое исследование (посев на флору) позволяет определить качественный и количественный состав микрофлоры исследуемого клинического материала, в том числе выявить патогенные микроорганизмы. При обнаружении условно-патогенных микроорганизмов в высоком титре или патогенных микроорганизмов определяется их чувствительность к антибиотикам и бактериофагам.

Для чего используется исследование?

  • Чтобы установить возбудителя инфекционного заболевания.
  • Для подбора рациональной антимикробной терапии.
  • Чтобы оценить эффективность проводимой терапии.

Когда назначается исследование?

При воспалительных заболеваниях различных локализаций (за исключением воспалительных заболеваний кишечника).

Что означают результаты?

Референсные значения для различных видов микроорганизмов зависят от их локализации (точки взятия биологического материала).

Что может влиять на результат?

Предшествующая противогрибковая или антибактериальная терапия.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Терапевт, врач общей практики, педиатр, хирург, ЛОР, пульмонолог, уролог, гинеколог, дерматовенеролог, офтальмолог.

Литература

  • Chernecky С.С. Laboratory tests and diagnostic procedures /  С.С. Chernecky, B.J. Berger ; 5th ed. – St Louis : Saunders Elsevier, 2008. – 1232 p.
  • Gill V.J., Fedorko D.P., Witebsky F.G. The clinician and the microbiology laboratory. In: Principles and practice of infectious disease / G.L. Mandell, Bennett J.E., R. Dolin (Eds) ; 6th ed. – Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. – 2701 p.
  • Levinson W. Medical microbiology and immunology: examination and board review (Lange medical books series) / W. Levinson ; 8th ed. – NY : McGraw-Hill, 2004. – 654 p.

Научно-популярные статьи – полезная информация на сайте ЛИТЕХ

Анализ на устойчивость к антибиотикам помогает правильно подобрать препарат для лечения и существенно повысить эффективность терапии. По результатам проведенного исследования врач составляет антибиотикограмму — список лекарств, к которым чувствителен или не чувствителен исследуемый микроорганизм. Единицей измерения является минимальное количество антибиотика, необходимого для устранения возбудителя.

Все микроорганизмы чувствительны к какой-либо группе антибиотиков. В зависимости от устойчивости к лекарствам, микробы делятся на три группы:

  • чувствительные — гибнут под воздействием обычных доз;
  • умеренно-устойчивые — погибают при приеме максимальных доз препаратов;
  • устойчивые штаммы — выживают даже при максимальных количествах антибиотика.

Чтобы определить, какие антибиотики успешно справятся с бактериями-возбудителями заболевания, необходимо сдать посев.

Посев мочи

Посев мочи на устойчивость к лекарственным препаратам обычно сдают при диагностике мочеполовых инфекций, приводящих к возникновению цистита, уретрита, пиелонефрита. Показаниями к проведению исследования являются:

  • болезненные мочеиспускания,
  • поясничные боли,
  • нарушения мочеиспускания,
  • изменения в результатах общих анализов мочи.

Для анализа на устойчивость к антибиотикам нужно собрать утреннюю порцию мочи в стерильную емкость. Перед сбором биоматериала необходимо провести гигиенические процедуры. При таком способе забора, моча содержит максимальную концентрацию микроорганизмов. Если за несколько дней перед сдачей анализов пациент принимал лекарства, результат может быть ложноотрицательным. Об этом следует заранее предупредить врача.

Образец подвергают двум видам анализов. Первый помогает определить возбудителя инфекции, второй — уровень его чувствительности к тем или иным антибиотикам.

Посев крови

Анализ крови берут из вены. Биоматериал помещают в специальную стерильную бутыль, в которой создана питательная среда для бактерий. В первую очередь устанавливают типы микроорганизмов в образце, а затем проводят исследование на их чувствительность к лекарствам.

Результаты бактериологического посева крови могут быть следующими:

  • нет роста бактерий — кровь стерильна;
  • чистый рост — означает наличие одного вида микроорганизмов, например, при сепсисе;
  • смешанный рост — из образца крови было выделено более одного вида микробов.

Результаты анализов на устойчивость к антибиотикам передают врачу. Он принимает решение о назначении тех или иных лекарств для терапии выявленной болезни.

Чтобы сдать анализы в нашей лаборатории, выбирайте нужный профиль и записывайтесь любым удобным способом — через интернет-регистратуру или по телефонам. Подробности о действующих скидках и акциях уточняйте у администраторов.

В нашей лаборатории действуют доступные цены на все исследования. Например, выгодно заказать оформление мужского или женского генетического паспорта здоровья. Вместе с документом Вы получаете заключение опытного генетика.

Все статьи

Посев на анаэробную микрофлору и определение чувствительности к антибиотикам (Anaerobic culture, Routine. Bacteria Identification and Susceptibility)

Метод определения
бактериологический, бактериоскопический

Исследуемый материал
Смотрите в описании

Обнаружение анаэробной флоры при гнойно-воспалительных процессах.

Анаэробные микроорганизмы составляют абсолютное большинство нормальной микрофлоры человеческого тела. Но при определенных условиях они становятся причиной тяжёлых гнойно-воспалительных заболеваний.

Вне зависимости от локализации очага они имеют общие характерные клинические проявления, обусловленные гнилостным характером поражения, газообразованием. Большинство анаэробных инфекций эндогенны и чаще всего поражают органы места их естественного обитания анаэробов желудочно-кишечный тракт, мочеполовая система, верхние дыхательные пути.

Только точная диагностика позволяет обосновать рациональную терапию и ликвидировать потенциально смертельно-опасную инфекцию.

Выделяемые возбудители: бактероиды, вейлонеллы, эубактерии, пептострептококки, актиномицеты, фузобактерии, клостридии, превотеллы, гемеллы, бифидобактерии, порфиромонас, пропионобактерии.

Материал для исследования:

  • аспираты из полостей (например, полости матки), биологические жидкости из брюшной, плевральной полостей, гнойное содержимое из абсцессов и флегмон;

  • кусочки тканей при миозитах и мионекрозе (путем погружения кусочка вглубь угольной среды с помощью прилагаемого к ней тампона), отделяемое со дна язв;

  • желчь;

  • семенная жидкость (секрет простаты).

Обратите внимание! Стоимость анализа указана для каждой отдельно взятой локализации. Для микробиологических исследований возможна дополнительная оплата стоимости взятия биоматериала или транспортной среды. Просим уточнять информацию в Федеральной справочной службе ИНВИТРО по тел. (495) 363-0-363.

Литература

  1. Гладкова Н. С. и соавт. Оценка различных методов лабораторной диагностики урогенитальных микоплазм.

  2. Вести дерматол. Венерол., 1999, № 2, рр.43 — 45.

  3. Gorbach S. Et al./ Infectious Diseases (3rd edition)/2003/ Lippincott Williams & Wilkins/2700 ps.

  4. Jacobs D. et al. Laboratory test handbook/ Lexi-Comp./2002 — 1534 p.

Руководство по идентификации бактериальных культур и интерпретации результатов

Реферат

Цель

Предоставить руководство по интерпретации результатов бактериальных культур.

Методы

Исследования были выявлены с помощью поиска в литературе PubMed (с 1966 по январь 2018). Поисковые запросы включали тесты на микробную чувствительность, микробную устойчивость к лекарственным препаратам и противоинфекционные агенты / фармакологию. Статьи включались, если они были опубликованы на английском языке. Также были проанализированы ссылки в указанных статьях.

Результаты

В этой статье рассмотрены основные концепции интерпретации результатов бактериальных посевов, включая время посева, общие места посева, возможность контаминации, интерпретацию окраски по Граму, роль быстрых диагностических тестов, стандартное тестирование чувствительности к антибиотикам и автоматическое тестирование.

Заключение

Это руководство может помочь фармацевтам в их роли в качестве неотъемлемых членов группы управления антимикробными препаратами в усилиях по улучшению ухода за пациентами.

Ключевые слова: тесты микробной чувствительности, микробная лекарственная устойчивость, противоинфекционные агенты / фармакология, фармакокинетика

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время существует нехватка фармацевтов, обученных инфекционным заболеваниям, для заполнения должностей по управлению антимикробными препаратами в Соединенных Штатах. Это означает, что фармацевты на различных других должностях должны взять на себя эти роли, чтобы улучшить назначение соответствующих антибиотиков. 1 Исследования показывают, что в условиях стационара примерно 50% пациентов получают хотя бы один антибиотик во время пребывания в стационаре, 30% из которых включают антибиотики широкого спектра действия. 2 5 Сообщается, что нецелевое использование антибиотиков достигает 50%, хотя оценки могут варьироваться в зависимости от учреждения и от того, как определяется термин «уместность». 6 9 Неправильное использование может привести к усилению побочных эффектов, вторичным инфекциям, лекарственным взаимодействиям, дополнительным расходам, увеличению продолжительности пребывания в больнице и повторной госпитализации. Кроме того, может развиться резистентность бактерий, что может привести к неэффективности лечения. 9 , 10 В этой статье рассматриваются сроки посева, общие места посева, интерпретация окраски по Граму, роль экспресс-тестов, обычных тестов на чувствительность к антибиотикам и автоматизированного тестирования.На протяжении всей статьи мы используем термин антибиотик вместо противомикробный , поскольку мы не охватывали тестирование вирусов или грибков.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУР

Медицинские работники должны быстро получить посевы для проведения терапии, одновременно принимая во внимание важность быстрого введения антибиотиков. 11 Руководящие принципы Кампании по борьбе с сепсисом 2016 г. рекомендуют вводить антибиотики в течение одного часа после постановки диагноза сепсиса и чтобы посевы не откладывали введение антибиотиков более чем на 45 минут. 12 У пациентов с сепсисом введение соответствующих антибиотиков в течение одного часа может снизить смертность. 13 Получение посевов перед введением антибиотиков может помочь клиницистам определить возбудителя болезни, что позволит снизить эскалацию за счет надлежащего лечения. Если посевы отбираются после введения антибиотика, может наблюдаться снижение результатов посева крови, что может увеличить стоимость и продолжительность пребывания пациента. 14 16

Культуры можно получить из участков, которые либо заселены бактериями, либо стерильны.Колонизированные бактериями увеличивают риск заражения нормальной флорой и могут привести к ложным результатам . Сайты, которые обычно считаются стерильными, включают спинномозговую жидкость, кровь и перикардиальную жидкость. Места, которые хорошо известны заражением, включают мокроту и носовые ходы. 17 Неправильная техника сбора посевов может также увеличить риск заражения. Ниже приведены рекомендации по интерпретации результатов для крови, дыхательных путей, мочи, кожи и мягких тканей, костей и суставов, спинномозговой жидкости и посевов стула.

Культуры крови

При оценке культур крови важно различать бактериемию и контаминацию. Заражение происходит, когда в собранный образец попадают бактерии из внешнего источника. 18 Например, нормальные кожные бактерии могут быть занесены при проведении венепункции с помощью одной иглы. Бактерии также могут присутствовать в медицинских устройствах, таких как центральные венозные катетеры. Центральные венозные катетеры связаны с более высоким уровнем заражения, чем венопункция.Темпы выявления загрязнителей растут, поскольку новые методы тестирования улучшают идентификацию бактерий даже в небольших количествах.

При оценке потенциального заражения клиницист должен оценить клинические проявления пациента и определить, проявляет ли он или она признаки и симптомы бактериемии. Например, если у пациента была гипотензия, тахикардия и лихорадка, это может указывать на наличие бактериемии. Кроме того, очень важно брать как минимум два образца с разных участков тела.Вторым участком часто является центральный венозный катетер, если он есть. Если в одной из двух культур растет организм, который считается вероятным контаминантом, необходимы повторные посевы. И наоборот, если один и тот же организм выращивается в нескольких образцах, результатом обычно является настоящая бактериемия. 19 , 20 Только одна положительная культура необходима, чтобы предположить истинную инфекцию у пациентов с грамотрицательными бактериями. 21 Грамположительные бактерии, особенно виды Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium , с большей вероятностью могут быть контаминантами. 22 Одно исследование по оценке 500 посевов крови показало, что видов Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium были контаминантами в 94% и 79% случаев соответственно. Однако в таких популяциях, как пациенты с ослабленным иммунитетом, эти две бактерии могут представлять настоящую инфекцию. Грамположительные бактерии, ассоциированные с истинной инфекцией, включают Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae . Повторные посевы должны быть взяты, чтобы гарантировать разрешение бактериемии.

Респираторные культуры

Для диагностики пневмонии многие клиницисты заказывают посев мокроты, эндотрахеальный аспират и, реже, бронхоальвеолярный лаваж. Они выполняются в дополнение к оценке признаков и симптомов (кашель, лихорадка, выделение мокроты, плевритная боль в груди) и рентгенографии грудной клетки. 23 Посев мокроты может быть трудно интерпретировать, потому что верхние дыхательные пути колонизированы бактериями, в отличие от нижних дыхательных путей, которые обычно стерильны. 24 Сообщения о чувствительности и специфичности посевов мокроты широко различаются. 23 Если получена культура мокроты, необходимо отметить наличие эпителиальных клеток, которые могут указывать на загрязнение культуры. Культуры мокроты должны содержать менее 10 эпителиальных клеток на поле с малым увеличением. В определенных группах пациентов, например, с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), у которых наблюдается обострение, следует избегать посева мокроты. 25 Вместо того, чтобы использовать такие культуры для определения наличия инфекции, в рекомендациях Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких 2017 рекомендуется оценивать симптомы пациента, такие как выделение мокроты, гнойность и одышка.У пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, посевы обычно получают путем эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа. Эндотрахеальная аспирация имеет меньшую специфичность, чем бронхоальвеолярный лаваж для диагностики пневмонии, хотя она имеет меньше осложнений и более низкую стоимость. 26 Эта более низкая специфичность может привести к более высокому использованию антибиотиков. Рекомендации различаются в зависимости от предпочтения эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа, поскольку выбор основан на деэскалации антибиотиков или стоимости и осложнениях этих методов. 27 , 28 Клиницисты должны руководствоваться стандартами своего учреждения, когда рекомендуют эндотрахеальную аспирацию или бронхоальвеолярный лаваж.

Посев мочи

Посев мочи следует отбирать только при подозрении на инфекцию, обычно при наличии симптомов, о которых сообщает пациент. 29 Типичные симптомы инфекции мочевыводящих путей включают дизурию, частоту и неотложность позывов, хотя пациенты с деменцией могут проявлять неспецифические признаки, такие как усталость и изменения психического статуса. 30 У пациентов с мочевыми катетерами симптомы носят более общий характер и могут включать лихорадку, слабость и изменение психического статуса. 31 Скрининг бессимптомной бактериурии следует проводить только у беременных или у пациентов, подвергающихся урологическим процедурам. 29 При обследовании пациента с потенциальной инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) следует оценивать посев мочи вместе с симптомами и анализом мочи. Десять или более лейкоцитов на микролитр в анализе мочи связаны с диагнозом ИМП, но это не должно быть единственным критерием, используемым для диагностики.Культуры у пациентов без мочевых катетеров лучше всего собирать на полпути, чтобы избежать заражения. В посеве мочи количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл является оценкой количества бактерий в образце. Более 10 3 КОЕ на мл в посеве мочи связано с инфекцией. Однако истинная инфекция может возникать у пациентов с более низкими КОЕ при наличии симптомов и лейкоцитов в моче. 32 Пациенты с катетер-ассоциированными ИМП также имеют более низкие КОЕ.И наоборот, более высокое количество КОЕ может иметь место в присутствии контаминантов и после неправильно взятого образца. Бактерии, которые обычно не наблюдаются при ИМП, могут быть вызваны контаминацией, за исключением случаев, когда у пациента есть факторы риска для других типов бактерий и образец не собирается надлежащим образом. Обычные бактерии при неосложненных ИМП включают видов Escherichia coli , видов Klebsiella , видов Proteus и Staphylococcus saprophyticus .

Инфекции кожи и мягких тканей

Американское общество инфекционных болезней (IDSA) рекомендует делать посевы на абсцессы и карбункулы, хотя они упоминают эмпирическое лечение без посева как разумное. 33 При целлюлите IDSA рекомендует проводить посев крови только при наличии у пациента определенных факторов. К этим факторам относятся: иммуносупрессия, злокачественные новообразования, укусы животных и / или иммерсионные травмы. 34 Посев на поверхность кожи следует получать только при гнойном дренаже. Получение кожных культур при инфекциях без дренажа часто приводит к выявлению полимикробных организмов, которые не являются причиной инфекции, что приводит к чрезмерно широкому лечению. 35 Как и в случае ИМП, для постановки диагноза важны анамнез пациента и обследование.Пациенты с гнойным дренажом с большей вероятностью будут инфицированы S. aureus , , а пациенты с негнойным целлюлитом с большей вероятностью будут инфицированы стрептококками группы А. 36

Инфекции костей и суставов

Бактериальные инфекции суставов и костей могут возникать при попадании бактерий из крови, протезов, травм или распространения кожной инфекции. Знание источника может помочь предсказать, какие бактерии могут быть причиной. Типичные симптомы совместных инфекций включают лихорадку, болезненные и опухшие суставы, болезненность и уменьшение диапазона движений. 37 Пациенты с протезами суставов или недавними операциями на суставах (обычно <3 месяцев) более подвержены инфекциям суставов. 38 Совместные инфекции диагностируются с помощью посевов синовиальной жидкости, из которых жидкость берется во время операции или путем аспирации. Повышенное количество лейкоцитов (WBC) в синовиальной жидкости, особенно когда количество превышает 50 000 клеток / мм 3 , может помочь в исключении (специфичность 90%), но не исключить (чувствительность 56%) инфекции суставов. 39 Окраска по Граму также имеет низкую чувствительность (45–71%) для диагностики инфекций суставов.Наконец, оценка содержания белка или глюкозы в синовиальной жидкости не помогает в диагностике. Пациенты с остеомиелитом обычно проявляют симптомы лихорадки, вялости, воспаления, эритемы и отека. 40 Посевы костной биопсии и рентгенограммы играют важную роль в диагностике остеомиелита, наряду с выявлением возбудителя. Также могут быть взяты посевы крови для определения организма при гематогенном остеомиелите. Наконец, у пациентов обычно наблюдается повышенное количество лейкоцитов, повышенная скорость оседания эритроцитов и повышенный уровень С-реактивного белка, хотя их нельзя использовать в диагностике без посева. 41

Культуры спинномозговой жидкости

Культуры спинномозговой жидкости (ЦСЖ) играют важную роль в диагностике менингита. 42 Культуры спинномозговой жидкости, связанные с нелеченым бактериальным менингитом, обычно показывают повышенное количество лейкоцитов (> 1000 клеток / мм 3 ), хотя может наблюдаться более низкое количество лейкоцитов. Повышение количества лейкоцитов также может произойти, если люмбальная пункция травматична. Общее правило состоит в том, что каждые 1000 эритроцитов в спинномозговой жидкости увеличивают количество лейкоцитов в спинномозговой жидкости на единицу. 43 Нейтрофилы обычно> 80%, хотя у 10% пациентов можно увидеть лимфоциты> 50%. Кроме того, при бактериальном менингите культуры спинномозговой жидкости часто имеют высокое содержание белка (> 0,9 г / л), поскольку белок имеет повышенное проникновение в спинномозговую жидкость при воспалении менингеальной оболочки. 44 При бактериальном менингите глюкоза утилизируется бактериями; следовательно, можно увидеть низкий уровень глюкозы в спинномозговой жидкости (<40 мг / дл) или соотношение между глюкозой в спинномозговой жидкости и глюкозой в сыворотке (≤ 40%). Давление открытия при люмбальной пункции также может быть выше 200 мм H 2 O. 43 Окраска по Граму полезна для диагностики пациентов с бактериальным менингитом, особенно с большим количеством бактерий. Сообщается, что в некоторых случаях специфичность окраски по Граму достигает 97%. Наконец, полимеразная цепная реакция (ПЦР) обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может использоваться для исключения бактериального менингита, если окраска ЦСЖ по Граму и культура отрицательны. 45

Культуры кала

Посевы кала могут быть рассмотрены у пациентов, которые поступают с постоянной диареей или кровавой диареей или которые недавно побывали в районах с плохой общественной системой санитарии.Достаточно получить один посев кала, и он может обнаружить патоген в 87–94% случаев. 46 Лаборатории регулярно проводят скрининг бактерий, таких как Salmonella, Shigella, E. coli и Campylobacter , в культурах стула. Кроме того, исследование Clostridium difficile может быть рассмотрено у пациентов с факторами риска инфекции, такими как принимавшие антибиотики в течение последних двух месяцев, имеющие более двух несформированных испражнений за 24 часа, увеличение количества лейкоцитов, ухудшение функции почек и снижение альбумина. 47 Существует несколько тестов для обнаружения C. difficile . Чаще всего эти тесты включают иммуноферментный анализ на токсины A и B, иммуноферментный анализ на глутаматдегидрогеназу (GDH) и молекулярный анализ. Большинство лабораторий сначала проводят иммуноанализ на токсины A и B, обычно одновременно с анализом GDH. Совместное использование этих двух тестов имеет высокую специфичность (97% или выше), но чувствительность тестов ниже (41–92%). 48 , 49 Если иммуноферментный анализ на токсины A и B, а также GDH положительны, то C.difficile скорее всего . Если один из них положительный, а другой отрицательный, следует провести дальнейшее тестирование с помощью молекулярных анализов, так как это может улучшить чувствительность и специфичность. Тестирование после разрешения бесполезно, так как посев кала будет оставаться положительным в течение нескольких недель после заражения.

РАННЕЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ

Важно проводить тестирование на чувствительность к антибиотикам, поскольку оно помогает врачам выбрать подходящую схему лечения инфекции.Различные подходы к ранней идентификации бактерий включают окрашивание по Граму, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF), ПЦР, технологию зондов с наночастицами и флуоресценцию пептидных нуклеиновых кислот in situ (PNA-FISH).

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму — это диагностический тест, который дает раннее выявление потенциальных бактерий посредством визуализации бактерий. Окраска по Граму помогает дифференцировать организм, будь то грамположительные или грамотрицательные. 50 Грамположительные бактерии имеют пурпурный цвет, а грамотрицательные — розовый. Кроме того, форма, расположение и размер организма могут предоставить дополнительную информацию, которая поможет идентифицировать организм. Обычно при окрашивании по Граму видны кокки, похожие на сферы; бациллы, напоминающие палочки; или коккобациллы, которые представляют собой комбинацию этих двух. Кокки могут быть расположены в виде узоров, таких как группы или цепочки; например, виды Staphylococcus появляются в виде грамположительных кокков в скоплениях.Размер может помочь микробиологу различать бациллы, хотя врачу об этом нечасто сообщают.

Для окрашивания по Граму технический специалист наносит бактерии на предметное стекло, а затем пропускает его над пламенем, чтобы убедиться, что бактерии остаются на предметном стекле. Затем наносится кристально-фиолетовый краситель, который окрашивает все бактерии в пурпурный цвет. Затем применяется йод, который помогает красителю связываться с пептидогликановым слоем клеточной стенки, а затем ацетон, который смывает краситель. Пурпурный краситель остается на грамположительных бактериях в результате прочной связи между бактериями и толстым пептидогликановым слоем, но он смывается с грамотрицательных бактерий, которые имеют тонкий пептидогликановый слой.Наконец, применяется краситель, такой как сафранин, который окрашивает грамотрицательные бактерии в розовый цвет. 51 Другие тесты могут быть выполнены для дальнейшей дифференциации бактерий. Чашки с агаром MacConkey можно использовать для дифференциации грамотрицательных бактерий, ферментирующих лактозу, и бактерий, не ферментирующих лактозу. Тест на коагулазу можно использовать для дифференциации между Staphylococcus aureus и другими видами стафилококков . Если тест на коагулазу положительный, вероятно, это бактерии. Staphylococcus aureus ; если он отрицательный, вероятнее всего, это бактерии Staphylococcus epidermis или Staphylococcus saprophyticus.

Понимание закономерностей предварительного роста организмов может помочь клиницистам выбрать подходящий антибиотик. Блок-схема предназначена для помощи в предварительной идентификации бактерий. Однако чувствительность и специфичность окраски по Граму могут широко варьироваться; поэтому перед деэскалацией проводится дальнейшая микробиологическая идентификация. 52 , 53 Тем не менее, окраска по Граму является полезным инструментом при проведении эмпирической терапии до получения окончательных результатов посева.

