Внебольничная пневмония мкб 10 код: Ошибка 404. Файл не найден

Содержание

Пневмония у взрослых (внебольничная пневмония) > Клинические протоколы МЗ РК

· Экстракорпоральная мембранная оксигенация:
Крайне тяжелые случаи острой ДН при тяжелой ВП могут потребовать проведения экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО) [УД – C]. ЭКМО должна проводиться в отделениях и центрах, имеющих опыт использования данной технологии.

Медикаментозное лечение

Антибактериальная терапия тяжелой ВП:
У госпитализированных пациентов с ВП используются амоксициллины, ингибиторзащищенные аминопенициллины, цефалоспорины III,V генерации, макролиды, респираторные фторхинолоны (левофлоксацин, моксифлоксацин) как в виде моно-, так и комбинированной терапии.

При более тяжелом течении пневмонии (у пациентов в ОАРИТ), а также при не эффективности вышеуказанных групп антимикробных препаратов, возможно назначение следующих групп антибиотиков: карбапенемы, оксазолидиноны.

Среди карбапенемов для лечения ВП применяется эртапенем. По активности в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов он сходен с имипенемом* и меропенемом, но не обладает значимой активностью в отношении P.aeruginosa и Acinetobacter spp., что является важным преимуществом при ВП.
Эртапенем не активен в отношении «атипичных» возбудителей (M.pneumoniae, C.pneumoniae, Legionellaspp.).

Оксазолидинон с доказанной антипневмококковой активностью — линезолид. Преимущества препарата: высокая активность в отношении полирезистентных грамположительных микроорганизмов, включая ПРП, метициллинорезистентный S.aureus.

Амоксициллин/клавуланат (амоксициллин/сульбактам), макролиды, фторхинолоны могут использоваться в виде ступенчатой терапии ВП у госпитализированных пациентов.

Системную антибактериальную терапию тяжелой ВП целесообразно начинать в как можно более короткие сроки с момента постановки диагноза; задержка с введением первой дозы АМП на 4 ч и более (при развитии септического шока на 1 ч и более) ухудшает прогноз [УД – С].

Стартовая АБТ тяжелой ВП предполагает внутривенное введение АМП [УД – С]. В дальнейшем по мере клинической стабилизации возможен перевод пациента на пероральный прием АМП в рамках концепции ступенчатой терапии.

Выбор режима эмпирической АМТ ТВП зависит от наличия факторов риска инфицирования P.aeruginosa, предполагаемой/документированной аспирации, клинических и/или эпидемиологических данных, свидетельствующих об инфицировании вирусами гриппа.

У лиц без факторов риска инфицирования P.aeruginosa и аспирации препаратами выбора являются амоксициллин/клавуланат; цефалоспорины III поколения без антисинегнойной активности или эртапенем в комбинации с макролидом для внутривенного введения [УД – В]. Альтернативным режимом является комбинация моксифлоксацина или левофлоксацина с цефалоспорином III поколения без антисинегнойной активности или цефтаролин [УД – В].

При тяжелой ВП показано преимущество комбинации антистрептококкового цефалоспорина III поколения с макролидом, по сравнению с монотерапией этими антибиотиками [УД – В].

При наличии факторов риска инфицирования P.aeruginosa препаратами выбора являются β-лактамные АМП с антисинегнойной активностью (пиперациллин/тазобактам, цефепим, меропенем, имипенем*) в сочетании ципрофлоксацином или левофлоксацином в высокой дозе [УД – В]; возможно назначение β-лактама с антисинегнойной активностью в комбинации с аминогликозидами II-III поколения и макролидами, либо респираторными фторхинолонами [УД – В].

При документированной/предполагаемой аспирации препаратами выбора являются ингибиторозащищенные β-лактамы, карбапенемы, либо комбинация цефалоспорина III поколения без антисинегнойной активности с клиндамицином [УД – С].

При риске MRSA к любой терапии добавить линезолид или ванкомицин [УД – В].

У пациентов с клиническими и/или эпидемиологическими данными, предполагающими инфицирование вирусами гриппа, в дополнение к антибиотикам рекомендуется назначение оселтамивира или занамивира [УД – D].
*применение препарата после регистрации на территории РК

Таблица 10 — Рекомендации по эмпирической антимикробной терапии тяжелой ВП

Очаговая пневмония дифференциальная диагностика mp3 download (1.4 MB)

внебольничная пневмония диагностика лечение
бронхомунал при пневмонии ребенку
сколько лечится полисегментарная пневмония
при пневмонии сколько соэ
суточный диурез при пневмонии
врожденная пневмония код мкб
пневмония у двухмесячного ребенка
задачи по крупозной пневмонии
пневмония в 85 лет
после лечения пневмонии кашель
пневмония и сахарный диабет
сколько лечат от пневмонии
после пневмонии отходит мокрота
двусторонняя пневмония легких лечение
двухсторонняя пневмония легких это
меры профилактики послеоперационных пневмоний
пневмония при…

Пневмония — воспаление лёгочной ткани обычно инфекционного происхождения с преимущественным поражением альвеол (развитием в них воспалительной экссудации). Пневмонии, вызванные инфекциями, являются формой острой респираторной инфекции, затрагивающей лёгкие. Основными возбудителями пневмонии являются бактерии и вирусы, реже её вызывают микоплазмы, грибы и паразиты.

Анализируются особенности клиники очаговых образований легких. Приводится рентгенологическая классификация. Рассматриваются дифференциальная диагностика очаговых процессов в легких, периферический рак, очаговые формы туберкулеза, пневмонии, кисты.

Вы можете задать бесплатный вопрос врачу clck.ru/SgZVa
Очаговая пневмония – поражение органов дыхания. Смертность в 8 случаях из Симптомы: температура до 39, боль в груди. Антибактериальное лечение. Двусторонняя пневмония диагностируется обычно как осложнение после длительного наркоза или проведения искусственной вентиляции легких. У больного двусторонней бронхопневмонией симптомы интоксикации гораздо более выражены, грудина болит с обеих сторон. Лечение показано проводить в условиях стационара. Поэтому о фиброзе после ковидной пневмонии…

Дается понятие о диссеминированных процессах в легких, приводится рентгенологическая классификация очаговых образований легких. Рассматриваются дифференциальная диагностика диссеминированных процессов в легких, гиперсенситивный пневмонит, экзогенный токсический альвеолит, идиопатические интерстициальные пневмонии.

В структуре легочной патологии диссеминированные заболевания составляют около 20%. На сегодняшний день насчитывается более 200 заболеваний, которые сопровождаются единым лучевым рентгенологическим синдромом – синдромом диссеминации легочной ткани. Однако в реальной практике большинству пульмонологов приходится чаще всего приходится сталкиваться с пятью ДЗЛ: легочный метастатический рак, диссеминированный туберкулез, саркоидоз, идиопатические интерстициальные пневмонии и септическая бактериальная пневмония. Остальные случаи ДЗЛ встречаются…

Граждане РФ, переболевшие коронавирусом, могут получить QR-код. Важно, что сертификат о перенесенном ковиде не выдается тем лицам, кто не обращался в медучреждение с заболеванием, а лечился самостоятельно. Справка об антителах не является подтверждением перенесенного коронавируса и не выступает поводом для присвоения QR-код переболевшего.
QR-код переболевшего COVID-19 — это код, в котором заложена информация о том, что человек, действительно, болел коронавирусом с указанием даты этого события.

Действует данный код в течение полугода с даты выздоровления. По истечении 6-ти месяцев документ теряется свою силу и для свободного перемещения в местах ограничений потребуется либо сдать ПЦР-тест, либо пройти вакцинацию.

QR-код необходимо для оперативного получения информации, разрешающей человеку посещение мероприятий, заведений общественного питания, различных организаций в период действия ограничений в связи с коронавирусной инфекцией.

С 7 июля 2021 года сертификат переболевшего коронавирусом позволит человеку при возвращении из-за границы не сдавать ПЦР-тест — данные о наличии сертификата о перенесенном ковиде нужно отправить через сайт госуслуг после прибытия в РФ.

Проверить, является ли учетная запись подтвержденной. Проверить это можно в настройках учетной записи. У подтвержденной записи будет соответствующая формулировка. Если ее нет, то нужно пройти процедуру подтверждения.

Если с упомянутыми пунктами всё в порядке, то следует отправить сообщение через форму обратной связи на госуслугах, указав подробную информацию о проблеме. Если в ответе на обращение будет указана необходимость обратиться в медучреждение, значит, проблема на стороне Минздрава. Возможно, информация о болезни не была передана в электронную базу или была удалена из нее по ошибке. Если проблема на стороне сайта, то она решится в кратчайшие сроки. Чем точнее будет дана информация в обращении, тем быстрее проблема будет решена.

Общая цель состояла в том, чтобы оценить прогностическую ценность предыстории пациентов с сепсисом, используя их полный спектр других предшествующих диагнозов. Для этого типа анализа множественных заболеваний популяция пациентов должна быть большой, чтобы получить статистически значимое описание временного анамнеза диагнозов. Поэтому мы использовали регистр для всего населения, включающий 6,6 миллиона пациентов.

Точное определение группы пациентов с сепсисом является ключевым шагом для того, чтобы в конечном итоге получить значимую оценку риска смертности.В литературе было предложено несколько подходов для определения групп пациентов с сепсисом на основе данных в медицинских записях, закодированных в терминологии МКБ-9 и МКБ-10 ^7,8,9. Ангус и др. . предложил один метод, при котором пациенты с диагнозом «инфекция и органная дисфункция» классифицируются как пациенты с сепсисом ⁸. Это широко используемый метод, однако совсем недавно проведенное исследование показало, что определение связано с неоптимальным положительным прогнозным значением ¹⁰.Альтернативный подход, предложенный Ибрагимом и др. . имел значительно более высокую производительность ^7,10. Этот подход включает большинство пациентов с диагнозом A40 («стрептококковый сепсис») или A41 («другой сепсис»). В датской терминологии МКБ-10 сепсис охватывает девятнадцать диагнозов (дополнительная таблица 1), причем A41 («другой сепсис») является наиболее часто используемым (см. Дополнительные сведения в дополнительном тексте). В нашей более ранней работе по анализу самых сильных траекторий болезни с самым высоким относительным риском в будущем в датской популяции по широкому спектру заболеваний, A41 появлялся часто, фактически он был включен в 217 из 1171 повторяющихся траекторий, рассчитанных для 6.2 миллиона человек ⁵. Поэтому мы изначально выбрали диагноз A41 для определения нашей популяции с сепсисом. NPR содержал группу из около 120 000 пациентов с сепсисом, у которых уровень 30-дневной смертности составлял 25% (eFig. 1). При подсчете наших пациентов, использующих «реализацию Ибрагима», 119 727 пациентов с сепсисом были разделены между нашим методом и «реализацией Ибрагима», наше определение охватывало еще 112 пациентов, тогда как «реализация Ибрагима» охватывала еще 6839, и этот простой подход является поэтому очень похож на «реализацию Ибрагима».Следовательно, он будет иметь очень похожие свойства при анализе чувствительности. В этом типе работы наиболее важно убедиться, что все пациенты, классифицируемые как пациенты с сепсисом, действительно имеют сепсис, в то время как это не повлияет на результаты каким-либо существенным образом, если мы потенциально пропустим небольшое количество пациентов, у которых также был сепсис (в качестве контрольной население без сепсиса составляет более 6 миллионов человек).

Перед анализом риска, связанного с множественными диагнозами, мы исследовали, в какой степени отдельные диагнозы в предшествующей истории болезни пациентов с сепсисом значительно повлияли на 30-дневную смертность.Из 1051 диагноза три уровня по МКБ-10 (с минимальным количеством пациентов, необходимым для статистического анализа, см. Методы) 231 диагноз значительно изменил относительный риск смерти от сепсиса (RR _{, умерло от сепсиса,}). См. EFig. 2 и дополнительный текст для более подробной информации.

Анализ корреляций между множеством более ранних диагнозов, очевидно, может дать лучшее представление о состоянии здоровья пациента.Мы исследовали, как последовательности последовательных диагнозов (траектории болезни) изменили RR _{sepsis dead}, чтобы получить более полное понимание связи между предшествующей историей болезни и риском смерти от сепсиса. Траектории временного заболевания были построены путем поиска всех значимо связанных диагнозов в парах и путем выбора диагнозов с временным направлением (где одно заболевание возникало значительно чаще, чем другое). Затем эти временные пары болезней были объединены в траектории временных последовательных заболеваний.В случае четырех стадий заболевания, когда болезнь A предшествовала болезни B, B предшествовала C, а C предшествовала D, у нас были бы три временные пары болезней и траектория болезни, содержащая болезни A, B, C и D в этом порядке ( см. Методы).

В нашей популяции сепсиса, состоящей примерно из 120 000 пациентов, мы обнаружили 2 279 таких траекторий болезни, состоящих из четырех последовательных заболеваний, при которых минимум 20 пациентов следовали всей траектории. На всех этих траекториях сепсис появился исключительно как четвертый и последний диагноз, подразумевая, что существует множество путей заболевания к сепсису.Однако в пределах применяемых пороговых значений мы не обнаружили никаких траекторий, продолжающихся после сепсиса, что указывает на гораздо менее систематический характер сопутствующих заболеваний, возникающих после сепсиса.

Из 120 000 пациентов с сепсисом в нашей когорте 28 484 пациента следовали по крайней мере по одной из 2279 зависимых от времени траекторий болезни. Поскольку может быть некоторое несоответствие между временем клинического представления и датой постановки диагноза, следование траекториям в строгом хронологическом порядке может исключить пациентов с очень похожим течением заболевания.Ослабление критерия таким образом, чтобы определенные пары диагнозов могли появляться в разном порядке (пока сепсис был последним диагнозом) 40 247 пациентов с сепсисом следовали по крайней мере по одной из этих траекторий.

Мы подсчитали RR _{умерших от сепсиса} для пациентов, следующих хотя бы по одной траектории, по сравнению с пациентами с сепсисом, не следовавшими какой-либо траектории, чтобы исследовать прогностическую ценность траекторий смертности у этих пациентов .RR _{умерших при сепсисе} было рассчитано с использованием метода Кокрана-Мантеля-Хензеля, который позволяет нам скорректировать возраст и пол. RR _{, погибших при сепсисе,} для 28 484 пациентов, следовавших хотя бы по одной траектории строго в правильном порядке, составило 1,32 (p = 1,88 · 10 ⁻⁷⁷). RR _{погибших при сепсисе} составило 1,30 (p = 2,46 · 10 ⁻⁸²) для 40 247 пациентов, следующих диагнозами траектории в расслабленном порядке, что указывает на способность траекторий заболевания прогнозировать ухудшение состояния здоровья пациента с сепсисом.Возраст пациентов, следующих по траектории, был значительно выше как для строгого, так и для расслабленного порядка (отношение шансов = 2,3 и 2,4 соответственно, p-значение <2,3 · 10 ^-308 для обоих, поправка на возраст при анализе смертности). Впоследствии мы создали сеть, основанную на всех траекториях, которая значительно изменила риск смерти (Бенджамини Хохберг скорректировал значение p <0,05), уменьшив количество траекторий с 2279 до 56 (рис. 1). Сеть состоит из 97 уникальных пар болезней (и соединяющих их ребер), которые появляются на любом из шагов 56 траекторий.Все индивидуальные траектории увеличили RR _{сепсис погибло}, что явно подчеркивает способность траекторий предсказывать худший исход. Из 56 значимых траекторий 25 начинались со злоупотребления алкоголем, девять — с сахарным диабетом, а восемнадцать — с сердечно-сосудистыми диагнозами.

Сеть была построена из 56 значимых траекторий сепсиса и одновременно иллюстрирует количество пациентов, которым был поставлен конкретный диагноз (размер узла), и повышенный риск смерти от сепсиса в течение 30 дней на разных этапах траектории, соединяющих два диагноза (ширина стрелки).42 узла окрашены в соответствии с их отношениями к главам МКБ-10. Обратите внимание, что A41 был увеличен до 33% от его фактического размера, что соответствует 120 000 пациентов. Ширина стрелок указывает на средневзвешенное значение _{случаев заражения сепсисом} RR для конкретного шага (на основе всех траекторий, содержащих этот шаг).

На рисунке 1 показаны все 56 значительных траекторий к сепсису в одной сети.Он имеет три основных отправных точки, упомянутых выше: «злоупотребление алкоголем», «инсулинозависимый сахарный диабет» (NIDDM) и сердечно-сосудистые диагнозы («стенокардия», «острый инфаркт миокарда» и «гипертония»). Часто появляется ряд других диагнозов, включая «другие анемии». В сети не появилось ни одного диагноза рака, хотя RR _{умерших от сепсиса} для пациентов, имевших какие-либо новообразования (доброкачественные или злокачественные) до постановки диагноза сепсиса, составлял 1,24 (p = 1,2⋅10 ⁻⁶⁰) при подсчете для 120000 пациентов и 1 .18 (p = 4,97⋅10 ⁻³⁰) для пациентов, имевших какой-либо рак до сепсиса (eTable 1). Пациенты могут быть здоровыми до тех пор, пока не будет диагностирован рак ¹¹, который затем может спровоцировать сепсис. Следовательно, их общая история болезни может быть менее похожей по сравнению с пациентами с диабетом, что может объяснить отсутствие точных траекторий рака четырех заболеваний. Однако мы обнаружили семнадцать траекторий рака из 310 траекторий, состоящих только из трех заболеваний с сепсисом в качестве последнего диагноза.Сеть раковых заболеваний этих траекторий также показала, что анемия была главной связью между раком и сепсисом (рис. 2). Это также указывает на то, что отсутствие четырех траекторий рака было связано с отсутствием общей истории болезни, а не с незначительным влиянием на смертность от сепсиса.

Сеть была создана из шестнадцати трех сепсис-траекторий, каждая из которых содержит как минимум одно заболевание из блока МКБ-10 «Рак (C00-C96)» из главы 2 МКБ-10: Новообразования.Узлы окрашены в соответствии с их главой в МКБ-10. Их размер соответствует количеству больных сепсисом, которым поставлен конкретный диагноз. Ширина стрелок указывает на RR _{, мертвый} сепсиса для определенного шага в траектории.

Мы исследовали «злоупотребление алкоголем», «сахарный диабет» и анемию более подробно, извлекая траектории, содержащие эти конкретные диагнозы (рис. 3). Из-за ограниченного количества траекторий, представленных на рисунках 3, мы показали точную траекторию для всей группы пациентов, имея один (изогнутый) край, соединяющий все четыре заболевания.Мы наблюдали несколько альтернативных путей от диабета до сепсиса через пролежни, пневмонию, анемию и истощение объема (рис. 3а). Все траектории в диабетической сети начинались с NIDDM, за которым следовали две дополнительные сопутствующие патологии до сепсиса. Самый высокий риск был связан с «другими полинейропатиями», за которыми следовала «пневмония», но также с атеросклерозом и впоследствии с ХОБЛ предполагал высокий риск смертности от сепсиса (рис. 3а).

Три сети были построены из 56 значимых траекторий сепсиса, описанных на рис. 1. Непрерывная линия показывает группу пациентов, следующих по определенной многоступенчатой траектории. Сюда входят все траектории, которые содержат либо ( a ) инсулинозависимый или инсулиннезависимый сахарный диабет, или ( b ) другие анемии или анемии при хронических заболеваниях, классифицированных в других рубриках, или ( c ) психические и поведенческие расстройства, вызванные употребление алкоголя.Узлы окрашены в соответствии с их главой МКБ-10. Ширина стрелок указывает на сепсис _{RR, погибший} для конкретной траектории.

Временные траектории заболевания в сети, начиная с «злоупотребления алкоголем», были гораздо более разнообразными, чем в сети диабетиков. Многие из этих путей включали общие осложнения алкоголизма, такие как «заболевания пищеварительной системы», «эпилепсия», «церебральный инфаркт» и полинейропатии (рис. 3b).

Анемия часто встречается у женщин в пременопаузе, однако распределение по возрасту и полу исключает это как основную причину в нашей популяции (eFig.3). Для всех траекторий в сети анемии анемия была последним диагнозом перед сепсисом. Сеть анемии-сепсиса выявила тот же образец отправных точек, что и полная сеть сепсиса, включая сосудистые заболевания, диабет и злоупотребление алкоголем. Траектории, включающие сосудистые заболевания, также имели два диагноза анемии до сепсиса. Траектории диабета имели сопутствующие диабетические заболевания до анемии и последующего сепсиса. Наконец, одна из траекторий, начавшаяся со «злоупотребления алкоголем», имела анемию до «печеночной недостаточности».

RR _{умерших от сепсиса} для пациентов с диабетом недавно обсуждалось в литературе с исследованиями, указывающими как на более высокий, так и на более низкий риск смертности ^12,13,14,15. В нашем исследовании «инсулинозависимый сахарный диабет» (IDDM) увеличивал риск (RR _{умерших от сепсиса} = 1,13, p = 1,77 · 10 ⁻³⁰), тогда как NIDDM не оказал никакого эффекта (RR _{умерших от сепсиса} = 1,11, p = 0.15). При объединении IDDM и NIDDM, RR _{умерших от сепсиса} составил 1,11 (p = 5,71 · 10 ^-9), что подчеркивает важное различие в силе ассоциации IDDM и NIDDM в отношении выживаемости при сепсисе.

Наши траектории включали девять траекторий диабета, которые значительно изменили RR _{сепсис мертвых}, восемь траекторий NIDDM, одну траекторию диабета IDDM и одну, содержащую как IDDM, так и NIDDM. Все девять траекторий увеличили риск смерти с сепсисом _{RR, умерших} между 1.45 и 3.01. Помимо диабета, «злоупотребление алкоголем» и «другие анемии» были двумя другими основными диагнозами в нашей сети (рис. 1). Мы подсчитали RR _{, умерших от сепсиса,}, связанных с любыми траекториями болезни, содержащими определенные специфические диагнозы (рис. 4a). Следование траектории сахарного диабета было связано с _{умерших от сепсиса RR} 1,59 (значение p = 6,27 · 10 ⁻²³), но в сочетании с траекторией злоупотребления алкоголем или анемией RR _{умерших от сепсиса увеличилось с} до 2.44 (p = 5,83 · 10 ⁻⁴) и 1,48 (p = 1,98 · 10 ⁻⁴) соответственно. Если пациент следовал всем трем типам траекторий, RR _{умерших при сепсисе} было 3,11 (p = 4,44 · 10 ⁻⁶). Разделение диабета на IDDM и NIDDM показало более высокую степень синергизма между анемией и NIDDM (RR _{с умершими от сепсиса} = 2,80), чем с анемией и IDDM (RR _{с умершими от сепсиса,} = 1,84) (рис. 4b).

Диаграммы Венна показывают значительные значения RR _{, умерших от сепсиса,} для групп пациентов, следующих по траекториям, содержащим сахарный диабет (E10, E11), злоупотребление алкоголем (F10) и / или анемию (D64), соответственно. Цветные цифры (внутри и снаружи трех эллипсоидов) указывают на то, что _{RR сепсис} умерли из-за следования траектории, содержащей этот конкретный диагноз, независимо от того, по какой из других траекторий следует пациент. Эллипсоиды без значений не имеют значения.

Мы сравнили сопутствующие заболевания сепсиса, обнаруженные в наших данных, с не зависящим от времени браузером коморбидности, разработанным Далианисом и др. . ¹⁶. Браузер основан на 600 000 шведских пациентов и использует терминологию МКБ-10 ¹⁶. Хотя браузер предоставлял доступ только к данным суммарного уровня (а не к данным индивидуального уровня), мы воспроизвели все три основные отправные точки в основной сети значимых траекторий, оба типа сахарного диабета, все четыре сердечных заболевания (I20, I21, I25 и I50), а также злоупотребление алкоголем были сопутствующими заболеваниями сепсиса в шведском исследовании (рис.5). Мы также подтвердили два кода анемии (D63 и D64), наблюдаемые в сети. Кроме того, мы подтвердили, что несколько видов рака были в значительной степени ассоциированы с сопутствующими заболеваниями, хотя количество пациентов с каждым отдельным раком в популяции сепсиса также было относительно небольшим в шведском наборе данных, что снова может объяснить отсутствие длины четырех траекторий рака-заболевания в нашем исследовании. данные. В целом наши основные наблюдения сопутствующих заболеваний подтвердились в этой независимой когорте.

Этот рисунок показывает значительные сопутствующие заболевания в шведском исследовании Dalianis et al . ¹⁶. Размер узла соответствует количеству пациентов в шведской когорте с этим кодом. Ширина стрелки указывает процент субпопуляции сепсиса с определенной коморбидностью. Длины расходящихся стрелок произвольны.

Недавние исследования продемонстрировали взаимосвязь между низким уровнем витамина D и респираторными инфекциями и диареей у маленьких детей.Острые инфекции нижних дыхательных путей (ALRI) и диарея являются одними из двух наиболее важных причин смерти детей в возрасте до 5 лет. В этой статье мы исследовали степень, в которой дефицит витамина D (<10 нг / мл) прогнозирует ALRI, клиническую пневмонию и диарею у детей в возрасте от 6 до 30 месяцев.

Мы использовали данные рандомизированного контролируемого исследования (РКИ) ежедневного приема фолиевой кислоты и / или витамина B12 в течение шести месяцев у детей в возрасте от 6 до 30 месяцев, проведенного в Дели, Индия.Обобщенные оценочные уравнения (GEE) использовались для изучения связи между дефицитом витамина D и эпизодами ALRI, клинической пневмонии и диареи.

Из 960 субъектов, у которых была измерена концентрация витамина D, 331 (34,5%) имели дефицит витамина D. Мы обнаружили, после учета соответствующих потенциальных факторов (возраст, пол, статус грудного вскармливания, истощение, задержка роста, недостаточный вес, статус анемии и сезон), что риск ALRI был значительно выше среди людей с дефицитом витамина D (OR 1.26; 95% ДИ: 1,03–1,55) по сравнению с детьми с избытком витамина D в течение шести месяцев наблюдения. Статус витамина D не был связан с эпизодами диареи или клинической пневмонии.

Авторские права: © 2017 Chowdhury et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Доступ к данным для «Инициативы интеграции знаний в области здорового рождения, роста и развития (HBGDki)» с BMGF. Они загружают данные. Тем временем минимальный набор данных был загружен на Figshare (URL: https://figshare.com/s/4ff5ff784d466aad86bc; DOI: 10.6084 / m9.figshare.4645588).

Финансирование: Исследование было поддержано грантами Центра интервенционных наук в области охраны здоровья матери и ребенка (CISMAC GRANTS 250216) (CISMAC; номер проекта 223269), который финансируется Исследовательским советом Норвегии через его Центры передового опыта. схема и Университет Бергена (UiB), Норвегия.Проведение основного исследования было поддержано грантами Регионального управления здравоохранения Юго-Восточной Норвегии (грант № 2012090) и Исследовательского фонда Thrasher (грант № 9144). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Дефицит витамина D считается наиболее распространенным дефицитом питания и часто одним из наиболее часто не диагностируемых заболеваний в мире [1].Распространенность дефицита витамина D среди детей раннего возраста составляет около 50–90% на Индийском субконтиненте [2]. Витамин D в основном вырабатывается в коже после воздействия ультрафиолетового излучения, и менее 10% витамина поступает из пищевых источников [3].

Витамин D — мощный иммуномодулятор адаптивного и врожденного иммунных ответов [4]. Исследования in vitro показали, что 1,25-дигидроксивитамин D3, активный метаболит витамина D, важен для стимулирования и регулирования иммунных ответов [5,6].Наблюдательные исследования предполагают связь между низкими концентрациями витамина D и повышенным риском инфекций нижних и верхних дыхательных путей у младенцев и детей младшего возраста [7]. Недавнее проспективное когортное исследование показало, что дефицит витамина D был связан с увеличением частоты диарейных заболеваний среди детей школьного возраста [8]. Однако менее ясна степень, в которой дефицит витамина D предсказывает эти инфекции у детей раннего возраста.

Расчетная заболеваемость пневмонией у детей до 5 лет составляет 0.29 эпизодов на ребенка в год в развивающихся странах, что приводит к 151 миллиону новых эпизодов ежегодно, из которых 7–13% случаев являются достаточно тяжелыми, опасными для жизни и требуют госпитализации [9]. В 2013 г. 25,3% случаев смерти детей в возрасте от 1 до 59 месяцев в Индии были вызваны пневмонией, что составило 150 169 смертей [10]. Во всем мире диарея является причиной 9% всех случаев смерти детей в возрасте до 5 лет, большинство из которых приходится на развивающиеся страны [10]. Хотя наблюдается снижение заболеваемости диареей в условиях ограниченных ресурсов, бремя болезней, связанных с рецидивирующими кишечными заболеваниями, по-прежнему остается проблемой общественного здравоохранения [11–12], что приводит к повышенной детской смертности [13–15].

Некоторые микроэлементы важны для врожденного и адаптивного иммунитета у детей раннего возраста [16]. Недавние метаанализы продемонстрировали снижение заболеваемости диареей у детей на 15% после приема витамина А [17] и на 13% снижения заболеваемости диареей и пневмонией после приема добавок цинка [18, 19]. Роль витамина D как иммуномодулятора вызвала повышенный интерес к исследованию его функции при инфекционных заболеваниях [20].

Мы провели рандомизированное контролируемое исследование (РКИ), в котором дети в возрасте от 6 до 30 месяцев получали ежедневно фолиевую кислоту и / или витамин B12 в течение шести месяцев.Основными исходами были частота респираторных инфекций (ALRI, клиническая пневмония) и диареи. Зарегистрированные участники наблюдались каждые две недели на предмет респираторных и диарейных заболеваний [21]. Используя данные этого исследования, мы изучили, в какой степени недостаточность витамина D (<10 нг / мл) на исходном уровне предсказывала эти исходы в течение 6-месячного периода наблюдения.

Исследование проводилось с января 2010 года по февраль 2012 года в социально-экономических условиях с низким и средним уровнем дохода в Тигри и Дакшинпури в Нью-Дели.Общая численность населения этого сайта составляла около 300 000 человек. Детали популяции были описаны ранее [21]. В этом рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании (NCT00717730 на www.clinicaltrials.gov) с факторным дизайном участвовало 1000 детей, и оценивалось влияние добавок фолиевой кислоты, витамина B12 или того и другого на детские инфекции [21]. Анализ в данной рукописи ограничен группой из 960 детей, у которых был доступен исходный уровень витамина D.

Диарея определялась как выделение 3 или более жидкого или водянистого стула в течение 24 часов. Два эпизода диареи разделялись 72-часовым или более периодом без диареи. ALRI определялся как кашель или затрудненное дыхание с повышенной частотой дыхания, превышающей пороговые значения для определенного возраста (≥ 50 вдохов / мин у младенцев и ≥ 40 вдохов / мин у детей старшего возраста) в соответствии с критериями ВОЗ, или кашель или затрудненное дыхание и ниже сундук на рисунке [22]. Клиническая пневмония определялась либо комбинацией кашля с крепитацией или бронхиальным дыханием при аускультации, либо как эпизод ALRI, связанный по крайней мере с одним из следующих признаков: втягивание нижней части грудной клетки, судороги, неспособность пить или есть, крайняя летаргия, беспокойство или Раздражительность, раздувание носа или нарушение сна и трудности при пробуждении.

Образцы крови были взяты на исходном уровне от всех детей; 3 мл крови собирали в откачанную пробирку, содержащую ЭДТА (Becton Dickinson). Плазму центрифугировали при ~ 450 × g при комнатной температуре в течение 10 мин, отделяли, переносили во флаконы для хранения и хранили при -20 ° C до анализа. Концентрация витамина D в плазме измерялась с помощью количественного анализа связывания электрохемилюминесценции с обнаружением 25 (OH) D ₂, гидроксилированных форм витамина D2 (Roche Diagnostics, Мангейм, Германия) [23] в Христианском медицинском колледже, Лаборатория биохимии Веллора.

Это исследование было проведено в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Хельсинкской декларации. Все процедуры были одобрены комитетами по этике Общества прикладных исследований, Нью-Дели, Христианским медицинским колледжем Веллора и Норвежским региональным комитетом по этике медицинских и медицинских исследований (REK VEST). В форме согласия на основное испытание также запрашивалось разрешение родителей на хранение образцов крови этих детей для использования в будущих исследованиях. Все родители согласились на то же.

Пропорции и средние значения (SD) или медиана (IQR) были рассчитаны для категориальных и непрерывных переменных по статусу витамина D на исходном уровне. Дефицит витамина D был определен на уровне <10 нг / мл (25 нмоль / л) [24]. Период наблюдения через 6 месяцев был разделен на 26 периодов по 7 дней для каждого ребенка. Для включения в анализ периода нам требовалась информация по 4 дням или более из данного 7-дневного периода. Чтобы учесть взаимозависимость нескольких периодов наблюдения у одного и того же ребенка, мы использовали обобщенные оценочные уравнения (GEE) с авторегрессионной ковариационно-дисперсионной матрицей с учетом времени.В этих моделях возникновение нового эпизода диареи, ALRI или клинической пневмонии в детском периоде моделировалось как зависимые переменные, а исходный статус витамина D - как независимая переменная. Мы включили типы полученных вмешательств и другие исходные переменные в качестве независимых переменных (возраст, пол, статус грудного вскармливания, истощение, задержка роста, недостаточный вес, статус анемии и время года) в модель, чтобы скорректировать возможные искажения. Модель использовала логит-связь, биномиальную дисперсию, авторегрессионную корреляцию и устойчивую стандартную ошибку для получения отношения шансов (OR).Мы использовали STATA версии 14 (Stata Corporation, College Station, TX) для большинства статистических анализов. Мы использовали обобщенные аддитивные модели в статистическом программном обеспечении R версии 3.1.2 (The R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия) для изучения нелинейных связей между уровнем витамина D на исходном уровне и заболеваемостью ALRI после поправки на возможные факторы, влияющие на факторы [25]. Мы также использовали обобщенные аддитивные модели для изучения нелинейных связей между уровнем витамина D на исходном уровне и сезоном, определяемым периодом регистрации в неделях.Мы считали ассоциацию статистически значимой, когда значение P было <0,05. Постфактуальные расчеты статистической мощности показали, что у нас была более 90% мощности для выявления как минимум на 25% больше эпизодов ALRI в течение 6 месяцев наблюдения в группе с дефицитом витамина D по сравнению с группой без дефицита витамина D с доступными выборка на уровне значимости 5%.

Всего в основное исследование было включено 1000 детей. Образцы крови на витамин D были собраны на исходном уровне у 960 (96%) детей.Из них 331 (34,5%) ребенок имел дефицит витамина D (<10 нг / мл). Исходные характеристики населения по статусу дефицита представлены в таблице 1. Примерно половина включенных детей были мальчиками, и почти все (98%) когда-либо находились на грудном вскармливании. Более 36,4% детей страдали задержкой роста, 31% - недостаточной массой тела и 10,7% - истощенными. Примерно 70% детей страдали анемией.

На рис. 1 показана взаимосвязь между витамином D в зависимости от недель регистрации. Поскольку в Индии сложно определить отдельные сезоны, мы разделили период зачисления на недели.Концентрации витамина D были выше в период с 24 ^-й до 32 ^-й недель, что соответствует месяцам (май-июль) с большим дневным светом. Базовые уровни витамина D были ниже у детей, которые были зачислены в первые недели года, которые соответствуют месяцам (январь-февраль) и имеют меньше дневного света.

График был построен с использованием обобщенных аддитивных моделей в R, сплошная линия отображает связь уровня витамина D на исходном уровне и в сезон.Заштрихованная область охватывает 95% доверительный интервал этой связи.

Эпизоды диареи у детей с дефицитом витамина D и без него показаны в таблице 2. Связи между статусом витамина D и эпизодами диарея в целом и в зависимости от эпизодов диареи продолжительностью 6 дней и более. Связь между статусом витамина D и ALRI и клинической пневмонией показана в таблице 3. Частота ALRI была значительно выше среди детей с дефицитом витамина D, чем среди детей с избытком витамина D (OR: 1.26; 95% ДИ: 1,03–1,55). Однако частота клинической пневмонии не была существенно связана со статусом витамина D (OR: 1,05; 95% CI: 0,79–1,38).

График был построен с использованием обобщенных аддитивных моделей в R, сплошная линия изображает связь уровня витамина D на исходном уровне и плотности заболеваемости ALRI.Заштрихованная область охватывает 95% доверительный интервал этой связи.

Мы сообщаем о распространенности дефицита витамина D и его связи с распространенными инфекциями у детей младшего возраста. Мы обнаружили высокую распространенность дефицита витамина D, что согласуется с другими исследованиями в Индии [2]. Однако недавнее исследование, проведенное в Непале, показало, что только <5% младенцев, находящихся на грудном вскармливании, имели дефицит витамина D, даже когда использовался более высокий порог (<20 нг / л) [26].Высокая распространенность дефицита витамина D, наблюдаемая в условиях нашего исследования, несмотря на обилие солнечного света, может быть связана с относительно высоким зенитным углом солнечного света в сочетании с загрязнением атмосферы, типом кожи V типа у населения и ограничением активности на открытом воздухе [27, 28 ]. Больше фотонов ультрафиолета B (UVB) поглощается стратосферной зоной, и, следовательно, меньше фотонов UVB проникает на поверхность земли, производя кожный пре-витамин D3 с относительно высоким зенитным углом Солнца. [29]. Недавнее исследование показало, что младенцы могут получать достаточное количество витамина D из грудного молока, если их матери принимают добавки витамина D в высоких дозах [30].Прикорм в рационе индийских младенцев и детей состоит в основном из злаков и с низким содержанием витамина D [31]. Вероятно, это еще один фактор, способствующий широко распространенному дефициту витамина D среди детей в этих условиях.

Мы обнаружили значительно более высокую заболеваемость ОРЗН среди детей с дефицитом витамина D по сравнению с детьми с избытком витамина D. Подобные результаты были показаны в предыдущих наблюдательных исследованиях [32–34]. Витамин-D индуцирует активацию TLR и антибактериальные реакции, которые, в свою очередь, усиливают продукцию кателицидина (LL-37), эндогенного антимикробного пептида, который высоко экспрессируется на участках естественного барьера. E.грамм. легкие [35]. Защитная роль витамина D против ALRI может быть объяснена его модулирующим действием как на врожденный, так и на адаптивный иммунитет и регулирующую функцию воспалительного каскада [36–39].

Мы не обнаружили никакой связи с клинической пневмонией, тяжелой формой ALRI и статусом витамина D. Другие обсервационные исследования показали неоднозначные результаты; в то время как одни исследования выявили связь между статусом витамина D и клинической пневмонией, другие — нет [40–43]. Витамин D по-разному влияет на врожденный и адаптивный иммунные ответы, которые могут объяснять различную роль в тяжести патоген-специфической инфекции [44].Более того, в недавнем систематическом обзоре был сделан вывод об отсутствии доказательств применения добавок витамина D среди детей младше 5 лет при лечении клинической пневмонии [45]. Даже если витамин D играет роль в защите от инфекций, он может не иметь терапевтической роли, поскольку после того, как инфекция возникла, другие факторы определяют ее течение и скорость ее исчезновения. Учитывая сложность взаимодействия витамина D с иммунной системой и воспалительным каскадом, необходимы дополнительные исследования для дальнейшего определения конкретной роли витамина D в усилении иммунной функции и уменьшении тяжести инфекций.

Низкий уровень витамина D в нашем исследовании не был связан с увеличением частоты и тяжести диареи, что согласуется с результатами другого обсервационного исследования [46]. Рандомизированное контролируемое исследование с трехмесячным болюсным введением 100 000 МЕ витамина D3 среди детей в возрасте от 1 до 29 месяцев не показало эффекта на диарейные заболевания [47]. Наше исследование проводилось в городских трущобах, где у детей часто встречается постоянное воздействие патогенных организмов и последующие кишечные инфекции [48].Это может замаскировать потенциальную полезную роль витамина D в этой популяции.

Может быть дефицит других ограничивающих питательных микроэлементов. Дефицит цинка увеличивает риск диареи и пневмонии. Предыдущее исследование в этой популяции показало, что дефицит цинка является обычным явлением, а добавление цинка снижает бремя диареи и инфекций нижних дыхательных путей [49,50]. Было показано, что на витамин D-зависимые гены в клетке влияет внутриклеточная концентрация цинка [51].Поскольку источники витамина D и цинка различны, мы не считаем, что статус витамина D зависит от статуса цинка. Однако существует вероятность того, что эти питательные вещества могут взаимодействовать друг с другом.

Сильной стороной нашего исследования является то, что данные взяты из хорошо проведенного исследования с очень низким уровнем отсева. Мы предприняли несколько контрольных визитов для оценки ALRI, клинической пневмонии и диареи, чтобы убедиться, что практически все эпизоды были задокументированы. Результаты были четко определены и оценены высококвалифицированным полевым персоналом.Результаты были скорректированы с учетом нескольких важных факторов, включая состояние питания детей и сезон зачисления.

Мы использовали иммунологический метод для измерения концентрации витамина D. Следует отметить, что иммуноанализы могут переоценивать 25OHD [52], потому что он липофильный, что делает его уязвимым для матричных эффектов в анализах связывания белков [53].

Результаты этого исследования могут иметь важное значение для общественного здравоохранения. Обогащенные продукты признаны важным источником витамина D [54], например, масла, зерновые порошки и даже соли и обогащение могут помочь в предотвращении дефицита витамина D.Добавки витамина D рекомендуются во многих странах, такие меры общественного здравоохранения требуют серьезного рассмотрения в контексте Индии.

Настоящее исследование демонстрирует, что дефицит витамина D часто встречается у детей Нью-Дели в возрасте 6–30 месяцев и связан с повышенным риском ALRI. Приоритет следует отдавать рандомизированным контролируемым испытаниям, оценивающим влияние добавок витамина D в этих условиях.

Мы благодарим Ратнасами Селвакумара, факультета биохимии Христианского медицинского колледжа, Веллор, Индия, за биохимический анализ.Общество прикладных исследований выражает признательность за основную поддержку, оказываемую Департаментом здоровья матерей, новорожденных, детей и подростков Всемирной организации здравоохранения, Женева (Центр сотрудничества с ВОЗ IND-096) и Центром интервенционных наук в области охраны здоровья матери и ребенка (проект RCN). № 223269), Центр международного здравоохранения Бергенского университета (Норвегия). Мы также выражаем признательность за поддержку, оказываемую Платформой интеграции и технологий знаний (KnIT), инициативой Grand Challenges Департамента биотехнологии и Совета по содействию исследованиям биотехнологической промышленности (BIRAC) правительства Индии и Фондом Билла и Мелинды Гейтс (США).Мы также благодарим Центр интервенционных наук в области охраны здоровья матери и ребенка (CISMAC; номер проекта 223269), который финансируется Исследовательским советом Норвегии через его систему центров передового опыта и Бергенским университетом (UiB), Норвегия. Проведение основного исследования было поддержано грантами Регионального управления здравоохранения Юго-Восточной Норвегии (грант № 2012090) и Исследовательского фонда Thrasher (грант № 9144).

5.
Cantorna MT. Витамин D и аутоиммунитет: является ли статус витамина D фактором окружающей среды, влияющим на распространенность аутоиммунных заболеваний? Труды Общества экспериментальной биологии и медицины Общества экспериментальной биологии и медицины (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк).2000; 223 (3): 230–3
6.
Пихлер Дж., Герстмайр М., Сепфалуси З., Урбанек Р., Петерлик М., Вилльхейм М. 1 альфа, 25 (ОН) 2D3 ингибирует не только Th2, но и дифференцировку Th3 в Т-клетках пуповинной крови человека. Педиатрические исследования. 2002. 52 (1): 12–8. pmid: 12084841
10.
Лю Л., Оза С., Хоган Д., Перин Дж., Рудан И., Лаун Дж. Э. и др.Глобальные, региональные и национальные причины детской смертности в 2000–2013 годах, с прогнозами для определения приоритетов на период после 2015 года: обновленный систематический анализ. Ланцет. 2015; 385 (9966): 430–40. pmid: 25280870
11.
Фишер Уокер К.Л., Перин Дж., Арье М.Дж., Боски-Пинто К., Блэк РЭ. Заболеваемость диареей в странах с низким и средним уровнем доходов в 1990 и 2010 годах: систематический обзор. BMC общественное здравоохранение. 2012; 12: 220. pmid: 22436130
14.
Родригес Л., Сервантес Э., Ортис Р. Недоедание и желудочно-кишечные и респираторные инфекции у детей: проблема общественного здравоохранения. Международный журнал исследований окружающей среды и общественного здоровья. 2011. 8 (4): 1174–205.pmid: 21695035
21.
Танежа С., Стрэнд Т.А., Кумар Т., Махеш М., Мохан С., Янгер М.С. и др. Добавки фолиевой кислоты и витамина B-12 и распространенные инфекции у детей в возрасте 6-30 месяцев в Индии: рандомизированное плацебо-контролируемое исследование. Американский журнал лечебного питания.2013; 98 (3): 731–7 pmid: 23
9
28.
Пури С., Марваха Р.К., Агарвал Н., Тандон Н., Агарвал Р., Гревал К. и др. Статус витамина D, по-видимому, здоровые школьницы из двух разных социально-экономических слоев в Дели: отношение к питанию и образу жизни. Британский журнал питания. 2008; 99: 876–882 pmid: 17

30.
Холлис Б.В., Вагнер К.Л., Ховард С.Р., Эбелинг М., Шари Дж. Р., Смит П. Г. и др. Материнские и младенческие добавки витамина D во время кормления грудью: рандомизированное контролируемое исследование. Педиатрия. 2015; 136 (4): 625–34 pmid: 26416936
31.
Национальный институт питания, Индия. Таблицы пищевого состава.В «Питательной ценности индийских продуктов питания», под редакцией Гопалана С., Састри БВР, Баласубраманиан С.К. Хайдарабад: Национальный институт питания, Индийский совет медицинских исследований. 1996: 45–95
33.
Каратекин Г., Кая А., Салихоглу О, Балджи Х., Нухоглу А.Связь субклинического дефицита витамина D у новорожденных с острой инфекцией нижних дыхательных путей и их матерей. Европейский журнал лечебного питания. 2009. 63 (4): 473–7. pmid: 18030309
41.
Рен Дж, Сун Би, Мяо П, Фэн Х.[Корреляция между уровнем витамина D в сыворотке крови и тяжестью внебольничной пневмонии у детей раннего возраста]. Zhongguo dang dai er ke za zhi = Китайский журнал современной педиатрии. 2013; 15 (7): 519–21 pmid: 23866270
43.Сакка АСЭ, Иман СС, Амер Х.А., Мустафа С.А. Дефицит витамина D и низкий уровень гемоглобина как факторы риска серьезности острых инфекций нижних дыхательных путей у детей Египта: исследование случай-контроль. Бюллетень Египетской педиатрической ассоциации. 2014; 62: 1–7 http://dx.doi.org/10.1016/j.epag.2013.12.001
46.
Ahmed AMS, Magalhaes RJS, Ahmed T., Long KZ, Hossain MDI, Islam M et al. Статус витамина D не мешает взаимосвязи между цинком и диареей: исследование, проведенное среди детей с пониженным и нормальным весом в возрасте 6–24 месяцев в городских районах Бангладеш. Европейский журнал клинического питания.2016; 70: 620–628. pmid: 26956127
49.Бхандари Н., Бахл Р., Танежа С., Стрэнд Т.А., Молбак К., Ульвик Р.Дж., Зоммерфельт Х., Бхан М.К. Существенное снижение заболеваемости тяжелыми диарейными заболеваниями за счет ежедневного приема добавок цинка у детей раннего возраста из Северной Индии. Педиатрия 2002; 109: e86. pmid: 12042580
50.
Bhandari N, Bahl R, Taneja S, Strand T, Molbak K, Ulvik RJ, Sommerfelt H, Bhan MK. Влияние рутинного приема цинка на пневмонию у детей в возрасте от 6 месяцев до 3 лет: рандомизированное контролируемое исследование в городских трущобах. BMJ 2002; 324: 1358.pmid: 12052800
51.
Крейг Т.А., Бенсон Л.М., Нейлор С., Кумар Р. Эффекты модуляции цинка на образование комплексов транскрипции рецептора витамина D и ретиноидного X рецептора альфа-ДНК: анализ с помощью масс-спектрометрии с микроэлектрораспылением. Rapid Commun Mass Spectrom 2001; 15: 1011–1016 pmid: 11400211
52.
Костелло С.Дж., Вулман Э., Радуга С., Стратиотис Л., О’Гарро Г., Уайтинг С. и др. Подходит ли высокопроизводительное измерение 25-гидроксивитамина D3 без 25-гидроксивитамина D2 для рутинного клинического использования? Летопись клинической биохимии.2009; 46 (Pt 1): 86–7

Производительность исследований и разработок в био-фармацевтической промышленности постоянно снижалась с начала 2000-х годов.Одна из возможных причин заключается в том, что биомедицинские проекты рискованны, занимают много времени и требуют значительных инвестиций. Следовательно, значительный капитал был перемещен из биофармацевтической промышленности в другие отрасли, которые считаются менее рискованными, что создает дефицит финансирования для ранних стадий фармацевтических НИОКР. Здесь мы исследуем и улучшаем новый метод финансирования, который был предложен для облегчения финансирования НИОКР в биофармацевтической промышленности. Этот новый метод финансирования является ярким примером быстро развивающихся инноваций в финансовой индустрии, от которых биофармацевтическая промышленность может получить огромную выгоду.Помимо проблем с финансированием, фармацевтические компании должны устранить нормативные препятствия, прежде чем они смогут коммерциализировать свои методы лечения. Эти нормативные стандарты лекарственных средств требуют определенного баланса преимуществ и рисков для одобрения терапии и в настоящее время не принимают во внимание тяжесть заболевания, на которое нацелена терапия. Во второй части этого тезиса мы предлагаем объективную и количественную структуру байесовского анализа решений, чтобы включить отзывы пациентов в процесс одобрения лекарств, и предлагаем корректировку стандартов одобрения в зависимости от тяжести заболевания.При запуске своего препарата фармацевтические компании устанавливают цену на препарат таким образом, чтобы ожидаемая выручка компенсировала затраты на все проекты, неудачные или успешные, которые были реализованы для того, чтобы привести к этому успешному лечению, которое приведет к дорогостоящему лечению. В последнее время появились некоторые высокоэффективные лечебные методы лечения с высокими ценами на болезни с большой распространенностью, такие как гепатит С. Эти высокие цены в сочетании с большим количеством пациентов создали неподъемное финансовое бремя для страховых компаний, чтобы покрыть самая широкая популяция пациентов, которым могут помочь эти препараты.Несмотря на прорывные открытия, фармацевтические компании, производящие эти лекарства, испытали негативную реакцию общественности из-за цен на лекарства. В последней части диссертации мы представляем новую парадигму финансирования для решения проблемы высоких совокупных затрат на эти высокоэффективные методы лечения.

xref
513 127
0000000016 00000 н.
0000003835 00000 н.
0000004006 00000 н.
0000004135 00000 п.
0000004212 00000 н.
0000004234 00000 н.
0000004789 00000 н.
0000004864 00000 н.
0000005003 00000 н.
0000005142 00000 н.
0000005281 00000 п.
0000005420 00000 н.
0000005558 00000 н.
0000005697 00000 п.
0000005835 00000 н.
0000005971 00000 п.
0000006479 00000 н.
0000006732 00000 н.
0000007174 00000 н.
0000007863 00000 н.
0000008025 00000 н.
0000008062 00000 н.
0000008538 00000 п.
0000008565 00000 н.
0000008679 00000 н.
0000008791 00000 н.
0000009359 00000 н.
0000009606 00000 н.
0000010602 00000 п.
0000011456 00000 п.
0000012223 00000 п.
0000012356 00000 п.
0000013040 00000 п.
0000013765 00000 п.
0000014580 00000 п.
0000015762 00000 п.
0000017059 00000 п.
0000017190 00000 п.
0000018474 00000 п.
0000018640 00000 п.
0000019906 00000 п.
0000020415 00000 п.
0000023065 00000 п.
0000023135 00000 п.
0000023243 00000 п.
0000035319 00000 п.
0000035586 00000 п.
0000036024 00000 п.
0000048186 00000 п.
0000058080 00000 п.
0000070328 00000 п.
0000070398 00000 п.
0000070501 00000 п.
0000081785 00000 п.
0000082046 00000 п.
0000082472 00000 п.
0000082499 00000 н.
0000083035 00000 п.
0000083353 00000 п.
0000083380 00000 п.
0000083816 00000 п.
0000083947 00000 п.
0000084285 00000 п.
0000084578 00000 п.
0000084912 00000 п.
0000085132 00000 п.
0000121869 00000 н.
0000121908 00000 н.
0000126186 00000 п.
0000126574 00000 н.
0000126920 00000 н.
0000127374 00000 н.
0000127830 00000 н.
0000128324 00000 н.
0000128782 00000 н.
0000128857 00000 н.
0000128929 00000 н.
0000129169 00000 н.
0000129238 00000 п.
0000129360 00000 н.
0000129548 00000 н.
0000129617 00000 н.
0000129908 00000 н.
0000129977 00000 н.
0000130252 00000 н.
0000130321 00000 н.
0000130626 00000 н.
0000130695 00000 п.
0000130942 00000 н.
0000131011 00000 н.
0000131134 00000 н.
0000131203 00000 н. uh5pNͽ> s9
̙D’Y «kiM ٗ ҢxzwGc

Резидентные макрофаги в тканях играют фундаментальную роль в защитном иммунитете и заживлении ран после травм, а также в поддержании гомеостаза.Функции макрофагов варьируются в зависимости от требований местной окружающей среды, и это отражается в фенотипическом разнообразии, обнаруженном среди макрофагов в разных тканях. В самом деле, хотя все тканевые макрофаги обладают общей транскрипционной сигнатурой «ядра» (1) , существуют дополнительные тканеспецифичные характеристики экспрессии генов, которые обеспечивают органоспецифичные и даже нишевые функции (2, 3) . Однако местные сигналы окружающей среды и нижестоящие молекулярные пути, которые контролируют этот тканеспецифический импринтинг макрофагов в различных средах, не полностью изучены.

Альвеолярные макрофаги — самая многочисленная популяция макрофагов в здоровом легком, где они обеспечивают первую линию защиты от переносимых по воздуху патогенов, а также поддерживают гомеостаз легких, например, за счет регуляции легочного сурфактанта. Однако при хронических патологиях легких, таких как аллергическая астма, идиопатический легочный фиброз (IPF) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), альвеолярные макрофаги проявляют аберрантную активность и во многих случаях, по-видимому, сохраняют болезнь (4) .Более того, моноциты и макрофаги, по-видимому, играют особую патогенную роль в контексте тяжелого коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19) (5) . Таким образом, механизмы, управляющие импринтингом альвеолярных макрофагов, могут дать важные сведения о том, как специфические для легких сигналы регулируют гомеостаз и восприимчивость к болезням.

Альвеолярные макрофаги происходят из эритромиелоидных предшественников (EMP) и моноцитов печени плода, которые засевают легкие во время эмбрионального развития (6–8) .Однако характерный фенотип и функциональные свойства альвеолярных макрофагов не развиваются до первых нескольких дней постнатальной жизни параллельно с альвеоляризацией легких и контролируются CSF-2 (GM-CSF) (8-10) и иммунорегуляторный цитокин TGF-β (11) . Вместе эти цитокины индуцируют экспрессию гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом фактора транскрипции (PPAR-γ), что способствует выживанию и тканеспецифической специализации, включая активацию генов, участвующих в захвате липидов и метаболизме.Следовательно, мыши, у которых Csf2rb, Tgfbr2 или Pparg были генетически удалены в миелоидных клетках, развивают спонтанный легочный альвеолярный протеиноз (9-11) . Однако альвеолярные макрофаги в основном не могут развиваться в отсутствие передачи сигналов рецептора CSF-2 и TGF-β из-за их ключевой роли в выживании макрофагов. Следовательно, остается неясным, контролируют ли эти факторы тканеспецифическую идентичность и функцию альвеолярных макрофагов и каким образом. Более того, хотя PPAR-γ считается «основным фактором транскрипции» альвеолярных макрофагов, он участвует в контроле над другими тканевыми макрофагами, включая макрофаги красной пульпы селезенки (12, 13) , и, таким образом, транскрипционная сеть, ответственная за передачу специфичность при дифференцировке альвеолярных макрофагов остается неясной.Наконец, остается неизвестным, участвуют ли и каким образом дополнительные регуляторы транскрипции в регуляции этих процессов в контексте воспаления и восстановления.

Здесь мы использовали секвенирование РНК одной клетки (scRNA-seq) для идентификации регуляторов транскрипции, экспрессируемых альвеолярными макрофагами. Мы показываем, что экспрессия транскрипционного фактора EGR2 является уникальной особенностью альвеолярных макрофагов легких по сравнению с другими мононуклеарными фагоцитами легких и макрофагами, находящимися в других тканях.Используя клеточно-специфическую абляцию Egr2 и смешанных химерных мышей костного мозга, мы показываем, что присущий клеткам EGR2 необходим для тканеспецифической идентичности альвеолярных макрофагов и их способности контролировать инфекцию основным респираторным патогеном, Streptococcus pneumoniae . Секвенирование РНК (RNA-seq) показывает, что EGR2 контролирует большую часть основной транскрипционной сигнатуры альвеолярных макрофагов, включая экспрессию Siglec5, Epcam и Car4 .Механически мы показываем, что экспрессия EGR2 индуцируется TGF-β и CSF-2-зависимой передачей сигналов и действует для поддержания экспрессии CCAAT-энхансер-связывающего белка бета (C / EBPβ), чтобы контролировать дифференцировку альвеолярных макрофагов. Наконец, используя модель повреждения легких, вызванную блеомицином, и комбинацию подходов к картированию судеб, мы показываем, что репопуляция ниши альвеолярных макрофагов после травмы происходит посредством дифференцировки клеток, происходящих из костного мозга, зависимым от EGR2 образом и что эти моноциты -производные макрофаги незаменимы для эффективного восстановления тканей и восстановления тканевого гомеостаза.

Чтобы начать анализировать молекулярные пути, лежащие в основе специфичного для ниши импринтинга альвеолярных макрофагов, мы выполнили scRNA-seq мононуклеарных фагоцитов легких мышей из перевариваемых веществ легких, чтобы идентифицировать уникальные транскрипционный профиль альвеолярных макрофагов. С этой целью негранулоцитарные клетки CD45 ⁺ из легких мышей Rag1 ^{— / —} очищали с помощью FACS и секвенировали с использованием платформы 10x Chromium (, дополнительная фигура 1A, ).3936 ячеек прошли контроль качества и были сгруппированы с использованием анализа уменьшения размерности Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) в пакете Seurat R. NK-клетки, идентифицированные по их экспрессии Ncr1, Nkg7 и Gzma , были исключены ( дополнительный рисунок 1A ), а оставшиеся миелоидные клетки были повторно кластеризованы, чтобы оставить шесть кластеров мононуклеарных фагоцитов, и они были аннотированы с использованием известных профили экспрессии гена-ориентира ( Рисунок 1A, B ).Кластер 1 представлял моноциты на основе их экспрессии Itgam (кодирует CD11b) , Csf1r и Cd68 , и его можно было разделить на классические и неклассические моноциты на основе экспрессии Ly6c2 и Treml4 соответственно ( Рисунок 1A, B ). Кластер 2 представлял интерстициальные макрофаги на основе их высокой экспрессии Cx3cr1 , Cd68, Csf1r и h3-Aa и отсутствия генов Xcr1 и Cd209a , которые определяли cDC1 (кластер 5) и cDC1 (кластер 6). ) соответственно.Альвеолярные макрофаги (кластер 3) сформировали самую большую популяцию и могут быть определены по их экспрессии Itgax (кодирует CD11c) , Siglec5 (кодирует SiglecF) и Car4 , а также по отсутствию Cx3cr1 и Itgam . Кластер 4 был транскрипционно подобен кластеру 3, но определялся генами, связанными с клеточным циклом, включая Mki67, Birc5 и Tubb5 , что позволяет предположить, что они представляют собой пролиферирующие альвеолярные макрофаги ( Рисунок 1A, B ).Затем мы сравнили профили экспрессии генов этих кластеров, сосредоточив внимание на генах, более высоко экспрессируемых альвеолярными макрофагами по сравнению со всеми другими мононуклеарными фагоцитами. 722 гена соответствовали этим критериям, в том числе Fapb1 , Spp1 (кодирующий остеопонтин) и Cidec , которые, как известно, уникально и высоко экспрессируются альвеолярными макрофагами ( Дополнительная таблица 1 ) (1, 3) . В этой кассете генов мы обратили внимание на гены, кодирующие факторы / регуляторы транскрипции, поскольку мы предположили, что они могут контролировать тканеспецифическую дифференцировку альвеолярных макрофагов.Как и ожидалось, они включали Pparg, Cebpb и Bhlhe41 , которые, как было показано, контролируют развитие и способность к самообновлению альвеолярных макрофагов (9, 14, 15) ( Рисунок 1C ). Однако этот анализ также выявил факторы транскрипции, такие как Id1, Klf7 и Egr2 , которые ранее не участвовали в контроле дифференцировки альвеолярных макрофагов. Мы сосредоточились на EGR2, который является частью семейства транскрипционных факторов ранней реакции роста (EGR), включающего EGR1-4, поскольку Egr2 , по-видимому, особенно избирательно экспрессируется альвеолярными макрофагами ( Рисунок 1D ) при сравнении с другими тканевыми макрофагами на мРНК (, фиг. 1E, ) и уровне белка (, фиг. 1F, G и дополнительная фиг. 2A, ).Напротив, несмотря на высокую экспрессию альвеолярных макрофагов, Pparg также экспрессировался на высоком уровне макрофагами красной пульпы селезенки (, рисунок 1E, ), что согласуется с предыдущими сообщениями (12, 13) . Затем мы выполнили аналогичный анализ экспрессии EGR2 в различных популяциях макрофагов человека из наборов данных scRNA-seq в Атласе клеток человека. В соответствии с нашим анализом на мышах, это показало, что экспрессия EGR2 была ограничена макрофагами легких и, в частности, макрофагами FABP4 ⁺, которые соответствуют макрофагам дыхательных путей ( Рисунок 1H ), и мы подтвердили это на уровне белка. , показывая, что макрофаги CD163 ⁺ HLA-DR ⁺ бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) равномерно экспрессируют EGR2 (, дополнительная фигура 2B, ).Таким образом, эти данные демонстрируют, что экспрессия EGR2 является конститутивным, специфическим и эволюционно консервативным признаком альвеолярных макрофагов.

A. Анализ уменьшения размерности UMAP 3936 клеток (негранулоцитарные, миелоидные клетки) выявляет шесть кластеров мононуклеарных фагоцитов, включая моноциты, макрофаги (Mϕ) и обычные дендритные клетки. клетки (кДК) в легких мышей.

E. Тепловая карта, показывающая относительную экспрессию выбранных факторов транскрипции альвеолярными макрофагами легких, CD102 ⁺ перитонеально макрофаги, микроглия головного мозга и макрофаги селезенки красной пульпы, полученные от консорциума ImmGen.

F. Репрезентативная экспрессия EGR2 альвеолярными макрофагами легких, CD102 ⁺ перитонеальными макрофагами, микроглией мозга и макрофагами красной пульпы селезенки, полученными от взрослых неманипулятивных мышей C57BL / 6. Затененные гистограммы представляют собой элементы управления изотипами. Данные взяты из одного из трех независимых экспериментов с 3-4 мышами на эксперимент.

G. Экспрессия EGR2 указанными популяциями макрофагов и миелоидных клеток показана как относительная средняя интенсивность флуоресценции (MFI) (MFI в Egr2 ^{fl / fl} (Cre ^—) — MFI в Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) мышей). Данные представляют 3-4 мыши на ткань. Планки погрешностей представляют S.D. Односторонний дисперсионный анализ с последующим пост-тестом множественных сравнений Тьюки. **** p <0,0001

Предыдущая работа показала, что EGR1 и EGR2 действуют дублирующим образом (19) , в то время как другие исследования показали, что факторы транскрипции EGR полностью не обязательны для дифференцировки макрофагов ( 20) .Однако многие из этих исследований были выполнены in vitro, и роль EGR в тканеспецифической дифференцировке макрофагов не была всесторонне оценена in vivo , отчасти из-за послеродовой летальности глобального Egr2 ^{— / —} мышей (21, 22) . Чтобы определить роль EGR2 в развитии и дифференцировке альвеолярных макрофагов, мы скрестили мышей Lyz2 ^Cre (23) с Egr2 ^{fl / fl} мышей (24) , чтобы получить штамм, у которого миелоидные клетки, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки и нейтрофилы, не имеют EGR2 конститутивным образом.Мы провели объективный анализ проточной цитометрии UMAP на лейкоцитах легких, полученных из Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей (называемых здесь Cre ⁺) и Egr2 ^{fl / fl} контрольных однопометников (называемых здесь Cre ^— мышей), фокусирующихся на отрицательных по происхождению (CD3 ^— CD19 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^—) Клетки CD11c ⁺ и CD11b ⁺ в переваривании легких ( Рисунок 2A ).Анализ поверхностных маркеров объединенных клеток мышей Cre ^— и Cre ⁺ подтвердил присутствие альвеолярных и интерстициальных макрофагов, эозинофилов и субпопуляций дендритных клеток и моноцитов (, рисунок 2A, ), и это было подтверждено с помощью ручного стробирования ( рисунок). 2B и (дополнительный рисунок 3A ). Из-за своего фенотипа CD11c ^hi CD11b ^—, альвеолярные макрофаги сгруппированы отдельно от других миелоидных клеток CD11b ⁺ ( Рисунок 2A-C ).Все миелоидные клетки, включая альвеолярные макрофаги, были одинаково многочисленны в легких мышей Cre ^— и Cre ⁺. ( Рисунок 2D ). Однако, в то время как альвеолярные макрофаги от мышей Cre ^— экспрессировали высокие уровни SiglecF, у большинства альвеолярных макрофагов, полученных от мышей Cre ⁺, отсутствовала экспрессия SiglecF (, рис. 2E ), что объясняет их отличное расположение в кластере альвеолярных макрофагов в UMAP-анализ. Действительно, только ~ 7% альвеолярных макрофагов у мышей Cre ⁺ экспрессировали высокие уровни SiglecF, и дальнейший анализ показал, что они экспрессировали высокие уровни EGR2 ( Рисунок 2F ), что позволяет предположить, что клетки SiglecF ⁺, оставшиеся в Cre ⁺ мыши представляют собой клетки, избежавшие Cre-опосредованной рекомбинации.В соответствии с этим, клетки SiglecF ⁺ у мышей Cre ⁺ экспрессировали высокие уровни CD11c, эквивалентные альвеолярным макрофагам от мышей Cre ^—, тогда как альвеолярные макрофаги SiglecF ^— экспрессировали более низкие уровни CD11c ( Рисунок 2G ). . Мы не обнаружили различий в пролиферативной активности Egr2- достаточных и — дефицитных альвеолярных макрофагов ( Рисунок 2G ). Что важно и согласуется с отсутствием экспрессии EGR2 другими резидентными макрофагами ткани, мы не наблюдали влияния на количество клеток и экспрессию маркеров сигнатуры резидентными макрофагами в других тканях, в том числе в селезенке, где макрофаги разделяют зависимость от PPAR-γ ( 12, 13) ( дополнительный рисунок 3B, C ).Таким образом, эти данные демонстрируют, что хотя экспрессия EGR2 необходима для выживания и самоподдержания альвеолярных макрофагов, она необходима для импринтинга ключевых фенотипических особенностей клеток в здоровом легком.

A. UMAP-анализ CD3 ^— CD19 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^— CD11b ⁺ / CD11c ^{+ объединены с взрослыми необработанными мышами Cre ^— и Cre ⁺ ( левая панель, ).Графики тепловой карты, показывающие относительную экспрессию указанных маркеров миелоидными кластерами.}

D. Относительная частота и абсолютное количество альвеолярных макрофагов, cDC1, cDC2, Ly6C ^hi моноцитов и CD64 ⁺ MHCII ⁺ интерстициальных макрофагов в переваривании легких взрослых необработанных мышей по сравнению с их численностью Cre ⁺ в Cre ^— однопометников.Символы представляют отдельных мышей, а данные объединены из трех независимых экспериментов с 8 мышами в группе. Планки погрешностей представляют S.D.

E. Репрезентативная экспрессия SiglecF с помощью CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов (из F ), полученных из перевариваемых веществ в легких взрослых необработанных Cre ^— или Cre ⁺ мышей ( слева ) частота макрофагов SiglecF ⁺ в каждом штамме ( справа ).Символы представляют отдельных мышей с 4 мышами в группе. Данные взяты из как минимум 5 независимых экспериментов. Планки погрешностей представляют S.D. Тест Стьюдента t , **** p <0,0001 (SiglecF)

F. Репрезентативная экспрессия EGR2 альвеолярными макрофагами, определяемыми SiglecF. Затененные гистограммы представляют собой элементы управления изотипами. Данные взяты из одного из трех независимых экспериментов с 3-4 мышами на эксперимент.

G. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) экспрессии CD11c с помощью SiglecF-определенного CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов из перевариваемых легких взрослых неманипулятивных мышей Cre ^— или Cre ⁺.Символы представляют отдельных мышей с 4 мышами в группе. Данные взяты из как минимум 5 независимых экспериментов. Планки погрешностей представляют S.D. Односторонний дисперсионный анализ с последующим пост-тестом множественных сравнений Тьюки. *** p <0,001, **** p <0,0001.

Неспособность альвеолярных макрофагов мышей Cre ⁺ экспрессировать SiglecF предполагает, что тканеспецифическая программа дифференцировки этих клеток может быть изменена дефицитом Egr2 .Следовательно, чтобы установить глобальные эффекты делеции Egr2 на дифференцировку альвеолярных макрофагов, мы затем выполнили объемную последовательность РНК CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов из перевариваемых легких мышей Cre ^— и Cre ⁺ ( с использованием только макрофагов SiglecF ^— от мышей Cre ⁺, чтобы исключить мешающие эффекты EGR2-достаточных альвеолярных макрофагов) ( Дополнительная фигура 4 ). Беспристрастная кластеризация подтвердила, что биологические реплики из каждой группы были очень похожими (, фиг. 3A, ), а анализ дифференциальной экспрессии генов (DEG) показал, что 858 генов дифференциально экспрессировались, по крайней мере, в 2 раза (417 и 441 гены подавлялись и подавлялись, соответственно) ( Дополнительная таблица 2 ).В соответствии с нашим анализом проточной цитометрии, Siglec5 , который кодирует SiglecF, был одним из наиболее подавляемых генов в альвеолярных макрофагах с дефицитом Egr2 ( Рисунок 3B ). Многие из наиболее дифференциально экспрессируемых генов составляли часть набора генов альвеолярных макрофагов, идентифицированного в нашем анализе scRNA-seq. Более того, примерно 30% основной сигнатуры альвеолярных макрофагов, идентифицированной консорциумом ImmGen (1) , было изменено дефицитом Egr2 (32 гена) ( Рисунок 3B, C ), включая экспрессию Spp1, Epcam, Car4 и Fabp1 , все из которых были подтверждены с помощью проточной цитометрии или количественной ПЦР ( Рисунок 3D, E ).Подавляющее большинство этих «сигнатурных» генов подавлялось в макрофагах, дефицитных по Egr2 , по сравнению с их аналогами с достаточным количеством Egr2 . Анализ генной онтологии (GO) показал, что основными путями, на которые влияет дефицит Egr2 , были «хемотаксис», «клеточный хемотаксис» и «процесс иммунной системы» ( Дополнительная таблица 3 ). В соответствии с этим, экспрессия хемокиновых рецепторов, таких как Ccr2 и Cx3cr1 , была повышена в альвеолярных макрофагах мышей Cre ⁺ по сравнению с их аналогами Cre ^— ( Рисунок 3F ).Гены, кодирующие механизм презентации антигена, такой как h3-Aa, h3-Eb1, Ciita и Cd74 , также были активированы в альвеолярных макрофагах мышей Cre ⁺. Параллельно наблюдалась значительно более высокая экспрессия MHCII на уровне белка в альвеолярных макрофагах с дефицитом Egr2 (, фиг. 3F, ). Действительно, более 50 генов, активированных в Egr2 дефицитных альвеолярных макрофагах, были генами, которые определяли интерстициальные макрофаги в нашем анализе scRNA-seq, включая Cd63, Mafb, Mmp12 и Msr1 ( Рисунок 3D , Дополнительная таблица) .Таким образом, абляция EGR2 делает альвеолярные макрофаги транскрипционно более похожими на их интерстициальные аналоги.

B. Тепловая карта, показывающая экспрессию 30 наиболее дифференциально экспрессируемых генов альвеолярными макрофагами от мышей Cre ^— и Cre ⁺.Каждый столбец представляет собой биологическую копию с четырьмя мышами на группу. Гены, выделенные красным, появляются в «основной сигнатуре» альвеолярных макрофагов, как определено ImmGen Consortium (1) .

D. Экспрессия Epcam , Spp1 и Cd63 из набора данных RNA-seq ( левые панели ), репрезентативная проточная цитометрическая проверка EpCAM, Spp1 (технология мРНК), обнаруженная с помощью технологии PrimeFlow Экспрессия CD63 ( средние панели ) и репликация данных по экспрессии MFI каждого из этих маркеров альвеолярными макрофагами от взрослых неманипулированных мышей Cre ^— и Cre ⁺.Символы представляют отдельных мышей, а данные взяты из одного из двух независимых экспериментов с 5 (Cre ^—) и 4 (Cre ⁺) мышами на группу. Тест Стьюдента t , ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

E. Экспрессия Siglec5 , Car4 и Fabp1 из набора данных RNA-seq ( левые панели ) и проверка методом проточной цитометрии (SiglecF) или qPCR ( Car4 , Car4 , Car4 ) . Символы представляют отдельных мышей, а данные для SiglecF взяты из одного из по меньшей мере 10 независимых экспериментов с 5 (Cre ^—) и 4 (Cre ⁺) мышами на группу.Данные для Car4 и Fabp1 представляют 2 (Cre ^—) и 4 (Cre ⁺) мыши на группу. Студенческий тест t , **** p <0,0001.

F. Экспрессия Ccr2 , Cx3cr1 и h3-Aa из набора данных RNA-seq и репликация данных экспрессии MFI CCR2, CX3CR1 и MHCII, как определено с помощью проточной цитометрии. Символы представляют отдельных мышей, а данные взяты из одного из двух независимых экспериментов с 5 (Cre ^—) и 4 (Cre ⁺) мышами на группу.Тест Стьюдента t , ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

G. Репликация данных MFI для экспрессии CD11a и TREM1, как определено с помощью проточной цитометрии. Символы представляют отдельных мышей, а данные взяты из одного из двух независимых экспериментов с 5 (Cre ^—) и 4 (Cre ⁺) мышами на группу. Тест Стьюдента t , ** p <0,01, **** p <0,0001.

H. Абсолютное количество CD11c ^hi CD11b ^— альвеолярных макрофагов, присутствующих в БАЛ взрослых неманипулированных мышей Cre ⁺, относительно их численности в однопометниках Cre ^—.Символы представляют отдельных мышей, а данные объединены из трех независимых экспериментов с 15 (Cre ^—) и 12 (Cre ⁺) мышами на группу.

Дальнейший фенотипический анализ выявил сниженную экспрессию маркеров «ядра сигнатуры» альвеолярных макрофагов TREM1 и CD11a на уровне белка в контексте дефицита Egr2 ( фигура 3G ). Экспрессия EpCAM и CD11a участвует в регуляции адгезии и патрулирования эпителия легких альвеолярными макрофагами (25) .Интересно, что хотя мы обнаружили эквивалентное количество альвеолярных макрофагов среди перевариваемых тканей, мы получили неизменно более высокое количество альвеолярных макрофагов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) мышей Cre ⁺, предполагая, что программа дифференцировки, зависящая от EGR2, может контролировать способность альвеолярного лаважа. макрофаги прикрепляются к клеткам своей ниши в дыхательных путях и взаимодействуют с ними ( Рисунок 3H ).

У людей с мутациями в EGR2 развиваются периферические невропатии из-за решающей роли EGR2 в функции клеток Шванна (26) .Однако многие из этих людей также часто сталкиваются с респираторными осложнениями, включая рецидивирующие пневмонии и / или рестриктивные заболевания легких, а в некоторых случаях — дыхательную недостаточность (26) . Причина респираторной недостаточности у этих людей остается невыясненной. Чтобы определить, могут ли изменения в поведении альвеолярных макрофагов способствовать этому, мы затем проверили функцию альвеолярных макрофагов с дефицитом Egr2 . Основная гомеостатическая функция альвеолярных макрофагов — регуляция легочного сурфактанта, а отсутствие альвеолярных макрофагов приводит к развитию легочного альвеолярного протеиноза (PAP) (8-10, 27, 28) .Однако дефицит Egr2 не приводил к спонтанному PAP, так как не было различий в уровнях общего белка в жидкости БАЛ у мышей Cre ⁺ и Cre ^— в возрасте 4 или более 9 месяцев. при котором PAP обнаруживается у Csf2rb ^{— / —} мышей (28) ( Рисунок 4A, ). Однако эти результаты были сбиты с толку тем фактом, что большинство альвеолярных макрофагов у старых (> 9 месяцев) мышей Cre ⁺ теперь было достаточно EGR2, при этом большинство клеток экспрессировали высокие уровни SiglecF (, фиг. 4B, C ).Эти данные свидетельствуют о том, что клетки, избежавшие рекомбинации Cre, могут иметь конкурентное преимущество перед своими аналогами с дефицитом EGR2, и действительно, абсолютное количество альвеолярных макрофагов SiglecF ⁺ больше не различается между старыми мышами Cre ^— и Cre ⁺. ( Рисунок 4D ). Эти данные согласуются с другими исследованиями, в которых отмечается возрастное повторное заселение альвеолярной ниши Cre «беглецами» у мышей Lyz2 ^Cre (11) .Примечательно, однако, что это предпочтительное увеличение количества «беглецов», достаточных для EGR2, не связано с различиями в уровне пролиферации подмножеств, определенных для EGR2, с идентичными частотами Ki67 ⁺ клеток среди макрофагов с достаточным и недостаточным для EGR2 у молодых взрослых. и старых мышей (, фиг. 4E, ).

B. Репрезентативная экспрессия SiglecF и EGR2 с помощью CD11c ^hi CD11b ^lo макрофагов и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) EGR2 с помощью SiglecF-определенного CD11c ^hi CD11b ^lo макрофагов, полученных от 11-12 месяцев старые Cre ^— или Cre ⁺ мышей. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные получены от 5 мышей на группу, взятых из двух независимых когорт старых мышей. Односторонний дисперсионный анализ с последующим пост-тестом множественных сравнений Тьюки. ** p <0,01, *** p <0,001.

C. Частота клеток SiglecF ⁺ среди макрофагов CD11c ^hi CD11b ^lo, полученных от мышей Cre ^— или Cre ⁺ в возрасте 11-12 месяцев. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные получены от 7 мышей в группе, взятых из трех независимых когорт старых мышей.Непарный тест Стьюдента t -тест, ** p <0,01

D. Репрезентативная экспрессия CD11c и CD11b с помощью Ly6C ^lo CD64 ⁺ макрофагов, полученных от Cre ^— или Cre ^{+ в возрасте 11-12 месяцев} мышей. Символы представляют отдельных мышей, а ошибка — s.d. Данные представляют 7 мышей на группу, объединенную из трех независимых когорт старых мышей.

E. Частота Ki67 ⁺ клеток среди SiglecF-определенных CD11c ^hi CD11b ^lo макрофагов, полученных от мышей Cre ^— или Cre ⁺ в возрасте 8 недель или 11-12 месяцев.Символы представляют отдельных мышей, а ошибка — s.d. Данные представляют 7 (Cre ⁺) или 8 (Cre ^—) мышей на группу (8-недельные мыши) или 5 мышей на группу (старые мыши), объединенные из двух независимых экспериментов.

G. Уровни бактерий (колониеобразующие единицы, КОЕ) в ЖБАЛ мышей Cre ^— или Cre ⁺ через 14 часов после заражения.Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные взяты от 10 (Cre ⁺) или 12 (Cre ^—) мышей на группу, объединенных из трех независимых экспериментов. Тест Манна-Уитни, * p <0,05.

H. Частота и абсолютное количество CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов в жидкости БАЛ Cre ^— или Cre ⁺ мышей через 14 часов после заражения. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные взяты от 10 (Cre ⁺) или 11 (Cre ^—) мышей на группу, объединенных из трех независимых экспериментов.Тест Манна-Уитни, * p <0,05.

Пытаясь обойти смешанные эффекты этих беглецов, мы создали второй штамм для удаления Egr2 из макрофагов путем скрещивания мышей Egr2 ^{fl / fl} с мышами, экспрессирующими «улучшенную» рекомбиназу Cre под контролем эндогенных Промотор Fgcr1 ( Fcgr1 ^iCre (3) ).Используя Fcgr1 ^iCre. Rosa26 ^LSL-RFP репортерных мышей, мы подтвердили, что этот подход привел к эффективной рекомбинации Cre в альвеолярных макрофагах, а также в других тканевых макрофагах, но не в других лейкоцитах ( Дополнительная фигура 5A ). Важно отметить, что альвеолярные макрофаги из Fcgr1 ^iCre. Мыши Egr2 ^{fl / fl} фенокопировали мышей из Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей ( дополнительный рисунок 5B ), но частота беглецов Cre была заметно ниже у Fcgr1 ^iCre. Egr2 ^{fl / fl} мышей по сравнению с Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей ( дополнительная фигура 5C, D ). Несмотря на это, мы не обнаружили развития протеиноза у Fcgr1 ^iCre. Egr2 ^{fl / fl} мышей по сравнению с их контрольными однопометниками ( дополнительная фигура 5E ). В соответствии с этим, дефицит Egr2 практически не влияет на экспрессию генов, связанных с захватом и метаболизмом липидов, которые характерны для нормальных альвеолярных макрофагов (9) ( Рисунок 4F ).Таким образом, хотя EGR2 незаменим для фенотипической идентичности альвеолярных макрофагов, он, по-видимому, незаменим для регулирования манипуляции с липидами.

Затем мы попытались определить, контролирует ли EGR2-зависимая дифференцировка защитные иммунные функции альвеолярных макрофагов. Для этого мы заразили Cre ^— ( Egr2 ^{fl / fl}) мышей и Cre ⁺ ( Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl}) мышей 1 × 10 ⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) Streptococcus pneumoniae , основано на предыдущей работе, показывающей, что альвеолярные макрофаги дикого типа эффективно устраняют инфекцию при этой дозе (30, 31) .Это показало, что у большинства мышей Cre ^— (8/12) инфекция исчезла через 14 часов после заражения, тогда как у большинства мышей Cre ⁺ (8/10) в этот момент времени обнаруживались бактерии в дыхательных путях ( Рисунок 4G ). Важно отметить, что неспособность удалить бактерии не отражала потерю резидентных в ткани макрофагов, которая может произойти во время воспаления или инфекции, поскольку альвеолярные макрофаги продолжали доминировать в дыхательных путях как у мышей Cre ⁺, так и у Cre ^— ( Рисунок 4H ). .Однако наш анализ РНК-seq показал, что экспрессия генов, кодирующих молекулы для распознавания, опсонизации и уничтожения бактерий, включая Colec12, Wfdc10, C3 и Marco , последний из которых, как было показано, необходим для иммунитета к S. pneumoniae (32) , были значительно снижены в Egr2 -дефицитных альвеолярных макрофагах ( Рисунок 4I ). Таким образом, EGR2-зависимая дифференцировка имеет решающее значение для оснащения альвеолярных макрофагов механизмами захвата и уничтожения пневмококков.

Альвеолярные макрофаги происходят из фетальных моноцитов, которые засевают развивающееся легкое в позднем гестационном периоде (8) . Чтобы определить точку, в которой происходит первая экспрессия EGR2, мы оценили экспрессию EGR2 макрофагами желточного мешка E10.5, макрофагами в эмбриональном легком (E16.5) и CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярными макрофагами в неонатальных и легкое взрослого с использованием базы данных ImmGen.Это показало, что Egr2 отсутствовал в макрофагах желточного мешка и макрофагах в эмбриональном легком на ст. E16.5, но он экспрессировался как неонатальными, так и взрослыми альвеолярными макрофагами ( Рисунок 5A ), что позволяет предположить, что он индуцируется во время альвеоляризации в неонатальный период. В соответствии с этим мы обнаружили высокую экспрессию EGR2 на уровне белка неонатальными (d1) CD64 ⁺ легочными макрофагами (иногда называемыми «преальвеолярными макрофагами») у мышей Cre ^—; как и ожидалось, эта экспрессия была эффективно удалена у мышей Cre ⁺ (, фиг. 5B, C ).Важно отметить, что моноциты Ly6C ^hi в легких неонатальных мышей d1 лишены какой-либо экспрессии EGR2 ( фиг. 5B, C ), что усиливает избирательность экспрессии EGR2 даже на этой высокодинамичной стадии развития миелоидных клеток в легких. В соответствии с нашим анализом зрелых альвеолярных макрофагов у взрослых мышей, делеция Egr2 не влияла на частоту и абсолютное количество преальвеолярных макрофагов ( Рисунок 5D ). Однако фенотипические различия уже были очевидны для Cre ⁺ ( Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl}) на этой стадии со сниженной экспрессией CD11c и SiglecF, которая сохранялась во взрослой жизни ( фиг. 5E, F ). Параллельно, экспрессия EpCAM отсутствовала в альвеолярных макрофагах в неонатальном периоде и постепенно повышалась с возрастом в зависимости от EGR2 (, фиг. 5F, ). Экспрессия CD11b, которая подавляется в зрелых альвеолярных макрофагах, была обнаружена на преальвеолярных макрофагах как у мышей Cre ^—, так и у Cre ⁺, и она снижалась в одинаковой степени с возрастом в обеих линиях.

B. Репрезентативная экспрессия Ly6C и CD64 живыми CD45 ⁺ CD3 ^— CD19 ^— Ly6G ^— клеток из легких необработанного новорожденного Cre ^— ( Egr2 fl / ) или Cre ⁺ ( Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl}) мышей. Данные объединены из одного из двух проведенных независимых экспериментов.

C. Гистограммы показывают репрезентативную экспрессию EGR2 с помощью CD64 ⁺ «преальвеолярных макрофагов» и моноцитов Ly6C ^hi из легких необработанного новорожденного Cre ^— ( Egr2 ^{fl / fl}) fl / fl Cre ⁺ ( Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl}) мышей, и гистограмма показывает среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) экспрессии EGR2 этими клетками.

E. FACS-графики показывают репрезентативную экспрессию CD11c и SiglecF CD64 ⁺ «преальвеолярными макрофагами» мышей в B , а гистограмма показывает MFI экспрессии CD11c, SiglecF и CD11b этими клетками.Символы обозначают отдельных мышей. Данные объединяют из двух независимых экспериментов с 4 (Cre ^—) или 8 (Cre ⁺) мышами на группу. Непарный тест Стьюдента t , ** p <0,01, **** p <0,0001

F. MFI экспрессии CD11c, SiglecF, CD11b и EpCAM (относительно клеток d5 Cre ^—) с помощью CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов, полученных из необработанных Egr2 ^{fl / fl} (Cre ^—) или Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) мышей указанного возраста. Символы обозначают отдельных мышей. Цветные * обозначают значимость между d5 и 3 и 5 неделями в пределах данных Cre ^— (синий) и Cre ⁺ (красный). Данные объединены из двух независимых экспериментов с 4-9 мышами в группе. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Тьюки, **** p <0,0001

H. Репрезентативная экспрессия EGR2 и SiglecF с помощью CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов, полученных из легких новорожденных (d8) Fcgr1 ^iCre. Tgfbr2 ^{fl / fl} и Cre ^— и Tgfbr2 ^{fl / +} контрольные однопометники. Столбчатые диаграммы показывают средние частоты CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов всех Ly6C ^lo CD64 ⁺ клеток ( верхних ) и клеток EGR2 ⁺ среди CD11c ^hi lo CD macropha ( нижний ).Символы обозначают отдельных мышей. Данные объединены из двух независимых экспериментов с 3-7 мышами в каждой группе. **** p <0,0001 (односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом множественных сравнений Тьюки).

I. Репрезентативная экспрессия EGR2 ( слева, ) и MFI EGR2 ( справа, ) очищенными с помощью FACS моноцитами Ly6C ^hi, культивированными in vitro с рекомбинантным CSF-1 (20 нг / мл) или CSF -2 (20 нг / мл) в течение пяти дней. Символы представляют моноциты, изолированные от отдельных мышей, а горизонтальные линии представляют собой среднее значение.Данные взяты от 6 мышей Cre ^— ( Egr2 ^{fl / fl}) или 3 Cre ⁺ ( Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl}) мышей на группу, объединенных из двух независимых экспериментов. Двусторонний дисперсионный анализ с последующим тестом множественных сравнений Тьюки, **** p <0,0001. Цветные * обозначают значимость между CSF-1 и CSF-2 в данных Cre ^— (синий) и Cre ⁺ (красный).

Далее мы приступили к определению факторов окружающей среды, которые определяют выражение EGR2. Многие исследования с использованием систем культивирования in vitro описывают экспрессию EGR2 как особенность «альтернативно активированных» макрофагов, зависящую от передачи сигналов IL-4R (33–35) . Важно отметить, что экспрессия EGR2 альвеолярными макрофагами не зависела от передачи сигналов IL-4R (фиг.5G и дополнительная фигура 5F ), как и ключевые зависимые от EGR2 фенотипические признаки, такие как экспрессия SiglecF и EpCAM ( дополнительная фигура 5F ).Недавно было показано, что TGF-β является критическим для развития альвеолярных макрофагов (11) , и поэтому мы далее исследовали, управляет ли ось TGF-β-TGF-βR экспрессией EGR2. Для этого мы создали новую линию мышей путем скрещивания мышей Fcgr1 ^iCre с мышами с сайтами LoxP, фланкирующими аллель Tgfbr2 ( Tgfbr2 ^{fl / fl}). В соответствии с решающей ролью TGF-βR в контроле развития альвеолярных макрофагов (11) , в легких новорожденных было мало альвеолярных макрофагов Fcgr1 ^{iCre / +}. Tgfbr2 ^{fl / fl} по сравнению с Fcgr1 ^{+ / +}. Tgfbr2 ^{fl / fl} и Fcgr1 ^{iCre / +}. Tgfbr2 ^{fl / +} контролы ( Рисунок 5H ). Поразительно, что в то время как альвеолярные макрофаги CD11c ⁺ CD11b ^lo экспрессировали высокие уровни EGR2 в контрольных группах, экспрессия EGR2 была в значительной степени отменена в Fcgr1 ^{iCre / +}. Tgfbr2 ^{fl / fl} мышей, демонстрируя, что передача сигналов TGF-βR жизненно важна для индукции EGR2 in vivo .Как Fcgr1 ^{iCre / +}. Tgfbr2 ^{fl / fl} развились фатальные судороги в возрасте от 14 до 21 дня, что, возможно, отражает незаменимую роль TGF-βR в контроле активности микроглии. (37–39) , мы не смогли провести дальнейшие анализы с использованием этого штамма .

Учитывая центральную роль CSF-2 в развитии альвеолярных макрофагов, мы также оценили роль CSF-2 в управлении экспрессией EGR2 с использованием системы культивирования in vitro , в которой моноциты Ly6C ^hi из костного мозга мыши были FACS- очищены и культивированы с рекомбинантным CSF-1 или CSF-2.Это показало, что CSF-2 также способен управлять экспрессией EGR2 в этой системе (, рис. 5I, ). Учитывая, что передача сигналов CSF-2R и TGF-βR, как известно, индуцирует экспрессию PPAR-γ (9, 11) , мы затем определили, находится ли PPAR-γ (кодируемый Pparg ) выше EGR2. Анализ опубликованного набора данных, сравнивающий профиль транскрипции -достаточного Pparg и-дефицитного макрофагов легких, выявил значительное подавление (изменение в 2,1 раза) Egr2 в контексте дефицита Pparg ( Рисунок 5j ).Напротив, экспрессия Pparg не была затронута в альвеолярных макрофагах из Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей ( фиг. 5K ), что позволяет предположить, что EGR2 находится ниже PPAR-γ. Другой фактор транскрипции, участвующий в контроле дифференцировки альвеолярных макрофагов, — это C / EBPβ (14) , и было показано, что EGR2 модулирует C / EBPβ in vitro (33) . В наших руках дефицит Egr2- привел к снижению экспрессии C / EBPβ на мРНК (, фиг. 5K, ) и уровне белка (, дополнительная фиг. 5G, ).Взятые вместе, эти данные подтверждают предположение о том, что экспрессия EGR2 альвеолярными макрофагами индуцируется TGF-β и CSF-2 PPAR-γ-зависимым образом в неонатальном периоде, и это, в свою очередь, индуцирует экспрессию C / EBPβ, чтобы управлять тканями. специфическая дифференциация.

Учитывая наблюдение, что альвеолярные макрофаги, достаточные для EGR2, начинают доминировать над Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) в воздушном пространстве мышей, мы затем намеревались определить, создает ли делеция EGR2 внутреннее конкурентное преимущество альвеолярных макрофагов.С этой целью мы создали смешанных химерных мышей костного мозга путем воссоздания смертельно облученных мышей WT (CD45.1 ⁺ /.2 ⁺) с соотношением WT 1: 1 (CD45.1 ⁺) и либо Cre ^— ( Egr2 ^{fl / fl}) или Cre ⁺ ( Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl}) (CD45.2 ⁺) клетки костного мозга ( Рисунок 6A ). Через 8 недель после восстановления мы обнаружили, что Egr2 с дефицитом (Cre ⁺) и Egr2 достаточным (Cre ^—) костного мозга вносили равный вклад в моноциты и нейтрофилы крови (данные не показаны), как и в пулы. моноцитов, интерстициальных макрофагов и субпопуляций дендритных клеток в легких ( Рисунок 6B, C ).Напротив, альвеолярные макрофаги были получены почти исключительно из WT BM у химерных мышей WT: Cre ⁺, тогда как они были получены в равной степени из обоих источников BM у химерных мышей WT: Cre ^— ( Рисунок 6B-D ). Смешанная химерная модель BM также подтвердила, что фенотипические и морфологические различия наблюдались у интактного Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей были обусловлены внутренней потерей EGR2 клетками, а не эффектами дефицита Egr2 на легочную среду ( фиг. 6E, F ).Мы также использовали эту систему для подтверждения сниженной экспрессии C / EBPβ альвеолярными макрофагами, происходящими от Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) костный мозг ( Рисунок 6F ). Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что присущий клетке EGR2 необходим для дифференцировки альвеолярных макрофагов и повторного заселения альвеолярной ниши после радиационно-индуцированного истощения.

B. Репрезентативная экспрессия CD11c и CD11b с помощью Ly6C ^lo CD64 ⁺ макрофагов среди живых CD45 ⁺ CD3 ^— CD19 ^— Ly6G ^— CD103 905 — 935 ) и репрезентативная экспрессия CD45.1 и CD45.2 от CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов ( нижние панели ) от химерных мышей WT: Cre ^— или WT: Cre ^—.

C. Вклад Egr2 ^{fl / fl} BM в указанные популяции миелоидных клеток легких у химерных мышей WT: Cre ⁺ относительно мышей WT: Cre ^—. Химеризм был нормализован для моноцитов крови Ly6C ^hi до нормализации Cre ⁺ до Cre ^—.Символы обозначают отдельных мышей. Данные получены от 12 (WT: Cre ⁺) или 13 (WT: Cre ^—) мышей на группу, объединенных из двух независимых экспериментов. Студенческий тест t с поправкой Холма-Сидака, **** p <0,0001.

F. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) экспрессии CD11c, SiglecF, EpCAM и C / EBPβ посредством WT- и Egr2 ^{fl / fl} -производных альвеолярных макрофагов в WT: Cre ^— или WT: Cre ^— химерных мышей. Символы обозначают отдельных мышей.Данные получены от 10 мышей на группу из двух проведенных экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с последующим пост-тестом множественных сравнений Тьюки, **** p <0,0001.

Утрата резидентных макрофагов в тканях является частым последствием воспаления, в том числе в легком (39) . Таким образом, учитывая, что макрофаги с дефицитом Egr2 не смогли восполнить альвеолярную нишу после лучевой терапии, мы затем попытались определить, играет ли EGR2 роль в репопуляции макрофагов после повреждения легких.Химиотерапевтический агент блеомицин представляет собой обычную модель хронического повреждения легких и саморазрешающегося легочного фиброза (40) , который характеризуется первоначальной потерей альвеолярных макрофагов во время воспалительной фазы (день 7) с последующей репопуляцией во время фиброза и разрешением. фазы (начиная с 14-го дня) ( Рисунок 7A ). Репопуляция макрофагов после травмы может происходить с помощью двух механизмов: in situ пролиферации резидентных клеток и / или пополнения моноцитами, происходящими из костного мозга.Чтобы определить, вносят ли полученные из костного мозга моноциты вклад в компартмент альвеолярных макрофагов после повреждения, вызванного блеомицином, мы использовали химерных мышей с защищенной тканью костного мозга для оценки кинетики восполнения, не подвергая легкие дополнительному воздействию ионизирующего излучения ( Рисунок 7B ). В соответствии с предыдущими исследованиями (41) , мы обнаружили, что инстилляция блеомицина приводит к прогрессивной замене резидентных альвеолярных макрофагов клетками, производными от BM, при этом весь компартмент альвеолярных макрофагов заменяется через 32 недели после травмы ( Рисунок 7B ).Интересно, что недавно появившиеся альвеолярные макрофаги, происходящие из моноцитов, экспрессировали низкие промежуточные уровни SiglecF, при этом приобретение SiglecF требует длительного пребывания в дыхательных путях ( Рисунок 7C) .

A. Абсолютное количество альвеолярных макрофагов через 1 и 3 недели после введения блеомицина или контроля носителя PBS. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединяют из двух независимых экспериментов в каждый момент времени с 13-15 мышами в группе. Тест Стьюдента t с поправкой Холма-Сидака, *** p <0,001.

B. Химеризм альвеолярных макрофагов, не являющихся хозяевами, у химерных мышей с защищенной тканью костного мозга через 1, 3 или 32 недели после введения блеомицина или контрольного носителя PBS. Химеризм нормализован до моноцитов крови Ly6C ^hi. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединяют из двух независимых экспериментов в каждый момент времени с 13-15 мышами в группе.Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Тьюки. *** p <0,001, **** p <0,0001.

C. Экспрессия SiglecF с помощью CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов из легких мышей в B . через 1 и 32 недели после введения блеомицина или PBS. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные взяты из одного из двух независимых экспериментов в каждый момент времени с 4 мышами в группе. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Тьюки.** p <0,01, **** p <0,0001.

D. Репрезентативная экспрессия CD11c и CD11b клетками CD11c ^hi CD64 ⁺, полученными с помощью BAL от мышей WT через две недели после инстилляции блеомицина или контроля носителя ( слева) . График показывает среднюю частоту альвеолярных макрофагов CD11b ⁺ ( справа ). Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединяют из двух независимых экспериментов с 7 (Cre ^—) или 10 (Cre ⁺) мышами на группу.Тест Манна-Уитни, *** p <0,001.

F. Экспериментальная схема индукции для экспериментальной схемы. Повреждение легких и введение тамоксифена в Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +} мышей с картированием судьбы. На нижних графиках показаны уровни рекомбинации в моноцитах Ly6C ^hi, интерстициальных макрофагах CD64 ⁺ и альвеолярных макрофагах из Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +} мышам вводили блеомицин или контрольный носитель. Репрезентативная экспрессия CD11c, SiglecF и CD11b с помощью RFP ⁺ (красный) или RFP ^— (серый) клеток, присутствующих в ЖБАЛ Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +} мышей через 3 недели после инстилляции блеомицина или носителя. Графики показывают среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) экспрессии CD11c и SiglecF клетками RFP ⁺. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Тест Манна-Уитни, *** p <0,001.

Далее мы исследовали этот процесс, чтобы определить, могут ли интерстициальные макрофаги, которые накапливаются в паренхиме легких во время повреждения, впоследствии созреть в альвеолярные макрофаги во время восстановления ткани (41, 42) . Действительно, во время фазы выздоровления мы отметили присутствие клеток с особенностями как альвеолярных, так и интерстициальных макрофагов (CD11c ^hi CD11b ⁺ MHCII ⁺ CD64 ^hi) в жидкости БАЛ ( Рисунок 7D ). ), и эти клетки экспрессировали промежуточные уровни SiglecF (, фиг. 7E, ), что указывает на недавнее происхождение моноцитов.Для более непосредственного изучения взаимосвязи этих промежуточных клеток с интерстициальными макрофагами мы выполнили исследования картирования судеб с использованием Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +} репортерных мышей, у которых введение тамоксифена приводит к необратимой экспрессии RFP клетками, экспрессирующими CX3CR1 (43, 44) ( Рисунок 7F ). Интерстициальные макрофаги характеризуются высокой экспрессией CX3CR1, и введение тамоксифена привело к маркировке 40-50% интерстициальных макрофагов как в здоровом легком, так и на 21 день после введения блеомицина ( фиг. 7F ).В Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +} рекомбинации не наблюдалось. Rosa26 ^{LSL-RFP / +} мышей в отсутствие тамоксифена ( дополнительная фигура 6A ). Хотя очень низкие уровни рекомбинации были обнаружены в контрольных альвеолярных макрофагах, четкая популяция клеток RFP ⁺ могла быть обнаружена в БАЛ реципиентов блеомицина после лечения тамоксифеном (, фиг. 7F, ). Поскольку моноциты плохо помечены в этой системе и уровни Cx3cr1 не изменились в bona fide резидентных альвеолярных макрофагах в ответ на лечение блеомицином ( Дополнительная фигура 6B ), эти клетки RFP ⁺ должны представлять моноциты с картированной судьбой. -производные CX3CR1 ⁺ ячеек.В соответствии с этим, клетки RFP ⁺ имели «гибридный» альвеолярный / интерстициальный профиль CD11c ^hi CD11b ⁺ SiglecF ^int, что подтверждает идею о том, что они представляют собой переходные клетки ( Рисунок 7F ). Таким образом, после повреждения, вызванного блеомицином, компартмент альвеолярных макрофагов восстанавливается моноцитами, которые переходят через состояние CX3CR1 ^hi.

), мы исследовали, необходим ли EGR2 для пополнения альвеолярной ниши во время восстановления после повреждения, вызванного блеомицином.Для этого мы вводили блеомицин на Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей и их однопометников Cre ^— и оценили динамику макрофагов в общем переваривании легких. Воспалительная фаза этого расстройства (день 7) была связана с накоплением макрофагов CD11b ⁺, и это происходило в той же степени у мышей Cre ^— и Cre ⁺ ( Рисунок 8A, B ). . В соответствии с недавними сообщениями (45) , популяция интерстициальных макрофагов CD11b ⁺ CD64 ⁺ была гетерогенной во время фиброзной фазы заболевания (d14-d21), с MHCII ⁺ и MHCII ^lo CD36 ⁺ Lyve1 ⁺ подмножеств.Эта картина была идентична между группами Cre ^— и Cre ⁺ ( дополнительная фигура 7A, C ), как и количество моноцитов и нейтрофилов Ly6C ^hi ( дополнительная фигура 7A, B ). Однако мы обнаружили значительное снижение количества эозинофилов в легких Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей по сравнению с Cre ^— однопометников, несмотря на отсутствие у эозинофилов экспрессии EGR2 ( дополнительная фигура 7D, E ).

B. Частота CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов и CD11c ^var CD11b ⁺ клеток от мышей в A. Символы представляют отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединяют по крайней мере из двух независимых экспериментов в каждый момент времени с 3-7 мышами в группе. Двусторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Тьюки, * p <0,05. ** p <0,01, p <0,001, **** p <0,0001

C. Абсолютное количество CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов в легких через шесть недель после инстилляции блеомицина.Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединены из двух независимых экспериментов с 6 (Cre ^—) или 7 (Cre ⁺) мышами в каждой группе. Тест Манна-Уитни, * p <0,05.

D. Частота Ki67 ⁺ CD11c ^hi CD11b ^lo альвеолярных макрофагов в легких через шесть недель после инстилляции блеомицина. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединены из двух независимых экспериментов с 6 (Cre ^—) или 7 (Cre ⁺) мышами в каждой группе.

E. Уровни CCL2, CCL7 и CSF2 в жидкости БАЛ, полученные из Egr2 ^{fl / fl} (Cre ^—) и Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) мышей через шесть недель после инстилляции блеомицина. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединены из двух независимых экспериментов с 6 мышами в группе. Тест Манна-Уитни (CCL2, CCL7), * p <0,05, непарный t-критерий Стьюдента (CSF2), ** p <0.01.

F. Репрезентативная экспрессия RFP с помощью CD11c ^hi CD64 ⁺ альвеолярных макрофагов, присутствующих в БАЛ Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +}. Egr2 ^{fl / fl} и их Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +}. Egr2 ^{+ / +} (белые кружки) или Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +}. Egr2 ^{fl / +} (закрашенные кружки) контроль через 3 недели после инстилляции блеомицина или контроля носителя. График показывает относительную частоту альвеолярных макрофагов RFP ⁺, присутствующих в БАЛ. Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединяются из двух независимых экспериментов в каждый момент времени с 10 ( Egr2 ^{+ / +} [открытые символы] / Egr2 ^{fl / +} [заполненные символы]) или 6 ( Egr2 ^{fl / fl}) на группу.Непарный t-критерий Стьюдента, *** p <0,001.

G. Двухфотонная флуоресцентная визуализация легочной ткани взрослого человека Egr2 ^{fl / fl} (Cre ^—) и Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) мышей через 6 недель после введения блеомицина. Срезы окрашивали CD68, αSMA и DAPI. Автофлуоресценция изображена серым цветом, а коллаген обнаружен генерацией второй гармоники (ГВГ).

H. Количественная оценка фиброзной оценки легочной ткани из Egr2 ^{fl / fl} (Cre ^—) и Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) через 3 или 6 недель после введения блеомицина или контрольных образцов PBS (с 3-недельной временной точки). См. Дополнительный рисунок . Символы представляют отдельных мышей, а ошибка — это S.D. Данные объединяют из двух независимых экспериментов из одного эксперимента с 6 (Cre ^—) или 7 (Cre ⁺) мышами на группу.Двусторонний дисперсионный анализ с последующим тестом множественных сравнений Тьюки, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001.

I. Количественная оценка плотности макрофагов в паренхиме и фиброзных областях легочной ткани из Egr2 ^{fl / fl} (Cre ^—) и Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) через 6 недель после введения блеомицина. См. Дополнительный рисунок 8. Символы представляют отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединяют из двух независимых экспериментов с 6 (Cre ^—) или 7 (Cre ⁺) мышами в каждой группе. T-критерий Стьюдента с поправкой Холма-Сидака для нескольких тестов, * p <0,05.

J. Профиль SSC-A и экспрессия CD45 с помощью BAL, полученного из Egr2 ^{fl / fl} (Cre ^—) и Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) через 6 недель после введения блеомицина. График показывает среднюю частоту клеток CD45 ⁺ среди всех живых одиночных событий.Символы обозначают отдельных мышей, а ошибка — S.D. Данные объединяют из двух независимых экспериментов с 5 (Cre ^—) или 7 (Cre ⁺) мышами на группу. Непарный t-критерий Стьюдента, **** p <0,0001.

K. Общая концентрация белка ( слева ), мутность ( центр ) и репрезентативные изображения ( справа ) жидкости БАЛ из Egr2 ^{fl / fl} (Cre ^—) и Lyz2 ^{Cre / +}. Egr2 ^{fl / fl} (Cre ⁺) через 6 недель после введения блеомицина. Символы обозначают отдельных мышей. Данные объединяют из двух независимых экспериментов из одного эксперимента с 6 (Cre ^—) или 7 (Cre ⁺) мышами на группу. Тест Манна-Уитни, * p <0,05.

Уменьшение количества альвеолярных макрофагов наблюдалось в обеих группах на 7-й день после введения блеомицина. Хотя это начало восстанавливаться к 14-му дню у контрольных мышей Cre ^— ( Egr2 ^{fl / fl)}, этого не произошло у Cre ⁺ ( Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl}), и действительно, компартмент альвеолярных макрофагов оставался значительно сниженным у мышей Cre ⁺ по сравнению с однопометниками Cre ^— даже через 6 недель ( Рисунок 8A-C ), что позволяет предположить, что EGR2 является незаменимым. для репопуляции ниши альвеолярных макрофагов после повреждения, вызванного блеомицином. Отсутствие репопуляции у мышей Cre ⁺, по-видимому, не отражало неспособность макрофагов с дефицитом Egr2 к пролиферации, поскольку доля пролиферирующих клеток Ki67 ⁺ была эквивалентна у мышей Cre ^— и Cre ⁺ ( Рисунок 8D ).Равным образом, это также не отражало нехватку хемоаттрактантов в дыхательных путях для рекрутирования клеток, происходящих из моноцитов, поскольку как CCL2, так и CCL7 были фактически повышены у мышей Cre ⁺ по сравнению с однопометниками Cre ^— ( Рисунок 8E ). Точно так же уровни CSF2 были повышены в ЖБАЛ мышей Cre ⁺, что исключает возможность того, что отсутствие соответствующих факторов роста является ответственной за дефектную дифференцировку альвеолярных макрофагов в отсутствие EGR2 ( фиг. 8E ).Вместо этого эти данные предполагают, что дефицит Egr2 ведет к внутренней неспособности происходящих из костного мозга клеток повторно заселять нишу макрофагов. Чтобы проверить это напрямую, мы пересекли Cx3cr1 ^Cre- ERT2 / +. Rosa26 ^{LSL-RFP / +} мышей с Egr2 ^{fl / fl} мышей для обеспечения временного RFP-мечения экспрессирующих CX3CR1 клеток и дефицита Egr2 у одного и того же животного. Мы вводили тамоксифен в период восстановления альвеолярных макрофагов (от d16 до d21) и оценивали присутствие RFP-меченных клеток среди альвеолярных макрофагов.По сравнению с обработанными тамоксифеном контролями ( Cx3cr1 ^{Cre-ERT2 / +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +}. Egr2 ^{+ / +} или Cx3cr1

5 + Cre- Rosa26 ^{LSL-RFP / +}. Egr2 ^{fl / +} мышей), мы обнаружили заметное снижение частоты альвеолярных макрофагов RFP ⁺ в БАЛ обработанных тамоксифеном Cx3cr1 ^{Cre- +}. Rosa26 ^{LSL-RFP / +}. Egr2 ^{fl / fl} мышей во время восстановления легких ( фигура 8F ), демонстрируя, что EGR2 контролирует посттравматическое репопуляцию альвеолярного макрофагального компартмента клетками CX3CR1 ⁺.

Чтобы определить последствия неспособности клеток с дефицитом Egr2 восстановить альвеолярную нишу, мы оценили фиброзный ответ и последующие процессы восстановления в Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей.Примечательно, что мы не обнаружили различий в степени фиброза или экспрессии ключевых генов, связанных с фиброзом, включая Col3a1 и Pdgfrb между необработанными Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей и их контрольных однопометников Egr2 ^{fl / fl} на 21 день, время, которое считается «пиковым» фиброзом ( фигура 8H, дополнительная фигура 8A, B ). Однако анализ через 6 недель после блеомицина показал, что в то время как мыши Cre ^— в значительной степени восстановили свои легкие, мыши Cre ⁺ имели дефектную репарацию, о чем свидетельствует стойкий фиброз и архитектурные повреждения ( Рисунок 8G, H, дополнительная фигура 8A ). .Это сопровождалось повышенным количеством макрофагов в паренхиме легких ( фигура 8I, дополнительная фигура 8A, ) и персистентностью паренхиматозных макрофагов, коррелирующей со степенью фиброза ( дополнительная фигура 8C, ). Кроме того, не удалось восстановить гомеостаз в дыхательных путях. Проточный цитометрический анализ жидкости БАЛ показал, что лейкоциты CD45 ⁺ составляли только 10% всех событий у мышей Cre ⁺ по сравнению с ~ 60% у их однопометников Cre ^— ( Рисунок 8J ).Подавляющее большинство фракции CD45 ^— не смогли экспрессировать маркеры сигнатуры для клеток эпителиального, эндотелиального или фибробластного происхождения, что позволяет предположить, что это может представлять собой клеточный дебрис, который также может быть обнаружен среди перевариваемых веществ в легких ( Дополнительная фигура 9A, B ). Это сопровождалось повышенными уровнями белка и мутности жидкости в БАЛ у мышей Cre ⁺ по сравнению с контрольной группой Cre ^—, что позволяет предположить, что неспособность пополнить нишу альвеолярных макрофагов после травмы была связана с развитием альвеолярного протеиноза (, рис. 8K). ).Таким образом, потеря EGR2-зависимых альвеолярных макрофагов, происходящих из моноцитов, приводит к дефектному восстановлению тканей, стойкому клеточному повреждению и неудачному восстановлению гомеостаза легких.

Учитывая многогранную роль макрофагов в гомеостазе тканей, воспалении и восстановлении тканей, а также во многих хронических патологиях, понимание сигналов окружающей среды и последующих молекулярных путей, которые управляют дифференцировкой макрофагов, является ключевой задачей в области иммунологии.Здесь мы идентифицируем фактор транскрипции EGR2 как избирательную и незаменимую часть тканеспецифической дифференцировки альвеолярных макрофагов легких.

Наш транскриптомный анализ идентифицировал EGR2 как особенность альвеолярных макрофагов легких мышей, результат согласуется с предыдущими исследованиями с использованием объемной транскриптомики для сравнения макрофагов из разных тканей (1, 6) и недавним исследованием с использованием аналогичного подхода на основе scRNA-seq. , которые идентифицировали EGR2, специфически активируемую в альвеолярных, а не интерстициальных макрофагах (46) .Важно, что EGR2 также экспрессируется альвеолярными макрофагами у крыс (47) , и мы показали, что EGR2 является особенностью альвеолярных макрофагов у человека, открытие согласуется с недавним межвидовым анализом (34) . Таким образом, EGR2, по-видимому, представляет собой эволюционно консервативный регулятор транскрипции альвеолярных макрофагов.

В то время как EGR2 участвовал в контроле дифференцировки моноцитов и макрофагов в прошлом, эти исследования часто приводили к противоречивым выводам (19, 20, 34) .Это может отражать тот факт, что в большинстве исследований, изучающих роль EGR2 в дифференцировке моноцитов-макрофагов, использовались системы культивирования in vitro из-за постнатальной летальности глобальных мышей с дефицитом Egr2 (21, 22) . Создавая Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} и Fcgr1 ^iCre. Egr2 ^{fl / fl} мышей, мы избежали этой летальности и допустили делецию EGR2, специфичную для миелоидов и макрофагов, соответственно.Наш анализ показал, что только макрофаги в дыхательных путях были затронуты делецией Egr2 , а наше транскрипционное профилирование и обширная фенотипическая характеристика показали, что EGR2 контролирует большую часть «сигнатуры» альвеолярных макрофагов, включая ключевые фенотипические признаки, такие как SiglecF, EpCAM и TREM1. . Это согласуется с недавним эпигенетическим анализом, показывающим чрезмерную представленность мотивов EGR в генах, определяющих альвеолярные макрофаги (2, 46) . Важно отметить, что хотя предыдущая работа предположила, что существует избыточность между членами семейства EGR, особенно EGR1 и EGR2, мы обнаружили, что на экспрессию Egr1 не влияла недостаточность EGR2 и не удалось спасти дифференцировку альвеолярных макрофагов.Действительно, в соответствии с недавним исследованием (46) , мы обнаружили, что EGR1 экспрессируется на низких уровнях альвеолярными макрофагами, но выше — интерстициальными макрофагами. Таким образом, вполне вероятно, что отдельные члены семейства EGR могут участвовать в дифференцировке анатомически различных макрофагов легких.

Примечательно, что при оценке просто на основе их уникального профиля CD11c ^hi CD11b ^lo, абсолютное количество альвеолярных макрофагов было эквивалентно между Cre ^– у взрослых ( Egr2 ^{fl / fl}) и Cre ^{. +} ( Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl}) мышей. Это могло бы объяснить, почему недавнее исследование лаборатории Надя с использованием независимого штамма Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} мышей пришли к выводу, что EGR2 не требуется для дифференцировки макрофагов (29) . В качестве альтернативы, это может отражать то, что в большинстве их исследований участвовало in vitro, генерировали макрофаги, полученные путем культивирования клеток костного мозга с CSF-1 (29) . Действительно, мы обнаружили, что моноцитов с дефицитом Egr2 созрели в макрофаги одинаково хорошо при культивировании in vitro с CSF-1.Однако, несмотря на то, что сообщалось, что он управляет экспрессией членов семейства EGR, включая EGR2 (20) , в наших руках CSF-1 ведет к плохой активации EGR2 в созревающих макрофагах in vitro . Вместо этого мы определили, что CSF-2 (GM-CSF) является мощным индуктором экспрессии EGR2 в созревающих макрофагах in vitro , что согласуется с почти уникальной зависимостью альвеолярных макрофагов от CSF-2, полученного из альвеолярных эпителиальных клеток, и не CSF-1, для их развития и выживания (8–10) .Однако TG-Fβ также индуцировал EGR2, и мы подтвердили, что TGF-β необходим для развития альвеолярных макрофагов (11) . В самом деле, TGF-β, как было показано, индуцирует экспрессию EGR2 вне клонов моноцитов / макрофагов, таких как эпителиальные клетки молочных желез (49) . Точно, как CSF-2 и TGF-β взаимодействуют, способствуя дифференцировке альвеолярных макрофагов, не совсем понятно, однако они оба индуцируют экспрессию PPAR-γ (9, 11) и альвеолярные макрофаги с дефицитом Pparg , экспрессирующие уменьшенное количество EGR2 (9) , что позволяет предположить EGR2 находится после PPAR-γ.Примечательно, что альвеолярные макрофаги от мышей с генетическим удалением Pparg, Csf2rb или Tgfbr2 (как показано здесь) имеют дефекты в их способности к установлению и самоподдержанию, фенотип, не наблюдаемый у мышей с дефицитом Egr2 . Таким образом, программа, зависящая от EGR2, по-видимому, представляет собой дискретную часть дифференцировки альвеолярных макрофагов, независимо от выживаемости клеток в состоянии здоровья.

EGR2 постоянно упоминается как признак альтернативной активации макрофагов, индуцированной IL-4.Действительно, добавление IL-4 к in vitro макрофаговых культур приводит к усилению регуляции EGR2 и делеции STAT6, расположенной ниже адапторной молекулы в сигнальном каскаде IL-4R, отменяет повышающую регуляцию EGR2 обработанным IL-4, in vitro сгенерировано макрофаги (33–35) . Однако зрелые альвеолярные макрофаги считаются относительно невосприимчивыми к IL-4 (50) , и мы не обнаружили влияния дефицита Il4ra на экспрессию EGR2 в организме, а также не обнаружили повышенную регуляцию EGR2 интерстициальными макрофагами, которые находятся в IL- 4 / ИЛ-13-богатая паренхима легких при фиброзе, индуцированном блеомицином.Т.о., ось IL-4-IL-4R достаточна, но не обязательна, для индукции экспрессии EGR2 in vivo .

В отличие от мышей, дефицитных по Pparg, Csf2rb или Tgfbr2 , у мышей с миелоидной или макрофагальной делецией Egr2 не развился спонтанный альвеолярный протеиноз, что позволяет предположить, что EGR2 не контролирует обработку липидов и метаболическую емкость альгов. Однако у мышей с дефицитом Egr2 обнаружены функциональные недостатки в способности контролировать низкие дозы S.pneumoniae , что предполагает, что EGR2 контролирует иммунные защитные свойства альвеолярных макрофагов. Хотя мы не можем исключить возможность того, что это отражает различия в убивающей способности Egr2 -дефицитных альвеолярных макрофагов, гены, кодирующие, например, на реактивные формы кислорода и азота не повлиял дефицит Egr2 . Вместо этого гены, кодирующие ключевые рецепторы распознавания патогенов и опсонины, значительно подавлялись в отсутствие EGR2. К ним относятся MARCO и компонент C3 комплемента, оба из которых, как было показано, имеют решающее значение для эффективного устранения S.pneumoniae (32, 51). Действительно, опсонизация является критическим фактором в оптимизации бактериального клиренса альвеолярными макрофагами при здоровье и болезни (52) . Таким образом, EGR2-зависимая дифференцировка оснащает альвеолярные макрофаги механизмом для распознавания и устранения пневмококков, и это может объяснять рецидивирующие пневмонии у людей с мутациями в EGR2 (26) . В будущей работе будет важно определить, распространяется ли это на другие респираторные патогены.

Потеря резидентных макрофагов в тканях является частым признаком воспаления или повреждения тканей.Мы показали, что резидентная популяция альвеолярных макрофагов заметно уменьшается после введения блеомицина, химиотерапевтического агента, обычно используемого для генерации фиброза легких. В соответствии с предыдущей работой (41, 53) , мы обнаружили, что основной механизм пополнения макрофагов заключается в рекрутировании происходящих из BM клеток, которые со временем созревают в настоящие альвеолярные макрофаги. Используя картирование генетической судьбы на основе Cx3cr1 , мы также показали, что клетки CX3CR1 ⁺ MHCII ⁺ с гибридным фенотипом могут быть обнаружены в дыхательных путях во время фиброзной фазы повреждения, что позволяет предположить, что интерстициальные макрофаги, происходящие из моноцитов, накапливаются после травма может пополнить нишу альвеолярных макрофагов.Хотя мы не можем исключить, что моноциты попадают в дыхательные пути во время этой фазы, чтобы непосредственно вызвать альвеолярные макрофаги, фенотип переходных клеток RFP ⁺ больше соответствовал фенотипу интерстициальных макрофагов, включая высокие уровни MHCII. Важно отметить, что репопуляция компартмента альвеолярных макрофагов зависела от EGR2, при этом конститутивная делеция EGR2 серьезно затрудняла приживление клеток, происходящих из моноцитов, в нишу альвеолярных макрофагов.Это контрастирует с начальной популяцией развивающейся альвеолярной ниши моноцитами, происходящими из печени плода, где дефицит Egr2 не влияет на развитие альвеолярных макрофагов. Это может указывать на дифференциальную зависимость онтогенетически отличных моноцитов от EGR2 или на присутствие компенсаторных путей во время развития, которые не присутствуют во время репопуляции, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью понять это.

Интересно, что хотя предыдущая работа предполагала, что альвеолярные макрофаги, происходящие из моноцитов, являются ключевыми профиброзными клетками (41, 53) , фиброз, по-видимому, нормально развивался у мышей с дефицитом Egr2 , несмотря на почти полное отсутствие альвеолярных клеток, происходящих из моноцитов. макрофаги.Причина расхождения наших результатов с данными Мишарина и соавт. (41) неясно, но может отражать различия в используемых системах. Например, в исследовании Misharin использовалась зависимость альвеолярных макрофагов от каспазы-8, чтобы препятствовать дифференцировке моноцитов в альвеолярные макрофаги с помощью Lyz2 ^Cre. Casp8 ^{fl / fl} и Itgax ^Cre. Casp8 ^{фл / фл} мышей. Однако делеция каспазы-8 также влияет на способность интерстициальных макрофагов к репопуляции после истощения, что означает, что дефицит Casp8 может иметь более широкое влияние на поведение макрофагов легких, чем нарушение дифференцировки альвеолярных макрофагов, происходящих из моноцитов.Напротив, экспрессия EGR2 ограничена альвеолярными макрофагами, и делеция не влияет на восстановление компартмента интерстициальных макрофагов. Расположение интерстициальных макрофагов в паренхиме, прилегающей к фибробластам, и их продукция митогена фибробластов PDGF-aa, предполагает, что интерстициальные макрофаги, вероятно, являются ключом к фиброзному процессу (42) . Действительно, истощение интерстициальных макрофагов с использованием Cx3cr1 ^Cre-ERT2. Rosa26 ^{Мыши LSL-DTA} уменьшают фиброз легких (42) , хотя, как мы показываем здесь, это также нацелено на клетки CX3CR1 ⁺, которым суждено стать производными моноцитов альвеолярными макрофагами.Тем не менее, наши данные показывают четкую роль макрофагов, происходящих из моноцитов, в процессах восстановления тканей, как Lyz2 ^Cre. Egr2 ^{fl / fl} у мышей не удалось восстановить легкое после травмы, это открытие согласуется с более ранним исследованием с использованием неспецифического, опосредованного клодронатом истощения легочных макрофагов (54) и недавним исследованием, в котором участвуют ApoE-продуцирующие, альвеолярные макрофаги, происходящие из моноцитов, в разрешении фиброза легких (55) . Эти результаты могут помочь объяснить развитие рестриктивной болезни легких у лиц с мутациями в EGR2 (26) .

Пневмония у взрослых (внебольничная пневмония) > Клинические протоколы МЗ РК

Очаговая пневмония дифференциальная диагностика mp3 download (1.4 MB)

QR-код переболевшего COVID-19 — ГБУЗ ЛО «Всеволожская КМБ»

Как получить через госуслуги

Что делать, если переболел официально ковидом, но QR-кода нет

Диагностические траектории предшествующей множественной заболеваемости прогнозируют смертность от сепсиса

Последовательное определение когорты пациентов с сепсисом

Смертность от сепсиса изменилась из-за 231 диагноза

Различные временные траектории заболевания, наблюдаемые в популяции сепсиса

Подмножество из 56 временных траекторий болезни предсказало более плохое состояние здоровья

Злоупотребление алкоголем, диабет и анемия являются ключевыми диагнозами в сети траекторий сепсиса

Сопутствующие заболевания объяснили различия в смертности от сепсиса, зарегистрированные при диабете

Независимая репликация с использованием шведского браузера коморбидности

Дефицит витамина D позволяет прогнозировать наличие инфекций у детей северной Индии: вторичный анализ данных

Абстрактные

Фон

Методы

Результаты

Заключение

Введение

Материалы и методы

Субъект

Определения

Аналитические процедуры

Этика

Статистический анализ

Результаты

Обсуждение

Заключение

Благодарности

Вклад авторов

Список литературы

Новый взгляд на инновации в фармацевтике

Аннотация

Описание

Отдел

Издатель

Ключевые слова

Фактор транскрипции EGR2 незаменим для тканеспецифического импринтинга альвеолярных макрофагов для здоровья и восстановления тканей.

Введение

Результаты

Экспрессия EGR2 является селективным свойством альвеолярных макрофагов

EGR2 требуется для фенотипической идентичности альвеолярных макрофагов

EGR2 контролирует тканеспецифичную программу транскрипции альвеолярных макрофагов

EGR2 контролирует различные функциональные характеристики альвеолярных макрофагов

Экспрессия EGR2 альвеолярными макрофагами зависит от TGFβ и CSF2

Моноциты, полученные из костного мозга, пополняют нишу альвеолярных макрофагов после повреждения легкого

EGR2 незаменим для репопуляции альвеолярных макрофагов и восстановления тканей после повреждения легких.

Обсуждение

Добавить комментарий Отменить ответ