Вакцина акдс инактивированная: АКДС – российская вакцина против дифтерии, столбняка и коклюша

 Фармацевтические аспекты и клиническая оценка вакцин COVID-19 
 Вакцины с вирусным вектором 
 Вакцины с вирусным вектором являются привлекательными кандидатами на вакцины благодаря их способности доставлять вакцины во многие ткани человека (тропизм), а также естественной адъювантной активности самого вектора. Вирусные векторы модифицируют путем делеции областей вирусной кДНК, что делает их недостаточными по репликации, с одновременным включением представляющего интерес гена для продуцирования антигена  in vivo  (Danthinne and Imperiale 2000).После того, как был получен стабильный нереплицирующийся вирусный вектор, его легко модифицировать для размещения новых антигенов путем включения новых антигенных генов. Это незначительное изменение требует меньших изменений в предшествующих производственных процессах (выделение аденовируса из клеточных компонентов в культуре), чем другие технологии вакцин, такие как субъединичные вакцины. По этим причинам AZD1222, Ad5-nCoV и Ad26.CoV2-S производства AstraZeneca, CanSino и Janssen, соответственно, были одними из первых вакцин, участвующих в клинических испытаниях, и в настоящее время проходят клинические испытания фазы 3, причем AstraZeneca является первой вакциной в своем классе. получить EUA в Великобритании 30 декабря -го  года.
 AstraZeneca и CanSino были первыми вирусными векторными вакцинами, которые опубликовали свои клинические результаты 1/2 фазы 20 июля 2020 года в Lancet (Folegatti et al. 2020b; Zhu et al.2020). Компания AstraZeneca перепрофилировала модифицированный вирусный вектор, полученный из шимпанзе, ранее использовавшийся при разработке вакцины против MERS. Ранее они продемонстрировали защиту от заболевания, опосредованного БВРС-КоВ, у приматов, кроме человека, а также безопасность при всех уровнях доз в клинических испытаниях фазы 1 (Folegatti et al.2020a; Van Doremalen et al.2020). CanSino также перепрофилировала ранее разработанную вакцину, используя вакцину против Эболы на основе Ad5 (Zhu et al. 2015). Эта вакцина была одобрена для использования в чрезвычайных ситуациях и создания запасов в Китае и в настоящее время является единственной вакциной от Ad5, получившей одобрение регулирующих органов (Li et al. 2018). Это позволило CanSino быстро применить свою технологию к SARS-CoV-2 и стать первым кандидатом, вступившим в клинические испытания 16 марта 2020 года. Тем временем Janssen Pharmaceuticals следует аналогичному подходу, используя Ad26, экспрессирующий стабилизированный полноразмерный S-белок (Mercado et al. .2020). Janssen использует свою платформу AdVac, которая ранее использовалась для одобренной Европейской комиссией Janssen вакцины против Эболы, а также для создания своих кандидатов на вакцины против ВИЧ, RSV и Зика (Baden et al.2013; Cox et al.2018; Williams et al.2020). Этот вектор Ad26 ранее использовался для экспрессии модифицированного белка gp140 ВИЧ у нечеловеческих приматов и людей (Baden et al. 2013). Несмотря на отставание от AstraZeneca и CanSino, доклинические результаты были опубликованы 30 июля 2020 г., и клинические испытания фазы 3 продолжаются.Полный список вакцин против COVID-19, которым выдана EUA, приведен в.
 Таблица 2. 
 Вакцины, полученные или примененные для EUA против COVID-19. (по состоянию на 15 -го  февраля 2021 г.)
 mRNA-127362; NIAID
 ID
 Разработчик
 Стратегии составления
 Страны с EUA
 Платформа
 CoronaVac
 Sinovac Biotech
 Инактивированный SARS-CoV -2 с использованием β-пропиолактона
 China, U.A.E
 Инактивированный вирус
 BBIBP-CorV
 Пекинский институт биологических продуктов; Sinopharm
 Инактивированный SARS-CoV-2 (веро-клетка)
 Китай, ОАЭ, Бхарат
 Инактивированный вирус
 Коваксин (BBV152)
 Bharat Biotech; Индийский совет медицинских исследований (ICMR)
 Инактивированная вакцина SARS-CoV-2 с квасцами
 Индия
 Инактивированный вирус
 NVX-CoV2373
 Novavax
 Полноразмерная наночастица S-белка с адъювантом Matrix-M
 Получение EUA от FDA
 Белковая субъединица
 EpiVacCorona
 Государственный научно-исследовательский центр вирусологии и биотехнологии Vector
 SARS-CoV-2 Пептиды
 Россия
 Пептид
 mRNA-1273na
 Ионизируемые липидные наночастицы инкапсулировали мРНК-S-белок
 US; несколько других стран
 мРНК
 BNT162b2
 BioNTech; Fosun Pharma; Pfizer
 b2: Липидные наночастицы с мРНК-стабилизированным предварительно слиянием S-белком
 US; несколько других стран
 мРНК
 AZD1222
 Оксфордский университет; Вектор аденовируса шимпанзе AstraZeneca
, кодируемый белком SARS-CoV-2 S
 UK; несколько других стран; Остановлен в Южной Африке
 Вирусный вектор
 Ad5-nCoV
 CanSino Biological Inc.; Пекинский институт биотехнологии
 Аденовирус типа 5, кодируемый белком SARS-CoV-2 S
 Китай, Мексика
 Вирусный вектор
 Sputnik V (Gam-COVID-Vac)
 Исследовательский институт Гамалеи
 Ad5 / Вакцина на основе Ad26, кодирующая белок SARS CoV-2 S (жидкий состав)
 Россия, несколько других стран
 Вирусный вектор
 Ad26.COV2-S
 Janssen Pharmaceutical Companies
 Ad26, закодированный с SARS-CoV-2 S белок
 США, запрос на одобрение в ЕС и Канаде
 Вирусный вектор
 При оценке текущих клинических данных о вирусных векторных вакцинах мы можем увидеть ожидаемые проблемы.В частности, вакцины на основе Ad5 демонстрируют ослабленный и отсроченный адаптивный иммунный ответ на SARS-CoV-2 у лиц с ранее существовавшим иммунитетом к Ad5. Пациенты с низким ранее существовавшим иммунитетом к Ad5 имели почти в 2 раза более высокие титры нейтрализующих антител против SARS-CoV-2, хотя клеточный иммунитет, который наблюдался в виде МКПК, секретирующих IFN-γ (в ответ на SARS-CoV-2), не наблюдался. изменяется у 88–90% пациентов, получавших вакцину (Zhu et al. 2020). Существующий ранее иммунитет против Ad5, а также возраст влияли на общий иммунитет и переносимость вакцины.Повышение переносимости (видимое как уменьшение побочных реакций) может компенсировать проблему снижения иммунного ответа, если пациенты могут получить более высокую дозу переносчика. Хотя устойчивые ответы антител наблюдались после однократной инъекции Ad5-nCoV в RBD-специфическом ИФА с частотой сероконверсии 96% и 97%, соответственно, на 28 день, сероконверсия нейтрализующих антител наблюдалась только в 59% и 47% случаев. групп с высокими и низкими дозами (Zhu et al. 2020). Основным недостатком этого исследования было невозможность сравнить результаты с образцами плазмы выздоравливающих пациентов, вылечившихся от инфекции SARS-CoV-2, в качестве положительного контроля.Количественное сравнение вакцин, производимых разными компаниями, затруднительно из-за изменений в антигене для разработки ELISA и используемых типов анализа нейтрализации. Анализ плазмы выздоравливающих предоставляет метрику для клинической применимости, поскольку эти образцы могут быть собраны со всего мира и являются репрезентативными для реакции на естественную инфекцию, которую вакцины пытаются имитировать. Однако они отметили, что титры антител против RBD, измеренные с помощью ELISA, и титры нейтрализующих антител к псевдовирусу значительно коррелировали с титрами нейтрализующих антител к живому вирусу с коэффициентом корреляции 0.75 и 0,72 (p <0,0001) соответственно. Таким образом, этот показатель потенциально может быть использован для оценки клинической применимости вакцин в будущем. Испытание фазы III для Ad5-nCoV с использованием однократной дозы 5 × 10  10  вирусных частиц (низкая доза) в настоящее время продолжается в России, Саудовской Аравии, Пакистане, Аргентине и Мексике.
 AZD1222 AstraZeneca позволяет избежать проблемы ограниченной эффективности уже существующего иммунитета против вирусного вектора за счет включения полноразмерного гена белка S в вектор ChAdOx1 аденовируса обезьян с дефицитом репликации.Поскольку это обезьяний вирус, его способность к передаче у людей низкая, поэтому распространенность ингибирующих титров намного ниже, чем у Ad5 (Dicks et al. 2012). Это обеспечивает большее проникновение вирусной частицы в клетки, что приводит к усиленной продукции антигена  in vivo  и более устойчивому иммунному ответу. Только один человек в этом исследовании имел ранее существовавшие высокие титры по отношению к переносчику, а 18% субъектов имели низкие титры. Для борьбы со сниженным адъювантным эффектом, обеспечиваемым частицами обезьяньего вируса по сравнению с человеческим, AZD1222 также включает последовательность тканевого активатора плазминогена (tPA) и оптимизированное секвенирование S-белка для увеличения продукции антигена  in vivo .В прошлом tPA использовался для повышения экспрессии и секреции модифицированной вакцины на основе вируса осповакцины, основанной на Анкаре (MVA), для профилактики туберкулеза (Kou et al.2017). После однократного внутримышечного введения AZD1222 S-специфические Т-клеточные ответы достигли пика на 14 день, что наблюдалось почти у всех пациентов (Folegatti et al. 2020b). Ответы анти-S IgG повысились к 28 дню, и нейтрализующие титры были обнаружены у 91% людей с использованием анализа MNA  80  (Folegatti et al. 2020b). В меньшей когорте из 10 человек была проведена повторная иммунизация.Эта группа показала повышенный ответ IgG, а также активность нейтрализации (100% по MNA  80 ), аналогичную уровням в плазме выздоравливающих (Folegatti et al. 2020b). Следует отметить, что как однократное, так и повторное введение показало нейтрализующую активность у 100% людей с использованием анализа PRNT  50 . Интересно, что бустерная иммунизация не влияла на ответы Т-клеток. Решение о том, следует ли продвигать однократную иммунизацию или режим первичной бустерной иммунизации, зависело от того, какой результат больше всего коррелирует с защитным иммунитетом.Например, если нейтрализующие титры являются лучшим показателем эффективности вакцины, тогда будут желательны схемы первичной бустерной вакцинации из-за увеличения титров, описанного выше. Если клеточный иммунитет является основным двигателем защитного иммунитета, предпочтительнее будет однократная иммунизация. Это подчеркивает проблемы при работе с новым вирусом. Хотя высокие ингибирующие титры предотвратили заражение от заражения SARS-CoV-2 у нечеловеческих приматов, появляется все больше доказательств того, что клеточный иммунитет также играет важную роль в защите (Ni et al.2020a, 2020b). В образцах плазмы выздоравливающих в этом исследовании обнаружен один бессимптомный человек с низкой нейтрализацией, тогда как 3 человека с тяжелым заболеванием имели высокую нейтрализующую активность, таким образом, нейтрализующая активность сама по себе не обязательно может обеспечивать защиту. Они решили использовать схему из двух доз для дальнейшей оценки.