Классификация распространенных грамположительных и грамотрицательных бактерий

Быстрые диагностические тесты

Быстрые диагностические тесты могут помочь в более быстром выявлении и снижении эскалации антибиотикотерапии. Фармацевты сыграли решающую роль в предоставлении поставщикам рекомендаций на основе этих тестов. 54 , 55 Эти системы быстрой диагностики включают MALDI-TOF, ПЦР, PNA-FISH и технологию датчиков наночастиц. MALDI-TOF можно объяснить, разложив аббревиатуру.Для выполнения MALDI-TOF образец выращивают на чашке с агаром и помещают на чашку MALDI, после чего добавляют матрицу. MA trix помогает преобразовать L asser в тепло, которое заставляет образец превращаться в D esorb с пластины и образовывать I onized молекулы. Молекулы превращаются в газ, который затем летит в лампу T ime- O f- F в зависимости от их размера и заряда. Молекулы с меньшим отношением размера к заряду движутся быстрее, что создает спектр, основанный на размере и заряде молекул.Этот спектр соответствует библиотекам спектров для известного организма, такого как Escherichia coli . Спектры также коррелируют со значением баллов на машине MALDI-TOF, которое указывает вероятность правильного определения тестируемого рода и / или вида. 56 Основным преимуществом MALDI-TOF является быстрая (менее пяти часов) идентификация бактерий. Однако в настоящее время тест не предоставляет информации о чувствительности и не может обнаружить гетерорезистентность.Гетерорезистентность возникает, когда субпопуляция бактериальных клеток проявляет более высокую устойчивость к антибиотикам, чем остальная часть культуры. 57

Альтернативным методом быстрой идентификации является ПЦР, которая работает путем создания множественных копий сегментов ДНК, используемых для идентификации бактерий. Для проведения ПЦР необходимы сегмент ДНК, нуклеотиды, полимераза и праймер. 58 ДНК нагревается, в результате чего она расщепляется на две отдельные нити. Эти нити праймируются, а затем полимераза создает новые нити ДНК, используя нуклеотиды.Процесс повторяется для создания нескольких копий сегментов ДНК, которые можно анализировать для идентификации микроба. Преимущества ПЦР включают быструю идентификацию (менее одного часа) бактерий и способность обнаруживать бактерии, пока пациент находится на антибактериальной терапии. Но этот метод также имеет некоторые ограничения, поскольку ПЦР может обнаруживать бактерии, которые становятся нежизнеспособными после лечения пациента от инфекции. 59 Кроме того, точность может снизиться при полимикробных инфекциях. Мультиплексная ПЦР, расширение ПЦР, решает эту проблему за счет использования нескольких праймеров, что позволяет идентифицировать несколько бактерий.Это также позволяет обнаруживать гены устойчивости к антибиотикам.

Технология наночастиц также использует ДНК для идентификации бактерий. Этот тест, в котором используются наносетки (слайды, покрытые ДНК) для связывания с грамположительной или грамотрицательной ДНК, используется только у пациентов с положительными культурами крови. 60 Когда происходит связывание, прикрепляются наночастицы золота, затем раствор смывается с предметного стекла, и раствор связывается с золотом. Свет, проходящий через слайды, позволяет визуализировать серебро, рассеивая свет в камере.Преимущества этого теста заключаются в быстрой идентификации (менее трех часов) большого количества бактерий и механизмов устойчивости. Его ограничения включают требование положительного посева крови и тот факт, что не все потенциальные патогены можно идентифицировать.

В отличие от ПЦР и технологии нанозондов-частиц, которые идентифицируют бактерии путем обнаружения ДНК, PNA-FISH идентифицирует бактерии с помощью зондов для идентификации рибосомной РНК. PNA-FISH также можно объяснить, разложив аббревиатуру.В этой процедуре зонды F люоресцентные p eptide- n ucleic a cid ( PNA ) наносят на бактерии, закрепленные на предметном стекле. 61 Эти зонды H гибридизуются (связываются) с рибосомной РНК и просматриваются под флуоресцентным микроскопом в реальном времени ( I n S itu) . Преимущества PNAFISH включают быстрое обнаружение (менее одного часа), возможность идентифицировать бактерии, которые труднее выращивать традиционными методами (анаэробы, виды Mycoplasma ) и меньшую стоимость по сравнению с ПЦР.Основным недостатком PNA-FISH является то, что исследователь должен предвидеть потенциальные бактерии, поскольку разные бактерии имеют разные наборы. Информация о окраске по Граму может помочь в выборе подходящего набора. Таким образом, если росли лактозоположительные грамотрицательные бациллы, технический специалист выбрал бы набор для использования с E. Coli / P. Aeruginosa . Кроме того, PNA-FISH может обнаруживать лекарственную устойчивость только в том случае, если возникают мутации с рибосомной РНК.

ОБЫЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ И ТЕСТИРОВАНИЕ НА АНТИБИОТИКУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ

Обычная идентификация бактерий заключается в окрашивании по Граму с последующей идентификацией бактерий и тестированием на чувствительность к антибиотикам.Процесс от начала до конца может занять до пяти дней, что может задержать время до деэскалации антибиотиков. 59 Стандарты чувствительности к антибиотикам в США определяются Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), что в основном относится к стандартам, установленным Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). Стандарты могут отличаться в других странах, что может привести к расхождениям в определении чувствительности к антибиотикам; это привело к созданию Национального комитета по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам США (USCAST).Этот комитет работает с Комитетом Европейского Союза по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам, чтобы нормализовать стандарты на международном уровне. Для определения чувствительности к антибиотикам используются количественные данные, которые далее разбиваются на качественные категории, как показано на рис.

Таблица 1

Окончательный отчет о чувствительности к антибиотикам для Klebsiella Pneumoniae

3 3

Amikill

Cefazolin Cefazolin

≥ 64

9 0353 R

МИК (мкг / мл) Интерпретация
≥ 32 R
Ампициллин / Сульбактам 16 I
Цефазолин ≥ 64 R
R
Ципрофлоксацин ≥ 64 R
ESBL * NEG
Gentamicin

Gentamicin

1 S
Пиперациллин ≥ 128
Пиперациллин / тазобактам 1.5 S
Тигециклин ≤ 0,5 S
Тобрамицин 8 I
Испытание на триметоприм / сульфаметоксазол выполняется путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК). МПК — это самая низкая концентрация антибиотика, необходимая для подавления роста организма. Самый низкий МПК не всегда коррелирует с наиболее эффективным лечением, поскольку разные антибиотики достигают разных концентраций в разных местах. 62 Для определения качественных категорий используются конкретные значения МИК, также известные как контрольные точки, для классификации бактерий как чувствительных, промежуточных или устойчивых к определенному антибиотику. Для определения контрольных точек CLSI использует фармакокинетические, фармакодинамические механизмы, механизмы резистентности и клинические данные.

CLSI определяет как чувствительные те изоляты, которые ингибируются типичными достижимыми концентрациями антибиотика при использовании дозировки, рекомендованной для лечения очага инфекции. 63 Дозозависимая чувствительная категория определяется, когда требуется режим дозирования, который приводит к большему воздействию лекарственного средства, чем тот, который используется в чувствительной категории для достижения клинической эффективности. Промежуточная категория включает изоляты, которые достигают обычно достижимых уровней в крови и тканях с помощью антибиотиков, а показатели ответа ниже, чем у чувствительных изолятов. Наконец, категория резистентности включает изоляты, которые не ингибируются обычными достижимыми концентрациями антибиотиков или для которых вероятны механизмы резистентности, а клиническая эффективность антибиотиков достоверно не доказана.

Тестирование диффузии

Дисковая диффузия, или метод Кирби-Бауэра, является распространенным тестом, используемым для определения чувствительности к антибиотикам (см.). При тестировании диффузии диск с антибиотиком помещается на пластину с агаром, содержащую бактерии. Планшет инкубируют до 24 часов, и в течение этого времени антибиотик диффундирует по всему планшету, образуя градиент концентрации, окружающий диск. 64 Чем меньше концентрация антибиотика, тем выше вероятность роста бактерий.Диаметр области, на которой нет роста, измеряется для определения восприимчивости в соответствии с рекомендациями CLSI. Большие зоны указывают на снижение роста бактерий с большей чувствительностью к антибиотикам, тогда как меньшие зоны показывают усиленный рост бактерий с меньшей чувствительностью к антибиотикам. Если антибиотик не подавляет рост, зоны подавления нет, следовательно, бактерии устойчивы.

Дисковая диффузия (метод Кирби-Бауэра)

Тестирование разведения

Обычные тесты разведения включают разведение в бульоне и разведение в агаре.В обоих тестах бактерии помещают на несколько планшетов, пробирок или лунок, содержащих определенную концентрацию антибиотика. 64 Например, максимальная концентрация антибиотика в наборе лунок может составлять 4,0 мкг / мл. Следующая лунка после одного разведения будет иметь концентрацию 2,0 мкг / мл, затем 1,0 мкг / мл после двух разведений и 0,5 мкг / мл после трех разведения. Пример микроразбавления бульона показан на, а разведение в агаре показано на. Результаты теста на разведение могут отличаться, и обычно бывает однократная ошибка разведения.Например, если определено, что МИК составляет 1 мкг / мл, истинный диапазон МИК может составлять от 0,5 до 2 мкг / мл. Это может быть проблематично, если диапазон включает чувствительные и промежуточные значения MIC.

Разведение бульона состоит из микроразведения и макроразведения. Несмотря на то, что они похожи, методы различаются в первую очередь модальностью, которая используется для проведения теста на чувствительность (лунки или пробирки). 65 Микроразбавление бульона выполняется путем помещения различных антибиотиков с разной концентрацией в лунки, содержащие жидкую среду, как показано на рис.Бактерии добавляются в каждую лунку, и лоток инкубируется. Присутствие бактериального роста затем определяется путем визуального осмотра планшета. МИК теста на микроразбавление бульона определяют, когда при использовании определенного антибиотика роста не наблюдается. Преимущество этого теста в том, что одновременно можно тестировать более одного антибиотика. Недостатки заключаются в том, что разбавление бульона требует больших затрат труда и времени, а также могут возникать потенциальные процедурные ошибки.

Тест на разведение в агаровой среде аналогичен тесту на разведение в бульоне, с основным отличием в том, что в нем используются физические среды, а не жидкие среды.Разбавление агара выполняется путем помещения стандартных концентраций организма на чашки с агаром, которые различаются по концентрации антибиотика, как показано на рис. 64 МИК определяют в первой пробирке, которая не демонстрирует роста организма. Этот тест обычно используется при тестировании нескольких бактерий против определенного антибиотика. Разбавление агара также является трудоемким и требует много времени, и при этом нельзя тестировать более одного антибиотика за раз. 65

Комбинированное тестирование диффузии и разведения

Е-тест — это количественный тест, сочетающий методы диффузии и разведения. 64 Вместо диска в тесте используется тест-полоска E-test, содержащая антибиотик, который диффундирует через пластину с агаром, содержащую бактерии. Вдоль полоски имплантирован антибиотик различной концентрации (). В отличие от тестирования разбавления, различия в концентрации не отличаются друг от друга на одно разведение; вместо этого они расположены ближе друг к другу, что может обеспечить большую точность. После инкубации планшета в течение 24 часов зона ингибирования образует эллипс и пересекает полосу на планшете.Точка пересечения определяет значение MIC. E-тест является преимуществом, потому что стабильный градиент используется с более высоким посевом бактерий, что позволяет более точно считывать значения MIC. Недостатки в том, что на полосках можно тестировать только один антибиотик, а тест может быть дорогостоящим и трудоемким.

Автоматизированные системы

Преимущество автоматизированных систем состоит в том, что они менее трудозатратны и позволяют быстрее составлять отчеты о результатах. 66 Эти системы в основном используют принципы разведения для определения чувствительности к антибиотикам.Полностью автоматические системы вводят бактерии в панель, инкубируют их, затем считывают и интерпретируют результаты чувствительности. Автоматические тесты определяют МПК с помощью алгоритмов и разрешают правила, предсказывающие устойчивость к другим антибиотикам. Кроме того, эти системы могут сохранять результаты для использования при создании антибиотиков вместе с другими отчетами. FDA устанавливает стандарты для утверждения автоматизированных систем, которые включают уровень ложной устойчивости менее 3% и ложной восприимчивости менее 1.5% на нижней границе 95% доверительного интервала (ДИ) и менее 7,5% на верхней границе 95% доверительного интервала. 67 Они также должны согласиться, в пределах одного разведения, на контрольную точку излома более чем в 90% случаев. Доступны различные автоматизированные системы, включая VITEK 2, Microscan Walkaway plus, Phoenix и Sensititre. Каждая система имеет множество панелей, которые тестируют разные бактерии и разные комбинации лекарств. Хотя ошибки могут возникать, это происходит на уровне комбинации лекарств и бактерий.Если ожидаются ошибки, результаты следует подтвердить ручным тестированием. Каждая система постоянно обновляется и может работать по-разному в зависимости от комбинации препарата и бактерий, что затрудняет рекомендацию одной системы по сравнению с другой.

In vitro по сравнению с In vivo Результаты

Антибиотики могут не дать излечения в клинических условиях ( in vivo, ), несмотря на демонстрацию чувствительности в лабораторных условиях ( in vitro, ). Это может происходить в результате механизмов резистентности, выработки токсинов или фармакокинетических и фармакодинамических свойств антибиотиков.Эта статья посвящена механизмам резистентности, и читатели могут обратиться к обзорам токсинов, фармакокинетики и фармакодинамики для получения дополнительной информации. 68 , 69 Резистентность может развиться во время лечения пациента антибиотиками; это было хорошо задокументировано с помощью клиндамицина. 70 D-тест на клиндамицин, использующий принцип дисковой диффузии, может помочь выявить индуцибельную резистентность к клиндамицину у гемолитических стрептококков S. aureus и β .Для проведения теста диск, содержащий клиндамицин и эритромицин, помещают на тот же планшет и планшеты инкубируют. Если зона подавления отображается в виде круга, индуцируемого сопротивления нет; если он отображается как «D», имеется индуцируемое сопротивление.

По мере развития новых механизмов устойчивости лабораториям необходимо разработать новые способы обнаружения устойчивости. Одним из примеров этого является обнаружение бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и / или бета-лактамазы AmpC. 71 , 72 БЛРС — это ферменты, расщепляющие многие бета-лактамные антибиотики, что делает их неэффективными.Они с большей вероятностью присутствуют в грамотрицательных бактериях, связанных с инфекциями, связанными со здоровьем. Для выявления БЛРС проводится скрининг путем тестирования определенных антибиотиков, таких как цефотаксим, с последующим добавлением клавулановой кислоты. Если скрининг БЛРС проводится с использованием микроразбавления бульона, МИК сравнивается между цефотаксимом и цефотаксимом плюс клавулановая кислота. Если при добавлении клавулановой кислоты наблюдается трехкратное изменение МИК при разведении, БЛРС присутствует. Например, если МИК составляет 2 мкг / мл для одного цефотаксима и снижается до 0.5 мкг / мл при добавлении клавулановой кислоты свидетельствует о наличии БЛРС. Интерпретация ESBL может быть дополнительно осложнена присутствием другой бета-лактамазы, AmpC. Это может привести к ложноотрицательному скринингу на БЛРС, но его можно обнаружить с помощью Е-теста. В будущем, вероятно, будут выявлены новые механизмы резистентности, которые создадут новые проблемы в достижении клинического излечения.

Руководство по идентификации бактериальных культур и интерпретации результатов

Реферат

Цель

Предоставить руководство по интерпретации результатов бактериальных культур.

Методы

Исследования были выявлены с помощью поиска в литературе PubMed (с 1966 по январь 2018). Поисковые запросы включали тесты на микробную чувствительность, микробную устойчивость к лекарственным препаратам и противоинфекционные агенты / фармакологию. Статьи включались, если они были опубликованы на английском языке. Также были проанализированы ссылки в указанных статьях.

Результаты

В этой статье рассмотрены основные концепции интерпретации результатов бактериальных посевов, включая время посева, общие места посева, возможность контаминации, интерпретацию окраски по Граму, роль быстрых диагностических тестов, стандартное тестирование чувствительности к антибиотикам и автоматическое тестирование.

Заключение

Это руководство может помочь фармацевтам в их роли в качестве неотъемлемых членов группы управления антимикробными препаратами в усилиях по улучшению ухода за пациентами.

Ключевые слова: тесты микробной чувствительности, микробная лекарственная устойчивость, противоинфекционные агенты / фармакология, фармакокинетика

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время существует нехватка фармацевтов, обученных инфекционным заболеваниям, для заполнения должностей по управлению антимикробными препаратами в Соединенных Штатах.Это означает, что фармацевты на различных других должностях должны взять на себя эти роли, чтобы улучшить назначение соответствующих антибиотиков. 1 Исследования показывают, что в условиях стационара примерно 50% пациентов получают хотя бы один антибиотик во время пребывания в стационаре, 30% из которых включают антибиотики широкого спектра действия. 2 5 Сообщается, что нецелевое использование антибиотиков достигает 50%, хотя оценки могут варьироваться в зависимости от учреждения и от того, как определяется термин «уместность». 6 9 Неправильное использование может привести к усилению побочных эффектов, вторичным инфекциям, лекарственным взаимодействиям, дополнительным расходам, увеличению продолжительности пребывания в больнице и повторной госпитализации. Кроме того, может развиться резистентность бактерий, что может привести к неэффективности лечения. 9 , 10 В этой статье рассматриваются сроки посева, общие места посева, интерпретация окраски по Граму, роль экспресс-тестов, обычных тестов на чувствительность к антибиотикам и автоматизированного тестирования.На протяжении всей статьи мы используем термин антибиотик вместо противомикробный , поскольку мы не охватывали тестирование вирусов или грибков.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУР

Медицинские работники должны быстро получить посевы для проведения терапии, одновременно принимая во внимание важность быстрого введения антибиотиков. 11 Руководящие принципы Кампании по борьбе с сепсисом 2016 г. рекомендуют вводить антибиотики в течение одного часа после постановки диагноза сепсиса и чтобы посевы не откладывали введение антибиотиков более чем на 45 минут. 12 У пациентов с сепсисом введение соответствующих антибиотиков в течение одного часа может снизить смертность. 13 Получение посевов перед введением антибиотиков может помочь клиницистам определить возбудителя болезни, что позволит снизить эскалацию за счет надлежащего лечения. Если посевы отбираются после введения антибиотика, может наблюдаться снижение результатов посева крови, что может увеличить стоимость и продолжительность пребывания пациента. 14 16

Культуры можно получить из участков, которые либо заселены бактериями, либо стерильны.Колонизированные бактериями увеличивают риск заражения нормальной флорой и могут привести к ложным результатам . Сайты, которые обычно считаются стерильными, включают спинномозговую жидкость, кровь и перикардиальную жидкость. Места, которые хорошо известны заражением, включают мокроту и носовые ходы. 17 Неправильная техника сбора посевов может также увеличить риск заражения. Ниже приведены рекомендации по интерпретации результатов для крови, дыхательных путей, мочи, кожи и мягких тканей, костей и суставов, спинномозговой жидкости и посевов стула.

Культуры крови

При оценке культур крови важно различать бактериемию и контаминацию. Заражение происходит, когда в собранный образец попадают бактерии из внешнего источника. 18 Например, нормальные кожные бактерии могут быть занесены при проведении венепункции с помощью одной иглы. Бактерии также могут присутствовать в медицинских устройствах, таких как центральные венозные катетеры. Центральные венозные катетеры связаны с более высоким уровнем заражения, чем венопункция.Темпы выявления загрязнителей растут, поскольку новые методы тестирования улучшают идентификацию бактерий даже в небольших количествах.

При оценке потенциального заражения клиницист должен оценить клинические проявления пациента и определить, проявляет ли он или она признаки и симптомы бактериемии. Например, если у пациента была гипотензия, тахикардия и лихорадка, это может указывать на наличие бактериемии. Кроме того, очень важно брать как минимум два образца с разных участков тела.Вторым участком часто является центральный венозный катетер, если он есть. Если в одной из двух культур растет организм, который считается вероятным контаминантом, необходимы повторные посевы. И наоборот, если один и тот же организм выращивается в нескольких образцах, результатом обычно является настоящая бактериемия. 19 , 20 Только одна положительная культура необходима, чтобы предположить истинную инфекцию у пациентов с грамотрицательными бактериями. 21 Грамположительные бактерии, особенно виды Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium , с большей вероятностью могут быть контаминантами. 22 Одно исследование по оценке 500 посевов крови показало, что видов Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium были контаминантами в 94% и 79% случаев соответственно. Однако в таких популяциях, как пациенты с ослабленным иммунитетом, эти две бактерии могут представлять настоящую инфекцию. Грамположительные бактерии, ассоциированные с истинной инфекцией, включают Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae . Повторные посевы должны быть взяты, чтобы гарантировать разрешение бактериемии.

Респираторные культуры

Для диагностики пневмонии многие клиницисты заказывают посев мокроты, эндотрахеальный аспират и, реже, бронхоальвеолярный лаваж. Они выполняются в дополнение к оценке признаков и симптомов (кашель, лихорадка, выделение мокроты, плевритная боль в груди) и рентгенографии грудной клетки. 23 Посев мокроты может быть трудно интерпретировать, потому что верхние дыхательные пути колонизированы бактериями, в отличие от нижних дыхательных путей, которые обычно стерильны. 24 Сообщения о чувствительности и специфичности посевов мокроты широко различаются. 23 Если получена культура мокроты, необходимо отметить наличие эпителиальных клеток, которые могут указывать на загрязнение культуры. Культуры мокроты должны содержать менее 10 эпителиальных клеток на поле с малым увеличением. В определенных группах пациентов, например, с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), у которых наблюдается обострение, следует избегать посева мокроты. 25 Вместо того, чтобы использовать такие культуры для определения наличия инфекции, в рекомендациях Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких 2017 рекомендуется оценивать симптомы пациента, такие как выделение мокроты, гнойность и одышка.У пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, посевы обычно получают путем эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа. Эндотрахеальная аспирация имеет меньшую специфичность, чем бронхоальвеолярный лаваж для диагностики пневмонии, хотя она имеет меньше осложнений и более низкую стоимость. 26 Эта более низкая специфичность может привести к более высокому использованию антибиотиков. Рекомендации различаются в зависимости от предпочтения эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа, поскольку выбор основан на деэскалации антибиотиков или стоимости и осложнениях этих методов. 27 , 28 Клиницисты должны руководствоваться стандартами своего учреждения, когда рекомендуют эндотрахеальную аспирацию или бронхоальвеолярный лаваж.

Посев мочи

Посев мочи следует отбирать только при подозрении на инфекцию, обычно при наличии симптомов, о которых сообщает пациент. 29 Типичные симптомы инфекции мочевыводящих путей включают дизурию, частоту и неотложность позывов, хотя пациенты с деменцией могут проявлять неспецифические признаки, такие как усталость и изменения психического статуса. 30 У пациентов с мочевыми катетерами симптомы носят более общий характер и могут включать лихорадку, слабость и изменение психического статуса. 31 Скрининг бессимптомной бактериурии следует проводить только у беременных или у пациентов, подвергающихся урологическим процедурам. 29 При обследовании пациента с потенциальной инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) следует оценивать посев мочи вместе с симптомами и анализом мочи. Десять или более лейкоцитов на микролитр в анализе мочи связаны с диагнозом ИМП, но это не должно быть единственным критерием, используемым для диагностики.Культуры у пациентов без мочевых катетеров лучше всего собирать на полпути, чтобы избежать заражения. В посеве мочи количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл является оценкой количества бактерий в образце. Более 10 3 КОЕ на мл в посеве мочи связано с инфекцией. Однако истинная инфекция может возникать у пациентов с более низкими КОЕ при наличии симптомов и лейкоцитов в моче. 32 Пациенты с катетер-ассоциированными ИМП также имеют более низкие КОЕ.И наоборот, более высокое количество КОЕ может иметь место в присутствии контаминантов и после неправильно взятого образца. Бактерии, которые обычно не наблюдаются при ИМП, могут быть вызваны контаминацией, за исключением случаев, когда у пациента есть факторы риска для других типов бактерий и образец не собирается надлежащим образом. Обычные бактерии при неосложненных ИМП включают видов Escherichia coli , видов Klebsiella , видов Proteus и Staphylococcus saprophyticus .

