Раствор для электрофореза: Электрофорез — ЛДЦ «Лечебно-диагностический центр»

1D PAGE Электрофорез

 

ПААГ готовят непосредственно перед проведением эксперимента. Из раствора(ов) акриламида и бисакриалмида. В качестве инициатора полимеризации используют персульфат аммония(ПСА), а катализатора тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). Смесь для образования геля (состоящую из раствора акриламида, бисакриламида, буфера, SDS, инициатора и катализатора заливают в специально подготовленный блок (чаще всего это пластина). После изготовления (застывания, полимеризации, образования) блока геля его можно использовать для разделения в специально приспособленной для этого камере. Стандартно разделение происходит в вертикальном блоке.

Методики

Протокол SDS электрофореза по Лэмли.

Необходимые реактивы:

• 1. ТРИС (трис(гидроксиметил)аминометан, 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол,CAS N 77-86-1) основание. Для электрофореза по Лэмли требования к Трис достаточно высоки. Использования реактива низких квалификаций типа Ч. или reagent, без дополнительной очистки недопустимо. ВНИМАНИЕ!!! Использовать солянокислую соль ТРИС – НЕЛЬЗЯ!!!
• 2. Акриламид. Идеальной является квалификация electrophoresis grade, но часто подходят и более дешевые марки акриламида, определить пригодность можно только экспериментальным путем. Не рекомендуется использование реактива квалификации reagent, for synthesis и т.п.
• 3. Бис акриламид, требования к реактиву аналогичны требованиям к акриламиду.
• 4. SDS , также весьма желательно использование реактива квалификации for molecularbiology и выше.
• 5. Глицин (аминоуксусная кислота), можно использовать реактив квалификации electrophoresis grade и выше, не рекомендуется использовать реактив квалификации ч. и reagent.
• 6. Соляная кислота квалификации ХЧ и выше (можно использовать разбавленный до 6 М реактив).
• 7. Персульфат аммония допустимо использование реактива ч и чда после тестирования. Так же необходимо тестировать реактив, если он хранился после даты выпуска более года.
• 8. Тетраметилэтилендиамин (TEMED) к нему не предъявляется очень высоких требований, но так как его расход очень небольшой, лучше использовать реактив высокого качества.
• 9. Глицерин можно использовать тоже без очень высоких требований – косметический , ч , чда, вполне подходят.
• 10. 2-Меркаптоэтанол (МЭ) или дитиотриэтол (ДТТ). К меркаптоэтанолу требования невысокие, но некоторые партии МЭ независимо от квалификации могут содержать примесь белков установить это можно только экспериментально. К ДТТ тоже требования невысокие.
• 11. Бромфеноловый синий – без высоких требований.
• 12. Дистиллированная вода – аналитической или фармацевтической чистоты.
• 13. Фильтровальная бумага.

Оборудование:

• 1. Камера для вертикального электрофореза с комплектом для заливки геля (стекла прокладки, устройство для заливки).
• 2. Блок питания постоянного напряжения с максимальным напряжением 300-400 V и мощностью от 50 W. Желательно, чтобы в блоке была стабилизация по току.
• 3. Автоматические пипетки со сменными наконечниками на варьируемые объемы: 1-10 мкл (2-20 мкл), 20-200 мкл, 100-1000 мкл. Наконечники к ним.
• 4. Полипропиленовые микропробирки – 1.5 мл (типа eppendorf).
• 5. Цилиндры мерные на 10, 50, 100, 250, 1000 мл. Вместо 10 мл и 50 мл цилиндров можно использовать центрифужные полипропиленовые пробирки на 15 мл и 50 мл (типа falcon) с нанесенными делениями.
• 6. Весы лабораторные с минимальным пределом взвешивания 0.5 г и максимальным 500 г, с ценой деления 10 мг.
• 7. рН метр с ценой шкалы 0.01 рН.
• 8. Пипетки стеклянные, градуированные на слив – 5 и 10 мл.
• 9. Общелабораторная посуда: стаканы термостойкие, воронки, стеклянные палочки, банки для растворов с пробками и т.д.
• 10. Водяная баня со штативом под микропробирки 1.5 мл или твердотельный термостат с гнездами под те же пробирки.
• 11. Магнитная мешалка (можно самого начального уровня) с набором магнитных якорей в полипропиленовой или политетерафторэтиленовой оболочке.

Приготовление запасных растворов

1) 10% SDS, 200 мл

Взвесить 20 г SDS, перенести количественно (ополаскивая небольшим 5-10 мл количеством воды посуду для взвешивания и собирая промывки в посуде для приготовления. Посуда для приготовления должна содержать надежную метку, указывающую объем 200 мл. Поместить в посуду для приготовления чистый якорь для магнитной мешалки и при постоянном перемешивании добавить сначала примерно 100 мл воды, а потом при постоянном перемешивании постепенном растворении довести объем раствора водой до метки 200 мл и дождаться полного растворения. Извлечь якорь и довести объем до метки 200 мл, размешать раствор стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Хранить при комнатной температуре, в холодильнике выпадает в осадок.

2) 30/1 акриламид (АА30/1), 100 мл

Взвесить 29 г акриламида, перенести количественно в посуду для растворения. Взвесить 1 г бисакриламида и перенести количественно в посуду для растворения. Посуда для растворения должна иметь надежную метку, соответствующую объему 100 мл.

Добавить 50 мл воды, нагретой до 50-600^оС погрузить чистый якорь магнитной мешалки медленно при постоянном перемешивании и растворении добавлять воду до метки 100 мл дождаться полного растворения. Извлечь якорь довести объем до метки 100 мл водой и размешать стеклянной палочкой до гомогенного состояния. Перелить раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой хранить на температуре +8-100^оС (нежелательно хранить при более низкой температуре, может выпасть осадок).

3) 1.5 М Трис-HCl pH=8.8 (Трис-8.8), 100мл

Взвесить 18.2 г Трис-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100 мл. Добавить примерно 60 мл воды погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания от 40 до 90 об/мин. Осторожно (чтобы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям добавления концентрированной или 6 М соляной кислоты до значения 8.8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как вы довели рН до величины 8.8, доведите водой объем раствора до отметки 100 мл при постоянном перемешивании извлеките якорь и снова добавьте воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенесите раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-100^оС.

4) Раствор 0.625 М Трис-HCl рН-6.8 (Трис-6.8), 100 мл

Взвесить 7.57 г Трис-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, которая имеет надежную метку объема 100мл. Добавить примерно 45-50 мл воды погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки. Поставить посуду с раствором на магнитную мешалку и включить перемешивание. Добиться регулировкой оборотов небольшой скорости перемешивания от 40 до 90 об/мин. Осторожно (что бы на повредить электроды якорем) погрузить в раствор электрод(ы) работающего рН-метра и приступить к подведению рН с помощью медленного, по каплям добавления концентрированной или 6 М соляной кислоты до значения 6.8. Трис относительно медленно реагирует с соляной кислотой, поэтому рекомендуется оставить раствор на ночь и проверить его рН на следующий день. При необходимости подвести рН раствора. После того как вы довели рН до величины 6.8, доведите водой объем раствора до отметки 100 мл при постоянном перемешивании извлеките якорь и снова добавьте воды до отметки, перемешивая раствор стеклянной палочкой. Перенесите раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-100^оС.

5) 10% раствор персульфата аммония(ПСА), 10 мл

Взвесить 1 г персульфата аммония в новой или чистой и сухой пробирке из полипропилена типа falcon. Добавить в пробирку воды до отметки 7мл, закрыть герметичной пробкой и интенсивно встряхивая, перемешать. Поставить пробирку вертикально и дать стечь раствору вниз 10 мин. Довести объем раствора водой до отметки 10 мл и снова перемешать. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор хранить в холодильнике при температуре 4-100^оС.

6) 10х Электродный буфер, 1л

Взвесить 144 г глицина и 30 г Триса-основания. Перенести количественно в посуду для приготовления, имеющую надежную метку объема 1 л. Добавить 0.7 л дистиллированной воды, погрузить в раствор чистый якорь магнитной мешалки поставить раствор в посуде на мешалку и перемешивать до растворения, затем при перемешивании довести объем раствора до 1 л водой. Извлечь якорь, проверить объем, при необходимости довести до 1 л и перемешать стеклянной палочкой. Перенести раствор в посуду для хранения с герметичной пробкой. Раствор рекомендуется хранить в холодильнике при температуре 4-100^оС.

Буфер для проб

Однократный буфер 20 мл

• Возьмите мерный цилиндр на 25 мл или полипропиленовую пробирку на 50 мл с делениями (типа falcon).
• Добавьте:
• 2 мл Трис-6.8,
• 5 мл 10%SDS,
• 2 мл глицерина,
• 10 мг БФС (бром феноловый синий) можно примерно на глаз.
• Доведите объем раствора до 20 мл, перемешайте встряхиванием. Хранить при комнатной температуре.

3х Буфер для проб 10 мл

• Возьмите полипропиленовую пробирку на 15 мл с градуировкой, типа falcon
• Добавьте:
• 3 мл Трис-6.8.
• Взвесьте и перенесите количественно 750 мг SDS в пробирку.
• Добавьте 3 мл глицерина.
• Добавьте 15 мг БФС (можно приблизительно не глаз).
• Доведите раствор горячей водой (50-800^оС) до объема 10 мл и перемешайте встряхиванием.

Проведение электрофореза по Лэмли

Приготовление разделяющего геля.

Внимание!!! Все растворы для приготовления перед смешением должны иметь комнатную температуру

Раствор для геля 10 мл: возьмите любой сосуд, вмещающий в себя 10-15 мл раствора.

Добавьте 2.5 мл Трис рН-8.8 и необходимое для нужной концентрации акриламида (см. Таблица) количество раствора акриламида АА30/1 и воды.

Таблица

Концентрация геля, %	6	7	8	10	12	15	20
Объем АА30/1, мл	2	2.33	2.67	3	4	5	6.67
Объем воды, мл	5.29	4.96	4.62	4.29	3.29	2.29	0.62

 

Перемешать (без пузырей) раствор.

Добавить 100 мкл 10% SDS, перемешать без пузырей.

Собрать блок для заливки геля.

Добавить в раствор для геля сначала 100 мкл 10% ПСА и затем 10 мкл ТЕМЕД аккуратно размешать без пузырей и залить в блок для геля (в зависимости от конструкции наслоить на поверхность раствора в блоке небольшое количество воды). Дождитесь полимеризации геля.

Приготовление концентрирующего геля 5 мл

В посуду 10-15 мл добавьте:

1 мл Трис рН-6.8

0.75 мл АА30/1 и 3.145 мл воды.

Аккуратно перемешайте раствор без пузырей.

Добавьте 50 мкл SDS, перемешайте без пузырей.

Возьмите блок с заполимеризовавшимся разделяющим гелем, удалите из него лишнюю воду путем стекания на фильтровальную бумагу. Подготовьте гребенку. Подготовьте блок к заливке концентрирующего геля. Добавьте к раствору для концентрирующего геля 50 мкл 10% ПСА и 5 мкл ТЕМЕД аккуратно (без пузырей) перемешайте и залейте в блок вставьте гребенку для образования карманов в геле в блок. Дождитесь полимеризации концентрирующего геля.

Подготовка проб.

В «сухую» безводную пробу или в осадок белков в микропробирке 1.5 мл добавляют однократный буфер для проб. Затем в вытяжном шкафу добавляют 2-10%об меркаптоэтанола. Пробу интенсивно встряхивают (или пипетируют автоматической пипеткой) и помещают в кипящую водяную баню или термостат на 100^оС, время инкубации от 5 до 30 мин. После инкубации пробы центрифугируют при 10 000-12 000g от 30 с. до 15 мин. в зависимости от того, как они растворились. Вместо МЭ можно использовать 100-200 мМ конечную концентрацию DTT из стокового 1М раствора (хранить на -20 в герметичной таре залитой под пробку). Перед употреблением разморозить и взболтать, затем отобрать небольшой объем и нагреть до 50-60^оС и внести в пробу необходимый объем.

Жидкая проба

В жидкую пробу (раствор белка) добавляют половину объема пробы трехкратного буфера для проб, далее добавляют 2-10%об от общего объема меркаптоэтанола. Далее поступают аналогично «сухой» пробе.

Проведение электрофореза

Поместите залитый блок в камеру приготовьте электродный буфер в объеме необходимом для камеры. Для этого 10х электродный буфер надо развести в отношении 1:9. Залейте электродный буфер в камеру. В верхнюю камеру (католит) ОБЯЗАТЕЛЬНО!!!! нужно добавить 10%SDS в объеме 0.01 объема буфера в верхней камере.

Нанесите пробы в карманы геля. Для нанесения используют микрошприц типа Hamilton на 10, 25, 50,100 мкл (в зависимости от загрузок) или автоматическую пипетку со специальным оттянутым наконечником для нанесения проб в гель. Подключите камеру к блоку питания. Обычно используется три режима в течение хода электрофореза:

• 1) вхождение проб в концентрирующий гель. Напряжение примерно 5 В/см;
• 2) пробы в концентрирующем геле. Напряжение примерно 7-10 В/см;
• 3) пробы вошли в разделяющий гель. Напряжение примерно 20-35 В/см.

В см. выражена длина геля.

Окончание электрофореза контролируют при подходе фронта красителя БФС к нижней границе геля.

Окраска и дальнейшие манипуляции с гелем зависят от целей эксперимента.

Требования к образцам.

• 1) Для успешного проведения эксперимента. Необходимо знать количественное содержание общего белка и белка интереса в образцах.
• 2) В образцах не должно содержаться большое количество сильной кислоты и щелочи, более 50 мМ концентрации.
• 3) В образцах должна отсутствовать соль в высокой концентрации, более 250 мМ в пересчете на ионную силу NaCl.
• 4) Плохо растворимые и мембранные белки требуют модифицированных, отличных от стандартной процедуры, методик.

 

Таблица 2.1.2.30.-2. — Приготовление концентрирующего геля / КонсультантПлюс

Компоненты раствора	Объем компонента (мл) на 1 кассету геля вместимостью
Раствор акриламида <1>
1,0 МТрис (pH 6,8) <2>
Раствор 100 г/л ДСН <3>
Раствор 100 г/л АПС <4>

 

———————————

<1> Раствор акриламида: 30% раствор акриламид/бисакриламида (29:1) P.

<2> МТрис (pH 6,8): 1 M буферный раствор трис-гидрохлорида pH 6,8 P.

<3> Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата P.

<4> Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата P. Благодаря аммония персульфату появляются свободные радикалы, ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата быстро разлагается, свежие растворы следует готовить ежедневно.

<5> ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин P.

 

Приготовление образцов. Если иное не указано в частной фармакопейной статье, образцы могут быть приготовлены приведенными ниже способами.