 AstraZeneca недавно опубликовала исследование фазы 2/3, проведенное в Великобритании 18 ноября -го , 2020 г., чтобы распространить вакцину-кандидат на пожилое население (Ramasamy et al.2021 г.). Они стратифицировали группы по возрасту на 18–55 лет, 56–69 лет и 70 лет и старше, аналогично испытаниям Moderna и Pfizer (см. Ниже), чтобы расширить применимость их вакцин-кандидатов. Реактогенность снижалась с возрастом. Системные реакции присутствовали у 86% молодых людей и снизились до 65% у пациентов старше 70 лет; Наиболее частыми побочными реакциями системного характера были утомляемость, головная боль, лихорадка и миалгия. Следует отметить, что в течение периода исследования произошло 13 серьезных нежелательных явлений, ни одно из которых не было сочтено связанным ни с одной из исследуемых вакцин.Титры связывающих IgG и нейтрализующие титры были одинаковыми для всех возрастных групп, получавших две дозы. Незначительное снижение титров связывающих антител наблюдалось при введении одной дозы, а более существенное снижение ингибирующих титров наблюдалось при введении однократной дозы на 53 день после вакцинации. Это исследование подтвердило, что AZD-1222 хорошо переносится пожилыми людьми, поэтому пожилые люди могут быть включены в исследования фазы 3. 23 ноября  rd , 2020 AstraZeneca объявила, что их исследование фазы 3 достигло основной конечной точки эффективности в предотвращении COVID-19 (Voysey et al.2021b). В этом испытании оценивались два режима дозирования, одна из которых представляла собой половинную дозу для праймирования иммунной системы, за которой следовала полная доза для усиления, а другая — две полные дозы. Удивительно, но режим половинной дозы привел к 90% -ной защите от инфекции SARS-CoV-2 через 2 недели после повторной иммунизации, в то время как режим полной дозы привел к 62% эффективности. Объяснение разницы в защите между режимами дозирования не найдено, и будет интересно посмотреть, сохранятся ли эти значения до завершения исследования.Одним из объяснений может быть более низкая индукция антител против ChAdOx1 при приеме половинной дозы, что позволяет обеспечить большую доставку последующей полной дозы, но эта гипотеза потребует дополнительных данных о титре анти-ChAdOx1 для проверки. В вакцинированной группе не было зарегистрировано ни одной госпитализации или тяжелых случаев COVID-19, а через 21 день после первой дозы было госпитализировано 10 случаев COVID-19, все в контрольной группе; двое из них были классифицированы как COVID-19 в тяжелой форме, в том числе один — со смертельным исходом. Эти исследования побудили EUA AZD1222 в Великобритании 30 декабря -го , 2020, а затем EUA в Индии, а также в Аргентине, Доминиканской Республике, Сальвадоре, Мексике и Марокко для активной иммунизации взрослых 6 января -го , 2021 г.Совсем недавно AZD1222 был одобрен для раннего использования в Канаде 26 февраля  th , 2021.
 После утверждения для раннего использования AZD1222 осознал проблему предоставления защиты от появляющихся вариантов. 7 февраля  и  министр здравоохранения ЮАР объявил о прекращении использования AZD1222 (Университет 2021 года). Это связано с предварительными выводами об эффективности, согласно которым профилактика легких форм болезни произошла только у 10% людей, получавших вакцину в Южной Африке (University, 2021).Вероятно, это связано с новым южноафриканским вариантом SARS-CoV-2, ответственным за 90% текущих случаев в Южной Африке. Хотя это тревожные результаты, это исследование имеет небольшой размер выборки и учитывает только 40 случаев COVID-19 (Университет, 2021 г.). Профилактика COVID-19 от умеренной до тяжелой степени не оценивалась в этой популяции, и ожидается, что она будет иметь большую эффективность, чем профилактика легких форм болезни, как это было замечено в других испытаниях вакцин. Чтобы еще больше повысить эффективность вакцины, Astrazeneca провела исследование, оценивающее время введения бустерной дозы, которое в настоящее время находится на стадии предварительной печати.Они обнаружили, что введение режима первичной бустерной вакцинации с интервалом в 12 недель повысило эффективность вакцины с 54,9% до 82,4% по сравнению с ранее установленным интервалом менее 6 недель (Voysey 2021a). Это может оказаться полезным для борьбы с вариантами, но по сравнению с эффективностью вакцины Янссена в популяции Южной Африки (54% профилактика умеренного и тяжелого заболевания, обсуждается ниже), эффективность около 10% в предотвращении легкого заболевания, вероятно, сделает эту вакцину вторичной. вариант вакцинации южноафриканцев.
 Janssen Pharmaceuticals также присоединилась к гонке за созданием вакцины, использующей нереплицирующийся вирусный вектор Ad26. Ad26 представляет собой аденовирус человека с меньшей распространенностью по сравнению с другими векторами, такими как Ad5, поэтому меньшая часть популяции будет иметь ранее существовавшие антитела к этому вектору, что позволяет улучшить доставку к клеткам-мишеням. Этот подход аналогичен подходу AstraZeneca с использованием аденовирусного вектора шимпанзе для обхода проблемы ранее существовавшего иммунитета. Янссен опубликовал промежуточные результаты исследования фазы 1 / 2а, оценивающего безопасность и эффективность вакцины у здоровых взрослых в возрасте 18–55 лет и пожилых людей в возрасте 65 лет и старше (Sadoff et al.2021 г.). 5 × 10  10  или 1 × 10  11  вирусных частиц на вакцинацию вводили либо в виде разовой дозы, либо с бустингом через 56 дней после первичной вакцинации. Промежуточные данные для этой вакцины-кандидата охватывают только безопасность и иммуногенность до 29 дней после первичной вакцинации. К настоящему времени у пожилого населения снизилась реактогенность вакцины, о чем свидетельствует более низкая распространенность местных и системных побочных реакций. Местные реакции были уменьшены с 58% до 27%, а системные реакции уменьшились с 64% до 36% у пожилых людей по сравнению с более молодыми людьми, соответственно.Лихорадка также была ниже у пожилых людей, у пожилых людей не было лихорадки 3 степени. Профили иммуногенности различных уровней доз дали интересные результаты. При обоих уровнях дозы одна доза показала нейтрализующую скорость сероконверсии 92% у молодых людей, но у пожилых людей более низкая доза вызвала большую скорость сероконверсии (100%), чем высокая доза (83%). Кроме того, средний геометрический титр (GMT) нейтрализующих антител увеличивался с увеличением дозы у более молодых людей (с 214 до 243), в то время как увеличение дозы приводило к небольшому снижению GMT (с 196 до 127) у пожилых людей.Эта же тенденция была более выражена для титров связывания IgG; более молодые люди увеличили GMT с 528 до 695 с увеличением дозы, в то время как пожилые люди снизили GMT с 507 до 248, показав более чем 2-кратное снижение. У всех участников уровни связывающих IgG и нейтрализующих антител, индуцированные обоими уровнями доз, были сопоставимы с уровнем в плазме выздоравливающих, хотя они находятся в нижней части распределения титров в плазме выздоравливающих. Другие вакцины-кандидаты показали аналогичные или более высокие значения среднего титра по сравнению с плазмой выздоравливающих, что может ограничивать сравнимую эффективность этой вакцины.Однако по сравнению с кандидатами, которым требуется две вакцинации, режим однократной дозы вакцины Янссена будет предпочтительнее, если уровни титра достаточны для обеспечения защиты. Ad26.CoV2.S также вызывает перекос клеток Th2, который наблюдался у 80% и 83% молодых и пожилых людей, соответственно. Это более слабый клеточный ответ по сравнению с другими вакцинами-кандидатами, но, как и в случае с другими вакцинами-кандидатами, не наблюдалось иммунного ответа Th3 или почти не наблюдалось. Т-клеточные ответы CD8 также индуцировались у 51% и 64% молодых людей, получавших низкие или высокие дозы, соответственно, и только 33% пожилых людей демонстрировали ответы Т-лимфоцитов CD8 в любой группе доз.Из-за более низких титров у пожилых людей, получавших высокую дозу, была выбрана низкая доза с режимом однократного приема для перехода к фазе 3 испытаний.
 29 января -го , 2021 Janssen объявил, что первичные и вторичные конечные точки были достигнуты для их исследования ENSEMBLE фазы 3 (J&J 2021). Было обнаружено, что вакцина на 66% эффективна в предотвращении COVID-19 от умеренной до тяжелой степени через 28 дней после вакцинации. Эффективность профилактики умеренных и тяжелых заболеваний варьировалась в зависимости от географического региона: 72% в США, 66% в Латинской Америке и 57% в Южной Африке.Вакцина оказала существенное влияние на снижение тяжелого заболевания с общей эффективностью 85% из всех исследованных регионов, и ни один из пациентов, получивших вакцину, не нуждался в госпитализации через 28 дней после вакцинации. Данные о предотвращении заражения SARS-CoV-2 после вакцинации не были опубликованы, хотя, учитывая снижение эффективности предотвращения тяжелого заболевания по сравнению с уже одобренными продуктами мРНК (100% и 90% для Moderna и Pfizer, соответственно), это Ожидается, что эта вакцина также снизит эффективность в отношении показателей инфицирования.Хотя эти значения эффективности снижаются по сравнению с другими одобренными продуктами, важно отметить, что примерно 95% инфекций COVID-19 в Южной Африке были вызваны вариантом ускользания B.1.351. Этот вариант не появлялся до тех пор, пока не были завершены испытания Moderna или Pfizer Phase 3, поэтому снижение эффективности в южноафриканской группе этого испытания, вероятно, связано с присутствием варианта, и, возможно, нецелесообразно сравнивать эту эффективность с исходами. видел в предыдущих испытаниях.На основании этих данных Janssen подал запрос на EUA в FDA, который был рассмотрен 26 февраля -го , 2021. Учитывая низкий уровень побочных эффектов (9% лихорадка и 0,2% лихорадка 3 степени), более низкие тяжелые побочные реакции, чем в группе плацебо. , и никаких признаков анафилаксии, в сочетании с текущим дефицитом вакцин на рынке, эта вакцина, вероятно, будет одобрена. Вакцина была одобрена для EUA Управлением по контролю за продуктами и лекарствами 27 февраля  th , 2021, что сделало ее первой вакциной против COVID-19, вводимой однократно, что решит многие логистические проблемы с распределением вакцины.Компания Janssen также примитивно начала набор участников для другого исследования фазы 3 (АНСАМБЛЬ 2: {«type»: «клиническое испытание», «attrs»: {«text»: «NCT04614948», «term_id»: «NCT04614948»}} NCT04614948) который позволит оценить эффективность схемы из 2 доз, вводимой с интервалом в 2 месяца.
 Спутник V, созданный институтом Гамалея, является последним конкурентом аденовирусных вакцин, опубликовавшим клинические данные фазы 1/2 4 сентября -го года , 2020 г. (Логунов и др., 2020). Их подход использовал гетерологичное первичное бустерное дозирование вирусных векторов Ad26 и Ad5, кодирующих полноразмерный S-белок, в замороженных или лиофилизированных составах.Наблюдались приемлемые системные и местные реакции, наиболее частыми из которых были боль в месте инъекции (58%), гипертермия (50%), головная боль (42%), астения (28%), боль в мышцах и суставах (24%) (Логунов и др., 2020). Сообщалось о побочных реакциях от легкой до умеренной, о тяжелых реакциях не сообщалось. Титры RBD-специфических IgG индуцировались однократным введением векторов Ad5 или Ad26 до уровней, сравнимых с уровнями выздоравливающих пациентов в плазме, а после гетерологичного первичного бустинга RBD-специфические IgG повышались почти в 10 раз по сравнению с выздоравливающими пациентами в плазме (Logunov et al.2020). Только режим прайм-буста индуцировал нейтрализующие антитела у 100% лиц с аналогичными значениями, что и у выздоравливающих пациентов с плазмой, кроме того, группа прайм-буста была уникальной тем, что пролиферация CD4 + и CD8 + Т-клеток наблюдалась у всех субъектов (Logunov et al. al.2020). Анализ проточной цитометрии Т-клеток после стимуляции  ex vivo  белком Spike использовали для оценки пролиферации в ответ на антиген. Это не такой надежный метод, как другие, использующие антиген-специфические анализы ELISpot для оценки клеточных ответов.Другой используемый метод заключался в кратном увеличении секреции IFN-γ с помощью PBMC, которое, опять же, можно было бы улучшить с помощью антиген-специфического анализа ELISpot. Ответ IFN-γ в циркуляции наблюдался на 28-й день у лиц, получавших Ad5 или Ad26 по отдельности или в комбинации (Logunov et al., 2020). В этом исследовании также изучалось влияние ранее существовавших титров Ad5 или Ad26 на эффективность вакцины и возможности перекрестной нейтрализации каждого из них. Вопреки результатам для вакцины CanSino на основе Ad5, ранее существовавший иммунитет к вектору не влиял на эффективность вакцины.Кроме того, они заявляют, что «введение rAd26 не увеличивало титр нейтрализующих антител к rAd5 на 28 день, и наоборот, что указывает на отсутствие перекрестной реактивности по отношению к компонентам вакцины». Это находится в некотором согласии с литературными данными, в которых мыши, примированные Ad26, усиливали иммунный ответ при введении Ad5 (Abbink et al. 2007), но должны быть подтверждены в продолжающемся более крупномасштабном клиническом исследовании фазы 3. Важно отметить, что нейтрализующие титры по отношению к вирусным векторам оценивались только на день 0 и день 28.Для группы первичного повышения это означает, что измерение проводится через 28 дней после получения rAd26 и через 7 дней после rAd5. 7 дней недостаточно для оценки реакции нейтрализующих антител, вызванной бустер-введением. Обычно для образования зародышевых центров и выработки антител IgG с нейтрализующей способностью требуется 2–3 недели, поэтому другой момент времени в 42 дня (как это было сделано для нейтрализации анти-SARS-CoV-2) даст более точную оценку перекрестной реактивности. от Ad5 до Ad26. Тем не менее, эти результаты являются многообещающими для использования гетерологичных иммунизаций с первичной повторной вакцинацией при разработке вакцин.Спутник V в настоящее время одобрен для использования во многих странах мира, самой последней из которых является Венгрия, первая из стран ЕС, принявшая участие. В пресс-релизе, предоставленном Национальным исследовательским центром Гамалея 14 декабря  и , промежуточные результаты исследования фазы 3 2020 года показали эффективность 91,4% от инфекции у 78 человек, у которых развился COVID-19 в ходе исследования. Это было принято через 21 день после однократной дозы и, как ожидается, улучшится при бустер-введении. Вакцина обеспечила 100% защиту от тяжелой формы COVID-19: все было зарегистрировано 20 человек в группе плацебо.Хотя эти показатели инфицирования ниже, чем в исследованиях фазы 3 Pfizer и Moderna (описанных ниже), это очень многообещающе и дает основания AstraZeneca сотрудничать с Институтом Гамалея в надежде повысить эффективность их вакцины. Это новое испытание будет состоять из одной дозы вектора ChAdOx1 и одной дозы вектора Ad5 или Ad26, кодирующего S-белок (NatureBiotechnology 2021).
 Компания Merck разрабатывала два репликационно-способных вирусных вектора в качестве кандидатов на вакцины против SARS-CoV-2. Считается, что использование репликационно-компетентных векторов обеспечивает более длительную продукцию антигена в клетках, обеспечивая большую иммунную стимуляцию, позволяя вводить разовую дозу.25 января  th , 2021 они объявили, что, хотя их вакцины хорошо переносятся здоровыми взрослыми, иммунные ответы были ниже, чем у выздоравливающей плазмы, и поэтому значительно снизились по сравнению с другими вакцинами, уже разрешенными для экстренного использования (Merck 2021). В связи с этим компания Merck решила отказаться от обоих кандидатов и сосредоточить свои усилия на разработке двух терапевтических препаратов от COVID-19, которые в настоящее время проходят клинические испытания. Учитывая, что они отказались от обеих вакцин с различными конструкциями, это может представлять собой общее ограничение репликационно-компетентных векторов в качестве платформ для вакцин.Будет интересно посмотреть, поддержат или опровергнут результаты клинических испытаний Merck результаты продолжающегося исследования фазы 2, проводимого Израильским институтом биологических исследований (IIBR). Подобно конструкции Merck, IIBR использует вирус везикулярного стоматита (VSV) в качестве средства доставки для своей вакцины. Они заменили исходный гликопротеин на поверхности VSV на S-белок (Yahalom-Ronen et al.2020). Следовательно, частица имеет S-белок на поверхности, а также генетический материал для производства частиц S-белка, экспонированных на поверхности, внутри клеток-мишеней.
 мРНК-вакцины 
 Хотя до COVID-19 на рынке не было одобренной мРНК-вакцины, этот подход предлагает много преимуществ по сравнению с другими платформами вакцин с точки зрения производства, универсальности и индуцированного иммунного ответа. Поскольку мРНК представляет собой простой генетический материал, ее можно оптимизировать для получения высоких урожаев с помощью реакций транскрипции in vitro. Этот процесс относительно дешев по сравнению с производством вирусных векторов и легко масштабируется из-за отсутствия культур клеток и этапов очистки.Конструкции мРНК могут быть адаптированы к новым антигенам, как только станет доступна генетическая информация об этом антигене, что обеспечивает быстрый метод выбора вакцины-кандидата. Например, в течение 5 дней после выпуска последовательности, производство мРНК / LNP, экспрессирующих SARS-CoV-2 S-2P, было начато в рамках текущей надлежащей производственной практики (CGMP) параллельно с доклинической оценкой Moderna (Corbett et al.2020). Проблема с мРНК-вакцинами — стабильность конструкции. мРНК необходима для прохождения гидрофобной клеточной мембраны и достижения цитоплазмы для эффективной транскрипции генетического материала.РНКаза и эндонуклеазы присутствуют в клетках и во всем организме для регулирования производства естественной мРНК и легко разрушают генетический материал до того, как может произойти транскрипция, поэтому важна защита от этих путей деградации до достижения цитоплазмы. Для этого мРНК-вакцины, которые в настоящее время проходят клинические испытания, упаковываются в липидные наночастицы. Идеальный носитель будет доставлять конструкцию мРНК в цитоплазму клетки, чтобы обеспечить трансляцию антигена, а также проявить адъювантную активность, чтобы вызвать устойчивый иммунный ответ.Модификации самой мРНК, такие как добавление синтетического кэпа, регуляторных элементов или нуклеозидных модификаций, могут защищать от деградации внутри клетки и способствовать увеличению выработки белка (Andries et al. 2015; Gallie 1991; Holtkamp et al. 2006). Основным преимуществом вакцин с мРНК перед другими платформами является индуцированная иммуногенность. Антиген продуцируется в цитоплазме клеток и поэтому обрабатывается как внутриклеточный патоген и загружается в молекулы MHC класса 1 для распознавания Т-клетками (Chahal et al.2017). Было показано, что это индуцирует мощные ответы CD4 + Т-клеток и эффекторных Т-лимфоцитов CD8 + (Sahin et al. 2020). CD4 + Т-клеточный ответ на мРНК-вакцины обычно следует по пути Th2, продуцирующему lFN-γ, IL-2 и TNF, но не IL-4 или IL-5, что снижает вероятность VAERD (Sahin et al. 2020).
 Moderna была второй компанией, опубликовавшей клинические данные по вакцине COVID-19 14 июля -го , 2020, и первой, получившей EUA 11 декабря -го , 2020. Их вакцина, мРНК-1273, состоит из липидной наночастицы, содержащей модифицированную нуклеозидами информационную РНК, кодирующую SARS-CoV-2 S, стабилизированную в своей префузионной конформации.Два остатка пролина были вставлены выше гептадного повтора в S-белок. Доклинические исследования на мышах продемонстрировали, что эта мутация индуцировала мощные нейтрализующие антитела к SARS-CoV-2 дикого типа и преобладающему мутанту D614G (Corbett et al.2020). В испытании фазы 1, в котором приняли участие 45 здоровых взрослых, все участники должны были получить две вакцинации с интервалом в 25, 100 или 250 мкг с интервалом 28 дней (Jackson et al. 2020). В это исследование не были включены буфер или отрицательный контроль, но сравнения с образцами выздоравливающей плазмы использовали в качестве положительного контроля.Средние геометрические титры связывающих антител IgG (GMTs) с S-2P быстро увеличивались после первой вакцинации, с сероконверсией у всех участников к 15 дню и аналогичными результатами, полученными при использовании RBD-специфического ELISA. После второй вакцинации нейтрализующая активность была обнаружена у всех индивидуумов, и наблюдалась доза-ответная зависимость. Нейтрализующая способность была выше, чем у образцов плазмы выздоравливающих для всех дозированных групп после второй вакцинации. Клеточные ответы на дозы 25 и 100 мкг показали, что Т-лимфоциты CD4 имеют асимметричный ответ Th2 по сравнению с клетками, экспрессирующими TNFα, IL-2 и lFN-γ; цитокинов Th3 не наблюдалось.Слабый ответ Т-лимфоцитов CD8 наблюдался в группе, получившей дозу 100 мкг. Это подтверждается исследованиями на мышах, демонстрирующими искаженный ответ Th2, индуцированный мРНК-1273, а также активированными CD8 Т-клетками, которые устраняют патоген без каких-либо признаков иммунопатологии. Большая часть данных о высоких дозах (250 мкг) не была предоставлена, но была более высокая частота тяжелых побочных реакций с этой дозой. Поскольку две вакцинации по 100 мкг вызвали сильный иммунный ответ с большей переносимостью, Moderna переходит к фазам 2 и 3 клинических испытаний с высокой дозой 100 мкг.
 Moderna совсем недавно опубликовала результаты исследования фазы 1 29 сентября -го , 2020, устанавливающие безопасность и эффективность мРНК-1273 у пожилых людей (Anderson et al. 2020). Подобные титры антител и нейтрализующие способности наблюдались у участников в возрасте 56–70 лет и старше 70 лет по сравнению с более молодыми участниками, ранее изучавшимися. Интересным открытием в этой популяции является то, что нейтрализация была незначительной после однократной дозы 25 или 100 мкг, но сопоставима с нейтрализацией более молодых пациентов и выздоравливающей плазмы через 15 дней после второй дозы, что свидетельствует о необходимости введения двух доз.Т-клеточные ответы также подтвердили фенотип Th2 с индукцией IFN-γ, IL-2 и TNFα при стимуляции пулами пептидов, что совпадает с отсутствием цитокинов Th3. Хотя в этом испытании участвовало всего 40 человек, оно послужило основой для Moderna для оценки мРНК-1273 у пожилых людей в продолжающихся испытаниях. 30 ноября  th , 2020 Moderna объявила о своем первичном анализе эффективности продолжающегося исследования фазы 3, в котором приняли участие 30 000 человек и проводились в 99 центрах (Baden et al., 2020).Первичной конечной точкой была профилактика инфекции SARS-CoV-2 через 2 недели после второй иммунизации. Удивительно, но из 196 подтвержденных случаев только 11 относились к группе, получавшей вакцину, что дает 94,1% эффективности от вирусной инфекции. Промежуточные результаты не только обеспечивают отличную защиту от инфекции SARS-CoV-2, но и показывают 100% защиту от тяжелых заболеваний; У 30 человек развился тяжелый COVID-19, и все они находились в группе плацебо. Это наряду с наблюдением того, что эффективность была постоянной для разных возрастов, расы и этнической принадлежности, а также гендерной демографии, делает эту вакцину надежной платформой, которую можно использовать в группах риска.Тестирование на детях, беременных и лицах с ослабленным иммунитетом все еще необходимо оценить, чтобы гарантировать адекватную безопасность и эффективность в этих группах населения. Заявка на EUA от FDA была подана в тот же день, когда были опубликованы эти результаты, а EUA была удовлетворена 11 дней спустя.
 Помимо Moderna, BioNtech и Pfizer — единственные компании, у которых в настоящее время есть мРНК-вакцина в клинических исследованиях фазы 3. Промежуточный отчет по клиническим данным фазы 1/2 по BNT162b1 был опубликован 1 июля  st , 2020, а полные результаты опубликованы 12 августа  th , 2020.Их платформа вакцины аналогична платформе Moderna в том, что они используют липидные наночастицы для доставки вакцины с модифицированной нуклеозидами мРНК. Основное различие в их вакцинной платформе — это интересующий антиген. BNT162b1 кодирует тримеризованный шип гликопротеина SARS-CoV-2 RBD. Антиген RBD, экспрессируемый BNT162b1, модифицируется путем добавления полученного из фибритина Т4 домена тримеризации фолдона для повышения его иммуногенности за счет поливалентного отображения. Это также было небольшое клиническое испытание с участием 45 человек в 3 группах доз 10, 30 и 100 мкг.Эти уровни доз ниже, чем те, которые были оценены Moderna, и составляют 25, 100 и 250 мкг, что может быть связано с оптимизированным дизайном антигена или различием в адъювантной активности носителей для доставки. В этом испытании низкие и средние дозы хорошо переносились, и пациенты получали две дозы вакцины с интервалом 21 день. Высокая доза 100 мкг вызвала повышенную реактогенность, при этом одна инъекция вызвала серьезные местные и системные побочные реакции примерно у 10% людей, и введение второй дозы было прекращено.Дозы 10 и 30 мкг хорошо переносились без серьезных побочных реакций после однократной вакцинации, и менее 10% людей имели сильную усталость или озноб после второй вакцинации. Временное снижение количества лимфоцитов наблюдалось во всех дозированных группах, но оно вернулось к нормальному уровню в течение 6-8 дней. Известно, что РНК-вакцины индуцируют интерферон I типа, связанный с временной миграцией лимфоцитов в ткани, что может объяснить снижение количества лимфоцитов. При оценке данных иммуногенности, как и в случае с Moderna, однократная вакцинация не индуцировала нейтрализующие титры в отношении SARS-CoV-2, за исключением высокой дозы, которая вызывала слабый нейтрализующий ответ ниже уровня выздоравливающей плазмы.Связывающие антитела также не индуцировались в группах с дозой 10 и 30 мкг после однократной вакцинации, таким образом, отсутствие высокого соотношения связывающих / нейтрализующих титров потенциально могло бы избежать проблемы ADE. После второй вакцинации 10 и 30 мкг индуцировались сильные связывающие и нейтрализующие титры. Для доз 10 и 30 мкг, соответственно, связывающие антитела были в 9,8 и 46 раз, а нейтрализующие антитела были в 1,9-4,6 раз больше, чем у панели сывороток выздоравливающего человека COVID-19, по крайней мере, через 14 дней после положительной ПЦР на SARS-CoV-2. результат.Требуемая низкая доза и наблюдаемая мощная нейтрализующая активность делают эту вакцину привлекательным кандидатом.
 14 октября -го , 2020, Pfizer и BioNtech опубликовали исследование фазы 1, в котором оценивали две из своих мРНК-вакцин у здоровых взрослых и пожилого населения (Walsh et al. 2020b). Включение людей в возрасте 65–85 лет соответствует подходу Moderna к тому, чтобы сделать эту вакцину доступной для пожилого населения, которое подвержено более высокому риску тяжелой формы COVID-19. Две вакцины-кандидаты различались по антигену, кодируемому модифицированной нуклеозидом мРНК, которая неожиданно практически не влияла на иммуногенность.Большая разница наблюдалась в реактогенности соединений. BNT162b2 кодирует полноразмерный S-белок со вставленными двумя остатками пролина для стабилизации его префузионной конформации, таким образом имитируя S-белок природного вируса. Подобно результатам Moderna, связывающие антитела индуцировались после однократной дозы любой вакцины и усиливались при последующей дозе до уровней в пределах диапазона выздоравливающей плазмы. Титры нейтрализации были значительно увеличены через 7 дней после повторной иммунизации и оставались до 14 дней.Как связывающий IgG, так и нейтрализующий титры были снижены у пожилых людей по сравнению с более молодыми субъектами, но оставались в 1,1–2,2 раза выше GMT ​​по сравнению с панелью сыворотки выздоравливающих. При исследовании реактогенности по отношению к BNT162b1 и BNT162b2 наблюдается явное усиление системных реакций на BNT162b1 по сравнению с BNT162b2. 75% молодых людей и 35% пожилых людей имели лихорадку выше 38 ° C после второй дозы 30 мкг BNT162b1, в то время как только 17% и 8% имели лихорадку выше 38 ° C после второй дозы 30 мкг BNT162b2.Эту тенденцию можно было наблюдать и в отношении утомляемости, и, как правило, у лиц старше 65 лет реактогенность была меньше, чем у более молодых участников. Основываясь на снижении реактогенности в сочетании с иммуногенностью, аналогичной BNT162b1, BNT162b2 прошел клинические испытания фазы 2/3 (Walsh et al. 2020a). 18 ноября  и , 2020, Pfizer и BioNtech первыми опубликовали свои данные по фазе 3, поскольку они достигли всех основных конечных точек эффективности. На сегодняшний день более 40000 человек получили две дозы вакцины, из них 170 подтвержденных случаев COVID-19.Из 170 случаев только 8 случаев были в группе лечения BNT162b2, что обеспечило защитную эффективность 95% (Polack et al. 2020). Подобные результаты наблюдались у пожилых людей с защитной эффективностью у 94% людей. У 10 человек в исследовании развился тяжелый COVID-19, и только 1 был в группе BNT162b2, что обеспечивало 90% защиту от тяжелого заболевания. Хотя это немного менее многообещающе, чем 100% защита Moderna от тяжелых заболеваний, необходимо отслеживать больше случаев, чтобы получить истинное представление об эффективности этой вакцины в предотвращении тяжелых заболеваний.Учитывая, что компании Pfizer и BioNtech подали заявку на разрешение на раннее использование через 2 дня, 20 ноября -го года , 2020, это, скорее всего, будет сделано в рамках постмаркетингового надзора. BNT162b2 была второй вакциной, одобренной для EUA Управлением по контролю за продуктами и лекарствами 11  th , 2020 и в настоящее время вводится широкой публике.
 Иммуногенность вакцин SARS-CoV-2, инактивированных адъювантом псораленом, и ДНК-вакцин SARS-CoV-2 Spike Protein у мышей BALB / c 
 Патогены.2021 май; 10 (5): 626.
,  1,   2,   * ,  1 ,  1,   2 ,  1,   2 ,  1,   3 ,  1 ,  1 ,  1 ,  4 ,  1,   † ,  5  и  6 
 Луис Мартинес-Собридо, академический редактор, Марта Л. ДеДиего, академический редактор, и Тереза ​​Чанг , Академический редактор
  2  Фонд Генри М. Джексона по развитию военной медицины, Бетесда, Мэриленд 20817, США
  3  Лейдос, 1750 Президент-стрит, Рестон, Вирджиния 20190, США
  †  Умер.
 Поступила 06.04.2021; Принята в 2021 г. 14 мая.
 Реферат 
 Разработка безопасной и эффективной вакцины для защиты от COVID-19 является глобальным приоритетом из-за нынешнего высокого уровня инфицирования SARS-CoV-2. В настоящее время существует более 160 кандидатов на вакцину против SARS-CoV-2, находящихся на клинической или доклинической стадии разработки. Из них есть только три вакцины-кандидата на основе цельного вируса, полученные с использованием инактивации β-пропиолактона или формалина. Здесь мы приготовили вакцину против SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 PsIV) с использованием нового метода инактивации псоралена и оценили ее иммуногенность у мышей с использованием двух разных адъювантов, квасцов и Advax-2.Мы сравнили иммуногенность SARS-CoV-2 PsIV с ДНК-вакцинами SARS-CoV-2, экспрессирующими либо полноразмерные, либо усеченные спайковые белки. Мы также сравнили вакцину, инактивированную псораленом, с режимом иммунизации первичной ДНК, инактивированной псораленом вакцины. После двух доз вакцина, инактивированная псораленом, при введении с квасцами или адъювантами Advax-2 вызывала дозозависимые ответы нейтрализующих антител у мышей. В целом, характер цитокиновых ответов ELISPOT на стимуляцию антигеном, наблюдаемый в этом исследовании, показывает, что SARS-CoV-2 PsIV с квасцовым адъювантом способствует ответу типа Th3, тогда как SARS-CoV-2 PsIV с адъювантом Advax-2 способствует Ответ типа Th2.
  Ключевые слова:  SARS-CoV-2, COVID-19, вакцина против SARS-CoV-2, инактивированная псораленом, нейтрализующие антитела против SARS-CoV-2, конформационные эпитопы поверхностных антигенов, 4′-аминометил-4, 5 ‘, 8-триметилпсорален (AMT), Advax-2, ДНК-вакцина, прайм-буст
 1. Введение 
 За последние 20 лет три коронавируса преодолели видовые барьеры, чтобы заразить людей и вызвать острое тяжелое респираторное заболевание: тяжелое. коронавирус острого респираторного синдрома (SARS-CoV) в 2003 г., коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) в 2012 г. и SARS-CoV-2 в 2019 г. [1,2].В настоящее время во всем мире зарегистрировано более 116 миллионов случаев заражения SARS-CoV-2 и более 2,5 миллионов случаев смерти из-за этой пандемии [3]. Инфекции SARS-CoV-2 у людей возникли в декабре 2019 года и с тех пор распространились по всему миру, вызвав COVID-19. Хотя у большинства пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, наблюдается легкое заболевание, которое обычно выздоравливает в течение двух-трех недель, у значительного числа пациентов проявляется тяжелая форма заболевания с повышенной смертностью.
 Разработка безопасной и эффективной вакцины для защиты от COVID-19 является глобальным приоритетом из-за нынешнего высокого уровня передачи болезней и большого числа госпитализаций и смертей, которые угрожают перегрузить системы здравоохранения во многих странах.Большинство вакцин, которые в настоящее время проходят доклинические и клинические испытания, были разработаны для выработки антител против шипового белка SARS-CoV-2 и включают передовые платформы для вакцин, такие как вакцины на основе информационной РНК, ДНК-вакцины, вирусные векторные вакцины, рекомбинантные белковые вакцины. , и вакцины с вирусоподобными частицами [4,5]. Недавно мРНК-вакцины против COVID-19, разработанные BioNTech / Pfizer и Moderna, получили разрешение на экстренное использование как в Великобритании, так и в США. Хотя эти вакцины демонстрируют краткосрочную защитную эффективность против COVID19, до сих пор неясно, будет ли нацеливание только на спайковый белок достаточным для обеспечения долгосрочной защиты от болезни [6].Соответственно, разработка вакцины, инактивированной цельным вирусом, для нацеливания на несколько других вирусных антигенов, включая спайковый белок, нуклеопротеин, белок оболочки и мембранный белок, с целью вызвать более широкий иммунный ответ, является логическим подходом, учитывая, что естественная инфекция генерирует иммунные ответы на эти другие вирусные антигены. белки.
 Недавно две группы разработали вакцины против SARS-CoV-2, инактивированные цельным вирусом, с использованием β-пропиолактона и оценили их эффективность и иммуногенность у нечеловеческих приматов [7,8].β-пропиолактон или формалин, обычно используемые соединения для инактивации вирусов, являются потенциально канцерогенными соединениями, которые инактивируют вирусы на уровне белков и нуклеиновых кислот [9,10].
 Мы ранее исследовали использование псоралена для инактивации всех четырех серотипов вируса денге и оценили иммуногенность вакцин против инактивированного псораленом вируса денге у мышей и нечеловеческих приматов [11,12]. Псорален представляет собой фуранокумарин, который интеркалирует с нуклеиновыми кислотами и при воздействии длинноволнового ультрафиолетового излучения приводит к межцепочечным поперечным связям за счет ковалентного связывания с пиримидиновыми основаниями [13,14,15].Таким образом, инактивация псоралена служит для инактивации вируса на уровне нуклеиновой кислоты, предположительно, при сохранении иммуногенных белковых эпитопов на поверхности вируса.
 В этой статье мы описываем инактивацию SARS-CoV-2 с использованием производного псоралена 4′-аминометил-4,5 ‘, 8-триметилпсорален (AMT) и облучения длинноволновым УФ-светом (365 нм) для получения очищенная инактивированная вакцина против SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 PsIV). Основная цель этого первоначального исследования на мышах состояла в том, чтобы показать, что SARS-CoV-2 PsIV способен вызывать ответы антител и Т-клеток на модели млекопитающих.Затем мы сравнили иммуногенность этой вакцины с ДНК-вакцинами SARS-CoV-2 на мышах. Вакцина против SARS-CoV-2 PsIV была приготовлена ​​с адъювантами квасцов или Advax-2 (Advax-CpG55.2). ДНК-вакцина SARS-CoV-2 кодировала либо полноразмерный спайковый белок SARS-CoV-2, либо усеченный спайковый белок (без трансмембранного участка). ДНК-вакцины также использовались в гетерологичном первичном-бустерном подходе, при котором животных примировали двумя дозами ДНК-вакцины, а затем бустировали SARS-CoV-2 PsIV, приготовленный с Advax-2.Здесь мы сообщаем результаты этих исследований иммуногенности на мышах.
 2. Материалы и методы 
 2.1. Химические вещества и реагенты 
 AMT был приобретен у Cayman Chemical (Анн-Арбор, Мичиган, США). Рекомбинантный сывороточный альбумин человека был приобретен у eEnzymes, LLC (Гейтерсбург, Мэриленд, США). Адъювант Альгидрогель (2%) был получен от InvivoGen (Сан-Диего, Калифорния, США), а сополимер Pluronic F-127 был получен от Sigma Aldrich. Адъювант Advax-2 был предоставлен Vaxine Pty Ltd., Аделаида, Австралия. Все остальные химические вещества и реагенты были приобретены в Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США). Кроличьи антитела против SARS-CoV-2 (NMRC) использовали в качестве первичных антител для ELISA. Конъюгат козьего антитела против кроличьего IgG с HRP (Pierce) использовали в качестве вторичного антитела для ELISA. В качестве субстрата использовали ABTS One Component (Seracare Inc., Милфорд, Массачусетс, США).
 2.2. Получение и инактивация SARS-CoV-2 
 Вкратце, штамм SARS-CoV-2 nCoV / USA-WA1 / 2020 размножали в культурах клеток Vero E6 и собирали центрифугированием при 3000 ×  g  в течение 15 минут.Затем 500 мл культурального супернатанта, содержащего SARS-CoV-2, обрабатывали бензоназой (ферментом, разлагающим свободные нуклеиновые кислоты) для удаления нуклеиновых кислот клетки-хозяина в культуральном супернатанте, и объем уменьшали до 50 мл (концентрирование) с использованием 100 K Кассеты мембранных фильтров MWCO. Концентрированный препарат вируса SARS-CoV-2 смешивали с AMT в концентрации 50 мкг AMT / мл, а затем полученную смесь обрабатывали длинноволновым УФ-светом (λ = 365 нм) в течение 5 минут (общая приложенная энергия = 1,445,400 мкДж). .Полная инактивация обработанного псораленом / UVA вируса SARS-CoV-2 была подтверждена его неспособностью расти в пермиссивных клетках (клетках Vero E6) с помощью теста двухпроходной амплификации вируса. Вкратце, аликвоты инактивированного вируса по 50 мкл использовали для заражения культивируемых клеток в двух экземплярах. После инкубации при 37 ° C в течение 5–8 дней клетки и супернатанты культур исследовали на наличие антигенов SARS-CoV-2 с помощью непрямого иммунофлуоресцентного анализа и вестерн-блоттинга, соответственно. Затем супернатант этой культуры инкубировали со свежими клетками Vero E6 для второго раунда амплификации и тестирования.Отрицательные результаты (указывающие на отсутствие вирус-специфических антигенов) подтвердили полную инактивацию SARS-CoV-2.
 2.3. Очистка и характеристика SARS-CoV-2 PsIV 
 Псорален-инактивированный SARS-CoV-2 очищали центрифугированием в градиенте глицерина-тартрата калия. Затем к чистому SARS-CoV-2 PsIV добавляли стабилизатор, фильтровали через фильтр 0,22 мкм и хранили при -80 ° C. Стабилизатор состоял из конечной концентрации 0,5% рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина, 2% Pluronic F-127 и 15% трегалозы.Присутствие антигенов SARS-CoV-2 в очищенном, инактивированном препарате вируса было подтверждено вестерн-блоттингом с использованием SARS-CoV-2-специфичного антиспайкового белка, антинуклеопротеина и антител против белка оболочки. Полученный продукт представлял собой очищенную вакцину SARS-CoV-2, инактивированную псораленом (SARS-CoV-2 PsIV). Чистоту SARS-CoV-2 PsIV оценивали с помощью гель-электрофореза с последующим окрашиванием серебром. SARS-CoV-2 Титр PsIV (частиц / мл) определяли с помощью Virocyt 2.0.
 2.4. ДНК-вакцины 
 Последовательности ДНК, кодирующие полноразмерный спайковый белок SARS-CoV-2 (штамм Вашингтон) и усеченный спайковый белок (лишенный трансмембранного и цитоплазматического домена S), были отдельно клонированы в плазмидный вектор VR1012 (Vical Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) [16,17]. В этом исследовании использовали очищенные конструкции рекомбинантной ДНК без эндотоксина (<10 ед / мг ДНК).
 2.5. Оценка иммуногенности вакцин-кандидатов от SARS-CoV-2 у мышей 
 Описанные здесь эксперименты были проведены в соответствии с Законом о благополучии животных и в соответствии с принципами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национального исследовательского совета. , National Academy Press, 2011. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) WRAIR / NMRC в соответствии со всеми применимыми федеральными постановлениями, регулирующими защиту животных и исследований.Мышей BALB / C (самки; возраст 6–8 недель) приобретали у Charles River. Во время исследования мышей содержали по 4 в каждой клетке и кормили стандартной диетой, состоящей из коммерчески производимого корма для мышей. Группы из 4 мышей иммунизировали различными вакцинами / адъювантами путем внутрикожной (хвостовой) инокуляции доз вакцин по 50 мкл. ДНК-вакцины SARS-CoV-2 PsIV и SARS-CoV-2 оценивались, как показано на. Животные в группе 1 служили контролем и получали квасцы в дни 1, 29 и 57. Животные в группе 2 также были контрольными и получали только Advax-2 в дни 1, 29 и 57.Низкие и высокие дозы вакцины SARS-CoV-2 PsIV, в состав которой входят либо квасцы, либо Advax-2 (как указано в таблице), вводили в дни 1, 29 и 57 группам 3, 4, 5 и 6. Животные в группах 7 и 8 получали дозы по 50 мкг соответствующих ДНК-вакцин (только ДНК) в дни 1, 29 и 57. Животные в группах первичной / повторной вакцинации (9 и 10) получали дозы по 50 мкг соответствующих ДНК-вакцин. (Только ДНК) на 1-й и 29-й дни, и они получили 10  7  частиц SARS-CoV-2 PsIV в составе с Advax-2 на 57-й день.Кровь брали у всех животных в дни 0, 29 и 56. На 71 день кровь собирали у всех животных перед эвтаназией для сбора селезенки для измерения ответа Т-клеток. Образцы сыворотки крови от каждого животного на 56-й и 71-й день были протестированы на наличие антител, нейтрализующих SARS-CoV-2, с помощью анализа микронейтрализации.
 Таблица 1 
 Группы вакцин и дозировка для исследования иммуногенности на мышах. Контрольные животные получали либо квасцы, либо Advax-2 в PBS (группы 1 и 2 соответственно). Две дозы вакцины (либо 0.2% Альгидрогель или 1 мг Адвакса-2 на дозу) вводили внутрикожно всем животным (первая доза на 1-й день и вторая доза на 29-й день). Животные в первичной / бустерной группе также получали дозу SARS-CoV-2 PsIV на 57 день. ДНК-вакцины (без носителя) вводились внутрикожно.
 Группы
 Адъювант и вакцина
 Количество животных
 Доза
 1
 Квасцы и PBS
 4
 Н / Д
 Advax 2
 и PBS
 4
 N / A
 3
 Квасцы и SARS-CoV-2 PsIV 
 (низкая доза)
 4
 10  5  частиц SARS-Cov-2 PsIV
 4
 Advax-2 и SARS-CoV-2 PsIV 
 (низкая доза)
 4
 10  5  частиц SARS-Cov-2 PsIV
 5
 Квасцы и SARS-CoV-2 PsIV 
 (высокая доза)
 4
 10  7  частиц SARS-Cov-2 PsIV
 6
 Advax-2 и SARS-CoV-2 PsIV 
 (высокая доза)
 4
 10  7  частиц SARS-Cov-2 PsIV
 7
 DN Вакцина, кодирующая полноразмерный спайковый белок SARS-CoV-2
 4
 50 мкг ДНК
 8
 ДНК-вакцина, кодирующая усеченный спайковый белок SARS-CoV-2
 4
 50 мкг ДНК
 9
 Prime / Boost (2 дозы ДНК; полноразмерный S-белок и PsIV)
 4
 50 мкг ДНК (2 дозы) и 
 10  7  частиц SARS-Cov-2 PsIV
 10
 Prime / Boost (2 дозы ДНК ; усеченный белок S и PsIV)
 4
 50 мкг ДНК (2 дозы) 
 10  7  частиц SARS-Cov-2 PsIV
 2.6. Анализ микронейтрализации SARS-CoV-2 
 Анти-SARS-CoV-2-нейтрализующие антитела в сыворотке анализировали с использованием теста микронейтрализации. Двести TCID  50  SARS-CoV-2 инкубировали с двукратными разведениями образцов сыворотки в 96-луночных планшетах в течение 1 ч при 37 ° C. Затем в каждую лунку добавляли клетки Vero81 (2 × 10  4 ) и инкубировали при 37 ° C в течение 84 часов. Через 84 часа клетки фиксировали, и SARS-CoV-2 измеряли путем количественного определения спайкового белка с использованием антитела против спайкового белка, специфичного для SARS-CoV-2, в стандартном формате ELISA.Наибольшее разведение сыворотки, которое привело к снижению абсорбции на ≥80% по сравнению с контролем, было определено как титр микронейтрализации 80% (MN  80 ).
 2.7. Анализы Т-клеток 
 2.7.1. Экстракция спленоцитов из селезенки мыши 
 Селезенки мышей собирали и помещали в 6-луночные планшеты для культивирования тканей, содержащие среду RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% смесью пенициллина и стрептомицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола. В капсуле селезенки делали небольшой разрез, чтобы обеспечить диффузию спленоцитов в среду, чему способствовало легкое давление с помощью шприца объемом 1 мл.Среды осторожно перемешивали для разрушения любых агрегатов клеток и переносили в центрифужную пробирку на 50 мл через фильтр для клеток 70 мкм. Центрифужные пробирки вращали со скоростью 1600 об / мин в течение 8 минут при 4 ° C, и полученный осадок суспендировали в 40 мл охлажденного фосфатно-солевого буфера (PBS). Пробирки снова центрифугировали при 1280 об / мин в течение 8 минут при 4 ° C, и осадок ресуспендировали в PBS перед подсчетом на извлечение и жизнеспособность. Свежие клетки селезенки использовали для анализов ELISPOT IFN-γ и IL-2, а оставшиеся клетки замораживали при концентрации 1 × 10  7  клеток / мл в фетальной бычьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксид (DMSO).Замороженные клетки размораживали и использовали для анализа ELISPOT на IL-4.
 2.7.2. Цитокин ELISPOT 
 Анализы цитокинов IFN-γ, IL-2 и IL-4 проводили на клетках селезенки с использованием наборов цитокинов от Mabtech (Швеция). Номера наборов: 3321M-2H для IFN-γ, 3441-2H для IL-2 и 3311-2A для IL-4. В качестве питательной среды использовали RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 1% пенициллина-стрептомицина. Для анализа были использованы следующие антигены, полученные из ресурсов BEI: пептидные массивы для белка-шипа (S) (номер по каталогу NR52402), нуклеопротеин (N) (номер по каталогу NR52404), мембранный белок (M) (номер по каталогу NR52403), и обволакивающий (E) белок (номер по каталогу NR52405) штамма SARS-CoV-2 Wuhan.Каждый индивидуальный пептид в массиве растворяли в ДМСО, и массивы воссоздали в пептидные пулы с концентрацией 1 мг / мл на пептид. Пептидный массив S-белка содержал 181 пептид, поэтому их превратили в два исходных пула, обозначенных как S1 (пептиды 1–90) и S2 (пептиды 91–181). Остальные три белка (белки N, M и E) были объединены в один исходный пул на белок. Вкратце, планшеты для ELISPOT (MAIPSWU10, Millipore) были покрыты цитокин-специфическими моноклональными антителами.Протоколы, рекомендованные производителем (Mabtech), использовались строго для покрытия моноклональными АБ и для разработки планшетов для ELISPOT. После покрытия планшетов и промывки в планшеты для ELISPOT добавляли 100 мкл / лунки пулов пептидов. Свежие клетки селезенки или замороженные-размороженные клетки селезенки, извлеченные в течение ночи в культуральной среде (100 мкл / лунку), немедленно добавляли в лунки. Конечная концентрация пептидов в исследуемых смесях составляла 1 мкг / мл. Концентрация клеток для анализов составляла 2 × 10  5  клеток / лунку (для анализов IFN-γ и IL-2) или 1 × 10  5  клеток / лунку (для анализа IL-4).Затем планшеты инкубировали при 37 ° C в 5% CO  2  в течение примерно 20 часов. Готовили фиктивные контроли, содержащие все, кроме пептидов, и инкубировали аналогичным образом. После 20-часовой инкубации клетки промывали и анализировали с использованием протокола, рекомендованного производителем (Mabtech). Пятна подсчитывали с использованием автоматического счетчика пятен (AID ELISPOT Reader, Autoimmun Diagnostika GmbH, Straßberg, Германия). Затем пятна были нормализованы на основе входных клеток на лунку, и результаты выражены в единицах образования пятен (SFU) на 10  6  клеток.Данные представлены как прямые цитокиновые ответы ex vivo и антиген-стимулированные ответы. Данные ELISPOT для IFN-γ, IL-2 и IL-4 из имитирующих контрольных экспериментов показаны как ответы ex vivo, а стимулированные антигеном ответы представляют данные после вычитания ответов ex vivo из соответствующих данных, стимулированных антигеном.
 2.7.3. Определение конечной точки с помощью ELISA для общих IgG, IgG1 и IgG2a 
 Антигенами, используемыми для измерения общих IgG, IgG1 и IgG2a в сыворотке мышей, был рекомбинантный белок SARS-CoV-2 N (Leinco Technologies, Фентон, Миссури, США, номер по каталогу: S854), рекомбинантный белок RBD (BEI Resources, № по каталогу: NR-52946) и рекомбинантный тримерный белок S (Leinco Technologies, № по каталогу: S848).Вторичными антителами к общим мышиным IgG, IgG1 и IgG2a были козьи антимышиные IgG (Fc-специфические) пероксидаза (HRP) (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), биотин крысиный антимышиный IgG1 и биотин. крысиный антимышиный IgG2a (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Стрептавидин-пероксидазу хрена (SA-HRP) (BD Bioscience) использовали для обнаружения биотинилированных антител.
 Плоскодонные планшеты для ELISA покрывали антигенами из расчета 1 мкг / лунку (N и RBD) или 0,5 мкг / лунку (тример S) в PBS и инкубировали в течение ночи при 4 ° C.Затем планшеты промывали PBS и блокировали, используя 200 мкл / лунку 5% обезжиренного молока (Difco) в течение не менее 1 ч при 37 ° C. После промывания в планшеты добавляли серийно разведенные сыворотки и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. Планшеты промывали, добавляли соответствующие вторичные антитела к общему IgG, IgG1 или IgG2a и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. Для измерения общего IgG добавляли конъюгат козьего антимышиного IgG-HRP и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. Затем планшеты промывали, добавляли субстрат TMB и инкубировали при комнатной температуре (в темноте) в течение 10 мин.Через 10 мин добавляли стоп-раствор, и планшеты считывали при 450 нм. Для измерения IgG1 и IgG2a планшеты промывали и инкубировали либо с биотинилированным антимышиным IgG1, либо с антимышиным IgG2a в течение 1 ч при 37 ° C. Затем планшеты промывали PBS и инкубировали со стрептавидин-пероксидазой хрена в течение 1 часа. Затем планшеты проявляли с подложкой TMB в течение 10 мин при комнатной температуре. После добавления стоп-раствора планшеты считывали при 450 нм.
 Для каждого эксперимента в качестве отрицательного контроля использовали четыре наивных сыворотки.Мышиные mAb против SARS-CoV-2 (GenScript, Cat / Clone ID: 10G6H5) и мышиные mAb против SARS-CoV-2 N (7B3) (Millipore; Cat: MABX8407) использовали в качестве положительных контролей. Значения отсечения были средним значением + 2,63sd + 0,1 отрицательных контролей для каждого разведения сыворотки [18]. Для исследуемой сыворотки последнее разведение сыворотки, набравшее выше порогового значения, было титром конечной точки.
 2,8. Анализ данных 
 Анализ данных проводился с использованием призмы GraphPad 8.3.1. Односторонний дисперсионный анализ с апостериорным тестом достоверно значимых различий Тьюки (HSD) был проведен для сравнения значимых различий между группами.Статистическая значимость обозначена как *  p  <0,05, **  p  <0,01, ***  p  <0,001 и ****  p  <0,0001.
 3. Результаты 
 3.1. Приготовление и очистка инактивированной вакцины против SARS-CoV-2 
 Штамм SARS-CoV-2 nCoV / USA-WA1 / 2020 был использован для приготовления цельновирусной вакцины, инактивированной псораленом (SARS-CoV-2 PsIV). Вакцина была приготовлена ​​до концентрации 10  9  очищенных вирусных частиц на мл.Присутствие SARS-CoV-2-специфических антигенов в SARS-CoV-2 PsIV было подтверждено Вестерн-блот-анализом с использованием анти-SARS-CoV-2 спайк-протеин-специфичных, нуклеокапсидных протеинов и обволакивающих протеин-специфических антител ( ).
 Вестерн-блот-анализ очищенного SARS-CoV-2 PsIV. Присутствие антигенов SARS-CoV-2 оценивали с помощью отдельных вестерн-блоттингов с использованием антител, специфичных к белку спайков (S), белку нуклеокапсида (N) или белку мембраны (M). Дорожки из N- и M-вестерн-блоттинга показаны рядом с дорожками из S-вестерн-блоттинга.При использовании антител, специфичных к спайковому белку, наблюдались две отдельные полосы: одна для мономера S-белка при 140 кДа и вторая полоса для субъединицы S1 при 76 кДа.
 3.2. Антительный ответ на SARS-CoV-2 PsIV у мышей 
 Иммуногенность SARS-CoV-2 PsIV оценивали путем иммунизации мышей BALB / c различными дозами вакцины в сочетании с квасцами или Advax-2 в качестве адъюванта. Advax-2 — адъювант дельта-инулина, содержащий олигонуклеотид CpG, который, как было показано, улучшает иммуногенность и эффективность ряда вакцин в клинических испытаниях на людях, в том числе против гриппа и гепатита B [19,20,21].Сыворотки от отдельных мышей в каждой группе в различные моменты времени тестировали на наличие антител, нейтрализующих SARS-CoV-2.
 Через двадцать восемь дней после введения второй дозы вакцин (сыворотка на 56-й день) животные, получившие низкую дозу PsIV SARS-CoV-2, не проявили каких-либо значительных нейтрализующих реакций антител (). Однако животные, получившие высокую дозу PsIV SARS-CoV-2, вызвали устойчивые нейтрализующие реакции антител, как показано на рис. Животные, получившие высокую дозу SARS-CoV-2 PsIV с адъювантом Advax-2, показали значительно более высокий геометрический средний нейтрализующий ответ антител, чем животные, получившие высокую дозу вакцины с квасцами.Мыши, получившие ДНК-вакцину SARS-CoV-2, кодирующую полноразмерный спайковый белок, вызвали нейтрализующие реакции антител, и средний геометрический титр был самым высоким по сравнению со всеми другими группами. Для групп с первичным бустом средние геометрические титры были аналогичны среднему геометрическому титру в группе только Advax 2 / SARS-CoV-2 PsIV.
 Microneut  80  данных (сыворотка на 56 день) мышей BALB / C, вакцинированных вакцинами против SARS-CoV-2 и PsIV, и ДНК-вакцинами, кодирующими полноразмерный и усеченный спайковый белок SARS-CoV-2.Кружки представляют отдельных мышей, а горизонтальные полосы представляют собой среднее геометрическое для каждой группы. * указывает на значительные различия ( p  ≤ 0,05) между группой адъюванта и PsIV по сравнению с группой, получавшей только соответствующий адъювант.
 Всем животным была сделана повторная вакцинация на 57 день для подготовки к измерению Т-клеточного ответа путем сбора клеток селезенки на 71 день (через две недели после введения бустерной дозы). Для групп с гетерологичной первичной буст-вакцинацией (9 и 10) мыши, которым вводили ДНК-вакцину в дни 1 и 29, получали SARS-CoV-2 PsIV на 57 день.Мыши в группах, получавших только ДНК, получили третью иммунизацию ДНК на 57-й день. Ответы нейтрализующих антител на 71-й день продолжали демонстрировать статистически лучшие ответы в группе вакцины с высокой дозой Advax-2 по сравнению с группой с высокой дозой квасцовой вакцины (). Животные, получившие низкую дозу вакцины SARS-CoV-2 PsIV, не вызывали никаких нейтрализующих реакций антител, независимо от используемого адъюванта. У мышей в группах вакцины ДНК не наблюдалось значительного увеличения нейтрализующих антител после иммунизации вакцинами ДНК или PsIV на 57 день.Эти результаты показывают, что SARS-CoV-2 PsIV может вызывать ответы нейтрализующих антител при более высоких дозах и что адъювант Advax-2 лучше усиливает иммуногенность, чем адъювант квасцов.
 Microneut  80  данные (сыворотка на 71 день) мышей BALB / C, вакцинированных SARS-CoV-2 PsIV, ДНК-вакцин, кодирующих полноразмерный или усеченный спайковый белок SARS-CoV-2, или вакцины ДНК и PsIV ( Prime / Boost). Кружки представляют отдельных мышей, а горизонтальные полосы представляют собой среднее геометрическое для каждой группы.* указывает на значительные различия ( p  ≤ 0,05) между группой адъюванта и PsIV по сравнению с группой, получавшей только соответствующий адъювант.
 Общие подклассы IgG и IgG 
 Антитела IgG Anti-SARS-CoV-2 против белка спайка и рецептор-связывающего домена белка спайка были обнаружены у всех мышей, вакцинированных SARS-CoV-2 PsIV и ДНК. Мыши, вакцинированные SARS-CoV-2 PsIV, также выработали антитела против белка нуклеокапсида (A). Дозозависимый ответ IgG для SARS-CoV-2 PsIV был очевиден, поскольку высокая доза индуцировала более высокие титры IgG, чем низкая доза.ДНК-вакцина, кодирующая полноразмерный спайковый белок, вызывала более высокий ответ IgG, чем ДНК-вакцина, кодирующая усеченный спайковый белок. Диапазон титров IgG варьировался между различными группами вакцины, причем наибольшая разница составляла до 64 раз. SARS-CoV-2 PsIV у квасцов вызывал самый высокий ответ IgG1, тогда как SARS-CoV-2 PsIV в Advax-2 вызывал самый высокий ответ IgG2a (B), хотя разница между двумя группами не была значимой ( p  = 0,053 –0,17).Как показано на дополнительном рисунке S1, отношение конечных титров для IgG2a к IgG1, SARS-CoV-2 PsIV с квасцами индуцировало почти эквивалентный ответ RBD IgG2a и IgG1, тогда как SARS-CoV-2 с Advax-2 индуцировал преимущественно ответ IgG2a. .
 Титры общих конечных точек IgG, IgG1 и IgG2a к антигенам SARS-CoV-2 из сывороток мышей на 71 день. ( A ) Конечные титры общих IgG к антигенам шипа (S), рецептор-связывающего домена (RBD) и нуклеокапсида (N) SARS-CoV-2. ( B ) Конечные титры IgG1 и IgG2a к RBD.Каждый символ представляет одну мышь, а горизонтальные линии представляют средние значения группы. Тесты Стьюдента  t  были использованы для сравнения различий между группами. * указывает на значительные различия между группой адъюванта и PsIV и соответствующей группой только адъюванта, а также между группой ДНК-вакцины и соответствующей группой первичной бустерной ДНК / PsIV.
 3.3. Т-клеточные ответы на SARS-CoV-2 PsIV у мышей 
 Все три цитокина IFN-γ, IL-2 и IL-4 были обнаружены ex vivo без стимуляции антигеном в клетках селезенки, выделенных из SARS-CoV-2 PsIV- вакцинированные мыши ().Контрольные группы только с квасцами и адъювантом Advax-2 имели минимальные ответы IFN-γ (SFU ≤ 10), IL-2 (SFU ≤ 15) и IL-4 (SFU ≤ 20). Когда квасцы использовались в качестве адъюванта, только высокая доза SARS-CoV-2 PsIV вызвала значительный ответ IFN-γ. Однако, когда Advax-2 использовался в качестве адъюванта, как низкие, так и высокие дозы SARS-CoV-2 PsIV вызывали значительные ответы IFN-γ, и наблюдалась дозозависимая реакция. В целом, введение SARS-CoV-2 PsIV с Advax-2 вызывало значительно более высокий ответ IFN-γ, чем введение SARS-CoV-2 PsIV с квасцами.Хотя клетки селезенки всех животных, иммунизированных SARS-CoV-2 PsIV, показали положительные ответы на IL-4, SARS-CoV-2 PsIV, приготовленный с квасцами, вызывал значительно более высокие ответы IL-4, чем SARS-CoV-2 PsIV, приготовленный с Advax-2. ДНК-вакцины сами по себе или примированные ДНК с последующей имитацией SARS-CoV-2 PsIV не вызывали каких-либо заметных ответов IFN-γ или IL-4 (SFU ≤ 20). Все группы мышей, вакцинированных SARS-CoV-2 PsIV, показали положительный ответ на IL-2, тогда как мыши, получившие только ДНК-вакцины, этого не сделали.Мыши, которые были примированы ДНК-вакцинами, а затем усилены SARS-CoV-2 PsIV, также имели ответы IL-2. Наблюдаемый паттерн цитокиновых ответов ex vivo предполагает, что SARS-CoV-2 PsIV с квасцами поляризовал цитокиновый ответ в сторону ответа Th3-типа, тогда как SARS-CoV-2 PsIV с Advax-2 поляризовал цитокиновый ответ в сторону ответа Th2-типа. .
 ELISPOT Ex vivo для IFN-γ, IL-2 и IL-4. Спленоциты мыши использовали для анализов ELISPOT. Данные представлены в виде единиц формирования пятна (SFU) на 1 × 10  6  ячеек.указывает на значительные различия между группами квасцов и PsIV (высокая или низкая доза) по сравнению с соответствующими группами дозировки Advax-2 и PsIV. > указывает на значительные различия между группами, получавшими только ДНК-вакцину, и соответствующими группами первичной бустерной ДНК / PsIV.
 В дополнение к ex vivo цитокин-продуцирующим эффекторным Т-клеткам, Т-клетки памяти также могут отвечать на стимуляцию антигеном с образованием цитокинов. Для оценки клеток памяти использовали три пула антигенов SARS-CoV-2, S1 + S2, N и M + E, чтобы стимулировать клетки для ответов ELISPOT.Для этих анализов значение SFU, равное 50 или более, считалось хорошим ответом. Одни только квасцы и Advax-2 показали минимальные ответы IL-4 (SFU ≤ 20), IL-2 (SFU ≤ 15) и IFN-γ (SFU ≤ 25) на все три антигена, за исключением двух мышей в Advax. -2 адъювантная группа (). Эти две мыши показали положительные ответы на IL-2 и IFN-γ с SFU> 50 на пул N-пептидов. Для IFN-γ низкая доза SARS-CoV-2 PsIV в квасцах вызвала низкий ответ с общим SFU ≤ 27, тогда как высокая доза SARS-CoV-2 PsIV в квасцах показала хороший ответ на пулы N-пептидов ( SFUs = 75–122), но не к другим антигенам.Низкая доза SARS-CoV-2 PsIV в Advax-2 вызвала хороший ответ на антигены N (SFU = 72–388), в то время как высокая доза SARS-CoV-2 PsIV в Advax-2 вызвала хороший ответ на все три антигены. SARS-CoV-2 PsIV в Advax-2 вызывал значительно более высокие ответы IFN-γ, чем SARS-CoV-2 PsIV у квасцов. ДНК-вакцины индуцировали ответы IFN-γ на пул S-пептидов, но после усиления SARS-CoV-2 PsIV также наблюдали ответ на пул N-пептидов. В отличие от ответов IFN-γ, только SARS-CoV-2 PsIV в квасцах вызывал ответы IL-4.Все остальные группы вакцины показали ответы, которые в основном были ниже 50 SFU. Все группы вакцины против SARS-CoV-2 PsIV показали ответы IL-2 на стимуляцию антигеном. Сами по себе ДНК-вакцины не вызывали ответов IL-2, но после иммунизации SARS-CoV-2 PsIV группы первичной иммунизации показали ответы IL-2, в первую очередь на пул N-пептидов. В целом, характер цитокиновых ответов ELISPOT на стимуляцию антигеном оказался сходным с паттерном цитокиновых ответов ex vivo, что позволяет предположить, что SAR-CoV-2 PsIV с квасцами способствует ответу типа Th3, тогда как SARS-CoV-2 PsIV с Advax -2 способствовал ответу Th2-типа.
 Ответ IFN-γ, IL-2 и IL-4 на стимуляцию антигеном. Спленоциты мышей стимулировали пулами пептидов, представляющими спайк полной длины (разделенный на два пула S1 и S2), нуклеокапсидом (N), мембранным (M) и оболочечным (E) белками. Антиген-специфические ответы на пул S-пептидов, пул N-пептидов и пулы пептидов M и E показаны черным, красным и синим соответственно. Данные представлены в виде SFU на 1 × 10  6  ячеек. Каждый символ представляет одну мышь, а горизонтальные линии представляют средние значения группы.указывает на значительные различия между группами квасцов и PsIV с высокими или низкими дозами по сравнению с соответствующими группами дозировки Advax и PsIV. > указывает на значительные различия между группами, получавшими только ДНК-вакцину, и соответствующими группами первичной бустерной ДНК / PsIV.
 4. Обсуждение 
 Мы подготовили и оценили очищенную инактивированную псораленом вакцину против цельного вируса SARS-CoV-2 на мышах BALB / c. В настоящее время эта вакцина является одной из немногих инактивированных цельновирусных вакцин, разработанных для нацеливания на весь вирус SARS-CoV-2, в отличие от сотен вакцин, нацеленных только на спайковый белок вируса.Другие вакцины на основе цельного вируса, инактивированные SARS-CoV-2, готовятся с использованием β-пропиолактона, обычно используемого химического вещества для инактивации вирусов [7,8]. Это соединение инактивирует вирусы, изменяя как нуклеиновую кислоту, так и поверхностные белки, подобно формалину. В отличие от β-пропиолактона и формалина, псорален инактивирует вирусные патогены на уровне нуклеиновых кислот, тем самым оставляя поверхностные вирусные белки в основном нетронутыми [11,12]. При использовании вируса денге вакцины, инактивированные псораленом, вызывали более высокий нейтрализующий ответ антител по сравнению с вакцинами, инактивированными формалином [12].Поэтому использование платформы, основанной на инактивации псоралена, для разработки вакцины против SARS-CoV-2 было логичным подходом.
 SARS-CoV-2 PsIV оценивался как с традиционным адъювантом из квасцов, так и с новым адъювантом Advax-2. Результаты наших исследований на мышах показывают, что SARS-CoV-2 PsIV способен вызывать устойчивые нейтрализующие реакции антител. Иммуногенность SARS-CoV-2 PsIV была значительно лучше при приготовлении с адъювантом Advax-2, чем с адъювантом квасцов (и).Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными для других вакцин, включая вакцины против гриппа и вируса Западного Нила [21,22]. В более ранних доклинических исследованиях других вакцин против коронавируса SARS использование квасцов в качестве адъюванта способствовало респираторной патологии, вызывая иммунные ответы Th3 в дыхательных путях, тогда как Advax-2 в первую очередь вызывал ответы Th2, что приводило к предотвращению связанной с вакциной иммунопатологии легких. [23]. Результаты иммуногенности, наблюдаемые в этом исследовании для SARS-CoV-2 PsIV с квасцами и Advax-2 у мышей, аналогичным образом показали, что Advax-2 способствовал ответу Th2, тогда как квасцы способствовали ответу Th3 (B и).Это предполагает, что комбинация SARS-CoV-2 PsIV и Advax-2 была бы идеальной комбинацией вакцины и адъюванта с минимальным риском связанной с вакциной иммунопатологии легких при повторном контакте с вирусом.
 Реакции нейтрализующих антител, вызванные SARS-CoV-2 PsIV, наблюдаемые в нашем доклиническом исследовании, по крайней мере, аналогичны, если не лучше, чем ответы, наблюдаемые для других вакцин против SARS-CoV-2, инактивированных цельным вирусом, которые в настоящее время производятся. клинические испытания, особенно с учетом того, что самая высокая доза SARS-CoV-2 PsIV, испытанная в этом исследовании, составляла 10  7  частиц (эквивалентно низким нг белков SARS-CoV-2 на дозу).Вакцины SARS-CoV-2, инактивированные β-пропиолактоном (BBIBP-CorV или PiCoVacc), были оценены в значительно более высоких дозах (2–8 мкг белков на дозу) на животных моделях [7,8,24]. Когда 10  5  частиц SARS-CoV-2 PsIV были использованы для иммунизации животных, наблюдались слабые реакции нейтрализующих антител. Однако введение 10  7  частиц SARS-CoV-2 PsIV привело к устойчивому нейтрализующему ответу антител. Следовательно, у мышей наблюдаются дозозависимые ответы нейтрализующих антител.В настоящее время мы находимся в стадии разработки процесса для производства больших количеств вакцины SARS-CoV-2 PsIV в более высоких концентрациях (10  11  –10  12  частиц / мл) для проведения исследования повышения дозы и эффективности в нечеловеческие приматы.
 В то время как вакцина SARS-CoV-2 PsIV вызвала превосходные нейтрализующие реакции антител у мышей по сравнению с ДНК-вакцинами и подходом первичной бустерной вакцинации в нашем исследовании, возможно, что 50 мкг / доза ДНК или внутрикожное введение ДНК у мышей может не быть оптимальной дозой или путем введения ДНК-вакцины мышам.Однако мы считаем, что 50 мкг / доза ДНК-вакцин обычно является оптимальной дозой для мышей, как это наблюдалось с ДНК-вакцинами против денге в нашей лаборатории (неопубликованные данные). Возможно, другие пути введения ДНК-вакцины, такие как внутримышечная инъекция и электропорация, могут дать лучший нейтрализующий ответ антител, и поэтому их необходимо изучить дополнительно [25].
 Таким образом, мы продемонстрировали, что вакцина против SARS-CoV-2, инактивированная псораленом, генерирует устойчивые нейтрализующие антитела и Т-клеточные ответы на спайковые и ядерные белки у мышей.В настоящее время неясно, необходимы ли иммунные ответы на другие вирусные белки, помимо белка спайков, для долгосрочной защиты от инфекции SARS-CoV-2. Возможно, что естественные иммунные ответы на весь вирус (живой или инактивированный) могут вызвать некоторые незащищающие ответы антител на иммунодоминантные, но не защитные эпитопы. Однако недавно сообщалось об обнаружении нейтрализующих ответов антител против белков S и N SARS-CoV-2 у большинства пациентов с COVID-19 в течение трех недель после заражения [6].Сообщалось также об обнаружении Т-клеток памяти CD4  +  и CD8  + , примированных против S, N и M белков SARS-CoV-2, у выздоровевших пациентов с COVID-19 [26]. Таким образом, по мере раскрытия дополнительной информации о взаимосвязи защиты и требований к долгосрочному иммунитету против SARS-CoV-2 наша цельновирусная вакцина, инактивированная псораленом, может иметь преимущества по сравнению с другими вакцинами, которые нацелены только на спайковый белок SARS-CoV-2. . Кроме того, приготовление SARS-CoV-2 PsIV с адъювантом Advax-2 способствует сильному Th2-ответу, который может быть полезен, чтобы избежать избыточного Th3-смещения, которое, как сообщалось, связано с связанной с вакциной иммунопатологией легких в предыдущих доклинических исследованиях на мелких животных. других инактивированных цельновирусных вакцин против коронавируса.
 Благодарности 
 Мы благодарим Qi Qiu (NMRC) за его помощь с анализами ELISA.
 Вклад авторов 
 Концептуализация, K.R.P., M.W., K.R., D.E. и A.K.S .; формальный анализ, K.R.P., A.K.S., D.E. и P.S .; привлечение финансирования, K.R.P .; расследование, D.E., Z.L., V.J., Y.C. и P.S .; методология, K.R.P., A.K.S., D.E., P.S. и K.R .; ресурсы, K.R.P., G.D., D.E., N.P. и S.-J.W .; составление оригинала черновика, А.К.С.; написание – просмотр и редактирование, П.С., K.R.P., M.W., D.E., N.P., K.R. и S.-J.W. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.
 Заявление институционального наблюдательного совета 
 Исследование проводилось в соответствии с Законом о благополучии животных и в соответствии с принципами, изложенными в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию, Национального исследовательского совета, National Academy Press, 2011 и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) WRAIR / NMRC в соответствии со всеми применимыми федеральными постановлениями, регулирующими защиту животных и исследования (протокол № 18-IDD-17).
 Конфликты интересов 
 Кевин Портер владеет патентом на «вирусную вакцину, инактивированную псораленом, и способ ее приготовления». NMRC также подал предварительный патент под названием «Псорален-инактивированная вакцина против коронавируса и способ приготовления» 1 декабря 2020 года. Николай Петровский является аффилированным лицом компании Vaxine Pty Ltd., которая владеет правами собственности на адъювант Advax-2.
 Заявление об ограничении ответственности 
 Мнения, выраженные в этой статье, отражают результаты исследований, проведенных авторами, и не обязательно отражают официальную политику или позицию Министерства военно-морского флота, Министерства обороны или правительства США.Авторы являются военнослужащими или федеральными служащими правительства Соединенных Штатов. Эта работа была подготовлена ​​в рамках их служебных обязанностей. Название 17 U.S.C. 105 гласит, что «Защита авторских прав под этим заголовком недоступна для какой-либо работы правительства Соединенных Штатов». Раздел 17 U.S.C. 101 определяет работу правительства США как работу, подготовленную военнослужащими или служащими правительства США в рамках служебных обязанностей этих лиц.
 Сноски 
  Примечание издателя:  MDPI остается нейтральным в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.
 Ссылки 
 1. Cascella M., Rajnik M., Cuomo A., Dulebohn S.C., Di Napoli R. Особенности, оценка и лечение коронавируса (COVID-19) StatPearls; Остров сокровищ, Флорида, США: 2020 г. [Google Scholar] 2. Уоллс А.С., Парк Ю.Дж., Торторичи М.А., Уолл А., Макгуайр А.Т., Вислер Д. Структура, функция и антигенность гликопротеина шипа SARS-CoV-2. Клетка. 2020 doi: 10.1016 / j.cell.2020.11.032. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4. Чжао Дж., Чжао С., Оу Дж., Чжан Дж., Lan W., Guan W., Wu X., Yan Y., Zhao W., Wu J., et al. COVID-19: новости о разработке вакцины против коронавируса. Передний. Иммунол. 2020; 11: 602256. DOI: 10.3389 / fimmu.2020.602256. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Форни Г., Мантовани А., Комиссия по Covid-19 Академии Национале деи Линчеи, R Вакцины от COVID-19: наши позиции и задачи впереди. Смерть клетки отличается. 2021; 28: 626–639. DOI: 10.1038 / s41418-020-00720-9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Чунг Дж.Ю., Тон М.Н., Квон Ю.Дж. Вакцины против COVID-19: состояние и перспективы с точки зрения доставки. Adv. Препарат Делив. Ред. 2021; 170: 1–25. DOI: 10.1016 / j.addr.2020.12.011. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Ван Х., Чжан Ю., Хуанг Б., Дэн В., Цюань Ю., Ван В., Сюй В., Чжао Ю., Ли Н., Чжан Дж. И др. Разработка инактивированной вакцины-кандидата BBIBP-CorV с мощной защитой от SARS-CoV-2. Клетка. 2020; 182: 713–721.e9. DOI: 10.1016 / j.cell.2020.06.008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8.Гао К., Бао Л., Мао Х., Ван Л., Сюй К., Ян М., Ли Ю., Чжу Л., Ван Н., Львов З. и др. Разработка инактивированной вакцины-кандидата от SARS-CoV-2. Наука. 2020; 369: 77–81. DOI: 10.1126 / science.abc1932. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Бхаттачарья А., Гупта Б., Сингх А., Сах К., Гупта В. Исследование натурального заменителя формалина: сравнение меда, сахара и сиропа пальмового сахара в качестве фиксаторов. Natl. J. Maxillofac. Surg. 2018; 9: 14–21. DOI: 10.4103 / njms.NJMS_57_17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11.Равипракаш К., Сан П., Равив Ю., Люк Т., Мартин Н., Кохель Т. Фотоинактивированный вирус денге в присутствии 1,5-йодонафтилазида (INA) или AMT, соединения псоралена (4′-аминометил -триоксален) обладает высокой иммуногенностью для мышей. Гм. Вакцины Immunother. 2013; 9: 2336–2341. DOI: 10.4161 / hv.25602. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Сундарам А.К., Юинг Д., Блевинс М., Лян З., Синк С., Лассан Дж., Равипракаш К., Дефанг Г., Уильямс М., Портер К.Р. и др. Сравнение очищенных инактивированных псораленом и инактивированных формалином вакцин против денге у мышей и нечеловеческих приматов.Вакцина. 2020; 38: 3313–3320. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2020.03.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Волловиц С. Основы технологии Helinx на основе псоралена для инактивации инфекционных патогенов и лейкоцитов в тромбоцитах и ​​плазме. Семин. Гематол. 2001; 38: 4–11. DOI: 10.1016 / S0037-1963 (01)
-0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Hanson C.V., Riggs J.L., Lennette E.H. Фотохимическая инактивация ДНК и РНК вирусов производными псоралена. J. Gen. Virol. 1978; 40: 345–358.DOI: 10.1099 / 0022-1317-40-2-345. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Hanson C.V. Фотохимическая инактивация вирусов псораленами: обзор. Кровяные клетки. 1992; 18: 7–25. [PubMed] [Google Scholar] 16. Равипракаш К., Портер К.Р., Кочел Т.Дж., Юинг Д., Симмонс М., Филлипс И., Мерфи Г.С., Вайс В.Р., Хейс К.Г. ДНК-вакцина вируса денге типа 1 вызывает защитные иммунные реакции у макак-резусов. J. Gen. Virol. 2000. 81: 1659–1667. DOI: 10.1099 / 0022-1317-81-7-1659. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17.Равипракаш К., Кочель Т.Дж., Юинг Д., Симмонс М., Филлипс И., Хейс К.Г., Портер К.Р. Иммуногенность ДНК-вакцин вируса денге типа 1, экспрессирующих усеченный и полноразмерный белок оболочки. Вакцина. 2000; 18: 2426–2434. DOI: 10.1016 / S0264-410X (99) 00570-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Фрей А., Ди Канцио Дж., Зураковски Д. Статистически определенный метод определения конечного титра для иммуноанализов. J. Immunol. Методы. 1998. 221: 35–41. DOI: 10.1016 / S0022-1759 (98) 00170-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19.Хаяси М., Аоши Т., Хаседа Ю., Кобияма К., Виджая Э., Накацу Н., Игараси Ю., Стэндли Д. М., Ямада Х., Хонда-Окубо Ю. и др. Advax, микрочастица дельта-инулина, усиливает свойство встроенного адъюванта совместно вводимых вакцин. EBioMedicine. 2017; 15: 127–136. DOI: 10.1016 / j.ebiom.2016.11.015. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Нолан Т., Ричмонд П.К., Формика Н.Т., Хошлер К., Скельо М.В., Стони Т., МакВернон Дж., Хартел Г., Соулвин Д.К., Беннет Дж. И др. Безопасность и иммуногенность прототипа адъювантной инактивированной вакцины против сплит-вируса гриппа A (H5N1) для младенцев и детей.Вакцина. 2008; 26: 6383–6391. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2008.08.046. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Петровский Н., Ларена М., Сиддхартан В., Проу Н.А., Холл Р.А., Лобигс М., Морри Дж. Инактивированная культура клеток вакцина против японского энцефалита (JE-ADVAX), содержащая адъювант дельта-инулина, обеспечивает надежную гетерологичную защиту от энцефалита Западного Нила. через перекрестно защищающие В-клетки памяти и нейтрализующие антитела. J. Virol. 2013; 87: 10324–10333. DOI: 10.1128 / JVI.00480-13. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22.Гордон Д.Л., Сайков Д., Хонда-Окубо Ю., Уилкс С.Х., Абан М., Барр И.Г., Петровский Н. Испытание фазы 1 на людях инактивированной вакцины против сезонного гриппа с низкой дозой, созданной с адъювантом инулина Advax delta. Вакцина. 2016; 34: 3780–3786. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2016.05.071. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Вонг Т.М., Петровский Н., Биссел С.Дж., Вили К.А., Росс Т.М. Адъюванты на основе дельта-инулина, которые вызывают фенотип Th2 после вакцинации, снижают титры респираторно-синцитиального вируса в легких без снижения иммунопатологии легких.Гм. Вакцины Immunother. 2016; 12: 2096–2105. DOI: 10.1080 / 21645515.2016.1162931. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Ся С., Чжан Ю., Ван Ю., Ван Х., Ян Ю., Гао Г.Ф., Тан В., Ву Г., Сюй М., Лу З. и др. Безопасность и иммуногенность инактивированной вакцины против SARS-CoV-2, BBIBP-CorV: рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование фазы 1/2. Lancet Infect. Дис. 2020 DOI: 10.1016 / S1473-3099 (20) 30831-8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Уильямс М., Юинг Д., Блевинс М., Сан П., Сундарам А.К., Равипракаш К.С., Портер К.Р., Сандерс Дж. У. Повышенная иммуногенность и защитная эффективность четырехвалентной ДНК-вакцины против денге с использованием электропорации и внутрикожной доставки. Вакцина. 2019; 37: 4444–4453. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2019.06.083. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Грифони А., Вейскопф Д., Рамирес С.И., Матеус Дж., Дэн Дж. М., Модербахер С. Р., Ролингс С. А., Сазерленд А., Премкумар Л., Джади Р. С. и др. Мишени Т-клеточного ответа на коронавирус SARS-CoV-2 у людей с заболеванием COVID-19 и у людей, не подвергавшихся воздействию.Клетка. 2020; 181: 1489–1501. DOI: 10.1016 / j.cell.2020.05.015. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
 Akston Biosciences 
 Обзор компании 
 Akston Biosciences Corporation использует свою новую платформу слитых белков для разработки и производства новых классов биопрепаратов, включая вакцины, инсулины сверхдлительного действия и средства для лечения аутоиммунных заболеваний. Основана командой SmartCells, Inc., разработавшей первый в мире клинический инсулин, чувствительный к глюкозе.(продана Merck & Co.), Akston вступила в партнерские отношения с Dechra Pharmaceuticals PLC (DPH) для коммерциализации раз в неделю инсулиновой терапии для собак и кошек. Он управляет производством биопрепаратов GMP и исследовательской лабораторией в Беверли, штат Массачусетс.
  Компания Akston создала ряд разнообразных терапевтических кандидатов для использования в целях защиты здоровья людей и животных :
 Платформа 
 Akston использует запатентованную платформу для слияния Fc для разработки своих терапевтических кандидатов, которые могут использовать преимущества многих различных биологических механизмов действия.Эта платформа «швейцарской армии» для многофункциональной белковой инженерии поддерживает индивидуализированное взаимодействие с иммунной системой, доставку индивидуальных агентов для лечения метаболических заболеваний и увеличение периода полужизни. Полностью биологические терапевтические препараты, разработанные на платформе Akston, могут производиться в больших масштабах с использованием установленных технологий. УЗНАТЬ БОЛЬШЕ
 Вакцина против COVID-19 — AKS-452 
 AKS-452 — это новый, биологически сконструированный слитый белок SARS-CoV-2-RBD-Fc, разработанный для индукции или усиления смешанного иммунного ответа Th2 / Th3 у пациентов против рецепторно-связывающего домена (RBD) нового шипового белка коронавируса.Клинические исследования показали устойчивую продукцию нейтрализующих антител в дозах микрограмм. Доказано, что AKS-452 стабилен при хранении в течение не менее шести месяцев при 25 ° Цельсия (77 ° Фаренгейта) и в течение одного месяца при 37 ° Цельсия (99 ° Фаренгейта). Это самая передовая вакцина слитого белка Fc, специфическая для COVID-19, в стадии коммерческой разработки, и внутренняя природа конструкции обеспечивает уникальное сочетание преимуществ по сравнению с вакцинами на основе нуклеиновых кислот, вирусных векторов и инактивированных вирусных вакцин. УЗНАТЬ БОЛЬШЕ
  Ветеринарная инсулиновая терапия   — AKS-321d и AKS-425c
 Akston сотрудничает с Dechra Pharmaceuticals PLC для коммерциализации препаратов инсулина AKS-321d и AKS-425c, применяемых один раз в неделю для собак и кошек, соответственно, которые являются незаменимой заменой существующего курса лечения инсулином два раза в день.В этих методах лечения используется специально разработанный инсулин для повышения глюкозоснижающей биоактивности и модифицированный Fc собаки или кошки Fc, который обеспечивает длительный период полужизни за счет рециклинга FcRn без активации иммунной системы. Многочисленные полевые исследования продемонстрировали успешное многомесячное лечение десятков собак и кошек с диабетом, принадлежащих клиенту. УЗНАТЬ БОЛЬШЕ
 Профилактика диабета 1 типа  — AKS -107
 Компания Akston разработала AKS-107, гибридный белок Fc-инсулин, предназначенный для прерывания ключевых процессов, ведущих к инсулиновому аутоиммунитету и диабету 1 типа.Он использует мутированную часть инсулина, которая не снижает уровень глюкозы в крови, и область Fc, чтобы направить иммунную систему на удаление В-клеток-мишеней. Akston сотрудничает с Helmsley Charitable Trust, который поддерживает производство AKS-107 GMP, и некоммерческой корпорацией Sanford Research, Inc. из Южной Дакоты, которая проведет Фазу 1 клинических испытаний. Он также получил значительную поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH) для поддержки исследований в области фармакологии и токсикологии, обеспечивающих безопасность IND.УЗНАТЬ БОЛЬШЕ
 Инсулинотерапия человека — AKS-433 и AKS-444 
 Используя знания, полученные при разработке ветеринарных инсулинов длительного действия, Akston разработала два новых кандидата на человеческий инсулин.