Инфекции кожи и мягких тканей

Американское общество инфекционных болезней (IDSA) рекомендует делать посевы на абсцессы и карбункулы, хотя они упоминают эмпирическое лечение без посева как разумное. 33 При целлюлите IDSA рекомендует проводить посев крови только при наличии у пациента определенных факторов. К этим факторам относятся: иммуносупрессия, злокачественные новообразования, укусы животных и / или иммерсионные травмы. 34 Посев на поверхность кожи следует получать только при гнойном дренаже. Получение кожных культур при инфекциях без дренажа часто приводит к выявлению полимикробных организмов, которые не являются причиной инфекции, что приводит к чрезмерно широкому лечению. 35 Как и в случае ИМП, для постановки диагноза важны анамнез пациента и обследование.Пациенты с гнойным дренажом с большей вероятностью будут инфицированы S. aureus , , а пациенты с негнойным целлюлитом с большей вероятностью будут инфицированы стрептококками группы А. 36

Инфекции костей и суставов

Бактериальные инфекции суставов и костей могут возникать при попадании бактерий из крови, протезов, травм или распространения кожной инфекции. Знание источника может помочь предсказать, какие бактерии могут быть причиной. Типичные симптомы совместных инфекций включают лихорадку, болезненные и опухшие суставы, болезненность и уменьшение диапазона движений. 37 Пациенты с протезами суставов или недавними операциями на суставах (обычно <3 месяцев) более подвержены инфекциям суставов. 38 Совместные инфекции диагностируются с помощью посевов синовиальной жидкости, из которых жидкость берется во время операции или путем аспирации. Повышенное количество лейкоцитов (WBC) в синовиальной жидкости, особенно когда количество превышает 50 000 клеток / мм 3 , может помочь в исключении (специфичность 90%), но не исключить (чувствительность 56%) инфекции суставов. 39 Окраска по Граму также имеет низкую чувствительность (45–71%) для диагностики инфекций суставов.Наконец, оценка содержания белка или глюкозы в синовиальной жидкости не помогает в диагностике. Пациенты с остеомиелитом обычно проявляют симптомы лихорадки, вялости, воспаления, эритемы и отека. 40 Посевы костной биопсии и рентгенограммы играют важную роль в диагностике остеомиелита, наряду с выявлением возбудителя. Также могут быть взяты посевы крови для определения организма при гематогенном остеомиелите. Наконец, у пациентов обычно наблюдается повышенное количество лейкоцитов, повышенная скорость оседания эритроцитов и повышенный уровень С-реактивного белка, хотя их нельзя использовать в диагностике без посева. 41

Культуры спинномозговой жидкости

Культуры спинномозговой жидкости (ЦСЖ) играют важную роль в диагностике менингита. 42 Культуры спинномозговой жидкости, связанные с нелеченым бактериальным менингитом, обычно показывают повышенное количество лейкоцитов (> 1000 клеток / мм 3 ), хотя может наблюдаться более низкое количество лейкоцитов. Повышение количества лейкоцитов также может произойти, если люмбальная пункция травматична. Общее правило состоит в том, что каждые 1000 эритроцитов в спинномозговой жидкости увеличивают количество лейкоцитов в спинномозговой жидкости на единицу. 43 Нейтрофилы обычно> 80%, хотя у 10% пациентов можно увидеть лимфоциты> 50%. Кроме того, при бактериальном менингите культуры спинномозговой жидкости часто имеют высокое содержание белка (> 0,9 г / л), поскольку белок имеет повышенное проникновение в спинномозговую жидкость при воспалении менингеальной оболочки. 44 При бактериальном менингите глюкоза утилизируется бактериями; следовательно, можно увидеть низкий уровень глюкозы в спинномозговой жидкости (<40 мг / дл) или соотношение между глюкозой в спинномозговой жидкости и глюкозой в сыворотке (≤ 40%). Давление открытия при люмбальной пункции также может быть выше 200 мм H 2 O. 43 Окраска по Граму полезна для диагностики пациентов с бактериальным менингитом, особенно с большим количеством бактерий. Сообщается, что в некоторых случаях специфичность окраски по Граму достигает 97%. Наконец, полимеразная цепная реакция (ПЦР) обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может использоваться для исключения бактериального менингита, если окраска ЦСЖ по Граму и культура отрицательны. 45

Культуры кала

Посевы кала могут быть рассмотрены у пациентов, которые поступают с постоянной диареей или кровавой диареей или которые недавно побывали в районах с плохой общественной системой санитарии.Достаточно получить один посев кала, и он может обнаружить патоген в 87–94% случаев. 46 Лаборатории регулярно проводят скрининг бактерий, таких как Salmonella, Shigella, E. coli и Campylobacter , в культурах стула. Кроме того, исследование Clostridium difficile может быть рассмотрено у пациентов с факторами риска инфекции, такими как принимавшие антибиотики в течение последних двух месяцев, имеющие более двух несформированных испражнений за 24 часа, увеличение количества лейкоцитов, ухудшение функции почек и снижение альбумина. 47 Существует несколько тестов для обнаружения C. difficile . Чаще всего эти тесты включают иммуноферментный анализ на токсины A и B, иммуноферментный анализ на глутаматдегидрогеназу (GDH) и молекулярный анализ. Большинство лабораторий сначала проводят иммуноанализ на токсины A и B, обычно одновременно с анализом GDH. Совместное использование этих двух тестов имеет высокую специфичность (97% или выше), но чувствительность тестов ниже (41–92%). 48 , 49 Если иммуноферментный анализ на токсины A и B, а также GDH положительны, то C.difficile скорее всего . Если один из них положительный, а другой отрицательный, следует провести дальнейшее тестирование с помощью молекулярных анализов, так как это может улучшить чувствительность и специфичность. Тестирование после разрешения бесполезно, так как посев кала будет оставаться положительным в течение нескольких недель после заражения.

РАННЕЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ

Важно проводить тестирование на чувствительность к антибиотикам, поскольку оно помогает врачам выбрать подходящую схему лечения инфекции.Различные подходы к ранней идентификации бактерий включают окрашивание по Граму, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF), ПЦР, технологию зондов с наночастицами и флуоресценцию пептидных нуклеиновых кислот in situ (PNA-FISH).

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму — это диагностический тест, который дает раннее выявление потенциальных бактерий посредством визуализации бактерий. Окраска по Граму помогает дифференцировать организм, будь то грамположительные или грамотрицательные. 50 Грамположительные бактерии имеют пурпурный цвет, а грамотрицательные — розовый. Кроме того, форма, расположение и размер организма могут предоставить дополнительную информацию, которая поможет идентифицировать организм. Обычно при окрашивании по Граму видны кокки, похожие на сферы; бациллы, напоминающие палочки; или коккобациллы, которые представляют собой комбинацию этих двух. Кокки могут быть расположены в виде узоров, таких как группы или цепочки; например, виды Staphylococcus появляются в виде грамположительных кокков в скоплениях.Размер может помочь микробиологу различать бациллы, хотя врачу об этом нечасто сообщают.

Для окрашивания по Граму технический специалист наносит бактерии на предметное стекло, а затем пропускает его над пламенем, чтобы убедиться, что бактерии остаются на предметном стекле. Затем наносится кристально-фиолетовый краситель, который окрашивает все бактерии в пурпурный цвет. Затем применяется йод, который помогает красителю связываться с пептидогликановым слоем клеточной стенки, а затем ацетон, который смывает краситель. Пурпурный краситель остается на грамположительных бактериях в результате прочной связи между бактериями и толстым пептидогликановым слоем, но он смывается с грамотрицательных бактерий, которые имеют тонкий пептидогликановый слой.Наконец, применяется краситель, такой как сафранин, который окрашивает грамотрицательные бактерии в розовый цвет. 51 Другие тесты могут быть выполнены для дальнейшей дифференциации бактерий. Чашки с агаром MacConkey можно использовать для дифференциации грамотрицательных бактерий, ферментирующих лактозу, и бактерий, не ферментирующих лактозу. Тест на коагулазу можно использовать для дифференциации между Staphylococcus aureus и другими видами стафилококков . Если тест на коагулазу положительный, вероятно, это бактерии. Staphylococcus aureus ; если он отрицательный, вероятнее всего, это бактерии Staphylococcus epidermis или Staphylococcus saprophyticus.

Понимание закономерностей предварительного роста организмов может помочь клиницистам выбрать подходящий антибиотик. Блок-схема предназначена для помощи в предварительной идентификации бактерий. Однако чувствительность и специфичность окраски по Граму могут широко варьироваться; поэтому перед деэскалацией проводится дальнейшая микробиологическая идентификация. 52 , 53 Тем не менее, окраска по Граму является полезным инструментом при проведении эмпирической терапии до получения окончательных результатов посева.

Классификация распространенных грамположительных и грамотрицательных бактерий

Быстрые диагностические тесты

Быстрые диагностические тесты могут помочь в более быстром выявлении и снижении эскалации антибиотикотерапии. Фармацевты сыграли решающую роль в предоставлении поставщикам рекомендаций на основе этих тестов. 54 , 55 Эти системы быстрой диагностики включают MALDI-TOF, ПЦР, PNA-FISH и технологию датчиков наночастиц. MALDI-TOF можно объяснить, разложив аббревиатуру.Для выполнения MALDI-TOF образец выращивают на чашке с агаром и помещают на чашку MALDI, после чего добавляют матрицу. MA trix помогает преобразовать L asser в тепло, которое заставляет образец превращаться в D esorb с пластины и образовывать I onized молекулы. Молекулы превращаются в газ, который затем летит в лампу T ime- O f- F в зависимости от их размера и заряда. Молекулы с меньшим отношением размера к заряду движутся быстрее, что создает спектр, основанный на размере и заряде молекул.Этот спектр соответствует библиотекам спектров для известного организма, такого как Escherichia coli . Спектры также коррелируют со значением баллов на машине MALDI-TOF, которое указывает вероятность правильного определения тестируемого рода и / или вида. 56 Основным преимуществом MALDI-TOF является быстрая (менее пяти часов) идентификация бактерий. Однако в настоящее время тест не предоставляет информации о чувствительности и не может обнаружить гетерорезистентность.Гетерорезистентность возникает, когда субпопуляция бактериальных клеток проявляет более высокую устойчивость к антибиотикам, чем остальная часть культуры. 57

Альтернативным методом быстрой идентификации является ПЦР, которая работает путем создания множественных копий сегментов ДНК, используемых для идентификации бактерий. Для проведения ПЦР необходимы сегмент ДНК, нуклеотиды, полимераза и праймер. 58 ДНК нагревается, в результате чего она расщепляется на две отдельные нити. Эти нити праймируются, а затем полимераза создает новые нити ДНК, используя нуклеотиды.Процесс повторяется для создания нескольких копий сегментов ДНК, которые можно анализировать для идентификации микроба. Преимущества ПЦР включают быструю идентификацию (менее одного часа) бактерий и способность обнаруживать бактерии, пока пациент находится на антибактериальной терапии. Но этот метод также имеет некоторые ограничения, поскольку ПЦР может обнаруживать бактерии, которые становятся нежизнеспособными после лечения пациента от инфекции. 59 Кроме того, точность может снизиться при полимикробных инфекциях. Мультиплексная ПЦР, расширение ПЦР, решает эту проблему за счет использования нескольких праймеров, что позволяет идентифицировать несколько бактерий.Это также позволяет обнаруживать гены устойчивости к антибиотикам.

Технология наночастиц также использует ДНК для идентификации бактерий. Этот тест, в котором используются наносетки (слайды, покрытые ДНК) для связывания с грамположительной или грамотрицательной ДНК, используется только у пациентов с положительными культурами крови. 60 Когда происходит связывание, прикрепляются наночастицы золота, затем раствор смывается с предметного стекла, и раствор связывается с золотом. Свет, проходящий через слайды, позволяет визуализировать серебро, рассеивая свет в камере.Преимущества этого теста заключаются в быстрой идентификации (менее трех часов) большого количества бактерий и механизмов устойчивости. Его ограничения включают требование положительного посева крови и тот факт, что не все потенциальные патогены можно идентифицировать.

В отличие от ПЦР и технологии нанозондов-частиц, которые идентифицируют бактерии путем обнаружения ДНК, PNA-FISH идентифицирует бактерии с помощью зондов для идентификации рибосомной РНК. PNA-FISH также можно объяснить, разложив аббревиатуру.В этой процедуре зонды F люоресцентные p eptide- n ucleic a cid ( PNA ) наносят на бактерии, закрепленные на предметном стекле. 61 Эти зонды H гибридизуются (связываются) с рибосомной РНК и просматриваются под флуоресцентным микроскопом в реальном времени ( I n S itu) . Преимущества PNAFISH включают быстрое обнаружение (менее одного часа), возможность идентифицировать бактерии, которые труднее выращивать традиционными методами (анаэробы, виды Mycoplasma ) и меньшую стоимость по сравнению с ПЦР.Основным недостатком PNA-FISH является то, что исследователь должен предвидеть потенциальные бактерии, поскольку разные бактерии имеют разные наборы. Информация о окраске по Граму может помочь в выборе подходящего набора. Таким образом, если росли лактозоположительные грамотрицательные бациллы, технический специалист выбрал бы набор для использования с E. Coli / P. Aeruginosa . Кроме того, PNA-FISH может обнаруживать лекарственную устойчивость только в том случае, если возникают мутации с рибосомной РНК.

ОБЫЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ И ТЕСТИРОВАНИЕ НА АНТИБИОТИКУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ

Обычная идентификация бактерий заключается в окрашивании по Граму с последующей идентификацией бактерий и тестированием на чувствительность к антибиотикам.Процесс от начала до конца может занять до пяти дней, что может задержать время до деэскалации антибиотиков. 59 Стандарты чувствительности к антибиотикам в США определяются Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), что в основном относится к стандартам, установленным Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). Стандарты могут отличаться в других странах, что может привести к расхождениям в определении чувствительности к антибиотикам; это привело к созданию Национального комитета по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам США (USCAST).Этот комитет работает с Комитетом Европейского Союза по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам, чтобы нормализовать стандарты на международном уровне. Для определения чувствительности к антибиотикам используются количественные данные, которые далее разбиваются на качественные категории, как показано на рис.

Таблица 1

Окончательный отчет о чувствительности к антибиотикам для Klebsiella Pneumoniae

3 3

Amikill

Cefazolin Cefazolin

≥ 64

9 0353 R

МИК (мкг / мл) Интерпретация
≥ 32 R
Ампициллин / Сульбактам 16 I
Цефазолин ≥ 64 R
R
Ципрофлоксацин ≥ 64 R
ESBL * NEG
Gentamicin

Gentamicin

1 S
Пиперациллин ≥ 128
Пиперациллин / тазобактам 1.5 S
Тигециклин ≤ 0,5 S
Тобрамицин 8 I
Испытание на триметоприм / сульфаметоксазол выполняется путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК). МПК — это самая низкая концентрация антибиотика, необходимая для подавления роста организма. Самый низкий МПК не всегда коррелирует с наиболее эффективным лечением, поскольку разные антибиотики достигают разных концентраций в разных местах. 62 Для определения качественных категорий используются конкретные значения МИК, также известные как контрольные точки, для классификации бактерий как чувствительных, промежуточных или устойчивых к определенному антибиотику. Для определения контрольных точек CLSI использует фармакокинетические, фармакодинамические механизмы, механизмы резистентности и клинические данные.

CLSI определяет как чувствительные те изоляты, которые ингибируются типичными достижимыми концентрациями антибиотика при использовании дозировки, рекомендованной для лечения очага инфекции. 63 Дозозависимая чувствительная категория определяется, когда требуется режим дозирования, который приводит к большему воздействию лекарственного средства, чем тот, который используется в чувствительной категории для достижения клинической эффективности. Промежуточная категория включает изоляты, которые достигают обычно достижимых уровней в крови и тканях с помощью антибиотиков, а показатели ответа ниже, чем у чувствительных изолятов. Наконец, категория резистентности включает изоляты, которые не ингибируются обычными достижимыми концентрациями антибиотиков или для которых вероятны механизмы резистентности, а клиническая эффективность антибиотиков достоверно не доказана.

Тестирование диффузии

Дисковая диффузия, или метод Кирби-Бауэра, является распространенным тестом, используемым для определения чувствительности к антибиотикам (см.). При тестировании диффузии диск с антибиотиком помещается на пластину с агаром, содержащую бактерии. Планшет инкубируют до 24 часов, и в течение этого времени антибиотик диффундирует по всему планшету, образуя градиент концентрации, окружающий диск. 64 Чем меньше концентрация антибиотика, тем выше вероятность роста бактерий.Диаметр области, на которой нет роста, измеряется для определения восприимчивости в соответствии с рекомендациями CLSI. Большие зоны указывают на снижение роста бактерий с большей чувствительностью к антибиотикам, тогда как меньшие зоны показывают усиленный рост бактерий с меньшей чувствительностью к антибиотикам. Если антибиотик не подавляет рост, зоны подавления нет, следовательно, бактерии устойчивы.

Дисковая диффузия (метод Кирби-Бауэра)

Тестирование разведения

Обычные тесты разведения включают разведение в бульоне и разведение в агаре.В обоих тестах бактерии помещают на несколько планшетов, пробирок или лунок, содержащих определенную концентрацию антибиотика. 64 Например, максимальная концентрация антибиотика в наборе лунок может составлять 4,0 мкг / мл. Следующая лунка после одного разведения будет иметь концентрацию 2,0 мкг / мл, затем 1,0 мкг / мл после двух разведений и 0,5 мкг / мл после трех разведения. Пример микроразбавления бульона показан на, а разведение в агаре показано на. Результаты теста на разведение могут отличаться, и обычно бывает однократная ошибка разведения.Например, если определено, что МИК составляет 1 мкг / мл, истинный диапазон МИК может составлять от 0,5 до 2 мкг / мл. Это может быть проблематично, если диапазон включает чувствительные и промежуточные значения MIC.

Разведение бульона состоит из микроразведения и макроразведения. Несмотря на то, что они похожи, методы различаются в первую очередь модальностью, которая используется для проведения теста на чувствительность (лунки или пробирки). 65 Микроразбавление бульона выполняется путем помещения различных антибиотиков с разной концентрацией в лунки, содержащие жидкую среду, как показано на рис.Бактерии добавляются в каждую лунку, и лоток инкубируется. Присутствие бактериального роста затем определяется путем визуального осмотра планшета. МИК теста на микроразбавление бульона определяют, когда при использовании определенного антибиотика роста не наблюдается. Преимущество этого теста в том, что одновременно можно тестировать более одного антибиотика. Недостатки заключаются в том, что разбавление бульона требует больших затрат труда и времени, а также могут возникать потенциальные процедурные ошибки.

Тест на разведение в агаровой среде аналогичен тесту на разведение в бульоне, с основным отличием в том, что в нем используются физические среды, а не жидкие среды.Разбавление агара выполняется путем помещения стандартных концентраций организма на чашки с агаром, которые различаются по концентрации антибиотика, как показано на рис. 64 МИК определяют в первой пробирке, которая не демонстрирует роста организма. Этот тест обычно используется при тестировании нескольких бактерий против определенного антибиотика. Разбавление агара также является трудоемким и требует много времени, и при этом нельзя тестировать более одного антибиотика за раз. 65

Комбинированное тестирование диффузии и разведения

Е-тест — это количественный тест, сочетающий методы диффузии и разведения. 64 Вместо диска в тесте используется тест-полоска E-test, содержащая антибиотик, который диффундирует через пластину с агаром, содержащую бактерии. Вдоль полоски имплантирован антибиотик различной концентрации (). В отличие от тестирования разбавления, различия в концентрации не отличаются друг от друга на одно разведение; вместо этого они расположены ближе друг к другу, что может обеспечить большую точность. После инкубации планшета в течение 24 часов зона ингибирования образует эллипс и пересекает полосу на планшете.Точка пересечения определяет значение MIC. E-тест является преимуществом, потому что стабильный градиент используется с более высоким посевом бактерий, что позволяет более точно считывать значения MIC. Недостатки в том, что на полосках можно тестировать только один антибиотик, а тест может быть дорогостоящим и трудоемким.

Автоматизированные системы

Преимущество автоматизированных систем состоит в том, что они менее трудозатратны и позволяют быстрее составлять отчеты о результатах. 66 Эти системы в основном используют принципы разведения для определения чувствительности к антибиотикам.Полностью автоматические системы вводят бактерии в панель, инкубируют их, затем считывают и интерпретируют результаты чувствительности. Автоматические тесты определяют МПК с помощью алгоритмов и разрешают правила, предсказывающие устойчивость к другим антибиотикам. Кроме того, эти системы могут сохранять результаты для использования при создании антибиотиков вместе с другими отчетами. FDA устанавливает стандарты для утверждения автоматизированных систем, которые включают уровень ложной устойчивости менее 3% и ложной восприимчивости менее 1.5% на нижней границе 95% доверительного интервала (ДИ) и менее 7,5% на верхней границе 95% доверительного интервала. 67 Они также должны согласиться, в пределах одного разведения, на контрольную точку излома более чем в 90% случаев. Доступны различные автоматизированные системы, включая VITEK 2, Microscan Walkaway plus, Phoenix и Sensititre. Каждая система имеет множество панелей, которые тестируют разные бактерии и разные комбинации лекарств. Хотя ошибки могут возникать, это происходит на уровне комбинации лекарств и бактерий.Если ожидаются ошибки, результаты следует подтвердить ручным тестированием. Каждая система постоянно обновляется и может работать по-разному в зависимости от комбинации препарата и бактерий, что затрудняет рекомендацию одной системы по сравнению с другой.

In vitro по сравнению с In vivo Результаты

Антибиотики могут не дать излечения в клинических условиях ( in vivo, ), несмотря на демонстрацию чувствительности в лабораторных условиях ( in vitro, ). Это может происходить в результате механизмов резистентности, выработки токсинов или фармакокинетических и фармакодинамических свойств антибиотиков.Эта статья посвящена механизмам резистентности, и читатели могут обратиться к обзорам токсинов, фармакокинетики и фармакодинамики для получения дополнительной информации. 68 , 69 Резистентность может развиться во время лечения пациента антибиотиками; это было хорошо задокументировано с помощью клиндамицина. 70 D-тест на клиндамицин, использующий принцип дисковой диффузии, может помочь выявить индуцибельную резистентность к клиндамицину у гемолитических стрептококков S. aureus и β .Для проведения теста диск, содержащий клиндамицин и эритромицин, помещают на тот же планшет и планшеты инкубируют. Если зона подавления отображается в виде круга, индуцируемого сопротивления нет; если он отображается как «D», имеется индуцируемое сопротивление.

По мере развития новых механизмов устойчивости лабораториям необходимо разработать новые способы обнаружения устойчивости. Одним из примеров этого является обнаружение бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и / или бета-лактамазы AmpC. 71 , 72 БЛРС — это ферменты, расщепляющие многие бета-лактамные антибиотики, что делает их неэффективными.Они с большей вероятностью присутствуют в грамотрицательных бактериях, связанных с инфекциями, связанными со здоровьем. Для выявления БЛРС проводится скрининг путем тестирования определенных антибиотиков, таких как цефотаксим, с последующим добавлением клавулановой кислоты. Если скрининг БЛРС проводится с использованием микроразбавления бульона, МИК сравнивается между цефотаксимом и цефотаксимом плюс клавулановая кислота. Если при добавлении клавулановой кислоты наблюдается трехкратное изменение МИК при разведении, БЛРС присутствует. Например, если МИК составляет 2 мкг / мл для одного цефотаксима и снижается до 0.5 мкг / мл при добавлении клавулановой кислоты свидетельствует о наличии БЛРС. Интерпретация ESBL может быть дополнительно осложнена присутствием другой бета-лактамазы, AmpC. Это может привести к ложноотрицательному скринингу на БЛРС, но его можно обнаружить с помощью Е-теста. В будущем, вероятно, будут выявлены новые механизмы резистентности, которые создадут новые проблемы в достижении клинического излечения.

Руководство по идентификации бактериальных культур и интерпретации результатов

Реферат

Цель

Предоставить руководство по интерпретации результатов бактериальных культур.

Методы

Исследования были выявлены с помощью поиска в литературе PubMed (с 1966 по январь 2018). Поисковые запросы включали тесты на микробную чувствительность, микробную устойчивость к лекарственным препаратам и противоинфекционные агенты / фармакологию. Статьи включались, если они были опубликованы на английском языке. Также были проанализированы ссылки в указанных статьях.

Результаты

В этой статье рассмотрены основные концепции интерпретации результатов бактериальных посевов, включая время посева, общие места посева, возможность контаминации, интерпретацию окраски по Граму, роль быстрых диагностических тестов, стандартное тестирование чувствительности к антибиотикам и автоматическое тестирование.

Заключение

Это руководство может помочь фармацевтам в их роли в качестве неотъемлемых членов группы управления антимикробными препаратами в усилиях по улучшению ухода за пациентами.

Ключевые слова: тесты микробной чувствительности, микробная лекарственная устойчивость, противоинфекционные агенты / фармакология, фармакокинетика

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время существует нехватка фармацевтов, обученных инфекционным заболеваниям, для заполнения должностей по управлению антимикробными препаратами в Соединенных Штатах.Это означает, что фармацевты на различных других должностях должны взять на себя эти роли, чтобы улучшить назначение соответствующих антибиотиков. 1 Исследования показывают, что в условиях стационара примерно 50% пациентов получают хотя бы один антибиотик во время пребывания в стационаре, 30% из которых включают антибиотики широкого спектра действия. 2 5 Сообщается, что нецелевое использование антибиотиков достигает 50%, хотя оценки могут варьироваться в зависимости от учреждения и от того, как определяется термин «уместность». 6 9 Неправильное использование может привести к усилению побочных эффектов, вторичным инфекциям, лекарственным взаимодействиям, дополнительным расходам, увеличению продолжительности пребывания в больнице и повторной госпитализации. Кроме того, может развиться резистентность бактерий, что может привести к неэффективности лечения. 9 , 10 В этой статье рассматриваются сроки посева, общие места посева, интерпретация окраски по Граму, роль экспресс-тестов, обычных тестов на чувствительность к антибиотикам и автоматизированного тестирования.На протяжении всей статьи мы используем термин антибиотик вместо противомикробный , поскольку мы не охватывали тестирование вирусов или грибков.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУР

Медицинские работники должны быстро получить посевы для проведения терапии, одновременно принимая во внимание важность быстрого введения антибиотиков. 11 Руководящие принципы Кампании по борьбе с сепсисом 2016 г. рекомендуют вводить антибиотики в течение одного часа после постановки диагноза сепсиса и чтобы посевы не откладывали введение антибиотиков более чем на 45 минут. 12 У пациентов с сепсисом введение соответствующих антибиотиков в течение одного часа может снизить смертность. 13 Получение посевов перед введением антибиотиков может помочь клиницистам определить возбудителя болезни, что позволит снизить эскалацию за счет надлежащего лечения. Если посевы отбираются после введения антибиотика, может наблюдаться снижение результатов посева крови, что может увеличить стоимость и продолжительность пребывания пациента. 14 16

Культуры можно получить из участков, которые либо заселены бактериями, либо стерильны.Колонизированные бактериями увеличивают риск заражения нормальной флорой и могут привести к ложным результатам . Сайты, которые обычно считаются стерильными, включают спинномозговую жидкость, кровь и перикардиальную жидкость. Места, которые хорошо известны заражением, включают мокроту и носовые ходы. 17 Неправильная техника сбора посевов может также увеличить риск заражения. Ниже приведены рекомендации по интерпретации результатов для крови, дыхательных путей, мочи, кожи и мягких тканей, костей и суставов, спинномозговой жидкости и посевов стула.