Приготовление образцов (невосстанавливающие условия). Смешивают равные объемы смеси, состоящей из воды P и испытуемого препарата или препарата сравнения, и концентрированного буферного раствора для приготовления образцов при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P.

Приготовление образцов (восстанавливающие условия). Смешивают равные объемы смеси, состоящей из воды P и испытуемого препарата или препарата сравнения, и концентрированного буферного раствора для приготовления образцов в восстанавливающих условиях при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P, содержащего 2-меркаптоэтанол (или дитиотреитол) в качестве восстановителя.

Концентрация, указанная в частной фармакопейной статье, может варьировать в зависимости от белка и способа окрашивания.

Обработка образца: образец выдерживают в кипящей водяной бане в течение 5 мин или нагревательном блоке при температуре 100 °C, затем охлаждают. Температура и время, указанные в частной фармакопейной статье могут варьировать в связи с возможным разрушением белка, которое может произойти при термической обработке.

Установка геля в приборе для электрофореза и электрофоретическое разделение. После завершения полимеризации (около 30 мин) политетрафторэтиленовую гребенку осторожно удаляют. Лунки незамедлительно промывают водой или буферным рабочим раствором для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P для удаления неполимеризованного акриламида. При необходимости выравнивают перегородки концентрирующего геля с помощью тупой иглы для подкожных инъекций, прикрепленной к шприцу. Снимают зажимы с одной короткой стороны, осторожно вытягивают трубку и возвращают зажимы на место. Повторяют эти операции с другой короткой стороны. Удаляют трубку со дна геля. Помещают гель в прибор для электрофореза. Верхний и нижний резервуары наполняют буферным раствором для электрофореза. Удаляют все пузырьки, образующиеся на дне геля между двумя стеклянными пластинками. Для этих целей лучше всего использовать изогнутую иглу, прикрепленную к шприцу. Не следует проводить первоначальный электрофорез до нанесения образцов, так как это приведет к нарушению прерывистости буферной системы. Перед нанесением образцов осторожно ополаскивают каждую лунку рабочим раствором для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P. Готовят испытуемый и контрольный образцы в рекомендованном буферном растворе для образцов и обрабатывают, как указано в частной фармакопейной статье. Наносят необходимое количество каждого раствора в лунки концентрирующего геля.

Электрофорез проводят в условиях, рекомендованных производителем оборудования. Производители оборудования для ДСН-ПААГ могут предоставлять гели различной площади и толщины. Время проведения электрофореза и показатели ток/напряжение могут варьировать при достижении оптимального разделения. Необходимо удостовериться, что фронт красителя перемещается в разделяющий гель. Когда краситель доходит до нижнего края геля, электрофорез останавливают. Кассету с гелем вынимают из прибора и осторожно разделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и отбрасывают концентрирующий гель и немедленно начинают окрашивание оставшегося геля.

Открыть полный текст документа

Буферный раствор для электрофореза — Справочник химика 21

    Он выполняется следующим образом. На середину полоски плотной, гомогенной фильтровальной (хроматографической) бумаги, пропитанной буферным раствором с определенным значением pH, наносят каплю исследуемого коллоидного раствора. Затем на полоску бумаги накладывают разность потенциалов. Под влиянием образующегося электрического поля отдельные компоненты, содержащиеся в капле, обладающие разными электрофоретическими подвижностями, передвигаются по полоске с различными скоростями. Через некоторое время компоненты распределяются на бумаге в виде стольких зон, различно удаленных от исходной точки, сколько компонентов содержалось в растворе. Полоску высушивают и прогревают для денатурации и фиксации находящихся на ней белков и после этого окрашивают подходящими красителями. В результате проявляется распределение компонентов по длине полоски. Роль бумаги в этом методе сводится к устранению диффузионного и конвекционного перемешивания белков при электрофорезе. [c.210]









    Прямые методы сводятся к наблюдению за поведением частиц в электрическом поле при электрофорезе. При этом исследуемый белок подвергают электрофорезу в буферных растворах с разными значениями pH. В буферном растворе со значением pH, равным изоэлектрической точке белка, последний электронейтрален и не перемещается в электрическом поле. Эти наблюдения проводят либо макроскопически в особых электрофоретических аппаратах, либо микроскопически в кювете ультрамикроскопа. Помимо прямых методов наблюдения изоэлектричеекого состояния белков существуют и косвенные методы, которые сводятся к наблюдению максимума или минимума того или иного физического свойства, изменяющегося с изменением дзета-потенциала испытуемого раствора. Все эти методы подробно описаны в соответствующих руководствах. [c.340]

    Схема установки для капиллярного зонного электрофореза не требует особых пояснений (рис. 6.7). Капилляр, в котором перемещаются зоны компонентов образца, помещают между двумя сосудами с раствором, проводящим электрический ток (обычно применяют буферные растворы), и устанавливают между электродами разность потенциалов Ея 20 30 кВ. [c.227]

    НОМ порошке, порошке поливинилхлорида и т. д., и главным образом на целлюлозе. Электрофоретический метод разделения имеет особое значение для разделения коллоидов и аминокислот, так как заряд частиц этих соединений зависит от значения pH среды. Поэтому значение pH раствора (изо-электрическая точка) оказывает большое влияние на направление движения ионов в растворе. Процесс электрофореза проводят часто в присутствии буферных растворов. Согласно уравнению (7.1.29), состав раствора оказывает большое влияние на скорость движения частиц в растворе. Движению частиц в электрическом поле препятствует явление диффузии. Влияние диффузии обратно пропорционально размерам частиц и силе поля. Для разделения ионов больших размеров можно применять электрофорез при низком напряжении, для разделения частиц небольших размеров следует работать при более высоких напряжениях. Электрофорез на носителе по технике выполнения проще, чем обычный электрофорез. При этом вещества в соответствии со скоростями их движения в электрическом поле фракционно осаждаются на носителе. Используя сорбционное действие носителя, можно замедлить движение частиц, что приведет к расширению зон фракционирования. Под действием выделяемого током тепла, особенно при работе с высокими напряжениями, происходит испарение растворителя, что затрудняет процесс разделения. Важным фактором является удаление перед разделением больших количеств электролитов, например, в процессе диализа. [c.387]

    И менее точен, но зато значительно проще, чем метод Тизелиуса. На полоску фильтровальной бумаги, увлажненной буферным раствором, наносят в форме поперечной черточки или пятна исследуемый биоколлоидный раствор. Полоску помещают в горизонтальном положении в закрытое пространство, а концы ее погружают в буферный раствор, где находятся электроды. После подключения источника электродвижущей силы электрическое поле вызывает движение компонентов, находящихся в черточке или пятне, вдоль полоски. Скорость перемещения компонентов зависит от их электрофоретической подвижности. Через некоторое время электрофорез прекращают, бумагу высушивают и погружают в раствор красителя, который на биоколлоиде адсорбируется сильнее, чем на бумаге. По полученному изображению видно положение компонентов в конце электрофореза, и можно судить об их числе и электрофоретической подвижности. Из сказанного выше видно, что бумага играет роль пористой среды, препятствующей растеканию компонентов и их конвективному перемешиванию со средой, в которой протекает электрофорез . В последнее время вместо бумаги используют гелеобразные среды (агар-агар, желатин), которые дают более резко очерченные зоны. Электрофорез на бумаге (и в других средах) сопровождается побочными явлениями, такими, например, как перенос вещества, вызываемый миграцией испаряющегося буфера (Машбёф, Ребейрот и др., 1953 г.). Кроме того, было установлено (Шелудко, Константинов, Цветанов, 1959 г.), что, например, в желатине не только сама электрофоретическая подвижность некоторых красителей меньше, чем в воде или водных растворах, но и соотношение между подвижностями компонентов в этом случае совсем иное. Эти особенности метода еще не до конца изучены. Поскольку рассматриваемый метод имеет важное практическое значение, различные проблемы создаваемой в настоящее время теории электрофореза в пористых и гелеобразных средах п разнообразные методы его использования являются предметом многих научных трудов. Некоторое представление о них читатель может получить из монографии [6 1. [c.158]

    Электрофоретическое разделение белков в водной среде основано на способности их заряженных частиц перемещаться относительно растворителя под влиянием внешнего электрического поля. Если концентрация водородных ионов в растворителе не равна изоэлектрической точке, то скорость перемещения частиц зависит от величины их свободного заряда, размера и формы. Поскольку даже близкородственные белки, например, некоторые фракции сывороточного альбумина, имеют весьма различную электрофоретическую подвижность и поскольку их подвижность изменяется неодинаково при изменениях pH и состава буферных растворов, электрофорез может быть с успехом применен для разделения белковых смесей и характеристики отдельных белков. [c.164]

    Белковые смеси анализируют электрофорезом на бумаге. Хроматографическую бумагу пропитывают буферным раствором, поддерживая тем самым необходимое значение pH. Наносят анализируемую смесь и создают электрическое напряжение. По истечении определенного времени (оно зависит от свойств разделяемых белков, носителя и приложенной разности потенциалов) проявляют электрофореграммы химическими и биохимическими методами. [c.216]

    По электрофоретической подвижности. Исследуемый белок подвергают электрофорезу в буферных растворах с разным значением pH. В буфере со значением pH, равным изоэлектрической точке белка, последний электронейтрален и перемешаться в электрическом поле не будет. [c.189]

    Различают свободный электрофорез и электрофорез в поддерживающих средах. При свободном электрофорезе изучаемую смесь белков помещают в буферный раствор, контактирующий с электродами. Установка для свободного электрофореза сложна она имеет фотооптическую систему для регистрации результатов разделения белковой смеси. Второй тип электрофореза предусматривает использование поддерживающих сред (специальной хроматографической бумаги, ацетатной целлюлозы, агарового или крахмального геля и т. п.), которые сначала пропитывают буферными растворами, а затем помещают на них исследуемую белковую смесь. Концы бумажных полос, агаровых или крахмальных блоков и т. п. контактируют обычно с буферным раствором, в который погружены электроды, соединенные с источником постоянного электрического тока (рис. 95  [c.218]

    Важнейшей областью применения электрофореза является анализ биоколлоидов, например анализ смесей белков в клиническом анализе. Белки, как амфотерные полиэлектролиты, обладают собственными зарядами, зависящим от pH среды. Регулируя значение pH, можно в широких пределах менять их подвижность и даже изменить направление движения в процессе электрофореза. Для каждого белка при определенном значении pH общее число положительных зарядов равно общему числу отрицательных зарядов. Эта иэоэлектрическая точка, при которой отсутствует движение частиц, является характерной величиной для определенного белка. Растворимость белка в этой точке минимальна. Подбирая соответствующие буферные растворы для установления определенной скорости движения и растворимости веществ, можно приспособить процессы электрофореза для решения разных проблем разделения веществ. Таким образом, электрофорез превосходит метод бумажной хроматографии. Кроме того, при помощи электрофореза, особенно при высоком напряжении, можно проводить разделение неионогенных веществ (например, сахар в виде боратного комплекса) [791. Методом электрофореза можно также определять изоэлектрические точки амфотерных веществ или заряды коллоидных частиц (по направлению движения). [c.387]

    После нанесения образцов белка в трубочки наслаивают электродный буфер, затем заливают буфер в верхний резервуар. При использовании щелочных буферных растворов в них добавляют раствор бромфенолового синего из расчета 0,5—1 мл красителя на 500 мл раствора, а в случае кислых буферов — метиленовый зеленый. Краситель маркирует движущийся пограничный слой во время электрофореза. [c.96]

    В хроматографии движение растворенного образца и разделение его на компоненты осуществляется за счет движения растворителя. При электрофорезе растворитель (буферный раствор) представляет собой неподвижную фазу, тогда как растворенное вещество (заряженные частицы) мигрирует под действием приложенного электрического поля. В [21, 22] приведены рекомендуемые экспериментальные условия для электрофореза большого числа соединений, в том числе подходящие буферные растворы. [c.403]

    Широкое распространение в настоящее время получил так называемый зональный электрофорез — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, ами-довым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково. [c.89]

    При высоких значениях pH гидроксильная группа может быть ионизирована в виде несущего заряд полианиона. В боратных буферных растворах полисахариды образуют отрицательно заряженный комплекс, который, как правило, должен двигаться к аноду. Однако при электрофорезе на твердых носителях (бумага, волокно, стеклянный порошок) при pH 9,3 возможно перемещение боратных комплексов к катоду. [c.48]

    Разновидность метода — бумажный электрофорез, оформление которого значительно проще. В этом методе на полоску однородной непроклеенной бумаги, пропитанной буферным раствором, наносят каплю исследуемого раствора. Концы полоски погружают в сосуды с электродами, заполненные тем же буферным раствором. Под действием поля компоненты движутся с различными скоростями (пропорциональными ) и через некоторое время наступает пространственное их разделение и проявление в виде отдельных пятен после фиксации специальным проявителем. По интенсивности пятен и сдвигу их от начального уровня можно оценить состав и концентрации компонентов в исходном растворе. [c.199]

    Для приготовления агаровых пластинок используют предметные стекла. Предварительно их обезжиривают, тщательно промывают водой и высушивают. Стекла нумеруют, укладывают на строго горизонтальную поверхность и на каждое осторожно наливают пипеткой с широким концом 4 мл агара. Пузырьки воздуха в агаре необходимо вывести пипеткой на края стекла. Когда агар застынет и образуется твердый гель, в нем посередине вырезают лунку (щель) для нанесения исследуемого раствора. Приготовленные пластинки укладывают в электрофоретическую камеру. Агаровое плато соединяют с буферным раствором бумажными мостиками из фильтровальной бумаги. В щель каждой пластинки вводят сыворотку крови, предварительно разведенную буферным раствором. На электрофореграмму наносят около 100—300 мкг белка в объеме 0,01 мл. Прибор подключают к источнику тока. Медленно повышая напряжение, доводят силу тока до 20—25 мА (напряжение 200—300 В). Электрофорез проводят в течение 3—4 ч. [c.93]

    Электрофорез сыворотки крови проводят в 1%-ном агаре в ме-динал-вероналовом буфере (pH 8,6) с ионной силой 0,05. Все белки сыворотки при pH 8,6 заряжаются отрицательно и перемещаются в электрическом ноле в сторону анода. Однако практически медленно продвигающиеся фракции белков сыворотки обычно движутся в сторону катода. Аномальное движение этих фракций объясняется наличием в агаровом геле электроэндоосмотического тока жидкости, направленного в описанных выше условиях от анода к катоду, а также тока жидкости, возникающего при неравномерном испарении воды с поверхности геля. Неравномерное испарение приводит к неравномерному распределению электрического поля в нем. Уменьшить испарение воды можно двумя способами 1) герметически закрывая электрофоретическую камеру во время электрофореза, 2) проводя электрофорез при низкой температуре (в холодильнике или холодной кОмнате, буферный раствор должен быть заранее охлажден). [c.92]

    При электрофорезе компоненты смеси ионов на твердом носителе (напрпмер, фильтровальная бумага или колонка с наполнителем, насыщенные проводящим буферным раствором) мигрируют с различными [c.380]

    Решающим при сочетании электрофореза с ТСХ является правильный выбор электролита, которым предварительно пропитывают тонкий слой сорбента. Обычно для разделения смесей ионов-щелочных металлов в качестве электролита применяют буферный раствор ЫН4С1 + НС1 (pH 2,18), 3,5-10- М раствор паравольфра-мата аммония или 0,001—0,1 М раствор нитрата аммония. Для анализа щелочноземельных металлов применяют 0,15 М раствор лимонной кислоты, для анализа тяжелых металлов — 0,05 М раствор КаОН, 0,1 М раствор НС1 или 0,1 М раствор а-оксиизомас-ляной кислоты. Редкоземельные элементы анализируют на фоне [c.159]

    Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 В. Схема одного из вариантов приборов для низковольтного электрофореза представлена на рис. 8. [c.89]

    Нейтральные полисахариды также могут быть разделены электрофорезом в щелочном [32] или боратном буферных растворах. [c.48]

    Одним из самых важных применений электрофореза является использование его в анализе естественных смесей коллоидов, например белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот, а также продуктов, полученных фракционной перегонкой. При электрофорезе между раствором белка и буфером в специальной У-образной трубке, снабженной электродами, образуется резкая граница, за движением которой можно проследить с помощью оптической шлирен-системы (разд. 11.10). Эти опыты обычно проводят при температуре 4° С, т. е. при максимальной плотности воды, так что температурный градиент в электрофоретической кювете, вызванный нагреванием током, сопровождается наименьшим градиентом плотности. Градиенты плотности горизонтально поперек кюветы стремятся вызвать конвекцию. На рис. 20.1 [1] показана электрофоретическая картина плазмы крови человека в буферном растворе (pH 8,6) диэтилбарбитурата натрия с ионной силой 0,10 (после 150 мин при 6,0 В/см и 1°С). Строится график зависимости градиента показателя преломления от расстояния в кювете (горизонтальная ось). Одна картина получена для той части кюветы, в которой белки опускаются вниз, а другая — для той части, где белки поднимаются вверх. Начальные положения границ указаны на рисунке тупыми концами стрелок. Различные виды белков представлены альбумином, аг, аг-, р-, у-глобу-линами и фибриногеном ф. Площадь под определенным пиком почти точно пропорциональна концентрации белка, дающего эту границу. Так, например, процент альбумина может быть получен делением площади пика альбумина на суммарную площадь всех пиков белков. е-Граница в спускающейся части и б-граница в поднимающейся части картины обусловлены не белковыми компонентами, а изменениями концентрации соли, которые возникают в опытах с обычным переносом вблизи начального положения границы. [c.603]

    С помощью амперометрических детекторов в условиях капиллярного зонного электрофореза можно определять электроактивные вещества на уровне субатомных количеств. Однако не все соединения имеют электроактивные группы. Для их определения используют косвенные методы амперометрического детектирования. При этом к буферному раствору добавляют ионофоры, например [c.585]

    Для каждой аминокислот1з1 характерна своя величина рТ, которая определяется строением боковой цепи К (ср. табл. 20). Вследствие этого в буферном растворе с постоянным pH разные аминокислоты несут неодинаковые по величине (а иногда — и по знаку) заряды, что сказывается на скорости и направлении их движения в электрическом поле. Это явление используется для электрофоретического разделения аминокислот на бумаге или на крахмале (электрофорез на носителях). Различия в зарядах аминокислот оказывают также влияние на их способность обмениваться с другими ионами. В сочетании с эффектом [c.350]

    Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Во внутренние части электродных отсеков погружают электроды. На листе хроматографической бумаги (18X45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4—5 см) на расстоянии 15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2X0,3 см), большие бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграм-мы — 2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6—8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между дву-мя-тремя лисгами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги. [c.91]

    Образцы наносят на бумагу капилляром или микропипеткой, все время подсушивая зону нанесения. После нанесения образцов бумагу, начиная с краев, увлажняют буферным раствором. При этом следят за тем, чтобы бумага увлажнялась равномерно, а фронты буферного раствора, пропитывающего бумагу слева и справа от линии старта, сошлись бы точно на линии старта. Избыток буфера удаляют фильтровальной бумагой. Избыточное увлажнение бумаги ухудшает разделение Бумагу помещают в специальный полиэтиленовый пакет и кладут на охлажденную плиту прибора для электрофореза. Контакты электрофореграммы с электродными отсеками обеспечиваются с помощью бумажных фитилей, смоченных в буферном растворе. Сверху на электрофореграмму нai/лaдывaют подушку из поролона, которая специальной крышкой прижимает бумагу к охлаждающей плите и обеспечивает эффективное отведение тепла, выделяющегося при электрофорезе. Прибор закрывают крышкой из пластмассы и подключают к источнику тока. Электрофорез проводят в течение 1,5—2,5 ч при на- [c.138]

    Проведение электрофореза. После того, как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмечепнь е участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы 0,01—0,02мл (1—2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышей и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22—24 ч при напряжении 200— 300 В [c.91]

    Зонный электрофорез на бумаге. Различают бумажный электрофорез низковольтный (при градиенте напряжения 20—30 В/см) и высоковольтный (с градиентом напряжения до 200 В/см). Высоковольтный электрофорез применяют для разделения низкомолекулярных соединений. Приборы оборудуют устройствами для отвода джоулевой теплоты, для чего используют инертные жидкости (тетрахлорид углерода, толуол), в которые помещают пропитанные буферным раствором бумажные полоски (фореграммы). Сама жидкость охлаждается с помощью погруженного в нее холодильника. [c.363]

    Зависимость суммарного заряда на полипептиде или белке от изменения pH среды можно использовать для разделения этих молекул с помощью электрофореза. Если смесь полипептидов в водном буферном растворе с известным значением pH подвергнуть воздействии сильного электрического поля, то молекулы с общим положительным или отрицательным зарядом будут перемен аться в противоположных направлениях, в то время как молекулы с нулевым зарядом при выбранном pH останутся ненодвижными. Сложную смесь белков можно раз-де. шть на компоненты, осуществляя электрофорез па бумаге, пропитанной буфером, или в гель-нроводящей пленке. Подвижность состав[1ых частей смеси или паправлспие их перемещения П[)и э. ектрофорезе зависят от значения pH, при котором проводится процесс. [c.300]

    Прн реакции хлоргидрата тиофенилового эфира аланина с коферментом А был получен хлоргидрат S-аланилкофермента А, который, выделяли с помощью электрофореза. Прн действии на это соединение глутаминовой кислоты в буферном растворе при pH 8 продуктом реакции, по данным электрофореграммы, была аланилглутамииовая кислота [358]. [c.267]

    Был сконструирован ряд приборов для непрерывного электрофореза. Одним из наиболее совершенных является прибор Свенсона и Братстена 1б6]. Вместо фильтровальной бумаги (рис. 488) в этом приборе используют стеклянный порошок насыпаемый между двумя пластинками. Стеклянный слой постоянно орошается сверху буферным раствором, а раствор разделя- [c.541]

    Для проведения электрофореза можно использовать прибор фирмы Реанал (описание к прибору прилагается). Прибор (рис. 10) состоит из двух резервуаров для буферных растворов емкостью 1,5 л. [c.95]

    На полоску хроматографической бумаги размером 1X1,5 см наносят 0,005— 0,1 мл 1—2%-ного раствора исследуемых полисахаридов в боратном. буфере (pH 9,3). Полоски подсушивают на воздухе н помещают в широкий бюкс. Полоски картона (картон для электрофореза) размером 2.5X40 см смачивают боратным буферным раствором и помещают в камеру прибора для Эотектро-фореза. Для этой цели можно использовать прибор ЭФА-1. Полоски бумаги с исследуемым раствором кладут на ленты картона, лежащие на рамке камеры прибора так, чтобы они были вблизи катода и на расстоянии 4—5 см от сгиба картона. Электрофорез проводят в боратном буферном растворе при pH 9,3. Электрофореграммы высушивают- и разрезают на отдельные участки длиной по 2 см. Полисахариды с каждого отрезка элюируют водой или раствором щеоючи. Элюаты гидролизуют с 2%-ным раствором НС1 в течение 3 ч при слабом кипении и затем исследуют хроматографией на бумаге или газожидкостной хроматографией. Качественная и количественная хроматография компонентов в гидролизатах элюатов позволяет установить порядок распределения полисахаридов на электрофореграммах и их химический состав. [c.51]

    После завершения электрофореза прибор отключают от источника тока, сливают буферный раствор, трубочки вынимают из прибора и с помощью стальной иглы (под слоем воды) или водой, вводимой шприцом между поверхностью геля и стенкой трубочки, выталкивают столбик геля в 7%-ный раствор уксусной кислоты. Столбики геля помещают в пробирки и добавляют раствор красителя амидового черного 10 Б. Время окрашивания 5—10 мин. В качестве красителя можно использовать кумасси R-250. В этом случае прокрашивают 1—2 ч при комнатной температуре. После окрашивания избыток красителя отмывают 7%-ным раствором уксусной кислоты, цилиндрики геля сохраняют в том же растворе кислоты. [c.96]

    Электрофоретическое разделение углеводов проводят на бумажных полосах, длина которых определяется рамкой прибора для электрофореза. При работе на приборе ЭФА-1 ленты (2,5X40 см) смачивают боратным буферным раствором с pH 9,2 и помещают на рамку прибора. Смесь углеводов наносят на полоски хроматографической бумаги (3X15 мм), которые помещают на ленты. Электрофорез проводят в боратном буферном растворе с pH 9,2. [c.86]

    Для препаративного разделения полисаридов применяют колонки, наполненные стеклянным порошком, и буферный раствор 0,05 М раствор ЫагВЮт- ЮНгО). Электрофорез проводят при напряжении примерно 450 в (1,8 в/см) и силе тока 28—30 ма [34]. [c.50]

---

Количественное определение 0,05 % раствора хлоргексидина методом капиллярного электрофореза

Zverkov, A. V., & Zouzova, A. P. (2013) Khlorgeksidin: nastoyashchee i budushchee odnogo iz osnovnykh antiseptikov [Chlorhexidine: Past, Present, and Future of the Famous Antiseptic Agent]. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya, 15(4), 279–285. [in Russian].

Gerke, A. N. (2015) Osnovnye principy mestnoj antimikrobnoj terapii v dermatologii [The basis of topical antimicrobial therapy in dermatology]. VetPharma, 1(23), 66–75. [in Russian].

Kasikhina, E. I. (2013) Hlorgeksidin: obzor lechebnykh vozmozhnostej i potencial’nykh klinicheskikh pokazanij v praktike akushera-ginekologa i venerologa [Chlorhexidine: a review of treatment options and potential clinical indications in the practice of an obstetrician/gynecologist and a venereologist]. Akurshestvo i ginekologiya, 4, 4–9. [in Russian].

Pogosyan, M.A. (2015) Hlorgeksidin – antiseptik, ne privodyashchij k bakteriorezistentstnosti [Chlorhexidine is an antiseptic that does not lead to bacterioresistance]. Byulleten’ mededicinskih internet-konferencij, 5(10), 1234–1235. [in Russian].

Kouzmina, E., Lapatina, A., & Smirnova, T. (2014) Opolaskivateli polosti rta s khlorgeksidinom: e’ffektivnost’ i bezopasnost’ primeneniya (obzor literatury) [Efficacy and safety of chlorhexidine mouthrinses (literature review)]. Dental Forum, 2(53), 34–39. [in Russian].

Kvashnina, D. V., & Kovalishena, O. V. (2016) Ocenka primeneniya khlorgeksidina kak antisepticheskogo sredstva [Evaluation of chlorhexidine application as an antiseptic]. Medicinskij al’manakh, 3(43), 62–66. [in Russian].

Dounar, H. G., & Rzheuski, S. E. (2017) Antimikrobnaya aktivnost’ gelya hlorgeksidina biglyukonata, prednaznachennogo dlya lecheniya kandidoza polosti rta [Antimicrobial activity of the gel with chlorhexidine digluconate intended for the treatment of oral candidiasis]. Vestnik Vitebskogo gosudarstvennogo

medicinskogo universiteta, 16(3), 91–97. [in Russian].

Lin, S.-C., Huang, C.-F., Shen, L.-J. Wang, H.-J., Lin, Ch.-Y., et al. (2015) Formulation and stability of an extemporaneous 0.02% chlorhexidine digluconate ophthalmic solution. J. Formos. Med. Assos., 114, 1162–1169. https://doi.org/10.1016/j.jfma.2014.08.003

George, J., Klika, A. K., & Higuera, C. A. (2017) Use of Chlorhexidine Preparations in Total Joint Arthroplasty. J. Bone Jt Infect., 2(1), 15–22. doi: 10.7150/jbji.16934

Fiorentino, F. A. M., Corrêa, M. A. & Salgado, H. R. N. (2010) Analytical Methods for the Determination of Chlorhexidine: A Review. Crit. Rev. Anal. Chem., 40, 89–101. doi: 10.1080/10408340903232020

Tyzhigirova, V. V., & Timofeeva, O. N. (2017) Analiz lekarstvennykh preparatov khlorgeksidina biglyukonata i miramistina metodami UF-spektrofotometrii i tonkoslojnoj khromatografii [Analysis of drugs chlorhexidine bigluconate and miramistine by UV- spectrophotometry and thin-layer chromatography]. Innovacionnye tekhnologii v farmacii Proceedings of the All-Russian Scientific and Practical Conference with international participation, (P. 115–121). Sumy: IGMU. [in Russian].

Mubeen, R. S., Mantri, A. P., Singh, S. K., et al. (2016) Simultaneous estimation of chlorhexidine digluconate and miconazole nitrate by RP- HPLC. European Journal of Biomedical and Pharmaceutical sciences, 3, 617–620.

Mohamme, T. G., & Abdel Aziz, E. M. (2017) Development and validation of a simple, fast, isocratic stability indicating RP-HPLC-UV method for the determination of chlorhexidine and its impurity para-chloroaniline in bulk and finished product. Journal of Pharmacy, 7, 01–08. doi: 10.9790/3013-0706010108

Bogdanovska, L., Saliu, S., Popovska, M., Dimitrovska, A., Ugrinova, L., & Petkovska, R. (2014) Development and validation of RP–HPLC assay of chlorhexidine in gingival crevicular fluid. Arh. farm., 64, 69–82. doi: 10.5937/arhfarm1402069B

Siddiqui, M. R., AlOthman, Z. A., & Rahman, N. (2017) Analytical techniques in pharmaceutical analysis: A review. Arabian Journal of Chemistry, 10(1), 1409–1421. https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2013.04.016

Kumar, M., Bhatia, R., & Rawal, R. K. (2018) Applications of various analytical techniques in quality control of pharmaceutical excipients. J. Pharm Biomed Anal., 157, 122–136. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2018.05.023

Ma, H., Bai, Y., Li, J., & Chang, Y. X. (2018) Screening bioactive compounds from natural product and its preparations using capillary electrophoresis. Electrophoresis, 39(1), 260–274. doi: 10.1002/elps.201700239

Hamdan, I. I. (2017) Capillary electrophoresis in the analysis of pharmaceuticals in environmental water: A critical review. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 40, 111–125. doi: 10.1080/10826076.2017.1293550

Abramova, E., Alekseeva, N., & Egorov, A. (2012) Attestaciya/kvalifikaciya (validaciya) oborudovaniya i analiticheskikh metodov v farmacevticheskom proizvodstve [Instrumentation and Analytical Methods Attestation/Qualification (Validation) when Carrying out Pharmaceutical Production]. Analitika, 1, 60–62. [in Russian].

(2015) Gosudarstvennaya farmakopeya Rossijskoj Federacii [State Pharmacopoeia of the Russian Federation] Retrieved from http://femb.ru/feml. [in Russian].

(2017). USP39-NF34. Rockville. Retrieved from http://www.usp.org/ sites/default/files/usp_pdf/EN/products/usp39-nf34-index-supplement1.pdf.

Электрофорез

Цветной бульвар

Москва, Самотечная, 5

круглосуточно

Преображенская площадь

Москва, Б. Черкизовская, 5

Ежедневно

c 09:00 до 21:00

Выходной:

1 января 2020

Бульвар Дмитрия Донского

Москва, Грина, 28 корпус 1

Ежедневно

c 09:00 до 21:00

Мичуринский проспект

Москва, Большая Очаковская, 3

Ежедневно

c 09:00 до 21:00

Набор для электрофореза «Энзимная коррекция»

Ферменкол

ФЕРМЕНКОЛ — уникальный ферментный комплекс из 9 коллагенолитических протеаз. Применяется для коррекции гипертофических и келоидных рубцов после операций, ран, ожогов, акне, а также в комплексной терапии контрактур.

Ферменкол избирательно воздействует на избыточную рубцовую ткань и разрушает ее основные компоненты: коллаген, эластин и гиалуроновую кислоту.

Применение

 

В зависимости от вида и возраста рубца готовится раствор Ферменкол нужной концентрации. Рекомендуемая концентрация для коррекции гипертрофических рубцов составляет 0,01-0,02%, для келоидных — 0,05-0,1%.

Готовый раствор ферментов применяют методом электрофореза. Процедуры электрофореза можно проводить в условиях физиотерапевтических и косметологических кабинетов или дома при помощи аппаратов Элфор

Электрофорез с Ферменколом — наиболее эффективный метод введения ферментов коллагеназы в рубцовую ткань. Постоянное электрическое напряжение позволяет вводить растворы ферментов, нанесенные на лечебные электроды,  в глубоко расположенные участки рубцовой ткани.

В набор входит:
Средство косметическое ферментное Ферменкол, cухое активное вещество, 4 мг
Средство для приготовления раствора ферментов Солактин, 40 мл

Рекомендуется использовать для ухода за проблемной и рубцово-измененной кожей после операций, ран, ожогов, гнойно-воспалительных заболеваний кожи, в т.ч. угревой сыпи. Проявляет выраженную коллагенолитическую активность в отношении избыточного коллагена рубцовой ткани.
Производитель: ОАО НПК «Высокие Технологии», 191167, Россия, Санкт-Петербург, ул. Александра Невского, д. 9, лит. А.
Изготовитель: ООО «Рэсбио» по заказу ОАО НПК «Высокие Технологии», 196641, Россия, Санкт-Петербург, пос. Металлострой, промзона «Металлострой», д. 5А.

Способ применения

Электрофорез
Исходя из клинической формы, возраста, площади и глубины рубца применяют растворы Ферменкол различной концентрации. Рекомендуемая концентрация для коррекции келоидных рубцов составляет0,5-1 мг/мл, для гипертрофических — 0,1-0,2 мг/мл.

Для проведения процедуры на 1 см² рубцовой ткани требуется 0,3-0,5 мл раствора Ферменкол.
Раствором Ферменкол смочить прослойку из фильтровальной бумаги или марлевую салфетку, наложить на рубцовый участок кожи. Сверху наложить смоченную в воде прокладку с электродом. Во избежание ожога проклада должна по периметру выступать за границы электрода.
Введение осуществлять с положительного полюса (с анода)!
Режим введения: плотность тока не более 0,1 мА/см² при локализации рубца на коже туловища и конечностей, и не более 0,05 мА/см² при электрофорезе в области лица. У детей до 5 лет при электрофорезе в области лица плотность тока не должна превышать 0,01 мА/см².
Продолжительность процедуры 20-25 минут. После процедуры электрофореза следует около 30 минут оставаться в помещении.
Длительность курса — 10-15 процедур.
Периодичность процедур: желательно ежедневно в одно и то же время суток, но не реже, чем через день.
Интервал между курсами — 7-10 дней.

Противопоказания

Индивидуальная непереносимость коллагеназ, гипотрофические рубцы.

Особые указания

Применять не ранее 3-4 недель после травмы, ожога или оперативного вмешательства.

Безопасность

Косметические средства Ферменкол содержат активные ферменты. При повышенной чувствительности кожи они могут вызывать ее покраснение, которое проходит вскоре после окончания курса применения. При попадании средства Ферменкол или его растворов, а также геля в глаза необходимо промыть их большим количеством воды. Попадание в открытую рану не опасно.
Беречь от детей.

Условия хранения

Хранить в сухом темном прохладном месте, не замораживать и не нагревать выше +40°С.
Срок хранения приготовленного раствора Ферменкол составляет 7 суток при температуре от +2°С до +6°С, раствор не замораживать.
3 года с даты изготовления.
Не использовать по истечении срока годности.

Имеются противопоказания, перед использованием следует ознакомиться с инструкцией по применению.

лечение суставов электрофорезом

Электрофорез – одна из наиболее распространённых процедур в электролечении. Особенностью метода является сочетание действия постоянного электрического тока  и лекарственного средства. Их совместное использование даёт значительный терапевтический эффект, чем объясняется широкое применение электрофореза в терапии заболеваний практически всех систем организма. В частности, высокую результативность показало лечение суставов методом электрофореза.

Процедура электрофореза осуществляется следующим образом:

• слой фильтровальной бумаги смачивается лекарственным препаратом;
• лекарственная прослойка накладывается на область воздействия;
• поверх прокладки накладываются электроды – важным моментом является заряд электрода, поскольку в разных случаях поверх смоченной лекарством ткани накладывается положительный или отрицательный электрод в зависимости от действующего вещества.

Лекарственные вещества, растворяясь, диссоциируют на ионы (заряженные частицы). При попадании медикамента в электрическое поле ионы приобретают способность к перемещению к противоположно заряженным полюсам. Благодаря этому они проникают в ткани организма, оказывая терапевтическое действие.

Преимущества использования электрофореза для лечения суставов

Широкое применение электрофореза объясняется терапевтическим эффектом, создаваемым процедурой. Среди преимуществ этого метода электролечения стоит упомянуть следующие факты:

• лекарство вводится локально, что позволяет сконцентрировать его воздействие именно в патологическом очаге;
• во время процедуры препарат скапливается в месте введения, создавая в тканях своеобразное «депо» – из него лекарство медленно распространяется по очагу патологии, что позволяет пролонгировать терапевтический эффект;
• введение препарата при электрофорезе возможно даже в случае нарушений микроциркуляции в окружающих тканях или в области патологического очага;
• электрофорез не предполагает повреждений кожи – вещество свободно проникает через кожный покров.
• при таком способе введения препарата риск развития побочных и аллергических реакций минимален, в отличие от парентерального и перорального введения.

Эти и другие эффекты описанного вида электролечения делают его незаменимым при заболеваниях опорно-двигательного аппарата в общем и суставов в частности. Чаще всего лечение суставов электрофорезом назначается при следующих заболеваниях:

• деформирующий артроз;
• плече-лопаточный периартроз;
• бурсит;
• эпикондилит;
• тендинит и т.д.
• дисплазия тазобедренных суставов у детей раннего возраста (первого года жизни).

Особенности лечения суставов электрофорезом

При лечении суставов электрофорезом чаще всего назначаются следующие препараты:

• эуфиллин;
• сернокислая магнезия;
• новокаин;
• растворы лидазы и т.д.

При использовании электрофореза не имеет значения размер сустава и глубина его расположения в тканях, поскольку  «депо» лекарственного средства создается внутрикожно в зоне патологического очага. Препарат будет поступать в ткани очага из кожного «депо» ещё на протяжении 15-20 суток.

Электрофорез является эффективной и безболезненной процедурой, однако даже для неё существуют некоторые противопоказания. Они являются общими для большинства видов электролечения:

• повреждения кожи в области воздействия;
• расстройства кожной чувствительности;
• индивидуальная непереносимость постоянного тока;
• онкологические заболевания;
• острый воспалительный процесс любой локализации с повышенной температурой.

Перед проведением курса электрофореза для лечения суставов следует в обязательном порядке пройти консультацию у нашего специалиста.

Назначение буфера в электрофорезе

Биохимики и молекулярные биологи используют электрофорез для разделения макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Это позволяет ученым выделять и анализировать отдельные белки или последовательности нуклеиновых кислот в сложной смеси. Типичным примером электрофореза в лаборатории является микробиолог, использующий полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для разделения фрагментов ДНК, производимых микробным сообществом. Независимо от цели электрофорез всегда требует использования буферного раствора.

TL; DR (слишком долго; не читал)

Электрофорез разделяет макромолекулы, такие как белок и нуклеиновые кислоты, по размеру, заряду и другим свойствам. Для электрофореза, который разделяет по заряду, ученые используют буфер для передачи этого заряда через гель. Буфер также поддерживает стабильный pH геля, сводя к минимуму изменения, которые могут произойти в белке или нуклеиновой кислоте при воздействии нестабильного pH.

Принципы электрофореза

Электрофорез разделяет молекулы по градиенту в зависимости от их размера, заряда или других свойств.Этот градиент может быть электрическим полем или, в случае денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE), денатурирующим агентом, таким как смесь мочевины и формамида. Белки будут мигрировать к аноду, если он заряжен отрицательно, и к катоду, если он заряжен положительно. Поскольку более крупные молекулы мигрируют медленнее, чем молекулы меньшего размера, ученые могут измерить пройденное расстояние и использовать логарифмы для определения размера фрагментов.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез

С DGGE ДНК движется по градиенту возрастающей денатурирующей способности до тех пор, пока мощность не станет достаточной для денатурирования или развертывания этого конкретного фрагмента ДНК полностью.На этом миграция останавливается. Ученые могут использовать этот метод для разделения фрагментов на основе их индивидуальной чувствительности к денатурированию.

Что делает буфер

В случае электрофореза, который разделяет на основе заряда, ионы в буфере передают заряд, необходимый для разделения. Буфер, предоставляя резервуар для слабой кислоты и основания, также поддерживает pH в узком диапазоне. Это важно, потому что структура и заряд белка или нуклеиновой кислоты изменятся при значительном изменении pH, что препятствует надлежащему разделению.

Типичные буферы

Различные буферы идеально подходят для поддержания геля для электрофореза в различных желаемых диапазонах pH. Типичные буферы, используемые учеными для этой цели, включают уксусную кислоту, борную кислоту, фосфорную кислоту и лимонную кислоту, а также глицин и таурин. Как правило, значение pKa (константа диссоциации кислоты) должно быть близко к требуемому pH. Нам предпочтительнее буферы, которые обеспечивают низкую величину заряда, чтобы не проводить слишком большой ток.

Капиллярный электрофорез в свободном растворе — обзор

2.1 Капиллярный зональный электрофорез (CZE)

CZE, также известный как капиллярный электрофорез в свободном растворе, является самым простым и наиболее часто используемым методом разделения в КЭ. В CZE капилляр полностью заполнен носителем или фоновым электролитом (BGE), обеспечивая буферную емкость и проводя электрический ток. На одном конце капилляра вводится очень маленькая зона образца, и прикладывается потенциал. Каждый компонент образца по-разному перемещается по капилляру и через некоторое время может разделиться на отдельные зоны.Скорость миграции и направление каждого компонента определяются кажущейся подвижностью иона, которая связана с зарядом и размером иона и скоростью EOF при заданном pH. Все нейтральные компоненты образца будут перемещаться со скоростью EOF, в то время как заряженные компоненты могут быть разделены с помощью CZE. Следовательно, важным условием успешного разделения в CZE является сохранение заряда молекулы путем выбора правильного состава BGE. В зависимости от значений p K _a каждой функциональной группы в молекуле и pH выбранного BGE, молекула может быть ионизирована.

Однако некоторые очень важные пищевые компоненты содержат группы, которые трудно ионизировать. Такие молекулы должны быть либо дериватизированы, либо образованы комплексом с веществом, которое может обеспечивать ионизируемую или заряженную функциональную группу в их структуре. Дериватизацию и комплексообразование можно проводить на этапе подготовки образца или на колонке во время анализа (Glatz, 2015). В этом случае агент дериватизации или комплексообразования является частью BGE. Например, сахариды или нуклеозиды, содержащие цис- -диольных групп, могут образовывать комплекс с боратами и мигрировать в виде анионов к положительному электроду (Coelho & Jesus, 2016; Hoffstetter-Kuhn, Paulus, Gassmann, & Widmer, 1991; Landers, Oda , & Schuchard, 1992; Quirino & Terabe, 2001).

Благодаря простоте механизма разделения CZE, можно моделировать электрофореграммы с помощью компьютерных программ, таких как PeakMaster, который доступен в Интернете (https://web.natur.cuni.cz/gas/peakmaster.html). Зная инструментальные параметры, такие как длина капилляра, приложенное напряжение, состав BGE и анализируемые вещества, подлежащие разделению, электрофореграмма может быть легко смоделирована. Программа содержит большую базу данных ионов, позволяющую моделировать экспериментальные условия для получения хорошего разделения и сигнала (Jaros, Hruska, Stedry, Zuskova, & Gas, 2004).Кроме того, в базу данных можно добавлять новые соединения, включая их значения и подвижности.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Рабочий процесс электрофореза нуклеиновых кислот

— 5 основных шагов | Thermo Fisher Scientific

Гель-электрофорез является частью многих экспериментов по молекулярной биологии. Настройка электрофореза нуклеиновых кислот включает ряд шагов для достижения оптимального разделения и анализа образцов нуклеиновых кислот.Как показано на рис. 1 , ключевыми этапами рабочего процесса гель-электрофореза нуклеиновых кислот являются:

Рисунок 1. Пять ключевых этапов гель-электрофореза нуклеиновых кислот.

1. Выбор и приготовление гелей.

Агароза и полиакриламид — две наиболее распространенные гелевые матрицы, используемые при электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот. Оба материала образуют трехмерные матрицы с размерами пор, подходящими для разделения нуклеиновых кислот, и не вступают в реакцию с образцами.Размеры пор можно регулировать, варьируя процентное содержание матрицы, чтобы эффективно разделять нуклеиновые кислоты разных размеров.

Выбор между агарозой и полиакриламидом зависит в первую очередь от диапазона размеров и желаемого разрешения разделения образцов нуклеиновой кислоты, хотя можно рассмотреть методы литья из геля и извлечения образцов (, таблица 1, ). Агароза образует матрицы с размерами пор, идеально подходящими для разделения молекул нуклеиновых кислот в диапазоне 0,1–25 т.п.н. С другой стороны, полиакриламид образует поры меньшего размера, которые разделяют молекулы нуклеиновой кислоты размером менее 1 т.п.н.В некоторых случаях разрешение по одному основанию между фрагментами размером <100 п.н. может быть достигнуто с помощью полиакриламидных гелей [1].

Таблица 1. Различия между агарозным и полиакриламидным гелями.

9084 реакции

	Агароза	Полиакриламид
Источник	Полисахаридный полимер из морских водорослей	Сшитый акриламид и бис-акриламидный подход 7
Восстановление нуклеиновой кислоты	Расплавление и извлечение	Растворение и диффузия или электроэлюирование
Диапазон разделения ДНК	50–50 000 п.н. мощность	5–10 нуклеотидов	Одиночные нуклеотиды

а.Гели агарозы

Для приготовления геля агароза обычно доступна в виде порошков, хотя в последние годы также стали доступны удобные предварительно взвешенные таблетки. Чтобы упростить рабочий процесс и сэкономить время, можно рассмотреть готовые агарозные гели, которые можно запускать, визуализировать и анализировать как интегрированную единицу в некоторых коммерчески доступных системах.

Более быстрый, простой и эффективный электрофорез

В этом видео представлены советы по достижению более быстрого, простого и эффективного электрофореза путем выбора правильных инструментов исследования.

Интегрированная платформа для прогона геля и визуализации

В этом видео показана полная система электрофореза, которая полностью объединяет электрофорез ДНК и захват изображений, чтобы помочь вашим открытиям.

Для изготовления ваших собственных гелей агарозы процент геля рассчитывается как:
% геля (вес / объем) = (граммы агарозы / миллилитры буфера) x 100%

Если используется флуоресцентная окраска нуклеиновой кислоты, это может быть включенным в рекомендуемой концентрации (например, 0,5 мкг / мл бромистого этидия) при заливке геля (подробнее: Визуализация геля).

В таблице 2 приведены рекомендуемые процентные содержания агарозного геля для разделения фрагментов ДНК разной длины [2]. В целом, гели с более высоким процентным содержанием приводят к лучшему разделению и разрешению более мелких фрагментов (, рис. 2, ). Обратите внимание, что гели с низким процентным содержанием могут быть хрупкими и сложными в обращении, в то время как гели с высоким процентным содержанием могут быть мутными и мешать визуализации.

Таблица 2. Рекомендуемое процентное содержание агарозных гелей для разделения фрагментов ДНК.

84

Процент геля	Диапазон эффективного разделения (п.о.)
0,5	2,000–50,000
0,6	1,000–20,000
800–12000
0,8	800–10 000
0,9	600–10 000
1.0	400–8000
42	300–7000
1,5	200–3000
2,0 ​​	100–2000
3,0	25–1000	4 3,0	25–1000	4	10–500
5,0	10–300

Рис. 2. Подвижность фрагментов ДНК в агарозных гелях разного процентного содержания. Та же самая лестница ДНК была разделена на 1%, 2% и 3% агарозных гелях в одинаковых условиях (включая время анализа).Фрагмент размером 1 т.п.н. обозначен красными звездочками для сравнения.

Основы агарозы

Агароза — это очищенная форма агара, углеводный структурный компонент клеточной стенки морских красных водорослей. Агароза представляет собой неразветвленный (линейный) полимер с молекулярной массой ~ 120 000, содержащий 800–1 000 моносахаридов. Цепи агарозы состоят из повторяющегося гетеродисахарида, а именно, D-галактозы и 3,6-ангидро-α-L-галактозы, связанных β-1,4-гликозидной связью. Дисахаридная единица, также известная как агаробиоза, образует цепь, соединенную α-1,3-связями (, рис. 3, ).

Рисунок 3. Структурная единица агарозы. Агарозная цепь состоит из 400–500 агаробиозных единиц.

Когда раствор агарозы нагревают и охлаждают, он образует гелевую матрицу с размером пор от 50 до 200 нм в диаметре, что определяется концентрацией геля. При температуре выше 90 ° C агароза плавится и превращается в беспорядочные клубки. При охлаждении две цепочки агарозы образуют спиральные волокна, связанные водородными связями. Дальнейшее охлаждение ниже точки гелеобразования (обычно <40 ° C) приводит к образованию сетей спиральных пучков, удерживаемых вместе большим количеством водородных связей, образуя гель с трехмерными сетками ( Рисунок 4 ) [3,4].Из-за водородных связей образование геля агарозы обратимо при нагревании. Следовательно, нуклеиновые кислоты, разделенные электрофорезом, можно экстрагировать путем плавления срезов геля, содержащих интересующие фрагменты.

Рис. 4. Структура агарозы в растворе, измененная при нагревании и охлаждении.

Для экстракции ДНК размером> 10 т.п.н. агароза с низкой температурой плавления (LMP) может быть лучшим выбором. LMP агароза плавится около 65 ° C (для 1% геля), относительно низкой температуры, что позволяет бережно извлекать очень большие неповрежденные молекулы нуклеиновой кислоты из гелей.Низкая температура гелеобразования агарозы LMP (~ 25 ° C) также делает ее идеальной для ферментативных реакций в геле (например, лигирования), когда ферменты активны в полутвердом растворе агарозы.

б. Полиакриламидные гели

Компоненты полиакриламида — акриламид и сшивающий агент, бисакриламид (также известный как «бис») — доступны в виде порошка, но для удобного приготовления гелей обычно используются заранее приготовленные исходные растворы. Порошок и жидкая форма являются известными нейротоксинами, и с ними следует обращаться осторожно, используя защитную лабораторную одежду.Общая концентрация акриламида и бисакриламида (выраженная в% T) в геле определяет размер пор, который обычно составляет 20–150 нм в диаметре [5]. Чем выше процент, тем меньше размер пор, что позволяет разделить молекулы меньшего размера. Таблица 3 показывает обычно используемые процентные содержания геля [2].

Таблица 3. Рекомендуемое процентное содержание полиакриламидных гелей для разделения фрагментов нуклеиновых кислот. Денатурирующие гели используются для разделения одноцепочечных нуклеиновых кислот в их линейной форме (размеры указаны в основаниях), а неденатурирующие гели в основном используются с двухцепочечными нуклеиновыми кислотами (bp = пары оснований).

3,5 –1,000 б.п.

Полиакриламидный гель (с бис, при 19: 1),%	Диапазон эффективного разделения
Денатурирующие гели
4,0	100–500 основ
70–400 оснований
6.0	40–300 оснований
8.0	30–200 оснований
10.0	20–100 оснований	20–100 15.0	10–50 оснований
20,0	5–30 основ
30,0	1–10 оснований
Неденатурирующие гели
5,0	80–500 б.п.
8,0	60–400 б.п.0	25–150 пар оснований
20,0	5–100 пар оснований

Для разделения нуклеиновых кислот обычно используются полиакриламидные гели с 3–30% (% T). Помимо% T, весовое процентное содержание бисакриламида (сшивающего агента) от общего количества акриламида (% C) имеет решающее значение для размера пор полиакриламидных гелей и разделения образцов (, таблица 4, ).

% T и% C можно выразить как:
% T (вес / объем) = [граммы (акриламид + бисакриламид) / миллилитры буфера] x 100%
% C (вес / вес) = [граммы бисакриламида / грамм (акриламид + бисакриламид)] x 100%

Таблица 4.Общие составы полиакриламидных гелей [5].

Акриламид: бис	% C	Относительный размер пор	Области применения
19: 1	5%	Маленький	ДНК и денатурирующие гели	3,3%	Средний	оцДНК и РНК в неденатурирующих гелях
37,5: 1	2,7%	Большой	Белковые гели

Основы полиакриламида

Полиакриламид представляет собой полимер акриламидных мономеров, часто сшитых бисакриламидом или N, N’-метиленбисакриламидом.Сшивающий агент, бисакриламид, содержит две единицы акриламида, соединенные метиленовым мостиком. Их полимеризация происходит в результате свободнорадикальных реакций, обычно инициируемых персульфатом аммония (APS), которые могут катализироваться TEMED (N, N, N ‘, N’-тетраметилэтилендиамин) (, рис. 5, ). Таким образом, концентрация APS и / или TEMED определяет скорость полимеризации при данной температуре.

Рис. 5. Показано образование полиакриламида со структурами акриламида и бисакриламида. Бисакриламид — это две единицы акриламида, соединенные метиленовым мостиком (красный).

c. Выбор буфера при приготовлении геля

Гели агарозы и полиакриламида получают с использованием ионного раствора с электропроводностью, чтобы обеспечить подвижность нуклеиновой кислоты во время электрофореза. Один и тот же тип буфера обычно используется как для геля, так и для рабочего буфера во время электрофоретического анализа, чтобы поддерживать одинаковый pH и ионную силу. Двумя наиболее распространенными буферами для электрофореза нуклеиновых кислот являются трис-ацетат с ЭДТА (ТАЕ) и трис-борат с ЭДТА (ТВЭ), оба с pH, близким к нейтральному, чтобы способствовать отрицательным зарядам нуклеиновых кислот (подробнее: Выбор буфера в геле). запустить).

Для анализа однонитевой ДНК или РНК часто готовят агарозный и полиакриламидный гели, которые проводят в денатурирующих условиях . Условия денатурирования разрушают водородные связи, которые могут образовываться между нуклеиновыми кислотами, и, таким образом, уменьшают образование вторичных структур, таких как петли шпильки. Таким образом, денатурирующий электрофорез является более рутинным методом разделения и анализа РНК. Обычные денатурирующие буферы, используемые с гелями агарозы и полиакриламида при электрофорезе нуклеиновых кислот, включают:

• Агароза: глиоксаль и ДМСО в натрий-фосфатном буфере, буфер NaOH-EDTA и формальдегид или формамид в буфере MOPS
• Полиакриламид: мочевина в буфере TBE

2.Подготовка стандартов и образцов

а. Выбор стандарта нуклеиновой кислоты

При работе с гелем для оценки размера интересующих образцов включается эталонный образец, содержащий нуклеиновые кислоты известных размеров, часто называемый стандартом или маркером или лестницей . Факторы, которые следует учитывать при выборе подходящей лестницы для данного образца, включают:

• Тип лестницы (то есть ДНК или РНК), структуру фрагмента (то есть одноцепочечную или двухцепочечную) и конформацию (т.е.е., суперспиральный, открытый круговой или линейный), чтобы обеспечить соответствующее сравнение миграции (подробнее: Влияние структуры и конформации на подвижность образца)
• Количество фрагментов и их модели разделения для оценки надлежащего размера
• Предполагаемое использование, например относительно того, предназначена ли лестница для качественного анализа или точных количественных измерений
• Пригодность лестницы для типа используемого геля (например, некоторые сборные гели рекомендуют специальные лестницы, разработанные для оптимальных прогонов)
• Тип загрузки красителей, чтобы избежать затемнения интересующие полосы ( Рисунок 6 )
• Совместимость загрузочного буфера с используемым гелем (например,g., концентрация соли в буфере может повлиять на миграцию образца)

В первые дни стандарты размера ДНК в основном получали из фрагментов рестрикционного расщепления вирусных геномов (например, лямбда φX174) и бактериальных плазмид (например, pUC19) . У этих стандартов часто возникали проблемы с воспроизводимостью переваривания, чистотой образцов и полосами при электрофорезе. Позже лестницы с фрагментами, полученными в результате реакций лигирования и / или ПЦР, стали предпочтительными из-за их воспроизводимости и получения фрагментов желаемого размера.Сегодня хроматографически очищенные фрагменты считаются золотым стандартом для лестниц, поскольку технология обеспечивает более высокий контроль над качеством, структурой полос, интенсивностью и количеством (, рис. 6, ).

Сегодня лестницы также разработаны для обеспечения устойчивости при комнатной температуре как для транспортировки, так и для хранения, а также для удобства и снижения воздействия на окружающую среду. Также доступны предварительно приготовленные, готовые к использованию лестницы, в которых лестницы подготовлены с оптимальной концентрацией загрузочного красителя для загрузки непосредственно на гели.

Обратите внимание, что лестницы от разных производителей с одинаковым описанием (например, 1 kb или 100 bp) могут , а не , содержать одинаковое количество, размер и интенсивность фрагментов ДНК ( Рисунок 7 ). Перед использованием проконсультируйтесь с прилагаемым руководством и протоколом от производителя для получения точных сведений о составе лестницы и ее правильном использовании.

В отличие от лестниц ДНК, лестницы РНК обычно снабжены загрузочным буфером, содержащим денатурант. Денатуранты помогают поддерживать РНК в одноцепочечной форме, обеспечивая более предсказуемые результаты миграции и разделения образцов.При проведении гель-электрофореза РНК следует избегать использования лестниц ДНК, поскольку их использование в денатурирующих условиях может привести к нетипичным структурам разделения из-за разделения двойных цепей.

Рисунок 6. Различия в лестницах ДНК. Лестница № 2 состоит из хроматографически очищенных фрагментов ДНК в оптимальном загрузочном буфере, что приводит к полосам равной или желаемой интенсивности, отсутствию мазков полос и отсутствию теней от красителей. В отличие от этого, лестница №1 была изготовлена ​​по более старой технологии и загружена в буфер с неоптимальным составом.

Рис. 7. Различия в составе фрагментов лестниц ДНК одного и того же описания от двух разных поставщиков, A и B.

б. Подготовка проб и стандартов

Количество ДНК, которое должно быть загружено в гель, должно быть рассчитано, чтобы гарантировать, что интересующие полосы хорошо разделены для визуализации и обнаружения. Хотя 1–100 нг / полоса ДНК обычно достаточно для обнаружения флуоресцентным красителем, минимальное определяемое количество зависит от используемого красителя (подробнее: Свойства красителей нуклеиновых кислот) [6].Обратите внимание, что перегрузка образца или стандарта может привести к смазыванию полос и маскированию близлежащих полос, что приведет к плохому разрешению, особенно когда фрагменты имеют одинаковый размер (, рис. 8A, ).

Рис. 8. Неоптимальное разделение проб. (A) Загруженное количество влияет на разрешение полосы. (B) Низкий объем загруженного сэмпла может привести к искажению полос.

Образцы и лестницы готовят в загрузочном красителе в буфере, так что конечный объем обычно будет занимать не менее 30% объема лунки.Использование меньшего объема может привести к искажению полосы из-за плохого распределения в скважине (, рис. 8B, ). Для образцов, содержащих ДНК-связывающие белки или липкие концы, перед нанесением геля смесь может потребоваться нагреть в загрузочном красителе с SDS, поскольку связывание белка и взаимодействие между фрагментами ДНК может вызвать плохое разделение (, фиг. 10B, ).

c. Выбор красителя и буфера для загрузки

Буферы для загрузки геля (обычно изготавливаемые в виде исходных растворов 6X или 10X) добавляются к образцам (и стандарту, если необходимо) при подготовке к гель-электрофорезу.Компоненты загрузочных буферов включают следующее:

• Ингредиент плотности , такой как глицерин или сахароза, увеличивает вязкость образцов, обеспечивая погружение образцов в лунки.
• Соли , такие как трис-HCl, создают среду с подходящей ионной силой и pH для образцов. Загрузка буферов с высокими концентрациями соли может привести к появлению более широких или искаженных полос и мазков.
• Хелатор металлов , такой как ЭДТА, предотвращает разложение нуклеиновых кислот нуклеазами, присутствующими в образце.
• Красители обеспечивают цвет для легкого мониторинга загрузки образца, хода электрофореза и часто изменений pH. Некоторые загрузочные буферы могут содержать более одного красителя для более эффективного отслеживания миграции молекул различного размера в образце.

Обычно загружающие красители представляют собой небольшие и отрицательно заряженные молекулы, так что они мигрируют в том же направлении, что и нуклеиновые кислоты. Некоторые из них отображают цвета, зависящие от pH, которые служат индикаторами pH для образцов во время загрузки и работы (, рис. 9A, ).Обычно используемые красители включают бромфеноловый синий, ксилолцианол, феноловый красный и оранжевый G. При выборе загрузочного буфера обратите внимание на очевидную миграцию красителя (ов) (, рисунок 9B, , , таблицы 5 и 6, ), чтобы избежать маскирование интересующих полос нуклеиновых кислот, особенно если они имеют аналогичный размер молекул ( Рисунок 9C ). Маскирование красителем делает анализ и количественное определение желаемых полос проблематичным и менее надежным.

Рис. 9. (A) Цвета красителя при нейтральном pH.(B) Миграция красителя в различных процентах агарозы и в буферах TAE и TBE. (C) Покрасьте полосы маскировки теней во время визуализации.

Иногда буфер загрузки включает детергенты или восстанавливающие агенты, такие как SDS, мочевина и формамид, для денатурирования. Эти добавки могут нарушать молекулярные взаимодействия между молекулами нуклеиновой кислоты и внутри них, способствуя линейности или одноцепочечной конформации молекул. Образцы следует нагреть с денатурирующими добавками в красителе для получения оптимальных результатов разделения (, рис. 10А, ).Для электрофореза двухцепочечной ДНК от ферментативных реакций к загрузочному буферу может быть добавлен SDS, чтобы нарушить взаимодействия между белками и нуклеиновыми кислотами, чтобы предотвратить изменение подвижности образца ( Рисунок 10B ).

Рис. 10. Влияние тепла и SDS на электрофорез образцов. (A) ступенек РНК в денатурирующем буфере загружали в гель без тепловой обработки. (B) Образцы ДНК из рестрикционного гидролизата и реакции лигирования получали в загрузочном буфере с или без SDS.Перед загрузкой геля образцы в SDS нагревали.

Таблица 5. Видимые размеры молекул бромфенолового синего и ксилолцианола FF в агарозном и полиакриламидном гелях [2].

(A) Гель агарозы в буферах TBE и TAE

0,5

900 12 п.н.

	Бромфеноловый синий		Ксилолцианол FF
Гель%	TBE	TA6	TA6	750 п.н.	1,150 п.н.	13000 п.н.	16,700 п.н.6	540 бит	850 бит	8,820 бит	11,600 бит
0,7	410 бит 320 п.н.	530 п.н.	4830 п.н.	6,500 п.0	220 bp	370 bp	3030 bp	4,160 bp
1,2	160 bp	275 bp	2,070 bp	9011 9011 9011 9011 2 9011 2 9011 4 900 110 п.н.	190 п.0	30 bp	60 bp	300 bp	460 bp
4,0	18 bp	40 bp	170 bp	26012	27 п.н.	105 п.о.	165 п.н.

(B) Полиакриламидный гель в денатурирующих и неденатурирующих буферах

9010 синий

Акриламид: бис (19: 1), гель%	Ксилолцианол FF
Денатурирующие гели
4.0	50 оснований	230 оснований
5,0	35 оснований	130 оснований
6,0	26 оснований	105 баз
баз	75 баз
10,0	12 баз	55 баз
15,0	10 баз	40 баз
20.0	8 основ	28 основ
30,0	6 основ	20 основ
Неденатурирующие гели
3,5		100 bp 5,0	65 б.п.	260 б.п.
8,0	45 б.п.	160 б.п.0	15 пар оснований	60 оснований
20,0	12 пар оснований	45 пар оснований

(A) Агарозный гель в буферах TBE и TAE

ophen

9010 синий

0.6

900 12 п.н.

Ксилолцианол FF
Гель%	TBE	TAE	TBE	TAE
0,5	750 bp	1,150 bp	540 бит	850 бит	8,820 бит	11,600 бит
0,7	410 бит 320 п.н.	530 п.н.	4830 п.н.	6,500 п.0	220 bp	370 bp	3030 bp	4,160 bp
1,2	160 bp	275 bp	2,070 bp	9011 9011 9011 9011 2 9011 2 9011 4 900 110 п.н.	190 п.0	30 bp	60 bp	300 bp	460 bp
4,0	18 bp	40 bp	170 bp	26012	27 п.н.	105 п.о.	165 п.н.

(B) Полиакриламидный гель в денатурирующих и неденатурирующих буферах

9010 синий

Акриламид: бис (19: 1), гель%	Ксилолцианол FF
Денатурирующие гели
4.0	50 оснований	230 оснований
5,0	35 оснований	130 оснований
6,0	26 оснований	105 баз
баз	75 баз
10,0	12 баз	55 баз
15,0	10 баз	40 баз
20.0	8 основ	28 основ
30,0	6 основ	20 основ
Неденатурирующие гели
3,5		100 bp 5,0	65 б.п.	260 б.п.
8,0	45 б.п.	160 б.п.0	15 п.н.	60 п.н.
20,0	12 п.н.	45 п. 3. Запуск электрофореза. Электрофорез проводится после приготовления гелей, стандартов и образцов. Перед снятием гребня и добавлением рабочего буфера гель должен полностью затвердеть. Гребень с гелем следует поднимать вверх, плавно и устойчиво, чтобы не разорвать гель и не деформировать лунки.После добавления буфера и удаления гребенки необходимо удалить пузырьки воздуха, которые могут застрять в лунках. Для полиакриламидных гелей лунки следует тщательно промыть буфером для удаления остатков неполимеризованного акриламида. Горизонтальные гели должны быть ориентированы в гелевом боксе так, чтобы лунки для образцов находились на стороне отрицательного электрода, чтобы перемещать образцы к положительному электроду, когда начинается электрофорез (, рис. 11A, ). Эту ориентацию можно запомнить как «бег к красному», поскольку положительный электрод обычно имеет красный код.Вертикальные гелевые ящики разработаны с углублениями, расположенными вверху (, рис. 11В, ). Рис. 11. Распределение гелей в системах горизонтального и вертикального электрофореза. Стрелки указывают направление миграции нуклеиновой кислоты при электрофорезе. а. Выбор рабочего буфера Рабочий буфер, представляющий собой ионный раствор с буферной емкостью, обычно используется в прогонах геля, чтобы обеспечить прохождение тока, препятствуя возможным изменениям pH.Во время электрофореза отрицательный электрод становится более основным, а положительный электрод — более кислым из-за потока электронов, что приводит к электролизу воды и сдвигу pH (, таблица 6, ). Выделение газов водорода и кислорода вызывает образование пузырьков на электродах, что является признаком того, что гель течет. В идеале рабочий буфер и буфер для приготовления геля должны быть одинаковыми для обеспечения эффективной проводимости. Таблица 6. Химические реакции и изменения pH на двух электродах. + 4 e — → 2 H 2 (газ) + 4 OH — Электрод Отрицательный (-) Положительный (+) Поток электронов In Out Химическая реакция 9004 2 H 2 O → O 2 (газ) + 4 H + + 4 e — Изменения pH Основной Кислый Выбор буфера для электрофореза зависит от размеров образца, времени анализа и процессов постэлектрофореза с трис-ацетатом ЭДТА (TAE) и трис-боратом EDTA (TBE) — два наиболее распространенных буфера (, таблица 7, ) [2,7]. TAE — лучший выбор для фрагментов размером> 1500 п.н., которые имеют тенденцию меньше размазываться в этом буфере. Из-за своей более низкой буферной способности TAE больше подходит для более коротких электрофоретических циклов (например, <2 часов). Более длительные прогоны геля в TAE могут привести к перегреву, денатурации и / или диффузии образца и, возможно, к плавлению геля из-за низкой буферной способности. TBE имеет более высокую емкость буферизации, что снижает вероятность перегрева и, таким образом, лучше подходит для более длительной работы.TBE лучше работает для разделения более коротких фрагментов, но дцДНК может более медленно мигрировать в TBE. TBE может ингибировать ферменты и поэтому может не подходить для последующих применений, включающих ферментативные стадии, такие как рестрикционное расщепление, клонирование и ПЦР. Использование буфера с ионной силой выше 1X TAE или 0,5–1X TBE может перемещать образцы быстрее, но, вероятно, будет выделять большое количество тепла из-за высокой проводимости, что приведет к денатурации образца и повреждению геля. Таблица 7. Руководство по выбору буфера. Буфер Преимущества Недостатки Разрешение нуклеиновых кислот ДНК РНК TAE большой емкости Разделение буферов Малая емкость лучше для более коротких серий Хорошо для последующих ферментативных приложений Более склонны к перегреву > 1000 пар оснований > 1500 оснований TBE (лучше для более коротких фрагментов) dsDNA мигрирует ~ 10% медленнее в TBE) Высокая ионная сила и буферная способность; подходит для длительных пробегов Менее подвержен перегреву Подавляет ферменты, что делает его непригодным для последующих ферментативных стадий (например,g., клонирование) <5000 п.н. <1500 оснований Гели должны быть полностью погружены в буфер, чтобы обеспечить поток ионов и предотвратить высыхание геля ( Рисунок 12A ). Однако при использовании горизонтального геля, такого как гель агарозы, глубина буфера над гелем не должна превышать 3-5 мм. Избыток буфера над гелем (> 5 мм) может привести к снижению подвижности нуклеиновой кислоты, увеличению искажения полосы и перегреву. Рисунок 12.Влияние рабочего буфера на электрофорез. (A) Верхняя часть геля не была погружена во время электрофореза. (B) Гель прогоняли в буфере с более низкими концентрациями соли, чем рекомендовано, что отличалось от буфера, используемого при приготовлении геля. Обратите внимание, что рабочий буфер денатурирующих агарозных гелей не может быть ни TAE, ни TBE, поскольку эти гели могут быть приготовлены в другом буфере, таком как фосфат натрия и MOPS (подробнее: подготовка денатурирующего геля).Важно выбрать рабочий буфер, совместимый с используемым гелем (, рис. 12В, ). б. Напряжение Чтобы запустить гель, к гелю прикладывают электрический потенциал с постоянным напряжением, током или мощностью (подробнее: их влияние на электрофоретические процессы). При электрофорезе нуклеиновых кислот обычно используется постоянное напряжение, при этом напряжение обычно устанавливается на уровне 5–10 В / см. Подаваемое напряжение (В) = расстояние между электродами (см) x рекомендованное В / см Напряжение можно регулировать в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК, а также типа рабочего буфера б / у ( Таблица 8 ).Рекомендуемые напряжения обычно предоставляются коммерчески доступными лестницами нуклеиновых кислот для оптимального разделения фрагментов в каждом продукте. Обратите внимание, что очень низкое напряжение замедляет миграцию нуклеиновых кислот, что может привести к диффузии малых молекул и низкому разрешению ( Рисунок 13A ). С другой стороны, когда напряжение слишком высокое, может произойти плохое разделение и смазывание образцов; в некоторых случаях может произойти перегрев буфера, «полосы улыбки» и даже денатурация образцов (, фиг. 13B, ). Рис. 13. Влияние напряжения на электрофорез ДНК. (A) Низкое напряжение приводит к плохому разрешению полосы и плохой диффузии. (B) Высокое напряжение может вызвать «улыбку». Таблица 8. Условия запуска в зависимости от размера фрагмента [2]. –10 В / см Размер ДНК Напряжение Оптимальный рабочий буфер <1 kb 5–10 В / см TBE TAE или TBE > 5 кб 1–3 В / см TAE до 10 кб до 23 В / см TAE В некоторых случаях датчик температуры может быть подключен к гелевому устройству, чтобы помочь контролировать охлаждение и нагрев буфера.Для циклов электрофоретики> 2 ч охлаждение и рециркуляция буфера могут улучшить разделение образцов. Для денатурирующих гелей нагревание буфера до 55 ° C может улучшить результаты за счет усиления однонитевых форм нуклеиновых кислот. c. Время выполнения Длина геля, используемое напряжение и размеры молекул в образце определяют время, необходимое для электрофореза. Обычно электрофорез проводят до тех пор, пока интересующая полоса не переместится на 40–60% длины геля.Через определенные интервалы времени во время прогона геля можно наблюдать относительные положения загружающих красителей, пока краситель бромфеноловый синий не переместится приблизительно на 60% длины геля и / или оранжевый краситель G не переместится на 80% длины геля. Самое главное, следует контролировать время анализа, чтобы гарантировать, что мельчайшие молекулы в образцах или стандартах не мигрируют из геля. Обратите внимание, что время работы меньше необходимого не будет достаточным для полного устранения полос (, рис. 14, ).Лестницы ДНК, содержащие отслеживающие красители, которые идут позади и впереди образцов, доступны для помощи в отслеживании движения геля, а также для обеспечения того, чтобы представляющие интерес полосы не были замаскированы красителями. Рис. 14. Влияние продолжительности анализа на разделение проб. 4. Визуализация образцов в геле. После завершения прогона геля образцы необходимо визуализировать. Поскольку нуклеиновые кислоты не видны при обычном окружающем освещении, для визуализации требуется метод обнаружения.Как описано в Табл. 9 , доступные методы предлагают различные диапазоны чувствительности и преимущества при обнаружении образцов [6]. Таблица 9. Распространенные гели окрашивания нуклеиновой кислоты и методы обнаружения. Пятно Преимущества и рекомендации Чувствительность для обнаружения (приблизительные количества дцДНК) Колориметрический Метиленовый синий Кристаллический нет. оборудование Требуется этап обесцвечивания Низкая чувствительность 0.5–1 мкг Флуоресцентный Требуется возбуждение УФ и / или синим светом Часто мутагенный Может потребоваться специальная утилизация отходов Предлагает более короткие рабочие процессы с высокой чувствительностью Можно использовать для окрашивания образцов во время или после электрофореза 25 мкг – 1 нг Радиоактивный Требуется обучение и меры предосторожности для обеспечения радиоактивной безопасности Обнаруживает или маркирует образцы радиоактивными зондами или нуклеотидами обнаружение олигонуклеотидов Считается наиболее чувствительным 10 фг – 1 нг а.Флуоресцентные пятна Среди доступных красителей для обнаружения образцов наиболее широко используются флуоресцентные красители (, рис. 15, ) благодаря простоте использования и высокой чувствительности. При возбуждении соответствующей длиной волны красители излучают видимый свет (т. Е. Флуоресцируют) (подробнее: основы флуоресценции). Интенсивность флуоресценции коррелирует с количеством связанной нуклеиновой кислоты, что является основой для обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот при электрофорезе. Бромид этидия (EtBr) — флуоресцентный краситель, обычно используемый в электрофорезе нуклеиновых кислот из-за его короткого времени окрашивания (~ 30 мин) и высокой чувствительности (обнаруживает ~ 1 нг двухцепочечной ДНК на полосу).Тем не менее, альтернативный краситель может быть рассмотрен по следующим причинам: Рис. 15. Различные типы красителей, связывающих нуклеиновые кислоты. Мутагенность и утилизация: Бромид этидия обладает сильным мутагенным действием, поэтому флуоресцентные красители, которые менее опасны и не требуют специальной утилизации, обеспечивают более безопасный рабочий процесс при электрофорезе нуклеиновых кислот ( Рисунок 16 ). Чувствительность: Флуоресцентные красители, чувствительность которых выше, чем EtBr, лучше подходят для обнаружения небольших количеств образцов ( Рисунок 16 ).Одноцепочечные нуклеиновые кислоты часто требуют большего количества образцов и / или интеркалирующего красителя для визуализации, потому что стэкинг оснований меньше. Следовательно, красители, которые предпочтительно связываются с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, являются хорошей альтернативой для обнаружения образцов при электрофорезе РНК. УФ-повреждение: Флуоресцентные красители, которые можно возбуждать синим светом с меньшей энергией вместо УФ-света, вызывают меньшее структурное повреждение нуклеиновых кислот, но обнаруживают с равной или более высокой чувствительностью ( Рисунок 17A ).Таким образом, возбуждение синим светом при электрофорезе может улучшить успех последующих приложений, таких как клонирование и секвенирование (, фиг. 17B, ). Рис. 16. Альтернативы бромистого этидия с улучшенными характеристиками. Щелкните изображение, чтобы увеличить Рис. 17. (A) Спектры возбуждения и испускания обычных красителей нуклеиновых кислот. Пятна возбуждаются наиболее эффективно на определенной длине волны, называемой максимумом возбуждения.Пятна SYBR Safe и SYBR Gold максимально возбуждаются синим светом и в меньшей степени УФ-светом. (B) Эффективность клонирования после указанного времени экспонирования с использованием синего света (для безопасного окрашивания SYBR) или ультрафиолетового света (для бромистого этидия) для визуализации вставки для клонирования во время электрофореза. Эффективность клонирования очищенного в геле фрагмента lacZ измеряли по количеству синих колоний, образованных на планшетах X-Gal, что указывает на встраивание функционального (немутантного) гена в вектор. б. УФ-затенение Вместо окрашивания красителем нуклеиновые кислоты можно косвенно визуализировать с помощью метода, называемого UV shadowing , с использованием поглощения УФ-излучения нуклеиновыми кислотами [8]. Он обычно используется для разделения и очистки олигонуклеотидов и РНК с помощью электрофореза, когда достаточно простого обнаружения и / или использование интеркалирующих красителей может повлиять на последующие применения. Для обнаружения УФ-затенением необходимы образцы от нанограмм до микрограммов, и следует использовать тонкий и прозрачный гель, такой как полиакриламид, для обеспечения поглощения и пропускания УФ-излучения.В протоколе УФ-затенения гель удаляют из кассеты после электрофореза для максимального обнаружения, завертывают в прозрачную пластиковую пленку для защиты и затем помещают на пластину для УФ-флуоресцентной тонкослойной хроматографии (ТСХ). Когда гель подвергается воздействию УФ-излучения, поглощение полосами нуклеиновой кислоты отбрасывает тени на пластину для ТСХ (, рис. 18, ). Затененные участки геля желаемых размеров вырезаются для дальнейшей обработки. Рис. 18. УФ-затенение для визуализации отдельных фрагментов. 5. Документирующие гели а. Флуоресцентная визуализация После визуализации гели нуклеиновых кислот обычно документируются для записи и анализа результатов электрофореза. Если образцы окрашиваются флуоресцентным красителем, требуется специальное оборудование для возбуждения красителя подходящим источником света для визуализации и захвата изображения геля. Источник возбуждающего света может находиться над гелем, называемым эпи-осветителем (аналогично ручной УФ-лампе), или под гелем, называемым трансиллюминатором (, фиг. 19, ).Поскольку источник света находится дальше в настройке эпи-осветителя, образцы подвергаются меньшему воздействию энергии. Это может уменьшить УФ-повреждение нуклеиновых кислот, но также может снизить сигнал полос геля. С другой стороны, трансиллюминатор обеспечивает более высокий сигнал для полос, но может увеличить УФ-повреждение из-за близости излучения к гелю. Рисунок 19. Эпи-освещение и просвечивание. б. Авторадиография Для электрофореза радиоактивно меченных нуклеиновых кислот гель подвергается воздействию рентгеновской пленки после электрофореза для документирования, процесс, называемый авторадиографией .Интенсивность радиоактивно меченых полос может быть измерена денситометрией для количественного определения. Top В заключение, рабочие процессы электрофореза нуклеиновых кислот включают ряд этапов и реагентов для разделения и анализа образцов. Выбор правильных инструментов для ваших образцов, а также признание преимуществ и недостатков рабочего процесса может значительно улучшить результаты электрофореза в приложениях молекулярной биологии. использованная литература Stellwagen NC (1998) ДНК-гель-электрофорез.В: Tietz D (редактор), Nucleic Acid Electrophoresis (Springer Lab Manual) . Гейдельберг: Springer. С. 1–53. Грин М.Р., Сэмбрук Дж. (2012) Анализ ДНК. В: Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (4-е изд.). Колд-Спринг-Харбор: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. С. 81–156. Yilmaz M, Ozic C, Gok I (2012) Принципы разделения нуклеиновых кислот электрофорезом в агарозном геле. В: Магдельдин С (редактор), Гель-электрофорез: принципы и основы .Риека: InTech. С. 33–40. Ли С.В., Бахаман А.Р. (2012) Дискриминационная сила электрофореза в агарозном геле при анализе фрагментов ДНК. В: Магдельдин С (редактор), Гель-электрофорез: принципы и основы . Риека: InTech. С. 41–56. Barril P, Nates Silivia (2012) Введение в матрицы для электрофореза в агарозе и полиакриламидном геле с точки зрения их чувствительности к обнаружению. В: Магдельдин С (редактор), Гель-электрофорез: принципы и основы .Риека: InTech. С. 3–14. Thermo Fisher Scientific Inc (2010) Обнаружение и анализ нуклеиновых кислот. В: Справочник по молекулярным зондам: Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки . pp 349–360. Brody JR, Kern SE (2004) История и принципы проводящих сред для стандартного электрофореза ДНК. Анальная биохимия 333 (1): 1–13. Hassur SM, Whitlock HW Jr (1974) УФ-затенение — новый и удобный метод определения местоположения частиц, поглощающих ультрафиолет, в полиакриламидных гелях. Anal Biochem 59 (1): 162–164. Top Деятельность 2 — Гель-электрофорез красителей Введение Этот эксперимент научит студентов, как приготовить и загрузить гель для электрофореза. Затем они пропустят гели в системе электрофореза, чтобы разделить несколько красителей, которые имеют разный размер молекул и несут разные заряды. Этот метод лежит в основе многих процедур, используемых в биотехнологии. Цели Узнайте, как гель-электрофорез разделяет молекулы. Узнайте, как использовать микропипетку для загрузки геля. Изучите меры безопасности при работе с электрическим током. Определите компоненты неизвестной смеси красителей. Материалы Образцы следующих красителей: 0,25% бромфенолового синего 0,25% Янус зеленый 1,00% Оранжевый G 0,25% Сафранин О 0,25% ксилолцианола 0.25% Неизвестная смесь Штатив для микропробирок Коробка с гелем для электрофореза и блок питания 1 лоток для геля с гребнем на 6-8 зубцов Стакан 250 мл или градуированный цилиндр Микропипетка 20 мкл с наконечниками Перчатки Бумага для покрытия лабораторного стола Водяная баня 60 ° C или микроволновая печь 0,7% раствор агарозы (достаточно 35 мл на гель) Контейнер с буфером TBE (1X) Мешок полиэтиленовый для утилизации отходов Дистиллированная вода Предварительная подготовка Сделайте 0.7% раствор агарозного геля: Чтобы приготовить 100 мл геля, которого хватит на 3 геля, отвесьте 0,7 г агарозы и поместите в стеклянный стакан или колбу на 200–250 мл. Добавьте 100 мл буфера 1X TBE (трис-борат-EDTA). Нагрейте в микроволновой печи по 30 секунд, каждый раз осторожно встряхивая, пока агароза полностью не растает. В качестве альтернативы раствор можно нагреть на горячей плите, время от времени осторожно встряхивая, пока агароза не растает. Согрейтесь, если класс будет использовать его в течение получаса.В противном случае дайте раствору остыть и затвердеть. Накройте крышкой и храните в холодильнике. Дневной класс: Снимите крышку с емкости с 0,7% агарозой. Погрузите бутылку в баню с дистиллированной горячей водой, чтобы жидкость расплавилась. Как вариант, растопите агарозу в микроволновой печи, а затем согрейте на горячей водяной бане. Сделайте этот шаг заранее и держите агарозу в тепле до тех пор, пока ученики не потребуют ее. Студентам нужно будет обращаться с бутылками, поэтому имейте в наличии прихватки. После лаборатории буферный раствор ТВЕ можно вылить обратно в контейнер и повторно использовать в лаборатории рестрикционного дайджеста. Информация для учителя Использование микропипетки Микропипетка — это очень тонкий и дорогой инструмент, который используется для очень точного и очень небольшого дозирования. Важно знать пределы объема микропипетки, которую вы используете, и никогда не набирать ни ниже, ни выше этих пределов.Настройки громкости микропипетки обычно считываются сверху вниз на циферблатах. Часто числа перед десятичной точкой будут другого цвета, чем числа, идущие после нее. Например, на микропипетке на 200 мкл объем, установленный на уровне 63,5 мкл, может иметь цифры 6 и 3 черными буквами, а 5 — красными буквами. Микропипетка предназначена для использования в одной руке. Установите микропипетку на желаемый объем, повернув ручку регулировки объема. Используя одноразовый наконечник, размер которого соответствует микропипетке, плотно вдавите стержень микропипетки в втулку наконечника до тех пор, пока не будет обеспечено прочное уплотнение. Для всасывания (втягивания) жидкости сначала нажмите на поршень до первого упора, поместите вертикально в жидкость на глубину примерно 2-3 мм и медленно отпустите поршень, пока он не вернется в верхнее положение. Теперь вы можете переместить микропипетку из жидкости в лунку с агарозным гелем или другой сосуд. Приложите наконечник к стенке лунки или другой поверхности и начните медленно нажимать на поршень, но на этот раз вы должны переместить поршень до второго упора, чтобы удалить всю жидкость. Удерживая поршень в нажатом положении, вытащите его из колодца или другого сосуда, а затем позвольте поршню вернуться в его нормальное положение. Если плунжер отпустить, пока он все еще находится в лунке, он будет откачивать жидкость, которую вы только что отложили туда! Выбросьте наконечник в соответствующий контейнер для отходов, нажав кнопку выталкивателя, которая находится в верхней части микропипетки. Всегда используйте свежий наконечник для каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения образцов. Буферный раствор: Трис / борат / EDTA (TBE) буфер обычно используется в системах электрофореза. Этот солевой раствор проводит электрический ток и регулирует pH раствора во время разделения фрагментов ДНК или, в данном случае, молекул красителя. При необходимости разбавьте основной раствор дистиллированной водой, чтобы получить раствор 1X. Дистиллированная вода: Минералы в обычной водопроводной воде быстро испачкают оборудование. Промойте и просушите на воздухе лотки для геля и коробки с гелем в дистиллированной воде.Будьте осторожны, чтобы не сорвать проводку в основании коробки с гелем во время этого процесса. Удаление геля: По завершении лабораторной работы соберите все гели в пластиковые пакеты и выбросьте их в мусор. Использование источников питания Источник питания вырабатывает напряжение, достаточно высокое, чтобы вызвать серьезное поражение электрическим током при неправильном обращении. НЕ подключайте блок питания к розетке до тех пор, пока защитная крышка не будет установлена ​​на ячейке и все остальные электрические соединения не будут выполнены должным образом. В данном устройстве используется 3-проводная вилка с заземлением. По соображениям безопасности его НЕ следует использовать с 2-проводной розеткой с переходной вилкой. Не работайте во влажной или влажной среде; любая конденсированная влага может вызвать короткое замыкание электрических компонентов. Убедитесь, что все электрическое оборудование сухое. Осмотрите все шнуры питания, патч-шнуры, банановые разъемы и вилки на предмет каких-либо дефектов, таких как потрескавшаяся и высохшая изоляция, а также ослабленные или шаткие банановые разъемы или вилки. Не вступайте в личный контакт и не допускайте контакта металла или любого проводящего материала с буферным резервуаром или электрофоретической ячейкой при включенном питании. Блок питания может продолжать вырабатывать некоторое напряжение, даже если питание было выключено. Чтобы исключить любой риск, связанный с этим событием, выполните все необходимые шаги, указанные в процедуре. При отсоединении коробки с гелем убедитесь, что провода не касаются друг друга, не соприкасаются с буферным раствором или иным образом не создают опасные электрические условия. Примечания Агароза — это вещество, полученное из морских водорослей, которое при растворении в жидкости образует желеобразную матрицу.Во время электрофореза через агарозу создается электрический ток, и молекулярные фрагменты могут перемещаться через агарозу между двумя электродами. Размер пор в геле и размер фрагмента, пытающегося переместиться, будут определять скорость, с которой прогрессирует каждый фрагмент. Направление, в котором движется осколок, определяется зарядом, который он несет. При использовании этого протокола гранулированные красители должны быть приготовлены в следующих концентрациях: Для всех, кроме Orange G, используйте 25 мг красителя, добавьте 10 мл 60% раствора глицерина или 4 г сахара и доведите до 10 мл дистиллированной водой. Для Orange G используйте 100 мг красителя и сделайте макияж, как указано выше. Orange G имеет размер всего 50 п.н. и легко снимается с конца геля. Он намного опережает бромфеноловый синий, краситель, который легче всего увидеть. Для жидких красителей при необходимости разбавить 60% раствором глицерина до необходимого разведения. Деятельность студентов — Гель-электрофорез красителей В этом эксперименте вы будете использовать электрофорез для разделения образцов красителей, которые имеют разный размер и заряд. Меры предосторожности УЧАЩИЕСЯ: Посоветуйтесь со своим учителем, чтобы убедиться, что вы понимаете все инструкции по технике безопасности при использовании этого оборудования. Цели Узнайте, как гель-электрофорез разделяет молекулы. Узнайте, как использовать микропипетку для загрузки геля. Изучите меры безопасности при работе с электрическим током. Определите компоненты неизвестной смеси красителей. Процедура Наденьте перчатки. Возможно, вы делитесь образцами красителя и агарозным гелем с другой лабораторной группой. Закройте каждый конец лотка с гелем лабораторной лентой. Поместите пластиковую расческу в середину лотка. Сойдите в баню с горячей водой и возьмите бутылку растопленной агарозы. Осторожно вылейте агарозу в лоток для геля, пока она не окажется примерно на 1/3 высоты зубцов расчески.Для этого нужно использовать около 30 мл раствора агарозы. Убедитесь, что в геле нет пузырьков. Дайте гелю застыть, не нарушая его, в течение примерно 10 минут. Осторожно снимите гребешок с геля, потянув прямо из затвердевшего геля. Снимите ленту с концов лотка для геля. Поместите гель в прибор для электрофореза. Добавьте 150 мл буфера 1x TBE, чтобы полностью заполнить коробку и покрыть верхнюю поверхность геля примерно 2 мм буфера. Примечание: на этом этапе коробку с гелем можно накрыть и при необходимости оставить до следующего дня. На гель загружают по 5-10 мкл каждого красителя в лунку. Следите за тем, какой краситель в какой колодец попадает, на листе записной книжки. Используйте новый наконечник для каждого красителя и будьте осторожны, чтобы не проколоть дно лунки. Используемые красители: Бромфеноловый синий Янус зеленый Оранжевый G Сафранин О Ксилол цианол Смеси любых из вышеперечисленных красителей, предоставленные учителем. Тщательно очистите весь пролитый буфер или любую другую жидкость, окружающую коробку с гелем. Перед продолжением убедитесь, что источник питания отключен от сети и выключен. Осторожно закройте крышку гелевого контейнера и правильно подсоедините клеммы. Подключите блок питания, выберите опцию 100 В и включите машину. Индикатор работы загорится, показывая, что в ячейку подается питание. Обратите внимание на крошечные пузырьки, которые образуются вдоль платиновых электродов. Дайте гелю растечься в спокойном состоянии в течение примерно 30 минут, но часто проверяйте, чтобы убедиться, что красители не стекают с конца геля в буферный отсек. Когда краситель достигнет примерно 1 см от конца геля, выключите источник питания. Затем отключите патч-корды от источника питания и отключите устройство. Убедитесь, что ваши перчатки надеты. Гель будет извлечен из коробки, чтобы вы могли записать свои наблюдения в лист активности. Заполните рабочий лист. Убрать Выбросьте все наконечники для пипеток и гели в пластиковые пакеты, которые затем можно выбросить в обычный мусор.Контейнер с гелем, лоток и гребень следует промыть дистиллированной водой, как указано выше, а затем дать высохнуть на воздухе. Будьте очень осторожны, чтобы не повредить крошечные электродные провода на каждом конце коробки с гелем. Тщательно вымойте руки и очистите место, где вы работали. Студенческая деятельность Почему гребенка помещена в центре в этом эксперименте электрофореза? На схеме ниже представлен ваш гель. Цветными карандашами или фломастерами нарисуйте результаты отделения краски.Обязательно пометьте каждую дорожку названием красителя, который был в лунке. Какой краситель, вероятно, содержит самую маленькую молекулу? Откуда мы это знаем? Перечислите красители с отрицательным зарядом. Объясните, почему вы выбрали эти красители. Если бы вы заливали гель для протекания ДНК, где бы вы поместили гребень? Поясните свой ответ. Ответы на задания Гребень находится в центре геля, поскольку используемые красители имеют положительный или отрицательный заряд и поэтому могут перемещаться в разных направлениях. Самая маленькая молекула — оранжевая G. Она проходит наибольшее расстояние в геле. Красители с отрицательным зарядом — это бромфеноловый синий, оранжевый G и ксилолцианол. Мы знаем это, потому что они движутся к положительному электроду. Гребень будет помещен рядом с концом геля, поскольку ДНК имеет отрицательный заряд и будет перемещаться только к положительному электроду. По материалам: http://ceprap.ucdavis.edu/Equipment/Protocols/gel_electrophoresis_of_dyes_03.pdf Общую информацию можно найти по адресу: http://ceprap.ucdavis.edu/acrobat/electrophoresis.pdf Чтобы создать собственную камеру для электрофореза, см .: http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/WWC/1993/moving.html Буфер для электрофореза в агарозном геле Буфер является важным ингредиентом любой биологической реакции. «Биологический буферный раствор — это комбинация слабой кислоты и конъюгированного основания или наоборот, которая помогает поддерживать постоянный pH раствора». Трис-борат EDTA и Трис-ацетат EDTA — два наиболее распространенных типа буферных растворов, используемых в электрофорезе ДНК в агарозном геле. Чтобы понять роль буфера для электрофореза, мы должны понимать важность электрофореза и каждого компонента, используемого в электрофорезе. Электрофорез разделяет молекулы ДНК / РНК или белков на основе молекулярной массы и чистого заряда молекулы. Это поможет идентифицировать и охарактеризовать молекулы. Буфер для электрофореза, агароза, EtBr и краситель для загрузки геля ДНК являются важным компонентом электрофореза в агарозном геле. Мы написали статью о EtBr и красителе для загрузки геля ДНК отдельно. Прочтите здесь, В этой статье мы обсудим буфер для гель-электрофореза, важность буфера для гель-электрофореза, роль буфера TAE и TBE в электрофорезе в агарозном геле, приготовление буфера 10X TAE / TBE и мое окончательное руководство по использованию буфер для электрофореза в агарозном геле. Значение буфера для гель-электрофореза Две важные функции, выполняемые буфером для гель-электрофореза, Он поддерживает pH реакции почти нейтральным. Слабая кислота и основание в буфере поддерживают pH в желаемом диапазоне. Поддерживая нейтральный pH, он контролирует общий заряд молекул, что помогает в правильной миграции и разделении молекулы. Кроме того, буфер для гель-электрофореза ДНК предотвращает атаку ДНКазой.Он также предотвращает гидролиз молекул ДНК, обеспечивая постоянную жидкую среду. Даже жидкая среда контролирует изменения температуры во время электрофореза. Более высокое напряжение увеличивает температуру геля агарозы, который может денатурировать ДНК. Это небольшое повышение температуры поддерживается жидкой средой буфера. Изображение представляет собой загрузку образца ДНК в гель. Изображение предоставлено: za.fotolia.com Буфер также равномерно распределяет заряд во время электрофореза. Роль буфера TBE / TAE в электрофорезе в агарозном геле Трис — сильное основание, а борат — кислота, комбинация обоих поддерживает почти нейтральный диапазон pH от 8 до 8,5. В щелочных условиях ДНК защищена и может правильно разделяться. EDTA играет важную роль в этой комбинации. ЭДТА — хелатирующий агент. Он хелатирует ион Mg2 +, который необходим для фермента ДНКазы в качестве кофактора. ДНКаза — это фермент, который расщепляет ДНК на мелкие фрагменты. Таким образом, добавление ЭДТА защищает нашу ДНК от ферментативной активности. Далее буфер нейтрализует заряд молекулы воды. Под действием электрического тока молекула воды распадается на H + и OH-. Ионы H + могут реагировать с PO3- ДНК. Таким образом, отрицательный заряд буфера нейтрализует заряд воды и защищает ДНК. Прочтите интересную статью: Краткое введение в цитогенетику [кариотипирование, FISH и микрочипы] Короткие тандемные повторы (STR): секрет каждого теста ДНК Хотя буфер TAE и буфер TBE работают одинаково в У электрофореза есть свои преимущества и недостатки. Буфер TAE может мешать ферментативной реакции и защищать ДНК, в отличие от буфера TBE. TAE имеет меньшую емкость буферизации, в то время как TBE имеет более высокую емкость буферизации по сравнению с буфером TAE. Однако борат может реагировать с сахарным остовом ДНК, поэтому это не всегда рекомендуется. Кроме того, если глицерин является компонентом красителя для загрузки геля ДНК, то TBE может стать серьезным препятствием. Борат вступает в реакцию с глицерином и снижает активность красителя для загрузки ДНК. Следовательно, если глицерин является основным компонентом красителя для загрузки геля ДНК, буфер TAE — лучший выбор для получения хорошего результата. Некоторые из интересных статей: Некоторые из важных свойств буфера TAE и TBE перечислены ниже: Буфер TAE: Он имеет меньшую емкость буферизации, поэтому его можно исчерпать при повторном использовании. Проводимость буфера TAE лучше, поэтому дцДНК может мигрировать быстрее по сравнению с буфером TBE. ДНК можно легко восстановить в буфере TAE, поэтому скорость восстановления буфера TAE выше. Это экономически выгодно и дешевле, чем другие буферные системы, кроме того, требования к рабочему раствору ниже по сравнению с буфером TBE (требуется только буфер 0,5X). Буфер TBE: TBE имеет более высокую емкость буферизации из-за бората. Из-за более низкой проводимости миграция дцДНК ниже по сравнению с буфером ТАЕ. Разрешение очень хорошее для более длинных фрагментов ДНК. Борат ингибирует многие ферменты ДНК, следовательно, целостность ДНК выше в буфере TBE. Буфер TBE немного дороже, а требования к рабочему раствору выше по сравнению с буфером TAE (требуется буфер 1X). Борат из буфера TBE может взаимодействовать с ДНК, поэтому скорость восстановления ниже по сравнению с буфером TAE. Безусловно, буфер TAE является наиболее подходящим и рекомендованным, чем буфер TBE. Приготовление буфера TAE / TBE Во время электрофореза требуется большой объем буфера.Обычно для 16-луночной установки для электрофореза в агарозном геле требуется буфер объемом от 1 до 1,2 литра. Поэтому всегда готовится большое количество буфера. Всегда готовьте 10-кратный запас буфера. Таким образом, мы можем сделать 10-кратный буфер во время каждого прогона. Мы рассмотрели статью о том, как приготовить праймер для ПЦР на основе наших исследовательских знаний, прочтите статью здесь: Руководство по созданию праймеров для ПЦР Приготовление буфера 10X TBE (для 250 мл) Tris- 900 мМ Борная кислота — 890 мМ ЭДТА — 2 мМ Добавьте дистиллированную воду, чтобы довести конечный объем до 250 мл. Добавьте ЭДТА в Трис и борную кислоту и перемешивайте до растворения ЭДТА в воде. Установите pH примерно от 8,0 до 8,5. Теперь у нас есть 250 мл буфера 10X TBE. Возьмите 10 мл буфера 10X TBE и добавьте 90 мл дистиллированной воды, что составляет 100 мл буфера 1X TBE. Аналогичным образом для приготовления 1000 мл буфера добавьте 100 мл 10X TBE буфера в 900 мл D / W. Приготовление буфера 10X TAE (для 250 мл) 400 мМ Трис 200 мМ уксусная кислота 10 мМ EDTA Добавить D / W, чтобы получить конечный объем 250 мл Приготовление 1X аналогично Буфер TBE. Мое полное руководство по использованию буфера для электрофореза: Свежеприготовленные реагенты являются ключом к достижению хорошего качества результата. Я всегда предпочитаю делать 250 мл 10-кратного буфера TAE. Этого хватит на весь день (если вы используете электрофорез 5-6 раз в день). Если вы приготовите маточный буферный раствор 10X TAE в течение 2–3 месяцев, буферная емкость снизится, так как соль диссоциирует через несколько дней. Добавление буфера 1X в резервуар с агарозным гелем. Изображение предоставлено: www.theextracellularmatrix.blogspot.com Следовательно, четкой полосы ДНК не будет наблюдаться. Если вы проводите критический или чувствительный эксперимент, используйте буфер один раз в каждом прогоне, в противном случае для стандартизации и подтверждающих исследований мы можем повторно использовать буфер. Если вы делали электрофорез столько раз, то понимаете, что после каждого цикла некоторое количество буфера обезвоживается и соль диссоциирует на обоих электродах. Прочтите статью: Рекомендации по созданию праймеров для ПЦР Это показывает, что буферная емкость рабочего буфера снижена, и он не используется для другого цикла электрофореза.Так что выбросьте этот буфер и приготовьте еще одну партию свежего буфера 1X. Всегда взвешивайте каждый химикат должным образом. Никогда не принимайте взвешивание как должное, потому что точное взвешивание делает вас лучшим исследователем. Используйте тот же буфер для заполнения резервуара и приготовления геля. Никогда не используйте два разных типа буфера для обоих (два разных типа буфера, что означает буфер из двух разных партий запаса). Это изменит качество результата. Прочтите статью: Роль MgCl2 в реакции ПЦР Раствор для электрофореза Agarose SFR, 100 г: Принадлежности для электрофореза в научной лаборатории: Amazon.com: Industrial & Scientific В настоящее время недоступен. Мы не знаем, когда и появится ли этот товар в наличии. Убедитесь, что это подходит введя номер вашей модели. Сверхвысокое разрешение: разрешение 238 bp и 242 bp диапазона Низкая температура плавления Стабильные и воспроизводимые результаты Без нуклеаз и протеаз Идеально подходит для AFLP, STR и тетрануклеотидных повторов. ]]> Характеристики Фирменное наименование Электронная микроскопия Количество позиций 1 Номер детали 10207 Размер EA Код UNSPSC 52150000 . Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт