Слияние яйцеклетки со сперматозоидом пронаблюдали с помощью «ЭКО-чипа»
Схема «ЭКО-чипа»
Benjamin Ravaux
Французские ученые разработали микрожидкостное устройство,
предназначенное для изучения слияния сперматозоида и яйцеклетки в процессе
оплодотворения. С его помощью можно наблюдать происходящее в реальном времени и
с высоким разрешением. Отчет о разработке и проведенных наблюдениях подготовлен
к презентации на 60 ежегодном слете Биофизического общества в Лос-Анджелесе.
Для проникновения сперматозоида в яйцеклетку необходимо
слияние их липидных клеточных мембран. Его обеспечивает взаимодействие закрепленного
на гликофосфатидилинозитоле белка Juno на поверхности яйцеклетки и белка Izumo
из суперсемейства иммуноглобулинов на сперматозоиде. Тем не менее, как именно
это взаимодействие влияет на слияние мембран, известно не было.
Чтобы разобраться в этом механизме, исследователи из Высшей
нормальной школы в Париже создали копию мембраны сперматозоида, состоящую из
одних липидов. Выяснилось, что состав этой мембраны таков, что она соединяется
с типичными липидами клеточной мембраны (в том числе яйцеклетки) с минимальными
затратами энергии. При включении в мембрану Izumo исследователи пронаблюдали,
как под действием специфичных для сперматозоидов липидов этот белок
олигомеризуется при контакте с яйцеклеткой.
На второй стадии эксперимента ученые создали микрожидкостное
устройство, которое направляет контакт отдельного сперматозоида с яйцеклеткой в
четко заданное место. Этот «ЭКО-чип» представляет собой многослойный кремниевый
полимер, закрепленный на предметном стекле. Его камеры, содержащие яйцеклетку и
сперматозоиды, соединены отверстием диаметром в 30 миллионных частей метра (0,00003 метра), через
которое может проникнуть только одна мужская половая клетка. Это отверстие
находится в фокусе конфокального микроскопа, позволяющего наблюдать процесс
оплодотворения в реальном времени с высоким разрешением.
С помощью микрожидкостного чипа ученые пронаблюдали
характерный тип движения, присущий наиболее «сильным» сперматозоидам, а также
выяснили, что слияние мембран половых клеток и проникновение мужского генетического
материала внутрь яйцеклетки происходят одновременно. По их
словам, это были лишь первые практические испытания устройства, подтверждающие
его пригодность для изучения процесса оплодотворения. Более подробную картину
взаимодействия мембранных белков и липидов при слиянии клеток, а также
последующего ремоделирования мембраны оплодотворенной яйцеклетки ученые
рассчитывают получить, комбинируя чип с использованием флуоресцентных антител и
других биологических инструментов.
Олег Лищук
Двойное оплодотворение (сингамия и тройное слияние)
Сингамия — объединение спермиев с ядром яйцеклетки.
Тройное слияние — объединение спермия с полярными ядрами центральной клетки.
Входя в зародышевый мешок, пыльцевая трубка изливает свое содержимое в синергиды, при этом одна из них или обе разрушаются. Процесс дегенерации синергид происходит в течение длительного отрезка времени и они сохраняются еще на стадии проэмбрио. Ядра синергид распадаются на отдельные структуры, имеющие сходство с мужскими гаметами; часто их принимают за спермии дополнительных пыльцевых трубок. Обнаружить спермий первой пыльцевой трубки трудно из-за быстроты излияния содержимого пыльцевой трубки в промежуток между яйцевым аппаратом в центральной клетке зародышевого мешка, откуда спермии «расходятся» в противоположных направлениях.
Через 30—40 мин спермии пшеницы попадают в цитоплазму обеих клеток. После проникновения в яйцеклетку спермий в течение 1 ч находится в ее цитоплазме, что дает возможность проследить все дальнейшие фазы его изменений. По пути к ядру яйцеклетки, находящейся в интерфазе, в спермиях становится отчетливо видна их хроматизация. Цитохимическое изучение процесса оплодотворения у ячменя выявило, что в ядре яйцеклетки после его контакта со спермием происходят большие структурные перестройки. Ослабляются связи ДНК с белками и усиливается связь с липидными компонентами и, вероятно, с ядерной мембраной. Хроматин деконденсируется, переходя в диффузное состояние; только после такой перестройки начинается процесс объединения ядер гамет.
У пшениц спермий имеет 2 явно различающихся по форме конца: широкий конец более рыхлый, чем узкий. Погружение спермия и деспирализация его в ядре яйцеклетки, как правило, начинаются с широкого конца, теряющего свои очертания, что особенно явственно наблюдается при слиянии второго спермия с полярными ядрами. Весь процесс объединения спермия с ядром яйцеклетки занимает 5—6 ч. В этом процессе хроматин спермия постепенно деспирализуется, появляются одно или 2 ядрышка, которые сливаются с женским ядрышком, а иногда остаются необъединенными.
Электронно-микроскопические исследования у некоторых форм ячменя показали, что спермии имеют плотное ядро, окруженное цитоплазмой. Последняя содержит органеллы, в основном митохондрии, диктиосомы, рибосомы, ЭР, липидные тела и маленькие вакуоли. Слияние спермиев с яйцеклеткой и центральной клеткой начинается с контакта плазматических мембран. Попав в женские клетки, спермии теряют свою цитоплазму, причем никаких различимых органелл спермиев не обнаружено. Вероятно, при сингамии мужская цитоплазма не входит в яйцеклетку. Слияние ядер спермия с ядром яйцеклетки и полярными ядрами происходит после контакта ядерных мембран и образования мостиков между ними. После окончательного слияния спермия с ядром яйцеклетки зигота длительное время находится в интерфазном периоде, продолжающимся у пшеницы 16—18 ч. В ядре зиготы нельзя отличить мужской хроматин от женского, и поэтому в профазу зигота вступает как единое целое.
Процесс погружения спермия в ядро центральной яйцеклетки сходен с таковым в яйцеклетке, но протекает значительно быстрее. Если в цитоплазме яйцеклетки спермий пшеницы находится около 1 ч, то в цитоплазме центральной клетки — 15—30 мин. Как уже отмечалось, полярные ядра, как правило, до оплодотворения сближены, но не слиты. С началом контакта спермия с полярными ядрами происходит их быстрое объединение, вследствие чего между ними можно наблюдать цитоплазму центральной клетки, которая затем дегенерирует. Наличие цитоплазматических «захватов» может служить показателем начала объединения полярных ядер, которое полностью еще не завершилось. Процесс их объединения со спермием происходит за 1.5—2 ч. У пшеницы через 2—3 ч после опыления, как правило, он уже закончен и в интерфазе видно ядро. Особенность этого процесса в центральной клетке — отсутствие объединения мужских и женских ядрышек в полярных ядрах и раздельное (асинхронное) вступление спермия в профазу внутри первичного ядра эндосперма. Полное объединение хроматина спермия и полярных ядер центральной клетки происходит в метафазе. Этот феномен асинхронного преобразования хроматина мужских и женских гамет во время оплодотворения у некоторых видов растений, в том числе и злаков, является общебиологическим. Некоторые исследователи объясняют его разными темпами прохождения мужскими и женскими гаметами различных периодов митотических циклов.
Темп прохождения сингамии и тройного слияния неодинаков. Вероятно, дело в разных условиях, имеющихся в яйцеклетке и центральной клетке. В полярных ядрах в момент контакта со спермием хроматин находится в диффузном состоянии, поэтому не происходит сложных перестроек, как в яйцеклетке, и процесс объединения совершается быстро. По-видимому, разная скорость процесса объединения спермия с женскими ядрами зависит также от плоидности клеток: яйцеклетка имеет гаплоидный набор хромосом, а центральная клетка — диплоидный. Различные размеры и строение этих 2 клеток обусловливают также и то, что у них и период интерфазы разной длительности: в зиготе — около 17—18 ч, а в первичной клетке эндосперма — всего 0.5—1 ч. Период покоя зиготы характеризуется значительными изменениями структур интерфазного ядра и цитоплазмы, что проявляется в заметном росте зиготы и ее ядра, в характере вакуолизации, в почти полном исчезновении крахмала в амилопластах, в изменении распределения митохондрий и других органелл. В первичной клетке эндосперма в отличие от зиготы в период короткой интерфазы не происходят такие изменения: присутствуют пластиды с крахмальными зернами и т. п. Различная продолжительность интерфазы в этих клетках объясняется, вероятно, разным характером процессов их дедифференциации. Как было отмечено ранее, половые клетки являются высокоспециализированными, а зигота, вступающая в митоз, характеризуется скорее признаками, присущими меристеме, и в определенном смысле тотипотентна. В интерфазный период происходят сложнейшие морфо-структурные преобразования, в результате которых «теряется» специализация, присущая половым клеткам. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение цитоплазмы яйцеклетки у кукурузы до и после оплодотворения выявило изменение поляризации органелл, формирование агрегатов рибосом, увеличение синтеза м-РНК Увеличение числа митохондрий и пластид в зиготе и изменение их внутренней организации свидетельствуют об интенсификации метаболической активности. Разный период покоя в зиготе и первичной клетке эндосперма у некоторых представителей цветковых растений, вероятно, можно объяснить также различным строением этих клеток, которые в свою очередь обусловлены неодинаковым строением семяпочек, завязи и цветка в целом.
Процесс двойного оплодотворения у всех хлебных злаков происходит сходным образом. Различия касаются типов, форм, размеров и строения половых клеток. Так, у кукурузы в зародышевом мешке спермии имеют округлую, несколько вытянутую форму, у ячменя и ржи все половые клетки значительно меньших размеров, чем у пшеницы.
Таким образом, процесс двойного оплодотворения у злаков идет по премитотическому типу, т. е. объединение половых ядер происходит до митоза. Следует отметить, что объединение спермия с полярными ядрами центральной клетки не соответствует классическому премитотическому типу. Первый этап, т. е. объединение спермия с ядрами центральной клетки, происходит до митоза, что соответствует премитотическому типу. Второй этап, т. е. объединение мужского и женского хроматина, не происходит до митоза, поскольку хроматин спермия вступает в профазу раньше, чем хроматин полярных ядер. Полное их объединение происходит в метафазе.
Исходя из этого, можно полагать, что в центральной клетке объединение половых гамет, вероятно, правильнее отнести к промежуточному типу оплодотворения, а весь процесс двойного оплодотворения охарактеризовать все же как премитотический.
Сопряженность процессов сингамии и тройного слияния. Несмотря на различие темпов сингамии и тройного слияния, имеется корреляция в их прохождении. Определенному состоянию яйцеклетки и зиготы всегда соответствует определенное состояние полярных ядер и эндосперма. Так, через 3 ч после опыления в первичной клетке эндосперма пшеницы наступает профаза, а в яйцеклетке происходит объединение спермия с ядром яйцеклетки. Через 7 ч после опыления зигота находится в покое, а в эндосперме прошло первое деление. Эта корреляция мало подвержена влиянию внешних факторов и практически от них не зависит, т. е. детерминирована. Естественно, что имеется определенная амплитуда колебания во времени в процессе двойного оплодотворения. Скорость протекания эмбриологических процессов в целом зависит от внешних условий, поэтому процесс двойного оплодотворения может либо замедляться, либо ускоряться. Нарушение сопряженности процессов сингамии и тройного слияния может проявляться при экстремальных условиях, что часто вызывает аномальное развитие зародыша и эндосперма.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Все о биологии. Понятия, классификации, примеры
Слияние спермия и яйцеклетки (ооцита) заслуженно называют «чудом зачатия»: лишь один из миллиона человеческих спермиев достигает яйцеклетки. Для преодоления чудовищных препятствий на пути к оплодотворению животные используют стратегии, призванные способствовать соединению двух репродуктивных клеток.
Слияние спермия и яйцеклетки
В процессе полового размножения сперматозоид и яйцеклетка двух различных особей должны соединиться, но зачастую обе гаметы разделяет громадное расстояние. Чтобы нарушить оболочку яйца, спермию приходится преодолеть путь, в тысячу раз превышающий его собственную длину. Процесс оплодотворения сходен у всех существ в царстве животных, как заметил в 1875 году немецкий эмбриолог Оскар Хертвиг. Именно он впервые описал слияние мужской и женской гамет морских ежей, которые проявили недюжинную смекалку для достижения успеха.
Оскар Гертвиг
Откладывание яиц
Оплодотворение может быть внешним и внутренним, но для обоих процессов нужна жидкая среда, в которой спермий может плыть к яйцеклетке. В случае внешнего оплодотворения самка подвижного животного откладывает яйца в определенном месте и определенной формы — лягушачья икра, например, — а неподвижные животные типа кораллов выпускают яйца в воду, где те либо опускаются на дно моря или реки, либо разносятся дальше течением. В процессе внутреннего оплодотворения участвуют половые органы. У млекопитающих пенис эякулирует семя в вагину или матку, а затем в фаллопиевой трубе встречаются сперматозоид и яйцеклетка. Мужская гамета меньше женской, потому что спермий стремится к яйцеклетке, а не наоборот. В массовой культуре оплодотворение обычно изображают в виде картинки, где толпы сперматозоидов наперегонки спешат к яйцеклетке, соревнуясь за право оплодотворить ее. В действительности, однако, у сперматозоида возникают немалые трудности с тем, чтобы вообще отыскать это яйцо. Из пяти миллионов спермиев в эякуляте мыши до фаллопиевой трубы добирается не больше 20%.
Направляя сперматозоид
В процессе внешнего оплодотворения сперматозоид ориентируется, используя хемотаксис — движение по направлению к химическому раздражителю. Этот механизм был описан американским эмбриологом Фрэнком Лилли в 1912 году на примере морских ежей Arbacia punctulata. Когда Лилли добавил каплю морской воды, предварительно смешанной с фолликулярной жидкостью неоплодотворенного яйца, к застывшим сперматозоидам, мужские гаметы собрались вокруг экстракта из яйца; вероятно, женские гаметы выделяли некое вещество, привлекающее их. Это вещество — resact — выделили в 1981-м фармакологи Дж. Рэндалл Хансброу и Дэвид Гарбере. Resact стимулирует открытие каналов в мембране спермия для свободного движения ионов, регулируя интенсивность движения его хвостика. В 2003 году немецкий биофизик Ульрих Бенджамин Каупп доказал, что спермий реагирует на единичную молекулу этого хемоаттрактанта и, вероятно, может отсчитывать молекулы, чтобы двигаться в определенном направлении.
При внутреннем оплодотворении, по крайней мере, у млекопитающих, движение сперматозоида определяет реотаксис — свойство двигаться против тока жидкости. Реотаксис был открыт в 2013 году Киоши Мики и Дэвидом Клэпемом, которые заметили, что сперматозоиды человека и мыши движутся «против течения», как лососи, идущие на нерест. Половой контакт стимулирует выделение стенками влагалища жидкого секрета, который смывает слизь и прочие препятствия на пути сперматозоида, расчищая ему дорогу и одновременно указывая направление движения. Реотаксис осуществляет естественный отбор спермиев, так что выживает лишь сильнейший пловец.
В процессе внутреннего оплодотворения в замкнутом пространстве оказываются сперматозоиды того же вида — опознание партнера происходит до начала полового акта, — и сперматозоид прокладывает кратчайший путь к яйцеклетке. При внешнем оплодотворении в окружающем пространстве находятся представители разных видов, поэтому движение кругами увеличивает шансы найти яйцеклетку, а определение специфических веществ помогает сперматозоиду не перепутать «адрес» и не вторгнуться в чужое яйцо. Хемотаксис встречается и в процессе внутреннего оплодотворения, но на короткой дистанции, аттрактантом сперматозоидов является «облачко» прогестерона, окружающее яйцеклетку.
Спермии млекопитающих, которые успешно добрались до фаллопиевой трубы, задерживаются там на некоторое время, что позволяет самкам выпустить за раз не одну яйцеклетку. Щелочная среда (и прогестерон у человека) помогают спермию, и ему гораздо легче проникнуть в яйцеклетку. Спермии, подвергшиеся такой обработке, «капацитации», обретают исключительную подвижность; перемещаясь за счет мощного биения своих жгутиков, они устремляются к конечной цели.
Слияние гамет
Гаметы сливаются после того, как спермий преодолеет три барьера: желеобразный (студенистый) слой, вителлиновую оболочку и клеточную мембрану яйца. У млекопитающих студенистый слой состоит из фолликулярных клеток, защищающих яйцо в процессе его созревания. Спермий прорывается сквозь cumulus oophorus, слой фолликулярных клеток, используя ферменты и грубую силу. Оболочка яйца называется zona pellucida и содержит различные гликопротеины ZP. Как только спермий распознает гликопротеины ZP, капсула на его конце — акросома — выделяет ферменты, которые прокладывают путь через zona pellucida. Акросомальная реакция позволяет спермию преодолеть последний барьер — клеточную мембрану, — где поверхностные белки способствуют слиянию ооцита и одного удачливого спермия. Это вызывает изменения в яйцеклетке: она выделяет ферменты, под действием которых zona pellucida становится непроницаемой и предотвращает дальнейшее проникновение спермиев.
«Как показывают многочисленные наблюдения за царством животных и растений, в нормальном процессе оплодотворения только единственный спермий проникает сквозь оболочку яйца» Оскар Хертвиг
В ожидании оплодотворения мейоз (клеточный цикл деления) в яйцеклетке останавливается. После проникновения спермия его ферменты возобновляют клеточный цикл: клетка завершает деление и формирует женский пронуклеус, содержащий половину хромосомного набора. Он сливается с мужским пронуклеусом, сформированным из материала спермия, образуя ядро с полным набором хромосом.
Последняя стадия оплодотворения несколько загадочна. И спермий, и яйцеклетка (ооцит) — специализированные клетки, отличающиеся от прочих с той же ДНК в силу наличия эпигенетических маркеров, регулирующих экспрессию генов. Эти маркеры должны быть «стерты», чтобы гены были считаны «с чистого листа», но без уничтожения тех потенциально положительных маркеров, которые родители намеренно добавили к своим гаметам. Как бы то ни было, но эта задача успешно решается, и в результате возникает оплодотворенное яйцо — зигота, постепенно превращающаяся в сложный многоклеточный организм, как все мы, — и это настоящее чудо.
Оплодотворение у млекопитающих
Женские гаметы в форме ооцитов хранятся в яичниках, где окружающие клетки снабжают их питательными веществами. В каждом менструальном цикле выброс гормона гонадотропин побуждает ооцит делиться на две неравные части — крупную яйцеклетку и небольшое полярное тельце. Неоплодотворенная яйцеклетка выходит в фаллопиеву трубу. Яйцеклетке требуется около суток для полного созревания. Спермий состоит из головки, содержащей ядро и акросому, и жгутика, снабженного митохондрионом, высвобождающим энергию. Мужская гамета выплывает из влагалища и матки в фаллопиеву трубу навстречу яйцеклетке.
Дитя трех родителей
В течение двадцати лет британский физиолог Роберт Эдвардс пытался оплодотворить человеческую яйцеклетку в чашке Петри, то есть in vitro («в стекле» по-латыни). Затем он объединил усилия с гинекологом Патриком Стептоу, который владел лапароскопической методикой извлечения яйцеклеток из яичника. Исследователи наблюдали за менструальным циклом женщины, определяли время овуляции, в этот момент извлекали яйцеклетку, оплодотворяли ее и помещали в матку будущей матери. Первый «ребенок из пробирки», Луиза Браун, родилась 27 июля 1978 года. С тех пор около шести миллионов детей появились на свет благодаря ЭКО. Вероятно, величайшее и самое дискуссионное изобретение последних трех десятилетий — это так называемые дети трех родителей. В 2015 году правительство Великобритании одобрило закон, согласно которому допускается искусственное оплодотворение с использованием генетического материала от третьего донора — ядро яйцеклетки одной матери переносится в яйцеклетку другой. В цитоплазме второй яйцеклетки, лишенной ядра, содержится митохондрия со своей собственной ДНК. Митохондрия содержит 37 генов, в то время как хромосомы ядра (ядерный геном) — более 20 000, но технически оплодотворенная яйцеклетка будет содержать генетический материал трех родителей (хотя доля одного из них составит менее 0,2% генов). Ребенок, рожденный в результате такой процедуры, будет избавлен от болезней, которые вызываются дефектом митохондриальной ДНК.
Роберт Эдвардс
Поделиться ссылкой
5. Двойное оплодотворение цветковых растений
Суть двойного оплодотворения у цветковых растений заключается в том, что в нём участвуют два спермия. Один из них оплодотворяет яйцеклетку, и образуется зигота. Второй спермий сливается с центральной клеткой, из которой развивается запасающая ткань (эндосперм).
В зиготе формируется двойной набор хромосом, а в будущем эндосперме — тройной.
Оплодотворению у цветковых растений предшествует формирование гаметофитов.
Мужской гаметофит (пыльцевое зерно) образуется в пыльцевых камерах пыльников тычинки из микроспоры.
Пыльцевое зерно состоит из двух гаплоидных клеток: вегетативной и генеративной, покрытых оболочкой.
Образование женского гаметофита (зародышевого мешка) происходит в завязи пестика в семязачатке из мегаспоры.
В состав зародышевого мешка входит семь клеток: гаплоидная яйцеклетка, центральная диплоидная клетка и пять вспомогательных гаплоидных клеток.
Когда пыльцевое зерно попадает на рыльце пестика, вегетативная клетка начинает делиться и образует пыльцевую трубку. Пыльцевая трубка прорастает через столбик пестика и проникает в семязачаток через пыльцевход.
Генеративная клетка пыльцевого зерна делится и образует два спермия. По пыльцевой трубке спермии проникают в семязачаток. Один спермий сливается с яйцеклеткой и образует диплоидную зиготу. Второй спермий сливается с центральной клеткой и образует триплоидную клетку.
Зигота делится, и развивается в зародыш нового растения. Из триплоидной клетки формируется эндосперм. Стенки семязачатка становятся семенной кожурой. Таким образом, семязачаток становится семенем.
Яйцеклетки, слияние — Справочник химика 21
Половое размножение получает окончательное развитие у эукариот, где рост многоклеточного организма начинается со слияния двух гаплоидных гамет — яйцеклетки и сперматозоида. Каждая гамета несет полный набор генетических инструкций образовавшееся после слияния ядер оплодотворенное яйцо (зигота) является диплоидным. Диплоидная клетка содержит два полных набора генетических матриц, полученных от двух совершенно разных родителей. Это дает развивающемуся организму огромные преимущества. В самом деле, если какой-либо ген, полученный от одного из родителей, окажется дефектным, то весьма мало вероятно, что соответствующий ген от второго родителя будет тоже дефектным. Кроме того, половое размножение — это средство смешивания генов, и каждый из нас получает не просто половину генов от матери и половину от отца, но также какие-то гены от дедушек и бабушек, от прадедушек и прабабушек и т. д. [c.39]
У человека и высших животных в результате мейоза образуются гаметы— яйцеклетка и сперматозоиды. При их слиянии возникает снова диплоидное ядро, из которого путем последовательных митозов развивается взрослый организм. Стадия мейоза характерна для жизненного цикла всех эукариот, однако отнюдь не всегда этот процесс протекает в период, аналогичный соответствующему моменту жизненного цикла человека. Так, клетки многих простейших и грибов обычно гаплоидны. После слияния двух гаплоидных ядер с образованием диплоидной клетки быстро наступает мейотическое деление, в результате которого вновь возникают гаплоидные особи. Чередование гаплоидных и диплоидных фаз жизненного цикла часто встречается у низших растений и примитивных животных. Например, гаметы папоротника падают на почву и [c.42]
Гаплоидные клетки, приспособленные для полового слияния, называются гаметами. В типичном случае образуются гаметы двух типов крупные неподвижные яйцеклетки (или яйца) и мелкие, способные передвигаться спермин (или сперматозоиды) (рис. 14-4). Во время диплоидной фазы, начинающейся сразу после слияния гамет, клетки размножаются и специализируются, образуя сложный многоклеточный организм. У большинства животных (но не растений) полезно различать клетки зачаткового пут, от которых берет начало следующее поколение гамет, и соматические клетки, образующие весь остальной организм и не оставляющие потомства. В некотором смысле соматические клетки нужны только для того, чтобы способствовать выживанию и размножению клеток зачаткового пути. [c.8]
Яйцеклетка и спермий специализированы для слияния, однако здесь важно то, что они сливаются только между собой, но не с другими клетками организма. Обе клетки используют специальные механизмы, обеспечивающие спе- [c.41]
Хромосомы претерпевают также изменения и перестройки другого рода, происходящие в процессе их нормального биологического функционирования. Слияние яйцеклетки со сперматозоидом у эукариот сопровождается генетической рекомбинацией, что приводит к появлению потомства с новой комбинацией генов. Кроме того, гены и части генов могут перемещаться из одного места хромосомы в другие. Гены могут также обмениваться и ре комбинировать при заражении клеток вирусами. [c.964]
У эукариотических организмов генетическая рекомбинация осуществляется при половом слиянии яйцеклетки и сперматозоида появляющиеся в потомстве клетки содержат дочерние хромосомы, состоящие из определенных генов обеих родительских хромосом (рис. 30-14). В этом процессе хромосомы сперматозоида и яйцеклетки расщепляются в гомологичных точках, а затем куски хромосом двух родительских клеток обмениваются своими генами и соединяются с образованием новых комбинаций генов. В результате потомство слившихся клеток обладает комбинацией фенотипических признаков, принадлежавших обоим родителям. Этот природный процесс расщепления, сборки и соединения генов [c.976]
Физическая связь между родительскими и дочерними особями осуществляется через сперматозоиды мужского организма и яйцеклетки женского организма. С момента слияния этих клеток начинается последовательная цепь химических превращений. Если тело родителей было покрыто шерстью, а не пером, то у развивающегося потомства в результате целого ряда последовательных реакций будут синтезироваться белки шерсти, а не перьев. Кардинально различные пути превращений приводят к образованию различных видов, несмотря на то, что пищей при развитии различных организмов часто служат одни и те же или сходные продукты. [c.416]
Образование нового организма начинается в момент слияния ядер яйцеклетки и сперматозоида, слияния, в результате которого получается одна клетка. В оплодотворенном яйце имеется два набора хромосом, по одному от каждой родительской клетки. Эти два набора равноценны (за исключением хромосом, определяющих пол), и, следовательно, в оплодотворенном яйце имеется по паре хромосом каждого вида. Затем оплодотворенное яйцо начинает дробиться для образования клеток нового организма. Это дробление, если наблюдать его в микроскоп, представляет собой целый ритуал, строго установленный и сложный, как придворный танец восемнадцатого столетия. Каждая хромосома увеличивается в размерах и затем расщепляется вдоль так, что образуются две точные копии исходной. Половинки быстро оттягиваются к противоположным концам клетки двумя пучками нитей. К этому времени оболочка, покрывавшая ядро, исчезает и движению хромосом уже ничто [c.103]
Каждый человек развивается из одной клетки величиной в несколько сотых долей миллиметра, клетки, которая образуется при слиянии яйцеклетки матери и сперматозоида отца. Это оплодотворенное яйцо содержит два гена, определяющих цвет глаз, — по одному от каждого родителя. В зависимости от наследственных особенностей родителей возможны три типа ВВ, ВЬ и ЬЬ. Первые два типа — ВВ я ВЬ — дадут субъектов с карими глазами, третий тип — с голубыми. Заметьте, что, если человек имеет оба типа гена, глаза у него все равно карие. Это происходит оттого, что ген, определяющий карий цвет глаз, доминирует над геном голубых глаз, т. е. подавляет его. Поэтому ген голубых глаз называется рецессивным. [c.156]
Необычные температурные условия могут привести к появлению гаплоидов либо путем прямой стимуляции яйцеклетки к партеногенетическому развитию, либо за счет замедления роста пыльцевой трубки при входе в завязь, благодаря чему растягивается время оплодотворения, и яйцеклетка начинает деление до слияния с мужской гаметой. [c.84]
Диплоидное ядро — результат слияния двух ядер Яйцеклетка Две клетки [c.63]
Клонирование эмбрионов путем пересадки ядра включает три основных этапа выделение интактного ядра донора, энуклеацию ооцита, пересадку ядра в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от амфибий пересадка ядра у млекопитающих не стимулирует ооцит. Поэтому требуется четвертый этап — активация ооцита и слияние мембран яйца и ооцита. 218 [c.218]
Было признано, что оплодотворенное яйцо служит материнской клеткой, дающей начало колонии клеток, из которых строится многоклеточный организм. Отсюда возникло представление, что, несмотря на несоизмеримость сперматозоида и яйцеклетки по величине, они вносят одинаковый вклад в наследственность особи развивающейся в результате их слияния. Цитологическое исследование яйцеклеток и сперматозоидов показало, что, в то время как крупная яйцеклетка содержит огромное количество цитоплазмы, у крошечного сперматозоида цитоплазмы практически нет. Между тем было обнаружено, что размеры ядер яйцеклетки и сперматозоида примерно одинаковы. Из постулированного равенства вкладов яйцеклетки и сперматозоида в наследственность и из того, что объемы их цитоплазмы различаются очень сильно, был сделан вывод, что наследственность клетки локализована, по-видимому, в ядре, а не в цитоплазме. К 1884 г., к моменту смерти Менделя, уже было открыто, что хроматин ядра состоит из измеримого числа нитевидных частиц, хромосом (фиг. 5), и что ядра яйцеклетки и сперматозоида привносят в оплодотворенное яйцо одинаковое [c.19]
ЗИГОТА. Оплодотворенная яйцеклетка образуется в результате слияния двух гамет. [c.521]
Семена растений состоят из трех четко различающихся частей. Зародыш развивается из зиготы, образованной в результате слияния ядра спермия, происходящего из пыльцевой клетки, с ядром яйцеклетки. Оплодотворенная яйцеклетка у голосеменных окружена питательным слоем, или эндоспермом, происходящим из той же гаметофитной ткани, что и яйцеклетка, и потому гаплоидным. У покрытосеменных в спермин формируются два ядра одно из них оплодотворяет яйцеклетку, тогда как другое сливается с двумя гаплоидными полярными ядрами, образующимися в женском гаметофите. (Эти полярные ядра формируются в ходе того же митотического деления, при котором образуется яйцеклетка.) В результате развивается триплоидный (Зп) эндосперм. [c.63]
Из теории эволюции Дарвина следует единство основных явлений жизни во всех организмах. То же положение вытекает из клеточной теории, предложенной Шлейденом и Шванном в 1839 г. Существование одноклеточных и факт возникновения многоклеточного организма из одной клетки — зиготы показывает, что свойства живого тела присущи отдельной клетке. В клетке заложен механизм наследственности и изменчивости, ответственный за биологическую эволюцию. Дальнейшее развитие биологии локализовало этот механизм со все возрастающей точностью. Зигота, возникающая в результате слияния яйцеклетки и сперматозоида, приобретает наследственные свойства обеих клеток. Так как сперматозоид состоит в основном из ядерного материала, за наследственность ответственна не вся клетка, а ее ядро (Геккель, 1868 г.). Цитология и генетика показали, что аппарат наследственности сосредоточен в хромосомах, находящихся в ядре клетки. [c.484]
У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (мужской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским проггуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно перемещать, ориентировать нужным образом и фиксировать. Опытный экспериментатор за день может инокулировать несколько сотен яйцеклеток. [c.421]
По способу переноса гамет и осуществления плазмогамии различают несколько типов грибов. У низших, преимущественно водных, грибов обе гаметы подвижны (планогаметы), и слияние их происходит вне гаметангиев. У оомицетов подвижна только мужская гамета она проникает в оогоний и оплодотворяет яйцеклетку. Для зигомицетов характерна гаметангиогамия — слияние целых соприкасающихся друг с другом многоядерных гаметангиев в многоядерную ценозиготу. [c.57]
Большинство клеток человеческого тела (соматических клеток) содержат 23 пары хромосом. Исютючение составляют гаметы (сперматозоиды и яйцеклетки), содержащие только половину этого числа хромосом. В процессе оплодотворения при слиянии сперматозоидов с яйцеклетками возникают новые клетки (зиготы) с необходимыми 23 парами хромосом, которые образуют основу живого организма. Дальнейшее развитие происходит путем митоза, или деления клеток — процесса, при котором каждая хромосома, прежде чем клетка разделится, дуплицируется. В результате возншсают две новые клетки с идентичной системой 23 пар хромосом. [c.39]
По крайней мере в одном отношении яйцеклетки-самые удивительные из всех животных клеток будучи активированы, они могут дать начало целому новому организму, причем иногда для этого достаточно нескольких дней или недель, У высших животных это исключительная привилегия яйцеклеток слияние со спермием при оплодотворении запускает программу развития, постепенное развертывание которой приводит к образованию новой особи. [c.27]
Однако у большинства организмов яйцеклетки не имеют микропиле и могут сливаться со спермием в любом участке своей поверхности. У яйцеклеток некоторых животных (таких, как морские ежи и амфибии) полиспермию предотвращает быстрая деполяризация плазматической мембраны после слияния с первым сперматозоидом. Мембранный потенциал яйца морского ежа составляет примерно — 60 мВ. Через несколько секунд после контакта со спермием мембранный потенциал резко падает и меняет знак, доходя приблизительно до + 20 мВ, а затем спустя около минуты начинает постепенно возвращаться к исходному уровню (рис. 14-49). Если предотвратить деполяризацию мембраны (в основном обусловленную притоком ионов Na в яйце- [c.45]
В результате слияния мужского сперматозоида и женской яйцеклетки образуется новая клетка, называемая зиготой. Эта клетка подвергается усиленному делению, называемому митозом, в результате чего образуется эмбрион. На ранних стадиях развития образуются клетки двух родов, в корне отличные друг от друга зародышевые клетки, из которых потом разовьются сперматозоиды или яйцеклетки, и соматические клетки, из которых разовьются все органы и ткани, специфичные для данного вида. Зародьшевые клетки совершенно обособлены и в значительной мере защищены от влияния тех колоссальных превращений, которые протекают в соматических клетках. Когда соматические клетки разовьются настолько, что половые железы достигают созревания, зародышевые клетки становятся активными и начинают вырабатывать, в зависимости от пола животного, сперматозоиды или яйцеклетки. Если сперматозоид и яйцеклетка родителей содержали все необходимое для развития уникальной ферментной системы, то зародышевые клетки детей также должны обладать всем необходимым, для того чтобы в свою очередь передать их следующему поколению. [c.417]
Подобные половые клетки, или гаметы (от греческого гамео — вступаю в брак), внешне могут в точности повторять друг друга это так называемые изогаметы (от греческого изос — равный). Однако и у таких одинаковых по внешнему виду клеток имеются различия в наследственном материале, поэтому говорят о плюс- и минус-гаметах. У других организмов гаметы уже и внешне отличаются друг от друга одни из них крупнее макрогаметы, их называют также женскими), другие мельче микрогаметы, или мужские гаметы). Но чаще всего гаметы резко различаются между собой. Одни из них очень велики и неподвижны — это яйцеклетки (которые на сей раз по праву называются женскими гаметами), другие же сохраняют подвижность — это истинные мужские гаметы, или сперматозоиды. Большинство цветковых растений и некоторые грибы пошли еще дальше по пути упразднения способности половых клеток к самостоятельному движению — яйцеклетка у них оплодотворяется не подвижной мужской гаметой, а просто ядром (мужским). Это, собственно, ничего или почти ничего не меняет, поскольку достигается главная цель — слияние ядер. Продукт слияния гамет — оплодотворенная яйцеклетка, или зигота, содержит теперь одно ядро, образовавшееся путем слияния ее собственного ядра с проникшим в нее мужским ядром. [c.117]
Однако подобный жизненный цикл ни в коем случае не является правилом. Многие растения, почти все животные и, конечно, человек — диплобионты у них оплодотворенная яйцеклетка претерпевает митотическое деление и, следовательно, все клетки развившегося из нее организма будут диплоидными, т. е. будут содержать двойной набор хромосом. Лишь при формировании половых клеток происходит, наконец, мейоз, так что гаметы (и только они), т. е. неонлодотворенные яйцеклетки и сперматозоиды, гаплоидны уже продукты их слияния снова диплоидны. Таким образом, здесь мейоз и слияние гамет чередуются как раз в обратном порядке (рис. 52). [c.136]
В клеточном ядре на определенной стадии развития клетки становятся видимыми под миюроскояом (под обычным оптическим микроскопом) хромосомы. Это червеобразные структуры число и форма хромосом однозначно характеризуют вид растения или животного. Во всех клетках человеческого тела, кроме половых, содержится по 23 пары хромосом, всего 46 хромосом. В половых клетках их вдвое меньше 23. в сперматозоиде и 23 1В яйцеклетке. При оплодотворении, т. е. при слиянии сперматозоида с яйцеклеткой, образуется полпый набор хромосом — 46. Все последующие клетки тела возникают 1В ршультате многократных делений, начавшихся с первой зародышевой клетки. [c.256]
В половой стадии гифы различного пола сближаются и происходит слияние, напоминающее слияние яйцеклетки и сперматозоида у человека. Ядро, образовавшееся при слиянии, тут же делится дважды, после чего в каждой образовавшейся клетке остается один набор генов. Четыре клетки, образовавшиеся из одного слившегося ядра в процессе этих делений, располагаются в ряд в так называемой сумке. Каждая из них делится еще раз и дает по паре ядер, генетически абсолютно одинаковых. Получившиеся восемь ядер образуют восемь половых спор, каждая величиной в 0,025 миллиметра. Этот цикл развития нейроспоры представлен на фиг. 1. [c.160]
Естественные тетраплоиды для кукурузы не известны, хотя и неоднократно предпринимались попытки их обнаружения [121 Были замечены факты спонтанного увеличения числа хромосом в соматических клет ках [131, а также нарушения редукции числа хромосом в мейозе [14 I Опыление гамет пыльцой окружающих их диплоидов ведет к образованию маложизнеспособных триплоидных семян и исключению их из популяции. Триплоидные особи также могут возникать в результате слияние двух спермиев с яйцеклеткой в случае проникновения в зародышевый мешок двух пыльцевых трубок [15]. [c.28]
В результате обширных работ Стадлера и его сотрудников имеется довольно много данных о генетическом эффекте, возникающем при облучении ультрафиолетовыми лучами пыльцы кукурузы, и о различиях между эффектами, производимыми рентгеновыми и ультрафиолетовыми лучами . Пыльцу наносят одним слоем и облучают сверху. После облучения ею опыляют растение кукурузы. Семена кукурузы просматривают и, если нужно, высеивают для получения растений первого поколения (/= J. Во время облучения пыльцевое зерно содержит два гаплоидных ядра, которые также называют спермиями. Когда они входят в зародышевый мешок (до оплодотворения мешок содержит восемь гаплоидных ядер, которые появлялись в результате трех последовательных делений одного ядра, возникавшего после мейоза), одно из этих ядер-спер-миев сливается с ядром яйцеклетки и образуется диплоидная зигота, которая путем размножения дает зародыш, или эмбрион, семени, а затем — растение Fj. Второе ядро-спермий сливается с двумя другими гаплоидными ядрами ядра слияния) и образует триплоидное ядро, которое путем размножения развивается в эндосперм — богатую крахмалом ткань, составляющую основную массу семени, но не сохраняющуюся в растении [c.143]
Для успешного оплодотворения необходимо, чтобы пыльца, попав на рыльце, начала прорастать и достигла завязи. Этому могут препятствовать гены несовместимости (серия аллелей 5), которые подавляют рост пыльцевых трубок на данном рыльце и могут действовать как при самоопылении у отдельных растений, так и при чужеродном опылении. Для прорастания пыльцы необходимо, чтобы аллели в тканях рыльца и пестика были разные (например, 5] и у рыльца, 5з и 54—у пыльцы). Если даже скрещивание растений с одинаковыми аллелями удается, то в гибридном организме будет полностью подавляться рост пыльцевых трубок при самоопылении Ри и гибрид окажется стерильным. Гены несовместимости могут контролировать любой этап процесса опыления от начальной реакции пыльцы на ткань рыльца и столбика до образования зиготы, то есть они могут препятствовать слиянию ядер спермия и яйцеклетки (см. главу I). [c.139]
Оплодотворением называют слияние ядра спермия с ядром яйцеклетки, в результате чего образуется диплоидная клетка — зигота. Этот процесс протекает в несколько стадий, перечисленных ниже. [c.86]
Пол зародыша определяется половыми хромосомами спермия. Х-хромосома определяет женский пол, и Y-хромосома — мужской. Все яйцеклетки содержат по одной Х-хромосоме, а спермии — либо X-, либо Y-хромосому. Следовательно, зигота, образующаяся при слиянии гамет, имеет либо генотип XX (женский), либо XY (мужской) (см. разд. 24.6). На ранних стадиях онтогенеза у эмбриона развивается пара недифференцированных гонад — половых валиков. До шестой недели никаких структурных различий между мужскими и женскими гонадами не отмечается, но в дальнейшем вступают в действие половые хромосомы, определяя, по какому типу пойдет развитие половой системы. [c.98]
К концу XIX в. благодаря существенному улучшению оптических характеристик микроскопов и совершенствованию цитологических методов стало возможным наблюдать поведение хромосом в гаметах и зиготах. В 1875 г. Гертвиг обратил внимание на то, что при оплодотворении яиц морского ежа происходит слияние двух ядер — ядра спермия и Ядра яйцеклетки. В 1902 г. Бовери продемонстрировал важную роль ядра в регуляции развития признаков организма, а в 1882 г. Флемминг описал поведение хромосом в процессе митоза. [c.188]
Половой процесс — слияние мужской (спермия) и женской (яйцеклетки) половой клетки, в ходе которого образуется диплоидная клетка (зигота) и определяется пол будущей особи. [c.465]
Оплодотворение двойное
Пыльцевые зерна, попав на рыльце пестика, поглощают воду, сахара и другие питательные вещества и образуют трубку. Трубка буквально прорастает в пестик до зародышевого мешка. Пыльцевая трубка проникает в зародышевый мешок, где одна мужская гамета соединяется с яйцеклеткой, образуя зиготу. После митотического деления зигота становится зародышем будущего семени. Вторая мужская гамета сливается с двумя полярными ядрами и образует эндосперм. Этот процесс известен как двойное оплодотворение.[ …]
Двойное оплодотворение представляет собой исторически сложившееся, качественно новое явление, свойственное только покрытосеменным растениям. Биологическое значение двойного оплодотворения заключается в том, что эндосперм, обогащенный двойной наследственностью, повышает жизнеспособность и приспособленность покрытосеменных, обеспечивает их преимущество перед другими растениями в современную геологическую эпоху.[ …]
Двойное оплодотворение — тип оплодотворения, свойственный покрытосеменным растениям, при котором один из спермиев сливается с яйцеклеткой с образованием диплоидной зиготы, дающей начало зародышу семени, а второй спермпй сливается с диплоидным ядром зародышевого мешка с образованием клетки, дающей начало эндосперму семенп.[ …]
После двойного оплодотворения первым обычно делится первичное ядро эндосперма (рис, 124). У пшеницы его деление начинается через 3—4 ч после опыления. В это время в цитоплазме зародышевого мешка и в первичном ядре эндосперма интенсивно накапливаются нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК), белки, полисахариды, ферменты, витамины и другие физиологически активные вещества. С момента образования зиготы и до полного формирования зародыша эндосперм служит основным источником его питания.[ …]
В момент оплодотворения мужская и женская гаметы сливаются, образуя одну клетку — зиготу, имеющую одно ядро — результат слияния ядер обеих гамет. От каждой из гамет ядро зиготы получает по гаплоидному набору хромосом, и в результате оно имеет двойной, диплоидный набор их. Из зиготы развивается организм, каждая клетка которого имеет диплоидный набор хромосом.[ …]
В спермии двойная спираль ДНК стабильная. Порядок азотистых оснований в мостиках и их относительная численность на известном участке ДНК и дают тот или другой геи, поскольку расположением оснований определяется чередование аминокислот в белке, образующемся в развивающемся животном под влиянием данного участка ДНК. Но белок ДНК образует только после оплодотворения, когда она становится способной к превращению в РНК (рибонуклеиновую кислоту): ДНК->РНК->белок.[ …]
Впоследствии из оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) образуется зародыш, а из оплодотворенного ядра центральной клетки — эндосперм. Двойное оплодотворение присуще всем систематическим группам покрытосеменных растений.[ …]
Постмитотический тип двойного оплодотворения детально исследован Е. Н. Герасимовой-Навашиной у рябчика горного (Fritillaria tenella) (рис. Она же изучала промежуточный тип двойного оплодотворения у гальтонии. Премитотический процесс оплодотворения у пшеницы показан на рисунках 111, Л и 113.[ …]
Как было отмечено выше, оплодотворение у цветковых (покрытосеменных) имеет существенную отличительную особенность в виде двойного оплодотворения (С. Г. Навашин, 1896), которое сводится к тому, что в зародышевом мешке гаплоидная яйцеклетка и диплоидная центральная клетка оплодотворяются спермиями, в результате чего образуется диплоидный зародыш и триплоидная клетка, развивающаяся в клетки эндосперма (см. гл. II).[ …]
Герасимова-Навашнна Е. Н. Двойное оплодотворение покрытосеменных и некоторые теоретические аспекты//Проблемы эмбриологии.— Киев: Наукова думка, 1971.[ …]
Правильным представлением об оплодотворении у покрытосеменных мы обязаны выдающемуся русскому цитологу-эмбриологу С. Г. Навашину, открывшему в 1898 г. двойное оплодотворение у лилейных и астровых. Он впервые показал, что у цветковых растений при оплодотворении один из спермиев сливается с ядром яйцеклетки, а другой — с ядром центральной клетки или полярными ядрами (рис. 109).[ …]
У плодовых растений после завершения двойного оплодотворения из с.емяпочки формируется семя, а наружные покровы семяпочки (или интегументы) превращаются в кожуру семени. Клетки нуцеллуса используются растущим зародышем или реже превращаются в питательную ткань — перисперм. У болв-шинства плодовых и ягодных растений эндосперм и клетки нуцеллуса идут на формирование зародыша, а запасные пластические вещества локализуются в семядолях зародыша (рис. 28).[ …]
При изучении структуры спермиев в процессе двойного оплодотворения С. Г. Навашин обнаружил, что их ядра находятся в состоянии поздней телофазы. Механизм движения спермиев в пыльцевой трубке и зародышевом мешке он рассматривал как активный процесс самостоятельного передвижения.[ …]
При слиянии сперматозоида с яйцеклеткой во время оплодотворения восстанавливается двойной набор хромосом, образуется зигота, из которой развивается организм человека.[ …]
Весь ;>тот процесс, как известно, принято намывать двойным оплодотворением. Ведь согласно общепринятому в литературе определению, оплодотворение (еипгамин) — это процесс слияния, мужской п женской половых клеток (гамет) с образованием зиготы, из которой и дальнейшем разнимается новый организм. Такое определение оплодотворения можно найти в любом учебнике биологии и в любом :нщнклопедичоском словаре (в том число в советских шщпклопедиях, в Большой и Малой). И даже в известном «Словаре русского языка» С. И. Ожегова (1973) мы читаем: «Оплодотворить. 1. Создать зародыш в ком-чем-н. слиянием мужской и женской половых клеток. 2. Послужить источником развития, совершенствования». Слияние одного из сиормпев с яйцеклеткой является, несомненно, оплодотворением, но тройное слияние по является, строго говоря, оплодотворением, так как 1) центральная клетка — не гамета и 2) в результате ¡»того слияния но образуется зигота, из которой и дальнейшем развивался бы новый организм. Очевидно, тройное слияние является оплодотворением лишь в указанном Ожеговым, втором, переносном смысле. Другими словами, в выражении «двойное оплодотворение» термин «оплодотворение» применяется в двух разных, смыслах — прямом и переносном. Тем не менее выражение «двойное онлодотиороние» настолько широко вошло в литературу, что было бы нецелесообразно его заменить (а попытки такого рода делались, в том числе известным, немецким ботаником. Достаточно, если мы будем помнить, что речь идет здесь о двух разных биологических процессах, условно объединяемых общим .названием.[ …]
Дозревание икринок. Вполне развитая в яичнике икринка, прежде чем быть оплодотворенной, должна еще дозреть, в ней происходит процесс изменения зародышевого пузырька или ядра. Всякая клетка, животная и растительная, состоит из протоплазмы и ядра, с ядрышком внутри и особого тельца, состоящего из тончайших радиально расположенных нитей ахроматического (неокрашивающегося) белкового вещества, называемого центрозомой. Эта центрозома лежит то рядом с ядром, то посредине между поверхностью желтка и центрально-лежащим ядром. Самое ядро состоит из нитей хроматина (окрашивающегося вещества, лежащего в массе нуклеина (белковое вещество), и ядрышка в середине. Нити хроматина, или хромозомы, находятся всегда в определенном числе (от одной до нескольких сот у разных видов). Перед делением клетки центрозома делится на две звездочки, отходящие к противоположным полюсам ядра. Ядро же своими нитями ахроматина образует двойной конус центрозомы. Хроматозомы ядра внутри этого двойного конуса или веретена образуют петли, которые передвигаются в середине веретена попарно и располагаются в два ряда, разделяющих веретено как бы пластинкой на две половины. Тогда происходит разделение веретена и всего ядра на две половины, влекущее за собою деление всей клетки протоплазмы, которая окружает каждую из вновь образовавшихся ядер. Этот процесс носит название кариокинезиса, или митозы.[ …]
Открытие в 1896 г. выдающимся русским ученым Сергеем Гавриловичем Навашииым двойного оплодотворения у покрытоременных растений положило начало новой .эре исследований в биологической науке. С. Г. Навашин является также основателем науки о ядре — кариологии.[ …]
Детально изучая поведение спермиев в зародышевом мешке, Е. Н. Герасимова-Навашина предложила различать два основных типа двойного оплодотворения: премитотический, когда объединение половых ядер происходит перед первым митозом зиготы, и постмитотический, когда объединение половых ядер наступает в начале первого митоза зиготы. Ею установлена также промежуточная форма двойного оплодотворения, характеризующаяся образованием собственной оболочки вокруг ядра спермия при медленном его погружении в ядро яйцеклетки. При этом объединение половых ядер происходит во время первого митоза зиготы (рис. 110).[ …]
Семена у покрытосеменных растений образуются из семяпочки в результате двойного оплодотворения. В пыльце сосредоточено большое количество физиологически активных веществ — фитогормоиов (ауксинов), ферментов, много аминокислоты пролина. Все это приводит к тому, что уже сразу после опыления интенсивность обмена веществ в системе пыльца — пестик резко усиливается. Пыльцевая трубка несет два спермия. В результате слияния первого спермия с яйцеклеткой образуется зигота, дающая при последующем развитии зародыш семени. Анатомически ткани зародыша целиком состоят из первичной меристемы. При слиянии второго спермия со вторичным ядром зародышевого мешка образуется триплоидное ядро. Оно начинает делиться и вместе с цитоплазмой образует множество «леток составляющих эндосперм. После опыления и особенно оплодотворения завязь начинает разрастаться. Вместе с пыльцой в зародышевый мешок привносятся как сами фнтогормоны (ауксины), так и ферменты, катализирующие синтез гормонов. Дыхание развивающегося после оплодотворения семени идет очень иптенсивно. Семя становится центром притяжения питательных веществ. В процессе развития п роста зародыша ткань эндосперма потребляется и к моменту созревания семян может частично или полностью исчезнуть. Некоторые семена лишены эндосперма, питательные вещества сосредоточены у них в тканях самого зародыша (в семядолях).[ …]
У одного конца семенного рубчика находится трудно различимый еемявходный след, пли микропиле, — место проникновения пыльцевой трубки в семяпочку при ее оплодотворении. У другого конца рубчика располагается небольшой, чаще двойной, бугорок — халаза, являющийся основанием семяпочки.[ …]
У Crépis capillaris ядра спермиев при слиянии с женскими половыми ядрами находятся в периоде G прерванного митотического цикла (стадия телофазы), который они заканчивают в зиготе (рис. 112, 118). У астровых и злаковых в момент оплодотворения спермии находятся в стадии поздней телофазы митоза. На рисунке 114 показан конец двойного оплодотворения у кукурузы в момент слияния мужских ядрышек с женскими в ядрах зиготы и первичного ядра эндосперма; при этом второй сперматозоид находится в полярных ядрах; в яйцеклетке процесс слияния уже закончен, присутствует ядрышко спермия; слева виден контур второй пыльцевой трубки со спермиями.[ …]
Заканчивая изложение экспериментов Г. Менделя, свидетельствующих о независимом характере перераспределения генов, остановимся кратко на перераспределении генов при других поли-гибридных скрещиваниях. Количество генных комбинаций в полигибридных скрещиваниях (например, тетрагибридных) возрастает с вовлечением в наблюдения каждой новой пары генов, ибо каждая новая пара приводит к двойному увеличению типов гамет, продуцируемых гибридами Г, к тройному увеличению количества разных генотипов среди гибридов Г2 и к увеличению в 4 раза количества возможных комбинаций при оплодотворении гамет, продуцируемых гибридами Е„.[ …]
Половое размножение — это образование нового организма при участии двух родительских особей. При половом размножении происходит слияние половых клеток — гамет мужского и женского организма. Новый организм несет наследственную информацию от обоих родителей. Половые клетки формируются в результате особого типа деления. В этом случае в отличие от клеток взрослого организма, которые несут диплоидный (двойной) набор хромосом, образующиеся гаметы имеют гаплоидный (одинарный) набор. В результате оплодотворения парный, диплоидный набор хромосом восстанавливается. Одна хромосома из пары является отцовской, а другая — материнской. Гаметы образуются в половых железах или в специализированных клетках в процессе мейоза.[ …]
Птицы — животные, приспособленные к полетам в земной атмосфере. Распространены по всему земному шару и насчитывают около 9 тыс. видов. Тело птиц покрыто перьями, а передние конечности превратились в крылья. В строении тела птиц имеются особенности, например, кости скелета у них полые, хорошо развита грудина-киль. Птицы —теплокровные животные (до 42° С). Легкие у них ячеистые и имеются воздушные мешки для активной вентиляции (это так называемое двойное дыхание). Сердце четырехкамерное; артериальная и венозная кровеносная системы разделены; пищеварительная, выделительная и половая системы у птиц и рептилий очень похожи. Нервная система птиц развита весьма хорошо, особенно передний мозг-мозжечок. Поведение птиц весьма сложное и у них выработано много условных рефлексов. Оплодотворение внутреннее; яйца откладываются, как правило, в гнезда; для птиц, как и рептилий, характерна забота о потомстве.[ …]
Жизненный цикл высших растений состоит из двух ритмически чередующихся фаз, или «поколений» (рис. 1),— полового (г а м е т о-ф и т а) и бесполого (спорофита). Половые органы развиваются на гаметофите. Гаметофит может быть обоеполым. В таком случае на нем развиваются как антеридии, так и архегонии. Но у подавляющего большинства высших растений (в том числе у всех голосеменных и цветковых растений) он однополый и несет или только антеридии (мужской гаметофит), или только архегонии (женский гаметофит). В результате оплодотворения, т. е. слияния мужской гаметы с женской, образуется новая клетка с двойным набором хромосом (отцовским и материнским), называемая зиготой.[ …]
Созревание сперматозоидов и оплодотворение.
Созревание сперматозоидов и оплодотворение
A million million spermatozoa
All of them alive
Out of that cataclysm but one poor Noah
Dare hope to survive
And among that billion minus one
Might have chanced to be
Shakespeare, another Newton, a new Donne
But that One was Me
(Aldous Huxley)
Сперматозоиды достигают оплодотворяющей способности в нижних отделах половых путей мужчины. После эякуляции они 6ыстро поднимаются по половым путям женщины за счет сокращений матки и маточных труб, а собственная их подвижность становится важной на более поздних этапах. Только небольшое число из них достигает места оплодотворения в ампуле трубы, и только один из нескольких миллионов спермиев эякулята оплодотворит яйцеклетку.
Большинство исследователей склонно думать, что выбор спермия, который оплодотворит яйцеклетку, не совсем случаен, и в этом процессе есть свои закономерности. Закономерности эти пока почти не известны. Известно только, что на всех этапах миграции спермиев элиминируются наименее жизнеспособные, и что первым и довольно эффективным фильтром на их пути является цервикальная слизь. Вероятно, факторы отбора спермиев действуют и после прохождения их через шеечный канал, но факторы эти пока практически не изучены. Возможно, в отсеве «плохих» спермиев играют роль такие факторы, которые в настоящее время интенсивно исследуются; отсеиваются, по-видимому, и сперматозоиды с относительными ферментными дефицитами.
О том, что популяция спермиев эякулята гетерогенна, известно давно. Гетерогенность эта включает в себя не только генетическую гетерогенность, обусловленную различными сочетаниями в спермиях отцовского и материнского генетического материала, но и различия в активности ферментных систем, в экспрессии различных антигенов и т.д. Гетерогенность во времени достижения капацитации имеет особое эволюционное значение. Современные методы обследования бесплодных пар, перечисленные выше, включающие изучение in vitro способности спермиев проходить через прозрачную оболочку и входить в ооплазму, видимо, смогут пролить новый свет на процессы выбора «хорошего» сперматозоида.
В женских половых путях сперматозоиды подвергаются изменениям, известным под названием капацитации. Эти изменения включают в себя: 1) приобретение сперматозоидами способности к акросомальной реакции, позволяющей осуществить слияние с оолеммой и 2) тонкие изменения в характере биения жгутика (сверхактивная подвижность) (например, у кролика после капацитации гидродинамическая мощность спермиев повышается в 20 раз) (8).
Последняя особенность стала известна лишь недавно. Из-за того, что импульс капацитированного спермия увеличивается в несколько раз, он буквально торпедирует яйцеклетку.
Механизмы капацитации во многом пока не ясны. Считают, что происходят тонкие изменения мембраны сперматозоидов, в основе которых лежит удаление поверхностных покровов, откладываемых на плазматической мембране спермиев в мужских половых путях. Эти изменения затрагивают наружную акросомную мембрану сперматозоидов.
Биохимия капацитации выяснена еще недостаточно. К факторам декапацитации, смываемых с поверхности спермиев в женском репродуктивном тракте относят гликопротеин с молекулярным весом 37000 (84), высокомолекулярный фактор (91, 142), сиалопротеины и ингибиторы специфических ферментов (7, 49). С мембраной сперматозоидов могут связываться лактатдегидрогеназа, цАМФ, b-субъединица ХГ, стероиды, иммуноглобулины, компоненты комплемента, катехоламины. То, что капацитация у млекопитающих, в том числе у человека, не зависит от каких-либо факторов яйцеклетки, и время капацитации значительно колеблется у различных спермиев, является важным приспособлением к внутреннему оплодотворению. Тот факт, что период времени между овуляцией и инсеминацией может быть разным, означает, что синхронное развитие функционально капацитированного состояния у всех сперматозоидов в один и тот же момент времени могло бы ограничить шансы успешного оплодотворения (8).
Результатом капацитации является способность спермиев к акросомной реакции, т.е. морфологическим изменениям акросомного колпачка, что является необходимым условием для оплодотворения у млекопитающих. В результате акросомной реакции происходит освобождение ферментов, облегчающих прохождение спермиев через пояс клеток лучистого венца и через прозрачную оболочку. В ходе акросомной реакции вначале начинает набухать передняя часть акросомного колпачка. Затем происходит слияние наружной акросомной мембраны с плазматической, что ведет к вакуолизации, последующему сбрасыванию колпачка и освобождению содержимого акросомы. Этот процесс, по-видимому, аналогичен другим формам фузии мембран, включающих деполяризацию плазматической и акросомной мембран, движение ионов кальция внутрь клетки через мембрану, повышение цАМФ внутри клетки и активацию внутримембранных ферментов.
При приближении сперматозоидов к яйцеклетке клетки яйценосного бугорка и лучистого венца, окружающие яйцеклетку, могут участвовать в ограничении числа спермиев, достигающих ооцита и обеспечивать правильную ориентацию спермиев по отношению к прозрачной оболочке. Благодаря гиалуронидазе и эстеразам акросомы и трубной жидкости и сверхактивной подвижности капацитированных спермиев, сперматозоиды проникают через лучистый венец, что приводит к временному начальному прикреплению спермиев к прозрачной оболочке. Затем спермии ложатся на поверхность прозрачной оболочки, образуя более прочное и стойкое соединение благодаря наличию в прозрачной оболочке сперматозоидных рецепторов.
Это связывание высоко видоспецифично. С прозрачной оболочкой могут связываться спермии только очень близкородственных видов (например, заяц и кролик) (42). Сперматозоиды человека связываются и проходят через прозрачную оболочку яйцеклетки гиббона, но не могут пересекать прозрачную оболочку яйцеклеток бабуина или макаки резус. Оплодотворение обычно происходит в ампуле маточной трубы. При слиянии цитоплазматических мембран сперматозоида и яйцеклетки головка спермия окружается микроворсинками яйцеклетки. Отщепляется второе полярное тельце.
Сразу после слияния мембран половых клеток происходит кортикальная реакция яйцеклетки, являющаяся составной частью обеспечения блока полиспермии (в первый момент после слияния мембран гамет блокада полиспермии обеспечивается, по-видимому, электрической реакцией, быстро распространяющейся по оолемме, а кортикальная реакция закрепляет эту блокаду). Кортикальная реакция проявляется сокращением цитоплазмы и выделением кортикальных гранул в периовулярное пространство. После проникновения головки сперматозоида в ооплазму оно превращается в мужской пронуклеус, а ядро яйцеклетки — в женский пронуклеус. Пронуклеусы сближаются и их мембраны исчезают. Хромосомы зиготы вступают в первое митотическое деление.
Теги:
зачатие у человека
Слияние сперматозоидов и яйцеклеток: события на плазматической мембране | Журнал клеточной науки
Слияние сперматозоидов и яйцеклеток — это событие слияния клеточно-клеточной мембраны, необходимое для размножения организмов, размножающихся половым путем. При слиянии гамет, как и в других событиях слияния, таких как слияние вирус-клетка и внутриклеточные везикулы, слияние мембран представляет собой двухэтапный процесс. Присоединение двух мембран через молекулы клеточной поверхности сопровождается физическим слиянием липидов плазматической мембраны.Недавний прогресс продемонстрировал важную роль тетраспанина ооцитов, CD9, в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток мышей, и был идентифицирован конкретный молекулярный сайт, критический для функции CD9. Отсутствие гликозилфосфатидилинозитол-заякоренных белков на поверхности ооцита также приводит к потере способности слияния ооцитов в этой гамете. Эти открытия являются хорошей отправной точкой для идентификации дополнительных белков, которые играют роль в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток.
В отличие от деления клеток, которое происходит повсеместно и часто во время развития организма, слияние двух клеток — редкое событие, ограниченное конкретными типами клеток.Здесь мы обсуждаем основные стратегии объединения мембран и цитоплазм двух клеток и сосредотачиваемся на слиянии сперматозоидов и яйцеклеток у млекопитающих в качестве репрезентативного примера.
Слияние мембран в системах животных происходит в трех контекстах: (1) слияние вирус-клетка, необходимое для инфекционности определенных вирусов; (2) слияние внутриклеточных везикул, критически важное для транспортировки белков и экзоцитоза; и (3) слияние клеток. Хотя о слиянии клеток с клетками известно относительно немного, слияние вирусов с клетками и внутриклеточное слияние лучше изучено (обзор Jahn et al., 2003). Хотя слияние вирус-клетка и внутриклеточное слияние происходят в разных клеточных средах и требуют разных белков, некоторые важные механистические концепции являются общими и могут также применяться к слиянию клетка-клетка.
Процесс слияния мембран можно разделить на три основных события. Во-первых, распознавание (прикрепление) мембраны: начальный контакт с мембраной достигается за счет связывания двух мембран, опосредованного белком или углеводом.Этот шаг обеспечивает целевую специфичность и называется прикреплением. Во-вторых, наложение мембран: активность слитых белков еще больше сближает две мембраны. Во многих системах это достигается с помощью слитого белка, охватывающего межмембранное пространство и физически связывающего две мембраны (посредством белок-липидных или белок-белковых взаимодействий). Затем один из множества факторов вызывает необратимое конформационное изменение, при котором слитый белок сворачивается сам на себя. Это изменение формы приводит к шарнирному движению, которое притягивает два конца белка, вставленных в мембрану, очень близко друг к другу, притягивая за собой мембраны (Smith and Helenius, 2004).В-третьих, липидное смешение: как только мембраны будут очень близко друг к другу, липидное смешение будет происходить между проксимальными мембранными листочками и затем дистальными листочками, что приведет к непрерывности цитоплазмы между двумя клетками (Jahn and Grubmuller, 2002). Неясно, необходимы ли белки для этого этапа, потому что липосомы можно заставить слиться без белков. В некоторых вирусных системах слияния слитый пептид, как полагают, активно нарушает организацию липидов в мембране, что способствует событию слияния (Tamm et al., 2003). На протяжении следующего обсуждения мы называем белки, которые, как считается, опосредуют первый этап, «белками прикрепления», а этапы два и три — «белками слияния».
Слияние двух клеток является критическим биологическим событием, которое необходимо для оплодотворения организмов, размножающихся половым путем, и для организации тканей во время развития. Вероятно, он включает три основных этапа, упомянутых выше, и опосредуется белками, которые имеют общие черты с теми, которые участвуют в других типах слияния мембран.Были предприняты значительные усилия для идентификации предполагаемых белков прикрепления и слияния в системах слияния клетка-клетка, особенно слияния миобластов Drosophila и слияния сперматозоидов и ооцитов млекопитающих (в первую очередь мышей). Ниже мы сконцентрируемся на слиянии сперматозоидов и яйцеклеток мышей и обсудим последние достижения в этой области, опираясь на наше понимание других систем слияния с целью разработки новых моделей.
Белки прикрепления отвечают за начальное взаимодействие между двумя мембранами.При слиянии вирус-клетка взаимодействия вирус-рецептор опосредуются углеводными фрагментами или доменами клеточной адгезии на белках или других молекулах плазматической мембраны (Bomsel and Alfsen, 2003; Dimitrov, 2004). Во многих случаях несколько белков участвуют в одном событии прикрепления вируса к клетке, производя сложное взаимодействие, которое происходит в ограниченные временные рамки. Некоторые предполагаемые белки прикрепления клетки к клетке обладают этими характеристиками. Наиболее охарактеризованными кандидатами являются четыре члена суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), участвующих в слиянии миобластов Drosophila : Sns, Hbs, Duf и Rst (Taylor, 2002).Каждый из этих белков содержит несколько Ig-подобных доменов, которые представляют собой четко определенные домены межклеточной адгезии. Нулевые мутации в гене sns или rst и duf или сверхэкспрессия hbs приводят к дефектам слияния миобластов на стадии прикрепления. Клетки, экспрессирующие Duf, агрегируются in vitro с клетками, экспрессирующими Sns и Hbs, и вполне вероятно, что эти белки действуют совместно при прикреплении in vivo. У хламидомонады мутанты fus1 не могут прикрепляться к процессу спаривания противоположного типа спаривания, и слияние никогда не наблюдается (Misamore et al., 2003). Fus1 представляет собой однопроходную трансмембранную белковую последовательность, которая имеет сходство в пределах пяти Ig-подобных повторов с бактериальными инвазинами и интиминами, которые опосредуют стадию адгезии, которая предшествует бактериальной инвазии в клетки-хозяева. Caenorhabditis elegans сперматозоид SPE-9 содержит десять повторов эпидермального фактора роста (EGF) во внеклеточном домене и, вероятно, действует как фактор прикрепления при слиянии гамет (Singson et al., 1998). Все эти белки содержат домены клеточной адгезии, и оптимальная функция кандидатов на слияние миобластов требует участия нескольких белков.Сходство между прикрепляющими белками клетка-клетка и вирусная клетка, вероятно, проистекает из их общей функции и может предоставить прогностические критерии, с помощью которых можно оценивать кандидатов в качестве белков прикрепления сперматозоидов к яйцеклетке.
Слитые белки непосредственно опосредуют смешивание двух мембранных бислоев. При слиянии вирус-клетка слитый белок обычно содержит один трансмембранный домен и слитый пептид — последовательность из 10-30 остатков, которые образуют амфифильный домен на N-конце (класс I) или внутри белка (класс II), который имеет решающее значение для синтеза (Черномордик, Козлов, 2003; Jahn et al., 2003). Предполагаемые слитые белки клетка-клетка разнообразны по структуре, и лишь немногие из них соответствуют портрету канонического вирусного слитого белка. Связано ли это с тем, что для каждого случая слияния клетки с клеткой используется альтернативный механизм слияния, или потому, что эти конкретные белки не представляют собой слитый белок, по сути, пока не ясно. Сильным кандидатом на роль «истинного» слитого белка является белок C. elegans EFF-1, который необходим (Mohler et al., 2002) и достаточен (Shemer et al., 2004) для большинства событий слияния эпителиальных клеток в развивающийся червь.EFF-1 является уникальным в системах слияния клеток, поскольку он содержит предполагаемый пептид слияния внутри белка и, таким образом, подобен слиянию вируса класса II (Shemer and Podbilewicz, 2003). У Saccharomyces cerevisiae отсутствие пентаспанового белка Prm1p на обоих типах спаривания дает близко расположенные (разделенные 8 нм), но неслитые мембраны более чем в половине пар спаривания (Heiman and Walter, 2000). В слиянии миобластов Drosophila единственные белки, которые, как сейчас показано, играют прямую роль в слиянии, являются цитоплазматическими (Loner, Myoblast city и Rols / Ants) и, вероятно, важны для перестройки цитоскелета, которая происходит после прикрепления и до слияния мембран (Taylor, 2003 г.).
Оплодотворение млекопитающих — это многоступенчатый процесс, который завершается слиянием плазматических мембран сперматозоидов и ооцитов (обзор Primakoff and Myles, 2002). Зрелые гаметы встречаются в яйцеводе, и сперма проникает через два барьера ооцитов — слой кумулюсных клеток и пеллюцидную оболочку (ZP), которая является внеклеточным матриксом ооцита. Связывание с ZP сигнализирует сперматозоиду об экзоцитозе его единственного гигантского секреторного пузырька, акросомы (Bleil and Wassarman, 1983), и этот экзоцитоз должен происходить для сперматозоидов, чтобы стать компетентными для слияния.Экзоцитоз акросомы (так называемая акросомная реакция) приводит к значительному ремоделированию поверхности сперматозоидов. Наружная акросомная и передняя плазматические мембраны головки везикулируют и теряются из сперматозоидов, обнажая новую поверхностную мембрану (внутреннюю акросомную мембрану) и изменяя морфологию клетки. Кроме того, содержимое акросомы содержит гидролитические ферменты, которые могут модифицировать белки на всей поверхности сперматозоидов и запускать сперматозоиды для прикрепления и слияния клеток.
Fusion топологически ограничен определенной областью каждой гаметы, которая может отражать уникальную популяцию белков, липидную организацию или состав или морфологию мембран этой области. Плазматическая мембрана сперматозоида, покрывающая акросому, которая не участвует в реакции акросомы, называется экваториальной областью, и процесс слияния, по-видимому, инициируется в этой области сперматозоида (Yanagimachi, 1988).Плазматическая мембрана ооцита может быть разделена на два поверхностных домена: область, свободная от микровилл, которая покрывает мейотическое веретено; и богатая микровиллами область, которая покрывает остальную поверхность ооцита. Слияние сперматозоидов и ооцитов происходит преимущественно (Johnson et al., 1975) или исключительно (Ebensperger and Barros, 1984) в области, богатой микровиллами. Вскоре после слияния в ооците происходит глобальное экзоцитозное событие, и содержимое кортикальных секреторных гранул высвобождается во внеклеточную среду.В эти гранулы входят ферменты, которые модифицируют ZP таким образом, чтобы предотвратить дальнейшее проникновение сперматозоидов через этот матрикс. Плазматическая мембрана ооцита быстро становится невосприимчивой ко второму событию слияния, что указывает на то, что механизм слияния строго регулируется. Как устанавливается мембранный блок полиспермии, неизвестно, но это зависит от включения мембраны сперматозоидов в плазматическую мембрану ооцита, повышения концентрации внутриклеточного кальция после слияния и полимеризации актина (Maleszewski et al., 1996; McAvey et al., 2002). Компетенция слияния может быть отключена удалением или инактивацией ключевых белков, либо химическим или физическим блоком, который делает другое событие слияния менее вероятным.
Идентификация предполагаемых белков прикрепления и слияния сперматозоидов и яйцеклеток является основной целью текущих исследовательских программ. На сегодняшний день основным подходом к исследованиям слияния гамет является использование клеточных биологических стратегий для идентификации кандидатов в белки прикрепления и слияния.После идентификации этих кандидатов эксперименты обычно включают осеменение суперовулированных ооцитов в присутствии реагентов, которые, как предполагается, ингибируют процесс оплодотворения. Обычно ZP удаляется из ооцита химическими или ферментативными методами, чтобы сфокусировать исследования на событиях, происходящих на плазматической мембране. Затем можно искать перспективных кандидатов путем целенаправленной делеции гена у мыши. Здесь мы ограничиваем наше обсуждение белками, которые были протестированы методом нокаута генов, который обеспечивает важные данные in vivo для оценки функции белков.Обсуждение других кандидатов можно найти в другом месте (Kaji and Kudo, 2004; Cuasnicu et al., 2001; Talbot et al., 2003).
Барьером для идентификации кандидатов на прикрепление является отсутствие физиологически значимого in vitro анализа связывания сперматозоидов с ооцитами (Talbot et al., 2003). Большая часть сперматозоидов, связанных в типичном анализе на адгезию, не может перейти к слиянию. Кроме того, физиологически релевантное прикрепление на уровне плазматической мембраны может быть трудно измерить из-за использования различных методов удаления ZP (Evans et al., 1997a; Evans et al., 1997b; Ямагата и др., 2002). В частности, ZP не может быть полностью удален некоторыми методами, и нельзя отличить, связываются ли сперматозоиды с остаточным ZP или с плазматической мембраной, что ограничивает интерпретацию данных (Yamagata et al., 2002). Кроме того, сперматозоиды в условиях отсутствия ZP должны подвергаться «спонтанной» акросомной реакции, и эти сперматозоиды могут не быть физиологически эквивалентными сперматозоидам, испытывающим акросомную реакцию, индуцированную ZP. Различия в протоколах промывки для удаления «неплотно связанных» сперматозоидов также препятствуют надежной количественной оценке связывания сперматозоидов и сравнению результатов, полученных в разных лабораториях.Таким образом, в настоящее время не существует подходящего метода для измерения связывания, и единственным окончательным показателем in vitro дефекта прикрепления является дефект слияния. По этой причине мы рассматриваем кандидатов на привязанность и слияние как одну группу.
CD9 является членом семейства белков тетраспанинов и в большом количестве экспрессируется на поверхности яйца мыши. Тетраспанины встречаются у многих видов (от 900 до 11 C.elegans для людей) практически во всех типах клеток и тканей и играют важную роль в организации мембран (Hemler, 2003). Предполагается, что тетраспанины опосредуют несколько «уровней» белковых взаимодействий, включая первичные (устойчивые к детергентам) взаимодействия с белками, такими как интегрины, члены суперсемейства Ig и заякоренные в мембране факторы роста, а также вторичные взаимодействия с другими тетраспанинами. Многие из этих белков взаимодействуют с другими белками, и сумма этих взаимодействий называется «тетраспаниновой сетью» (Boucheix and Rubinstein, 2001), очень большой сетью белков, связанных ассоциациями (прямыми и косвенными) с тетраспанинами.Тетраспаниновая сеть связана с обогащенным тетраспанином микродоменом уникального липидного состава, который можно отличить от классического мембранного рафта по нескольким критериям (Hemler, 2003). В этих микродоменах тетраспанины способны регулировать критические клеточные события, которые требуют кооперативной функции нескольких белков в специализированном клеточном домене.
Два близкородственных тетраспанина CD9 и CD81, как известно, играют важную роль в событиях слияния мембран: человеческий CD81 является корецептором вируса гепатита С (Cormier et al., 2004), и как CD9, так и CD81 участвуют в слиянии миобластов млекопитающих (Schwander et al., 2003; Tachibana and Hemler, 1999) и слиянии моноцитов / макрофагов у мышей (Takeda et al., 2003). Однозначная роль CD9 в слиянии сперматозоидов и ооцитов была установлена в 2000 году, когда мышей с делециями в этом гене были получены в трех лабораториях (Kaji et al., 2000; Le Naour et al., 2000; Miyado et al., 2000). . Мыши здоровы и жизнеспособны, но фертильность у самок сильно снижена. Самки Cd9 — / — демонстрируют нормальный оогенез и продуцируют зрелые ооциты в количестве, сопоставимом с таковым дикого типа (Miyado et al., 2000). После спаривания в перивителлиновом пространстве обнаруживается много сперматозоидов, что указывает на то, что ранние взаимодействия сперматозоидов с ооцитами протекают нормально, а бесплодие является результатом нарушения прикрепления или слияния на плазматической мембране (Kaji et al., 2000; Miyado et al., 2000) . Роль CD81 во взаимодействиях сперматозоидов и яйцеклеток не выяснена. CD81 экспрессируется в ооците на низких уровнях (Takahashi et al., 2001). Cd81 — / — мыши имеют дефекты репродукции после нескольких поколений обратного скрещивания (см. Deng et al., 2000), но подробности неизвестны, поскольку официальное исследование не было опубликовано.
Фундаментальный вопрос, касающийся CD9 при слиянии сперматозоидов и яйцеклеток, заключается в том, функционирует ли он в цис-форме с белками в мембране ооцита или в транс как партнер по адгезии для белка сперматозоидов. CD9 демонстрирует ориентацию в мембране, характерную для тетраспанина, в которой N- и C-концы являются цитоплазматическими, а две внеклеточные петли, одна маленькая (EC1) и одна большая (EC2), выступают во внеклеточное пространство.Появляющиеся доказательства функциональной роли EC2 во многих тетраспанинах (Hemler, 2003) побудили исследователей сосредоточиться на этом домене CD9. Цис- или транс-функцию CD9 тестировали в анализах слияния сперматозоидов с яйцеклеткой путем предварительной инкубации конструкции мышиного EC2, экспрессируемой бактериями, со спермой или ооцитами перед оплодотворением (Zhu et al., 2002). Ингибирование слияния наблюдали только тогда, когда ооциты предварительно инкубировали с конструкцией EC2. Таким образом, цис-взаимодействие CD9 с одним или несколькими дополнительными белками на плазматической мембране яйца важно для слияния и согласуется с предполагаемой ролью CD9 как организатора тетраспаниновой сети на поверхности ооцита.
Хотя взаимодействие в цис-состоянии предполагается экспериментами с доменом EC2, CD9 также может работать в транс. Существует преимущество транс-взаимодействия между CD81 в гепатоцитах и вирусом гепатита С (Bartosch et al., 2003; Cormier et al., 2004). Недавние эксперименты продемонстрировали, что специфичный для беременности гликопротеин 17 (PSG17), растворимый член подсемейства карциноэмбриональных антигенов (CEA) суперсемейства Ig, связывается с макрофагами транс-зависимым образом от CD9 (Waterhouse et al., 2002). PSG17 и CD9 взаимодействуют напрямую in vitro, и это взаимодействие зависит от ключевых остатков в петле EC2 (см. Ниже) (Ellerman et al., 2003). Когда яйца предварительно инкубируют с PSG17, слияние сперматозоидов и яйцеклеток существенно ингибируется (Ellerman et al., 2003). Сам PSG17 (или заякоренная в мембране изоформа PSG17) не экспрессируется в сперматозоидах и, таким образом, вряд ли опосредует взаимодействие сперматозоидов с ооцитами in vivo. Однако, по крайней мере, один родственный белок в подсемействе CEA, sperad, был зарегистрирован в сперме морских свинок (Quill and Garbers, 1996).Гомолог этого белка мыши будет хорошим кандидатом для тестирования на роль в слиянии. Хотя эти данные также совместимы с исключительно цис-функцией CD9, они повышают вероятность того, что CD9 играет дополнительную транс-роль в качестве рецептора для сперматозоидов.
Исследования связывания вируса гепатита с CD81 показали, что одна аминокислота (F186) в петле EC2 важна для межклеточных взаимодействий (Higginbottom et al., 2000). В тестах для проверки того, является ли эквивалентная область CD9 критической для слияния гамет, в ооциты Cd9 — / — вводили мРНК, кодирующую CD9 дикого типа или один из двух мутантов CD9, F174 → A или SFQ173-175 → AAA. , созревшие in vitro и осемененные спермой дикого типа (Zhu et al., 2002). CD9 дикого типа восстанавливает слияние в 55% ооцитов, которые в противном случае не могут слиться со спермой. Мутанты обладают незначительным (F → A) или нулевым (SFQ → AAA) эффектом. В аналогичных экспериментах мышиный CD81 лишь умеренно эффективен при спасении ооцитов Cd9 — / — (Kaji et al., 2002). Таким образом, первоначальное молекулярное рассечение петли EC2 идентифицировало специфический сайт, необходимый для слияния сперматозоидов и яйцеклеток.
Исследования CD9 в других системах указывают на роль этого белка в регуляции слияния клеток, а не в непосредственном посредничестве перемешивания мембран. В отличие от потребности в CD9 при слиянии сперматозоидов и ооцитов, в других типах клеток CD9 и CD81 важны для поддержания неактивного состояния слияния. Cd9 — / — Cd81 — / — мыши с двойным нокаутом имеют высокую частоту образования многоядерных гигантских клеток, которые возникают в результате слияния моноцитов / макрофагов между клетками (Takeda et al., 2003). С этим выводом согласуется наблюдение, что антитела против CD9 и против CD81 способствуют слиянию моноцитов, хотя они не влияют на адгезию. Следовательно, в разных типах клеток (яйцеклетка против моноцитов / макрофагов) отсутствие CD9 оказывает противоположное влияние на способность к слиянию.Эти результаты могут означать, что у CD9 есть партнеры, специфичные для определенного типа клеток, которые являются ключевыми модуляторами слияния, или что разные типы клеток имеют разные механизмы слияния ядер с мембраной, которые имеют различные взаимодействия с CD9.
Гликозилфосфатидилинозитол (GPI) -зависимые белки (GPI-AP) представляют собой класс внеклеточных гликопротеинов, которые прикрепляются к мембранам с помощью липидного якоря GPI, а не через трансмембранный домен.Исследования in vitro с использованием фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C, фермента, который расщепляет GPI-якорь, показали, что этот класс белков играет роль в слиянии гамет (Coonrod et al., 1999). Ооцит-специфический нокаут Pig-A, фермента, действующего в биосинтезе якоря GPI, вызывает бесплодие самок мышей из-за дефекта оплодотворения (Alfieri et al., 2003). Исследование клеток в яйцеводе через 24 часа после спаривания показывает, что у животных дикого типа 84% здоровых клеток представляют собой двухклеточные эмбрионы, тогда как только 1% клеток в тканеспецифических нокаутах прогрессируют до двухклеточной стадии.Многие из нокаутных яиц содержат сперматозоиды в перивителлиновом пространстве после спаривания, что указывает на то, что проникновение в кучевой слой и ZP происходит нормально. In vitro сперматозоиды не могут сливаться с ооцитами, не содержащими ZP, от нокаутных самок.
Дефект в этих ооцитах может быть вызван одним из нескольких факторов. В ооцитах может отсутствовать один или несколько GPI-AP, критических для слияния. CD55 был недавно идентифицирован как яичный GPI-заякоренный белок, но мыши, у которых есть целевые делеции в этом гене, здоровы и плодовиты, что исключает роль этого белка в слиянии сперматозоидов и ооцитов (Alfieri et al., 2003; Sun et al., 1999). Идентификация потенциальных кандидатов в литературе или протеомная каталогизация GPI-AP ооцитов будут полезны для изучения их возможной функции. Отсутствие GPI-AP может также приводить к нарушениям плазматической мембраны ооцита. GPI-заякоренные белки обогащены классическими липидными рафтами, и потеря GPI-AP может привести к нарушению этих специализированных доменов.
Присутствие домена дезинтегрина в белках сперматозоидов семейства ADAM (для «дезинтегрина и металлопротеазы») вместе с серией экспериментов in vitro первоначально указывало на роль интегринов яйца в событиях слияния плазматической мембраны.Однако тесты in vivo роли интегринов не подтвердили первоначальные данные in vitro. Нокаут-эксперименты с использованием членов семейства интегринов до сих пор не показали никакой роли какого-либо интегрина, который, как известно, экспрессируется в ооците или действует как рецептор ADAM — все интегрины β1, включая α-субъединицы 2, 3, 5, 6, 9 и v, интегрин αvβ3 и интегрин αvβ5 (He et al., 2003; Miller et al., 2000). Все самки мышей с нокаутом, лишенные этих интегринов на яйцах, имеют нормальную фертильность in vivo и / или (где применимо) in vitro.Блокирование функции дополнительных интегринов в различных комбинациях также не влияет на слияние. Хотя все еще возможно, что роль некоторых интегринов ооцитов в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток будет обнаружена, дальнейшее рассмотрение этой гипотезы должно ждать новых доказательств.
Белки семейства
ADAM являются идеальными кандидатами на роль прикрепляющих белков на сперматозоидах благодаря наличию трансмембранного домена и двух доменов межклеточной адгезии — дезинтегриновых и цистеин-богатых доменов (Iba et al., 2000; Примакофф и Майлз, 2000). Основополагающие члены семейства ADAM, субъединицы гетеродимерного удобрения (ADAM1b-ADAM2), были первоначально идентифицированы при скрининге моноклональных антител для белков спермы морских свинок, играющих роль в слиянии гамет (Primakoff et al., 1987). На сегодняшний день идентифицировано 39 членов семьи ADAM. Около половины из них являются белками, специфичными для семенников или обогащенными семенниками, что указывает на то, что это семейство белков может играть важную роль в функции сперматозоидов.
Наиболее изученными ADAM сперматозоидов являются оплодотворение β (ADAM2) и циритестин (ADAM3).Первоначальные эксперименты на мышиной системе показали, что пептиды из дезинтегриновой петли этих двух ADAM сильно ингибируют слияние сперматозоидов и ооцитов in vitro, тогда как те же области ADAM1, ADAM4 и ADAM5 неэффективны (Yuan et al., 1997). Нацеленная делеция Adam2 или Adam3 дает бесплодных мышей-самцов (Cho et al., 1998; Nishimura et al., 2001; Shamsadin et al., 1999). Однако обе линии мышей обнаруживают дефекты в процессе оплодотворения до взаимодействия с мембраной гамет. Adam2 — / — сперматозоиды обнаруживают дефектный транзит по женским репродуктивным трактам (Cho et al., 1998). Adam2 — / — и Adam3 — / — мыши обнаруживают дефектное связывание ZP (Cho et al., 1998; Nishimura et al., 2001; Shamsadin et al., 1999). Тесты in vitro ооцитов без ZP показали, что сперматозоиды Adam3 — / — связываются с плазматической мембраной ооцита на очень низких уровнях (9% по сравнению с диким типом), но сливаются с нормальной скоростью (Nishimura et al., 2001). Это открытие исключает необходимую роль циритестина в физиологически значимом связывании или слиянии с плазматической мембраной. Такой вывод подтверждается недавними данными, показывающими, что ADAM3 высвобождается из клетки во время акросомной реакции и, следовательно, может не присутствовать на поверхности сперматозоидов в качестве интегрального белка во время связывания с плазматической мембраной (Kim et al., 2004). Adam2 — / — сперматозоиды демонстрируют аналогичное снижение связывания с плазматической мембраной и снижение слияния на 50% в этих условиях in vitro (Cho et al., 1998). Adam2 — / — Adam3 — / — мыши с двойным нокаутом, имитирующие сперму Adam2 — / — (Nishimura et al., 2001). ADAM2 не важен для связывания или слияния плазматической мембраны, но может играть роль в этом процессе. Молекулярное рассечение этого белка может дать лучшее понимание его прямой роли, если таковая имеется, в слиянии.
Наконец, еще один фактор усложняет интерпретацию этих данных. Adam2 — / — и Adam3 — / — сперматозоиды не лишены только генетически нацеленного белка. Благодаря еще не определенному механизму, уровни по крайней мере двух других ADAM (ADAM3, ADAM1b) снижаются в сперме Adam2 — / — , и возможно, что потеря распространяется на другие классы белков (Nishimura и др., 2001). Adam3 — / — сперматозоиды демонстрируют аналогичный, хотя и менее тяжелый фенотип. Существенная роль белка ADAM в слиянии все еще возможна, поскольку несколько других ADAM экспрессируются в сперматозоидах (Brachvogel et al., 2002; Choi et al., 2003; Вольфсберг и др., 1995; Чжу и др., 2001). Исследования ингибирования рекомбинантного белка и пептидной петли дезинтегрина показывают несколько специфическое и сильное ингибирование слияния (Chen and Sampson, 1999; Yuan et al., 1997). Эти пептиды могут ингибировать взаимодействие некоторых других ADAM с ооцитом.
Прогресс последних нескольких лет позволил идентифицировать несколько белков, важных для слияния сперматозоидов и яйцеклеток, хотя многие нерешенные вопросы остаются.Чтобы добиться прогресса в идентификации белков прикрепления, создание надежного анализа связывания было бы значительным преимуществом. Улучшение настоящего анализа может быть достигнуто за счет использования сперматозоидов с зеленым флуоресцентным белком (GFP) -акрозином (Nakanishi et al., 1999), что позволяет различать неспецифическое (без акросомы) связывание сперматозоидов с плазматической мембраной ооцита и связывание сперматозоидов, прореагировавших на акросомы. Следует стремиться к более глубокому пониманию роли CD9, включая идентификацию ассоциированных белков ооцита и возможного лиганда сперматозоидов.В свете недавних исследований (Cherukuri et al., 2004), домены вне EC2, особенно сайты пальмитоилирования, также могут быть исследованы. Присутствие Ig-подобных доменов на связывающих белках в других системах слияния и предполагаемая роль PSG-17-подобного белка во взаимодействиях сперматозоида и яйцеклетки побуждают к тщательному изучению белков гамет, содержащих домены Ig. Транскриптом спермы мыши был недавно опубликован (Schultz et al., 2003) и, вероятно, будет полезен в этом качестве. Наконец, недавние технологические достижения сделали генетический скрининг мутантов у мышей правдоподобным методом выявления мутантов, дефектных в биологическом процессе (Branda and Dymecki, 2004; Lessard et al., 2004). Вполне вероятно, что в будущем «прямая генетика» предоставит мощный подход к идентификации кандидатов для прикрепления гамет и слитых белков в сперматозоидах и ооцитах.
Слияние сперматозоидов и яйцеклеток: события на плазматической мембране | Журнал клеточной науки
Слияние сперматозоидов и яйцеклеток — это событие слияния клеточно-клеточной мембраны, необходимое для размножения организмов, размножающихся половым путем. При слиянии гамет, как и в других событиях слияния, таких как слияние вирус-клетка и внутриклеточные везикулы, слияние мембран представляет собой двухэтапный процесс.Присоединение двух мембран через молекулы клеточной поверхности сопровождается физическим слиянием липидов плазматической мембраны. Недавний прогресс продемонстрировал важную роль тетраспанина ооцитов, CD9, в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток мышей, и был идентифицирован конкретный молекулярный сайт, критический для функции CD9. Отсутствие гликозилфосфатидилинозитол-заякоренных белков на поверхности ооцита также приводит к потере способности слияния ооцитов в этой гамете. Эти открытия являются хорошей отправной точкой для идентификации дополнительных белков, которые играют роль в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток.
В отличие от деления клеток, которое происходит повсеместно и часто во время развития организма, слияние двух клеток — редкое событие, ограниченное конкретными типами клеток. Здесь мы обсуждаем основные стратегии объединения мембран и цитоплазм двух клеток и сосредотачиваемся на слиянии сперматозоидов и яйцеклеток у млекопитающих в качестве репрезентативного примера.
Слияние мембран в системах животных происходит в трех контекстах: (1) слияние вирус-клетка, необходимое для инфекционности определенных вирусов; (2) слияние внутриклеточных везикул, критически важное для транспортировки белков и экзоцитоза; и (3) слияние клеток.Хотя относительно мало известно о слиянии клетки с клеткой, слияние вируса с клеткой и внутриклеточное слияние лучше изучено (обзор Jahn et al., 2003). Хотя слияние вирус-клетка и внутриклеточное слияние происходят в разных клеточных средах и требуют разных белков, некоторые важные механистические концепции являются общими и могут также применяться к слиянию клетка-клетка.
Процесс слияния мембран можно разделить на три основных события.Во-первых, распознавание (прикрепление) мембраны: начальный контакт с мембраной достигается за счет связывания двух мембран, опосредованного белком или углеводом. Этот шаг обеспечивает целевую специфичность и называется прикреплением. Во-вторых, наложение мембран: активность слитых белков еще больше сближает две мембраны. Во многих системах это достигается с помощью слитого белка, охватывающего межмембранное пространство и физически связывающего две мембраны (посредством белок-липидных или белок-белковых взаимодействий).Затем один из множества факторов вызывает необратимое конформационное изменение, при котором слитый белок сворачивается сам на себя. Это изменение формы приводит к шарнирному движению, которое притягивает два конца белка, вставленных в мембрану, очень близко друг к другу, притягивая за собой мембраны (Smith and Helenius, 2004). В-третьих, липидное смешение: как только мембраны будут очень близко друг к другу, липидное смешение будет происходить между проксимальными мембранными листочками и затем дистальными листочками, что приведет к непрерывности цитоплазмы между двумя клетками (Jahn and Grubmuller, 2002).Неясно, необходимы ли белки для этого этапа, потому что липосомы можно заставить слиться без белков. В некоторых вирусных системах слияния слитый пептид, как полагают, активно нарушает организацию липидов в мембране, что способствует событию слияния (Tamm et al., 2003). На протяжении следующего обсуждения мы называем белки, которые, как считается, опосредуют первый этап, «белками прикрепления», а этапы два и три — «белками слияния».
Слияние двух клеток является критическим биологическим событием, которое необходимо для оплодотворения организмов, размножающихся половым путем, и для организации тканей во время развития.Вероятно, он включает три основных этапа, упомянутых выше, и опосредуется белками, которые имеют общие черты с теми, которые участвуют в других типах слияния мембран. Были предприняты значительные усилия для идентификации предполагаемых белков прикрепления и слияния в системах слияния клетка-клетка, особенно слияния миобластов Drosophila и слияния сперматозоидов и ооцитов млекопитающих (в первую очередь мышей). Ниже мы сконцентрируемся на слиянии сперматозоидов и яйцеклеток мышей и обсудим последние достижения в этой области, опираясь на наше понимание других систем слияния с целью разработки новых моделей.
Белки прикрепления отвечают за начальное взаимодействие между двумя мембранами. При слиянии вирус-клетка взаимодействия вирус-рецептор опосредуются углеводными фрагментами или доменами клеточной адгезии на белках или других молекулах плазматической мембраны (Bomsel and Alfsen, 2003; Dimitrov, 2004). Во многих случаях несколько белков участвуют в одном событии прикрепления вируса к клетке, производя сложное взаимодействие, которое происходит в ограниченные временные рамки.Некоторые предполагаемые белки прикрепления клетки к клетке обладают этими характеристиками. Наиболее охарактеризованными кандидатами являются четыре члена суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), участвующих в слиянии миобластов Drosophila : Sns, Hbs, Duf и Rst (Taylor, 2002). Каждый из этих белков содержит несколько Ig-подобных доменов, которые представляют собой четко определенные домены межклеточной адгезии. Нулевые мутации в гене sns или rst и duf или сверхэкспрессия hbs приводят к дефектам слияния миобластов на стадии прикрепления.Клетки, экспрессирующие Duf, агрегируются in vitro с клетками, экспрессирующими Sns и Hbs, и вполне вероятно, что эти белки действуют совместно при прикреплении in vivo. У Chlamydomonas мутанты fus1 неспособны прикрепляться к процессу спаривания противоположного типа спаривания, и слияние никогда не наблюдается (Misamore et al., 2003). Fus1 представляет собой однопроходную трансмембранную белковую последовательность, которая имеет сходство в пределах пяти Ig-подобных повторов с бактериальными инвазинами и интиминами, которые опосредуют стадию адгезии, которая предшествует бактериальной инвазии в клетки-хозяева. Caenorhabditis elegans сперматозоид SPE-9 содержит десять повторов эпидермального фактора роста (EGF) во внеклеточном домене и, вероятно, действует как фактор прикрепления при слиянии гамет (Singson et al., 1998). Все эти белки содержат домены клеточной адгезии, и оптимальная функция кандидатов на слияние миобластов требует участия нескольких белков. Сходство между прикрепляющими белками клетка-клетка и вирусная клетка, вероятно, проистекает из их общей функции и может предоставить прогностические критерии, с помощью которых можно оценивать кандидатов в качестве белков прикрепления сперматозоидов к яйцеклетке.
Слитые белки непосредственно опосредуют смешивание двух мембранных бислоев. При слиянии вирус-клетка слитый белок обычно содержит один трансмембранный домен и слитый пептид — последовательность из 10-30 остатков, которые образуют амфифильный домен на N-конце (класс I) или внутри белка (класс II), который имеет решающее значение для слияния (Черномордик, Козлов, 2003; Ян и др., 2003). Предполагаемые слитые белки клетка-клетка разнообразны по структуре, и лишь немногие из них соответствуют портрету канонического вирусного слитого белка.Связано ли это с тем, что для каждого случая слияния клетки с клеткой используется альтернативный механизм слияния, или потому, что эти конкретные белки не представляют собой слитый белок, по сути, пока не ясно. Сильным кандидатом на роль «истинного» слитого белка является белок C. elegans EFF-1, который необходим (Mohler et al., 2002) и достаточен (Shemer et al., 2004) для большинства событий слияния эпителиальных клеток в развивающийся червь. EFF-1 является уникальным в системах слияния клеток, поскольку он содержит предполагаемый пептид слияния внутри белка и, таким образом, подобен слиянию вируса класса II (Shemer and Podbilewicz, 2003).У Saccharomyces cerevisiae отсутствие пентаспанового белка Prm1p на обоих типах спаривания дает близко расположенные (разделенные 8 нм), но неслитые мембраны более чем в половине пар спаривания (Heiman and Walter, 2000). В слиянии миобластов Drosophila единственные белки, которые, как сейчас показано, играют прямую роль в слиянии, являются цитоплазматическими (Loner, Myoblast city и Rols / Ants) и, вероятно, важны для перестройки цитоскелета, которая происходит после прикрепления и до слияния мембран (Taylor, 2003 г.).
Оплодотворение млекопитающих — это многоступенчатый процесс, который завершается слиянием плазматических мембран сперматозоидов и ооцитов (обзор Primakoff and Myles, 2002). Зрелые гаметы встречаются в яйцеводе, и сперма проникает через два барьера ооцитов — слой кумулюсных клеток и пеллюцидную оболочку (ZP), которая является внеклеточным матриксом ооцита. Связывание с ZP сигнализирует сперматозоиду об экзоцитозе его единственного гигантского секреторного пузырька, акросомы (Bleil and Wassarman, 1983), и этот экзоцитоз должен происходить для сперматозоидов, чтобы стать компетентными для слияния.Экзоцитоз акросомы (так называемая акросомная реакция) приводит к значительному ремоделированию поверхности сперматозоидов. Наружная акросомная и передняя плазматические мембраны головки везикулируют и теряются из сперматозоидов, обнажая новую поверхностную мембрану (внутреннюю акросомную мембрану) и изменяя морфологию клетки. Кроме того, содержимое акросомы содержит гидролитические ферменты, которые могут модифицировать белки на всей поверхности сперматозоидов и запускать сперматозоиды для прикрепления и слияния клеток.
Fusion топологически ограничен определенной областью каждой гаметы, которая может отражать уникальную популяцию белков, липидную организацию или состав или морфологию мембран этой области. Плазматическая мембрана сперматозоида, покрывающая акросому, которая не участвует в реакции акросомы, называется экваториальной областью, и процесс слияния, по-видимому, инициируется в этой области сперматозоида (Yanagimachi, 1988).Плазматическая мембрана ооцита может быть разделена на два поверхностных домена: область, свободная от микровилл, которая покрывает мейотическое веретено; и богатая микровиллами область, которая покрывает остальную поверхность ооцита. Слияние сперматозоидов и ооцитов происходит преимущественно (Johnson et al., 1975) или исключительно (Ebensperger and Barros, 1984) в области, богатой микровиллами. Вскоре после слияния в ооците происходит глобальное экзоцитозное событие, и содержимое кортикальных секреторных гранул высвобождается во внеклеточную среду.В эти гранулы входят ферменты, которые модифицируют ZP таким образом, чтобы предотвратить дальнейшее проникновение сперматозоидов через этот матрикс. Плазматическая мембрана ооцита быстро становится невосприимчивой ко второму событию слияния, что указывает на то, что механизм слияния строго регулируется. Как устанавливается мембранный блок полиспермии, неизвестно, но это зависит от включения мембраны сперматозоидов в плазматическую мембрану ооцита, повышения концентрации внутриклеточного кальция после слияния и полимеризации актина (Maleszewski et al., 1996; McAvey et al., 2002). Компетенция слияния может быть отключена удалением или инактивацией ключевых белков, либо химическим или физическим блоком, который делает другое событие слияния менее вероятным.
Идентификация предполагаемых белков прикрепления и слияния сперматозоидов и яйцеклеток является основной целью текущих исследовательских программ. На сегодняшний день основным подходом к исследованиям слияния гамет является использование клеточных биологических стратегий для идентификации кандидатов в белки прикрепления и слияния.После идентификации этих кандидатов эксперименты обычно включают осеменение суперовулированных ооцитов в присутствии реагентов, которые, как предполагается, ингибируют процесс оплодотворения. Обычно ZP удаляется из ооцита химическими или ферментативными методами, чтобы сфокусировать исследования на событиях, происходящих на плазматической мембране. Затем можно искать перспективных кандидатов путем целенаправленной делеции гена у мыши. Здесь мы ограничиваем наше обсуждение белками, которые были протестированы методом нокаута генов, который обеспечивает важные данные in vivo для оценки функции белков.Обсуждение других кандидатов можно найти в другом месте (Kaji and Kudo, 2004; Cuasnicu et al., 2001; Talbot et al., 2003).
Барьером для идентификации кандидатов на прикрепление является отсутствие физиологически значимого in vitro анализа связывания сперматозоидов с ооцитами (Talbot et al., 2003). Большая часть сперматозоидов, связанных в типичном анализе на адгезию, не может перейти к слиянию. Кроме того, физиологически релевантное прикрепление на уровне плазматической мембраны может быть трудно измерить из-за использования различных методов удаления ZP (Evans et al., 1997a; Evans et al., 1997b; Ямагата и др., 2002). В частности, ZP не может быть полностью удален некоторыми методами, и нельзя отличить, связываются ли сперматозоиды с остаточным ZP или с плазматической мембраной, что ограничивает интерпретацию данных (Yamagata et al., 2002). Кроме того, сперматозоиды в условиях отсутствия ZP должны подвергаться «спонтанной» акросомной реакции, и эти сперматозоиды могут не быть физиологически эквивалентными сперматозоидам, испытывающим акросомную реакцию, индуцированную ZP. Различия в протоколах промывки для удаления «неплотно связанных» сперматозоидов также препятствуют надежной количественной оценке связывания сперматозоидов и сравнению результатов, полученных в разных лабораториях.Таким образом, в настоящее время не существует подходящего метода для измерения связывания, и единственным окончательным показателем in vitro дефекта прикрепления является дефект слияния. По этой причине мы рассматриваем кандидатов на привязанность и слияние как одну группу.
CD9 является членом семейства белков тетраспанинов и в большом количестве экспрессируется на поверхности яйца мыши. Тетраспанины встречаются у многих видов (от 900 до 11 C.elegans для людей) практически во всех типах клеток и тканей и играют важную роль в организации мембран (Hemler, 2003). Предполагается, что тетраспанины опосредуют несколько «уровней» белковых взаимодействий, включая первичные (устойчивые к детергентам) взаимодействия с белками, такими как интегрины, члены суперсемейства Ig и заякоренные в мембране факторы роста, а также вторичные взаимодействия с другими тетраспанинами. Многие из этих белков взаимодействуют с другими белками, и сумма этих взаимодействий называется «тетраспаниновой сетью» (Boucheix and Rubinstein, 2001), очень большой сетью белков, связанных ассоциациями (прямыми и косвенными) с тетраспанинами.Тетраспаниновая сеть связана с обогащенным тетраспанином микродоменом уникального липидного состава, который можно отличить от классического мембранного рафта по нескольким критериям (Hemler, 2003). В этих микродоменах тетраспанины способны регулировать критические клеточные события, которые требуют кооперативной функции нескольких белков в специализированном клеточном домене.
Два близкородственных тетраспанина CD9 и CD81, как известно, играют важную роль в событиях слияния мембран: человеческий CD81 является корецептором вируса гепатита С (Cormier et al., 2004), и как CD9, так и CD81 участвуют в слиянии миобластов млекопитающих (Schwander et al., 2003; Tachibana and Hemler, 1999) и слиянии моноцитов / макрофагов у мышей (Takeda et al., 2003). Однозначная роль CD9 в слиянии сперматозоидов и ооцитов была установлена в 2000 году, когда мышей с делециями в этом гене были получены в трех лабораториях (Kaji et al., 2000; Le Naour et al., 2000; Miyado et al., 2000). . Мыши здоровы и жизнеспособны, но фертильность у самок сильно снижена. Самки Cd9 — / — демонстрируют нормальный оогенез и продуцируют зрелые ооциты в количестве, сопоставимом с таковым дикого типа (Miyado et al., 2000). После спаривания в перивителлиновом пространстве обнаруживается много сперматозоидов, что указывает на то, что ранние взаимодействия сперматозоидов с ооцитами протекают нормально, а бесплодие является результатом нарушения прикрепления или слияния на плазматической мембране (Kaji et al., 2000; Miyado et al., 2000) . Роль CD81 во взаимодействиях сперматозоидов и яйцеклеток не выяснена. CD81 экспрессируется в ооците на низких уровнях (Takahashi et al., 2001). Cd81 — / — мыши имеют дефекты репродукции после нескольких поколений обратного скрещивания (см. Deng et al., 2000), но подробности неизвестны, поскольку официальное исследование не было опубликовано.
Фундаментальный вопрос, касающийся CD9 при слиянии сперматозоидов и яйцеклеток, заключается в том, функционирует ли он в цис-форме с белками в мембране ооцита или в транс как партнер по адгезии для белка сперматозоидов. CD9 демонстрирует ориентацию в мембране, характерную для тетраспанина, в которой N- и C-концы являются цитоплазматическими, а две внеклеточные петли, одна маленькая (EC1) и одна большая (EC2), выступают во внеклеточное пространство.Появляющиеся доказательства функциональной роли EC2 во многих тетраспанинах (Hemler, 2003) побудили исследователей сосредоточиться на этом домене CD9. Цис- или транс-функцию CD9 тестировали в анализах слияния сперматозоидов с яйцеклеткой путем предварительной инкубации конструкции мышиного EC2, экспрессируемой бактериями, со спермой или ооцитами перед оплодотворением (Zhu et al., 2002). Ингибирование слияния наблюдали только тогда, когда ооциты предварительно инкубировали с конструкцией EC2. Таким образом, цис-взаимодействие CD9 с одним или несколькими дополнительными белками на плазматической мембране яйца важно для слияния и согласуется с предполагаемой ролью CD9 как организатора тетраспаниновой сети на поверхности ооцита.
Хотя взаимодействие в цис-состоянии предполагается экспериментами с доменом EC2, CD9 также может работать в транс. Существует преимущество транс-взаимодействия между CD81 в гепатоцитах и вирусом гепатита С (Bartosch et al., 2003; Cormier et al., 2004). Недавние эксперименты продемонстрировали, что специфичный для беременности гликопротеин 17 (PSG17), растворимый член подсемейства карциноэмбриональных антигенов (CEA) суперсемейства Ig, связывается с макрофагами транс-зависимым образом от CD9 (Waterhouse et al., 2002). PSG17 и CD9 взаимодействуют напрямую in vitro, и это взаимодействие зависит от ключевых остатков в петле EC2 (см. Ниже) (Ellerman et al., 2003). Когда яйца предварительно инкубируют с PSG17, слияние сперматозоидов и яйцеклеток существенно ингибируется (Ellerman et al., 2003). Сам PSG17 (или заякоренная в мембране изоформа PSG17) не экспрессируется в сперматозоидах и, таким образом, вряд ли опосредует взаимодействие сперматозоидов с ооцитами in vivo. Однако, по крайней мере, один родственный белок в подсемействе CEA, sperad, был зарегистрирован в сперме морских свинок (Quill and Garbers, 1996).Гомолог этого белка мыши будет хорошим кандидатом для тестирования на роль в слиянии. Хотя эти данные также совместимы с исключительно цис-функцией CD9, они повышают вероятность того, что CD9 играет дополнительную транс-роль в качестве рецептора для сперматозоидов.
Исследования связывания вируса гепатита с CD81 показали, что одна аминокислота (F186) в петле EC2 важна для межклеточных взаимодействий (Higginbottom et al., 2000). В тестах для проверки того, является ли эквивалентная область CD9 критической для слияния гамет, в ооциты Cd9 — / — вводили мРНК, кодирующую CD9 дикого типа или один из двух мутантов CD9, F174 → A или SFQ173-175 → AAA. , созревшие in vitro и осемененные спермой дикого типа (Zhu et al., 2002). CD9 дикого типа восстанавливает слияние в 55% ооцитов, которые в противном случае не могут слиться со спермой. Мутанты обладают незначительным (F → A) или нулевым (SFQ → AAA) эффектом. В аналогичных экспериментах мышиный CD81 лишь умеренно эффективен при спасении ооцитов Cd9 — / — (Kaji et al., 2002). Таким образом, первоначальное молекулярное рассечение петли EC2 идентифицировало специфический сайт, необходимый для слияния сперматозоидов и яйцеклеток.
Исследования CD9 в других системах указывают на роль этого белка в регуляции слияния клеток, а не в непосредственном посредничестве перемешивания мембран. В отличие от потребности в CD9 при слиянии сперматозоидов и ооцитов, в других типах клеток CD9 и CD81 важны для поддержания неактивного состояния слияния. Cd9 — / — Cd81 — / — мыши с двойным нокаутом имеют высокую частоту образования многоядерных гигантских клеток, которые возникают в результате слияния моноцитов / макрофагов между клетками (Takeda et al., 2003). С этим выводом согласуется наблюдение, что антитела против CD9 и против CD81 способствуют слиянию моноцитов, хотя они не влияют на адгезию. Следовательно, в разных типах клеток (яйцеклетка против моноцитов / макрофагов) отсутствие CD9 оказывает противоположное влияние на способность к слиянию.Эти результаты могут означать, что у CD9 есть партнеры, специфичные для определенного типа клеток, которые являются ключевыми модуляторами слияния, или что разные типы клеток имеют разные механизмы слияния ядер с мембраной, которые имеют различные взаимодействия с CD9.
Гликозилфосфатидилинозитол (GPI) -зависимые белки (GPI-AP) представляют собой класс внеклеточных гликопротеинов, которые прикрепляются к мембранам с помощью липидного якоря GPI, а не через трансмембранный домен.Исследования in vitro с использованием фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C, фермента, который расщепляет GPI-якорь, показали, что этот класс белков играет роль в слиянии гамет (Coonrod et al., 1999). Ооцит-специфический нокаут Pig-A, фермента, действующего в биосинтезе якоря GPI, вызывает бесплодие самок мышей из-за дефекта оплодотворения (Alfieri et al., 2003). Исследование клеток в яйцеводе через 24 часа после спаривания показывает, что у животных дикого типа 84% здоровых клеток представляют собой двухклеточные эмбрионы, тогда как только 1% клеток в тканеспецифических нокаутах прогрессируют до двухклеточной стадии.Многие из нокаутных яиц содержат сперматозоиды в перивителлиновом пространстве после спаривания, что указывает на то, что проникновение в кучевой слой и ZP происходит нормально. In vitro сперматозоиды не могут сливаться с ооцитами, не содержащими ZP, от нокаутных самок.
Дефект в этих ооцитах может быть вызван одним из нескольких факторов. В ооцитах может отсутствовать один или несколько GPI-AP, критических для слияния. CD55 был недавно идентифицирован как яичный GPI-заякоренный белок, но мыши, у которых есть целевые делеции в этом гене, здоровы и плодовиты, что исключает роль этого белка в слиянии сперматозоидов и ооцитов (Alfieri et al., 2003; Sun et al., 1999). Идентификация потенциальных кандидатов в литературе или протеомная каталогизация GPI-AP ооцитов будут полезны для изучения их возможной функции. Отсутствие GPI-AP может также приводить к нарушениям плазматической мембраны ооцита. GPI-заякоренные белки обогащены классическими липидными рафтами, и потеря GPI-AP может привести к нарушению этих специализированных доменов.
Присутствие домена дезинтегрина в белках сперматозоидов семейства ADAM (для «дезинтегрина и металлопротеазы») вместе с серией экспериментов in vitro первоначально указывало на роль интегринов яйца в событиях слияния плазматической мембраны.Однако тесты in vivo роли интегринов не подтвердили первоначальные данные in vitro. Нокаут-эксперименты с использованием членов семейства интегринов до сих пор не показали никакой роли какого-либо интегрина, который, как известно, экспрессируется в ооците или действует как рецептор ADAM — все интегрины β1, включая α-субъединицы 2, 3, 5, 6, 9 и v, интегрин αvβ3 и интегрин αvβ5 (He et al., 2003; Miller et al., 2000). Все самки мышей с нокаутом, лишенные этих интегринов на яйцах, имеют нормальную фертильность in vivo и / или (где применимо) in vitro.Блокирование функции дополнительных интегринов в различных комбинациях также не влияет на слияние. Хотя все еще возможно, что роль некоторых интегринов ооцитов в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток будет обнаружена, дальнейшее рассмотрение этой гипотезы должно ждать новых доказательств.
Белки семейства
ADAM являются идеальными кандидатами на роль прикрепляющих белков на сперматозоидах благодаря наличию трансмембранного домена и двух доменов межклеточной адгезии — дезинтегриновых и цистеин-богатых доменов (Iba et al., 2000; Примакофф и Майлз, 2000). Основополагающие члены семейства ADAM, субъединицы гетеродимерного удобрения (ADAM1b-ADAM2), были первоначально идентифицированы при скрининге моноклональных антител для белков спермы морских свинок, играющих роль в слиянии гамет (Primakoff et al., 1987). На сегодняшний день идентифицировано 39 членов семьи ADAM. Около половины из них являются белками, специфичными для семенников или обогащенными семенниками, что указывает на то, что это семейство белков может играть важную роль в функции сперматозоидов.
Наиболее изученными ADAM сперматозоидов являются оплодотворение β (ADAM2) и циритестин (ADAM3).Первоначальные эксперименты на мышиной системе показали, что пептиды из дезинтегриновой петли этих двух ADAM сильно ингибируют слияние сперматозоидов и ооцитов in vitro, тогда как те же области ADAM1, ADAM4 и ADAM5 неэффективны (Yuan et al., 1997). Нацеленная делеция Adam2 или Adam3 дает бесплодных мышей-самцов (Cho et al., 1998; Nishimura et al., 2001; Shamsadin et al., 1999). Однако обе линии мышей обнаруживают дефекты в процессе оплодотворения до взаимодействия с мембраной гамет. Adam2 — / — сперматозоиды обнаруживают дефектный транзит по женским репродуктивным трактам (Cho et al., 1998). Adam2 — / — и Adam3 — / — мыши обнаруживают дефектное связывание ZP (Cho et al., 1998; Nishimura et al., 2001; Shamsadin et al., 1999). Тесты in vitro ооцитов без ZP показали, что сперматозоиды Adam3 — / — связываются с плазматической мембраной ооцита на очень низких уровнях (9% по сравнению с диким типом), но сливаются с нормальной скоростью (Nishimura et al., 2001). Это открытие исключает необходимую роль циритестина в физиологически значимом связывании или слиянии с плазматической мембраной. Такой вывод подтверждается недавними данными, показывающими, что ADAM3 высвобождается из клетки во время акросомной реакции и, следовательно, может не присутствовать на поверхности сперматозоидов в качестве интегрального белка во время связывания с плазматической мембраной (Kim et al., 2004). Adam2 — / — сперматозоиды демонстрируют аналогичное снижение связывания с плазматической мембраной и снижение слияния на 50% в этих условиях in vitro (Cho et al., 1998). Adam2 — / — Adam3 — / — мыши с двойным нокаутом, имитирующие сперму Adam2 — / — (Nishimura et al., 2001). ADAM2 не важен для связывания или слияния плазматической мембраны, но может играть роль в этом процессе. Молекулярное рассечение этого белка может дать лучшее понимание его прямой роли, если таковая имеется, в слиянии.
Наконец, еще один фактор усложняет интерпретацию этих данных. Adam2 — / — и Adam3 — / — сперматозоиды не лишены только генетически нацеленного белка. Благодаря еще не определенному механизму, уровни по крайней мере двух других ADAM (ADAM3, ADAM1b) снижаются в сперме Adam2 — / — , и возможно, что потеря распространяется на другие классы белков (Nishimura и др., 2001). Adam3 — / — сперматозоиды демонстрируют аналогичный, хотя и менее тяжелый фенотип. Существенная роль белка ADAM в слиянии все еще возможна, поскольку несколько других ADAM экспрессируются в сперматозоидах (Brachvogel et al., 2002; Choi et al., 2003; Вольфсберг и др., 1995; Чжу и др., 2001). Исследования ингибирования рекомбинантного белка и пептидной петли дезинтегрина показывают несколько специфическое и сильное ингибирование слияния (Chen and Sampson, 1999; Yuan et al., 1997). Эти пептиды могут ингибировать взаимодействие некоторых других ADAM с ооцитом.
Прогресс последних нескольких лет позволил идентифицировать несколько белков, важных для слияния сперматозоидов и яйцеклеток, хотя многие нерешенные вопросы остаются.Чтобы добиться прогресса в идентификации белков прикрепления, создание надежного анализа связывания было бы значительным преимуществом. Улучшение настоящего анализа может быть достигнуто за счет использования сперматозоидов с зеленым флуоресцентным белком (GFP) -акрозином (Nakanishi et al., 1999), что позволяет различать неспецифическое (без акросомы) связывание сперматозоидов с плазматической мембраной ооцита и связывание сперматозоидов, прореагировавших на акросомы. Следует стремиться к более глубокому пониманию роли CD9, включая идентификацию ассоциированных белков ооцита и возможного лиганда сперматозоидов.В свете недавних исследований (Cherukuri et al., 2004), домены вне EC2, особенно сайты пальмитоилирования, также могут быть исследованы. Присутствие Ig-подобных доменов на связывающих белках в других системах слияния и предполагаемая роль PSG-17-подобного белка во взаимодействиях сперматозоида и яйцеклетки побуждают к тщательному изучению белков гамет, содержащих домены Ig. Транскриптом спермы мыши был недавно опубликован (Schultz et al., 2003) и, вероятно, будет полезен в этом качестве. Наконец, недавние технологические достижения сделали генетический скрининг мутантов у мышей правдоподобным методом выявления мутантов, дефектных в биологическом процессе (Branda and Dymecki, 2004; Lessard et al., 2004). Вполне вероятно, что в будущем «прямая генетика» предоставит мощный подход к идентификации кандидатов для прикрепления гамет и слитых белков в сперматозоидах и ооцитах.
Слияние сперматозоидов и яйцеклеток: события на плазматической мембране | Журнал клеточной науки
Слияние сперматозоидов и яйцеклеток — это событие слияния клеточно-клеточной мембраны, необходимое для размножения организмов, размножающихся половым путем. При слиянии гамет, как и в других событиях слияния, таких как слияние вирус-клетка и внутриклеточные везикулы, слияние мембран представляет собой двухэтапный процесс.Присоединение двух мембран через молекулы клеточной поверхности сопровождается физическим слиянием липидов плазматической мембраны. Недавний прогресс продемонстрировал важную роль тетраспанина ооцитов, CD9, в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток мышей, и был идентифицирован конкретный молекулярный сайт, критический для функции CD9. Отсутствие гликозилфосфатидилинозитол-заякоренных белков на поверхности ооцита также приводит к потере способности слияния ооцитов в этой гамете. Эти открытия являются хорошей отправной точкой для идентификации дополнительных белков, которые играют роль в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток.
В отличие от деления клеток, которое происходит повсеместно и часто во время развития организма, слияние двух клеток — редкое событие, ограниченное конкретными типами клеток. Здесь мы обсуждаем основные стратегии объединения мембран и цитоплазм двух клеток и сосредотачиваемся на слиянии сперматозоидов и яйцеклеток у млекопитающих в качестве репрезентативного примера.
Слияние мембран в системах животных происходит в трех контекстах: (1) слияние вирус-клетка, необходимое для инфекционности определенных вирусов; (2) слияние внутриклеточных везикул, критически важное для транспортировки белков и экзоцитоза; и (3) слияние клеток.Хотя относительно мало известно о слиянии клетки с клеткой, слияние вируса с клеткой и внутриклеточное слияние лучше изучено (обзор Jahn et al., 2003). Хотя слияние вирус-клетка и внутриклеточное слияние происходят в разных клеточных средах и требуют разных белков, некоторые важные механистические концепции являются общими и могут также применяться к слиянию клетка-клетка.
Процесс слияния мембран можно разделить на три основных события.Во-первых, распознавание (прикрепление) мембраны: начальный контакт с мембраной достигается за счет связывания двух мембран, опосредованного белком или углеводом. Этот шаг обеспечивает целевую специфичность и называется прикреплением. Во-вторых, наложение мембран: активность слитых белков еще больше сближает две мембраны. Во многих системах это достигается с помощью слитого белка, охватывающего межмембранное пространство и физически связывающего две мембраны (посредством белок-липидных или белок-белковых взаимодействий).Затем один из множества факторов вызывает необратимое конформационное изменение, при котором слитый белок сворачивается сам на себя. Это изменение формы приводит к шарнирному движению, которое притягивает два конца белка, вставленных в мембрану, очень близко друг к другу, притягивая за собой мембраны (Smith and Helenius, 2004). В-третьих, липидное смешение: как только мембраны будут очень близко друг к другу, липидное смешение будет происходить между проксимальными мембранными листочками и затем дистальными листочками, что приведет к непрерывности цитоплазмы между двумя клетками (Jahn and Grubmuller, 2002).Неясно, необходимы ли белки для этого этапа, потому что липосомы можно заставить слиться без белков. В некоторых вирусных системах слияния слитый пептид, как полагают, активно нарушает организацию липидов в мембране, что способствует событию слияния (Tamm et al., 2003). На протяжении следующего обсуждения мы называем белки, которые, как считается, опосредуют первый этап, «белками прикрепления», а этапы два и три — «белками слияния».
Слияние двух клеток является критическим биологическим событием, которое необходимо для оплодотворения организмов, размножающихся половым путем, и для организации тканей во время развития.Вероятно, он включает три основных этапа, упомянутых выше, и опосредуется белками, которые имеют общие черты с теми, которые участвуют в других типах слияния мембран. Были предприняты значительные усилия для идентификации предполагаемых белков прикрепления и слияния в системах слияния клетка-клетка, особенно слияния миобластов Drosophila и слияния сперматозоидов и ооцитов млекопитающих (в первую очередь мышей). Ниже мы сконцентрируемся на слиянии сперматозоидов и яйцеклеток мышей и обсудим последние достижения в этой области, опираясь на наше понимание других систем слияния с целью разработки новых моделей.
Белки прикрепления отвечают за начальное взаимодействие между двумя мембранами. При слиянии вирус-клетка взаимодействия вирус-рецептор опосредуются углеводными фрагментами или доменами клеточной адгезии на белках или других молекулах плазматической мембраны (Bomsel and Alfsen, 2003; Dimitrov, 2004). Во многих случаях несколько белков участвуют в одном событии прикрепления вируса к клетке, производя сложное взаимодействие, которое происходит в ограниченные временные рамки.Некоторые предполагаемые белки прикрепления клетки к клетке обладают этими характеристиками. Наиболее охарактеризованными кандидатами являются четыре члена суперсемейства иммуноглобулинов (Ig), участвующих в слиянии миобластов Drosophila : Sns, Hbs, Duf и Rst (Taylor, 2002). Каждый из этих белков содержит несколько Ig-подобных доменов, которые представляют собой четко определенные домены межклеточной адгезии. Нулевые мутации в гене sns или rst и duf или сверхэкспрессия hbs приводят к дефектам слияния миобластов на стадии прикрепления.Клетки, экспрессирующие Duf, агрегируются in vitro с клетками, экспрессирующими Sns и Hbs, и вполне вероятно, что эти белки действуют совместно при прикреплении in vivo. У Chlamydomonas мутанты fus1 неспособны прикрепляться к процессу спаривания противоположного типа спаривания, и слияние никогда не наблюдается (Misamore et al., 2003). Fus1 представляет собой однопроходную трансмембранную белковую последовательность, которая имеет сходство в пределах пяти Ig-подобных повторов с бактериальными инвазинами и интиминами, которые опосредуют стадию адгезии, которая предшествует бактериальной инвазии в клетки-хозяева. Caenorhabditis elegans сперматозоид SPE-9 содержит десять повторов эпидермального фактора роста (EGF) во внеклеточном домене и, вероятно, действует как фактор прикрепления при слиянии гамет (Singson et al., 1998). Все эти белки содержат домены клеточной адгезии, и оптимальная функция кандидатов на слияние миобластов требует участия нескольких белков. Сходство между прикрепляющими белками клетка-клетка и вирусная клетка, вероятно, проистекает из их общей функции и может предоставить прогностические критерии, с помощью которых можно оценивать кандидатов в качестве белков прикрепления сперматозоидов к яйцеклетке.
Слитые белки непосредственно опосредуют смешивание двух мембранных бислоев. При слиянии вирус-клетка слитый белок обычно содержит один трансмембранный домен и слитый пептид — последовательность из 10-30 остатков, которые образуют амфифильный домен на N-конце (класс I) или внутри белка (класс II), который имеет решающее значение для слияния (Черномордик, Козлов, 2003; Ян и др., 2003). Предполагаемые слитые белки клетка-клетка разнообразны по структуре, и лишь немногие из них соответствуют портрету канонического вирусного слитого белка.Связано ли это с тем, что для каждого случая слияния клетки с клеткой используется альтернативный механизм слияния, или потому, что эти конкретные белки не представляют собой слитый белок, по сути, пока не ясно. Сильным кандидатом на роль «истинного» слитого белка является белок C. elegans EFF-1, который необходим (Mohler et al., 2002) и достаточен (Shemer et al., 2004) для большинства событий слияния эпителиальных клеток в развивающийся червь. EFF-1 является уникальным в системах слияния клеток, поскольку он содержит предполагаемый пептид слияния внутри белка и, таким образом, подобен слиянию вируса класса II (Shemer and Podbilewicz, 2003).У Saccharomyces cerevisiae отсутствие пентаспанового белка Prm1p на обоих типах спаривания дает близко расположенные (разделенные 8 нм), но неслитые мембраны более чем в половине пар спаривания (Heiman and Walter, 2000). В слиянии миобластов Drosophila единственные белки, которые, как сейчас показано, играют прямую роль в слиянии, являются цитоплазматическими (Loner, Myoblast city и Rols / Ants) и, вероятно, важны для перестройки цитоскелета, которая происходит после прикрепления и до слияния мембран (Taylor, 2003 г.).
Оплодотворение млекопитающих — это многоступенчатый процесс, который завершается слиянием плазматических мембран сперматозоидов и ооцитов (обзор Primakoff and Myles, 2002). Зрелые гаметы встречаются в яйцеводе, и сперма проникает через два барьера ооцитов — слой кумулюсных клеток и пеллюцидную оболочку (ZP), которая является внеклеточным матриксом ооцита. Связывание с ZP сигнализирует сперматозоиду об экзоцитозе его единственного гигантского секреторного пузырька, акросомы (Bleil and Wassarman, 1983), и этот экзоцитоз должен происходить для сперматозоидов, чтобы стать компетентными для слияния.Экзоцитоз акросомы (так называемая акросомная реакция) приводит к значительному ремоделированию поверхности сперматозоидов. Наружная акросомная и передняя плазматические мембраны головки везикулируют и теряются из сперматозоидов, обнажая новую поверхностную мембрану (внутреннюю акросомную мембрану) и изменяя морфологию клетки. Кроме того, содержимое акросомы содержит гидролитические ферменты, которые могут модифицировать белки на всей поверхности сперматозоидов и запускать сперматозоиды для прикрепления и слияния клеток.
Fusion топологически ограничен определенной областью каждой гаметы, которая может отражать уникальную популяцию белков, липидную организацию или состав или морфологию мембран этой области. Плазматическая мембрана сперматозоида, покрывающая акросому, которая не участвует в реакции акросомы, называется экваториальной областью, и процесс слияния, по-видимому, инициируется в этой области сперматозоида (Yanagimachi, 1988).Плазматическая мембрана ооцита может быть разделена на два поверхностных домена: область, свободная от микровилл, которая покрывает мейотическое веретено; и богатая микровиллами область, которая покрывает остальную поверхность ооцита. Слияние сперматозоидов и ооцитов происходит преимущественно (Johnson et al., 1975) или исключительно (Ebensperger and Barros, 1984) в области, богатой микровиллами. Вскоре после слияния в ооците происходит глобальное экзоцитозное событие, и содержимое кортикальных секреторных гранул высвобождается во внеклеточную среду.В эти гранулы входят ферменты, которые модифицируют ZP таким образом, чтобы предотвратить дальнейшее проникновение сперматозоидов через этот матрикс. Плазматическая мембрана ооцита быстро становится невосприимчивой ко второму событию слияния, что указывает на то, что механизм слияния строго регулируется. Как устанавливается мембранный блок полиспермии, неизвестно, но это зависит от включения мембраны сперматозоидов в плазматическую мембрану ооцита, повышения концентрации внутриклеточного кальция после слияния и полимеризации актина (Maleszewski et al., 1996; McAvey et al., 2002). Компетенция слияния может быть отключена удалением или инактивацией ключевых белков, либо химическим или физическим блоком, который делает другое событие слияния менее вероятным.
Идентификация предполагаемых белков прикрепления и слияния сперматозоидов и яйцеклеток является основной целью текущих исследовательских программ. На сегодняшний день основным подходом к исследованиям слияния гамет является использование клеточных биологических стратегий для идентификации кандидатов в белки прикрепления и слияния.После идентификации этих кандидатов эксперименты обычно включают осеменение суперовулированных ооцитов в присутствии реагентов, которые, как предполагается, ингибируют процесс оплодотворения. Обычно ZP удаляется из ооцита химическими или ферментативными методами, чтобы сфокусировать исследования на событиях, происходящих на плазматической мембране. Затем можно искать перспективных кандидатов путем целенаправленной делеции гена у мыши. Здесь мы ограничиваем наше обсуждение белками, которые были протестированы методом нокаута генов, который обеспечивает важные данные in vivo для оценки функции белков.Обсуждение других кандидатов можно найти в другом месте (Kaji and Kudo, 2004; Cuasnicu et al., 2001; Talbot et al., 2003).
Барьером для идентификации кандидатов на прикрепление является отсутствие физиологически значимого in vitro анализа связывания сперматозоидов с ооцитами (Talbot et al., 2003). Большая часть сперматозоидов, связанных в типичном анализе на адгезию, не может перейти к слиянию. Кроме того, физиологически релевантное прикрепление на уровне плазматической мембраны может быть трудно измерить из-за использования различных методов удаления ZP (Evans et al., 1997a; Evans et al., 1997b; Ямагата и др., 2002). В частности, ZP не может быть полностью удален некоторыми методами, и нельзя отличить, связываются ли сперматозоиды с остаточным ZP или с плазматической мембраной, что ограничивает интерпретацию данных (Yamagata et al., 2002). Кроме того, сперматозоиды в условиях отсутствия ZP должны подвергаться «спонтанной» акросомной реакции, и эти сперматозоиды могут не быть физиологически эквивалентными сперматозоидам, испытывающим акросомную реакцию, индуцированную ZP. Различия в протоколах промывки для удаления «неплотно связанных» сперматозоидов также препятствуют надежной количественной оценке связывания сперматозоидов и сравнению результатов, полученных в разных лабораториях.Таким образом, в настоящее время не существует подходящего метода для измерения связывания, и единственным окончательным показателем in vitro дефекта прикрепления является дефект слияния. По этой причине мы рассматриваем кандидатов на привязанность и слияние как одну группу.
CD9 является членом семейства белков тетраспанинов и в большом количестве экспрессируется на поверхности яйца мыши. Тетраспанины встречаются у многих видов (от 900 до 11 C.elegans для людей) практически во всех типах клеток и тканей и играют важную роль в организации мембран (Hemler, 2003). Предполагается, что тетраспанины опосредуют несколько «уровней» белковых взаимодействий, включая первичные (устойчивые к детергентам) взаимодействия с белками, такими как интегрины, члены суперсемейства Ig и заякоренные в мембране факторы роста, а также вторичные взаимодействия с другими тетраспанинами. Многие из этих белков взаимодействуют с другими белками, и сумма этих взаимодействий называется «тетраспаниновой сетью» (Boucheix and Rubinstein, 2001), очень большой сетью белков, связанных ассоциациями (прямыми и косвенными) с тетраспанинами.Тетраспаниновая сеть связана с обогащенным тетраспанином микродоменом уникального липидного состава, который можно отличить от классического мембранного рафта по нескольким критериям (Hemler, 2003). В этих микродоменах тетраспанины способны регулировать критические клеточные события, которые требуют кооперативной функции нескольких белков в специализированном клеточном домене.
Два близкородственных тетраспанина CD9 и CD81, как известно, играют важную роль в событиях слияния мембран: человеческий CD81 является корецептором вируса гепатита С (Cormier et al., 2004), и как CD9, так и CD81 участвуют в слиянии миобластов млекопитающих (Schwander et al., 2003; Tachibana and Hemler, 1999) и слиянии моноцитов / макрофагов у мышей (Takeda et al., 2003). Однозначная роль CD9 в слиянии сперматозоидов и ооцитов была установлена в 2000 году, когда мышей с делециями в этом гене были получены в трех лабораториях (Kaji et al., 2000; Le Naour et al., 2000; Miyado et al., 2000). . Мыши здоровы и жизнеспособны, но фертильность у самок сильно снижена. Самки Cd9 — / — демонстрируют нормальный оогенез и продуцируют зрелые ооциты в количестве, сопоставимом с таковым дикого типа (Miyado et al., 2000). После спаривания в перивителлиновом пространстве обнаруживается много сперматозоидов, что указывает на то, что ранние взаимодействия сперматозоидов с ооцитами протекают нормально, а бесплодие является результатом нарушения прикрепления или слияния на плазматической мембране (Kaji et al., 2000; Miyado et al., 2000) . Роль CD81 во взаимодействиях сперматозоидов и яйцеклеток не выяснена. CD81 экспрессируется в ооците на низких уровнях (Takahashi et al., 2001). Cd81 — / — мыши имеют дефекты репродукции после нескольких поколений обратного скрещивания (см. Deng et al., 2000), но подробности неизвестны, поскольку официальное исследование не было опубликовано.
Фундаментальный вопрос, касающийся CD9 при слиянии сперматозоидов и яйцеклеток, заключается в том, функционирует ли он в цис-форме с белками в мембране ооцита или в транс как партнер по адгезии для белка сперматозоидов. CD9 демонстрирует ориентацию в мембране, характерную для тетраспанина, в которой N- и C-концы являются цитоплазматическими, а две внеклеточные петли, одна маленькая (EC1) и одна большая (EC2), выступают во внеклеточное пространство.Появляющиеся доказательства функциональной роли EC2 во многих тетраспанинах (Hemler, 2003) побудили исследователей сосредоточиться на этом домене CD9. Цис- или транс-функцию CD9 тестировали в анализах слияния сперматозоидов с яйцеклеткой путем предварительной инкубации конструкции мышиного EC2, экспрессируемой бактериями, со спермой или ооцитами перед оплодотворением (Zhu et al., 2002). Ингибирование слияния наблюдали только тогда, когда ооциты предварительно инкубировали с конструкцией EC2. Таким образом, цис-взаимодействие CD9 с одним или несколькими дополнительными белками на плазматической мембране яйца важно для слияния и согласуется с предполагаемой ролью CD9 как организатора тетраспаниновой сети на поверхности ооцита.
Хотя взаимодействие в цис-состоянии предполагается экспериментами с доменом EC2, CD9 также может работать в транс. Существует преимущество транс-взаимодействия между CD81 в гепатоцитах и вирусом гепатита С (Bartosch et al., 2003; Cormier et al., 2004). Недавние эксперименты продемонстрировали, что специфичный для беременности гликопротеин 17 (PSG17), растворимый член подсемейства карциноэмбриональных антигенов (CEA) суперсемейства Ig, связывается с макрофагами транс-зависимым образом от CD9 (Waterhouse et al., 2002). PSG17 и CD9 взаимодействуют напрямую in vitro, и это взаимодействие зависит от ключевых остатков в петле EC2 (см. Ниже) (Ellerman et al., 2003). Когда яйца предварительно инкубируют с PSG17, слияние сперматозоидов и яйцеклеток существенно ингибируется (Ellerman et al., 2003). Сам PSG17 (или заякоренная в мембране изоформа PSG17) не экспрессируется в сперматозоидах и, таким образом, вряд ли опосредует взаимодействие сперматозоидов с ооцитами in vivo. Однако, по крайней мере, один родственный белок в подсемействе CEA, sperad, был зарегистрирован в сперме морских свинок (Quill and Garbers, 1996).Гомолог этого белка мыши будет хорошим кандидатом для тестирования на роль в слиянии. Хотя эти данные также совместимы с исключительно цис-функцией CD9, они повышают вероятность того, что CD9 играет дополнительную транс-роль в качестве рецептора для сперматозоидов.
Исследования связывания вируса гепатита с CD81 показали, что одна аминокислота (F186) в петле EC2 важна для межклеточных взаимодействий (Higginbottom et al., 2000). В тестах для проверки того, является ли эквивалентная область CD9 критической для слияния гамет, в ооциты Cd9 — / — вводили мРНК, кодирующую CD9 дикого типа или один из двух мутантов CD9, F174 → A или SFQ173-175 → AAA. , созревшие in vitro и осемененные спермой дикого типа (Zhu et al., 2002). CD9 дикого типа восстанавливает слияние в 55% ооцитов, которые в противном случае не могут слиться со спермой. Мутанты обладают незначительным (F → A) или нулевым (SFQ → AAA) эффектом. В аналогичных экспериментах мышиный CD81 лишь умеренно эффективен при спасении ооцитов Cd9 — / — (Kaji et al., 2002). Таким образом, первоначальное молекулярное рассечение петли EC2 идентифицировало специфический сайт, необходимый для слияния сперматозоидов и яйцеклеток.
Исследования CD9 в других системах указывают на роль этого белка в регуляции слияния клеток, а не в непосредственном посредничестве перемешивания мембран. В отличие от потребности в CD9 при слиянии сперматозоидов и ооцитов, в других типах клеток CD9 и CD81 важны для поддержания неактивного состояния слияния. Cd9 — / — Cd81 — / — мыши с двойным нокаутом имеют высокую частоту образования многоядерных гигантских клеток, которые возникают в результате слияния моноцитов / макрофагов между клетками (Takeda et al., 2003). С этим выводом согласуется наблюдение, что антитела против CD9 и против CD81 способствуют слиянию моноцитов, хотя они не влияют на адгезию. Следовательно, в разных типах клеток (яйцеклетка против моноцитов / макрофагов) отсутствие CD9 оказывает противоположное влияние на способность к слиянию.Эти результаты могут означать, что у CD9 есть партнеры, специфичные для определенного типа клеток, которые являются ключевыми модуляторами слияния, или что разные типы клеток имеют разные механизмы слияния ядер с мембраной, которые имеют различные взаимодействия с CD9.
Гликозилфосфатидилинозитол (GPI) -зависимые белки (GPI-AP) представляют собой класс внеклеточных гликопротеинов, которые прикрепляются к мембранам с помощью липидного якоря GPI, а не через трансмембранный домен.Исследования in vitro с использованием фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы C, фермента, который расщепляет GPI-якорь, показали, что этот класс белков играет роль в слиянии гамет (Coonrod et al., 1999). Ооцит-специфический нокаут Pig-A, фермента, действующего в биосинтезе якоря GPI, вызывает бесплодие самок мышей из-за дефекта оплодотворения (Alfieri et al., 2003). Исследование клеток в яйцеводе через 24 часа после спаривания показывает, что у животных дикого типа 84% здоровых клеток представляют собой двухклеточные эмбрионы, тогда как только 1% клеток в тканеспецифических нокаутах прогрессируют до двухклеточной стадии.Многие из нокаутных яиц содержат сперматозоиды в перивителлиновом пространстве после спаривания, что указывает на то, что проникновение в кучевой слой и ZP происходит нормально. In vitro сперматозоиды не могут сливаться с ооцитами, не содержащими ZP, от нокаутных самок.
Дефект в этих ооцитах может быть вызван одним из нескольких факторов. В ооцитах может отсутствовать один или несколько GPI-AP, критических для слияния. CD55 был недавно идентифицирован как яичный GPI-заякоренный белок, но мыши, у которых есть целевые делеции в этом гене, здоровы и плодовиты, что исключает роль этого белка в слиянии сперматозоидов и ооцитов (Alfieri et al., 2003; Sun et al., 1999). Идентификация потенциальных кандидатов в литературе или протеомная каталогизация GPI-AP ооцитов будут полезны для изучения их возможной функции. Отсутствие GPI-AP может также приводить к нарушениям плазматической мембраны ооцита. GPI-заякоренные белки обогащены классическими липидными рафтами, и потеря GPI-AP может привести к нарушению этих специализированных доменов.
Присутствие домена дезинтегрина в белках сперматозоидов семейства ADAM (для «дезинтегрина и металлопротеазы») вместе с серией экспериментов in vitro первоначально указывало на роль интегринов яйца в событиях слияния плазматической мембраны.Однако тесты in vivo роли интегринов не подтвердили первоначальные данные in vitro. Нокаут-эксперименты с использованием членов семейства интегринов до сих пор не показали никакой роли какого-либо интегрина, который, как известно, экспрессируется в ооците или действует как рецептор ADAM — все интегрины β1, включая α-субъединицы 2, 3, 5, 6, 9 и v, интегрин αvβ3 и интегрин αvβ5 (He et al., 2003; Miller et al., 2000). Все самки мышей с нокаутом, лишенные этих интегринов на яйцах, имеют нормальную фертильность in vivo и / или (где применимо) in vitro.Блокирование функции дополнительных интегринов в различных комбинациях также не влияет на слияние. Хотя все еще возможно, что роль некоторых интегринов ооцитов в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток будет обнаружена, дальнейшее рассмотрение этой гипотезы должно ждать новых доказательств.
Белки семейства
ADAM являются идеальными кандидатами на роль прикрепляющих белков на сперматозоидах благодаря наличию трансмембранного домена и двух доменов межклеточной адгезии — дезинтегриновых и цистеин-богатых доменов (Iba et al., 2000; Примакофф и Майлз, 2000). Основополагающие члены семейства ADAM, субъединицы гетеродимерного удобрения (ADAM1b-ADAM2), были первоначально идентифицированы при скрининге моноклональных антител для белков спермы морских свинок, играющих роль в слиянии гамет (Primakoff et al., 1987). На сегодняшний день идентифицировано 39 членов семьи ADAM. Около половины из них являются белками, специфичными для семенников или обогащенными семенниками, что указывает на то, что это семейство белков может играть важную роль в функции сперматозоидов.
Наиболее изученными ADAM сперматозоидов являются оплодотворение β (ADAM2) и циритестин (ADAM3).Первоначальные эксперименты на мышиной системе показали, что пептиды из дезинтегриновой петли этих двух ADAM сильно ингибируют слияние сперматозоидов и ооцитов in vitro, тогда как те же области ADAM1, ADAM4 и ADAM5 неэффективны (Yuan et al., 1997). Нацеленная делеция Adam2 или Adam3 дает бесплодных мышей-самцов (Cho et al., 1998; Nishimura et al., 2001; Shamsadin et al., 1999). Однако обе линии мышей обнаруживают дефекты в процессе оплодотворения до взаимодействия с мембраной гамет. Adam2 — / — сперматозоиды обнаруживают дефектный транзит по женским репродуктивным трактам (Cho et al., 1998). Adam2 — / — и Adam3 — / — мыши обнаруживают дефектное связывание ZP (Cho et al., 1998; Nishimura et al., 2001; Shamsadin et al., 1999). Тесты in vitro ооцитов без ZP показали, что сперматозоиды Adam3 — / — связываются с плазматической мембраной ооцита на очень низких уровнях (9% по сравнению с диким типом), но сливаются с нормальной скоростью (Nishimura et al., 2001). Это открытие исключает необходимую роль циритестина в физиологически значимом связывании или слиянии с плазматической мембраной. Такой вывод подтверждается недавними данными, показывающими, что ADAM3 высвобождается из клетки во время акросомной реакции и, следовательно, может не присутствовать на поверхности сперматозоидов в качестве интегрального белка во время связывания с плазматической мембраной (Kim et al., 2004). Adam2 — / — сперматозоиды демонстрируют аналогичное снижение связывания с плазматической мембраной и снижение слияния на 50% в этих условиях in vitro (Cho et al., 1998). Adam2 — / — Adam3 — / — мыши с двойным нокаутом, имитирующие сперму Adam2 — / — (Nishimura et al., 2001). ADAM2 не важен для связывания или слияния плазматической мембраны, но может играть роль в этом процессе. Молекулярное рассечение этого белка может дать лучшее понимание его прямой роли, если таковая имеется, в слиянии.
Наконец, еще один фактор усложняет интерпретацию этих данных. Adam2 — / — и Adam3 — / — сперматозоиды не лишены только генетически нацеленного белка. Благодаря еще не определенному механизму, уровни по крайней мере двух других ADAM (ADAM3, ADAM1b) снижаются в сперме Adam2 — / — , и возможно, что потеря распространяется на другие классы белков (Nishimura и др., 2001). Adam3 — / — сперматозоиды демонстрируют аналогичный, хотя и менее тяжелый фенотип. Существенная роль белка ADAM в слиянии все еще возможна, поскольку несколько других ADAM экспрессируются в сперматозоидах (Brachvogel et al., 2002; Choi et al., 2003; Вольфсберг и др., 1995; Чжу и др., 2001). Исследования ингибирования рекомбинантного белка и пептидной петли дезинтегрина показывают несколько специфическое и сильное ингибирование слияния (Chen and Sampson, 1999; Yuan et al., 1997). Эти пептиды могут ингибировать взаимодействие некоторых других ADAM с ооцитом.
Прогресс последних нескольких лет позволил идентифицировать несколько белков, важных для слияния сперматозоидов и яйцеклеток, хотя многие нерешенные вопросы остаются.Чтобы добиться прогресса в идентификации белков прикрепления, создание надежного анализа связывания было бы значительным преимуществом. Улучшение настоящего анализа может быть достигнуто за счет использования сперматозоидов с зеленым флуоресцентным белком (GFP) -акрозином (Nakanishi et al., 1999), что позволяет различать неспецифическое (без акросомы) связывание сперматозоидов с плазматической мембраной ооцита и связывание сперматозоидов, прореагировавших на акросомы. Следует стремиться к более глубокому пониманию роли CD9, включая идентификацию ассоциированных белков ооцита и возможного лиганда сперматозоидов.В свете недавних исследований (Cherukuri et al., 2004), домены вне EC2, особенно сайты пальмитоилирования, также могут быть исследованы. Присутствие Ig-подобных доменов на связывающих белках в других системах слияния и предполагаемая роль PSG-17-подобного белка во взаимодействиях сперматозоида и яйцеклетки побуждают к тщательному изучению белков гамет, содержащих домены Ig. Транскриптом спермы мыши был недавно опубликован (Schultz et al., 2003) и, вероятно, будет полезен в этом качестве. Наконец, недавние технологические достижения сделали генетический скрининг мутантов у мышей правдоподобным методом выявления мутантов, дефектных в биологическом процессе (Branda and Dymecki, 2004; Lessard et al., 2004). Вполне вероятно, что в будущем «прямая генетика» предоставит мощный подход к идентификации кандидатов для прикрепления гамет и слитых белков в сперматозоидах и ооцитах.
Слияние сперматозоидов и яйцеклеток без расшифровки | Nature
Inoue, N., Ikawa, M., Isotani, A. & Okabe, M. Nature 434 , 234–238 (2005).
ADS
CAS
Статья
Google ученый
Hunnicutt, G.R., Primakoff, P. & Myles, D. G. Biol. Репродукция. 55 , 80–86 (1996).
CAS
Статья
Google ученый
Stein, K. K. et al. J. Cell Sci. 117 , 6269–6274 (2004).
CAS
Статья
Google ученый
Okabe, M. et al. J. Reprod. Иммунол. 11 , 91–100 (1987).
CAS
Статья
Google ученый
Окабе, М.и другие. J. Reprod. Иммунол. 13 , 211–219 (1988).
CAS
Статья
Google ученый
Taylor, M. V. Curr. Биол. 12 , R224 – R228 (2002).
CAS
Статья
Google ученый
Ле Наур, Ф., Рубинштейн, Э., Жасмин, К., Пренан, М. и Буше, К. Science 287 , 319–321 (2000).
ADS
CAS
Статья
Google ученый
Miyado, K. et al. Science 287 , 321–324 (2000).
ADS
CAS
Статья
Google ученый
Kaji, K. et al. Dev. Биол. 247 , 327–334 (2002).
CAS
Статья
Google ученый
Уотерхаус, Р., Ha, C. & Dveksler, G. S. J. Exp. Med. 195 , 277–282 (2002).
CAS
Статья
Google ученый
Alfieri, J. A. et al. J. Cell Sci. 116 , 2149–2155 (2003).
CAS
Статья
Google ученый
Дин, Дж. BioEssays 26 , 29–38 (2004).
CAS
Статья
Google ученый
Неразгаданные загадки в распознавании сперматозоидов
Abstract
Половое размножение — настолько успешный способ создания потомства с тонкими генетическими вариациями, что подавляющее большинство видов эукариот используют его.У млекопитающих это связано с образованием высокоспециализированных клеток: сперматозоидов у мужчин и яйцеклеток у женщин, каждая из которых несет генетическую наследственность индивидуума. Взаимодействие сперматозоидов и яйцеклеток завершается слиянием их клеточных мембран, вызывая молекулярные события, которые приводят к образованию нового генетически отличного организма. Хотя у нас есть хорошее клеточное описание оплодотворения у млекопитающих, многие из задействованных молекул остаются неизвестными, и особенно идентичность и роль белков клеточной поверхности, которые отвечают за распознавание, связывание и слияние сперматозоидов с яйцеклеткой.Здесь мы выделим и обсудим эти пробелы в наших знаниях и то, как роль некоторых недавно обнаруженных поверхностей сперматозоидов и секретируемых белков способствует нашему пониманию этого фундаментального процесса.
Образец цитирования: Bianchi E, Wright GJ (2020) Находка и объединение: неразгаданные тайны распознавания сперматозоидов и яйцеклеток. ПЛоС Биол 18 (11):
e3000953.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000953
Опубликовано: 13 ноября 2020 г.
Авторские права: © 2020 Bianchi, Wright.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Эта работа была поддержана грантом MR / M012468 / 1 Совета медицинских исследований Великобритании (https://mrc.ukri.org/), грантом BB / T006390 / 1 Совета по исследованиям биотехнологии и биологических наук (https : //bbsrc.ukri.org/) и грант Wellcome Trust 206194.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов
Сокращения:
АДАМ ,
Дезинтегрин и металлопротеиназа; CD,
Кластер дифференциации; ИЗОБРАЗИТЕЛЬНОЕ ИСКУССТВО,
Вспомогательные репродуктивные технологии; ЭФФ-1,
Нарушение сращения эпителия 1; ФИМП,
Мембранный белок, влияющий на оплодотворение; GCS1,
Специфичные для генеративных клеток 1; GPI,
Гликозилфосфатидилинозитол; HAP2,
Hapless 2; Ig,
иммуноглобулин; ЭКО,
экстракорпоральное оплодотворение; SAMP14,
белок акросомальной мембраны сперматозоидов 14; SOF1,
Требуется слияние сперматозоидов и ооцитов 1; SPACA6,
Протеин, ассоциированный с мембраной SPerm ACrosome 6; TMEM95,
TransMEMbrane белок 95; VERL,
Рецептор желточной оболочки для лизина; ЗП,
zona pellucida
Введение
Оплодотворение — это объединение двух гаплоидных клеток — яйцеклетки и сперматозоида — для создания нового диплоидного организма, который обеспечивает передачу генетической информации от одного поколения к другому.Яйцо является одной из самых крупных клеток у млекопитающих и защищено гликопротеиновым матриксом, который под микроскопом выглядит как полупрозрачное кольцо и поэтому называется zona pellucida (ZP) от латинского «zona», что означает пояс или кольцо. и «pellucidum», что означает «прозрачный». Само яйцо окружено мембраной, называемой оолеммой, и у млекопитающих характеризуется большим количеством коротких выступов (микроворсинок), хотя они отсутствуют в области, прилегающей к мейотическому веретену, что также отмечено присутствием полярное тело.Сперма имеет отличительную морфологию, состоящую из 3 областей: головы, средней части и хвоста. Голова содержит ядро с отцовской ДНК и внутриклеточную мембраносвязанную органеллу, называемую акросомой, расположенную над ядром. Средняя часть содержит митохондрии, которые генерируют химическую энергию, которая затем передается хвостом, чтобы продвигать сперматозоиды в женских половых путях (рис. 1A).
Рис. 1. Схема гамет млекопитающих и различных стадий оплодотворения.
(A) До оплодотворения яйца млекопитающих удерживаются в метафазе II второго мейотического деления с хромосомами, выровненными на метафазной пластинке; половина материнской ДНК экструдировалась и удерживалась в полярном теле во время мейоза I. Оолемма, покрывающая мейотическое веретено, лишена микроворсинок, и сперматозоиды не прилипают или не сливаются в этой области. Обратите внимание, что яйцеклетка и сперматозоиды не масштабированы; головка сперматозоида в 5–10 раз меньше яйцеклетки. (B) Оплодотворение разделено на несколько этапов.Акросомная реакция высвобождает ферменты и обнажает лиганды сперматозоидов (такие как IZUMO1), которые ранее были изолированы в головке сперматозоида, и только сперматозоиды, прореагировавшие на акросомы, могут пройти через ZP и оплодотворить яйцеклетку. Связывание и слияние рассматриваются как отдельные события, потому что есть свидетельства того, что их можно генетически и экспериментально различить. Изменения в яйцеклетке, вызванные оплодотворением, снижают способность сперматозоидов слиться с уже оплодотворенной яйцеклеткой по механизму, известному как блок полиспермии.Модификации происходят как на яичной мембране, так и на ZP (подробные обзоры по этому поводу см. [4-6]). ZP, zona pellucida.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000953.g001
Оплодотворение привлекало биологов на протяжении веков, а развитие методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у млекопитающих позволило очень подробно описать клеточное происхождение сперматозоидов. и яйцо ведут себя и взаимодействуют. Основываясь на этих микроскопических наблюдениях, оплодотворение можно концептуально разделить на 4 последовательных события (рис. 1B).Во-первых, акросомная мембрана сливается с плазматической мембраной сперматозоидов, этот процесс известен как акросомная реакция. Это событие высвобождает ферменты и лиганды клеточной поверхности, которые ранее были изолированы в головке сперматозоида [1,2]. Во-вторых, сперма должна проникнуть через ЗП, чтобы получить доступ к перивителлиновому пространству: заметному промежутку между яйцеклеткой и ЗП. В-третьих, сперматозоид, прореагировавший на акросомы, должен распознавать оолемму и прикрепляться к ней, после чего происходит слияние сперматозоидов и оболочек яйцеклетки, так что две клетки становятся одной; создан новый диплоидный организм и достигнуто оплодотворение [3].Наконец, оплодотворенная яйцеклетка должна предотвращать дополнительные слияния сперматозоидов, чтобы избежать создания нежизнеспособного полиплоидного эмбриона, и это достигается изменением как ZP, так и оолеммы, так что они становятся менее восприимчивыми к дополнительным поступающим сперматозоидам [4-6]. В этой неразгаданной тайне мы сосредоточимся на клеточных взаимодействиях сперматозоидов и яйцеклетки и особенно на молекулах, участвующих в связывании сперматозоидов с ZP, связывании сперматозоидов с оолеммой и слиянии клеточных мембран; на каждом этапе мы будем выделять, где задействованные молекулярные механизмы остаются нерешенной загадкой.
Несмотря на подробное клеточное описание этого процесса, нашему пониманию задействованных молекулярных механизмов препятствуют некоторые уникальные экспериментальные проблемы [7]. Сперматозоиды и яйцеклетки — это окончательно дифференцированные клетки, которые в течение короткого времени выживают вне организма и быстро дегенерируют и умирают, если оплодотворение не происходит. Зрелая сперма вырабатывается в огромных количествах на протяжении всей взрослой жизни мужчины и на последних стадиях спермиогенеза транскрипционно и трансляционно молчит [8,9].Напротив, в яичнике присутствует ограниченное количество ооцитов, и очень немногие из них в конечном итоге созревают и высвобождаются или овулируются в течение жизни самки. У млекопитающих ооциты являются очень редким типом клеток, что ограничивает количество доступного биологического материала, и, по понятным причинам, существуют очень строгие этические ограничения, которые не позволяют смешивать человеческие сперматозоиды и яйцеклетки для экспериментального анализа. Более того, изучение роли и молекулярных взаимодействий рецепторов на клеточной поверхности, встроенных в мембрану, затруднено из-за их амфипатического характера и, как правило, весьма преходящей природы внеклеточных белок-белковых взаимодействий [10].
Разработка методов ЭКО у млекопитающих была одним из главных биомедицинских прорывов 20-го века, открыв путь к вспомогательному лечению бесплодия [11,12] и предоставив ученым бесценный инструмент для исследования клеточной основы взаимодействия сперматозоидов и яйцеклеток. Впервые гаметы можно было наблюдать и изучать вне организма, и молекулярные основы этого процесса клеточного распознавания можно было легко исследовать, добавляя экзогенные молекулы, такие как антитела, экстракты клеток и неорганические соединения [13-15].К сожалению, многие кандидаты, которые были идентифицированы с помощью этих подходов, оказались незаменимыми для оплодотворения, когда их роль была исследована с использованием целевого разрушения генов у мышей [16]; например, роль ADAM (дезинтегрин и металлопротеаза) 1b / ADAM2 — гетеродимера поверхности сперматозоидов, первоначально названного фертином [17], была поставлена под сомнение, когда впоследствии было обнаружено, что самцы мышей с дефицитом генов полностью фертильны [18] . IZUMO1, названный в честь японского брачного храма, является единственным примером белка поверхности сперматозоидов, который изначально был продемонстрирован как необходимый для оплодотворения путем добавления моноклонального антитела, распознающего этот белок в анализах ЭКО [19], и роль которого была недвусмысленно подтверждена в генах. -дефицитные мыши [20].Внедрение технологий редактирования генов в 1980-х годах стало бесценным инструментом для исследования функций генов в модельных организмах [21], а замечательные успехи, достигнутые за последнее десятилетие [22], значительно упростили создание мышей с дефицитом генов. систематически применяется для исследования роли большого количества потенциальных кандидатов в сперматозоиды, многие из которых не играют никакой роли в фертильности [23,24]. Примечательно, что всего за несколько месяцев было сообщено о 4 новых генах, которые кодируют поверхность сперматозоидов или секретируемые белки, которые необходимы для мужской фертильности: SPerm ACrosome мембранно-ассоциированный белок 6 ( Spaca6 ), мембранный белок, влияющий на оплодотворение ( Fimp ). ), Для слияния сперматозоидов и ооцитов требуется 1 ( Sof1 ) и белок TransMEMbrane 95 ( Tmem95 ) [25–28].В этой статье мы обсудим 2 фундаментальные и все же непреходящие загадки, касающиеся распознавания сперматозоидов и яйцеклеток, и поместим эти недавние открытия в наше понимание оплодотворения.
Как сперма распознает ЗП?
ZP образует защитную оболочку вокруг яйцеклетки и представляет собой главный барьер для доступа сперматозоидов к мембране яйцеклетки. У людей эта оболочка внеклеточного матрикса состоит из 4 белков (ZP1, ZP2, ZP3 и ZP4), а у мышей — из 3, поскольку Zp4 является псевдогеном.У других млекопитающих существуют разные комбинации одних и тех же гликопротеинов; например, ZP у свиней и крупного рогатого скота состоит из ортологов ZP2, ZP3 и ZP4. Наблюдение за тем, что сперматозоиды легко связываются с ZP неоплодотворенных яйцеклеток, но неспособны связывать ZP двухклеточных эмбрионов, побудило исследователей исследовать, какой из белков ZP опосредует это связывание и действует как рецептор сперматозоидов. Теперь ясно, что N-концевое протеолитическое расщепление ZP2 снижает способность сперматозоидов связывать яйцеклетку [29–31], и эксперименты по обмену доменов на трансгенных животных подтверждают гипотезу о том, что ZP2 является рецептором сперматозоидов [32].Считается, что после оплодотворения яйцеклетка активируется, вызывая экзоцитоз кортикальных гранул с высвобождением астацин-подобной металлоэндопептидазы, называемой овастацином. Мутация сайта процессинга ZP2 или генетическое устранение гена, кодирующего овастацин, предотвращает расщепление ZP2, что приводит к сохранению связывания сперматозоидов с ZP даже после оплодотворения [33,34]. Поскольку у нас еще нет сперматозоида-лиганда-кандидата для ZP2, остается загадкой, является ли отщепленный фрагмент ZP2 реальным рецептором сперматозоидов или же структурные изменения, возникающие в результате расщепления, скрывают или удаляют сайт связывания сперматозоидов.Также были получены доказательства того, что ZP3 и / или гликаны являются рецептором сперматозоидов ZP [35]; однако эксперименты по целенаправленной делеции генов на животных моделях не разрешили вопрос, потому что ZP2 и ZP3 необходимы для образования ZP [29,36]. Примечательно, что ни один из новых незаменимых белков сперматозоидов, по-видимому, не участвует в связывании ZP, поскольку удаление ZP не преодолевает дефект бесплодия сперматозоидов с удаленным геном [25–28]. Кристаллическая структура белков ZP может, наконец, дать долгожданный ответ, и недавняя структура домена ZP, модуля полимеризации белка, состоящего примерно из 260 аминокислот, обнаруженных во многих секретируемых белках, включая все ZP, предполагает, что область связывания сперматозоидов может лежат на границе между субъединицами ZP2 и ZP3 [37].Как сперматозоиды проходят через фибриллярную сеть, когда они связаны с ней, остается открытым вопросом в серии событий, ведущих к оплодотворению. Новые идеи были получены из структуры лизина белка сперматозоидов и его партнера по связыванию яйцеклеток VERL (рецептор желточной оболочки для лизина) морского моллюска. Хотя нет известных гомологов лизина у позвоночных, функциональные области ZP2 и VERL структурно гомологичны, это указывает на то, что сходные механизмы связывания и прохождения через ZP могут быть приняты такими разными видами, как моллюски и млекопитающие [38,39].
Опосредуют ли недавно идентифицированные белки сперматозоидов слияние или связывание?
Золотым стандартным методом оценки важности гена для оплодотворения является проверка фертильности генетически модифицированного животного, у которого отсутствует интересующий ген [40]. На основании этого критерия до недавнего времени было известно, что для оплодотворения у млекопитающих необходимы только 3 гена, каждый из которых кодирует белок клеточной поверхности: CD9 (кластер дифференциации 9) и JUNO (названный в честь римской богини брака и плодородия) в яйце. [41–43] и IZUMO1 в сперме [20] (Рис. 1).Животные, лишенные этих белков, обладают характерным фенотипом; хотя они способны производить сперматозоиды и яйцеклетки, которые явно нормальны по количеству, внешнему виду и поведению, оплодотворение не удается на заключительной стадии адгезии и слияния.
Тщательное исследование CD9-дефицитных яиц показало, что форма и распределение их микроворсинок были изменены [44], предполагая, что этот белок участвует в организации общей архитектуры клеточной мембраны и других белков, встроенных в нее.CD9 принадлежит к семейству мембранных белков, известных как тетраспанины, которые, как следует из их названия, содержат 4 трансмембранные области, что недавно было подтверждено структурными исследованиями [45]. CD9 образует гомофильные и гетерофильные взаимодействия, а также макромолекулярные комплексы с другими тетраспанинами, включая CD81 [46], который также экспрессируется в яйцах и отсутствие которого также снижает фертильность самок; примечательно, что яйца, лишенные как CD9, так и CD81, стерильны, не влияя на проникновение сперматозоидов и ZP [47].Тетраспанины играют хорошо известную роль в клеточной адгезии и передаче сигналов [48], что побудило к поиску партнеров по взаимодействию CD9 и CD81, но те, которые были идентифицированы, впоследствии оказались незаменимыми для оплодотворения [49]. Некоторые элегантные биофизические измерения показали, что CD9 генерирует компетентные к слиянию сайты на поверхности яйца [50] с накоплением молекул CD9 в месте взаимодействия сперматозоида с яйцом, которое предшествует событию слияния [51]. Эти наблюдения согласуются со способностью тетраспанинов организовывать распределение и функциональную кластеризацию на плазматической мембране путем образования высокоорганизованных микродоменов [52].Другой важный яичный белок, JUNO, был идентифицирован как рецептор IZUMO1 путем экспрессионного клонирования библиотеки кДНК ооцитов мыши [42]. IZUMO1 — это лиганд поверхности сперматозоидов, который был идентифицирован 9 лет назад и, как было показано, необходим для мужской фертильности [20]. Эти 2 белка образуют пару рецептор-лиганд, которая важна для адгезии сперматозоидов и яйцеклеток (Рис. 2), а выделение JUNO после оплодотворения с поверхности яйца обеспечивает вероятный механизм мембранного блока для полиспермии [42,53]. Экспрессия и связывание JUNO и IZUMO1 подтверждены у людей [54] и у других животных [55,56], предполагая, что их роль сохраняется среди млекопитающих.Гетерологичная экспрессия IZUMO1 и JUNO в соседних клетках не вызывает слияния мембран, что стимулирует поиск других белков, известных как «фузогены», которые необходимы на заключительном этапе оплодотворения. Существование дополнительного рецептора яйца для IZUMO1 было предложено в модели, согласно которой первоначальное задействование JUNO посредством IZUMO1 запускает димеризацию IZUMO1, вызывая конформационное изменение, опосредованное дисульфид-изомеразой белка, которое отключает IZUMO1 от JUNO, что делает его доступным для связывания второго рецептора и тем самым сближают мембраны клеток гамет [57].Эта модель нуждается в дальнейших экспериментальных доказательствах, поскольку для IZUMO1 не был идентифицирован никакой другой рецептор яйца, кроме JUNO, а IZUMO1 не обладает какой-либо структурной гомологией с известными фузогенами [58] из других организмов, подтверждая идею о том, что это адгезионный белок, а не фузоген.
Рис. 2. Белки клеточной поверхности, необходимые для оплодотворения млекопитающих.
Связывание GPI-заякоренного яичного белка JUNO с эктодоменом сперматозоида IZUMO1 обеспечивает адгезию мембран клеток гамет и имеет важное значение для оплодотворения.Три однопроходных мембранных белка, экспрессируемых спермой, — SPACA6, TMEM95 и FIMP — необходимы для оплодотворения. Как и IZUMO1, внеклеточная область SPACA6 содержит иммуноглобулин-подобный домен, в то время как структурные данные для TMEM95 и FIMP отсутствуют. Четвертый белок сперматозоидов, необходимый для оплодотворения, SOF1, представляет собой предположительно секретируемую молекулу неизвестной структуры. Два тетраспанина, CD9 и CD81, также необходимы для оплодотворения, и нет никаких доказательств того, что они напрямую взаимодействуют с какими-либо другими белками.CD, Кластер дифференциации; FIMP, протеин, влияющий на оплодотворение; GPI, гликозилфосфатидилинозитол; SOF1, требуется слияние сперматозоидов и ооцитов 1; SPACA6, ассоциированный с мембраной белок SPerm ACrosome 6; TMEM95, трансмембранный белок 95.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000953.g002
Использование технологий CRISPR привело к недавней и замечательной идентификации 4 новых белков спермы, которые необходимы для оплодотворения млекопитающих (рис. 2). Это 3 заякоренных в мембране белка, FIMP [28], SPACA6 [25,27] и TMEM95 [25,26], и предсказанный секретируемый белок, SOF1 [25].Подобно IZUMO1, SPACA6 представляет собой трансмембранный белок типа I с коротким цитоплазматическим С-концом и иммуноглобулиновым (Ig) -подобным доменом в середине его внеклеточной области. TMEM95, FIMP и SOF1 — это небольшие белки, состоящие менее чем из 200 аминокислот, которые высоко экспрессируются в семенниках. Самцы мышей, лишенные любого из этих 4 белков, фенокопировали Izumo1 -дефицитных самцов; они производят сперматозоиды нормальной морфологии и подвижности, и их прохождение ZP и связывание с яйцеклетками было сопоставимо с таковым у сперматозоидов дикого типа.Однако они потерпели неудачу на самом последнем этапе и не слились с яйцом. Однако одно из основных различий между IZUMO1 и четырьмя новыми белками состоит в том, что гетерологичные клетки, сверхэкспрессирующие IZUMO1, способны эффективно прикрепляться к яйцеклеткам, что не присуще ни одному из новых кандидатов, что позволяет предположить, что они играют незначительную роль в сперматозоиде или не играют никакой роли. –Распознавание яиц. Может ли кто-нибудь из этих новых кандидатов выполнять роль фузогена для оплодотворения?
Gamete fusogens: эволюционная перспектива
Поскольку слияние мембран является энергетически неблагоприятным событием, для него требуется действие определенного белка или fusogen.Оценка способности молекулы к слиянию часто основана на косвенных измерениях, обычно на внутриклеточном переносе маркера между двумя сливающимися клетками. Существует также негласное предположение, что кандидат-фузоген сохраняет свою активность, когда изолирован от его естественной биологической среды и экспрессируется в гетерологичной системе. Подобно IZUMO1, SPACA6, FIMP, TMEM95 и SOF1 не способны индуцировать слияние клеток ни по отдельности, ни вместе при оценке в анализе слияния клеток [25–28]. Эти новые белки сперматозоидов, таким образом, вряд ли будут долгожданной молекулой, которая индуцирует слияние в гаметах млекопитающих.В частности, FIMP, по-видимому, не подходит для этой роли, потому что мужская фертильность была спасена трансгенной сверхэкспрессией, хотя она не была обнаружена в 40% сперматозоидов, прореагировавших на акросомы, что позволяет предположить, что FIMP не является существенным после реакции акросомы и, следовательно, не участвует в сперматозоиде-яйцеклетке. слияние.
Если они не являются фузогенами и не участвуют в связывании сперматозоидов с яйцеклеткой, могут ли они выполнять клеточно-автономную функцию в сперматозоидах, возможно, путем образования комплексов с другими белками сперматозоидов? Во время акросомной реакции массивная реорганизация мембран сперматозоидов перемещает секвестрированные молекулы, такие как IZUMO1, в определенную область на поверхности сперматозоидов, что вызывает слияние с оолеммой.Вполне возможно, что даже небольшой недостаток в этом перемещении мог бы произвести сильный эффект; однако световая микроскопия показала, что на перемещение IZUMO1 не сильно влияет отсутствие SPACA6, FIMP, TMEM95 или SOF1 [25–28]. Тем не менее, более мощные методы микроскопии, которые могут предоставить более подробный пространственно-временной анализ локализации IZUMO1, могут предоставить более информативные данные. Могут ли эти новые белки обеспечить функциональность IZUMO1? Анализы связывания клеток и эксперименты по коиммунопреципитации предполагают, что они не взаимодействуют напрямую с IZUMO1, но функциональное взаимодействие SPACA6, TMEM95, SOF1 и FIMP еще не исследовано полностью.
Другой, но родственный белок, SPACA4, представляет собой очень интересный случай с эволюционной точки зрения, и возможный слияние гамет SPACA4 / белок акросомной мембраны 14 сперматозоидов (SAMP14) является заякоренным гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) белком, отображаемым на поверхности акросомы. прореагировала сперма, роль которой у млекопитающих должна быть полностью выяснена [59]. Антитело, продуцируемое против рекомбинантного SPACA4, блокировало оплодотворение яиц хомячка без ZP спермой человека [60], но, как мы обсуждали выше, необходимо создание генетически модифицированных мышей, чтобы определить, является ли этот белок важным.Примечательно, что ортолог SPACA4 у рыбок данио — белок, названный Bouncer — важен для распознавания сперматозоидов и яйцеклеток у этой модели позвоночных [59]. У рыбок данио Bouncer отображается на поверхности икры и обеспечивает оплодотворение для конкретных видов, биология, которая имеет большее значение для нерестовых видов, чем для млекопитающих, оплодотворяющих изнутри. Идентичность рецептора спермы для Bouncer остается неизвестной, и если он существует, важно понять, ограничивается ли его экспрессия также различными гаметами.
Заключение
Идентификация молекул, необходимых для оплодотворения, и понимание того, как они взаимодействуют и взаимодействуют для обеспечения распознавания, связывания и слияния сперматозоидов и яйцеклеток, может привести к существенному улучшению вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не только у людей, но и у исчезающих видов. чье выживание может зависеть от таких подходов. АРТ также широко используются в животноводстве, где более эффективные протоколы являются ценным активом. Кроме того, это может привести к разработке более совершенных диагностических тестов на бесплодие и к новым негормональным контрацептивам.
Заключительные замечания по подходам и техническим достижениям
Идентификация этих новых незаменимых белков сперматозоидов, несомненно, станет важным вкладом в всеобъемлющее молекулярное понимание оплодотворения млекопитающих, хотя сейчас необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять их точную механистическую роль. Вопрос о том, существует ли фузоген для оплодотворения или нет, остается важным, но без ответа. У растений и водорослей использование генетического скрининга на оплодотворение и слияние мутантов привело к открытию HAP2 (Hapless 2) и является примером того, как можно решить эту проблему.HAP2 / GCS1 (Generative Cell Specific 1) — это мембранный белок, необходимый для слияния гамет, который консервативен у всех низших эукариот, кроме грибов [61–63], и не имеет гомологов у позвоночных. HAP2 структурно подобен EFF-1 (Epithelial Fusion Failure-1), белку слияния соматических клеток в Caenorhabditis elegans , и слитым белкам вирусного класса II [64], что указывает на то, что они могли развиться от общего предка [65] ]. Мы можем предположить, что систематические крупномасштабные экраны вместе с постоянным совершенствованием методов криоэлектронной микроскопии и разработкой более эффективных протоколов получения гамет из соматических клеток проложат путь к новым захватывающим открытиям.
Благодарности
Мы благодарим Марию Хименес-Мовилла, Пабло Бермехо-Альварес и Масахито Икава за предоставленные данные перед публикацией.
Список литературы
- 1.
Hirohashi N, Yanagimachi R. Реакция акросомы спермы: ее место и роль в оплодотворении. Биол Репрод. 2018; 99: 127–133. pmid: 29462288 - 2.
Рамальо-Сантос Дж., Шаттен Дж., Морено РД. Контроль слияния мембран во время спермиогенеза и акросомной реакции.Биол Репрод. 2002; 67: 1043–1051. pmid: 12297516 - 3.
Бьянки Э, Райт ГДж. Сперма встречается с яйцеклеткой: генетика оплодотворения млекопитающих. Анну Рев Жене. 2016; 50: 93–111. pmid: 27617973 - 4.
Эванс JP. Предотвращение полиспермии в яйцах млекопитающих — вклад мембранного блока и других механизмов. Mol Reprod Dev. 2020; 87: 341–349. pmid: 32219915 - 5.
Гарднер AJ, Эванс JP. Мембранная блокировка полиспермии млекопитающих: новые сведения о том, как яйца млекопитающих предотвращают оплодотворение множественными сперматозоидами.Reprod Fertil Dev. 2006; 18: 53–61. pmid: 16478602 - 6.
Вонг JL, Wessel GM. Защищая зиготу: ищите предков животных, препятствующих полиспермии. Curr Top Dev Biol. 2006; 72: 1–151. pmid: 16564333 - 7.
Wright GJ, Bianchi E. Проблемы, связанные с выяснением молекулярных основ распознавания сперматозоидов у млекопитающих, и подходы к их преодолению. Cell Tissue Res. 2016; 363: 227–235. pmid: 26224538 - 8.
Grunewald S, Paasch U, Glander H-J, Anderegg U.Зрелые сперматозоиды человека не транскрибируют новую РНК. Андрология. 2005; 37: 69–71. pmid: 16026427 - 9.
Шефер М., Найерния К., Энгель В., Шефер Ю. Трансляционный контроль в сперматогенезе. Dev Biol. 1995; 172: 344–352. pmid: 8612956 - 10.
Райт Г.Дж. Инициирование сигнала в биологических системах: свойства и обнаружение временных межклеточных белковых взаимодействий. Мол Биосист. 2009; 5: 1405–1412. pmid: 19593473 - 11.
Бедфорд Дж. М., Чанг М. С..Оплодотворение яйцеклеток кролика in vitro. Природа. 1962; 193: 808–809. pmid: 13866459 - 12.
Biggers JD. ЭКО и перенос эмбрионов: историческое происхождение и развитие. Репродукция Биомед онлайн. 2012; 25: 118–127. pmid: 22695311 - 13.
Алмейда Е.А., Хуовила А.П., Сазерленд А.Е., Стивенс Л.Е., Каларко П.Г., Шоу Л.М. и др. Интегрин яиц мыши альфа 6 бета 1 действует как рецептор сперматозоидов. Клетка. 1995. 81: 1095–1104. pmid: 7600577 - 14.
Понсе Р.Х., Янагимачи Р., Urch UA, Ямагата Т., Ито М.Сохранение слияния оолеммы хомяка со сперматозоидами после различных обработок ферментами: поиск молекул, участвующих в слиянии сперматозоидов и яйцеклеток. Зигота. 1993; 1: 163–171. pmid: 8081812 - 15.
Цукуи С., Нода Ю., Яно Дж., Фукуда А., Мори Т. Ингибирование проникновения сперматозоидов через блестящую оболочку человека с помощью антиспермальных антител. Fertil Steril. 1986; 46: 92–96. pmid: 3522282 - 16.
Окабе М. Механизм оплодотворения: современный взгляд. Exp Anim. 2014; 63: 357–365. pmid: 24974794 - 17.Blobel CP, Wolfsberg TG, Turck CW, Myles DG, Primakoff P, White JM. Потенциальный пептид слияния и домен интегринового лиганда в белке, активном при слиянии сперматозоидов и яйцеклеток. Природа. 1992; 356: 248–252. pmid: 1552944
- 18.
Ким Э., Ямасита М., Наканиши Т., Пак Кей Э, Кимура М., Кашивабара С. И. и др. Сперматозоиды мышей, лишенные удобрения ADAM1b / ADAM2, могут сливаться с плазматической мембраной яйцеклетки и влиять на оплодотворение. J Biol Chem. 2006; 281: 5634–5639. pmid: 16407235 - 19.
Окабе М., Ягасаки М., Ода Х, Мацно С., Кохама Й, Мимура Т.Влияние моноклональных антител против сперматозоидов мыши (OBF13) на взаимодействие сперматозоидов мыши с свободными от зон зон мышами и яйцами хомяков. J Reprod Immunol. 1988; 13: 211–219. pmid: 3172058 - 20.
Иноуэ Н., Икава М., Исотани А., Окабе М. Белок суперсемейства иммуноглобулинов Идзумо необходим для слияния сперматозоидов с яйцеклетками. Природа. 2005; 434: 234–238. pmid: 15759005 - 21.
Капеччи MR. Нацеливание на гены у мышей: функциональный анализ генома млекопитающих в двадцать первом веке.Nat Rev Genet. 2005; 6: 507–512. pmid: 15931173 - 22.
Берджио Г. Новое определение трансгенеза мышей с помощью технологии редактирования генома CRISPR / Cas9. Геномная биология. 2018; 19: 27. pmid: 294 - 23.
Miyata H, Castaneda JM, Fujihara Y, Yu Z, Archambeault DR, Isotani A, et al. Геномная инженерия обнаруживает 54 эволюционно консервативных и обогащенных семенниками гена, которые не требуются для фертильности самцов мышей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2016; 113: 7704–7710. pmid: 27357688 - 24.Лу И, Оура С., Мацумура Т., Оджи А., Сакурай Н., Фуджихара Ю. и др. Редактирование генома, опосредованное CRISPR / Cas9, выявило 30 генов, обогащенных семенниками, которые необходимы для мужской фертильности у мышей †. Биол Репрод. 2019; 101: 501–511. pmid: 31201419
- 25.
Нода Т., Лу И, Фуджихара И, Оура С., Кояно Т., Кобаяши С. и др. Белки сперматозоидов SOF1, TMEM95 и SPACA6 необходимы для слияния сперматозоидов и ооцитов у мышей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2020; 117: 11493–11502. pmid: 32393636 - 26.
Ламас-Торанцо I, Хамзе Дж. Г., Бьянки Э, Фернандес-Фуэртес Б., Перес-Серезалес С., Лагуна-Барраза Р. и др.TMEM95 — это белок мембраны сперматозоидов, необходимый для оплодотворения млекопитающих. Элиф. 2020; 9: e53913. pmid: 32484434 - 27.
Barbaux S, Ialy-Radio C, Chalbi M, Dybal E, Homps-Legrand M, Do Cruzeiro M и др. Белок сперматозоида SPACA6 необходим для слияния / слияния сперматозоидов и яйцеклеток млекопитающих. Научные отчеты. 2020; 10: 5335. pmid: 32210282 - 28.
Fujihara Y, Lu Y, Noda T., Oji A, Larasati T., Kojima-Kita K и др. Сперматозоиды, в которых отсутствует мембранный белок, влияющий на оплодотворение (FIMP), не могут слиться с ооцитами мышей.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2020; 117: 9393–9400. pmid: 32295885 - 29.
Ранкин Т.Л., О’Брайен М., Ли Э., Вигглсворт К., Эппиг Дж., Дин Дж. Дефектные zonae pellucidae у Zp2-нулевых мышей нарушают фолликулогенез, фертильность и развитие. Разработка. 2001; 128: 1119–1126. pmid: 11245577 - 30.
Байбаков Б., Боггс Н.А., Яугер Б., Байбаков Г., Дин Дж. Сперма человека связывается с N-концевым доменом ZP2 в гуманизированной zonae pellucidae у трансгенных мышей. J Cell Biol. 2012; 197: 897–905.pmid: 22734000 - 31.
Gahlay G, Gauthier L, Baibakov B, Epifano O, Dean J. Распознавание гамет у мышей зависит от статуса расщепления белка zona pellucida яйца. Наука. 2010. 329: 216–219. pmid: 20616279 - 32.
Авелла М.А., Байбаков Б., Дин Дж. Одиночный домен белка ZP2 zona pellucida опосредует распознавание гамет у мышей и людей. J Cell Biol. 2014; 205: 801–809. pmid: 24934154 - 33.
Буркарт А.Д., Сюн Б., Байбаков Б., Хименес-Мовилла М., Дин Дж.Овастацин, кортикальная гранулярная протеаза, расщепляет ZP2 в блестящей оболочке для предотвращения полиспермии. J Cell Biol. 2012; 197: 37–44. pmid: 22472438 - 34.
Токухиро К., Дин Дж. Гликан-независимое распознавание гамет запускает искры цинка в яйцах и расщепление ZP2 для предотвращения полиспермии. Dev Cell. 2018; 46: 627–640.e5. pmid: 30122633 - 35.
Wassarman PM, Bleil JD, Florman HM, Greve JM, Roller RJ, Salzmann GS. Природа рецептора яйцеклетки мыши для спермы. Adv Exp Med Biol.1986; 207: 55–77. pmid: 3548245 - 36.
Ранкин Т., Фамилари М., Ли Е., Гинзберг А., Дуайер Н., Бланшетт-Маки Дж. И др. Мыши, гомозиготные по инсерционной мутации в гене Zp3, лишены блестящей оболочки и бесплодны. Разработка. 1996; 122: 2903–2910. pmid: 8787763 - 37.
Сциапанава А., Сюй С., Брунати М., Замора-Кабаллеро С. Крио-ЭМ-структура природного уромодулина человека, модульного полимера Zona Pellucida. bioRxiv 119206 [Препринт]. 2020 [цитируется 15 июня 2020 года].Доступно по ссылке: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.28.119206v1.abstract - 38.
Радж I, Садат Аль Хоссейни Х., Диогарди Э., Нишимура К., Хан Л., Вилла А и др. Структурные основы распознавания яйцеклетки-сперматозоидов при оплодотворении. Клетка. 2017; 169: 1315–1326.e17. pmid: 28622512 - 39.
Льюис CA, Talbot CF, Vacquier VD. Белок из сперматозоидов морского ушка растворяет желточный слой яйца неферментативным механизмом. Dev Biol. 1982; 92: 227–239. pmid: 7106382 - 40.Иноуэ Н., Ямагути Р., Икава М., Окабе М. Взаимодействие сперматозоидов и яйцеклеток и животные, подвергшиеся манипуляции с генами. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007. 65: 363–371. pmid: 17644977
- 41.
Ле Наур Ф., Рубинштейн Э., Жасмин С., Пренан М., Буше С. Резкое снижение фертильности самок у мышей с дефицитом CD9. Наука. 2000. 287: 319–321. pmid: 10634790 - 42.
Бьянки Э, Доу Б., Гулдинг Д., Райт Г.Дж. Юнона является рецептором яйцеклетки Идзумо и необходим для оплодотворения млекопитающих. Природа.2014; 508: 483–487. pmid: 24739963 - 43.
Миядо К., Ямада Г., Ямада С., Хасува Х., Накамура И., Рю Ф. и др. Потребность CD9 на плазматической мембране яйца для оплодотворения. Наука. 2000. 287: 321–324. pmid: 10634791 - 44.
Runge KE, Evans JE, He Z-Y, Gupta S, McDonald KL, Stahlberg H и др. CD9 ооцита обогащен микровиллярной мембраной и необходим для нормальной формы и распределения микроворсинок. Dev Biol. 2007. 304: 317–325. pmid: 17239847 - 45.Умеда Р., Сатух Ю., Такемото М., Накада-Накура Ю., Лю К., Йокояма Т. и др. Структурные представления о функции тетраспанина CD9. Nat Commun. 2020; 11: 1606. pmid: 32231207
- 46.
Horváth G, Serru V, Clay D, Billard M, Boucheix C, Rubinstein E. CD19 связан с интегрином-ассоциированными тетраспанами CD9, CD81 и CD82. J Biol Chem. 1998; 273: 30537–30543. pmid: 9804823 - 47.
Рубинштейн Э., Зийят А., Пренант М., Вробель Э., Вольф Дж.П., Леви С. и др. Снижение фертильности самок мышей, лишенных CD81.Dev Biol. 2006; 290: 351–358. pmid: 16380109 - 48.
Термини CM, Gillette JM. Тетраспанины действуют как регуляторы клеточной сигнализации. Front Cell Dev Biol. 2017; 5: 34. pmid: 28428953 - 49.
Иноуэ Н., Нисикава Т., Икава М., Окабе М. Белок IGSF8, взаимодействующий с тетраспанином, незаменим для фертильности мышей. Fertil Steril. 2012; 98: 465–470. pmid: 22609062 - 50.
Jégou A, Ziyyat A, Barraud-Lange V, Perez E, Wolf JP, Pincet F и др. CD9-тетраспанин генерирует компетентные для слияния сайты на мембране яйца для оплодотворения млекопитающих.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2011; 108: 10946–10951. pmid: 216 - 51.
Раво Б., Фавье С., Перес Э., Гурье С. Приливы белка CD9 яйца, коррелированные с колебаниями сперматозоидов, настраивают способность к слиянию гамет у млекопитающих. J Mol Cell Biol. 2018; 10: 494–502. pmid: 29370390 - 52.
Чаррин С., Ле Наур Ф., Сильви О., Милхиет П.-Э, Буше С., Рубинштейн Э. Боковая организация мембранных белков: тетраспанины плетут свои сети. Биохим Дж. 2009; 420: 133–154. pmid: 19426143 - 53.Бьянки Э, Райт ГДж. Изумо встречает Юнону: предотвращение полиспермии при оплодотворении. Клеточный цикл. 2014; 13 (13): 2019–2020. pmid: 24
1
- 54.
Жан Ч., Хагигирад Ф., Чжу Й., Чалби М., Зийят А., Рубинштейн Э. и др. JUNO, рецептор сперматозоидов IZUMO1, экспрессируется ооцитом человека и необходим для оплодотворения человека. Hum Reprod. 2019; 34: 118–126. pmid: 30517645 - 55.
Xing W-J, Han B-D, Wu Q, Zhao L, Bao X-H, Bou S. Молекулярное клонирование и характеристика гена Izumo1 у овец и кашемировых коз выявили альтернативный сплайсинг.Мол Биол Реп. 2011; 38: 1995–2006. pmid: 20963501 - 56.
Бьянки Э, Райт ГДж. Межвидовое оплодотворение: рецептор яйцеклетки хомяка, Juno, связывает лиганд человеческой спермы, Izumo1. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015; 370: 20140101. pmid: 25533103 - 57.
Иноуэ Н., Хагихара И., Райт Д., Сузуки Т., Вада I. Димеризация сперматозоидов, вызванная ооцитами. IZUMO1 способствует слиянию сперматозоидов и яйцеклеток у мышей. Nat Commun. 2015; 6: 8858. pmid: 26568141 - 58.
Нисимура К., Хан Л., Бьянки Е., Райт Г. Дж., Де Санктис Д., Джовин Л.Структура сперматозоидов Izumo1 обнаруживает неожиданное сходство с инвазионными белками Plasmodium. Curr Biol. 2016; 26: R661–2. pmid: 27374339 - 59.
Herberg S, Gert KR, Schleiffer A, Pauli A. Белок-прыгун Ly6 / uPAR необходим и достаточен для видоспецифичного оплодотворения. Наука. 2018; 361: 1029–1033. pmid: 301 - 60.
Шетти Дж., Волкович М.Дж., Digilio LC, Клотц К.Л., Джейс Флорида, Дикман А.Б. и др. SAMP14, новый ассоциированный с акросомной мембраной, гликозилфосфатидилинозитол-заякоренный член суперсемейства рецепторов активатора плазминогена типа Ly-6 / урокиназы, играющий роль во взаимодействии сперматозоидов и яйцеклеток.J Biol Chem. 2003; 278: 30506–30515. pmid: 12788941 - 61.
Fédry J, Liu Y, Péhau-Arnaudet G, Pei J, Li W, Tortorici MA и др. Фузоген HAP2 древних гамет представляет собой слитый белок класса II эукариот. Клетка. 2017; 168: 904–915.e10. pmid: 28235200 - 62.
фон Бессер К., Франк А.С., Джонсон М.А., Преусс Д. Arabidopsis HAP2 (GCS1) — это ген, специфичный для сперматозоидов, необходимый для управления пыльцевыми трубками и оплодотворения. Разработка. 2006; 133: 4761–4769. pmid: 17079265 - 63.Лю Й., Тевари Р., Нин Дж., Благборо А.М., Гарбом С., Пей Дж. И др. Консервативный ген стерильности растений HAP2 функционирует после прикрепления фузогенных мембран в гаметах Chlamydomonas и Plasmodium. Genes Dev. 2008. 22: 1051–1068. pmid: 18367645
- 64.
Эрнандес Дж. М., Подбилевич Б. Признаки слияния клеток. Разработка. 2017; 144: 4481–4495. pmid: 29254991 - 65.
Валанси Ч., Мой Д., Лейкина Э., Матвеев Э., Гранья М., Черномордик Л.В. и др. Arabidopsis HAP2 / GCS1 представляет собой слитый белок гамет, гомологичный соматическим и вирусным фузогенам.Журнал клеточной биологии. 2017; 216 (3): 571–581. pmid: 28137780
Молекулярный взгляд на слияние сперматозоидов и яйцеклеток
Давняя загадка в биологии развития и репродуктивной медицине связана с слиянием оболочек сперматозоидов и яйцеклеток. Только в 2005 году был идентифицирован Izumo1, белок сперматозоидов, необходимый для этого слияния. И всего два года назад рецептор Izumo1, названный Juno, был обнаружен на поверхности зрелого человеческого яйца.
В этом исследовании исследователи из Университета Торонто определили кристаллические структуры человека Izumo1 и Juno, по отдельности и в комплексе. Это первые структуры с атомарным разрешением любого белкового комплекса между спермой и яйцеклеткой в момент зачатия любого организма. Исследователи использовали в основном три метода: рентгеновскую кристаллографию в канадском источнике света, малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) на ALS Beamline 12.3.1 и масс-спектрометрию с дейтериевым обменом (DXMS) в Калифорнийском университете в Сан-Диего.
SAXS, кристаллографические и сравнительные исследования DXMS показали, что Izumo1 в форме бумеранга имеет архитектуру, которая полностью отличается от других вирусных и клеточных слитых белков. Он фиксируется в вертикальном положении при связывании с Юноной, что, возможно, является одним из структурных изменений, необходимых для слияния. Эти структуры предоставляют столь необходимую базовую информацию о механизмах распознавания и слияния сперматозоидов и яйцеклеток, а также служат важным ориентиром для разработки негормональных контрацептивов и методов лечения бесплодия для людей и других млекопитающих.
В целом, результаты создают основу для дальнейшей характеристики взаимодействия сперматозоидов и яйцеклеток и предоставляют обновленную модель для понимания фундаментальных принципов процесса оплодотворения и слияния млекопитающих.
Иллюстрация слияния белков Izumo1 (синий) и Juno (красный). Идзумо1, названная в честь японского святилища, посвященного браку, и Юнона, названная в честь римской богини брака и зачатия, играют ключевую роль в плодородии. (Изображение любезно предоставлено Джой Ку, © 2016.)
SAXS выполнено на ALS Beamline 12.3.1.
Х. Айдин, А. Султана, С. Ли, А. Тавалингам и Дж. Э. Ли, «Молекулярная архитектура человеческого сперматозоида IZUMO1 и комплекса оплодотворения яйцеклетки JUNO», Nature 534 , 562 (2016).
Молекулярные детали слияния сперматозоидов и яйцеклеток — ScienceDaily
Слияние сперматозоидов с яйцеклеткой — это самый первый шаг в процессе, который приводит к появлению новых особей у видов, размножающихся половым путем. Каким бы фундаментальным ни был этот процесс, ученые только сейчас начинают понимать, как он работает.
В статье, опубликованной в PLOS Biology , исследователи подробно описали структуру белков, которые обеспечивают слияние сперматозоидов и яйцеклеток у двух разных видов: цветковых растений и простейших. Исследователи надеются, что раскрытие процесса у этих видов и их родственников может приблизить ученых к пониманию его у половых видов, включая людей и других позвоночных.
«Меня удивляет, что мы до сих пор не знаем, как человеческая сперма сливается с человеческой яйцеклеткой», — сказал Марк Джонсон, доцент биологии Университета Брауна и соавтор исследования.«Одна из вещей, которую мы надеемся сделать в этой статье, — это установить структурную сигнатуру белков, которая заставляет слияние гамет работать у этих видов, чтобы мы могли искать ее у видов, у которых эти белковые механизмы все еще неизвестны».
Джонсон много лет работал над пониманием слияния гамет (сперматозоидов и яйцеклеток). В начале 2000-х он идентифицировал белок на мембране сперматозоидов цветкового растения Arabidopsis thaliana , который, по-видимому, оказал некоторое влияние на процесс слияния гамет у этого вида.Его работа показала, что мутация в гене, который производит белок, известный как HAP2, приводит к тому, что сперматозоиды не могут слиться с яйцеклеткой Arabidopsis .
Несколько лет спустя Кристин Бил, аспирантка Брауна, работающая с Джонсоном, предсказала, что HAP2 связан с белком, который вирусы используют для проникновения в клетки-хозяева. В этом есть смысл, говорит Джонсон, поскольку и сперматозоиды, и вирусы должны иметь механизм для встраивания себя в клеточную мембрану.
После этих первых открытий Джонсон и другие исследователи провели поиск в геномах других организмов последовательностей генов, которые похожи на Arabidopsis HAP2.Они обнаружили похожие последовательности у самых разных эукариот (организмов, клетки которых имеют дискретное ядро) — у многих видов растений, водорослей, насекомых и некоторых животных. Однако у позвоночных, в том числе человека, он явно отсутствовал.
Возможно, говорит Джонсон, у позвоночных действительно есть HAP2-подобный белок, но его генетическая последовательность, возможно, настолько изменилась за историю эволюции, что исследователям трудно определить ее по одной последовательности. Таким образом, вместо того, чтобы искать гены, которые производят этот белок, может быть лучше посмотреть на структуру самих белков — поискать белки позвоночных, которые структурно похожи на те из белков HAP2, которые уже были идентифицированы.Но это требует детального изучения структуры известных белков HAP2, что и решили сделать Джонсон и его коллеги в своем последнем исследовании.
Лаборатория
Джонсона работала с лабораторией Феликса Рея в Институте Пастера в Париже, где аспирант Джульетта Федри выяснила структуры белков HAP2 двух отдаленно родственных видов эукариот: Arabidopsis и Trypanosoma cruzi , простейшего паразита. Чтобы разрешить структуры, команда в Париже использовала метод, называемый рентгеновской кристаллографией, который включает в себя кристаллизацию белков с последующим наблюдением за тем, как кристаллы рассеивают рентгеновские лучи.Структуру белка можно наблюдать по диаграмме рассеяния. Лаборатория Рея специализируется на этой технике, в частности, для визуализации вирусных слитых белков, связанных с HAP2.
Дженнифер Форсина, аспирантка лаборатории Джонсона, воспользовалась новыми структурными данными, чтобы определить, как HAP2 способствует оплодотворению цветущих растений, определяя аминокислоты на кончике белка, который вставляется в мембрану яйца.
Исследование показало, что, хотя основная структура белков HAP2 двух видов была в целом схожей, в ходе эволюции они стали различаться в ключевых областях.В частности, кончики белков — части, которые, как считается, первыми проникают через мембрану яйцеклетки, — существенно различались. В то время как текущее растение HAP2 имеет единственную спиральную структуру на конце, у простейшего варианта есть три небольших петли, которые зацепляются за целевую мембрану. По словам Джонсона, хотя различия в механизмах вставки между двумя белками проливают новый свет на то, как работает HAP2, сходство между ними важно при поиске HAP2 в других организмах.
«На данный момент у нас есть два вида организмов: те, для которых мы знаем, как работает слияние гамет — и все они имеют HAP2, — и организмы, для которых мы не знаем, как работает слияние гамет, ни один из которых не имеет узнаваемого HAP2, — сказал Джонсон. «Теперь, когда мы знаем, что структурно консервативно в этих двух белках, которые различаются на уровне последовательностей, мы можем подумать о поиске этих структур для поиска родственных белков у других видов».
Это включает людей, говорит Джонсон.«Нам просто нужно получить больше структур для белков человека, чтобы мы могли искать общие структурные особенности».
.