Культуры крови

При оценке культур крови важно различать бактериемию и контаминацию. Заражение происходит, когда в собранный образец попадают бактерии из внешнего источника. 18 Например, нормальные кожные бактерии могут быть занесены при проведении венепункции с помощью одной иглы. Бактерии также могут присутствовать в медицинских устройствах, таких как центральные венозные катетеры. Центральные венозные катетеры связаны с более высоким уровнем заражения, чем венопункция.Темпы выявления загрязнителей растут, поскольку новые методы тестирования улучшают идентификацию бактерий даже в небольших количествах.

При оценке потенциального заражения клиницист должен оценить клинические проявления пациента и определить, проявляет ли он или она признаки и симптомы бактериемии. Например, если у пациента была гипотензия, тахикардия и лихорадка, это может указывать на наличие бактериемии. Кроме того, очень важно брать как минимум два образца с разных участков тела.Вторым участком часто является центральный венозный катетер, если он есть. Если в одной из двух культур растет организм, который считается вероятным контаминантом, необходимы повторные посевы. И наоборот, если один и тот же организм выращивается в нескольких образцах, результатом обычно является настоящая бактериемия. 19 , 20 Только одна положительная культура необходима, чтобы предположить истинную инфекцию у пациентов с грамотрицательными бактериями. 21 Грамположительные бактерии, особенно виды Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium , с большей вероятностью могут быть контаминантами. 22 Одно исследование по оценке 500 посевов крови показало, что видов Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium были контаминантами в 94% и 79% случаев соответственно. Однако в таких популяциях, как пациенты с ослабленным иммунитетом, эти две бактерии могут представлять настоящую инфекцию. Грамположительные бактерии, ассоциированные с истинной инфекцией, включают Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae . Повторные посевы должны быть взяты, чтобы гарантировать разрешение бактериемии.

Респираторные культуры

Для диагностики пневмонии многие клиницисты заказывают посев мокроты, эндотрахеальный аспират и, реже, бронхоальвеолярный лаваж. Они выполняются в дополнение к оценке признаков и симптомов (кашель, лихорадка, выделение мокроты, плевритная боль в груди) и рентгенографии грудной клетки. 23 Посев мокроты может быть трудно интерпретировать, потому что верхние дыхательные пути колонизированы бактериями, в отличие от нижних дыхательных путей, которые обычно стерильны. 24 Сообщения о чувствительности и специфичности посевов мокроты широко различаются. 23 Если получена культура мокроты, необходимо отметить наличие эпителиальных клеток, которые могут указывать на загрязнение культуры. Культуры мокроты должны содержать менее 10 эпителиальных клеток на поле с малым увеличением. В определенных группах пациентов, например, с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), у которых наблюдается обострение, следует избегать посева мокроты. 25 Вместо того, чтобы использовать такие культуры для определения наличия инфекции, в рекомендациях Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких 2017 рекомендуется оценивать симптомы пациента, такие как выделение мокроты, гнойность и одышка.У пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, посевы обычно получают путем эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа. Эндотрахеальная аспирация имеет меньшую специфичность, чем бронхоальвеолярный лаваж для диагностики пневмонии, хотя она имеет меньше осложнений и более низкую стоимость. 26 Эта более низкая специфичность может привести к более высокому использованию антибиотиков. Рекомендации различаются в зависимости от предпочтения эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа, поскольку выбор основан на деэскалации антибиотиков или стоимости и осложнениях этих методов. 27 , 28 Клиницисты должны руководствоваться стандартами своего учреждения, когда рекомендуют эндотрахеальную аспирацию или бронхоальвеолярный лаваж.

Посев мочи

Посев мочи следует отбирать только при подозрении на инфекцию, обычно при наличии симптомов, о которых сообщает пациент. 29 Типичные симптомы инфекции мочевыводящих путей включают дизурию, частоту и неотложность позывов, хотя пациенты с деменцией могут проявлять неспецифические признаки, такие как усталость и изменения психического статуса. 30 У пациентов с мочевыми катетерами симптомы носят более общий характер и могут включать лихорадку, слабость и изменение психического статуса. 31 Скрининг бессимптомной бактериурии следует проводить только у беременных или у пациентов, подвергающихся урологическим процедурам. 29 При обследовании пациента с потенциальной инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) следует оценивать посев мочи вместе с симптомами и анализом мочи. Десять или более лейкоцитов на микролитр в анализе мочи связаны с диагнозом ИМП, но это не должно быть единственным критерием, используемым для диагностики.Культуры у пациентов без мочевых катетеров лучше всего собирать на полпути, чтобы избежать заражения. В посеве мочи количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл является оценкой количества бактерий в образце. Более 10 3 КОЕ на мл в посеве мочи связано с инфекцией. Однако истинная инфекция может возникать у пациентов с более низкими КОЕ при наличии симптомов и лейкоцитов в моче. 32 Пациенты с катетер-ассоциированными ИМП также имеют более низкие КОЕ.И наоборот, более высокое количество КОЕ может иметь место в присутствии контаминантов и после неправильно взятого образца. Бактерии, которые обычно не наблюдаются при ИМП, могут быть вызваны контаминацией, за исключением случаев, когда у пациента есть факторы риска для других типов бактерий и образец не собирается надлежащим образом. Обычные бактерии при неосложненных ИМП включают видов Escherichia coli , видов Klebsiella , видов Proteus и Staphylococcus saprophyticus .

Инфекции кожи и мягких тканей

Американское общество инфекционных болезней (IDSA) рекомендует делать посевы на абсцессы и карбункулы, хотя они упоминают эмпирическое лечение без посева как разумное. 33 При целлюлите IDSA рекомендует проводить посев крови только при наличии у пациента определенных факторов. К этим факторам относятся: иммуносупрессия, злокачественные новообразования, укусы животных и / или иммерсионные травмы. 34 Посев на поверхность кожи следует получать только при гнойном дренаже. Получение кожных культур при инфекциях без дренажа часто приводит к выявлению полимикробных организмов, которые не являются причиной инфекции, что приводит к чрезмерно широкому лечению. 35 Как и в случае ИМП, для постановки диагноза важны анамнез пациента и обследование.Пациенты с гнойным дренажом с большей вероятностью будут инфицированы S. aureus , , а пациенты с негнойным целлюлитом с большей вероятностью будут инфицированы стрептококками группы А. 36

Инфекции костей и суставов

Бактериальные инфекции суставов и костей могут возникать при попадании бактерий из крови, протезов, травм или распространения кожной инфекции. Знание источника может помочь предсказать, какие бактерии могут быть причиной. Типичные симптомы совместных инфекций включают лихорадку, болезненные и опухшие суставы, болезненность и уменьшение диапазона движений. 37 Пациенты с протезами суставов или недавними операциями на суставах (обычно <3 месяцев) более подвержены инфекциям суставов. 38 Совместные инфекции диагностируются с помощью посевов синовиальной жидкости, из которых жидкость берется во время операции или путем аспирации. Повышенное количество лейкоцитов (WBC) в синовиальной жидкости, особенно когда количество превышает 50 000 клеток / мм 3 , может помочь в исключении (специфичность 90%), но не исключить (чувствительность 56%) инфекции суставов. 39 Окраска по Граму также имеет низкую чувствительность (45–71%) для диагностики инфекций суставов.Наконец, оценка содержания белка или глюкозы в синовиальной жидкости не помогает в диагностике. Пациенты с остеомиелитом обычно проявляют симптомы лихорадки, вялости, воспаления, эритемы и отека. 40 Посевы костной биопсии и рентгенограммы играют важную роль в диагностике остеомиелита, наряду с выявлением возбудителя. Также могут быть взяты посевы крови для определения организма при гематогенном остеомиелите. Наконец, у пациентов обычно наблюдается повышенное количество лейкоцитов, повышенная скорость оседания эритроцитов и повышенный уровень С-реактивного белка, хотя их нельзя использовать в диагностике без посева. 41

Культуры спинномозговой жидкости

Культуры спинномозговой жидкости (ЦСЖ) играют важную роль в диагностике менингита. 42 Культуры спинномозговой жидкости, связанные с нелеченым бактериальным менингитом, обычно показывают повышенное количество лейкоцитов (> 1000 клеток / мм 3 ), хотя может наблюдаться более низкое количество лейкоцитов. Повышение количества лейкоцитов также может произойти, если люмбальная пункция травматична. Общее правило состоит в том, что каждые 1000 эритроцитов в спинномозговой жидкости увеличивают количество лейкоцитов в спинномозговой жидкости на единицу. 43 Нейтрофилы обычно> 80%, хотя у 10% пациентов можно увидеть лимфоциты> 50%. Кроме того, при бактериальном менингите культуры спинномозговой жидкости часто имеют высокое содержание белка (> 0,9 г / л), поскольку белок имеет повышенное проникновение в спинномозговую жидкость при воспалении менингеальной оболочки. 44 При бактериальном менингите глюкоза утилизируется бактериями; следовательно, можно увидеть низкий уровень глюкозы в спинномозговой жидкости (<40 мг / дл) или соотношение между глюкозой в спинномозговой жидкости и глюкозой в сыворотке (≤ 40%). Давление открытия при люмбальной пункции также может быть выше 200 мм H 2 O. 43 Окраска по Граму полезна для диагностики пациентов с бактериальным менингитом, особенно с большим количеством бактерий. Сообщается, что в некоторых случаях специфичность окраски по Граму достигает 97%. Наконец, полимеразная цепная реакция (ПЦР) обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может использоваться для исключения бактериального менингита, если окраска ЦСЖ по Граму и культура отрицательны. 45

Культуры кала

Посевы кала могут быть рассмотрены у пациентов, которые поступают с постоянной диареей или кровавой диареей или которые недавно побывали в районах с плохой общественной системой санитарии.Достаточно получить один посев кала, и он может обнаружить патоген в 87–94% случаев. 46 Лаборатории регулярно проводят скрининг бактерий, таких как Salmonella, Shigella, E. coli и Campylobacter , в культурах стула. Кроме того, исследование Clostridium difficile может быть рассмотрено у пациентов с факторами риска инфекции, такими как принимавшие антибиотики в течение последних двух месяцев, имеющие более двух несформированных испражнений за 24 часа, увеличение количества лейкоцитов, ухудшение функции почек и снижение альбумина. 47 Существует несколько тестов для обнаружения C. difficile . Чаще всего эти тесты включают иммуноферментный анализ на токсины A и B, иммуноферментный анализ на глутаматдегидрогеназу (GDH) и молекулярный анализ. Большинство лабораторий сначала проводят иммуноанализ на токсины A и B, обычно одновременно с анализом GDH. Совместное использование этих двух тестов имеет высокую специфичность (97% или выше), но чувствительность тестов ниже (41–92%). 48 , 49 Если иммуноферментный анализ на токсины A и B, а также GDH положительны, то C.difficile скорее всего . Если один из них положительный, а другой отрицательный, следует провести дальнейшее тестирование с помощью молекулярных анализов, так как это может улучшить чувствительность и специфичность. Тестирование после разрешения бесполезно, так как посев кала будет оставаться положительным в течение нескольких недель после заражения.

РАННЕЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ

Важно проводить тестирование на чувствительность к антибиотикам, поскольку оно помогает врачам выбрать подходящую схему лечения инфекции.Различные подходы к ранней идентификации бактерий включают окрашивание по Граму, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF), ПЦР, технологию зондов с наночастицами и флуоресценцию пептидных нуклеиновых кислот in situ (PNA-FISH).

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму — это диагностический тест, который дает раннее выявление потенциальных бактерий посредством визуализации бактерий. Окраска по Граму помогает дифференцировать организм, будь то грамположительные или грамотрицательные. 50 Грамположительные бактерии имеют пурпурный цвет, а грамотрицательные — розовый. Кроме того, форма, расположение и размер организма могут предоставить дополнительную информацию, которая поможет идентифицировать организм. Обычно при окрашивании по Граму видны кокки, похожие на сферы; бациллы, напоминающие палочки; или коккобациллы, которые представляют собой комбинацию этих двух. Кокки могут быть расположены в виде узоров, таких как группы или цепочки; например, виды Staphylococcus появляются в виде грамположительных кокков в скоплениях.Размер может помочь микробиологу различать бациллы, хотя врачу об этом нечасто сообщают.

Для окрашивания по Граму технический специалист наносит бактерии на предметное стекло, а затем пропускает его над пламенем, чтобы убедиться, что бактерии остаются на предметном стекле. Затем наносится кристально-фиолетовый краситель, который окрашивает все бактерии в пурпурный цвет. Затем применяется йод, который помогает красителю связываться с пептидогликановым слоем клеточной стенки, а затем ацетон, который смывает краситель. Пурпурный краситель остается на грамположительных бактериях в результате прочной связи между бактериями и толстым пептидогликановым слоем, но он смывается с грамотрицательных бактерий, которые имеют тонкий пептидогликановый слой.Наконец, применяется краситель, такой как сафранин, который окрашивает грамотрицательные бактерии в розовый цвет. 51 Другие тесты могут быть выполнены для дальнейшей дифференциации бактерий. Чашки с агаром MacConkey можно использовать для дифференциации грамотрицательных бактерий, ферментирующих лактозу, и бактерий, не ферментирующих лактозу. Тест на коагулазу можно использовать для дифференциации между Staphylococcus aureus и другими видами стафилококков . Если тест на коагулазу положительный, вероятно, это бактерии. Staphylococcus aureus ; если он отрицательный, вероятнее всего, это бактерии Staphylococcus epidermis или Staphylococcus saprophyticus.

Понимание закономерностей предварительного роста организмов может помочь клиницистам выбрать подходящий антибиотик. Блок-схема предназначена для помощи в предварительной идентификации бактерий. Однако чувствительность и специфичность окраски по Граму могут широко варьироваться; поэтому перед деэскалацией проводится дальнейшая микробиологическая идентификация. 52 , 53 Тем не менее, окраска по Граму является полезным инструментом при проведении эмпирической терапии до получения окончательных результатов посева.

Классификация распространенных грамположительных и грамотрицательных бактерий

Быстрые диагностические тесты

Быстрые диагностические тесты могут помочь в более быстром выявлении и снижении эскалации антибиотикотерапии. Фармацевты сыграли решающую роль в предоставлении поставщикам рекомендаций на основе этих тестов. 54 , 55 Эти системы быстрой диагностики включают MALDI-TOF, ПЦР, PNA-FISH и технологию датчиков наночастиц. MALDI-TOF можно объяснить, разложив аббревиатуру.Для выполнения MALDI-TOF образец выращивают на чашке с агаром и помещают на чашку MALDI, после чего добавляют матрицу. MA trix помогает преобразовать L asser в тепло, которое заставляет образец превращаться в D esorb с пластины и образовывать I onized молекулы. Молекулы превращаются в газ, который затем летит в лампу T ime- O f- F в зависимости от их размера и заряда. Молекулы с меньшим отношением размера к заряду движутся быстрее, что создает спектр, основанный на размере и заряде молекул.Этот спектр соответствует библиотекам спектров для известного организма, такого как Escherichia coli . Спектры также коррелируют со значением баллов на машине MALDI-TOF, которое указывает вероятность правильного определения тестируемого рода и / или вида. 56 Основным преимуществом MALDI-TOF является быстрая (менее пяти часов) идентификация бактерий. Однако в настоящее время тест не предоставляет информации о чувствительности и не может обнаружить гетерорезистентность.Гетерорезистентность возникает, когда субпопуляция бактериальных клеток проявляет более высокую устойчивость к антибиотикам, чем остальная часть культуры. 57

Альтернативным методом быстрой идентификации является ПЦР, которая работает путем создания множественных копий сегментов ДНК, используемых для идентификации бактерий. Для проведения ПЦР необходимы сегмент ДНК, нуклеотиды, полимераза и праймер. 58 ДНК нагревается, в результате чего она расщепляется на две отдельные нити. Эти нити праймируются, а затем полимераза создает новые нити ДНК, используя нуклеотиды.Процесс повторяется для создания нескольких копий сегментов ДНК, которые можно анализировать для идентификации микроба. Преимущества ПЦР включают быструю идентификацию (менее одного часа) бактерий и способность обнаруживать бактерии, пока пациент находится на антибактериальной терапии. Но этот метод также имеет некоторые ограничения, поскольку ПЦР может обнаруживать бактерии, которые становятся нежизнеспособными после лечения пациента от инфекции. 59 Кроме того, точность может снизиться при полимикробных инфекциях. Мультиплексная ПЦР, расширение ПЦР, решает эту проблему за счет использования нескольких праймеров, что позволяет идентифицировать несколько бактерий.Это также позволяет обнаруживать гены устойчивости к антибиотикам.

Технология наночастиц также использует ДНК для идентификации бактерий. Этот тест, в котором используются наносетки (слайды, покрытые ДНК) для связывания с грамположительной или грамотрицательной ДНК, используется только у пациентов с положительными культурами крови. 60 Когда происходит связывание, прикрепляются наночастицы золота, затем раствор смывается с предметного стекла, и раствор связывается с золотом. Свет, проходящий через слайды, позволяет визуализировать серебро, рассеивая свет в камере.Преимущества этого теста заключаются в быстрой идентификации (менее трех часов) большого количества бактерий и механизмов устойчивости. Его ограничения включают требование положительного посева крови и тот факт, что не все потенциальные патогены можно идентифицировать.

В отличие от ПЦР и технологии нанозондов-частиц, которые идентифицируют бактерии путем обнаружения ДНК, PNA-FISH идентифицирует бактерии с помощью зондов для идентификации рибосомной РНК. PNA-FISH также можно объяснить, разложив аббревиатуру.В этой процедуре зонды F люоресцентные p eptide- n ucleic a cid ( PNA ) наносят на бактерии, закрепленные на предметном стекле. 61 Эти зонды H гибридизуются (связываются) с рибосомной РНК и просматриваются под флуоресцентным микроскопом в реальном времени ( I n S itu) . Преимущества PNAFISH включают быстрое обнаружение (менее одного часа), возможность идентифицировать бактерии, которые труднее выращивать традиционными методами (анаэробы, виды Mycoplasma ) и меньшую стоимость по сравнению с ПЦР.Основным недостатком PNA-FISH является то, что исследователь должен предвидеть потенциальные бактерии, поскольку разные бактерии имеют разные наборы. Информация о окраске по Граму может помочь в выборе подходящего набора. Таким образом, если росли лактозоположительные грамотрицательные бациллы, технический специалист выбрал бы набор для использования с E. Coli / P. Aeruginosa . Кроме того, PNA-FISH может обнаруживать лекарственную устойчивость только в том случае, если возникают мутации с рибосомной РНК.

ОБЫЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ И ТЕСТИРОВАНИЕ НА АНТИБИОТИКУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ

Обычная идентификация бактерий заключается в окрашивании по Граму с последующей идентификацией бактерий и тестированием на чувствительность к антибиотикам.Процесс от начала до конца может занять до пяти дней, что может задержать время до деэскалации антибиотиков. 59 Стандарты чувствительности к антибиотикам в США определяются Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), что в основном относится к стандартам, установленным Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). Стандарты могут отличаться в других странах, что может привести к расхождениям в определении чувствительности к антибиотикам; это привело к созданию Национального комитета по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам США (USCAST).Этот комитет работает с Комитетом Европейского Союза по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам, чтобы нормализовать стандарты на международном уровне. Для определения чувствительности к антибиотикам используются количественные данные, которые далее разбиваются на качественные категории, как показано на рис.

Таблица 1

Окончательный отчет о чувствительности к антибиотикам для Klebsiella Pneumoniae

3 3

Amikill

Cefazolin Cefazolin

≥ 64

9 0353 R

МИК (мкг / мл) Интерпретация
≥ 32 R
Ампициллин / Сульбактам 16 I
Цефазолин ≥ 64 R
R
Ципрофлоксацин ≥ 64 R
ESBL * NEG
Gentamicin

Gentamicin

1 S
Пиперациллин ≥ 128
Пиперациллин / тазобактам 1.5 S
Тигециклин ≤ 0,5 S
Тобрамицин 8 I
Испытание на триметоприм / сульфаметоксазол выполняется путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК). МПК — это самая низкая концентрация антибиотика, необходимая для подавления роста организма. Самый низкий МПК не всегда коррелирует с наиболее эффективным лечением, поскольку разные антибиотики достигают разных концентраций в разных местах. 62 Для определения качественных категорий используются конкретные значения МИК, также известные как контрольные точки, для классификации бактерий как чувствительных, промежуточных или устойчивых к определенному антибиотику. Для определения контрольных точек CLSI использует фармакокинетические, фармакодинамические механизмы, механизмы резистентности и клинические данные.

CLSI определяет как чувствительные те изоляты, которые ингибируются типичными достижимыми концентрациями антибиотика при использовании дозировки, рекомендованной для лечения очага инфекции. 63 Дозозависимая чувствительная категория определяется, когда требуется режим дозирования, который приводит к большему воздействию лекарственного средства, чем тот, который используется в чувствительной категории для достижения клинической эффективности. Промежуточная категория включает изоляты, которые достигают обычно достижимых уровней в крови и тканях с помощью антибиотиков, а показатели ответа ниже, чем у чувствительных изолятов. Наконец, категория резистентности включает изоляты, которые не ингибируются обычными достижимыми концентрациями антибиотиков или для которых вероятны механизмы резистентности, а клиническая эффективность антибиотиков достоверно не доказана.

Тестирование диффузии

Дисковая диффузия, или метод Кирби-Бауэра, является распространенным тестом, используемым для определения чувствительности к антибиотикам (см.). При тестировании диффузии диск с антибиотиком помещается на пластину с агаром, содержащую бактерии. Планшет инкубируют до 24 часов, и в течение этого времени антибиотик диффундирует по всему планшету, образуя градиент концентрации, окружающий диск. 64 Чем меньше концентрация антибиотика, тем выше вероятность роста бактерий.Диаметр области, на которой нет роста, измеряется для определения восприимчивости в соответствии с рекомендациями CLSI. Большие зоны указывают на снижение роста бактерий с большей чувствительностью к антибиотикам, тогда как меньшие зоны показывают усиленный рост бактерий с меньшей чувствительностью к антибиотикам. Если антибиотик не подавляет рост, зоны подавления нет, следовательно, бактерии устойчивы.

Дисковая диффузия (метод Кирби-Бауэра)

Тестирование разведения

Обычные тесты разведения включают разведение в бульоне и разведение в агаре.В обоих тестах бактерии помещают на несколько планшетов, пробирок или лунок, содержащих определенную концентрацию антибиотика. 64 Например, максимальная концентрация антибиотика в наборе лунок может составлять 4,0 мкг / мл. Следующая лунка после одного разведения будет иметь концентрацию 2,0 мкг / мл, затем 1,0 мкг / мл после двух разведений и 0,5 мкг / мл после трех разведения. Пример микроразбавления бульона показан на, а разведение в агаре показано на. Результаты теста на разведение могут отличаться, и обычно бывает однократная ошибка разведения.Например, если определено, что МИК составляет 1 мкг / мл, истинный диапазон МИК может составлять от 0,5 до 2 мкг / мл. Это может быть проблематично, если диапазон включает чувствительные и промежуточные значения MIC.

Разведение бульона состоит из микроразведения и макроразведения. Несмотря на то, что они похожи, методы различаются в первую очередь модальностью, которая используется для проведения теста на чувствительность (лунки или пробирки). 65 Микроразбавление бульона выполняется путем помещения различных антибиотиков с разной концентрацией в лунки, содержащие жидкую среду, как показано на рис.Бактерии добавляются в каждую лунку, и лоток инкубируется. Присутствие бактериального роста затем определяется путем визуального осмотра планшета. МИК теста на микроразбавление бульона определяют, когда при использовании определенного антибиотика роста не наблюдается. Преимущество этого теста в том, что одновременно можно тестировать более одного антибиотика. Недостатки заключаются в том, что разбавление бульона требует больших затрат труда и времени, а также могут возникать потенциальные процедурные ошибки.

Тест на разведение в агаровой среде аналогичен тесту на разведение в бульоне, с основным отличием в том, что в нем используются физические среды, а не жидкие среды.Разбавление агара выполняется путем помещения стандартных концентраций организма на чашки с агаром, которые различаются по концентрации антибиотика, как показано на рис. 64 МИК определяют в первой пробирке, которая не демонстрирует роста организма. Этот тест обычно используется при тестировании нескольких бактерий против определенного антибиотика. Разбавление агара также является трудоемким и требует много времени, и при этом нельзя тестировать более одного антибиотика за раз. 65

Комбинированное тестирование диффузии и разведения

Е-тест — это количественный тест, сочетающий методы диффузии и разведения. 64 Вместо диска в тесте используется тест-полоска E-test, содержащая антибиотик, который диффундирует через пластину с агаром, содержащую бактерии. Вдоль полоски имплантирован антибиотик различной концентрации (). В отличие от тестирования разбавления, различия в концентрации не отличаются друг от друга на одно разведение; вместо этого они расположены ближе друг к другу, что может обеспечить большую точность. После инкубации планшета в течение 24 часов зона ингибирования образует эллипс и пересекает полосу на планшете.Точка пересечения определяет значение MIC. E-тест является преимуществом, потому что стабильный градиент используется с более высоким посевом бактерий, что позволяет более точно считывать значения MIC. Недостатки в том, что на полосках можно тестировать только один антибиотик, а тест может быть дорогостоящим и трудоемким.

Автоматизированные системы

Преимущество автоматизированных систем состоит в том, что они менее трудозатратны и позволяют быстрее составлять отчеты о результатах. 66 Эти системы в основном используют принципы разведения для определения чувствительности к антибиотикам.Полностью автоматические системы вводят бактерии в панель, инкубируют их, затем считывают и интерпретируют результаты чувствительности. Автоматические тесты определяют МПК с помощью алгоритмов и разрешают правила, предсказывающие устойчивость к другим антибиотикам. Кроме того, эти системы могут сохранять результаты для использования при создании антибиотиков вместе с другими отчетами. FDA устанавливает стандарты для утверждения автоматизированных систем, которые включают уровень ложной устойчивости менее 3% и ложной восприимчивости менее 1.5% на нижней границе 95% доверительного интервала (ДИ) и менее 7,5% на верхней границе 95% доверительного интервала. 67 Они также должны согласиться, в пределах одного разведения, на контрольную точку излома более чем в 90% случаев. Доступны различные автоматизированные системы, включая VITEK 2, Microscan Walkaway plus, Phoenix и Sensititre. Каждая система имеет множество панелей, которые тестируют разные бактерии и разные комбинации лекарств. Хотя ошибки могут возникать, это происходит на уровне комбинации лекарств и бактерий.Если ожидаются ошибки, результаты следует подтвердить ручным тестированием. Каждая система постоянно обновляется и может работать по-разному в зависимости от комбинации препарата и бактерий, что затрудняет рекомендацию одной системы по сравнению с другой.

In vitro по сравнению с In vivo Результаты

Антибиотики могут не дать излечения в клинических условиях ( in vivo, ), несмотря на демонстрацию чувствительности в лабораторных условиях ( in vitro, ). Это может происходить в результате механизмов резистентности, выработки токсинов или фармакокинетических и фармакодинамических свойств антибиотиков.Эта статья посвящена механизмам резистентности, и читатели могут обратиться к обзорам токсинов, фармакокинетики и фармакодинамики для получения дополнительной информации. 68 , 69 Резистентность может развиться во время лечения пациента антибиотиками; это было хорошо задокументировано с помощью клиндамицина. 70 D-тест на клиндамицин, использующий принцип дисковой диффузии, может помочь выявить индуцибельную резистентность к клиндамицину у гемолитических стрептококков S. aureus и β .Для проведения теста диск, содержащий клиндамицин и эритромицин, помещают на тот же планшет и планшеты инкубируют. Если зона подавления отображается в виде круга, индуцируемого сопротивления нет; если он отображается как «D», имеется индуцируемое сопротивление.

По мере развития новых механизмов устойчивости лабораториям необходимо разработать новые способы обнаружения устойчивости. Одним из примеров этого является обнаружение бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и / или бета-лактамазы AmpC. 71 , 72 БЛРС — это ферменты, расщепляющие многие бета-лактамные антибиотики, что делает их неэффективными.Они с большей вероятностью присутствуют в грамотрицательных бактериях, связанных с инфекциями, связанными со здоровьем. Для выявления БЛРС проводится скрининг путем тестирования определенных антибиотиков, таких как цефотаксим, с последующим добавлением клавулановой кислоты. Если скрининг БЛРС проводится с использованием микроразбавления бульона, МИК сравнивается между цефотаксимом и цефотаксимом плюс клавулановая кислота. Если при добавлении клавулановой кислоты наблюдается трехкратное изменение МИК при разведении, БЛРС присутствует. Например, если МИК составляет 2 мкг / мл для одного цефотаксима и снижается до 0.5 мкг / мл при добавлении клавулановой кислоты свидетельствует о наличии БЛРС. Интерпретация ESBL может быть дополнительно осложнена присутствием другой бета-лактамазы, AmpC. Это может привести к ложноотрицательному скринингу на БЛРС, но его можно обнаружить с помощью Е-теста. В будущем, вероятно, будут выявлены новые механизмы резистентности, которые создадут новые проблемы в достижении клинического излечения.

Руководство по идентификации бактериальных культур и интерпретации результатов

Реферат

Цель

Предоставить руководство по интерпретации результатов бактериальных культур.

Методы

Исследования были выявлены с помощью поиска в литературе PubMed (с 1966 по январь 2018). Поисковые запросы включали тесты на микробную чувствительность, микробную устойчивость к лекарственным препаратам и противоинфекционные агенты / фармакологию. Статьи включались, если они были опубликованы на английском языке. Также были проанализированы ссылки в указанных статьях.

Результаты

В этой статье рассмотрены основные концепции интерпретации результатов бактериальных посевов, включая время посева, общие места посева, возможность контаминации, интерпретацию окраски по Граму, роль быстрых диагностических тестов, стандартное тестирование чувствительности к антибиотикам и автоматическое тестирование.

Заключение

Это руководство может помочь фармацевтам в их роли в качестве неотъемлемых членов группы управления антимикробными препаратами в усилиях по улучшению ухода за пациентами.

Ключевые слова: тесты микробной чувствительности, микробная лекарственная устойчивость, противоинфекционные агенты / фармакология, фармакокинетика

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время существует нехватка фармацевтов, обученных инфекционным заболеваниям, для заполнения должностей по управлению антимикробными препаратами в Соединенных Штатах.Это означает, что фармацевты на различных других должностях должны взять на себя эти роли, чтобы улучшить назначение соответствующих антибиотиков. 1 Исследования показывают, что в условиях стационара примерно 50% пациентов получают хотя бы один антибиотик во время пребывания в стационаре, 30% из которых включают антибиотики широкого спектра действия. 2 5 Сообщается, что нецелевое использование антибиотиков достигает 50%, хотя оценки могут варьироваться в зависимости от учреждения и от того, как определяется термин «уместность». 6 9 Неправильное использование может привести к усилению побочных эффектов, вторичным инфекциям, лекарственным взаимодействиям, дополнительным расходам, увеличению продолжительности пребывания в больнице и повторной госпитализации. Кроме того, может развиться резистентность бактерий, что может привести к неэффективности лечения. 9 , 10 В этой статье рассматриваются сроки посева, общие места посева, интерпретация окраски по Граму, роль экспресс-тестов, обычных тестов на чувствительность к антибиотикам и автоматизированного тестирования.На протяжении всей статьи мы используем термин антибиотик вместо противомикробный , поскольку мы не охватывали тестирование вирусов или грибков.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУР

Медицинские работники должны быстро получить посевы для проведения терапии, одновременно принимая во внимание важность быстрого введения антибиотиков. 11 Руководящие принципы Кампании по борьбе с сепсисом 2016 г. рекомендуют вводить антибиотики в течение одного часа после постановки диагноза сепсиса и чтобы посевы не откладывали введение антибиотиков более чем на 45 минут. 12 У пациентов с сепсисом введение соответствующих антибиотиков в течение одного часа может снизить смертность. 13 Получение посевов перед введением антибиотиков может помочь клиницистам определить возбудителя болезни, что позволит снизить эскалацию за счет надлежащего лечения. Если посевы отбираются после введения антибиотика, может наблюдаться снижение результатов посева крови, что может увеличить стоимость и продолжительность пребывания пациента. 14 16

Культуры можно получить из участков, которые либо заселены бактериями, либо стерильны.Колонизированные бактериями увеличивают риск заражения нормальной флорой и могут привести к ложным результатам . Сайты, которые обычно считаются стерильными, включают спинномозговую жидкость, кровь и перикардиальную жидкость. Места, которые хорошо известны заражением, включают мокроту и носовые ходы. 17 Неправильная техника сбора посевов может также увеличить риск заражения. Ниже приведены рекомендации по интерпретации результатов для крови, дыхательных путей, мочи, кожи и мягких тканей, костей и суставов, спинномозговой жидкости и посевов стула.

Культуры крови

При оценке культур крови важно различать бактериемию и контаминацию. Заражение происходит, когда в собранный образец попадают бактерии из внешнего источника. 18 Например, нормальные кожные бактерии могут быть занесены при проведении венепункции с помощью одной иглы. Бактерии также могут присутствовать в медицинских устройствах, таких как центральные венозные катетеры. Центральные венозные катетеры связаны с более высоким уровнем заражения, чем венопункция.Темпы выявления загрязнителей растут, поскольку новые методы тестирования улучшают идентификацию бактерий даже в небольших количествах.

При оценке потенциального заражения клиницист должен оценить клинические проявления пациента и определить, проявляет ли он или она признаки и симптомы бактериемии. Например, если у пациента была гипотензия, тахикардия и лихорадка, это может указывать на наличие бактериемии. Кроме того, очень важно брать как минимум два образца с разных участков тела.Вторым участком часто является центральный венозный катетер, если он есть. Если в одной из двух культур растет организм, который считается вероятным контаминантом, необходимы повторные посевы. И наоборот, если один и тот же организм выращивается в нескольких образцах, результатом обычно является настоящая бактериемия. 19 , 20 Только одна положительная культура необходима, чтобы предположить истинную инфекцию у пациентов с грамотрицательными бактериями. 21 Грамположительные бактерии, особенно виды Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium , с большей вероятностью могут быть контаминантами. 22 Одно исследование по оценке 500 посевов крови показало, что видов Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium были контаминантами в 94% и 79% случаев соответственно. Однако в таких популяциях, как пациенты с ослабленным иммунитетом, эти две бактерии могут представлять настоящую инфекцию. Грамположительные бактерии, ассоциированные с истинной инфекцией, включают Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae . Повторные посевы должны быть взяты, чтобы гарантировать разрешение бактериемии.

Респираторные культуры

Для диагностики пневмонии многие клиницисты заказывают посев мокроты, эндотрахеальный аспират и, реже, бронхоальвеолярный лаваж. Они выполняются в дополнение к оценке признаков и симптомов (кашель, лихорадка, выделение мокроты, плевритная боль в груди) и рентгенографии грудной клетки. 23 Посев мокроты может быть трудно интерпретировать, потому что верхние дыхательные пути колонизированы бактериями, в отличие от нижних дыхательных путей, которые обычно стерильны. 24 Сообщения о чувствительности и специфичности посевов мокроты широко различаются. 23 Если получена культура мокроты, необходимо отметить наличие эпителиальных клеток, которые могут указывать на загрязнение культуры. Культуры мокроты должны содержать менее 10 эпителиальных клеток на поле с малым увеличением. В определенных группах пациентов, например, с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), у которых наблюдается обострение, следует избегать посева мокроты. 25 Вместо того, чтобы использовать такие культуры для определения наличия инфекции, в рекомендациях Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких 2017 рекомендуется оценивать симптомы пациента, такие как выделение мокроты, гнойность и одышка.У пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, посевы обычно получают путем эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа. Эндотрахеальная аспирация имеет меньшую специфичность, чем бронхоальвеолярный лаваж для диагностики пневмонии, хотя она имеет меньше осложнений и более низкую стоимость. 26 Эта более низкая специфичность может привести к более высокому использованию антибиотиков. Рекомендации различаются в зависимости от предпочтения эндотрахеальной аспирации или бронхоальвеолярного лаважа, поскольку выбор основан на деэскалации антибиотиков или стоимости и осложнениях этих методов. 27 , 28 Клиницисты должны руководствоваться стандартами своего учреждения, когда рекомендуют эндотрахеальную аспирацию или бронхоальвеолярный лаваж.

Посев мочи

Посев мочи следует отбирать только при подозрении на инфекцию, обычно при наличии симптомов, о которых сообщает пациент. 29 Типичные симптомы инфекции мочевыводящих путей включают дизурию, частоту и неотложность позывов, хотя пациенты с деменцией могут проявлять неспецифические признаки, такие как усталость и изменения психического статуса. 30 У пациентов с мочевыми катетерами симптомы носят более общий характер и могут включать лихорадку, слабость и изменение психического статуса. 31 Скрининг бессимптомной бактериурии следует проводить только у беременных или у пациентов, подвергающихся урологическим процедурам. 29 При обследовании пациента с потенциальной инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) следует оценивать посев мочи вместе с симптомами и анализом мочи. Десять или более лейкоцитов на микролитр в анализе мочи связаны с диагнозом ИМП, но это не должно быть единственным критерием, используемым для диагностики.Культуры у пациентов без мочевых катетеров лучше всего собирать на полпути, чтобы избежать заражения. В посеве мочи количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл является оценкой количества бактерий в образце. Более 10 3 КОЕ на мл в посеве мочи связано с инфекцией. Однако истинная инфекция может возникать у пациентов с более низкими КОЕ при наличии симптомов и лейкоцитов в моче. 32 Пациенты с катетер-ассоциированными ИМП также имеют более низкие КОЕ.И наоборот, более высокое количество КОЕ может иметь место в присутствии контаминантов и после неправильно взятого образца. Бактерии, которые обычно не наблюдаются при ИМП, могут быть вызваны контаминацией, за исключением случаев, когда у пациента есть факторы риска для других типов бактерий и образец не собирается надлежащим образом. Обычные бактерии при неосложненных ИМП включают видов Escherichia coli , видов Klebsiella , видов Proteus и Staphylococcus saprophyticus .

Инфекции кожи и мягких тканей

Американское общество инфекционных болезней (IDSA) рекомендует делать посевы на абсцессы и карбункулы, хотя они упоминают эмпирическое лечение без посева как разумное. 33 При целлюлите IDSA рекомендует проводить посев крови только при наличии у пациента определенных факторов. К этим факторам относятся: иммуносупрессия, злокачественные новообразования, укусы животных и / или иммерсионные травмы. 34 Посев на поверхность кожи следует получать только при гнойном дренаже. Получение кожных культур при инфекциях без дренажа часто приводит к выявлению полимикробных организмов, которые не являются причиной инфекции, что приводит к чрезмерно широкому лечению. 35 Как и в случае ИМП, для постановки диагноза важны анамнез пациента и обследование.Пациенты с гнойным дренажом с большей вероятностью будут инфицированы S. aureus , , а пациенты с негнойным целлюлитом с большей вероятностью будут инфицированы стрептококками группы А. 36

Инфекции костей и суставов

Бактериальные инфекции суставов и костей могут возникать при попадании бактерий из крови, протезов, травм или распространения кожной инфекции. Знание источника может помочь предсказать, какие бактерии могут быть причиной. Типичные симптомы совместных инфекций включают лихорадку, болезненные и опухшие суставы, болезненность и уменьшение диапазона движений. 37 Пациенты с протезами суставов или недавними операциями на суставах (обычно <3 месяцев) более подвержены инфекциям суставов. 38 Совместные инфекции диагностируются с помощью посевов синовиальной жидкости, из которых жидкость берется во время операции или путем аспирации. Повышенное количество лейкоцитов (WBC) в синовиальной жидкости, особенно когда количество превышает 50 000 клеток / мм 3 , может помочь в исключении (специфичность 90%), но не исключить (чувствительность 56%) инфекции суставов. 39 Окраска по Граму также имеет низкую чувствительность (45–71%) для диагностики инфекций суставов.Наконец, оценка содержания белка или глюкозы в синовиальной жидкости не помогает в диагностике. Пациенты с остеомиелитом обычно проявляют симптомы лихорадки, вялости, воспаления, эритемы и отека. 40 Посевы костной биопсии и рентгенограммы играют важную роль в диагностике остеомиелита, наряду с выявлением возбудителя. Также могут быть взяты посевы крови для определения организма при гематогенном остеомиелите. Наконец, у пациентов обычно наблюдается повышенное количество лейкоцитов, повышенная скорость оседания эритроцитов и повышенный уровень С-реактивного белка, хотя их нельзя использовать в диагностике без посева. 41

Культуры спинномозговой жидкости

Культуры спинномозговой жидкости (ЦСЖ) играют важную роль в диагностике менингита. 42 Культуры спинномозговой жидкости, связанные с нелеченым бактериальным менингитом, обычно показывают повышенное количество лейкоцитов (> 1000 клеток / мм 3 ), хотя может наблюдаться более низкое количество лейкоцитов. Повышение количества лейкоцитов также может произойти, если люмбальная пункция травматична. Общее правило состоит в том, что каждые 1000 эритроцитов в спинномозговой жидкости увеличивают количество лейкоцитов в спинномозговой жидкости на единицу. 43 Нейтрофилы обычно> 80%, хотя у 10% пациентов можно увидеть лимфоциты> 50%. Кроме того, при бактериальном менингите культуры спинномозговой жидкости часто имеют высокое содержание белка (> 0,9 г / л), поскольку белок имеет повышенное проникновение в спинномозговую жидкость при воспалении менингеальной оболочки. 44 При бактериальном менингите глюкоза утилизируется бактериями; следовательно, можно увидеть низкий уровень глюкозы в спинномозговой жидкости (<40 мг / дл) или соотношение между глюкозой в спинномозговой жидкости и глюкозой в сыворотке (≤ 40%). Давление открытия при люмбальной пункции также может быть выше 200 мм H 2 O. 43 Окраска по Граму полезна для диагностики пациентов с бактериальным менингитом, особенно с большим количеством бактерий. Сообщается, что в некоторых случаях специфичность окраски по Граму достигает 97%. Наконец, полимеразная цепная реакция (ПЦР) обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может использоваться для исключения бактериального менингита, если окраска ЦСЖ по Граму и культура отрицательны. 45

Культуры кала

Посевы кала могут быть рассмотрены у пациентов, которые поступают с постоянной диареей или кровавой диареей или которые недавно побывали в районах с плохой общественной системой санитарии.Достаточно получить один посев кала, и он может обнаружить патоген в 87–94% случаев. 46 Лаборатории регулярно проводят скрининг бактерий, таких как Salmonella, Shigella, E. coli и Campylobacter , в культурах стула. Кроме того, исследование Clostridium difficile может быть рассмотрено у пациентов с факторами риска инфекции, такими как принимавшие антибиотики в течение последних двух месяцев, имеющие более двух несформированных испражнений за 24 часа, увеличение количества лейкоцитов, ухудшение функции почек и снижение альбумина. 47 Существует несколько тестов для обнаружения C. difficile . Чаще всего эти тесты включают иммуноферментный анализ на токсины A и B, иммуноферментный анализ на глутаматдегидрогеназу (GDH) и молекулярный анализ. Большинство лабораторий сначала проводят иммуноанализ на токсины A и B, обычно одновременно с анализом GDH. Совместное использование этих двух тестов имеет высокую специфичность (97% или выше), но чувствительность тестов ниже (41–92%). 48 , 49 Если иммуноферментный анализ на токсины A и B, а также GDH положительны, то C.difficile скорее всего . Если один из них положительный, а другой отрицательный, следует провести дальнейшее тестирование с помощью молекулярных анализов, так как это может улучшить чувствительность и специфичность. Тестирование после разрешения бесполезно, так как посев кала будет оставаться положительным в течение нескольких недель после заражения.

РАННЕЕ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ

Важно проводить тестирование на чувствительность к антибиотикам, поскольку оно помогает врачам выбрать подходящую схему лечения инфекции.Различные подходы к ранней идентификации бактерий включают окрашивание по Граму, масс-спектрометрию с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF), ПЦР, технологию зондов с наночастицами и флуоресценцию пептидных нуклеиновых кислот in situ (PNA-FISH).

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму — это диагностический тест, который дает раннее выявление потенциальных бактерий посредством визуализации бактерий. Окраска по Граму помогает дифференцировать организм, будь то грамположительные или грамотрицательные. 50 Грамположительные бактерии имеют пурпурный цвет, а грамотрицательные — розовый. Кроме того, форма, расположение и размер организма могут предоставить дополнительную информацию, которая поможет идентифицировать организм. Обычно при окрашивании по Граму видны кокки, похожие на сферы; бациллы, напоминающие палочки; или коккобациллы, которые представляют собой комбинацию этих двух. Кокки могут быть расположены в виде узоров, таких как группы или цепочки; например, виды Staphylococcus появляются в виде грамположительных кокков в скоплениях.Размер может помочь микробиологу различать бациллы, хотя врачу об этом нечасто сообщают.

Для окрашивания по Граму технический специалист наносит бактерии на предметное стекло, а затем пропускает его над пламенем, чтобы убедиться, что бактерии остаются на предметном стекле. Затем наносится кристально-фиолетовый краситель, который окрашивает все бактерии в пурпурный цвет. Затем применяется йод, который помогает красителю связываться с пептидогликановым слоем клеточной стенки, а затем ацетон, который смывает краситель. Пурпурный краситель остается на грамположительных бактериях в результате прочной связи между бактериями и толстым пептидогликановым слоем, но он смывается с грамотрицательных бактерий, которые имеют тонкий пептидогликановый слой.Наконец, применяется краситель, такой как сафранин, который окрашивает грамотрицательные бактерии в розовый цвет. 51 Другие тесты могут быть выполнены для дальнейшей дифференциации бактерий. Чашки с агаром MacConkey можно использовать для дифференциации грамотрицательных бактерий, ферментирующих лактозу, и бактерий, не ферментирующих лактозу. Тест на коагулазу можно использовать для дифференциации между Staphylococcus aureus и другими видами стафилококков . Если тест на коагулазу положительный, вероятно, это бактерии. Staphylococcus aureus ; если он отрицательный, вероятнее всего, это бактерии Staphylococcus epidermis или Staphylococcus saprophyticus.

Понимание закономерностей предварительного роста организмов может помочь клиницистам выбрать подходящий антибиотик. Блок-схема предназначена для помощи в предварительной идентификации бактерий. Однако чувствительность и специфичность окраски по Граму могут широко варьироваться; поэтому перед деэскалацией проводится дальнейшая микробиологическая идентификация. 52 , 53 Тем не менее, окраска по Граму является полезным инструментом при проведении эмпирической терапии до получения окончательных результатов посева.

Классификация распространенных грамположительных и грамотрицательных бактерий

Быстрые диагностические тесты

Быстрые диагностические тесты могут помочь в более быстром выявлении и снижении эскалации антибиотикотерапии. Фармацевты сыграли решающую роль в предоставлении поставщикам рекомендаций на основе этих тестов. 54 , 55 Эти системы быстрой диагностики включают MALDI-TOF, ПЦР, PNA-FISH и технологию датчиков наночастиц. MALDI-TOF можно объяснить, разложив аббревиатуру.Для выполнения MALDI-TOF образец выращивают на чашке с агаром и помещают на чашку MALDI, после чего добавляют матрицу. MA trix помогает преобразовать L asser в тепло, которое заставляет образец превращаться в D esorb с пластины и образовывать I onized молекулы. Молекулы превращаются в газ, который затем летит в лампу T ime- O f- F в зависимости от их размера и заряда. Молекулы с меньшим отношением размера к заряду движутся быстрее, что создает спектр, основанный на размере и заряде молекул.Этот спектр соответствует библиотекам спектров для известного организма, такого как Escherichia coli . Спектры также коррелируют со значением баллов на машине MALDI-TOF, которое указывает вероятность правильного определения тестируемого рода и / или вида. 56 Основным преимуществом MALDI-TOF является быстрая (менее пяти часов) идентификация бактерий. Однако в настоящее время тест не предоставляет информации о чувствительности и не может обнаружить гетерорезистентность.Гетерорезистентность возникает, когда субпопуляция бактериальных клеток проявляет более высокую устойчивость к антибиотикам, чем остальная часть культуры. 57

Альтернативным методом быстрой идентификации является ПЦР, которая работает путем создания множественных копий сегментов ДНК, используемых для идентификации бактерий. Для проведения ПЦР необходимы сегмент ДНК, нуклеотиды, полимераза и праймер. 58 ДНК нагревается, в результате чего она расщепляется на две отдельные нити. Эти нити праймируются, а затем полимераза создает новые нити ДНК, используя нуклеотиды.Процесс повторяется для создания нескольких копий сегментов ДНК, которые можно анализировать для идентификации микроба. Преимущества ПЦР включают быструю идентификацию (менее одного часа) бактерий и способность обнаруживать бактерии, пока пациент находится на антибактериальной терапии. Но этот метод также имеет некоторые ограничения, поскольку ПЦР может обнаруживать бактерии, которые становятся нежизнеспособными после лечения пациента от инфекции. 59 Кроме того, точность может снизиться при полимикробных инфекциях. Мультиплексная ПЦР, расширение ПЦР, решает эту проблему за счет использования нескольких праймеров, что позволяет идентифицировать несколько бактерий.Это также позволяет обнаруживать гены устойчивости к антибиотикам.

Технология наночастиц также использует ДНК для идентификации бактерий. Этот тест, в котором используются наносетки (слайды, покрытые ДНК) для связывания с грамположительной или грамотрицательной ДНК, используется только у пациентов с положительными культурами крови. 60 Когда происходит связывание, прикрепляются наночастицы золота, затем раствор смывается с предметного стекла, и раствор связывается с золотом. Свет, проходящий через слайды, позволяет визуализировать серебро, рассеивая свет в камере.Преимущества этого теста заключаются в быстрой идентификации (менее трех часов) большого количества бактерий и механизмов устойчивости. Его ограничения включают требование положительного посева крови и тот факт, что не все потенциальные патогены можно идентифицировать.

В отличие от ПЦР и технологии нанозондов-частиц, которые идентифицируют бактерии путем обнаружения ДНК, PNA-FISH идентифицирует бактерии с помощью зондов для идентификации рибосомной РНК. PNA-FISH также можно объяснить, разложив аббревиатуру.В этой процедуре зонды F люоресцентные p eptide- n ucleic a cid ( PNA ) наносят на бактерии, закрепленные на предметном стекле. 61 Эти зонды H гибридизуются (связываются) с рибосомной РНК и просматриваются под флуоресцентным микроскопом в реальном времени ( I n S itu) . Преимущества PNAFISH включают быстрое обнаружение (менее одного часа), возможность идентифицировать бактерии, которые труднее выращивать традиционными методами (анаэробы, виды Mycoplasma ) и меньшую стоимость по сравнению с ПЦР.Основным недостатком PNA-FISH является то, что исследователь должен предвидеть потенциальные бактерии, поскольку разные бактерии имеют разные наборы. Информация о окраске по Граму может помочь в выборе подходящего набора. Таким образом, если росли лактозоположительные грамотрицательные бациллы, технический специалист выбрал бы набор для использования с E. Coli / P. Aeruginosa . Кроме того, PNA-FISH может обнаруживать лекарственную устойчивость только в том случае, если возникают мутации с рибосомной РНК.

ОБЫЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛОВ И ТЕСТИРОВАНИЕ НА АНТИБИОТИКУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ

Обычная идентификация бактерий заключается в окрашивании по Граму с последующей идентификацией бактерий и тестированием на чувствительность к антибиотикам.Процесс от начала до конца может занять до пяти дней, что может задержать время до деэскалации антибиотиков. 59 Стандарты чувствительности к антибиотикам в США определяются Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), что в основном относится к стандартам, установленным Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI). Стандарты могут отличаться в других странах, что может привести к расхождениям в определении чувствительности к антибиотикам; это привело к созданию Национального комитета по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам США (USCAST).Этот комитет работает с Комитетом Европейского Союза по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам, чтобы нормализовать стандарты на международном уровне. Для определения чувствительности к антибиотикам используются количественные данные, которые далее разбиваются на качественные категории, как показано на рис.

Таблица 1

Окончательный отчет о чувствительности к антибиотикам для Klebsiella Pneumoniae

3 3

Amikill

Cefazolin Cefazolin

≥ 64

9 0353 R

МИК (мкг / мл) Интерпретация
≥ 32 R
Ампициллин / Сульбактам 16 I
Цефазолин ≥ 64 R
R
Ципрофлоксацин ≥ 64 R
ESBL * NEG
Gentamicin

Gentamicin

1 S
Пиперациллин ≥ 128
Пиперациллин / тазобактам 1.5 S
Тигециклин ≤ 0,5 S
Тобрамицин 8 I
Испытание на триметоприм / сульфаметоксазол выполняется путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК). МПК — это самая низкая концентрация антибиотика, необходимая для подавления роста организма. Самый низкий МПК не всегда коррелирует с наиболее эффективным лечением, поскольку разные антибиотики достигают разных концентраций в разных местах. 62 Для определения качественных категорий используются конкретные значения МИК, также известные как контрольные точки, для классификации бактерий как чувствительных, промежуточных или устойчивых к определенному антибиотику. Для определения контрольных точек CLSI использует фармакокинетические, фармакодинамические механизмы, механизмы резистентности и клинические данные.

CLSI определяет как чувствительные те изоляты, которые ингибируются типичными достижимыми концентрациями антибиотика при использовании дозировки, рекомендованной для лечения очага инфекции. 63 Дозозависимая чувствительная категория определяется, когда требуется режим дозирования, который приводит к большему воздействию лекарственного средства, чем тот, который используется в чувствительной категории для достижения клинической эффективности. Промежуточная категория включает изоляты, которые достигают обычно достижимых уровней в крови и тканях с помощью антибиотиков, а показатели ответа ниже, чем у чувствительных изолятов. Наконец, категория резистентности включает изоляты, которые не ингибируются обычными достижимыми концентрациями антибиотиков или для которых вероятны механизмы резистентности, а клиническая эффективность антибиотиков достоверно не доказана.

Тестирование диффузии

Дисковая диффузия, или метод Кирби-Бауэра, является распространенным тестом, используемым для определения чувствительности к антибиотикам (см.). При тестировании диффузии диск с антибиотиком помещается на пластину с агаром, содержащую бактерии. Планшет инкубируют до 24 часов, и в течение этого времени антибиотик диффундирует по всему планшету, образуя градиент концентрации, окружающий диск. 64 Чем меньше концентрация антибиотика, тем выше вероятность роста бактерий.Диаметр области, на которой нет роста, измеряется для определения восприимчивости в соответствии с рекомендациями CLSI. Большие зоны указывают на снижение роста бактерий с большей чувствительностью к антибиотикам, тогда как меньшие зоны показывают усиленный рост бактерий с меньшей чувствительностью к антибиотикам. Если антибиотик не подавляет рост, зоны подавления нет, следовательно, бактерии устойчивы.

Дисковая диффузия (метод Кирби-Бауэра)

Тестирование разведения

Обычные тесты разведения включают разведение в бульоне и разведение в агаре.В обоих тестах бактерии помещают на несколько планшетов, пробирок или лунок, содержащих определенную концентрацию антибиотика. 64 Например, максимальная концентрация антибиотика в наборе лунок может составлять 4,0 мкг / мл. Следующая лунка после одного разведения будет иметь концентрацию 2,0 мкг / мл, затем 1,0 мкг / мл после двух разведений и 0,5 мкг / мл после трех разведения. Пример микроразбавления бульона показан на, а разведение в агаре показано на. Результаты теста на разведение могут отличаться, и обычно бывает однократная ошибка разведения.Например, если определено, что МИК составляет 1 мкг / мл, истинный диапазон МИК может составлять от 0,5 до 2 мкг / мл. Это может быть проблематично, если диапазон включает чувствительные и промежуточные значения MIC.

Разведение бульона состоит из микроразведения и макроразведения. Несмотря на то, что они похожи, методы различаются в первую очередь модальностью, которая используется для проведения теста на чувствительность (лунки или пробирки). 65 Микроразбавление бульона выполняется путем помещения различных антибиотиков с разной концентрацией в лунки, содержащие жидкую среду, как показано на рис.Бактерии добавляются в каждую лунку, и лоток инкубируется. Присутствие бактериального роста затем определяется путем визуального осмотра планшета. МИК теста на микроразбавление бульона определяют, когда при использовании определенного антибиотика роста не наблюдается. Преимущество этого теста в том, что одновременно можно тестировать более одного антибиотика. Недостатки заключаются в том, что разбавление бульона требует больших затрат труда и времени, а также могут возникать потенциальные процедурные ошибки.

Тест на разведение в агаровой среде аналогичен тесту на разведение в бульоне, с основным отличием в том, что в нем используются физические среды, а не жидкие среды.Разбавление агара выполняется путем помещения стандартных концентраций организма на чашки с агаром, которые различаются по концентрации антибиотика, как показано на рис. 64 МИК определяют в первой пробирке, которая не демонстрирует роста организма. Этот тест обычно используется при тестировании нескольких бактерий против определенного антибиотика. Разбавление агара также является трудоемким и требует много времени, и при этом нельзя тестировать более одного антибиотика за раз. 65

Комбинированное тестирование диффузии и разведения

Е-тест — это количественный тест, сочетающий методы диффузии и разведения. 64 Вместо диска в тесте используется тест-полоска E-test, содержащая антибиотик, который диффундирует через пластину с агаром, содержащую бактерии. Вдоль полоски имплантирован антибиотик различной концентрации (). В отличие от тестирования разбавления, различия в концентрации не отличаются друг от друга на одно разведение; вместо этого они расположены ближе друг к другу, что может обеспечить большую точность. После инкубации планшета в течение 24 часов зона ингибирования образует эллипс и пересекает полосу на планшете.Точка пересечения определяет значение MIC. E-тест является преимуществом, потому что стабильный градиент используется с более высоким посевом бактерий, что позволяет более точно считывать значения MIC. Недостатки в том, что на полосках можно тестировать только один антибиотик, а тест может быть дорогостоящим и трудоемким.

Автоматизированные системы

Преимущество автоматизированных систем состоит в том, что они менее трудозатратны и позволяют быстрее составлять отчеты о результатах. 66 Эти системы в основном используют принципы разведения для определения чувствительности к антибиотикам.Полностью автоматические системы вводят бактерии в панель, инкубируют их, затем считывают и интерпретируют результаты чувствительности. Автоматические тесты определяют МПК с помощью алгоритмов и разрешают правила, предсказывающие устойчивость к другим антибиотикам. Кроме того, эти системы могут сохранять результаты для использования при создании антибиотиков вместе с другими отчетами. FDA устанавливает стандарты для утверждения автоматизированных систем, которые включают уровень ложной устойчивости менее 3% и ложной восприимчивости менее 1.5% на нижней границе 95% доверительного интервала (ДИ) и менее 7,5% на верхней границе 95% доверительного интервала. 67 Они также должны согласиться, в пределах одного разведения, на контрольную точку излома более чем в 90% случаев. Доступны различные автоматизированные системы, включая VITEK 2, Microscan Walkaway plus, Phoenix и Sensititre. Каждая система имеет множество панелей, которые тестируют разные бактерии и разные комбинации лекарств. Хотя ошибки могут возникать, это происходит на уровне комбинации лекарств и бактерий.Если ожидаются ошибки, результаты следует подтвердить ручным тестированием. Каждая система постоянно обновляется и может работать по-разному в зависимости от комбинации препарата и бактерий, что затрудняет рекомендацию одной системы по сравнению с другой.

In vitro по сравнению с In vivo Результаты

Антибиотики могут не дать излечения в клинических условиях ( in vivo, ), несмотря на демонстрацию чувствительности в лабораторных условиях ( in vitro, ). Это может происходить в результате механизмов резистентности, выработки токсинов или фармакокинетических и фармакодинамических свойств антибиотиков.Эта статья посвящена механизмам резистентности, и читатели могут обратиться к обзорам токсинов, фармакокинетики и фармакодинамики для получения дополнительной информации. 68 , 69 Резистентность может развиться во время лечения пациента антибиотиками; это было хорошо задокументировано с помощью клиндамицина. 70 D-тест на клиндамицин, использующий принцип дисковой диффузии, может помочь выявить индуцибельную резистентность к клиндамицину у гемолитических стрептококков S. aureus и β .Для проведения теста диск, содержащий клиндамицин и эритромицин, помещают на тот же планшет и планшеты инкубируют. Если зона подавления отображается в виде круга, индуцируемого сопротивления нет; если он отображается как «D», имеется индуцируемое сопротивление.

По мере развития новых механизмов устойчивости лабораториям необходимо разработать новые способы обнаружения устойчивости. Одним из примеров этого является обнаружение бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и / или бета-лактамазы AmpC. 71 , 72 БЛРС — это ферменты, расщепляющие многие бета-лактамные антибиотики, что делает их неэффективными.Они с большей вероятностью присутствуют в грамотрицательных бактериях, связанных с инфекциями, связанными со здоровьем. Для выявления БЛРС проводится скрининг путем тестирования определенных антибиотиков, таких как цефотаксим, с последующим добавлением клавулановой кислоты. Если скрининг БЛРС проводится с использованием микроразбавления бульона, МИК сравнивается между цефотаксимом и цефотаксимом плюс клавулановая кислота. Если при добавлении клавулановой кислоты наблюдается трехкратное изменение МИК при разведении, БЛРС присутствует. Например, если МИК составляет 2 мкг / мл для одного цефотаксима и снижается до 0.5 мкг / мл при добавлении клавулановой кислоты свидетельствует о наличии БЛРС. Интерпретация ESBL может быть дополнительно осложнена присутствием другой бета-лактамазы, AmpC. Это может привести к ложноотрицательному скринингу на БЛРС, но его можно обнаружить с помощью Е-теста. В будущем, вероятно, будут выявлены новые механизмы резистентности, которые создадут новые проблемы в достижении клинического излечения.

Тестирование на чувствительность к противомикробным препаратам: обзор общих принципов и современной практики | Клинические инфекционные болезни

Аннотация

Важной задачей лаборатории клинической микробиологии является проведение испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам значимых бактериальных изолятов.Цели тестирования — выявить возможную лекарственную устойчивость у распространенных патогенов и гарантировать чувствительность к препаратам выбора для конкретных инфекций. Наиболее широко используемые методы тестирования включают микроразбавление бульона или быстрые автоматизированные инструментальные методы, в которых используются коммерчески продаваемые материалы и устройства. Ручные методы, которые обеспечивают гибкость и возможную экономию затрат, включают методы диффузии по диску и градиентной диффузии. У каждого метода есть свои сильные и слабые стороны, в том числе организмы, которые могут быть точно протестированы этим методом.Некоторые методы обеспечивают количественные результаты (например, минимальную ингибирующую концентрацию), и все обеспечивают качественные оценки с использованием категорий чувствительности, промежуточности или устойчивости. В целом современные методы тестирования обеспечивают точное обнаружение общих механизмов устойчивости к противомикробным препаратам. Однако новые или появляющиеся механизмы устойчивости требуют постоянной бдительности в отношении способности каждого метода тестирования точно определять устойчивость.

Появление устойчивости к противомикробным препаратам и обоснование для проведения тестирования на чувствительность

Проведение испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам в лаборатории клинической микробиологии важно для подтверждения чувствительности к выбранным эмпирическим антимикробным агентам или для выявления устойчивости у отдельных бактериальных изолятов.Эмпирическая терапия продолжает быть эффективной в отношении некоторых бактериальных патогенов, поскольку механизмы устойчивости не наблюдались, например, сохраняющаяся чувствительность к пенициллину Streptococcus pyogenes . Проверка чувствительности отдельных изолятов важна для видов, которые могут обладать механизмами приобретенной устойчивости (например, представители Enterobacteriaceae, виды Pseudomonas, видов Staphylococcus , виды Enterococcus и Streptococcus pneumoniae).

Обзор широко используемых методов тестирования на чувствительность

Тесты разбавления бульона. Одним из первых методов тестирования чувствительности к противомикробным препаратам был метод разведения макробротом или пробиркой [1]. Эта процедура включала приготовление двукратных разведений антибиотиков (например, 1, 2, 4, 8 и 16 мкг / мл) в жидкой питательной среде, разливаемой в пробирки [1, 2]. Пробирки с антибиотиками засевали стандартизированной бактериальной суспензией 1–5 × 10 5 КОЕ / мл.После инкубации в течение ночи при 35 ° C пробирки исследовали на предмет видимого роста бактерий, о чем свидетельствует помутнение. Самая низкая концентрация антибиотика, предотвращающая рост, представляет собой минимальную ингибирующую концентрацию (МИК). Считалось, что точность этого метода составляет плюс-минус 1 двукратная концентрация, в значительной степени из-за практики ручного приготовления серийных разведений антибиотиков [3]. Достоинством этого метода было получение количественного результата (т. Е. MIC).Основными недостатками метода макроразведения были утомительная ручная работа по приготовлению растворов антибиотиков для каждого теста, возможность ошибок при приготовлении растворов антибиотиков, а также относительно большое количество реагентов и пространство, необходимое для каждого теста.

Миниатюризация и механизация теста за счет использования небольших одноразовых пластиковых лотков для «микроразбавления» (рис. 1) сделали тестирование разбавления бульона практичным и популярным. Стандартные лотки содержат 96 лунок, каждая объемом 0 мкл.1 мл, что позволяет протестировать примерно 12 антибиотиков в 8 двукратных разведениях в одном лотке [2, 4]. Панели для микроразведений обычно готовятся с использованием дозирующих инструментов, которые распределяют точные объемы предварительно взвешенных и разведенных антибиотиков в бульоне в отдельные лунки лотков из сосудов большого объема. Сотни идентичных тарелок можно приготовить из одного основного набора разведений за относительно короткий период. Некоторые лаборатории клинической микробиологии готовят свои собственные панели; вместо этого замороженные или высушенные панели для микроразведения приобретаются у одного из нескольких коммерческих поставщиков.Стоимость готовых панелей составляет примерно от 10 до 22 долларов каждая. Инокуляция панелей стандартом 5 × 10 5 КОЕ / мл осуществляется с помощью одноразового устройства, которое переносит 0,01–0,05 мл стандартизированной бактериальной суспензии в каждую лунку лотка для микроразведений или с помощью механизированного дозатора. После инкубации МИК определяют с помощью ручного или автоматического устройства просмотра для проверки каждой лунки панели на предмет роста [2].

Рисунок 1

Панель чувствительности к микроразбавлению бульона, содержащая 98 лунок с реагентами и одноразовый посевной лоток

Рисунок 1

Панель чувствительности к микроразведению бульона, содержащая 98 лунок с реагентами и одноразовый посевной лоток

МИК, воспроизводимость и удобство заранее приготовленных панелей, а также экономия реагентов и пространства, которая достигается за счет миниатюризации теста.Также оказывается помощь в создании компьютеризированных отчетов, если используется автоматический считыватель панелей. Основным недостатком метода микроразведения является некоторая негибкость выбора лекарств, доступных в стандартных коммерческих панелях.

Антимикробный градиентный метод. Метод диффузии в градиенте противомикробных препаратов использует принцип установления градиента концентрации противомикробных препаратов в агаризованной среде как средство определения чувствительности. Etest (bioMérieux AB BIODISK) (рис. 2) — это коммерческая версия, доступная в США.В нем используются тонкие пластиковые тест-полоски, которые пропитаны с нижней стороны градиентом концентрации высушенного антибиотика и отмечены на верхней поверхности шкалой концентрации. До 5 или 6 полосок могут быть размещены радиально на поверхности соответствующей 150-миллиметровой чашки с агаром, засеянной стандартизированной суспензией организмов, подобной той, которая используется для теста диффузии на дисках. После инкубации в течение ночи тесты считываются, просматривая полоски сверху планшета. МИК определяют по пересечению нижней части эллиптической зоны ингибирования роста с тест-полоской.

Рисунок 2

Изолят Staphylococcus aureus протестирован методом градиентной диффузии Etest с ванкомицином (VA), даптомицином (DM) и линезолидом (LZ) на агаре Мюллера-Хинтона. Минимальная ингибирующая концентрация каждого агента определяется пересечением роста микроорганизмов с полоской при измерении с использованием шкалы, нанесенной на полоску.

Рисунок 2

Изолят Staphylococcus aureus протестирован методом градиентной диффузии Etest с ванкомицином (VA), даптомицином (DM) и линезолидом (LZ) на агаре Мюллера-Хинтона.Минимальная ингибирующая концентрация каждого агента определяется пересечением роста микроорганизмов с полоской при измерении с использованием шкалы, нанесенной на полоску.

Метод градиентной диффузии обладает внутренней гибкостью, поскольку позволяет тестировать лекарственные препараты, выбранные лабораторией. Полоски Etest стоят примерно 2–3 доллара каждая и могут представлять собой дорогостоящий подход, если тестируется несколько препаратов. Этот метод лучше всего подходит для ситуаций, в которых необходим МПК только для одного или двух препаратов или когда нужно тестировать требовательный организм, требующий обогащенной среды или специальной инкубационной атмосферы (например, пенициллин и цефтриаксон с пневмококками) [5-7].Как правило, результаты Etest хорошо коррелируют с MIC, полученными с помощью методов разбавления в бульоне или агаре [5-9]. Однако есть некоторые систематические предубеждения в сторону более высоких или более низких значений МИК, определяемых Etest при тестировании определенных комбинаций организм-противомикробный агент [6, 10]. Это может представлять собой потенциальный недостаток, когда стандартные критерии интерпретации МИК, полученные в результате тестирования разбавления бульона [10], применяются к МИК Etest, которые могут быть не идентичными.

Тест диффузии диска. Метод дисковой диффузионной восприимчивости [2, 11, 12] прост, практичен и хорошо стандартизирован.Тест проводится путем нанесения бактериального посевного материала примерно 1-2 × 10 8 КОЕ / мл на поверхность большой (диаметром 150 мм) чашки с агаром Мюллера-Хинтона. На засеянную поверхность агара помещают до 12 коммерческих бумажных дисков с фиксированной концентрацией антибиотиков (рис. 3). Планшеты инкубируют в течение 16–24 ч при 35 ° C перед определением результатов. Зоны задержки роста вокруг каждого диска с антибиотиком измеряются с точностью до миллиметра. Диаметр зоны зависит от восприимчивости изолята и скорости диффузии лекарственного средства через агаровую среду.Диаметр зоны каждого препарата интерпретируется с использованием критериев, опубликованных Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI, ранее Национальный комитет клинических лабораторных стандартов или NCCLS) [13] или критериями, включенными в Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) — утвержденные товарные вкладыши для дисков. Результаты диско-диффузионного теста являются «качественными» в том смысле, что категория восприимчивости (т. Е. Чувствительная, промежуточная или устойчивая) определяется тестом, а не МПК.Однако некоторые коммерчески доступные системы считывания зон заявляют, что рассчитывают приблизительный МПК для некоторых организмов и антибиотиков путем сравнения размеров зон со стандартными кривыми этого вида и лекарства, хранящимися в алгоритме [14, 15].

Рисунок 3

Диско-диффузионный тест с изолятом Escherichia coli из посевов мочи. Диаметр всех зон ингибирования измеряется, и эти значения переводятся в категории восприимчивых, промежуточных или устойчивых с использованием последних таблиц, опубликованных CLSI.

Рис. 3

Диско-диффузионный тест с изолятом Escherichia coli из посевов мочи. Диаметр всех зон ингибирования измеряется, и эти значения переводятся в категории восприимчивых, промежуточных или устойчивых с использованием последних таблиц, опубликованных CLSI.

Преимуществами дискового метода являются простота тестирования, не требующая специального оборудования, предоставление категориальных результатов, легко интерпретируемых всеми клиницистами, и гибкость в выборе дисков для тестирования.Это наименее затратный из всех методов определения чувствительности (примерно 2,50-5 долларов США за тест для материалов). К недостаткам теста дисков можно отнести отсутствие механизации или автоматизации теста. Хотя не все привередливые или медленно растущие бактерии могут быть точно протестированы этим методом, дисковый тест стандартизирован для тестирования стрептококков, Haemophilus influenzae и N. meningitidis с использованием специализированных сред, условий инкубации и определенного размера зоны. критерии интерпретации [12].

Автоматизированные приборные системы. Использование инструментов может стандартизировать считывание конечных точек и часто дает результаты теста на чувствительность за более короткий период, чем ручное считывание, потому что чувствительные оптические системы обнаружения позволяют обнаруживать незначительные изменения в росте бактерий. В настоящее время FDA разрешает использовать 4 автоматизированных прибора в США. Три из них могут дать быстрые (3,5–16 ч) результаты теста на чувствительность, а четвертый — ночная система [16].MicroScan WalkAway (Siemens Healthcare Diagnostics) — это большой автономный инкубатор / считывающее устройство, которое может инкубировать и анализировать 40–96 лотков для микроразведений. В WalkAway используются лотки для микроразведений стандартного размера, которые гидратируются и инокулируются вручную, а затем помещаются в одно из гнезд инкубатора в приборе. Прибор инкубирует лотки в течение соответствующего периода, периодически исследуя их с помощью фотометра или флуорометра для определения развития роста. Тестовые панели грамотрицательной чувствительности, содержащие флуорогенные субстраты, можно прочитать в 3.5–7 ч. Отдельные грамположительные и грамотрицательные панели, считываемые с использованием турбидиметрических конечных точек, готовы через 4,5–18 часов.

Автоматизированная микробиологическая система BD Phoenix Automated Microbiology System (BD Diagnostics) оснащена большим считывающим устройством-инкубатором, способным обрабатывать 99 тестовых панелей, которые содержат 84 лунки, предназначенные для двойных разведений антибиотиков, и засеваются вручную. Phoenix контролирует каждую панель каждые 20 минут, используя как турбидометрическое, так и колориметрическое (индикатор окисления-восстановления) определение роста. Тест-панели на грамотрицательные, грамположительные, S.pneumoniae , β-гемолитики и стрептококки группы viridans. Результаты МИК получают через 6–16 часов.

Система Vitek 2 (bioMérieux) высоко автоматизирована и использует очень компактные пластиковые карточки с реагентами (размером с кредитную карту), которые содержат микролитровые количества антибиотиков и тестовые среды в 64-луночном формате. Vitek 2 использует повторяющийся турбидиметрический мониторинг роста бактерий в течение сокращенного инкубационного периода. Прибор может быть настроен на одновременное выполнение 30–240 тестов.Карты восприимчивости позволяют проводить тестирование на обычные, быстрорастущие грамположительные и грамотрицательные аэробные бактерии, а также на S. pneumoniae в течение 4–10 часов. Более старая, менее автоматизированная система Vitek 1 до сих пор используется в некоторых лабораториях. Система более ограничена 45-луночной картой и не включает S. pneumoniae .

Sensititre ARIS 2X (Trek Diagnostic Systems) — это автоматизированная система инкубации и считывания в ночное время с 64 панелями. Тестовые панели представляют собой стандартные 96-луночные планшеты для микроразведения, которые можно засеять с помощью автоинкулятора Sensititre.Рост определяется измерением флуоресценции через 18–24 ч инкубации. Доступны тестовые панели для грамположительных и грамотрицательных бактерий, видов S. pneumoniae , Haemophilus и неферментативных грамотрицательных бацилл.

Приборы Phoenix, Sensititre ARIS 2X, Vitek 1 и 2 и WalkAway имеют усовершенствованное компьютерное программное обеспечение, используемое для интерпретации результатов восприимчивости, включая «экспертные системы» для анализа результатов тестов на атипичные паттерны и необычные фенотипы устойчивости [16].Два исследования [17, 18] показали, что предоставление быстрых результатов теста на чувствительность может привести к более своевременным изменениям в соответствующей противомикробной терапии, существенной экономии прямых затрат, связанной с заказом меньшего количества дополнительных лабораторных тестов, выполнением меньшего количества инвазивных процедур и сокращением продолжительности лечения. оставаться. Эти преимущества лучше всего реализуются в сочетании с расширенным графиком укомплектования персоналом лаборатории и электронной передачей проверенных результатов в режиме реального времени. Одним из первых недостатков быстрых методов тестирования на чувствительность была ограниченная способность выявлять некоторые типы устойчивости к противомикробным препаратам, включая индуцибельные β-лактамазы и устойчивость к ванкомицину.Тем не менее, инструменты, недавно одобренные FDA, значительно улучшились в значительной степени за счет модификации компьютерного программного обеспечения инструментов для обеспечения расширенной инкубации проблемных комбинаций организм-лекарство или путем редактирования результатов чувствительности с использованием экспертного программного обеспечения, чтобы предотвратить получение маловероятных результатов. сообщил. В некоторых случаях эти модификации приводят к длительной инкубации (т.е.> 10 ч) тестовых панелей для обеспечения точных результатов, что делает их менее «быстрыми».”

Выбор препаратов для стандартного тестирования

Лаборатория должна протестировать и сообщить о противомикробных средствах, которые наиболее подходят для изолированного организма, для очага инфекции и формуляра учреждения [13, 19]. CLSI предоставляет таблицы, в которых перечислены противомикробные агенты, подходящие для тестирования представителей Enterobacteriaceae, Pseudomonas и других грамотрицательных неферментеров глюкозы, стафилококков, энтерококков, стрептококков, видов Haemophilus и т. Д.[13]. Списки включают рекомендации для агентов, которые важно тестировать в плановом порядке, и тех, которые могут тестироваться или о которых можно сообщить выборочно на основе формуляра учреждения.

Затем необходимо определить доступность противомикробных агентов для тестирования по стандартной лабораторной методике тестирования. Процедуры дисковой диффузии и градиентной диффузии обеспечивают максимальную гибкость, включая тестирование новых доступных лекарств. Большинство панелей для микроразведений бульонов или автоматизированных тестовых панелей содержат ≤96 лунок, что эффективно ограничивает количество тестируемых агентов или диапазон разведений каждого лекарства, которое может быть включено.Производители коммерчески приготовленных панелей пытались решить эту проблему, предлагая ряд различных стандартных конфигураций панелей или путем включения меньшего количества разведений каждого лекарства в одну панель [19]. Другим решением этой проблемы является тестирование противомикробных агентов, которые имеют активность, по существу, такую ​​же, как у желаемых лекарственных препаратов. В документе о тестировании чувствительности CLSI [13] перечислены группы некоторых противомикробных агентов с почти идентичной активностью, которые могут предоставить практические альтернативы для тестирования.

Интерпретация результатов теста на чувствительность

Результаты теста на чувствительность должны интерпретироваться лабораторией до передачи отчета врачу пациента. Оптимальная интерпретация МПК требует знания фармакокинетики препарата у людей и информации о вероятном успехе конкретного препарата в уничтожении бактерий на различных участках тела [20]. Лучше всего это сделать, обратившись к экспертному источнику, например, CLSI, который публикует критерии интерпретации МИК всех соответствующих антибиотиков для большинства родов бактерий [13].Действительно, и значения МИК, и диаметры дисковых диффузионных зон должны интерпретироваться с использованием таблицы значений, которые относятся к доказанной клинической эффективности каждого антибиотика и для различных видов бактерий [12]. Размер зоны CLSI и критерии интерпретации МИК устанавливаются путем анализа трех видов данных: (1.) микробиологических данных, включая сравнение МИК и размеров зон на большом количестве бактериальных штаммов, в том числе штаммов с известными механизмами устойчивости, которые имеют были определены фенотипически или генотипически; (2) фармакокинетические и фармакодинамические данные; и (3) результаты клинических исследований (включая сравнение МПК и диаметра зоны с микробиологической эрадикацией и клинической эффективностью), полученные в ходе исследований до утверждения FDA и продажи антибиотика [20].

Результат «чувствительность» указывает на то, что организм пациента должен реагировать на терапию этим антибиотиком, используя дозировку, обычно рекомендованную для данного типа инфекции и вида [13, 20]. И наоборот, организм с МИК или размером зоны, интерпретируемым как «устойчивый», не должен подавляться концентрациями антибиотика, достигаемыми с дозировками, обычно используемыми с этим лекарством [13, 20]. «Промежуточный» результат указывает на то, что микроорганизм попадает в диапазон чувствительности, в котором МПК приближается или превышает уровень антибиотика, который обычно может быть достигнут, и для которого клинический ответ, вероятно, будет меньше, чем для чувствительного штамма.Исключения могут иметь место, если антибиотик высококонцентрирован в жидкости организма, такой как моча, или если можно безопасно вводить более высокие, чем обычно, дозы антибиотика (например, некоторые пенициллины и цефалоспорины). Иногда «промежуточный» результат также может означать, что некоторые переменные в тесте на чувствительность не контролировались должным образом, и что значения попали в «буферную зону», отделяющую восприимчивые от устойчивых штаммов [13, 20]. Как правило, сообщение о результате категории «чувствительный», «промежуточный» или «устойчивый» предоставляет клиницисту информацию, необходимую для выбора соответствующей терапии.Отчетность о МПК может помочь врачу выбрать из группы аналогичных препаратов для лечения инфекционного эндокардита или остеомиелита, лечение которых, вероятно, будет продолжительным.

Важно, чтобы таблицы, используемые для интерпретации тестов на восприимчивость, отражали самые актуальные критерии. Действительно, документы CLSI часто пересматриваются и обновляются, обычно один раз в год. Использование старой или устаревшей информации из исходных изданий одобренных FDA этикеток лекарств или старых таблиц CLSI может представлять собой серьезный недостаток в отчетности о результатах пациентов.

Какова допустимая точность метода проверки чувствительности?

При оценке точности различных методов тестирования чувствительности по сравнению со стандартными эталонными методами, термины очень серьезные и серьезные ошибки использовались для описания ложно-чувствительных или ложно-устойчивых результатов, соответственно. При оценке новых методов тестирования чувствительности важно изучить репрезентативное количество штаммов, устойчивых к различным лекарствам, чтобы проверить способность нового теста выявлять резистентность, и протестировать ряд чувствительных штаммов, чтобы определить частоту серьезных ошибок, которые можно ожидать в типичных клинических лабораторных условиях [16, 21].Чтобы получить разрешение на продажу в Соединенных Штатах, FDA требует, чтобы очень серьезные ошибки, относящиеся к тестируемому устройству, составляли <1,5% для сравнения отдельных видов / лекарств, основные ошибки не должны превышать 3%, а общее обязательное соглашение по MIC> 90% МИК устройств в пределах одного двойного разведения эталонного МИК CLSI [22]. Недавний международный стандарт оценки устройств для тестирования чувствительности предлагает аналогичные, но не идентичные критерии приемлемой точности [23]. Появление новых механизмов устойчивости к противомикробным препаратам, включая те, которые трудно обнаружить (например, промежуточная чувствительность к ванкомицину у S.aureus и производство карбапенемазы у некоторых грамотрицательных организмов) требует, чтобы характеристики устройств для определения чувствительности постоянно пересматривались и обновлялись по мере необходимости. В некоторых случаях было необходимо использовать специальные вспомогательные методы тестирования (например, скрининговые агары с однократной концентрацией, модифицированный тест Ходжа на продукцию карбапенемазы) [13], чтобы дополнить рутинное тестирование с помощью коммерческой инструментальной системы.

Текущие методы испытаний и будущие направления

Методы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам, описанные в этой статье, обеспечивают надежные результаты при использовании в соответствии с процедурами, определенными CLSI или производителями коммерческих продуктов.Однако есть значительные возможности для улучшения в области быстрого и точного распознавания устойчивости бактерий к антибиотикам. Существует потребность в разработке новых автоматизированных инструментов, которые могли бы обеспечить более быстрые результаты, а также сэкономить деньги за счет более низких затрат на реагенты и меньших трудозатрат. Для этого, вероятно, потребуется изучить различные методологические подходы к обнаружению роста бактерий. Прямое обнаружение генов устойчивости с помощью полимеразной цепной реакции или аналогичных методов имеет ограниченную полезность, потому что только несколько генов устойчивости прочно связаны с фенотипической устойчивостью (например, mecA, vanA и vanB ) [24].Существуют сотни β-лактамаз и многочисленные мутации, приобретения и механизмы экспрессии, которые приводят к устойчивости к фторхинолонам, аминогликозидам и макролидам [25]; слишком много, чтобы их можно было легко обнаружить с помощью современных молекулярных методов. Таким образом, представляется вероятным, что фенотипические измерения уровня чувствительности бактериальных изолятов к противомикробным препаратам будут оставаться клинически значимыми в ближайшие годы.

Благодарности

Возможный конфликт интересов. J.H.J. и M.J.F. раскрыть свое членство в консультативных комитетах по микробиологии компаний BD Diagnostics и bioMérieux. J.H.J. консультировал Accelr8 Technology и получил исследовательскую поддержку от BD Diagnostics, bioMérieux, Merck, Pfizer и Siemens Healthcare.

Список литературы

1,.

Тестирование чувствительности к антибиотикам: отчет о международном совместном исследовании

,

Acta Pathol Microbiol Scand

,

1971

, vol.

217

Доп.

(стр.

1

90

) 2,. ,,,,.

Тесты на чувствительность к антибактериальным препаратам: методы разведения и дисковой диффузии

,

Руководство клинического микробиолога

,

2007

9-е изд.

Вашингтон, округ Колумбия

Американское общество микробиологов

(стр.

1152

72

) 3. ,

Современные методы тестирования чувствительности к антибиотикам

,

1972

Springfield, IL

Charles C. Thomas

4

Институт клинических и лабораторных стандартов

,

Методы исследования чувствительности к противомикробным препаратам при разведении бактерий, которые росли в аэробных условиях.Утвержденный стандарт M7-A10

,

2009

Wayne, PA

Институт клинических и лабораторных стандартов

5,,,.

Точность теста E для определения антимикробной чувствительности стафилококков, энтерококков, Campylobacter jejuni и грамотрицательных бактерий, устойчивых к антимикробным агентам

,

J Clin Microbiol

,

1992

, vol.

30

(стр.

3243

8

) 6,,,,,.

Выявление устойчивости к пенициллину и цефалоспоринам расширенного спектра среди клинических изолятов Streptococcus pneumoniae с использованием теста E

,

J Clin Microbiol

,

1994

, vol.

32

(стр.

159

63

) 7,,,.

Оценка теста E для определения чувствительности анаэробных бактерий

,

J Clin Microbiol

,

1991

, vol.

29

(стр.

2197

203

) 8,,,.

Сравнение E-теста с методами разведения в агаре, микроразбавления бульона и определения чувствительности к диффузии в агаре с использованием специального набора бактерий

,

J Clin Microbiol

,

1991

, vol.

29

(стр.

533

8

) 9,,.

Сравнение Oxoid M.I.C. Устройство для оценки с микроразбавлением бульона и тестовым устройством E от AB Biodisk для тестирования энтеробактерий на чувствительность к противомикробным препаратам [аннотация P859]

,

Программа и выдержки 18-го ежегодного собрания Европейского конгресса по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Барселона). Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям

,

2008

10,,.

МИК ванкомицина для метициллин-устойчивых изолятов Staphylococcus aureus (MRSA) различается в зависимости от используемого метода теста на чувствительность

,

Противомикробные агенты Chemother

,

2008

, vol.

52

стр.

4528

11,,,.

Определение чувствительности к антибиотикам стандартным методом с одним диском

,

Am J Clin Pathol

,

1966

, vol.

45

(стр.

493

6

) 12

Институт клинических и лабораторных стандартов

,

Стандарты эффективности тестов на чувствительность дисков к антимикробным препаратам.Утвержденный стандарт M2-A10

,

2009

Wayne, PA

Институт клинических и лабораторных стандартов

13

Институт клинических и лабораторных стандартов

,

Стандарты эффективности тестирования чувствительности к противомикробным препаратам. Девятнадцатое информационное приложение M100-S19

,

2009

Wayne, PA

Институт клинических и лабораторных стандартов

14,.

Оценка видео-ридера BIOMIC для определения интерпретируемых категорий изолятов на основе результатов диско-диффузионной чувствительности

,

J Clin Microbiol

,

1998

, vol.

36

(стр.

302

4

) 15,,,,,.

Сравнение и оценка систем чувствительности к противомикробным препаратам Osiris и Sirscan 2000 в лаборатории клинической микробиологии

,

J Clin Microbiol

,

2003

, vol.

41

(стр.

3627

30

) 16,. ,,,,.

Приборы для тестирования чувствительности и компьютеризированные экспертные системы для анализа и интерпретации данных

,

Руководство по клинической микробиологии 9-е изд

,

2007

Вашингтон, округ Колумбия

Американское общество микробиологии

(стр.

245

56

) 17,,,.

Клиническое влияние экспресс-тестирования чувствительности in vitro и идентификации бактерий

,

J Clin Microbiol

,

1994

, vol.

32

(стр.

1757

62

) 18,,.

Клинические и финансовые преимущества быстрой идентификации бактерий и определения чувствительности к противомикробным препаратам

,

J Clin Microbiol

,

1999

, vol.

37

(стр.

1415

8

) 19.

Выбор противомикробных препаратов для рутинного тестирования в лаборатории клинической микробиологии

,

Diagn Microbiol Infect Dis

,

1993

, vol.

16

(стр.

245

9

) 20

Институт клинических и лабораторных стандартов

Разработка критериев чувствительности in vitro и параметров контроля качества; утвержденное руководство

,

Документ CLSI M23-A

,

2008

3-е изд.

Wayne, PA

Институт клинических и лабораторных стандартов

21.

Критерии выбора системы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам

,

J Clin Microbiol

,

1993

, vol.

31

(стр.

2841

4

) 22

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США

,

Руководство по специальным мерам контроля класса II: системы испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам (AST); руководство для промышленности и FDA

,

2003

Rockville, MD

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США

23

Международная организация по стандартизации

,

Системы клинического лабораторного тестирования и диагностики in vitro — тестирование чувствительности к инфекционным агентам и оценка эффективности устройств для определения чувствительности к противомикробным препаратам.Часть 2: оценка эффективности устройств для определения чувствительности к противомикробным препаратам. ISO 20776-2

,

2007

Женева

Международная организация по стандартизации

24.

ДНК-зонды для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам

,

Clin Lab Med

,

1989

, vol.

9

(стр.

341

7

) 25,. ,,,,.

Механизмы устойчивости к антибактериальным агентам

,

Руководство по клинической микробиологии 9-е изд

,

2007

Вашингтон, округ Колумбия

Американское общество микробиологии

(стр.

1114

45

)

© 2009 Американского общества инфекционистов

Определение чувствительности к антибиотикам в условиях отсутствия культур на основе спектров комбинационного рассеяния одной бактерии

Дизайн исследования

Стандартный тест на микроразбавление в бульоне, используемый для определения МИК антибиотика, основан на серии посевов бактерий в течение ночи в присутствии антибиотика в возрастающих концентрациях. Используемый диапазон концентраций соответствует серии удвоенных концентраций, включая низкие и высокие контрольные точки, как они определены CLSI и EUCAST (таблица 1 и методы), и зависит от вида бактерий.Мониторинг роста в каждой культуре позволяет определить МИК, при которой бактерии не растут. МИК под нижней контрольной точкой определяет восприимчивые штаммы, в то время как значения МИК выше высокой контрольной точки определяют резистентные штаммы.

Таблица 1 Описание биологической модели и экспериментальной базы данных. Были протестированы три антибиотика: гентамицин, подавляющий синтез белка, ципрофлоксацин, предотвращающий сверхспирализацию ДНК, и амоксициллин, препятствующий синтезу клеточной стенки.Для каждого из них перечислены клинические контрольные точки из EUCAST 4 для E . coli , проверенные концентрации, эталоны чувствительных и устойчивых штаммов E . coli с соответствующими МИК (измеренными в Vitek®2). Каждый «эксперимент» заключался в тестировании в один день одного штамма в присутствии одного антибиотика в нескольких концентрациях (включая 0) и получении около 50 спектров на концентрацию; его тиражировали в разные даты.Общая база данных содержит 3668 спектров отдельных бактерий. Обратите внимание, что E . coli ATCC 25922 — это эталон для контроля качества AST, рекомендованный EUCAST.

Здесь, на основе того же принципа, мы инкубировали серию бактериальных суспензий в присутствии антибиотиков при возрастающих концентрациях в диапазоне от нижнего нижнего порога до верхнего порогового значения, определенного EUCAST (см. Таблицу 1). Культуры бактерий без антибиотика также инкубировали в качестве эталона.Время инкубации в присутствии антибиотиков было сокращено до двух часов перед проведением рамановского хемометрического анализа отдельных клеток. Для этого из суспензии отбирали бактерии и помещали на покровное стекло для получения спектров комбинационного рассеяния на отдельных бактериальных клетках. После получения спектров каждый спектр был предварительно обработан для удаления фонового сигнала (в основном флуоресценции) и сигнала стекла (см. Подробности в разделе «Методы»), чтобы уменьшить влияние небиологического и неспецифического сигнала 25 .Результирующие спектры, нормированные на их среднюю интенсивность в интересующей области [650–1750] см –1 , были названы «нормализованными суммарными спектрами». Для ясности в нижеследующем описании бактерии, которые инкубировали в течение 2 часов с антибиотиком, называются «незащищенными» бактериями и бактериями, которые инкубируются без антибиотика, «незащищенными» бактериями. Тест проводился как на чувствительном штамме, так и на устойчивом штамме для каждой молекулы антибиотика (см. Таблицу 1), чтобы подтвердить специфичность обнаруженного эффекта.Метод применялся для трех бактерицидных антибиотиков с разными механизмами действия: аминогликозида, хинолона и бета -лактама. Полученные экспериментальные условия суммированы в таблице 1. Для каждого протестированного антибиотика были проведены анализы жизнеспособности, которые заключались в культивировании образцов на агаризованной культуральной среде непосредственно после инкубации с антибиотиком. Это позволило нам подтвердить, что в наших условиях антибиотики действовали на бактериальные клетки и приводили к потере жизнеспособности, как и следовало ожидать для различных концентраций антибиотиков (см. Дополнительный рис.1). У устойчивых штаммов потери жизнеспособности не наблюдалось. Мы подтвердили, что количество клеток было не меньше, чем до инкубации образца, путем подсчета клеток с помощью микроскопии (данные не показаны). Эта нумерация в сочетании с более классической нумерацией чашек Петри подтвердила, что мы могли наблюдать и собирать спектры бактерий, которые все еще находились в образце, но больше не могли расти. Таким образом, мы убедились, что в нашем исследовании не было систематической ошибки путем выбора конкретной популяции клеток из-за протокола подготовки образца, и что мы измеряли воздействие на клетки, на которые воздействовал антибиотик.

Извлечение спектральной сигнатуры эффекта антибиотика

Чтобы извлечь рамановскую сигнатуру эффекта антибиотика на отдельные бактерии, мы сначала проанализировали изменения, индуцированные в спектрах комбинационного рассеяния отдельных бактериальных клеток, когда они подвергались воздействию ингибирующих концентраций антибиотиков. Такие модификации проиллюстрированы рис. 1 в случае чувствительного элемента E . coli клеток (EC1; см. Таблицу 1) инкубировали в течение 2 часов в отсутствие или в присутствии гентамицина при восьмикратном превышении соответствующей МИК (8 мкг / мл).Хотя спектральные различия между экспонированными и необлученными бактериями были очень слабыми (см. Необработанные спектры на рис. 1a, b и нормализованные сетевые спектры на рис. 1c, d), они могли четко прослеживаться на небольшом количестве пиков комбинационного рассеяния (см. Увеличение на рис. 1в, г). Они сопровождались гораздо более высокой межклеточной спектральной вариабельностью в присутствии антибиотика, сосредоточенной на нескольких специфических пиках комбинационного рассеяния (рис. 1e). Анализ главных компонентов (PCA) нормализованных сетевых спектров (рис. 1f) ясно показал эту повышенную вариабельность среди спектров подвергшихся воздействию бактерий, а также частичное различение спектров необработанных бактерий.Это свидетельствует о том, что действие антибиотика не было однородным среди отдельных клеток в бактериальной популяции, хотя потеря жизнеспособности в этих условиях составила более 99,99% (см. Дополнительный рис. 1). Очень похожие спектральные модификации можно было наблюдать на одном и том же штамме в присутствии ингибирующих концентраций ципрофлоксацина и амоксициллина (не показано).

Рисунок 1

Рамановские спектры отдельных бактериальных клеток из чувствительных клеток E . coli штамм EC1 инкубировали в течение 2 часов в отсутствие или в присутствии 8 мкг / мл гентамицина.Необработанные спектры в отсутствие ( a ) (44 спектра) и ( b ) в присутствии (39 спектров) антибиотика, полученные в одном эксперименте; ( c , d ) соответствующие нормализованные сетчатые спектры в интересующей области [650–1750] см −1 с увеличением области [1400–1520] см −1 и ( e ) ассоциированные дисперсионные спектры бактерий, инкубированных с (синий) и без (красный) антибиотиком; ( f ) График PCA нормализованных сетевых спектров, свидетельствующий об увеличенной дисперсии среди подвергнутых воздействию бактерий (синие точки) и их отличия от незащищенных бактерий (красные точки).Соответствующие эллипсы 50% уверенности нанесены в качестве наглядного пособия.

Чтобы выделить спектральные изменения, которые были специфичны для эффекта антибиотика и произошли с небольшой амплитудой, мы вычислили «разностные спектры», определяемые как разность между каждым нормализованным чистым спектром и средним значением всех нормализованных чистых спектров, измеренных на необлученные бактериальные клетки в том же эксперименте (т. е. того же штамма и даты). Эта процедура была разработана для удаления основной части специфичной для штамма информации и метаболической изменчивости, происходящей от бактерий в разные даты, и свидетельствует о спектральных изменениях, которые воспроизводимы для разных дат и штаммов.

Таким образом, мы смогли четко определить действие антибиотика на чувствительный штамм. Результаты, представленные на фиг. 2 для трех антибиотиков, показали, что разностные спектры экспонированных восприимчивых бактериальных клеток демонстрируют значимые и воспроизводимые положительные и отрицательные пики. Это проиллюстрировано средним значением этих разностных спектров, обозначенным синей линией на рис. 2a – c и сопровождаемым вышеупомянутой высокой межклеточной изменчивостью, сконцентрированной на одних и тех же положениях пиков (диапазон ± σ вокруг среднего значения, показанного светом. -синяя полоса на рис.2а – в). Пики были более очевидными для гентамицина (рис. 2a) и ципрофлоксацина (рис. 2b), чем для амоксициллина (рис. 2c), где они были значительно уменьшены при усреднении. Напротив, не наблюдалось значительных спектральных модификаций для экспонированных устойчивых бактерий (среднее значение их разностных спектров показано красной линией на рис. 2a – c), для которых межклеточная изменчивость также оказалась ниже (розовый цвет). группа). Это подтверждает специфичность спектральных изменений, вызванных антибиотиком на чувствительном штамме.Для трех антибиотиков графики PCA тех же разностных спектров (рис. 2d – f) показали более очевидные спектральные изменения, в том числе для амоксициллина, которые значительно отделяли экспонированные (синие точки) от необлученных (голубые точки) восприимчивые бактериальные клетки, причем последние накладываются точно на экспонированные (красные точки) и необлученные (розовые точки) резистентные бактерии. Графики PCA также показали, что результаты для подверженных воздействию чувствительных бактерий были вполне воспроизводимыми с настоящего момента (наложены темно-синие эллипсы для трех дат экспериментов на рис.2г – е).

Рисунок 2

Спектральная характеристика эффекта антибиотика, извлеченная из разностных спектров отдельных бактериальных клеток. «Разностные спектры» ( i , и . Различия между каждым нормализованным чистым спектром и средним значением всех нормализованных чистых спектров, измеренных на необлученных бактериальных клетках) отдельных бактериальных клеток, инкубированных в течение 2 часов, показаны для ( a ) гентамицин (0 и 8 мкг / мл, 374 спектра), ( b ) ципрофлоксацин (0 и 0.064 мкг / мл, 483 спектра) и ( c ) амоксициллина (0 и 8 мкг / мл, 474 спектра). Для наглядности показано только среднее значение разностных спектров для экспонированных восприимчивых бактерий (синяя линия) и экспонированных устойчивых (красная линия), а также соответствующий диапазон стандартного отклонения ± σ (голубые и розовые полосы). . ( d – f ) Соответствующие графики PCA разностных спектров для восприимчивых бактерий, экспонированных (темно-синие точки) и не экспонированных (голубые точки), а также для устойчивых бактерий, подвергшихся воздействию и не подвергавшихся воздействию (соотв.красные и розовые точки). Эллипсы 50% уверенности также нанесены одними и теми же цветами независимо для каждой из трех дат экспериментов в качестве наглядного руководства для демонстрации воспроизводимости экспериментов. ( г – i ) Графики векторов нагрузки, LV1 для ( г ) гентамицина и ( х ) ципрофлоксацина, дающие веса, участвующие в оценке PC1, и LV ‘= (LV1 – LV2) × √2 / 2 для ( i ) амоксициллина, давая веса, участвующие в оценке (PC1 – PC2) × √2 / 2. Эти векторы нагрузки составляют «спектральную сигнатуру» эффекта антибиотика.

На графиках PCA основное разделение спектров от подверженных воздействию чувствительных бактерий и спектров от незащищенных или устойчивых бактерий наблюдалось параллельно оси первого «основного компонента» (PC1) для гентамицина и ципрофлоксацина (рис. 2d). , д). Для амоксициллина (рис. 2f) и для этого конкретного ограниченного набора данных он был скорее параллелен направлению PC1 – PC2. (Для более крупных наборов данных амоксициллина, включающих больше концентраций, как показано на рис. 3 или рис. 4, ось PC1 была более точно выровнена с наблюдаемыми сдвигами.) Поэтому мы исследовали «вектор нагрузки» LV1 (рис. 2g, h для гентамицина и ципрофлоксацина) или LV ‘= (LV1 – LV2) × √2 / 2 (рис. 2i для амоксициллина), который дает спектральные характеристики которые вносят вклад в оценку PC1 или, соответственно, в оценку (PC1 – PC2) × √2 / 2, с их весами (положительными или отрицательными). Положительная оценка соответствует увеличению пиков с положительной массой в векторе загрузки и уменьшению пиков с отрицательной массой по сравнению со спектрами необлученных бактериальных клеток (и наоборот, отрицательной оценке).Таким образом, этот вектор составлял подходящую «спектральную сигнатуру» эффекта антибиотика. Поразительно, что сигнатуры, полученные для трех антибиотиков, были очень похожими (рис. 2g – i). Также заметно, что для гентамицина (рис. 2d) и амоксициллина (рис. 2f) эффект антибиотика отражался как в спектрах с положительным сдвигом, так и в спектрах с отрицательным сдвигом в PC1 (соответственно PC1 – PC2). Этого не произошло с ципрофлоксацином (рис. 2e), для которого наблюдались только положительные сдвиги. Это будет подробнее обсуждаться в следующих разделах.Спектральные зоны, вносящие значительный вклад в сигнатуру, соответствуют спектральным характеристикам, типичным для спектров комбинационного рассеяния бактерий: пики с положительными весами при 783 см 1 , 1240 см -1 , 1483 см -1 и 1574 см -1 , приписываются нуклеиновой кислоте 15 , тогда как пики при 1125 см -1 и 1443 см -1 с отрицательными весами обычно приписываются белкам 15 .

Рис. 3

Анализ зависимости эффекта от дозы для трех антибиотиков.( a – c ) графики PCA разностных спектров (ранее определенных в тексте и на рис. 2) для отдельных бактериальных клеток чувствительного штамма (EC1), инкубированных в течение 2 часов с ( a ) гентамицином (382 спектра), ( b ) ципрофлоксацин (345 спектров) и ( c ) амоксициллин (418 спектров) в различных концентрациях (от двух до четырех независимых экспериментов на концентрацию и антибиотик в большинстве случаев), с эллипсами 50% достоверности, нанесенными для каждой концентрации. ( d f ) Ящичковые диаграммы распределений оценок PC1 для различных концентраций антибиотика (с указанием соответствия между цветами и концентрациями).Вертикальные черные линии показывают контрольные МПК.

Рисунок 4

Анализ гетерогенности спектральных модификаций чувствительного бактериального штамма EC1, подвергнутого воздействию различных антибиотиков. ( a ) Общий PCA разностных спектров (2481 спектр) отдельных бактериальных клеток из чувствительного штамма EC1 для трех антибиотиков во всех концентрациях. Точки, соответствующие экспонированным (или необлученным) клеткам, показаны серым (соответственно красным), что свидетельствует о различении действия антибиотика параллельно оси PC1.( b ) Соответствующий вектор нагрузки LV1 рассматривается как общая спектральная характеристика эффекта антибиотика. ( c e ) Отдельные гистограммы оценок PC1 спектров различия для каждого антибиотика. Гистограммы четко показывают два [для ципрофлоксацина ( d )] или три [для гентамицина ( c ) и амоксициллина ( e )] пика распределения. Соответствующие популяции разграничиваются путем подгонки гистограмм с (2 или 3) распределениями Гаусса и помещением пороговых значений оценки в значения, которые уравнивают области хвоста перекрывающихся распределений [вертикальные пунктирные линии в ( c e )].Цветовой код, используемый для подгонки по Гауссу, является общим для ( c k ) и объясняется ниже. Таким образом, каждый спектр различий был отнесен к одной из трех групп в соответствии с его баллом PC1. Полученные спектры средней разности трех групп показаны в ( f h ). Группа разностных спектров с низкими оценками около 0 содержит разностные спектры всех необлученных бактерий и называется группой «без эффекта» (синее распределение). Группа спектров с высокими положительными баллами (называемая «эффект ATB +», оранжевое распределение) и группа спектров с высокими отрицательными баллами (называемая «эффектом ATB -», зеленое распределение) специфичны для подверженных воздействию чувствительных бактерий.( i k ) Графики относительных размеров 3 групп в зависимости от концентрации антибиотика для каждого антибиотика. Для ципрофлоксацина ( d , g , j ) группа «эффект АТБ -» не наблюдается. Вертикальные черные линии в ( i k ) показывают контрольные значения MIC.

Анализ зависимости доза-эффект

Чтобы определить, можно ли напрямую использовать эту спектральную характеристику эффекта антибиотика и соответствующий балл для определения МИК чувствительного штамма, мы изучили вариации (и распределения) Оценка PC1 отдельных бактериальных клеток EC1, инкубированных с возрастающими концентрациями антибиотика, от значительно меньших (включая 0) до значительно превышающих МИК.Результаты, полученные для трех антибиотиков (см. Рис. 3), показали, что оценка PC1 имеет тенденцию к увеличению с увеличением концентрации антибиотика, по крайней мере, для гентамицина и ципрофлоксацина (рис. 3d, e). Однако это изменение было в значительной степени замаскировано высокой спектральной вариабельностью от клетки к клетке (рис. 3a – c), которую мы наблюдали, особенно при высоких концентрациях антибиотиков. В случае амоксициллина даже может наблюдаться снижение показателя PC1 с увеличением концентрации (рис. 3f, от 0 до 2 мкг / мл и от 4 до 8 мкг / мл).Обратите внимание, что на этих новых графиках PCA вектор нагрузки LV1, связанный с PC1 (не показан), был очень похож на спектральную сигнатуру, показанную на рис. 2g – i.

Для дальнейшего анализа распределения оценок PC1 для различных концентраций антибиотика, принимая во внимание тот факт, что были обнаружены очень похожие спектральные сигнатуры для эффекта антибиотика с тремя антибиотиками, мы рассчитали глобальный PCA для всех разностных спектров. измеряли на отдельных бактериальных клетках чувствительного штамма (все три антибиотика, все концентрации, все эксперименты).Основная дискриминирующая ось для эффекта антибиотика снова была обнаружена параллельно PC1, практически без дискриминации вдоль оси PC2 (см. Фиг. 4a). Затем вектор нагрузки LV1, связанный с главным компонентом PC1, был взят в качестве общей спектральной характеристики эффекта антибиотика (рис. 4b), и мы построили глобальное распределение баллов PC1 для каждого антибиотика (рис. 4c – e). Полученные гистограммы ясно показали бимодальное (для ципрофлоксацина) или тримодальное (для гентамицина и амоксициллина) перераспределение спектров, что свидетельствует о существовании различных популяций бактериальных состояний.Эти популяции были ограничены путем подгонки гистограмм с (двумя или тремя) пиками Гаусса. Первую популяцию с низкими оценками (около нуля), соответствующими спектрам с плоской разницей (спектр средней разности показан синим цветом на рис. 4f – h), назвали группой «без эффекта». Вторая популяция с высокими положительными оценками была названа группой «эффект ATB +». Его средний разностный спектр (показан оранжевым на рис. 4f – h) характеризуется положительными пиками при 783 см −1 , 1240 см −1 , 1483 см −1 и 1574 см −1 и отрицательными пики при 1125 см −1 и 1443 см −1 .Третья популяция с высокими отрицательными оценками была названа группой «эффект ATB -». Эта последняя группа имеет спектр средней разницы с примерно одинаковыми пиками и противоположными интенсивностями (зеленый на рис. 4f, h; не наблюдается для ципрофлоксацина). Чтобы дополнительно охарактеризовать взаимосвязь между концентрацией антибиотика и спектральным эффектом, мы рассчитали относительное содержание каждой из этих трех групп среди разностных спектров как функцию концентрации антибиотика. Полученные графики (рис. 4i – k) показали, что группа «без эффекта», как и ожидалось, содержала все незащищенные бактерии.При увеличении концентрации антибиотика относительный размер этой группы постепенно уменьшался. Напротив, группы «эффект ATB +» и «эффект ATB -» наблюдались только среди подвергшихся воздействию бактерий (за исключением ципрофлоксацина, для которого группа «эффект ATB -» не наблюдалась) и постепенно увеличивались в размере с увеличением концентрации антибиотика. Это важное наблюдение показывает, что на уровне отдельных бактериальных клеток модификация спектральных свойств комбинационного рассеяния (следовательно, метаболического состояния) не изменяется непрерывно.Вместо этого бактериальные клетки демонстрируют или не показывают сигнатуру антибиотического эффекта в своем спектре, и только пропорция бактериальных клеток с измененным спектром изменяется с концентрацией антибиотика. Эта популяционная модель является ключевым элементом для полного улавливания и понимания эффекта антибиотиков с помощью измерений спектров комбинационного рассеяния.

Обратите внимание, что сосуществование этих двух или трех групп при заданной концентрации антибиотика, возможно, с сопоставимыми относительными размерами, в значительной степени объясняет высокую дисперсию, наблюдаемую среди спектров подверженных воздействию чувствительных бактерий, описанных выше.Это также объясняет, почему эта дисперсия в основном сосредоточена на 6 положениях пиков, перечисленных выше. Кроме того, мы заметили, что для каждого антибиотика группа «без эффекта» снизилась ниже 50%, в то время как две другие группы стали большинством при концентрациях, близких к МИК (см. Значения МИК в Таблице 1), что позволяет предположить, что наблюдение одиночных клеток Рамановские спектры можно использовать для оценки MIC данного штамма. Как описано в следующих параграфах, мы подтвердили эту возможность, разработав прямой метод определения МИК на основе машинного обучения и используя только несколько спектров отдельных бактерий для каждой концентрации.

Автоматическое определение эффекта антибиотика и определение МИК

Основой нашего подхода было использование контролируемого машинного обучения для автоматического распознавания эффекта антибиотика в нескольких спектрах отдельных бактериальных клеток и повторения этого теста для серии бактериальных суспензий тот же штамм инкубировали с увеличивающимися концентрациями антибиотика, чтобы определить, произошел ли переход и при какой концентрации по сравнению с эталонной МИК. Первым шагом для каждого антибиотика было создание обучающей базы данных разностных спектров, принадлежащих к двум классам: класс «без эффекта» с разностными спектрами от необлученных чувствительных бактериальных клеток и класс «эффект ATB» только с разностные спектры чувствительных бактериальных клеток, подвергшихся действию ингибирующих концентраций антибиотика (≥2 мкг / мл для гентамицина, ≥0.005 мкг / мл для ципрофлоксацина и ≥8 мкг / мл для амоксициллина). Все спектры устойчивых штаммов были исключены из этой обучающей базы данных.

Для классификации использовался алгоритм SVM с ядром «радиальной базисной функции» (RBF) 26 (программное обеспечение доступно на http://www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/libsvm) для работы с нелинейный характер наблюдаемого эффекта, особенно сосуществование противоположных популяций «ATB-эффект +» и «ATB-эффект-» среди разностных спектров подверженных воздействию чувствительных бактерий.Обратите внимание, что, хотя мы использовали полные разностные спектры для классификации, мы заметили, что линейный SVM имеет ограниченную производительность для этой задачи. Это говорит о том, что полные данные не были или плохо линейно разделялись из-за вышеупомянутых противоположных популяций, что подтверждается в двух измерениях PCA (рис. 4a), следовательно, использование ядра RBF. Чтобы обеспечить надежную и строгую проверку классификатора, избегая любых артефактов переобучения или искажающего эффекта, мы следовали схеме перекрестной проверки «оставить одну-дату-нет».Для этого мы построили валидационное разбиение, сгруппировав все разностные спектры, соответствующие заданной дате, в одной и той же тестовой группе. Эта группа была исключена из обучающего справочника при тестировании. Конечно, это было реализовано путем конструирования в случае устойчивых штаммов или более низких концентраций, поскольку они не были включены в обучающую базу данных. С помощью этой схемы проверки спектры каждого эксперимента тестировались только с использованием спектров из других экспериментов в качестве эталона.

Из-за высокой межклеточной спектральной изменчивости, включая присутствие подвергшихся воздействию бактерий без наблюдаемых спектральных изменений, необходимо было повторить тест на небольшом количестве разностных спектров, чтобы надежно решить, были ли бактериальные клетки восприимчивы к антибиотику или нет. заданная концентрация. В целях проверки достоверности теста в реальных условиях, как можно более близких к клиническому применению прямого образца, мы ограничили средний спектр незащищенных бактерий, используемый при вычислении разностных спектров, до того же небольшого числа не подвергавшихся воздействию бактерий.Мы смогли достичь удовлетворительных результатов только с 5 разностными спектрами для гентамицина и ципрофлоксацина (от 5 экспонированных и 5 необлученных клеток) и 11 разностных спектров для амоксициллина (от 11 экспонированных и 11 необлученных клеток). Классификатор пометил каждый из 5 (или 11) тестируемых спектров различий, и большинство голосов было применено для присвоения класса тестируемому набору. Подробные характеристики представлены в виде матриц неточностей на рис. 5 (см. Также дополнительный рис. 2–4 для матриц неточностей, полученных с другими числами разностных спектров).Для восприимчивого штамма (рис. 5a – c) наблюдался резкий переход для концентраций, близких к МИК, от маркировки «Нет эффекта» под МИК к маркировке «эффект ATB» над МИК. Для устойчивых штаммов (рис. 5d – f) классификатор не обнаружил антибиотического эффекта, независимо от антибиотика или используемой концентрации, за исключением штамма EC2 с гентамицином в очень высоких концентрациях, близких к МПК или превышающих их. Это подтверждает как высокую специфичность теста, так и то, что он не зависит от штамма.Обратите внимание, что, за исключением концентрации непосредственно ниже МИК, где произошел переход, правильная скорость мечения (как «Нет эффекта» или «Эффект ATB» в зависимости от концентрации и деформации) всегда была выше 97% (со средним значением 99,3% в 24 испытанных условиях, исключая концентрацию ниже МПК). Эти результаты показывают, что предлагаемый метод не только способен надежно определять чувствительный / резистентный фенотип бактериального штамма при каждой тестируемой концентрации, но также оценивать его MIC для каждого из протестированных антибиотиков.

Рис. 5

Матрицы неточностей для автоматического различения классов «Нет эффекта» и «Эффект ATB» при различных концентрациях антибиотиков с помощью классификатора SVM. Матрицы построены для чувствительного штамма EC1 и ( a ) гентамицина (847 спектров), ( b ) ципрофлоксацина (850 спектров) и ( c ) амоксициллина (602 спектра), а также для устойчивых штаммов ( d ). ) EC2 и гентамицин (404 спектра), ( e ) EC3 и ципрофлоксацин (399 спектров) и ( f ) EC2 и амоксициллин (366 спектров).Для каждой концентрации антибиотика (одна строка матрицы) цифры отражают степень классификации в каждом из классов «Нет эффекта» и «Эффект ATB» (в%, с его стандартным отклонением, рассчитанным среди 2-7 независимых экспериментов в считается концентрация). Горизонтальные черные линии показывают контрольные значения MIC для восприимчивого штамма (, c ), а также наблюдаемый полный переход, наблюдаемый для устойчивого штамма EC2 и гентамицина ( d ) при расширении диапазона концентраций до очень высоких значений.

Диагностика чувствительности к антибиотикам будущего

По мере роста лекарственной устойчивости необходимы улучшения в клинических испытаниях на чувствительность к антибиотикам и инвестиции в широкое внедрение, чтобы открыть новое поколение диагностических средств, которые могут информировать о различных типах лекарственной устойчивости и быстро предсказывать лекарственную чувствительность с высокой точностью.

Бактерии, устойчивые к антибиотикам, представляют собой растущую проблему, и распространение устойчивости означает, что чувствительность к антибиотикам не может быть легко предсказана на основе только видов бактерий.Таким образом, становится все более важным проводить специальные тесты на резистентность, чтобы сократить время лечения, гарантировать эффективность и снизить вероятность выбора устойчивых к лекарствам патогенов.

Текущие тесты на чувствительность к антибиотикам (AST) в значительной степени основаны на трудоемких методах культивирования. После первоначального выращивания патогенов из образцов пациентов чистую культуру обрабатывают различными антибиотиками и оценивают рост бактерий либо на агаре, измеряя зоны ингибирования вокруг диска или полоски, пропитанной антибиотиком, либо путем оценки мутности в жидкой среде, содержащей лекарственное средство. .В обоих подходах определяется минимальная ингибирующая концентрация (МИК) группы антибиотиков, и эти значения сравниваются с рекомендованными контрольными точками устойчивости, которые получены из фармакокинетических и фармакодинамических профилей препаратов для конкретных патогенов, а также эпидемиологических данных. сравнение МПК с эффективностью лечения.

AST на основе культур имеет несколько ограничений. Во-первых, это отнимает много времени, требуются дни для культивирования патогенов, а затем тестирования на чувствительность, в течение которого клиницисты, вероятно, уже назначили эмпирические и потенциально неоптимальные антибиотики.Во-вторых, культивирование затруднено — несмотря на стандартизацию сред Мюллера-Хинтона для AST, требуются различные модификации рецептов для поддержки привередливых патогенов, обеспечения воспроизводимости определенных лекарств (например, концентрации катионов влияют на активность полимиксина) или даже активации генов устойчивости (например, предварительная обработка эритромицином для индукции устойчивости к клиндамицину). В-третьих, клинически значимые контрольные точки резистентности могут быть трудными для определения, если у нас нет четкой связи между MIC и успешными результатами (например, резистентность к недавно одобренным лекарствам редко проверяется).

Кроме того, использование МПК и зон ингибирования имеет недостаточное разрешение для выявления возникающих явлений резистентности, которые были причастны к неудачам клинического лечения, включая персистентность (способность некоторых бактерий переносить присутствие лекарства, но не расти в нем) или гетерорезистентность (когда подмножество бактерий может реплицироваться в антибиотике, несмотря на то, что большая часть населения чувствительна). Недавние исследования показывают, что многие клинические штаммы гетерорезистентны к различным антибиотикам.Андерссон и его коллеги (http://doi.org/c96t) обнаружили, что часть клеток может спонтанно и нестабильно амплифицировать гены, которые способствуют устойчивости к лекарствам; и в этом выпуске Weiss и его коллеги (http://doi.org/c96v) обнаружили, что существующие подходы к AST недостаточно чувствительны, чтобы уловить эту популяционную гетерогенность, и часто ошибочно классифицируют гетерорезистентные штаммы как чувствительные к лекарствам или как полностью резистентные. В первом случае можно закончить лечение неэффективным препаратом, а во втором потенциально полезные препараты могут быть исключены.Действительно, исследование показало, что сочетание препаратов, к которым штаммы гетерорезистентны, может успешно лечить инфекции у мышей. В этих исследованиях гетерорезистентность оценивалась путем разбавления и посева на колониеобразующие единицы, что было бы трудоемко и сложно выполнять в повседневной практике в клинике. Таким образом, для выявления различных явлений резистентности необходимы методы AST, которые обладают большей чувствительностью для анализа ответов разнородных популяций.

Использование геномного секвенирования для определения AST является многообещающим и может ускорить диагностику, минуя культивирование с антибиотиком.В клинике уже используются тесты на основе последовательности (обычно на основе ПЦР или гибридизации) — например, для выявления мутаций, вызывающих устойчивость к рифампину, у Mycobacterium tuberculosis . Основным ограничением использования секвенирования является фенотипическое подтверждение того, что определенные геномные маркеры являются прогностическими, поскольку влияние определенных мутаций или известных генов устойчивости может различаться для разных организмов, а новые полиморфизмы или гены могут вызывать неожиданную устойчивость к лекарствам. В качестве примера можно привести работу Харрисона и его сотрудников в этом выпуске (http: // doi.org / c96w), который показал, что у многих метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus развились изменения в гене, придающем устойчивость к β-лактамным антибиотикам, что увеличивает чувствительность штамма к комбинации β-лактамного пенициллина и ингибитора β-лактамаз. Можно было бы предсказать полную устойчивость ко всем β-лактамным препаратам, учитывая обнаружение гена устойчивости. Таким образом, все еще существует потребность в фенотипическом тестировании для уточнения предсказания на основе последовательностей и выявления случаев, когда устойчивость возникает без идентифицируемых геномных изменений.Автоматическое дозирование и чашки с предварительно загруженными лекарствами увеличили производительность определения МИК на основе бульонов в клинических лабораториях, а нетурбидометрические технологии обещают еще более быстрое и более чувствительное фенотипическое АСТ. К ним относятся использование масс-спектрометрии для обнаружения признаков микробной активности или репликации и микрожидкостная визуализация отдельных клеток, чтобы быстро увидеть изменения в морфологии бактерий в присутствии антибиотика.

Однако одной только разработки новых методов AST недостаточно, поскольку недооцениваемая трудность при внедрении диагностики — давление со стороны больничного бюджета.С учетом количества пациентов и образцов для тестирования оптимальными являются те тесты, которые могут максимизировать количество полезных диагнозов для максимально возможного количества пациентов, минимизируя затраты и труд. Некоторые из технологий секвенирования, масс-спектрометрии или визуализации требуют больших вложений в дорогостоящие машины и реагенты, а также требуют специального обучения операторов. С другой стороны, если новая диагностика AST сможет превзойти (или дополнить) текущие тесты в ключевых областях, вероятно, возникнет значительная компенсация затрат, связанных со временем госпитализации, количеством выполненных медицинских процедур и общим улучшением здоровья населения.Несмотря на кажущиеся большие вложения, выгода от вложения денег в разработку новых (а также дешевых и требующих оказания медицинской помощи) диагностических систем AST многочисленна.

Патогены продолжают приобретать разнообразные механизмы для противодействия существующим антибиотикам, и теперь перед клиницистами стоит задача найти новые терапевтические схемы для лечения высокорезистентных штаммов, включая те, которые кодируют скрытые механизмы устойчивости к антибиотикам и толерантности, которые наши текущие тесты не могут обнаружить . Как гласит пословица, необходимость — мать изобретения, и до того, как устойчивость к антибиотикам станет универсальной, у нас есть возможность инвестировать в диагностику AST следующего поколения, которая может обеспечить более быстрые, надежные и информативные результаты.Мы не должны тратить его зря.

Об этой статье

Цитируйте эту статью

Диагностика чувствительности к антибиотикам на будущее.
Nat Microbiol 4, 1603 (2019). https://doi.org/10.1038/s41564-019-0577-4

Ссылка для скачивания

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *